[go: up one dir, main page]

CA2764584A1 - Composition de complexe prothrombique - Google Patents

Composition de complexe prothrombique Download PDF

Info

Publication number
CA2764584A1
CA2764584A1 CA2764584A CA2764584A CA2764584A1 CA 2764584 A1 CA2764584 A1 CA 2764584A1 CA 2764584 A CA2764584 A CA 2764584A CA 2764584 A CA2764584 A CA 2764584A CA 2764584 A1 CA2764584 A1 CA 2764584A1
Authority
CA
Canada
Prior art keywords
protein
factor
eluate
hydroxyapatite
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Abandoned
Application number
CA2764584A
Other languages
English (en)
Inventor
Jacques Chabbat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB SA
Original Assignee
LFB SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LFB SA filed Critical LFB SA
Publication of CA2764584A1 publication Critical patent/CA2764584A1/fr
Abandoned legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'une composition ou concentré de complexe prothrombique comprenant les facteurs de coagulation II, VII, IX et X, ledit procédé comprenant les étapes consistant à fournir un surnageant d'un cryoprécipité de plasma, à appliquer ledit surnageant sur une résine échangeuse d' anions pour obtenir un éluat contenant ledit complexe et des protéines de haut poids moléculaire et à appliquer ledit éluat sur une colonne d' hydroxyapatite pour obtenir un second éluat contenant ledit complexe. L' invention fournit encore une composition susceptible d'être obtenue par ce procédé.

Description

COMPOSITION DE COMPLEXE PROTHROMBIQUE

DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de préparation d'une composition ou concentré de complexe prothrombique comprenant les facteurs de coagulation II, VII, IX et X. L'invention fournit encore une composition susceptible d'être obtenue par ce procédé.

ETAT DE LA TECHNIQUE

La mise à disposition de concentrés de protéines dépendantes de la vitamine K et, plus particulièrement, de concentrés de complexe prothrombique comprenant les Facteurs de coagulation II, VII, IX et X (également appelé PPSB) est primordiale pour prévenir ou traiter les accidents hémorragiques chez les patients hémophiles qui souffrent d'un déficit en l'un ou plusieurs des facteurs de la coagulation et/ou qui souffrent d'un déficit pour certaines protéines de haut poids moléculaires.

Lors d'un épisode hémorragique, les patients sont soumis à un traitement par le PPSB et reçoivent par conséquent des doses importantes de protéines plasmatiques usuellement co-purifiées avec le PPSB, qui peuvent entraîner l'apparition d'effets secondaires tels que des chocs anaphylactiques, des réactions de type inflammatoire et des problèmes de tolérance. C'est notamment le cas avec les Immunoglobulines M et les facteurs C3a, C4a ou C5a, également appelés anaphylatoxines, qui résultent de l'activation des facteurs C3, C4, C5. Les facteurs C3a, C4a et C5a (particulièrement le C3a) sont impliqués dans l'inflammation allergique. L'activation des mastocytes et des basophiles par les fragments C5a et C3a du complément entraîne en effet la libération de leucotriènes et
2 d'histamine, à l'origine d'une augmentation de la perméabilité capillaire, d'une bronchoconstriction et d'une vasodilatation.
Afin d'éviter la formation de ces fragments au cours du procédé de purification des facteurs vitamine-K
dépendant, il est donc préférable d'éliminer leur précurseurs respectifs à savoir les facteurs C3, C4 ou C5 du système du complément.

Les concentrés de PPSB disponibles commercialement à
ce jour, tels que le Kaskadil (du Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies) comprennent tous une proportion importante (environ 80%) de protéines contaminantes autres que les Facteurs II, VII, IX et X
composant le PPSB. La protéine vitamine-K-dépendant dont la concentration est la plus importante est la prothrombine ou facteur II (avec une concentration de l'ordre de 4,5 mg/ml pour une concentration de protéines totales dans le Kaskadil d'environ 35-45 mg/ml).
Il existe par conséquent un besoin important pour un procédé autorisant un plus haut degré de purification du PPSB, et susceptible de préserver l'activité et la proportion respective des Facteurs II, VII, IX et X qui le composent.
Le document EP-A-0528701 (Association pour l'essor de la transfusion sanguine) décrit un procédé de préparation de thrombine humaine destiné à un usage thérapeutique et comprenant des étapes successives de purification d'un surnageant de cryoprécipité de plasma sur une résine DEAE-Sephadex A50, de recalcification et d'inactivation virale de l'éluat contenant le PPSB.
Le document US-P-4411794 décrit un procédé de purification des facteurs de coagulation II, VII, IX et X
comprenant une étape d'adsorption d'un surnageant de précipitation du plasma avec du sulfate d'ammonium sur un support minéral de type hydroxyapatite en présence d'ions calcium, suivie d'une étape de purification sur silice
3 colloïdale et d'une dialyse. Il apparaît toutefois que le concentré de PPSB qui en résulte comprend de nombreuses protéines contaminantes et ne possède pas le degré de pureté requis pour répondre aux critères actuels en matière de sécurité sanitaire des produits dérivés du sang. Le sulfate d'amonium n'est en particulier pas adapté à une utilisation thérapeutique et présente une toxicité relative.
Le document US-P-4272523 décrit un procédé de fractionnement du plasma à partir d'un surnageant de cryoprécipité de plasma. Ce brevet décrit notamment la préparation d'un concentré de PPSB en cumulant les étapes d'adsorption du surnageant de cryoprécipité sur silice colloïdale, de dialyse/ultrafiltration, d'adsorption sur phosphate tricalcique de type hydroxyapatite, et d'adsorption sur résine échangeuse d'anions de type DEAE-Sephadex. Il apparaît toutefois que l'étape de purification sur silice colloïdale utilisée pour éliminer les protéines de haut poids moléculaire telles que le fibrinogène et que l'étape de purification sur phosphate tricalcique se déroulent sous la forme d'une adsorption par lot (en batch) , une forme de mise en oeuvre qui, par sa faible reproductibilité et sa difficulté
d'automatisation, se révèle difficile à mettre en oeuvre à
une échelle industrielle. En effet le phosphate tricalcique est difficilement maîtrisable car il se présente sous forme de poudre sensible à l'hygrométrie et dont les caractéristiques intrinsèques peuvent varier en fonction des lots. Le procédé du document US-P-4272523 s'avère donc inadapté pour la préparation à grande échelle de concentrés de PPSB destinés à un usage thérapeutique.
Le document EP-A-0832200 décrit un procédé de purification d'une composition de FXI recombinant, comprenant les étapes successives de chromatographie sur résine échangeuse d'anions, sur résine héparine puis sur résine hydroxyapatite. Ce document n'a pas trait à un facteur du complexe prothrombique et le produit de départ
4 est une composition d'un facteur recombinant et non d'origine humaine.
Le document W02006/075664 décrit un procédé de purification de FVII recombinant comprenant une étape de chromatographie sur hydroxyapatite, sans traitement préalable de la composition contenant le FVII
recombinant.

RESUME DE L'INVENTION
Le demandeur a trouvé de manière surprenante qu'un procédé de purification d'un concentré de protéines dépendantes de la vitamine K, notamment complexe prothrombique, combinant les étapes de préparation d'un surnageant de cryoprécipité de plasma, de chromatographie sur résine échangeuse d'anions et de chromatographie sur hydroxyapatite permet de préparer, de manière industrielle, un concentré de PPSB présentant un haut degré de pureté. Le PPSB préparé par l'invention est sensiblement dépourvu de protéines contaminantes et les facteurs II, VII, IX et X qu'il contient présentent une activité spécifique élevée. Le procédé de l'invention se distingue tout particulièrement des procédés de purification connus à ce jour par le nombre réduit et la reproductibilité des étapes de purification mises en oeuvre, et par l'utilisation d'hydroxyapatite pour chromatographier un éluat contenant des protéines de haut poids moléculaire telles que fibrinogène, fibronectine, immunoglobulines, protéines du complément.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une composition de complexe prothrombique comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un surnageant d'un cryoprécipité de plasma, b) appliquer ledit surnageant sur une résine échangeuse d'anions, et éluer en un éluat contenant ledit complexe et des protéines de haut poids moléculaire, c) appliquer l'éluat résultant de l'étape b) sur une colonne d'hydroxyapatite, d) éluer en un éluant contenant ledit complexe.
5 Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une étape additionnelle de préélution cl), ladite préélution étant de préférence effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8,5, de préférence environ 8,avec un tampon phosphate de sodium ou phosphate de potassium, notamment en une concentration de 0,005 à
0,05M, avantageusement de 0,01 à 0,05M, avantageusement de 0,02 à 0,05M, et de manière préférée 0,03M, ledit tampon comprenant également du NaCl 0,25 M.

Plus préférablement, l'élution de l'étape d) est réalisée avec un tampon phosphate de potassium de préférence 0,5 M, NaCl 0,075 M, pH 8.

Avantageusement, le procédé de l'invention comprend au moins une étape additionnelle d'inactivation virale de l'éluat résultant de l'étape b) et/ou de l'éluat résultant de l'étape d). Dans un mode de réalisation préféré, ladite au moins une étape d'inactivation virale est effectuée sur l'éluat résultant de l'étape b) sous la forme d'un traitement solvant-détergent, de préférence en présence d'un mélange Tween(polysorbate 80)-TnBP, de préférence par un mélange polysorbate 80 1%(v/v) - TnBP
0,3% (v/v). Dans un mode de réalisation particulier, ladite au moins une étape d'inactivation virale est effectuée sous la forme d'un traitement UV-C (Ultra Violet C), traitement avec des ions caprylate et/ou par chauffage à sec. Avantageusement, ladite au moins une étape d'inactivation virale est complétée par une étape d'élimination virale effectuée sur l'éluat résultant de l'étape d) sous la forme d'une nanofiltration, par exemple une ou plusieurs nanofiltrations sur un ou plusieurs filtre(s) de porosité comprise par exemple entre 15nm et 100nm. De préférence sur au moins un filtre
6 de porosité par exemple de 15nm, notamment sur un filtre Planova 15N de Asahi.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé
de l'invention comprend au moins une étape additionnelle de diafiltration-ultrafiltration après l'étape b) et/ou après l'étape d) .

Dans un mode de réalisation particulier, l'étape b) du procédé de l'invention comprend 2 sous-étapes mises en oeuvre sur deux résines échangeuses d'anions distinctes.

Dans un mode de réalisation particulier, la résine échangeuse d'anions de l'étape b) possède un groupe chargé positivement choisi parmi le diéthylaminoéthane (DEAE), la polyéthylèneimine (PEI) et l'aminoéthane quaternaire (QAE), ladite résine échangeuse d'anions étant de préférence du type DEAE.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé
de l'invention comprend l'addition d'un inhibiteur de la thrombine, de préférence l'antithrombine III ou d'un mélange d'antithrombine III et d'héparine après l'étape b) ou après l'étape d).
Dans un mode de réalisation, la composition préparée par le procédé de l'invention comprend en outre d'autres protéines dépendantes de la vitamine K tel que les protéines C, S et Z.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé
selon l'invention comprend une étape additionnelle finale de formulation, de préférence par lyophilisation et/ou addition d'adjuvants ou de véhicules pharmaceutiquement acceptables.

La présente invention concerne également une composition de complexe prothrombique susceptible d'être
7 obtenue par le procédé selon l'invention, et dont la concentration en Immunoglobulines, et de préférence en IgM, est inférieure à 0,1 %, et/ou dont la concentration en fibrinogène est inférieure à 0,1 %, et/ou dont la concentration en fibronectine est inférieure à 0,1 %
et/ou dont la concentration en facteurs du complément est inférieure à 0,1 %.

Dans un mode de réalisation particulier, l'activité
spécifique moyenne du FIX dans la composition de complexe prothrombique selon l'invention est d'au moins 4 UI par mg de protéines.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition de complexe prothrombique selon l'invention comprend en outre la protéine C, la protéine S et la protéine Z.

Dans un mode de réalisation particulier, les protéines dépendantes de la vitamine K, constituées par le Facteur II (FII), le Facteur VII (FVII), le Facteur IX
(FIX), le Facteur X (FX), la protéine C, la protéine S et la protéine Z de la composition de complexe prothrombique selon l'invention représentent au minimum 80 %, de préférence 85%, et plus préférablement 90%, des protéines totales de la composition.

La présente invention concerne également l'utilisation de la composition de complexe prothrombique selon l'invention comme médicament, préférablement comme médicament pour le traitement et la prévention d'accidents hémorragiques liés au déficit en facteurs dépendants de la vitamine K, ou au surdosage en antivitamine K, ou comme médicament pour le traitement et la prévention d'accidents hémorragiques liés à un déficit constitutionnel ou acquis en facteur II ou en facteur X.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
8 Figure 1 : Rendements d'élution en facteurs II, IX, VII et X en fonction de la charge protéique déposée sur la colonne d'hydroxyapatite.
Figure 2 : Quantité de facteurs II, IX, VII et X non retenus sur colonne d'hydroxyapatite en fonction de la charge protéique introduite.
Figure 3 : Variation du pourcentage de FII et de FIX
non fixé en fonction de la charge protéique déposée sur colonne d'hydroxyapatite.
Figure 4 : Gel SDS-PAGE correspondant aux quantités de protéines éliminées au cours de la préélution lors de la chromatographie sur hydroxyapatite. gel SDS PAGE 12 %
- Non réduit - dépôts : 10 pg de protéines, correspondant aux Prééluats et éluats de la chromatographie sur HA
Biorad. Puits 1 et 10 : Standards de poids moléculaires.
Puits 2 : PI-1. Puits 3 : Essai 3 prééluat 0,25 M NaCl.
Puits 4 : Essai 3 éluat. Puits 5 : Essai 5 prééluat 0,25 M NaCl ; 30 mM phosphate. Puits 6 : Essai 5 éluat. Puits 7 : PI-1. Puits 8 : Essai 6 prééluat 0,25 M NaCl ; 30 mM
phosphate. Puits 9 : Essai 6 éluat.
Figure 5: Evolution de la pression de filtration en fonction du temps.
Figure 6 : Evolution du débit de filtration en fonction du poids filtré.
Figure 7 : Electrophorèse SDS Page Novex 4 - 12 %
sans réducteur - coloration bleu coomassie colloïdal.
Puits 1 : 97 E 0801 - PI-1. Puits 2 : 97 E 0801 - Non Adsorbé HA Céramique. Puits 3 : 97 E 0801 - Pré élution.
Puits 4 : 97 E 0801 - élution. Puits 5 : 97 E 0801 -élution dialysée 10 kDa. Puits 6 : 97 E 0901 - Après filtration 15 nm. Puits 7 : 97 E 1401 - Après filtration 15 nm. Puits 8 : 97 E 1601 - Après filtration 15 nm.
Puits 9 : 97 E 1601 - Retentât final 15 nm. Puits 10 Témoin de poids moléculaires Novex.
Figure 8 : Caractérisation du facteur IX par immunoblot. Puits 1 : 97 E 1106 - Eluat HA dialysé avant nanofiltration. Puits 2 et 3 : 97 E 1106 - PI-1. Puits
9 4 : 97 E 1504 - Filtrat 15 nm. Puits 5 : Témoin Facteur IX HP. Le Facteur IX HP est un Facteur IX de haute pureté , c'est-à-dire un concentré de Facteur IX ayant une activité spécifique (exprimée en unité de FIX par mg de protéines) supérieure à 100 U/mg.
DESCRIPTION DETAILLEE DE MODES DE REALISATION

Le procédé de purification de protéines dépendantes de la vitamine K et notamment de complexe prothrombique de la présente invention comprend les étapes suivantes :
a) fournir un surnageant d'un cryoprécipité de plasma. Dans un mode de réalisation particulier, le surnageant de cryprécipité de plasma peut être obtenu par fractionnement de Cohn. Dans ce cas particulier, il s'avère nécessaire d'éviter la dénaturation des protéines par l'éthanol et donc de travailler à basse température ou d'éliminer l'alcool avant de procéder à l'adsorption des protéines sur hydroxyapatite. Dans un autre mode de réalisation, le surnageant de cryprécipité de plasma peut être obtenu par fractionnement avec un sel ammonium sulfate. Dans ce cas particulier, il s'avère nécessaire d'opérer une dialyse afin de se trouver dans des conditions optimales d'adsorption sur hydroxyapatite.
b) appliquer ledit surnageant sur une résine échangeuse d'anions, et éluer en un éluat contenant ledit complexe et des protéines de haut poids moléculaire, c) appliquer l'éluat résultant de l'étape b) sur une colonne d'hydroxyapatite, d) éluer en un éluant contenant ledit complexe.

Les protéines de haut poids moléculaires sont celles ayant un PM exprimé en kDa supérieur à 300, de préférence supérieur à 200, notamment supérieur à 160, voire supérieure à 100.

La résine hydroxyapatite utilisée dans l'invention peut être par exemple ceramic-Hydroxyapatite (ceramic HA), Biogel HT, etc.

5 Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une étape additionnelle de préélution cl), ladite préélution étant de préférence effectuée à température ambiante avec un tampon phosphate de potassium 0,01 M, NaCl 0,25 M, pH 8,0 ou un tampon
10 phosphate de potassium 0,03 M, NaCl 0,25 M, pH 8,0. La concentration en phosphate de potassium du tampon de préélution varie de préférence de 0.02 à 0.05M, et est préférentiellement égale à 0.03M. Le pH du tampon de préélution varie de préférence de pH 6,5 à pH 8,5, et est préférentiellement égal à pH 8.

De manière préférentielle, l'élution de l'étape d) est réalisée avec un tampon phosphate de potassium 0,5 M, NaCl 0,075 M, pH 8. Le pH du tampon d'élution varie de préférence de pH 6,5 à pH 8,5, et est préférentiellement égal à pH 8. La concentration en phosphate de potassium du tampon d'élution varie de préférence de 0,1 M à 0,5 M
et est préférentiellement égale à 0,25 M.

La chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite et, de préférence sur hydroxyapatite céramique (HA-Biorad), permet d'éliminer les protéines de haut poids moléculaire qui sont éluées avec les protéines dépendantes de la vitamine K (notamment le complexe prothrombique) lors de l'étape b) de chromatographie sur résine échangeuse d'anions. L'élimination de ces protéines de haut poids moléculaire permet de réduire, ou de préférence d'éliminer les effets secondaires qui résultent généralement de l'utilisation thérapeutique d'une solution de complexe prothrombique. En effet, les protéines contaminantes de haut poids moléculaire qui sont éliminées lors de la chromatographie sur hydroxyapatite comprennent par exemple certains facteurs
11 du complément (tel le C4) qui réduisent, de manière directe ou indirecte (par exemple après clivage sous la forme d'anaphylatoxines), la tolérance du patient aux solutions de complexe prothrombique distribuées commercialement à ce jour. Le demandeur a trouvé de manière surprenante que la seule étape de chromatographie sur hydroxyapatite permet d'éliminer la plupart des protéines contaminantes de haut poids moléculaire contenues dans le surnageant de cryoprécipité de plasma sans nécessiter la mise en oeuvre préalable telle qu'une purification sur silice colloïdale, par exemple. On élimine aussi les protéines telles que fibrinogène, fibronectine, Ig.

La chromatographie sur hydroxyapatite permet en outre de ne pas modifier la proportion respective des facteurs dépendants de la vitamine K lors de leur purification, puisque le rapport entre les facteurs II, VII, IX ou X dans le concentré de complexe prothrombique obtenu par le procédé de l'invention est extrêmement comparable à celui rencontré dans le plasma natif.

Il en résulte que la composition de complexe prothrombique (concentré de protéines dépendantes de la vitamine K) résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite est significativement enrichi. La teneur, par rapport à la teneur en protéines, de cette composition ou concentré en protéines du complexe prothrombique est d'environ 60%, de préférence d'environ 70%, et plus préférablement d'environ 80%, et l'activité
spécifique des facteurs II, VII, IX X est significativement accrue par rapport aux concentrés prothrombiques distribués commercialement (de 4 à 8 fois supérieure, de préférence 5 fois supérieure), comme par exemple le Kaskadil .

Par ailleurs, l'élimination des protéines de haut poids moléculaire lors de la chomatographie sur
12 hydroxyapatite constitue un avantage industriel en ce qu'elle permet désormais d'inactiver viralement le concentré de protéines dépendantes de la vitamine K par nanofiltration sur des filtres de porosité de l'ordre de 15 nm. Les filtres seraient sinon rapidement colmatés par la présence de telles protéines de haut poids moléculaire dans la solution à filtrer. Enfin, lorsqu'une inactivation virale par traitement solvant-détergent est réalisée entre la chromatographie sur la résine échangeuse d'anions de l'étape b) et la chromatographie sur hydroxyapatite de l'étape d), la purification sur hydroxyapatite permet d'éliminer sensiblement l'intégralité du solvant et du détergent présents dans le concentré protéique chargé sur l'hydroxyapatite.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend au moins une étape additionnelle d'inactivation virale de l'éluat résultant de l'étape b) et/ou de l'éluat résultant de l'étape d) . De manière préférentielle, l'étape d'inactivation virale effectuée sur l'éluat résultant de l'étape b) correspond à un traitement solvant-détergent, de préférence en présence d'un mélange Tween (polysorbate 80)-TnBP, de préférence par un mélange polysorbate 80 1% (v/v) - TnBP 0, 3% (v/v) .
Dans un mode de réalisation particulier, ladite au moins une étape d'inactivation virale est effectuée sous la forme d'un traitement UV-C (Ultra Violet C), traitement avec des ions caprylate et/ou par chauffage à sec. De manière préférentielle, le procédé de l'invention peut comprendre une seconde étape d'élimination virale effectuée sur l'éluat résultant de l'étape d) et correspondant à au moins une nanofiltration, de préférence au moins sur un filtre de porosité 15nm, de préférence sur un filtre Planova 15N (Asahi).
On peut ainsi éliminer les virus à enveloppe et ceux sans enveloppe.
13 Le procédé de l'invention peut donc comprendre au moins une étape d'inactivation virale visant à sécuriser d'un point de vue virologique le produit final qui est destiné à une administration thérapeutique.
Une première étape d'inactivation virale par traitement avec un mélange solvant-détergent et permettant d'inactiver les virus enveloppés peut être mise en oeuvre à tout stade du procédé et, de préférence après la purification sur résine échangeuse d'anions. Le mélange solvant-détergent utilisé peut correspondre à
tout mélange approprié connu de l'homme du métier et se compose de manière préférentielle comme indiqué supra. Le traitement d'inactivation virale par solvant-détergent est généralement mis en oeuvre pendant une durée de quelques heures (par exemple 7 heures), à une température sensiblement ambiante (par exemple de 25 1 C).

Par ailleurs, le procédé de l'invention peut également comprendre au moins une étape d'élimination virale par nanofiltration sur au moins un filtre de faible porosité, par exemple sur au moins un filtre de porosité comprise entre 15nm et 100nm. Une telle étape de nanofiltration permet plus particulièrement de sécuriser le produit final vis-à-vis des virus non-enveloppés (virus de type poliovirus ou parvovirus) et des agents transmissibles non conventionnels (type prion). Dans le cadre du procédé de l'invention, la nanofiltration est réalisée sur au moins un filtre ayant une porosité de 15nm, et de préférence sur au moins un filtre Planova 15N
(Asahi). Dans un mode de réalisation particulier, la nanofiltration est réalisée sur au moins deux filtres ayant une porosité différente, de préférence une porosité
décroissante. Cette nanofiltration est de préférence effectuée après la chromatographie sur hydroxyapatite dans la mesure où la présence de concentrations importantes de protéines de haut poids moléculaires (par exemple le fibrinogène, la fibronectine, ou les IgM) dans l'extrait protéique à filtrer conduit généralement au
14 colmatage du filtre, a fortiori lorsque le procédé est mis en oeuvre à une échelle industrielle.

Le concentré de PPSB résultant du procédé comprenant les 2 étapes d'inactivation virale susmentionnées se révèle conforme aux recommandations internationales émises par l'EMEA ou la FDA en ce qui concerne les produits plasmatiques et biotechnologiques, dans la mesure où il satisfait à la fois aux conditions de sécurité requises pour les virus non enveloppés et pour les virus nus.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend au moins une étape additionnelle de diafiltration-ultrafiltration après l'étape b) et/ou après l'étape d).

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend deux sous-étapes de chromatographie sur résine échangeurs d'anions. Il y a alors une étape additionnelle b2) consistant à appliquer l'éluat de l'étape b) sur une seconde résine échangeuse d'anions et à éluer le concentré de protéines dépendantes de la vitamine K comprenant des protéines de haut poids moléculaire. De manière préférentielle, la seconde résine échangeuse d'anions est une résine de type DEAE-Sepharose, et de préférence la DEAE-Sepharose FF
(Amersham). Une résine DEAE-Sépharose présente l'avantage de résister à la pression ainsi qu'au traitement à la soude usuellement utilisé pour sanitiser et régénérer le gel.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une étape additionnelle finale de formulation, de préférence par lyophilisation et/ou addition d'adjuvants ou de véhicules pharmaceutiquement acceptables. Dans un mode de réalisation, le produit obtenu après formulation comprend du NaCl 0,13 M, de l'arginine 2g/l, de la lysine 2g/l, du citrate de sodium 3 g/l, et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le produit obtenu après formulation comprend de l'arginine 10g/l, du mannitol 35g/l, et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le produit 5 obtenu après formulation comprend du mannitol 45g/1 et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le produit obtenu après formulation comprend du citrate de sodium 1 g/l, du mannitol 35g/1, et a un pH de 6,9 à 7,1.

10 Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprenant une étape d'addition d'un inhibiteur de la thrombine, de préférence l'antithrombine III ou un mélange d'antithrombine III et d'héparine.
L'antithrombine peut être d'origine plasmatique humaine
15 ou d'origine humaine recombinante, comme par exemple l'Atryn(D, distribuée commercialement par GTC
Biotherapeutics. Cette addition peut être effectuée après l'étape b) et/ou après l'étape d). De manière préférée, l'addition de l'inhibiteur de la thrombine est effectuée après le traitement solvant-détergent de l'éluat résultant de l'étape b), ou avant nanofiltration de l'éluat résultant de l'étape d). Le cofacteur II de l'héparine peut également être utilisé en tant qu'inhibiteur de la thrombine, dans l e s mêmes concentrations que celles proposées pour l'antithrombine.
L'addition d'un inhibiteur de la thrombine permet avantageusement d'empêcher ou de limiter l'activation de la prothrombine (FII) en thrombine lors des étapes de purification mises en oeuvre lors du procédé de l'invention. L'absence d'activité thrombique dans le concentré de protéines dépendantes de la vitamine K
obtenu par le procédé de l'invention le rend compatible avec une utilisation en tant que médicament thérapeutique ou prophylactique chez l'homme et permet une conservation satisfaisante de ce concentré.
16 De manière préférée, la résine échangeuse d'anions de l'étape b) du procédé de l'invention possède un groupe chargé positivement choisi parmi le diéthylaminoéthane (DEAE), la polyéthylèneimine (PEI) et l'aminoéthane quaternaire (QAE). Cette résine échangeuse d'anions est plus préférablement la DEAE-Sephadex A-50(D distribuée par GE Healthcare. La chromatographie de l'étape b) permet d'éliminer une partie (qui peut être importante) des protéines constituées par l'albumine, les immunoglobulines (à l'exception, dans une certaine mesure, de certaines Ig comme l'IgM), de l'antithrombine III, et de l'alpha-antitrypsine. La récupération des protéines plasmatiques adsorbées sur la résine échangeuse d'anions s'opère par augmentation graduelle de la force ionique.

Dans un mode de réalisation particulier, les protéines vitamine K dépendants obtenus suite à l'étape d) peuvent ensuite être purifiés indépendamment par des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple sur un gel d'affinité.

La présente invention porte également sur le concentré de facteur prothrombique (protéines dépendantes de la vitamine K susceptible d'être obtenu par le procédé
décrit ci-dessus. Ce concentré de protéines comprend préférentiellement les facteur II, VII, IX et X, et possède une concentration en IgM inférieure à 0,1%
(pourcentage rapporté au taux protéines total du concentré), une concentration en fibrinogène inférieure à
0,1% (pourcentage rapporté au taux protéines total du concentré), une concentration en fibronectine inférieure à 0,1% et une concentration en facteurs du complément inférieure à 0,1%. De préférence, le concentré de l'invention comprend également les protéines C, S et Z, et possède une activité spécifique moyenne du FIX d'au moins 4 UI par mg de protéines.
17 La présente invention concerne enfin sur l'utilisation du concentré de facteur prothrombique susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention comme médicament, et plus particulièrement comme médicament pour le traitement et la prévention d'accidents hémorragiques liés au déficit en facteurs dépendants de la vitamine K, tel qu'un déficit constitutionnel en facteur II ou en facteur X, ou au surdosage en antivitamine K.
Le procédé de la présente invention est illustré de manière plus détaillée par les exemples qui suivent. Ces exemples décrivent des modes de réalisation spécifiques de la présente invention et ne sauraient être considérés comme restreignant la portée de cette dernière.

EXEMPLES
Exemple 1 : Conditions expérimentales mises en oeuvre pour la purification du concentré de protéines dépendantes de la vitamine K

A - Préparation du Surnageant de cryoprécipité de plasma.
On utilise comme matière de départ un surnageant de cryoprécipité de plasma que l'on obtient par congélation-décongélation et centrifugation à 0-3 C de plasma frais congelé.
La cryoprécipitation est réalisée en amont du fractionnement plasmatique, à une température inférieure à 2 C, afin de séparer le cryoprécipité insoluble à une température inférieure à 4 , principalement composé de Facteur VIII, de fibronectine et de fibrinogène.
Le cryoprécipité est séparé du surnageant par centrifugation en continu à une température voisine de
18 +4 C. Le surnageant de centrifugation est appelé
cryosurnageant.

Le cryosurnageant contient essentiellement l'albumine, les immunoglobulines ainsi que les autres facteurs de coagulation dont les facteurs Vitamine-K
Dépendant, composés de la Prothrombine (Facteur II), du Facteur VII, du Facteur IX, du Facteur X, de la Protéine C, de la Protéine S et de la Protéine Z.
B - Chromatographie sur résine échangeuse d'anions L'étape suivante consiste à préparer une fraction enrichie en facteur vitamine K-dépendant après adsorption sur un gel d'échange d'anions faibles, le DEAE Sephadex A- 50 (diéthylamino-éthyl Sephadex).

Le cryosurnageant est réchauffé à une température minimale de +10 C (optimalement de +16 à 18 C). Ce cryosurnageant peut, le cas échéant subir des filtrations clarifiante sur filtres de 1 }gym puis de 0,5 }gym avant sa purification sur le gel de DEAE-Sephadex.

Le volume de cryosurnageant purifié est classiquement de 2000 à 3000 litres. Environ 1,5 g de DEAE-Sephadex sec sont utilisés par litre de cryosurnageant purifié.

Préalablement à la purification, la poudre de DEAE-Sephadex est gonflée (3 lavages), avec tamisages du gel sur toile inox après chaque lavage. La préparation, le gonflement et l'équilibrage de la DEAE-Sephadex sont réalisés dans une solution de chlorure de sodium 0,075 M
dans un container doté d'une pale d'agitation et d'une grille de fond de cuve (tamis) pouvant laisser échapper le liquide mais retenant les billes de DEAE-Sephadex.
L'opération de gonflement du DEAE-Sephadex est réalisée à
température ambiante (15 - 25 C).
19 L'équilibrage final du gel est contrôlé par la mesure de l'osmolarité de l'effluent.

Le cryosurnageant à une température préférentielle de 17+/-1 C, est envoyé en continu sur la DEAE-Sephadex gonflée et équilibrée, à un débit de 400 kg par heure après équilibrage des débits d'alimentation.

La totalité du cryosurnageant est ainsi mise en contact avec la DEAE-Sephadex sous agitation continuelle, permettant la fixation en continu des facteurs dépendants de la vitamine-K sur le gel.

Le gel est ensuite lavé trois fois avec un tampon contenant 0,2M de NaCl, 10 mM d'acide citrique, à pH 7, à
raison de 140 1 de tampon pour 2200 litres de cryosurnageant purifié.

L'élution des protéines dépendantes de la vitamine-K
(et des protéines de haut poids moléculaire qui sont co-purifiées avec elles) est réalisée à l'aide d'un tampon NaCl 2M, acide citrique 10 mM, à pH 7, à raison de 75 litres de tampon pour 2200 litres de cryosurnageant purifié.

La fraction protéique obtenue lors de l'élution est ensuite dessalée par des moyens classiques, c'est-à-dire par ultrafiltration à l'aide de cassettes ayant un seuil de coupure de 10 kilodaltons et éventuellement 30 kilodaltons et dialyse contre un tampon NaCl 0,15M, acide citrique 10 mM, à pH7.

L'éluat protéique résultant de la purification sur DEAE-Sephadex sera nommé PPSB Produit Intermédiaire 1 ou PPSB-PI-1 dans le cadre de la présente demande.
A ce stade du procédé de purification, il s'avère possible de congeler le PPSB-PI-1 dans l'attente de la mise en oeuvre des autres étapes de purification l'éluat résultant de la DEAE-Sephadex à ce stade.

C - Inactivation virale par traitement 5 Solvant/Détergent Le PPSB-PI-1 est ensuite soumis à une inactivation virale par traitement avec un mélange solvant-détergent, et plus spécifiquement par un traitement avec du 10 polysorbate 80 (1% v/v) - Tri n-Butyl Phosphate (TnBP) (0,3% v/v). Le traitement d'inactivation virale est effectué pendant une durée d'au moins 6 heures à une température de 24 à 25 C.

15 D'autres détergents peuvent être utilisés en tant qu'alternative au polysorbate, tels que le cholate ou l'octoxynol (Triton X100) à des concentrations allant de 0,5 à 2 %, en présence de TNBP, à une température de 15 à
C mais préférentiellement autour de 25 C. La durée
20 minimale d'incubation pour l'inactivation virale est de 4 heures mais cette incubation peut s'étendre jusqu'à 12 heures. Les pH généralement appliqués vont de 6 à 8 et la concentration en protéines totales de 10 à 40 g/l.

25 D - Chromatographie sur Hydroxyapatite HA
D.1 - Package du gel Le gel de chromatographie utilisé est le Macro prep -céramic hydroxyapatite hydroxyapatite (Biorad), possédant une 30 granulométrie de 40 microns. Le gel sec est mis en suspension dans un tampon phosphate 0,4 M pH 6,8, puis transféré dans une colonne Pharmacia K50/30.Le package est effectué à un débit de 100 cm/h. La quantité utilisée est de 30 g de gel sec, ce qui fourni une colonne de 50 ml de gel packé. La colonne est rincée par 5 volumes de colonne de NaOH 2 M et stockée dans NaOH 2 M.
21 D.2 - Préparation du PPSB-PI-1 à injecter sur la colonne Le PPSB-PI-1 est, le cas échéant, décongelé et viralement inactivé pendant 3 heures en présence de polysorbate 80 1% et de TnBP 0,3%. Le PPSB-PI-1 viralement inactivé est ensuite dilué au demi, de manière optionnelle avec une solution de benzamidine 20 mM; et le pH de la solution est ajusté à 8 avec du NaOH 0,1M.

D.3 - Chromatographie:
La colonne est reliée à un détecteur U.V Pharmacia muni d'une cellule de détection industrielle, et la densité optique de l'effluent est enregistrée à 280 nm.
Le gel stocké en NaOH 2M est lavé par 5 volumes de tampon de prééquilibrage (phosphate de potassium 0,4 M; pH 6,8).
La colonne est ensuite équilibrée par 15 volumes de tampon d'équilibrage (phosphate de potassium 0,01M; NaCl 0,075 M; benzamidine 10 mM (optionnel); pH 8) . Puis la solution de PPSB est injectée à un débit de 100 cm/h et la colonne est lavée par le tampon d'équilibrage jusqu'au retour à la ligne de base.
La préélution s'effectue au même débit avec un tampon de préélution (phosphate de potassium 0,01 M; NaCl 0,25 M; benzamidine 10 mM; pH 8 ou phosphate de potassium 0,03 M; NaCl 0,25 M; benzamidine 10 mM (optionnel); pH 8) et 5 volumes de colonne de prééluat sont recueillis. Le gel est ensuite lavé avec 15 volumes du même tampon.
L'élution est effectuée au même débit avec un tampon d'élution (phosphate de potassium 0,5 M; NaCl 0,075 M; benzamidine 10 mM (optionnel); pH 8) et 5 volumes de colonne d'éluat sont collectés. Le gel est régénéré par 5 volumes de colonne de NaOH 2M et stocké
dans du NaOH 2M.

E - Ultrafiltration et dialyse L'éluat résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite est soumis à une ultrafiltration réalisée
22 sur une cassette Sartorius ultrasart slice polysulfone de 0,1 m2 et de 10 kD de seuil de coupure.
L'éluat est concentré 3 fois et dialysé à volume constant contre de l'eau p.p.i (purifiée pour injection) jusqu'à obtenir une résistivité de 70 ohms (la pression d'entrée sur la cassette est de 0,5 bars et le débit d'ultrafiltration est de 45 ml/mn), puis dialysé à volume constant contre 5 volumes de tampon de dialyse (citrate trisodique 3 g/l; NaCl 0,13 M; lysine 2 g/l; arginine 2 g/l; pH 7). Le produit est ensuite reconcentré 2 fois et la cassette est rincée avec le tampon de dialyse de manière à obtenir un volume final égal à 80% du volume initial. Le produit est enfin congelé et stocké à -40 C, et pourra, le cas échéant être ultérieurement filtré sur filtre de porosité de 15 nm.

F - Dosage Les quantités et/ou les concentrations des Facteur de la coagulation II (FII), Facteur VII (FVII), Facteur IX (FIX) et Facteur X (FX) qui composent le complexe prothrombique (ou PPSB) sont dosées (par la mesure de la capacité à induire la coagulation) et l'activité
thrombique est mesurée.
De même, la quantité et/ou la concentration des protéines C, S est dosée à l'aide des kits Asserachrom Total Protein S et Asserachrom Protein C , distribués par Stago.
Les dosages antigéniques des facteurs VII, IX, X et de la protéine Z sont réalisés par ELISA à l'aide des kits Asserachrom VII:Ag , Asserachrom IX:Ag , Asserachro m X:Ag , et Asserachrom Protein Z distribués par Stago.
Les quantités et/ou les concentrations de polysorbate 80 et de TnBP sont mesurées.
23 Exemple 2 : Résultats expérimentaux A - Etude de la capacité de la colonne La capacité de la colonne d'hydroxyapatite a été
testée avec des doses de 3, 5, 7 et 9 ml de PPSB-PI-1 viralement inactivé par ml de gel, dans les mêmes conditions expérimentales que celles décrites ci-dessus.
Il n'a pas été effectué de préélution.
Le rendement calculé pour chaque facteur correspond au rapport de la quantité totale d'unités coagulantes dans l'éluat résultant de l'hydroxyapatite sur la quantité totale d'unités coagulantes dans le PPSB-PI-1.
Les rendements obtenus en fonction de la charge sont détaillés dans le tableau I suivant :

Tableau I - Rendements d'élution en facteurs II, IX, VII et X en fonction de la charge sur le gel Charge de la Rendemen Rendemen Rendemen Rendemen colonne ts ts FVII ts FIX ts FX
FII
ml de PPSB-PI-1 ml de gel Ces données sont représentées graphiquement dans la figure 1. On observe une nette décroissance de la fixation du FX en fonction de la charge.
Le pourcentage de facteur non fixé calculé pour chaque facteur correspond au rapport de la quantité
totale d'unités coagulantes dans la fraction non fixée à
24 la quantité totale d'unités coagulantes dans le PPSB-PI-1 de départ. Les pourcentages de facteur non fixé sont résumés dans le tableau II.

Tableau II : Quantité de facteurs II, IX, VII et X
non retenus sur le gel en fonction de la charge.

Charge de la Non fixé Non fixé Non fixé Non fixé
colonne FII FVII FIX FX
ml de PPSB-PI-1 ml de gel 3 < 1 < 1 < 1 5 5 3 < 1 < 1 14 7 11 5 < 1 26 9 18 8 < 1 35 Ces données sont représentées graphiquement dans la figure 2. Sur cette dernière figure, il apparaît de manière plus nette que le FII et le FX sont les facteurs qui se fixent le moins sur la colonne d'hydroxyapatite.

La figure 3 montre par ailleurs que pour ces deux facteurs (FII et FX), le pourcentage de facteur non fixé
varie de manière linéaire avec la charge. La charge de 5 ml de PPSB-PI-1 par ml de gel pour laquelle la fixation des FII et FX est encore acceptable à été retenue.

B - Influence de la préélution Dans le but d'éliminer le plus grand nombre de protéines contaminantes, une préélution avec un tampon phosphate 30 mM a été testée. Une telle préélution est de préférence réalisée avec un tampon phosphate à mM, et plus préférentiellement 30 mM, dans la mesure où
l'élution des facteurs II et VII a été constaté à partir d'une concentration en phosphate de 50 mM. Les conditions opératoires sont identiques à celles décrites plus haut et la charge protéique utilisée est de 5 ml de PPSB-PI-1 par ml de gel.

Aucun facteur de coagulation n'a pu être détecté
5 dans les prééluats. Les rendements ne sont donc pas affectés par cette préélution, ainsi que le montre les résultats suivants:

Tableau III : Quantité de facteurs II, IX, VII et X
10 dans l'éluat en fonction du type de préélution réalisée.
N Essai Préélution FII: FVII: FIX:C FX:C
C C
o o o o o o o o 3 0,25 M NaCl 83 86 86 68 4 0,25 M NaCl 88 103 112 92 5 0,25 M NaCl, 30 mM 95 80 93 69 phosphate 6 0,25 M NaCl, 30 mM 80 81 79 72 phosphate Tableau IV : Quantité de protéines copurifiées éliminées au cours de la préélution phosphate N Essai Protéines totales Protéines prééluat 30 mM totales phosphate éluat mg mg 3 (pas de préélution 5 1218 phosphate) 0 916 4 (pas de préélution 44 964 phosphate) La préélution réalisée avec un Tampon phosphate 30 mM permet en outre d'éliminer un grand nombre de 5 protéines accompagnantes et notamment des protéines de hauts poids moléculaire (100 à 200 kD) ainsi que le montre le gel SDS PAGE (voir figure 4).

E - Influence de l'addition d'antithrombine et 10 d'héparine Afin de maintenir une faible activité thrombique dans l'extrait protéique en cours de purification, on ajoute dans l'éluat de chromatographie hydroxyapatite avant ultrafiltration de l'antithrombine purifiée à une concentration de 0,5 U/ml (de préférence à une concentration de 0,1 à 0,04 unité d'antithrombine par unité de FIX) et de l'héparine à 2 U/ml. Les conditions expérimentales sont les mêmes que celles décrites plus haut, avec une préélution en tampon phosphate 3OmM. La charge de la colonne était de 5 ml de PPSB par ml de gel.

El - Activités en FII, FX, FVII et X dans les éluats dialysés après purification sur hydroxyapatite Tableau V : Activités en facteurs II, IX, VII et X
et activité thrombique dans l'éluat après hydroxyapatite N Essai FII :C FVII :C FIX :C FX :C activité activité
thrombique thrombique U/ml U/ml U/ml U/ml 6h 37 C 25h 20 C
25 19 8,4 23 19 >6 h >24h
26 19 8,5 22 19 >6 h >24h
27 21 8,5 17 21 >6 h >24h
28 20 9,5 17 22 >6 h >24h moyenne 20 9 20 20 écart type 1,0 0,5 3,2 1,5 C.V. 4,8 5,9 16,2 7,4 PI-1 35 16 27 48 >6 h >24h Les essais réalisés sont reproductibles entre eux et les activités thrombiques mesurées à 6h et à 24 h sont quasiment nulles, et sont de ce fait conformes pour un usage thérapeutique ultérieur du concentré de protéines dépendant de la vitamine K (une activité thrombique de 6 heures et plus correspond à de très faibles quantités de thrombine, très inférieures à 0,001 unité NIH).

E2 - Rendements en FII, FX, FVII et X dans l'éluat dialysé après purification sur hydroxyapatite Tableau VI : Rendements en facteurs II, IX, VII et X
et activité thrombique dans l'éluat dialysé ou ultrafiltré après hydroxyapatite N Essai FII :C FVII :C FIX :C FX :C
o o o o o o o o moyenne 71 60 71 64 écart type 12,4 2,5 5,8 5,5 C.V. 17,7 4,2 8,2 8,6 Les rendements sont de l'ordre de 70 % pour les facteurs II et IX et de l'ordre de 60 et 64 % en moyenne pour les facteurs VII et X.

Tableau VII : Rendements en facteurs II, IX, VII et X après ultrafiltration de l'éluat résultant de l'hydroxyapatite N Essai FII :C FVII :C FIX :C FX :C

o o o o o o o o moyenne 83 71 73 79 écart type 15,6 9,8 3,6 9,2 C.V. 18,9 13,9 4, 9 11,6 Les rendements pour l'ensemble des facteurs après ultrafiltration sont de l'ordre de 70 à 80%.
29 Tableau VIII : Activités spécifiques en facteurs II, X. VII et IX dans l'éluat dialysé après hydroxyapatite N essai FII :C FVII :C FIX :C FX :C protéines totales U/mg U/mg U/mg U/mg mg/ml 25 6,3 2,8 7,7 6,8 3 26 5,7 2,7 4,9 6,3 2,9 27 6, 8 2,7 5,5 6, 8 3, 1 28 5,7 2,7 4,9 6,3 3,5 moyenne 6,1 2,7 5,8 6,6 3,1 écart type 0,5 0,1 1,3 0,3 0,3 C.V. 8,7 1,8 23,1 4,4 8,4 PPSB-PI-1 1,2 0,6 1 1,2 35 Les activités spécifiques calculées pour chaque facteur sont augmentées d'environ cinq fois par rapport à
un concentré de FII, FVII, FIX et FX obtenu par la mise en oeuvre d'une chromatographie sur résine échangeuse d'anion à la place de l'hydroxyapatite de l'invention.
F -Conclusion sur l'étape de purification sur hydroxyapatite La fixation des facteurs de coagulation dépendants de la vitamine K apparaît plus spécifique sur des surfaces à base de phosphate de calcium (de type hydroxyapatite) comparé au gel d'échange d'ions ce qui explique la pureté du produit obtenu. L'analyse des protéines récupérées après élution sur gel d'hydroxyapatite montre que les protéines comprises dans le concentré protéique d'intérêt ont un poids moléculaire compris entre 75 et 50 kDa, ce qui correspond au poids moléculaire des protéines dépendantes de la vitamine K, et en particulier au poids moléculaire des différents facteurs de coagulation composant le complexe prothrombique.

Le tableau IX ci-dessous établit la liste des protéines présentes dans un concentré protéique obtenu par purification sur une résine échangeuse d'anions après inactivation virale (et en remplacement de la 5 purification sur hydroxyapatite de l'invention). Il convient de remarquer que dans un tel concentré, la somme des protéines dépendantes de la vitamine K (FII, FVII, FIX, FX, protéine C, protéine S, protéine Z) représente 17% des protéines totales.
Tableau IX : Liste et proportions relatives des protéines présentes dans un concentré résultant d'une purification unique sur une résine échangeuse d'anions ou d'une purification comprenant une première résine échangeuse d'anions et une seconde résine échangeuse d'anions en remplacement de la chromatographie sur hydroxyapatite de l'invention Protéines % P M
Ig M 0,30 à 0,40 900 C 4 bp 1,60 à 2 590 Fibronectine 0,45 à 0,65 440 Fibrinogène 0,65 à 1 330 C 4 9 à 13 206 C 3 0,55 à 0,75 180 C 3 c 0,45 à 0,65 180 C 5 0,05 à 0,1 180 Protéine S 0,90 à 1,15 75 rothrombine (F II) 12 à 15 68,7 Albumine 2,10 à 2,5 68 Antithrombine III 0,05 à 1,5 65 Facteur X 1,25 à 1,75 59 Protéine C 0,20 à 0,50 57 Facteur IX 0,15 à 0,45 55,4 Protéine Z 0,05 à 0,20 55 Facteur VII 0,01 à 0,05 50 Au contraire, le concentré protéique résultant du procédé de l'invention et notamment obtenu après l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite contient une proportion en protéines dépendantes de la vitamine K
(FII, FVII, FIX, FX, protéine C, protéine S, protéine Z) de l'ordre de 90 à 95 % des protéines totales.
Le concentré qui résulte de cette chromatographie sur hydroxyapatite présente une activité spécifique augmentée de 5 à 7 fois par rapport au produit intermédiaire 1 résultant de la chromatographie sur résine échangeuse d'anions. Des mesures complémentaires montrent par ailleurs que la chromatographie sur hydroxyapatite permet en outre d'éliminer efficacement le polysorbate 80 et le TnBP utilisés lors de l'étape d'inactivation virale.

Enfin, l'addition d'antithrombine III et d'héparine dans l'éluat de chromatographie d'hydroxyapatite permet d'obtenir de façon systématique un produit dépourvu d'activité thrombique à 24 h.

Enfin, l'élimination de la plupart des protéines contaminantes et notamment des protéines contaminantes de hauts poids moléculaires permet de filtrer le produit sur membranes de porosité 15 nm en utilisant des surfaces de filtration acceptables (environ 10 litres de produit par mètre carré de membrane).

G - Nanofiltration du concentré obtenu après chromatographie sur hydroxyapatite G.1 - Mise en oeuvre expérimentale de la nanofiltration Les filtres utilisés sont des filtres de référence Planova 15 N (Asahi) . Les filtres utilisés sont composés de fibres creuses en cellulose cupro ammonium hydrophile, dont la taille nominale des pores est de 15 2 nm.

Le tampon d'équilibration des filtres se compose de chlorure de sodium 0,13M, de Tri Sodium Citrate 2 H20 3g/l, de Lysine HCl 2g/l, d'Arginine HCl 2g/1 et d'eau p.p.i. (purifiée pour injection). Le tampon est ajusté à
pH 7,0 0,05, à une résistivité de 75 Q.cm, et à une osmolalité de 314 mosmol / Kg H20, à une température de 20 à 25 C.

Les filtres sont préparés individuellement, rincés en eau ppi sous une pression de l'ordre de 500 mBar.
L'intégrité du filtre est contrôlée avant utilisation après rinçage à l'eau ppi. La réalisation du test de fuite à l'air ou Leakage test , contrôle l'absence de passage d'air à travers les fibres dans la jaquette externe sous une pression d'air de 1000 50 mBar. (SOP
of integrity Test for Asahi Planova Filters). Avant filtration de la solution, le filtre est équilibré à
l'aide du tampon de formulation. Dans un mode de réalisation particulier, le tampon de formulation se compose de NaCl 0,13M, arginine 2g/1, lysine 2g/1, citrate de sodium 3 g/l, et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le tampon de formulation se compose d'arginine 10 g/l, de mannitol 35g/1 et a un pH
de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le tampon de formulation se compose de mannitol 45g/1 et a un pH de 6,9 à 7,1. Dans un autre mode de réalisation, le tampon de formulation se compose de citrate de sodium 1g/1, de mannitol 35 g/l et a un pH de 6,9 à 7,1.
Le pH et la résistivité du filtrat 15 nm sont contrôlés (pH 7,0 0,1 - Osmolalité 314 10 mOsmol / Kg H20) .

Un flacon d'éluat résultant de la purification sur hydroxyapatite céramique décrite plus haut et éventuellement dialysé est décongelé en bain marie à 37 C
2 C. Une préfiltration est éventuellement réalisée sur un filtre en tri-acétate de cellulose 0,2 }gym (Sartolab P

- Sartorius) avant filtration sur le filtre de 15 nm Planova 15N.

La filtration de l'éluat est réalisée sous une pression d'air comprimé constante de 500 50 mBar. La mesure de pression est effectuée en entrée du filtre de nm à l'aide d'un manomètre numérique. L'éluat résultant de la filtration sur filtre 15 nm est collecté
en sortie basse de filtre dans un flacon positionné sur 10 une balance. Des relevés du poids filtré sont effectués à
intervalles de temps réguliers afin de déterminer le débit de filtration. La filtration réalisée est frontale sans recirculation.

15 En fin de filtration un test de fuite à l'air ( leakage test ) est réalisé après remplissage de la jaquette externe du filtre afin de contrôler l'intégrité
de la membrane et de valider l'étape de filtration.

Afin de tester la reproductibilité de l'étape de nanofiltration, les essais sont réalisés en appliquant des conditions opératoires standardisées détaillées dans le tableau X.

Tableau X : Conditions et paramètres opératoires appliqués lors de la nanofiltration sur 15 nm Paramètres opératoires Valeurs Température C 20 2 Pression appliquée mBar 500 50 Protéines totales g/l 5,0 1,0 Facteur IX :C Total UI Environ 3 200 Charge protéique moyenne g/m2 50 10 Charge volumétrique 1/m2 10,0 1 Après nanofiltration, la quantité et/ou la concentration des facteurs de coagulation FII, FVII, FIX

et FX est mesurée par des techniques classiques connues de l'homme du métier. Il en va de même pour la détermination des taux de protéines totales.

G.2 - Résultats obtenus après nanofiltration de l'éluat résultant de l'hydroxyapatite G.2.1 - Suivi des paramètres de nanofiltration La pression de filtration a été maintenue dans une moyenne de 500 100 mBar pendant les essais de filtration (voir figure 5).

L'évolution du débit de filtration est mesurée pendant la nanofiltration (voir la figure 6) . On observe une diminution régulière du débit de filtration en fonction du poids filtré. Un profil similaire est obtenu pour tous les essais réalisés.

Tableau XI: Suivi des débits de nanofiltrations N essai Débit initial Débit final Ratio nanofiltration g/min g/min %
97 E 2703 2,3 0,4 17,4 97 E 0204 3,0 0, 9 30, 0 97 E 0804 2, 0 0, 6 30, 0 97 E 0904 1,8 0, 6 33,3 97 E 1504 1,8 0,3 16,7 Suivant les préconisations du fournisseur de filtre Asahi, le débit de filtration final doit être supérieur à
10 % du débit initial. Pour un ratio de débit inférieur à
10 % le filtre est considéré comme étant colmaté, en particulier pour les pores de plus faible diamètre. Une poursuite de la filtration pourrait en effet favoriser le passage des virus potentiels par les pores les plus larges de la membrane.

Le ratio des débits de nanofiltration final /
5 initial est conforme pour tous les essais réalisés.
Tableau XII: suivi des paramètres de filtration N essai Durée filtration Capacité Débit moyen Capacité
nanofiltration min 1/m2 1/heure/m2 g/m2 97 E 2703 138 11,4 4,9 50,2 97 E 0204 70 9,7 8,0 42,7 97 E 0804 89 10,0 6,8 49,0 97 E 0904 99 10,5 6,4 52,5 97 E 1504 148 10,7 4,3 51,4 La durée moyenne de filtration est de l'ordre de 2 10 heures. La capacité volumétrique moyenne est de l'ordre de 10 l/m2 de membrane, ce qui correspond à une capacité
d'environ 47,9 4,7 g de protéines par m2.

G.2.2 - Bilan en protéines totales et en facteurs de 15 coagulation après nanofiltration Tableau XIII: Bilan en protéines totales N essai Volume Protéines Perméat 15Protéines Rendement 7o Totales Totales nanofiltration l g/l mg 1 /1 g %
97 E 2703 120,0 4,6 552 114,6 4,4 504 95,7 97 E 0204 102,0 4,8 490 108,7 4,4 478 97,7 97 E 0804 112,0 6,4 717 116,7 5,9 689 96,0 97 E 0904 110,0 5,5 605 121,4 5,0 607 100,3 97 E 1504 112,0 4,8 538 112,0 4,8 538 94,0 Moyenne/écart 111,2 5,2 580 114,7 4,9 563 96,7 type 6,4 0,7 86 4,8 0,6 85 2,4 On note de bons rendements de nanofiltration en protéines totales avec des valeurs supérieures à 90 %.
Les essais sont réalisés à partir de matières premières provenant de lots différents se révèlent parfaitement reproductibles.

Tableau XIV : Bilan en facteurs de coagulation au cours de l'étape de nanofiltration 15 nm N essai FII:C FVII:C FIX:C F X : C
nanofiltration UI/ml UI/ml UI/ml UI/ml Avant Après Avant Après Avant Filtrat Avant Filtrat 97 E 2703 30 36 16,0 15,0 25 23 24 22 97 E 0204 32 28 19,0 18,0 27 25 30 27 97 E 0804 39 39 30,0 26,0 32 35 39 36 97 E 0904 34 39 20,0 17,0 31 26 32 29 97 E 1504 30 30 19,0 19,0 29 29 29 29 Moyenne 33 34,4 20,8 19,0 28,8 27,6 30,8 28,6 / Ecart Type 3,7 5,1 5,4 4,2 2,9 4,7 5,4 5,0 10 On note une bonne reproductibilité des différents essais pour tous les facteurs de coagulation L'étape de chromatographie sur hydroxyapatite céramique permet une bonne récupération pour l'ensemble 15 des facteurs dépendants de la vitamine K. On note que les concentrations avant et après nanofiltration sur 15 nm sont très proches démontrant ainsi un rendement élevé de nanofiltration des quatre facteurs de coagulation.

Tableau XV : Evolution de l'activité spécifique au cours de la nanofiltration 15 nm N essai A.S. FII A.S. FVII A.S. FIX A.S. FX
nanofiltration UI/mg UI/mg UI/mg UI/mg Avant Après Avant Après Avant Après Avant Après 97 E 2703 6,5 8,2 3,5 3,4 5,4 5,2 5,2 5,0 97 E 0204 6,7 6,4 4, 0 4, 1 5, 6 5,7 6,3 6, 1 97 E 0804 6,1 6,6 4,7 4,4 5,0 5,9 6,1 6,1 97 E 0904 6,2 7,8 3, 6 3,4 5, 6 5,2 5,8 5, 8 97 E 1504 6,3 6,3 4, 0 4,0 6, 0 6,0 6,0 6, 0 Moyenne 6,4 7,1 4,0 3,9 5,5 5,6 5,9 5,8 / Ecart Type 0,24 0,88 0,47 0,44 0,36 0,38 0,42 0,46 Les activités spécifiques déterminées pour tous les facteurs de coagulation sont de même ordre pour tous les essais réalisés avant et après nanofiltration. L'activité
spécifique déterminée par rapport au facteur IX est supérieure à 5 pour tous les essais réalisés.
Tableau XVI : Rendement en facteurs de coagulation après nanofiltration 15 nm N essai FII:C FVII:C FIX:C FX:C
nanofiltration % % % %
97 E 2703 120,0 100,0 104,5 95,7 97 E 0204 93,2 101,0 98,7 95,9 97 E 0804 104,2 90,3 114,0 96,2 97 E 0904 126, 6 93,8 92, 6 100, 0 97 E 1504 84,8 107,5 98,4 95,2 Moyenne 105,8 98,5 101,6 96, 6 / Ecart Type 17,6 6,7 8,1 1,9 On observe pour chaque essai réalisé un rendement de même ordre (et supérieur à 90%) pour tous les facteurs de coagulation.

G.2.3 - Détermination de l'activité thrombique La détermination de l'activité thrombique est réalisée sur un appareil automatique détectant l'apparition d'un caillot par opacification de l'échantillon.

L'analyse réalisée correspond à un test de coagulation dont la sensibilité permet la détection d'une faible quantité de thrombine résiduelle dans un échantillon. Le résultat est conforme si l'on obtient une absence de coagulation après 6 heures à 37 C et après 24 heures à 24 C.
Aucune génération de thrombine n'est observée au cours de la nanofiltration de l'éluat résultant de l'hydroxyapatite. La détermination de l'activité
thrombique indique une absence de coagulation après 6 Heures à 37 C. Toutefois, les tests réalisés montrent qu'un début de formation de caillot peut être observé au temps 24 Heures, ce résultat étant confirmé par un test réalisé de façon traditionnelle en bain-Marie.

Des expériences ont été réalisées pour déterminer si l'ajout d'un inhibiteur de protéases, tel que par exemple l'antithrombine III permet de faire disparaître l'activité thrombique résiduelle observée à 24 heures.

La détermination des activités protéasiques a été
réalisée par spectrophotomètrie, en utilisant des substrats chromogénes spécifiques. L'hydrolyse d'un substrat chromogène spécifique par une protéase s'accompagne en effet de la libération d'une molécule de couleur jaune détectée à 405 nm, dont la vitesse d'apparition est proportionnelle à la concentration de l'enzyme de la solution testée.

Tableau XVII Détermination de l'activité
thrombique avec le substrat chromogène S 2238 S 2238 + i S 2238 S 2238 Activité IIa Etapes 2581 + AT-III
U Do 0 U Do U DO + Héparine PPSB-PI-1 97 E 1106 0,0172 0,0142 0,0030 0,0149 Eluat HA dialysé
97 E 1106 0,0314 0,0200 0,0114 0,0339 Filtrat 15 nm 97 E 2506 0,0065 0,0020 0,0045 0,0014 97 E 1007 0,0075 0,0015 0,0060 0,0021 97 E 1607 0,0090 0,0021 0,0069 0,0017 97 E 1707 0,0103 0,0018 0,0085 0,0018 Le substrat S2238 est un substrat spécifique de la thrombine. On note qu'en absence d'inhibiteur, une activité résiduelle de type thrombine est observée dans tous les échantillons testés. Cette activité est sensiblement inhibée par l'addition de l'inhibiteur de la thrombine i 2581 et de façon équivalente en présence d'un mélange d'Antithrombine III (AT-III) et d'héparine. La thrombine peut donc être neutralisée efficacement par son inhibiteur physiologique l'AT-III en présence d'héparine.

L'activité thrombique résiduelle mesurée par le test de l'activité thrombique avec le substrat chromogène correspond à une activité inférieure à 0,01 UI/ml dans les filtrats 15 nm.

L'aprotinine montre également une bonne efficacité
pour l'inhibition des protéases résiduelles. Toutefois, l'origine bovine de cet inhibiteur ne permet pas de l'utiliser dans le cadre de la purification de produits destinés à un usage thérapeutique chez l'homme.

G.2.4 - Caractérisation du concentré protéique par électrophorèse SDS Page Ainsi qu'on peut le voir sur la Figure 7, la 5 majorité des protéines de haut poids moléculaire ont été
éliminées dans la fraction non adsorbée de la chromatographie sur hydroxyapatite HA Céramique. On ne note pas de différence notable de composition à l'étape de nanofiltration 15 nm, le filtrat 15 nm se révélant en 10 tous points similaire au concentré protéique avant nanofiltration.
La bande majeure à 66 kDa correspond essentiellement à la prothrombine qui représente à elle seule environ 60 % des protéines totales du concentré protéique.
G.2.5 - Caractérisation du facteur IX par immunoblot Un immunoblot est réalisé après électrophorèse sur gel SDS Page 10 % homogène sans réducteur. Après transfert sur nitrocellulose et saturation avec de l'albumine, un contact avec un anticorps primaire monoclonal anti-facteur IX (Sigma Réf. F1020) est réalisé. Le marquage par un anticorps secondaire anti-souris marqué à la péroxydase (BioRad) est réalisé avant révélation par technique ECL sur film d'autoradiographie (Pierce). Les résultats sont montrés dans la figure 8. On observe, la présence de bandes non spécifiques dans les puits correspondant au PI-1.

Au contraire, l'éluat dialysé provenant de la colonne hydroxy-apatite céramique ne présente d'une seule bande homogène. On ne note par ailleurs pas de différence visible après nanofiltration 15 nm, ni avec le facteur IX
HP utilisé comme témoin.
G.2.6 - Conclusion La nanofiltration sur filtre Planova Asahi 15 nm de l'éluat dialysé résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite céramique a été réalisée de façon reproductible en respectant des conditions opératoires standardisées.

On note de façon reproductible, une diminution du débit proportionnel au poids filtré. La capacité
volumétrique moyenne du filtre est de l'ordre de 10 1/m2 de membrane, ce qui correspond à une capacité moyenne de 47,9 4,7 g de protéines pour les essais réalisés.

Le bilan en protéines totales donne un rendement moyen de 91,1 14,0 %, comparable au rendement en facteurs de coagulation 99,4 22,2 pour le FII :C, 91,5 18,2 pour le facteur VII :C, 95,8 16,1 pour le facteur IX :C et 90,5 15,1 pour le facteur X :C.
L'activité spécifique pour les différents facteurs est de même ordre avant et après nanofiltration.

On ne note pas de différence notable avant et après filtration 15 nm par caractérisation par électrophorèse SDS Page.
H - Essais d'optimisation de la stabilité de la solution au cours de la fabrication Des essais complémentaires ont été réalisés en faisant varier différents paramètres avec pour objectif d'obtenir un éluat résultant de l'hydroxyapatite qui puisse être filtré sur 15 nm et présenter une teneur très faible ou inexistante en activité thrombique.

Tableau XVIII: Liste des essais réalisés pour la stabilisation de l'éluat hydroxy-apatite céramique N essai Formulation Matière Benzamidine AT III Héparine Activité
N première mMol/1 U/ml UI/ml Thrombique 97 E 1806 a Congelée 50 - 2,0 Conforme 97 E 1007 a Fraîche - 2,0 * 5,0 Conforme b Fraîche - 0,5 ** 2,0 Conforme b Fraîche - 0,5 ** - Conforme * AT-III additionné au moment du traitement Solvant Détergent avant chromatographie ** AT-III additionné avant ultrafiltration Formulation a : NaCl 0,13 M - Citrate de Sodium 0,010 M, Lysine HCl 2,0 g/l, Arginine HCl 2,0 g/l, pH 7,0 0'l Formulation b : NaCl 0,13 M, Citrate de Sodium 0,010 M, pH 7,0 0,1 Afin de pouvoir comparer les résultats des essais entre eux, les paramètres de conduite de l'étape de nanofiltration n'ont pas été modifiés.
Dans l'essai 97E1806, de la benzamidine 50 mM a été
ajoutée dans les tampons et de l'héparine 2UI/ml a été
ajoutée avant l'étape de nanofiltration sur 15 nm. Le concentré de protéines résultant de la nanofiltration sur filtre de porosité 15 nm ne présente pas d'activité
thrombique.

Lors de l'essai 97E1007, de l'héparine 5 UI/ml et de l'AT-III 2 U/ml ont été ajoutées au moment du traitement Solvant Détergent et avant l'étape de chromatographie sur hydroxyapatite, une bonne filtrabilité de 12,5 1/m2 et une absence de coagulation (et donc d'activité
thrombique) sont observées.

Dans les essais 97E2312 et 97E3012, de l'héparine 2 UI/ml et de l'AT-III 0,5 UI/ml sont ajoutées directement dans l'éluat résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite avant étape d'ultrafiltration. Le concentré de protéines résultant de la nanofiltration sur filtre de porosité 15 nm ne présente pas d'activité
thrombique.

Dans les essais 98E0801 et 98E1301, de l'AT-III 0,5 UI/ ml est ajoutée en absence d'héparine dans léluat résultant de la chromatographie sur hydroxyapatite avant l'ultrafiltration. Dans ces deux cas, le concentré de protéines résultant de la nanofiltration sur filtre de porosité 15 nm ne présente pas d'activité thrombique.
L'antithrombine III constitue par conséquent un bon inhibiteur de l'activité thrombique du concentré
protéique contenant le complexe prothrombique de l'invention. L'héparine semble en outre agir comme un cofacteur de l'AT-III et potentialiser l'activité
inhibitrice de cette dernière. La meilleure efficacité de l'antithrombine est ainsi obtenue lorsque celle-ci est ajoutée dans l'éluat de chromatographie hydroxyapatite.
Il apparaît en effet que l'antithrombine ne se fixe que très peu sur l'hydroxyapatite.

I - Comparaison entre le concentré de protéines obtenu par le procédé de l'invention et un concentré
obtenu par un procédé comprenant une chromatographie sur résine échangeuse d'ions en remplacement de la chromatographie sur hydroxyapatite Tableau XIX : Comparaison de la composition d'un PPSB purifié avec une chromatographie d'échange d'ions en remplacement de la chromatographie sur hydroxyapatite et du concentré selon l'invention nanofiltré 15 N
Caractéristiques Concentré obtenu par Concentré
un procédé nanofiltré
comprenant une obtenu par le chromatographie procédé de d'échange d'anions l'invention en remplacement de l'hydroxyapatite Protéines totales 32,0 7,5 5,0 0,6 mg/ml AS UI FIX/mg 0,8 0,2 5,9 0,4 FII UI/ml 40,0 8 35,0 4,8 FVII UI/ml 26,5 8,5 19,0 3,8 FIX UI/ml 25,5 5,5 27,8 4,2 FX UI/ml 40 8 29,2 4,7 Activité thrombique à Absence Absence 37 C à 6 heures Activité thrombique à Absence Absence 25 C à 24 heures Héparine UI / UI FIX 0,1 - 0,25 0,1 - 0,25 Antithrombine UI/ml Absence 0,5 - 1 Les résultats du tableau XIX montrent que la chromatographie sur hydroxy-apatite céramique effectuée dans le cadre du procédé de la présente invention permet d'obtenir un taux de purification des protéines dépendantes de la vitamine K très largement supérieur à
celui qui serait obtenu avec l'utilisation d'une seconde résine échangeuse d'anions en remplacement de l'hydroxyapatite de l'invention. Par ailleurs, L'ensemble des facteurs dépendants de la vitamine K représentent 70 à 80 % des protéines totales pour le concentré nanofiltré
obtenu par le porcédé de la présente invention, contre 15 à 17 % seulement pour un concentré qui serait produit en utilisant une seconde résine échangeuse d'anions en 5 remplacement de l'hydroxyapatite.

On note également que les ratios respectifs des facteurs de coagulation composant le complexe prothrombique sont comparables dans les concentrés 10 obtenus par les deux procédés susmentionnés.

Claims (19)

1. Procédé de préparation d'une composition de complexe prothrombique comprenant les étapes suivantes :
a) fournir un surnageant d'un cryoprécipité de plasma b) appliquer ledit surnageant sur une résine échangeuse d'anions, et éluer en un éluat contenant ledit complexe et des protéines de haut poids moléculaire, c) appliquer l'éluat résultant de l'étape b) sur une colonne d'hydroxyapatite, d) éluer en un éluant contenant ledit complexe.
2. Le procédé selon la revendication 1 comprenant une étape additionnelle de préélution cl), ladite préélution étant de préférence effectuée à un pH compris entre 6,5 et 8,5, de préférence environ 8,avec un tampon phosphate de sodium ou phosphate de potassium, notamment en une concentration de 0,005 à 0,05M, avantageusement de 0,01 à 0,05M, avantageusement de 0,02 à 0,05M, et de manière préférée 0,03M, ledit tampon comprenant également de préférence du NaCl, avantageusement en une concentration de 0,25 M.
3. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'élution de l'étape d) est réalisée avec un tampon phosphate de potassium de préférence 0,5 M, NaCl 0,075 M, pH 8.
4. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant au moins une étape additionnelle d'inactivation virale de l'éluat résultant de l'étape b) et/ou de l'éluat résultant de l'étape d).
5. Le procédé selon la revendication 4 dans lequel ladite au moins une étape d'inactivation virale est effectuée sur l'éluat résultant de l'étape b) sous la forme d'un traitement solvant-détergent, de préférence en présence d'un mélange Tween(polysorbate 80)-TnBP, de préférence par un mélange polysorbate 80 1%(v/v) - TnBP
0,3% (v/v).
6. Le procédé selon l'une des revendications 4 ou 5, comprenant au moins une étape additionnelle d'élimination virale effectuée sur l'éluat résultant de l'étape d) sous la forme d'une nanofiltration, de préférence sur un filtre ayant une porosité de 15 à
100nm, de préférence sur un filtre ayant une porosité de 15nm.
7. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant au moins une étape additionnelle de diafiltration-ultrafiltration après l'étape b) et/ou après l'étape d).
8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle l'étape b) comprend 2 sous-étapes mises en oeuvre sur deux résines échangeuses d'anions distinctes.
9. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la résine échangeuse d'anions de l'étape b) possède un groupe chargé positivement choisi parmi le diéthylaminoéthane (DEAE), la polyéthylèneimine (PEI) et l'aminoéthane quaternaire (QAE), ladite résine échangeuse d'anions étant de préférence du type DEAE.
10. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant l'addition d'un inhibiteur de la thrombine, de préférence l'antithrombine III ou d'un mélange d'antithrombine III et d'héparine après l'étape b) ou après l'étape d).
11. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la composition comprend en outre d'autres protéines dépendantes de la vitamine K tel que C, S et Z.
12. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant une étape additionnelle finale de formulation, de préférence par lyophilisation et/ou addition d'adjuvants ou de véhicules pharmaceutiquement acceptables.
13. Composition de complexe prothrombique susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, et dont la concentration en Immunoglobulines, et de préférence en IgM, est inférieure à 0,1 %, et/ou dont la concentration en fibrinogène est inférieure à 0,1 %, et/ou dont la concentration en fibronectine est inférieure à 0,1 %
et/ou dont la concentration en facteurs du complément est inférieure à 0,1 %.
14. Composition de complexe prothrombique selon la revendication 13, dont l'activité spécifique moyenne du FIX est d'au moins 4 UI par mg de protéines.
15. Composition de complexe prothrombique selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14 comprenant en outre la protéine C, la protéine S et la protéine Z.
16. Composition de complexe prothrombique selon la revendication 15, dans laquel les protéines dépendantes de la vitamine K, constituées par le Facteur II (FII), le Facteur VII (FVII), le Facteur IX (FIX), le Facteur X
(FX), la protéine C, la protéine S et la protéine Z, représentent au minimum 80 %, de préférence 85%, et plus préférablement 90%, des protéines totales de la composition.
17. Composition de complexe prothrombique selon l'une quelconque des revendications 13 à 16 comme médicament.
18. Composition de complexe prothrombique selon l'une quelconque des revendications 13 à 16 comme médicament pour le traitement et la prévention d'accidents hémorragiques liés au déficit en facteurs dépendants de la vitamine K, ou au surdosage en antivitamine K.
19. Composition de complexe prothrombique selon l'une quelconque des revendications 13 à 16 comme médicament pour le traitement et la prévention d'accidents hémorragiques liés à un déficit constitutionnel ou acquis en facteur II ou en facteur X.
CA2764584A 2009-06-05 2010-06-04 Composition de complexe prothrombique Abandoned CA2764584A1 (fr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0902723A FR2946348B1 (fr) 2009-06-05 2009-06-05 Procede de preparation d'une composition de complexe prothrombique a haut degre de purete
FR09/02723 2009-06-05
PCT/IB2010/052497 WO2010140140A1 (fr) 2009-06-05 2010-06-04 Composition de complexe prothrombique

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CA2764584A1 true CA2764584A1 (fr) 2010-12-09

Family

ID=41531870

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CA2764584A Abandoned CA2764584A1 (fr) 2009-06-05 2010-06-04 Composition de complexe prothrombique

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20120087907A1 (fr)
EP (1) EP2438165A1 (fr)
JP (1) JP2012528850A (fr)
KR (1) KR20120047216A (fr)
CN (1) CN102459583A (fr)
AU (1) AU2010255377A1 (fr)
BR (1) BRPI1009641A2 (fr)
CA (1) CA2764584A1 (fr)
FR (1) FR2946348B1 (fr)
IL (1) IL216395A0 (fr)
WO (1) WO2010140140A1 (fr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI641382B (zh) * 2013-01-31 2018-11-21 韓美藥品股份有限公司 於包含因子ｖｉｉ之組成物中使病毒失活之方法
CN103351432A (zh) * 2013-07-09 2013-10-16 武汉中原瑞德生物制品有限责任公司 从血浆组分沉淀中提取人凝血因子ⅷ和人纤维蛋白原的工艺
CN105440127B (zh) * 2015-12-30 2018-10-16 上海莱士血液制品股份有限公司 一种以人血浆Cohn组分III为原料的FEIBA的制备方法
EP3400029B1 (fr) * 2016-01-07 2022-03-02 Eio Biomedical Ltd Compositions pour réduire les adhésions tissulaires
CN106139935A (zh) * 2016-06-23 2016-11-23 广州新克力生物科技有限公司 一种白细胞和血小板的过滤膜及其制备方法
AU2018217375B2 (en) * 2017-02-09 2024-04-18 Csl Behring Gmbh A blood coagulation factor replacement product for use in the treatment or prophylaxis of bleedings
CN109943554B (zh) * 2017-12-21 2021-04-16 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 一种从蛇毒中提取凝血因子x激活剂的方法
CN109593747B (zh) * 2018-12-25 2021-08-10 山东泰邦生物制品有限公司 一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法
CN110835626B (zh) * 2019-12-04 2021-12-21 长春雷允上药业有限公司 一种凝血酶的制备方法
EP3945095A1 (fr) * 2020-07-28 2022-02-02 Bia Separations D.O.O. Processus de purification de concentré de complexe de prothrombine (pcc) et de correction à partir de plasma complet ou de plasma surnageant de cryoprécipité

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2902158A1 (de) 1979-01-20 1980-07-31 Biotest Serum Institut Gmbh Verfahren zur herstellung von fibrinogen, einem die gerinnungsfaktoren ii, vii, ix und x enthaltenden prothrombinkomplex, antithrombin iii und einer loesung von lagerstabilen serumproteinen
DE3101752A1 (de) 1981-01-21 1982-08-26 Behringwerke Ag, 3550 Marburg "verfahren zur reinigung der blutgerinnungsfaktoren ii, vii, ix und/oder x und danach hergestellte praeparationen"
FR2632524B1 (fr) * 1988-06-09 1992-03-13 Fondation Nale Transfusion San Procede de preparation d'une fraction concentree en facteur viia et son application a titre de medicament
FR2679251B1 (fr) 1991-07-18 1993-11-12 Nord Assoc Essor Transfusion San Procede de preparation d'un concentre de thrombine humaine destine a un usage therapeutique.
US5714583A (en) 1995-06-07 1998-02-03 Genetics Institute, Inc. Factor IX purification methods
DE59712322D1 (de) * 1996-03-20 2005-06-30 Baxter Ag Pharmazeutisches Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen
CN101160133B (zh) * 2004-11-05 2013-01-09 普罗瑟拉生物公司 治疗用途的来自人血浆的内-α抑制剂蛋白质的制备和组合物
AU2005318106B2 (en) * 2004-12-23 2011-11-03 Novo Nordisk Health Care Ag Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a Vitamin K-dependent protein of interest
JP2006197464A (ja) 2005-01-17 2006-07-27 Sharp Corp 電話システム

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012528850A (ja) 2012-11-15
US20120087907A1 (en) 2012-04-12
FR2946348B1 (fr) 2011-08-05
EP2438165A1 (fr) 2012-04-11
BRPI1009641A2 (pt) 2015-08-18
AU2010255377A1 (en) 2011-12-15
FR2946348A1 (fr) 2010-12-10
WO2010140140A1 (fr) 2010-12-09
KR20120047216A (ko) 2012-05-11
CN102459583A (zh) 2012-05-16
IL216395A0 (en) 2012-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2764584A1 (fr) Composition de complexe prothrombique
BE1004178A3 (fr) Procede de preparation a l&#39;echelle industrielle d&#39;un concentre de facteur von willebrand humain standardise, de tres haute purete, approprie a un usage therapeutique.
EP0317376B1 (fr) Préparation de concentré de facteur IX humain de haute pureté et d&#39;autres protéines plasmatiques
CA2073734C (fr) Procede de preparation d&#39;un concentre de thrombine humaine destine a un usage therapeutique
TW585871B (en) Improved methods for processing activated protein C
CA2697404A1 (fr) Procede de purification du facteur viii et du facteur von willebrand
EP1962885A2 (fr) Procede de preparation d&#39;un concentre de facteur h et utilisation de ce concentre de facteur h au titre de medicament
EP0512883B1 (fr) Procédé de préparation d&#39;un concentré de facteur XI de la coagulation sanguine à haute activité spécifique, approprié à un usage thérapeutique
CA2551345A1 (fr) Procede de separation des proteines fibrinogenes, facteur xiii et colle biologique d&#39;une fraction plasmatique solubilisee et de preparation de concentres lyophilises desdites proteines
CN116425860A (zh) 因子xa衍生物的制备
EP2292656B1 (fr) Procédé de préparation d&#39;un concentré von Willebrand (fvw) par voie chromatographique et concentré de fvw susceptible d&#39;être ainsi obtenu
WO2011058285A1 (fr) Procede de fabrication d&#39;une preparation de facteur h
FR2952639A1 (fr) Procede de purification de facteur b
RU2734783C2 (ru) Способ отделения фактора viii от продуктов крови
WO2012143483A1 (fr) Procede de preparation d&#39;un concentre de facteur xi
CA2833631C (fr) Nouveau procede de preparation d&#39;un concentre de fv inactive par un virus a partir d&#39;un plasma humain, pouvant etre transpose a l&#39;echelle industrielle
FR2622108A1 (fr) Preparation de concentres de proconvertine (facteur vii), de facteur antihemophilique b (facteur ix) et d&#39;autres proteines plasmatiques, et leur utilisation therapeutique
FR3090321A1 (fr) Procédé de filtration du fibrinogène
FR3064917A1 (fr) Facteur x mute
FR3004451A1 (fr) Procede de preparation d&#39;une solution de proteine c viralement securisee par une double etape de nanofiltration

Legal Events

Date Code Title Description
FZDE Discontinued

Effective date: 20140604