CA2378452A1 - Peptides anti-microbiens de mollusques - Google Patents
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Abstract
Peptide anti-microbien, dénommé myticine, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu à partir d'un mollusque bivalve, et en ce que sa masse moléculaire est d'environ 4,5 kDa; son pI est d'environ 8,7; il compre nd 8 résidus cystéine, son procédé de préparation et ses applications. Acide nucléique codant pour ledit peptide.
Description
,x é.» s ~ .,a.. ~ 33 01 45 63 84 47 CRB IHET ORES 28~09~01 11:17 Pq : 3i5 28-09-2001 ~ CA 02378452 2002-O1-04 FR000197 i PFPTIUL~ ANTT-MICR0131r;ta~: DE MOLLuSt?CjEE.
L' lnventi.en est 'relative .~ de nouveâux pepttdc:s ~.lnti-mi rrobic:ns p.r.oduil.s par dPS inollu.,ques.
DC: t: polypeFotides dote ctc~ propricStés ant i_ microbiennes àcent prc~c~uiL~ par urm grande v~riPté
d~ E:S~7P[:P$ (anima.l es vu véqPtales) , chP~ le~,c?uelles ils W z~Licipent â dc:s mécani sme~ non-spéoi fi ic;ucs de c:lc~lcnse CQnr.l"F ~C.'.t; 7.nfeCt ~ Otlt~ .
Dans le c~t~ des mc~llu~que.~ ~~i.v~~lvc:~, nlZ
1t7 jusqu'à présel'1L identif~.é Gi'le~.z Myti.llas o7a11~provinc-.1c31i~~, ttn pel:~Lido dPn«mmé MGLr-1, apy~~rc_rutt: aux dc~,iensines d' irl:,PCaes [HUBERT Pfi al. , Eur. ,7. lüoc-_heru., 24Q, 302-301;, (1936) J ; des pepl.idc~s de la talttille dP.s déio.nsinr~g orle Pg~31 emen'L été: mis en évidcnc:e c:hP~ M. ytililc: edo.l.i. ,, 1~ ainsi qur~ dc.~ pPpt9.des dc':rlUmmé.S « m.yt.ilioe~ » [C:HARLET r_~.1 al . , ,7. !si «1 . Cheln. , l'!1, 21.E30t3-2J.$13, (1990) ; .
Tnveritt.uiw: ont ma i ntern3nL rais en Fvi c:lPnc~c de n«tivP~tlX peptides anal-lnie.e~c~t~ien.~ prOdtlltS tiar My~i,ltls rla..l.lopl-üvincial.i.s, qui sUnt diffe~rertt;~, des dPfen~;irxc;;
L' lnventi.en est 'relative .~ de nouveâux pepttdc:s ~.lnti-mi rrobic:ns p.r.oduil.s par dPS inollu.,ques.
DC: t: polypeFotides dote ctc~ propricStés ant i_ microbiennes àcent prc~c~uiL~ par urm grande v~riPté
d~ E:S~7P[:P$ (anima.l es vu véqPtales) , chP~ le~,c?uelles ils W z~Licipent â dc:s mécani sme~ non-spéoi fi ic;ucs de c:lc~lcnse CQnr.l"F ~C.'.t; 7.nfeCt ~ Otlt~ .
Dans le c~t~ des mc~llu~que.~ ~~i.v~~lvc:~, nlZ
1t7 jusqu'à présel'1L identif~.é Gi'le~.z Myti.llas o7a11~provinc-.1c31i~~, ttn pel:~Lido dPn«mmé MGLr-1, apy~~rc_rutt: aux dc~,iensines d' irl:,PCaes [HUBERT Pfi al. , Eur. ,7. lüoc-_heru., 24Q, 302-301;, (1936) J ; des pepl.idc~s de la talttille dP.s déio.nsinr~g orle Pg~31 emen'L été: mis en évidcnc:e c:hP~ M. ytililc: edo.l.i. ,, 1~ ainsi qur~ dc.~ pPpt9.des dc':rlUmmé.S « m.yt.ilioe~ » [C:HARLET r_~.1 al . , ,7. !si «1 . Cheln. , l'!1, 21.E30t3-2J.$13, (1990) ; .
Tnveritt.uiw: ont ma i ntern3nL rais en Fvi c:lPnc~c de n«tivP~tlX peptides anal-lnie.e~c~t~ien.~ prOdtlltS tiar My~i,ltls rla..l.lopl-üvincial.i.s, qui sUnt diffe~rertt;~, des dPfen~;irxc;;
2~ M~_G1, et des Myt.ilines prPCFc~FmmFr'tL c~onnue.~.
La présente invention a ~c~ur objet des i~eptides ariti-rnicrol=~iPn.;, r~~~.rlorccln~;s ci-apré~
lttyl:icine~ » c~ui possèdent l.es t;aractPrj.,ti.que~:
rst~ivanGF~; , .
2~ - 1P1,7T; rtt~~:;:.:C' rrlUl5c:u7 ai rp P~;t, d' environ 4, 5 kDe ;
- leur pT est d' erlwir-on !3, 7 - ils rompt etlr'tcYnt 8 rés.ic~us cys Léinc, .
Selon un mc~c:~e de réalisai i.Qn j>rcfsré d' un pyt_.ic~e anti.-mi crabic_n conforme d l' invention, il :3U c;c~mp~ent~ 1n séduenc:p (I) ~;uivante (c.:ode 1 lc:Ltre) HXzHX2C:TpYX3t::X~TCFCGT11X~,CTX fiYX~(.',. FtX;,Z,HXyGKXlot_''.XllCXy, ,I~lt::~R
d:_ins l,~que~.lc~ . X1- 1~ au S, X~= V aLt H, X:5- Y cru W, X1= H
otr C;, X,'= ~ ou t~, X,;- R vu II, X~~= t; ~u L, Xe- N ou V, Xq= R
ou P, Xlo- L at~. M. X11= r' i~u A, X1~~= L ou V.
FEUILLE MODIFIÉE
Fmofan>;~~em zd.~ev. a :1y Avantageusement, un peptide conforme à
l'invention comprend l'une des séquences (Ia) ou (Ib) suivantes (code 1 lettre) .
HSHACTSYWCGKFCGTASCTHYLCRVLHPGKMCACVHCSR (Ia) HPHVCTSYYCSKFCGTAGCTRYGCRNLHRGKLCFCLHCSR (Ib) Les séquences (Ia) et (Ib) représentent les formes matures, isolées à partir de l'hémolymphe de Mytilus galloprovincialis, de 2 Myticines dénommées Myticine a et Myticine b, dont les ADNc ont également été
clonés par les Inventeurs. A titre d'illustration de l'objet de la présente invention, les caractéristiques des Myticines a et b sont plus spécifiquement indiquées ci-après.
La séquence d'ADNc et la séquence polypeptidique de la Myticine a sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID N0: 1 et SEQ ID N0: 2. La séquence d'ADNc et la séquence polypeptidique de la Myticine b, sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID N0: 3 et SEQ ID N0: 4.
Le peptide actif de 40 acides aminés, correspondant à la séquence (I), et plus particulièrement à l'une des séquences (Ia) et (Ib) est flanqué d'une séquence signal de 20 acides aminés, et d'un peptide C-terminal de 36 acides aminés. La séquence signal permettrait l'adressage du produit de traduction vers le réticulum endoplasmique. Le peptide C-terminal permettrait ensuite l'adressage vers les granules cytoplasmiques dans lesquels les Myticines sont stockées sous forme mature et/ou la protection de la cellule contre une éventuelle activité cytolytique du peptide mature.
La masse moléculaire de la forme mature de la Myticine a est de 4438 Da ; la masse moléculaire de la forme mature de la Myticine b est de 4562 Da.
La présente invention a ~c~ur objet des i~eptides ariti-rnicrol=~iPn.;, r~~~.rlorccln~;s ci-apré~
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rst~ivanGF~; , .
2~ - 1P1,7T; rtt~~:;:.:C' rrlUl5c:u7 ai rp P~;t, d' environ 4, 5 kDe ;
- leur pT est d' erlwir-on !3, 7 - ils rompt etlr'tcYnt 8 rés.ic~us cys Léinc, .
Selon un mc~c:~e de réalisai i.Qn j>rcfsré d' un pyt_.ic~e anti.-mi crabic_n conforme d l' invention, il :3U c;c~mp~ent~ 1n séduenc:p (I) ~;uivante (c.:ode 1 lc:Ltre) HXzHX2C:TpYX3t::X~TCFCGT11X~,CTX fiYX~(.',. FtX;,Z,HXyGKXlot_''.XllCXy, ,I~lt::~R
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ou P, Xlo- L at~. M. X11= r' i~u A, X1~~= L ou V.
FEUILLE MODIFIÉE
Fmofan>;~~em zd.~ev. a :1y Avantageusement, un peptide conforme à
l'invention comprend l'une des séquences (Ia) ou (Ib) suivantes (code 1 lettre) .
HSHACTSYWCGKFCGTASCTHYLCRVLHPGKMCACVHCSR (Ia) HPHVCTSYYCSKFCGTAGCTRYGCRNLHRGKLCFCLHCSR (Ib) Les séquences (Ia) et (Ib) représentent les formes matures, isolées à partir de l'hémolymphe de Mytilus galloprovincialis, de 2 Myticines dénommées Myticine a et Myticine b, dont les ADNc ont également été
clonés par les Inventeurs. A titre d'illustration de l'objet de la présente invention, les caractéristiques des Myticines a et b sont plus spécifiquement indiquées ci-après.
La séquence d'ADNc et la séquence polypeptidique de la Myticine a sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID N0: 1 et SEQ ID N0: 2. La séquence d'ADNc et la séquence polypeptidique de la Myticine b, sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID N0: 3 et SEQ ID N0: 4.
Le peptide actif de 40 acides aminés, correspondant à la séquence (I), et plus particulièrement à l'une des séquences (Ia) et (Ib) est flanqué d'une séquence signal de 20 acides aminés, et d'un peptide C-terminal de 36 acides aminés. La séquence signal permettrait l'adressage du produit de traduction vers le réticulum endoplasmique. Le peptide C-terminal permettrait ensuite l'adressage vers les granules cytoplasmiques dans lesquels les Myticines sont stockées sous forme mature et/ou la protection de la cellule contre une éventuelle activité cytolytique du peptide mature.
La masse moléculaire de la forme mature de la Myticine a est de 4438 Da ; la masse moléculaire de la forme mature de la Myticine b est de 4562 Da.
3 Les Myticines ne présentent aucune homologie significative avec les peptides anti-microbiens connus dans l'art antérieur, et définissent un nouveau groupe de peptides anti-microbiens.
Les Myticines peuvent être obtenues par extraction à partir des mollusques qui les produisent, ou bien par synthèse peptidique, ou, avantageusement, par génie génétique, en exprimant au moins une séquence d'acide nucléique codant une Myticine, dans une cellule hôte appropriée.
La présente Invention englobe également des acides nucléiques comprenant une séquence codant une Myticine, tel que définie ci-dessus.
Des acides nucléiques conformes à l'invention, peuvent être obtenus par criblage de banques d'acide nucléique à l'aide d'oligonucléotides dérivés des séquences SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 3, ou de leurs séquences complémentaires. Les oligonucléotides utilisables dans ce but font également partie de l'objet de la présente invention ; avantageusement, ces oligonucléotides comprennent au moins 15 pb, et de préférence au moins 20 pb, de la portion codante de l'une des séquences SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 3, ou de son complémentaire.
Les acides nucléiques conformes à l'invention englobent également les cassettes d'expression, comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant une Myticine, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
Par « promoteur approprié » on entend tout promoteur fonctionnel dans la cellule-hôte destinée à
héberger la cassette d'expression. I1 peut s'agir d'un promoteur constitutif ou d'un promoteur inductible ~ il peut également s'agir, dans le cas où la cassette est destinée à l'expression d'une Myticine chez un animal ou une plante, d'un promoteur tissu-spécifique.
Les Myticines peuvent être obtenues par extraction à partir des mollusques qui les produisent, ou bien par synthèse peptidique, ou, avantageusement, par génie génétique, en exprimant au moins une séquence d'acide nucléique codant une Myticine, dans une cellule hôte appropriée.
La présente Invention englobe également des acides nucléiques comprenant une séquence codant une Myticine, tel que définie ci-dessus.
Des acides nucléiques conformes à l'invention, peuvent être obtenus par criblage de banques d'acide nucléique à l'aide d'oligonucléotides dérivés des séquences SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 3, ou de leurs séquences complémentaires. Les oligonucléotides utilisables dans ce but font également partie de l'objet de la présente invention ; avantageusement, ces oligonucléotides comprennent au moins 15 pb, et de préférence au moins 20 pb, de la portion codante de l'une des séquences SEQ ID N0: 1 ou SEQ ID N0: 3, ou de son complémentaire.
Les acides nucléiques conformes à l'invention englobent également les cassettes d'expression, comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant une Myticine, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
Par « promoteur approprié » on entend tout promoteur fonctionnel dans la cellule-hôte destinée à
héberger la cassette d'expression. I1 peut s'agir d'un promoteur constitutif ou d'un promoteur inductible ~ il peut également s'agir, dans le cas où la cassette est destinée à l'expression d'une Myticine chez un animal ou une plante, d'un promoteur tissu-spécifique.
4 PCT/FR00/01975 Une cassette d'expression conforme à
l'invention peut comprendre également au moins une séquence codant une séquence d'adressage appropriée ;
ladite séquence d'adressage peut être choisie parmi celles qui sont naturellement associées aux Myticines, telles que les séquences signal et/ou les séquences C-terminales associées aux isoformes Myticine a et Myticine b décrites ci-dessus ; il est également possible de choisir une ou plusieurs séquences d'adressage hétérologues, fonctionnelles dans une cellule-hôte donnée . il peut s'agir notamment de séquences permettant l'adressage d'une Myticine vers un compartiment cellulaire déterminé, ou sa sécrétion dans le milieu de culture.
L'Invention a également pour objet .
- des vecteurs recombinants caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention, codant une Myticine, et en particulier des vecteurs comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
- des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention. I1 peut s'agir de cellules en culture, ou de cellules faisant partie d'un organisme pluricellulaire, animal ou plante. La séquence d'acide nucléique conforme à l'invention présente dans une cellule transformée peut être soit incorporée dans l'ADN
chromosomique de ladite cellule, soit être portée par un vecteur extra-chromosomique.
L' invention a également pour obj et un procédé
de production d'une Myticine, caractérisé en ce qu'il comprend l'expression de ladite Myticine, dans au moins une cellule transformée conforme à l'invention.
Les Myticines conformes à l'invention peuvent être exprimées dans des cultures de cellules transformées en utilisant des techniques similaires à celles utilisées pour des peptides antimicrobiens de l'art antérieur, par exemple dans des cellules d'insecte, comme décrit par HELLERS et al. [Eur. J. Biochem. 199, pp. 435-439, (1991)] pour les cécropines, ou dans la levure, comme
l'invention peut comprendre également au moins une séquence codant une séquence d'adressage appropriée ;
ladite séquence d'adressage peut être choisie parmi celles qui sont naturellement associées aux Myticines, telles que les séquences signal et/ou les séquences C-terminales associées aux isoformes Myticine a et Myticine b décrites ci-dessus ; il est également possible de choisir une ou plusieurs séquences d'adressage hétérologues, fonctionnelles dans une cellule-hôte donnée . il peut s'agir notamment de séquences permettant l'adressage d'une Myticine vers un compartiment cellulaire déterminé, ou sa sécrétion dans le milieu de culture.
L'Invention a également pour objet .
- des vecteurs recombinants caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention, codant une Myticine, et en particulier des vecteurs comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
- des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention. I1 peut s'agir de cellules en culture, ou de cellules faisant partie d'un organisme pluricellulaire, animal ou plante. La séquence d'acide nucléique conforme à l'invention présente dans une cellule transformée peut être soit incorporée dans l'ADN
chromosomique de ladite cellule, soit être portée par un vecteur extra-chromosomique.
L' invention a également pour obj et un procédé
de production d'une Myticine, caractérisé en ce qu'il comprend l'expression de ladite Myticine, dans au moins une cellule transformée conforme à l'invention.
Les Myticines conformes à l'invention peuvent être exprimées dans des cultures de cellules transformées en utilisant des techniques similaires à celles utilisées pour des peptides antimicrobiens de l'art antérieur, par exemple dans des cellules d'insecte, comme décrit par HELLERS et al. [Eur. J. Biochem. 199, pp. 435-439, (1991)] pour les cécropines, ou dans la levure, comme
5 décrit par REICHHART et al. [Invertebrate Reproduction and Development, 21, pp. 15-24, (1992)].
Elles peuvent également être exprimées dans des animaux ou des plantes transgéniques, pour augmenter la résistance de ceux-ci aux infections, comme décrit par exemple par JAYNES et al., [Plant Science, 89, pp. 43-53 (1993)] dans le cas de peptides analogues de la cécropine B, exprimés dans des plants de tabac transgénique, ou par NORELLI et al. [Euphytica, 77, pp. 123-128 (1994)] pour des plants de pommiers transgéniques exprimant le gène de l'attacine-E.
Les Myticines sont utilisables en particulier pour l'obtention de produits et en particulier de médicaments anti-infectieux, par exemple anti-bactériens ou fongicides.
De tels produits trouvent leur application pour la prévention et le traitement de différentes maladies microbiennes, dans des secteurs très variés, en particulier dans les domaines de la santé et de l'agriculture, et dans celui de l'aquaculture, pour limiter le développement de maladies infectieuses dans les élevages.
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de purification et de caractérisation des Myticines.
EXED~LE 1 . ISO?~ATION DE PEPTIDES ANTI-MICROBIENS A
PARTIR DE h'HEMOhYI~HE DE MYTILUS GALZOPROVINCIALIS.
Préparation des fractions de l'hémolymphe Une réaction immunitaire est induite chez des moules (Mytilus galloprovincialis) adultes selon le protocole suivant . la coquille est vidée de son liquide,
Elles peuvent également être exprimées dans des animaux ou des plantes transgéniques, pour augmenter la résistance de ceux-ci aux infections, comme décrit par exemple par JAYNES et al., [Plant Science, 89, pp. 43-53 (1993)] dans le cas de peptides analogues de la cécropine B, exprimés dans des plants de tabac transgénique, ou par NORELLI et al. [Euphytica, 77, pp. 123-128 (1994)] pour des plants de pommiers transgéniques exprimant le gène de l'attacine-E.
Les Myticines sont utilisables en particulier pour l'obtention de produits et en particulier de médicaments anti-infectieux, par exemple anti-bactériens ou fongicides.
De tels produits trouvent leur application pour la prévention et le traitement de différentes maladies microbiennes, dans des secteurs très variés, en particulier dans les domaines de la santé et de l'agriculture, et dans celui de l'aquaculture, pour limiter le développement de maladies infectieuses dans les élevages.
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de purification et de caractérisation des Myticines.
EXED~LE 1 . ISO?~ATION DE PEPTIDES ANTI-MICROBIENS A
PARTIR DE h'HEMOhYI~HE DE MYTILUS GALZOPROVINCIALIS.
Préparation des fractions de l'hémolymphe Une réaction immunitaire est induite chez des moules (Mytilus galloprovincialis) adultes selon le protocole suivant . la coquille est vidée de son liquide,
6 et 100 ~,1 d'une suspension de bactéries (109 bactéries/ml) ou de champignons (suspension d'hyphes à 1 DO à 600nm), préalablement tués par la chaleur sont injectés dans le muscle adducteur. L'hémolymphe (approximativement 0,5 ml/animal) est prélevée à partir du muscle postérieur adducteur à l'aide d'une seringue en présence de 1 volume de tampon anti-agrégant MAS (Modified Alsevier Solution) et centrifugée immédiatement à 800g pendant 15 min à 4°C.
Le surnageant, correspondant à la fraction plasmatique, est additionné d'aprotinine (5~.g/ml) et congelé (-80°C) jusqu'à utilisation, et le culot cellulaire est séché et conservé à -80°C jusqu'à utilisation.
Purification des Myticines.
Fraction plasmatique . Le plasma est dilué
(1:l v/v) dans de l'eau stérilisée par ultrafiltration (MilliQ) additionnée de 0,1% d'acide trifluoroacétique.
Le pH est amené à 3,9 par addition d'HC1 1M, sous agitation dans un bain-marie glacé pendant 30 min. Après centrifugation (10000 g, 20 min, 4°C) le surnageant est recueilli et maintenu à 4°C jusqu'à utilisation.
Hémocytes . Après décongélation le culot d'hémocytes est resuspendu dans 5 volumes de tampon Tris 50 mM, pH 8.7, contenant 50mM NaCl, et homogénéisé. Après centrifugation (10000 g, 20 min, 4°C), le culot contenant les organites cellulaires est repris dans 3 volumes d' acide acétique 2 M, et traité par sonication (3 X 30s) dans dans un bain-marie glacé. Après élimination des débris par centrifugation (10000 g, 20 min, 4°C) l'extrait acide est conservé à 4°C jusqu'à utilisation.
Purification HPLC
La fraction plasmatique ou les extraits acides d'hémocytes sont déposés sur des colonnes SEP-PAK C18 VAC
(WATERS ASSOCIATES) pré-équilibrées par de l'eau acidifiée (0,05% acide trifluoroacétique). Après lavage à
l'eau acidifiée, on effectue 2 élutions successives par des solutions d'acétonitrile à 10% et 40~ dans de l'eau
Le surnageant, correspondant à la fraction plasmatique, est additionné d'aprotinine (5~.g/ml) et congelé (-80°C) jusqu'à utilisation, et le culot cellulaire est séché et conservé à -80°C jusqu'à utilisation.
Purification des Myticines.
Fraction plasmatique . Le plasma est dilué
(1:l v/v) dans de l'eau stérilisée par ultrafiltration (MilliQ) additionnée de 0,1% d'acide trifluoroacétique.
Le pH est amené à 3,9 par addition d'HC1 1M, sous agitation dans un bain-marie glacé pendant 30 min. Après centrifugation (10000 g, 20 min, 4°C) le surnageant est recueilli et maintenu à 4°C jusqu'à utilisation.
Hémocytes . Après décongélation le culot d'hémocytes est resuspendu dans 5 volumes de tampon Tris 50 mM, pH 8.7, contenant 50mM NaCl, et homogénéisé. Après centrifugation (10000 g, 20 min, 4°C), le culot contenant les organites cellulaires est repris dans 3 volumes d' acide acétique 2 M, et traité par sonication (3 X 30s) dans dans un bain-marie glacé. Après élimination des débris par centrifugation (10000 g, 20 min, 4°C) l'extrait acide est conservé à 4°C jusqu'à utilisation.
Purification HPLC
La fraction plasmatique ou les extraits acides d'hémocytes sont déposés sur des colonnes SEP-PAK C18 VAC
(WATERS ASSOCIATES) pré-équilibrées par de l'eau acidifiée (0,05% acide trifluoroacétique). Après lavage à
l'eau acidifiée, on effectue 2 élutions successives par des solutions d'acétonitrile à 10% et 40~ dans de l'eau
7 acidifiée (0,05% acide trifluoroacétique). Les fractions obtenues sont lyophilisées et reconstituées avec de l'eau ultrafiltrée avant d'être soumises à une chromatographie HPLC en phase inverse.
Toutes les étapes de purification HPLC ont été
effectuées sur un système HPLC BECKMAN GOLD HPLC équipé
d'un détecteur BECKMAN 168. L'élution est suivie par mesure de l'absorption UV à 225 nm.
Etape l: les fractions éluées sur SEP-PAK à
40% d'acétonitrile sont déposées sur une colonne HPLC
phase inverse SEPHASIL C18 (250 mm X 4,1 mm) (PHARMACIA).
L'élution est effectuée par un gradient linéaire de 5 à
50% d' acétonitrile dans l' eau acidifiée, pendant 90 min à
un débit de 0,9 ml/min. Les fractions correspondant aux pics d'absorbance sont collectées dans des tubes de polypropylène (MICROSORB 75 X 12 mm, NUNC IMMUNOTUBES), séchées sous vide, et reconstituées avec de l'eau ultrafiltrée, préalablement au test de leur activité
antimicrobienne.
Etape 2: Les fractions actives récupérées à
l'issue de l'étape 1 sont déposées sur une colonne HPLC
phase inverse SEPHASIL C8 (250 mm X 4,1 mm) (PHARMACIA).
L'élution est effectuée, à un débit de 0,9 ml/min, par un gradient linéaire de 20 à 30% d'acétonitrile dans l'eau acidifiée pendant 40 min.
Etape 3: Les fractions actives récupérées à
l'issue de l'étape 2, sont déposées sur une colonne SEPHASIL C18, (250 mm X 4,1 mm) (PHARMACIA) en utilisant le gradient biphasique décrit dans l'étape 2, à un débit de 0,9 ml/min.
Etape 4: La dernière étape de purification est effectuée sur une colonne phase inverse DELTA PAK HPI C18 (2 X 150 mm) (WATERS AS SOCIATES) en utilisant le gradient biphasique décrit dans l'étape 2, à un débit de 0,3 ml%min.
Toutes les étapes de purification HPLC ont été
effectuées sur un système HPLC BECKMAN GOLD HPLC équipé
d'un détecteur BECKMAN 168. L'élution est suivie par mesure de l'absorption UV à 225 nm.
Etape l: les fractions éluées sur SEP-PAK à
40% d'acétonitrile sont déposées sur une colonne HPLC
phase inverse SEPHASIL C18 (250 mm X 4,1 mm) (PHARMACIA).
L'élution est effectuée par un gradient linéaire de 5 à
50% d' acétonitrile dans l' eau acidifiée, pendant 90 min à
un débit de 0,9 ml/min. Les fractions correspondant aux pics d'absorbance sont collectées dans des tubes de polypropylène (MICROSORB 75 X 12 mm, NUNC IMMUNOTUBES), séchées sous vide, et reconstituées avec de l'eau ultrafiltrée, préalablement au test de leur activité
antimicrobienne.
Etape 2: Les fractions actives récupérées à
l'issue de l'étape 1 sont déposées sur une colonne HPLC
phase inverse SEPHASIL C8 (250 mm X 4,1 mm) (PHARMACIA).
L'élution est effectuée, à un débit de 0,9 ml/min, par un gradient linéaire de 20 à 30% d'acétonitrile dans l'eau acidifiée pendant 40 min.
Etape 3: Les fractions actives récupérées à
l'issue de l'étape 2, sont déposées sur une colonne SEPHASIL C18, (250 mm X 4,1 mm) (PHARMACIA) en utilisant le gradient biphasique décrit dans l'étape 2, à un débit de 0,9 ml/min.
Etape 4: La dernière étape de purification est effectuée sur une colonne phase inverse DELTA PAK HPI C18 (2 X 150 mm) (WATERS AS SOCIATES) en utilisant le gradient biphasique décrit dans l'étape 2, à un débit de 0,3 ml%min.
8 EXEMPLE 2 . ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES PEPTIDES OBTENUS
Micro-organismes utilisés:
La liste des micro-organismes utilisés pour déterminer les activités anti-microbiennes de la Myticine a et de la Myticine b est indiquée ci-après, dans le Tableau 1 Essais antibactériens et détermination de la CMB:
La concentration minimale bactéricide (CMB) des peptides a été déterminée selon le protocole décrit par HANCOCK et al. [http://www.interchg.ubc.ca/bobh/
methods.htm].
On effectue une série de dilutions successives au 1/2 des peptides dans une solution aqueuse contenant 0,01 d'acide acétique et 0,2~ de sérum albumine bovine (BSA) .
Des aliquotes de 10,1 de chaque dilution sont incubées dans des plaques stériles de microtitation en polypropylène à 96 puits, en présence de 100 ~,1 de suspension bactérienne à une densité optique de départ A6oo - 0, 001 dans du milieu liquide MUELLER HINTON BROTH.
L'incubation est effectuée pendant 18 h à 37°C sous agitation, sauf dans le cas des bactéries marines, pour lesquelles l'incubation est effectuée à 25°C. La CMB est déterminée en étalant sur milieu solide MUELLER HINTON
AGAR le contenu des puits correspondant aux 3 premières dilutions pour lesquelles on n'observe aucune croissance bactérienne, et en incubant à 37°C pendant 18 heures. La plus faible concentration de peptide qui prévient toute formation résiduelle de colonies correspond à la CMB.
Activité antifongique L'activité antifongique a été déterminée par calcul de la CMI (concentration minimale inhibitrice) dans un test d'inhibition de croissance de Fusarium oxysporum en phase liquide, selon le protocole décrit par FELHBAUM et al [J. Biol. Chem., 269:33159-63, (1994)].
Micro-organismes utilisés:
La liste des micro-organismes utilisés pour déterminer les activités anti-microbiennes de la Myticine a et de la Myticine b est indiquée ci-après, dans le Tableau 1 Essais antibactériens et détermination de la CMB:
La concentration minimale bactéricide (CMB) des peptides a été déterminée selon le protocole décrit par HANCOCK et al. [http://www.interchg.ubc.ca/bobh/
methods.htm].
On effectue une série de dilutions successives au 1/2 des peptides dans une solution aqueuse contenant 0,01 d'acide acétique et 0,2~ de sérum albumine bovine (BSA) .
Des aliquotes de 10,1 de chaque dilution sont incubées dans des plaques stériles de microtitation en polypropylène à 96 puits, en présence de 100 ~,1 de suspension bactérienne à une densité optique de départ A6oo - 0, 001 dans du milieu liquide MUELLER HINTON BROTH.
L'incubation est effectuée pendant 18 h à 37°C sous agitation, sauf dans le cas des bactéries marines, pour lesquelles l'incubation est effectuée à 25°C. La CMB est déterminée en étalant sur milieu solide MUELLER HINTON
AGAR le contenu des puits correspondant aux 3 premières dilutions pour lesquelles on n'observe aucune croissance bactérienne, et en incubant à 37°C pendant 18 heures. La plus faible concentration de peptide qui prévient toute formation résiduelle de colonies correspond à la CMB.
Activité antifongique L'activité antifongique a été déterminée par calcul de la CMI (concentration minimale inhibitrice) dans un test d'inhibition de croissance de Fusarium oxysporum en phase liquide, selon le protocole décrit par FELHBAUM et al [J. Biol. Chem., 269:33159-63, (1994)].
9 On effectue une série de dilutions successives au 1/2 des peptides, comme indiqué ci-dessus pour la détermination de l'activité antibactérienne.
80.1 de spores suspendues (concentration finale, 104 spores/ml) dans du milieu « Potato Dextrose Broth » (DIFCO) sont ajoutés à 101 de solution de peptide dans des plaques stériles de microtitation en polypropylène à 96 puits. Le volume final est ajusté à
1001 par addition d'eau. L'inhibition de croissance est déterminée après une incubation de 24 heures à 25°C à
l'obscurité, par observation au microscope et mesure de l'augmentation de la D06oo- La valeur de la CMI correspond à un intervalle (a-b) de concentrations en peptide, où
(a) représente la concentration la plus élevée à laquelle on observe une croissance, et (b) représente la concentration la plus faible qui induit 100 d'inhibition de croissance.
Activité anti-protozoaire Le protozoaire parasite des huitres, Perkinsus marinus est cultivé en milieu DMEM (GIBCO), selon le protocole décrit par GAUTHIER et VASTA [J. Invertebr.
Pathol., 66, 156-168, (1995)].
80.1 de spores suspendues (concentration finale, 104 spores/ml) dans du milieu « Potato Dextrose Broth » (DIFCO) sont ajoutés à 101 de solution de peptide dans des plaques stériles de microtitation en polypropylène à 96 puits. Le volume final est ajusté à
1001 par addition d'eau. L'inhibition de croissance est déterminée après une incubation de 24 heures à 25°C à
l'obscurité, par observation au microscope et mesure de l'augmentation de la D06oo- La valeur de la CMI correspond à un intervalle (a-b) de concentrations en peptide, où
(a) représente la concentration la plus élevée à laquelle on observe une croissance, et (b) représente la concentration la plus faible qui induit 100 d'inhibition de croissance.
Activité anti-protozoaire Le protozoaire parasite des huitres, Perkinsus marinus est cultivé en milieu DMEM (GIBCO), selon le protocole décrit par GAUTHIER et VASTA [J. Invertebr.
Pathol., 66, 156-168, (1995)].
10 ~,M de peptide purifié sont additionnés à
4 X 104 P. marinus, dans de l'eau de mer (volume final 20 ~,l). Le mélange est incubé pendant 1 heure à
température de la pièce. La viabilité des parasites est estimée par coloration à l'orange d'acridine et au bromure d'éthidium, comme décrit par MORVAN et al. [J.
Invertebr. Pathol., 69, 177-82, (1997)]. La viabilité
maximale est évaluée, à titre de contrôle positif, dans des échantillons dans lesquels le peptide n'a pas été
ajouté.
Les résultats des différentes expérimentations effectuées, pour les peptides Myticine a et Myticine b sont illustrées par le Tableau 1 ci-dessous ; les activités biologiques sont exprimées en ~tM.
TART,FAT1 l Myticine a Myticine b BACTERIES
Gram-positif Micrococcus luteus 2,25-4,5 1-2 Bacilles megaterium 2,45-4,5 1-2 Staphylococcus aureus >20 >20 Listeria monocytogenes >20 >20 Aerococcus viridans 4,5-9 2-4 Enterococcus faecalis >20 N.D
Gram-ngatif Escherichia coli D31 >20 10-20 Salmonella newport >20 >20 S. typhimurium >20 >20 Brucella suis >20 >20 Pseudomonas aeruginosa >20 N.D
Enteromonas aerogenes >20 N.D
Vibrio alginolyticus >20 >20 V. vulnificus >20 >20 V. splendides >20 >20 CHAMPIGNONS
Fusarium oxysporum >20 5-10 PROTOZOAIRE PARASITE D'HUITRES
Perkinsus marines >20 ~ >20 N.D : non déterminé
Ces résultats montrent que les 2 peptides sont actifs en particulier sur Micrococcus luteus ; le peptide 5 Myticine b appara3t en outre plus actif que le peptide Myticine a sur Micrococcus luteus, Escherichia coli, et Fusarium oxysporum.
EXEMPLE 3 . CLONAGE DES ADN DES PEPTIDES MYTICINE.
Une banque d'ADNc a été construite dans le 10 vecteur ZAP EXPRESS (STRATAGENE) à partir des ARN poly(A)+
totaux d'hémocytes de moules adultes. Une sonde d'ADN
représentant 83 pb de l'ADNc de la Myticine a a été
construite en utilisant le kit de clonage PCR SCRIPT Amp (SK+) (STRATAGENE), et marquée par amorcage aléatoire en utilisant le kit de marquage d'ADN READY-TO-GO
(PHARMACIA), et utilisée pour cribler la banque d'ADN
transférée sur membranes HYBOND-N, (AMERSHAM). Des hybridations à stringence élevée ont été effectuées pendant une nuit à 65°C en solution de Denhardt 5X, 5X
SSPE, 0,1 ~SDS, 100 ~,g/ml d'ADN de sperme de saumon. Les
4 X 104 P. marinus, dans de l'eau de mer (volume final 20 ~,l). Le mélange est incubé pendant 1 heure à
température de la pièce. La viabilité des parasites est estimée par coloration à l'orange d'acridine et au bromure d'éthidium, comme décrit par MORVAN et al. [J.
Invertebr. Pathol., 69, 177-82, (1997)]. La viabilité
maximale est évaluée, à titre de contrôle positif, dans des échantillons dans lesquels le peptide n'a pas été
ajouté.
Les résultats des différentes expérimentations effectuées, pour les peptides Myticine a et Myticine b sont illustrées par le Tableau 1 ci-dessous ; les activités biologiques sont exprimées en ~tM.
TART,FAT1 l Myticine a Myticine b BACTERIES
Gram-positif Micrococcus luteus 2,25-4,5 1-2 Bacilles megaterium 2,45-4,5 1-2 Staphylococcus aureus >20 >20 Listeria monocytogenes >20 >20 Aerococcus viridans 4,5-9 2-4 Enterococcus faecalis >20 N.D
Gram-ngatif Escherichia coli D31 >20 10-20 Salmonella newport >20 >20 S. typhimurium >20 >20 Brucella suis >20 >20 Pseudomonas aeruginosa >20 N.D
Enteromonas aerogenes >20 N.D
Vibrio alginolyticus >20 >20 V. vulnificus >20 >20 V. splendides >20 >20 CHAMPIGNONS
Fusarium oxysporum >20 5-10 PROTOZOAIRE PARASITE D'HUITRES
Perkinsus marines >20 ~ >20 N.D : non déterminé
Ces résultats montrent que les 2 peptides sont actifs en particulier sur Micrococcus luteus ; le peptide 5 Myticine b appara3t en outre plus actif que le peptide Myticine a sur Micrococcus luteus, Escherichia coli, et Fusarium oxysporum.
EXEMPLE 3 . CLONAGE DES ADN DES PEPTIDES MYTICINE.
Une banque d'ADNc a été construite dans le 10 vecteur ZAP EXPRESS (STRATAGENE) à partir des ARN poly(A)+
totaux d'hémocytes de moules adultes. Une sonde d'ADN
représentant 83 pb de l'ADNc de la Myticine a a été
construite en utilisant le kit de clonage PCR SCRIPT Amp (SK+) (STRATAGENE), et marquée par amorcage aléatoire en utilisant le kit de marquage d'ADN READY-TO-GO
(PHARMACIA), et utilisée pour cribler la banque d'ADN
transférée sur membranes HYBOND-N, (AMERSHAM). Des hybridations à stringence élevée ont été effectuées pendant une nuit à 65°C en solution de Denhardt 5X, 5X
SSPE, 0,1 ~SDS, 100 ~,g/ml d'ADN de sperme de saumon. Les
11 filtres préalablement rincés à 65°C en solution 0,5 X SSC
contenant 0,1 % SDS, ont été autoradiographiés. Un criblage secondaire a été effectué pour purifier les clones positifs. Les phagemides ont été obtenus par excision in vivo et leurs 2 brins ont été séquencés.
110 clones positifs ont été obtenus. Parmi ces clones, 4 ont été séquencés, et correspondent aux peptides Myticine a et Myticine B.
Dans les 2 cas, la séquence en acides aminés déduite du cadre de lecture ouverte commence par un peptide signal de 20 acides aminés ; ce peptide-signal est directement suivi, à son extrémité C-terminale, par un peptide de 40 acides aminés, débutant par un résidu histidine, qui correspond à la forme active du peptide ;
ce peptide actif est suivi par une extension C-terminale de 36 acides aminés.
WO 01/04294 CA 02378452 2002-0l-04 pCT/FR00/01975 LISTE DE SÉQUENCES
<110> CNRS
IFREMER
ROCH, Philippe MITTA, Guillaume HUBERT, Florence NOEL, Thierry <120> Peptides anti-microbiens de mollusques <130> MJPcb644/43 <140>
<141>
<150> FR 9908858 <151> 1999-07-08 <160> 4 <210> 1 <211> 663 <212> ADN
<213> Mytilus incialis galloprov <220>
<221> CDS
<222> (43)..(330) <220>
<221> mat_peptide <222> (103)..(222) <220>
<221> sig peptide <222> (43)..(102) <400> 1 aaggataata ttttgattta at atgaaggcaaca 54 actgcaaact caaacgtaca MetLysAlaThr atc ttg tta gca ctagtg gcagtctttgtc gcaggtacggaagct 102 gtt Ile Leu Leu Ala LeuVal AlaValPheVal AlaGlyThrGluAla Val cat tcg cac gct acatca tactggtgtggt aagttttgtggaact 150 tgt His Ser His Ala ThrSer TyrTrpCysGly LysPheCysGlyThr Cys gct agt tgc aca tatcta tgcagagtactc catcccggtaaaatg 198 cat Ala Ser Cys Thr TyrLeu CysArgValLeu HisProGlyLysMet His tgc gca tgt gtt tgcagc agggtgaacaat cctttcagagttaat 246 cat Cys Ala Cys Val,HisCysSer ArgValAsnAsn ProPheArgValAsn WO 01/04294 CA 02378452 2002-O1-04 pCT/FR00/01975 caa gtt gct aaa agt att aac gat ttg gat tac act cca ata atg aag 294 Gln Val A1a Lys Ser I1e Asn Asp Leu Asp Tyr Thr Pro Ile Met Lys tcg atg gaa aac ttg gac aat gga atg gat atg tta taagcaaaca 340 Ser Met Glu Asn Leu Asp Asn Gly Met Asp Met Leu acttatgcaa tgcagatcac aactgtgaat ctttgctatc attctcactg cttttcacct 400 ttcaacaaac gaaaaattat cagcaacttg aaaaataaca aacttgagtc atgtctgttc 460 agtttccagt ctaatattta tatcattata tgaaaggtat aacaaaatta gtaccattgt 520 gttctaatag aaacaattta taaacaagaa acattacact ttaagtataa attaacagga 580 ttttgtcctg cagctgtttt atctttcttt tctcagctat agtcttctga ttgtaataaa 640 atagcttgaa aaaaaaaaaa aaa 663 <210> 2 <211> 96 <212> PRT
<213> Mytilus galloprovincialis <400> 2 Met Lys Ala Thr Ile Leu Leu Ala Val Leu Val Ala Val Phe Val Ala Gly Thr Glu Ala His Ser His Ala Cys Thr Ser Tyr Trp Cys Gly Lys Phe Cys Gly Thr Ala Ser Cys Thr His Tyr Leu Cys Arg Val Leu His Pro Gly Lys Met Cys Ala Cys Val His Cys Ser Arg Val Asn Asn Pro Phe Arg Val Asn Gln Val Ala Lys Ser Ile Asn Asp Leu Asp Tyr Thr Pro Ile Met Lys Ser Met Glu Asn Leu Asp Asn Gly Met Asp Met Leu <210> 3 <211> 681 <212> ADN
<213> Mytilus galloprovincialis <220>
<221> CDS
<222> (13)..(300) <220>
<221> mat_peptide <222> (73)..(192) WO 01/04294 CA 02378452 2002-O1-04 pCT/FR00/01975 <220>
<221> sig_peptide <222> (13)..(72) <400> 3 caaacgtaca ac atg aag gca aca atg ttg tta gca gtt gta gtg gct gtc 51 Met Lys Ala Thr Met Leu Leu Ala Val Val Val Ala Val tttgtcgca ggtacagaa gctcatccgcat gtttgcacatcg tactac 99 PheValAla GlyThrGlu AlaHisProHis ValCysThrSer TyrTyr tgtagcaag ttttgtggg actgctggttgc acacgttatgga tgccga 147 CysSerLys PheCysGly ThrAlaGlyCys ThrArgTyrGly CysArg aatctccat cgcgggaag ctttgcttctgt cttcattgcagc agggtg 195 AsnLeu.His ArgGlyLys LeuCysPheCys LeuHisCysSer ArgVa1 aagttcccg tttggagca actcaagatgct aaaagtatgaac gaactg 243 LysPhePro PheGlyAla ThrGlnAspAla LysSerMetAsn GluLeu gaatacact ccaataatg aagtcgatggaa aatttggacaac ggaatg 291 GluTyrThr ProIleMet LysSerMetGlu AsnLeuAspAsn GlyMet gatatgtta taagcaaact tgtatacttt 340 tatgacatga agatcacaac AspMetLeu tgctattcct gtatccgctt tactcctttc ttcacacttt gtacggaatc cgtcaacaga 400 aaattcatca tcaacttgaa aactaacaaa agatgtgtcg cacacgttac actcaccagt 460 ccataagtta tatcattaaa aaaagatgaa tcaagttacc gttaacgtgt gttcagatat 520 atctctgaca gaagaagtaa ctgttaacaa gaaatactgt tttccctcaa gttattaaaa 580 attagaagtc tccctgcaac tgttttatct ttccttactc agttcttttt tcatgttcta 640 ataaaacagt ttgaaatgaa caaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 681 <210> 4 <211> 96 <212> PRT
<213> Mytilus galloprovincialis <400> 4 Met Lys Ala Thr Met Leu Leu A1a Val Val Val Ala Va1 Phe Val Ala Gly Thr Glu Ala His Pro His Val Cys Thr Ser Tyr Tyr Cys Ser Lys 20~ 25 30 Phe Cys Gly Thr Ala Gly Cys Thr Arg Tyr Gly Cys Arg Asn Leu His WO 01/04294 CA 02378452 2002-O1-04 pCT~00/01975 Arg Gly Lys Leu Cys Phe Cys Leu His Cys Ser Arg Val Lys Phe Pro Phe Gly Ala Thr Gln Asp Ala Lys Ser Met Asn Glu Leu Glu Tyr Thr Pro Ile Met Lys Ser Met Glu Asn Leu Asp Asn Gly Met Asp Met Leu
contenant 0,1 % SDS, ont été autoradiographiés. Un criblage secondaire a été effectué pour purifier les clones positifs. Les phagemides ont été obtenus par excision in vivo et leurs 2 brins ont été séquencés.
110 clones positifs ont été obtenus. Parmi ces clones, 4 ont été séquencés, et correspondent aux peptides Myticine a et Myticine B.
Dans les 2 cas, la séquence en acides aminés déduite du cadre de lecture ouverte commence par un peptide signal de 20 acides aminés ; ce peptide-signal est directement suivi, à son extrémité C-terminale, par un peptide de 40 acides aminés, débutant par un résidu histidine, qui correspond à la forme active du peptide ;
ce peptide actif est suivi par une extension C-terminale de 36 acides aminés.
WO 01/04294 CA 02378452 2002-0l-04 pCT/FR00/01975 LISTE DE SÉQUENCES
<110> CNRS
IFREMER
ROCH, Philippe MITTA, Guillaume HUBERT, Florence NOEL, Thierry <120> Peptides anti-microbiens de mollusques <130> MJPcb644/43 <140>
<141>
<150> FR 9908858 <151> 1999-07-08 <160> 4 <210> 1 <211> 663 <212> ADN
<213> Mytilus incialis galloprov <220>
<221> CDS
<222> (43)..(330) <220>
<221> mat_peptide <222> (103)..(222) <220>
<221> sig peptide <222> (43)..(102) <400> 1 aaggataata ttttgattta at atgaaggcaaca 54 actgcaaact caaacgtaca MetLysAlaThr atc ttg tta gca ctagtg gcagtctttgtc gcaggtacggaagct 102 gtt Ile Leu Leu Ala LeuVal AlaValPheVal AlaGlyThrGluAla Val cat tcg cac gct acatca tactggtgtggt aagttttgtggaact 150 tgt His Ser His Ala ThrSer TyrTrpCysGly LysPheCysGlyThr Cys gct agt tgc aca tatcta tgcagagtactc catcccggtaaaatg 198 cat Ala Ser Cys Thr TyrLeu CysArgValLeu HisProGlyLysMet His tgc gca tgt gtt tgcagc agggtgaacaat cctttcagagttaat 246 cat Cys Ala Cys Val,HisCysSer ArgValAsnAsn ProPheArgValAsn WO 01/04294 CA 02378452 2002-O1-04 pCT/FR00/01975 caa gtt gct aaa agt att aac gat ttg gat tac act cca ata atg aag 294 Gln Val A1a Lys Ser I1e Asn Asp Leu Asp Tyr Thr Pro Ile Met Lys tcg atg gaa aac ttg gac aat gga atg gat atg tta taagcaaaca 340 Ser Met Glu Asn Leu Asp Asn Gly Met Asp Met Leu acttatgcaa tgcagatcac aactgtgaat ctttgctatc attctcactg cttttcacct 400 ttcaacaaac gaaaaattat cagcaacttg aaaaataaca aacttgagtc atgtctgttc 460 agtttccagt ctaatattta tatcattata tgaaaggtat aacaaaatta gtaccattgt 520 gttctaatag aaacaattta taaacaagaa acattacact ttaagtataa attaacagga 580 ttttgtcctg cagctgtttt atctttcttt tctcagctat agtcttctga ttgtaataaa 640 atagcttgaa aaaaaaaaaa aaa 663 <210> 2 <211> 96 <212> PRT
<213> Mytilus galloprovincialis <400> 2 Met Lys Ala Thr Ile Leu Leu Ala Val Leu Val Ala Val Phe Val Ala Gly Thr Glu Ala His Ser His Ala Cys Thr Ser Tyr Trp Cys Gly Lys Phe Cys Gly Thr Ala Ser Cys Thr His Tyr Leu Cys Arg Val Leu His Pro Gly Lys Met Cys Ala Cys Val His Cys Ser Arg Val Asn Asn Pro Phe Arg Val Asn Gln Val Ala Lys Ser Ile Asn Asp Leu Asp Tyr Thr Pro Ile Met Lys Ser Met Glu Asn Leu Asp Asn Gly Met Asp Met Leu <210> 3 <211> 681 <212> ADN
<213> Mytilus galloprovincialis <220>
<221> CDS
<222> (13)..(300) <220>
<221> mat_peptide <222> (73)..(192) WO 01/04294 CA 02378452 2002-O1-04 pCT/FR00/01975 <220>
<221> sig_peptide <222> (13)..(72) <400> 3 caaacgtaca ac atg aag gca aca atg ttg tta gca gtt gta gtg gct gtc 51 Met Lys Ala Thr Met Leu Leu Ala Val Val Val Ala Val tttgtcgca ggtacagaa gctcatccgcat gtttgcacatcg tactac 99 PheValAla GlyThrGlu AlaHisProHis ValCysThrSer TyrTyr tgtagcaag ttttgtggg actgctggttgc acacgttatgga tgccga 147 CysSerLys PheCysGly ThrAlaGlyCys ThrArgTyrGly CysArg aatctccat cgcgggaag ctttgcttctgt cttcattgcagc agggtg 195 AsnLeu.His ArgGlyLys LeuCysPheCys LeuHisCysSer ArgVa1 aagttcccg tttggagca actcaagatgct aaaagtatgaac gaactg 243 LysPhePro PheGlyAla ThrGlnAspAla LysSerMetAsn GluLeu gaatacact ccaataatg aagtcgatggaa aatttggacaac ggaatg 291 GluTyrThr ProIleMet LysSerMetGlu AsnLeuAspAsn GlyMet gatatgtta taagcaaact tgtatacttt 340 tatgacatga agatcacaac AspMetLeu tgctattcct gtatccgctt tactcctttc ttcacacttt gtacggaatc cgtcaacaga 400 aaattcatca tcaacttgaa aactaacaaa agatgtgtcg cacacgttac actcaccagt 460 ccataagtta tatcattaaa aaaagatgaa tcaagttacc gttaacgtgt gttcagatat 520 atctctgaca gaagaagtaa ctgttaacaa gaaatactgt tttccctcaa gttattaaaa 580 attagaagtc tccctgcaac tgttttatct ttccttactc agttcttttt tcatgttcta 640 ataaaacagt ttgaaatgaa caaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 681 <210> 4 <211> 96 <212> PRT
<213> Mytilus galloprovincialis <400> 4 Met Lys Ala Thr Met Leu Leu A1a Val Val Val Ala Va1 Phe Val Ala Gly Thr Glu Ala His Pro His Val Cys Thr Ser Tyr Tyr Cys Ser Lys 20~ 25 30 Phe Cys Gly Thr Ala Gly Cys Thr Arg Tyr Gly Cys Arg Asn Leu His WO 01/04294 CA 02378452 2002-O1-04 pCT~00/01975 Arg Gly Lys Leu Cys Phe Cys Leu His Cys Ser Arg Val Lys Phe Pro Phe Gly Ala Thr Gln Asp Ala Lys Ser Met Asn Glu Leu Glu Tyr Thr Pro Ile Met Lys Ser Met Glu Asn Leu Asp Asn Gly Met Asp Met Leu
Claims (10)
1) Peptide anti-microbien, dénommé myticine, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu à
partir d'un mollusque bivalve, et en ce que - sa masse moléculaire est d'environ 4,5 kDa;
- son pI est d'environ 8,7;
- il comprend 8 résidus cystéine.
partir d'un mollusque bivalve, et en ce que - sa masse moléculaire est d'environ 4,5 kDa;
- son pI est d'environ 8,7;
- il comprend 8 résidus cystéine.
2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence (I) suivante:
HX2HX2CTSYX3CX4KFCGTAX5CTX6YX7CRX8LHX9GKX10CX11CX12HCSR (I) dans laquelle: X1- P ou S, X2- V ou A, X3 = Y ou W, X4 -S ou G, X5 = S ou G, X6= R ou H, X7= G ou L, X8= N ou V, X9 = R ou P, X10 = L ou M, X11 = P ou A, X12 = L ou V.
HX2HX2CTSYX3CX4KFCGTAX5CTX6YX7CRX8LHX9GKX10CX11CX12HCSR (I) dans laquelle: X1- P ou S, X2- V ou A, X3 = Y ou W, X4 -S ou G, X5 = S ou G, X6= R ou H, X7= G ou L, X8= N ou V, X9 = R ou P, X10 = L ou M, X11 = P ou A, X12 = L ou V.
3) Peptide selon la revendication 2 choisi dans le groupe constitué par:
- un peptide comprenant la séquence (Ia) suivante:
IISHACTSYWCGKFCCTASCTHYLCRVLHPCKMCACVHCSR (Ia) - un peptide comprenant la séquence (Ib) suivante:
HPHVCTSYYCSKFCGTACCTRYGCRNLHRGKLCFCLHCSR (Ib)
- un peptide comprenant la séquence (Ia) suivante:
IISHACTSYWCGKFCCTASCTHYLCRVLHPCKMCACVHCSR (Ia) - un peptide comprenant la séquence (Ib) suivante:
HPHVCTSYYCSKFCGTACCTRYGCRNLHRGKLCFCLHCSR (Ib)
4) Acide nucléique comprenant une séquence codant pour un peptide selon une quelconque des revendication 1 à 3.
5) Procédé d'obtention d'un acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend le criblage d'une banque nucléique à l'aide d'un fragment de plus de 15 pb de la portion codante d'une séquence choisie parmi SEQ ID NO :1 et SEQ ID NO :3.
6) Cassette d'expression, comprenant au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 4, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
7) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence d'acide nucléique selon la revendication 4.
8) Cellule procaryote ou eucaryote transformée par une séquence d'acide nucléique selon la revendication 4.
9) Procédé de production d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérise en ce qu'il comprend l'expression d'un acide nucléique selon la revendication 4, dans au moins une cellule transformée selon la revendication 8.
10) Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'obtention d'un agent anti-microbien.
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