CA2387591A1 - Utilisation de derives d'indirubine pour la fabrication de medicaments - Google Patents
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Abstract
L'invention vise l'utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteur s de la GSK-3.beta. de dérivés d'indirubine. Application pour le traitement de pathologies impliquant GSK-3.beta. et CDK5.
Description
Utilisation de dérivés d'indirubine pour la fabrication de médicaments.
L'invention a pour objet une nouvelle utilisation en s thérapeutique de dérivés d'indirubine.
L'indirubine appartient à la famille des indigoides. Le terme indigoide est utilisé comme nom générique des colorants du groupe de l'indigo. Il s'agit de bis-indoles, dérivés de diverses sources naturelles par fermentation, oxydation et dimérisation l0 en prêsence de lumière.
L'indirubine (ou isoindigotine), répond à la formule A
~'1 is \ ~ ~ NH
O
Elle constitue le principe actif du Danggui Longhui 20 Wan, utilisé en médecine traditionnelle chinoise dans le traitement de maladies chroniques, comme les leucémies.
Dans la demande EP 98 109 854.2, dans laquelle certains des inventeurs de la demande sont co-inventeurs, on rapporte que des dérivés d'indigoïdes, parmi lesquels l'indirubine et ses 2s dérivés, sont des inhibiteurs puissants des kinases cycline-dépendantes (CDKs en abrégé), avec des ICSO (dose inhibitrice à
50%) de 50 à 200 nM (voir également Hoessel et al., Nature Cell Biology, vol 1, n°1, mai 1999). Ces kinases sont des régulateurs clês du cycle cellulaire.
30 Les inhibiteurs entrent en compétition avec l'ATP pour se lier à la sous-unité catalytique de la kinase.
Ces propriétês inhibitrices de CDKs, qui entraînent un arrêt du cycle cellulaire, confèrent à ces dérivés d'indigoïdes
L'invention a pour objet une nouvelle utilisation en s thérapeutique de dérivés d'indirubine.
L'indirubine appartient à la famille des indigoides. Le terme indigoide est utilisé comme nom générique des colorants du groupe de l'indigo. Il s'agit de bis-indoles, dérivés de diverses sources naturelles par fermentation, oxydation et dimérisation l0 en prêsence de lumière.
L'indirubine (ou isoindigotine), répond à la formule A
~'1 is \ ~ ~ NH
O
Elle constitue le principe actif du Danggui Longhui 20 Wan, utilisé en médecine traditionnelle chinoise dans le traitement de maladies chroniques, comme les leucémies.
Dans la demande EP 98 109 854.2, dans laquelle certains des inventeurs de la demande sont co-inventeurs, on rapporte que des dérivés d'indigoïdes, parmi lesquels l'indirubine et ses 2s dérivés, sont des inhibiteurs puissants des kinases cycline-dépendantes (CDKs en abrégé), avec des ICSO (dose inhibitrice à
50%) de 50 à 200 nM (voir également Hoessel et al., Nature Cell Biology, vol 1, n°1, mai 1999). Ces kinases sont des régulateurs clês du cycle cellulaire.
30 Les inhibiteurs entrent en compétition avec l'ATP pour se lier à la sous-unité catalytique de la kinase.
Ces propriétês inhibitrices de CDKs, qui entraînent un arrêt du cycle cellulaire, confèrent à ces dérivés d'indigoïdes
2 un intérêt pour le traitement de pathologies liées à la perte du contrôle de la prolifération comme les cancers, le psoriasis, les maladies cardiovasculaires, les maladies infectieuses, la néphrologie, les maladies neurodégénératives et les infections virales.
De manière surprenante, les inventeurs ont à présent mis en évidence que, parmi ces dérivés d'indigoïdes, seuls les dérivés d'indirubine exerçaient en outre un effet inhibiteur sur une autre cible enzymatique, constituée par la glycogène synthase kinase-3~i ou GSK-3~i en abrégé .
Cette kinase est un élément essentiel de la voie de signaux WNT. Elle est impliquée dans de multiples processus physiologiques: régulation du cycle cellulaire par contrôle de taux de cycline D1 et de (3-caténine, formation dorso-ventrale durant le développement, action de l'insuline sur la synthèse de glycogène, excroissance axonale, neurotoxicité de HIV-1 à
médiation par Tat, et autres.
De plus, on sait que la GSK-3(3 et la CDK5 sont responsables pour une bonne part de l'hyperphosphorylation anormale de la protéine tau liant les microtubules comme observé
dans les filaments appariés en hélice dans la maladie d'Alzheimer.
On mesure également l'intérêt de pouvoir disposer de dérivés inhibiteurs de l'activité de GSK-3~i pour favoriser la division cellulaire.
Or, les seuls inhibiteurs de la GSK-3~3 connus à ce jour sont constitués par le lithium et certains dérivés de purine.
La sélectivité du lithium n'a pas été rapportée, mais étant donné la nature atomique du produit, il est vraisemblable qu'elle doit être très faible. De plus, le lithium n'agit qu'à
des doses considérables (ICso autour de 10 mM).
De manière surprenante, les inventeurs ont à présent mis en évidence que, parmi ces dérivés d'indigoïdes, seuls les dérivés d'indirubine exerçaient en outre un effet inhibiteur sur une autre cible enzymatique, constituée par la glycogène synthase kinase-3~i ou GSK-3~i en abrégé .
Cette kinase est un élément essentiel de la voie de signaux WNT. Elle est impliquée dans de multiples processus physiologiques: régulation du cycle cellulaire par contrôle de taux de cycline D1 et de (3-caténine, formation dorso-ventrale durant le développement, action de l'insuline sur la synthèse de glycogène, excroissance axonale, neurotoxicité de HIV-1 à
médiation par Tat, et autres.
De plus, on sait que la GSK-3(3 et la CDK5 sont responsables pour une bonne part de l'hyperphosphorylation anormale de la protéine tau liant les microtubules comme observé
dans les filaments appariés en hélice dans la maladie d'Alzheimer.
On mesure également l'intérêt de pouvoir disposer de dérivés inhibiteurs de l'activité de GSK-3~i pour favoriser la division cellulaire.
Or, les seuls inhibiteurs de la GSK-3~3 connus à ce jour sont constitués par le lithium et certains dérivés de purine.
La sélectivité du lithium n'a pas été rapportée, mais étant donné la nature atomique du produit, il est vraisemblable qu'elle doit être très faible. De plus, le lithium n'agit qu'à
des doses considérables (ICso autour de 10 mM).
3 I1 en est de même avec les dérivés de purine décrits dans la demande WO 98/16528, qui sont peu sélectifs et dont les ICso sont autour de 10 ~,M.
L'invention apporte une solution â ces problëmes avec l'utilisation d'indirubines de grande efficacité avec des ICSo inférieures à 10 ~.M, et le plus généralement de l'ordre de 5 à
50 nM, pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de GSK-3~i.
Conformément à l'invention, pour la fabrication desdits médicaments, on utilise des dérivés d'indirubine répondant à la formule gênérale I .
Rs R' Rs R' ~~ ~.. ~ ~,~i .a R' R R' Y
dans laquelle R1 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe méthylènehydroxy; un radical alcoyle ou alkyloxy ou méthylènealkoxy, à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18; un radical cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un radical aryle, aralkyle ou aryloxy, substitué ou non substitué, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe mono-, di-ou trialkylsilyle ayant 1 à 6 atomes de carbone, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas, dans le groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée; un groupe mono-, di- ou triarylsilyle, avec des groupes aryle substitués ou non, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas; un groupe trifluorométhyle; un groupe -COM; -COOM; ou -CHZCOOM, avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C18, â chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes
L'invention apporte une solution â ces problëmes avec l'utilisation d'indirubines de grande efficacité avec des ICSo inférieures à 10 ~.M, et le plus généralement de l'ordre de 5 à
50 nM, pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de GSK-3~i.
Conformément à l'invention, pour la fabrication desdits médicaments, on utilise des dérivés d'indirubine répondant à la formule gênérale I .
Rs R' Rs R' ~~ ~.. ~ ~,~i .a R' R R' Y
dans laquelle R1 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe méthylènehydroxy; un radical alcoyle ou alkyloxy ou méthylènealkoxy, à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18; un radical cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un radical aryle, aralkyle ou aryloxy, substitué ou non substitué, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe mono-, di-ou trialkylsilyle ayant 1 à 6 atomes de carbone, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas, dans le groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée; un groupe mono-, di- ou triarylsilyle, avec des groupes aryle substitués ou non, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas; un groupe trifluorométhyle; un groupe -COM; -COOM; ou -CHZCOOM, avec M représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C18, â chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes
4 hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, radicaux alkyle ou groupe alcoxy; un groupe -NRllRlz, dans lequel R11 et R12, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas l0 échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe acyle; un groupe méthylèneamino -CH2-NRllRlz, dans lequel R11 et R12 présentent les significations ci-dessus; un groupe benzyle, dans lequel le noyau benzène comprend, le cas échéant, un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échêant un ou plusieurs hétéroatomes; un résidu d'acide aminé physiologique lié à
l' azote, comme un amide; un O-glycoside ou un N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les disaccharides; ou un groupe méthylènesulfonate; R2, R3, R', R5, R', Re, R9 et Rl°, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène; d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe nitroso;
un groupe nitro; un groupe alkoxy; un groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino; un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe aralkyle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe aryloxy, substitué ou non comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènearyloxy, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe cycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe trifluoromêthyle; un groupe -COM; -COOM; ou CH2COOM, avec M
représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant en outre
l' azote, comme un amide; un O-glycoside ou un N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les disaccharides; ou un groupe méthylènesulfonate; R2, R3, R', R5, R', Re, R9 et Rl°, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène; d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe nitroso;
un groupe nitro; un groupe alkoxy; un groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino; un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe aralkyle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe aryloxy, substitué ou non comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènearyloxy, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe cycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe trifluoromêthyle; un groupe -COM; -COOM; ou CH2COOM, avec M
représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant en outre
5 par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, groupes alkyle ou groupes alcoxy ; un groupe -NR11R12, dans lequel R11 et R12, identiques ou différents, représentent un atome l0 d'hydrogène, un radical alkyle â chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, un groupe acyle, ou dans lequel l'atome d'azote fait partie d'un groupe cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe -CONR11R12, dans lequel R11 et R12 présentent les significations ci-dessus; un groupe hydroxylamino; un groupe phosphate; un groupe phosphonate; un groupe sulfate; un groupe sulfonate; un groupe sulfonamide; un groupe -SOZNR11R12, dans lequel R11 et Rlz présentent les significations données ci-dessus; un groupe azo -N=N-R13, dans lequel R13 représente un groupe aromatique, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, ou un groupe O-glycoside ou N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les dissacharides; ou R1 et R5, et R6 et Rlo, respectivement, forment ensemble, indépendamment l'un de l'autre, un cycle ayant 1 à 4 groupes CH2, le cas échéant substitué; et X et Y, identiques ou différents, représentent un 3o atome d' oxygène; de soufre; de sélénium; de tellurium; un groupe -NR14, dans lequel R14 représente un atome d' hydrogène, un groupe alkyle, à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou
6 sulfonate, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, un groupe aralkyle, ou un groupe sulfonate; ou -NOR14, dans lequel le groupe Rl' présente les significations données ci-dessus, et les sels de ces dérivés physiologiquement acceptables.
Dans une disposition de l'invention, un ou plusieurs atomes d'un ou plusieurs cycles benzéniques sont remplacés par des atomes d'azote.
Dans une autre disposition, un ou plusieurs systèmes l0 cycliques aromatiques ou non aromatiques, qui comprennent, le cas échéant, un ou plusieurs hétéroatomes indépendamment l'un de l'autre, sont condensés au système indirubine.
Dans encore une autre disposition, les dérivés d'indirubine de formule (I) sont liês à un ester de polyéthylèneglycol ou à un éther de polyéthylèneglycol par des liaisons, respectivement, ester ou éther.
L'invention vise plus spécialement les dérivés d'indirubine possédant une ICso vis-à-vis de GSK-3(3 inférieure à
10 ~.M et de préférence à 1 ~.M, et notamment ceux avec une ICso infërieure à 50 nM.
De maniêre préférée, dans de tels dérivés, X et Y, identiques ou différents, représentent un groupe = O ou = NOH.
Dans les familles correspondantes, les substituants R1, R3, R' et Ra présentent avantageusement les significations suivantes:
- R3: un atome d'hydrogène, d'halogène, un radical alkyle, un groupe -S03H, -S02NH2, -SOz-N- (CH3) 2, -SOZ-N-CZHS-OH, -SOZ-N- (CZHS-OH) 2, -SOz-NH-CH3, - R4 et Re, indépendamment l' un de l' autre . un atome d'hydrogène ou d'halogène, - R1: un radical alkyle ou aryle, les autres substituants donnés sur la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.
Dans une disposition de l'invention, un ou plusieurs atomes d'un ou plusieurs cycles benzéniques sont remplacés par des atomes d'azote.
Dans une autre disposition, un ou plusieurs systèmes l0 cycliques aromatiques ou non aromatiques, qui comprennent, le cas échéant, un ou plusieurs hétéroatomes indépendamment l'un de l'autre, sont condensés au système indirubine.
Dans encore une autre disposition, les dérivés d'indirubine de formule (I) sont liês à un ester de polyéthylèneglycol ou à un éther de polyéthylèneglycol par des liaisons, respectivement, ester ou éther.
L'invention vise plus spécialement les dérivés d'indirubine possédant une ICso vis-à-vis de GSK-3(3 inférieure à
10 ~.M et de préférence à 1 ~.M, et notamment ceux avec une ICso infërieure à 50 nM.
De maniêre préférée, dans de tels dérivés, X et Y, identiques ou différents, représentent un groupe = O ou = NOH.
Dans les familles correspondantes, les substituants R1, R3, R' et Ra présentent avantageusement les significations suivantes:
- R3: un atome d'hydrogène, d'halogène, un radical alkyle, un groupe -S03H, -S02NH2, -SOz-N- (CH3) 2, -SOZ-N-CZHS-OH, -SOZ-N- (CZHS-OH) 2, -SOz-NH-CH3, - R4 et Re, indépendamment l' un de l' autre . un atome d'hydrogène ou d'halogène, - R1: un radical alkyle ou aryle, les autres substituants donnés sur la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.
7 Dans une famille préférée selon l'invention, X = Y, ces deux substituants représentant un groupe = O.
Des dérivés de cette famille constituant des inhibiteurs de GSK-3~3 de grande efficacité, avec des ICso inférieures à 5 ~M, le plus généralement à 1 ~M, voire à 50 nM, comprennent avantageusement des substituants R1, R3, R' et R8 répondant aux significations suivantes .
- R1: alkyle, notamment méthyle, et phényle, - R3: hydrogène, halogène (F, C1, Br, I), N02, - S03H, -SOzNH2, -SOz-N (CH3) z, -S02-N-CZHS-OH, -S02-N- (CzHS-OH) 2, -SOz-NHCH3 , -R4 et Re: halogène, en particulier I ou Br, les autres substituants donnés dans la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.
Des dérivés particulièrement préférés sont choisis parmi l'indirubine, la 5-iodo-indirubine, la 5-bromo-indirubine, la 5-chloro-indirubine, la 5-fluoro-indirubine, la 5-méthyl indirubine, la 5-nitro-indirubine, la 5-S03H-indirubine, la 5' bromo-indirubine, la 5-5'-dibromo-indirubine ou l'acide 5' bromo-indirubine 5-sulfonique.
Dans une autre famille préférée selon l'invention, X
reprêsente un groupe = NOH et Y un groupe = O.
Dans un groupe préférê de cette famille, R3 représente un atome d'halogène, notamment I, ou un groupe - S03Na .
Les dérivés correspondants présentent avantageusement une ICso vis-à-vis de GSK-3~i inférieure à 100 nM, et même pour nombre d'entre eux inférieure à 50 nM.
Des dérivés préférés de ce groupe sont choisis parmi l'indirubine-3'-monoxime, la 5-iodo-indirubine-3'-monoxime et la 5-S03Na-indirubine-3'-monoxime.
Comme indiqué plus haut, les dérivés définis ci-dessus, ont déjà été décrits comme inhibiteurs des CDKs, ainsi que
Des dérivés de cette famille constituant des inhibiteurs de GSK-3~3 de grande efficacité, avec des ICso inférieures à 5 ~M, le plus généralement à 1 ~M, voire à 50 nM, comprennent avantageusement des substituants R1, R3, R' et R8 répondant aux significations suivantes .
- R1: alkyle, notamment méthyle, et phényle, - R3: hydrogène, halogène (F, C1, Br, I), N02, - S03H, -SOzNH2, -SOz-N (CH3) z, -S02-N-CZHS-OH, -S02-N- (CzHS-OH) 2, -SOz-NHCH3 , -R4 et Re: halogène, en particulier I ou Br, les autres substituants donnés dans la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.
Des dérivés particulièrement préférés sont choisis parmi l'indirubine, la 5-iodo-indirubine, la 5-bromo-indirubine, la 5-chloro-indirubine, la 5-fluoro-indirubine, la 5-méthyl indirubine, la 5-nitro-indirubine, la 5-S03H-indirubine, la 5' bromo-indirubine, la 5-5'-dibromo-indirubine ou l'acide 5' bromo-indirubine 5-sulfonique.
Dans une autre famille préférée selon l'invention, X
reprêsente un groupe = NOH et Y un groupe = O.
Dans un groupe préférê de cette famille, R3 représente un atome d'halogène, notamment I, ou un groupe - S03Na .
Les dérivés correspondants présentent avantageusement une ICso vis-à-vis de GSK-3~i inférieure à 100 nM, et même pour nombre d'entre eux inférieure à 50 nM.
Des dérivés préférés de ce groupe sont choisis parmi l'indirubine-3'-monoxime, la 5-iodo-indirubine-3'-monoxime et la 5-S03Na-indirubine-3'-monoxime.
Comme indiqué plus haut, les dérivés définis ci-dessus, ont déjà été décrits comme inhibiteurs des CDKs, ainsi que
8 d'autres indigoïdes dérivés par exemple de l'indigo ou de l'isoindigo. Or de maniëre surprenante, seuls les dérivés d'indirubine exercent en outre un effet inhibiteur vis-à-vis de GSK-3~i .
Cet effet est le plus généralement du même ordre de grandeur vis-à-vis des CDKs et de la GSK-3~i.
Les médicaments fabriqués conformément à l'invention en utilisant les dérivés d'indirubine définis ci-dessus sont utilisables pour le traitement des pathologies dans lesquelles la GSK-3(3 est impliquée .
I1 en est ainsi par exemple des diabètes, où les inhibiteurs de GSK-3(3 sont utilisables comme insulino-mimétiques.
On rappelle que l'insuline agit par une cascade d'évènements biochimiques conduisant à une inhibition de la GSK-3~i et que cette inhibition est responsable de la réponse des cellules à
l'insuline.
De même, ces médicaments présentent un grand intérêt pour le traitement de maladies neurodêgénératives. Comme démontré dans les exemples, l'hyperphosphorylation de la protéine tau provoquêe par CDKS et GSK-3(3 peut être en effet inhibée par les dérivês d'indirubine. En administrant les médicaments fabriqués selon l'invention, il est alors possible, grâce à leur effet inhibiteur à la fois de CDK5 et de GSK-3(3, d'empêcher l'hyperphosphorylation de la protéine tau chez les malades d'Alzheimer et de lutter contre la neurodégénérescence.
Ces médicaments trouvent également une application de grand intérêt pour le traitement de maladies maniaco-dépressives.
On citera également leur utilisation pour le traitement de cancers où leur effet inhibiteur à la fois de GSK-3~3 ét de CDKS, qui se traduit par l'apoptose de la cellule tumorale, est avantageusement mis à profit.
Cet effet est le plus généralement du même ordre de grandeur vis-à-vis des CDKs et de la GSK-3~i.
Les médicaments fabriqués conformément à l'invention en utilisant les dérivés d'indirubine définis ci-dessus sont utilisables pour le traitement des pathologies dans lesquelles la GSK-3(3 est impliquée .
I1 en est ainsi par exemple des diabètes, où les inhibiteurs de GSK-3(3 sont utilisables comme insulino-mimétiques.
On rappelle que l'insuline agit par une cascade d'évènements biochimiques conduisant à une inhibition de la GSK-3~i et que cette inhibition est responsable de la réponse des cellules à
l'insuline.
De même, ces médicaments présentent un grand intérêt pour le traitement de maladies neurodêgénératives. Comme démontré dans les exemples, l'hyperphosphorylation de la protéine tau provoquêe par CDKS et GSK-3(3 peut être en effet inhibée par les dérivês d'indirubine. En administrant les médicaments fabriqués selon l'invention, il est alors possible, grâce à leur effet inhibiteur à la fois de CDK5 et de GSK-3(3, d'empêcher l'hyperphosphorylation de la protéine tau chez les malades d'Alzheimer et de lutter contre la neurodégénérescence.
Ces médicaments trouvent également une application de grand intérêt pour le traitement de maladies maniaco-dépressives.
On citera également leur utilisation pour le traitement de cancers où leur effet inhibiteur à la fois de GSK-3~3 ét de CDKS, qui se traduit par l'apoptose de la cellule tumorale, est avantageusement mis à profit.
9 PCT/FR00/03264 Ces médicaments s'avêrent également efficaces pour le traitement de maladies provoquées par des parasites unicellulaires comme la malaria, les trypanosomes, les leishmanias, les toxoplasmes, les pneumocystis et autres, ou des parasites pluricellulaires, comme les champignons et les vers.
Lors de l'élaboration des médicaments, les principes actifs, utilisés en quantités thérapeutiquement efficaces, sont mélangés avec les véhicules pharmaceutiquement acceptables pour le mode d'administration choisi.
l0 Ainsi pour une administration par voie orale, les médicaments sont préparés sous forme de gélules, comprimés, dragées, capsules, pilules, gouttes et analogues. De tels médicaments peuvent renfermer de 1 à 100 mg de principe actif par unité.
1S Pour l'administration par voie injectable (intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire), les médicaments se présentent sous forme de solutions stériles ou stérilisables.
Les doses par unité de prise peuvent varier de 1 à 50 mg de principe actif. La posologie quotidienne est choisie de maniêre 20 à obtenir une concentration finale d'au plus 100 ~.M en dérivé
d'indirubine dans le sang du patient traité.
Afin d'illustrer l'invention, sans toutefois en limiter sa portée, on rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages.
25 Dans ces exemples, il sera fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent respectivement, - les figures 1A à 1C, les effets inhibiteurs d'indirubines utilisées selon l'invention vis-à-vis de GSK-3(3 , CDKS/p25 et CDK1/cycline B, 30 - la figure 2, l'effet compétiteur avec ATP pour la fixation à
GSK-3~i, et - la figure 3, l'effet inhibiteur par les indirubines, in vitro, de la phosphorylation de tau par GSK-3(3.
Caractérisation des indirubines Les analyses élémentaires ont été effectuées à l'aide d'un appareil d'analyse élémentaire de CHN Perkin-Elmer 2400.
Les spectres de RMN1H ont été enregistrés à 400 MHz, de RMN 1'C à
5 100 MHz sur un appareil Bruker AMX 400, avec comme référence interne du tétraméthylsilane. s désigne un singulet, d, un doublet et m, un multiplet. Les spectres de masse ont été pris selon le mode d'ions positifs sous impact électronique (EI 70) et avec un appareil Finingan MAT 90.
Exemples de synthèses d'indirubines indirubine L'indirubine est préparée selon Russell et al, J.Am.Chem.Soc.1969,91,3851-3859 (méthode modifiée) en utilisant 1,76 g (12,0 mmole) d'isatine et 2,00 g (11,4 mmole) d'indoxylacétate. Après filtration, le résidu est lavé 2 fois avec du méthanol, et plusieurs fois avec de l'eau froide, jusqu'à
neutralité du filtrat. Le produit est séché sur KOH. On obtient 2,42 g (81,0%) de cristaux violet sombre R~ - 0,64 (acétate d'éthyle hexane 1/1 v/v); PF 341-343 °C . 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6,91 (d, J = 8,1, C7H), 7,02 (m, C5H et C5'H), 7,26 (m,C6H), 7,42 (d, J = 8, 1, C7'H) , 7, 58 (m C6'H) , 7, 66 (d, J = C4'H) , 8, 77 (d, J
- 7, 7, C4H) , 11, O1 (s) et 10, 88 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RHIN (DMSO
-d6, 90°C) 8 106, 97 (s, C3) , 109, 57 (d, J = 162, 2, C7) , 113, 15 (d, J = 168,7, C7'), 119,37 = 162,1, Hz) (s, C3a'),121,21 (d, J et 121,19 (d, J - 162,1 Hz) (C5 et C5' ), 121,58 (s,C3a), 124,62 (d,J - 164,6, Hz) et 124,20 (d, J 163,8, z) (C6 C4'), - H et 129, 15 (d, J = 159, 8, C6' ) , 48 C4) , 136, 85 (d, J = 138, (s, 161, 4, C7a), 141,07 (s, C7a' ),152,35 (s, ), 171,11 (s, C2), 188,27 C2' (s, C3' ) ; MS m/e 262 (M+, 100) , 234 (43) , (25) , (4) Anal. (C16H10N2~2) C. H, N.
5-iodoindirubine On procède comme décrit pour l' indirubine . En partant de 655 mg de 5-iodoisatine (2,40 mmole) et de 399 mg d'indoxylacétate (2,28 mmole, la réaction conduit à 720 mg de produit brut. Par recristallisation à partir d'éthanol, on obtient 58 mg (6,2 ~) de cristaux violet sombre ; Rf - 0,68 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v); PF 334-335 °C . 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6,75 (d, J = 8,1, C7H), 7,04 ;1H (m, C5'H), 7,42 (d, J = 8,1, C7'H), 7,57 (m, C6H
et C6'H), 7,65 (d, J = 7,5, C4'H), 9,11 (s, C4H), 11,00 (s) et 11, 09 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RMN (DMSO -ds, 90°C) 8 83, 73 (d, J =
16,9, C5), 105,18 (s, C3), 111,85 (d, J - 164,6, C7), 113,43 (d, J = 167, 2, C7' ) , 119, 27 (s, C3a' ) , 121, 65 (d, J = 163, 6, C5' ) , 124,03 (s, C3a), 124,44 (d, J = 163,9, Hz, C4'), 132,49 (d, J =
171,2, C6), 137,00 (d, J = 166,9, Hz) et 137,15 (d, J = 160,1 Hz) (C4 et C6'), 139,26 (s, C7a'), 140,44 (s,C7a), 152,41 (s, C2' ) , 170, 48 (s, C2) , 188, 54 (s, C3' ) ; MS m/e 388 (M+, 100) , 360 (3) , 261 (6) , 233 (16) , 205 (16) . Anal. (C16H9INZO2) C, H, N.
5-bromoindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 1,30 g de 5-bromoisatine (5,75 mmole) et de 1,00 g d'indoxylacétate (5,71 mmole), le produit brut est recristallisé à partir de pyridine et conduit à 1,16 g (59,3 ~) de cristaux noirs avec une nuance violette; R~ - 0,49 (acétate d'éthyle hexane 1/1 v/v) 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6, 86 (d, J = 8, 4, C7H) , 7, 05 (pt, C5'H) , 7, 41-7,31 (m, C6H et C7'H), 7,59 (m,C6'H), 7,66 (d, J = 7,5, C4'H), 8, 94 (s, C4H) , 11,.10 (s) et 11, 00 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RMN
(DMSO -d6, 90°C) 8 104,92 (s, C3), 111,24 (d,J - 165,1, C7), 112,89 (s, C5), 113,53 (d, J 167,8, C7'), 118,92 (s,C3a'), 121, 64 (d, J = 164, 4, C5' ) , 123, 41 (s, C3a) , 124, 49 (d, J = 164, 0, C4'), 126,60 (d, J = 171,3, C6), 131,03 (d, 167,1, C4), 137,29 (d, J = 160,9, C6'), 139,16 (s, C7a'), 139,74 (s,C7a), 152,42 (s, C2' ) , 170, 50 (s, C2) , 188, 77 (s, C3' ) ; MS m/e 342 (M+, 100) , 340 (M+, 100) 314 (18) , 312 (18) , 261 (7) . Anal. (C16H9BrNz02) C, H, N.
5-chloroindirubine On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 5-chloroisatine (2,75 mmole) et de 480 mg d'indoxylacétate (2,73 mmole), on obtient 766 mg (94,6 ~) d°une poudre violette, RI -0, 60 (acétate d' éthyle /hexane 1/1 v/v) . 1H-RMN (DMSO-ds) 8 6, 89 (d, J = 8, 3, C7H) , 7, 04 (m, C5'H) , 7, 27 (d, J = 8, 3, C6'H) , 7, 42 (d, J = 7, 8, C7'H) , 7, 58 (m, C6'H) , 7, 65 (d, J = 7, 6, C4'H) , 8, 78 (s,C4H), 10,99 (s) et 11,09 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN (DMSO-ds) 8 104,95 (s, C3), 110,61 (d,J = 164,6, C7), 113,50 (d, J = 168,6, C7'), 118,85 (s, C3a'), 121,54 (d, J = 165,4, C5'), 122,85 (s, C3a), 123,76 (d, J = 170,2 Hz) et 124,41 (d, J = 163,8 Hz) (C6 et C4'),125,00 (s,C5), 128,16 (d, J = 167,0, C4), 137,21 (d, J =
159, 8, C6' ) , 139, 10 (s) et 139, 31 (s) ( C7a et C7a' ) , 152, 39 (s, C2'), 170,52 (s, C2), 188,72 (s, C3') ; MS m/e 296 (M+ , 100), 268 (39) ; 233 (35) , 205 (50) . Anal. (C16H9CINz02) C, H, N.
5-fluroroindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 5-fluoroisatine (3,03 mmole) et de 530 mg d'indoxylacé~tate (3,00 mmole), on obtient 776 mg (92,4 )d'une poudre violette, Rf - 0,32 (acétate d'éthyle/ hexane 1/2 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6,87 (dd, JH,x = 8, 3, JH,H = 4, 7 C7H) , 7, 10-7, O1 (m, C6H et C5'H) , 7, 42 (d, J = 8,2, C7'H), 7,58 (pt, C6'H), 7,65 (d, J = 7,4, C4'H), 8, 56 (d, JF,H _ 10, 6, C4H) , 11, 00 (b,NlH et N1'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) 8 305, 93 (s, C3) , 110, 13 (dd, J~,H - 163, 5, J~,F - 8, 7, C7) , 111, 34 (dd, J~,H = 169, 3, J~,F = 27, 6, C6) , 113, 57 (d, J = 162, 0, C7' ) , 115, 24 (dd, J~,H = 188, 9, J~,F = 24, 7, C4) 118, 98 (s, C3a' ) , 121, 64 (d, J = 164, 2, C5' ) , 122, 41 (d, J~,F = 10, 8, C3a) , 124, 56 (d, J = 163, 5, C4' ) , 137,31 (s, C7a) 137, 36 (d, J = 162,8, C6'), 139,12 (s, C7a') 152,60 (s, C2'), 157,40 (d, J~,F = 233,2, C5), 171,02 (s, C2), 188,96 (s, C3') ; MS m/e 280 (M+ , 100) , 252 (73) , 223 (32) . Anal. (C16H9FNz02) C, H, N.
5-méthylindirubine On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 5-méthylisatine (3,10 mmole) et 540 mg d'indoxylacétate (3,07 mmole), on obtient 781 mg (92,0 %) d'une poudre violette, Rj -0,44 (acétate d'éthyle/hexane 1/2 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 8 2,33 (s, CH3), 7,08-7,0 (m, C6H et C5'H), 6,79 (d, J = 7,9, C7H), 7,42 (d, J = 7,9, C7'H), 7,58 (pt, C6'H), 7,64 (d, J = 7,6, C4'H), 8,63 (s,C4H), 10,79 (s) et 11,00 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN
(DMSO-d6) b 20,99 (g,J = 126,5, CH3), 106,79 (s, C3), 109,17 (d, J = 161,3, C7), 113,33 (d, J = 168,5, C7'), 119,94 (s, C3a'), 121,09 (d, J = 164,4 C5') 121,45 (s,C3a), 124,19 (d, J = 163,7, C4'), 125,11 (d, J - 164,4, C6), 129,72 (d, J - 157,4, C4), 129,72 (s, C5) 136,96 (d, J = 161,6, C6'), 138,08 (s) et 138,65 (s) (C7a et C7a'), 152,38(s, C2'), 171,93 (s, C2), 188,49 (s, C3' ) ; MS m/e 276 (M' , 100) , 261 (10) , 248 (47) , 247 (53) . Anal.
( Cl~HIaNzOa ) C. H. N .
5-nitroindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 1,00 g de 5-nitroisatine (5,20 mmole) et 900 mg d'indoxylacétate (5,14 mmole), on obtient 1,39 g (88,2 %) d'une poudre violette, Rf=
0, 16 (d' éthyle acétate/hexane 34 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 7, O1 (d, J - 8,7, C7H), 7,05 (pt, C5'H), 7,40 (d, J - 8,1, C7'), 7,58 (pt, C6'H), 7,64 (d, J - 7,5, C4'H), 8,13 (d, J = 8,7, C6H), 9,60 (s,C4H), 11,15 (s) et 11,49 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN
(DMSO-d6) 8 103, 51 (s, C3) , 109, 27 (d, J = 167, 8, C7) , 113, 68 (d, J - 167,8, C7'), 118,83 (s, C3a'), 119,48 (d, J - 167,8 C6) 121, 59 (s, C3a) , 121, 97 (d, J = 163, 0, C5' ) , 124, 60 (d) et 124, 69 (d) (C4 et C4'), 137,37 (d, J - 161,6, C6'), 139,97 (s, C5) 136,96 (d, J - 161,6, C6'), 138, (s) et 138,65 (s, C7a'), 141, 63 (s, C5) , 145, 71 (s, C7a) , 152, 38 (s, C2' ) , 170, 93 (s, C2) , 188, 78 (s, C3' ) ; MS m/e 307 (M+ , 100) , 276 (10) , 262 (100) , 234 (23) . Anal. (C16H9N304) C, H, N.
acide indirubine-5-sulfonique (sel de sodium) On opêre comme décrit pour l'indirubine. En partant de 250 mg du sel de sodium dihydraté de l'acide isatine-5-sulfonique (1,00 mmole) et de 170 mg d'indoxylacétate (0,971 mmole), on obtient 258 mg (70,8 %) d'un solide violet, Rf - 0,73 (éthanol): 1H-RMN
(DMSO-ds) 8 6,84 (d, J = 8,0, C7H), 7,04 (m, C5'H), 7,43 (d, J =
8, 0, C7'H) , 7, 54-7, 61 (m, C4'H et C6'H) , 7, 67 (d, J = 7, 4, C6H) , 9,13 (s,C4H), 10,99 (s) et 11,05 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN
(DMSO-d6) 8 106,25 (s, C3), 108,20 (d, J = 163,3, C7), 113,39 (d, J = 168,6, C7'), 120,50 (s) et 118,98 (s) (C3a et C3a'), 121,28 (d, J = 157, 9 C5' ) 122, 57 (d, J = 169,4, C6), 124,27 (d, J = 165,6, C4'), 126,83 (d, J = 163,3, C4), 137,02 (d, J = 161,0, C6'), 138,45 (s, C5), 140,89 (s) et 141,64 (s) (C7a et C7a'), 152,39 (s, C2'), 171,14 (s, C2) , 188, 33 (s, C3' ) . Anal. (C16H9NzNaOSS 1, 5 Hz0) C, H, N.
5'-bromoindirubine On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 59 mg d'isatine (0,40 mmole) et de 100 mg de 5-bromo-indoxylacétate (0,394 mmole), on obtient 123 mg (92,6 %) d'une poudre violette, Rf - 0,59 (acétate d'éthyle/hexane 1/l v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 6,89 (d, J = 7,8, C7H), 7,02 (pt, C5H), 7,26 (pt, C6H), 7,39 (d, J = 8,5, C7'H); 7,71 (d, J = 8,5, C6'H), 7,76 (s,C4'H), 8,73 (d, J - 7, 8, C4H) , 10, 89 (s) et 11, 08 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RMN
(DMSO-ds) 8 107,43 (s, C3), 109,54 (d, J = 161,4, C7), 112,63 (s, C5'), 115,49 (d, J = 169,4, C7'), 120,64 (s) et 121,20 (s) (C3a et C3a'), 121,20 (d, J = 160,0 C5) 124,69 (d, J = 154,5, C6), 126,31 (d, J = 163,0, C4'), 129,56 (d, J = 159,0, C4), 137,69 (s, C7a') 138,87 (d, J = 166,1, C6'), 141,05 (s, C7a), 151,23 (s, C2'), 170,64 (s, C2), 187,15 (s, C3'); MS m/e 342 (M+, 100), 340 (M+, 100),314 (16), 312 (16), 261 (1), 233 (44). Anal.
(C16H9BrNz02) H, N , C: calc, 56, 3; trouvé, 55, 7.
5,5'-dibromoindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 89 mg de 5-bromoisatine (0,39 mmole) et de 100 mg de 5-bromo-indoxylactate (0,394 mg (94,0 ~) d'une mmole), on obtient poudre violette: (DMSO-d6) 8 6, 84 (d, = 8, l, C7H) , 7, 7,36 (m, C6H et 7,71 (d, J = 8,5, C6'H), C7'H), 7,76 (s,C4'H), 8,88 (s, C4H), 11,01 et 11,16 (s) (N1H et N1'H); MS m/e 422 (s) (M+, 47) , 420 (M+, 100)418 (M', 48) , 394 392 (7) , 390 (3) , (3) , , 342 (25) , 340 (25) , (15) , 311 (15) . Anal.(C16HBBr2N2O2) C, 313 H, N.
acide 5'-bromoindirubine-5-sulfonique (sel de sodium) On procède comme décrit pour l' indirubine . En partant de 224 mg l0 de sel de sodium dihydraté de l'acide isatine-5-sulfonique (0,787 mmole) et de 190 mg de 5-bromo-indoxylacétate(0,748 mmole ) , on obtient 2 04 mg ( 56 , 9 ~ ) d' une poudre violette : 1H-RMN
(DMSO-d6) 8 6,82 (d, J = 8,0, C7H), 7,40 (d, J = 8,5, C7'H), 7,55 (d, J = 8,0, C6H), 7,73 (d, J = 8,5, C6'H), 7,79 (s,C4'H), 9,09 (s, C4H), 11,11 (b,NlH et N1'H) . Anal. (Cl6HaBr2N2NaO5S2H20) H, N, C: calc, 40,1 ; trouvé 39,6.
indirubine-3'-monoxime On prépare ce composé comme décrit Farbwerke vorm. Meilster Lucius & Brüning in Hoechst a.M. Verfahren zur Herstellung von Derivaten der Indirubine. DRP 283726. Le produit brut est recristallisé à partir d'éthanol/eau (7/2, v/v). On obtient le composé recherché sous forme de cristaux rouge sombre, R~ = 0,55 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN (DMSO-ds) 8 6,90 (d, J
- 7,9, C7H), 7,42 (d, J = 7,9, C7'H), 7,58 (pt, C6'H), 7,64 (d, J = 7,6, C7H), 6,95 (m, C5H), 7,03 (m " C5'H), 7,13 (m, C6H), 7,41 (m, C6'H et C7'H), 8,24 (d, J = 7,2, C4H), 8,65 (d, J =
7,2, C4H) 10,72 (s) et 11,73 (s) (N1H et N1'H), 13,48 (s, NOH) ;
13C-RMN (DMSO-ds) 8 98,88 (s, C3), 108,91 (d, J - 162,3, C7), 111,52 (d, J = 165,8, C7'), 116,54 (s, C3a'), 120,43 (d, 160,2, C5'), 121,49 (d, J = 161,6 C5) 122,66 (s,C3a), 123,09 (d, J =
165;1, C6), 125,92 (d, J = 154,0, C4), 127,95 (d, J - 164,4, C4'), 132,02 (d, J = 159,5, C6'), 138,34 (s, C7a), 144,83 (s, C7a' ) , 145, 32 (s, C2' ) , 151, 22 (s, C3' ) , 170, 95 (s, C2) ; MS m/e 277 (M+, 100 %) , 260 (87 %) , 247 (24 %) , 220 (14 %) , 205 (11) .
Anal . (C16H11N30z 0, 25 Ho0) C, H, N.
5-iodoindirubine-3'-oxime On opère comme décrit pour l'indirubine-3'-monoxime. En partant de 250 mg d'indirubine-3'-monoxime (0,644 mmole) et de 175 mg de chlorhydrate d'hydroxylamine (2,52 mmole) dans 7,5 ml de pyridine, on obtient un précipité. Le produit brut est lavé avec de l'eau et recristallisé à partir d'éthanol. On obtient 119 mg (45,9 %) de cristaux rouge, Rf - 8,50 (d'acétate éthyle/hexane 1/1 v/v) : 1H-RMN (DMSO-ds) 6, 73 (d, J = 6, 7, C7H) , 7, 09-7, 01 (m, C5'H), 7,44-7,40 (m, C6, C6'H, et C7'H), 8,26 (d, J - 7,6, C4'H), 8,90 (s, C4H), 10,79 (s) et 11,88 (s) (N1H et N1'H), 13,68 (s, NOH); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 83,69 (s, C5), 96,59 (s, C3), 110,89 (d, C7), 111,51 (d, C7'), 116,44 (s, C3a'), 121,77 (d, C5') 125,40 (s,C3a), 127,42 (d, C4'), 130,00 (d, C6), 131,52 (d, C6'), 133,40 (d, C4), 137,20 (s, C7a), 144,01 (s, C7a'), 146,68 (s, C2'), 151,52 (s, C3'), 170,25 (s, C2); MS m/e 403 (M+, 100), 387 (9) , 373 (10) , 276 (5) , 260 (46) . Anal. (C1~H12Nz02) C, H, N.
6-iodoindirubine On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 250 mg de 6-iodoisatine (0,92 mmole) et de 120 mg d'indoxylacétate (0,69 mmole), on obtient 182 mg (68,0 %) d'une poudre violette, Rf -0,47 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 8 7,01 (pt, J = 7,5, C5'H), 7,19 (s, C7H), 7,38 (m, C5H et C7"H), 7,56 (pt, J = 7,3, C6'H), 7,62 (d, J = 7,6, C4'H), 8,49 (d, J = 8,3, C4H) , 10, 93 (s) et 11, 03 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) b 94,60 (d, J = 10,4, C6), 105,57 (s, C3), 113,71 (d, J = 169,5, C7'), 118,05 (d, J - 167,1, C4'), 119,17 (s, C3a'), 121,24 (s,C3a), 121,65 (d, J = 163,4, C7), 124,56 (d, J = 163,4, C5'), 126,17 (d, J = 167,1, C4), 129,99 (d, J - 167,5, C5), 137,29 (d, J - 161,0, C6'), 139,07 (s, C7a'), 142,12 (s, C7a), 152,56 (s, C2'), 170,70 (s, C2), 188,83 (s, C3'); MS m/e 388 (M' , 100), 360 (9), 261 (15), 233 (53), 205 (53) , 127 (2) . Anal. (C16H9INz02) H, N. C . cale, 49, 5 %; trouvé
48,5 %.
1-méthylindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 200 mg de 1-méthylisatine (1,24 mmole) et 217 mg d'indoxylacétate (1,24 mmole), le produit brut est recristallisé à partir de pyridine et sublimé (140°C, sous vide), on obtient 195 mg (56,9 %) de billes claires légèrement violettes violettes; Rf = 0,88 (acétate d'éthyle/hexane 3/2 v/v: 1H-RMN (DMSO-ds) 8 3,29 (s, CH3), 7,02-7,12 (m, CSH, C7H, et C5'H), 7,35 (pt, C6H), 7,43 (d,J = 8,3, C7'H) , 7, 59 (pt, C6'H) , 7, 67 (d, J = 7, 6, C4'H) , 8, 81 (d, J = 7, 3, C4H), 11,07 (s, N1'H) ; MS m/e 276 (M', 100), 248 (25), 247 (54).
Anal . ( C1.,H12N202 ) C, H, N .
1-phénylindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 1-phénylisatine (2,24 mmole) et de 334 mg d'indoxylacétate (1,90 mmole), on obtient 597 mg (92,6 %) d'une poudre violette, RJ - 0,92 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v) . 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6,83 (pt, J = 7,3, C7H), 7,05 (pt, C5'H), 7,16 (pt, C5H), 7,29 (pt, C6H), 7,42 (d, J = 8,0, C7'H), 7,53-7,48 (m) et 7,64-7,58 (m) (C6'h et 5 phényl-H, 7,69 (d, J = 7,3, C4'H), 8,92 (d, J
7,6, C4H),11,17 (s, N1'H) ; l'C-R1~1 (DMSO-d6) 8 104,96 (s,C3),108,71 (s, C7), 113,48 (s, C7'), 118,96 (s, C3a'), 120,80 (s, C3a), 121,50 (d, J = 159,1, Hz), et 122,34 (d, J~,H = 160, 8, Hz) , (C5 et 124, 44 (d) et 124, 56 C5' ) , (d) (C6 et C4'), 126,75 (d, J = 161,5, C3"et C5"), 127,93 (d, J - 161,5, Hz)et 128,99 (d, J - 160,8 Hz) (C4 et C4"), 129,46 (d, J =161,5, C2"et C6"), 137,18 (d, J - 161,6, C6'), 139,11 (s) et 133,97 (s) (C7a' et C1"), 141,34 (s, C7a), 152,32 (s, C2' ) , 168, 36 (s, C2) , 188, (s, C3' ) ; MS m/e 388 100) 44 (M+, , 311 (13) , 310 (58) , 309 (39) Anal. (CzzH14N2~2) C. H, N.
acide 3'-hydroxyiminoidirubine-5-sulfonique (sel de sodium) On opère selon Lucius et al ci-dessus (méthode modifiée) avec 500 mg de sel de sodium de l'acide indirubine-5-sulfonique (0,644 mmole) et 400 mg de chlorhydrate d'hydroxylamine (5,76 mmole) dans 15 ml de pyridine. Le précipité produit en ajoutant 100 ml d'acide chlorhydrique et 20 ml d'une solution saturé de chlorure de sodium au mélange réactionnel est combiné au précipité obtenu à partir du filtrat, qui a été produit en ajoutant 15 ml d'une solution saturé de chlorure de sodium. Ce produit brut est recristallisé à partir d'eau. On obtient 170 mg l0 (34,0 %) de plaquettes noires à écailles, à nuance rouge, R~ -0,76 (éthanol): 1H-RMN (DMSO-ds) 8 6,82 (d, J = 8,1, C7H), 7,10-6,97 (m, C5'H), 7,41-7,39 (m, C6' et C7'), 7,48 (d, J - 7,9, C6H), 8,26 (d,J = 7,7, C4'H), 8,92 (s, C4H), 10,82 (s) et 11,80 (s) (N1H et N1'H) , 13, 79 (s, NOH) ; 13C-RMN (DMSO-d6) 8 98, 64 (s, l5 C3), 107,32 (d, J - 162,3, C7), 111,36 (d, J - 165,8, C7'), 116,59 (s, C3a'), 120,55 (d, J - 167,2, C5'), 121,42 (d, J
159,5, C6), 121,65 (s, C3a), 123,74 (d, J = 163,0, C4), 128,02 (d, J = 167,8, C4'), 131,84 (d, J = 158,8, C6'), 138,21 (s, ,C5), 140,87 (s, C7a), 144,53 (s, C7a'), 145,52 (s, C2'), 151,32 (s, 20 C3' ) , 171, 17 (s, C2) Anal. (C16H1oN3NaO2S) C, H, N.
indirubine-5-sulfonamide On opère comme décrit ci-dessus pour l'indirubine. En partant de 120 mg d'isatine-5-sulfonamide (0,530 mmole) et de 79 mg d'indoxylacétate (0,045 mmole), on obtient 79 mg (92,0 %) de 5-25 méthyly indirubine sous forme de poudre noire contenant 8% en masse d'indigo (l'indigo a été identifié par DC et 1H-RMN); Rf =
0, 79 (acétate d' éthyle) : 1H-RMr1 (DMSO-d6) 8 7, 04-7, 08 (m, C7H et C5'H), 7,23 (s,NH2), 7,44(d, J - 7,9, C7'H), 7,60 (pt, C6'H), 7,69 (d, J = 7,4, C6H), 7,74 (d, J = 8,1, C4'H), 9,31 (s, C4H), 30 11, 15 (s) et 11.25 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) 8 104, 92 (s, C3), 113,56 (d, J = 159,9, C7'), 119,01 (s, C3a'), 121,13 (s, C3a), 121,72 (d, J = 165,2, C5'), 122,27 (d, J= 169,8, C6), 124,44 (d, J= 164,5, C4'), 126,98 (d, J= 159,2, C4), 109,22 (d, J= 165, 2, C7) , 137, 24 (s, C5) , 137, 24 (d, J= 160, 5, C6' ) , 139, 32 (s, C7a'), 142,99 (s; C7a), 152,45 (s, C2'), 170,98 (s, C2), 188, 52 (s, C3' ) .
diméthylamide de l'acide indirubine-5-sulfonique On opère comme décrit ci-dessus pour l'indirubine. En partant de 397 mg de diméthylamide de l'acide isatine 5-sulfonique (1,56 mmole) et de 246 mg d'indoxylacétate (1,40 mmole), on obtient 240 mg (46,5 %) de l'acide recherché sous forme de poudre violette, R~= 0,39 (acétate d'éthyle/hexane 3/2 v/v): 1H-RMN
(DMSO-d6) 8 2, 65 (s, 2 CH3) , 7, 02-7, 13 (m, C7H et C5'H) , 7, 44 (d, J= 8,1, C7'H), 7,57-7,72 (m, C6H, C4'H, et C6'H), 9,21 (s, C4H), 11,18 (s) et 11,33 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 37,20 (q, J = 139,4,CH3,)104,16 (s, C3), 109,11 (d, J - 165,8, C7), 113,22 (d, J = 167,2, C7'), 118,71 (s, C3 a'), 121,36 (d, J =
165,1, C5'), 121,48 (s, C3a), 123,18 (d, J = 172,0, C6), 124,22 (d, J = 163,7, C4'), 127,64 (s, C5), 128,06 (d, J = 166,5, C49, 136,93 (d, J = 164,4, C6'), 139,34 (s, C7a'), 143,53 (s, C7a), 152,10 (s, C2'), 170,51 (s, C2), 188,37 (s, C3'); MS m/e 369 (M+, 83) , 326 (6) , 262 (84) , 261 (100) . Anal. (C18H15N304S) H, N;
C: calc, 58.5 %; trouvé, 57.8 %.
(2-hydroxyéthyl)-amide de l'acide indirubine-5 sulfonique On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 150 mg du (2-hydroxyêthyl)-amide de l'acide isatine-5-sulfonique (0,630 mmole) et de 83 mg d'indoxylacétate (0,47 mmole), on obtient 143 mg (78,9 %) du composé recherché sous forme de poudre violette;
Rf = 0, 62 (méthanol/ acétate d' éthyle 1/20 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 2, 84 (t, JfCH2, CH21} - 6, 5, visible en ajoutant D20, -N-CHZ-) , 3,40 (m, -CHZ-O), 4,67 (t, J = 4,6, OH), 7,07 (m, C7H et C5'H), 7,43 -7,46 (m, C7'H et S02-NH-; en ajoutant D20: 7,44, d, J -8, 1, C7'H) , 7, 61 (pt, C6,H) , 7, 69-7, 71 (m, C6H et C4' ) , 9, 27 (s, C4H), 11,18 (s) et 11,29 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 45, 00 (t, J= 138, 0, -NH-CH2) , 59, 85 (t, J= 141, 1, -CH2-OH) , 104,52 (s, C3), 109,44 (d, J-- 165,9, C7), 113,60 (d, J= 168,5, C7'), I18,92 (s, C3a'), 121,36 (s, C3a), 121,74 (d, J= 164,0, C5'), 122,95 (d, J= 162,4, C6), 124,52 (d, J= 159,6, C4'), 127,53 (d, 1J~,H - 165,9, C4), 133,20 (s, C5), 137,29 (d, J=
163,4, C6'), 139,44 (s, C7a'), 143,32 (s, C7a), 152,46 (s, C2'), 5 170, 87 (s, C2) , 188, 70 (s, C3' ) , MS m/e 385 (M+, 40) , 355 (48) , 325 (29) , 262 (35) , 261 (100) . Anal. (ClBHisN30sS) C, H, N.
bis-(2-hydroxyêthyl)-amide de l'acide indirubine-5-sulfonique On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 400 mg de bis-(2-hydroxyéthyl) amide de l'acide isatine-5-sulfonique bis
Lors de l'élaboration des médicaments, les principes actifs, utilisés en quantités thérapeutiquement efficaces, sont mélangés avec les véhicules pharmaceutiquement acceptables pour le mode d'administration choisi.
l0 Ainsi pour une administration par voie orale, les médicaments sont préparés sous forme de gélules, comprimés, dragées, capsules, pilules, gouttes et analogues. De tels médicaments peuvent renfermer de 1 à 100 mg de principe actif par unité.
1S Pour l'administration par voie injectable (intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire), les médicaments se présentent sous forme de solutions stériles ou stérilisables.
Les doses par unité de prise peuvent varier de 1 à 50 mg de principe actif. La posologie quotidienne est choisie de maniêre 20 à obtenir une concentration finale d'au plus 100 ~.M en dérivé
d'indirubine dans le sang du patient traité.
Afin d'illustrer l'invention, sans toutefois en limiter sa portée, on rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages.
25 Dans ces exemples, il sera fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent respectivement, - les figures 1A à 1C, les effets inhibiteurs d'indirubines utilisées selon l'invention vis-à-vis de GSK-3(3 , CDKS/p25 et CDK1/cycline B, 30 - la figure 2, l'effet compétiteur avec ATP pour la fixation à
GSK-3~i, et - la figure 3, l'effet inhibiteur par les indirubines, in vitro, de la phosphorylation de tau par GSK-3(3.
Caractérisation des indirubines Les analyses élémentaires ont été effectuées à l'aide d'un appareil d'analyse élémentaire de CHN Perkin-Elmer 2400.
Les spectres de RMN1H ont été enregistrés à 400 MHz, de RMN 1'C à
5 100 MHz sur un appareil Bruker AMX 400, avec comme référence interne du tétraméthylsilane. s désigne un singulet, d, un doublet et m, un multiplet. Les spectres de masse ont été pris selon le mode d'ions positifs sous impact électronique (EI 70) et avec un appareil Finingan MAT 90.
Exemples de synthèses d'indirubines indirubine L'indirubine est préparée selon Russell et al, J.Am.Chem.Soc.1969,91,3851-3859 (méthode modifiée) en utilisant 1,76 g (12,0 mmole) d'isatine et 2,00 g (11,4 mmole) d'indoxylacétate. Après filtration, le résidu est lavé 2 fois avec du méthanol, et plusieurs fois avec de l'eau froide, jusqu'à
neutralité du filtrat. Le produit est séché sur KOH. On obtient 2,42 g (81,0%) de cristaux violet sombre R~ - 0,64 (acétate d'éthyle hexane 1/1 v/v); PF 341-343 °C . 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6,91 (d, J = 8,1, C7H), 7,02 (m, C5H et C5'H), 7,26 (m,C6H), 7,42 (d, J = 8, 1, C7'H) , 7, 58 (m C6'H) , 7, 66 (d, J = C4'H) , 8, 77 (d, J
- 7, 7, C4H) , 11, O1 (s) et 10, 88 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RHIN (DMSO
-d6, 90°C) 8 106, 97 (s, C3) , 109, 57 (d, J = 162, 2, C7) , 113, 15 (d, J = 168,7, C7'), 119,37 = 162,1, Hz) (s, C3a'),121,21 (d, J et 121,19 (d, J - 162,1 Hz) (C5 et C5' ), 121,58 (s,C3a), 124,62 (d,J - 164,6, Hz) et 124,20 (d, J 163,8, z) (C6 C4'), - H et 129, 15 (d, J = 159, 8, C6' ) , 48 C4) , 136, 85 (d, J = 138, (s, 161, 4, C7a), 141,07 (s, C7a' ),152,35 (s, ), 171,11 (s, C2), 188,27 C2' (s, C3' ) ; MS m/e 262 (M+, 100) , 234 (43) , (25) , (4) Anal. (C16H10N2~2) C. H, N.
5-iodoindirubine On procède comme décrit pour l' indirubine . En partant de 655 mg de 5-iodoisatine (2,40 mmole) et de 399 mg d'indoxylacétate (2,28 mmole, la réaction conduit à 720 mg de produit brut. Par recristallisation à partir d'éthanol, on obtient 58 mg (6,2 ~) de cristaux violet sombre ; Rf - 0,68 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v); PF 334-335 °C . 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6,75 (d, J = 8,1, C7H), 7,04 ;1H (m, C5'H), 7,42 (d, J = 8,1, C7'H), 7,57 (m, C6H
et C6'H), 7,65 (d, J = 7,5, C4'H), 9,11 (s, C4H), 11,00 (s) et 11, 09 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RMN (DMSO -ds, 90°C) 8 83, 73 (d, J =
16,9, C5), 105,18 (s, C3), 111,85 (d, J - 164,6, C7), 113,43 (d, J = 167, 2, C7' ) , 119, 27 (s, C3a' ) , 121, 65 (d, J = 163, 6, C5' ) , 124,03 (s, C3a), 124,44 (d, J = 163,9, Hz, C4'), 132,49 (d, J =
171,2, C6), 137,00 (d, J = 166,9, Hz) et 137,15 (d, J = 160,1 Hz) (C4 et C6'), 139,26 (s, C7a'), 140,44 (s,C7a), 152,41 (s, C2' ) , 170, 48 (s, C2) , 188, 54 (s, C3' ) ; MS m/e 388 (M+, 100) , 360 (3) , 261 (6) , 233 (16) , 205 (16) . Anal. (C16H9INZO2) C, H, N.
5-bromoindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 1,30 g de 5-bromoisatine (5,75 mmole) et de 1,00 g d'indoxylacétate (5,71 mmole), le produit brut est recristallisé à partir de pyridine et conduit à 1,16 g (59,3 ~) de cristaux noirs avec une nuance violette; R~ - 0,49 (acétate d'éthyle hexane 1/1 v/v) 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6, 86 (d, J = 8, 4, C7H) , 7, 05 (pt, C5'H) , 7, 41-7,31 (m, C6H et C7'H), 7,59 (m,C6'H), 7,66 (d, J = 7,5, C4'H), 8, 94 (s, C4H) , 11,.10 (s) et 11, 00 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RMN
(DMSO -d6, 90°C) 8 104,92 (s, C3), 111,24 (d,J - 165,1, C7), 112,89 (s, C5), 113,53 (d, J 167,8, C7'), 118,92 (s,C3a'), 121, 64 (d, J = 164, 4, C5' ) , 123, 41 (s, C3a) , 124, 49 (d, J = 164, 0, C4'), 126,60 (d, J = 171,3, C6), 131,03 (d, 167,1, C4), 137,29 (d, J = 160,9, C6'), 139,16 (s, C7a'), 139,74 (s,C7a), 152,42 (s, C2' ) , 170, 50 (s, C2) , 188, 77 (s, C3' ) ; MS m/e 342 (M+, 100) , 340 (M+, 100) 314 (18) , 312 (18) , 261 (7) . Anal. (C16H9BrNz02) C, H, N.
5-chloroindirubine On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 5-chloroisatine (2,75 mmole) et de 480 mg d'indoxylacétate (2,73 mmole), on obtient 766 mg (94,6 ~) d°une poudre violette, RI -0, 60 (acétate d' éthyle /hexane 1/1 v/v) . 1H-RMN (DMSO-ds) 8 6, 89 (d, J = 8, 3, C7H) , 7, 04 (m, C5'H) , 7, 27 (d, J = 8, 3, C6'H) , 7, 42 (d, J = 7, 8, C7'H) , 7, 58 (m, C6'H) , 7, 65 (d, J = 7, 6, C4'H) , 8, 78 (s,C4H), 10,99 (s) et 11,09 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN (DMSO-ds) 8 104,95 (s, C3), 110,61 (d,J = 164,6, C7), 113,50 (d, J = 168,6, C7'), 118,85 (s, C3a'), 121,54 (d, J = 165,4, C5'), 122,85 (s, C3a), 123,76 (d, J = 170,2 Hz) et 124,41 (d, J = 163,8 Hz) (C6 et C4'),125,00 (s,C5), 128,16 (d, J = 167,0, C4), 137,21 (d, J =
159, 8, C6' ) , 139, 10 (s) et 139, 31 (s) ( C7a et C7a' ) , 152, 39 (s, C2'), 170,52 (s, C2), 188,72 (s, C3') ; MS m/e 296 (M+ , 100), 268 (39) ; 233 (35) , 205 (50) . Anal. (C16H9CINz02) C, H, N.
5-fluroroindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 5-fluoroisatine (3,03 mmole) et de 530 mg d'indoxylacé~tate (3,00 mmole), on obtient 776 mg (92,4 )d'une poudre violette, Rf - 0,32 (acétate d'éthyle/ hexane 1/2 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6,87 (dd, JH,x = 8, 3, JH,H = 4, 7 C7H) , 7, 10-7, O1 (m, C6H et C5'H) , 7, 42 (d, J = 8,2, C7'H), 7,58 (pt, C6'H), 7,65 (d, J = 7,4, C4'H), 8, 56 (d, JF,H _ 10, 6, C4H) , 11, 00 (b,NlH et N1'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) 8 305, 93 (s, C3) , 110, 13 (dd, J~,H - 163, 5, J~,F - 8, 7, C7) , 111, 34 (dd, J~,H = 169, 3, J~,F = 27, 6, C6) , 113, 57 (d, J = 162, 0, C7' ) , 115, 24 (dd, J~,H = 188, 9, J~,F = 24, 7, C4) 118, 98 (s, C3a' ) , 121, 64 (d, J = 164, 2, C5' ) , 122, 41 (d, J~,F = 10, 8, C3a) , 124, 56 (d, J = 163, 5, C4' ) , 137,31 (s, C7a) 137, 36 (d, J = 162,8, C6'), 139,12 (s, C7a') 152,60 (s, C2'), 157,40 (d, J~,F = 233,2, C5), 171,02 (s, C2), 188,96 (s, C3') ; MS m/e 280 (M+ , 100) , 252 (73) , 223 (32) . Anal. (C16H9FNz02) C, H, N.
5-méthylindirubine On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 5-méthylisatine (3,10 mmole) et 540 mg d'indoxylacétate (3,07 mmole), on obtient 781 mg (92,0 %) d'une poudre violette, Rj -0,44 (acétate d'éthyle/hexane 1/2 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 8 2,33 (s, CH3), 7,08-7,0 (m, C6H et C5'H), 6,79 (d, J = 7,9, C7H), 7,42 (d, J = 7,9, C7'H), 7,58 (pt, C6'H), 7,64 (d, J = 7,6, C4'H), 8,63 (s,C4H), 10,79 (s) et 11,00 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN
(DMSO-d6) b 20,99 (g,J = 126,5, CH3), 106,79 (s, C3), 109,17 (d, J = 161,3, C7), 113,33 (d, J = 168,5, C7'), 119,94 (s, C3a'), 121,09 (d, J = 164,4 C5') 121,45 (s,C3a), 124,19 (d, J = 163,7, C4'), 125,11 (d, J - 164,4, C6), 129,72 (d, J - 157,4, C4), 129,72 (s, C5) 136,96 (d, J = 161,6, C6'), 138,08 (s) et 138,65 (s) (C7a et C7a'), 152,38(s, C2'), 171,93 (s, C2), 188,49 (s, C3' ) ; MS m/e 276 (M' , 100) , 261 (10) , 248 (47) , 247 (53) . Anal.
( Cl~HIaNzOa ) C. H. N .
5-nitroindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 1,00 g de 5-nitroisatine (5,20 mmole) et 900 mg d'indoxylacétate (5,14 mmole), on obtient 1,39 g (88,2 %) d'une poudre violette, Rf=
0, 16 (d' éthyle acétate/hexane 34 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 7, O1 (d, J - 8,7, C7H), 7,05 (pt, C5'H), 7,40 (d, J - 8,1, C7'), 7,58 (pt, C6'H), 7,64 (d, J - 7,5, C4'H), 8,13 (d, J = 8,7, C6H), 9,60 (s,C4H), 11,15 (s) et 11,49 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN
(DMSO-d6) 8 103, 51 (s, C3) , 109, 27 (d, J = 167, 8, C7) , 113, 68 (d, J - 167,8, C7'), 118,83 (s, C3a'), 119,48 (d, J - 167,8 C6) 121, 59 (s, C3a) , 121, 97 (d, J = 163, 0, C5' ) , 124, 60 (d) et 124, 69 (d) (C4 et C4'), 137,37 (d, J - 161,6, C6'), 139,97 (s, C5) 136,96 (d, J - 161,6, C6'), 138, (s) et 138,65 (s, C7a'), 141, 63 (s, C5) , 145, 71 (s, C7a) , 152, 38 (s, C2' ) , 170, 93 (s, C2) , 188, 78 (s, C3' ) ; MS m/e 307 (M+ , 100) , 276 (10) , 262 (100) , 234 (23) . Anal. (C16H9N304) C, H, N.
acide indirubine-5-sulfonique (sel de sodium) On opêre comme décrit pour l'indirubine. En partant de 250 mg du sel de sodium dihydraté de l'acide isatine-5-sulfonique (1,00 mmole) et de 170 mg d'indoxylacétate (0,971 mmole), on obtient 258 mg (70,8 %) d'un solide violet, Rf - 0,73 (éthanol): 1H-RMN
(DMSO-ds) 8 6,84 (d, J = 8,0, C7H), 7,04 (m, C5'H), 7,43 (d, J =
8, 0, C7'H) , 7, 54-7, 61 (m, C4'H et C6'H) , 7, 67 (d, J = 7, 4, C6H) , 9,13 (s,C4H), 10,99 (s) et 11,05 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN
(DMSO-d6) 8 106,25 (s, C3), 108,20 (d, J = 163,3, C7), 113,39 (d, J = 168,6, C7'), 120,50 (s) et 118,98 (s) (C3a et C3a'), 121,28 (d, J = 157, 9 C5' ) 122, 57 (d, J = 169,4, C6), 124,27 (d, J = 165,6, C4'), 126,83 (d, J = 163,3, C4), 137,02 (d, J = 161,0, C6'), 138,45 (s, C5), 140,89 (s) et 141,64 (s) (C7a et C7a'), 152,39 (s, C2'), 171,14 (s, C2) , 188, 33 (s, C3' ) . Anal. (C16H9NzNaOSS 1, 5 Hz0) C, H, N.
5'-bromoindirubine On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 59 mg d'isatine (0,40 mmole) et de 100 mg de 5-bromo-indoxylacétate (0,394 mmole), on obtient 123 mg (92,6 %) d'une poudre violette, Rf - 0,59 (acétate d'éthyle/hexane 1/l v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 6,89 (d, J = 7,8, C7H), 7,02 (pt, C5H), 7,26 (pt, C6H), 7,39 (d, J = 8,5, C7'H); 7,71 (d, J = 8,5, C6'H), 7,76 (s,C4'H), 8,73 (d, J - 7, 8, C4H) , 10, 89 (s) et 11, 08 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RMN
(DMSO-ds) 8 107,43 (s, C3), 109,54 (d, J = 161,4, C7), 112,63 (s, C5'), 115,49 (d, J = 169,4, C7'), 120,64 (s) et 121,20 (s) (C3a et C3a'), 121,20 (d, J = 160,0 C5) 124,69 (d, J = 154,5, C6), 126,31 (d, J = 163,0, C4'), 129,56 (d, J = 159,0, C4), 137,69 (s, C7a') 138,87 (d, J = 166,1, C6'), 141,05 (s, C7a), 151,23 (s, C2'), 170,64 (s, C2), 187,15 (s, C3'); MS m/e 342 (M+, 100), 340 (M+, 100),314 (16), 312 (16), 261 (1), 233 (44). Anal.
(C16H9BrNz02) H, N , C: calc, 56, 3; trouvé, 55, 7.
5,5'-dibromoindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 89 mg de 5-bromoisatine (0,39 mmole) et de 100 mg de 5-bromo-indoxylactate (0,394 mg (94,0 ~) d'une mmole), on obtient poudre violette: (DMSO-d6) 8 6, 84 (d, = 8, l, C7H) , 7, 7,36 (m, C6H et 7,71 (d, J = 8,5, C6'H), C7'H), 7,76 (s,C4'H), 8,88 (s, C4H), 11,01 et 11,16 (s) (N1H et N1'H); MS m/e 422 (s) (M+, 47) , 420 (M+, 100)418 (M', 48) , 394 392 (7) , 390 (3) , (3) , , 342 (25) , 340 (25) , (15) , 311 (15) . Anal.(C16HBBr2N2O2) C, 313 H, N.
acide 5'-bromoindirubine-5-sulfonique (sel de sodium) On procède comme décrit pour l' indirubine . En partant de 224 mg l0 de sel de sodium dihydraté de l'acide isatine-5-sulfonique (0,787 mmole) et de 190 mg de 5-bromo-indoxylacétate(0,748 mmole ) , on obtient 2 04 mg ( 56 , 9 ~ ) d' une poudre violette : 1H-RMN
(DMSO-d6) 8 6,82 (d, J = 8,0, C7H), 7,40 (d, J = 8,5, C7'H), 7,55 (d, J = 8,0, C6H), 7,73 (d, J = 8,5, C6'H), 7,79 (s,C4'H), 9,09 (s, C4H), 11,11 (b,NlH et N1'H) . Anal. (Cl6HaBr2N2NaO5S2H20) H, N, C: calc, 40,1 ; trouvé 39,6.
indirubine-3'-monoxime On prépare ce composé comme décrit Farbwerke vorm. Meilster Lucius & Brüning in Hoechst a.M. Verfahren zur Herstellung von Derivaten der Indirubine. DRP 283726. Le produit brut est recristallisé à partir d'éthanol/eau (7/2, v/v). On obtient le composé recherché sous forme de cristaux rouge sombre, R~ = 0,55 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN (DMSO-ds) 8 6,90 (d, J
- 7,9, C7H), 7,42 (d, J = 7,9, C7'H), 7,58 (pt, C6'H), 7,64 (d, J = 7,6, C7H), 6,95 (m, C5H), 7,03 (m " C5'H), 7,13 (m, C6H), 7,41 (m, C6'H et C7'H), 8,24 (d, J = 7,2, C4H), 8,65 (d, J =
7,2, C4H) 10,72 (s) et 11,73 (s) (N1H et N1'H), 13,48 (s, NOH) ;
13C-RMN (DMSO-ds) 8 98,88 (s, C3), 108,91 (d, J - 162,3, C7), 111,52 (d, J = 165,8, C7'), 116,54 (s, C3a'), 120,43 (d, 160,2, C5'), 121,49 (d, J = 161,6 C5) 122,66 (s,C3a), 123,09 (d, J =
165;1, C6), 125,92 (d, J = 154,0, C4), 127,95 (d, J - 164,4, C4'), 132,02 (d, J = 159,5, C6'), 138,34 (s, C7a), 144,83 (s, C7a' ) , 145, 32 (s, C2' ) , 151, 22 (s, C3' ) , 170, 95 (s, C2) ; MS m/e 277 (M+, 100 %) , 260 (87 %) , 247 (24 %) , 220 (14 %) , 205 (11) .
Anal . (C16H11N30z 0, 25 Ho0) C, H, N.
5-iodoindirubine-3'-oxime On opère comme décrit pour l'indirubine-3'-monoxime. En partant de 250 mg d'indirubine-3'-monoxime (0,644 mmole) et de 175 mg de chlorhydrate d'hydroxylamine (2,52 mmole) dans 7,5 ml de pyridine, on obtient un précipité. Le produit brut est lavé avec de l'eau et recristallisé à partir d'éthanol. On obtient 119 mg (45,9 %) de cristaux rouge, Rf - 8,50 (d'acétate éthyle/hexane 1/1 v/v) : 1H-RMN (DMSO-ds) 6, 73 (d, J = 6, 7, C7H) , 7, 09-7, 01 (m, C5'H), 7,44-7,40 (m, C6, C6'H, et C7'H), 8,26 (d, J - 7,6, C4'H), 8,90 (s, C4H), 10,79 (s) et 11,88 (s) (N1H et N1'H), 13,68 (s, NOH); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 83,69 (s, C5), 96,59 (s, C3), 110,89 (d, C7), 111,51 (d, C7'), 116,44 (s, C3a'), 121,77 (d, C5') 125,40 (s,C3a), 127,42 (d, C4'), 130,00 (d, C6), 131,52 (d, C6'), 133,40 (d, C4), 137,20 (s, C7a), 144,01 (s, C7a'), 146,68 (s, C2'), 151,52 (s, C3'), 170,25 (s, C2); MS m/e 403 (M+, 100), 387 (9) , 373 (10) , 276 (5) , 260 (46) . Anal. (C1~H12Nz02) C, H, N.
6-iodoindirubine On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 250 mg de 6-iodoisatine (0,92 mmole) et de 120 mg d'indoxylacétate (0,69 mmole), on obtient 182 mg (68,0 %) d'une poudre violette, Rf -0,47 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 8 7,01 (pt, J = 7,5, C5'H), 7,19 (s, C7H), 7,38 (m, C5H et C7"H), 7,56 (pt, J = 7,3, C6'H), 7,62 (d, J = 7,6, C4'H), 8,49 (d, J = 8,3, C4H) , 10, 93 (s) et 11, 03 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) b 94,60 (d, J = 10,4, C6), 105,57 (s, C3), 113,71 (d, J = 169,5, C7'), 118,05 (d, J - 167,1, C4'), 119,17 (s, C3a'), 121,24 (s,C3a), 121,65 (d, J = 163,4, C7), 124,56 (d, J = 163,4, C5'), 126,17 (d, J = 167,1, C4), 129,99 (d, J - 167,5, C5), 137,29 (d, J - 161,0, C6'), 139,07 (s, C7a'), 142,12 (s, C7a), 152,56 (s, C2'), 170,70 (s, C2), 188,83 (s, C3'); MS m/e 388 (M' , 100), 360 (9), 261 (15), 233 (53), 205 (53) , 127 (2) . Anal. (C16H9INz02) H, N. C . cale, 49, 5 %; trouvé
48,5 %.
1-méthylindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 200 mg de 1-méthylisatine (1,24 mmole) et 217 mg d'indoxylacétate (1,24 mmole), le produit brut est recristallisé à partir de pyridine et sublimé (140°C, sous vide), on obtient 195 mg (56,9 %) de billes claires légèrement violettes violettes; Rf = 0,88 (acétate d'éthyle/hexane 3/2 v/v: 1H-RMN (DMSO-ds) 8 3,29 (s, CH3), 7,02-7,12 (m, CSH, C7H, et C5'H), 7,35 (pt, C6H), 7,43 (d,J = 8,3, C7'H) , 7, 59 (pt, C6'H) , 7, 67 (d, J = 7, 6, C4'H) , 8, 81 (d, J = 7, 3, C4H), 11,07 (s, N1'H) ; MS m/e 276 (M', 100), 248 (25), 247 (54).
Anal . ( C1.,H12N202 ) C, H, N .
1-phénylindirubine On procède comme décrit pour l'indirubine. En partant de 500 mg de 1-phénylisatine (2,24 mmole) et de 334 mg d'indoxylacétate (1,90 mmole), on obtient 597 mg (92,6 %) d'une poudre violette, RJ - 0,92 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v) . 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6,83 (pt, J = 7,3, C7H), 7,05 (pt, C5'H), 7,16 (pt, C5H), 7,29 (pt, C6H), 7,42 (d, J = 8,0, C7'H), 7,53-7,48 (m) et 7,64-7,58 (m) (C6'h et 5 phényl-H, 7,69 (d, J = 7,3, C4'H), 8,92 (d, J
7,6, C4H),11,17 (s, N1'H) ; l'C-R1~1 (DMSO-d6) 8 104,96 (s,C3),108,71 (s, C7), 113,48 (s, C7'), 118,96 (s, C3a'), 120,80 (s, C3a), 121,50 (d, J = 159,1, Hz), et 122,34 (d, J~,H = 160, 8, Hz) , (C5 et 124, 44 (d) et 124, 56 C5' ) , (d) (C6 et C4'), 126,75 (d, J = 161,5, C3"et C5"), 127,93 (d, J - 161,5, Hz)et 128,99 (d, J - 160,8 Hz) (C4 et C4"), 129,46 (d, J =161,5, C2"et C6"), 137,18 (d, J - 161,6, C6'), 139,11 (s) et 133,97 (s) (C7a' et C1"), 141,34 (s, C7a), 152,32 (s, C2' ) , 168, 36 (s, C2) , 188, (s, C3' ) ; MS m/e 388 100) 44 (M+, , 311 (13) , 310 (58) , 309 (39) Anal. (CzzH14N2~2) C. H, N.
acide 3'-hydroxyiminoidirubine-5-sulfonique (sel de sodium) On opère selon Lucius et al ci-dessus (méthode modifiée) avec 500 mg de sel de sodium de l'acide indirubine-5-sulfonique (0,644 mmole) et 400 mg de chlorhydrate d'hydroxylamine (5,76 mmole) dans 15 ml de pyridine. Le précipité produit en ajoutant 100 ml d'acide chlorhydrique et 20 ml d'une solution saturé de chlorure de sodium au mélange réactionnel est combiné au précipité obtenu à partir du filtrat, qui a été produit en ajoutant 15 ml d'une solution saturé de chlorure de sodium. Ce produit brut est recristallisé à partir d'eau. On obtient 170 mg l0 (34,0 %) de plaquettes noires à écailles, à nuance rouge, R~ -0,76 (éthanol): 1H-RMN (DMSO-ds) 8 6,82 (d, J = 8,1, C7H), 7,10-6,97 (m, C5'H), 7,41-7,39 (m, C6' et C7'), 7,48 (d, J - 7,9, C6H), 8,26 (d,J = 7,7, C4'H), 8,92 (s, C4H), 10,82 (s) et 11,80 (s) (N1H et N1'H) , 13, 79 (s, NOH) ; 13C-RMN (DMSO-d6) 8 98, 64 (s, l5 C3), 107,32 (d, J - 162,3, C7), 111,36 (d, J - 165,8, C7'), 116,59 (s, C3a'), 120,55 (d, J - 167,2, C5'), 121,42 (d, J
159,5, C6), 121,65 (s, C3a), 123,74 (d, J = 163,0, C4), 128,02 (d, J = 167,8, C4'), 131,84 (d, J = 158,8, C6'), 138,21 (s, ,C5), 140,87 (s, C7a), 144,53 (s, C7a'), 145,52 (s, C2'), 151,32 (s, 20 C3' ) , 171, 17 (s, C2) Anal. (C16H1oN3NaO2S) C, H, N.
indirubine-5-sulfonamide On opère comme décrit ci-dessus pour l'indirubine. En partant de 120 mg d'isatine-5-sulfonamide (0,530 mmole) et de 79 mg d'indoxylacétate (0,045 mmole), on obtient 79 mg (92,0 %) de 5-25 méthyly indirubine sous forme de poudre noire contenant 8% en masse d'indigo (l'indigo a été identifié par DC et 1H-RMN); Rf =
0, 79 (acétate d' éthyle) : 1H-RMr1 (DMSO-d6) 8 7, 04-7, 08 (m, C7H et C5'H), 7,23 (s,NH2), 7,44(d, J - 7,9, C7'H), 7,60 (pt, C6'H), 7,69 (d, J = 7,4, C6H), 7,74 (d, J = 8,1, C4'H), 9,31 (s, C4H), 30 11, 15 (s) et 11.25 (s) (N1H et N1'H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) 8 104, 92 (s, C3), 113,56 (d, J = 159,9, C7'), 119,01 (s, C3a'), 121,13 (s, C3a), 121,72 (d, J = 165,2, C5'), 122,27 (d, J= 169,8, C6), 124,44 (d, J= 164,5, C4'), 126,98 (d, J= 159,2, C4), 109,22 (d, J= 165, 2, C7) , 137, 24 (s, C5) , 137, 24 (d, J= 160, 5, C6' ) , 139, 32 (s, C7a'), 142,99 (s; C7a), 152,45 (s, C2'), 170,98 (s, C2), 188, 52 (s, C3' ) .
diméthylamide de l'acide indirubine-5-sulfonique On opère comme décrit ci-dessus pour l'indirubine. En partant de 397 mg de diméthylamide de l'acide isatine 5-sulfonique (1,56 mmole) et de 246 mg d'indoxylacétate (1,40 mmole), on obtient 240 mg (46,5 %) de l'acide recherché sous forme de poudre violette, R~= 0,39 (acétate d'éthyle/hexane 3/2 v/v): 1H-RMN
(DMSO-d6) 8 2, 65 (s, 2 CH3) , 7, 02-7, 13 (m, C7H et C5'H) , 7, 44 (d, J= 8,1, C7'H), 7,57-7,72 (m, C6H, C4'H, et C6'H), 9,21 (s, C4H), 11,18 (s) et 11,33 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 37,20 (q, J = 139,4,CH3,)104,16 (s, C3), 109,11 (d, J - 165,8, C7), 113,22 (d, J = 167,2, C7'), 118,71 (s, C3 a'), 121,36 (d, J =
165,1, C5'), 121,48 (s, C3a), 123,18 (d, J = 172,0, C6), 124,22 (d, J = 163,7, C4'), 127,64 (s, C5), 128,06 (d, J = 166,5, C49, 136,93 (d, J = 164,4, C6'), 139,34 (s, C7a'), 143,53 (s, C7a), 152,10 (s, C2'), 170,51 (s, C2), 188,37 (s, C3'); MS m/e 369 (M+, 83) , 326 (6) , 262 (84) , 261 (100) . Anal. (C18H15N304S) H, N;
C: calc, 58.5 %; trouvé, 57.8 %.
(2-hydroxyéthyl)-amide de l'acide indirubine-5 sulfonique On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 150 mg du (2-hydroxyêthyl)-amide de l'acide isatine-5-sulfonique (0,630 mmole) et de 83 mg d'indoxylacétate (0,47 mmole), on obtient 143 mg (78,9 %) du composé recherché sous forme de poudre violette;
Rf = 0, 62 (méthanol/ acétate d' éthyle 1/20 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 2, 84 (t, JfCH2, CH21} - 6, 5, visible en ajoutant D20, -N-CHZ-) , 3,40 (m, -CHZ-O), 4,67 (t, J = 4,6, OH), 7,07 (m, C7H et C5'H), 7,43 -7,46 (m, C7'H et S02-NH-; en ajoutant D20: 7,44, d, J -8, 1, C7'H) , 7, 61 (pt, C6,H) , 7, 69-7, 71 (m, C6H et C4' ) , 9, 27 (s, C4H), 11,18 (s) et 11,29 (s) (N1H et Nl'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 45, 00 (t, J= 138, 0, -NH-CH2) , 59, 85 (t, J= 141, 1, -CH2-OH) , 104,52 (s, C3), 109,44 (d, J-- 165,9, C7), 113,60 (d, J= 168,5, C7'), I18,92 (s, C3a'), 121,36 (s, C3a), 121,74 (d, J= 164,0, C5'), 122,95 (d, J= 162,4, C6), 124,52 (d, J= 159,6, C4'), 127,53 (d, 1J~,H - 165,9, C4), 133,20 (s, C5), 137,29 (d, J=
163,4, C6'), 139,44 (s, C7a'), 143,32 (s, C7a), 152,46 (s, C2'), 5 170, 87 (s, C2) , 188, 70 (s, C3' ) , MS m/e 385 (M+, 40) , 355 (48) , 325 (29) , 262 (35) , 261 (100) . Anal. (ClBHisN30sS) C, H, N.
bis-(2-hydroxyêthyl)-amide de l'acide indirubine-5-sulfonique On opère comme décrit pour l'indirubine. En partant de 400 mg de bis-(2-hydroxyéthyl) amide de l'acide isatine-5-sulfonique bis
10 (2-hydroxyéthyl) amide (1,27 mmole) et 167 mg d'indoxyl acétate (0,953 mmole),on obtient 355 mg (86,7 %) de l'amide mentionné
ci-dessus sous forme de poudre violette, Rf - 0,51 (méthanol/
acétate d' éthyle 1/20 v/v) : 1H-RMN (DMSO-ds) 8 3, 20 (t, J = 6, 5, 2 -N-CH2) , 3, 56 (m, 2 -CH20-) , 4, 84 (t, J = 5, 5, 2 -OH) , 7, 09-15 7,05 (m, C7H et C5'H), 7,72-7,68 (m, C6H et C4'), 7,45 (d, J--8,0, C7'H), 7,61 (m, C6'), 9,26 (s, C4H), 11,18 (s) et 11,32 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN (DMSO-d6) b 51,32 (t, J= 135,0, 2 -NH-CHz), 60,01 (t, J= 141,0, 2 -CH2-OH), 104,31 (s, C3), 109,48 (d,.J =
165,3, C7), 113,62 (d, J = 168,5, C7'), 118,91 (s, C3a'), 121,69 20 (s, C3a) , 121, 79 (d, J = 164, 0, C5' ) , 122, 88 (d, J = 162, 4, C6) , 124,64 (d, J = 162,7, C4'), 127,98 (d, J = 165,2, C4), 131,51 (s, C5), 137,32 (d, J = 160,1 Hz,C6'), 139,61 (s, C7a'), 143,59 (s, C7a), 152,48 (s, C2'), 170,81 (s, C2), 188,87 (s, C3'); MS
m/e 429 (M+, 9) , 369 (22) , 365 (22) , 355 (63) , 261 (31) , 43 (100) . Anal. (CZOH19N3O6S) C, H, N.
méthylamide de l'acide indirubine-5-sulfonique On opère comme décrit ci-dessus pour l'indirubine. En partant de 380 mg du méthylamide de l'acide isatine-5-sulfonique (1,58 mmole) et de 227 mg d'indoxylacétate (1, 30 mmole), on obtient 370 mg (80,1 %) de l'amide ci-dessus sous forme d'une poudre violette, Rf - 0,72 (acêtate d'éthyle): 1H-RMN (DMSO-ds) 8 2,46 (d, J= 5, 0, CH3) , 7, 05-7, 09 (m, C7H et C5'H) , 7, 32 (q, NH-CH3) , 7,45 (d, J= 8,3, C7'H), 7,61 (m, C6'H), 7,67-7,71 (m, C6H et C4'), 9,27 (s, C4H), 11,18 (s) et 11,30 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 28,65 (q, J - 13 8,7, CH3), 104,48 (s, C3), 109,41 (d, J= 165,7, C7), 113,58 (d, J-- 165,7, C7'), 118,90 (s, C3a'), 121,42 (s, C3a), 121,73 (d, J = 171,0, C5'), 123,13 (d, J = 164,5, C6), 124,50 (d, J = 159,8, C4'), 127,61 (d, J =
165,7. C4),131,93 (s, C5), 137,28 (d, J= 160,6, C6'), 139,43 (s, C7a'), 143,36 (s, C7a), 152,45 (s, C2'), 170,85 (s, C2), 188,68 (s, C3'); MS m/e 255 (M+, 15), 263 (18), 262 (100), 261 (7).
Anal . ( C1~H13N3~4'S ) C, H, N.
5-iodoisatine On opêre comme décrit par Roedig, Mueller E. (Hrsg.), Methoden der organishen Chemie (Houbeyn-Weyl), Stuttgart, Georg Thieme Verlag 1960,5/4, 586, et Borsche et al Chem.Ber.1924, 1770-1775, Rf = 0,60 (acétone/éther de pétrole 40-70 1/1 v/v); PF 262 °C: 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6,75 (d, J - 8,3, C7H), 7,75 (s, C4H), 7, 78 (d, J = 8, 2, C6H) , 11, 09 (b, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-ds) 8 85, 39 (s, C5), 114,59 (d, J= 167, 1, C7),119,89 (d, J-- 7,2, C3a), 132,38 (d,J--170,3 , C4), 145,76 (d, J = 167,1, C6), 145,76 (d, J
- 167,1, C6), 149,95 (b, C7a), 158,66 (s, C2), 183,06 (s, C3);
MS m/e 262 (M+, 100) , 234 (43) .
diméthylamide de l'acide isatine-5-sulfonique On opère comme décrit par Haller, brevet DE 715760, 1938, Rf = 0, 18 (acétate d' éthyle /hexane 1 /1 v/v) : 1H-RMN (DMSO-ds) 8 2,62 (s, 2 CH3), 7,12 (d, J 8,2, C7H), 7,71 (s, C4H), 7,94 (d, J
- 8, 2, C6H) , 11, 47 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-ds) 8 182, 89 (s, C3) , 159,37 (s, C2), 153,60 (s, C7a), 136,98 (d, J = 167,32, C6), 128,62 (s, C5), 123,27 (d,J = 169,2, C4), 118,05 (s, C3a), 112,68 (d, J-- 169,2, C7), 37,48 (q, J-- 140,1, 2 CH3 ) . Anal . ( CloHION2O4S ) C, H, N .
bis-(2-hydroxyéthyl)-amide de l' acide isatine-5-sulfonique On opêre comme décrit par Haller ci-dessus en partant de 526 mg de bis-(2-hydroxyéhyl)-amine (5,00 mmole) et de 1,00 g de 3,3-dichloro-2-oxo-2.3-dihydroindol-5-sulfonyle ( voir Haller ci-dessus) (3,34 mmole). Le précipité qui se forme est huileux et boueux. On décante le surnageant, puis on mélange le précipité
et le surnageant avec 5 ml d'eau. On porte à reflux 2 h. En refroidissant, on obtient un précipité de cristaux rouge.
Rendement: 476 mg (45,3 g), Rf = 0,51 (méthanol/acétate d'éthyle 1/20 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 2, 78 (t, J = 6, 2, 2 -N-CHZ-) , 3, 38 (t, J = 6,2, 2-CHz-O-),7,08 (d, J = 8,2, C7), 7,78 (s, C4), 7,96 (d, J= 8, 2, C6) , 11, 43 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) 8 50, 73 (t, J =
l0 138, 8, 2 -N-CHz-) , 59, 64 (t, J = 141, 7, 2 -CHZOH-) , 112, 57 (d, J =
168,6, C7), 117,91 (s, C3a), 122,78 (d, J= 169,3, C4), 133,29 (s, C5), 136,44 (d, J= 166,4, C6), 153,28 (s, C7a), 159,37 (s, C2) , 182, 95 (s, C3) . Anal. ( C12H14NzO6S) C, H, N.
6-lodoisatine On opêre comme décrit par Marvel et al , Organic Syntheses, Coll. Vol. l, 2ad ed.; Gilman,H Ed.; Wiley& Sons: New York, 1941, 327-330, en utilisant 1,50 g de 2-hydroxyimino-N-(3-iodophényl)-acétamide (5,17 mmole) et 3,9 ml d'acide sulfurique concentré.
Après filtration, le produit brut, formé d'un mélange de 4-et 6-iodoisatine et de sous-produits, est purifié selon Sadler, J.Org.Chem. 1956, 21, 169-170 et Holt et al, Proc.R.Soc. London B 1958, 148, 481-494. On obtient 216 mg (15,0 %) de cristaux orange; PF 255-258 °C; Rf - 0,76 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 8 7,25 (m, C4H et C7H), 7,45 (d, J-- 7,6, C5H), 11,07 (s, N1H); 13C-RMN (DMSO-d6) b 107,28 (d, J-- 10,4, C6), 117,41 (s, C3a), 120,83 (d, J = 170,3, C7), 125,84 (d, J =
173,7, C4), 131,82 (d, J = 167,9, C5), 151,30 (s, C7a), 159,35 (s, C2) , 183, 79 (s, C3) . Anal. (C8H4IN0z) C, H, N.
isoindigo On opère comme décrit par Wahl et al, Compte rendus hebdomadaires des séances de l'académie des sciences, 1909, 716-19 et 4(5), 1039-43:Rf - 0,67 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN
(DMSO-ds) 8 6,85 (d, J= 7,7, C7H et C7'H), 6,97 (pt, C5'H et C5'H), 7,34 (pt, C6H et C6'H), 9,07 (d, J= 8,0, C4H et C4'H), 10,90 (s, N1H et N1'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 109,42 (d, J = 162,5, C7 et C7'), 121,04 (d, J= 161,2, C5 et C5'), 121,58 (s, C3a et C3a'), 129,21 (d, J= 166,5, C6 et C6'), 132,52 (d, J= 159,9, C4 et C4'), 133,24 (s, C3 et C3'), 143,98 (s, C7a et C7a'), 168,88 (s, C2 et C2' ) ; MS m/e 262 (M+, 100) , 234 (85) , 205 (18) . Anal.
(Cl6HizNaOz) C. H. N.
2,2'-bisindole On opère comme décrit parBergman et al, Tetrahedron 1995, 51 (19), 563-42,Rf = 0,82 (W, acétate d'éthyle /hexane 1/1): GC/MS
Rt= 14, 1 min, m/e 232 (M', 100) ; 7~,",~, (éthanol) 221 (4, 78) , 271 (4, 00) , 333 (4, 80) , 351 (4, 79) . Anal. (Cl6HiaNz) C, H, N.
3,3'-diphényl-2.2'-bisindole On opère comme décrit par Fûrstner et al, Angewandte Chemie, 1995,107 (6), 725-8. La recristallisation à partir d'acétate d'éthyle / éther de pétrole (40-70) 115 v/v conduit à des cristaux incolores (55.8 %), Rf - 0,50 (W, acétate d'éthyle /
éther de petrole (40-70) 115 v/v) : GC/MS Rt= 19, 0 min, m/e~ 384 (M+, 100) .
isatin-5-sulfonamide On refroidit au préalable une solution aqueuse à 25 %
d'ammoniaque (5,0 ml) à 0-5°C avant d'ajouter un échantillon de 0,50 g de chlorure de 3,3-dichloro-2-oxo-2,3-dihydroindol-5-sulfonyle ( voir Haller ci-dessus), (1,7 mmole), par portions, en agitant et en refroidissant à nouveau. Après 2h, on ajoute une petite quantité de glace pilée et 20 % d'acide chlorhydrique jusqu'à réaction acide du mélange. Le solvant est éliminé sous vide et le résidu orange est séché sur KOH. La poudre jaune obtenue est extraite 3 fois avec 35 ml d'acétone. L' acétone est é1 iminée sous vide , ce qui conduit à 14 0 mg ( 3 6 , 4 % ) de poudre orange, Rf= 0, 73 (acétate d' éthyle) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 7, 05 (d, J = 8, 2, C7) , 7.41 (s, NHZ) , 7, 85 (s, C4) , 7, 98 (d, J = 8, 2, C6) ,
ci-dessus sous forme de poudre violette, Rf - 0,51 (méthanol/
acétate d' éthyle 1/20 v/v) : 1H-RMN (DMSO-ds) 8 3, 20 (t, J = 6, 5, 2 -N-CH2) , 3, 56 (m, 2 -CH20-) , 4, 84 (t, J = 5, 5, 2 -OH) , 7, 09-15 7,05 (m, C7H et C5'H), 7,72-7,68 (m, C6H et C4'), 7,45 (d, J--8,0, C7'H), 7,61 (m, C6'), 9,26 (s, C4H), 11,18 (s) et 11,32 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN (DMSO-d6) b 51,32 (t, J= 135,0, 2 -NH-CHz), 60,01 (t, J= 141,0, 2 -CH2-OH), 104,31 (s, C3), 109,48 (d,.J =
165,3, C7), 113,62 (d, J = 168,5, C7'), 118,91 (s, C3a'), 121,69 20 (s, C3a) , 121, 79 (d, J = 164, 0, C5' ) , 122, 88 (d, J = 162, 4, C6) , 124,64 (d, J = 162,7, C4'), 127,98 (d, J = 165,2, C4), 131,51 (s, C5), 137,32 (d, J = 160,1 Hz,C6'), 139,61 (s, C7a'), 143,59 (s, C7a), 152,48 (s, C2'), 170,81 (s, C2), 188,87 (s, C3'); MS
m/e 429 (M+, 9) , 369 (22) , 365 (22) , 355 (63) , 261 (31) , 43 (100) . Anal. (CZOH19N3O6S) C, H, N.
méthylamide de l'acide indirubine-5-sulfonique On opère comme décrit ci-dessus pour l'indirubine. En partant de 380 mg du méthylamide de l'acide isatine-5-sulfonique (1,58 mmole) et de 227 mg d'indoxylacétate (1, 30 mmole), on obtient 370 mg (80,1 %) de l'amide ci-dessus sous forme d'une poudre violette, Rf - 0,72 (acêtate d'éthyle): 1H-RMN (DMSO-ds) 8 2,46 (d, J= 5, 0, CH3) , 7, 05-7, 09 (m, C7H et C5'H) , 7, 32 (q, NH-CH3) , 7,45 (d, J= 8,3, C7'H), 7,61 (m, C6'H), 7,67-7,71 (m, C6H et C4'), 9,27 (s, C4H), 11,18 (s) et 11,30 (s) (N1H et N1'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 28,65 (q, J - 13 8,7, CH3), 104,48 (s, C3), 109,41 (d, J= 165,7, C7), 113,58 (d, J-- 165,7, C7'), 118,90 (s, C3a'), 121,42 (s, C3a), 121,73 (d, J = 171,0, C5'), 123,13 (d, J = 164,5, C6), 124,50 (d, J = 159,8, C4'), 127,61 (d, J =
165,7. C4),131,93 (s, C5), 137,28 (d, J= 160,6, C6'), 139,43 (s, C7a'), 143,36 (s, C7a), 152,45 (s, C2'), 170,85 (s, C2), 188,68 (s, C3'); MS m/e 255 (M+, 15), 263 (18), 262 (100), 261 (7).
Anal . ( C1~H13N3~4'S ) C, H, N.
5-iodoisatine On opêre comme décrit par Roedig, Mueller E. (Hrsg.), Methoden der organishen Chemie (Houbeyn-Weyl), Stuttgart, Georg Thieme Verlag 1960,5/4, 586, et Borsche et al Chem.Ber.1924, 1770-1775, Rf = 0,60 (acétone/éther de pétrole 40-70 1/1 v/v); PF 262 °C: 1H-RMN (DMSO-d6) 8 6,75 (d, J - 8,3, C7H), 7,75 (s, C4H), 7, 78 (d, J = 8, 2, C6H) , 11, 09 (b, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-ds) 8 85, 39 (s, C5), 114,59 (d, J= 167, 1, C7),119,89 (d, J-- 7,2, C3a), 132,38 (d,J--170,3 , C4), 145,76 (d, J = 167,1, C6), 145,76 (d, J
- 167,1, C6), 149,95 (b, C7a), 158,66 (s, C2), 183,06 (s, C3);
MS m/e 262 (M+, 100) , 234 (43) .
diméthylamide de l'acide isatine-5-sulfonique On opère comme décrit par Haller, brevet DE 715760, 1938, Rf = 0, 18 (acétate d' éthyle /hexane 1 /1 v/v) : 1H-RMN (DMSO-ds) 8 2,62 (s, 2 CH3), 7,12 (d, J 8,2, C7H), 7,71 (s, C4H), 7,94 (d, J
- 8, 2, C6H) , 11, 47 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-ds) 8 182, 89 (s, C3) , 159,37 (s, C2), 153,60 (s, C7a), 136,98 (d, J = 167,32, C6), 128,62 (s, C5), 123,27 (d,J = 169,2, C4), 118,05 (s, C3a), 112,68 (d, J-- 169,2, C7), 37,48 (q, J-- 140,1, 2 CH3 ) . Anal . ( CloHION2O4S ) C, H, N .
bis-(2-hydroxyéthyl)-amide de l' acide isatine-5-sulfonique On opêre comme décrit par Haller ci-dessus en partant de 526 mg de bis-(2-hydroxyéhyl)-amine (5,00 mmole) et de 1,00 g de 3,3-dichloro-2-oxo-2.3-dihydroindol-5-sulfonyle ( voir Haller ci-dessus) (3,34 mmole). Le précipité qui se forme est huileux et boueux. On décante le surnageant, puis on mélange le précipité
et le surnageant avec 5 ml d'eau. On porte à reflux 2 h. En refroidissant, on obtient un précipité de cristaux rouge.
Rendement: 476 mg (45,3 g), Rf = 0,51 (méthanol/acétate d'éthyle 1/20 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 2, 78 (t, J = 6, 2, 2 -N-CHZ-) , 3, 38 (t, J = 6,2, 2-CHz-O-),7,08 (d, J = 8,2, C7), 7,78 (s, C4), 7,96 (d, J= 8, 2, C6) , 11, 43 (s, N1H) ; 13C-RMN (DMSO-d6) 8 50, 73 (t, J =
l0 138, 8, 2 -N-CHz-) , 59, 64 (t, J = 141, 7, 2 -CHZOH-) , 112, 57 (d, J =
168,6, C7), 117,91 (s, C3a), 122,78 (d, J= 169,3, C4), 133,29 (s, C5), 136,44 (d, J= 166,4, C6), 153,28 (s, C7a), 159,37 (s, C2) , 182, 95 (s, C3) . Anal. ( C12H14NzO6S) C, H, N.
6-lodoisatine On opêre comme décrit par Marvel et al , Organic Syntheses, Coll. Vol. l, 2ad ed.; Gilman,H Ed.; Wiley& Sons: New York, 1941, 327-330, en utilisant 1,50 g de 2-hydroxyimino-N-(3-iodophényl)-acétamide (5,17 mmole) et 3,9 ml d'acide sulfurique concentré.
Après filtration, le produit brut, formé d'un mélange de 4-et 6-iodoisatine et de sous-produits, est purifié selon Sadler, J.Org.Chem. 1956, 21, 169-170 et Holt et al, Proc.R.Soc. London B 1958, 148, 481-494. On obtient 216 mg (15,0 %) de cristaux orange; PF 255-258 °C; Rf - 0,76 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN (DMSO-d6) 8 7,25 (m, C4H et C7H), 7,45 (d, J-- 7,6, C5H), 11,07 (s, N1H); 13C-RMN (DMSO-d6) b 107,28 (d, J-- 10,4, C6), 117,41 (s, C3a), 120,83 (d, J = 170,3, C7), 125,84 (d, J =
173,7, C4), 131,82 (d, J = 167,9, C5), 151,30 (s, C7a), 159,35 (s, C2) , 183, 79 (s, C3) . Anal. (C8H4IN0z) C, H, N.
isoindigo On opère comme décrit par Wahl et al, Compte rendus hebdomadaires des séances de l'académie des sciences, 1909, 716-19 et 4(5), 1039-43:Rf - 0,67 (acétate d'éthyle/hexane 1/1 v/v): 1H-RMN
(DMSO-ds) 8 6,85 (d, J= 7,7, C7H et C7'H), 6,97 (pt, C5'H et C5'H), 7,34 (pt, C6H et C6'H), 9,07 (d, J= 8,0, C4H et C4'H), 10,90 (s, N1H et N1'H); 13C-RMN (DMSO-d6) 109,42 (d, J = 162,5, C7 et C7'), 121,04 (d, J= 161,2, C5 et C5'), 121,58 (s, C3a et C3a'), 129,21 (d, J= 166,5, C6 et C6'), 132,52 (d, J= 159,9, C4 et C4'), 133,24 (s, C3 et C3'), 143,98 (s, C7a et C7a'), 168,88 (s, C2 et C2' ) ; MS m/e 262 (M+, 100) , 234 (85) , 205 (18) . Anal.
(Cl6HizNaOz) C. H. N.
2,2'-bisindole On opère comme décrit parBergman et al, Tetrahedron 1995, 51 (19), 563-42,Rf = 0,82 (W, acétate d'éthyle /hexane 1/1): GC/MS
Rt= 14, 1 min, m/e 232 (M', 100) ; 7~,",~, (éthanol) 221 (4, 78) , 271 (4, 00) , 333 (4, 80) , 351 (4, 79) . Anal. (Cl6HiaNz) C, H, N.
3,3'-diphényl-2.2'-bisindole On opère comme décrit par Fûrstner et al, Angewandte Chemie, 1995,107 (6), 725-8. La recristallisation à partir d'acétate d'éthyle / éther de pétrole (40-70) 115 v/v conduit à des cristaux incolores (55.8 %), Rf - 0,50 (W, acétate d'éthyle /
éther de petrole (40-70) 115 v/v) : GC/MS Rt= 19, 0 min, m/e~ 384 (M+, 100) .
isatin-5-sulfonamide On refroidit au préalable une solution aqueuse à 25 %
d'ammoniaque (5,0 ml) à 0-5°C avant d'ajouter un échantillon de 0,50 g de chlorure de 3,3-dichloro-2-oxo-2,3-dihydroindol-5-sulfonyle ( voir Haller ci-dessus), (1,7 mmole), par portions, en agitant et en refroidissant à nouveau. Après 2h, on ajoute une petite quantité de glace pilée et 20 % d'acide chlorhydrique jusqu'à réaction acide du mélange. Le solvant est éliminé sous vide et le résidu orange est séché sur KOH. La poudre jaune obtenue est extraite 3 fois avec 35 ml d'acétone. L' acétone est é1 iminée sous vide , ce qui conduit à 14 0 mg ( 3 6 , 4 % ) de poudre orange, Rf= 0, 73 (acétate d' éthyle) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 7, 05 (d, J = 8, 2, C7) , 7.41 (s, NHZ) , 7, 85 (s, C4) , 7, 98 (d, J = 8, 2, C6) ,
11,39 (s, N1H); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 112,12 (d, J= 168,3, C7), 117,73 (s, C3a), 121,67 (d, J= 166,8, C4), 134,97 (d, J-- 165,4, C6) , 138, 36 (s, C5) , 152, 56 (s, C7a) , 159, 50 (s, C2) , 184, 22 (s, C3) ; MS m/e 226 (M+, 28) , 198 (100) .
(2-hydroxyéthyl)-amide de l'acide isatine-5-sulfonique On opère selon Haller ci-dessus, en partant de 295 mg de 2-aminoéthanol (4,83 mmole, 0,300 ml), 5,1 ml d'éthanol et 0,900 mg de chlorure 3.3-dichloro-2-oxo-2,3-dihydroindol-5-sulfonyl (Haller) (3,01 mmole). Après 30 min d'agitation, on ajoute à
nouveau 0, 100 ml de 2-aminoêthanol, et 15 min plus tard 20 g de l0 glace pilée et 0,900 ml d'acide chlorhydrique à 20 %. En réchauffant à la température ambiante, on obtient une masse huileuse qui se dépose au fond du récipient. On laisse décanter le surnageant et le solvant restant est éliminé sous vide.
L'huile jaune obtenue est portée à reflux dans l'eau. pendant 2 h. En refroidissant, la solution orange obtenue précipite 374 mg (45,8 %) de cristaux jaune, Rf - 0,52 (méthanol /acétate d'éthyle 1/20 v/v): 1H-RMN (DMSO-ds) 8 2,73- 2,82 (m,N-CHZ-), 3,38 (t, J = 6. 1 Hz, -CHz-O-) , 7, 07 (d, J = 7, 6, C7) , 7, 66 (t, J =. 5, 7 Hz, -SOZ-NH-) . 7, 81 (s, C4) , 7, 96 (d, J= 8, 4, C6) , 11, 42 (s, Nl H ) .
méthylamide de l'acide isatine-5-sulfonique On opère selon Haller ci-dessus, en partant de 0,572 ml d'une solution aqueuse à 40 % de méthylamine (6,62 mmole), 5,6 ml d'éthanol et 1,00 g de chlorure de 3,3-dichloro-2-oxo-2,3-dihydroindol-5-sulfonyle (Haller) (3, 34 mmole) . Le précipité qui se forme est éliminé par filtration et on porte à reflux dans l'eau pendant 2 h. Par refroidissement, la solution précipite (cristaux jaune). Rendement: 420 mg (52,3 %), Rf = 0,29 (acétate d'éthyle /hexane 2/1 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 2,41 (d, J-- 5,0, CH3) , 7, 08 (d, J= 8, 3, C7) , 7, 48 (q, J-- 5, D, NHz) , 7, 77 (s, C4) , 7,95 (d, J-- 8,3, C6), 11,42 (s, N1H); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 28,52 (q, J= 139,2, CH3), 112,40 (d, J-- 168,9, C7), 118,04 (s, C3a), 122,48 (d, J-- 169,2, C4), 133,13 (s, C5), 136,15 (d, J= 166,0, C6) , 153,44 (s, C7a) , 159,44 (s, C2) , 183, 04 (s, C3) .
2-hydroxyimino-N-(3-iodophényl)-acétamide On opère comme décrit par Marvel et Hiers ci-dessus et on 5 purifie le produit obtenu en procédant selon Holt and Sadler ci-dessus; PF 152-154 °C; Rf - 0,29 (acétate d'éthyle /hexane 1/1 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 7, 12 (pt, J = 8, 1, C5'H) , 7, 44 (pt, J =
7,9, C4'H ou C6'H), 7,63 (s, C2H), 7,65 (pt, J-- 8,2, C4'H ou C6'H), 8,16 (Pt, J - 1,7, C2'H), 10,27 (s, NH), 12,27 (s, 10 C2NOH) ; 13C-RMN (DMSO-d6) 8 94, 69 (d, J = 11, 7, C3' ) , 119, 32 (d, J
- 165,7, C6'), 128,22 (d, J = 168,0, C2'), 130,95 (d, J = 162,8, C5) , 132, 57 (d, J = 168, 1, C4' ) , 140, 06 (s, C1' ) , 144, 05 (d, J =
171, 5, C2) , 160, 67 (s, C1) .
. Tampons 15 Les tampons utilisés ont les compositions suivantes:
Tampon d'homogénéisation: - 60 mM de ~3-glycérophosphate, 15 mM de p-nitrophénylphosphate, 25 mM de Mops (pH 7,2), 15 mM d'EGTA, 15 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 1 mM vanadate de sodium, 1 mM de NaF, 1 mM de phénylphosphate, 10 ~g de leupeptine/ml, 10 ~.g 20 d'aprotinine/ml, 10 ~.g d'inhibiteur de trypsine de soja/ml et 100 ~.M de benzamidine.
Tampon A . 10 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, 1 mM de DTT, 25 mM de Tris-HC1 pH 7,5, 50 ~.g d'héparine/ml.
Tampon.. C . tampon d'homogénéisation, mais renfermant 5 mM
25 d'EGTA, et dépourvu de NaF et d'inhibiteurs de protéase.
Tris-tampon salin de Tween-20 (TBST) . 50 mM de Tris pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20R.
Tampon de lyse hypotonique (HLB) . 50 mM de Tris-HC1 ph 7,4, 120 mM de NaCl, 10% de glycérol, 1% de Nonidet-P40, 5 mM de DTT, 1 mM d'EGTA, 20 mM de NaF, 1 mM d'orthovanadate, 5 ~M de microcystine, 100 ~g/ml de chacun des produits suivants leupeptine, aprotinine, pepstatine.
Préparations de kinases et déterminations des __~___;.~~..
Les activités des kinases ont été dêterminées dans le tampon A
ou C (à moins d'indications contraires), à 30°C, à une concentration finale en ATP de 15 ~.M. Les valeurs des essais à
blanc ont été soustraites et les activités calculées en pmoles de phosphate incorporé pour une incubation de 10 min. Les valeurs des activités sont généralement exprimées en ~ de l'activité maximale, c'est-à-dire, en l'absence d'inhibiteurs.
Des essais témoins ont été réalisés à l'aide de dilutions appropriées de Me2S0. Dans quelques cas, comme indiqué
ci-après, la phosphorylation des substrats est déterminée par autoradiographie après SDS-PAGE.
La GSK-3(3 utilisée est soit l' enzyme purifiêe à partir du muscle de lapin ou exprimée et purifiée à partir de cellules d'insecte Sf9 (Hughes et al, 1992, Eur. J. Biochem., 203 305,311). Les déterminations ont été effectuées avec ,une dilution â 1/100 dans 1 mg de BSA/ml de DTT 10 mM, avec 5 ~,1 de GS-1 40 ~.M comme substrat, dans le tampon A, en présence de 15 ~,M (y3zP] ATP (3000 Ci/moles ; 1 mCi/ml) dans un volume final de ~.1. Après 30 minutes d'incubation à 30°C, des aliquotes de 25 ~.1 de surnageant ont été appliquês sur des bandes de papier de phosphocellulose Whatman P81, de 2,5 x 3 cm, et 20 secondes plus tard, des filtres ont été lavés 5 fois (pendant au moins 5 min.
25 à chaque fois), dans une solution de 10 ml d'acide phosphorique/1 d'eau. Les filtres humides ont f ait l'objet de comptage en présence de 1 ml de fluide de scintillation ACS
(Amersham).
La CDK1/cycline B utilisée a êté extraite à l'aide d'un 30 tampon d'homogénéisation à partir d'ovocytes d'étoiles de mer (Marthasterias glacialis) et purifiée par chromatographie d'affinité sur des billes de p9~'shel- Sépharose à partir desquelles le produit a été élué par du pg~xsnH~ libre, comme décrit par Meijer et al., 1997, (Methods in Enzymology, vol 283 . 113-128), et Borgne et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 . 11977-11986.
L'activité kinase a été déterminée dans le tampon C, avec 1 mg d'histone H1/ml, en présence de 15 ~.M de ~y3zP) ATP
((3000 Ci/mmol ; 1 mCi/ml) dans un volume final de 30 ~.1.
Après 10 minutes d'incubation à 30°C, des aliquotes de 25 ~,1 de surnageant ont été déposés sur des papiers de phosphocellulose P81 et traités comme décrit ci-dessus.
La CDKS/p25 a été reconstituée en mélangeant des quantités égales de CDK5 et de p25 de mammifère recombinantes, exprimées dans E.coli sous forme de protéine de fusion GST
(Glutathione-S-transférase) et purifiées par chromatographie d'affinité sur glutathione-agarose p25 est une version tronquée de p35, l'activateur de CDK5 de 35kDa. Son activité a été
déterminée dans le tampon C comme décrit pour CDK1/cycline B.
Phosphorylation in vitro et in vivo de tau .
Cellules et virus . on a cultivé les cellules Sf9 (InVitrogen, San Diego, CA) à 27°C dans un milieu de Grace de culture en monocouche (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), supplémenté
avec 10% de sérum bovin foetal et 50 ~.g de gentamycine/ml et 2,5 ~,g d'amphotéricine/ml. BaculoGold a été obtenu auprès de PharMingen (San Diego, CA),et pVL1392 de InVitrogen.
La transfection de tau . on a excisé, à partir d'un vecteur d'expression bactérien pNG2 (Biernat et al., 1993,Neuron 11 . 153-163) et le gène codant pour htau23, l'isoforme tau humain le plus court, avec XbaI et BamHI. Le gène a été inséré
dans le vecteur de transfert de baculovirus pVL1392 découpé avec les mêmes endonucléases. Le système BaculoGold a été utilisé
pour la construction du vecteur contenant le baculovirus tau.
L'ADN de BaculoGold est un type modifié de baculovirus contenant une délétion léthale.
La co-transfection de l'ADN de BaculoGold avec un vecteur de transfert de baculovirus complément permet de récupérer la délétion léthale de cet ADN viral et de reconstituer des particules de virus viables portant la séquence codant pour htau23.
L'ADN plasmidique utilisé pour les transfections a été
purifié en utilisant des cartouches de QIAGEN (Hilden, Allemagne).
Les cellules Sf9 cultivées en monocouches (2x106 l0 cellules dans un récipient de culture cellulaire de 60 mm) ont été co-transfectées avec de l'ADN de baculovirus (0,5 ~.g d'ADN
de BaculoGold) et avec les dérivés de pVL1392 (2 ~.g) en utilisant la méthode de co-précipitation au phosphate de calcium. La présence de protéine recombinante a étê examinée IS dans les cellules infectées 5 jours après l'infection par SDS-PAGE et Western blot.
Phos horylation de tau dans les cellules Sf9.
Pour déterminer les effets des inhibiteurs de kinase sur la phosphorylation de tau, les cellules Sf9 infectées par le 20 baculovirus exprimant htau23 ont été traitées 36 heures après l'infection, avec 50 ~.M d'indirubine-3'-monoxime pendant 5 heures avant d'être recueillies. Pour obtenir des échantillons de tau témoins avec une phosphorylation plus élevée, les cellule s Sf9 exprimant htau23 ont été traitées avec 0,2 ~,M
25 d'acide okadaique pendant 5 heures avant rêcolte.
Western blot de tau .
Les cellules Sf9 ont été infectées avec un virus recombinant à une MOI de 1 à 5.
Les lysats cellulaires ont été préparés dans le tampon 30 de lyse hypotonique (HLB).
Après 15 minutes de centrifugation à 16000 g, le surnageant a été rêcupéré et sa concentration en NaCl augmentée jusqu'à 500 mM. Le surnageant a été ensuite soumis à ébullition pendant 10 min. et recentrifugé à 16000 g pendant 15 min. Les protéines (3 ~.g) ont été résolues par SDS-PAGE, transférées sur une membrane de PVDF et étudiées avec un Western blot avec les anticorps suivants . AT-8 (1: 2000), AT-180 (1:1000), AT-100 (1:500), PHF-1 (1:600) et l'anticorps polyclonal anti-tau K9JA.
La phos horylation de tau in vitro a été effectuée en utilisant de la GSK-3~i purifiée et la protéine tau-32 humaine recombinante en tant que substrat. Après 30 minutes d'incubation en présence de différentes concentrations d'indirubine-3'-monoxime, dans les conditions d'étude de la GSK-3~3 décrite ci-dessus, la réaction de la kinase a été arrêtée par addition de tampon Laemmli. La protéine tau a été résolue en SDS-PAGE à 10%
et son taux de phosphorylation visualisé par autoradiographie.
$xemple 1 . Etude de l'inhibition de GSK-3~3, de CDKS/p25 et de CDK1/cycline B ar les indirubines.
Les activités kinases ont été déterminées avec un substrat approprié (GSK-3~3: GS1 peptide; CDKs: histone H1) en présence de 15 ~.M d'ATP et à des concentrations croissantes en dêrivés testés.
Les valeurs de ICso ont été calculées à partir des courbes dose/réponse et sont données dans le tableau 1.
m~~,i o", i Composs aSK3 CDKl CDKS
1 y ~ r i.
' 5-iodo-indirubine-3'-monoxime Or:009 0,025 0,020 ,.gym n py:
indirubine-3'-monoxime O;~b2~'~.0,180 0,100 .;~.~,~so tr ~::..
..:, r 9 5-SOz hydroxythylamide indirubine 0,,X0330,065 0,050 ~
5-S03NIi2-indirubine Q, 0440.0, 110 0, 075 ' ., r~' r.::
5-nitro-indirubine 0,'042'::..0,250 0,380 5-chloro-indirubine :;0;x;0500, 280 0, 230 "
.1~"S~-.;~;m '~~i , ,x w;~",..,~,'~.-....,i;7._, 5-bromo-indirubine 0~',~Sa~'','~:0, 230 0, 250 IJ~,~.
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~
5-SO2 dimthylamide-indirubine 0,180 0,100 ''0'~060' 5-5'-dibromo-indirubine 0,250 600 200 ~, ,~~.,.
5-S03H-indirubine 0, 280 '.~ ~ Q','65'.
0, 5'-bromo-indirubine 0,350 0,510 4 5-SOZ d~hydroxythylamide-indirubine 0,400 0,150 0,150 indirubine 0,600 10,000 5,500 w ~:. ~'A
,.")iii~i~.i~'~1 W
acide 5'-bromo-indirubine-sulfonique 4,000 0=0'8'0_ ,075 Les dterminations effectues titre f comparati avec d'autres indigoïdes, comme les dérivês d'isatine ou d'indigo, 5 donnent les résultats rapportés dans le tableau 2.
rn-L1 --_~ .1 Composs aSK3 CDKl CDKS
isatine-5-sulfonique acide-dihydroxythylamide29 600 800 3-indoxylactate 70 >1000>1000 6-iodo-isatine 75 600 800 acide isatine-5-sulfonique-dimthylamide 85 >1000>1000 3,3'-diphnyl-2,2'-bisindol 180 500 500 1-phnyl-indirubine 200 500 800 acide indigo-5,5',7,-trisulfonique (sel 280 >1000>1000 K3) 5-nitro-isatine 310 >1000>1000 iso-indigo 320 40 130 acide indigo-5,5',7,7'-ttrasulfonique (sel350 >1000>1000 K4) indigo carmine 360 400 >1000 2-(2indolyl)indole 380 700 300 5-bromo-3-indoxylactate 400 >1000>1000 indigo 550 >1000>1000 5-iodo-isatine >1000 300 800 5-bromo-isatine >1000 600 >1000 1-mthyl-indirubine >1000 >1000>1000 isatine >1000 >1000>1000 5-fluoro-isatine >1000 >1000>1000 5-chloro-isatine >1000 >1000>1000 5-mthyl-isatine >1000 >1000>1000 acide 5-sulfonique isatine, sel de sodium >1000 >1000>1000 1-mthyl-isatine >1000 >1000>1000 1-phnyl-isatine >1000 >1000>1000 L'examen de ces 2 tableaux montre que, parmi les indigoïdes, seuls les dérivés d'indirubine exercent à la fois un effet inhibiteur vis-â-vis de GSK-3(3 et de CDKs. I1 ressort en effet clairement de ces résultats que ni l'isatine, ni l'indigo ou leurs dérivés, n'exercent d'effet significatif sur l'une de ces 3 kinases.
Les figures 1A à 1D donnent les courbes dose-réponse pour la 5-iodo-indirubine-3'-monoxime (A), la 5,5' dibromoindirubine (B), l'acide 5-sulfonique indirubine-3' monoxime (C) et l'indirubine-3'-monoxime (D). L'inhibition de GSK-3(3 et des CDKs est déterminée comme indiqué plus haut.
L'activité est exprimée en ~ de l'activité maximale (sans inhibiteurs).
Exemple 2 . Etude du mécanisme d'action des indirubines On procède à cet effet à des expêriences de cinétique en faisant varier à la fois les niveaux d'ATP et les concentrations en indirubine-3' -monoxime.
Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 2 (1/V
en fonction de 1/ATP).
Les concentrations en ATP dans le mélange réactionnel varient de 0 à 2 ~,M, la concentration de GS-1 étant maintenue constante à 6,7 ~,M.
On constate que l'indirubine-3' -monoxime agit en compétition avec l'ATP pour se fixer.
La linéarité de la pente dans l'encadré de la figure montre qu'il s'agit d'un inhibiteur linéaire.
La constante apparente d'inhibition Ki est de 50 nM.
Exemple 3 . Etude de l'inhibition par les indirubines, in vitro et in vivo, de la phosphorylation de tau par GSK-3~i On rapporte les résultats obtenus avec l'indirubine-3' -monoxime sur la phosphorylation d'un substrat physiologique, constitué par la protéine tau liant des microtubules.
On utilise une protéine tau humaine recombinante exprimée dans une bactérie. La protéine est phosphorylée in vitro par GSK-3(3 en présence des concentrations croissantes en indirubine-3' -monoxime. On procède ensuite à une résolution par SDS-PAGE, suivie d'une autoradiographie.
La figure 3A donra.e les résultats obtenus et montre que la phosphorylation est inhibée de manière dose-dépendante par l'indirubine-3' -monoxime, avec une ICso autour de 100 nM. Une quantification de ces résultats est donnée sur la figure 3B qui donne le ~ de phosphorylation de tau en fonction de la concentration en indirubine-3'-monoxine (nM).
Des études in vivo ont été également effectuées. Les résultats sont illustrés par la figure 3C.
Les cellules Sf9 exprimant htau23 ou bien n'ont pas subi de traitement (-) ou ont êtê exposées â 0,2 ~.M d'acide okadaïque (0A) , ou à 50 ~.M d'indirubine-3' -monoxime ou à NG-97 pendant 5h.
Les lysats cellulaires (3 ~.g de htau23) ont été résolus par SDS-PAGE, colorés au bleu de Coomassie ou mis à réagir avec divers anticorps. K9JA (anticorps pan-tau) reconnaît toutes les préparations renfermant tau. AT8, AT 180 et PHF1 sont spécifiques pour différents motifs phosphorylês SP ou TP à
savoir, respectivement, Ser 202 ; Thr 205, Thr 231; Ser 235 et Ser 396 ; Ser 404 (numérotation dans htau 40, qui correspond à
l'isoforme le plus long de la protéine tau humaine). AT 100 reconnaît la protéine tau phosphorylée à T 212 et S214 (réaction très spécifique de la protéine tau chez la maladie d'Alzheimer, mais qui se produit êgalement dans les cellules Sf9, si les 2 sites sont phosphorylés).
La disparition du signal AT100 après traitement avec l'indirubine-3'- monoxime montre que ce dérivé est bien capable d'inhiber une activité de type GSK-3~i dans les cellules Sf9.
La figure 3D reprêsente le diagramme des isoformes tau, des épitopes reconnus par les anticorps et des sites préférés de phosphorylation . (a) htau 23, (b) htau 40, le plus petit et le plus grand des 6 isoformes générés par l'assemblage alternatif (résidus 352 et 441). La protéine htau 23 est dépourvue des inserts N-terminaux et de la deuxième répétition. Les répétitions sont représentées en grisé et les régions adjacentes ensombre . Certains épitopes sont indiqués.
Exemple 4 . Etude de l'inhibition par les indirubines, in vitro et in vivo, de la phos horylation de DARPP-32 par CDKS/p25 La protéine neuronale DARPP-32 a été identifiée comme substrat physiologique de CDKS/p25. DARPP-32 devient un inhibiteur de kinase cAMP-dépendante (PKA) lorsqu'il est l0 phosphorylé par CDKS/p25 sur Thr 75.
Cette protéine a été utilisée comme substrat pour la phosphorylation in vitro par CDKS/p25.
On prépare des coupes de striatum de cerveau de souris adulte en opérant selon la méthodologie standard. Après mise en équilibre dans un tampon de bicarbonate de Krebs oxygéné par aération continue (95% OZ/5% COZ) , les coupes sont traitées avec différentes concentrations d'indirubine-3'-monoxime, ou avec l0um de roscovitine pendant 60 min., ou sont laissées dans le tampon de bicarbonate de Krebs pendant le même temps.
Les coupes sont homogénéisées par sonication dans SDS
1% et NaF 50 mM à ébullition. Les concentrations en protéines sont déterminées par la méthode BCA en utilisant une courbe standard de BSA. On soumet des quantités égales de protéine (80~.g) à un SDS-PAGE en utilisant un gel d'acrylamide à 15%, on effectue ensuite un transfert par électrophorèse sur une membrane de cellulose, puis des immunoempreintes avec un anticorps spécifique d'une situation de phosphorylation capable de détecter spécifiquement DARPP-32 phosphorylé sur Thr 75.
Les résultats sont rapportés sur la figure 4.
On constate que l'indirubine-3'-monoxime inhibe cette phosphorylation de manière concentration-dépendante, avec une ICso autour de 100 nM.
La phosphorylation de DARPP-32 par CDKS/p25 peut être contrôlée avec un anticorps phosphospécifique dirigé contre DARPP-32 phospho-Thr 75.
On n'observe pas de phosphorylation in vivo sur ce 5 site dans le tissu p35 -/- . On constate une inhibition par l'indirubine-3' -monoxime, ce qui montre que les indirubines sont capables d'inhiber CDK5 in vivo.
(2-hydroxyéthyl)-amide de l'acide isatine-5-sulfonique On opère selon Haller ci-dessus, en partant de 295 mg de 2-aminoéthanol (4,83 mmole, 0,300 ml), 5,1 ml d'éthanol et 0,900 mg de chlorure 3.3-dichloro-2-oxo-2,3-dihydroindol-5-sulfonyl (Haller) (3,01 mmole). Après 30 min d'agitation, on ajoute à
nouveau 0, 100 ml de 2-aminoêthanol, et 15 min plus tard 20 g de l0 glace pilée et 0,900 ml d'acide chlorhydrique à 20 %. En réchauffant à la température ambiante, on obtient une masse huileuse qui se dépose au fond du récipient. On laisse décanter le surnageant et le solvant restant est éliminé sous vide.
L'huile jaune obtenue est portée à reflux dans l'eau. pendant 2 h. En refroidissant, la solution orange obtenue précipite 374 mg (45,8 %) de cristaux jaune, Rf - 0,52 (méthanol /acétate d'éthyle 1/20 v/v): 1H-RMN (DMSO-ds) 8 2,73- 2,82 (m,N-CHZ-), 3,38 (t, J = 6. 1 Hz, -CHz-O-) , 7, 07 (d, J = 7, 6, C7) , 7, 66 (t, J =. 5, 7 Hz, -SOZ-NH-) . 7, 81 (s, C4) , 7, 96 (d, J= 8, 4, C6) , 11, 42 (s, Nl H ) .
méthylamide de l'acide isatine-5-sulfonique On opère selon Haller ci-dessus, en partant de 0,572 ml d'une solution aqueuse à 40 % de méthylamine (6,62 mmole), 5,6 ml d'éthanol et 1,00 g de chlorure de 3,3-dichloro-2-oxo-2,3-dihydroindol-5-sulfonyle (Haller) (3, 34 mmole) . Le précipité qui se forme est éliminé par filtration et on porte à reflux dans l'eau pendant 2 h. Par refroidissement, la solution précipite (cristaux jaune). Rendement: 420 mg (52,3 %), Rf = 0,29 (acétate d'éthyle /hexane 2/1 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 2,41 (d, J-- 5,0, CH3) , 7, 08 (d, J= 8, 3, C7) , 7, 48 (q, J-- 5, D, NHz) , 7, 77 (s, C4) , 7,95 (d, J-- 8,3, C6), 11,42 (s, N1H); 13C-RMN (DMSO-d6) 8 28,52 (q, J= 139,2, CH3), 112,40 (d, J-- 168,9, C7), 118,04 (s, C3a), 122,48 (d, J-- 169,2, C4), 133,13 (s, C5), 136,15 (d, J= 166,0, C6) , 153,44 (s, C7a) , 159,44 (s, C2) , 183, 04 (s, C3) .
2-hydroxyimino-N-(3-iodophényl)-acétamide On opère comme décrit par Marvel et Hiers ci-dessus et on 5 purifie le produit obtenu en procédant selon Holt and Sadler ci-dessus; PF 152-154 °C; Rf - 0,29 (acétate d'éthyle /hexane 1/1 v/v) : 1H-RMN (DMSO-d6) 8 7, 12 (pt, J = 8, 1, C5'H) , 7, 44 (pt, J =
7,9, C4'H ou C6'H), 7,63 (s, C2H), 7,65 (pt, J-- 8,2, C4'H ou C6'H), 8,16 (Pt, J - 1,7, C2'H), 10,27 (s, NH), 12,27 (s, 10 C2NOH) ; 13C-RMN (DMSO-d6) 8 94, 69 (d, J = 11, 7, C3' ) , 119, 32 (d, J
- 165,7, C6'), 128,22 (d, J = 168,0, C2'), 130,95 (d, J = 162,8, C5) , 132, 57 (d, J = 168, 1, C4' ) , 140, 06 (s, C1' ) , 144, 05 (d, J =
171, 5, C2) , 160, 67 (s, C1) .
. Tampons 15 Les tampons utilisés ont les compositions suivantes:
Tampon d'homogénéisation: - 60 mM de ~3-glycérophosphate, 15 mM de p-nitrophénylphosphate, 25 mM de Mops (pH 7,2), 15 mM d'EGTA, 15 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 1 mM vanadate de sodium, 1 mM de NaF, 1 mM de phénylphosphate, 10 ~g de leupeptine/ml, 10 ~.g 20 d'aprotinine/ml, 10 ~.g d'inhibiteur de trypsine de soja/ml et 100 ~.M de benzamidine.
Tampon A . 10 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, 1 mM de DTT, 25 mM de Tris-HC1 pH 7,5, 50 ~.g d'héparine/ml.
Tampon.. C . tampon d'homogénéisation, mais renfermant 5 mM
25 d'EGTA, et dépourvu de NaF et d'inhibiteurs de protéase.
Tris-tampon salin de Tween-20 (TBST) . 50 mM de Tris pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20R.
Tampon de lyse hypotonique (HLB) . 50 mM de Tris-HC1 ph 7,4, 120 mM de NaCl, 10% de glycérol, 1% de Nonidet-P40, 5 mM de DTT, 1 mM d'EGTA, 20 mM de NaF, 1 mM d'orthovanadate, 5 ~M de microcystine, 100 ~g/ml de chacun des produits suivants leupeptine, aprotinine, pepstatine.
Préparations de kinases et déterminations des __~___;.~~..
Les activités des kinases ont été dêterminées dans le tampon A
ou C (à moins d'indications contraires), à 30°C, à une concentration finale en ATP de 15 ~.M. Les valeurs des essais à
blanc ont été soustraites et les activités calculées en pmoles de phosphate incorporé pour une incubation de 10 min. Les valeurs des activités sont généralement exprimées en ~ de l'activité maximale, c'est-à-dire, en l'absence d'inhibiteurs.
Des essais témoins ont été réalisés à l'aide de dilutions appropriées de Me2S0. Dans quelques cas, comme indiqué
ci-après, la phosphorylation des substrats est déterminée par autoradiographie après SDS-PAGE.
La GSK-3(3 utilisée est soit l' enzyme purifiêe à partir du muscle de lapin ou exprimée et purifiée à partir de cellules d'insecte Sf9 (Hughes et al, 1992, Eur. J. Biochem., 203 305,311). Les déterminations ont été effectuées avec ,une dilution â 1/100 dans 1 mg de BSA/ml de DTT 10 mM, avec 5 ~,1 de GS-1 40 ~.M comme substrat, dans le tampon A, en présence de 15 ~,M (y3zP] ATP (3000 Ci/moles ; 1 mCi/ml) dans un volume final de ~.1. Après 30 minutes d'incubation à 30°C, des aliquotes de 25 ~.1 de surnageant ont été appliquês sur des bandes de papier de phosphocellulose Whatman P81, de 2,5 x 3 cm, et 20 secondes plus tard, des filtres ont été lavés 5 fois (pendant au moins 5 min.
25 à chaque fois), dans une solution de 10 ml d'acide phosphorique/1 d'eau. Les filtres humides ont f ait l'objet de comptage en présence de 1 ml de fluide de scintillation ACS
(Amersham).
La CDK1/cycline B utilisée a êté extraite à l'aide d'un 30 tampon d'homogénéisation à partir d'ovocytes d'étoiles de mer (Marthasterias glacialis) et purifiée par chromatographie d'affinité sur des billes de p9~'shel- Sépharose à partir desquelles le produit a été élué par du pg~xsnH~ libre, comme décrit par Meijer et al., 1997, (Methods in Enzymology, vol 283 . 113-128), et Borgne et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 . 11977-11986.
L'activité kinase a été déterminée dans le tampon C, avec 1 mg d'histone H1/ml, en présence de 15 ~.M de ~y3zP) ATP
((3000 Ci/mmol ; 1 mCi/ml) dans un volume final de 30 ~.1.
Après 10 minutes d'incubation à 30°C, des aliquotes de 25 ~,1 de surnageant ont été déposés sur des papiers de phosphocellulose P81 et traités comme décrit ci-dessus.
La CDKS/p25 a été reconstituée en mélangeant des quantités égales de CDK5 et de p25 de mammifère recombinantes, exprimées dans E.coli sous forme de protéine de fusion GST
(Glutathione-S-transférase) et purifiées par chromatographie d'affinité sur glutathione-agarose p25 est une version tronquée de p35, l'activateur de CDK5 de 35kDa. Son activité a été
déterminée dans le tampon C comme décrit pour CDK1/cycline B.
Phosphorylation in vitro et in vivo de tau .
Cellules et virus . on a cultivé les cellules Sf9 (InVitrogen, San Diego, CA) à 27°C dans un milieu de Grace de culture en monocouche (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), supplémenté
avec 10% de sérum bovin foetal et 50 ~.g de gentamycine/ml et 2,5 ~,g d'amphotéricine/ml. BaculoGold a été obtenu auprès de PharMingen (San Diego, CA),et pVL1392 de InVitrogen.
La transfection de tau . on a excisé, à partir d'un vecteur d'expression bactérien pNG2 (Biernat et al., 1993,Neuron 11 . 153-163) et le gène codant pour htau23, l'isoforme tau humain le plus court, avec XbaI et BamHI. Le gène a été inséré
dans le vecteur de transfert de baculovirus pVL1392 découpé avec les mêmes endonucléases. Le système BaculoGold a été utilisé
pour la construction du vecteur contenant le baculovirus tau.
L'ADN de BaculoGold est un type modifié de baculovirus contenant une délétion léthale.
La co-transfection de l'ADN de BaculoGold avec un vecteur de transfert de baculovirus complément permet de récupérer la délétion léthale de cet ADN viral et de reconstituer des particules de virus viables portant la séquence codant pour htau23.
L'ADN plasmidique utilisé pour les transfections a été
purifié en utilisant des cartouches de QIAGEN (Hilden, Allemagne).
Les cellules Sf9 cultivées en monocouches (2x106 l0 cellules dans un récipient de culture cellulaire de 60 mm) ont été co-transfectées avec de l'ADN de baculovirus (0,5 ~.g d'ADN
de BaculoGold) et avec les dérivés de pVL1392 (2 ~.g) en utilisant la méthode de co-précipitation au phosphate de calcium. La présence de protéine recombinante a étê examinée IS dans les cellules infectées 5 jours après l'infection par SDS-PAGE et Western blot.
Phos horylation de tau dans les cellules Sf9.
Pour déterminer les effets des inhibiteurs de kinase sur la phosphorylation de tau, les cellules Sf9 infectées par le 20 baculovirus exprimant htau23 ont été traitées 36 heures après l'infection, avec 50 ~.M d'indirubine-3'-monoxime pendant 5 heures avant d'être recueillies. Pour obtenir des échantillons de tau témoins avec une phosphorylation plus élevée, les cellule s Sf9 exprimant htau23 ont été traitées avec 0,2 ~,M
25 d'acide okadaique pendant 5 heures avant rêcolte.
Western blot de tau .
Les cellules Sf9 ont été infectées avec un virus recombinant à une MOI de 1 à 5.
Les lysats cellulaires ont été préparés dans le tampon 30 de lyse hypotonique (HLB).
Après 15 minutes de centrifugation à 16000 g, le surnageant a été rêcupéré et sa concentration en NaCl augmentée jusqu'à 500 mM. Le surnageant a été ensuite soumis à ébullition pendant 10 min. et recentrifugé à 16000 g pendant 15 min. Les protéines (3 ~.g) ont été résolues par SDS-PAGE, transférées sur une membrane de PVDF et étudiées avec un Western blot avec les anticorps suivants . AT-8 (1: 2000), AT-180 (1:1000), AT-100 (1:500), PHF-1 (1:600) et l'anticorps polyclonal anti-tau K9JA.
La phos horylation de tau in vitro a été effectuée en utilisant de la GSK-3~i purifiée et la protéine tau-32 humaine recombinante en tant que substrat. Après 30 minutes d'incubation en présence de différentes concentrations d'indirubine-3'-monoxime, dans les conditions d'étude de la GSK-3~3 décrite ci-dessus, la réaction de la kinase a été arrêtée par addition de tampon Laemmli. La protéine tau a été résolue en SDS-PAGE à 10%
et son taux de phosphorylation visualisé par autoradiographie.
$xemple 1 . Etude de l'inhibition de GSK-3~3, de CDKS/p25 et de CDK1/cycline B ar les indirubines.
Les activités kinases ont été déterminées avec un substrat approprié (GSK-3~3: GS1 peptide; CDKs: histone H1) en présence de 15 ~.M d'ATP et à des concentrations croissantes en dêrivés testés.
Les valeurs de ICso ont été calculées à partir des courbes dose/réponse et sont données dans le tableau 1.
m~~,i o", i Composs aSK3 CDKl CDKS
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indirubine-3'-monoxime O;~b2~'~.0,180 0,100 .;~.~,~so tr ~::..
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5-S03H-indirubine 0, 280 '.~ ~ Q','65'.
0, 5'-bromo-indirubine 0,350 0,510 4 5-SOZ d~hydroxythylamide-indirubine 0,400 0,150 0,150 indirubine 0,600 10,000 5,500 w ~:. ~'A
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acide 5'-bromo-indirubine-sulfonique 4,000 0=0'8'0_ ,075 Les dterminations effectues titre f comparati avec d'autres indigoïdes, comme les dérivês d'isatine ou d'indigo, 5 donnent les résultats rapportés dans le tableau 2.
rn-L1 --_~ .1 Composs aSK3 CDKl CDKS
isatine-5-sulfonique acide-dihydroxythylamide29 600 800 3-indoxylactate 70 >1000>1000 6-iodo-isatine 75 600 800 acide isatine-5-sulfonique-dimthylamide 85 >1000>1000 3,3'-diphnyl-2,2'-bisindol 180 500 500 1-phnyl-indirubine 200 500 800 acide indigo-5,5',7,-trisulfonique (sel 280 >1000>1000 K3) 5-nitro-isatine 310 >1000>1000 iso-indigo 320 40 130 acide indigo-5,5',7,7'-ttrasulfonique (sel350 >1000>1000 K4) indigo carmine 360 400 >1000 2-(2indolyl)indole 380 700 300 5-bromo-3-indoxylactate 400 >1000>1000 indigo 550 >1000>1000 5-iodo-isatine >1000 300 800 5-bromo-isatine >1000 600 >1000 1-mthyl-indirubine >1000 >1000>1000 isatine >1000 >1000>1000 5-fluoro-isatine >1000 >1000>1000 5-chloro-isatine >1000 >1000>1000 5-mthyl-isatine >1000 >1000>1000 acide 5-sulfonique isatine, sel de sodium >1000 >1000>1000 1-mthyl-isatine >1000 >1000>1000 1-phnyl-isatine >1000 >1000>1000 L'examen de ces 2 tableaux montre que, parmi les indigoïdes, seuls les dérivés d'indirubine exercent à la fois un effet inhibiteur vis-â-vis de GSK-3(3 et de CDKs. I1 ressort en effet clairement de ces résultats que ni l'isatine, ni l'indigo ou leurs dérivés, n'exercent d'effet significatif sur l'une de ces 3 kinases.
Les figures 1A à 1D donnent les courbes dose-réponse pour la 5-iodo-indirubine-3'-monoxime (A), la 5,5' dibromoindirubine (B), l'acide 5-sulfonique indirubine-3' monoxime (C) et l'indirubine-3'-monoxime (D). L'inhibition de GSK-3(3 et des CDKs est déterminée comme indiqué plus haut.
L'activité est exprimée en ~ de l'activité maximale (sans inhibiteurs).
Exemple 2 . Etude du mécanisme d'action des indirubines On procède à cet effet à des expêriences de cinétique en faisant varier à la fois les niveaux d'ATP et les concentrations en indirubine-3' -monoxime.
Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 2 (1/V
en fonction de 1/ATP).
Les concentrations en ATP dans le mélange réactionnel varient de 0 à 2 ~,M, la concentration de GS-1 étant maintenue constante à 6,7 ~,M.
On constate que l'indirubine-3' -monoxime agit en compétition avec l'ATP pour se fixer.
La linéarité de la pente dans l'encadré de la figure montre qu'il s'agit d'un inhibiteur linéaire.
La constante apparente d'inhibition Ki est de 50 nM.
Exemple 3 . Etude de l'inhibition par les indirubines, in vitro et in vivo, de la phosphorylation de tau par GSK-3~i On rapporte les résultats obtenus avec l'indirubine-3' -monoxime sur la phosphorylation d'un substrat physiologique, constitué par la protéine tau liant des microtubules.
On utilise une protéine tau humaine recombinante exprimée dans une bactérie. La protéine est phosphorylée in vitro par GSK-3(3 en présence des concentrations croissantes en indirubine-3' -monoxime. On procède ensuite à une résolution par SDS-PAGE, suivie d'une autoradiographie.
La figure 3A donra.e les résultats obtenus et montre que la phosphorylation est inhibée de manière dose-dépendante par l'indirubine-3' -monoxime, avec une ICso autour de 100 nM. Une quantification de ces résultats est donnée sur la figure 3B qui donne le ~ de phosphorylation de tau en fonction de la concentration en indirubine-3'-monoxine (nM).
Des études in vivo ont été également effectuées. Les résultats sont illustrés par la figure 3C.
Les cellules Sf9 exprimant htau23 ou bien n'ont pas subi de traitement (-) ou ont êtê exposées â 0,2 ~.M d'acide okadaïque (0A) , ou à 50 ~.M d'indirubine-3' -monoxime ou à NG-97 pendant 5h.
Les lysats cellulaires (3 ~.g de htau23) ont été résolus par SDS-PAGE, colorés au bleu de Coomassie ou mis à réagir avec divers anticorps. K9JA (anticorps pan-tau) reconnaît toutes les préparations renfermant tau. AT8, AT 180 et PHF1 sont spécifiques pour différents motifs phosphorylês SP ou TP à
savoir, respectivement, Ser 202 ; Thr 205, Thr 231; Ser 235 et Ser 396 ; Ser 404 (numérotation dans htau 40, qui correspond à
l'isoforme le plus long de la protéine tau humaine). AT 100 reconnaît la protéine tau phosphorylée à T 212 et S214 (réaction très spécifique de la protéine tau chez la maladie d'Alzheimer, mais qui se produit êgalement dans les cellules Sf9, si les 2 sites sont phosphorylés).
La disparition du signal AT100 après traitement avec l'indirubine-3'- monoxime montre que ce dérivé est bien capable d'inhiber une activité de type GSK-3~i dans les cellules Sf9.
La figure 3D reprêsente le diagramme des isoformes tau, des épitopes reconnus par les anticorps et des sites préférés de phosphorylation . (a) htau 23, (b) htau 40, le plus petit et le plus grand des 6 isoformes générés par l'assemblage alternatif (résidus 352 et 441). La protéine htau 23 est dépourvue des inserts N-terminaux et de la deuxième répétition. Les répétitions sont représentées en grisé et les régions adjacentes ensombre . Certains épitopes sont indiqués.
Exemple 4 . Etude de l'inhibition par les indirubines, in vitro et in vivo, de la phos horylation de DARPP-32 par CDKS/p25 La protéine neuronale DARPP-32 a été identifiée comme substrat physiologique de CDKS/p25. DARPP-32 devient un inhibiteur de kinase cAMP-dépendante (PKA) lorsqu'il est l0 phosphorylé par CDKS/p25 sur Thr 75.
Cette protéine a été utilisée comme substrat pour la phosphorylation in vitro par CDKS/p25.
On prépare des coupes de striatum de cerveau de souris adulte en opérant selon la méthodologie standard. Après mise en équilibre dans un tampon de bicarbonate de Krebs oxygéné par aération continue (95% OZ/5% COZ) , les coupes sont traitées avec différentes concentrations d'indirubine-3'-monoxime, ou avec l0um de roscovitine pendant 60 min., ou sont laissées dans le tampon de bicarbonate de Krebs pendant le même temps.
Les coupes sont homogénéisées par sonication dans SDS
1% et NaF 50 mM à ébullition. Les concentrations en protéines sont déterminées par la méthode BCA en utilisant une courbe standard de BSA. On soumet des quantités égales de protéine (80~.g) à un SDS-PAGE en utilisant un gel d'acrylamide à 15%, on effectue ensuite un transfert par électrophorèse sur une membrane de cellulose, puis des immunoempreintes avec un anticorps spécifique d'une situation de phosphorylation capable de détecter spécifiquement DARPP-32 phosphorylé sur Thr 75.
Les résultats sont rapportés sur la figure 4.
On constate que l'indirubine-3'-monoxime inhibe cette phosphorylation de manière concentration-dépendante, avec une ICso autour de 100 nM.
La phosphorylation de DARPP-32 par CDKS/p25 peut être contrôlée avec un anticorps phosphospécifique dirigé contre DARPP-32 phospho-Thr 75.
On n'observe pas de phosphorylation in vivo sur ce 5 site dans le tissu p35 -/- . On constate une inhibition par l'indirubine-3' -monoxime, ce qui montre que les indirubines sont capables d'inhiber CDK5 in vivo.
Claims (15)
1. Utilisation pour la fabrication de médicaments inhibiteurs de la GSK-3.beta. de dérivés d'indirubine répondant à la formule générale I:
dans laquelle R1 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe méthylènehydroxy; un radical alcoyle ou alkyloxy ou méthylènealkoxy, à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18; un radical cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un radical aryle, aralkyle ou aryloxy, substitué ou non substitué, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe mono-, di- ou trialkylsilyle ayant 1 à 6 atomes de carbone, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas, dans le groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée; un groupe mono-, di- ou triarylsilyle, avec des groupes aryle substitués ou non, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas; un groupe trifluorométhyle; un groupe -COM; -COOM; ou -CH2COOM, avec M
représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, radicaux alkyle ou groupe alcoxy; un groupe -NR11R12, dans lequel R11 et R12, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe acyle; un groupe méthylèneamino -CH 2-NR 11R 12, dans lequel R 11 et R 12 présentent les significations ci-dessus; un groupe benzyle, dans lequel le noyau benzène comprend, le cas échéant, un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un résidu d'acide aminé physiologique lié à l'azote, comme un amide; un O-glycoside ou un N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les disaccharides; ou un groupe méthylènesulfonate; R 2, R 3, R 4, R 5, R 7, R 8, R 9 et R 10, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène; d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe nitroso; un groupe nitro; un groupe alkoxy; un groupe alkyle à
chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué
par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino; un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes ; un groupe aralkyle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe aryloxy, substitué ou non comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènearyloxy, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe cycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe trifluorométhyle; un groupe -COM; -COOM; ou CH 2COOM, avec M
représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C18, â chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, groupes alkyle ou groupes alcoxy ; un groupe -NR11R12, dans lequel R11 et R12, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, un groupe acyle, ou dans lequel l'atome d'azote fait partie d'un groupe cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe -CONR11R12, dans lequel R11 et R12 présentent les significations ci-dessus; un groupe hydroxylamino; un groupe phosphate; un groupe phosphonate; un groupe sulfate; un groupe sulfonate; un groupe sulfonamide; un groupe -SO2NR11R12, dans lequel R11 et R12 présentent les significations données ci-dessus; un groupe azo -N=N-R13, dans lequel R13 représente un groupe aromatique, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, ou un groupe O-glycoside ou N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou, les dissacharides; ou R1 et R5, et R6 et R10, respectivement, forment ensemble, indépendamment l'un de l'autre, un cycle ayant 1 à 4 groupes CH2, le cas échéant substitué; et X et Y, identiques ou différents, représentent un atome d'oxygène; de soufre; de sélénium; de tellurium; un groupe -NR14, dans lequel R14 représente un atome d'hydrogène; un groupe alkyle, à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, un groupe aralkyle, ou un groupe sulfonate; ou -NOR14, dans lequel le groupe R14 présente les significations données ci-dessus, et les sels de ces dérivés physiologiquement acceptables.
dans laquelle R1 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un atome d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe méthylènehydroxy; un radical alcoyle ou alkyloxy ou méthylènealkoxy, à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18; un radical cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un radical aryle, aralkyle ou aryloxy, substitué ou non substitué, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe mono-, di- ou trialkylsilyle ayant 1 à 6 atomes de carbone, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas, dans le groupe alkyle à chaîne droite ou ramifiée; un groupe mono-, di- ou triarylsilyle, avec des groupes aryle substitués ou non, indépendamment l'un de l'autre, dans chaque cas; un groupe trifluorométhyle; un groupe -COM; -COOM; ou -CH2COOM, avec M
représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C18, à chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, radicaux alkyle ou groupe alcoxy; un groupe -NR11R12, dans lequel R11 et R12, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe acyle; un groupe méthylèneamino -CH 2-NR 11R 12, dans lequel R 11 et R 12 présentent les significations ci-dessus; un groupe benzyle, dans lequel le noyau benzène comprend, le cas échéant, un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un résidu d'acide aminé physiologique lié à l'azote, comme un amide; un O-glycoside ou un N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou les disaccharides; ou un groupe méthylènesulfonate; R 2, R 3, R 4, R 5, R 7, R 8, R 9 et R 10, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène; d'halogène; un groupe hydroxy; un groupe nitroso; un groupe nitro; un groupe alkoxy; un groupe alkyle à
chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué
par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino; un groupe aryle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes ; un groupe aralkyle, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe aryloxy, substitué ou non comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènearyloxy, substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe cycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe méthylènecycloalkyle, avec 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe trifluorométhyle; un groupe -COM; -COOM; ou CH 2COOM, avec M
représentant un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C18, â chaîne droite ou ramifiée, substituée le cas échéant en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, ou un groupe aryle comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, pouvant être substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, groupes alkyle ou groupes alcoxy ; un groupe -NR11R12, dans lequel R11 et R12, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué en outre par un ou plusieurs groupes hydroxy et/ou amino, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, un groupe acyle, ou dans lequel l'atome d'azote fait partie d'un groupe cycloalkyle ayant 3 à 7 atomes de carbone, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes; un groupe -CONR11R12, dans lequel R11 et R12 présentent les significations ci-dessus; un groupe hydroxylamino; un groupe phosphate; un groupe phosphonate; un groupe sulfate; un groupe sulfonate; un groupe sulfonamide; un groupe -SO2NR11R12, dans lequel R11 et R12 présentent les significations données ci-dessus; un groupe azo -N=N-R13, dans lequel R13 représente un groupe aromatique, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, ou un groupe O-glycoside ou N-glycoside, dans lequel le glycoside est choisi parmi les monosaccharides ou, les dissacharides; ou R1 et R5, et R6 et R10, respectivement, forment ensemble, indépendamment l'un de l'autre, un cycle ayant 1 à 4 groupes CH2, le cas échéant substitué; et X et Y, identiques ou différents, représentent un atome d'oxygène; de soufre; de sélénium; de tellurium; un groupe -NR14, dans lequel R14 représente un atome d'hydrogène; un groupe alkyle, à chaîne droite ou ramifiée, en C1 à C18, le cas échéant substitué par un ou plusieurs groupes carboxyle, phosphoryle ou sulfonate, un groupe aryle substitué ou non, comprenant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, un groupe aralkyle, ou un groupe sulfonate; ou -NOR14, dans lequel le groupe R14 présente les significations données ci-dessus, et les sels de ces dérivés physiologiquement acceptables.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que, dans lesdits dérivés d'indirubine, un ou plusieurs atomes d'un ou plusieurs cycles benzéniques sont remplacés par des atomes d'azote.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que dans lesdits dérivés d'indirubine, un ou plusieurs systèmes cycliques aromatiques ou non aromatiques, qui comprennent, le cas échéant, un ou plusieurs hétéroatomes indépendamment l'un de l'autre, sont condensés au système indirubine.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les dérivés d'indirubine sont liés à un ester de polyéthylèneglycol ou à un éther de polyéthylèneglycol par des liaisons, respectivement, ester ou éther.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que, dans lesdits dérivés d'indirubine, X et Y, identiques ou différents, représentent un groupe = O ou = NOH.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que les substituants R1, R3, R4 et R8 desdits dérivés d'indirubine présentent les significations suivantes :
- R3: un atome d'hydrogène, d'halogène, un radical alkyle, un groupe -SO3H, -SO2NH2, -SO2-N-(CH3)2, -SO2-N-C2H5-OH, -SO2-N-(C2H5-OH)2, -SO2-NH-CH3, - R4 et R8, indépendamment l'un de l'autre: un atome d'hydrogène ou d'halogène, - R1: un radical alkyle ou aryle, les autres substituants donnés sur la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.
- R3: un atome d'hydrogène, d'halogène, un radical alkyle, un groupe -SO3H, -SO2NH2, -SO2-N-(CH3)2, -SO2-N-C2H5-OH, -SO2-N-(C2H5-OH)2, -SO2-NH-CH3, - R4 et R8, indépendamment l'un de l'autre: un atome d'hydrogène ou d'halogène, - R1: un radical alkyle ou aryle, les autres substituants donnés sur la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 â 4, caractérisée en ce que dans lesdits dérivés d'indirubine, X = Y, ces deux substituants représentant un groupe = O.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que les substituants R1, R3, R4 et R8, dans lesdits dérivés d'indirubine, rêpondent aux significations suivantes .
- R1: alkyle, notamment méthyle, et phényle - R3: hydrogène , halogène ( F, C1, Br, I ) , N02, - S03H, -S02NH2, -SO2-N (CH3) 2, -S02-N-C2H5-OH, -S02-N- (C2H5-OH) 2, -SO2 -NHCH3, -R4 et R8 : halogène, en particulier I ou Br, les autres substituants donnés dans la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.
- R1: alkyle, notamment méthyle, et phényle - R3: hydrogène , halogène ( F, C1, Br, I ) , N02, - S03H, -S02NH2, -SO2-N (CH3) 2, -S02-N-C2H5-OH, -S02-N- (C2H5-OH) 2, -SO2 -NHCH3, -R4 et R8 : halogène, en particulier I ou Br, les autres substituants donnés dans la formule (I) représentant un atome d'hydrogène.
9. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que lesdits dérivés sont choisis parmi l'indirubine, la 5-iodo-indirubine, la 5-bromo-indirubine, la 5-chloro-indirubine, la 5-fluoro-indirubine, la 5-méthyl-indirubine, la 5-nitro-indirubine, la 5-S03H-indirubine, la 5'-bromo-indirubine, la 5-5'-dibromo-indirubine ou l'acide 5'-bromo-indirubine 5-sulfonique.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que, dans lesdits dérivés d'indirubine, X représente un groupe - NOH et Y un groupe = O.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que R3 représente un atome d'halogène, notamment I, ou un groupe -SO3Na.
12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que lesdits dérivés sont choisis parmi l'indirubine-3'-monoxime, la 5-iodo-indirubine-3'-monoxime et la 5-SO3Na-indirubine-3'-monoxime.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie orale, sous forme de gélules, comprimés, dragées ou capsules.
14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractêrisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie injectable, sous forme de solution.
15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, pour le traitement de pathologies impliquant GSK-3.beta. et CDK5.
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