BRPI0811686B1 - Método para a produção de sacarídeo - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE SACARÍDEO, COMPOSIÇÃO DE SACARÍDEO SOLÚVEL EM ÁGUA DO TIPO PROGUT E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE SACARÍDEO. A presente invenção refere-se a uma nova composição de sacarídeo isolada de uma cultura de levedura. A invenção também se refere a uma composição de sacarídeo à base de células de levedura com maior solubilidade em água. As composições de sacarídeo descritas na invenção podem ser utilizadas como aditivos nutritivos ou farmacêuticos ou como parte de uma composição nutritiva ou farmacêutica a fim de promover a saúde de um animal ou de seres humanos aos quais a dita composição é administrada. A invenção também se refere aos métodos de produção das ditas composições de sacarídeo.
Description
A presente invenção é dirigida a uma nova composição de sacarídeo isolada de uma cultura de levedura. A invenção também é dirigida a uma composição de sacarídeo à base de célula de levedura com maior solubilidade em água. As composições do sacarídeo descritas na invenção podem ser utilizadas como aditivos nutritivos ou farmacêuticos ou como parte de uma composição nutritiva ou farmacêutica a fim de promover a saúde de um animal ou de seres humanos aos quais a dita composição é administrada. A invenção também é dirigida aos métodos de produção das ditas composições de sacarídeo.
Progut™ é um ingrediente de alimentação animal inteiramente à base de levedura para manter a boa saúde do intestino, melhorar o crescimento e substituir os antibióticos na maioria de problemas gastrintestinais nos animais (vide o documento de patente US 20020061345). O Progut™ é inteiramente produzido de levedura de cerveja (Saccharomyces Cerevisiae) e portanto contém tanto partículas de parede de célula de levedura (na maior parte manoproteínas e β-glucanos) e nucleotídeos internos da célula. Todos esses componentes foram mostrados como sendo importantes para a atividade do Progut™.
A presente invenção revela novos produtos do tipo de progut especialmente produzidos com hidrólise de ácido forte otimizada ou condições de hidrólise enzimática ou combinações surpreendentemente eficazes dos mesmos para obter um novo produto bioativo e altamente solúvel. Foi observado que condições de tratamento com ácidos surpreendentemente fortes, incluindo concentrações de ácido muito elevadas que incluem aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1 M de ácido e/ou alta temperatura de reação na faixa de 75-100 graus Celsius, foram necessárias para obter maior solubilização e obter polissacarídeos e oligossacãrídeos altamente bioativos e de baixo peso molecular. As condições são drásticas e revelam alta resistência dos materiais de levedura à hidrólise; no entanto, há uma condição mais favorável em que o aumento do ácido para 2 M com alta temperatura causa uma solubilização menos eficaz dos materiais de parede de célula e/ou uma maior quantidade de monossacarídeos livres causados pela hidrólise próxima da hidrólise total.
A característica química exclusiva, incluindo o oligossacarídeo com alto teor de manose e oligossacarídeo com baixo teor de amido e sacarídeo com alto teor de Glcβ são relacionados à alta bioatividade das novas frações de sacarídeo. Estes são claramente diferentes dos produtos anteriores e são produtos concorrentes. As condições ideais de hidrólise para produzir uma quantidade substancial de oligossacãrídeos com manose efetiva e sacarídeos Glcβ na mesma preparação são novas e especialmente inventivas quando os sacarídeos são produzidos para a mesma preparação e da matéria-prima de levedura, incluindo a levedura nativa sem tratamentos químicos principais hidrolíticos ou de extração, tal como a levedura derivada da fermentação, como a levedura derivada do processo de cervejaria.
Deve ser compreendido que os tratamentos com ácido dos materiais de levedura antecedentes são principalmente tratamentos suaves com baixas concentrações de ácido em faixas de pH e temperaturas de reação modestas, e são utilizados tipicamente junto com tratamentos alcalinos para obter principalmente as preparações de parede de célula insolúveis referidas como glucanos. Não há nenhuma evidência da preparação de glucano derivado de ácido beta6.
Nesta invenção, um conjunto de amostras antigas e novas de Progut™, bem como as amostras dos produtos relacionados selecionados são analisadas. A análise é realizada principalmente pela cromatografia de permeação em gel, mas o processo utiliza a análise em NMR dos componentes solúveis aqui isolados pela cromatografia de permeação em gel.
Um outro alvo deste estudo era a produção de um novo Progut™ com maior solubilidade e sem perder sua atividade. Isto pode ser obtido com a degradação das manoproteínas e/ou β-glucanos tanto enzimaticamente, mecanicamente como pela hidrólise de ácido.
Figura 1 - Quantidades de componentes solúveis em um produto do tipo Progut (PG) e amostras relacionadas. PG1-PG9, amostras de produto do tipo Progut; amostras relacionadas: Cl, Agrimos; C2, Ascogen; C3, Alphamune Alpharma;C4, Bio-Mos.
Figura 2 - Comparação de PG1 e PG2, em solução a 0,2%. Cromatogramas de permeação em gel de A.PG1 e B. PG2 de componentes solúveis em água de soluções a 0,2% (preparações iguais de amostra); na coluna Peptídeos Superdex (A2i4 foi medido) .
Figura 3 - Comparação de PG1 e de PG2, em solução a 1%. Cromatogramas de permeação em gel de A.PG1 e B.PG2 componentes solúveis em água de soluções a 1% (preparações iguais de amostra) ; na coluna Peptídeos Superdex (A214 foi medido).
Figura 4 - Comparação de nove amostras de PG e amostras relacionadas. Cromatogramas de permeação em gel de A.PG1, B.PG2, C.PG3, D.PG4, E.PG5, F.PG6, G.PG7, H.PG8, I.PG9, J.Cl, K.C2, L.C3, M.C4, componentes solúveis em água de soluções a 1% (preparações iguais de amostra); na coluna Peptídeos Superdex (A230 foi medido). Com PG9, aproximadamente 50% a menos de material foi analisado. No entanto, isto é compensado pelo ajuste da faixa adequadamente a fim de poder comparar os resultados igualmente.
Figura 5 - Comparação de cinco amostras de PG. Cromatogramas de permeação em gel de A.PG10, B.PG11, C.PG12, D.PG13, E.PG14, componentes solúveis em água de soluções a 1% (preparações iguais de amostra); na coluna Peptídeos Superdex (A230 foi medido) .
Figura 6 - Comparação das amostras de PG geradas da solução de levedura de cerveja e de sua versão homogeneizada. Cromatogramas de permeação em gel de ácido hidrolisado. A. levedura de cerveja e B. levedura de cerveja homogeneizada, componentes solúveis em água de soluções a 1% (preparações iguais de amostra); na coluna Peptídeos Superdex (A2I4 foi medido) .
Figura 7 - Comparação de amostras geradas por degradações enzimática ou química para testes de adesão bacteriana. Cromatogramas de permeação em gel de A. Levedo de cerveja (BY) + glucanex (G) , B. Homogeneizada BY (HBY) + G, C.BY G + savinase (S) , D. HBY G+S, E.BY IM H3PO4, F.HBY 1M H3PO4, G.BY G + pectinase (PE), H.HBY G+PE, I.PG1 PE, J.PG1 + PR, componentes solúveis em água de soluções a 1% (preparações iguais de amostra); na coluna Peptídeos Superdex, A, B, e I são os cromatogramas preparativos, onde A23O foi medido (comparáveis uns aos outros) ; os outros eram analíticos, onde A234 foi medido (comparáveis uns aos outros).
Figura 8 - Comparação de PG1, PG solúvel em água (PG WS), PG solúvel em água com emulsificante (PG WS+E), e PG super-hidrolisado. Cromatogramas de permeação em gel de A.PG1, B.PG WS, C.PG WS+E e D.PG 15h componentes solúveis em água de soluções a 1% (preparações iguais de amostra); na coluna Peptídeos Superdex (A2I4 foi medido) .
Figura 9 - Efeito da pronase em amostras de produto do tipo Progut. As amostras de produto do tipo Progut 1 e 2 (PG1 e PG2) sem (colunas cinza) e com (colunas cinza-escuro) digestão de pronase.
Figura 10 - Efeito da pronase em um produto do tipo Progut e na solução de levedura de cerveja. As amostras de produto do tipo Progut 1 e 2 (PG1 e PG2) sem (colunas cinza) e com (colunas cinza-escuro) digestão de pronase (segunda experiência). A levedura de cerveja (BY) foi tratada primeiramente com pronase e então com a hidrólise de ácido (BY1) ou primeiro com a hidrólise de ácido e então com a pronase (BY2), colunas cinza-escuro. Como controle, BY foi hidrolisado por ácido com o procedimento do processo (colunas cinza).
Figura 11 - Efeito da savinase em um produto do tipo Progut e na solução de levedura de cerveja. As amostras de produto do tipo Progut 1 e 2 (PG1 e PG2) sem (colunas cinza) e com (colunas cinza-escuro) digestão de savinase. A levedura de cerveja (BY) foi tratada primeiramente com savinase e então com a hidrólise de ácido (BY1) ou primeiramente com a hidrólise de ácido e então com savinase (BY2), colunas cinza-escuro. Como controles, BY e BY2 foram hidrolisados por ácido com o procedimento do processo (colunas cinza).
Figura 12 - Efeito da pectinase em um produto do tipo Progut e na solução de levedura de cerveja. As amostras de produto do tipo Progut 1 e 2 (PG1 e PG2) sem (colunas cinza) e com (colunas cinza-escuro) digestão de pectinase. A levedura de cerveja (BY) foi tratada primeiramente com pectinase e então com a hidrólise de ácido (BY1) ou primeiro com a hidrólise de ácido e então com pectinase (BY2), colunas cinza-escuro. Como controles, BY e BY2 foram hidrolisados por ácido com o procedimento do processo (colunas cinza).
Figura 13 - Efeito da glucanex na solução de levedura de cerveja. Primeira experiência, levedura de cerveja com glucanex 5, 20, 100 mg a 30°C (G5 30°C, G20 30°C, G100 30°C, respectivamente), após o qual o tratamento com ácido do processo, colunas cinza-escuro. Segunda experiência, levedura de cerveja com 20 mg de glucanex a 37 ou 50 °C (G2 0 3 7°C, G2 0 50°C, respectivamente), após o qual o tratamento com ácido do processo, colunas cinza-escuro. Como controle, em ambas as experiências a levedura de cerveja foi tratada somente com o tratamento com ácido do processo, colunas cinza.
Figura 14 - Efeito combinado de glucanex e savinase sobre a solução de levedura de cerveja. A. Solução de levedura de cerveja primeiro com glucanex 5, 20, 100 mg a 30°C e então com savinase 4 μl a 37°C (G 5+S, G 20+S, G 100+S, respectivamente), após o qual o tratamento com ácido do processo, colunas cinza-escuro. B.Solução de levedura de cerveja primeiro com glucanex 20 mg a 37°C e então com savinase 4 ou 20 μl a 37 °C (G 37+S4, G 37+S20, respectivamente), colunas cinza-escuro, ou com glucanex 20 mg a 50°C e então com savinase 4 ou 20 μl a 37 °C (G 50+S4, G 50+S20, respectivamente), após o qual o tratamento com ácido do processo, colunas cinza-escuro. Como controles tanto para A. como para B., a solução de levedura de cerveja foi incubada sem enzimas e tratada somente com o tratamento com ácido do processo, colunas cinza.
Figura 15 - Efeito combinado de glucanex e endoglucanase e/ou savinase sobre a solução de levedura de cerveja. Solução de levedura de cerveja, com glucanex 20 mg e endoglucanoase 200 μg a 37°C a 50°C (G 37+EG, G 50+EG, respectivamente) ou primeiro com glucanex 20 mg, endoglucanoase 200 μg a 37 °C ou 50°C e então com savinase 4 μg a 37 °C (G 37+EG+S, G 50+EG+S, respectivamente) seguida pelo tratamento com ácido do processo, colunas cinza-escuro. Como controles, a solução de levedura de cerveja foi incubada sem enzimas e tratada somente com o tratamento com ácido do processo, colunas cinza.
Figura 16 - Efeito de concentrações mais altas de H3PO4 combinadas com o tratamento de savinase na solução de levedura de cerveja. Hidrólise de ácido da solução de levedura de cerveja com diferentes concentrações de H3PO4, 0,3M, 0,5M, 1M a 100°C (0,3M, 0,5M, 1M, respectivamente), colunas cinza- escuro. Incubação da solução de levedura de cerveja com savinase (4 μl) , então hidrólise de ácido com diferentes concentrações de H3PO4-, 0,3M, 0,5M, IM, 2M a 80°C (0,3M+S, 0,5M+S, 1M+S, respectivamente), colunas cinza-escuro. Como controles, a solução de levedura de cerveja foi tratada com o tratamento com ácido do processo, colunas cinza.
Figura 17 - Efeito de HC1 na solução de levedura de cervej a. Hidrólise de ácido da solução de levedura de cerveja com diferentes concentrações de HC1, 0,3M, 0,5M, 1M, 2M a 80°C (0,3M, 0,5M, IM, 2M, respectivamente), colunas cinza-escuro. Como controle, a solução de levedura de cerveja foi tratada com o tratamento com ácido do processo, colunas cinza.
Figura 18 - Efeito do H2SO4 na solução de levedura de cerveja. Hidrólise de ácido da solução de levedura de cerveja com diferentes concentrações de H2SO4, 0,3M, 0,5M, IM, 2M a 80°C (0,3M, 0,5M, IM, 2M, respectivamente), colunas cinza-escuro. Como controle, a solução de levedura de cerveja foi tratada com o tratamento com ácido do processo, colunas cinza.
Figura 19 - Efeito da homogeneização. A solução de levedura de cerveja foi tratada com a hidrólise de ácido do processo ou 1 M de H3PO4, e a solução de levedura de cerveja homogeneizada foi tratada com 1 M de H3PO4, a 80°C (BY, BY IM, HBY IM, respectivamente) .
Figura 20 - Efeito da homogeneização com glucanex, savinase e pectinase. Solução de levedura de cerveja (cinza) e sua versão homogeneizada (cinza escuro), tratada com glucanex, glucanex e savinase, e glucanex e pectinase (BY G, BY G+S, BY G+P, respectivamente), seguido pela hidrólise de ácido do processo.
Figura 21 - Comparação entre as solubilidades de PG 1, PG 2, PG WS e PG WS+E. Figura 22 - Comparação de PG1, PG-WS, Agrimos, Ascogen, Alphamune Alpharm e Bio-Mos pela cromatografia de permeação em gel. As amostras das soluções a 1% foram realizadas na coluna Peptídeos Superdex (A230 foi medido).
Figura 23 - Solubilidade dos produtos de levedura em água, medida das soluções a 1%. PG Av, Progut™ média (n=9) ; PG S, produto solúvel do tipo Progut; Ag, Agrimos; Al, Alphamune™; BM, Bio-Mos®.
Figura 24 Mostra a análise em GPC analítica de cinco amostras do tipo Progut. Esta análise mostra que há pouca variação no perfil de GPC do material solúvel e desse modo o processo de produção está bem padronizado.
Figura 25 Análise em GPC analítica de PG, Progut™; PG S, produto solúvel do tipo Progut; e PG WS, tipo Progut solúvel em água (produto totalmente solúvel (em água), processado depois do Progut S).
Figura 26 Comparação das quantidades de poli- e de oligossacarídeos solúveis, bem como de peptídeos. As quantidades relativas de material foram medidas como áreas dos cromatogramas de permeação em gel em volume de eluição 6- 14 ml, a 214 nm. PGAV refere-se à área média de cinco bateladas diferentes de PG e é definido como 1.
Figura 27 Análise de GPC de PG; PG S: Agrimos; Alphamune™; e Bio-Mos®. Figura 28 Comparação da quantidade de poli e de oligossacarídeos e de peptídeos em materiais do tipo Progut e em três produtos concorrentes. PGAv, média (refere-se à área média de cinco bateladas diferentes de PG e é definido como 1) ; PG S; PG WS;Ag, Agrimos; Al, Alphamune™; BM, Bio-Mos®. Os resultados são mostrados como quantidades relativas medidas dos cromatogramas de permeação em gel, em 230 nm, de 6-14 ml. Figura 29
Correlação da quantidade de material solúvel de tamanho médio com os resultados da análise de adesão bacteriana de cinco bateladas de produtos do tipo Progut. Painel A. Quantidades relativas de material do tamanho de poli- e oligossacarídeos solúveis tal como medido por GPC (dados da análise preparatória de GPC de componentes parcialmente purificados, isto é, quase livres de aminoácido/peptídeo solúveis de 400 mg de soluções de PG a 1%, medido a 230 nm, de 6-14 ml. Aqui a área média de cinco amostras de PG era 27800 mAu, que recebeu o valor 1). Painel B. Resultados da análise de adesão bacteriana de E. coli. Figura 30
Correlação da quantidade de material solúvel com os resultados da análise de adesão bacteriana de um produto do tipo Progut e em amostras concorrentes. Painel A. Quantidades relativas de material do tamanho de poli- e oligossacãrídeos solúveis. (Dados da análise analítica, 1% de amostra, GPC, de componentes parcialmente purificados, isto é, quase livres de aminoácido/peptídeo solúveis de 400 mg de soluções de PG a 1%, medido a 230 nm, de 6-14 ml. Aqui a área média de cinco amostras de PG era 205 mAu, que recebeu o valor 1). Painel B. Resultados da análise de adesão bacteriana de E. coli. Figura 31 Teor de manose de material do tamanho de poli- e oligossacãrídeos solúveis (isto é, os componentes solúveis de PG a 1% ou das soluções relacionadas isoladas por GPC, coluna Peptídeos Superdex 10/30, a 6-16 ml) . PGAv, média (n=5) ; PG WS; Ag, Agrimos; Al, Alphamune™; BM, Bio-Mos®. Figura 32 Comparação do teor de manose com os resultados da análise de adesão bacteriana de cinco bateladas de produto do tipo Progut. Painel A. O teor de manose de material do tamanho de poli- e oligossacãrídeos solúveis (isto é, os componentes solúveis das soluções de PG a 1% isoladas por GPC, coluna Peptídeos Superdex 10/30, a 6-16 ml Painel B. Resultados da análise de adesão bacteriana de E. coli. Figura 33 1H NMR de poli- e oligossacarídeos solúveis de um produto do tipo Progut. Algumas características estruturais dos mano-oligossacarídeos são indicadas do espectro de NMR. Figura 34 Comparação de 1H NMR de PG e concorrentes.
A invenção revelou métodos novos para produzir 10 produtos terapêuticos ou nutracêuticos solúveis (alimentos ou produtos alimentares ou aditivos dos mesmos) de levedura, de preferência materiais do tipo de levedura de cerveja. A invenção revelou vários métodos para a produção dos materiais, incluindo métodos hidrolíticos e/ou degradativos 15 específicos. 1) glicosidase específica, especialmente a endoglicosidase, 2) enzimas clivadoras de proteína, tais como proteases, pronase e savinase 20 3) hidrólise química melhorada, especialmente hidrólise de ácido forte, e 4) homogeneização física da matéria-prima. A invenção é também uma combinação dirigida dos métodos com maior atividade de solubilização. 25 Matéria-prima preferida para produzir o produto solúvel novo.
A presente invenção é dirigida de preferência à utilização de materiais de levedura apropriados, especialmente a levedura do processo de fermentação, com 30 maior preferência a levedura de cerveja como matéria-prima quando a levedura foi derivada do processo de fabricação de cerveja. Deve ser compreendido que tal material de levedura inclui materiais não solúveis derivados de vegetais, especialmente os materiais não solúveis derivados de vegetais que compreendem polissacarídeos de vegetais tais como sacarídeos de hemicelulose (como mostrado pela clivagem por pectinase) e materiais vegetais derivados de β-glucano, tais como beta-glucano de cereal, e de preferência o cereal é o cereal utilizado no processo de fabricação de cerveja, com a maior preferência a cevada. Deve ser compreendido que as reações enzimáticas novas são úteis para a produção de quantidades adicionais de sacarídeos solúveis do tipo de cereal do novo produto.
Deve ser compreendido que os novos sacarídeos produzidos por reações enzimáticas específicas ou alternativamente por métodos químicos têm efeitos benéficos adicionais sobre a saúde.
Deve ser compreendido ainda que as combinações solúveis preferidas podem ser produzidas pela combinação das matérias-primas 1) leveduras não utilizadas na fabricação de cerveja e 2) polissacarídeos derivados de vegetais, de preferência polissacarídeos vegetais tais como polissacarídeos de hemicelulose e/ou glucanos vegetais, especialmente cereais, e com mais preferência polissacarídeos derivados de cevada ou glucanos de cereais, com mais preferência o glucano de cevada. Do processo preferido O processo otimizado preferido inclui pelo menos as seguintes etapas: 1. Provisão da levedura de cerveja como matéria- prima . 2. Hidrólise por enzima e/ou por hidrólise de ácido otimizada. A invenção também se refere a um do processo que compreende as etapas de: 1. Provisão da levedura de cerveja como matéria- prima . 2. Homogeneização física do material. 3. Hidrólise por enzima e/ou por ácido, em uma realização preferida por ácido. A invenção também se refere a um processo que compreende as etapas de: 1. Provisão da levedura de cerveja como matéria- prima . 2. Homogeneização física do material. 3. Hidrólise por enzima e ácido.
Novo oligossacarídeo e composições de polissacarídeo de baixo peso molecular Os novos processos de produção degradativos apresentam um produto com maior solubilidade ou menos material não-solúvel. Além da maior solubilidade, os materiais possuem ações biológicas ampliadas contra infecções que causam diarréia e uma ação que aumenta o crescimento dos animais.
Isolamento do componente solúvel do novo produto A invenção é dirigida especialmente à separação da nova fração solúvel produzida com materiais de levedura de cervej a.
Composições de oligossacarídeo preferidas no produto Os autores da presente invenção analisaram as atividades biológicas dos novos produtos solúveis a partir dos perfis dos cromatogramas de Peptídeos Superdex (soluções a 1% em água). A absorvência indica quantidades relativas dos componentes solúveis de tamanhos diferentes.
A relativa efetividade do produto do tipo Progut nos modelos biológicos e no material relacionado poderia ser apresentada em números ao calcular as áreas de eluição (por exemplo, Tabela 1) . A invenção revelou novas preparações de 5 sacarídeo solúveis referidas como materiais "Solúveis" e "Solúveis em água" úteis para a inibição de atividade bacteriana prejudicial, tal como a diarréia, causada pelas atividades da E. coli. Deve ser compreendido que tais preparações são úteis para o crescimento e o bem-estar de 10 seres humanos e de animais. Tipos de produto preferidos
Deve ser compreendido que os novos sacarídeos solúveis produzidos pelo novo processo de hidrólise podem ser utilizados como uma composição não-fracionada derivada da 15 levedura. A preparação na realização preferida é neutralizada ou parcialmente neutralizada de preferência por um alcalino forte, tal como o hidróxido de sódio. Em uma realização preferida, o produto é seco, por exemplo, por secagem por aspersão, por secagem em tambor ou por outros métodos de 20 secagem conhecidos.
A invenção também é dirigida aos produtos fracionados que incluem os produtos parcialmente fracionados e de sacarídeo purificado. Os métodos de purificação parcial preferidos incluem a remoção da parte principal de 25 componentes não-sacarídeos, tais como 1) dessalinização, na realização preferida, pela precipitação do sal, tal como a precipitação de fosfato por Cálcio ou por outros íons, 2) remoção de moléculas iônicas ou de moléculas hidrofóbicas por adsorventes específicos, tais como matrizes hidrofóbicas ou 30 de troca de íon e/ou 3) remoção do material ou da parte não- solúvel da mesma. Deve ser compreendido que a purificação parcial aumenta o novo teor de sacarídeo da preparação tipicamente em torno de 10-30% ou mesmo 50%. A dessalinização depois da hidrólise com ácido fosfórico forte aumenta a quantidade de sacarídeos na preparação até mesmo em torno de 30-60%, aumentando desse modo as quantidades preferidas de sacarídeos de manose preferidos Mana3Man em aproximadamente 15, com mais preferência 20 g/kg, para aproximadamente 20 g/kg e com mais preferência 30 g/kg.
Os métodos de purificação preferidos incluem o isolamento da fração de sacarídeo ou de parte dela. O teor de sacarídeos na fração purificada é de preferência pelo menos 10%, com mais preferência pelo menos 25%, mesmo com mais preferência pelo menos aproximadamente 50%. As frações de filtragem de gel medidas em NMR são estimadas para incluir purezas de sacarídeo de pelo menos 60%, ainda com mais preferência pelo menos 70%. Deve ser compreendido que purezas similares podem ser obtidas por outros métodos de purificação e de fracionamento padrão. Tamanhos preferidos dos materiais de sacarídeo
A invenção revelou duas faixas de tamanho principal preferidas dos produtos de tamanho grande dos produtos solúveis com eluição de 6 a 12 min da coluna Peptídeos Superdex e do produto de tamanho intermediário com eluição de aproximadamente 12 minutos a aproximadamente 16 minutos.
A invenção é dirigida especialmente às frações de sacarídeo descritas, que contêm sacarídeos novos e úteis e se correlaciona com a atividade biológica aumentada melhorada do produto.
Tamanhos e frações dos polissacarídeos solúveis preferidos O produto compreende um pico em lacuna correspondente aos sacarídeos com tamanho de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 unidades de Hexose (Hex) de tamanho de filtragem de gel e com os possíveis polissacarídeos solúveis maiores. Com mais preferência o lacuna de aproximadamente 7,7 minutos corresponde aos polissacarídeos solúveis de aproximadamente 25 unidades hexose de sacarídeos e maiores. A invenção é dirigida aos novos produtos que compreendem uma alta quantidade de materiais de polissacarídeo solúvel, que era uma característica dos novos produtos. As frações de polissacarídeo preferidas incluem a fração com eluição de 6-9 minutos que corresponde aos sacarídeos de aproximadamente 20 unidades de hexose e maiores da coluna Peptídeos Superdex e de 6-12 min.
Deve ser compreendido que a posição de eluição em 12 min. é aproximadamente uma borda t dos oligossacarídeos (DP10) e dos polissacarídeos que compreendem mais de 10 resíduos de monossacarídeo.
A invenção é dirigida desse modo às frações de polissacarídeo a) de 10 a 30-mers ou tamanho de filtragem de gel de polissacarídeos solúveis de 10 a pelo menos 30 unidades de Hex e maiores b) de 2 0 a 3 0-mers ou tamanho de filtragem de gel de 2 0 a pelo menos 3 0 unidades de Hex produzidos pelos processos de acordo com a invenção. Produto de tamanho intermediário preferido
A invenção também se refere a um produto de tamanho intermediário preferido com eluição de aproximadamente 12 minutos a aproximadamente 16 minutos. Esta faixa corresponde aos oligossacarídeos de aproximadamente di/trissacarídeos a aproximadamente decassacarídeos ou aos sacarídeos com tamanho de filtragem de gel de 3 a pelo menos aproximadamente 10 unidades de Hex. Oligossacarídeo maior e fração de polissacarídeo preferidos
A invenção também se refere à fração de combinação de oligossacarídeos maiores e polissacarídeos que eluem de aproximadamente 6 minutos a 14 minutos. Esta fração preferida contém oligossacãrídeos de aproximadamente 4-6-mers, com mais preferência de aproximadamente 5-6-mer aos polissacarídeos de pelo menos aproximadamente 20-30 mers ou ao tamanho de filtragem de gel de 5 a pelo menos 10 unidades de Hex e polissacarídeos solúveis maiores.
Na filtragem de gel duas unidades de hexose (tal como a glicose, a manose ou a galactose) correspondem tipicamente a um HexNAc (por exemplo, GlcNAc ou GalNAc) no oligossacarídeo ou polissacarídeo e o tamanho de eluição previsto de um sacarídeo pode ser calculado tipicamente a partir da quantidade de unidade de Hex.
Homogeneização da matéria-prima e combinação com a hidrólise Foi revelado que a homogeneização da solução de levedura de cerveja antes do processo de hidrólise de ácido aumenta a solubilidade de um produto do tipo Progut em 15%, com a matéria-prima de levedura de cerveja e mais ácida ainda.
A invenção é especialmente dirigida aos processos que incluem a homogeneização antes da hidrólise, em uma realização preferida da hidrólise de ácido.
Tratamentos enzimáticos aumentam a solubilidade do produto de hidrólise de ácido (PG) A invenção revelou que o produto hidrolisado por ácido pode ser mais solubilizado pelo tratamento enzimático com a protease ou as enzimas clivadoras de polissacarídeo. O tratamento enzimático preferido inclui a Pronase, a Savinase, a Pectinase, a glucanex e a glucanex combinada com a savinase ou enzimas com especificidade para o mesmo tipo de proteína ou polissacarídeo.
Tratamento enzimático antes da hidrólise de ácido A invenção revelou que o produto hidrolisado por ácido é mais solúvel se tratado enzimaticamente com a protease ou enzimas clivadoras de polissacarídeo antes da hidrólise de ácido. O tratamento enzimático preferido inclui 5 a Pronase, a Savinase, a Pectinase, a glucanex e a glucanex combinada com a savinase, e a enzima de englucanase combinada opcionalmente com a savinase ou as enzimas com especificidade para o mesmo tipo de proteína ou de polissacarídeo. Condições otimizadas da hidrólise de ácido A invenção é dirigida às condições otimizadas da hidrólise de ácido para produzir o novo produto solúvel. A invenção revelou que tratamentos ácidos com quantidades crescentes de ácido aumentam a solubilidade da levedura de cerveja.
A invenção é dirigida especialmente aos processos de hidrólise otimizados sendo que a quantidade de matéria- prima de levedura calculada como peso seco está entre 5-35 em peso/volume (w/v)% do volume total da reação, com mais preferência entre 10-30% (w/v), ainda com mais preferência 20 15-25% (w/v) e com mais preferência aproximadamente 20% (w/v) do volume total da reação.
A presente invenção é dirigida às condições de hidrólise otimizadas no que diz respeito ao tempo, à temperatura, à concentração de ácido (/quantidade de ácido 25 por quantidade de amostra) e ao tipo de ácido. O ácido preferido inclui o ácido fosfórico dos ácidos inorgânicos (H3PO4) , o ácido clorídrico e o ácido sulfúrico. O ácido mais preferido é o ácido fosfórico (H3PO4) .
A presente invenção revela novos produtos do tipo 30 progut especialmente produzidos com hidrólise de ácido forte otimizada ou condições de hidrólise enzimática ou combinações surpreendentemente eficazes dos mesmos para obter o novo produto bioativo e solúvel. Foi observado que condições de tratamento com ácido surpreendentemente forte, incluindo concentrações de ácido muito altas que incluem aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1 M de ácido e/ou uma alta temperatura de reação em uma faixa de 75-100 graus Celsius eram necessárias para obter maior solubilização e obter polissacarídeos e oligossacarídeos de baixo peso molecular altamente bioativos. As condições são drásticas e revelam alta resistência dos materiais de levedura à hidrólise; no entanto, há condições mais favoráveis em que o aumento do ácido para 2 M com alta temperatura causa uma solubilização menos eficaz dos materiais de parede de célula e/ou uma maior quantidade de monossacarídeos livres causados pela hidrólise próxima da hidrólise total. Hidrólise otimizada por H3P04
A invenção é de preferência dirigida à utilização do ácido fosfórico (H3PO4) com concentrações acima de 0,5 M, com mais preferência acima de aproximadamente 0,75 M e ainda com mais preferência acima de 1 M, ou com a maior preferência de aproximadamente 1M.
O efeito da solubilização foi reduzido com um ácido fosfórico de 2 M mesmo abaixo do efeito de 0,5 M, e a concentração de ácido extrema surpreendentemente não aumentou a hidrólise, mas causou a precipitação do material. Isto indica que a concentração de ácido ideal é de aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 1 M para uma solubilização eficaz.
Em uma realização preferida, aproximadamente 1 M de H3PO4 é utilizado como concentração ideal, e a faixa preferida é de aproximadamente 0,75 M a aproximadamente 1,25 M, e ainda com mais preferência de aproximadamente 0,8 M a aproximadamente 1,2 M e com a maior preferência aproximadamente 0,9 M a aproximadamente 1,1 M, quando a reação é realizada a uma temperatura de aproximadamente 80 graus Celsius (de preferência entre 70-100 graus Celsius, e ainda com mais preferência entre 70 e 95 graus Celsius, e ainda com mais preferência entre 75 e 85 graus Celsius) . O tempo de reação preferido é de aproximadamente 4 horas, de preferência de 2 a 8 horas, com mais preferência de 3 a 5 horas, o com a maior preferência de 3,5 a 4,5 horas.
A invenção é especialmente dirigida às condições de hidrólise forte ou a combinação das condições de hidrólise de ácido forte e da hidrólise enzimática para obter uma quantidade maior de sacarídeos altamente solúveis e bioativos de acordo com a invenção, em uma realização preferida em que a condição de hidrólise equivalente da presente invenção é utilizada.
Em uma realização preferida, as condições são equivalentes a aproximadamente 1 M de H3PO4 por 4 horas em aproximadamente 75 a 90 graus Celsius por aproximadamente 4 horas. Deve ser compreendido que se a temperatura for aumentada, a quantidade de ácido e/ou o tempo de reação podem ser diminuídos e vice-versa. Em uma outra realização preferida a temperatura é aumentada de aproximadamente 90 a aproximadamente 100 graus Celsius e a quantidade de ácido é de aproximadamente 0,5 Ma aproximadamente 1 M e o tempo de reação é de aproximadamente 4 horas. A Figura 16 mostra uma alta solubilização a 100 graus com 0,5 e 1 M de ácido.
Deve ser compreendido ainda que um produto altamente solúvel e bioativo pode ser obtido utilizando uma enzima de acordo com a invenção ou uma enzima em combinação com a hidrólise de ácido, tal como mostrado na Figura 16 para a enzima de savinase. A utilização da enzima intensifica o processo de solubilização de modo que uma menor concentração de ácido, temperatura de reação ou tempo de reação sejam necessários. A invenção é, em uma realização preferida, dirigida para a utilização de uma enzima de acordo com a invenção em combinação com 0,3-1 M de ácido.
Hidrólise otimizada pelo ácido clorídrico HC1 A invenção é dirigida de preferência à utilização de HCL com concentrações acima de 0,5 M e com mais preferência acima de aproximadamente 0,75 M e ainda com mais preferência acima ou aproximadamente 1M. 2 M de ácido produzem um solubilização mais alta, mas também uma quantidade maior de monossacarídeos à medida que as condições de hidrólise de ácido com ácido mineral muito forte se aproximam das condições de hidrólise total.
Em uma realização preferida o HC1 é utilizado em uma concentração ideal, e a faixa preferida é de aproximadamente 0,75 M a aproximadamente 1,25 M, ainda com mais preferência de aproximadamente 0,8 Ma aproximadamente 1,2 M e com a maior preferência aproximadamente 0,9 M a aproximadamente 1,1 M, quando a reação é realizada a uma temperatura de aproximadamente 80 graus Celsius (de preferência entre 70-90 graus Celsius, ainda com mais preferência entre 75 e 85 graus Celsius). O tempo de reação preferido é de aproximadamente 4 horas, de preferência de 2 a 8 horas, com mais preferência de 3 a 5 horas, e com a maior preferência de 3,5 a 4,5 horas.
A invenção também se refere à utilização do H2SO4 com concentrações aumentadas acima de 0,5 M e de aproximadamente 1 M, tal como descrito acima para outros tratamentos com ácido. Os dados mostram que 2 M de ácido não produzem uma maior solubilização, o que possivelmente indica uma maior precipitação. Além disso (NT - Falta alguma coisa no texto original)
A invenção apresenta ainda várias combinações úteis dos métodos, tal como descrito na seção experimental. As combinações preferidas incluem a homogeneização com hidrólise enzimática ou química.
Em uma realização preferida, a invenção é dirigida às combinações dos métodos tais como homogeneização e hidrólise química melhorada. Este método é preferido por causa da alta eficiência na solubilização do produto e dos baixos custos dos métodos e dos reagentes.
A invenção também se refere à combinação da homogeneização com a hidrólise enzimática pela glicosidase e/ou por enzimas clivadoras de proteína.
A invenção apresenta ainda as combinações preferidas da clivagem enzimática de proteínas e da clivagem de glicosidase na produção de material de alto rendimento. O método é combinado de preferência com a homogeneização.
A invenção apresenta ainda as combinações preferidas dos métodos de clivagem química com a clivagem enzimática das proteínas e/ou a clivagem de glicosidase na produção de material de alto rendimento. O método é combinado de preferência com a homogeneização. Atividades melhoradas dos carboidratos solúveis produzidos
A invenção revelou que os métodos de solubilização preferidos produzidos aumentaram as quantidades de materiais moleculares solúveis com atividades biológicas úteis. A invenção é dirigida especialmente às atividades ampliadas contra micróbios patogênicos, tais como os micróbios causadores da diarréia, especialmente bactérias incluindo a E. coli. Tratamentos enzimáticos preferidos Endoglicosidases preferidas Clivagem de polissacarídeos de glicose
A invenção revelou que as enzima clivadoras de polissacarídeo de glicose são úteis na produção do novo produto solúvel.
Em uma realização preferida, as enzimas endo-β- glicosidade que clivaram os polissacarídeos de glicose β- ligados, tais como endo-glicosidade e glucanex, compreendem atividades de celulase que têm atividades úteis em reduzir o material insolúvel no novo do processo de produção. A invenção é especialmente dirigida à clivagem dos polissacarídeos do tipo de celulose e beta-glucanos. Os β- glucanos preferidos a ser clivados são os de estrutura Glcβ4Glc que compreendem os β-glucanos tais como a celulose, os b-glucanos de cereais, incluindo as ligações β4 e β3 entre os resíduos de glicose. As endo-β-glicosidades preferidas são as endo-glicosidades e as celulases.
A invenção é especialmente dirigida à clivagem de β-glucanos residuais não-solúveis, tal como o glucano de parede de célula de levedura, o glucano de cereal e/ou o material de celulose no material de levedura de cerveja, em uma realização preferida, a fim de produzir uma maior solubilidade e/ou a fim de produzir oligossacãrídeos de glucano bioativos solúveis.
A invenção é especialmente dirigida à produção da celulose e/ou dos oligossacãrídeos de β-glucano de cereal que compreendem estruturas de acordo com a fórmula estruturas [Glcβ4]n Glc, sendo que n é um inteiro entre 2-20, com mais preferência 2-10,
A invenção é dirigida com mais preferência à produção de um oligossacarídeo de glucano do tipo de cereal para o produto. De preferência, o produto compreende ligações β4 e β3 entre os resíduos de glicose de acordo com a fórmula [Glcβ4 ] nl [Glcβ3]n2 [Glcβ4]n3Glcβ3 [Glcβ4 ] n4Glc- estruturas em que nl, n3 e n4 são inteiros de 0 a aproximadamente 5, de preferência de 1 a 4, e ainda com mais preferência de 1 a 3, independentemente e n2 é 0 ou 1 A invenção é especialmente dirigida à produção catalisada de endo-β-glicosidade de oligossacarídeos de glucano.
A invenção revelou a presença de materiais de glicose a-ligados nas frações preferidas de acordo com a invenção. A invenção também se refere à utilização das endo- α-glicosidades na produção de novos produtos solúveis. As enzimas clivadoras de polissacarídeo a-glicose são especialmente preferidas no ajuste e otimização da composição de novos produtos e são preferidas como enzimas adicionais com atividade endo-a-glicosidade, especialmente atividade endo-a4-glicosidade, de preferência enzimas clivadoras de amido ou amilose. Clivagem de pectina e de materiais de hemicelulose relacionados
A invenção também se refere ao tratamento do material de levedura de cerveja por uma preparação de enzima de pectinase. Deve ser compreendido que as pectinases revelaram compreender múltiplas atividades. A invenção é dirigida à divagem da pectina e/ou outros materiais do tipo de hemicelulose, tais como a pectina que compreende materiais de hemicelulose, por preparados que compreendem a enzima de pectinase.
Em uma realização preferida, a invenção é dirigida à produção de pectina e ou de oligossacarídeos derivados de hemicelulose ou de polissacarídeos de baixo peso molecular solúveis para o produto.
Tratamentos de protease preferidos A invenção é dirigida à utilização da protease para clivar materiais de proteína da matéria-prima ou do material hidrolisado com ácido. As proteases preferidas são a savinase ou a pronase. NOVOS MATERIAIS QUE COMPREENDEM OS GLICANOS COM SOLUBILIDADE MELHORADA PRODUTO DO TIPO PROGUT SOLÚVEL E PRODUTO DO TIPO PROGUT SOLÚVEL EM ÁGUA
A presente invenção revelou que é possível produzir uma preparação de levedura hidrolisada com ácido com maior solubilidade em água por meio dos métodos otimizados de acordo com a invenção. Deve ser compreendido que o material altamente solúvel é útil para uma formulação mais eficaz de rações e alimentos. A fração solúvel é especialmente preferida para rações líquidas e alimentos líquidos ou aditivos alimentares, especialmente drinks e bebidas. Deve ser compreendido que o material com muito menos de 50% de material solúvel não é útil para os alimentos ou bebidas líquidos devido às razões práticas, tais como engarrafamento e transferência dos materiais líquidos na produção, e um material prático deve, de preferência, ter bem mais do que 50% de material solúvel. Deve ser compreendido que algumas aplicações toleram parcialmente os materiais insolúveis, e uma parte menor de material insolúvel é utilizada, em uma realização preferida, em composições alimentares como fibras para favorecer a nutrição e a saúde. As solubilidades totais de um produto do tipo Progut e a versão solúvel do mesmo em comparação com alguns produtos de referência utilizados na alimentação animal estão representadas na Figura 23.
Os novos produtos solúveis compreendem ainda uma quantidade maior de materiais de sacarídeo solúveis (oligossacãrídeos e polissacarídeos) com atividade biológica melhorada. As quantidades de materiais poli- e oligossacãrídeos solúveis (que eluem entre 6-14 min. da coluna Peptídeos Superdex, como mostrado na Figura 25) são representadas nas Figuras 26 e 28. A quantidade de oligossacãrídeos em um produto do tipo Progut solúvel e em um produto do tipo Progut solúvel em água era de aproximadamente 2 vezes maior ou mesmo 3 vezes maior, respectivamente, do que produto do tipo Progut menos otimizado.
A invenção é especialmente dirigida a um novo produto do tipo Progut solúvel, sendo que a solubilidade total enquanto solução em água a 1% é superior a 55%, com mais preferência superior a 60%, ainda com mais preferência superior a 65%, ainda com mais preferência superior a 63%, ainda com mais preferência superior a 66%, ainda com mais preferência superior a 67%, e com a maior preferência superior a 68%. Em uma realização preferida, a solubilidade em água é de aproximadamente 70%, de preferência na faixa de 55% a 85%, com mais preferência na faixa de 60% a 80%, com mais preferência na faixa de 63% a 77%, com mais preferência na faixa de 65% a 75%, ainda com mais preferência na faixa de 66% a 74%, ainda com mais preferência na faixa de 67% a 73%.
A invenção também se refere praticamente aos produtos que compreendem sacarídeos completamente solúveis em água, sendo que o produto solúvel em água tem praticamente uma solubilidade em água completa como uma solução em água a 1% (peso/volume) a temperatura ambiente (de preferência entre 20-25 graus Celsius). A fração solúvel em água preferida é isolada do produto do tipo Progut, de preferência do produto do tipo Progut solúvel em água.
A solubilidade em água completa preferida é pelo menos 90% ou superior a 90%, com mais preferência superior a 93%, ainda com mais preferência superior a 95%, ainda com mais preferência superior a 96%, com mais preferência superior a 97%, e com a maior preferência superior a 98%.
A invenção também se refere ao produto do tipo Progut semi-solúvel em água, sendo que os materiais não- solúveis são parcialmente removidos. Deve ser compreendido que uma baixa remoção parcial fornece material similar ao do produto solúvel, e uma grande remoção é similar ao produto solúvel em água. Em uma realização preferida os componentes não-solúveis podem ser removidos em uma extensão que varia de aproximadamente 10% a aproximadamente 80%, com mais preferência de aproximadamente 20% a aproximadamente 75%, com mais preferência de aproximadamente 25% a aproximadamente 66%, ainda com mais preferência de aproximadamente 33% a aproximadamente 66% para obter o produto semi-solúvel em água. A solubilidade total do produto semi-solúvel em água está preferivelmente na faixa de aproximadamente 73% a aproximadamente 94%, com mais preferência de aproximadamente 76% a aproximadamente 92,5%, ainda com mais preferência de aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, e ainda com mais preferência de aproximadamente 81% a aproximadamente 89%. Em uma realização preferida, a solubilidade está próxima de aproximadamente 80%, de preferência na faixa de aproximadamente 75 e aproximadamente 85%, ou próxima de aproximadamente 90%, na faixa de aproximadamente 85% a aproximadamente 95%. A solubilidade total da fração semi- solúvel em água é ajustada de preferência para cobrir as solubilidades entre as frações/materiais solúveis e solúveis em água.
A palavra "aproximadamente" indica de preferência nas realizações preferidas dentro de 2% de unidades de valor, e com mais preferência dentro de 1%, ou com mais preferência dentro de 0,5% unidade de valor exato, ou na realização separada exatamente o valor.
Componentes de carboidrato ativos biologicamente A invenção revela também que o material novo com solubilidade aprimorada melhorou a atividade biológica contra a bactéria que causa a diarréia. Isto é mostrado na Figura 29 e em comparação com os materiais relacionados na Figura 30, painel B. A atividade biológica se correlaciona com a presença de materiais absorventes de UV. Os materiais foram deproteinizados e as impurezas hidrofóbicas foram removidas e não continham grandes impurezas na faixa de oligossacarídeo observável por NMR. Portanto, a absorvência parece corresponder aos materiais de carboidrato, sacarídeos, incluindo oligo- e polissacarídeos solúveis em água, parcialmente devido à absorvência do aldeído da extremidade de redução e às derivatizações da extremidade de redução formadas no processo e à menor quantidade de resíduos de GlcNAc ligados aos sacarídeos. Uma quantidade menor de materiais de peptídeo é provavelmente incluída, tal como indicado nas legendas das figuras, mas com base no NMR a importância quantitativa dos mesmos é limitada.
Sacarídeos de manose
A análise mostrada na Figura 31 revela que os novos produtos do tipo Progut solúveis altamente ativos incluem quantidades maiores de oligossacarídeos de manose. A Figura 32 mostra que as atividades biológicas das frações se correlacionam parcialmente com o teor de manose. Os autores da presente invenção foram capazes de definir, por meio de análise em NMR, os novos oligossacarídeos e polissacarídeos de manose altamente ativos nos produtos do tipo Progut. O aumento deste tipo de oligossacãrídeos é especialmente útil para novas moléculas nutracêuticas. O teor de manose foi aumentado em aproximadamente 50% nos novos produtos solúveis.
Estruturas Man&3 terminais preferidas A invenção revelou também que, além do teor de manose, a atividade mais alta dos produtos do tipo Progut (por exemplo, tal como mostrado na Figura 30) é explicada por estruturas específicas dos oligossacãrídeos de manose. A invenção é especialmente dirigida às seqüências de oligossacarídeo que compreendem uma maior quantidade de estruturas Mana3 terminais tal como mostrado nas Figuras 33- 34. A invenção revelou também quantidades distintas de epítopos Mana2 3-substituídos de terminais de extremidades de não-redução e de epítopos Mana2 de cadeia média em estruturas Mana2 lineares, que são partes-chave dos sacarídeos de manose derivados de levedura.
A invenção é dirigida de preferência às estruturas Mana3 terminais aumentadas, com mais preferência Manα3Manα2 terminais de extremidades de não-redução que compreendem os oligossacãrídeos produzidos pelo processo de acordo com a presente invenção e em uma realização preferida produzidos da levedura de cerveja. Em uma realização preferida, a quantidade de estruturas Manoc3 terminais resulta no sinal NMR, que é maior do que o sinal NMR de epítopos Mana2 3- substituídos de terminal de extremidade de não-redução ou maior do que o sinal NMR dos epítopos Mana2 de cadeia média nas estruturas Mana2 lineares, tal como indicado nas Figuras 33-34. Em uma realização preferida o sinal Mano<3 é mais alto do que qualquer um dos sinais dos epítopos Mana2 marcados na Figura 33 no espectroscópio NMR de prótons, tal como indicado nas Figuras 33 e 34. A invenção é especialmente dirigida aos glicanos Mana3, sendo que o sinal de NMR de próton na posição
Manot3 é pelo menos 5% mais alto, com mais preferência pelo menos 7% mais alto, ainda com mais preferência 9, e com a maior preferência pelo menos 10% mais alto que o sinal Manot2 comparativo indicado na Figura 33.
Deve ser compreendido que as estruturas Manα3Manα2 de extremidade de não-redução terminais são componentes ativos novos a ser dirigidos para a inibição dos patógenos, especialmente as bactérias diarreiagênicas tais como a E. coli. A estrutura Mana2 de extremidade de redução dá a conformação do novo glicano. A atividade deste glicano não pode ser conhecida com base em outros glicanos, tais como as estruturas Manα3Manβ4GlcNAc ou de epítopos de dissacarídeo redutores.
A presente invenção também se refere às frações de sacarídeo enriquecidas Mana3 terminais que compreendem pelo menos aproximadamente 10 gramas, ainda com mais preferência pelo menos 15 gramas/kg, ainda com mais preferência pelo menos 16 gramas, ainda com mais preferência pelo menos 17 gramas, ainda com mais preferência pelo menos 18 gramas, ainda com mais preferência pelo menos 19 gramas, ainda com mais preferência pelo menos 20 gramas, ainda com mais preferência pelo menos 21 gramas, ainda com mais preferência pelo menos 22 gramas, e com a maior preferência pelo menos 23 ou 24 gramas por quilograma dos oligossacarídeos de manose preferidos. O oligossacarídeo de manose preferido inclui os oligossacarídeos que compreendem a manose, de preferência principalmente a manose, mas que podem compreender também outros resíduos de monossacarídeo, de preferência Glc, ou GlcNAc ou GlcN, de preferência como componentes menores.
Os autores da presente invenção observaram sinais de oligossacarídeos de β-glicose na região de aproximadamente 4,51-4,53 ppm no espectro NMR de prótons. Estes são associados aos sinais dos novos oligossacãrídeos e de polissacarídeos de glicose de baixo do peso molecular incomuns. A invenção é especialmente dirigida aos oligossacãrídeos enriquecidos com o sacarídeo de glicose βδ- ligados que têm sinais característicos na região (gentiobiose HI de Glcβδ está em aproximadamente 4,51 ppm, os sinais de resíduos de Glcβδ de cadeia média estão em aproximadamente 4.519; 4.529; e 4.523 ppm; Lo V.M. et al. Carbohydr Res. (1993) 245, 333-345).
A invenção também se refere aos materiais de sacarídeo de acordo com a invenção, quando o material compreende também uma quantidade menor de GlcN/GlcNAc, de preferência os materiais são materiais Glcβ derivados de levedura e compreendem com mais preferência os resíduos Glc Glcβδ.
A invenção está em uma realização separada adicional dirigida aos oligossacãrídeos de glicose β4- ligados, quando a matéria-prima de levedura é cultivada em (cereal) β3/4glucano ou em materiais que contêm celulose, e os sinais de sacarídeo preferidos β (3/4)glicose estão na região preferida (por exemplo, os oligossacãrídeos β3/4glucano têm sinais Glc Hl de β4-vinculados em aproximadamente 4,53 ppm).
A quantidade de materiais de glicose é comparável com os materiais de manose na amostra baseada na análise de monossacarídeos, e parte dos materiais de Glc inclui materiais Glca, mas ambos os sinais alfa e beta correspondem a uma quantidade substancial de sacarídeos. Oligossacãrídeos enriquecidos preferidos de acordo com a invenção
A invenção é dirigida aos sacarídeos preferidos de acordo com a invenção, sendo que os sinais são especialmente dos oligossacarídeos devido à intensidade dos sinais NMR dos produtos do tipo Progut. Os oligossacarídeos de acordo com a invenção têm um grau de oligomerização entre 2-10. Deve ser compreendido que a maior parte dos fundamentos é dirigida aos materiais de polissacarídeo tais como os glucanos, e aos polissacarídeos grandes que são insolúveis.
A invenção é dirigida aos novos produtos do tipo Progut com oligossacarídeo maior específico e teor de polissacarídeo.
A amostra de 0,4 grama de produto do tipo Progut seco ou produto relativo foi diluída em água como solução a 1% (peso/volume). A amostra foi centrifugada e a fração solúvel em água foi seca e separada para uma análise posterior. A fração de oligossacarídeo e de polissacarídeo foi então purificada pela remoção de proteínas e peptídeos e das impurezas lipofílicas pela incubação com 1,4 ml de resina de Dowex H+- e coluna de eluição de ligação (análise, seção experimental) . A amostra purificada foi seca em um centrifugador a vácuo e dissolvida em 1.000 microlitros de água. Uma amostra de 15 microlitros dos 1.000 microlitros foi passada pela coluna Peptídeos Superdex e a área de absorção de 6 a 14 min. foi coletada em 214 nm. O produto do tipo Progut padronizado produziu 680 mAU (unidades de absorção) na faixa de sacarídeos maiores que eluem entre 6-14 minutos da coluna (contendo oligossacarídeos e polissacarídeos maiores).
A invenção é especificamente dirigida aos novos produtos do tipo Progut, especialmente os produtos solúveis e solúveis em água, que produzem mais do que 680 mAU (unidades Abs, unidades de absorção) como uma absorção integral entre 6-14 min por 6 mg da amostra seca original, quando passou pela coluna Peptídeos Superdex (Amersham Pharmacia, Analysis Examples) com vazão de 1,0 ml/min, quando a fração de sacarídeo essencialmente purificada da contaminação de peptídeos e proteínas da fração de sacarídeo. A invenção também se refere às frações de oligossacarídeo equivalentes com faixa de tamanho de material correspondente na filtragem de gel e no material produzido pelo processo de acordo com a invenção. Os valores preferidos para a absorção integral são 1,3 vez, com mais preferência 1,5 vez, ainda com mais preferência 1,7 vez, ainda com mais preferência 1,8 vez, ainda com mais preferência 2,0 vezes, ainda com mais preferência 2,3 vezes, ainda com mais preferência 2,5 vezes, ainda com mais preferência 2,7 vezes, ainda com mais preferência 2,8 vezes, e com a maior preferência 2,9 vezes, 3,0 vezes ou 3,2 vezes os 680mAU.
A invenção é dirigida aos novos produtos do tipo Progut com teor total específico de oligossacarídeo e de polissacarídeo. Isto foi feito analisando-se o teor total de manose na fração de oligossacarídeo e/ou de polissacarídeo que elui entre 6 a 16 min da coluna Peptídeos Superdex. PURIFICAÇÃO OU ISOLAMENTO DOS MATERIAIS DE SACARÍDEO SOLÚVEIS A presente invenção é especialmente dirigida às frações purificadas ou enriquecidas que compreendem um ou vários dos tipos de sacarídeo preferidos de acordo com a invenção. Deve ser compreendido que as frações enriquecidas ou purificadas têm especialmente alta atividade específica como alimentos ou rações funcionais nutracêuticos ou aditivos alimentares (alimentos ou rações) ou nutracêuticos. Os métodos de purificação preferidos incluem os seguintes e as combinações dos mesmos a) métodos cromatográficos tais como i. cromatografias para absorção de carregadas e ou lipofólicas (impurezas hidrofóbicas) ii. cromatografia de exclusão por tamanho, especialmente filtragem de gel, para remover as impurezas de baixo peso molecular iii. cromatografias de afinidade com matrizes que se ligam aos sacarídeos ou a parte dos mesmos, de preferência cromatografia de carbono ativado e/ou b) Métodos de solução de separação de fase tais como a extração com solventes e/ou precipitação das impurezas ou sacarídeos. Em uma realização preferida, um solvente orgânico é utilizado para precipitação, de preferência um álcool ou uma acetona tal como o metanol ou o etanol, com mais preferência o etanol; ou a acetona é utilizada para precipitação dos sacarídeos do tamanho preferido. e/ou c) Centrifugação e separação da solução e do precipitante e/ou d) Métodos químicos ou enzimáticos para degradar componentes indesejados, de preferência hidrólise alcalina suave para degradar impurezas instáveis alcalinas e/ou hidrólise enzimática de Glca compreendendo sacarídeos do tipo de glicogênio/amido. A invenção também é especialmente dirigida às cromatografias de troca de íons e/ou hidrofóbicas para a remoção das impurezas e/ou cromatografias de exclusão por tamanho para a purificação da nova fração de sacarídeo. Deve ser compreendido que a troca de íon em um material de resina de troca de cátion da realização preferida também absorve compostos lipofílicos ou ambas as matrizes podem ser incluídas na mesma coluna.
As Figuras 9-21 mostram as solubilidades de fração de produto depois dos tratamentos com ácido e/ou enzima. O material insolúvel restante em soluções de água a 0,2% foi medido. As quantidades mostradas correspondem a 100 mg do produto seco original em 50 ml. As quantidades em mg indicadas correspondem desse modo à % de materiais insolúveis. Na Figura 23 a quantidade de material solúvel é indicada como %.
Abreviaturas BY Levedura de cerveja HBY Levedura de cerveja homogeneizada G Glucanex PG produto do tipo Progut PGS produto do tipo Progut solúvel PG WS produto do tipo Progut solúvel em água PG WS+E produto do tipo Progut solúvel em água com emulsificante PE Pectinase PR Pronase S Savinase EXEMPLO 1 Materiais e Métodos Materiais Amostras de ProgutTM (PG) obtidas junto a Suomen Rehu Catorze amostras de produto do tipo Progut™ de bateladas de produção diferentes: PG1-PG14. Três amostras de produto do tipo Progut de processos de produção diferentes: PG 15h, hidrolisado por 15 h; PG WS, PG solúvel em água; PG WS E+, PG solúvel em água com emulsificante. PG 1 demonstrou funcionar bem, ao passo que PG2 não foi tão eficaz como indicado nos ensaios de aderência bacteriana. PG4 ofereceu bons resultados no campo quando testado com cabras.
Amostras comerciais de outros produtores Agrimos (Cl) , e Ascogen (C2), Alphamune alpharma (C3) , e Bio-Mos (C4). Amostras de levedura de cerveja integral Levedura de cerveja, BY, e levedura de cerveja homogeneizada, HBY. Procedimento de análise Preparação da amostra
Tanto soluções em água a 0,2% como soluções em água a 1% foram preparadas do produto do tipo Progut e das amostras relacionadas. Eles foram incubados em temperatura ambiente por 2-5 horas sob misturação suave. As misturas foram então centrifugadas (4.000 RPM por 20 minutos), o sobrenadante foi liofilizado e o peso seco foi medido. Análise dos componentes solúveis
Os componentes solúveis das amostras foram purificados por duas etapas de purificação antes da cromatografia de permeação em gel: Primeiro, o material seco foi diluído em uma solução de pasta de grânulos H+- (resina AG 50W-X8, Bio-Rad, 1,4 ml para 0,4 g de amostra) e foi incubada com misturação suave à RT (temperatura ambiente) por duas horas. Segundo, o sobrenadante da solução de grânulos H+- foi eluído através da coluna BondElut C-18 (500 mg/6 ml, Varian). Após a concentração as amostras foram submetidas a uma cromatograf ia de permeação em gel em uma coluna de peptídeos Superdex 10/300 GL (Amersham Biosciences), com 50 mM de amônio-bicarbonato, na vazão de 1 ml/min, medindo a capacidade de absorção em 214 ou 230 nm, no Akta Purifier 10 (bomba P-903, UV-900, Amersham Biosciences). Coluna de
peptídeos Superdex: Volume de lacuna, 6,7 ml; volume total de eluição, 18,0 ml; e eluição dos poli/óligo/monossacarídeos:
Em volume de lacuna de 30 unidades de Hex; em 7,7 ml 25 unidades de Hex; em 14,4 ml cinco unidades de Hex; em 16,7 ml duas unidades de Hex, e a 17,3 ml uma unidade de Hex.
Espectroscópio de ressonância, magnética nuclear (NMR) Para a análise em NMR, as amostras foram coletadas da cromatografia de Peptídeos Superdex tal como segue: Componentes de tamanho grande (eluição de 6 a 12 ml) e componentes de tamanho intermediário (eluição de 12 a 16 ml). Antes de uma experiência ∑H NMR dimensional as amostras foram primeiro liofilizados e então dissolvidos em D20 (99,9%). Os espectros de NMR foram registrados por um espectrômetro Varian Unity 500 (Varian Inc.) em 23 °C.
Hidrólise de ácido da levedura de cerveja A hidrólise de ácido da solução de levedura de cerveja integral com H3PO4 é similar à hidrólise utilizada no do processo de fabricação do produto do tipo Progut: o pH é ajustado a 2,4 por H3PO4 (concentrado, 87%) e incubado a 80°C por quatro horas. Esta hidrólise de ácido é referida daqui em diante no texto como 'hidrólise de ácido do processo'.
Comparação das quantidades dos componentes solúveis Soluções a 1% de nove amostras de produto do tipo Progut e quatro amostras relacionadas foram preparadas e os pesos secos dos componentes solúveis em água foram medidos (Figura 1) . Dos resultados mostrados na Figura 1 pode ser concluído que cerca de 50% do material do produto do tipo Progut é solúvel em água, embora a solubilidade varie, dependendo da batelada. O Alphamune alpharma (C3), o Bio-Mos (C4) , e o Agrimos (Cl) têm menos componentes solúveis do que o produto do tipo Progut. Por outro lado, o Ascogen (C2) parece ter uma boa solubilidade. No entanto, deve ser observado que nessas amostras liofilizadas podem ser deixadas quantidades variáveis de água. Portanto, o erro nos pesos secos pode ser mais alto do que na média. Comparação dos materiais solúveis por cromatografia de permeação em gel Cromatogramas de soluções a 0,2% Comparação de PG 1 e 2 Soluções a 0,2% de PG1 e de PG2 foram preparadas tal como descrito em Materiais e Métodos, e os cromatogramas do material solúvel são mostrados na Figura 2. Ao comparar os materiais solúveis de PG1 e 2 pode ser ao passo que PG1 tem relativamente mais material de tamanho intermediário (eluição entre 12-16 ml) do que PG2 e, pelo contrário, PG2 tem mais material de tamanho grande (eluição entre 6-12 ml) do que PG1. A quantidade total de material solúvel parece ser mais elevada em PG1 do que em PG2, como indicado pela capacidade de absorção mais alta em PG1. O mesmo fenômeno pode ser apontado também na Figura 1. Essas diferenças na solubilidade e no comportamento cromatográf ico sugerem a efetividade de PG1 e de PG2: PG1 e PG2 foram testados por testes de aderência bacteriana e PG1 demonstrou ser eficaz, ao passo que PG2 era ineficaz. Cromatogramas de soluções a 1% Comparação de PG1 e 2 A análise em NMR dos componentes solúveis requer uma quantidade substancial de material. Portanto, as soluções a 1% foram produzidas para cromatogramas de permeação em gel semipreparatórios. Como uma comparação com os cromatogramas das soluções a 0,2% na Figura 3 são mostrados os cromatogramas de materiais solúveis das soluções a 1% de PG1 e 2. Embora o detector esteja um tanto sobrecarregado, talvez possa ser visto ainda mais claramente que em PG2 não há muitos componentes solúveis de tamanho intermediários como em PG1. Comparação de nove produtos do tipo Progut e quatro amostras relacionadas Nove produtos do tipo Progut (PG1-9) e quatro amostras relacionadas (Cl-4) foram preparados simultaneamente e analisados igualmente. Portanto, os seus cromatogramas de permeação em gel são comparáveis. Aqui, as amostras foram detectadas em A23o, e para comparação apropriada PG1 e 2 foram reanalisados. A faixa do eixo de absorvência é ajustada para ser equivalente em todos os cromatogramas a fim de facilitar a comparação das amostras. Os cromatogramas de PG1, 3, 4 e 6 parecem bastante similares (Figuras 4, A, C, D, F) tanto na forma quanto na quantidade de material. Tanto PG1 (no ensaio de aderência bacteriana) quanto PG4 (na experiência de campo com cabras) demonstraram ser eficazes. Por outro lado, PG2, 5, 7 e 8 têm menos material do que as outras amostras de PG (Figuras 4, B, E, G, H) . Desses, PG2 é conhecido como sendo ineficaz no ensaio de aderência bacteriana. Os dados indicam que em uma realização preferida o produto do tipo Progut eficaz pode ser previsto pela forma do cromatograma e especialmente pela quantidade de material solúvel de tamanho intermediário. As quantidades relativas do material de tamanho intermediário (que elui em 12-16 ml) podem ser calculadas como a área do cromatograma (unidades mAbs multiplicadas pelo ml) e a comparação desses valores (Tabela 1) confirma as estimativas das diferenças entre o as amostras de produto do tipo Progut. O material de tamanho grande (que elui em 6-12 ml) e de tamanho intermediário (que elui em 12-16 ml) foi coletado para análise em NMR. Em amostras relacionadas as quantidades de material de tamanho intermediário e até mesmo grande são muito menores do que nas amostras de produto do tipo Progut (Figura 4, J, K, L, M). A quantidade total de material solúvel no Alphamune alpharma (C3) e no Bio-Mos (C4) (Figura 4, L, M, respectivamente) parece menor quando comparada com as amostras de produto do tipo Progut, o que também pode ser visto na Figura 1. No Agrimos (Cl) e especialmente no Ascogen (C2) a quantidade total de material solúvel é comparável ao produto do tipo Progut, mas a maioria dela é material está de tamanho de baixo peso molecular (Figura 4, J, K) . O material de tamanho de baixo peso molecular não é bom para inibir a aderência bacteriana, embora possa ter algumas outras propriedades benéficas. Tabela 1. Quantidades relativas de componentes dos cromatogramas na Figura 4. A área foi calculada como unidades mAbs multiplicadas por ml (aqui, as áreas são combinadas de
Comparação de cinco amostras de produto do tipo Progut As amostras de produto do tipo Progut PG10-14 foram preparadas do mesmo modo para a cromatografia de permeação em gel tal como as amostras da Figura 4. Portanto, os cromatogramas das figuras 4 e 5 são comparáveis. Embora nenhuma informação da bioatividade de PG10-14 esteja disponível, esses cromatogramas sugerem que essas bateladas de produto do tipo Progut (PG10-14) devem funcionar bem, porque em todas as amostras há quantidades substanciais de material solúvel que consiste na maior parte de compostos de peso molecular intermediário a alto. O material de tamanho grande (que elui em 6-12 ml) e de tamanho intermediário (que elui em 12-16 ml) foi coletado para a análise em NMR. Levedura, de cerveja em ácido hidrolisado e sua versão homogeneizada
A solução de levedura de cerveja foi homogeneizada por um homogeneizador de pressão industrial e as amostras tanto da solução de levedura de cerveja quanto de sua versão homogeneizada foram hidrolisadas pelo processo de hidrólise de ácido do produto do tipo Progut tal como descrito em Materiais e Métodos. A fim de isolar as amostras para NMR por cromatografia de permeação em gel semipreparatório o detector foi sobrecarregado, e os cromatogramas comparáveis às Figs 4 e 5 não estão disponíveis. No entanto, os cromatogramas de permeação em gel analíticos foram rodados (Figura 6) , e os perfis dos cromatogramas imitam aquele de PG1 (Figura 2A). A comparação das áreas nos cromatogramas das Figura 6A e B indica que a homogeneização aumenta a solubilidade em 15%. Amostras preparadas para testes de aderência bacteriana
Uma alta solubilidade mais alta do produto do tipo Progut é necessária para a sua dosagem no alimento líquido, com mais preferência na água potável. Dez candidatos a amostra foram escolhidos entre os novos produto do tipo Progut solúveis em água. Essas amostras foram preparadas em quantidades suficientes para testes de aderência bacteriana, e seus cromatogramas de permeação em gel são apresentados na Figura 7. (Os processos experimentais são apresentados em Materiais e Métodos do Exemplo 2.) As amostras eram: 1. Levedura de cerveja tratada com glucanex e a hidrólise de ácido do processo, BY G (Figura 7 A) 2. Levedura de cerveja homogeneizada tratada com glucanex e a hidrólise de ácido do processo, HBY G (Figura 7 B) . 3. Levedura de cerveja tratada com glucanex e savinase, seguido pela hidrólise de ácido do processo, BY G+S (Figura 7 C) 4. Levedura de cerveja homogeneizada tratada com glucanex e savinase, seguido pela hidrólise de ácido do processo, HBY G+S (Figura 7 D) 5. Levedura de cerveja tratada com 1 M de H3PO4, BY 1M (Figura 7 E) 6. Levedura de cerveja homogeneizada tratada com 1 M de H3PO4, HBY 1M (Figura 7 F) 7. Levedura de cerveja tratada com glucanex e pectinase, seguido pela hidrólise de ácido do processo, BY G+PE (Figura 7 G) 8. Levedura de cerveja homogeneizada tratada com glucanex e pectinase, seguido pela hidrólise de ácido do processo, HBY G+PE (Figura 7 H) 9. PG1 tratado com pectinase, PG1 PE (Figura 7 I) 10. PG1 tratado com pronase, PG1 PR(Figura 7 J) Cinco dos candidatos ao novo produto do tipo Progut solúvel em água (amostras 1, 2, 5, 6 e 9) foram finalmente escolhidos para os testes de aderência bacteriana. O tratamento da levedura de cerveja com glucanex e com 1 M de H3PO4 resultou no material com a melhor atividade no ensaio de aderência bacteriana realizado do mesmo modo que o do processo de teste do produto do tipo Progut antigo.
De maneira interessante, os cromatogramas da levedura de cerveja e de sua versão homogeneizada após o tratamento enzimático são muito similares. Por outro lado, material mais solúvel, de tamanho intermediário, é encontrado na levedura de cerveja homogeneizada tratada com 1 M de H3PO4 do que na amostra não homogeneizada (Figura 7, F versus E). Produto do tipo Progut solúvel em água
A fim de testar a eficácia da levedura de cerveja tratada com 1M de H3PO4 no campo, isto foi produzido em escala industrial e o produto foi nomeado como produto do tipo Progut solúvel em água (PG WS) . Uma outra versão do PG WS também foi produzida ao inserir um emulsificante, e ela foi nomeada PG WS+E. Suas solubilidades foram analisadas pela cromatografia de permeação em gel e, para facilitar a comparação, PG1 foi analisado no mesmo conjunto de experiências (Figura 8) . Ao comparar os cromatogramas de PG (Fig 8 A) e de PG WS (Figura 8 B) , e as quantidades relativas de material foram calculadas a partir deles (Tabela 2), pode ser concluído que há mais de 30% de material mais solúvel em PG WS. Especificamente, a quantidade relativa de material de tamanho muito grande (que elui em 6-9 ml) aumentou substancialmente, 60%. No entanto, a quantidade relativa de material de tamanho intermediário (12-16 ml) é aproximadamente igual. Desse modo, a concentração mais alta de H3PO4 na produção de PG WS parece diminuir a parte insolúvel apenas o bastante para torná-lo solúvel em água. Embora o produto não seja completamente solúvel, a mudança é grande o bastante para permitir que PG WS seja aplicado como alimento líquido na água potável.
Uma outra amostra foi preparada por uma longa (15 horas) hidrólise (PG 15h) em um do processo de produção normal diferente. O cromatograma de permeação em gel de PG 15h (Figura 8 D) sugere que o produto é similar a PG1. A análise em NMR revelará se há mudanças nas estruturas dos componentes. Tabela 2. Quantidades relativas de material dos cromatogramas nas Figura 8A e B. A quantidade de material é especificada como a área dos cromatogramas como unidades mAbs calculadas multiplicadas por ml.
L análise em NMR dos componentes de tamanho intermediário nas amostras de produto do tipo Progut Os sinais mais notáveis na análise em NMR da fração de tamanho intermediário podem ser atribuídos a H-l das cadeias de carboidrato a-glicosídico. Considerando a origem biológica do material analisado, as cadeias de a-glucano e as cadeias a-manosídicas são a fonte prevista dos sinais. Os espectros também mostram sinais que se originam de H-l das unidades β-glicosidicas. Ê esperado que esses sinais se originem dos vários resíduos de β-glicose. É esperado que os oligômeros de carboidrato que contêm tais unidades sejam produzidos no do processo da presente invenção a partir, por exemplo, dos beta-glucanos da levedura e da cevada.
As amostras de produto do tipo Progut e as amostras relacionadas dos principais produtores foram analisadas para sua solubilidade, e seus perfis de cromatografia de permeação em gel são gerados. Desses resultados, parece que a quantidade relativa de material solúvel de amostras igualmente do processadas sugere a eficácia do produto do tipo Progut na questão da alimentação animal. A quantidade tanto de material de tamanho grande quanto intermediário parece ser particularmente importante. Em todas as amostras relacionadas, a quantidade de material de tamanho grande e intermediário é claramente mais baixa do que nas amostras de produto do tipo Progut. Em algumas das amostras relacionadas, a maioria do material solúvel é de tamanho de baixo peso molecular, o que provavelmente não seja eficaz para inibir a aderência bacteriana.
A invenção é dirigida ao isolamento dos componentes solúveis mostrados nesses cromatogramas de permeação em gele ao fracionamento adicional opcional dos materiais e à análise química mais detalhada, por exemplo, por NMR para materiais isolados e fracionados. A invenção é especialmente dirigida ao material de tamanho intermediário e sua quantidade relativa como componente importante para a atividade. A invenção também é dirigida ao material de tamanho grande e sua quantidade relativa como componente importante para a atividade. EXEMPLO 2 Materiais e métodos Materiais Amostras de produto do tipo ProgutTM (PG) obtidas junto a Suomen Rehu PG1; PG2; PG 15h, PG hidrolisado para 15 h; PG WS, PG solúvel em água; PG WS E+, PG solúvel em água com emulsificante. PG1 demonstrou funcionar bem, ao passo que PG2 não foi assim eficaz em ensaios de aderência bacteriana. Amostras de levedura de cerveja integral
As amostras de levedura de cerveja utilizadas nas presentes experiências tinham 20% de substância seca, na média. Hidrólise com ácido Ácido fosfórico
A hidrólise de ácido principal da solução de levedura de cerveja inteira com H3PO4 é similar à hidrólise utilizada no do processo de fabricação do produto do tipo Progut: o pH é ajustado para 2,4 pelo H3PO4 (concentrado, 87%), e incubada a 80°C por quatro horas. Esta hidrólise de ácido é referida daqui por diante no texto como 'hidrólise de ácido do processo'.
A hidrólise de ácido com concentrações mais altas de H3PO4 foi realizada com 0,3 M, 0,5 M, lMe2Mde H3PO4 a 80°C ou a 100°C, por quatro horas. Ácido clorídrico A hidrólise de ácido com HC1 foi realizada com 0,3 M, 0,5 M, lMe2Mde HC1 a 80 °C, por quatro horas. Ácido sulfúrico A hidrólise de ácido com H2SO4 foi realizada com 0,3M, 0,5M, lMe2Mde H2SO4 a 80 °C, por quatro horas.
Uma solução de água a 0,2% foi preparada com as amostras de produto do tipo Progut ou solução de levedura de cerveja (isto é, 500 μl da mistura de reação, contendo 100 mg de material de peso seco, foram diluídos até 5 0 ml com H2O) . Ela foi incubada em temperatura ambiente por duas a cinco horas sob misturação suave. Foi mostrado que a duração da incubação não era relevante para a solubilidade. A mistura foi centrifugada (4.000 rpm por vinte minutos) e o peso do precipitado foi medido após a liofilização.
Pronase 0 mg de pronase (Streptomyces griseus, 4 8 U/mg, Sigma) para 5 ml de solução de levedura de cerveja/2 0% de solução do produto do tipo Progut, 5 mM de CaCl2, incubação a 37°C por cinco horas.A hidrólise de ácido do processo foi realizada tanto antes quanto depois do tratamento enzimático. O efeito da pronase foi analisado pela experiência da solubilidade. Savinase ml de solução de levedura de cerveja/20% de solução do produto do tipo Progut, pH ajustado para 10 pelo NaOH, 4 ou 20 μl de savinase (protease de Bacillus sp, 16 mU/μl, Sigma), incubação a 37°C por cinco horas. A hidrólise de ácido do processo foi realizada tanto antes quanto depois do tratamento enzimático. O efeito da savinase foi mostrado pela experiência da solubilidade. Glucanex O efeito da glucanex (enzimas de lisina de Trichoderma harzianum, 1,18 U/g, Sigma) sobre a solubilidade da solução de levedura de cerveja foi estudado ao variar a quantidade de glucanex ou a temperatura na reação. Para 5 ml de solução de levedura de cerveja, 5-100 mg de glucanex foram adicionados e foi incubada a 30, 37 ou 50°C por cinco horas. A hidrólise de ácido do processo foi realizada após o tratamento enzimático. 0 efeito da glucanex foi mostrado pela experiência da solubilidade. Pectinase mg de pectinase foram adicionados (Aspergillus niger, 1 U/mg, Calbiochem) para 5 ml de solução de levedura de cerveja ou 2 0% de solução do produto do tipo Progut e incubada a 37 °C por cinco horas. A hidrólise de ácido do processo foi realizada tanto antes quanto depois do tratamento enzimático. O efeito da pectinase foi mostrado pela experiência da solubilidade. Endoglucanase 200 μg de endoglucanase (endoglucanase I de T. reesei, obtida junto a VTT) para 5 ml da solução de levedura de cerveja, incubação a 37 ou 50°C por cinco horas. Esta reação só foi realizada em conjunto com glucanex ou com glucanex e savinase (vide abaixo).
Tratamentos enzimáticos combinados Efeito combinado de glucanex e savinase: Primeira reação por glucanex, tal como descrito, e então savinase com pH 10, tal como descrito. A hidrólise de ácido do processo foi realizada após os tratamentos enzimáticos, e depois disso o efeito das enzimas foi mostrado pela experiência da 5 solubilidade. Efeito combinado de glucanex e endoglucanase: Reações concomitantes por glucanex e endoglucanoase, a 37 ou 50°C, como descrito. A hidrólise de ácido do processo foi realizada após os tratamentos enzimáticos, e depois disso o 10 efeito das enzimas foi mostrado pela experiência de solubilidade. Efeito combinado de glucanex, endoglucanoase e savinase: Primeiramente a reação por glucanex e endoglucanoase, a 37 ou 50°C, como descrito, e então a 15 savinase com pH 10, como descrito. A hidrólise de ácido do processo foi realizada após os tratamentos enzimáticos, e depois disso o efeito das enzimas foi mostrado pela experiência da solubilidade.
Cada série de experiências incluiu uma reação de controle, que imitasse o processo de produção do produto do tipo Progut original, isto é, a solução de levedura de cerveja foi tratada com a hidrólise de ácido do processo, como descrito em Materiais e Métodos. O aumento na solubilidade dos componentes após as experiências de hidrólise enzimática e/ou de ácido foi medido de forma inversa: uma vez que o peso seco dos componentes solúveis era impossível de medir, em vez disso foi medida a diminuição dos componentes insolúveis. Efeito da pronase
As amostras de produto do tipo Progut foram tratadas com a pronase, como descrito em Materiais e Métodos. PG1 é, de acordo com os testes de inibição de aderência bacteriana, eficaz como alimentação animal e parece ter melhor solubilidade do que PG2. A solubilidade de ambas as amostras do produto do tipo Progut aumenta consideravelmente pelo tratamento de pronase, como visto na Figura 9, onde as quantidades de material insolúvel são apresentadas (o material de peso seco original nessas amostras era 100 mg).
Na série seguinte de experiências, as digestões de pronase com PG1 e PG2 foram repetidas, e tal como mostrado na Figura 10, os resultados são bastante similares.
Nesta série de experiências, também o efeito do pH na digestão de pronase com levedura de cerveja foi estudado. As digestões foram realizadas com pH 5 (o pH da solução de levedura de cerveja intacta) e com pH 8, e seguidas pela hidrólise de ácido. A mudança no pH durante a incubação não causou nenhuma diferença significativa na solubilidade (dados não mostrados). A atividade da pronase incubada tanto antes quanto depois da hidrólise de ácido também foi estudada.
Os resultados na Figura 10 mostram que a pronase é mais eficaz após a hidrólise de ácido do que antes dela, sugerindo mais provavelmente que depois da hidrólise de ácido as proteínas ficam desnaturadas e mais acessíveis à protease.
Desse modo, a pronase deve aumentar a solubilidade do produto do tipo Progut, mesmo se for utilizada antes da hidrólise de ácido. Considerando o processo de produção do produto do tipo Progut, isto é benéfico, porque a hidrólise de ácido destruiria a pronase e o próprio produto não teria atividade enzimática restante quando utilizado como alimento animal.
Ao comparar os resultados da solubilidade do produto do tipo Progut ou da levedura de cerveja (Fig 10) , parece que o processo de produção do produto do tipo Progut original, industrial (1) , é mais eficaz na produção de um produto mais solúvel e, (2) este produto é mais vulnerável à ação da pronase do que o processo da hidrólise de ácido em escala de laboratório para a levedura de cerveja intacta. Efeito da savinase
A fim de examinar a reatividade de uma outra protease com o produto do tipo Progut, a savinase (protease de Bacillus sp.) foi escolhida, uma protease básica que faz parte da produção industrial. Quando testada com o produto do tipo Progut, a savinase diminuiu a quantidade de material insolúvel quase pela metade (Figura 11). No entanto, a eficácia da pronase (Figura 10) parece bem melhor: Enquanto a pronase diminuiu a quantidade de material insolúvel até 22% (PG1), na PG1 tratada com savinase havia 53% restantes. Em contraste com a ação da pronase, a quantidade de material 15 insolúvel é independente se a savinase for utilizada antes ou depois da hidrólise de ácido do processo (tal como nas Figuras 10 e 11, experiências com levedura de cerveja). Devido ao fato que a savinase é uma enzima industrial, ela poderia ser utilizada com custos razoáveis.
No entanto, a utilização da savinase não é tão prática quanto a utilização da pronase: como a savinase é uma protease básica, o pH tem de ser ajustado em 10 a fim de começar a reação efetiva. Isto significa que após a neutralização (indiferente se a savinase for realizada antes ou depois da 25 hidrólise de ácido do processo) a concentração de fosfato de sódio do produto é substancial.
Efeito da pectinase As pectinas são polissacarídeos grandes, heterogêneos, e de parede de células negativamente carregadas.
A pectinase industrial é uma enzima lisina de pectina e, além disso, contém diversas outras atividades enzimáticas também. Portanto, pensou-se que o tratamento com pectinase poderia ser eficaz na solução do produto do tipo Progut. Certamente, a pectinase demonstrou ser mais eficaz do que a savinase, mas não tão eficaz quanto a pronase na produção de produto do tipo Progut mais solúvel em água (Figuras 10, 11 e 12) . Por exemplo, o peso seco do material insolúvel em PG1 diminuiu com a pronase até 22% e com a pectinase até 34%, deixando 8,5 ou 15 mg de material insolúvel, respectivamente. Em contraste com a protease, a pronase e a savinase, o tratamento com pectinase é eficaz com a solução de levedura de cerveja somente após a hidrólise de ácido do procedimento (Figura 12). Efeito de glucanex
A fim de analisar o impacto dos β-glucanos na solubilidade do produto do tipo Progut, tratamentos com β- glucanase foram realizados. A glucanex (enzimas de lisina de Trichoderma harzianum) foi escolhida, porque ela era uma conhecida enzima de hidrolisação do glucano da parede de célula de levedura eficaz em termos de custo. A glucanex é conhecida por também conter celulase, protease e atividades da quitinase. Primeiro, o efeito de várias quantidades de glucanex foi estudado a 30°C. Foi mostrado claramente que quantidades pequenas de glucanex não aumentam substancialmente a solubilidade da levedura de cerveja. No entanto, com 100 mg/5 ml da solução de cerveja, a quantidade de material insolúvel diminuiu até 46% como mostrado na Figura 13. Na segunda série de reação, o efeito da temperatura foi estudado e ela foi realizada com a levedura de cerveja que tinha estado a +4°C por um mês, tornando-a um pouco mais líquida. O aumento da temperatura de incubação em aproximadamente 7°C (de 30°C para 37°C) aumentou claramente a solubilidade (o material insolúvel de 64% para 54%) . Em contraste, quando a temperatura foi aumentada para 50°C, a quantidade de material insolúvel diminuiu somente em 26%, sugerindo que a enzima não tolerou tais altas temperaturas. A 37°C a glucanex produz aproximadamente a mesma redução na quantidade de material insolúvel que a pronase e a pectinase (cf. Figuras 10, 12 e 13). Efeito dos tratamentos com enzima combinados
As enzimas de degradação de proteína e de polissacarídeo eram bastante eficazes em diminuir a quantidade de material insolúvel no produto do tipo Progut ou nas soluções de levedura de cerveja, tal como mostrado acima. No entanto, nenhum desses tipos de enzima podia sozinho produzir o produto solúvel em água. Em seguida foi estudado se as reatividades das proteases e, por exemplo, das glucanases são combinatórias, isto é, se o produto solúvel pode ser produzido pela ação combinada dessas enzimas.
Glucanex e savinase Glucanex e a savinase são ambas enzimas industriais eficazes em termos de custo, e portanto foram escolhidas para serem testadas para a reatividade combinada. Ao comparar o efeito de glucanex sozinha (Figura 13) ou da savinase sozinha (Figura 11) e sua ação combinada, pode ser visto claramente que elas funcionam mais eficazmente em conjunto (/Figura 14): O material insolúvel foi reduzido com tratamento com glucanex (20 mg, 37 °C) sozinho em torno de 47% e com a savinase sozinha (4 μl, 37 °C) em torno de 32%, ao passo que em sua reação combinada a redução foi 77% (isto é, somente 12 mg do material em peso seco original permaneceu insolúvel). No entanto, mesmo na melhor reação realizada (100 mg de glucanex a 30°C e 4 μl de savinase a 37°C) ainda há 8,5 mg fora dos 100 mg de material em peso seco originalmente na solução de levedura de cerveja restante. A savinase demonstrou ser menos eficaz do que a pronase ou a pectinase, e a glucanex aproximadamente igualmente eficaz como a pronase e a pectinase (ver acima) . A ação combinada da glucanex e da savinase com a solução de levedura de cerveja oferece resultados muito melhores do que com a pronase e a pectinase, e realmente tem uma eficácia parecida com aquela da pronase e da pectinase com um produto do tipo Progut.
Endoglucanase combinada com glucanex e/ou savinase A fim de melhorar a degradação de polissacarídeo, foi estudada a eficácia da endoglucanase (endoglucanase I de T. reesei} em combinação com a glucanex e a savinase. Experiências do tratamento de glucanex e endoglucanase (Figura 15) e da glucanex sozinho (Figura 13) não mostram nenhum efeito cumulativo; as quantidades de material insolúvel comparadas ao controle são 54% e 53%, respectivamente. Do mesmo modo, com a glucanex e a savinase, nessas experiências a endoglucanase não melhora a solubilidade (com EG 22% e sem 23% de material insolúvel versus o controle).
Efeito dos ácidos A fim de estabelecer a diferença entre o efeito de solubilização do H3PO4 comparado a outros ácidos, dois ácidos fortes, HCl e o H2SO4, foram escolhidos para experiências da hidrólise de ácido. O efeito de altas concentrações de ácido sobre a solubilidade da solução de levedura de cerveja também foi estudado. H3PO4 - Efeito do aumento da concentração com ou sem savinase A Figura 16 mostra os resultados de dois conjuntos de experiências com a solução de levedura de cerveja. Claramente, concentrações mais altas de H3PO4 (0,3 M, 0,5 M e 1 M, a 100°C) aumentam a solubilidade do produto (Figura 16, primeiros três pares de coluna). O tratamento da savinase com a solução de levedura de cerveja combinado com a hidrólise de ácido a 80°C, em altas concentrações de H3PO4 (0,3 M, 0,5 M, 1 M e 2M), resulta em uma solubilidade bastante similar com a hidrólise de ácido a 100°C. HC1
A hidrólise de ácido da solução de levedura de cerveja com concentrações de HC1 variáveis (Figura 17) mostra uma eficácia bastante similar como a hidrólise com H3PO4. H2SO4
A hidrólise de ácido da solução de levedura de cerveja com o aumento das concentrações de H2SO4 (Figura 18) comparada com a hidrólise por H3PO4 (Figura 16) indica que os ácidos oferecem regularmente solubilidades similares. De modo interessante, a solubilidade das hidrólises de ácido do produto diminui com 2 M de ácido em comparação a 1 M. 2 M de H2S04 pode precipitar componentes da solução de levedura de cerveja, porque é um ácido muito forte. Efeito da homogeneização
A fim de analisar se o tratamento mecânico da solução de levedura de cerveja melhoraria o efeito da hidrólise de ácido, uma amostra de levedura de cerveja foi homogeneizada por um homogeneizador industrial. Há um aumento de 10% na solubilidade quando comparada com os resultados da hidrólise de ácido a 1 M da levedura de cerveja homogeneizada e normal (Figura 19, 75% de material insolúvel de levedura de cerveja restante e 65% de levedura de cerveja homogeneizada restante comparando com a hidrólise do processo). Em contraste, tal como mostrado na Figura 20, a homogeneização só tem um efeito menor na eficácia da degradação das enzimas glucanex, savinase e pectinase.
Comparação de PG, PG WS e PG WS E+ De acordo com esses resultados de solubilidade aqui apresentados, cinco amostras foram escolhidas para serem preparadas para experiências de inibição de aderência bacteriana. Essas amostras são: 1. solução de levedura de cerveja com tratamento de glucanex e hidrólise de ácido do processo, 2. solução de levedura de cerveja homogeneizada com tratamento de glucanex e hidrólise de ácido do processo, 3. hidrólise de ácido com 1 M de H3PO4 na solução de levedura de cerveja, 4. hidrólise de ácido com 1 M de H3PO4 na solução de levedura de cerveja homogeneizada, e 5. PG 1 tratada com pectinase. Todas apresentaram bons resultados nos ensaios de aderência bacteriana (realizados do mesmo modo como no processo de teste do produto do tipo Progut antigo), sendo amostra tratada com glucanex a mais eficaz. No entanto, ao passo que o produto com a hidrólise de ácido com 1 M de H3PO4 foi tão eficaz, ele foi escolhido para ser produzido para experiências de campo. O produto do tipo Progut solúvel em água (PG WS) e o produto do tipo Progut solúvel em água com emulsificante (PG WS+E) foram produzidos por processo industrial e suas amostras foram estudadas para sua solubilidade. A Figura 21 mostra as solubilidades do produto do tipo Progut solúvel em água com e sem o emulsificante em comparação com PG1 e 2. A quantidade de material insolúvel diminuiu em 40% ao comparar PG1 e PG WS. Por outro lado, parece que o emulsificante não aumenta a solubilidade quando comparado com a solubilidade de PG WS. Além disso, uma amostra de um produto do tipo Progut super-hidrolisado foi trazida para análise. A experiência de solubilidade deste produto do tipo Progut hidrolisado por 15 horas mostrou que havia uma quantidade quase igual de material insolúvel restante quando comparado a PG1. Uma análise posterior deve ser feita a fim de poder considerar se houve, por exemplo, superdegradação.
A hidrólise com 1 M de H3PO4 da solução de levedura de cerveja na produção do processo produz um produto que pode ser aplicado aos animais como um componente da água potável. Isto significa que a quantidade de material insolúvel restante no produto do tipo Progut solúvel em água (26%) é pequena o bastante para permanecer líquida durante o processo da aplicação aos animais. Este procedimento de produção de PG-WS aumentou notavelmente a solubilidade, de 42% de material insolúvel do produto do tipo Progut atual para 26% de PG-WS. Os tratamentos enzimáticos combinados com a hidrólise de ácido do processo do produto do tipo Progut ou da solução de levedura de cerveja produziram produtos ainda mais solúveis do que a hidrólise com 1 M de H3PO4 acima mencionada sozinha. Na melhor das hipóteses, a quantidade de material insolúvel foi diminuída para 10% quando tratada com a pronase ou a ação combinada de glucanex e savinase.
EXEMPLO 3 Solubilidade do produto do tipo Progut, do novo produto solúvel em água e dos concorrentes O processo de hidrólise foi desenvolvido adicionalmente para produzir o produto solúvel do tipo Progut, referido como Solúvel do tipo Progut, que pode ser utilizado na alimentação animal como misturas líquidas em alimentadores automatizados sem problemas de aplicação. A solubilidade do produto do tipo Progut é em média de cerca de 50% (n = 9) ao passo que o produto solúvel do tipo Progut tem uma solubilidade maior do que 70%. Todos os produtos concorrentes mostram solubilidades menores que 40% (Figura 23) . Características do produto solúvel do tipo Progut
No que diz respeito à saúde e ao bem-estar dos animais, os materiais biologicamente relevantes em um produto do tipo Progut e em outros produtos de levedura são pensados para ter poli- e oligossacarídeos solúveis. Aqui, em soluções diluídas a 1% ou mais, todos os oligossacarídeos são solúveis.
A parte insolúvel consiste de componentes de parede de célula, isto é, principalmente de polissacarídeos e de proteínas insolúveis. Na cromatografia de permeação em gel (GPC) os poli-e os oligossacarídeos solúveis, assim como os peptídeos (também referidos neste relatório como "material de tamanho médio") elui em 6-14 ml, e suas quantidades relativas são medidas em 214 nm.
O processo de hidrólise modificado de um produto solúvel do tipo Progut resulta em um aumento quase duplicado no material de tamanho médio e a quantidade detectada no novo produto solúvel do tipo Progut adicional processado é quase três vezes maior (Figura 25 e 26). A invenção também revelou um produto solúvel praticamente totalmente isolado referido como produto do tipo Progut solúvel em água.
A quantidade de poli- e de oligossacarídeos e de peptídeos é substancialmente mais baixa nos três produtos concorrentes (Figura 27 e 28) . Correlação do material solúvel com análise de aderência bacteriana
A atividade biológica do produto do tipo Progut é proporcional à quantidade de material de tamanho médio. A Figura 29 mostra que uma quantidade mais alta de poli- e de oligossacarídeos e de peptídeos leva a uma atividade mais alta na aderência bacteriana. Também é evidente que os produtos concorrentes que carregam baixas quantidades de material do tamanho médio mostram uma aderência bacteriana de E. coli muito mais baixa (Figura 30).
Análise de monossacarídeo - comparação do teor de manose Acredita-se que o manano e os mano-oligossacarídeos nos produtos de levedura sejam componentes bioativos. O teor de manose da fração de poli- e de oligossacarídeo solúveis foi portanto medido e, como mostrado na Figura 31, os produtos do tipo Progut têm claramente mais mano- oligossacarídeos solúveis do que os produtos concorrentes. O teor de manose também foi comparado à atividade de aderência bacteriana da E. coli. Foi descoberto que a correlação entre a quantidade de manose e a atividade de aderência bacteriana não é direta (Figura 32) . Portanto, é levantada a hipótese de que nem todo poli- e oligossacãrídeos com manose demonstra atividade de aderência bacteriana similar, mas determinadas estruturas mostram uma bioatividade mais alta.
Análise de NMR de componentes solúveis A análise de 1H NMR pode revelar características estruturais dos mano-oligossacarídeos no produto do tipo Progut e em outros produtos de levedura. A Figura 33 mostra a análise em NMR da amostra do produto do tipo Progut. Os detalhes estruturais de um sacarídeo de manano de levedura típico e de seus picos NMR característicos são mostrados na inserção. Ao comparar os espectros em NMR do produto do tipo Progut e dos três produtos concorrentes (Figura 34), pode ser concluído que a quantidade relativa de unidades Manai-3 terminais (marcas azuis nas Figuras 33 e 34) é claramente mais alta no produto do tipo Progut. Foi mostrado que algumas cepas de E.coli (prejudiciais à saúde do intestino) se ligam preferencialmente às estruturas Manal-3 nos mamíferos. O aumento dos oligossacãrídeos com unidades Manal-3 terminais é uma conseqüência da etapa de hidrólise do processo do produto do tipo Progut. Detalhes da análise de 1H NMR As amostras em NMR foram divididas em duas categorias, de acordo com sua composição de sacarídeo.
Amostras contendo manopolissacarídeo/ oligossacarídeo com manose de baixo peso molecular As formas lineares/larguras dos sinais de sacarídeo sugerem que os sacarídeos são razoavelmente grandes. Os sinais anoméricos 1H das unidades de manose constituintes foram atribuídos com base nos dados publicados para oligossacarídeos de manano mais altos. Os seguintes fragmentos de mano-oligossacarídeo foram identificados. A unidade de manose que corresponde à letra maiúscula está em negrito. A concentração relativa dos diferentes resíduos de manose em cada amostra é dada na Tabela 1. A integração foi realizada utilizando alturas máximas e o sinal para A recebeu o valor 1. De acordo com a integração, a concentração de um a-D-Manp-(1-3)- a-D-Manp-(1-2) terminal e outros epítopos de manose comuns é mais alta nas amostras de PG comparadas com as amostras dos concorrentes, além disso, a proporção relativa do epítopo B Manp-(1-3)-a-D-Manp-(1-2) com um epítopo A interno a-D-Manp-(1-2) é mais alta no. Todas essas amostras também contêm amido, como indicado (+) na Tabela 3. A integração do sinal-chave de manose indica que o teor de amido é menor nas amostras do tipo PG. Lista de estruturas de monossacarídeo específicas que correspondem aos sinais A-E NMR de manose A) - a-D-Manp-(1-2)-a-D-Manp-(1-2)-a-D-Manp B) a-D-Manp-(1-3)-a-D-Manp-(1-2)-a-D-Manp C) - a-D-Manp-(1-6)-a-D-Manp-(1-6)-α-D-Manp-α-D-Manp(1- 2) + D) - α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp-(1-6)-α-D-Manp- E) - α-D-Manp-(1-6)-α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp- e 5 -α-D-Manp-(1-6)-α-D-Manp-(1-6)-α-D-Manp-α-D-Manp(1- 2) + e -α-D-Manp-(1-3)-α-D-Manp-(1-2)-α-D-Manp- Tabela 3. Sinais 1H-NMR de fragmentos de mano- 10 oligossacarídeo e as concentrações relativas de resíduos de tnanose diferentes. No nome da amostra, "grande" indica componentes de tamanho grande na cromatografia de permeação em gel, eluindo de 6-12 ml. Fragmentos de mano-oligossacarideo
difícil de atribuir devido aos antecedentes, mas claramente menor do que 5,302. Amostras que contêm oligossacarídeo de amido
As amostras a seguir contêm oligossacãrídeos de amido como o único componente de sacarídeo identificável: PG1 intermediário (que elui de GPC em 12-16 ml) , PG2 intermediário, PG3 intermediário, PG4 intermediário, PG6 intermediário, PG7 intermediário, PG8 intermediário, PG9 intermediário, PG 15h intermediário, PG10 intermediário, PG11 intermediário, PG12 intermediário, PG13 intermediário, PG14 intermediário, Ag intermediário, As intermediário, Al intermediário e BM intermediário.
A atribuição é baseada na presença de sinais em 5.409 ppm, 4.972 ppm, 5.231 ppm e 4.645 ppm, correspondendo ao anomérico His da cadeia [a-(1-4)Glcp]n, ponto ramificado a-(l-6)-Glcp e extremidade de redução a-D-Glcp e β-D-Glcp, respectivamente.
Também há diversas amostras que possivelmente contêm fragmentos de mano-oligossacarídeo além do componente principal de oligossacarídeo de amido. A identificação dessas moléculas requer uma investigação adicional.
Nos espectros em NMR das amostras PG1 intermediárias, os sinais PG S intermediário, PG S+E intermediário e PG WS intermediário que correspondem aos fragmentos de terminal a-D-Manp-(1-3)-a-D-Manp-(1-2)-a-D-Manp e a-D-Manp-(1-2)-a-D-Manp-(1-2)-a-D-Manp- estavam presentes. Baixas quantidades de amido A Tabela 4 inclui a quantificação de amido na fração de sacarídeo grande por NMR. Em uma realização preferida, a invenção é dirigida às frações de sacarídeo (6- 12 min e opcionalmente também oligossacarídeos) e ao material de acordo com a invenção, sendo que a quantidade de epítopos de amido Glca4 é menor do que 3,5 vezes a mais que de Manp- (1-3)-a-D-Manp-(1-2), e com mais preferência menor do que 3 vezes. A invenção também revela a presença de sinais de extremidade redutores de amido nas amostras presentes indicando cadeias de amido de baixo peso molecular.Além disso, o amido preferido, de acordo com a invenção, contém quantidades modestas de estruturas Glcαδ-ramifiçadas. A invenção é dirigida às baixas quantidades de amido no contexto de altas quantidades de sacarídeos de manose preferidos. Deve ser compreendido que os fragmentos de amido podem ser degradados por enzimas do tipo amilase. Em uma realização preferida, o material de amido residual é degradado por enzimas de degradação de amido, tais como a amilase, para obter sacarídeos de manose/glicose mais puros. A análise da fração de filtragem de gel de Peptídeos Superdex intermediária revela que a quantidade de oligossacarídeos de amido é particularmente baixa nas novas frações solúveis (PG solúvel em água e solúvel). Presença de quantidades mais altas de oligossacarídeos de manose nas novas preparações solúveis Os sinais de oligossacarídeos de manose eram mais evidentes nas preparações de sacarídeo solúveis (Solúveis e Solúveis em água). Ao comparar o sinal a-D-Manp-(1-3)-a-D- Manp- (1-2)-a-D-Manp- com o sinal do oligossacarídeo de amido entre as preparações solúveis, esses sinais eram pelo menos cerca de 20% do sinal de amido Glcβ4, em determinadas preparações, cerca de 30-60% do sinal de amido e cerca da mesma quantidade oligossacarídeos assináveis totais. Nas preparações de processo antigas, somente sinais muito menores α-D-Manp-(1-3)-α-D-Manp foram observados, e estes eram somente uma pequena %, tipicamente menos do que cerca de 5% do sinal de amido. A fração intermediária que compreende os oligossacarídeos maiores que eluem entre doze e dezesseis minutos compreende a maioria dos oligossacarídeos, exceto os menores (dissacarídeos e provavelmente parte ou trissacarídeos), mas não monossacarídeos. Deve ser compreendido que a presença de oligossacarídeos de manose menores não é provável nas amostras. A quantidade da fração intermediária (superdex peptídeo 12-16) é parte substancial do material de tipo de sacarídeo total, tal como indicado pelos perfis de filtragem de gel, estimados em cerca de 20- 50% de sacarídeos totais. Portanto, as amostras incluem pelo menos cerca de 4%-30%, com mais preferência pelo menos cerca de 5-30%, ainda com mais preferência pelo menos cerca de 10- 30% de oligossacarídeos de manose dos sacarídeos totais. A quantidade de oligossacarídeos de manose da manose total que compreende sacarídeos é cerca de 10-60%, com mais preferência 20-60% com base no teor de manose e de glicose da amostra.
Os oligossacarídeos de manose nas preparações são altamente enriquecidos com o epítopo Mana3 terminal, que é o sinal de manose principal nas preparações, indicando o enriquecimento do novo sacarídeo de manose bioativo que inibe os patógenos de ligação de manose.
Os dados revelam que os oligossacarídeos de manose principais efetivos com peso molecular mais baixo que eluem entre doze e dezesseis minutos são produzidos eficazmente pelo presente método otimizado para produzir o solúvel, mas não outros métodos, incluindo métodos de progut anteriores ou um método concorrente.
Surpreendentemente, os materiais concorrentes parecem não conter quantidades significativas de oligossacarídeos de manose, embora alguns desses sejam anunciados como mano-oligossacarídeos. Parece que a produção eficaz de oligossacãrídeos de manose de levedura não é tarefa fácil, apesar dos esforços de muitas empresas. Os materiais de manose residuais dos concorrentes aparecem como materiais fracamente solúveis de alto peso molecular, como demonstrados também pelos sinais NMR muito amplos e fracos, em comparação com os sinais mais estreitos e suaves dos materiais de acordo com a presente invenção. A invenção é, em uma realização preferida, dirigida ao novo material de sacarídeo, de acordo com a invenção, produzindo espectros em NMR essencialmente similares no que diz respeito aos sinais A-E de manose e aos sinais Glcbeta de acordo com a invenção, incluindo de preferência uma largura máxima similar, e/ou integrais máximas similares e baixas quantidades similares de sinais de amido e/ou de outras impurezas, tais como um sinal de impureza em cerca de 4,7 ppm incluindo o possível material de não-carboidrato. Referências para a análise de NMR: Kath, F., e Kulicke, de W-M (1999) Die Angewandte Makromoleculare Chemie 268, 69-80 Shibata, N. , Kojima, C., Satoh, Y. , Satoh, R. , Suzuki, A., Kobayashi, H., e Suzuki, S. (1993) Eur. J. Biochem 217, 1-12 Ikuta, K. , Shibata, N. , Blake J.S., Dahl M.V., Nelson, R.D., Hisamichi, K. , Kobayashi, H., Suzuki, S., e Okawa, Y. (1997) Biochem J. 323, 297-305. Concluindo, o produto do tipo Progut contém mais unidades Manal-3 terminais, tal como mostrado por 1H NMR (Figuras 33 e 34), e o teor de mano-oligossacarídeo é mais alto, tal como mostrado pela análise de monossacarídeo de material solúvel (Figura 31) , do que nos produtos concorrentes.
De acordo com esses resultados, pode ser concluído que a quantidade de mano-oligossacarídeos ativos é claramente mais alta no produto do tipo Progut do que nos produtos concorrentes. Atribuição dos materiais que compreendem alfa- e beta-Glc
A Tabela 4 mostra a presença específica de materiais Glcb nas amostras do tipo Progut. A quantidade mais alta de material Glcb foi encontrada no produto solúvel indicado pelo sinal de NMR em cerca de 4,53 ppm. A invenção é especialmente dirigida aos novos produtos solúveis quando a quantidade de sinal Glcβ NMR em cerca de 4,53 ppm é pelo menos cerca de 80% (0,8 vez na Tabela 4) do sinal Mana3 em cerca de 5,14 ppm, com mais preferência 90% (0,9 vez na Tabela 4) do sinal Mana3. A invenção é dirigida ainda às quantidades equimolares dos materiais Glcβ e Mana3 terminais.
É notável que nenhum dos materiais concorrentes contém o sinal Glcβ. O sinal Glcβ é considerado para incluir uma quantidade principal de material Glcβδ, e isto é suportado também pela presença do sinal assinável do sinal Glcβ6-H2 em 3,31 ppm. 0 sinal Glcβ também sobrepõe a região para o sinal de glucano cerial e as formas de sinal consideradas para indicar a presença parcial do epítopo Glcβ4 de sacarídeos derivados de glucano cerial no material de sacarídeo preferido. Tabela 4. Sinais de 1H-NMR de fragmentos de oligossacarídeo e das concentrações relativas de resíduos de monossacarídeo diferentes. No nome da amostra, "grande" indica componentes de tamanho grande da cromatografia de permeação em gel, eluindo de 6-12 ml.
Nota: os sinais Hl de Glcβl-6 e Glcβl-4 têm o mesmo valor. b Hl de Glcβl-3 ramificado em Glcβl-6 glucano c A intensidade deste sinal não foi medida, em vez 5 disso, é referenciada se for detectado (sim) ou não (não) d Nota - Há uma base bastante grande a 4,53 ppm; portanto, as intensidades podem estar um tanto superestimadas + sinal de pequeno, par claramente detectãvel, muito pequeno para ser integrado - nenhum sinal detectável n.d. Não determinado, o sinal que surge de H2O sobrepõe a possibilidade de detectar este sinal. EXEMPLO 4 Experimentações com animais O novo preparado de sacarídeo solúvel em água solúvel PG é administrado aos animais de teste como suplemento alimentar com quantidades de 0,3% -3% da alimentação ou da água potável utilizando os métodos padrão usados nos testes de Progut (publicado por Suomen Rehu). Altos ganhos de peso e/ou menos diarréia foram observados em relação às preparações regulares de Progut ou aos produtos concorrentes.
Claims (7)
1. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE SACARÍDEO, que compreende o produto para uso na prevenção de desarranjos gástricos, de doenças intestinais e na promoção do crescimento em animais ou seres humanos, caracterizado por compreender: A. a provisão de matéria-prima de levedura, de preferência matéria-prima de levedura de cerveja, B. a hidrólise por hidrólise ácida otimizada por ácido inorgânico selecionado a partir do grupo de HCl, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, na concentração de 0,5 M a 1 M e à temperatura de reação no intervalo de 75-100°C e o tempo de reação sendo de 2 a 8 horas; ou por enzima e hidrólise ácida otimizada por ácido orgânico selecionado a partir do grupo de HCl, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, na concentração de 0,5 M a 1 M e à temperatura de reação no intervalo de 75-100°C e o tempo de reação sendo de 2 a 8 horas para resultar na composição de sacarídeo, sendo que a solubilidade total da composição é superior a 55% em uma solução a 1% em água.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ambas as hidrólise enzimática e hidrólise ácida otimizada serem usadas.
3. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo tratamento enzimático incluir pronase, savinase, pectinase e/ou endoglucanase ou incluir enzimas com especificidade para o mesmo tipo de proteína ou polissacarídeo.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: A. provisão de matéria-prima de levedura, de preferência matéria-prima de levedura de cerveja B. homogeneização física do material C. hidrólise por ácido inorgânico.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo tempo de reação ser de 3 a 5 horas ou de 3,5 a 4,5 horas.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela fração de sacarídeo solúvel ser isolada ou purificada por um método ou por quaisquer combinações do mesmo, selecionados do grupo: a) métodos cromatográficos tais como i. cromatografias para absorção de cargas e ou lipofólicas (impurezas hidrofóbicas) ii. cromatografia de exclusão por tamanho, especialmente filtragem de gel, para remover as impurezas de baixo peso molecular iii. cromatografias de afinidade com as matrizes se ligando aos sacarídeos ou a parte dos mesmos, de preferência cromatografia em carbono ativado; e/ou b) métodos de solução de separação de fase tais como a extração com solventes e/ou precipitação das impurezas ou dos sacarídeos; e/ou c) centrifugação e separação da solução e do precipitado e/ou d) métodos químicos ou enzimáticas para degradar componentes indesejados, de preferência hidrólise alcalina suave para degradar impurezas instáveis alcalinas e/ou hidrólise enzimática de sacarídeos do tipo Glcα que compreendem glicogênio/amido.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo solvente orgânico usado para a precipitação de impurezas ou sacarídeos ser um álcool ou cetona, tal como metanol ou etanol, de preferência em que etanol ou acetona são usados para a precipitação dos sacarídeos de tamanho preferido.
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