CA2412946A1 - Procede de controle de la qualite microbiologique d'un milieu aqueux et necessaire approprie - Google Patents
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- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Abstract
Procédé de contrôle de la qualité microbiologique d'un milieu aqueux environnemental, susceptible de comporter différents micro-organismes, comprenant les étapes suivantes: on choisit un ensemble de référence, constitué d'au moins trois micro-organismes, représentatifs, ensemble ou séparément, d'un niveau de qualité microbiologique, on dispose d'un nécessaire de détermination microbiologique, constitué d'au moins trois sondes d'identification spécifiquement et respectivement desdits trois microorganismes, après traitement du milieu à analyser, on met lesdits microorganismes, ou toute fraction obtenue à partir de ces derniers, en contact avec ledit nécessaire de détermination, moyennant quoi on multi-détermine lesdits microorganismes, cette détermination étant représentative du niveau de qualité microbiologique du milieu. Nécessaire de détermination microbiologique approprié pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention.
Description
PROCEDE DE CONTRÖLE DE LA QUALITE MICROBIOLOGIQUE D'UN
MILIEU AQUEUX ET NECESSAIRE APPROPRIE
La présente invention relève du domaine du diagnostic microbiologique, des techniques de détection permettant l'identification et la S quantification de microorganismes présents dans des fluides et produits comme par exemple les eaux.
Elle concerne également des nécessaires de dosage et des procédés, permettant ces identifications et quantifications de microorganismes sur des échantillons de volumes importants, en des temps inférieurs à la journée, et permettant éventuellement un contrôle en suivi de production, voire un asservissement des techniques de purification et de production aux résultats de ces dosages.
Les méthodes classiques d'identification microbiologique requièrent une étape de culture sur milieux sélectifs suivie en général d'une identification, selon des caractéristiques morphologiques, biochimiques, et/ou immunologiques.
Ces méthodes sont longues, un jour à plusieurs semaines pour des bactéries à croissance lente, par exemple 10 à 12 jours pour Legionella, jusqu'à un mois pour les Mycobactéries, peu spécifiques, et peu sensibles quand elles sont appliquées à un échantillon complexe polymicrobien (eau, environnement, aliments). De plus, elles ne permettent pas de détecter les bactéries viables non cultivables (VBNC) stressées par des facteurs environnementaux ou des traitements de désinfection, et ne se prêtent pas à
l'automatisation.
Depuis plus de dix ans, les méthodes de biologie moléculaire, en particulier celles basées sur l'amplification enzymatique in vitro (PCR) et l'utilisation de sondes oligonucléotidiques ont rëvolutionné le diagnostic microbiologique.
Grâce à leur rapidité, sensibilité et spécificité, elles constituent une alternative aux méthodes classiques pour détecfier en particulier des microorganismes indicateurs ou pathogènes dans des échantillons d'eau ou fout échantillon, permettant de détecter la présence de tels microorganismes dans l'environnement.
Parmi les méthodes de biologie moléculaire utilisées pour détecter en particulier des microorganismes indicateurs ou pathogènes dans des échantillons d'eau ou tout échantillon, permettant de détecter la présence de
MILIEU AQUEUX ET NECESSAIRE APPROPRIE
La présente invention relève du domaine du diagnostic microbiologique, des techniques de détection permettant l'identification et la S quantification de microorganismes présents dans des fluides et produits comme par exemple les eaux.
Elle concerne également des nécessaires de dosage et des procédés, permettant ces identifications et quantifications de microorganismes sur des échantillons de volumes importants, en des temps inférieurs à la journée, et permettant éventuellement un contrôle en suivi de production, voire un asservissement des techniques de purification et de production aux résultats de ces dosages.
Les méthodes classiques d'identification microbiologique requièrent une étape de culture sur milieux sélectifs suivie en général d'une identification, selon des caractéristiques morphologiques, biochimiques, et/ou immunologiques.
Ces méthodes sont longues, un jour à plusieurs semaines pour des bactéries à croissance lente, par exemple 10 à 12 jours pour Legionella, jusqu'à un mois pour les Mycobactéries, peu spécifiques, et peu sensibles quand elles sont appliquées à un échantillon complexe polymicrobien (eau, environnement, aliments). De plus, elles ne permettent pas de détecter les bactéries viables non cultivables (VBNC) stressées par des facteurs environnementaux ou des traitements de désinfection, et ne se prêtent pas à
l'automatisation.
Depuis plus de dix ans, les méthodes de biologie moléculaire, en particulier celles basées sur l'amplification enzymatique in vitro (PCR) et l'utilisation de sondes oligonucléotidiques ont rëvolutionné le diagnostic microbiologique.
Grâce à leur rapidité, sensibilité et spécificité, elles constituent une alternative aux méthodes classiques pour détecfier en particulier des microorganismes indicateurs ou pathogènes dans des échantillons d'eau ou fout échantillon, permettant de détecter la présence de tels microorganismes dans l'environnement.
Parmi les méthodes de biologie moléculaire utilisées pour détecter en particulier des microorganismes indicateurs ou pathogènes dans des échantillons d'eau ou tout échantillon, permettant de détecter la présence de
2 tels microorganismes dans l'environnement, on peut citer notamment les suivantes.
Pour la détection des indicateurs de contamination fécale (coliformes totaux, thermotolérants, E colis usuellement recherchés dans le contrôle sanitaire de l'eau, des tests rapides basés sur une PCR-hybridation avec une sonde ont été développés pour des échantillons d'eau potable notamment [Bej, A. K. et al. Appl. Environ. Microbiol, 1990, n° 56, p.
307-314].
[Fricker, E.J. et al., Letters in Applied Microbiology, 1994, n° 19, p.
44-46].
Ces indicateurs de contamination fécale ne permettent cependant pas de prédire la présence de contamination bactérienne d'origine non fécale (Pseudomonas aeruginosa, Legionella...) ainsi que de contaminations non bactériennes (virus et parasites).
Des tests de détection moléculaire basés sur la PCR pour rechercher spécifiquement des microorganismes pathogènes (bactéries, virus parasites) ont donc été développés.
Dans le domaine de ia détection des bactéries, on notera notamment le brevet européen EP-A-0 438 115 qui décrit une méthode de détection des microorganismes pathogènes Legionella et des indicateurs de contamination fécale, via une étape d'amplification enzymatique in vitro dans des échantillons aquatiques environnementaux.
Plusieurs publications font également état de tests PCR pour détecter les Salmonelles dans l'eau et l'environnement, [Way,J.S. et al., Appl.
Environm. Microbiol., 1993, n° 59, p. 1473-1479] [lNaage, A.S. et al., Appl.
Microbiol., 1999, n° 87, p. 418-428], de même que les Légionelles [Bej, A. K., Appl. Environ. Microbiol., 1991, n° 57, p. 2429-2432], Dans US-B-5,298,392 la détection d'indicateurs de contaminations fécales et pathogènes est décrite.
Dans le domaine de la détection des virus, leur présence n'étant pas corrélée à celle des indicateurs de contamination fécale traditionnellement recherchés dans le contrôle sanitaire de l'eau, des méthodes d'analyse rapides et efficaces sont nécessaires notamment pour le contrôle des contaminations virales des eaux.
Les méthodes conventionnelles pour détecter les virus dans l'eau et l'environnement requièrent une étape de culture cellulaire animale, méthode longue, lourde et contraignante, restreinte â quelques familles de virus.
Pour la détection des indicateurs de contamination fécale (coliformes totaux, thermotolérants, E colis usuellement recherchés dans le contrôle sanitaire de l'eau, des tests rapides basés sur une PCR-hybridation avec une sonde ont été développés pour des échantillons d'eau potable notamment [Bej, A. K. et al. Appl. Environ. Microbiol, 1990, n° 56, p.
307-314].
[Fricker, E.J. et al., Letters in Applied Microbiology, 1994, n° 19, p.
44-46].
Ces indicateurs de contamination fécale ne permettent cependant pas de prédire la présence de contamination bactérienne d'origine non fécale (Pseudomonas aeruginosa, Legionella...) ainsi que de contaminations non bactériennes (virus et parasites).
Des tests de détection moléculaire basés sur la PCR pour rechercher spécifiquement des microorganismes pathogènes (bactéries, virus parasites) ont donc été développés.
Dans le domaine de ia détection des bactéries, on notera notamment le brevet européen EP-A-0 438 115 qui décrit une méthode de détection des microorganismes pathogènes Legionella et des indicateurs de contamination fécale, via une étape d'amplification enzymatique in vitro dans des échantillons aquatiques environnementaux.
Plusieurs publications font également état de tests PCR pour détecter les Salmonelles dans l'eau et l'environnement, [Way,J.S. et al., Appl.
Environm. Microbiol., 1993, n° 59, p. 1473-1479] [lNaage, A.S. et al., Appl.
Microbiol., 1999, n° 87, p. 418-428], de même que les Légionelles [Bej, A. K., Appl. Environ. Microbiol., 1991, n° 57, p. 2429-2432], Dans US-B-5,298,392 la détection d'indicateurs de contaminations fécales et pathogènes est décrite.
Dans le domaine de la détection des virus, leur présence n'étant pas corrélée à celle des indicateurs de contamination fécale traditionnellement recherchés dans le contrôle sanitaire de l'eau, des méthodes d'analyse rapides et efficaces sont nécessaires notamment pour le contrôle des contaminations virales des eaux.
Les méthodes conventionnelles pour détecter les virus dans l'eau et l'environnement requièrent une étape de culture cellulaire animale, méthode longue, lourde et contraignante, restreinte â quelques familles de virus.
3 De nombreuses méthodes basées sur une _ étape d'amplification enzymatique ont été décrites pour rechercher les virus pathogènes dans l'eau et l'environnement. A titre d'exemples, on pourra citer, pour la détection par RT-PCR des Enterovirus, Hépatite A et Rotavirus, dans des échantillons d'eau [Abbaszadegan M. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1997, n° 63(1 ), p.
324-328]
et [Gilgen M. et al. , International Journal of food Microbiology, 1997 , n° 37, p.
189-199]
Dans le domaine de la détection des parasites notamment pour la détection de Giardia et Cryptosporidium qui sont deux parasites, dont la transmission dans l'eau et l'environnement sous une forme enkystée (oocyste et cyste) les rend particulièrement résistants aux traitement classiques de désinfection comme la chloration, des , méthodes conventionnelles standardisées . (EPA 1622-1623 et DWI) ont été mises au point. Elles comprennent une étape de filtration suivie d'une capture immunomagnétique (/MS) des oocystes et d'une détection par immunofluorescence (/FA). Ces méthodes sont longues, fastidieuses, non spécifiques des espèces pathogènes pour l'homme (Giardia lamblia et Cryptosporidium parvum) et ne permettent pas de déterminer la viabilité des parasites détectés.
Des mëthodes moléculaires plus rapides, sensibles et spécifiques basées sur une étape d'amplification enzymatique (PCR) ont été décrites.
Dans WO-A-94102635, WO-A-97102281 et US-A-5,693,472 des amorces et sondes pour détecter l'espèce C. parvum dans des échantillons aquatiques et/ou biologiques sont décrits.
EP-A-0 453 290 et US-A-5,558,989 décrivent une méthode de détection de l'espèce pathogène chez l'homme, Giardia lamblia, basée sur l'utilisation de sondes nucléiques (ADN et/ou ARN) correspondant à la séquence de 18S rRNA. EP-A-0 550 883 décrit un test PCR avec réactifs pour rechercher G. lamblia dont la sensibilité est de 1-5 oocystes I ml de concentrat d'eau.
Des méthodes moléculaires distinguant les parasites morts des parasites viables etlou infectieux permettant ainsi de mieux apprécier le risque sanitaire réel posé par la présence de ces parasites dans l'eau ont été
décrites.
On citera notamment WO-A-97/42349 qui .concerne la dëtection des Cryptosporidium et Giardia viables (par dëtection des ARNm des protéines de chocs thermiques hsp 70) et/ou infectieux (culture cellulaire et amplification enzymatique) et US-A-5,556,774 qui concerne une méthode de détection des
324-328]
et [Gilgen M. et al. , International Journal of food Microbiology, 1997 , n° 37, p.
189-199]
Dans le domaine de la détection des parasites notamment pour la détection de Giardia et Cryptosporidium qui sont deux parasites, dont la transmission dans l'eau et l'environnement sous une forme enkystée (oocyste et cyste) les rend particulièrement résistants aux traitement classiques de désinfection comme la chloration, des , méthodes conventionnelles standardisées . (EPA 1622-1623 et DWI) ont été mises au point. Elles comprennent une étape de filtration suivie d'une capture immunomagnétique (/MS) des oocystes et d'une détection par immunofluorescence (/FA). Ces méthodes sont longues, fastidieuses, non spécifiques des espèces pathogènes pour l'homme (Giardia lamblia et Cryptosporidium parvum) et ne permettent pas de déterminer la viabilité des parasites détectés.
Des mëthodes moléculaires plus rapides, sensibles et spécifiques basées sur une étape d'amplification enzymatique (PCR) ont été décrites.
Dans WO-A-94102635, WO-A-97102281 et US-A-5,693,472 des amorces et sondes pour détecter l'espèce C. parvum dans des échantillons aquatiques et/ou biologiques sont décrits.
EP-A-0 453 290 et US-A-5,558,989 décrivent une méthode de détection de l'espèce pathogène chez l'homme, Giardia lamblia, basée sur l'utilisation de sondes nucléiques (ADN et/ou ARN) correspondant à la séquence de 18S rRNA. EP-A-0 550 883 décrit un test PCR avec réactifs pour rechercher G. lamblia dont la sensibilité est de 1-5 oocystes I ml de concentrat d'eau.
Des méthodes moléculaires distinguant les parasites morts des parasites viables etlou infectieux permettant ainsi de mieux apprécier le risque sanitaire réel posé par la présence de ces parasites dans l'eau ont été
décrites.
On citera notamment WO-A-97/42349 qui .concerne la dëtection des Cryptosporidium et Giardia viables (par dëtection des ARNm des protéines de chocs thermiques hsp 70) et/ou infectieux (culture cellulaire et amplification enzymatique) et US-A-5,556,774 qui concerne une méthode de détection des
4 . Cryptosporidium viables par combinaison d'une étape PCR et une étape d'excystation in vitro.
Si les principales méthodes moléculaires citées ci-dessus pour rechercher des indicateurs de contamination et des microorganismes pathogènes incluant des bactéries, parasites, et virus sont beaucoup plus performantes que les méthodes classiques en termes de rapidité, sensibilité et spécificité, elles ne ciblent qu'un type de micro-organisme par test.
Aussi pour mesurer ou détecter plusieurs paramètres il faudrait mettre en oeuvre autant de tests spécifiques, pue de paramètres à mesurer ou détecter, ce qui rend une analyse microbiologique complète extrêmement lourde.
Quelques approches de multidétection ont été décrites mais leur capacité de multidétection est faible puisqu'elles ne détectent au maximum que 3 paramètres.
On citera en particulier la technique de multiplex PCR qui consiste à réaliser plusieurs réactions PCR dans le même tube.
A titre d'exemple dans [Bej, A. K. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1991, n° 57, p. 597-700] on décrit la détection simultanée de Legionella et L. pneumophila et la détection simultanée sur E. coli, Salmonelle et Shigella, dans [Bej, A. K. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1991, n° 57, p.
2429-2432] la détection simultanée des coliformes totaux, E coli et Shigella, et dans EP-A-0 438 115 la détection des Legionelles et indicateurs de contamination fécales.
La technique d'hybridation in situ (FISH) réalisëe avec deux ou au maximum trois sondes fluorescentes peut permettre de détecter plusieurs paramètres simultanément mais avec une sensibilité moins élevée que les méthodes d'amplification enzymatique citées ci-dessus.
Dans la publication [Eggers, M. et al., Presented et the 27t"
International Conference on Environmental Systems, 1997], on décrit une approche pour détecter simultanément des microorganismes de l'eau et l'air dans l'espace. Cette approche ne cible que les bactéries, par exemple E. coli et Vibrio proteolyticus, par hybridation directe de l'ARNr 16S sur un support solide (microplaque à 96 puits). 1l n'y a pas d'étape d'amplification enzymatique aussi la sensibilité est peu élevée, et la capacité de multidétection est restreinte à quelques microorganismes, néanmoins une méthode de multidétection dans l'eau et l'air utilisant une technique apparentée aux biopuces est décrite.
Avant de poursuivre, et pour la clarté et la bonne compréhension, différents termes utilisés dans la descripfiion et les revendications nécessitent d'être définis.
- Un fragment nucléotidique, ou un oligonucléotide, ou un
Si les principales méthodes moléculaires citées ci-dessus pour rechercher des indicateurs de contamination et des microorganismes pathogènes incluant des bactéries, parasites, et virus sont beaucoup plus performantes que les méthodes classiques en termes de rapidité, sensibilité et spécificité, elles ne ciblent qu'un type de micro-organisme par test.
Aussi pour mesurer ou détecter plusieurs paramètres il faudrait mettre en oeuvre autant de tests spécifiques, pue de paramètres à mesurer ou détecter, ce qui rend une analyse microbiologique complète extrêmement lourde.
Quelques approches de multidétection ont été décrites mais leur capacité de multidétection est faible puisqu'elles ne détectent au maximum que 3 paramètres.
On citera en particulier la technique de multiplex PCR qui consiste à réaliser plusieurs réactions PCR dans le même tube.
A titre d'exemple dans [Bej, A. K. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1991, n° 57, p. 597-700] on décrit la détection simultanée de Legionella et L. pneumophila et la détection simultanée sur E. coli, Salmonelle et Shigella, dans [Bej, A. K. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1991, n° 57, p.
2429-2432] la détection simultanée des coliformes totaux, E coli et Shigella, et dans EP-A-0 438 115 la détection des Legionelles et indicateurs de contamination fécales.
La technique d'hybridation in situ (FISH) réalisëe avec deux ou au maximum trois sondes fluorescentes peut permettre de détecter plusieurs paramètres simultanément mais avec une sensibilité moins élevée que les méthodes d'amplification enzymatique citées ci-dessus.
Dans la publication [Eggers, M. et al., Presented et the 27t"
International Conference on Environmental Systems, 1997], on décrit une approche pour détecter simultanément des microorganismes de l'eau et l'air dans l'espace. Cette approche ne cible que les bactéries, par exemple E. coli et Vibrio proteolyticus, par hybridation directe de l'ARNr 16S sur un support solide (microplaque à 96 puits). 1l n'y a pas d'étape d'amplification enzymatique aussi la sensibilité est peu élevée, et la capacité de multidétection est restreinte à quelques microorganismes, néanmoins une méthode de multidétection dans l'eau et l'air utilisant une technique apparentée aux biopuces est décrite.
Avant de poursuivre, et pour la clarté et la bonne compréhension, différents termes utilisés dans la descripfiion et les revendications nécessitent d'être définis.
- Un fragment nucléotidique, ou un oligonucléotide, ou un
5 polynucléotide, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à
un fragment nucléotidique dans des conditions prédéterminées, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à
partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique.
- Un motif nucléotidique est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les ëiéments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou de l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifië dans l'un au moins des trois éléments constitutifs précités ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soif au niveau des bases, avec des , bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide [P.E. Nielsen et al, Science, 1991, n° 254, p. 1497-1500], soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates.
- Par "séquence « informationnelle », on entend toute suite ordonnée de motifs de type riucléotidique, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent une information de même qualité que celle des acides nucléiques naturels.
- Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogène stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique « capable de s'hybrider » avec un polynucléotide est un fragment
un fragment nucléotidique dans des conditions prédéterminées, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à
partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique.
- Un motif nucléotidique est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les ëiéments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou de l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifië dans l'un au moins des trois éléments constitutifs précités ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soif au niveau des bases, avec des , bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide [P.E. Nielsen et al, Science, 1991, n° 254, p. 1497-1500], soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates.
- Par "séquence « informationnelle », on entend toute suite ordonnée de motifs de type riucléotidique, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent une information de même qualité que celle des acides nucléiques naturels.
- Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogène stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique « capable de s'hybrider » avec un polynucléotide est un fragment
6 pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des cond~tior~s d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques.
La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier.
En général, selon la longueur des sondes utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 65°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1 molaire.
- Une sonde est un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 monomères, notamment de 6 à 35 monomères, possédant une spécificité
d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique ayant, par exemple, une séquence nucléotidique comprise dans un ARN ribosomique, l'ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN ribosomique et l'ADN (appelé ici ADN
ribosomique ou ADNr) dont ledit ARN ribosomique est le produit de transcription ; une sonde peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de détection).
- Une sonde de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exempte par covalence ou adsorption.
- Une sonde de détection peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes (notamment une peroxydase, une phosphatase alcaline, ou une enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent), des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes
La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier.
En général, selon la longueur des sondes utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 65°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1 molaire.
- Une sonde est un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 monomères, notamment de 6 à 35 monomères, possédant une spécificité
d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un fragment nucléotidique ayant, par exemple, une séquence nucléotidique comprise dans un ARN ribosomique, l'ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN ribosomique et l'ADN (appelé ici ADN
ribosomique ou ADNr) dont ledit ARN ribosomique est le produit de transcription ; une sonde peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de détection).
- Une sonde de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exempte par covalence ou adsorption.
- Une sonde de détection peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes (notamment une peroxydase, une phosphatase alcaline, ou une enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent), des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes
7 - ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine.
- Une amorce est une sonde comprenant de 5 à 100, préférentiellement de 10 à 40 motifs nuclëotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé de séquençage, dans une méthode de transcription inverse, etc...
- L'identité entre un fragment et une séquence de référence, qui caractérise le degré d'identité entre ledit fragment et ladite séquence, est mesuré par alignement dudit fragment sur ladite séquence puis détermination du nombre de monomères identiques entre les deux.
Les sondes et amorces selon l'invention sont choisies parmi (a) les séquences identifiées dans le listage de séquences annexé
à la description, (b) tout fragment des séquences (a), à la fois, comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque des séquences (a) et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite séquence (a) ; à titre d'exemple, un fragment (b) comporte 10 nucléotides parmi lesquels 5 nucléotides contigus appartiennent à une séquence (a) et au moins 2 nucléotides des 5 nucléotides restants sont identiques respectivement aux deux nucléotides correspondants dans la séquence de référence, après alignement.
- Par séquence d'identification, on désigne toute séquence ou tout fragment tel que défini ci-dessus, pouvant servir de sonde de détection et/ou de capture.
- Par traitement du milieu aqueux, on entend toute étape de filtration et/ou de lyse et/ou de purification.
- Par étape de lyse, on entend une étape capable de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des microorganismes (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet de la Demanderesse WO-A-00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, WO-A-99/53304 sur la lyse électrique, et WO-A-99/15321 sur la lyse mécanique.
L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US-A-5,234,809).
- Par étape de purification, on entend la séparation entre les acides nucléiques des micro-organismes et les constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnëtiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US-A-4,672,040 et US-A-5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet déposées par la Demanderesse sous les références suivantes : WO-A-97/45202 et WO-A-99/35500.
Dans la dernière de ces demandes de brevet, il s'agit de particules magnétiques thermosensibles ayant chacune un noyau magnétique recouvert d'une couche intermédiaire. La couche intermédiaire est elle-même recouverte par une couche externe à base d'un polymère susceptible d'interagir avec au moins une molécule biologique, le polymère externe est thermosensible et présente une température critique inférieure de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 10 et 100°C et de préférence entre 20 et 60°C.
Cette couche externe est synthétisée à partir de monomères cationiques, qui génèrent un polymère ayant la capacité de lier les acides nucléiques. Cette couche intermédiaire isole les charges magnétiques du noyau, afin d'éviter les problèmes d'inhibition des techniques d'amplification de ces acides nucléiques.
Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne (kits Qiagen par exemple), soit sous forme de particules inertes [Boom R, et al., J.
Clin. Microbiol., 1990, n°28(3), p. 495-503] ou magnétiques (Merck:
MagPrep~
Silica, Promega: MagneSiIT"" Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne (kits Qiagen par exemple) ou en format particulaire paramagnétique (Whatman:
DEAE-Magarose) [Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344].
Une autre méthode très pertinente pour l'invention est celle de l'ads_orption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-BindTM).
- Par étape de détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une méthode de détection à l'aide d'un marqueur.
De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinicat Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, tnd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249].
Dans un premier mode de réalisation de l'invention, une méthode d'hybridation à l'aide de sondes spécifiques est mise en oeuvre pour l'étape de détection. Ce mode d'exécution particulier consiste à mettre en contact les acides nucléiques, amplifiés ou non, des micro-organismes à détecter avec une sonde de capture fixée sur un support solide, et capable de s'hybrider spécifiquement avec lesdits acides nucléiques; puis à révéler, selon les méthodes connues, la présence éventuelle des acides nucléiques fixés au support solide notamment par l'intermédiaire d'au moins une sonde de capture.
Par "marqueur", on entend un traceur capable d'engendrer un signal. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêtagalactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ;
les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, ssS OU X251.
Ainsi, le polynucléotide peut être marqué pendant l'étape d'amplification enzymatique, par exemple en utilisant un nucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le nucléotide marqué
sera un désoxyribonucléotide dans les systèmes d'amplification générant un ADN, comme la PCR, ou un ribonucléotide dans les techniques d'amplification générant un ARN, comme les techniques TMA ou NASBA.
- . Le polynucléotide peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812.
Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides 5 nucléiques est décrit dans la demande FR-A-2 780 059 de la Demanderesse.
Un autre mode préférentiel de détection utilise l'activité exonucléase 5'-3' d'une polymérase tel que décrit par Holland P.M., PNAS (1991 ) p 7276-7280.
Des systèmes d'amplification du signal peuvent être utilisés comme décrit dans le document WO-A-95/08000 et, dans ce cas, la réaction 10 préliminaire d'amplification enzymatique peut ne pas être nécessaire.
- Par amplification enzymatique, on entend une processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique particulier à l'aide d'amorces spécifiques par l'action d'au moins une enzyme. Ainsi, pour l'amplification des acides nucléiques, il existe, entre autres, les techniques suivantes - PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A-4,683,195, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159, - LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0 201 184, - RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069, - 3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995, - NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A-91 /02818, et - TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet U S-A-5, 399, 491.
On parle alors d'amplicons pour désigner les polynucléotides générés par une technique d'amplification enzymatique.
- Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un acide nuclëique. Des matériaux de synthèse, ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose, ou le dextran ;
des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux- minéraux tels pue la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la fiorme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO -A-94/12670, d'une particule ou d'une biopuce.
- Par "biopuce", on entend un support solide de dimension réduite où sont fixés une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées.
A titre d'illustration, des exemples de ces biopuces sont donnés dans les publications de [G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n°16, p. 40 44 ; F. Ginot, Human Mutation, 1997, n°10, p.1-10 ; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n°1(3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, n° 22(15), p. 2915-2921 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n°
16, p. 541-546] ou dans les brevets US-A-4,981,783, US-A-5,700,637, US-A
5, 445, 934, U S-A-5, 744, 305 et U S-A-5, 807, 522.
La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les acides nucléiques tout en générant un bruit de fond minimum pour la méthode de détection. Un avantage des biopuces est qu'elles simplifient l'utilisation de nombreuses sondes de capture permettant ainsi la détection multiple de micro-organismes à détecter tout en tenant compte du polymorphisme desdits micro-organismes à détecter L'invention décrite ci-après permet de résoudre les problèmes posés par les méthodes précédemment décrites, à la fois en terme de sensibilité, spécificité et capacité de multidétection, tout en étant rapide et facile à mettre en oeuvre.
Un premier objet de l'invention est un procédé de contrôle de la qualité microbiologique d'un milieu aqueux environnemental, susceptible de comporter différents micro-organismes, comprenant les étapes suivantes - on choisit un ensemble de référence, constitué d'au moins trois micro-organismes, représentatifs, ensemble ou séparément, d'un niveau de qualité
microbiologique, - on dispose d'un nécessaire de détermination microbiologique, constitué d'au moins trois sondes d'identification spécifiquement et respectivement desdits trois microorganismes, - après traitement du milieu à analyser, on met - I~sdits microorganismes, ou toute fraction obtenue à partir de ces derniers, en contact avec ledit nécessaire de détermination, moyennant quoi on multi-détermine lesdits microorganismes, cette détermination étant représentative du niveau de qualité
microbiologique du milieu.
L'invention concerne aussi un nécessaire de détermination microbiologique comprenant un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus etlou de parasites, lesdites sondes d'identification étant chacune spécifiques d'une espèce ou au moins d'un genre de bactérie, virus ou parasite susceptible d'être présent dans un échantillon de liquide à doser.
Selon l'invention, un nécessaire désigne toute méthode manuelle, semi-automatique ou automatique permettant la mise en oeuvre d'un moyen de dosage, dosage signifiant l'identification et/ou la détermination de la viabilité
et/ou la quantification, chacun de ces trois paramètres étant déterminés en séquence ou selon les combinaisons : identification seule ; identification et quantification ; identification et viabilité ; identification, quantification et viabilité.
Cette invention concerne également une méthode de multidétection utilisant en particulier la technique des biopuces pour rechercher un grand nombre des paramètres microbiologiques incluant des indicateurs de contamination exigés dans les différentes législations (USA, France, Europe) et des microorganismes pathogènes incluant des bactéries, virus et parasites.
En une seule mise en oeuvre une analyse microbiologique complète d'un échantillon peut être réalisée avec rapidité en par exemple environ 4 heures et avec une grande sensibilité par exemple de l'ordre de 1 micro cible/101-1001 grâce à l'étape d'amplification enzymatique.
Cette méthode de multidétection est spécifique des espèces recherchées grâce à l'utilisation de séquences, dites séquences d'identification de chaque espèce, comme sonde, et peut permettre de déterminer la viabilité
des microorganismes par la détection de marqueurs de viabilité comme par exemple, ARNr et/ou ARNm.
La rapidité, la sensibilité et la spécificité de cette méthode de multidétection, permettent de l'appliquer indifféremment à tout milieu aqueux environnemental, c'est à dire tout milieu aqueux à l'exclusion de tout fluide corporel. En particulier cette méthode s'applique à toute eau destinée à la consommation humaine, eaux propres industrielles, eaux résiduaires urbaines et industrielles, eaux de l'industrie agro-alimentaire, eaux de process et à
tout fluide ou produit.
Cette détection simultanée en une seule étape de multiples produits d'amplifications spécifiques, est possible grâce à l'utilisation de support solide en particulier sous la forme d'un support solide de dimension réduite où sont fixées une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées, ou « biopuce », ces sondes de capture étant constituées par un jeu de fragments ou de la totalité de séquences nucléotidiques spécifiques dites séquences d'identification des microorganismes recherchés.
Ces séquences d'identification ou ces fragments peuvent également être mis en oeuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues comme les techniques de dépôt ponctuel sur filtre dites "DOT-BLOT"[Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982], les techniques de transfert d'ADN dites "SOUTHERN BLOT" [Southern E. M., J. Mol. Biol., 1975, 98, 503], les techniques de transfert d'ARN dites "NORTHERN BLOT", ou les techniques "SANDWICH" [Dunn A. R. et al., Cel1,1977, 12,23].
Parmi les microorganismes recherchés, on citera à titre d 'exemple les microorganismes suivants Parmi les bactéries Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 095ï :H7, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis , Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Staphylococcus epidermatitis, Staphylococcus aureus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Pseudomonas aeruginosa;
Vibrio cholerae, Acinetobacter baumanü, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, le genre Mycobacterium, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, le genre Legionella, Legionella pneumophila, le genre Salmonelle.
Parmi les virus et plus particulièrement parmi les Adenovirus, les Adeno virus 40, et les Adeno virus 41 bis ;
les Astrovirus, HastV 7-2 ;
les Enterovirus, tels que Poliovirus, Coxsackievirus, ou Echovirus, les Rotavirus, les Calicivirus, tels que Virus de Norwalk, Virus de Sapporo, et les virus de l'Hépatite tels que le virus de l'Hépatite A, Parmi les parasites Le genre Cryptosporidium, tel que Cryptosporidium parvum, le genre Giardia, tel que Giardia lamblia et les Microsporidies.
Les microorganismes peuvent être recherchés au niveau du genre auquel ils appartiennent soit au niveau taxonomique inférieur c'est à dire au niveau de l'espèce, soit au niveau des sérotypes, des sous-types et en épidémiologie : par exemple pour Legionella la détermination pourra être effectuée par la séquence d'identification SEQ ID N0:9 pour la recherche au niveau du genre et par SEQ ID N0:10 ou 11 pour une détermination par une séquence d'identification spécifique de la bactérie Legionella pneumophila.
Les séquences matérialisées sur la biopuce, dites séquences d'identification correspondant aux espèces recherchëes seront choisies parmi les séquences dont la liste est jointe en annexe de SEQ ID N0:1 à SEQ ID
N0:104.
Des variantes de mises en oeuvre du procédé selon l'invention sont ci-après exposées.
Le nécessaire de détermination microbiologique exposé aux microorganismes du milieu aqueux répond avantageusement à l'une quelconque des présentations suivantes Les trois sondes d'identification qu'il comprend ont au moins une séquence choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos :1-104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moïns 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
II comprend au moins une sonde d'identification spécifique à une bactérie, au moins une sonde d'identification spécifique à un parasite et au moins une sonde d'identification spécifique à un virus ; de préférence, il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO :1 à
SEQ ID NO :39, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:66 à SEQ ID
N0:69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49, SEQ ID NO :63 à SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; et au moins une séquence choisie parmi entre SEQ ID
N0:50 à SEQ ID N0:60,et SEQ ID N0:70 à SEQ ID N0:104, et tous fragments 5 de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
II comprend au moins quatre sondes d'identification spécifiques à
au moins quatre bactéries différentes ; de préférence, elles sont choisies parmi 10 SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:66 à SEQ ID N0:69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec Ladite quelconque séquence:
15 II comprend au moins cinq sondes d'identification spécifiques à au moins cinq virus différents ; de préférence, elles sont choisies parmi SEQ ID
N0:50 à SEQ ID N0:60, et SEQ ID N0:70 à SEQ ID .N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins deux sondes d'identification spécifiques à au moins deux parasites ; de préférence, elle est choisie parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49 et SEQ iD N0:63 à SEQ iD NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins une sonde d'identification spécifique à une bactérie et au moins une sonde d'identification spécifique à au moins un parasite. De préférence, il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:1 à
SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:67 à
SEQ ID N0:69, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence, et au moins une sonde d'identification comprise SEQ ID N0:40 à
SEQ ID N0:49,_ SEQ iD N0:63 à SEQ ID N0:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes : Escherichia coli, genre Salmonelle, Staphylococcus aureus. De préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N09:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:15, SEQ ID
N0:23, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes : Escherichia coli, genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Clostridium pertringens. De préférence, au moins une sonde d'identification dudit nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID
N0:69, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus 2o dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Genre Cryptosporidium. De préférence, au moins une sonde dudit nécessaire est choisie parmi SEQ ID
N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ iD N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID N0:69, SEQ
ID N0:15, SEQ iD N0:23, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:44, et fous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites sëquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Gardia lamblia, Cryptosporidium parvum.
De préférence, au moins une sonde dudit nécessaire est choisie parmi SEQ ID
N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:46 à SEQ ID NO: 49, SEQ ID N0:63, SEQ
ID N0:64 et SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans Tune quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Enterovirus, Genre Cryptosporidium, De préférence, au moins une sonde d'identification dudit nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID
N0:62, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:53 à SEQ
ID N0:55, SEQ ID N0:70 à SEQ ID N0:75, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Escherichia coli sérotype 0157 :H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus eguinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A
et B, Echovirus, Genre Cr~ptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia. De préfërence, au moins une sonde d'identification du nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 à SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49, SEQ ID
N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:61 à SEQ ID N0:75, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Escherichia coli sërotype 0157 : H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus eguinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A
et 8, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus. De préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:9 à SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:14 à SEQ ID N0:20, SEQ ID
N0:23, SEQ ID N0:25 à SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:51, SEQ
ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec lâdite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Escherichia coli sérotype 0157 : H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium pertringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A
et 8, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Nonivalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Genre Mycobactéries, Mycobacterium aviumï Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, Acinetobacter baumanü, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Astrovirus. De préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:9 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes : Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0957:H7, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus eguinus, Clostridium perfringens , Staphylococcus epidermitis, Staphylococcus aureus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni,-_Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Acinetobacter baumanü, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, le genre Mycobactéries, Mycobacferium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, le genre Legionella,~
Legionella pneumophila, le genre Salmonelle.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants l0 les Adenovirus, tels que Adeno virus 40, Adeno virus 41 bis;
les Astrovirus, HAstV 9-2;
les Enterovirus, tels que Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, les Rotavirus, les Calicivirus, tels que Virus de Norwalk, Virus de Sapporo, et les virus de l'Hëpatife tel que le virus de l'Hépatite A.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les parasites suivants Le genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia et les Microsporidies.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Escherichia coli sérotype 0157 : H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A
et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A. De préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID
N0:4, SEQ iD N0:9 à SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:14 à SEQ ID N0:20, SEQ
ID N0:23, SEQ ID N0:25 à SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:51, SEQ ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID NO :75, SEQ ID NO :97, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité -avec _ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia 5 coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, 10 Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A. De préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:9 à SEQ ID
N0:11, SEQ ID N0:14 à SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 à SEQ
15 ID N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:51, SEQ ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID NO :68, SEQ ID NO :70 à SEQ ID NO :75, SEQ ID NO :97, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque 20 séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0157:H7, genre Salmonelle, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus. De préférence au moins une sonde d'identificatiôn du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ 1D N0:14 , SEQ ID NO 62, SEQ 1D NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ
ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ
ID NO 11, SEQ ID 23, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi les Calicivirus et les Rotavirus. De préférence au moins une sonde d'identification du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ ID NO
59, SEQ ID NO :60 SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 96, SEQ ID NO :98 à SEQ !D NO :104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites sëquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants Virus de l'hépatite A, Enterovirus, au moins un virus choisi parmi le virus de Norwalk et les Rotavirus. De préférence au moins une sonde d'identification du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ ID NO 98 à 104, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 56 à SEQ ID NO 58, SEQ ID NO :60, SEQID NO :97, SEQ ID NO :70 à SEQ ID NO :75, SEQ ID NO 76 à SEQ ID
NO 96, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomëres contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détérmination microbiologique sont choisis parmi les parasites suivants : genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia. De préférence au moins une sonde d'identification du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0957:H7, genre Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Virus de l'hépatite 3o A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi les Calicivirus et les Rotavirus, genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia ; de préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ ID N0:14 , SEQ ID NO 62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ ID 23, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO :60 SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 96, SEQ ID NO :98, SEQ ID. N0:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence, ou Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0957:H7, genre Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi le vrius de Norwalk et les Rotavirus, genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia ; de préférence, au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14 , SEQ 1D NO 62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ
ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ
ID NO 11, SEQ ID 23, SEQ ID NO 98 à 104, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 56 à
SEQ ID NO 58, SEQ ID NO :60, SEQID NO :97, SEQ ID NO :70 à
SEQ ID NO :75, SEQ ID NO 76 à SEQ ID NO 96, SEQ ID N0:40 à SEQ ID NO
45, SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire ' de détermination microbiologique sont choisis parmi Virus de Norwalk, Virus Hepatitis A, Enterovirus. De préférence, au moins une sonde d'identification choisie parmi parmi SEQ ID NO 59, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO 97, SEQ ID N0 70 à SEQ
ID NO 75.
Les sondes de capture comportent avantageusement au moins 10, de préférence au moins 13, voire au moins 15, même au moins 17 bases etlou au plus 35, de préférence au 25, voire au plus 20. Par exemple, une sonde de capture comporte entre 10 et 35 bases, avantageusement entre 17 et 20 3o bases, avec au moins une position d'interrogation située dans la région centrale de la séquence connue, en l2eme position par rapport à l'extrémité 3' de la séquence. Pour les espèces E. coli et E. faecalis, il y aura de préférence des sondes de capture de 17 bases, avec 2 positions d'interrogations : une en 10eme et une en $eme position. Ces sondes de capture ont, suivant le cas des longueurs comprises entre 10 et 25 nucléotides. Les positions d'interrogation varient alors en fonction de la longueur de la sonde de capture.
Les séquences spécifiiques dites séquences d'identification, ont été
sélectionnées par des techniques de sélection informatique et sont chacune suffisamment spécifique d'une espèce etlou d'un membre d'une espèce qu'elles permettent de discriminer des genres taxonomiquement proches et/ou des espèces du même genre et d'éviter les phénomènes d'hybridation croisée.
Dans un mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries etlou de virus etiou de parasites comprenant au moins quatre sondes d'identification spécifiques à au moins quatre bactéries différentes.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries etlou de virus etlou de parasites comprenant au moins cinq sondes d'identification spécifiques à au moins cinq virus différents.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites comprenant au moins deux sondes d'identification spécifique à un parasite.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites comprenant au moins une sonde spécifique d'une bactérie et au moins une sonde d'identification spécifique d'un parasite.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes spëcifiques des bactéries sont choisies parmi les sondes spécifiques des bactéries suivantes Escherichia coli, Genre Salmonella, Staphylococcus aureus.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes spécifiques des bactéries sont choisies parmi les sondes spécifiques des bactéries suivantes Escherichia coli, genre Saimonella, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes spécifiques des bactéries sont choisies parmi les sondes spécifiques des bactéries suivantes Escherichia coli, Enterococcus faecalis , Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes spécifiques des bactéries sont choisies parmi les sondes spécifiques des bactéries suivantes Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0757 ;H7, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus eguinus, Clostridium perfringens , Staphylococcus epidermifis, Staphylococcus aureus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Acinetobacter baumanü, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia , le genre Mycobactéries, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Myco6acterium marinum, Mycobacterium gordonae, le genre Legionella, Legionella pneumophila, le genre Salmonelle.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactëries etlou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants Escherichia coli, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Genre Cryptosporidium.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Gardia lamblia, Cryptosporidium parvum.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants Escherichia coli, - Er~terococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enferococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Closfridium perfringens, Genre Salmonelle, Sfaphylococcus aureus, Enterovirus : virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre 5 Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries etlou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants l0 Escherichia coli, Enferococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus : virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et 8, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Genre Legionella, 15 Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification 20 de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, 25 Enferovirus : virus de la poliomyélife, virus coxsackie A et 8, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Nonwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Genre Mycobactéries, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, Acinetobacter baumanü, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenofrophomonas maltophilia, Asfrovirus.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le -néEessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactëries et/ou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterovirus, Genre Cryptosporidium, Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes d'identification spécifiques des virus sont spécifiques des virus suivants les Adenovirus, tel que Adeno virus 40, Adeno virus 49bis;
les Astrovirus, HastV 1-2;
les Enterovirus, tels qiue Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, les Rotavirus, les Calicivïrus, tels que Virus de Norwalk, Virus de Sapporo et, les virus de l'Hépatite tel que le virus de l'Hépatite A.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes spécifiques des parasites sont choisies parmi les sondes spécifiques des parasites suivants Le genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia et les Microsporidies.
Selon l'invention dans un mode de réalisation, le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ
LD N0:1 à SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:66 à
SEQ ID N0:69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:40 à
SEQ ID N0:49, SEQ ID NO: 63 à SEQ ID N0:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence ; et au moins une séquence choisie parmi SEQ ID N0:50 à SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:70 à SEQ ID N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation diffiërent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins 4 sondes d'identifications choisies parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:62, SEQ ID
N0:66 à SEQ ID N0:69, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque 1o séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins 5 sondes d'identification comprise entre SEQ ID N0:50 à SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:70 à SEQ ID N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49, SEQ ID NO: 63 à SEQ ID N0:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:61,~ SEQ ID N0:62, SEQ ID
N0:66 à SEQ ID N0:69, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence, et au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49, SEQ ID NO: 63 à SEQ ID N0:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans ~un . mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID
N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID N0:69, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:68, S.EQ ID
N0:69, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont ia séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un ëchantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID
N0:69, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID. N0:40 à SEQ ID N0:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID
N0:69, SEQ ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:70 à SEQ ID N0:75, SEQ
ID N0:40 à SEQ ID N0:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 à-SEQ LD
N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49, SEQ ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ
ID N0:61 à SEQ ID N0:75, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID
N0:11, SEQ ID N0:14 à SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 à SEQ
ID N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:51, SEQ ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID N0:59, SEQ ID N0:60 à SEQ ID N0:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une séquence comprise entre SEQ ID
N0:1 à SEQ ID N0:6; SEQ ID N0:9 à SEQ ID N0:22, et SEQ ID N0:23 à SEQ
ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID
N0:14 , SEQ ID NO 62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 15, SEQ
ID NO 5; SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ
ID 23. et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70°!° d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme prësent dans un échantillon comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID
NO 59, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 75 et tous fragments de celles-oi comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le 5 nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID
NO 98 à 104, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 98, SEQ ID NO 56 à SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 76 à SEQ ID NO 96 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites 10 séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nëcessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une séquence comprise entre choisie 15 parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 65 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
Ces fragments nucléotidiques, dite séquences d'identification selon 20 l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enferococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, 25 Enterovirus : virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus, 30 Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Genre Mycobactérium, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, Acinetobacter baumanü, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Astrovirus.
Les Adenovirus, tel gue Adeno virus 40, Adeno virus 41 bis;
les Astrovirus, HastV 9-2 ; -les Enterovirus, tels que Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, les Rotavirus, les Calicivirus, tels que Virus de Norwalk, Virus de Sapporo, et les virus de l'Hépatite, tel que l'Hépatite A, le genre Cryptosporidium, tels que Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia et les Microsporidies.
Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi (es microorganismes suivants Escherichia coli, genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Clostridium pen'ringens.
Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification 2o selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia soli, genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Genre Cryptosporidium Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterovirus et Genre Cryptosporidium.
Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins ê autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus : virus de la poliomyélife, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus : virus de la poliomyëlite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norvvalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus.
Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus : virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Genre Mycobactéries, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, Acinetobacter baumanü, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Astrovirus.
On pourra également concevoir et utiliser un nëcessaire de détermination microbiologique selon l'invention comportant des séquences d'identification pour identifier des microorganismes au niveau des sérotypes, des sous-types et en épidémiologie.
Le procédé d'analyse d'un échantillon susceptible de contenir au moins une bactérie, parasite et/ou virus, selon l'invention utilise un mélange de séquences nucléotidiques comme sondes d'identification spécifiques d'un sérotype, d'un sous-type, d'une espèce ou au moins un genre de bactérie, virus et/ou parasite susceptible d'être présent dans l'échantillon.
Ce procédé d'analyse d'un échantillon selon l'invention est caractérisé par une étape de détection comprenant la mise en oeuvre d'un nécessaire de détermination microbiologique tel que défini précedemment.
Dans un mode préférentiel d'exécution préalablement à l'étape de détection, on peut effectuer au moins une étape de lyse.
Dans un autre mode d'exécution, postérieurement à cette étape de lyse, on effectue une ëtape d'amplification.
L'invention concerne également un procédé de contrôle d'un échantillon liquide dans lequel préalablement à toute étape de détection une étape d'enrichissement en microorganismes dudit échantillon est effectuée.
Cette étape d'enrichissement peut être effectuée par filtration notammment en utilisant un moyen de filtration comprenant des fibres creuses et utilisé en mode frontal permettant d'obtenir dans un temps limité, à partir d'un échantillon liquide de départ de volume important et prédeterminé, un échantillon à analyser d'un volume suffisamment faible, tout en garantissant la viabilité des microorganismes, pour que les techniques d'analyse, notamment la multidétection selon l'invention, puissent être ensuite mises en oeuvre.
Ce moyen de filtration est basé sur la technique de l'ultrafiltration sur fibres creuses en mode frontal.
Par mode frontal, par opposition au mode tangentiel, on entend tout passage en une passe d'un échantillon liquide de départ dans le moyen de filtration, sans recyclage d'au moins une partie du même échantillon à
l'entrée dudit moyen de filtration.
L'utilisation de ce moyen d'ultrafiltration en mode frontal permet d'obtenir des concentrats de volume faible, d 'effectuer ia concentration d'un prélèvement dans une échelle de temps de l'ordre de l'heure au plus en un seul passage, tout en garantissant la viabilité des microorganismes, la multi-récupération et des rendements de l'ordre de 100 %.
Par multi-récupération, on entend la possibilité de récupérer dans l'échantillon final pratiquement tous les différents genres ou espèces de microorganismes présents dans l'échantillon de départ.
Ces rendements élevés sont obtenus en raison de l'inexistence de volumes, dits volumes morts, dus par exemple sur d'autres dispositifs à la.
présence de tuyauteries annexes, par exemple de recyclage, et par la fiabilité
de la porosité sur toute la longueur de la fibre creuse.
Le procédé de contrôle selon l'invention, est ainsi appliqué sur un échantillon obtenu éventuellement par filtration, d'un volume compris entre 1 ml et 100 litres.
Une étape de lyse des microorganismes est effectuëe, soit par lyse mécanique soit par lyse chimique, telles que décrites précédemment.
Une étape de purification est éventuellement appliquée, en utilisant éventuellement les techniques de capture par des oligonucléotides fixés sur des particules magnétiques, ou par utilisation de colonnes de silice, de particules de silice (inerte ou magnétique), de colonnes échangeuses d'ions, ou de toute autre méthode citée précédemment.
Une étape d'amplification enzymatique est éventuellement appliquée également en utilisant préférentiellement les techniques de transcription telles que TMA, NASBA, mais en utilisant en particulier les techniques de PCR et RT-PCR.
Une étape de marquage de l'amplicon est appliquée, par utilisation préférentielle d'un marqueur fluorescent.
Une étape d'hybridation est ensuite appliquée, en utilisant préférentiellement les sondes d'identification spécifiques ou leurs fragments fixés sur un support solide, et en particulier en utilisant une biopuce.
Le procédé de contrôle et le nécessaire de détermination microbiologique selôn l'invention utilisant ces séquences spécifiques permet de détecter simultanément un bactérie et/ou un virus etlou un parasite d'un panel fixe en une seule étape de multidétection finale.
En fonction des liquides à analyser des panels fixes de microorganismes peuvent être facilement définis.
3o Un autre objet de l'invention est un procédé de production et/ou désinfection d'un liquide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'analyse mettant en oeuvre un nécessaire de détermination microbiologique selon l'une quelconque des revendications de 35 à 48 et générant un algorithme d'interprétation des données permettant l'asservissement dudit procédé de production et/ou désinfection auxdites données générées par le nécessaire de détermination microbiologique.
Les avantages de l'invention et les techniques mises en oeuvre sont illustrës par les exemples non limitatifs et les figures en annexe.
5 La figure 1 représente l'évolution du base-call sur les sondes spécifiques d'Escherichia coli et d'Acinetobacter baumanü en fonction du nombre de copies d'ARNr de chacun des partenaires ajoutées avant amplification.
La zone encadrée dans le graphique représente les proportions E.
10 colilA. baumanü à partir desquelles les cibles E, coli sont interprétables par la puce.
La figure 2 représente l'évolution du base-call sur les sondes spécifiques d'E, coli, S. typhimurium et A. baumanü en fonction des proportions du nombre de copies de transcripts marqués représentant les 3 espèces.
15 Dans les exemples ci-dessous décrits les souches utilisées sont Escherichia coli ATCC 11775 Enterococcus faecalis 19433T
Salmonella typhimurium API 9810059 Acinetobacter baumanü ATCC 19606 Exemple 1 : Détection et identification d'une seule cellule bactérienne en culture : cas d'Escherichia coli (gram -) et d'Enterococcus faecalis (gram +) a) Préparation de la culture On cultive une souche d'E, coli ou E, faecalis à 37°C dans 2 ml de bouillon Luria Bertani. Lorsque la culture a atteint une densité optique à 620 nanomètres de 0,2, on prélève 1 ml. (10$ bactériesiml). On réalise des dilutions en série, jusqu'à avoir 0,1 cellule/pl.
b) Extraction et purification des acides nucléiques 1. Lyse des micoorganismes De la suspension à 0.1 cellules par microlitres, 10p1 sont prélevés (1 cellule). Sur cette suspension, on ajoute 100p1 d'un tampon de lyse contenant du Tris 10mM, de l'EDTA 1 mM (dilution d'une solution TE100X
commercialisëe chez SIGMA, ref. T-9285) et du lyzozyme (Sigma, ref. L-6876) dont la concentration est différente selon le Gram de la bactérie : 3 mg/ml pour E. faecalis, 400 pgJma pour E. coli. La lyse des bactéries s'effectue en laissant le tube contenant la suspension bactérienne en contact avec le tampon de lyse durant 5 à 10mn à température ambiante.
2. Extraction et purification des acides nucléiques.
Cette étape s'effectue en utilisant le kit Rneasy mini kit commercialisé par Qiagen (ref. 74104) selon le protocole recommandé pour l'extraction et la purification des ARN totaux bactériens.
c) RT-PCR
Les deux étapes de RT et PCR vont s'effectuer l'un après l'autre, dans un seul tube, en utilisant le kit ACCESS (ref A1250, Promega).
Pour cela, on ajoute à 25p1 de la suspension d'ARN total le tampon 5X AMVITfI, 1 mM de MgS04, 200pM de dNTPs (deoxyribonucleosides triphosphates), 5U d'AMV RT polymérase, 5U de Tfl polymérase, 5U de RNAsin (Pranega ref. NZIII), 0.5pM des amorces eubactériennes A1.1 et 5'gaggcagcagtggggaat3' 5'taatacgactcactatagggaggaggattactaccagggtatctaat3' (en gras : promoteur de la polymérase T7), afin d'obtenir 50p1 de volume réactionnel final.
Pour l'étape de RT, le mélange est mis à incuber 45mn à 48°C, puis 5mn à 94°C. Pour l'étape de PCR on réalise ensuite 35 cycles composés chacun des 3 étapes suivantes : 94°C 1 mn, 55°C 1 mn, 68°C 1 mn. Une extension finale de 7mn à 68°C est ensuite réalisée.
d) Vérification de l'amplicfication On dépose 5p1 de produit d'amplification (amplicon) sur un gel d'agarose 1,5% dans de l'EDTA-Tris Borate. Après une migration de 20mn à
200V, on visualise la bande d'amplification par coloration au Bromure d'Ethidium et par illumination aux UV. On montre que l'amplification est positive par la présence d'une bande ayant la taille attendue (450 paires de bases).
e) Identification de l'amplicon sur une puce à ADN (Affymetrix, Santa Clara) Une biopuce est synthétisée sur un support solide en verre selon le procédé décrit dans le brevet US 5 744 305 (Affymetrix, Fodor et al) en utilisant la stratégie de reséquençage décrite dans la demande WO 95!11995 (Affymax, Chee et al) et selon la méthode décrite par A Troesch et al. dans J. Clin.
Microbiol., vol. 37(1 ), p 49-55, 1999 avec les variantes suivantes : les oligonucléotides synthétisés sur la puce réalisent le reséquençage des séquences d'identification. Ce procédé permet de dïminuer le nombre total d'oligonucléotides synthétisés et donc présentent un avantage considérable en terme de coût de production efi sans compromis sur la qualité de l'identification des différents microorganismes de part le choix de ces séquences d'identification . Les oligonucléotides comportent 20 bases, avec une position d'interrogation en 12eme position par rapport à l'extrémité 3' de la séquence.
Pour les espèces E. coli et E, faecalis, il y a également des oligonucléotides de I0 17 bases, avec 2 positions d'interrogations : une en 10 et une en 8eme position.
D'autres oligonucléotides ont des longueurs comprises entre 10 et 25 nucléotides. Les positions d'interrogation varient alors en fonction de la longueur de l'oligonucléotide.
L'analyse est effectuée sur le système complet GeneChip~
(référence 900228, Affymetrix, Santa Clara, CA) qui comprend le lecteur GeneArray~, le four d'hybridation GeneChip~ , la station fluidique GeneChip~
et le logicel d'analyse GeneChip~.
1. Transcription et marquage des amplicons.
Grâce à l'amorce antisens S9T7, tous les produits d'amplifications présentent un promoteur pour la RNA polymérase T7. Ces amplicons vont alors servir de matrice à une réaction de transcription au cours de laquelle sera incorporé un ribonucléotide fluorescent.
A partir des 50p1 de produit d'amplification positif, un aliquot (entre 2 et 12p1) est prélevé est ajouté à un mélange de transcription contenant les composants du kit Megascript T7 d'Ambion (ref. 1334) et de fluorescein-12-UTP (Roche, ref. 1427857). Le mélange réactionnel final se fait dans 20p1 et la réaction de transcription s'effectue pendant 2 heures à 37°C.
2. Fragmentation des transcripts marqués Afin d'améliorer les conditions d'hybridation, les transcripts marqués sont clivés en fragments d'environ 20 nucéotides. Pour cela, les 20p1 de transcripts marqués sont soumis à l'action de l'imidazole (SIGMA) 30mM et du chlorure de manganèse (Merck) 30mM pendant 30mn à 65°C.
3. Hybridation sur la puce de recherche A partir des 20p1 de transcripts marqués et fragmentés un aliquot de 5p1 est prélevé et ajouté à 700p1 de tampon d'hybridation dont la composition est de SSPE 6X (Eurobio), DTAB 5mM (Sigma), Triton 0.5% (Mark - . eurolab). Ce mélange est hybridé sur la puce dans les conditions suivantes : 40 . mn à 45°C. Après lavage, la puce est scannée, puis l'image d'hybridation obtenue est analysée par le logiciel Genechip~ (Affymetrix, Santa Clara) Les spots d'hybridation permettent de reconstituer la séquence de l'amplicon, qui ensuite comparée aux séquences de références de la puce. La séquence (et donc l'espèce qui lui correspond) qui présente le meilleur pourcentage d'homologie (base-call, en %) avec la séquence de l'amplicon est retenue pour l'identification.
4. Interprétation des résultats.
Seule une partie de la séquence de 450 bases est analysée. Elle correspond à tout ou partie des sondes d'identification représentées sur la biopuce. Le seuil d'interprétation, c'est à dire niveau d'identification est fixé à
au moins 70% de base-call sur la sëquence d'identification. En dessous de ce seuil, la cible n'est pas identifiée.
Résultats L'ARN extrait d'une seule cellule bactérienne (E. coli ou E, faecalis) donne lieu à un produit d'amplification, puis à une identification correcte sur la biopuce.
Exemple 2: Discrimination de mélanges de 2 espèces bactériennes différentes.
Dans cet exemple, la RT-PCR eubactérienne a été appliquées à
des cibles synthétiques. C'est à dire que ces cibles proviennent de l'amplification, puis de la transcription de l'ADN ribosomal 16S dans son entier.
Ces cibles sont appelées transcripts in-vitro. Dans cet exemple, la cible est un mélange de transcripts in-vitro représentant les espèces Escherichia coli et Acinetobacter baumanü. Quand on ajoute la cible au tube de RT-PCR, on ne résonne plus en terme de nombre de bactéries, mais de nombre de copies de transcripts in-vitro, puis en nombre d'équivalents-bactéries, en partant du postulat suivant : 1 bactérie correspond à 104 copies d'ARN ribosomal 16S.
Pour cela, tes transcripts ont été dosés à 10~~ copies / p1. Pour Acinetobacter baumanii, la dilution 1 OBCOpies/pl est préparée. Pour Escherichia coli, les dilutions 103/p1, 104/p1, 105/p1 et 106/p1 sont préparées. Le conditions du mélange réactionnel pour la RT-PCR sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1, paragraphe c), sauf que le volume de cible n'est plus 25p1 d'une suspension d'ARN total, mais 2p1 d'un mélange constitué de 1 p1 de chaque dilution de transcript représentant chaque espèce dans les proportions suivantes Equivalents bactries 0/0 0,111041110' 101104102110'10/0 E, colilA, bauman Copies de transcripts 0 103 104 105 106 108 d'E. coli Copies de transcripts 0 106 108 108 108 0 d'A. bauman L'unique amplicon obtenu est ensuite traité selon l'étape e) de l'exemple 1.
Résultats ~5 La figure 1 montre qu'en ramenant le nombre de copies d'ARNr 16S à un nombre de bactéries, il est donc possible de détecter, par utilisation de la puce à ADN, l'équivalent de 1 E. coli en présence de 104 A baumanü, soit une proportion de 0.01 %.
Exemple 3: Discrimination d'un mélange de 3 espèces bactériennes différentes Des transcripts marqués de 3 espèces bactériennes (Escherichia coli, Salmonella thyphimurium, Acinetobacter baumanil~sont obtenus selon le protocole e) à f.1. Ils sont ensuite purifiés à l'aide du kit Rneasy mini kit (Qiagen, ref. 74104) selon le protocole adapté à la purification de transcripts in vitro. Les transcripts marqués sont dosés (lecture à 260nm sur un spectrophotomètre) de manière à connaître le nombre de cibles (ou copies) introduites dans le mélange d'hybridation. Le nombre total de copies dans un mélange d'hybridation est fixé à 1013 copies.
Les transcripts correspondant aux espèces E. coli et S. thyphimurium sont en même nombre de copies. Ces transcripts ont été
rajoutés par rapports aux transcripts d'A, baumanü de la façon suivante Proportion de E. coli-S. fhyphimurium*lAØ01%0.1% 1% 10% 20% 50%
baumanil Nbre de copies de transcripts5.1085.109 5.10' 5.10" 10'Z 2,5.10'2 E. coli Nbre de copies de transcripts 5.108 5.109 5.10'.5.10"10'2 2,5.10'2 S. thyphimurium _ Nbre de copies de transcripts 1 O" 10'3 1O'3 1O'3 8.10'2 5.10'Z
A. bauman Résultats La figure 2 montre que la détection d'E. coli se fait à des proportions plus faibles (1 %) que celle de S. thyphimurium (10%). Ce résultat 5 montre qu'il est possible de détecter sur la puce 3 espèces bactériennes différentes.
Exemple 4 , détection simultanée d'Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Salmonelle enteritidis a) Préparation des suspensions bactériennes Souches testées Escherichia coli ATCC 11775T
Staphylococcus aureus ATCC 12600T
Salmonelle enteritidis ATCC 13076 Les souches sont cultivées dans un bouillon Trypcase Soja à 37°C.
Lorsque la culture atteint une densité optique de 0.2-0.3 (10$ bactéries/ml), on réalise des dilutions en cascade de 1/10eme, jusqu'à atteindre 100 bactérie/ml.
b) Mélange des bactéries On mélange les 3 espèces bactériennes en utilisant ies suspensions produites dans la partie a), de manière à avoir : 100 Escherichia coli, 100 Staphylococcus aureus et 100 Salmonelle enteritidis.
c) Obtention des ARN totaux 1. Lyse des microorganismes Le volume final sera de 100~t1. On rajoute 1 p1 de tampon TE100X
(Sigma refT-9285), du lysozyme à 100mg/ml (Sigma, Ref.L-6876) pour avoir une concentration finale de 10mg/ml. On complète ou non avec de l'eau (Sigma, ref. W-4502) pour avoir 100~t1. On incube 30 mi+n à 25°C.
2. Purification des acides nuclëiques On utilise ensuite le RNeasy Mini Kit (Qiagen, ref 74104) en appliquant le protocole préconisé par Qiagen pour ies bactéries.
d) RT-PCR
On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250) selon le protocole indiqué Exemple 1, partie c).
e) Vérification de l'amplification Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie d).
f) Analyse sur une biopuce 1. Transcription et marquage des amplicons Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-1.
2. Fragmentation des transcripts marqués Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-2.
3. Hybridation sur la puce Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-3 4. Interprétation des résultats Le base-call sur la séquence d'identification correspondant à
chacun des taxons doit être supérieur à 90%. En dessous la cible n'est pas identifiée.
Résultats Es ce teste Base-call sur la s uence d'identification corres ondante Escherichia coli 100%
Sta h lococcus aureus 100%
Salmonella enteritidis 100%
Conclusion II y a eu detection simultanée des 3 espèces bactériennes par hybridation sur les séquences d'identification correspondantes Exemple 5 . detection simultanée d'Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis et Pseudomonas aeruginosa a) Préparation des suspensions bactériennes Souches testées Escherichia coli ATCC 11775T
Staphylococcus aureus ATCC 12600T
Salmonella enteritidis ATCC 13076 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145T
Les suspensions bactériennes sont préparées selon le protocole indiqué Exemple 4, partie a) b) Mélange des bactéries On mélange les 4 espèces bactëriennes en utilisant les suspensions produites dans la partie a), de manière à avoir : 100 Escherichia coli, 100 Staphylococcus aureus, 100 Salmonella enteritidis et 100 Pseudomonas aeruginosa.
c) Obtention des ARN totaux Selon les protocoles indiqué Exemple 4, partie c) d) RT-PCR
On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250) selon le protocole indiqué Exemple 1, partie c).
e) Vérification de l'amplification Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie d).
f) Analyse sur une biopuce 1. Transcription et marquage des amplicons Selon (e protocole indiqué Exemple 1, partie e)-1.
2. Fragmentation des transcripts marqués Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-2.
3. Hybridation sur la puce Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-3 4. Interprétation des résultats Le base-call sur la séquence d'identification de chacun des taxons doit être supérieur à 90%. En dessous la cible n'est pas identifiée.
l0 Résultat Es ce teste Base-call sur la s uence d'identification cortes ondante Escherichia coli 100%
Sta h lococcus aureus 91,9%
Salmonella enteritidis 100%
Pseudomonas aeru 100%
inosa Conclusion I S II y a eu detection simultanée des 4 espéces bactëriennes par hybridation sur les séquences d'identification correspondantes Exemple 6 . Détection simultanée d'Escherichia coli, 20 Cryptosporïdiurri parvum et du Poliovirus Sabin 3.
a) Préparation des suspensions.
Pour Escherichia soli, les dilutions sont effectuées comme indiqué
Ex 4 , a).
25 Pour Cryptosporidium parvum, des dilutions en cascades sont effectuées à partir d'une suspension d'oocystes titrée à 10~/ml, commercialisée par Waterborne Inc. (St Louis, USA).
Pour le Poliovirus Sabin 3 on utilise une suspension titrée à 109 PFU/ml b) Mélange des microorganismes.
- .On mélange 3000 E. coli, 3000 C. parvum et 3000 cfu du Poliovirus de manière à obtenir 300 p1 de volume final.
c) Préparation des acides nucléiques Les 300p1 sont séparés en 3X100 p1, car l'extraction et la purification des ARN subissent 3 processus séparés.
1. Escherichia coli Préparation des ARN totaux selon le protocole indiqué EX 4, partie c) 2. Cryptosporidium parvum On utilise le kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, ref. 74104) selon un protocole modifié. Pour cela, on ajoute aux 100p1 350 p1 de tampon de lyse RLT du kit RNeasy, et 25 p1 de Protéinase K à 19 mg/ml (Roche, ref. 1964372) ce qui ramène à 1 mg/ml. On laisse agir 30 mn à 65°C.
On continue ensuite selon le protocole RNeasy Mini Kit "for bacteria".
3. Pour Poliovirus Sabin 3 On rajoute 40p1 d'eau (Sigma, ref. W-4502) aux 100p1, et on utilise le Qiamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, ref. 52906), selon les instructions du fournisseur.
d) Amplification par RT-PCR
1. Escherichia coli On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250) selon le protocole indiqué Exemple 1, partie c).
2. Cryptosporidium parvurrt On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250).
Pour cela, on ajoute aux 25p1 d'ARN total obtenu à l'étape b) 2, 25p1 de mélange réactionnel de manière à avoir, dans les 50p1 final : le tampon AMV/Tfi 1X, le MgS04 2,5 mM, les dNTP 200 ~rM, 5U de Tfl, 5U d'AMV, 5U de RNAsin (Promega ref. N2111 ), et les primers XIA2F et XIA2R 200pM.
XIA2F 5' GGAAGGGTTGTATTATTAGATAAAG 3' XIA2R-T7 5' taatacgactcactatagggaggaggattaAAGGAGTAAGGAACAACCTCCA 3' Tirés de la publi de Xiao et .al. dans Applied and Environmental Microbiology, 1999 5 (en gras : promoteur T7 de la polymérise T7, qui sera utilisé (ors de la transcription) Pour l'étape de RT, le mélange est mis à incuber 45 mn à 48°C.
Pour l'étape PCR on incube 5 mn à 94°C, puis on réalise 30 cycles composés 10 chacun des 3 étapes suivantes : 94°C 45 sec, 55°C 45 sec, 68°C 1 mn. Une extension finale de 7 mn à 68°C est ensuite réalisée.
3. Poliovirus Sabin 3 On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250).
15 Pour cela, on ajoute aux 25p1 d'ARN total obtenu à l'étape b) 2, 25pl,de mélange réactionnel de manière à avoir, dans les 50p1 final : le tampon AMV/Tfl 1X, le MgS04 2 mM, les dNTP 300 pM, 5U de Tfl, 5U d'AMV, 5U de RNAsin (Promega ref. N2111 ), et les primers spécifiques 200pM.
20 Pour l'étape de RT, le mélange est mis à incuber 45 mn à 48°C.
Pour l'étape PCR on incube 2 mn à 94°C, puis on réalise 40 cycles composés chacun des 3 étapes suivantes : 94°C 15 sec, 55°C 30 sec, 68°C 1 mn. Une extension finale de 7 mn à 68°C est ensuite réalisée.
25 e) Vérification de l'amplification Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie d).
f) Analyse sur une biopuce 30 1. Transcription et marquage des amplicons Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-1.
2. Purification des transcripts marqués.
Les 3 tubes contenant les 20p1 de transcription sont rassemblés la purification se fait en utilisant le RNeasy Mini Kit (Qiagen ref. 74104), protocole 35 pour la purification de transcripts in-vitro. On obtient 20p1 de transcript 3. Fragmentation des transcripts marqués et purifiés.
Selon le protocole indiqué Exempte 1, partie e)-2. -3. Hybridation sur la puce Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-3 4. Interprétation des résultats Le base-call sur la séquence signature d'E. coli et C. parvum doit être supérieur à 90%. Pour le Poliovirus 3, en raison d'un polymorphisme de séquence le seuil de détection se situe au dessus de 85%
Résultat Es ce teste Base-cala sur ia s uence d'identification corres ondante Escherichia coli 100%
C tos oridium arvum 100%
Poliovirus Sabin 88,9%
Conclusion II y a eu detection simultanée des 3 paramètres par hybridation sur les séquences d'identification correspondantes Exemple 7: détection simultanée d'un Entérovirus (Coxsackivirus A9) et du virus de l'Hépatite A.
1- Cibles considérées Souche de Coxsackievirus A9 à 7 TCIDSO/pL (extraction des acides nucléiques par utilisation du kit Qiamp Viral RNA de Qiagen -ref. 52904 -selon les indications du fournisseur) Souche vaccinale du virus de l'Hépatite A à 17.5 DICC5o/pL
(extraction des acides nucléiques par utilisation du kit Qiamp Viral RNA de Qiagen -ref. 52904- selon les indications du fournisseur) 2- RT-PCR multiplex On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250) Pour cela, on ajoute 1 pL de chaque souche virale et 48pL de milieu réactionnel de façon de la manière suivante Concentration finaleltube RNasine 2.5 U
Tampon 5X 1X
dNTP 0.3mM
Primers H1 +H2~a~ 0.5pM
Primers Enterovirus~b~0.3NM
MgS04 2 mM
T4 gene 32 protein 2.5Ng Tfl 5U
(a) : publication Robertson et al., Virus Research, 1989, 13, 207-l0 (b) : désignés dans la région 5'NCR
Pour l'étape de rétro-transcription, le mélange est incubé 45 minutes à 48°C. Après une étapes de dénaturation de 2 minutes à
94°C, les ADN complémentaires obtenus sont amplifiés selon les modalités suivantes 45 cycles de [15 secondes à 94°C, 30 secondes à 55°C, 45 secondes à 68°C]
avec une étape d'élongation de 7 minutes.
3- Vérification de l'amplification On dépose 8pL de produits de RT-PCR sur un gel de 1.5%
d'agarose dans de l'EDTA-Tris-Borate. Après une migration de 30 minutes sous 100 V, on visualise des produits d'amplification par coloration du gel par du Bromure d'Ethidium et par illumination U.V.. La visualisation d'une bande vers 500bp (entérovirus) et d'une autre à 249bp (HAV) montrent que l'amplification est effective.
Analyse sur une biopuce Le marquage des produits d'amplification s'effectue selon le brevet W099/65926.
Interprétation des résultats & conclusions Le base-call sur la séquence correspondante à chaque virus doit être supérieur à 95%. En dessous de ce seuil, la cible n'est pas identifiée.
On obtient les résultats suivants Base-Call Coxsackievirus A9 96.7 HAV 96.9 Conclusion II y a eu détection simultanée des 2 souches virale par hybridation sur les séquences d'identification correspondantes.
ZISTE DE SEQUENCES
<110> BIOMERIEUX
<120> PROCEDE DE CONTROLE DE LA QUALITÉ MICROBIOZOGIQUE D'UN
MILIEU AQUEUX ET NÉCESSAIRE APPROPRIE
<130> AQUAGENE B05B3650 <140>
<141>
<150> FR00-08839 <151> 200-07-06 <160> 104 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 39 <212> ADN
<213> Campylobacter soli <400> 1 tttgtgaaat ctaatggctt aaccattaaa ctgcttgag 39 <210> 2 <211> 29 <212> ADN
<213> Campylobacter soli <400> 2 atccgtagag atcaccaaga atacccatt 2g <210> 3 <211> 54 <212> ADN
<213> Campylobacter jejuni <400> 3 gtctcttgtg aaatctaatg, gcttaaccat taaactgctt gggaaactga tagt 54 <210> 4 <211> 24 <212> ADN
<213> Campylobacter jejuni <400> 4 ggaactcaac tgacgctaag gcgc 24 <210> 5 <211> 24 <400> 5 gtggttcagc aagttggatg tgaa 24 <210> 6 <211> 27 <212> ADN
<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 6 aaactactga gctagagtac ggtagag 27 <210> 7 <211> 35 <212> ADN
<213> Pseudomonas fluorescens <400> 7 tgttttgacg ttaccgacag aataagcacc ggcta 35 <210> 8 <211> 27 <212> ADN
<213> Pseudomonas fluorescens <400> 8 tagagtatgg tagagggtgg tggaatt 27 <210> 9 <211> 21 <212> ADN
<213> legionella <400> 9 atactgacac tgaggcacga a 21 <210> 10 <211> 23 <212> ADN
<213> Legionella pneumophila <400> 10 ttactgggog tcaagggtgc gta 23 <210> 11 <211> 23 <212> ADN
<213> Legi< " ' ' ' ' <400> 11 ttaacctaaa <210> 12 <211> 27 <212> ADN
<213> Acinetobacter baumannü
<400> 12 gcgtaggcgg cttattaagt cggatgt 27 <210> 13 <211> 27 <212> ADN
<213> Acinetobacter baumannü
<400> 13 cattcgatac tggtgagcta gagtatg 27 <210> 14 <211> 47 <212> ADN
<213> Escherichia Coli Shigella Species <400> 14 cggggaggaa gggagtaaag ttaatacctt tgctcattga cgttacc 47 <210> 15 <211> 22 <212> ADN
<213> salmonella <400> 15 gaggaaggtg ttgtggttaa ta 22 <210> 16 <211> 32 <212> ADN
<213> Aeromonas caviae <400> 16 cagtagctaa tatctgctgg ctgtgacgtt ac 32 <210> 17 <211> 32 <212> ADN
<213> Aeromonas hydrophila <400> 17 acgcaggcgg ttggataagt tagatgtgaa ag 32 .
<210> 18 <211> 20 <212> ADN
<400> 18 aattgcattt aaaactgtcc 20 <210> 19 <211> 35 <212> ADN
<213> Aeromonas sobria <400> 19 gaaaggttgg cagctaatat ctgtcagctg tgacg 35 <210> 20 <211> 26 <212> ADN
<213> Aeromonas sobria <400> 20 aattgctgtt cagctagagt cttgta 26 <210> 21 <211> 53 <212> ADN
<213> Vibrio cholerae <400> 21 cagtagggag gaaggtggtt aagttaatac cttaatcatt tgacgttacc tac 53 <210> 22 <211> 48 <212> ADN
<213> Vibrio Cholerae <400> 22 tcaacctagg aatcgcattt gaaactgaca agctagagta ctgtagag 48 <210> 23 <211> 37 <212> ADN
<213> Staphylococcus aureus <400> 23 gttattaggg aagaacatat gtgtaagtaa ctgtgca 37 <210> 24 <211> 37 <212> ADN
<213> Staphylococcus epidermidis <400> 24 tattagggaa <211> 23 <212> ADN
<213> streptococcus bovis streptococcus equinus <400> 25 ttggaaactg ttagacttga gtg 23 <210> 26 <211> 43 <212> ADN
<213> Enterococcus faecalis <400> 26 aagaacaagg acgttagtaa ctgaacgtcc cctgacggta tct 43 <210> 27 <211> 27 <212> ADN
<213> Enterococcus faecium, hirae, durans <400> 27 agagtaactg ttcatccctt gacggta 27 <210> 28 <211> 29 <212> ADN
<2I3> CLostridium perfringens <400> 28 agcgtaggcg gatgattaag tgggatgtg 29 <210> 29 <211> 22 <212> ADN
<213> Clostridium perfringens <400> 29 gtgctgcatt ccaaactggt ta 22 <210> 30 <211> 24 <212> ADN
<213> Mycobacterium sp.
<400> 30 gcgtgcgggc gatacgggca gact 24 <210> 31 <211> 25 <212> ADN
<213> Mvcox aaggtccggg ttttctcgga ttgac 25 <210> 32 _ <211> 29 <212> ADN
<213> Mycobacterium kansasü
<400> 32 gtccgggttc tctcggattg acggtaggt 29 <210> 33 <211> 22 <212> ADN
<213> Mycobacterium gordonae <400> 33 gttttctcgg gctgacggta gg 22 <210> 34 <211> 24 <212> ADN
<213> Mycobacterium marinum <400> 34 aggttcgggt tttctcggat tgac 24 <210> 35 <211> 20 <212> ADN
<213> Mycobacterium xenopi <400> 35 ctttcagcct cgacgaagct 20 <210> 36 <211> 22 <212> ADN
<213> Mycobacterium xenopi <400> 36 gtgacggtag gggcagaaga ag 22 <210> 37 <211> 42 <212> ADN
<213> Burkholderia gladioli <400> 37 ccggaaagaa <212> ADN
<213> Burkholderia cepacia <400> 38 _ actgcattgg tgactggcag gctag 2~5 <210> 39 <211> 39 <212> ADN
<213> Stenotrophomonas maltophilia <400> 39 gaggaacatc catggcgaag gcagctacct ggaccaaca 39 <210> 40 <211> 23 <212> ADN
<213> Cryptosporidium <400> 40 cagttatagt ttacttgata atc 23 <210> 41 <211> 20 <212> ADN
<213> Cryptosporidium <400> 41 ttattagata aagaaccaat 20 <210> 42 <211> 27 <212> ADN
<213> Cryptosporidium <400> 42 acctatcagc tttagacggt agggtat 27 <210> 43 <211> 27 <212> ADN
<213> Cryptosporidium <400> 43 tgccttgaat actccagcat ggaataa 27 <210> 44 <211> 37 <212> ADN
<213> Crypt
- Une amorce est une sonde comprenant de 5 à 100, préférentiellement de 10 à 40 motifs nuclëotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé de séquençage, dans une méthode de transcription inverse, etc...
- L'identité entre un fragment et une séquence de référence, qui caractérise le degré d'identité entre ledit fragment et ladite séquence, est mesuré par alignement dudit fragment sur ladite séquence puis détermination du nombre de monomères identiques entre les deux.
Les sondes et amorces selon l'invention sont choisies parmi (a) les séquences identifiées dans le listage de séquences annexé
à la description, (b) tout fragment des séquences (a), à la fois, comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque des séquences (a) et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite séquence (a) ; à titre d'exemple, un fragment (b) comporte 10 nucléotides parmi lesquels 5 nucléotides contigus appartiennent à une séquence (a) et au moins 2 nucléotides des 5 nucléotides restants sont identiques respectivement aux deux nucléotides correspondants dans la séquence de référence, après alignement.
- Par séquence d'identification, on désigne toute séquence ou tout fragment tel que défini ci-dessus, pouvant servir de sonde de détection et/ou de capture.
- Par traitement du milieu aqueux, on entend toute étape de filtration et/ou de lyse et/ou de purification.
- Par étape de lyse, on entend une étape capable de libérer les acides nucléiques contenus dans les enveloppes protéiques et/ou lipidiques des microorganismes (comme des débris cellulaires qui perturbent les réactions ultérieures). A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes de lyse telles que décrite dans les demandes de brevet de la Demanderesse WO-A-00/05338 sur la lyse mixte magnétique et mécanique, WO-A-99/53304 sur la lyse électrique, et WO-A-99/15321 sur la lyse mécanique.
L'homme du métier pourra utiliser d'autres méthodes de lyse bien connues telles que les chocs thermiques ou osmotiques ou les lyses chimiques par des agents chaotropiques tels que les sels de guanidium (US-A-5,234,809).
- Par étape de purification, on entend la séparation entre les acides nucléiques des micro-organismes et les constituants cellulaires relargués dans l'étape de lyse. Cette étape permet généralement de concentrer les acides nucléiques. A titre d'exemple, on peut utiliser des particules magnëtiques éventuellement revêtues d'oligonucléotides, par adsorption ou covalence (voir à ce sujet les brevets US-A-4,672,040 et US-A-5,750,338), et ainsi purifier les acides nucléiques qui se sont fixés sur ces particules magnétiques, par une étape de lavage. Cette étape de purification des acides nucléiques est particulièrement intéressante si l'on souhaite amplifier ultérieurement lesdits acides nucléiques. Un mode de réalisation particulièrement intéressant de ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet déposées par la Demanderesse sous les références suivantes : WO-A-97/45202 et WO-A-99/35500.
Dans la dernière de ces demandes de brevet, il s'agit de particules magnétiques thermosensibles ayant chacune un noyau magnétique recouvert d'une couche intermédiaire. La couche intermédiaire est elle-même recouverte par une couche externe à base d'un polymère susceptible d'interagir avec au moins une molécule biologique, le polymère externe est thermosensible et présente une température critique inférieure de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 10 et 100°C et de préférence entre 20 et 60°C.
Cette couche externe est synthétisée à partir de monomères cationiques, qui génèrent un polymère ayant la capacité de lier les acides nucléiques. Cette couche intermédiaire isole les charges magnétiques du noyau, afin d'éviter les problèmes d'inhibition des techniques d'amplification de ces acides nucléiques.
Un autre exemple intéressant de méthode de purification des acides nucléiques est l'utilisation de silice soit sous forme de colonne (kits Qiagen par exemple), soit sous forme de particules inertes [Boom R, et al., J.
Clin. Microbiol., 1990, n°28(3), p. 495-503] ou magnétiques (Merck:
MagPrep~
Silica, Promega: MagneSiIT"" Paramagnetic particles). D'autres méthodes très répandues reposent sur des résines échangeuses d'ions en colonne (kits Qiagen par exemple) ou en format particulaire paramagnétique (Whatman:
DEAE-Magarose) [Levison PR et al., J. Chromatography, 1998, p. 337-344].
Une autre méthode très pertinente pour l'invention est celle de l'ads_orption sur support d'oxyde métallique (société Xtrana: matrice Xtra-BindTM).
- Par étape de détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une méthode de détection à l'aide d'un marqueur.
De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinicat Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, tnd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249].
Dans un premier mode de réalisation de l'invention, une méthode d'hybridation à l'aide de sondes spécifiques est mise en oeuvre pour l'étape de détection. Ce mode d'exécution particulier consiste à mettre en contact les acides nucléiques, amplifiés ou non, des micro-organismes à détecter avec une sonde de capture fixée sur un support solide, et capable de s'hybrider spécifiquement avec lesdits acides nucléiques; puis à révéler, selon les méthodes connues, la présence éventuelle des acides nucléiques fixés au support solide notamment par l'intermédiaire d'au moins une sonde de capture.
Par "marqueur", on entend un traceur capable d'engendrer un signal. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la bêtagalactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ;
les groupements à densité électronique détectable par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, ssS OU X251.
Ainsi, le polynucléotide peut être marqué pendant l'étape d'amplification enzymatique, par exemple en utilisant un nucléotide triphosphate marqué pour la réaction d'amplification. Le nucléotide marqué
sera un désoxyribonucléotide dans les systèmes d'amplification générant un ADN, comme la PCR, ou un ribonucléotide dans les techniques d'amplification générant un ARN, comme les techniques TMA ou NASBA.
- . Le polynucléotide peut aussi être marqué après l'étape d'amplification, par exemple en hybridant une sonde marquée selon la technique d'hybridation sandwich décrite dans le document WO-A-91/19812.
Un autre mode particulier préférentiel de marquage d'acides 5 nucléiques est décrit dans la demande FR-A-2 780 059 de la Demanderesse.
Un autre mode préférentiel de détection utilise l'activité exonucléase 5'-3' d'une polymérase tel que décrit par Holland P.M., PNAS (1991 ) p 7276-7280.
Des systèmes d'amplification du signal peuvent être utilisés comme décrit dans le document WO-A-95/08000 et, dans ce cas, la réaction 10 préliminaire d'amplification enzymatique peut ne pas être nécessaire.
- Par amplification enzymatique, on entend une processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique particulier à l'aide d'amorces spécifiques par l'action d'au moins une enzyme. Ainsi, pour l'amplification des acides nucléiques, il existe, entre autres, les techniques suivantes - PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US-A-4,683,195, US-A-4,683,202 et US-A-4,800,159, - LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0 201 184, - RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO-A-90/01069, - 3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995, - NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO-A-91 /02818, et - TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet U S-A-5, 399, 491.
On parle alors d'amplicons pour désigner les polynucléotides générés par une technique d'amplification enzymatique.
- Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un acide nuclëique. Des matériaux de synthèse, ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, notamment les polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose, ou le dextran ;
des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux- minéraux tels pue la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la fiorme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO -A-94/12670, d'une particule ou d'une biopuce.
- Par "biopuce", on entend un support solide de dimension réduite où sont fixés une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées.
A titre d'illustration, des exemples de ces biopuces sont donnés dans les publications de [G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n°16, p. 40 44 ; F. Ginot, Human Mutation, 1997, n°10, p.1-10 ; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n°1(3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, n° 22(15), p. 2915-2921 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n°
16, p. 541-546] ou dans les brevets US-A-4,981,783, US-A-5,700,637, US-A
5, 445, 934, U S-A-5, 744, 305 et U S-A-5, 807, 522.
La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les acides nucléiques tout en générant un bruit de fond minimum pour la méthode de détection. Un avantage des biopuces est qu'elles simplifient l'utilisation de nombreuses sondes de capture permettant ainsi la détection multiple de micro-organismes à détecter tout en tenant compte du polymorphisme desdits micro-organismes à détecter L'invention décrite ci-après permet de résoudre les problèmes posés par les méthodes précédemment décrites, à la fois en terme de sensibilité, spécificité et capacité de multidétection, tout en étant rapide et facile à mettre en oeuvre.
Un premier objet de l'invention est un procédé de contrôle de la qualité microbiologique d'un milieu aqueux environnemental, susceptible de comporter différents micro-organismes, comprenant les étapes suivantes - on choisit un ensemble de référence, constitué d'au moins trois micro-organismes, représentatifs, ensemble ou séparément, d'un niveau de qualité
microbiologique, - on dispose d'un nécessaire de détermination microbiologique, constitué d'au moins trois sondes d'identification spécifiquement et respectivement desdits trois microorganismes, - après traitement du milieu à analyser, on met - I~sdits microorganismes, ou toute fraction obtenue à partir de ces derniers, en contact avec ledit nécessaire de détermination, moyennant quoi on multi-détermine lesdits microorganismes, cette détermination étant représentative du niveau de qualité
microbiologique du milieu.
L'invention concerne aussi un nécessaire de détermination microbiologique comprenant un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus etlou de parasites, lesdites sondes d'identification étant chacune spécifiques d'une espèce ou au moins d'un genre de bactérie, virus ou parasite susceptible d'être présent dans un échantillon de liquide à doser.
Selon l'invention, un nécessaire désigne toute méthode manuelle, semi-automatique ou automatique permettant la mise en oeuvre d'un moyen de dosage, dosage signifiant l'identification et/ou la détermination de la viabilité
et/ou la quantification, chacun de ces trois paramètres étant déterminés en séquence ou selon les combinaisons : identification seule ; identification et quantification ; identification et viabilité ; identification, quantification et viabilité.
Cette invention concerne également une méthode de multidétection utilisant en particulier la technique des biopuces pour rechercher un grand nombre des paramètres microbiologiques incluant des indicateurs de contamination exigés dans les différentes législations (USA, France, Europe) et des microorganismes pathogènes incluant des bactéries, virus et parasites.
En une seule mise en oeuvre une analyse microbiologique complète d'un échantillon peut être réalisée avec rapidité en par exemple environ 4 heures et avec une grande sensibilité par exemple de l'ordre de 1 micro cible/101-1001 grâce à l'étape d'amplification enzymatique.
Cette méthode de multidétection est spécifique des espèces recherchées grâce à l'utilisation de séquences, dites séquences d'identification de chaque espèce, comme sonde, et peut permettre de déterminer la viabilité
des microorganismes par la détection de marqueurs de viabilité comme par exemple, ARNr et/ou ARNm.
La rapidité, la sensibilité et la spécificité de cette méthode de multidétection, permettent de l'appliquer indifféremment à tout milieu aqueux environnemental, c'est à dire tout milieu aqueux à l'exclusion de tout fluide corporel. En particulier cette méthode s'applique à toute eau destinée à la consommation humaine, eaux propres industrielles, eaux résiduaires urbaines et industrielles, eaux de l'industrie agro-alimentaire, eaux de process et à
tout fluide ou produit.
Cette détection simultanée en une seule étape de multiples produits d'amplifications spécifiques, est possible grâce à l'utilisation de support solide en particulier sous la forme d'un support solide de dimension réduite où sont fixées une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées, ou « biopuce », ces sondes de capture étant constituées par un jeu de fragments ou de la totalité de séquences nucléotidiques spécifiques dites séquences d'identification des microorganismes recherchés.
Ces séquences d'identification ou ces fragments peuvent également être mis en oeuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues comme les techniques de dépôt ponctuel sur filtre dites "DOT-BLOT"[Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982], les techniques de transfert d'ADN dites "SOUTHERN BLOT" [Southern E. M., J. Mol. Biol., 1975, 98, 503], les techniques de transfert d'ARN dites "NORTHERN BLOT", ou les techniques "SANDWICH" [Dunn A. R. et al., Cel1,1977, 12,23].
Parmi les microorganismes recherchés, on citera à titre d 'exemple les microorganismes suivants Parmi les bactéries Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 095ï :H7, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis , Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Staphylococcus epidermatitis, Staphylococcus aureus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Pseudomonas aeruginosa;
Vibrio cholerae, Acinetobacter baumanü, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, le genre Mycobacterium, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, le genre Legionella, Legionella pneumophila, le genre Salmonelle.
Parmi les virus et plus particulièrement parmi les Adenovirus, les Adeno virus 40, et les Adeno virus 41 bis ;
les Astrovirus, HastV 7-2 ;
les Enterovirus, tels que Poliovirus, Coxsackievirus, ou Echovirus, les Rotavirus, les Calicivirus, tels que Virus de Norwalk, Virus de Sapporo, et les virus de l'Hépatite tels que le virus de l'Hépatite A, Parmi les parasites Le genre Cryptosporidium, tel que Cryptosporidium parvum, le genre Giardia, tel que Giardia lamblia et les Microsporidies.
Les microorganismes peuvent être recherchés au niveau du genre auquel ils appartiennent soit au niveau taxonomique inférieur c'est à dire au niveau de l'espèce, soit au niveau des sérotypes, des sous-types et en épidémiologie : par exemple pour Legionella la détermination pourra être effectuée par la séquence d'identification SEQ ID N0:9 pour la recherche au niveau du genre et par SEQ ID N0:10 ou 11 pour une détermination par une séquence d'identification spécifique de la bactérie Legionella pneumophila.
Les séquences matérialisées sur la biopuce, dites séquences d'identification correspondant aux espèces recherchëes seront choisies parmi les séquences dont la liste est jointe en annexe de SEQ ID N0:1 à SEQ ID
N0:104.
Des variantes de mises en oeuvre du procédé selon l'invention sont ci-après exposées.
Le nécessaire de détermination microbiologique exposé aux microorganismes du milieu aqueux répond avantageusement à l'une quelconque des présentations suivantes Les trois sondes d'identification qu'il comprend ont au moins une séquence choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos :1-104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moïns 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
II comprend au moins une sonde d'identification spécifique à une bactérie, au moins une sonde d'identification spécifique à un parasite et au moins une sonde d'identification spécifique à un virus ; de préférence, il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO :1 à
SEQ ID NO :39, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:66 à SEQ ID
N0:69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49, SEQ ID NO :63 à SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; et au moins une séquence choisie parmi entre SEQ ID
N0:50 à SEQ ID N0:60,et SEQ ID N0:70 à SEQ ID N0:104, et tous fragments 5 de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
II comprend au moins quatre sondes d'identification spécifiques à
au moins quatre bactéries différentes ; de préférence, elles sont choisies parmi 10 SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:66 à SEQ ID N0:69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec Ladite quelconque séquence:
15 II comprend au moins cinq sondes d'identification spécifiques à au moins cinq virus différents ; de préférence, elles sont choisies parmi SEQ ID
N0:50 à SEQ ID N0:60, et SEQ ID N0:70 à SEQ ID .N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins deux sondes d'identification spécifiques à au moins deux parasites ; de préférence, elle est choisie parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49 et SEQ iD N0:63 à SEQ iD NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins une sonde d'identification spécifique à une bactérie et au moins une sonde d'identification spécifique à au moins un parasite. De préférence, il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:1 à
SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:67 à
SEQ ID N0:69, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence, et au moins une sonde d'identification comprise SEQ ID N0:40 à
SEQ ID N0:49,_ SEQ iD N0:63 à SEQ ID N0:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes : Escherichia coli, genre Salmonelle, Staphylococcus aureus. De préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N09:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:15, SEQ ID
N0:23, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes : Escherichia coli, genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Clostridium pertringens. De préférence, au moins une sonde d'identification dudit nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID
N0:69, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus 2o dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Genre Cryptosporidium. De préférence, au moins une sonde dudit nécessaire est choisie parmi SEQ ID
N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ iD N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID N0:69, SEQ
ID N0:15, SEQ iD N0:23, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:44, et fous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites sëquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Gardia lamblia, Cryptosporidium parvum.
De préférence, au moins une sonde dudit nécessaire est choisie parmi SEQ ID
N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:46 à SEQ ID NO: 49, SEQ ID N0:63, SEQ
ID N0:64 et SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans Tune quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Enterovirus, Genre Cryptosporidium, De préférence, au moins une sonde d'identification dudit nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID
N0:62, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:53 à SEQ
ID N0:55, SEQ ID N0:70 à SEQ ID N0:75, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Escherichia coli sérotype 0157 :H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus eguinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A
et B, Echovirus, Genre Cr~ptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia. De préfërence, au moins une sonde d'identification du nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 à SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49, SEQ ID
N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:61 à SEQ ID N0:75, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Escherichia coli sërotype 0157 : H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus eguinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A
et 8, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus. De préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:9 à SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:14 à SEQ ID N0:20, SEQ ID
N0:23, SEQ ID N0:25 à SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:51, SEQ
ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec lâdite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Escherichia coli sérotype 0157 : H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium pertringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A
et 8, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Nonivalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Genre Mycobactéries, Mycobacterium aviumï Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, Acinetobacter baumanü, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Astrovirus. De préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:9 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes : Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0957:H7, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus eguinus, Clostridium perfringens , Staphylococcus epidermitis, Staphylococcus aureus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni,-_Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Acinetobacter baumanü, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, le genre Mycobactéries, Mycobacferium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, le genre Legionella,~
Legionella pneumophila, le genre Salmonelle.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants l0 les Adenovirus, tels que Adeno virus 40, Adeno virus 41 bis;
les Astrovirus, HAstV 9-2;
les Enterovirus, tels que Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, les Rotavirus, les Calicivirus, tels que Virus de Norwalk, Virus de Sapporo, et les virus de l'Hëpatife tel que le virus de l'Hépatite A.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les parasites suivants Le genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia et les Microsporidies.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Escherichia coli sérotype 0157 : H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A
et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A. De préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID
N0:4, SEQ iD N0:9 à SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:14 à SEQ ID N0:20, SEQ
ID N0:23, SEQ ID N0:25 à SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:51, SEQ ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID NO :75, SEQ ID NO :97, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité -avec _ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia 5 coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, 10 Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A. De préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire est choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:9 à SEQ ID
N0:11, SEQ ID N0:14 à SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 à SEQ
15 ID N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:51, SEQ ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID NO :68, SEQ ID NO :70 à SEQ ID NO :75, SEQ ID NO :97, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque 20 séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0157:H7, genre Salmonelle, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus. De préférence au moins une sonde d'identificatiôn du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ 1D N0:14 , SEQ ID NO 62, SEQ 1D NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ
ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ
ID NO 11, SEQ ID 23, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi les Calicivirus et les Rotavirus. De préférence au moins une sonde d'identification du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ ID NO
59, SEQ ID NO :60 SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 96, SEQ ID NO :98 à SEQ !D NO :104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites sëquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants Virus de l'hépatite A, Enterovirus, au moins un virus choisi parmi le virus de Norwalk et les Rotavirus. De préférence au moins une sonde d'identification du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ ID NO 98 à 104, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 56 à SEQ ID NO 58, SEQ ID NO :60, SEQID NO :97, SEQ ID NO :70 à SEQ ID NO :75, SEQ ID NO 76 à SEQ ID
NO 96, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomëres contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détérmination microbiologique sont choisis parmi les parasites suivants : genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia. De préférence au moins une sonde d'identification du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0957:H7, genre Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Virus de l'hépatite 3o A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi les Calicivirus et les Rotavirus, genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia ; de préférence, au moins une sonde d'identification du nécessaire de détermination est choisie parmi SEQ ID N0:14 , SEQ ID NO 62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ ID 23, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO :60 SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 96, SEQ ID NO :98, SEQ ID. N0:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence, ou Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0957:H7, genre Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi le vrius de Norwalk et les Rotavirus, genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia ; de préférence, au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14 , SEQ 1D NO 62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ
ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ
ID NO 11, SEQ ID 23, SEQ ID NO 98 à 104, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 56 à
SEQ ID NO 58, SEQ ID NO :60, SEQID NO :97, SEQ ID NO :70 à
SEQ ID NO :75, SEQ ID NO 76 à SEQ ID NO 96, SEQ ID N0:40 à SEQ ID NO
45, SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Lesdits microorganismes du nécessaire ' de détermination microbiologique sont choisis parmi Virus de Norwalk, Virus Hepatitis A, Enterovirus. De préférence, au moins une sonde d'identification choisie parmi parmi SEQ ID NO 59, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO 97, SEQ ID N0 70 à SEQ
ID NO 75.
Les sondes de capture comportent avantageusement au moins 10, de préférence au moins 13, voire au moins 15, même au moins 17 bases etlou au plus 35, de préférence au 25, voire au plus 20. Par exemple, une sonde de capture comporte entre 10 et 35 bases, avantageusement entre 17 et 20 3o bases, avec au moins une position d'interrogation située dans la région centrale de la séquence connue, en l2eme position par rapport à l'extrémité 3' de la séquence. Pour les espèces E. coli et E. faecalis, il y aura de préférence des sondes de capture de 17 bases, avec 2 positions d'interrogations : une en 10eme et une en $eme position. Ces sondes de capture ont, suivant le cas des longueurs comprises entre 10 et 25 nucléotides. Les positions d'interrogation varient alors en fonction de la longueur de la sonde de capture.
Les séquences spécifiiques dites séquences d'identification, ont été
sélectionnées par des techniques de sélection informatique et sont chacune suffisamment spécifique d'une espèce etlou d'un membre d'une espèce qu'elles permettent de discriminer des genres taxonomiquement proches et/ou des espèces du même genre et d'éviter les phénomènes d'hybridation croisée.
Dans un mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries etlou de virus etiou de parasites comprenant au moins quatre sondes d'identification spécifiques à au moins quatre bactéries différentes.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries etlou de virus etlou de parasites comprenant au moins cinq sondes d'identification spécifiques à au moins cinq virus différents.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites comprenant au moins deux sondes d'identification spécifique à un parasite.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites comprenant au moins une sonde spécifique d'une bactérie et au moins une sonde d'identification spécifique d'un parasite.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes spëcifiques des bactéries sont choisies parmi les sondes spécifiques des bactéries suivantes Escherichia coli, Genre Salmonella, Staphylococcus aureus.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes spécifiques des bactéries sont choisies parmi les sondes spécifiques des bactéries suivantes Escherichia coli, genre Saimonella, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes spécifiques des bactéries sont choisies parmi les sondes spécifiques des bactéries suivantes Escherichia coli, Enterococcus faecalis , Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes spécifiques des bactéries sont choisies parmi les sondes spécifiques des bactéries suivantes Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0757 ;H7, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus eguinus, Clostridium perfringens , Staphylococcus epidermifis, Staphylococcus aureus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Acinetobacter baumanü, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia , le genre Mycobactéries, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Myco6acterium marinum, Mycobacterium gordonae, le genre Legionella, Legionella pneumophila, le genre Salmonelle.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactëries etlou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants Escherichia coli, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Genre Cryptosporidium.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Gardia lamblia, Cryptosporidium parvum.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants Escherichia coli, - Er~terococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enferococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Closfridium perfringens, Genre Salmonelle, Sfaphylococcus aureus, Enterovirus : virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre 5 Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries etlou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants l0 Escherichia coli, Enferococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus : virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et 8, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Genre Legionella, 15 Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification 20 de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, 25 Enferovirus : virus de la poliomyélife, virus coxsackie A et 8, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Nonwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Genre Mycobactéries, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, Acinetobacter baumanü, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenofrophomonas maltophilia, Asfrovirus.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le -néEessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactëries et/ou de virus et/ou de parasites choisis les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterovirus, Genre Cryptosporidium, Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes d'identification spécifiques des virus sont spécifiques des virus suivants les Adenovirus, tel que Adeno virus 40, Adeno virus 49bis;
les Astrovirus, HastV 1-2;
les Enterovirus, tels qiue Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, les Rotavirus, les Calicivïrus, tels que Virus de Norwalk, Virus de Sapporo et, les virus de l'Hépatite tel que le virus de l'Hépatite A.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention le nécessaire de détermination microbiologique comprend un mélange de sondes d'identification de bactéries et/ou de virus et/ou de parasites dont les sondes spécifiques des parasites sont choisies parmi les sondes spécifiques des parasites suivants Le genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia et les Microsporidies.
Selon l'invention dans un mode de réalisation, le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ
LD N0:1 à SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:66 à
SEQ ID N0:69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:40 à
SEQ ID N0:49, SEQ ID NO: 63 à SEQ ID N0:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence ; et au moins une séquence choisie parmi SEQ ID N0:50 à SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:70 à SEQ ID N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation diffiërent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins 4 sondes d'identifications choisies parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:62, SEQ ID
N0:66 à SEQ ID N0:69, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque 1o séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins 5 sondes d'identification comprise entre SEQ ID N0:50 à SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:70 à SEQ ID N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49, SEQ ID NO: 63 à SEQ ID N0:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:61,~ SEQ ID N0:62, SEQ ID
N0:66 à SEQ ID N0:69, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence, et au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49, SEQ ID NO: 63 à SEQ ID N0:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans ~un . mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID
N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID N0:69, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:68, S.EQ ID
N0:69, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont ia séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un ëchantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID
N0:69, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID. N0:40 à SEQ ID N0:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID
N0:69, SEQ ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:70 à SEQ ID N0:75, SEQ
ID N0:40 à SEQ ID N0:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 à-SEQ LD
N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:49, SEQ ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ
ID N0:61 à SEQ ID N0:75, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID N0:1 à SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID
N0:11, SEQ ID N0:14 à SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 à SEQ
ID N0:29, SEQ ID N0:40 à SEQ ID N0:51, SEQ ID N0:53 à SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID N0:59, SEQ ID N0:60 à SEQ ID N0:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une séquence comprise entre SEQ ID
N0:1 à SEQ ID N0:6; SEQ ID N0:9 à SEQ ID N0:22, et SEQ ID N0:23 à SEQ
ID N0:55, SEQ ID N0:56 à SEQ ID N0:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID
N0:14 , SEQ ID NO 62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 15, SEQ
ID NO 5; SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ
ID 23. et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70°!° d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme prësent dans un échantillon comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID
NO 59, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 75 et tous fragments de celles-oi comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le 5 nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID
NO 98 à 104, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 98, SEQ ID NO 56 à SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 76 à SEQ ID NO 96 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites 10 séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
Selon l'invention dans un mode de réalisation différent le nëcessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon comprend au moins une séquence comprise entre choisie 15 parmi SEQ ID N0:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 65 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
Ces fragments nucléotidiques, dite séquences d'identification selon 20 l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enferococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, 25 Enterovirus : virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus, 30 Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Genre Mycobactérium, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, Acinetobacter baumanü, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Astrovirus.
Les Adenovirus, tel gue Adeno virus 40, Adeno virus 41 bis;
les Astrovirus, HastV 9-2 ; -les Enterovirus, tels que Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, les Rotavirus, les Calicivirus, tels que Virus de Norwalk, Virus de Sapporo, et les virus de l'Hépatite, tel que l'Hépatite A, le genre Cryptosporidium, tels que Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia et les Microsporidies.
Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi (es microorganismes suivants Escherichia coli, genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Clostridium pen'ringens.
Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification 2o selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia soli, genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Genre Cryptosporidium Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterovirus et Genre Cryptosporidium.
Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins ê autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus : virus de la poliomyélife, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus : virus de la poliomyëlite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norvvalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus.
Dans un autre mode de réalisation ces séquences d'identification selon l'invention permettent le dosage sélectif d'un microorganisme en présence d'au moins 2 autres microorganismes choisis parmi les microorganismes suivants Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus : virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Genre Mycobactéries, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, Acinetobacter baumanü, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Astrovirus.
On pourra également concevoir et utiliser un nëcessaire de détermination microbiologique selon l'invention comportant des séquences d'identification pour identifier des microorganismes au niveau des sérotypes, des sous-types et en épidémiologie.
Le procédé d'analyse d'un échantillon susceptible de contenir au moins une bactérie, parasite et/ou virus, selon l'invention utilise un mélange de séquences nucléotidiques comme sondes d'identification spécifiques d'un sérotype, d'un sous-type, d'une espèce ou au moins un genre de bactérie, virus et/ou parasite susceptible d'être présent dans l'échantillon.
Ce procédé d'analyse d'un échantillon selon l'invention est caractérisé par une étape de détection comprenant la mise en oeuvre d'un nécessaire de détermination microbiologique tel que défini précedemment.
Dans un mode préférentiel d'exécution préalablement à l'étape de détection, on peut effectuer au moins une étape de lyse.
Dans un autre mode d'exécution, postérieurement à cette étape de lyse, on effectue une ëtape d'amplification.
L'invention concerne également un procédé de contrôle d'un échantillon liquide dans lequel préalablement à toute étape de détection une étape d'enrichissement en microorganismes dudit échantillon est effectuée.
Cette étape d'enrichissement peut être effectuée par filtration notammment en utilisant un moyen de filtration comprenant des fibres creuses et utilisé en mode frontal permettant d'obtenir dans un temps limité, à partir d'un échantillon liquide de départ de volume important et prédeterminé, un échantillon à analyser d'un volume suffisamment faible, tout en garantissant la viabilité des microorganismes, pour que les techniques d'analyse, notamment la multidétection selon l'invention, puissent être ensuite mises en oeuvre.
Ce moyen de filtration est basé sur la technique de l'ultrafiltration sur fibres creuses en mode frontal.
Par mode frontal, par opposition au mode tangentiel, on entend tout passage en une passe d'un échantillon liquide de départ dans le moyen de filtration, sans recyclage d'au moins une partie du même échantillon à
l'entrée dudit moyen de filtration.
L'utilisation de ce moyen d'ultrafiltration en mode frontal permet d'obtenir des concentrats de volume faible, d 'effectuer ia concentration d'un prélèvement dans une échelle de temps de l'ordre de l'heure au plus en un seul passage, tout en garantissant la viabilité des microorganismes, la multi-récupération et des rendements de l'ordre de 100 %.
Par multi-récupération, on entend la possibilité de récupérer dans l'échantillon final pratiquement tous les différents genres ou espèces de microorganismes présents dans l'échantillon de départ.
Ces rendements élevés sont obtenus en raison de l'inexistence de volumes, dits volumes morts, dus par exemple sur d'autres dispositifs à la.
présence de tuyauteries annexes, par exemple de recyclage, et par la fiabilité
de la porosité sur toute la longueur de la fibre creuse.
Le procédé de contrôle selon l'invention, est ainsi appliqué sur un échantillon obtenu éventuellement par filtration, d'un volume compris entre 1 ml et 100 litres.
Une étape de lyse des microorganismes est effectuëe, soit par lyse mécanique soit par lyse chimique, telles que décrites précédemment.
Une étape de purification est éventuellement appliquée, en utilisant éventuellement les techniques de capture par des oligonucléotides fixés sur des particules magnétiques, ou par utilisation de colonnes de silice, de particules de silice (inerte ou magnétique), de colonnes échangeuses d'ions, ou de toute autre méthode citée précédemment.
Une étape d'amplification enzymatique est éventuellement appliquée également en utilisant préférentiellement les techniques de transcription telles que TMA, NASBA, mais en utilisant en particulier les techniques de PCR et RT-PCR.
Une étape de marquage de l'amplicon est appliquée, par utilisation préférentielle d'un marqueur fluorescent.
Une étape d'hybridation est ensuite appliquée, en utilisant préférentiellement les sondes d'identification spécifiques ou leurs fragments fixés sur un support solide, et en particulier en utilisant une biopuce.
Le procédé de contrôle et le nécessaire de détermination microbiologique selôn l'invention utilisant ces séquences spécifiques permet de détecter simultanément un bactérie et/ou un virus etlou un parasite d'un panel fixe en une seule étape de multidétection finale.
En fonction des liquides à analyser des panels fixes de microorganismes peuvent être facilement définis.
3o Un autre objet de l'invention est un procédé de production et/ou désinfection d'un liquide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'analyse mettant en oeuvre un nécessaire de détermination microbiologique selon l'une quelconque des revendications de 35 à 48 et générant un algorithme d'interprétation des données permettant l'asservissement dudit procédé de production et/ou désinfection auxdites données générées par le nécessaire de détermination microbiologique.
Les avantages de l'invention et les techniques mises en oeuvre sont illustrës par les exemples non limitatifs et les figures en annexe.
5 La figure 1 représente l'évolution du base-call sur les sondes spécifiques d'Escherichia coli et d'Acinetobacter baumanü en fonction du nombre de copies d'ARNr de chacun des partenaires ajoutées avant amplification.
La zone encadrée dans le graphique représente les proportions E.
10 colilA. baumanü à partir desquelles les cibles E, coli sont interprétables par la puce.
La figure 2 représente l'évolution du base-call sur les sondes spécifiques d'E, coli, S. typhimurium et A. baumanü en fonction des proportions du nombre de copies de transcripts marqués représentant les 3 espèces.
15 Dans les exemples ci-dessous décrits les souches utilisées sont Escherichia coli ATCC 11775 Enterococcus faecalis 19433T
Salmonella typhimurium API 9810059 Acinetobacter baumanü ATCC 19606 Exemple 1 : Détection et identification d'une seule cellule bactérienne en culture : cas d'Escherichia coli (gram -) et d'Enterococcus faecalis (gram +) a) Préparation de la culture On cultive une souche d'E, coli ou E, faecalis à 37°C dans 2 ml de bouillon Luria Bertani. Lorsque la culture a atteint une densité optique à 620 nanomètres de 0,2, on prélève 1 ml. (10$ bactériesiml). On réalise des dilutions en série, jusqu'à avoir 0,1 cellule/pl.
b) Extraction et purification des acides nucléiques 1. Lyse des micoorganismes De la suspension à 0.1 cellules par microlitres, 10p1 sont prélevés (1 cellule). Sur cette suspension, on ajoute 100p1 d'un tampon de lyse contenant du Tris 10mM, de l'EDTA 1 mM (dilution d'une solution TE100X
commercialisëe chez SIGMA, ref. T-9285) et du lyzozyme (Sigma, ref. L-6876) dont la concentration est différente selon le Gram de la bactérie : 3 mg/ml pour E. faecalis, 400 pgJma pour E. coli. La lyse des bactéries s'effectue en laissant le tube contenant la suspension bactérienne en contact avec le tampon de lyse durant 5 à 10mn à température ambiante.
2. Extraction et purification des acides nucléiques.
Cette étape s'effectue en utilisant le kit Rneasy mini kit commercialisé par Qiagen (ref. 74104) selon le protocole recommandé pour l'extraction et la purification des ARN totaux bactériens.
c) RT-PCR
Les deux étapes de RT et PCR vont s'effectuer l'un après l'autre, dans un seul tube, en utilisant le kit ACCESS (ref A1250, Promega).
Pour cela, on ajoute à 25p1 de la suspension d'ARN total le tampon 5X AMVITfI, 1 mM de MgS04, 200pM de dNTPs (deoxyribonucleosides triphosphates), 5U d'AMV RT polymérase, 5U de Tfl polymérase, 5U de RNAsin (Pranega ref. NZIII), 0.5pM des amorces eubactériennes A1.1 et 5'gaggcagcagtggggaat3' 5'taatacgactcactatagggaggaggattactaccagggtatctaat3' (en gras : promoteur de la polymérase T7), afin d'obtenir 50p1 de volume réactionnel final.
Pour l'étape de RT, le mélange est mis à incuber 45mn à 48°C, puis 5mn à 94°C. Pour l'étape de PCR on réalise ensuite 35 cycles composés chacun des 3 étapes suivantes : 94°C 1 mn, 55°C 1 mn, 68°C 1 mn. Une extension finale de 7mn à 68°C est ensuite réalisée.
d) Vérification de l'amplicfication On dépose 5p1 de produit d'amplification (amplicon) sur un gel d'agarose 1,5% dans de l'EDTA-Tris Borate. Après une migration de 20mn à
200V, on visualise la bande d'amplification par coloration au Bromure d'Ethidium et par illumination aux UV. On montre que l'amplification est positive par la présence d'une bande ayant la taille attendue (450 paires de bases).
e) Identification de l'amplicon sur une puce à ADN (Affymetrix, Santa Clara) Une biopuce est synthétisée sur un support solide en verre selon le procédé décrit dans le brevet US 5 744 305 (Affymetrix, Fodor et al) en utilisant la stratégie de reséquençage décrite dans la demande WO 95!11995 (Affymax, Chee et al) et selon la méthode décrite par A Troesch et al. dans J. Clin.
Microbiol., vol. 37(1 ), p 49-55, 1999 avec les variantes suivantes : les oligonucléotides synthétisés sur la puce réalisent le reséquençage des séquences d'identification. Ce procédé permet de dïminuer le nombre total d'oligonucléotides synthétisés et donc présentent un avantage considérable en terme de coût de production efi sans compromis sur la qualité de l'identification des différents microorganismes de part le choix de ces séquences d'identification . Les oligonucléotides comportent 20 bases, avec une position d'interrogation en 12eme position par rapport à l'extrémité 3' de la séquence.
Pour les espèces E. coli et E, faecalis, il y a également des oligonucléotides de I0 17 bases, avec 2 positions d'interrogations : une en 10 et une en 8eme position.
D'autres oligonucléotides ont des longueurs comprises entre 10 et 25 nucléotides. Les positions d'interrogation varient alors en fonction de la longueur de l'oligonucléotide.
L'analyse est effectuée sur le système complet GeneChip~
(référence 900228, Affymetrix, Santa Clara, CA) qui comprend le lecteur GeneArray~, le four d'hybridation GeneChip~ , la station fluidique GeneChip~
et le logicel d'analyse GeneChip~.
1. Transcription et marquage des amplicons.
Grâce à l'amorce antisens S9T7, tous les produits d'amplifications présentent un promoteur pour la RNA polymérase T7. Ces amplicons vont alors servir de matrice à une réaction de transcription au cours de laquelle sera incorporé un ribonucléotide fluorescent.
A partir des 50p1 de produit d'amplification positif, un aliquot (entre 2 et 12p1) est prélevé est ajouté à un mélange de transcription contenant les composants du kit Megascript T7 d'Ambion (ref. 1334) et de fluorescein-12-UTP (Roche, ref. 1427857). Le mélange réactionnel final se fait dans 20p1 et la réaction de transcription s'effectue pendant 2 heures à 37°C.
2. Fragmentation des transcripts marqués Afin d'améliorer les conditions d'hybridation, les transcripts marqués sont clivés en fragments d'environ 20 nucéotides. Pour cela, les 20p1 de transcripts marqués sont soumis à l'action de l'imidazole (SIGMA) 30mM et du chlorure de manganèse (Merck) 30mM pendant 30mn à 65°C.
3. Hybridation sur la puce de recherche A partir des 20p1 de transcripts marqués et fragmentés un aliquot de 5p1 est prélevé et ajouté à 700p1 de tampon d'hybridation dont la composition est de SSPE 6X (Eurobio), DTAB 5mM (Sigma), Triton 0.5% (Mark - . eurolab). Ce mélange est hybridé sur la puce dans les conditions suivantes : 40 . mn à 45°C. Après lavage, la puce est scannée, puis l'image d'hybridation obtenue est analysée par le logiciel Genechip~ (Affymetrix, Santa Clara) Les spots d'hybridation permettent de reconstituer la séquence de l'amplicon, qui ensuite comparée aux séquences de références de la puce. La séquence (et donc l'espèce qui lui correspond) qui présente le meilleur pourcentage d'homologie (base-call, en %) avec la séquence de l'amplicon est retenue pour l'identification.
4. Interprétation des résultats.
Seule une partie de la séquence de 450 bases est analysée. Elle correspond à tout ou partie des sondes d'identification représentées sur la biopuce. Le seuil d'interprétation, c'est à dire niveau d'identification est fixé à
au moins 70% de base-call sur la sëquence d'identification. En dessous de ce seuil, la cible n'est pas identifiée.
Résultats L'ARN extrait d'une seule cellule bactérienne (E. coli ou E, faecalis) donne lieu à un produit d'amplification, puis à une identification correcte sur la biopuce.
Exemple 2: Discrimination de mélanges de 2 espèces bactériennes différentes.
Dans cet exemple, la RT-PCR eubactérienne a été appliquées à
des cibles synthétiques. C'est à dire que ces cibles proviennent de l'amplification, puis de la transcription de l'ADN ribosomal 16S dans son entier.
Ces cibles sont appelées transcripts in-vitro. Dans cet exemple, la cible est un mélange de transcripts in-vitro représentant les espèces Escherichia coli et Acinetobacter baumanü. Quand on ajoute la cible au tube de RT-PCR, on ne résonne plus en terme de nombre de bactéries, mais de nombre de copies de transcripts in-vitro, puis en nombre d'équivalents-bactéries, en partant du postulat suivant : 1 bactérie correspond à 104 copies d'ARN ribosomal 16S.
Pour cela, tes transcripts ont été dosés à 10~~ copies / p1. Pour Acinetobacter baumanii, la dilution 1 OBCOpies/pl est préparée. Pour Escherichia coli, les dilutions 103/p1, 104/p1, 105/p1 et 106/p1 sont préparées. Le conditions du mélange réactionnel pour la RT-PCR sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1, paragraphe c), sauf que le volume de cible n'est plus 25p1 d'une suspension d'ARN total, mais 2p1 d'un mélange constitué de 1 p1 de chaque dilution de transcript représentant chaque espèce dans les proportions suivantes Equivalents bactries 0/0 0,111041110' 101104102110'10/0 E, colilA, bauman Copies de transcripts 0 103 104 105 106 108 d'E. coli Copies de transcripts 0 106 108 108 108 0 d'A. bauman L'unique amplicon obtenu est ensuite traité selon l'étape e) de l'exemple 1.
Résultats ~5 La figure 1 montre qu'en ramenant le nombre de copies d'ARNr 16S à un nombre de bactéries, il est donc possible de détecter, par utilisation de la puce à ADN, l'équivalent de 1 E. coli en présence de 104 A baumanü, soit une proportion de 0.01 %.
Exemple 3: Discrimination d'un mélange de 3 espèces bactériennes différentes Des transcripts marqués de 3 espèces bactériennes (Escherichia coli, Salmonella thyphimurium, Acinetobacter baumanil~sont obtenus selon le protocole e) à f.1. Ils sont ensuite purifiés à l'aide du kit Rneasy mini kit (Qiagen, ref. 74104) selon le protocole adapté à la purification de transcripts in vitro. Les transcripts marqués sont dosés (lecture à 260nm sur un spectrophotomètre) de manière à connaître le nombre de cibles (ou copies) introduites dans le mélange d'hybridation. Le nombre total de copies dans un mélange d'hybridation est fixé à 1013 copies.
Les transcripts correspondant aux espèces E. coli et S. thyphimurium sont en même nombre de copies. Ces transcripts ont été
rajoutés par rapports aux transcripts d'A, baumanü de la façon suivante Proportion de E. coli-S. fhyphimurium*lAØ01%0.1% 1% 10% 20% 50%
baumanil Nbre de copies de transcripts5.1085.109 5.10' 5.10" 10'Z 2,5.10'2 E. coli Nbre de copies de transcripts 5.108 5.109 5.10'.5.10"10'2 2,5.10'2 S. thyphimurium _ Nbre de copies de transcripts 1 O" 10'3 1O'3 1O'3 8.10'2 5.10'Z
A. bauman Résultats La figure 2 montre que la détection d'E. coli se fait à des proportions plus faibles (1 %) que celle de S. thyphimurium (10%). Ce résultat 5 montre qu'il est possible de détecter sur la puce 3 espèces bactériennes différentes.
Exemple 4 , détection simultanée d'Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Salmonelle enteritidis a) Préparation des suspensions bactériennes Souches testées Escherichia coli ATCC 11775T
Staphylococcus aureus ATCC 12600T
Salmonelle enteritidis ATCC 13076 Les souches sont cultivées dans un bouillon Trypcase Soja à 37°C.
Lorsque la culture atteint une densité optique de 0.2-0.3 (10$ bactéries/ml), on réalise des dilutions en cascade de 1/10eme, jusqu'à atteindre 100 bactérie/ml.
b) Mélange des bactéries On mélange les 3 espèces bactériennes en utilisant ies suspensions produites dans la partie a), de manière à avoir : 100 Escherichia coli, 100 Staphylococcus aureus et 100 Salmonelle enteritidis.
c) Obtention des ARN totaux 1. Lyse des microorganismes Le volume final sera de 100~t1. On rajoute 1 p1 de tampon TE100X
(Sigma refT-9285), du lysozyme à 100mg/ml (Sigma, Ref.L-6876) pour avoir une concentration finale de 10mg/ml. On complète ou non avec de l'eau (Sigma, ref. W-4502) pour avoir 100~t1. On incube 30 mi+n à 25°C.
2. Purification des acides nuclëiques On utilise ensuite le RNeasy Mini Kit (Qiagen, ref 74104) en appliquant le protocole préconisé par Qiagen pour ies bactéries.
d) RT-PCR
On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250) selon le protocole indiqué Exemple 1, partie c).
e) Vérification de l'amplification Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie d).
f) Analyse sur une biopuce 1. Transcription et marquage des amplicons Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-1.
2. Fragmentation des transcripts marqués Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-2.
3. Hybridation sur la puce Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-3 4. Interprétation des résultats Le base-call sur la séquence d'identification correspondant à
chacun des taxons doit être supérieur à 90%. En dessous la cible n'est pas identifiée.
Résultats Es ce teste Base-call sur la s uence d'identification corres ondante Escherichia coli 100%
Sta h lococcus aureus 100%
Salmonella enteritidis 100%
Conclusion II y a eu detection simultanée des 3 espèces bactériennes par hybridation sur les séquences d'identification correspondantes Exemple 5 . detection simultanée d'Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis et Pseudomonas aeruginosa a) Préparation des suspensions bactériennes Souches testées Escherichia coli ATCC 11775T
Staphylococcus aureus ATCC 12600T
Salmonella enteritidis ATCC 13076 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145T
Les suspensions bactériennes sont préparées selon le protocole indiqué Exemple 4, partie a) b) Mélange des bactéries On mélange les 4 espèces bactëriennes en utilisant les suspensions produites dans la partie a), de manière à avoir : 100 Escherichia coli, 100 Staphylococcus aureus, 100 Salmonella enteritidis et 100 Pseudomonas aeruginosa.
c) Obtention des ARN totaux Selon les protocoles indiqué Exemple 4, partie c) d) RT-PCR
On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250) selon le protocole indiqué Exemple 1, partie c).
e) Vérification de l'amplification Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie d).
f) Analyse sur une biopuce 1. Transcription et marquage des amplicons Selon (e protocole indiqué Exemple 1, partie e)-1.
2. Fragmentation des transcripts marqués Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-2.
3. Hybridation sur la puce Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-3 4. Interprétation des résultats Le base-call sur la séquence d'identification de chacun des taxons doit être supérieur à 90%. En dessous la cible n'est pas identifiée.
l0 Résultat Es ce teste Base-call sur la s uence d'identification cortes ondante Escherichia coli 100%
Sta h lococcus aureus 91,9%
Salmonella enteritidis 100%
Pseudomonas aeru 100%
inosa Conclusion I S II y a eu detection simultanée des 4 espéces bactëriennes par hybridation sur les séquences d'identification correspondantes Exemple 6 . Détection simultanée d'Escherichia coli, 20 Cryptosporïdiurri parvum et du Poliovirus Sabin 3.
a) Préparation des suspensions.
Pour Escherichia soli, les dilutions sont effectuées comme indiqué
Ex 4 , a).
25 Pour Cryptosporidium parvum, des dilutions en cascades sont effectuées à partir d'une suspension d'oocystes titrée à 10~/ml, commercialisée par Waterborne Inc. (St Louis, USA).
Pour le Poliovirus Sabin 3 on utilise une suspension titrée à 109 PFU/ml b) Mélange des microorganismes.
- .On mélange 3000 E. coli, 3000 C. parvum et 3000 cfu du Poliovirus de manière à obtenir 300 p1 de volume final.
c) Préparation des acides nucléiques Les 300p1 sont séparés en 3X100 p1, car l'extraction et la purification des ARN subissent 3 processus séparés.
1. Escherichia coli Préparation des ARN totaux selon le protocole indiqué EX 4, partie c) 2. Cryptosporidium parvum On utilise le kit RNeasy Mini Kit (Qiagen, ref. 74104) selon un protocole modifié. Pour cela, on ajoute aux 100p1 350 p1 de tampon de lyse RLT du kit RNeasy, et 25 p1 de Protéinase K à 19 mg/ml (Roche, ref. 1964372) ce qui ramène à 1 mg/ml. On laisse agir 30 mn à 65°C.
On continue ensuite selon le protocole RNeasy Mini Kit "for bacteria".
3. Pour Poliovirus Sabin 3 On rajoute 40p1 d'eau (Sigma, ref. W-4502) aux 100p1, et on utilise le Qiamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, ref. 52906), selon les instructions du fournisseur.
d) Amplification par RT-PCR
1. Escherichia coli On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250) selon le protocole indiqué Exemple 1, partie c).
2. Cryptosporidium parvurrt On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250).
Pour cela, on ajoute aux 25p1 d'ARN total obtenu à l'étape b) 2, 25p1 de mélange réactionnel de manière à avoir, dans les 50p1 final : le tampon AMV/Tfi 1X, le MgS04 2,5 mM, les dNTP 200 ~rM, 5U de Tfl, 5U d'AMV, 5U de RNAsin (Promega ref. N2111 ), et les primers XIA2F et XIA2R 200pM.
XIA2F 5' GGAAGGGTTGTATTATTAGATAAAG 3' XIA2R-T7 5' taatacgactcactatagggaggaggattaAAGGAGTAAGGAACAACCTCCA 3' Tirés de la publi de Xiao et .al. dans Applied and Environmental Microbiology, 1999 5 (en gras : promoteur T7 de la polymérise T7, qui sera utilisé (ors de la transcription) Pour l'étape de RT, le mélange est mis à incuber 45 mn à 48°C.
Pour l'étape PCR on incube 5 mn à 94°C, puis on réalise 30 cycles composés 10 chacun des 3 étapes suivantes : 94°C 45 sec, 55°C 45 sec, 68°C 1 mn. Une extension finale de 7 mn à 68°C est ensuite réalisée.
3. Poliovirus Sabin 3 On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250).
15 Pour cela, on ajoute aux 25p1 d'ARN total obtenu à l'étape b) 2, 25pl,de mélange réactionnel de manière à avoir, dans les 50p1 final : le tampon AMV/Tfl 1X, le MgS04 2 mM, les dNTP 300 pM, 5U de Tfl, 5U d'AMV, 5U de RNAsin (Promega ref. N2111 ), et les primers spécifiques 200pM.
20 Pour l'étape de RT, le mélange est mis à incuber 45 mn à 48°C.
Pour l'étape PCR on incube 2 mn à 94°C, puis on réalise 40 cycles composés chacun des 3 étapes suivantes : 94°C 15 sec, 55°C 30 sec, 68°C 1 mn. Une extension finale de 7 mn à 68°C est ensuite réalisée.
25 e) Vérification de l'amplification Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie d).
f) Analyse sur une biopuce 30 1. Transcription et marquage des amplicons Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-1.
2. Purification des transcripts marqués.
Les 3 tubes contenant les 20p1 de transcription sont rassemblés la purification se fait en utilisant le RNeasy Mini Kit (Qiagen ref. 74104), protocole 35 pour la purification de transcripts in-vitro. On obtient 20p1 de transcript 3. Fragmentation des transcripts marqués et purifiés.
Selon le protocole indiqué Exempte 1, partie e)-2. -3. Hybridation sur la puce Selon le protocole indiqué Exemple 1, partie e)-3 4. Interprétation des résultats Le base-call sur la séquence signature d'E. coli et C. parvum doit être supérieur à 90%. Pour le Poliovirus 3, en raison d'un polymorphisme de séquence le seuil de détection se situe au dessus de 85%
Résultat Es ce teste Base-cala sur ia s uence d'identification corres ondante Escherichia coli 100%
C tos oridium arvum 100%
Poliovirus Sabin 88,9%
Conclusion II y a eu detection simultanée des 3 paramètres par hybridation sur les séquences d'identification correspondantes Exemple 7: détection simultanée d'un Entérovirus (Coxsackivirus A9) et du virus de l'Hépatite A.
1- Cibles considérées Souche de Coxsackievirus A9 à 7 TCIDSO/pL (extraction des acides nucléiques par utilisation du kit Qiamp Viral RNA de Qiagen -ref. 52904 -selon les indications du fournisseur) Souche vaccinale du virus de l'Hépatite A à 17.5 DICC5o/pL
(extraction des acides nucléiques par utilisation du kit Qiamp Viral RNA de Qiagen -ref. 52904- selon les indications du fournisseur) 2- RT-PCR multiplex On effectue une RT-PCR en utilisant le kit ACCESS (Promega, ref.
A1250) Pour cela, on ajoute 1 pL de chaque souche virale et 48pL de milieu réactionnel de façon de la manière suivante Concentration finaleltube RNasine 2.5 U
Tampon 5X 1X
dNTP 0.3mM
Primers H1 +H2~a~ 0.5pM
Primers Enterovirus~b~0.3NM
MgS04 2 mM
T4 gene 32 protein 2.5Ng Tfl 5U
(a) : publication Robertson et al., Virus Research, 1989, 13, 207-l0 (b) : désignés dans la région 5'NCR
Pour l'étape de rétro-transcription, le mélange est incubé 45 minutes à 48°C. Après une étapes de dénaturation de 2 minutes à
94°C, les ADN complémentaires obtenus sont amplifiés selon les modalités suivantes 45 cycles de [15 secondes à 94°C, 30 secondes à 55°C, 45 secondes à 68°C]
avec une étape d'élongation de 7 minutes.
3- Vérification de l'amplification On dépose 8pL de produits de RT-PCR sur un gel de 1.5%
d'agarose dans de l'EDTA-Tris-Borate. Après une migration de 30 minutes sous 100 V, on visualise des produits d'amplification par coloration du gel par du Bromure d'Ethidium et par illumination U.V.. La visualisation d'une bande vers 500bp (entérovirus) et d'une autre à 249bp (HAV) montrent que l'amplification est effective.
Analyse sur une biopuce Le marquage des produits d'amplification s'effectue selon le brevet W099/65926.
Interprétation des résultats & conclusions Le base-call sur la séquence correspondante à chaque virus doit être supérieur à 95%. En dessous de ce seuil, la cible n'est pas identifiée.
On obtient les résultats suivants Base-Call Coxsackievirus A9 96.7 HAV 96.9 Conclusion II y a eu détection simultanée des 2 souches virale par hybridation sur les séquences d'identification correspondantes.
ZISTE DE SEQUENCES
<110> BIOMERIEUX
<120> PROCEDE DE CONTROLE DE LA QUALITÉ MICROBIOZOGIQUE D'UN
MILIEU AQUEUX ET NÉCESSAIRE APPROPRIE
<130> AQUAGENE B05B3650 <140>
<141>
<150> FR00-08839 <151> 200-07-06 <160> 104 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 39 <212> ADN
<213> Campylobacter soli <400> 1 tttgtgaaat ctaatggctt aaccattaaa ctgcttgag 39 <210> 2 <211> 29 <212> ADN
<213> Campylobacter soli <400> 2 atccgtagag atcaccaaga atacccatt 2g <210> 3 <211> 54 <212> ADN
<213> Campylobacter jejuni <400> 3 gtctcttgtg aaatctaatg, gcttaaccat taaactgctt gggaaactga tagt 54 <210> 4 <211> 24 <212> ADN
<213> Campylobacter jejuni <400> 4 ggaactcaac tgacgctaag gcgc 24 <210> 5 <211> 24 <400> 5 gtggttcagc aagttggatg tgaa 24 <210> 6 <211> 27 <212> ADN
<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 6 aaactactga gctagagtac ggtagag 27 <210> 7 <211> 35 <212> ADN
<213> Pseudomonas fluorescens <400> 7 tgttttgacg ttaccgacag aataagcacc ggcta 35 <210> 8 <211> 27 <212> ADN
<213> Pseudomonas fluorescens <400> 8 tagagtatgg tagagggtgg tggaatt 27 <210> 9 <211> 21 <212> ADN
<213> legionella <400> 9 atactgacac tgaggcacga a 21 <210> 10 <211> 23 <212> ADN
<213> Legionella pneumophila <400> 10 ttactgggog tcaagggtgc gta 23 <210> 11 <211> 23 <212> ADN
<213> Legi< " ' ' ' ' <400> 11 ttaacctaaa <210> 12 <211> 27 <212> ADN
<213> Acinetobacter baumannü
<400> 12 gcgtaggcgg cttattaagt cggatgt 27 <210> 13 <211> 27 <212> ADN
<213> Acinetobacter baumannü
<400> 13 cattcgatac tggtgagcta gagtatg 27 <210> 14 <211> 47 <212> ADN
<213> Escherichia Coli Shigella Species <400> 14 cggggaggaa gggagtaaag ttaatacctt tgctcattga cgttacc 47 <210> 15 <211> 22 <212> ADN
<213> salmonella <400> 15 gaggaaggtg ttgtggttaa ta 22 <210> 16 <211> 32 <212> ADN
<213> Aeromonas caviae <400> 16 cagtagctaa tatctgctgg ctgtgacgtt ac 32 <210> 17 <211> 32 <212> ADN
<213> Aeromonas hydrophila <400> 17 acgcaggcgg ttggataagt tagatgtgaa ag 32 .
<210> 18 <211> 20 <212> ADN
<400> 18 aattgcattt aaaactgtcc 20 <210> 19 <211> 35 <212> ADN
<213> Aeromonas sobria <400> 19 gaaaggttgg cagctaatat ctgtcagctg tgacg 35 <210> 20 <211> 26 <212> ADN
<213> Aeromonas sobria <400> 20 aattgctgtt cagctagagt cttgta 26 <210> 21 <211> 53 <212> ADN
<213> Vibrio cholerae <400> 21 cagtagggag gaaggtggtt aagttaatac cttaatcatt tgacgttacc tac 53 <210> 22 <211> 48 <212> ADN
<213> Vibrio Cholerae <400> 22 tcaacctagg aatcgcattt gaaactgaca agctagagta ctgtagag 48 <210> 23 <211> 37 <212> ADN
<213> Staphylococcus aureus <400> 23 gttattaggg aagaacatat gtgtaagtaa ctgtgca 37 <210> 24 <211> 37 <212> ADN
<213> Staphylococcus epidermidis <400> 24 tattagggaa <211> 23 <212> ADN
<213> streptococcus bovis streptococcus equinus <400> 25 ttggaaactg ttagacttga gtg 23 <210> 26 <211> 43 <212> ADN
<213> Enterococcus faecalis <400> 26 aagaacaagg acgttagtaa ctgaacgtcc cctgacggta tct 43 <210> 27 <211> 27 <212> ADN
<213> Enterococcus faecium, hirae, durans <400> 27 agagtaactg ttcatccctt gacggta 27 <210> 28 <211> 29 <212> ADN
<2I3> CLostridium perfringens <400> 28 agcgtaggcg gatgattaag tgggatgtg 29 <210> 29 <211> 22 <212> ADN
<213> Clostridium perfringens <400> 29 gtgctgcatt ccaaactggt ta 22 <210> 30 <211> 24 <212> ADN
<213> Mycobacterium sp.
<400> 30 gcgtgcgggc gatacgggca gact 24 <210> 31 <211> 25 <212> ADN
<213> Mvcox aaggtccggg ttttctcgga ttgac 25 <210> 32 _ <211> 29 <212> ADN
<213> Mycobacterium kansasü
<400> 32 gtccgggttc tctcggattg acggtaggt 29 <210> 33 <211> 22 <212> ADN
<213> Mycobacterium gordonae <400> 33 gttttctcgg gctgacggta gg 22 <210> 34 <211> 24 <212> ADN
<213> Mycobacterium marinum <400> 34 aggttcgggt tttctcggat tgac 24 <210> 35 <211> 20 <212> ADN
<213> Mycobacterium xenopi <400> 35 ctttcagcct cgacgaagct 20 <210> 36 <211> 22 <212> ADN
<213> Mycobacterium xenopi <400> 36 gtgacggtag gggcagaaga ag 22 <210> 37 <211> 42 <212> ADN
<213> Burkholderia gladioli <400> 37 ccggaaagaa <212> ADN
<213> Burkholderia cepacia <400> 38 _ actgcattgg tgactggcag gctag 2~5 <210> 39 <211> 39 <212> ADN
<213> Stenotrophomonas maltophilia <400> 39 gaggaacatc catggcgaag gcagctacct ggaccaaca 39 <210> 40 <211> 23 <212> ADN
<213> Cryptosporidium <400> 40 cagttatagt ttacttgata atc 23 <210> 41 <211> 20 <212> ADN
<213> Cryptosporidium <400> 41 ttattagata aagaaccaat 20 <210> 42 <211> 27 <212> ADN
<213> Cryptosporidium <400> 42 acctatcagc tttagacggt agggtat 27 <210> 43 <211> 27 <212> ADN
<213> Cryptosporidium <400> 43 tgccttgaat actccagcat ggaataa 27 <210> 44 <211> 37 <212> ADN
<213> Crypt
8 <210> 45 <211> 35 <212> P.DN.
<213> Cryptosporidium parvum <400> 45 tcattataac agttatagtt tacttgataa tcttt 35 <210> 46 <211> 43 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 46 attggaatga gttaagtata aaccccttta caagtatcaa ttg 43 <210> 47 <211> 29 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 47 tagttggatt tctgttaata atttatata 29 <210> 48 <211> 36 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 48 atatttatat aatattaaca taattcatat tactat 36 <210> 49 <211> 41 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 49 tttcgaagga aatgggtaat cttttgaata tgcatcgtga t 41 <210> 50 <211> 382 <212> ADN
<213> Adenovirus 40 /L19443) <400> 50 ctaaagggaa ' ' ' ' " ' ' ' ' "' ctaacctgtg ) cgccgcccct ) aci-rcrtcata )
<213> Cryptosporidium parvum <400> 45 tcattataac agttatagtt tacttgataa tcttt 35 <210> 46 <211> 43 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 46 attggaatga gttaagtata aaccccttta caagtatcaa ttg 43 <210> 47 <211> 29 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 47 tagttggatt tctgttaata atttatata 29 <210> 48 <211> 36 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 48 atatttatat aatattaaca taattcatat tactat 36 <210> 49 <211> 41 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 49 tttcgaagga aatgggtaat cttttgaata tgcatcgtga t 41 <210> 50 <211> 382 <212> ADN
<213> Adenovirus 40 /L19443) <400> 50 ctaaagggaa ' ' ' ' " ' ' ' ' "' ctaacctgtg ) cgccgcccct ) aci-rcrtcata )
9 aatcatatta ggttatatcc ag 382 <210> 51 <211> 382 <212> ADN
<213> Adenovirus 41 bis (M18289) <400> 51 ctgaagggaa ctgccagtgt taagcataat atgatttgtg gcactggtca ctctcagctg 60 ctaacttgcg cagatggaaa ctgtcagact ctaaaagtga ttcatgtggt ttcccatcag 120 cgccgcccct ggcctgtttt tgagcataac atgcttatgc gttgtaccat gcatttgggg 180 gctcgtcgtg gcatgttttc tccatatcag agtaattttt gccatactaa agttttaatg 240 gaaactgatg ctttttcgcg ggtgtggtgg agcggggtgt ttgatttgac catagagctg 300 tataaagtgg tgagatatga tgagttaaag gctcgttgtc gcccctgtga gtgtggagcc 360 aatcacatca ggttatatcc ag 382 <210> 52 <211> 67 <212> ADN
<213> Astrovirus HAstü-1-2 (L23513) <400> 52 agggtacagc ttccttcttt tctgtctctg tttagattat tttaatcacc atttaaaatt 60 ga~ttaa 67 <210> 53 <211> 521 <212> ADN
<213> Poliovirus (X00595) <400> 53 cggtaccttt gtgcgcctgt tttatactcc cctcccgcaa cttagaagca cgaaaccaag 60 ttcaatagaa gggggtacaa accagtacca ctacgaacaa gcacttctgt ttccecggtg 120 acattgcata gactgctcac gcggttgaaa gtgatcgatc cgttacccgc ttgtgtactt 180 cgaaaagcct agtatcgcct tggaatcttc gacgcgttgc gctcagcacc cgaccccggg 240 gtgtggctta ggctgatgag tctggacatt cctcaccggt gacggtggtc taggctgcgt 300 tggcggccta cctatggcta acgccatagg acgttagatg tgaacaaggt gtgaagagcc 360 tattgagcta cataagagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaac cacggaacag 420 gcggtcgcga accagtgact ggcttgtcgt aacgcgcaag tctgtggcgg aaccgactac 480 tttgggtgtc cgtgtttcct gttattttta tcatggctgc t 521 <210> 54 <211> 520 <212> ADN
<213> Coxsackievirus (D00538) <400> 54 aggtaccttt gtacgcctgt tttatatccc ttcccccgta actttagaag cttatcaaaa 60 gttcaatagc aggggtacaa gccagtacct ctacgaacaa gcacttctgt ttccccggtg 120 aaatcatata ' ~ ' ' cgagaagcct p tgtagcttag 0 aaracrr_ctac l1 ttgggtgtcc gtgtttccct ttatattcat actggctgct 520 <210> 55 <211> 525 <212> ADN
<213> Echovirus (X77708) <400> 55 cggtaccttt gtgcgcctgt tttatatacc ctcccctcag taacctagaa gttcatcaca 60 aatgatcaat agttagctca acaaaccagt tgagcataga tcaagcactt ctgttacccc 120 gggctgagta tcaataagct gttgacacgg ctgaaggaga aaacgcccgt tacccgacca 180 gctacttcgg agaacctagt atcaccatag aggttgcgta gcgtttcgct ccgcacaacc 240 ccagtgtaga tcaggtcgat gagtcaccgc gttccccaca ggcgactgtg gcggtggctg 300 cgttggcggc ctgcccatgg ggttacccat gggacgcttc aatactgaca tggtgtgaag 360 agttgactga gctagctggt agtcctccgg cccctgaatg cggctaatcc taactgtgga 420 gcaagtgccc acaacccagt gggtggcttg tcgtaatggg caactctgca gcggaaccga 480 ctactttggg tgacagtgtt tctctttatt cttatattgg ctgct 525 <210> 56 <211> 981 <212> ADN
<213> Rotavirus U36242 <400> 56 atgtatggta ttgaatatac cacaattctg accattttga tatttatcat attattgaat 60 tatatattaa aaactataac taatacgatg gactatatag tttttaaatt tttgctacta 120 atcgctctga tgtcaccatt tgtaaggacg caaaattatg gcatgtattt accaataaca 180 ggatcactag acgctgtata cacaaattca actagtggag aatcatttct aacttcaacg 240 ctatgtttat actatccaac agaagctaaa aatgagattt cagataatga atgggaaaat 300 actctatcag aattattttt aactaaagga tggccggctg gatcagttta ttttaaagac 360 tacaatgata ttactacatt ttctatgaat ccacaactgt attgtgatta taatgtagta 420 ttgatgagat atgataatac atctgaatta gatgcatcgg agttagcaga tcttatattg 480 aacgaatggc tgtgcaatcc tatggatata tcactttact attatcaaca aaatagcgaa 540 tcaaacaaat ggatatcaat cggaacagac tgtacggtaa aagtttgtcc actcaataca 600 caaactctag gaattggatg caaaactacg gacgtggata catttgagat tgttgcgtcg 660 tctgaaaaat tggtaattac tgatgttgta aatggtgtaa accataaaat aaatatttca 720 ataagtacat gtactatacg taattgtaat aaactaggac cacgagaaaa tgttgctata 780 attcaagttg gtggaccgaa cgcactagat atcactgctg atccaacaac agttccacag 840 gttcaaagaa ttatgcgagt aaattggaaa aaatggtggc aagtgtttta tacagtagtt 900 gactatatta accaaattat acaagttatg tccaaacggt caagatcatt agacacagct 960 gctttttatt atagaattta g 981 <210> 57 <211> 981 <212> ADN
<213> Rotavirus M86834 <400> 57 atgtatggta ttgaatatac cacagttcta ttttatttga tatcgttcgt tcttgtgagt 60 tacattttaa aaaccataac gaaaatgatg gactatatta tttatagagt aacttttata 120 attgttgtat +-~,-,.~,~~~,.+ ~t,.~»tn,.n ,.»."++,+~ ~..,...~,.,.,+++
n........+~,_.~ , 00 ggatctatgg p ctatgtctat 0 acattatctc p aatgaatggt tgtgtaatcc aatggatata acgctatatg attatcaaca aactggagaa 540 gcaaataaat ggatatcaat gggatcatct tgtactgtca aagtgtgccc attaaatacg 600 caaactttag gaattggctg ccaaacaacg aatgtagcta cttttgaaat ggtggctgac 660 agtgaaaaac t=agçgatagt tgatgttgtt gataatgtaa atcataaatt agatattaca 720 tctacaacgt gtacaatacg aaattgtaag aaattaggtc caagagaaaa tgtggctata 780 atacaggttg,gtggttctaa tatactagat ataacggctg atcccacgac ttcaccgcaa 840 acggaacgaa tgatgcgtgt taattggaag aaatggtggc aagtatttta cactgtagtt 900 gattatatta atcagatagt acaaatgatg tccaaaagat cgaggtcgct agattcatcc 960 tctttttatt atagagtata g ggl <210> 58 <211> 981 <212> ADN
<213> Rotavirus U26395 <400> 58 atgtatggta ttgaatatac cacaattcta atctttctga tatcaatcat cctactcaac 60 tatatattaa aatcagtgac ccgaataatg gactacatta tatatagatt tttattaatt 120 tctgtagcat tatttgcctt aactaaaget cagaactatg gacttaatat accaataaca 180 ggatcaatgg acactgttta ctccaactct actcaagaag gaatatttct aacatccaca 240 ttatgtttgt attatccaac tgaagcaagt actcaaatca gtgatggtga ttggaaagac 300 tcattatcac aaatgtttct tacaaaaggt tggccaacag gatcagtcta ttttaaagag 360 tactcaaata ttgttgactt ttccgttgat ccacaattat attgtgatta taacttagta 420 ctaatgaagt atgatcaaaa tcttgaacta gatatgtcag aattagctga tttgatattg 480 aatgaatggc tatgtaatec aatggatata acattatatt attatcaaca atcgggagaa 540 tcaaataagt ggatatcaat gggatcatca tgtactgtga aagtgtgtcc actgaataca 600 caaacgttag gaataggttg tcaaacaacg aatgtagact catttgaaac ggttgctgaa 660 aatgaaaaat tagctatagt ggatgtcgtt gatgggatca atcataaaat aaatttgaca 720 actacgacat gtactattCg aaattgtaag aagttaggtc caagagagta tgtagctatc 780 atacaagttg gtggctctaa tatattagac ataacagcgg atccagcgac taatccacaa 840 attgagagaa tgatgagagt gaattggaaa agatggtggc aagtatttta taccatagta 900 gattatatta atcagattgt acaggtgatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgca 960 gctttttatt atagagtata g ggl <210> 59 <211> 398 <212> ADN
<213> Virus de Norwalk (M87661) <400> 59 ataaaagttg gcatgaacac aatagaagat ggccccctca tctatgctga gcatgctaaa 60 tataagaatc attttgatgc agattataca gcatgggact caacacaaaa tagacaaatt 120 atgacagaat ccttctccat tatgtcgcgc cttacggcct caccagaatt ggccgaggtt 180 gtggcccaag atttgctagc accatctgag atggatgtag gtgattatgt catcagggtc 240 aaagaggggc tgccatctgg attcccatgt acttcccagg tgaacagcat'aaatcactgg 300 ataattactc tctgtgcact gtctgaggcc actggtttat cacctgatgt ggtgcaatcc 360 atgtcatatt tctcatttta tggtgatgat gagattgt 3gg <210> 60 <211> 247 <212> ADN
<213> Hepat <400> 60 ccatgaaaga tttgaaagga aaagctaaca gagggaaaat ggatgtttca ggagtacaag 180 cacctgtggg agctatcaca acaattgagg atccagtttt agcaaagaaa gtacctgaga 240 catttcc 247 <210> 61 <211> 54 <212> ADN
<213> Enterococcus faecalïs <400> 61 tctcaatcac tggacgtggt actgttgcta caggacgtgt tgaacgtggt gaag 54 <210> 62 <211> 53 <212> ADN
<213> Escherichia coli <400> 62 tctccatctc cggtcgtggt accgttgtta ccggtcgtgt agaacgcggt atc 53 <210> 63 <211> 21 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 63 tcctacgtct aacttcacgt g 21 <210> 64 <211> 21 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 64 tgtgattggt aaaaagtata g 21 <210> 65 <211> 164 <212> ADN
<213> Giardia lamblia <400> 65 ggaatgtctt gtaggcgccc gCCCCCâCCg cgcgccggat gcgtccctgc cccttgtaca 60 caccgcccgt cgctcctacc gaatgggcgc ggcggcgagc gccccggacg cgcgaagggc 120 cgcgagoccc cgcgcctgga ggaaggagaa gtcgtaacaa ggta 164 <210> 66 <211> 23 <212> ADN
<213> Esche <210> 67 <211> 24 _ <212> ADN
<213> Enterococcus faecalis <400> 67 actgaacgtc ccctgacggt atct 24 <210> 68 <211> 5l <212> ADN
<213> Escherichia coli 0157 :H7 <400> 68 tggatcgcga aaactgtgga attgagcagc gttggtggga aagcgcgtta c 51 <210> 69 <211> 81 <212> ADN
<213> Escherichia coli 0157 :H7 <400> 69 tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattga gcagcgttgg tgggaaagcg 60 cgttacaaga aagccgggca a 81 <210> 70 <211> 30 <212> ADN
<213> Poliovirus type 2 <400> 70 CtCCggccCC tgaatgcggc taatcctaac 30 <210> 71 <211> 20 <212> ADN
' <213> Poliovirus type 2 <400> 71 accagtgact ggcttgtcgt 20 <210> 72 <211> 30 <212> ADN
<213> ~oxsackievirus A21 <400> 72 tccggaccct <212> ADN
<223> Coxsackievïrus A21 <400> 73 ccagtgagta ggttgtcgta 2p <210> 74 <211> 30 <212> ADN
<213> Echovirus 12 <400> 74 agtcctccgg cccctgaatg cggctaatcc 30 <210> 75 <211> 20 <212> ADN
<213> Echovirus 12 <400> 75 acaacccagt gggtggcttg 20 <210> 76 <211> 1061 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 76 ggctttaaaa gagagaattt ccgtttggct agcggttagc tccttttaat gtatggtatt 60 gaatatacca caattctaac ctttctgata tcaatagttt tattgaacta tatattaaaa 120 tcactaacta gtgcgatgga ctttataatt tatagatttc ttttacttat tgttattgca 180 tcaccttttg ttaaaacaca aaattatgga attaatttac cgatcactgg ctccatggat 240 acagcatatg caaattcatc acagcaagaa acatttttga cttcaacgct atgcttatat 300 tatcctacag aagcgtcaac tcaaattgga gatacagaat ggaaggatac tctgtcccaa 360 ttattcttga ctaaagggtg gccaactgga tcagtctatt ttaaagaata caccgatatc 420 gcttcattct caattgatcc gcaactttat tgggattata atgttgtact gatgaagtat 480 gattcaacgt tagagctaga tatgtctgaa ttagctgatt taattctaaa tgaatggtta 540 tgtaacccaa tggatataac attatattat tatcagcaaa cagatgaagc gaataaatgg 600 atatcgatgg gacagtcttg taccataaaa gtatgtccat tgaatacgca gactttagga 660 ataggttgta ttaccacaaa tacagcgaca tttgaagagg tggctacaag tgaaaaatta 720 gtaataaccg atgttgttga tggtgtgaac cataaacttg atgtgactac aaatacctgt 780 acaattagga attgtaagaa gttgggacca agagaaaatg ta,gcgattat acaagtcggt 840 ggctcagatg tgttagatat tacagcggat ccaactactg caccacaaac tgaacgtatg 900 atgcgagtaa attggaagaa atggtggcaa gttttctata cagtagtaga ttatattaat 960 cagattgtgc aagttatgtc caaaagatca cggtcattaa attcagcagc tttttactat 1020 agggtttgat atatcttaga ttagaattgt atgatgtgac c 1061 <210> 77 <211> 30 <212> ADN
<213> Rotai <400> 77 <210> 78 <211> 21 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 78 aatacatctg aattagatgc a 21 <210> 79 <211> 19 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 79 caaacaaatg gatatcaat 19 <210> 80 <211> 45 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 80 ggttcaaaga attatgcgag taaattggaa aaaatggtgg caagt 45 <210> 81 <211> 20 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 81 ctttttatta tagaatttag 20 <210> 82 <211> 30 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 82 tttatagagt aacttttata attgttgtat 30 <210> 83 <211> 21 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 83 tctggagagg agttggatat a 21 <210> 84 <211> 19 <400> 84 caaataaatg gatatcaat 19 <210> 85 <211> 45 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 85 aacggaacga atgatgcgtg ttaattggaa gaaatggtgg caagt 45 <210> 86 <211> 20 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 86 ctttttatta tagagtatag 20 <210> 87 <211> 30 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 87 tatatagatt tttattaatt tctgtagcat 30 <210> 88 <211> 21 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> B8 caaaatcttg aactagatat g 21 <210> B9 <211> 19 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 89 caaataagtg gatatcaat 19 <210> 90 <211> 45 <212> ADN
<213> Rota--------<400> 90 aattaaqaq2 i <210> 91 <211> 20 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 91 ctttttatta tagagtatag 20 <210> 92 <211> 30 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 92 tttatagatt tcttttactt attgttattg 30 <210> 93 <211> 21 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 93 tcaacgttag agctagatat g 21 <210> 94 <211> 19 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 94 cgaataaatg gatatcgat 19 <210> 95 <211> 45 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 95 aactgaacgt atgatgcgag taaattggaa gaaatggtgg caagt 45 <210> 96 <211> 20 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 96 ctttttacta tagggtttga 20 <210> 97 <211> 64 <272> ADN
<400> 97 atggatgttt caggagtaca agcacctgtg ggagctatca caacaattga ggatccagtt 60 ttag 64 <210> 98 <211> 551 <212> ADN
<213> Sapporo Virus <400> 98 tgtgatgctg ccaccacgct tatagccacc gcggctttta aggccgtggc taccaggcta 60 caggtggtga caccaatgac accagttgct gttggcatta acatggactc tgttcagatg 120 caagtgatga atgactcttt aaaggggggt gttctttact gtttggatta ttccaaatgg 180 gattccacac aaaaccctgc agtgacagca gcctccctgg caatattgga gagatttgct 240 gagccccatc caattgtgtc ttgtgccatt gaggctcttt cctcccctgc agagggctat 300 gtcaatgata tcaaatttgt gacacgcggc ggcctaccat ctgggatgcc atttacatct 360 gtcgtcaatt ctatcaacca tatgatatac gtggcggcag ccatcctgca ggcatacgaa 420 agccacaatg tcccatatac tggaaacgtc ttccaagtgg agaccgttca cacgtatggt 480 gatgattgca tgtacagcgt gtgccctgcc actgcatcaa ttttccacac tgtgcttgca 540 aacctaacgt c 551 <210> 99 <2l1> 382 <212> ADN
<213> Southampton Virus <400> 99 tcaaagttgg aatgaattca attgaggatg ggccactgat ctatgcagaa cattcaaaat 60 ataagtacca ctttgatgca gattacacag cttgggactc aactcaaaat aggcaaatca 120 tgacagagtc attttcaatc atgtgtcggc taactgcatc acccgaacta gcttcggtgg 180 tggctcaaga cttgctcgca ccctcagaga tggatgttgg cgactacgtc ataagagtga 240 aggaaggcct cccatctggt ttcccatgca catcacaagt taatagtata aaccattggt 300 taataactct gtgcgccctt tctgaagtga ctggcctgtc gccagacgtt atccaatcca 360 tgtcatattt ctctttctat gg 382 <210> 100 <211> 312 <212> ADN
<213> Desert Shield Virus <400> 100 tttgatgctg attacacggc ctgggattcc actcaaaaca gggaaatcat gatggagtcc 60 tttaacatca tgtgtaaact cactgccaac ccttccctgg ctgcggtagt ggcacaagac 120 ttactttctc cttctgaaat ggatgttgga gattatgtaa tcagtgtgaa agacggcctg 180 ccatcaggct tcccgtgtac ctcacaagtc aacagcataa atcactggat tctcaccctg 240 tgtgcattgt cagaagtcac cgggctctcc ccagatgtgt tgcagtcaca gtcgtatttt 300 tccttctatg gg 312 <210> 101 <211> 362 <212> ADN
<213> Toronto Virus <400> 101 aatgaagatg gtcccataat atttgagaaa cattccagat acagatacca ctatgatgca 60 gattactccc gctgggactc cacgcagcag cgggcagtgc tggcagcagc acttgaaatc 120 atggtgaggt tctctgctga accacagcta gcacaaatag tagctgaaga cctgctagca 180 ccaagtgtgg ttgatgtggg tgacttcaag atcaccatta atgaaggcct accttctggt 240 gtgccttgca cctcacagtg gaactccatt gcccactggt tgcttactct gtgtgccctt 300 tctgaagtta caggactagg ccccgacatc atacaagcta attctatgta ctctttctat 360 gg 362 <210> 102 <211> 364 <212> ADN
<213> Snow Mountain Virus <400> 102 tgaatgagga tggacccata atttttgaaa agcactccag gttctcatac cactatgatg 60 cagattactc acgctgggac tcaacccaac agagggcagt gctagctgca gccttggaaa 120 tcatggtaaa attctcacca gaaccacatt tggcccaaat tgttgcagag gatctcctag 180 cccccagtgt gatggatgta ggtgatttca aaataacaat taatgaggga ctgccctcgg 240 gagtaccctg cacatcacag tggaattcca tcgcccactg gctcctcaca ctctgtgcac 300 tatctgaagt cacaaacctg gctcctgaca tcatacaagc taactccttg ttctctttct 360 atgg 364 <210> 103 <211> 376 <212> ADN
<213> Hawwaü Virus <400> 103 tcagagttgg tatgaacatg aatgaggatg gccccattat ctttgagaaa cactccaggt 60 ataaatatca ttaagattat tctcgatggg actcaacaca gcagagagcc gtactagetg 120 cagccctaga gatcatggtc aaattctccc cagagccaca cttggcccag gtagttgaag 180 aagaccttct ttcccccagt gtgatggatg tgggtgactt caagatatca atcaacgagg 240 gtcttccctc tggggtgccc tgcacctcgc aatggaactc catcacccac tggctcctca 300 ctctttgtgc actctctgaa gtcacggacc tgtcccctga catcattcaa gccaattcct 360 tattctcttt ctatgg 376 <210> 104 <211> 382 <212> ADN
<213> Bristol Virus <400> 104 tcagagttgg catgaatatg aatgaggatg gccccatcat cttcgagaga cactccagat 60 acaagtatca ctatgatgct gactactctc ggtgggattc aacacaacaa agggccgtgt 120 tagcagcagc cctagaaatc atggttaaat tctccccaga accgcatttg gcccagatag 180 ttgcagaaga ccttctatct cctagtgtga tggatgtggg tgacttcaaa atatcaatca 240 atgagggcct tccctctggt gtgccctgca cctctcaatg gaattccatc gcccactggc 300 tcctcactct ctgtgcactc tctgaagtta caaacctgtc ccctgacatc atacaggcta 360 attCCCtCtt ttCCttCtat gg 382
<213> Adenovirus 41 bis (M18289) <400> 51 ctgaagggaa ctgccagtgt taagcataat atgatttgtg gcactggtca ctctcagctg 60 ctaacttgcg cagatggaaa ctgtcagact ctaaaagtga ttcatgtggt ttcccatcag 120 cgccgcccct ggcctgtttt tgagcataac atgcttatgc gttgtaccat gcatttgggg 180 gctcgtcgtg gcatgttttc tccatatcag agtaattttt gccatactaa agttttaatg 240 gaaactgatg ctttttcgcg ggtgtggtgg agcggggtgt ttgatttgac catagagctg 300 tataaagtgg tgagatatga tgagttaaag gctcgttgtc gcccctgtga gtgtggagcc 360 aatcacatca ggttatatcc ag 382 <210> 52 <211> 67 <212> ADN
<213> Astrovirus HAstü-1-2 (L23513) <400> 52 agggtacagc ttccttcttt tctgtctctg tttagattat tttaatcacc atttaaaatt 60 ga~ttaa 67 <210> 53 <211> 521 <212> ADN
<213> Poliovirus (X00595) <400> 53 cggtaccttt gtgcgcctgt tttatactcc cctcccgcaa cttagaagca cgaaaccaag 60 ttcaatagaa gggggtacaa accagtacca ctacgaacaa gcacttctgt ttccecggtg 120 acattgcata gactgctcac gcggttgaaa gtgatcgatc cgttacccgc ttgtgtactt 180 cgaaaagcct agtatcgcct tggaatcttc gacgcgttgc gctcagcacc cgaccccggg 240 gtgtggctta ggctgatgag tctggacatt cctcaccggt gacggtggtc taggctgcgt 300 tggcggccta cctatggcta acgccatagg acgttagatg tgaacaaggt gtgaagagcc 360 tattgagcta cataagagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaac cacggaacag 420 gcggtcgcga accagtgact ggcttgtcgt aacgcgcaag tctgtggcgg aaccgactac 480 tttgggtgtc cgtgtttcct gttattttta tcatggctgc t 521 <210> 54 <211> 520 <212> ADN
<213> Coxsackievirus (D00538) <400> 54 aggtaccttt gtacgcctgt tttatatccc ttcccccgta actttagaag cttatcaaaa 60 gttcaatagc aggggtacaa gccagtacct ctacgaacaa gcacttctgt ttccccggtg 120 aaatcatata ' ~ ' ' cgagaagcct p tgtagcttag 0 aaracrr_ctac l1 ttgggtgtcc gtgtttccct ttatattcat actggctgct 520 <210> 55 <211> 525 <212> ADN
<213> Echovirus (X77708) <400> 55 cggtaccttt gtgcgcctgt tttatatacc ctcccctcag taacctagaa gttcatcaca 60 aatgatcaat agttagctca acaaaccagt tgagcataga tcaagcactt ctgttacccc 120 gggctgagta tcaataagct gttgacacgg ctgaaggaga aaacgcccgt tacccgacca 180 gctacttcgg agaacctagt atcaccatag aggttgcgta gcgtttcgct ccgcacaacc 240 ccagtgtaga tcaggtcgat gagtcaccgc gttccccaca ggcgactgtg gcggtggctg 300 cgttggcggc ctgcccatgg ggttacccat gggacgcttc aatactgaca tggtgtgaag 360 agttgactga gctagctggt agtcctccgg cccctgaatg cggctaatcc taactgtgga 420 gcaagtgccc acaacccagt gggtggcttg tcgtaatggg caactctgca gcggaaccga 480 ctactttggg tgacagtgtt tctctttatt cttatattgg ctgct 525 <210> 56 <211> 981 <212> ADN
<213> Rotavirus U36242 <400> 56 atgtatggta ttgaatatac cacaattctg accattttga tatttatcat attattgaat 60 tatatattaa aaactataac taatacgatg gactatatag tttttaaatt tttgctacta 120 atcgctctga tgtcaccatt tgtaaggacg caaaattatg gcatgtattt accaataaca 180 ggatcactag acgctgtata cacaaattca actagtggag aatcatttct aacttcaacg 240 ctatgtttat actatccaac agaagctaaa aatgagattt cagataatga atgggaaaat 300 actctatcag aattattttt aactaaagga tggccggctg gatcagttta ttttaaagac 360 tacaatgata ttactacatt ttctatgaat ccacaactgt attgtgatta taatgtagta 420 ttgatgagat atgataatac atctgaatta gatgcatcgg agttagcaga tcttatattg 480 aacgaatggc tgtgcaatcc tatggatata tcactttact attatcaaca aaatagcgaa 540 tcaaacaaat ggatatcaat cggaacagac tgtacggtaa aagtttgtcc actcaataca 600 caaactctag gaattggatg caaaactacg gacgtggata catttgagat tgttgcgtcg 660 tctgaaaaat tggtaattac tgatgttgta aatggtgtaa accataaaat aaatatttca 720 ataagtacat gtactatacg taattgtaat aaactaggac cacgagaaaa tgttgctata 780 attcaagttg gtggaccgaa cgcactagat atcactgctg atccaacaac agttccacag 840 gttcaaagaa ttatgcgagt aaattggaaa aaatggtggc aagtgtttta tacagtagtt 900 gactatatta accaaattat acaagttatg tccaaacggt caagatcatt agacacagct 960 gctttttatt atagaattta g 981 <210> 57 <211> 981 <212> ADN
<213> Rotavirus M86834 <400> 57 atgtatggta ttgaatatac cacagttcta ttttatttga tatcgttcgt tcttgtgagt 60 tacattttaa aaaccataac gaaaatgatg gactatatta tttatagagt aacttttata 120 attgttgtat +-~,-,.~,~~~,.+ ~t,.~»tn,.n ,.»."++,+~ ~..,...~,.,.,+++
n........+~,_.~ , 00 ggatctatgg p ctatgtctat 0 acattatctc p aatgaatggt tgtgtaatcc aatggatata acgctatatg attatcaaca aactggagaa 540 gcaaataaat ggatatcaat gggatcatct tgtactgtca aagtgtgccc attaaatacg 600 caaactttag gaattggctg ccaaacaacg aatgtagcta cttttgaaat ggtggctgac 660 agtgaaaaac t=agçgatagt tgatgttgtt gataatgtaa atcataaatt agatattaca 720 tctacaacgt gtacaatacg aaattgtaag aaattaggtc caagagaaaa tgtggctata 780 atacaggttg,gtggttctaa tatactagat ataacggctg atcccacgac ttcaccgcaa 840 acggaacgaa tgatgcgtgt taattggaag aaatggtggc aagtatttta cactgtagtt 900 gattatatta atcagatagt acaaatgatg tccaaaagat cgaggtcgct agattcatcc 960 tctttttatt atagagtata g ggl <210> 58 <211> 981 <212> ADN
<213> Rotavirus U26395 <400> 58 atgtatggta ttgaatatac cacaattcta atctttctga tatcaatcat cctactcaac 60 tatatattaa aatcagtgac ccgaataatg gactacatta tatatagatt tttattaatt 120 tctgtagcat tatttgcctt aactaaaget cagaactatg gacttaatat accaataaca 180 ggatcaatgg acactgttta ctccaactct actcaagaag gaatatttct aacatccaca 240 ttatgtttgt attatccaac tgaagcaagt actcaaatca gtgatggtga ttggaaagac 300 tcattatcac aaatgtttct tacaaaaggt tggccaacag gatcagtcta ttttaaagag 360 tactcaaata ttgttgactt ttccgttgat ccacaattat attgtgatta taacttagta 420 ctaatgaagt atgatcaaaa tcttgaacta gatatgtcag aattagctga tttgatattg 480 aatgaatggc tatgtaatec aatggatata acattatatt attatcaaca atcgggagaa 540 tcaaataagt ggatatcaat gggatcatca tgtactgtga aagtgtgtcc actgaataca 600 caaacgttag gaataggttg tcaaacaacg aatgtagact catttgaaac ggttgctgaa 660 aatgaaaaat tagctatagt ggatgtcgtt gatgggatca atcataaaat aaatttgaca 720 actacgacat gtactattCg aaattgtaag aagttaggtc caagagagta tgtagctatc 780 atacaagttg gtggctctaa tatattagac ataacagcgg atccagcgac taatccacaa 840 attgagagaa tgatgagagt gaattggaaa agatggtggc aagtatttta taccatagta 900 gattatatta atcagattgt acaggtgatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgca 960 gctttttatt atagagtata g ggl <210> 59 <211> 398 <212> ADN
<213> Virus de Norwalk (M87661) <400> 59 ataaaagttg gcatgaacac aatagaagat ggccccctca tctatgctga gcatgctaaa 60 tataagaatc attttgatgc agattataca gcatgggact caacacaaaa tagacaaatt 120 atgacagaat ccttctccat tatgtcgcgc cttacggcct caccagaatt ggccgaggtt 180 gtggcccaag atttgctagc accatctgag atggatgtag gtgattatgt catcagggtc 240 aaagaggggc tgccatctgg attcccatgt acttcccagg tgaacagcat'aaatcactgg 300 ataattactc tctgtgcact gtctgaggcc actggtttat cacctgatgt ggtgcaatcc 360 atgtcatatt tctcatttta tggtgatgat gagattgt 3gg <210> 60 <211> 247 <212> ADN
<213> Hepat <400> 60 ccatgaaaga tttgaaagga aaagctaaca gagggaaaat ggatgtttca ggagtacaag 180 cacctgtggg agctatcaca acaattgagg atccagtttt agcaaagaaa gtacctgaga 240 catttcc 247 <210> 61 <211> 54 <212> ADN
<213> Enterococcus faecalïs <400> 61 tctcaatcac tggacgtggt actgttgcta caggacgtgt tgaacgtggt gaag 54 <210> 62 <211> 53 <212> ADN
<213> Escherichia coli <400> 62 tctccatctc cggtcgtggt accgttgtta ccggtcgtgt agaacgcggt atc 53 <210> 63 <211> 21 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 63 tcctacgtct aacttcacgt g 21 <210> 64 <211> 21 <212> ADN
<213> Cryptosporidium parvum <400> 64 tgtgattggt aaaaagtata g 21 <210> 65 <211> 164 <212> ADN
<213> Giardia lamblia <400> 65 ggaatgtctt gtaggcgccc gCCCCCâCCg cgcgccggat gcgtccctgc cccttgtaca 60 caccgcccgt cgctcctacc gaatgggcgc ggcggcgagc gccccggacg cgcgaagggc 120 cgcgagoccc cgcgcctgga ggaaggagaa gtcgtaacaa ggta 164 <210> 66 <211> 23 <212> ADN
<213> Esche <210> 67 <211> 24 _ <212> ADN
<213> Enterococcus faecalis <400> 67 actgaacgtc ccctgacggt atct 24 <210> 68 <211> 5l <212> ADN
<213> Escherichia coli 0157 :H7 <400> 68 tggatcgcga aaactgtgga attgagcagc gttggtggga aagcgcgtta c 51 <210> 69 <211> 81 <212> ADN
<213> Escherichia coli 0157 :H7 <400> 69 tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattga gcagcgttgg tgggaaagcg 60 cgttacaaga aagccgggca a 81 <210> 70 <211> 30 <212> ADN
<213> Poliovirus type 2 <400> 70 CtCCggccCC tgaatgcggc taatcctaac 30 <210> 71 <211> 20 <212> ADN
' <213> Poliovirus type 2 <400> 71 accagtgact ggcttgtcgt 20 <210> 72 <211> 30 <212> ADN
<213> ~oxsackievirus A21 <400> 72 tccggaccct <212> ADN
<223> Coxsackievïrus A21 <400> 73 ccagtgagta ggttgtcgta 2p <210> 74 <211> 30 <212> ADN
<213> Echovirus 12 <400> 74 agtcctccgg cccctgaatg cggctaatcc 30 <210> 75 <211> 20 <212> ADN
<213> Echovirus 12 <400> 75 acaacccagt gggtggcttg 20 <210> 76 <211> 1061 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 76 ggctttaaaa gagagaattt ccgtttggct agcggttagc tccttttaat gtatggtatt 60 gaatatacca caattctaac ctttctgata tcaatagttt tattgaacta tatattaaaa 120 tcactaacta gtgcgatgga ctttataatt tatagatttc ttttacttat tgttattgca 180 tcaccttttg ttaaaacaca aaattatgga attaatttac cgatcactgg ctccatggat 240 acagcatatg caaattcatc acagcaagaa acatttttga cttcaacgct atgcttatat 300 tatcctacag aagcgtcaac tcaaattgga gatacagaat ggaaggatac tctgtcccaa 360 ttattcttga ctaaagggtg gccaactgga tcagtctatt ttaaagaata caccgatatc 420 gcttcattct caattgatcc gcaactttat tgggattata atgttgtact gatgaagtat 480 gattcaacgt tagagctaga tatgtctgaa ttagctgatt taattctaaa tgaatggtta 540 tgtaacccaa tggatataac attatattat tatcagcaaa cagatgaagc gaataaatgg 600 atatcgatgg gacagtcttg taccataaaa gtatgtccat tgaatacgca gactttagga 660 ataggttgta ttaccacaaa tacagcgaca tttgaagagg tggctacaag tgaaaaatta 720 gtaataaccg atgttgttga tggtgtgaac cataaacttg atgtgactac aaatacctgt 780 acaattagga attgtaagaa gttgggacca agagaaaatg ta,gcgattat acaagtcggt 840 ggctcagatg tgttagatat tacagcggat ccaactactg caccacaaac tgaacgtatg 900 atgcgagtaa attggaagaa atggtggcaa gttttctata cagtagtaga ttatattaat 960 cagattgtgc aagttatgtc caaaagatca cggtcattaa attcagcagc tttttactat 1020 agggtttgat atatcttaga ttagaattgt atgatgtgac c 1061 <210> 77 <211> 30 <212> ADN
<213> Rotai <400> 77 <210> 78 <211> 21 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 78 aatacatctg aattagatgc a 21 <210> 79 <211> 19 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 79 caaacaaatg gatatcaat 19 <210> 80 <211> 45 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 80 ggttcaaaga attatgcgag taaattggaa aaaatggtgg caagt 45 <210> 81 <211> 20 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 81 ctttttatta tagaatttag 20 <210> 82 <211> 30 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 82 tttatagagt aacttttata attgttgtat 30 <210> 83 <211> 21 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 83 tctggagagg agttggatat a 21 <210> 84 <211> 19 <400> 84 caaataaatg gatatcaat 19 <210> 85 <211> 45 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 85 aacggaacga atgatgcgtg ttaattggaa gaaatggtgg caagt 45 <210> 86 <211> 20 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 86 ctttttatta tagagtatag 20 <210> 87 <211> 30 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 87 tatatagatt tttattaatt tctgtagcat 30 <210> 88 <211> 21 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> B8 caaaatcttg aactagatat g 21 <210> B9 <211> 19 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 89 caaataagtg gatatcaat 19 <210> 90 <211> 45 <212> ADN
<213> Rota--------<400> 90 aattaaqaq2 i <210> 91 <211> 20 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 91 ctttttatta tagagtatag 20 <210> 92 <211> 30 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 92 tttatagatt tcttttactt attgttattg 30 <210> 93 <211> 21 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 93 tcaacgttag agctagatat g 21 <210> 94 <211> 19 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 94 cgaataaatg gatatcgat 19 <210> 95 <211> 45 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 95 aactgaacgt atgatgcgag taaattggaa gaaatggtgg caagt 45 <210> 96 <211> 20 <212> ADN
<213> Rotavirus <400> 96 ctttttacta tagggtttga 20 <210> 97 <211> 64 <272> ADN
<400> 97 atggatgttt caggagtaca agcacctgtg ggagctatca caacaattga ggatccagtt 60 ttag 64 <210> 98 <211> 551 <212> ADN
<213> Sapporo Virus <400> 98 tgtgatgctg ccaccacgct tatagccacc gcggctttta aggccgtggc taccaggcta 60 caggtggtga caccaatgac accagttgct gttggcatta acatggactc tgttcagatg 120 caagtgatga atgactcttt aaaggggggt gttctttact gtttggatta ttccaaatgg 180 gattccacac aaaaccctgc agtgacagca gcctccctgg caatattgga gagatttgct 240 gagccccatc caattgtgtc ttgtgccatt gaggctcttt cctcccctgc agagggctat 300 gtcaatgata tcaaatttgt gacacgcggc ggcctaccat ctgggatgcc atttacatct 360 gtcgtcaatt ctatcaacca tatgatatac gtggcggcag ccatcctgca ggcatacgaa 420 agccacaatg tcccatatac tggaaacgtc ttccaagtgg agaccgttca cacgtatggt 480 gatgattgca tgtacagcgt gtgccctgcc actgcatcaa ttttccacac tgtgcttgca 540 aacctaacgt c 551 <210> 99 <2l1> 382 <212> ADN
<213> Southampton Virus <400> 99 tcaaagttgg aatgaattca attgaggatg ggccactgat ctatgcagaa cattcaaaat 60 ataagtacca ctttgatgca gattacacag cttgggactc aactcaaaat aggcaaatca 120 tgacagagtc attttcaatc atgtgtcggc taactgcatc acccgaacta gcttcggtgg 180 tggctcaaga cttgctcgca ccctcagaga tggatgttgg cgactacgtc ataagagtga 240 aggaaggcct cccatctggt ttcccatgca catcacaagt taatagtata aaccattggt 300 taataactct gtgcgccctt tctgaagtga ctggcctgtc gccagacgtt atccaatcca 360 tgtcatattt ctctttctat gg 382 <210> 100 <211> 312 <212> ADN
<213> Desert Shield Virus <400> 100 tttgatgctg attacacggc ctgggattcc actcaaaaca gggaaatcat gatggagtcc 60 tttaacatca tgtgtaaact cactgccaac ccttccctgg ctgcggtagt ggcacaagac 120 ttactttctc cttctgaaat ggatgttgga gattatgtaa tcagtgtgaa agacggcctg 180 ccatcaggct tcccgtgtac ctcacaagtc aacagcataa atcactggat tctcaccctg 240 tgtgcattgt cagaagtcac cgggctctcc ccagatgtgt tgcagtcaca gtcgtatttt 300 tccttctatg gg 312 <210> 101 <211> 362 <212> ADN
<213> Toronto Virus <400> 101 aatgaagatg gtcccataat atttgagaaa cattccagat acagatacca ctatgatgca 60 gattactccc gctgggactc cacgcagcag cgggcagtgc tggcagcagc acttgaaatc 120 atggtgaggt tctctgctga accacagcta gcacaaatag tagctgaaga cctgctagca 180 ccaagtgtgg ttgatgtggg tgacttcaag atcaccatta atgaaggcct accttctggt 240 gtgccttgca cctcacagtg gaactccatt gcccactggt tgcttactct gtgtgccctt 300 tctgaagtta caggactagg ccccgacatc atacaagcta attctatgta ctctttctat 360 gg 362 <210> 102 <211> 364 <212> ADN
<213> Snow Mountain Virus <400> 102 tgaatgagga tggacccata atttttgaaa agcactccag gttctcatac cactatgatg 60 cagattactc acgctgggac tcaacccaac agagggcagt gctagctgca gccttggaaa 120 tcatggtaaa attctcacca gaaccacatt tggcccaaat tgttgcagag gatctcctag 180 cccccagtgt gatggatgta ggtgatttca aaataacaat taatgaggga ctgccctcgg 240 gagtaccctg cacatcacag tggaattcca tcgcccactg gctcctcaca ctctgtgcac 300 tatctgaagt cacaaacctg gctcctgaca tcatacaagc taactccttg ttctctttct 360 atgg 364 <210> 103 <211> 376 <212> ADN
<213> Hawwaü Virus <400> 103 tcagagttgg tatgaacatg aatgaggatg gccccattat ctttgagaaa cactccaggt 60 ataaatatca ttaagattat tctcgatggg actcaacaca gcagagagcc gtactagetg 120 cagccctaga gatcatggtc aaattctccc cagagccaca cttggcccag gtagttgaag 180 aagaccttct ttcccccagt gtgatggatg tgggtgactt caagatatca atcaacgagg 240 gtcttccctc tggggtgccc tgcacctcgc aatggaactc catcacccac tggctcctca 300 ctctttgtgc actctctgaa gtcacggacc tgtcccctga catcattcaa gccaattcct 360 tattctcttt ctatgg 376 <210> 104 <211> 382 <212> ADN
<213> Bristol Virus <400> 104 tcagagttgg catgaatatg aatgaggatg gccccatcat cttcgagaga cactccagat 60 acaagtatca ctatgatgct gactactctc ggtgggattc aacacaacaa agggccgtgt 120 tagcagcagc cctagaaatc atggttaaat tctccccaga accgcatttg gcccagatag 180 ttgcagaaga ccttctatct cctagtgtga tggatgtggg tgacttcaaa atatcaatca 240 atgagggcct tccctctggt gtgccctgca cctctcaatg gaattccatc gcccactggc 300 tcctcactct ctgtgcactc tctgaagtta caaacctgtc ccctgacatc atacaggcta 360 attCCCtCtt ttCCttCtat gg 382
Claims
REVENDICATIONS
1/ Procédé de contrôle de la qualité microbiologique d'un milieu aqueux environnemental, susceptible de comporter différents micro-organismes, caractérisé en ce que:
- on choisit un ensemble de référence, constitué d'au moins trois micro-organismes, représentatifs, ensemble ou séparément, d'un niveau de qualité
microbiologique, - on dispose d'un nécessaire de détermination microbiologique, constitué d'au mains trois sondes d'identification respectivement spécifiques desdits trois microorganismes, - après traitement du milieu à analyser, on met lesdits microorganismes, ou toute fraction obtenue à partir de ces derniers, en contact avec ledit nécessaire de détermination, moyennant quoi on multi-détermine lesdits microorganismes, cette détermination étant représentative du niveau de qualité
microbiologique du milieu.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins une sonde d'identification spécifique à une bactérie, au moins une sonde d'identification spécifique à un parasite et au moins une sonde d'identification spécifique à
un virus.
3/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins quatre sondes d'identification spécifiques à au moins quatre bactéries différentes.
4/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins cinq sondes d'identification spécifiques à au moins cinq virus différents.
5/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins deux sondes d'identification spécifiques à au moins deux parasites.
6/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins une sonde d'identification spécifique à une bactérie et au moins une sonde d'identification spécifique à au moins un parasite.
7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes:
Escherichia coli, genre Salmonella, Staphylococcus aureus.
8/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2,3 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes:
Escherichia coli, genre Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens.
9/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2,3 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes:
Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0157:H7, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Staphylococcus epidermitis, Staphylococcus aureus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Acinetobacter baumanii, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, le genre Mycobactéries, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, le genre Legionella, Legionella pneumophila, le genre Salmonella.
10/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3, 5 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, genre Salmonella, Staphylococcus aureus, Genre Cryptosporidium.
11/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3, 5 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : genre Salmonella, Staphylococcus aureus, Gardia lamblia, Cryptosporidium parvum.
12/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3, 5 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Escherichia coli sérotype 0157 :H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia.
13/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants:
Escherichia coJi, Escherichia coli sérotype 0157 :H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus eguinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Nonwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus.
14/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants:
Escherichia coli, Escherichia coli sérotype 0157 :H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobàcter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Genre Mycobactéries, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacferium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacferium gordonae, Acinetobacter baumanii, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Astrovirus.
15/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants:
Escherichia coli, Enterovirus, Genre Cryptosporidium, 16/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 4, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants:
les Adenovirus, Adeno 40, Adeno 41bis;
les Astrovirus, HAstV-1-2;
les Enterovirus, Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, les Rotavirus, les Calicivirus : Virus de Norwalk, Virus de Sapporo et Virus de l'Hépatite A.
17/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 5, 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les parasites suivants:
Le genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia et les Microsporidies.
18/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2,3 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes:
Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE O157:H7, genre Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus.
19/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2 et 4, caractérisé en ce pue lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants:
Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi les Calicivirus et les Rotavirus.
20/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2 et 4, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants:
Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi le vrius de Norwalk et les Rotavirus.
21/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2 et 5, 6 caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les parasites suivants:
genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia.
22/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2,3 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi:
Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0157:H7, genre Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi les Calicivirus et les Rotavirus, genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia.
23/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2,3 et 6, caractérisé en ce pue lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi:
Escherichia coli, Escherichia soli SEROTYPE 0157 :H7, genre Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi le vrius de Norwalk et les Rotavirus, genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia.
24/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sondes d'identification ont une séquence choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos :1-104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
25/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO :1 à SEQ ID NO :39, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ
ID NO:40 à SEQ ID NO:49 , SEQ ID NO :63 à SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; et au moins une séquence choisie parmi entre SEQ ID NO:50 à SEQ ID NO:60, SEQ ID NO 70 SEQ ID NO 104 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
26/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins quatre sondes d'identification choisies parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
27/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins cinq sondes d'identification choisies parmi SEQ ID NO:50 à SEQ ID NO:60, SEQ ID NO 70 SEQ ID NO 104 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
28/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins deux sondes d'identification choisies parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:49 et SEQ ID NO:63 à
SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
29/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence, et au moins une séquence comprise SEQ ID NO:40 à
SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:63 à SEQ ID NO:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
30/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO 66, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
31/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
32/ Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
33/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:46 à SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64 et SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
34/ Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO:53 à
SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:70-à SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:40 à SEQ ID
NO:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
35/ Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 à
SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:53 à SEQ ID
NO:55, SEQ ID NO:61 à SEQ ID NO:75, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
36/ Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:9 à SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14 à SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 à SEQ ID
NO:29, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53 à SEQ ID NO:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
37/ Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisies parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9 à SEQ ID NO:55 à
SEQ ID NO:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont fa séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
38/ Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisies parmi SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO 62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO
69, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ ID 23.
39/ Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisies parmi SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO
75.
40/ Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisies parmi SEQ ID NO 98 à 104, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 97, SEQ ID
NO 56 à SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 76 à SEQ ID NO 96.
41/ Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisies parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 65 42/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, préalablement à la mise en contact avec le nécessaire de détermination, on effectue au moins une étape de lyse.
43/ Procédé selon la revendication 42, caractérisé en ce que, postérieurement à l'étape de lyse, on effectue une étape d'amplification.
44/ Procédé de contrôle selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par la mise en avant traitement du milieu à analyser, d'une étape d'enrichissement en microorganismes du dit échantillon.
45/ Procédé de contrôle selon la revendication 44, caractérisé en ce que l'étape d'enrichissement est effectuée par filtration.
46/ Procédé de contrôle d'un échantillon liquide selon la revendication 45 , caractérisé en ce que fa filtration est conduite en utilisant un moyen de filtration à fibres creuses, utilisé en mode frontal.
47/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID
NO:39, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:49 , SEQ ID NO :63 à
SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; et au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO:50 à SEQ ID
NO:60, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 104 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
48/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins quatre sondes d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID
NO:39, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
49/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins cinq sondes d'identification choisies parmi SEQ ID NO:50 à SEQ ID
NO:60, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 104 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
50/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID
NO:49, SEQ ID NO :63 à SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
51/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID
NO:39, SEQ ID NO :61, SEQ ID NO :62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence, et au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:49, SEQ ID NO :63 à SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
52/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:62, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO 68 SEQ ID NO 69, SEQ ID NO:15, SEQ
ID NO:23, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
54/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:62, SEQ ID NO 66,SEQ ID 68, NO SEQ ID 69, NO SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO:23, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
55/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:62, SEQ ID NO 66, SEQ ID 68, NO SEQ ID 69, SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO:23, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
56/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:62, SEQ ID NO 66 ,SEQ ID 68, NO SEQ ID 69, SEQ ID NO:53 à SEQ ID
NO:55, SEQ ID NO 70 à SEQ ID 75, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
57/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 à SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:40 à SEQ
ID NO:49, SEQ ID NO:53 à SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:61 à SEQ ID NO:75, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
58/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID
NO:4, SEQ ID NO:9 à SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14 à SEQ ID NO:20, SEQ
ID NO:23, SEQ ID NO:25 à SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:53 à SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 à SEQ ID NO:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monoméres contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
59/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID
NO:6, SEQ ID NO:9 à SEQ ID NO:55 à SEQ ID NO:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
60/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO
62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID
NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ ID 23 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
61/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO 59, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 96, SEQ ID NO :98, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
62/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO 98 à 104, SEQ
ID NO 59, SEQ ID NO 56 à SEQ ID NO 58, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO :97, SEQ ID NO 7-0 à SEQ ID NO 96, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
63/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO
45, SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
64/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO
62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID
NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ ID 23, SEQ ID NO
59, SEQ ID NO :60 SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 96, SEQ ID NO :98 à SEQ ID NO :104, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID
NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
65/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO
62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID
NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ ID 23, SEQ ID NO
98 à 104, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 56 à SEQ ID NO 58, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO :97, SEQ ID NO :70 à SEQ ID NO :75, SEQ ID NO 76 à SEQ ID
NO 96, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
66/ Nécessaire de détermination microbiologique selon l'une quelconque des revendications 47 à 64, caractérisé en ce que les sondes d'identifications ou leurs fragments sont fixés sur un support solide 67/ Nécessaire de détermination microbiologique selon l'une quelconque des revendications 47 à 65, caractérisé en ce que les sondes d'identification ou leurs fragments sont fixés sur un support solide et constituent une biopuce.
68/ Procédé de production et/ou désinfection d'un liquide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'analyse mettant en oeuvre un nécessaire de détermination microbiologique selon l'une quelconque des revendications de 47 à 67 et générant un algorithme d'interprétation des données permettant l'asservissement dudit procédé de production et/ou désinfection auxdites données générées par le nécessaire de détermination microbiologique.
1/ Procédé de contrôle de la qualité microbiologique d'un milieu aqueux environnemental, susceptible de comporter différents micro-organismes, caractérisé en ce que:
- on choisit un ensemble de référence, constitué d'au moins trois micro-organismes, représentatifs, ensemble ou séparément, d'un niveau de qualité
microbiologique, - on dispose d'un nécessaire de détermination microbiologique, constitué d'au mains trois sondes d'identification respectivement spécifiques desdits trois microorganismes, - après traitement du milieu à analyser, on met lesdits microorganismes, ou toute fraction obtenue à partir de ces derniers, en contact avec ledit nécessaire de détermination, moyennant quoi on multi-détermine lesdits microorganismes, cette détermination étant représentative du niveau de qualité
microbiologique du milieu.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins une sonde d'identification spécifique à une bactérie, au moins une sonde d'identification spécifique à un parasite et au moins une sonde d'identification spécifique à
un virus.
3/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins quatre sondes d'identification spécifiques à au moins quatre bactéries différentes.
4/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins cinq sondes d'identification spécifiques à au moins cinq virus différents.
5/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins deux sondes d'identification spécifiques à au moins deux parasites.
6/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le nécessaire de détermination microbiologique comprend au moins une sonde d'identification spécifique à une bactérie et au moins une sonde d'identification spécifique à au moins un parasite.
7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes:
Escherichia coli, genre Salmonella, Staphylococcus aureus.
8/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2,3 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes:
Escherichia coli, genre Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens.
9/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2,3 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes:
Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0157:H7, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Staphylococcus epidermitis, Staphylococcus aureus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Acinetobacter baumanii, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, le genre Mycobactéries, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium gordonae, le genre Legionella, Legionella pneumophila, le genre Salmonella.
10/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3, 5 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, genre Salmonella, Staphylococcus aureus, Genre Cryptosporidium.
11/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3, 5 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : genre Salmonella, Staphylococcus aureus, Gardia lamblia, Cryptosporidium parvum.
12/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 3, 5 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants : Escherichia coli, Escherichia coli sérotype 0157 :H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia.
13/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants:
Escherichia coJi, Escherichia coli sérotype 0157 :H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus eguinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Nonwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus.
14/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants:
Escherichia coli, Escherichia coli sérotype 0157 :H7, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus hirae, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Clostridium perfringens, Genre Salmonelle, Staphylococcus aureus, Enterovirus: virus de la poliomyélite, virus coxsackie A et B, Echovirus, Genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia, Genre Legionella, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophile, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria, Campylobàcter coli, Campylobacter jejuni, Virus de l'hépatite A, Calicivirus : Norwalk et Sapporo Virus, Adenovirus, Rotavirus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Genre Mycobactéries, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium simiae, Mycobacterium kansasü, Mycobacferium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacferium gordonae, Acinetobacter baumanii, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia gladioli, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Astrovirus.
15/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les microorganismes suivants:
Escherichia coli, Enterovirus, Genre Cryptosporidium, 16/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 4, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants:
les Adenovirus, Adeno 40, Adeno 41bis;
les Astrovirus, HAstV-1-2;
les Enterovirus, Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, les Rotavirus, les Calicivirus : Virus de Norwalk, Virus de Sapporo et Virus de l'Hépatite A.
17/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2 et 5, 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les parasites suivants:
Le genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia lamblia et les Microsporidies.
18/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2,3 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les bactéries suivantes:
Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE O157:H7, genre Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus.
19/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2 et 4, caractérisé en ce pue lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants:
Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi les Calicivirus et les Rotavirus.
20/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2 et 4, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les virus suivants:
Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi le vrius de Norwalk et les Rotavirus.
21/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2 et 5, 6 caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi les parasites suivants:
genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia.
22/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2,3 et 6, caractérisé en ce que lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi:
Escherichia coli, Escherichia coli SEROTYPE 0157:H7, genre Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi les Calicivirus et les Rotavirus, genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia.
23/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1,2,3 et 6, caractérisé en ce pue lesdits microorganismes du nécessaire de détermination microbiologique sont choisis parmi:
Escherichia coli, Escherichia soli SEROTYPE 0157 :H7, genre Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, genre Mycobacterium, genre Legionella, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, Virus de l'hépatite A, Enterovirus, et au moins un virus choisi parmi le vrius de Norwalk et les Rotavirus, genre Cryptosporidium, Cryptosporidium parvum, genre Giardia, Giardia Lamblia.
24/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sondes d'identification ont une séquence choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID Nos :1-104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
25/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO :1 à SEQ ID NO :39, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ
ID NO:40 à SEQ ID NO:49 , SEQ ID NO :63 à SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; et au moins une séquence choisie parmi entre SEQ ID NO:50 à SEQ ID NO:60, SEQ ID NO 70 SEQ ID NO 104 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
26/ Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins quatre sondes d'identification choisies parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
27/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins cinq sondes d'identification choisies parmi SEQ ID NO:50 à SEQ ID NO:60, SEQ ID NO 70 SEQ ID NO 104 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
28/ Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins deux sondes d'identification choisies parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:49 et SEQ ID NO:63 à
SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
29/ Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence, et au moins une séquence comprise SEQ ID NO:40 à
SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:63 à SEQ ID NO:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
30/ Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO 66, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
31/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
32/ Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
33/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:46 à SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64 et SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
34/ Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO:53 à
SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:70-à SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:40 à SEQ ID
NO:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
35/ Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 à
SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:53 à SEQ ID
NO:55, SEQ ID NO:61 à SEQ ID NO:75, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
36/ Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:9 à SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14 à SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 à SEQ ID
NO:29, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53 à SEQ ID NO:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
37/ Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisies parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9 à SEQ ID NO:55 à
SEQ ID NO:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont fa séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
38/ Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisies parmi SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO 62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO
69, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ ID 23.
39/ Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisies parmi SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO
75.
40/ Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisies parmi SEQ ID NO 98 à 104, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 97, SEQ ID
NO 56 à SEQ ID NO 58, SEQ ID NO 76 à SEQ ID NO 96.
41/ Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le nécessaire d'identification comprend au moins une sonde d'identification choisies parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 65 42/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, préalablement à la mise en contact avec le nécessaire de détermination, on effectue au moins une étape de lyse.
43/ Procédé selon la revendication 42, caractérisé en ce que, postérieurement à l'étape de lyse, on effectue une étape d'amplification.
44/ Procédé de contrôle selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par la mise en avant traitement du milieu à analyser, d'une étape d'enrichissement en microorganismes du dit échantillon.
45/ Procédé de contrôle selon la revendication 44, caractérisé en ce que l'étape d'enrichissement est effectuée par filtration.
46/ Procédé de contrôle d'un échantillon liquide selon la revendication 45 , caractérisé en ce que fa filtration est conduite en utilisant un moyen de filtration à fibres creuses, utilisé en mode frontal.
47/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID
NO:39, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:49 , SEQ ID NO :63 à
SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence ; et au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO:50 à SEQ ID
NO:60, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 104 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
48/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins quatre sondes d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID
NO:39, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
49/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins cinq sondes d'identification choisies parmi SEQ ID NO:50 à SEQ ID
NO:60, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 104 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
50/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID
NO:49, SEQ ID NO :63 à SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
51/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID
NO:39, SEQ ID NO :61, SEQ ID NO :62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence, et au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:49, SEQ ID NO :63 à SEQ ID NO :65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
52/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:62, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO 68 SEQ ID NO 69, SEQ ID NO:15, SEQ
ID NO:23, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
54/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:62, SEQ ID NO 66,SEQ ID 68, NO SEQ ID 69, NO SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO:23, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
55/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:62, SEQ ID NO 66, SEQ ID 68, NO SEQ ID 69, SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO:23, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité
avec ladite quelconque séquence.
56/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:62, SEQ ID NO 66 ,SEQ ID 68, NO SEQ ID 69, SEQ ID NO:53 à SEQ ID
NO:55, SEQ ID NO 70 à SEQ ID 75, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO:44, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
57/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:15, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 à SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:40 à SEQ
ID NO:49, SEQ ID NO:53 à SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:61 à SEQ ID NO:75, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
58/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID
NO:4, SEQ ID NO:9 à SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14 à SEQ ID NO:20, SEQ
ID NO:23, SEQ ID NO:25 à SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:53 à SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57 à SEQ ID NO:65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monoméres contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
59/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:1 à SEQ ID
NO:6, SEQ ID NO:9 à SEQ ID NO:55 à SEQ ID NO:104, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
60/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO
62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID
NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ ID 23 et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
61/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO 59, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 96, SEQ ID NO :98, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
62/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO 98 à 104, SEQ
ID NO 59, SEQ ID NO 56 à SEQ ID NO 58, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO :97, SEQ ID NO 7-0 à SEQ ID NO 96, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
63/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO
45, SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
64/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO
62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID
NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ ID 23, SEQ ID NO
59, SEQ ID NO :60 SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 70 à SEQ ID NO 96, SEQ ID NO :98 à SEQ ID NO :104, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID
NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70% d'identité avec ladite quelconque séquence.
65/ Nécessaire de détermination microbiologique d'un microorganisme présent dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde d'identification choisie parmi SEQ ID NO:14 , SEQ ID NO
62, SEQ ID NO 66 à SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 5, SEQ ID
NO 6, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 11, SEQ ID 23, SEQ ID NO
98 à 104, SEQ ID NO 59, SEQ ID NO 56 à SEQ ID NO 58, SEQ ID NO :60, SEQ ID NO :97, SEQ ID NO :70 à SEQ ID NO :75, SEQ ID NO 76 à SEQ ID
NO 96, SEQ ID NO:40 à SEQ ID NO 45, SEQ ID NO 65, et tous fragments de celles-ci comprenant au moins 5 monomères contigus inclus dans l'une quelconque desdites séquences et dont la séquence présente au moins 70%
d'identité avec ladite quelconque séquence.
66/ Nécessaire de détermination microbiologique selon l'une quelconque des revendications 47 à 64, caractérisé en ce que les sondes d'identifications ou leurs fragments sont fixés sur un support solide 67/ Nécessaire de détermination microbiologique selon l'une quelconque des revendications 47 à 65, caractérisé en ce que les sondes d'identification ou leurs fragments sont fixés sur un support solide et constituent une biopuce.
68/ Procédé de production et/ou désinfection d'un liquide, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'analyse mettant en oeuvre un nécessaire de détermination microbiologique selon l'une quelconque des revendications de 47 à 67 et générant un algorithme d'interprétation des données permettant l'asservissement dudit procédé de production et/ou désinfection auxdites données générées par le nécessaire de détermination microbiologique.
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