BRPI0906710B1 - Peptídeo derivado de pres modificado hidrofóbico de vírus da hepatite b (hbv) , peptídeo e composição farmacêutica - Google Patents
Peptídeo derivado de pres modificado hidrofóbico de vírus da hepatite b (hbv) , peptídeo e composição farmacêutica Download PDFInfo
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Abstract
peptídeo derivado de pres modificado hidrofóbico de vírus da hepatite b (hbv), peptídeo e composição farmacêutica a presente invenção relaciona-se a peptídeos derivados de pres modificados hidrofóbicos de vírus da hepatite b (hbv) que são derivados de uma seqüência de consenso de pres de hbv e são n-terminais preferivelmente aciladas e cterminal opcional modificada. esses peptídeos derivados de pres modificados hidrofóbicos de hbv são inibidores de entrada de hbv muito eficazes bem como inibidores de entrada de hdv e são, portanto, adequados para a inibição de infecção por hbv e/ou hdv, prevenção de infecção primária por hbv e/ou hdv bem como o tratamento de hepatite b e/ou d (crônica). a presente invenção também se relacionaa composições farmacêuticas e de vacina que compreendem esses peptídeos derivados de pres modificados hidrofóbicos de hbv.
Description
PEPTÍDEO DERIVADO DE PRES MODIFICADO HIDROFÓBICO DE VÍRUS DA HEPATITE B (HBV), PEPTÍDEO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA
A presente invenção relaciona-se a peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de vírus da hepatite B (HBV) que são derivados de uma seqüência de consenso de preS de HBV e são N-terminais preferivelmente aciladas e Cterminal opcional modificada. Esses peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicosde HBV são inibidores de entrada de HBV muito eficazes bem como inibidores de entrada de HDV e são portanto, adequados para a inibição de infecção por HBV e/ou HDV, prevenção de infecção primária por HBV e/ou HDV bem como o tratamento de hepatite B e/ou D (crônica). A presente invenção também relaciona-se a composições farmacêuticas e de vacina que compreendem esses peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de HBV.
Fundamento da invenção
Atualmente, cerca de 2 bilhões de pessoas carregam os marcadores sorológicos de HBV. Cerca de 400 milhões deles são cronicamente infectados com HBV. De acordo com o “Centro de Controle de Doenças” (CDC) 15-25% de pessoas cronicamente infectadas por HBV são propensas a desenvolver carcinoma hepatocelular (HCC) em uma década se elas não receberem tratamento adequado (1). HCC relacionado ao HBV tem um prognóstico ruim e HBV foi, portanto, classificado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como o carcinogênio humano de ocorrência natural mais importante. A despeito da existência de uma vacina profilática, o número de infecções aumentará nas próximas décadas devido
Petição 870190066406, de 15/07/2019, pág. 13/78
2/61 ao crescimento da população mundial e à limitação da profilaxia em países pobres.
Em países industriais o HBV é primariamente transmitido por via parenteral. 90-95% dos indivíduos imuno competentes infectados de forma aguda, ficam livres do vírus, assim adquirindo proteção imune de longa duração. Cerca de 5-10% deles desenvolvem Hepatite B crônica (300.000-500.000 pessoas na Alemanha). Em contraste, em áreas altamente endêmicas, particularmente na África Central e Oriente Asiático, o modo principal de transmissão é verticalmente de mãe para filho. Infelizmente, a infecção de crianças não totalmente imuno competentes resulta em uma duração crônica de 90-98% da doença. HCC relacionada a hepatite B é portanto a malignidade mais comum em vários desses países.
Os regimes terapêuticos atualmente aprovados para o tratamento de infecções crônicas por vírus da hepatite B (HBV) se direcionam às etapas de replicação do genoma viral depois de uma infecção já estabelecida (Lamivudine, Adefovir, Entecavir) ou agem como moduladoresdo sistema imune (interferon alfa). Infelizmente, apenas 10-25% dos pacientes preservam uma resposta virológica sustentada com essas terapias, refletindo, entre outros, a rápida seleção de mutantes resistentes a nucleotídeos. A despeito da disponibilidade da vacina preventiva, é, portanto, de máxima importância o desenvolvimento de novos terápicos que visem as etapas de replicação até agora não afetadas, por exemplo, entrada do vírus.
A inibição específica da entrada do vírus é um conceito terapêutico atrativo para controlar e
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3/61 eventualmente eliminar as infecções agudas e crônicas. Para HIV, a interferência com a entrada de vírus foi realizada de modo bem-sucedido por um peptídeo derivado da proteína gp41 que consiste em 36 aminoácidos (Fuzeon®) que evita a fusão da membrana viral e celular (2).
A despeito da disponibilidade de uma vacina profilática e inibidores da transcriptase reversa (RT), o número de pessoas infectadas por HBV e o número de mortes relacionadas ao HBV por todo o mundo (atualmente, cerca de 500.000 por ano) é crescente. Cerca de dois terços dos cânceres primários de fígado são atribuíveis à infecção persistente por HBV (3).
O tratamento atual segue duas estratégias: (i) tratamento com interferon (IFN alfa) modula respostas imunes contra HBV e apresenta um efeito antiviral direto, que leva a benefício clínico de longa duração em cerca de 30% de pacientes tratados sem erradicação do vírus; (ii) administração de inibidores da transcriptase reversa viral suprimem a replicação viral e é acompanhada por melhorias bioquímicas e histológicas significativas depois de um ano de tratamento. No entanto, o tratamento de longa duração é associado ao surgimento de cepas resistentes do vírus (4).
HBV é o protótipo de uma família de DNA vírus pequenos envelopados de mamíferos e pássaros (5). O envelope do HBV abriga três proteínas denominadas L-(grande), M-(média) e S-(pequena) (veja a Figura 1 A). Elas partilham o domínio S do terminal C com quatro regiões de transmembrana. A proteína M e L carregam extensões N-terminais adicionais de aminoácidos 55 (preS2) e, 107 ou 118 (preS 1) genótipodependentes, (veja a Figura 1B). Em vírions a proporção
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4/61 estoiquimétrica de L, M e S é cerca de 1:1:4, embora as partículas subvirais não infecciosas (SVPs)secretadas de modo mais abundante contenham quase exclusivamente proteína S- e apenas traços da proteína L (6). Durante a síntese, o domínio preS1- de L é miristoilado e translocado na direção de ER. Essa modificação é essencial para a infectividade de HBV (7, 8).
Os estudos dos eventos anteriores de infecção por HBV foram limitados, porque nem os sistemas de cultura de células nem os modelos de animal pequeno eram disponíveis até recentemente (9). O desenvolvimento da linhagem de células suscetíveis ao HBV, HepaRG, facilitou a investigação sistemática da entrada de HBV e resultou na descoberta de inibidores de entrada derivados da proteína do envelope (10).
Além disso, até hoje não existe terapia eficaz para infecção por HDV, um visusóide satélite que utiliza as proteínas do envelope de HBV para a entrada nos hepatócitos (15, 17, 20). Há uma necessidade na técnica por terapias eficazes contra infecção por HDV.
Portanto, a presente invenção visa melhorar os métodos e meios para a inibição, prevenção e/ou tratamento de infecção por HBV e outras doenças relacionadas ao HBV como apresentados na técnica prévia e é, portanto, um objetivo da presente invenção o fornecimento de métodos e meios melhorados que permitam uma inibição direcionada e eficaz, prevenção e/ou tratamento de infecção por HBV e doenças relacionadas ao HBV.
É um objetivo adicional da presente invenção o fornecimento de métodos e meios para a inibição, prevenção
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5/61 e/ou tratamento de infecção por HDV e doenças relacionadas ao HDV.
Sumário da invenção
De acordo com a presente invenção este objetivo é solucionado ao fornecer peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de HBV.
Os referidos peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos têm a fórmula geral
Hm - P - Rn,
P é o peptídeo derivado de preS e compreende a seqüência de aminoácidos da seqüência de consenso de preS de HBV ou variantes dessa.
H é a referida modificação hidrofóbica do peptídeo P derivado de preS, que é N-terminal de P e selecionada de acilação e adição de porções hidrofóbicas; em que m é pelo menos 1.
R é uma modificação C-terminal opcional (ou seja, n é 0 ou pelo menos 1) do referido peptídeo P derivado de preS.
De acordo com a presente invenção esse objetivo é também solucionado ao fornecer uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico de HBV como aqui definido e opcionalmente um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
De acordo com a presente invenção esse objetivo é também solucionado ao fornecer o peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV e/ou composição farmacêutica(s) respectiva da invenção para o diagnóstico, prevenção e/ou tratamento de doenças.
De acordo com a presente invenção esse objetivo é
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6/61 também solucionado ao fornecer o peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV ou a composição farmacêutica(s) da invenção para a inibição de infecção por
HBV e/ou HDV; para a prevenção de uma infecção primária por
HBV e/ou HDV e/ou para o tratamento de hepatite B e/ou D.
De acordo com a presente invenção esse objetivo é também solucionado pelo uso do peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV ou a composição farmacêutica(s) da invenção para a manufatura de um medicamento para a inibição de infecção por HBV e/ou HDV; para a prevenção de uma infecção primária por HBV e/ou HDV e/ou para o tratamento de hepatite B e/ou D (crônica).
De acordo com a presente invenção esse objetivo é também solucionado por métodos de inibição de infecção por HBV e/ou HDV; de prevenção de uma infecção primária por HBV e/ou HDV e/ou tratamento de hepatite B e/ou D (crônica) por utilização do peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV ou da composição farmacêutica(s) da invenção.
De acordo com a presente invenção esse objetivo é também solucionado ao fornecer uma composição de vacina que compreende pelo menos i, peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico de HBV como aqui definido e opcionalmente um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Descrição das modalidades preferidas da invenção
Antes de a presente invenção ser descrita em maiores detalhes abaixo, deve-se entender que essa invenção não é limitada à metodologia, protocolos e reagentes em particular aqui descritos uma vez que esses podem variar. É
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7/61 também entendido que a terminologia aqui usada é para o objetivo de descrição de modalidades particulares apenas, e não pretende limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações em apêndice. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados que aqueles comumente entendidos por pessoa habilitada na técnica. para o objetivo da presente invenção, todas as referências aqui citadas são incorporadas em suas totalidades por referência.
Peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de HBV
Como acima apontado, a presente invenção fornece peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de vírus da hepatite B (HBV).
O envelope de HBV engloba três proteínas denominadas L-(grande), M-(média) e S-(pequena) (veja a Figura 1 A). Elas partilham o domínio S do terminal C com quatro regiões de transmembrana. A proteína M e L carregam extensões Nterminais adicionais de aminoácidos 55 (preS2) e, 107 ou 118 (preS 1) genótipo-dependentes, (veja a Figura 1B).
Portanto, a expressão peptídeo derivado de preS de HBV de acordo com a presente invenção refere-se a um peptídeo com uma seqüência de aminoácidos que corresponde às extensões N-terminais da proteína L de HBV, preS 1, preferivelmente a uma seqüência de consenso da espécie e genótipos A até H bem como de vírus da hepatite B de macaco barrigudo (WMHBV), chimpanzé e gorila, mas também refere-se a variantes desses, preferivelmente variantes com truncagem no terminal N e/ou terminal C, variantes de substituição de aminoácido.
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Id. de Seq. N°: 1 mostra a seqüência de aminoácidos de consenso de preS de HBV da espécie e genótipos A até H bem como de macaco barrigudo (WMHBV).
Veja o alinhamento na Figura 2 que mostra a seqüência de consenso de preS de HBV (Consenso) e os oito genótipos de HBV (A-H) bem como a seqüência de preS de HBV de macaco barrigudo (WMHBV) que engloba os aminoácidos 2-48. Note que os genótipos A, B, C, E, F, G e H têm até onze aminoácidos adicionais em seus terminais N.
A seqüência de aminoácidos de HBV genótipo C neste pedido refere-se a uma seqüência artificial, que corresponde ou é idêntica ao Genótipo C de HBV, como mostrado, por exemplo, em Genbank ABV02850.1, exceto pela posição 46 (de acordo com a numeração como abaixo descrito) é Lys (K) no genótipo C da presente invenção em vez de Gln (Q) como na seqüência de Genbank; a seqüência de genótipo C de HBV deste pedido também pode ser referida como genótipo C de HBV Q46K. Veja também Id. de Seq. Nos: 4, 12, 21-27.
A Figura 2 também mostra a numeração dos resíduos de aminoácido da seqüência de consenso preS de HBV, que serão referidos por toda essa especificação:
O resíduo de aminoácido número 1 é a metionina (Met1) de genótipo D (anteriormente descrito como subtipo ayw, veja também Id. de Seq. N°: 5), enquanto o resíduo de aminoácido número (-11) é a metionina (Met(-11)) de genótipo C (Id. de Seq. N°: 4). Met1 ou Met(-11) in vivo, respectivamente, é clivada por uma metionil aminopeptidase celular e modificada por uma subseqüente transferência de um resíduo de miristoil de Miristoil-CoA ao resíduo de aminoácido número 2 glicina (Gly2) ou resíduo de aminoácido
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9/61 número (-10) glicina (Gly(-10)), respectivamente, por Nmiristoil transferase. O resíduo de aminoácido N-terminal de genótipo D é o aminoácido natural Glicina (Gly2) e é numerado 2 de acordo com a numeração respectiva dos códons da estrutura de leitura aberta subjacente de L (ou, por exemplo, Gly(-10) para genótipo C).
A seqüência de consenso de preS de HBV também compreende os aminoácidos N-terminais adicionais de genótipos A, B, C, E, F, G e H (designados nas posições ). Assim, no total a seqüência de consenso de preS de HBV engloba as posições (-11) a 48.
Portanto, há uma diferença entre a numeração acima
| descrita e | a real listagem de aminoácidos | em | Id. de | Seq. | |||
| N°: 1, por | exemplo, | ||||||
| Met ( | -11), número | de | resíduo (- | 11), | é | listado | como |
| resíduo de | aminoácido 1 | em | Id. de Seq. | N°: | 1; | ||
| Gly ( | -10), número | de | resíduo (- | 10), | é | listado | como |
| resíduo de | aminoácido 2 | em | Id. de Seq. | N°: | 1; |
Met 1, número de resíduo 1, é listado como resíduode aminoácido 12 em Id. de Seq. N°:1;
Gly 2, número de resíduo 2, é listado como resíduode
| aminoácido 13 | em | Id. | de | Seq. N° | : 1; |
| Gly 48, | número | de | resíduo | 48, é listado como resíduo | |
| de aminoácido | 58 | em | Id. | de Seq. | N°: 1. |
Id. de Seq. N°: 1 seqüência de consenso de preS de HBV (posições (-11) a48) ( -11 ) -M GGWSS T PRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFRA NSNNP
DWDFN PNKDH WPEAN KVG- 48
Id. de Seq. N°: 2 HBV Genótipo A (-11) -M GGWSS KPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP
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| 10/61 | |
| DWDFN PVKDD WPAAN | QVG-48 |
| Id. de Seq. N°: 3 | HBV Genótipo B |
(-11) -M GGWSS KPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFKA NSENP
| DWDLN PHKDN WPDAN | KVG-48 |
| Id. de Seq. N°: 4 | seqüência de aminoácidos artificial, |
| que corresponde a | HBV Genótipo C exceto pela posição 46 ser |
| Lys (K) em vez de | Gln (Q); Q46K |
(-11) -M GGWSS KPRQG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP
DWDFN PNKDH WPEAN KVG-48
Id. de Seq. N°: 5 HBV Genótipo D
1-MGQNL STSNP LGFFP DHQLD PAFRA NTANP DWDFN PNKDT WPDAN
KVG-48
| Id. de Seq. N°: 6 | HBV Genótipo E |
(-10) -MGLSW TVPLE WGKNI STTNP LGFFP DHQLD PAFRA NTRNP
DWDHN PNKDH WTEAN KVG-48
Id. de Seq. N°: 7 HBV Genótipo F (-11) -M GAPLS TTRRG MGQNL SVPNP LGFFP DHQLD PLFRA NSSSP
DWDFN TNKDS WPMAN KVG-48
Id. de Seq. N°: 8 HBV Genótipo G (-10) -MGLSW TVPLE WGKNL SASNP LGFLP DHQLD PAFRA NTNNP
DWDFN PKKDP WPEAN KVG-48
Id. de Seq. N°: 9 HBV Genótipo H (-11) -M GAPLS TARRG MGQNL SVPNP LGFFP DHQLD PLFRA NSSSP
DWDFN TNKDN WPMAN KVG-48
Id. de Seq. N°:10 WMHBV
1-MGLNQ STFNP LGFFP SHQLD PLFKA NAGSA DWDKN PNKDP WPQAH
DTA-4B
| Para Id. de | Seq. Nos: 2-10 veja também números de |
acesso Genbank:
| HBV Genótipo | A Genbank AAT28684.1 |
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HBV Genótipo B Genbank AAU01950.1
HBV Genótipo C Genbank ABV02850.1 (em que a posição 46 é Lys (K) (como em Id. de Seq. N°: 4) em vez de Gln (Q) (de ABV02850.1)
| HBV | Genótipo | D | Genbank | AAR19337.1 |
| HBV | Genótipo | E | Genbank | ABS31101.1 |
| HBV | Genótipo | F | Genbank | ABK19774.1 |
| HBV | Genótipo | G | Genbank | AAF34735.1/AF160501 |
| HBV | Genótipo | H | Genbank | AAM09052.1 |
WMHBV Genbank AAC16905.1
Um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico de
HBV de acordo com a presente invenção tem a fórmula:
Hm - P - Rn em que
P é o referido peptídeo derivado de preS;
H é a referida modificação hidrofóbica deP;
R é uma modificação C-terminalde P;
m é pelo menos1;
n é 0 ou pelo menos1.
O peptídeo derivado de preS de HBV, P, de acordo com a presente invenção compreende:
a seqüência de aminoácidos de a seqüência de consenso de preS de HBV como mostrado em
Id. de Seq. N°: 1 ou variantes dessa.
Variantes são preferivelmente variantes com truncagem no terminal N e/ou terminal C substituição de aminoácido ou variantes de deleção ou variantes prolongadas.
Variantes compreendem além disso uma seqüência de aminoácidos que compreende aminoácido
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12/61 modificado(s), aminoácido(s) não natural ou peptidomimético(s) ou compostos adicionais que podem imitar uma estrutura/esqueleto de peptídeo.
Preferivelmente, as variantes são selecionadas de variantes com truncagem no terminal N e/ou terminal C de Id. de Seq. N°: 1; substituição de aminoácido ou variantes de deleção; variantes que compreendem aminoácido modificado(s), aminoácido(s) não natural ou peptidomimético(s) ou compostos adicionais que podem imitar uma estrutura/esqueleto de peptídeo.
De acordo com a invenção, uma variante de um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico que contém pelo menos 10 ou 20 aminoácidos consecutivos de Id. de Seq. N°:
| 1 e | pode consistir | em 11, 12, | 13, 14, 15, 16, | 17, | 18, | 19, |
| 20, | 21, 22, 23, 24, | 25, 26, 27, | 28, 29, 30, 31, | 32, | 33, | 34, |
| 35, | 36, 37, 38, 39, | 40, 41, 42 | , 43, 44, 45, 46 | , 47 | , 48 | ou |
mais aminoácidos de Id. de Seq. N°: 1 ou seus variantes.
Variantes com truncagem no terminal N e/ou terminal C compreendem preferivelmente pelo menos 48 aminoácidos consecutivos de Id. de Seq. N°: 1 (preferivelmente resíduos 2 a 48), mais preferivelmente pelo menos 17 aminoácidos consecutivos de Id. de Seq. N°: 1 (preferivelmente resíduos 5 a 21) ou pelo menos 20 aminoácidos consecutivos de Id. de Seq. N°: 1 (preferivelmente resíduos 2 a 21).
O termo variante também refere-se às seqüências homólogas encontradas nas diferentes espécies virais, cepas ou subtipos do gênero hepadnavirus, como HBV cepa alfa1, HBV cepa LSH (isolada de chimpanzé), macaco barrigudo HBV (WMHBV), ou cepas selecionadas do grupo que consiste em HBV genótipos A até H, bem como o HBV genótipo C como aqui
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13/61 definido, Q46K (como Id. de Seq. N°: 4).
O termo variante também refere-se às seqüências homólogas que mostram pelo menos 50% de identidade de seqüência ao Id. de Seq. N°: 1 ou qualquer outra seqüência de aminoácidos aqui revelada, preferivelmente 70%, mais preferivelmente 80%, even mais preferivelmente 90% ou 95%.
Portanto, em peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico preferido de acordo com a invenção P compreende uma variante de Id. de Seq. N°: 1 com uma seqüência de aminoácidos das diferentes espécies virais, cepas ou subtipos, preferivelmente dos genótipos de HBV ou macaco barrigudo HBV (WMHBV) ou variantes desses.
Preferivelmente, P compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada de Id. de Seq. Nos: 2 a 10 ou variantes dessa (veja também a Figura 2).
Em uma modalidade preferida nos peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de acordo com a invenção P compreende uma variante de Id. de Seq. N°: 1 com uma seqüência de aminoácidos selecionada de
| resíduos | de | aminoácido | 2 | a | 21, | ||||
| resíduos | de | aminoácido | 5 | a | 21, | ||||
| resíduos | de | aminoácido | 5 | a | 15 | ou | |||
| resíduos | de | aminoácido | 9 | a | 15 | (veja | também | [Id. | de |
Seq. N°:15]) da seqüência de consenso de preS de HBV como mostrado em Id. de Seq. N°:1.
Mais preferivelmente, P não compreende substituiçãode aminoácidos e/ou deleções nos resíduos 9 a 22 de Id. de Seq. N°: 1, como por deleção dos resíduos 17a 21.
Mais preferivelmente, P não compreende substituiçãode
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14/61 aminoácidos e/ou deleções nos resíduos 9 a 15 de Id. de Seq. N°: 1.
Mais preferivelmente, a porção da seqüência NPLGFFP [Id. de Seq. N°: 15] (que corresponde aos resíduos 9 a 15 de Id. de Seq. N°: 1) não é interrompido ou modificado, como por substituição dos resíduos 11-15 por D-aminoácidos.
Mais preferivelmente, nos peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de acordo com a invenção, P compreende uma variante de Id. de Seq. N°: 1 como uma seqüência de aminoácidos selecionada de resíduos de aminoácido 2 a 48 da seqüência de consenso [Id. de Seq.
N°:11];
resíduos de aminoácido2
Seq. N°:12];
resíduos de aminoácido2
Seq. N°:13];
resíduos de aminoácido5
Seq. N°:14];
resíduos de aminoácido9
Seq. N°:15];
resíduos de aminoácido2
Seq. N°:16];
resíduos de aminoácido5
Seq. N°:17];
resíduos de aminoácido2
Seq. N°:18] resíduos de aminoácido5
Seq. N°:19] resíduos de aminoácido2
Seq. N°:20];
a 48 de genótipo C [Id. de a 21 de genótipo C [Id. de a 21 de genótipo C [Id. de a 15 de genótipo C [Id. de a 48 de genótipo D [Id. de a 48 de genótipo D [Id. de a 33 de genótipo D [Id. de a 33 de genótipo D [Id. de a 21 de genótipo D [Id. de
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15/61 resíduos de aminoácido 9 a 15 de genótipo D [Id. de Seq. N°: 15].
Portanto, preferivelmente, P compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada de Id. de Seq. Nos: 11 a 20 ou variantes dessa.
Para seqüências de aminoácidos preferidas de P veja também abaixo, as Tabelas 1-7, Figuras e Exemplos.
Variantes de Id. de Seq. N°: 1 também compreendem variantes ou análogos que compreendem deleções de aminoácido, substituição de aminoácidos, como substituição conservadora ou não conservadora por outros aminoácidos ou por isósteres (aminoácidos modificados que têm similaridade estrutural e espacial aos aminoácidos da proteína), adições de aminoácido ou adições de isóstere, desde que as seqüências despertem 70% de inibição de infecção por HBV com uma concentração de peptídeo abaixo de 10 μΜ, e preferivelmente abaixo de 1 μΜ.
Substituição conservadora de aminoácidos tipicamente relacionam-se a substituições entre aminoácidos da mesma classe. Essas classes incluem, por exemplo,
- aminoácidos que têm cadeias laterais polares não carregadas, como asparagina, glutamina, serina, treonina e tirosina;
- aminoácidos que têm cadeias laterais básicas, como lisina, arginina e histidina;
- aminoácidos que têm cadeias laterais ácidas, como ácido aspártico e ácido glutâmico; e
- aminoácidos que têm cadeias laterais não polares, como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano, e cisteína.
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Os peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos da invenção podem ser preferivelmente modificados para terem propriedades imunogênicas aumentadas. Tais propriedades imunogênicas aumentadas referem-se, por exemplo, ao aumento da faixa de anticorpos produzidos depois da imunização, ou à permissão da produção de anticorpos capazes de neutralizar a infecção por várias cepas virais.
Em outra modalidade, os peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos da invenção podem ser preferivelmente modificados para diminuir suas propriedades imunogênicas. Tais peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos devem ser particularmente úteis em uma aplicação terapêutica para inibir a infecção in vivo por HBV enquanto evita ou limita os efeitos colaterais.
Portanto, motives de seqüência preferidos a serem modificados por substituição e/ou deleção são seqüências responsáveis pela imunogenicidade, como epitopos de células B e/ou epitopos de células T, e porções de reconhecimento de anticorpo.
Os epitopos de células B de HBV são preferivelmente resíduos de aminoácido 20 a 23, porção DPAF, de Id. de Seq. N°: 1 e resíduos de aminoácido 2 6 a 32, porção NSNNPDW da seqüência de consenso (Id. de Seq. N°: 1) e genótipo C (Id. de Seq. N°: 4) ou NTANPDW de genótipo D (Id. de Seq. N°: 5).
Em uma modalidade preferida resíduos de aminoácido 20 a 23 de Id. de Seq. N°: 1 são modificados, preferivelmente por substituição de aminoácido, e/ou os resíduos de aminoácido 26 a 32 são modificados, preferivelmente por
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17/61 substituição de aminoácido e/ou deleção.
Preferivelmente, os resíduos de aminoácido 20 a 23 de Id. de Seq. N°: 1 (porção DPAF) são modificados por substituição de aminoácido alanina, preferivelmente na porção APAF.
Preferivelmente, os resíduos de aminoácido 26 a 32 de Id. de Seq. N°: 1 são modificados por substituição de aminoácido alanina, preferivelmente na porção NANAPDW ou
NAAAPDW.
Em uma modalidade preferida P compreende uma seqüência de aminoácidos selecionadas de Id. de Seq. Nos: 21 a 28 ou variantes dessas.
Veja também abaixo, as Tabelas 2, 7 e as figuras respectivas e Exemplos.
| Em | uma | modalidade | mais preferida, | P | compreende uma | |||
| seqüência de | aminoácidos | selecionada | de | |||||
| Id. | de | Seq. N°: | 11 | (resíduos | 2 | a 4 8 < | a seqüência de | |
| consenso) | , | |||||||
| Id. | de | Seq. N°: | 12 | (resíduos | 2 | a 48 | de | genótipo C), |
| Id. | de | Seq. N°: | 13 | (resíduos | 2 | a 21 | de | genótipo C), |
| Id. | de | Seq. N°: | 4 | (resíduos | (- | 11) | a | 48 de genótipo |
| C), e | ||||||||
| Id. | de | Seq. N°: | 20 | (resíduos | 2 | a 21 | de | genótipo D). |
A modificação hidrofóbica (H) do peptídeo P derivado de preS é N-terminal de P.
N-terminal refere-se à modificação hidrofóbica no terminal N, ou seja, o primeiro resíduo de aminoácido respectivo (por exemplo, Gly 2), mas compreende também a modificação hidrofóbica próxima ao terminal N, como os resíduos de aminoácido respectivos (-4), (-3), (-2), (-1),
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1, 2 ou 3 ou 4. Portanto, a modificação hidrofóbica pode ser também obtida por uma ligação de uma porção hidrofóbica em um sítio próximo ao terminal N de P.
A modificação hidrofóbica do referido peptídeo derivado de preS de HBV de acordo com a presente invenção adiciona uma porção hidrofóbica ao peptídeo.
Além disso, m é pelo menos 1, ou seja, modificação com pelo menos uma porção hidrofóbica ou grupo.
Em modalidades preferidas dessa invenção m é 1, 2, 3, 4 ou mais. Ou seja, P pode ser modificado com mais de uma porção hidrofóbica ou grupo, como 2. As porções hidrofóbicas ou grupos podem ser os mesmos ou diferentes.
A modificação hidrofóbica do referido peptídeo derivado de preS de HBV de acordo com a presente invenção é selecionadas de:
- acilação;
- adição de porções hidrofóbicas.
A acilação é preferivelmente selecionada de acilação com ácidos carboxílicos, ácidos graxos, aminoácidos com cadeias laterais lipofílicas.
Os ácidos graxos preferidos são ácidos graxos saturados ou insaturados, ácidos graxos ramificados ou não ramificados, preferivelmente com 8 a 22 átomos de carbono (C8 a C22).
Mais preferivelmente, a modificação hidrofóbica por acilação é selecionada de acilação com miristoil (C14), palmitoil (C16) ou estearoil (C18).
A adição de porções hidrofóbicas é preferivelmente selecionada de adição de colesterol, derivados de colesterol, fosfolipídeos, glicolipídeos, ésteres de
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19/61 glicerol, esteróides, ceramidas, derivados de isopreno, adamantano, famesol, grupos alifáticos, compostos poliaromáticos.
A ligação das porções hidrofóbicas é preferivelmente por ligação covalente, que pode ser realizada via carbamato, amida, éter, dissulfeto ou qualquer outra ligação que esteja dentro da habilidade do profissional habilitado na técnica.
Portanto, os peptídeos derivados de preS hidrofóbicos modificados, preferivelmente acilados dessa invenção são preferivelmente lipopeptídeos devido a sua porção/grupo lipofílico ou hidrofóbico N-terminal.
Para peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos preferidos, veja também as Tabelas 1 e 2.
Peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos mais preferidos da invenção são os seguintes:
- P compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada de Id. de Seq. N°: 11, Id. de Seq. N°: 12, Id.
de Seq. N°: 13, Id. de Seq. N°: 4, e Id. de Seq. N°: 20 e
- H é uma modificação hidrofóbica por acilação com miristoil (C 14) ou estearoil (C18), preferivelmente estearoil (C18).
Portanto, os peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos mais preferidos da invenção são:
Designação Seqüência Modificação do peptídeo de aminoácidos hidrofóbica
HBVpreS/2-48estearoil Id. de Seq. N°: 11 Estearoil (C18) (consenso)
HBVpreS/2-48myr Id. de Seq. N°: 11 Miristoil (C14) (consenso)
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| HBVpreS/2-48estearoil (C) | Id. de | Seq. N°: 12 | Estearoil | (C18) |
| HBVpreS/2-48nrr(C) | Id. de | Seq. N°: 12 | Miristoil | (C14) |
| HBVpreS/2-21estearoil (C) | Id. de | Seq. N°: 12 | Estearoil | (C18) |
| HBVpreS/ (-11)-48estearoil (C) | Id. de | Seq. N°:4 | Estearoil | (C18) |
| HBVpreS/ (-11)-48yr(C) | Id. de | Seq. N°:4 | Miristoil | (C14) |
| HBVpreS/2-21estearoil (D) | Id. de | Seq. N°:20 | Estearoil | (C18) |
em que (C) refere-se a HBV genótipo C Q46K.
Modalidade preferida das seqüências de genótipo C
Em uma modalidade muito preferida dessa invenção os peptídeos preS modificados hidrofóbicos de acordo com a invenção P compreendem uma seqüência de aminoácidos derivada do genótipo C.
O peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) da presente invenção derivado de genótipo C inibe a infecção por HBV de modo mais potente que aqueles do genótipo D correspondente. Veja também a Figura 3 e Tabela 3.
Como acima discutido, a seqüência de aminoácidos de HBV genótipo C nesse pedido refere-se a uma seqüência artificial, que corresponde ou é idêntica ao HBV de Genótipo C, como, por exemplo, mostrado em Genbank ABV02850.1, exceto pela posição 46 (de acordo com a numeração como abaixo descrito) ser Lys (K) no genótipo C da presente invenção em vez de Gln (Q) como na seqüência de Genbank; a seqüência de HBV de genótipo C desse pedido pode ser referida como HBV genótipo C Q46K. Veja também Id. de Seq. Nos: 4, 12, 21-27.
A mesma numeração como acima descrito para a seqüência de consenso de preS de HBV é usada para a numeração dos resíduos de aminoácido das seqüências de genótipo C (veja
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21/61 também Figura 2), por exemplo
| Met ( | -11), número | de | resíduo (- | 11), | é | listado como |
| resíduo de | aminoácido 1 | em | Id. de Seq. | N°: | 4; | |
| Gly ( | -10), número | de | resíduo (- | 10), | é | listado como |
| resíduo de | aminoácido 2 | em | Id. de Seq. | N°: | 4; |
Met 1, número de resíduo 1, é listado como resíduode aminoácido 12 em Id. de Seq. N°:4;
Gly 2, número de resíduo 2, é listado como resíduode
| aminoácido 13 | em Id. de Seq. N°: 4 | e é | listado | como | resíduo |
| de aminoácido | 1 em Id. de Seq. N°: | 12; | |||
| Gly 48, | número de resíduo 48 | , é | listado | como | resíduo |
| de aminoácido | 58 em Id. de Seq. | N°: | 4 e é | listado como |
resíduo de aminoácido 47 em Id. de Seq. N°:12.
Id. de Seq. N°: 12 seqüência de aminoácidos, que corresponde às posições 2 a 48 de HBV
Genótipo C exceto pela posição 46 ser Lys (K) em vez de Gln (Q); Q46K
2-GTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DWDFN PNKDH WPEAN KVG
P pode ser preferivelmente selecionado de
Id. de Seq. N°: 12 (resíduos 2 a 48 de genótipo C),
Id. de Seq. N°: 4 (resíduos (-11) a 48 de genótipo C),
Id. de Seq. N°: 13 (resíduos 2 a 21 de genótipo C),
Id. de Seq. N°: 14 (resíduos 5 a 21 de genótipo C) e
Id. de Seq. N°: 15 (resíduos 9 a 15 de genótipo C).
Na modalidade preferida de seqüências de genótipo C, um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico de vírus da hepatite B (HBV) é de fórmula:
Hm-P-Rn,
Em que, preferivelmente
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P é um peptídeo derivado de preS que compreende a seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°:12 ou uma variante truncada de terminal N- e/ou C dessa seqüência de pelo menos 10 aminoácidos consecutivos, ou um derivado dessa que compreendem aminoácido modificado(s), aminoácido(s) não natural ou peptidomimético(s);
H é uma modificação hidrofóbica do peptídeo P derivado de preS, que é N-terminal de P e é selecionada de acilação e adição de porções hidrofóbicas;
R é uma modificação C-terminal do referido peptídeo P derivado de preS;
m é pelo menos 1; e n é 0 ou pelo menos 1.
O peptídeo preferido da invenção é particularmente eficaz para a inibição de infecção por HBV e/ou HDV, para a prevenção de uma infecção aguda por HBV e/ou HDV e/ou para o tratamento de hepatite B e/ou D.
Preferivelmente, P compreende ou consiste na seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 12 (resíduos 2 a 48 de genótipo C).
Também preferivelmente, P compreende uma variante da seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 12, em que uma variante contém pelo menos 10 resíduos de aminoácido consecutivos de Id. de Seq. N°: 12 (preferivelmente resíduos 9 a 18), mais preferivelmente 15 ou 20, e pode consistir em 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou mais resíduos de aminoácido de Id. de Seq. N°: 12.
Preferivelmente, os resíduos de aminoácido
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23/61 consecutivos de Id. de Seq. N°: 12 que são contidos em P são selecionados de
| Seq. | resíduos N°: 15], | de | aminoácido | 9 | a | 15 | de | genótipo | C [ = | Id. | de | |
| 5 | resíduos | de | aminoácido | 2 | a | 15 | de | genótipo | C, | |||
| resíduos | de | aminoácido | 9 | a | 18 | de | genótipo | C, | ||||
| resíduos | de | aminoácido | 2 | a | 18 | de | genótipo | C, | ||||
| resíduos | de | aminoácido | 2 | a | 20 | de | genótipo | C, | ||||
| resíduos | de | aminoácido | 2 | a | 21 | de | genótipo | C [ = | Id. | de | ||
| 10 | Seq. | N°: 13], | ||||||||||
| resíduos | de | aminoácido | 5 | a | 21 | de | genótipo | C [ = | Id. | de | ||
| Seq. | N°: 14], | |||||||||||
| resíduos | de | aminoácido | 2 | a | 25 | de | genótipo | C, | ||||
| resíduos | de | aminoácido | 2 | a | 30 | de | genótipo | C, | ||||
| 15 | resíduos | de | aminoácido | 2 | a | 35 | de | genótipo | C, | |||
| resíduos | de | aminoácido | 2 | a | 40 | de | genótipo | C, | ||||
| resíduos | de | aminoácido | 2 | a | 45 | de | genótipo | C, | ||||
| resíduos | de | aminoácido | 2 | a | 46 | de | genótipo | C, | ||||
| ou resíduos | de aminoácido | 2 | a | 48 | de genótipo C | [ = | ||||||
| 20 | Id. | de Seq. N | o . | 12]. |
Em uma modalidades, P contém os resíduos de aminoácido respectivos remanescentes de Id. de Seq. N°: 12, ou seja,
| resíduos resíduos | de de | aminoácido aminoácido | 16 19 | a a | 48 48 | de de | genótipo genótipo | C, C, | |
| 25 | resíduos | de | aminoácido | 21 | a | 48 | de | genótipo | C, |
| resíduos | de | aminoácido | 22 | a | 48 | de | genótipo | C, | |
| resíduos | de | aminoácido | 26 | a | 48 | de | genótipo | C, | |
| resíduos | de | aminoácido | 31 | a | 48 | de | genótipo | C, | |
| resíduos | de | aminoácido | 36 | a | 48 | de | genótipo | C, | |
| 30 | resíduos | de | aminoácido | 41 | a | 48 | de | genótipo | C, |
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| resíduos | de aminoácido | 46 a | 48 | de | genótipo | C, ou |
| resíduos | de aminoácido | 47 a | 48 | de | genótipo | C, |
| que são | idênticos | aos | respectivos resíduos de |
aminoácido de Id. de Seq. N°: 12 ou são um derivado desses, em que um derivado compreende pelo menos uma modificação selecionada de uma substituição de aminoácido, uma deleção de aminoácido, um aminoácido modificado, um aminoácido não natural ou um peptidomimético, em que pelo menos uma modificação é 1, 2, 3, 4, 5 ou mais modificações.
Substituições preferidas de aminoácidos são aqui descritas.
Preferivelmente, P compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada de
- seqüência de aminoácidos que contém resíduos de aminoácido 2 a 15 de Id. de Seq. N°: 12 e, adjacente a um derivado de resíduos de aminoácido 16 a 48 de Id. de Seq. N°:12;
- seqüência de aminoácidos que contém resíduos de aminoácido 2 a 20 de Id. de Seq. N°: 12 e, adjacente a um derivado de resíduos de aminoácido 21 a 48 de Id. de Seq. N°:12;
- seqüência de aminoácidos que contém resíduos de aminoácido 2 a 25 de Id. de Seq. N°: 12 e, adjacente a um derivado de resíduos de aminoácido 26 a 48 de Id. de Seq. N°:12;
- seqüência de aminoácidos que contém resíduos de aminoácido 2 a 30 de Id. de Seq. N°: 12 e, adjacente a um derivado de resíduos de aminoácido 31 a 48 de Id. de Seq. N°:12;
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- seqüência de aminoácidos que contém resíduos de aminoácido 2 a 35 de Id. de Seq. N°: 12 e, adjacente a um derivado de resíduos de aminoácido 36 a 48 de Id. de Seq. N°: 12;
- seqüência de aminoácidos que contém resíduos de aminoácido 2 a 40 de Id. de Seq. N°: 12 e, adjacente a um derivado de resíduos de aminoácido 41 a 48 de Id. de Seq. N°: 12;
- seqüência de aminoácidos que contém a seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 12;
em que um derivado compreende pelo menos uma modificação selecionada de uma substituição de aminoácido, uma deleção de aminoácido, um aminoácido modificado, um aminoácido não natural ou um peptidomimético, em que pelo menos uma modificação é 1, 2, 3, 4, 5 ou mais modificações.
Na modalidade preferida de seqüências de genótipo C:
P compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada de Id. de Seq. N°: 12 ou as variantes/derivados/modificações respectivamente descritas,
H é uma modificação hidrofóbica por acilação com
| miristoil | (C14) | ou | estearoil (C18), | preferivelmente |
| miristoil | (C14). | |||
| Modificação | por | miristoilação é | preferida em | |
| aplicações | in | vivo | e medicinais devido | a sua maior |
segurança, por exemplo, não aos efeitos adversos do grupo estearoil (resposta imune inata etc.).
Portanto, os peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos mais preferidos da invenção são:
HBVpreS/(-11)-4 8myr (C) [Id. de Seq. N°: 4]
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| HBVpreS/2-4 8myr (C) | [Id. | de | Seq. | N°: | 12] | |
| HBVpre S/2-21myr (C) | [Id. | de | Seq. | N°: | 13] | |
| HBVpre S/5-21myr (C) | [Id. | de | Seq. | N°: | 14] | |
| HBVpreS/9-15myr (C) | [Id. | de | Seq | . N°: | 15] | |
| Mais preferivelmente | ||||||
| HBVpreS/2-4 8myr (C) | [Id. | de | Seq | . N°: | 12] | . |
| A modificação C-terminal | (R) | do | referido | pe | ptídeo P |
derivado de preS é preferivelmente uma modificação com uma porção que protege de degradação, como degradação in vivo.
C-terminal refere-se à modificação no terminal C, ou seja, o último respectivo resíduo de aminoácido, mas compreende também a modificação em proximidade ao terminal C, como o último exceto um resíduo de aminoácido, o último exceto dois resíduos de aminoácido ou mais resíduos de aminoácido (por exemplo, introdução de um D-aminoácido que protege o carreador de degradação enzimática, por exemplo, pela ação de carboxipeptidases).
O profissional habilitado será capaz de selecionar a porção adequada respectiva dependendo da aplicação respectiva.
As porções preferidas que protegem da degradação são selecionadas de amidas, D-aminoácidos, aminoácidos modificados, aminoácidos cíclicos; polímeros naturais e sintéticos, como PEG, glicano.
Em uma modalidade P é fundido a um peptídeo ou proteína, preferivelmente selecionada de albumina, domínios Fc de IgGs humanas.
A fusão é preferivelmente C-terminal de P.
Além disso, n é 0 ou pelo menos 1, ou seja, a modificação C-terminal (R) é opcional.
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Preferivelmente, n é 1.
Em modalidades adicionais dessa invenção n é 1, 2, 3, 4 ou mais. Ou seja, o terminal C de P ou sua proximidade pode ser modificado com mais de uma porção ou grupo, como 2. As porções ou grupos podem ser os mesmos ou diferentes.
Em uma modalidade dessa invenção H e/ou R são ligados a P via um ligante ou espaçador.
Ligante ou espaçador são conhecidos pelo profissional habilitado, como polialanina, poliglicina, carboidratos, grupos (CH2)n.
O profissional habilitado, portanto, será capaz de selecionar o ligante ou espaçador respectivo adequado dependendo da respectiva aplicação.
Em uma modalidade preferida, o peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico de acordo com a invenção carrega um rótulo ou marcador, preferivelmente selecionado de um corante fluorescente, um radioisótopo e um agente de contraste.
Os radioisótopos preferidos são 131I, 125I, 99mTc, 18F, 68Ga, 111In, 90Y, 177Lu.
Corantes fluorescentes preferidos são corantes Alexa, derivados de rodamina e fluoresceína, corantes Cy.
Agentes de contraste preferidos são complexos de Gadolínio (Gd), complexos e partículas de ferro supramagnético (Fe), compostos que contêm átomos de alto número atômico, ou seja, iodo para tomografia computadorizada (CT), microbolhas e carreadores como lipossomos que contêm esses agentes de contraste.
Os peptídeos dessa invenção podem ser preparados por vários procedimentos facilmente conhecidos por aqueles
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28/61 habilitados na técnica, em geral por procedimentos químicos sintéticos e/ou procedimentos de engenharia genética.
Os procedimentos químicos sintéticos incluem mais particularmente a síntese seqüencial de fase solida e em bloco (11). O procedimento seqüencial de fase solida pode ser realizado com o uso de métodos automatizados estabelecidos como pelo uso de um sintetizador de peptídeo automatizado. Nesse procedimento um aminoácido α-amino protegido é ligado a um suporte de resina. O suporte de resina empregado pode ser qualquer resina adequada convencionalmente empregada na técnica para a preparação de fase sólida de (poli)peptídeos, preferivelmente poliestireno que foi copolimerizado com polioxietileno para fornecer sítios para formação de éster com o aminoácido oamino protegido inicialmente introduzido. Esse método otimizado, aplicado pelos inventores, foi explicitamente descrito (veja, por exemplo, 12). Os aminoácidos são introduzidos um por um (em etapas). Cada ciclo de síntese que corresponde à introdução de um aminoácido inclui uma etapa de desproteção, sucessivas etapas de lavagem, uma etapa de ligação com ativação do aminoácido, e subseqüentes etapas de lavagem. Cada uma dessas etapas é seguida por uma filtração. Os agentes reativos para ligação são os agentes reativos clássicos para síntese de (poli)peptídeo como diciclohexilcarbodiimida, hidroxibenzotriazol, benzotriazi1-1-il-oxitris (dimetilamino) fosfônio hexafluorfosfato, e difenilfosforilazida. Depois da síntese do polipeptídeo na resina, o polipeptídeo é separado da resina por um tratamento com um ácido forte como ácido trifluoracético na presença de anisol, etanoditiol ou 2Petição 870190066406, de 15/07/2019, pág. 40/78
29/61 metilindol. O composto é então purificado por técnicas clássicas de purificação, em particular por meio de HPLC.
Os peptídeos da presente invenção também podem ser obtidos por ligação fragmentos de (poli)peptídeo que são seletivamente protegidos, essa ligação sendo efetuada, por exemplo, em uma solução.
Os peptídeos podem ser também produzidos por técnicas de engenharia genética como conhecido por profissional habilitado. Um sistema de expressão eucariótico, como o sistema de baculovírus, é particularmente adequado. De acordo com esse procedimento, as proteínas são expressas em células de inseto infectadas com um baculovírus recombinante que contém uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína heteróloga e que regula as seqüências de ácidos nucleicos, como um promotor. Várias linhagens de células são disponíveis para infecção com baculovírus recombinante, como a linhagem de células Sf-9, disponível pela American Type Culture Collection” (CRL 1711). A expressão em sistema de expressão procariótico, como E. coli, é também particularmente adequada.
A introdução da porção hidrofóbica ao peptídeo pode ser realizada por vários procedimentos prontamente conhecidos por aqueles habilitados na técnica, que incluem abordagens sintéticas e de engenharia genética.
Alternativamente, os peptídeos e/ou peptídeos de fusão (ou seja, peptídeos modificados hidrofóbicos) podem ser produzidos por linhagens de células eucarióticas estavelmente transfectadas, como CHO e outras linhagens de células que são conhecidas na técnica e comumente usadas para a geração de vacinas e outros. Devido à propriedade
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30/61 intrínseca de que os aminoácidos N-terminal 47-preS1 promovem a secreção de uma proteína/peptídeo miristoilado, o peptídeo modificado hidrofóbico biologicamente ativo pode ser extraído de sobrenadantes de cultura de células.
Características dos peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos da invenção
Os peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos da presente invenção são inibidores versáteis da entrada do vírus da hepatite e também exibem um hepatotropismo/tropismo hepático, ou seja, eles se dirigem ao fígado. O tropismo hepático é mostrado em particular na Figura 11.
O referido hepatotropismo é também revelado no pedido de patente provisória US correspondente dos inventores com o título: Peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de vírus da hepatite B virus (HBV) e seu uso como veículos para a liberação específica de compostos ao fígado que foi depositado no mesmo dia e que é aqui englobado em sua totalidade por referência.
O peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV da presente invenção é um inibidor de entrada de HBV muito adequado e eficaz, mas também de HDV, in vitro (por exemplo, por prevenção da ligação e/ou internalização de partículas de HBV aos hepatócitos) ou in vivo.
Como pode ser observado a partir das Figuras e Exemplos, o peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) da presente invenção tem uma alta atividade inibidora, ou seja, eles inibem de modo eficaz a infecção por HBV e/ou HDV em doses muito baixas. Os valores de IC50 das modalidades mais preferidas estão na faixa de 0,01 a
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500 nM, preferivelmente 0,025 a 50 nM, mais preferivelmente 0,05 a 25 nM. Veja também a Tabela 1.
O peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) da presente invenção derivado de genótipo C inibe a infecção por HBV de modo mais potente que aqueles do genótipo D correspondente.
Além disso, os peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos da presente invenção podem ser destinados a não conter epitopos imunogênicos mas ainda exibem uma forte atividade inibidora, como HBVpreS/2-21st'YI que não compreende os epitopos imunogênicos em sua seqüência mas
| ainda tem | uma IC50 de | cerca de 8 nM. | ||
| Os | peptídeos | derivados de | preS | modificados |
| hidrofóbicos de HBV | da invenção são | também | capazes de | |
| prevenir | o genótipo | C e D de HBV, | porque | um peptídeo |
derivado de genótipo C (como HBVpreS/2-21estearoil(C) ou
HBVpreS/2-48myr(C)) pode inibir a entrada de genótipo D de
HBV.
Composições farmacêuticas e de vacinas
Como acima apontado, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico de HBV como aqui definido e opcionalmente um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende:
- pelo menos um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico de HBV como aqui definido;
- um conjugado como aqui definido; e
- opcionalmente um veículo e/ou excipiente
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32/61 farmaceuticamente aceitável.
As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são muito adequadas para todos os usos e métodos aqui descritos.
Como acima apontado, a presente invenção fornece uma composição de vacina que compreendem pelo menos um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico de HBV como aqui definido e opcionalmente um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
As composições de vacina de acordo com a presente invenção são bem adequadas para os usos e métodos aqui descritos.
Um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a qualquer veículo em que ou com o qual as composições farmacêuticas e de vacina de acordo com a invenção podem ser formuladas. Ele inclui uma solução salina como solução salina tamponada por fosfato. Em geral, um diluente ou carreador é selecionado com base no modo e via de administração, e prática farmacêutica padrão.
Aplicações médicas
Como acima apontado, a presente invenção fornece o primeiro uso médico do peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV e/ou respectiva composição farmacêutica(s) dessa invenção.
Portanto, o peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV ou a composição farmacêutica(s) de acordo com a invenção são adequados e, portanto, fornecidos para o diagnóstico, prevenção e/ou tratamento de doenças.
Como acima apontado, a presente invenção também fornece o peptídeo derivado de preS modificado
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33/61 hidrofóbico(s) de HBV e/ou respectiva composição farmacêutica(s) dessa invenção para o diagnóstico, prevenção e/ou tratamento de certas doenças.
Em uma modalidade preferida o peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV ou a composição farmacêutica(s) da invenção são fornecidos para a inibição de infecção por HBV e/ou HDV; para a prevenção de uma infecção primária por HBV e/ou HDV e/ou para o tratamento de hepatite B e/ou D, preferivelmente hepatite B e/ou D crônica.
Em uma modalidade preferida o peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV ou a composição farmacêutica(s) da invenção são usados para a manufatura de um medicamento para a inibição de infecção por HBV e/ou HDV; para a prevenção de uma infecção primária por HBV e/ou HDV e/ou para o tratamento de hepatite B e/ou D.
Preferivelmente, o peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV ou a composição farmacêutica(s) da invenção são fornecidos para a inibição de infecção por HBV e/ou HDV.
Preferivelmente, o peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV ou a composição farmacêutica(s) da invenção são fornecidos para a prevenção de uma infecção primária por HBV e/ou HDV.
Preferivelmente, a infecção por HBV de qualquer genótipo de HBV é inibida ou evitada.
Os peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de HBV da invenção são capazes de prevenção de genótipo C e D de HBV, porque um peptídeo derivado de genótipo C (como HBVpreS/2-21estearoil(C) ou HBVpreS/2Petição 870190066406, de 15/07/2019, pág. 45/78
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48myr(C)) pode inibir a entrada do genótipo D de HBV.
Em uma modalidade preferida o peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV ou a composição farmacêutica(s) da invenção são usados/fornecido como inibidores de entrada de HBV e/ou HDV.
Preferivelmente, o peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV ou a composição farmacêutica(s) da invenção são fornecidos para o tratamento de hepatite B e/ou D, em particular hepatite B e/ou D crônica.
Os peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de HBV da presente invenção são inibidores de entrada de HBV muito adequados e eficazes, mas também de HDV, in vitro (por exemplo, por prevenção da ligação e/ou internalização de partículas do HBV aos hepatócitos) ou in vivo.
Além disso, a invenção fornece um método de inibição in vitro de infecção dos hepatócitos por HBV que compreendem o uso de um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico ou composição farmacêutica como acima descrito.
Hepatócitos adequados incluem hepatócitos primários humanos ou a linhagem de células derivada de hepatoma chamada HepaRG (22) (descrita no pedido de patente FR 0109044), hepatócitos de Tupaia belangeri (23), que são também suscetíveis à infecção por HBV.
Além disso, e como acima apontado, a presente invenção fornece métodos para a inibição de infecção por HBV e/ou HDV; de prevenção de uma infecção primária por HBV e/ou HDV e/ou tratamento (crônica) de hepatite B e/ou D por
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35/61 utilização do peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) de HBV ou a composição farmacêutica(s) da invenção.
Via de administração
Preferivelmente, a via de administração do peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos ou composições farmacêuticas da presente invenção é selecionada de subcutânea, intravenosa, oral, nasal, intramuscular, transdérmica, por inalação, por supositório.
Uma modalidade preferida para administração ou aplicação nasal é um spray nasal.
Quantidade terapeuticamente eficaz
Os peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos ou as composições farmacêuticas da invenção são fornecidos de modo que eles compreendam uma quantidade terapeuticamente eficaz do referido peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico(s) da referida composição farmacêutica(s).
Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico ou uma composição farmacêutica dessa invenção refere-se à quantidade que é suficiente para inibir uma infecção por HBV e/ou HDV; prevenir uma infecção primária por HBV e/ou HDV; tratar hepatite B e/ou D e/ou vacinar e/ou inibir a entrada de HBV e/ou HDV in vivo.
Uma quantidade terapeuticamente eficaz preferida está na faixa de 10 pg a 1 mg por kg de peso corporal, preferivelmente 10 pg a 100 pg.
Para o uso de um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico da invenção como uma vacina, a quantidade
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36/61 terapeuticamente eficaz preferida está na faixa de 10 pg a 1 mg por kg de peso corporal.
No caso de um valor de IC50 do peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico usado de cerca de 10 nM, uma quantidade terapeuticamente eficaz preferida é cerca de 100 pg por kg de peso corporal ou na faixa de 1 a 5 mg por paciente. a quantidade terapeuticamente eficaz preferida na faixa de 1 a 5 mg por paciente pode ser administrada uma vez ao dia ou em outras modalidades apenas uma vez a cada 2-3 dias.
A quantidade terapeuticamente eficaz preferida depende da aplicação respectiva e do resultado desejado de inibição, tratamento ou vacinação.
O profissional habilitado será capaz de determinar quantidades terapeuticamente eficazes adequadas.
Identificação do receptor de HBV
A invenção também relaciona-se a um método para a identificação in vitro e/ou in vivo de um receptor do hepatócito envolvido na ligação e/ou penetração de HBV e/ou quantificação da expressão do referido receptor que compreende o uso de um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico como acima descrito.
O referido receptor de hepatócito pode ser identificado em mamíferos ou respectivos modelos animais, preferivelmente camundongo ou humano.
Em particular, o referido método compreende as etapas que compreendem:
- o contato de uma biópsia de fígado ou um hepatócito com um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico da invenção sob condições e por um período de tempo
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37/61 suficientes para permitir a ligação específica do referido peptídeo a um receptor expresso na superfície de um hepatócito;
- detecção da ligação do referido peptídeo a um receptor; e
- identificação do referido receptor.
Isso pode ser realizado de acordo com procedimentos clássicos bem conhecidos por pessoa habilitada na técnica. Por exemplo, isso pode envolver marcação radioativa, por enzima ou fluorescente dos peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos da invenção, e subseqüente detecção com um método adequado. Inúmeros materiais fluorescentes são conhecidos e podem ser utilizados como marcadores. Esses incluem, por exemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, verelho Texas, Cy3, Cy5, marcadores DIGE. Marcadores de enzima compreendem a conjugação de uma enzima a uma molécula de interesse, por exemplo, um polipeptídeo, e podem ser detectados por qualquer técnica de colorimetria, espectrofotometria, ou fluorspectrofotometria.
Os inventores identificaram lipopeptídeos derivados de proteína de superfície de HBV-preS1 que bloqueiam de modo eficaz a entrada de HBV in vitro e in vivo. Estudos de biodistribuição da presente invenção nesses peptídeos inibidores revelaram que eles se acumulam seletivamente no fígado em que eles se ligam e presumivelmente entram nos hepatócitos. Esse hepatotropismo requer a acilação Nterminal do peptídeo e depende de um certa porção de seqüência de preS de HBV nos aminoácidos N-terminais 47 preS1, ou seja, nos resíduos de aminoácido 2 a 21 (ou
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38/61 preferivelmente a seqüência mínima de resíduos 9 a 15). A observação dos inventores de que essa seqüência de peptídeo adicionalmente porta um sinal de translocação de membrana que facilita o transporte de proteínas de fusão completas através das membranas plasmáticas (resultados não publicados) abre a possibilidade de liberação específica de qualquer tipo de fármaco à membrana plasmática de hepatócitos ou seletivamente mesmo para o interior da célula.
Os inventores mostraram que lipopeptídeos derivados de preS1 de HBV são capazes de evitar completamente a infecção por HBV em um modelo de camundongo transplantado uPA-RAG-1 em doses muito baixas. Estudos de farmacocinética nesses inibidores de entrada derivados de HBVpreS também indicaram um hepatotropismo marcante combinado com uma estabilidade sérica extraordinariamente alta (t1/2 ca. 60 h) e uma meiavida longa no órgão desejado (t1/2 ca. 24 h) . Tanto a acilação N-terminal quanto a integridade de certas seqüências de aminoácidos dos peptídeos são mandatórias. Os peptídeos podem também ser usados, portanto, como vetores versáteis para direcionamento de fármaco específico para o fígado para vencer as infecções de hepatócitos ou para tratar carcinoma hepatocelular. (Veja também o pedido de patente provisória US correspondente dos inventores com o título: Peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de vírus da hepatite B (HBV) e seu uso como veículos para a liberação específica de compostos ao fígado, que foi depositada no mesmo dia).
Os inventores também provaram o princípio de que a infecção por WMHBV pode ser eficientemente bloqueada
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39/61 através da aplicação subcutânea de peptídeos derivados da proteína do envelope de HBV in vivo. Isso are novas perspectivas para a prevenção de infecção aguda por HBV e opções terapêuticas para hepatite B crônica. Um vez que o camundongo uPA/RAG-2/Pfp usado nessa invenção é desprovido de células B, células T, e células NK, um efeito inibidor direto dos peptídeos sobre hepatócitos suscetíveis é presumido. Isso é sustentado pelo acúmulo eficiente de peptídeos derivados de preS acilados no fígado, seguido por um lento clearance possivelmente pela via biliar. Ambas propriedades permitem a aplicação subcutânea em doses muito baixas e baixas freqüências. Uma vez que 5 injeções de 0,2 mg/kg de HBV/preS2-4 8myr em 5 dias resultaram na prevenção do estabelecimento de infecção por WMHBV, a administração contínua de cerca de 30 vezes mais de peptídeo ativo HBV/preS2-4 8estearoil deve ser eficaz em doses abaixo de 7 mg/kg ~13 nmol/kg quando dado diariamente ou a cada 2 dias. Levando em consideração que a dose farmacológica eficiente por peso corporal obtida em camundongo deve ser corrigida para humanos (13) por um fator de cerca de 10, a dose eficiente por pessoa deve ser menor que 100pg/dia.
O regime baseado em análogo de nucleotídeos/nucleosídeos para o tratamento de infecção crônica por HBV freqüentemente resulta na seleção de mutantes resistentes (4, 14). Isso demanda estratégias alternativas e novos fármacos que dirijam-se a diferentes etapas do ciclo de replicação do HBV. A inibição da entrada com lipopeptídeos de HBV representa tal abordagem. Devido ao modo de ação, os inventores supõem eficácia contra qualquer tipo de mutante resistente a
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40/61 nucleotídeos/nucleosídeos. Além disso, uma vez que a atividade do peptídeos requer uma seqüência conservada no domínio preS 1 (15), os peptídeos são ativos contra qualquer genótipo de HBV. Em contraste a Fuzeon® que visa a proteína de HIV gp41 assim permitindo o surgimento de mutações compensadoras intramoleculares, estudos prévios indicam que os lipopeptídeos de HBV acilados se dirigem a um componente celular que previne a interação do HBV com seu receptor (16, 17). Portanto, o surgimento de mutantes resistentes parece improvável.
Indicações aparentes para aplicações clínicas de lipopeptídeos derivados de preS de HBV são a prevenção de infecções ainda não estabelecidas por HBV (por exemplo, profilaxia pós-exposição, transmissão vertical ou prevenção de reinfecção de transplante de fígado). No entanto, os inibidores da entrada são também eficazes em pacientes cronicamente infectados, como em combinação com interferon α ou inibidores da transcriptase reversa viral. Uma vez que a manutenção da infecção crônica por HBV pode depender de um turnover dinâmico de hepatócitos infectados limpos pelo sistema imune por um lado e (re)infecção de células curadas/não infectadas por outro lado (18), será interessante avaliar a eficácia de tais abordagens terapêuticas no sistema quimérico uPA para reprimir a disseminação da infecção e surgimento de cepas resistentes com o tratamento antiviral (19).
Os lipopeptídeos derivados de preS de HBV também inibem a infecção in vitro de HDV, um virusóide satélite que utiliza as proteínas do envelope de HBV para a entrada em hepatócitos (15, 17, 20). Até hoje, não existe qualquer
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41/61 terapia eficaz para infecção por HDV, os lipopeptídeos derivados de preS representam a primeira terapia seletiva para essa doença hepática freqüentemente complicada.
A aplicação de lipopeptídeos derivados de preS de HBV em pacientes imunocompetentes desperta reações imunes celulares e humorais. Isso é benéfico para o resultado terapêutico, uma vez que é conhecido que os anticorpos que reconhecem os epitopos de HBVpreS/2-48 neutralizam a infecção por HBV in vitro (21). Além disso, foi especulado que a eliminação do vírus em uma infecção natural requer o estabelecimento bem sucedido imunidade específica para HBVpreS. Portanto, além da interferência direta com a entrada do vírus, o estímulo de respostas imunes específicas para preS pelo peptídeo pode contribuir para a eliminação do vírus através de reações imunes citolíticas ou não citolíticas, especialmente em combinação com IFNa.
Tabela 1 Peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos preferidos
| Designação de peptídeo | Seqüência de aminoácidos | IC50/ IC90 | |
| HBVpreS/(-11)- 48(consenso) | consenso | Id. de Seq. N°: 1 | |
| Id. de Seq. N°: 11 | IC50~70 pM | ||
| HBVpreS/2- 4 8myr (consenso) | |||
| Id. de Seq. N°: 11 | IC50~50 pM | ||
| HBVpreS/2- 48estearoii (consenso) | |||
| Peptídeos de Genótipo C | |||
| *HBVpreS/(-11)- 48myr (C) | natural | Id. de Seq. N°: 4 | IC50~4 nM |
| Id. de Seq. N°: 4 | IC50~1 nM |
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| *HBVpreS/(-11)- 4gesteraoil (C) | ||||
| Id. de Seq. N°: 12 | IC90~5 nM | |||
| *HBVpreS/2-48myr(C) | ||||
| Id. de Seq. N°: 12 | IC90~1 nM | |||
| *HBVpreS/2- 4gesteraoil (C) | ||||
| HBVpreS/5-48myr (C) | truncado | N-terminal | ||
| HBVpreS/5- 4gesteraoil (C) | ||||
| HBVpreS/9-4 8myr (C) | ||||
| HBVpreS/9- 48esteraoil (C) | ||||
| HBVpreS/2-21myr (C) | truncado | N- e/ou C-terminal | Id. de Seq. N°: 13 | |
| Id. de Seq. N°: 13 | ||||
| HBVpreS/2- 21esteraoil (C) | ||||
| Id. de Seq. N°: 14 | ||||
| HBVpreS/5-21myr (C) | ||||
| Id. de Seq. N°: 14 | ||||
| HBVpreS/5- 21esteraoil (C) | ||||
| HBVpreS/9-21myr (C) | ||||
| HBVpreS/9- 21esteraoil (C) | ||||
| HBVpreS/2-15myr (C) | ||||
| HBVpreS/2- 15esteraoil (C) | ||||
| HBVpreS/5-15myr (C) | ||||
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| HBVpreS/5- | ||||||||
| l^esteraoil (C) | ||||||||
| HBVpreS/9-15myr (C)** | Id. | de | Seq. | N°: | 15 | |||
| HBVpreS/9- | Id. | de | Seq. | N°: | 15 | |||
| 15esteraoil (C) ** | ||||||||
| HBVpreS/(-2)- 20Palm(C) | IC50~25 nM | |||||||
| Peptídeos de Genótipo D | ||||||||
| HBV preS/1-48myr (D) | natural | Id. | de | Seq. | N°: | 5 | ||
| HBV preS/2-4 8myr(D | Id. | de | Seq. | N°: | 16 | |||
| *HBVpreS/2- 4 8esteraoil (d) | Id. | de | Seq. | N°: | 16 | IC90-3 nM | ||
| HBVpreS/5-4 8myr (D) | truncado | N- | Id. | de | Seq. | N°: | 17 | |
| *HBVpreS/5- 48esteraoil (d) | terminal | Id. | de | Seq. | N°: | 17 | IC50-4 nM | |
| HBVpreS/9-48myr(D) | ||||||||
| *HBVpreS/9- | IC50- | |||||||
| 48esteraoil (d) | 11AM | |||||||
| HBVpreS/2-33myr (D) | truncado | N- e/ou | Id. | de | Seq. | N°: | 18 | |
| C- | ||||||||
| **HBVpreS/2- 33esteraoil (d) | terminal | Id. | de | Seq. | N°: | 18 | IC50-6 nM | |
| HBV *reS/2-2 6myr (D) | ||||||||
| **HBVpreS/2- | ||||||||
| 26esteraoil (D) | ||||||||
| HBVpreS/5-33myr(D) | Id. | de | Seq. | N°: | 19 |
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| *HBVpreS/5- 33esteraoil (d) | Id. de Seq. N°: 19 | IC50-7 nM | ||
| HBVpreS/9-33myr (D) | ||||
| *HBVpreS/9- 3333esteraoil (D) | ||||
| IC50-500 nM | ||||
| HBVpreS/2-21myr(D) | ||||
| Id. de Seq. N°: 20 | ||||
| *HBVpreS/2- 21esteraoil (d) | ||||
| Id. de Seq. N°: 20 | IC50-2 nM | |||
| HBVpreS/5-21myr (D) | ||||
| HBVpreS/5- 21esteraoil(D) | ||||
| HBVpreS/9-21myr(D) | ||||
| HBVpreS/9- 21esteraoil(D) | ||||
| HBVpreS/2-15myr (D) | ||||
| *HBVpreS/2- 15esteraoil(D) | IC50-200 nM | |||
| HBVpreS/5-15myr (D) | ||||
| HBVpreS/5- 15esteraoil(D) | ||||
| HBVpreS/9-15myr(D) * * | Id. de Seq. N°: 15 | |||
| HBVpreS/9- 15esteraoil(D)** | Id. de Seq. N°: 15 |
myr refere-se a miristoilação do terminal N;
palm refere-se a palmitoilação do terminal N;
estearoil refere-se a estearoilação do terminal N;
(C) refere-se ao genótipo C (com Q46K, como em Id. de Seq.
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N°: 4);
(D) refere-se ao genótipo D;
* peptídeos são mostrados nas Figuras;
** seqüência mínima.
Tabela 2 peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos preferidos com alterações nos epitopos imunogênicos
| Designação do peptídeo | Seqüência aminoácidos | de | |||
| HBVpreS/2-4 8myr-Ala21·23'29' 30 (C) | Id. | de | Seq. | N°: | 21 |
| HBVpreS/2-4 8estearoil-Ala21·23'29' 30 (C) | Id. | de | Seq. | N°: | 21 |
| HBVpreS/(-11)- 48myr-D20A(C) | Id. | de | Seq. | N°: | 22 |
| HBVpreS/ (-11) - 48estearoil-D20A(C) | Id. | de | Seq. | N°: | 22 |
| HBVpreS/2-4 8myr-D2 0A(C) | Id. | de | Seq. | N°: | 23 |
| HBVpreS/2-48estearoil -D20A(C) | Id. | de | Seq. | N°: | 23 |
| HBVpreS/ (-11) -48myr-SNN( 27-29)ANA(C) | Id. | de | Seq. | N°: | 24 |
| HBVpreS/(-11) -48estearoil-SNN(27- 2 9)ANA(C) | Id. | de | Seq. | N°: | 24 |
| HBVpreS/2-4 8myr-SNN(27-2 9)ANA(C) | Id. | de | Seq. | N°: | 25 |
| HBVpreS/2-48estearoil-SNN(27-2 9)ANA(C) | Id. | de | Seq. | N°: | 25 |
| HBVpreS/(-11)-48myr-D2 0A + SNN(27- 2 9) ANA (C) | Id. | de | Seq. | N°: | 26 |
| HBVpreS/(-11)-4 8estearoil-D2 0A + | Id. | de | Seq. | N°: | 26 |
| SNN(27-29)ANA(C) | |||||
| HBVpreS/2-4 8myr-D2 0A + SNN(27- 2 9)ANA(C) | Id. | de | Seq. | N°: | 27 |
| FIBVpreS/2-48estearoil-D20A + SNN(27- 2 9)ANA(C) | Id. | de | Seq. | N°: | 27 |
| HBVpreS/2-4 8myr- Ala21·23,29,30 (D) | Id. | de | Seq. | N°: | 28 |
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46/61 *HBVpreS/2-48estearoil- Ala21-23'29'30 (D) Id. de Seq. N°: 28 myr refere-se a miristoilação do terminal N;
estearoil refere-se a estearoilação do terminal N;
(C) refere-se ao genótipo C (com Q46K, como em Id. de Seq.
N°: 4);
(D) refere-se ao genótipo D;
Tabela 3 Estudos comparativos de inibição com peptídeos preS modificados hidrofóbicos de genótipo C e D
| Designação do peptídeo | Seqüência de aminoácidos | Genótipo | Porção hidrofóbica | Inibição | |
| HBVpreS/2-48myr(D) | Id. de N° : | Seq. 16 | D | Miristoil (C 14) | ++ |
| HBVpreS/2-48myr(C) | Id. de | Seq. | Miristoil | ||
| N° : | 12 | C | (C14) | +++ | |
| HBVpre S/(-11)- 48myr (C) | Id. de N°: | Seq. 4 | C | Miristoil (C14) | ++ |
| HBVpreS/2- | Id. de | Seq. | Estearoil | ||
| 48estearoil (C) | N° : | 12 | C | (C18) | ++++ |
| HBVpreS/(-11)- | Id. de | Seq. | Estearoil | +++ | |
| 48estearoil(C) | N°: | 4 | C | (C18) |
Veja também a Figura 3.
Em que (C) refere-se ao genótipo C de HBV Q46K.
Tabela 4 Estudos de inibição da infecção com peptídeos preS modificados hidrofóbicos com a seqüência de consenso.
| Designação do peptídeo | Seqüência de aminoácidos | Porção hidrofóbica | Inibição |
| HBVpreS/2-48myr consenso) | Id. de Seq. N°: 11 | Miristoil (C14) | ++++ |
| HBVpreS/2-48estearoil | Id. de Seq. N°: | Searoil (C 18) | ++++ |
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| (consenso) | 11 |
Veja também a Figura 4.
Tabela 5 Estudos comparativos de inibição com variantes de deleção C-terminais.
| Designação do peptídeo | Seqüência de aminoácidos | Genótipo | Porção hidrofóbica | Inibição |
| HBVpreS/2- | SEQ ID NO, | Estearoil | + + + | |
| 48estearoil (D) | 16 | D | (C18) | |
| HBVpreS/2- 33estearoil (D) | Id. de Seq. N° : 18 | D | Estearoil (C18) | + |
| HBVpreS/2- 26estearoil(D) | D | Estearoil (C18) | + | |
| HBVpreS/2- 21estearoil(D) | Id. de Seq. N° : 20 | D | Estearoil (C18) | + + + |
| HBVpreS/2- 15estearoil(D) | D | Estearoil (C18) | + /- |
Veja também a Figura 5.
Tabela 6 Estudos comparativos de inibição com variantes de deleção C e N-terminais
| Designação do peptídeo | Seqüência de aminoácidos | Genótipo | Porção hidrofóbica | Inibição |
| HBVpreS/2- 15estearoil(D) | Id. de Seq. N° : 16 | D | Estearoil (C18) | + + + |
| HBVpreS/2- 33estearoil(D) | Id. de Seq. N° : 18 | D | Estearoil (C18) | + |
| HBVpreS/5- 33estearoil(D) | Id. de Seq. N° : 19 | D | Estearoil (C18) | + |
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| HBVpreS/5- 48estearoil (D) | Id. de Seq. N° : 17 | D | Estearoil (C18) | + |
| HBVpreS/9- 33estearoil (D) | D | Estearoil (C18) | + /- | |
| HBVpreS/9- 48estearoil( | D | Estearoil (C18) | + /- |
Veja também a Figura 6.
Tabela 7 Estudos comparativos de inibição com peptídeos preS modificados hidrofóbicos que demonstram a necessidade dos resíduos de aminoácido 9 a 15 (a seqüência mínima)
| Designação do peptídeo | Seqüência de aminoácidos | Genótipo | Inibição |
| HBVpreS/2-48estearoil (D) | Id. de Seq. N°: 16 | D | + + + |
| HBVpreS/2-48estearoil (D-AS11-15)(D) | D | - | |
| HBVpreS/2-48estearoil (Ala11-15)(D) | D | - | |
| HBVpreS/2-48estearoil (Δ17-21) (D) | D | + | |
| HBVpreS/2-48estearoil (Ala17-21)(D) | D | - | |
| HBVpreS/2-48estearoil (Ala2-9) (D) | D | - |
Veja também a Figura 7.
Tabela 8 Estudos comparativos de inibição com peptídeos preS modificados hidrofóbicos
| Designação do peptídeo | Seqüência de aminoácidos | Genótipo | Inibição |
| HBVpreS/2-48estearoil (retroinverso)(D) | D | --- | |
| HBVpreS/2-48estearoil- Ala21'23'29'30 (D) | Id. de Seq. N°: 28 | D | ++ |
retroinverso seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 16
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49/61 na direção C para N
Veja também a Figura 8.
Tabela 9 Estudos comparativos de inibição adicionais com peptídeos preS modificados hidrofóbicos que demonstram a necessidade de resíduos de aminoácido 9 a 15 (a seqüência mínima)
| Designação do peptídeo | Seqüência de aminoácidos | Genótipo | Inibição |
| HBVpreS/2-48estearoil (Ala18) (D) | D | -H- | |
| HBVpreS/2-48estearoil (Δ11-15)(D) | D | --- | |
| HBVpreS/2- 48estearoil(Ser13)(D) | D | + | |
| HBVpreS/2-48estearoil (Arg11)(D) | D | --- |
Veja também a Figura 9.
Os exemplos e desenhos a seguir ilustram a presente invenção sem, no entanto, limitar a mesma.
Breve descrição dos desenhos
Figura 1. Representação esquemática da partícula de HBV e as proteínas L-, M- e S- de HBV.
(A) O DNA parcialmente de filamento duplo é covalentemente associado com o complexo de polimerase viral, que consiste na proteína terminal, (TP), a transcriptase reversa (RT) e a RNaseH. O genoma é encapsulado por uma capsula icosaédrica, constituída de 120 dímeros de proteína de núcleo. As 3 proteínas de superfície do HBV L-, M- e S- são englobadas na bicamada lipídica derivada de ER. As proteínas L- e M- contêm o domínio S completo que serve
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50/61 como uma âncora de membrana.
(B) A estrutura do domínio das 3 proteínas de superfície do HBV L, M e S.
A proteína L contém o domínio preS1 de 107 aminoácidos N-terminalmente miristoilados, o domínio preS2 de 55 aminoácidos e o domínio S que contém os 4 segmentos de transmembrana (I-IV).
Figura 2. seqüência de consenso de preS1 de HBV.
No topo: a proteína L de HBV L com seu domínio preS1, preS2 e S é mostrada. O terminal N é miristoilado.
O alinhamento abaixo mostra: a seqüência de consenso (Consenso) e os oito genótipos de HBV (A-H) bem como a seqüência de preS de HBV de macaco barrigudo (WMHBV) que engloba aminoácidos 2-50. Note que os genótipos A, B, C, E, G e H têm onze aminoácidos adicionais em seus terminais N, o genótipo F tem 10 resíduos de aminoácido adicionais. No fundo, os subdomínios funcionais conhecidos são mostrados. Por favor, note que o genótipo C de HBV refere-se ao genótipo C de HBV Q46K.
Figura 3 Ensaio comparativo de inibição de infecção de peptídeos HBVderivados de preS miristoilados e estearoilados dos dois genótipos C e D.
Células HepaRG foram infectadas na ausência (0 nM) ou na presença de 1, 5, 25, 100 e 2.000 nM de HBVpreS/248myr(D), HBVpreS/2-4 8myr(C), HBVpreS/(-11)- 48myr(C),
HBVpreS/2-48estearoil(C) e HBVpreS/(-11)-48estearoil(C). O inóculo infeccioso (HBV de genótipo D) e os peptídeos foram incubados de um dia para o outro. Depois de lavagem, as células foram mantidas por mais 12 dias para permitir a expressão do gene viral. Os sobrenadantes da cultura de
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51/61 células do dia 8-12 foram coletados e analisados para HBSAg secretado com o uso de um ELISA quantitativo comercialmente disponível. Os valores do HBsAg da respectiva infecção incompleta foram ajustados a 100% e o grau de inibição da infecção é dado em % da infecção incompleta.
Em que (C) ou genótipo C refere-se ao genótipo C de HBV Q46K.
Figura 4. Ensaio inibição de infecção de peptídeos HBVderivados de preS miristoilados e estearoilados com a seqüência de consenso
Células HepaRG foram infectadas na ausência (0 nM) ou na presença de 0,125; 0,25; 0,5; 0,75 e 1 nM de HBVpreS/248myr(consenso) e HBVpreS/2-4 8estearoil(consenso). O inóculo infeccioso (HBV de genótipo D) e os peptídeos foram incubados de um dia para o outro. Depois de lavagem, as células foram mantidas por mais 12 dias para permitir a expressão do gene viral. Os sobrenadantes da cultura de células do dia 8-12 foram coletados e analisados para HBSAg secretado com o uso de um ELISA quantitativo comercialmente disponível. Os valores do HBsAg da respectiva infecção incompleta foram ajustados a 100% e o grau de inibição da infecção é dado em % da infecção incompleta.
Figure 5. Ensaio comparativo de inibição de infecção de peptídeos HBVderivados de preS C-terminalmente deletados estearoilados de genótipo D.
Células HepaRG foram infectadas na ausência (0 nM) ou na presença de 1, 5, 25, 100 e 1.000 nM de HBVpreS/248estearoil(D), HBVpreS/2-15estearoil(D), HBVpreS/2-21estearoil(D), HBVpreS/2-26estearoil(D) e HBVpreS/2-33estearoil(D). O inóculo infeccioso (HBV de genótipo D) e os peptídeos foram
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52/61 incubados de um dia para o outro. Depois de lavagem, as células foram mantidas por mais 12 dias para permitir a expressão do gene viral. Os sobrenadantes da cultura de células do dia 8-12 foram coletados e analisados para HBSAg secretado com o uso de um ELISA quantitativo comercialmente disponível. Os valores do HBsAg da respectiva infecção incompleta foram ajustados a 100% e o grau de inibição da infecção é dado em % da infecção incompleta.
Figura 6. Ensaio comparativo de inibição de infecção de peptídeos HBVderivados de preS C- e N-terminalmente deletados estearoilados de genótipo D.
Células HepaRG foram infectadas na ausência (0 nM) ou na presença de 1, 5, 25, 100 e 1.000 nM de HBVpreS/248estearoil (D), HBVpreS/2-33estearoil (D), HBVpreS/5-33estearoil (D), HBVpreS/5-48estearoil(D), HBVpreS/9-33estearoil(D) e HBVpreS/948estearoil(D). O inóculo infeccioso (HBV de genótipo D) e os peptídeos foram incubados de um dia para o outro. Depois de lavagem, as células foram mantidas por mais 12 dias para permitir a expressão do gene viral. Os sobrenadantes da cultura de células do dia 8-12 foram coletados e analisados para HBSAg secretado com o uso de um ELISA quantitativo comercialmente disponível. Os valores do HBsAg da respectiva infecção incompleta foram ajustados a 100% e o grau de inibição da infecção é dado em % da infecção incompleta.
Figura 7. Ensaio comparativo de inibição de infecção de peptídeos HBVpreS/2-48 internamente mutados estearoilados de genótipo D.
Células HepaRG foram infectadas na ausência (0 nM) ou na presença de 1, 5, 25, 100 e 1.000 nM de HBVpreS/2Petição 870190066406, de 15/07/2019, pág. 64/78
53/61 48estearoii(D), HBVpreS/2-4 8estearoil (D-AS11-15)(D), HBVpreS/248estearoil(Ala11-15)(D), HBVpreS/2-4 8estearoil( Δ17-21)(D),
HBVpreS/2-48estearoil(Ala17-21)(D) e HBVpreS/2-4 8estearoil(Ala29)(D). O inóculo infeccioso (HBV de genótipo D) e os peptídeos foram incubados de um dia para o outro. Depois de lavagem, as células foram mantidas por mais 12 dias para permitir a expressão do gene viral. Os sobrenadantes da cultura de células do dia 8-12 foram coletados e analisados para HBSAg secretado com o uso de um ELISA quantitativo comercialmente disponível. Os valores do HBsAg da respectiva infecção incompleta foram ajustados a 100% e o grau de inibição da infecção é dado em % da infecção incompleta.
Figura 8. Ensaio comparativo de inibição de infecção de peptídeos HBVpreS/2-48 internamente mutados estearoilados de genótipo D.
Células HepaRG foram infectadas na ausência (0 nM) ou na presença de 1, 5, 25, 100 e 1.000 nM de HBVpreS/24 8estearoil(retroinverso) (D) e HBVpreS/2-48estearoil(Ala21'23' 29,30)(D). O inóculo infeccioso (HBV de genótipo D) e os peptídeos foram incubados de um dia para o outro. Depois de lavagem, as células foram mantidas por mais 12 dias para permitir a expressão do gene viral. Os sobrenadantes da cultura de células do dia 8-12 foram coletados e analisados para HBSAg secretado com o uso de um ELISA quantitativo comercialmente disponível. Os valores do HBsAg da respectiva infecção incompleta foram ajustados a 100% e o grau de inibição da infecção é dado em % da infecção incompleta.
Figura 9. Ensaio comparativo de inibição de infecção de
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54/61 peptídeos HBVpreS/2-48 internamente mutados estearoilados de genótipo D.
Células HepaRG foram infectadas na ausência (0 nM) ou na presença de 1, 5, 25, 100 e 1.000 nM de HBVpreS/248estearoil (Ala18)(D) ,
HBVpreS/2-48estearoil (A11-15)(D),
HBVpreS/2-48estearoil(Ser13)(D)
HBVpreS/248estearoil(Arg11)(D). O inóculo infeccioso (HBV de genótipo D) e os peptídeos foram incubados de um dia para o outro. Depois de lavagem, as células foram mantidas por mais 12 dias para permitir a expressão do gene viral. Os sobrenadantes da cultura de células do dia 8-12 foram coletados e analisados para HBSAg secretado com o uso de um ELISA quantitativo comercialmente disponível. Os valores do HBsAg da respectiva infecção incompleta foram ajustados a 100% e o grau de inibição da infecção é dado em % da infecção incompleta.
Figura 10. Peptídeos HBVderivados de preS estearoilados de genótipo D usados nessa invenção.
Figura 11. Os peptídeos preS modificados hidrofóbicos da invenção mostram um tropismo hepático in vivo.
A Biodistribuição de HBVpreS/2-48 Tyrestearoil (D) em camundongos.
B Biodistribuição de HBVpreS/5-48 D-Tyrestearoil (D) em camundongos.
C Biodistribuição de HBVpreS/2-33-D Tyrestearoil (D) em camundongos.
Figura 12. Inibição da infecção por HBV em células HepaRG por Myrcludex B, efeito de acilação.
Myrcludex B refere-se ao HBVpreS/2-48(C), em que (C) refere-se ao genótipo C de HBV Q46K. Ensaio competitive que
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55/61 compara o HBVpreS/2-48(C), HBVpreS/2-4 8myr(C) e HBVpreS/248estearoil(C) estearoilados e miristoilados. As concentrações testadas estavam abaixo de 1 nM para ter competição não total.
São mostradas medicos de HBeAg, dia 7-14 p.i.
Mesmas condicoes de reação e infecção como para os experimentos mostrados nas Figuras 3 a 9.
EXEMPLOS
Métodos
Síntese de peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos de HBV
A síntese foi realizada como descrito, por exemplo, em (16).
Linhagens de células e culturas de células primárias.
Células HepaRG cresceram em meio William's E suplementado com 10% soro fetal de bezerro (FCS), 100 unidades/ml penicilina, 100 pg/ml estreptomicina, 5 pg/ml insulina e 5x10-5 M hemissuccinato de hidrocortisona (16) . As células foram passadas a 1/5 a cada duas semanas por tripsinização. Duas a três semanas antes da infecção, a diferenciação celular foi induzida por adição de 2% DMSO no meio de manutenção. O meio foi substituído a cada 2-3 dias. Ensaios de competição de infecção.
Como um inóculo infeccioso, um sobrenadante de cultura 50 vezes concentrado de células HepG2 clone 2.2.15 (23) foi usado, por causa de seu suprimento ilimitado e uma constante qualidade. Ele foi preparado a partir de sobrenadantes recém coletados por precipitação de partículas virais na presença de 6% polietileno glicol (PEG) 8000. O pélete foi ressuspenso em solução salina
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56/61 tamponada por fosfato (PBS) contendo 25% FCS. As alíquotas foram estocadas a -80°C. Células HepaRG ou PHH diferenciadas foram incubadas com a fonte de infecção concentrada, diluídas 10 vezes em meio de cultura suplementado com 4% PEG 8000 (Sigma), por 20 h a 37°C. Ao final da incubação, as células foram lavadas três vezes com o meio de cultura e mantidas na presença de 2% DMSO e 5x105 M hemissuccinato de hidrocortisona e coletadas em momentos indicados.
Os experimentos de competição foram realizados em places de 12 cavidades. Aproximadamente 1 x106 células foram primeiramente pré-incubadas por 30 minutos com with peptídeos derivados de HBV quimicamente sintetizados seguido por uma co-incubação de células com peptídeo e vírus por 20 h. todas as séries de competição foram realizadas pelo menos duas vezes e os resultados de um experimento representativo são mostrados em cada caso (veja as Figuras 3 a 7).
As células HepaRG foram infectadas na ausência (0 nM) ou na presença de • 1, 5, 25, 100 e 2.000 nM de,
- HBVpreS/2-4 8myr(D)
- HBVpreS/2-4 8myr(C) ,
- HBVpreS/(-11)-48myr(C),
- HBVpreS/2-48estearoil(C) e
- HBVpreS/(-11)-48estearoil(C) ; ou • 0,125; 0,25; 0,5; 0,75 e 1 nM de
- HBVpreS/2-48myr(consenso) e
- HBVpreS/2-48estearoil(consenso) • 1, 5, 25, 100 e 1.000 nM de
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57/61
- HBVpreS/2-48estearoil(D),
- HBVpreS/2-15estearoil(D),
- HBVpreS/2-21estearoil(D),
- HBVpreS/2-26estearoil(D) e
- HBVpreS/2-33estearoil(D) ; ou • 1, 5, 25, 100 e 1.000 nM de
- HBVpreS/2-48estearoil(D),
- HBVpreS/2-33estearoil(D),
- HBVpreS/5-33estearoil(D),
- HBVpreS/5-48estearoil(D),
- HBVpreS/9-33estearoil(D) e
- HBVpreS/9-48estearoil(D) ; ou • 1, 5, 25, 100 e 1.000 nM de
- HBVpreS/2-48estearoil(D),
- HBVpreS/2-48estearoil(D-AS11-15)(D),
- HBVpreS/2-48estearoil(Ala11-15)(D),
- HBVpreS/2-48estearoil (Δ17-21)(D),
- HBVpreS/2-48estearoil(Ala17-21)(D) ou • 1, 5, 25, 100 e 1.000 nM de
- HBVpreS/2-48estearoil(retroinverso)(D) e
- HBVpreS/2-48estearoil(Ala21'23' 29,30 )(D); ou • 1, 5, 25, 100 e 1.000 nM de
- HBVpreS/2-48estearoil(Ala18)(D),
- HBVpreS/2-48estearoil (A11-15)(D),
- HBVpreS/2-4 8estearoil(Ser13)(D)
- HBVpreS/2-48estearoil(Arg11)(D); ou • 50, 100, 150, 250 e 1.000 pM (0,05, 0,1, 0,25 e 1 nM) de - HBVpreS/2-4 8myr(C) e
- HBVpreS/2-4 8estearoil (C), em que (C) refere-se ao genótipo C de HBV Q46K.
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O inóculo infeccioso (HBV de genótipo D) e os peptídeos foram incubados de um dia para o outro. Depois de lavagem, as células foram mantidas por mais 12 dias para permitir a expressão do gene viral. Os sobrenadantes da cultura de células do dia 8-12 foram coletados e analisados para HBSAg secretado com o uso de um ELISA quantitativo comercialmente disponível. Os valores do HBsAg da respectiva infecção incompleta foram ajustados a 100% e o grau de inibição da infecção é dado em % da infecção incompleta.
Os resultados são mostrados nas figuras 3 a 9 e 12 bem como nas Tabelas 3 a 9.
Biodistribuição dos peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos
A biodistribuição dos peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos foi estudada em camundongos machos
NMRI. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as leis da Alemanha. Os peptídeos, contendo um resíduo Tyr adicional na extremidade C-terminal foram marcados com 131I (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany) pelo método de cloraminaT e purificados por HPLC. Os peptídeos marcados foram administrados por via subcutânea por injeção de uma solução em 50% DMSO. Em tempos selecionados os camundongos foram sacrificados e a radioatividade contida no sangue, coração, pulmão, baço, fígado, rins, músculos e cérebro foi medida em um contador γ (Canberra Packard, Riisselsheim, Alemanha) e expressa como uma percentagem da dose injetada por grama de tecido (%ID/g).
Avaliacao de estabilidade dos peptídeos derivados de preS modificados hidrofóbicos depois da extração do fígado
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Para determiner a estabilidade do peptídeo no fígado, HBVpreS/2-4 8myr (D)marcado com 131I foi extraído de um lobo hepático 24 h depois da injeção subcutânea. Para esse fim, 1 ml de água por grama de tecido hepático congelado foi adicionado à amostra. Depois de homogeneização, um volume igual de acetonitrila foi adicionado e a homogeneização foi repetida. Depois da centrifugação (2 x 10 minutos a 4.000 x g) essa solução foi separada em uma coluna de HPLC de fase reversa e a radioatividade de cada fração foi quantificada em um contador gama.
As características reveladas na descrição anterior, nas reivindicações e/ou nos desenhos em apêndice podem, separadamente e em qualquer combinação desses, ser material para a realização da invenção em diversas formas.
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Claims (13)
- REIVINDICAÇÕES1. Peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico de vírus da hepatite B (HBV) CARACTERIZADO pelo fato de que é da fórmulaHm- P- Rn, em queP é o referido peptídeo derivado de preS que compreende a sequência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 11 ou Id. deSeq. N°: 12;H é uma modificação hidrofóbica do peptídeo P derivado de preS, que é N-terminal de P e selecionada de acilação, e adição de porções hidrofóbicas;R é uma modificação C-terminal do referido peptídeo P derivado de preS que protege o peptídeo de degradação;m é pelo menos 1; e n é 0 ou pelo menos 1.
- 2. Peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que H e/ou R são ligados a P por meio de um ligante ou espaçador.
- 3. Peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que H é uma modificação hidrofóbica por acilação com ácidos carboxílicos, ácidos graxos, ácidos graxos C8 a C22, ou aminoácidos com cadeias laterais lipofílicas.
- 4. Peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que H é uma modificação hidrofóbica por acilação com miristoil (C14), palmitoil (C16) ou estearoil (C18).Petição 870190066406, de 15/07/2019, pág. 74/782/3
- 5. Peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que H é uma modificação hidrofóbica por adição de porções hidrofóbicas selecionadas de colesterol, derivados de colesterol, fosfolipídeos, glicolipídeos, ésteres de glicerol, esteroides, ceramidas, derivados de isopreno, adamantano, farnesol, grupos alifáticos, compostos poliaromáticos.
- 6. Peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que R é uma modificação com uma porção selecionada de amida, D-aminoácido, aminoácido modificado, aminoácido cíclico; polímero natural e sintético, como PEG, glicina.
- 7. Peptídeo CARACTERIZADO por compreender um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que compreende ainda um rótulo, preferivelmente selecionado de um pigmento fluorescente, um radioisótopo e um agente de contraste.
- 8. Peptídeo CARACTERIZADO por compreender um peptídeo derivado de preS modificado hidrofóbico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e de acordo com a reivindicação 7, em que o peptídeo é fundido a um peptídeo ou proteína, preferivelmente selecionado de albumina e domínios Fc de IgGs humanas.
- 9. Peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e de acordo com as reivindicações 7 ou 8, CARACTERIZADO pelo fato de ser para uso no diagnóstico, prevenção e/ou tratamento de uma doença em um paciente.Petição 870190066406, de 15/07/2019, pág. 75/783/3
- 10. Peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e de acordo com a reivindicação 7 ou 8, para uso de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de a doença ser HBV e/ou infecção por HDV, infecção primária por HBV e/ou HDV, hepatite B e/ou D, ou hepatite crônica B e/ou D.
- 11. Peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e de acordo com as reivindicação 7 ou 8, para uso de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo é administrado ao paciente por uma rota de administração selecionada de subcutânea, intravenosa, oral, nasal, intramuscular, transdérmica, por inalação, ou por supositório.
- 12. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
- 13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz está na faixa de 10 pg a 1 mg por kg de peso corporal, de um modo preferido, 10 pg a 100 pg.
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