CH677285A5

CH677285A5 -

Info

Publication number: CH677285A5
Application number: CH902/88A
Authority: CH
Inventors: Hans Soederlund; Arja Weckman
Original assignee: Orion Yhtymae Oy
Priority date: 1987-03-11
Filing date: 1988-03-10
Publication date: 1991-04-30
Also published as: IL102154A; NO881064L; FI880994L; CA1338207C; US5989817A; ATA64388A; HUT50868A; NO172909B; DE3807994C2; US5476769A; IE880697L; IL102154A0; LU87153A1; DK129588A; DK175384B1; GB2202328B; BE1003990A5; NL194922C; IT8819722A0; NL8800594A

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein schnelles und empfindliches Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren mit Hilfe von Hybridisierungstechniken, bei dem die Detektorsonden als modifizierte Primer in Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure eingebaut werden, bevor die Hybridisierungsreaktion durchgeführt wird. Ausserdem betrifft die Erfindung eine Reagenzienkombination und ein Besteck zur Durchführung dieses Verfahrens.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren mit Hilfe von Hybridisierungstechniken, bei dem die Einfangsonden als modifizierte Primer in Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäuren eingebaut werden, bevör die Hybridisierungsreaktion durchgeführt wird. Die Erfindung betrifft ferner eine Reagenzienkombination und ein Besteck zur Durchführung dieses Verfahrens.

Bei Hybridisierungsreaktionen wird ein markiertes Oligo- oder Polynucleotid, d.h. das Sondenmolekül, über Basenpaarungen an eine nachzuweisende Nucleinsäure angelagert. Verschiedene Hybridisie-rungsverfahren wurden zum Nachweis von Nucleinsäuren verwendet. Bei direkten Hybridisierungsver-fahren befindet sich die Probe entweder in Lösung oder sie ist an einen festen Träger gebunden. Die nachzuweisende Nucleinsäure wird mit einem markierten Sondenmolekül nachgewiesen.

Die US-PS 4 486 539 beschreibt ein Sandwich-Hybridisierungs-Verfahren. Bei diesem Verfahren werden zwei getrennte Sondenmoleküle verwendet. Eines davon ist eine Detektorsonde. Sie ist markiert und wird zum Nachweis verwendet. Die andere ist eine Einfangsonde. Sie ist an einem festen Träger immobilisiert und dient der Abtrennung der nachzuweisenden Nucleinsäure vom Reaktionsgemisch,

Das Hybridisierungsverfahren in Lösung wird in der GB-OS 2 169 403 beschrieben. Bei diesem Verfahren werden zwei verschiedene Sondenmoleküle verwendet, die sich in derselben Lösung befinden. Die Detektorsonde wird mit einer nachweisbaren Markierung markiert. Die Einfangsonde wird mit einer Gruppe versehen, die eine Affinität für einen anderen Bestandteil aufweist. Nach der Hybridisierung wird das zwischen der Einfangsonde, der nachzuweisenden Nucleinsäure und der Detektorsonde gebildete Hybrid aus der Hybridisierungslösung mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares abgetrennt.

Die enzymatisch katalysierte DNA-Polymerisation, bei der die Nucleotidsequenz eines vorgegebenen Nucleinsäurestranges, d.h. einer Matrize, exakt kopiert wird und dabei der komplementäre Strang synthetisiert wird, ist aus dem Stand der Technik gut bekannt; vgl. z.B. Kornberg, «DNA replication», W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 221-225 und 670-679,1980, und Maniatis et al., «Molecular Cloning, A Laboratory Manual», Colti Spring Harbor Laboratory, S. 122, 1982. Diese biologische Vermehrung wird bei Hybridtsierungs-Nachweisverfahren verwendet, also in Nachweisverfahren, bei denen der nachzuweisende Mikroorganismus gezüchtet und dadurch seine DNA vor der Durchführung des Tests angereichert wird; vgl. z.B. Woo, Methods Enzymol. 68 (1979), S. 389, und US-PS 4 358 535. Spezifische DNA-Sequenzen lassen sich auch in lebenden Zellen amplifizieren, z.B. durch Verwendung geeigneter Arzneistoffe, vgl. z.B. Clewell und Helinski, J. Bacteriol. 110 (1972), S. 1135, und EP-A 55 742. Eine noch spezifischere DNA-Anreicherung wird in der EP-A 175 689 beschrieben. Dabei wird die nachzuweisende Nucleinsäure mit einem Plasmid-Replikon verbunden und in eine geeignete Zelle eingeführt. Eine weitere Methode wird in der EP-A 201 184 beschrieben. Dabei wird die Primer-abhängige DNA-Synthese in einer in vitro-Reaktion zur Amplifikation der nachzuweisenden DNA benützt. In der EP-A 200362 wird ein Verfahren zum Nachweis amplifizierter Nucieinsäure-Sequenzen vorgeschlagen, das jedoch insbesondere zur Durchführung von Reihenuntersuchungen nicht schnell, empfindlich und einfach genug ist.

Dementsprechend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein schnell und einfach durchführbares Verfahren zum Nachweis von geringen Nucleinsäure-Konzentrationen bereitzustellen.

Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe durch die Bereitstellung eines Hybridisierungsverfahrens gelöst, bei dem entweder die Detektorsonden oder die Einfangsonden als modifizierte Primer wirken, die in die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure während einer matrizenabhängigen Polymerisationsreaktion vor der Durchführung der Hybridisierung eingebaut werden, bei dem also die nachzuweisende Nucleinsäure amplifiziert wird.

In einem jeden der erfindungsgemässen Verfahren wird mindestens ein Primer benötigt, der immer modifiziert ist. Wenn die Detektorsonden als Primer bei der Polymerisationsreaktion dienen, weisen die Primer mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle auf, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann.

In einem anderen erfindungsgemässen Verfahren werden die Einfangsonden als Primer bei der Poly-merisationsreaktion verwendet. Dabei weisen die Primer mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine geeignete Stelle auf, an die mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.

Die Erfindung betrifft auch eine Reagenzienkombination und ein Besteck zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die Reagenzienkombination in einem unterteilten Behälter.

Durch die Verwendung der Detektor- oder Einfangsonden als Primer in einer Polymerisationsreaktion ist es möglich, die Empfindlichkeit der Hybridisierungsreaktion um mehrere Grössenordnungen gegenüber Nachweisverfahren zu steigern, bei denen die nachzuweisende Nucleinsäure direkt gemessen wird. Ausserdem wird erfindungsgemäss ein bequemes Verfahren zur Durchführung der Hybridisie-

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rungsreaktion in Lösung bereitgegestellt, so dass die Hybridmoleküle einfach und schnell aus der Hybri-disierungslösung nach der Hybridisierungsreaktion abgetrennt werden können.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist besonders brauchbar zur Diagnose bestimmter Krankheiten, die mit üblichen Verfahren nur sehr schwer zu diagnostizieren sind. Daher ist das erfindungsgemässe Verfahren besonders geeignet zur Identifizierung von Cytomegalie-Viren und HIV- bzw. AIDS-Viren.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 zeigt die Nucleotidsequenz der modifizierten Primer Pa und Pb und der selektiven Sondenmole-küie Si und S2, die in den Beispielen 1 bis 3 verwendet werden. Ferner zeigt sie die relativen Stellen der modifizierten Primer Pa und Pb und der selektiven Sondenmoleküle Si und S2 in der in diesem Fall nachzuweisenden Nucleinsäure. Die durchgehenden Linien A und B bezeichnen die beiden nachzuweisenden Stränge, die in beiden Richtungen weitergehen. Die Pfeilspitzen an den Primern Pa und Pb bezeichnen die Richtung, in der sie während der Polymerisation verlängert werden.

Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz der modifizierten Primer Pa und Pb und des selektiven Sondenmoleküls S, die in Beispiel 4 verwendet werden. Ferner zeigt sie die relativen Stellen der modifizierten Primer Pa und Pb und des selektiven Sondenmoleküls S in der in diesem Falle nachzuweisenden Nucleinsäure. Die Linie A bezeichnet die RNA und ihre identischen DNA-Kopien, und die Linie B zeigt die komplementären DNA-Kopien. Die Pfeilspitzen an den Primern Pa und Pb bezeichnen die Richtung, in der sie bei der Polymerisation verlängert werden.

Präparation von Sondenmolekülen

Die erfindungsgemäss verwendeten Sondenmoleküle sind Oligo- oder Polynucleotide. Sie können synthetisch oder halbsynthetisch hergestellt werden, je nachdem, welche Herstellungsweise für die als Primer zu verwendenden Sondenmoleküle bevorzugt wird. Ausserdem lassen sich die Sondenmoleküle durch DNA-Rekombinationsverfahren oder aus unmittelbar aus der Natur isolierten Nucleinsäuren herstellen. Ein Sondenmolekül kann an einen geeigneten Vektor gebunden werden. Es kann gegebenenfalls Vektorteile enthalten. Eine Reihe erfindungsgemäss verwendbarer Primer und Sondenmoleküle ist im Handel erhältlich.

Die Detektorsonden als modifizierte Primer

In einem der erfindungsgemässen Verfahren sind die Detektorsonden Oligo- oder Polynucleotide, die an die nachzuweisende Nucleinsäure über Basenpaarungen gebunden werden und als Primer für eine matrizenabhängige, enzymatische Nucleinsäuresynthese dienen. Wesentlich ist, dass die als Detektorsonde wirkenden Primer mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweisen, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann.

Als Markierung lassen sich verschiedene radioaktive Isotope oder radioaktiv markierte Verbindungen verwenden. Die Markierungssubstanz kann auch fluoreszieren, lumineszieren, lichtemittieren oder enzymatisch oder immunologisch nachweisbar sein. Es lassen sich auch Markierungen verwenden, die auf der Affinität von Biotin zu Avidin oder Streptavidin beruhen, Lanthanid-Chelate, Ferritin- und Häm-Verbindungen. Weitere Beispiele sind immunologisch nachweisbare Haptene, wie AAF und AIF (Acetoxyacetylfluorenderivate). Die Identifizierung kann auch mit Hilfe von vermittelnden Molekülen, z.B. Proteinen, durchgeführt werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren hängt nicht von der verwendeten Markierung ab. Alle gegenwärtig bekannten Markierungssubstanzen, die für die Hybridisierung von Nucleinsäuren geeignet sind, lassen sich verwenden. Es ist jedoch wesentlich, dass die Markierung aus einer Gruppe von Markierungen ausgewählt wird, die nicht die Funktion des Primers stören, sofern die Detektorsonden als Primer verwendet werden. Der als Detektorsonde verwendete Primer muss so mit der Markierung versehen werden, dass die Nucleinsäure-Polymerase den Primer immer noch als solchen erkennt.

Die Einfanasonden als modifizierte Primer

In einem anderen erfindungsgemässen Verfahren sind die Einfangsonden Oligo- oder Polynucleotide, die an die nachzuweisende Nucleinsäure über Basenpaarungen gebunden werden und als Primer bei einer matrizenabhängigen, enzymatischen Nucleinsäuresynthese wirken. Wesentlich ist, dass die als Ein-fangsonde wirkenden Primer mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweisen, an die mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann. Das Teil oder die Teile des Affinitätspaares lassen sich auch über ein vermittelndes Molekül an den als Einfangsonde wirkenden Primer binden. Die einzigen Bedingungen sind, dass sich das Hybrid aus der Hybridisierungslösung mit Hilfe des Affinitätspaares abtrennen lässt und dass die Funktion des Primers nicht beeinträchtigt wird.

Das Teil des Affinitätspaares ist ein Bestandteil mit einer Affinität für einen anderen Bestandteil. Bei3

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spiele solcher Affinitätspaare sind Biotin - Avidin oder Streptavidin, ein Schwermetallderivat - eine Thiogruppe, verschiedene Homopoiynucleotide, wie Poly dG - Poly dC, Poly dA — Poly dT und Poly dA -Poly U. Es lassen sich aber auch andere Paare von Verbindungen verwenden, vorausgesetzt, dass sie eine ausreichende Affinität für die spezifische Bindung des modifizierten, als Einfangsonde wirkenden Primers, der in die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure eingebaut ist, an den festen Träger aufweisen, Geeignete Affinitätspaare sind auch in immunologischen Verfahren verwendete Liganden und Konjugale.

Die selektive Einfanasonde

In einem der erfindungsgemässen Verfahren, bei dem die Detektorsonde als Primer verwendet wird, wird eine selektive Ëinfangsonde benötigt, um die selektive Abtrennung der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure zu ermöglichen, in die die modifizierten Primer eingebaut sind. Wesentlich ist, dass die Einfangsonden ausreichend homolog zur nachzuweisenden Nucleinsäure sind, um ihre spezifische Hybridisierung mit den Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure zu gestatten und dadurch die selektive Abtrennung und den Nachweis der als Detektorsonde wirkenden Primer zu ermöglichen, die in die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure eingebaut sind.

Die selektive Detektorsonde

In einem anderen erfindungsgemässen Verfahren, bei dem die Einfangsonden als modifizierte Primer verwendet werden, wird eine selektive Detektorsonde benötigt, um den Nachweis der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäuren zu ermöglichen, in die die modifizierten Primer eingebaut sind. Wesentlich ist, dass die Detektorsonde ausreichend homolog zur nachzuweisenden Nucleinsäure ist, um spezifisch mit dieser zu hybridisieren und dadurch die nachzuweisende Nucleinsäure selektiv zu identifizieren. Die Detektorsonden können geeignete, nachweisbare Markierungen aufweisen, beispielsweise die vorstehend genannten.

Reaaenzienkombinationen

Die Detektorsonde als modifizierter Primer

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Reagenzienkombination, enthaltend mindestens einen modifizierten Primer, der mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann, und mindestens eine selektive Einfangsonde, die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares oder mindetens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.

Die Ejnfanasonde als modifizierter Primer

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Reagenzienkombination enthaltend mindestens einen modifizierten Primer, der mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein geeignetes Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann, und mindestens eine selektive Detektorsonde, die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann.

Die Erfindung beschreibt auch ein für den Nachweis von Nucleinsäure geeignetes Besteck. Das Besteck enthält, gegebenenfalls verpackt in einen unterteilten Behälter, eine der vorstehend genannten Reagenzienkombinationen in Verbindung mit mindestens einem der folgenden Reaktanten oder der folgenden Einrichtungen, die beim Testverfahren benötigt werden, d.h. gegebenenfalls ein Gefäss enthaltend mindestens ein Reagens zur matrizenabhängigen Polymerisation, gegebenenfalls ein Gefäss mit den vier Desoxynucleosidtriphosphaten, gegebenenfalls eine für die Durchführung der Polymerisation und der Hybridisierung geeignete Einrichtung, gegebenenfalls eine zum Abtrennen der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure geeignete Einrichtung, und gegebenenfalls eine zum Nachweis der Markierung geeignete Einrichtung. Die bevorzugten Einrichtungen und Reaktanten werden nachstehend näher erläutert.

Beim erfindungsgemässen Verfahren werden zunächst mindestens zwei modifizierte Primer zu einer denaturierten Probenlösung zugegeben. Beide Primer sind entweder als Detektorsonde oder als Einfangsonde wirkende Primer. Dabei lagern sich die modifizierten Primer jeweils an den komplementären Strang der nachzuweisenden Nucleinsäure, d.h. die Matrize, an. Nach der Zugabe eines Enzyms, das matrizenabhängig Nucleinsäure synthetisiert, werden die Primer verlängert. Dieses Verfahren schreitet in vitro mit hoher Ausbeute fort. Dabei werden neue Nucleinsäurestränge geschaffen, die mehrere tausend Nucleotide lang sein können, sofern die gewählten Bedingungen dafür geeignet sind.

Durch Venwendung eines Überschusses der modifizierten Primer kann der Vorgang wiederholt wer4

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den, um komplementäre Kopien der neu synthetisierten Stränge herzustellen, die somit identische Kopien der zunächst verwendeten Matrizen darstellen. Durch Wiederholung dieses Vorgangs wird eine Reaktionskaskade eingeleitet, durch die die nachzuweisende Nucleinsäure vervielfältigt wird. Dieser Vorgang lässt sich so oft wie gewünscht wiederholen, um die gewünschte Nachweisempfindlichkeit zu erhalten. In Fällen, in denen die Konzentration der nachzuweisenden Nucleinsäure nicht extrem niedrig ist, reicht eine Vervielfältigung aus, um die Nucleinsäure nachweisbar zu machen.

Es ist auch möglich, lediglich einen modifizierten Primer beim erfindungsgemässen Verfahren zu verwenden. In diesem Fall wird die Vervielfältigung jedoch nicht so wirksam sein, wie bei der Verwendung von mindestens zwei Primern, da keine Reaktionskaskade eingeleitet wird.

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren kann sowohl DNA als auch RNA bestimmt werden. Falls jedoch die zu bestimmende Nucleinsäure eine RNA ist, ist es bequemer, zunächst eine entsprechende cDNA-Kopie der RNA mit einer reversen Transkriptase anzufertigen und sodann das erfindungsgemässe Verfahren durchzuführen.

Nachdem die modifizierten Primer in die Kopien der zu bestimmenden Nucleinsäuren eingebaut sind, wird das Reaktionsgemisch mit einem geeigneten selektiven Sondenmolekül versetzt, das die zu bestimmende Sequenz und ihre Kopien erkennt, und die Hybridisierung wird unter Bedingungen durchgeführt, die für den gewünschten Hybridisierungsvorgang geeignet sind.

Bei der Hybridisierungsreaktion wird je nach Wahl der modifizierten Primer entweder eine selektive Éinfangsonde oder eine selektive Detektorsonde mit den Kopien der zu bestimmenden Nucleinsäure hybridisiert, die nunmehr in vielfachen Mengen gegenüber der Ausgangssituation vorliegt.

Falls die ursprüngliche Probe die nachzuweisende Sequenz enthält, hybridisiert das selektive Sondenmolekül mit den neu synthetisierten Kopien der zu bestimmenden Nucleinsäure. Es wird ein Hybrid zwischen dem kopierten Molekül, in das der modifizierte Primer eingebaut ist, und dem selektiven Sondenmolekül gebildet. Die gebildeten Hybride lassen sich erfindungsgemäss aus der Hybridisierungslö-sung in einfacher Weise mit Hilfe des Teils des Affinitätspaares abtrennen, die entweder an dem als Einfangsonde wirkenden Primer oder an der selektiven Einfangsonde befestigt ist. Während der Fraktionierung bleiben die Hybride, die einen solchen Einfangteil aufweisen, an einem festen Träger mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares haften. Die Menge der selektiven Detektorsonde oder des als Detektorsonde wirkenden Primers, die am Träger haften bleibt, kann in an sich bekannter Weise direkt am Trägermaterial oder nach der Elution im Eluat bestimmt werden. Die ermittelte Menge der Markierung ist ein Mass für die Menge der zu bestimmenden Nucleinsäure.

Vor der Fraktionierung wird die Lösung gegebenenfalls verdünnt, um die Bedingungen vorteilhaft für das Affinitätspaar zu beeinflussen. Sodann wird die Lösung mit dem festen Träger in Berührung gebracht. Der zu verwendende Träger kann beispielsweise eine Affinitätschromatographiesäule, ein Filter, eine Plastikoberfläche oder eine Glasoberfläche sein. Günstige Einrichtungen zur Durchführung der Abtrennung sind unterschiedliche Typen von Mikrotiterplatten, Eintauchsystemen oder magnetischen Teilchen. Es ist aber auch möglich, die Abtrennung in Teströhrchen oder mit Körnchen durchzuführen.

Als Trägermaterial kann für die Affinitätschromatographiesäule beispielsweise ein natürliches oder synthetisches Polymer, wie die Cellulose, Polyacrylamid, Polystyrol, Dextran oder Agarose, verwendet werden. Diese Materialien können auch als Suspensionen in einem Teströhrchen eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Teströhrchen verwendet, an deren innerer Oberfläche das andere Teil des Affinitätspaares gebunden ist. Eine Voraussetzung für das ausgewählte Material ist, dass es die Bindung eines Bestandteils mit Affinität zu dem Teil des Affinitätspaares gestattet, an den als Einfangsonde wirkenden Primer oder die selektive Einfangsonde gebunden ist.

Es ist nicht erforderlich, das Teil oder die Teile des Affinitätspaares an den als Einfangsonde wirkenden Primer zu Beginn der Polymerisation zu binden. Auch ist es nicht notwendig, die nachweisbare Markierung an den als Einfangsonde wirkenden Primer vor der Polymerisation zu binden. Sie können auch nach der Polymerisation an den modifizierten Primer angelagert oder gebunden werden, der in die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure eingebaut ist. Wenn beispielsweise die nachweisbare Markierung bei den Hybridisierungsbedingungen nicht beständig ist, kann sie auch nach der Hybridisierung der selektiven Einfangsonde mit den Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure zugegeben werden.

Wenn die Detektorsonden als modifizierte Primer wirken, die in die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure eingebaut sind, lässt sich das Hybrid aus dem Reaktionsgemisch mit Hilfe selektiver Einfangsonden abtrennen, die an festen Trägern immobilisiert sind. Bei einem derartigen Verfahren wird die Reaktionsgeschwindigkeit dadurch begrenzt, dass die nachzuweisende Nucleinsäure und ihre Kopien, in die die als Detektorsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit der selektiven Einfangsonde hybridisieren müssen, die an einem festen Träger immobilisiert ist. Deshalb wird bei der vorliegenden Erfindung die Hybridisierung in Lösung bevorzugt. Falls das Verfahren jedoch mit einer immobilisierten Einfangsonde durchgeführt wird, wird das am festen Träger gebildete Hybrid gewaschen, und die Menge der Markierung am Trägermaterial wird in an sich bekannter Weise gemessen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

Nachweis von Cvtomeaalievirus-DNA mitais modifizierte Primer wirkenden Detektorsonden

In diesem erfindungsgemässen Beispiel wird als nachzuweisende Nucleinsäure das rekombinante Plasmid pBR322/CMV Hindlil L verwendet. Dieses enthält ein 12,3 kb Fragment des Cytomegalievirus-Genoms (CMV, ÂD 169, ATCG VR-538). Die beiden als Detektorsonde verwendeten Primer Pa und Pb (vgl. Fig. 1) haben eine Länge von 20 Nucleotiden und wurden in an sich bekannter Weise mit einem automatischen DNA-Synthesegerät synthetisiert. Sie entsprechen zwei Regionen der CMV-spezifischen Insertion, die 111 Nucleotide voneinander entfernt sind. Die beiden selektiven Einfangsonden Si und S2 (vgl. Fig, 1) erkennen Bereiche in jedem der beiden DNA-Stränge, die zwischen den beiden als Detektorsonde wirkenden Primern liegen. Die als Detektorsonde wirkenden Primer Pa und Pb werden mit 32P an ihren 5'-Enden so markiert, dass ihre spezifische Aktivität 4x109 CPM/jig beträgt. Die Markierung wird in an sich bekannter Weise mit Polynucleotidkinase und Gamma-32P-ATP durchgeführt; vgl. Maniatis et aL, «Molecular Cloning, A Laboratory Manual», Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

Die 3'-Enden der Einfangsonden werden mit biotinylierten Nucleotiden versehen. Dabei wird Bio 11-dUTP (BRL) und eine terminale Transferase (Promega Biotech.) verwendet; vgl. Riley et al., DNA 5 (4) (1986), S. 333-337. Das nachzuweisende Plasmid wird durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert. DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, wurde bei Boehringer-Mannheim und Streptavidin-Agarose bei BRL gekauft.

Mit diesen Reagenzien wird das folgende Experiment durchgeführt:

Es werden vier unterschiedliche Reaktionen durchgeführt, die 0, 104, 106 und 108 Moleküle des nachzuweisenden Plasmids enthalten. Dies entspricht 0,2x10-20, 2x10"18 bzw. 2x10-16 Mol. Weitere Bestandteile des Gesamtreaktionsvolumens von 50 jil sind 2 pMol der beiden Primer, 0,5 mM von jedem der vier Desoxynucleosidtriphosphate (d.h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCIa, 50 mM NaCI und 10 mM Dithiothreitol. Das Reaktionsgemisch wird 2 Minuten auf 100°C erhitzt und dann 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschliessend wird 1 jil (1 Einheit) DNA-Polymerase zugegeben. Das Gemisch wird nochmals 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Das Aufkochen und das anschliessende Anlagern der als Detektorsonde wirkenden Primer sowie die Inkubation mit der DNA-Polymerase bei 37°G ist ein DNA-Synthesezyklus. Bei diesem Experiment wird der Reaktionszyklus entweder nur einmal durchgeführt oder 5- oder 15mal wiederholt. Nach dem letzten Reaktionszyklus wird die Probe nochmals auf 100°C erhitzt. Sodann werden 100 pMol der selektiven Einfangsonde und 0,9M NaCI, 20 mM EDTA, 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5) und 0,1% Natriumdodecylsulfat zugegeben. Das Gesamtvolumen beträgt 100 ni. Die angegebenen Konzentrationen sind die Endkonzentrationen. Das Gemisch wird sodann 1 Stunde bei 50°C inkubiert. Nach dieser Hybridisierungsreaktion werden 200 jil einer 25%igen Suspension von Streptavidin-Agarose in 1M NaCI, 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5) und 1 mM EDTA zugegeben. Es wird 15 Minuten bei 37°C in einem Rotationsmischer inkubiert, damit die biotinylierten Moleküle an die Streptavidin-Agarose binden können. Die Agarose wird kurz abzentrifugiert und der Überstand wird abgebaut. Sodann wird die Agarose einmal mit gepufferter IM NaCl-Lösung und zweimal mit einer Lösung enthaltend 150 mM NaCI, 15 mM Natriumeitrat und 0,2% Natriumdodecylsulphat (pH 8) bei 37°C gewaschen. Sodann wird die durch die gebildeten Hybride an die Agarose gebundene Radioaktivität mit einem Zählgerät bestimmt. Das Isolierungs- und Waschverfahren der die biotinylierten Markierungen enthaltenden DNA-Hybride erfolgt wie in der GB-A 2 169 403.

Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle I zusammengefasst. Aus Tabelle I ergibt sich, dass bei einem einzigen DNA-Synthesezykius nur dann genügend Radioaktivität für den Nachweis eingebaut wird, wenn hohe Ausgangskonzentrationen der nachzuweisenden Nucleinsäure vorliegen. Werden jedoch 15 DNA-Synthesezyklen durchgeführt, lassen sich selbst sehr geringe Mengen dieser nachzuweisenden Nucleinsäure nachweisen. Bei einer grossen Menge der nachzuweisenden Nucleinsäure und 15 DNA-Synthesezyklen wird die Reaktion durch die Menge des als Detektorsonde wirkenden Primers begrenzt.

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Tabelle l

Menge der nach- 32P-Aktivität in den gesammelten Hybriden*

zuweisenden (CPM über Hintergrund)13

Nucleinsäure -[ 5 15 Anzahl der DNA-(MqI) Synthesezyklen

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2 x 10~20

ND

650

2x10"18

ND

300

11 000

2x10~16

700

13 000

36 000

a Mittelwert aus zwei Messungen b ND: nicht nachweisbar (weniger als zweimal soviel Radioaktivität wie die mitt-lere Hintergrundaktivität)

Beispiel 2

Bestimmung von Cvtomeaalievirus-DNA mit Einfanasonden als modifizierte Primer

Bei diesem erfindungsgemässen Beispiel werden die Einfangsonden als Primer verwendet. Bis auf die nachfolgend genannten Abweichungen werden die gleichen Reagenzien wie in Beispiel 1 verwendet. Die als Einfangsonde wirkenden Primer Pa und Pb (vgl. Fig. 1) werden nicht mit 32P markiert. Statt dessen werden ihre 5'-Enden mit einem Biotinrest versehen. Diese chemische Modifizierung wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, vgl. Chollet und Kawashima, Nucleic Acids Research, 13 (1985), S. 1529 — 1541. Die beiden selektiven Sondenmoleküle Si und S2 (vgl. Fig. 1) werden in diesem Experiment an ihren 5'-Enden markiert. Sie werden als Detektorsonden verwendet. Ihre spezifischen Aktivitäten sind 2 x 109 bzw. 2,5 x 109 cpm/ng.

Die Reaktionsgemische haben die in Beispiel 1 beschriebene Zusammensetzung. Die biotinylierten, als Einfangsonde wirkenden Primer, werden jedoch in 10facher Menge zugefügt, d.h. 20 pM pro Reaktion. Wie in Beispiel 1 beschrieben, werden 1,5 oder 15 DNA-Synthesezyklen durchgeführt. Sodann werden die Proben auf 100°C erhitzt und 0,5 pM von jedem der 32P-markierten Sondenmoleküle Si und Sg werden zugegeben. Die Hybridisierung wird unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen durchgeführt.

Die Hybride werden sodann an Streptavidin-Agarose gesammelt, gewaschen und die 32P-Aktivität wird wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst.

Tabelle II

Menge der nach- 32P-Aktivität in den gesammelten Hybriden®

zuweisenden (CPM über Hintergrund)0

Nucleinsäure ■) 5 15 Anzahl der DNA-(M°Q Synthesezyklen

0

2x10~20

ND

800

2x10~18

ND

400

13000

2x10~16

300

11 000

54000

a Mittelwert aus zwei Messungen b ND: nicht nachweisbar (vgl. Beispiel 1)

Beispiel 3

Nachweis von Cvtomeaalievirus-DNA aus klinischen Proben mit Einfanasonden als modifizierte Primer

In diesem Beispiel wird gezeigt, dass das erfindungsgemässe Verfahren zur Untersuchung klinischer Proben geeignet ist. Dies erfolgt durch den Nachweis von CMV aus dem Urin eines Kindes, das bekann-termassen an einer Cytomegalîevîrus-lnfektion leidet. Der Urin eines gesunden Kindes wird dabei als Kontrolle verwendet. Aus zwei Proben mit jeweils 10 ml Urin wird die Gesamt-DNA isoliert nach der Vor-

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schritt von Virtanen et al., J. Clin. Microbiol. 20 (6) (1984), S. 1083-1088. Die in 20 jxl H2O gelösten DNA's werden als nachzuweisende Nucleinsäure in gemäss Beispiel 2 ausgeführten Reaktionen verwendet Nach 10 DNA-Synthesezyklen wird die Probe mit dem markierten, selektiven Sondenmolekül versetzt. Sodann wird die Hybridisierung durchgeführt und die Hybride werden gesammelt. Die DNA aus dem Urin des Patienten zeigt in den Hybriden eine deutlich erhöhte Radioaktivität, während die des gesunden Kindes lediglich Hintergrund-Radioaktivität zeigt. Die tatsächlichen cpm-Werte sind 2300 bzw. 240.

Beispiel 4

Nachweis von SFV fSemliki Forest-VirusVRNA mit Einfanasonden als modifizierte Primer

Beispiel 4 zeigt, dass das erfindungsgemässe Verfahren auch für den Nachweis von RNA geeignet ist Als Modellsystem wird SFV (Semliki Forest-Virus)-RNA verwendet.

Die verwendeten Reagenzien sind zwei 5'-biotinylierte, als Einfangsonde wirkende Primer (vgl. Fig. 2), die wie In Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurden, eine einzige 5'-32P-markierte, selektive Detektorsonde, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, reverse Transkriptase (Promega Biotech) und DNA-Polymerase, Klenow-Fragment (Boehringer Mannheim).

Der erste Schritt beim Nachweis der SFV-RNA ist die Synthese einer cDNA-Kopie. In 20 jtl Reaktionsgemisch sind 10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KCl, 10 mM MgCfe, 10 mM Dithiothreitol, 0,5 mM von jedem der vier Desoxynucleosidtriphosphate, 0,5 ng t-RNA, 10 pg SFV-RNA, 10 pM als Einfangsonde wirkender Primer Pa und 100 Einheiten reverse Transkriptase enthalten. Dieses Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei 37°C inkubiert Sodann wird das Gemisch 5 Minuten auf 100°C erhitzt und bei Umgebungstemperatur abgekühlt Anschliessend wird das Reaktionsgemisch mit 50 |il einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 50 mM NaCI, 10 mM MgCfe, 10 mM Dithiothreitol, 10 pM des als Einfangsonde wirkenden Primers Pb und mit 0,5 mM von jedem der vier Desoxynucleosidtriphosphate versetzt. Die Temperatur wird auf 37°C erhöht Nach 5 Minuten wird 1 Einheit DNA-Polymerase zugegeben. Es wird 10 Minuten inkubiert und das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten auf 100°C erhitzt Sodann wird das Reaktronsgemisch auf 37°C abgekühlt Insgesamt werden 5 DNA-Synthesezyklen durchgeführt. Nach einem letzten Denaturierungsschritt werden 0,1 pMol (1,2 x 106 cpm) der selektiven Detektorsonde in 80 nl 1M NaCI, 50 mM EDTA, 50 mM Natriumphosphat (pH 7,5) und 0,1% Natriumdodecylsulfat zugegeben. Die Lösung wird 2 Stunden bei 55°C inkubiert. Anschliessend werden die Hybride gesammelt und wie in Beispiel 1 beschrieben gewaschen.

Als negative Kontrolle für die Reaktionen wird eine identische Probe in gleicher Weise behandelt, jedoch ohne Zugabe der reversen Transkriptase. Die Probe, in der ausgehend von der RNA mit reverser Transkriptase eine cDNA-Kopie hergesteilt wurde, ergibt eine 32P-Aktivität von 420 cpm in den eingefangenen Hybriden, während die negative Kontrolle lediglich 50 cpm ergibt

Beispiel 5

Vergleich verschiedener Methoden zum Nachweis von vervielfältigter DNA

In diesem Beispiel werden drei Methoden zum Nachweis von vervielfältigter DNA verglichen. Es werden die Reagenzien und das Vervielfältigungsverfahren von Beispiel 1 und 2 verwendet. Jedqch werden als selektive Einfang- oder Detektorsonden M13-Clone verwendet, die etwa 100 Nucleotide zwischen den Primern erkennen.

Die M13-Cione werden durch Subclonierung eines Haelll-Restriktionsfragmentes des rekombinanten Plasmids pBR322/CMV Hindlll L in den Phagen Vektor M13mp10 in üblicher Weise erhalten. Die als selektive Einfangsonden zu verwendenden M13-Clone werden unter Verwendung von Photoprobe®-Bio-tin (Vector Laboratories) mit Biotin modifiziert. Die als selektive Detektorsonden zu verwendenden Myelone werden mit 32P-dCTP unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Primer-Verlängerung markiert, so dass die spezifische Aktivität 2x108 cpm/ng beträgt; vgl. Hu und Messing, Gene 17 (1982), S. 271-277.

Jetzt werden 10 Vervielfältigungscyclen von 3x105 Molekülen (0,5x10-15 Mol) des lînearisîerten Plasmids pBR322/CMV Hindlll L durchgeführt. Zum Nachweis nach der Methode 1 und 2 werden jeweils 2 pMol der 32P-markierten, als Detektorsonde wirkenden Primer Pa und Pb verwendet Das Vervielfältigungsverfahren wird gemäss Beispiel 1 durchgeführt. Zum Nachweis nach der Methode 3 werden 25 pMol der biotinylierten als Einfangsonde wirkenden Primer im Vervielfältigungsverfahren verwendet Dabei wird die Reaktion wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.

Ergebnisse der Nachweismethode 1 : Verwendung einer selektiven Einfangsonde zum Einsammeln der in Lösung mit den Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure gebildeten Hybride.

Bei dieser Nachweismethode werden biotinylierte selektive M13 Einfangsonden zum Einsammeln der vervielfältigten DNA-Fragmente verwendet. Nach dem letzten Vervielfältigungscyclus wird das Probengemisch auf 100°C erhitzt und mit jeweils 2 x 109 Molekülen der biotinylierten, selektiven Anfangs8

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sonden sowie mit NaCI (0,6 M), EDTA (5 mMol) Natriumphosphat (20 mMol) und SDS (0,1%) versetzt. Angegeben sind die Endkonzentrationen in einem Endvolumen von 100 jil. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei 65°C inkubiert. Die gebildeten Hybride werden an Streptavidin-Agarose wie in Beispiel 1 beschrieben, abgetrennt, jedoch wird zusätzlich zweimal jeweils 1 Minute bei 50°C mit 15 mM NaCI, 1,5 mM Natriumeitrat und 0,2% SDS gewaschen. Die Radioaktivität der abgetrennten Hybride wird gemessen.

Nachweismethode 2: Verwendung von vor der Hybridisierung mit den Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure immobilisierten, selektiven Einfangsonden

Bei dieser Methode werden immobilisierte, selektive M13-Sondenmoleküie zum Einfangen der vervielfältigten DNA verwendet. Nach den letzten Vervielfältigungscyclen werden die Proben auf 100°C erhitzt. Sodann werden sie mit NaCI (0,6 M), Natriumeitrat (60 mM), Ficoll® (0,02%), Polyvinylpyrrolidon (0,02%), Rinderserumalbumin (0,02%) und denaturierter Heringspermien-DNA (0,2 mg/ml) versetzt. Wie angegeben, sind die Endkonzentrationen in einem Endvolumen von 100 p.l. Sodann wird jede Probe mit einer Nitrocellulosefilterscheibe versetzt, an der 5x1010 Moleküle von jedem der selektiven Sondenmoleküle nach dem in der US-PS 4 486 539 beschriebenen Verfahren immobilisiert sind. Das Gemisch wird 2 oder 18 Stunden bei 65°C mit Filtern inkubiert. Nach der Hybridisierung werden die Filter zweimal jeweils 20 Minuten bei 50°C mit 15 mM NaCI, 1,5 mM Natriumeitrat und 0,2% SDS gewaschen und die an die Filter gebundene Radioaktivität wird gemessen.

Nachweismethode 3: Verwendung einer selektiven Detektorsonde zum Nachweis

Bei dieser Methode werden 32P-markierte, selektive Ml3-Detektorsonden zum Nachweis der vervielfältigten DNA verwendet. Die Hybride werden mit Hilfe der als Anfangssonde wirkenden Primer abgetrennt, die an ihren 5'-Enden gemäss Beispiel 2 biotinyliert sind. Die vervielfältigten Proben werden auf 100°C erhitzt und mit 2x 108 Molekülen (2x 105 cpm) von jedem der 32P-markierten, selektiven Sondenmoleküle wie bei Nachweismethode 1 mit Salzen versetzt. Die Hybridisierung und die Abtrennung der gebildeten Hybride wird gemäss Nachweismethode 1 durchgeführt.

Die bei den drei Nachweismethoden erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle III zusammengefasst und verglichen.

Die Methoden 1 und 3 haben den Vorteil einer höheren Hybridisierungsgeschwindigkeit in Lösung, verglichen zur Filterhybridisierung bei der Methode 2. Die höchste 32P-Aktivität wird bei der Methode 3 erhalten, da die selektive Detektorsonde viele 32P-Atome pro Molekül enthält.

Tabelle III

Methode

Primer

Selektives M13-Sonden-moiekül

Hybridisie-

rungszeit,

Std.

32P-Aktivität in den Hybridmolekülen (cpmf

1

32P-markierter Primer als Detektorsonde biotinylierte Einfangsonde

2

870

2

32P-markierter Primer als Detektorsonde immobilisierte Einfangsonde

2 18

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3

biotinylierter Primer als Einfangsonde

32P-markierte Detektorsonde

2

7800

a Mittel aus drei Messungen (cpm über Hintergrund)

Beispiel 6

Vervielfältigung von Cvtomeaalievirus-DNA mit biotinvliertem als Detektorsonde wirkenden Primern und indirekte Bestimmung mit Streotavidin-Meerrettich-Peroxidase

Bei diesem Beispiel wird die Vervielfältigung des CMV-Plasmids (pBR322/CMV Hindlll L) mit den als Detektorsonde wirkenden, biotinylierten Primern Pa und Pb gemäss Beispiel 2 durchgeführt. Die in Beispiel 5 beschriebenen M13-Clone werden mit Sulfongruppen modifiziert und als selektive Einfangsonden verwendet. Die gebildeten Hybride werden in den Bohrungen von Mikrotiterplatten abgetrennt, die mit Disuifon-modifizierte DNA erkennenden Antikörpern beschichtet sind. Der Nachweis der gebildeten Hybride wird schliesslich mit einem Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat durchgeführt, das die Biotinreste der Primermoleküle nachweist.

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Die M13-CIone werden durch eine Sulfonierungsreaktion modifiziert. Dabei werden die von der Firma Orgenics Ltd (Yavne, Israel) empfohlenen Reagenzien und Verfahren verwendet. Polystyrol-Mikroti-terplatten (Nunc, Dänemark) werden mit 10 ng/ml IgG in 10 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH 9,6) über Nacht bei 4°C beschichtet. Das IgG wurde durch Reinigung eines monoclonalen Antikörpers gegen mit Sulfongruppen modifizierte DNA erhalten (Orgenics Ltd.).

Reaktionsgemische enthalten 3x105 Moleküle des linearisierten Plasmids pBR322/GMV Hindlll L oder Kontrollen ohne Plasmid und 25 pMol von jedem der biotinylierten Primer Pa und Pb werden unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen 10 Vervielfältigungscyclen unterworfen. Die Proben werden auf 100°C erhitzt und dann mit jeweils 2 x 109 Molekülen von jeder der sulfonierten, selektiven Einfangsonden zusammen mit den in Beispiel 5 für die Methode 1 angegebenen Reagenzien versetzt.

Das Gemisch wird 2 Stunden bei 65°C inkubiert, mit 100 fil 0,2% Tween 20 verdünnt und in die beschichteten Mikrotiterpiatten überführt. Die Hybride werden 2 Stunden bei 37°G an die Bohrungen der Mikrotiterplatte gebunden. Das Reaktionsgemisch wird verworfen und die Bohrungen werden jeweils 3mal mit 0,1% Tween 20 in 0,15 molar Natriumchlorid, 20 mM Natriumphosphat (pH 7,5) (PBS) gewaschen. Es werden 200 jtl eines Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugats (Amersham, UK) zugesetzt, das 1:2000 in einer einprozentigen Rinderserumalbumin-Lösung mit 0,1% Tween 20 in PBS verdünnt ist. Die Bohrungen der Mikrotiterplatte werden 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Auf diese Weise wird viermal gewaschen, Sodann werden 200 |il einer Substratlösung, bestehend aus 0,46 mg/ml o-Phenylendiamin, 0,01% H2O2 in 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH 5,0) zugegeben. Nach 15 Minuten bei 22° wird die Umsetzung durch Zugabe von 50 nl 2N H2SO4 gestoppt, und die Absorption des farbigen Reaktionsprodukts bei 492 nm wird mit einem Photospektrometer gemessen. Diese Abtrennungs- und Nachweisverfahren wurden bereits von Syvänen et al in Nucleic Acids Res. 14 (1986), S. 5037-5048 beschrieben.

Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle IV zusammengefasst. 3x105 Moleküle (0,5x 10~18 Mol) des nachzuweisenden Plasmids sind nach 10 Vervielfältigungscyclen deutlich nachweisbar.

Tabelle IV

Menge der nachzuweisenden Absorption bei 492 nma

Nucleinsäure (Mol)

0,5x10~18 0,348

0 0,120

a Mittelwert aus drei Messungen.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren durch Hybridisierung, dadurch gekennzeichnet, dass man dabei als Éinfangsonden Primer verwendet, die mindestens einen geeigneten Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweisen, an die mindestens ein geeigneter Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann, welche Einfangsonden in Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure eingebaut werden, und sodann die Kopien durch mindestens eine selektive Detektorsonde nachweist,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) mindestens einen Primer der nachzuweisenden Nucleinsäure mit mindestens einem Teil eines Affinitätspaares oder mit mindestens einer spezifischen Stelle bereitstellt, an der mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann;

(b) den oder die als Einfangsonde wirkenden Primer mit der einzelsträngigen, nachzuweisenden Nucleinsäure unter Bedingungen reagieren lässt, die eine matrizenabhängige Polymerisationsreaktion gestatten;

(c) die einzelsträngigen Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure, in die die als Einfangsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit einer Detektorsonde hybridisiert, die selektiv mit der nachzuweisenden Nucleinsäure zu hybridisieren vermag;

(d) die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure, in die die als Einfangsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit Hilfe des anderen Teils des Affinitätspaares abtrennt; und

(e) die vorliegenden selektiven Detektorsonden nachweist, die mit den Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure hybridisiert haben.

3. Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren durch Hybridisierung, bei dem man als Detektorsonden Primer verwendet, die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweisen, an die mindestens eine geeignete, nachweisbare Markierung gebunden werden kann, welche Detektorsonden in Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäuren eingebaut werden, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäuren, in die die Detektorsonden eingebaut sind, zuerst mit mindestens einer selektiven Einfangsonde hybridisiert, das gebildete Hybrid mit Hilfe der Einfangsonde abtrennt und sodann das vorliegende Hybrid nachweist.

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4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) mindestens einen Primer der nachzuweisenden Nucleinsäure mit mindestens einer nachweisbaren Markierung oder mindestens einer spezifischen Stelle bereitstellt, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann;

(b) den oder die als Detektorsonde wirkenden Primer mit der einzelsträngigen, nachzuweisenden Nucleinsäure unter Bedingungen reagieren lässt, die eine matrizenabhängige Polymerisationsreaktion gestatten;

(c) die einzelsträngigen Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure, in die die als Detektorsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit einer Einfangsonde hybridisiert, die selektiv mit der nachzuweisenden Nucleinsäure zu hybridisieren vermag;

(d) die Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure, in die die als Detektorsonde wirkenden Primer eingebaut sind, mit Hilfe der selektiven Einfangsonde abtrennt; und

(e) die vorliegenden Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäuren nachweist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die selektive Einfangsonde mindestens einen Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.

6. Reagenzienkombination zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 3 zum Nachweis von Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass sie folgende Bestandteile enthält:

(a) als Detektorsonde mindestens einen Primer einer nachzuweisenden Nucleinsäure, der mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann; und

(b) mindestens eine Einfangsonde, die selektiy mit der nachzuweisenden Nucleinsäure zu hybridisieren vermag und mindestens einen Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann.

7. Reagenzienkombination zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 zum Nachweis von Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass sie folgende Bestandteile enthält:

(a) als Einfangsonde mindestens einen Primer einer nachzuweisenden Nucleinsäure, der mindestens einen Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann; und

(b) mindestens eine Detektorsonde, die selektiv mit der nachzuweisenden Nucleinsäure zu hybridisieren vermag und mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann.

8. Besteck zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 3 zum Nachweis von Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Bestandteile enthält:

(a) als Detektorsonde mindestens einen Primer einer nachzuweisenden Nucleinsäure, der mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann;

(b) mindestens eine Einfangsonde, die selektiv mit der nachzuweisenden Nucleinsäure zu hybridisieren vermag und mindestens einen Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann;

(c) ein Gefäss, enthaltend mindestens ein Reagens zur matrizenabhängigen Polymerisation; und/oder

(d) ein Gefäss mit den vier Desoxynucleosidtriphosphaten; und/oder

(e) eine Einrichtung zur Durchführung der Polymerisation und der Hybridisierung; und/oder

(f) eine Einrichtung zum Abtrennen der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure; und/oder

(g) eine Einrichtung zum Nachweis der Markierung.

9. Besteck zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 zum Nachweis von Nucleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Bestandteile enthält:

(a) als Einfangsonde mindestens einen Primer der nachzuweisenden Nucleinsäure, der mindestens einen Teil eines Affinitätspaares oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens ein Teil eines Affinitätspaares gebunden werden kann;

(b) mindestens eine Detektorsonde, die selektiv mit der nachzuweisenden Nucleinsäure zu hybridisieren vermag und die mindestens eine nachweisbare Markierung oder mindestens eine spezifische Stelle aufweist, an die mindestens eine nachweisbare Markierung gebunden werden kann;

(d) ein Gefäss mit den vier Nucleosidtriphosphaten; und/oder

(f) eine Einrichtung zur Abtrennung der Kopien der nachzuweisenden Nucleinsäure; und/oder

(g) eine Einrichtung zum Nachweis der Markierung.

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