NO300692B1 - Solubilisert forgrenet ß-1,3-glukan og anvendelse derav samt anvendelse av usolubilisert forgrenet ß-1,3-glukan - Google Patents

Abstract

P-(l-)-glukanasebehandling av glukan fra gjærcel-ler," som er rent eller forgrad, spesielt gjær fra familien Saccharomvces. og mere spesielt Saccharomvces cerevisiae gir et nytt glukanprodukt som er egnet for bruk til å øke stimuleringen av immunsy-stemer av vertsdyr. Solubiliseringen av slikt gjærcelleglukan er ytterligere beskrevet for å utvikle anvendeligheten av gjærcelleglukan som en adjuvant.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår strukturell modifisering av gjærglukaner, spesielt, men ikke utelukkende fra familien Saccharomyces, ved å bruke /?- (1-6) -glukanase, og anvendel-sen av slike modifiserte glukaner i vaksiner og dyreforformuleringer. Spesielt angår oppfinnelsen solubilisert forgrenet ( 3- 1, 3-glukan med j8-l, 3-bundne sidekjeder som er bundet via en ( 3- 1,6-binding og som er fritt for /S-1,6-bundne kjeder, samt anvendelse av et slikt materiale til fremstilling av medikamenter eller forprodukter med immunstimulerende egenskaper.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Det er kjent fra europeisk patentsøknad Ser. nr. 91111-143.3 (publikasjon nr. 0466031 A2) at immunsystemet hos dyr som lever i vann kan bli stimulert ved tilføring av en effektiv mengde av cellevegg-glukan fra gjær. Det er videre kjent at effekten av vaksiner på slike vannlevende dyr kan bli øket ved å tilføre en effektiv mengde av slikt gjærcellevegg-glukan sammen med vaksineantigenene.

Slike glukanblandinger er partikulære glukaner, slik som dem avledet fra gjærtypen Saccharom<y>ces cerevisiae. Slike partikulære glukaner er makromolekylære og består av en kjede av glukoseenheter bundet via /3-l,3)- og /3-1,6-bin-dinger, hvilket glukan er et forgrenet 13- 1,3-glukan som har /S-l, 3-bundne og /3-1, 6-bundne kjeder deri.

Slike partikulære glukaner blir fremstilt av KS Biotec-Mackzymal under varemerket "MacroGard" og er kraftige aktivatorer for makrofag/monocytt-celleserier. Således har slike partikulære glukaner en dyptgående effekt på immunsystemet .

Selv om det partikulære glukan avledet fra Saccharomyces cerevisiae er funnet å ha et antall gunstige effekter på fisk og andre dyr, er bruken av glukanet i den partikulære og således uløselige form begrenset.

I tillegg er det nå antatt at tilstedeværelsen av ( 3- 1, 3-forgreninger medvirker til de ønskede farmasøytiske fordeler som kan erholdes fra partikulært glukan.

Følgelig vil et system hvorved j6-l, 3-bundne forgreninger blir gjort lettere tilgjengelig i glukanet være meget ønskelig.

Oppsummering av oppfinnelsen

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det blitt funnet at ved å behandle det partikulære glukan avledet fra gjær-organismer, spesielt av familien Saccharomyces, og mere spesielt Saccharomyces cerevisiae, med en /S-l, 6-glukanase blir det erholdt et modifisert partikulært glukan som er særpreget ved sin økede aktivitet til å fremskaffe stimulering av immunsystemet. Den kjemiske forbindelse som fremstilles ved dette er et glukan, som er et usolubilisert forgrenet /S-l, 3-glukan med /3-1, 3-bundne sidekjeder som er bundet via en /S-l, 6-binding og som er fritt for ( 3- 1, 6-bundne kjeder.

Således er det i én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse fremskaffet et slikt /S-l, 3-glukan fra gjær som er særpreget ved sin økede evne til å stimulere immunsystemet hos fisk og andre dyr.

I en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er

det fremskaffet et nytt solubilisert ( 3- 1, 3-glukan fra gjær som er anvendelig for å øke aktiviteten av veterinærvaksi-ner. Et slikt solubilisert jS-1,3-glukan er særpreget ved at det fremstilles ved å sette et uoppløselig glukan, som er et forgrenet jS-1, 3-glukan med ( 3- 1, 3-bundne sidekjeder som er bundet via en /S-l, 6-binding og som er fritt for ( 3- 1, 6-bundne kjeder, i kontakt med et solubiliseringmiddel såsom

maursyre ved en temperatur i området 70-90°C.

I enda en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse blir et slikt prodkt anvendt for å fremskaffe en ny for-glukanblanding eller medikament som er anvendelig som en bestanddel i konvensjonelt dyrefor.

Andre utførelsesformer og fordeler ifølge foreliggende oppfinnelse vil være innlysende fra den følgende beskrivel-se og krav.

Fremgangsmåte for fremstilling av B - 1 . 6- glukanasebehandlet glukan (" MacroGard").

"MacroGard" type glukan blir avledet fra Saccharom<y>ces cerevisiae som angitt i europeisk patentsøknad nr. Ser. nr. 91111143.3. Selv om slikt glukan er kjent for å stimulere immunsystemet hos fisk, blir dets aktivitet øket ved behandling derav med en /3-1,6-glukanase ifølge foreliggende oppfinnelse.

Slik glukanasebehandling av glukanet utføres ved å suspen-dere glukanpartiklen i et bufret medium ved en pH i området fra omkring 4 til omkring 8 og ved en temperatur i området fra omkring 20 til omkring 50°C. Egnete bufrede media er de valgt fra gruppen omfattende natriumacetat, ammoniumacetat og natrium-kaliumfosfat. For tiden foretrukne bufferoppløs-ninger er natriumacetat eller ammoniumacetat. Enzymatisk nedbrytning av glukanet blir startet opp ved tilsetningen av /?-l, 6-glukanasen til det bufrede medium.

jS-1,6-glukanaser som er egnet for modifiseringen av gjær-glukan i samsvar med foreliggende oppfinnelse, er slike som er fremstilt fra en mikroorganisme valgt fra gruppen omfattende Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Rhizopus chinensis, Gibberella fuj ikuroi, Bacillus circulans, Mucor lilmalis, og Acineto-

bacter. Av disse er en for tiden foretrukken glukanase den som er erholdt fra Trichoderma harzianum.

Mengden av jS-1, 6-glukanase anvendt for behandling av glukanet ligger normalt i området fra 1 til 50 enheter pr. g glukan.

Enzymatisk nedbryting blir avsluttet ved å varme opp reak-sjonsblandingen til en temperatur i området fra 80 til 100°C, fortrinnsvis i en tid i området fra 2 til 10 minutter. Ande måter å stoppe enzymnedbrytningen på er f.eks. ved å tilsette proteaser eller inhibitorer til reaksjons-blandingen.

Alternativt•kan enzymet enkelt bli fjernet ved vask. De vaskede partikler blir deretter resuspendert i vann med tilsetningen av et baktericid slik som 0,3 % formalin (volum/volum) og lagret ved en temperatur på omkring 4°C.

Det resulterende enzymbehandlede glukan kan bli karakterisert som et forgrenet /S-l, 3-glukan med /S-l, 3-bundne sidekjeder som er festet via en /S-l, 6-binding og som er fri for /3-1,6-bundne kjeder. I denne forbindelse er uttrykket "/S-1,6-kjeder" ment å inkludere kjeder på mere enn 1 /3-l,6-bundne glukoseenheter. /S-l, 6-glukanaseenzymspaltningen sikrer at de fleste kjeder på mere enn 4 /S-l, 6-bundne glukoseenheter blir spaltet bort.

For ytterligere å øke anvendeligheten av glukanet blir det utsatt for solubilisering. En slik solubiliseringsbehand-ling blir generelt utført ved en temperatur i området fra omkring 70 til 90°C over en periode på fra 30 til 60 min ved tilstedeværelse av et solubiliseringsmiddel. Et for tiden foretrukket solubiliseringsmiddel er maursyre. Etter solubilisering blir oppløsningsmidlet fjernet, og det resulterende glukan blir kokt i destillert vann.

Ved utførelse av foreliggende oppfinnelse kan glukan først bli enzymbehandlet og deretter solubilisert eller omvendt, bli solubilisert og derpå enzymbehandlet.

I henhold til en annen utførelse av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et /S-l, 6-glukanasebehandlet forglukan fra gjær, f.eks. Saccharomyces cerevisiae. Slikt forglukan kan erholdes ved først å sette gjærcelleveggen i kontakt med en vandig alkalisk oppløsning under betingelser egnet å utføre ekstraksjonen av proteiner og lipider fra dette. Generelt blir slik ekstraksjon utført ved en temperatur i området omkring 50 - 80°C i omkring 2-8 timer. Et for tiden foretrukket alkalisk ekstraksjonsmiddel er natrium-hydroksyd. Etter ekstraksjon blir celleveggene gjenvunnet fra den vandige alkaliske oppløsning og vasket for å fjerne oppløste celleveggkomponenter fra dette. De vaskete gjær-cellevegger blir deretter nøytralisert ved behandling med en syre slik som fosforsyre. Deretter blir det nøytraliser-te vaskede glukan pasteurisert og deretter tørket.

Passende enzymer for behandling av forglukan er slike som kan benyttes ved behandling av glukan av høy renhet.

Det enzymbehandlete forglukan blir fremstilt ved å sette glukanet i kontakt med en /S-l, 6-glukanase på samme måte som benyttet ved enzymbehandlingen av det partikulære glukan. /S-l, 6-glukanasebehandlet forglukan ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttig i dyreforformuleringer.

De følgende eksempler blir presentert for å illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Dette eksempel gir fremgangsmåten benyttet for å fremskaffe en immunostimulatorisk glukanpartikkel som er egnet for anvendelse ved utføringen av foreliggende oppfinnelse.

500 g tørr Saccharomyces cerivisiae ble suspendert i en 3 liters 6%-ig vandig NaOH oppløsning. Denne suspensjon ble deretter omrørt over natten ved romtemperatur. Etter omrø-ring ble suspensjonen sentrifugert ved 2000 x g i 25 minutter. Supernatanten ble kastet, og det uoppløselige residuum ble derpå resuspendert i 3 liter 3%-ig NaOH og inkubert i 3 timer ved 75°C, fulgt av avkjøling av suspensjonen over

natten. Suspensjonen ble deretter sentrifugert ved 2000 x g 1 25 minutter og supernatanten ble dekantert. Residuet ble så resuspendert i 3%-ig NaOH, oppvarmet og sentrifugert som tidligere beskrevet.

Det uoppløselige residuum som var tilbake ble så justert til pH 4,5 med eddiksyre. Det uoppløselige residuum ble deretter vasket med 2 liter vann tre ganger og gjenvunnet ved sentrifugering ved 2000 x g i 25 minutter etter hver vask (supernatanten ble helt fra). Residuet ble så suspendert i 3 liter av en 0,5 M vandig eddiksyreoppløsning. Suspensjonen ble oppvarmet i 3 timer ved 90°C. Suspensjonen ble derpå avkjølt til romtemperatur. Etter avkjøling ble det uoppløselige residuum samlet opp ved sentrifugering ved 2000 x g i 25 minutter. Denne behandling (fra justering til pH 4,5 til oppsamling av det avkjølte residuum) ble gjentatt 6 ganger.

Det uoppløselige residuum ble deretter suspendert i 3 liter destillert vann og omrørt i 30 minutter ved 100°C, derpå avkjølt og sentrifugert ved 2000 x g i 25 minutter. Supernatanten ble kastet. Det uoppløselige residuum ble vasket på denne måten 4 ganger. Residuet ble deretter suspendert i 2 liter etanol og oppvarmet ved 78°C i 2 timer. Denne etanolvask ble gjentatt 4 ganger. Residuet ble deretter vasket 4 ganger med 3 liter destillert vann ved romtemperatur for å fjerne etanol, for derved å gi en suspensjon av det ønskede glukanprodukt.

EKSEMPEL 2

Dette eksempel gir fremgangsmåten for å fremstille glukanpartikler som i hovedsak er fri for 0-1, 6-bundne kjeder ved bruken av 0-1,6-glukanase isolert fra Trichoderma harzianum.

200~mg glukanpartikler fremstilt ifølge eksempel 1 ble suspendert i 40 ml 50 mM ammoniumacetatbuffer, pH 5,0, sammen med 20 enheter (8-1,6-glukanase ved 37°C i 6 timer under konstant omrøring. Den enzymatiske nedbrytning av glukanpartiklene ble stoppet ved å oppvarme suspensjonen til 100°C i 5 minutter. Partiklene ble så vasket tre ganger med 200 ml sterilt destillert H20 ved sentrifugering ved 2000 x g i 10 minutter, hvoretter 185 mg tørket enzymbehandlet glukan ble fremstilt.

Enzymbehandlingen vil kun spalte 0-1,6-bindinger inne i 0-1,6-bundne kjeder, men vil ikke fjerne /S-l, 6-bundne gluko-sylresiduer som fremstrekker seg fra forgreningspunktene. Det resulterende enzymbehandlede glukan kan karakteriseres som et forgrenet /S-l, 3-glukan med /S-l, 3-bundne sidekjeder som er festet med en /S-l, 6-binding og som er fri for 0-1,6-bundne kjeder.

EKSEMPEL 3

Dette eksempel fremskaffer fremgangsmåten for å solubili-sere glukanpartikler fremstilt i samsvar med eksempel 1 ved hydrolyse ved å bruke maursyre (HCOOH).

2,0 g glukanpartikler ble suspendert i 1,0 liter 90%-ig maursyre og oppvarmet ved 80°C under konstant omrøring. Suspensjonen ble avkjølt til 35°C og maursyren ble inndam-pet. Residuet inneholdende de hydroksylerte partikler ble kokt i 500 ml destillert vann i 3 timer, hvoretter den avkjølte suspensjon ble filtrert gjennom et 0,44 /zm filter, frosset og lyofilisert, hvorved 1,0 g tørre solubiliserte partikler ble fremstilt. De frysetørkede partikler ble så

oppløst i 100 ml destillert vann og dialysert ved å bruke en dialysemembranslange med en nominell molekylvekt (NMWCO) på 5000 Dalton, mot springvann i 24 timer, og derpå fryse-tørket. Dette resulterte i 1,8 g solubilisert glukanprodukt.

EKSEMPEL 4

Dette eksempel viser de biologiske effekter av glukanpartikler fremstilt i henhold til eksempel 1, og jS-1,6-glukanasebehandlede glukanpartikler fremstilt i henhold til eksempel 2 på immunresponser hos atlanterhavslaks.

Et A-lags positivt isolat av Aeromonas Salmonicida, under-art salmonicida, referert til som stamme nr. 3175/88 (Vikan Veterinary Fish Research Station, Namsos, Norge) ble brukt. Bakterien ble dyrket i hjerne-hjerte-infusjonsmedium (Dif-co, USA) i 30 timer ved 14°C i en risteinkubator, og kul-turmediet med bakterien ble sentrifugert i 10 minutter ved 3000 x g. Pelletten ble resuspendert i 0,9 % fysiologisk saltvann, og bakterien ble avlivet ved å tilsette 0,5% formalin (volum/volum) til suspensjonen og inkubere ved 14°C i 24 timer. Den formaliniserte kultur ble derpå vasket med sterilt 0,9 % fysiologisk saltvann og resuspendert til en konsentrasjon 2 x IO<9> ml"<1> bakterier i 0,9 % fysiologisk saltvann med 0,3% formalin. Bakteriesuspensjoner ble blandet med en lik volumdel fysiologisk saltvann eller med de forskjellige glukansuspensjoner (10 mg ml"<1> i fysiologisk saltvann). Formalin ble tilsatt til vaksinene til en endelig konsentrasjon på 0,3 % (volum/volum).

Ved utførelse av disse forsøk ble to grupper av forsøksfisk benyttet. I vaksineforsøket ble atlanterhavslaks presmolt på 20-40 g brukt. I forsøket hvor serum ble samlet opp for å måle blodlysozym-aktivitet etter glukaninjeksjon ble atlanterhavslaks på 50-70 brukt. Fisken ble holdt i 150 liters tanker utstyrt med aerert ferskvann ved 12°C og matet med kommersielle pelletter ad libitum to ganger daglig. I vaksinasjonsforsøket ble 40 fisk i hver gruppe IP-injisert med 0,1 ml av de forskjellige vaksinepreparater eller vaksine uten glukan som en kontroll. Blod ble samlet opp i evakuerte rør (Venoject, Terumo-Europe, Belgia) fra 10 fisk i hver gruppe 6, 10 og 18 uker etter injeksjon. Blodprøver ble tillatt å koagulere over natten ved 4°C og sera ble samlet opp etter å sentrifugere rørene ved 2000 x g i 10 minutter. Individuelle serumprøver ble overført til Micronic serumrør (Flow Laboratories Ltd., Lugano, Sveits) og lagret ved -80°C til de ble brukt.

For å måle effekten av glukaner på blodlysozymaktivitet ble laks IP-injisert med 0,3 ml av de forskjellige glukaner i fysiologisk saltvann eller med 0,3 ml fysiologisk saltvann som negativ kontroll. Glukanene ble tilført ved en konsentrasjon på 10 mg ml"<1.> Blodprøver ble samlet opp fra 10 fisk fra hver gruppe 10 og 20 dager etter injeksjon ved å bruke evakuerte rør (Venoject). Rørene ble holdt på is inntil de ble sentrifugert ved 2000 x g i 10 minutter, og individuelle serumprøver ble overført til Micronic serumrør og lagret ved -80°C inntil de ble brukt.

Lysozymaktivitet ble målt med den turbidimetriske metode ved å bruke 0,2 mg ml"<1> frysetørket Micrococcus lvsodeikti-cus som substratet i 0,04 M natriumfosfatbuffer ved pH 5,75. Serum (20 fil) ble tilsatt til 3 ml av suspensjonen og reduksjonen i absorbans ved 54 0 nm ble målt etter 0,5 minutter og 4,5 minutter ved 22 °C. Én enhet lysozymaktivitet ble definert som en reduksjon i absorbanse på 0,001 min"<1>. Resultater er uttrykt som gjennomsnittlig lysozymaktivitet i serum i 10 fisk (tabell 1 og 2.).

Nivået av spesifikt antistoff mot A-laget av A^_ salmonicida i laksesera ble målt med et enzym-tilknyttet immuno-sorbent assay (ELISA). A-lagprotein ble renset fra hele A. salmonicida celler (Bjørnsdottir et al. (1992), Journal of Fish Diseases, 15:105-118), og proteininnhold ble bestemt

(Bradford, M. M. (1976) Analytical Biochemistry, 72-248-254) ved å bruke et fargemiddelreagenskonsentrat fra Bio-Rad Laboratories (Richmont, USA). Mikrotitterplater ble belagt med 100 /il av 5 /xg ml"<1> lagprotein i 50 mM karbo-natbuffer, pH 9,6, og inkubert over natten ved 4°C. Den videre fremgangsmåte ble utført som beskrevet av Håvard-stexn et al, ( Journal of Fish Diseases (1990), 13-101-111). Antistofftiteren i sammenslåtte serumprøver ble bestemt før individuelle serumprøver ble målt ved tre forskjellige fortynninger (1:500, 1:1000 og 1:2000). Absorbans ble avlest ved 492 nm i et Multiscan MCC/340 MK II (Flow Laboratories Ltd.). Resultater er uttrykt som gjennomsnittlig antistoffrespons til A-laget av bakterien ved en fortynning på 1:2000 i serum fra 10 fisk (tabell 1 og 2).

Begge injeksjoner av ubehandlede og 0-1,6-glukanasebehandlede glukanpartikler induserte signifikant høyere (p<0,01) lysozymaktivitet i serum sammenlignet med saltvannskontroll både 10 og 20 dager etter injeksjon. Ved dag 20 etter injeksjon var lysozymnivåene hos fisk injisert med 0-1,6-glukanasebehandlede glukanpartikler signifikant høyere (p<0,05) sammenlignet med fisk injisert med ubehandlede partikler.

0-1, 6-glukanasebehandlede glukanpartikler induserte signifikant høyere (<0,05) antistoffrespons til vaksinen sammenlignet med vaksine uten adjuvant ved alle tre prøvetag-ningstider, mens ubehandlede glukanplartikler induserte signifikant høyere respons 10 og 18 uker etter injeksjon. 0-1,6-glukanasebehandlete glukanpartikler induserte signifikant høyere (p<0,05) antistoffrespons enn ubehandlede glukanpartikler ved 10. uke etter injeksjon, mens ingen signifikante forskjeller mellom de to ble observert ved 6 og 18 uker etter injeksjon.

Injeksjon av solubiliserte glukanpartikler induserte signifikant høyere (p<0,01) lysozymaktivitet enn ubehandlede glukanpartikler både 10 og 2 0 dager før injeksjon. Ingen signifikante forskjeller kunne observeres mellom egenskape-ne hos solubiliserte glukanpartikler og ubehandlede glukanpartikler til å indusere øket antistoffrespons mot vaksi-neantigenet på noe prøvetakningstidspunkt. Begge induserte signifikant høyere (p<0,05) antistoffrespons enn vaksinen uten adjuvant 10 og 18 uker etter injeksjon, men ikke ved 6 uker etter injeksjon.

EKSEMPEL 5

Dette eksempel gir fremgangsmåten for å fremskaffe en glukanblanding egnet for bruk ved foring av dyr.

1000 kg tørt celleveggmateriale fra Saccharom<y>ces cerevisiae ble suspendert i 5300 1 vann ved en temperatur på 65°C i en tank av rustfritt stål. Til suspensjonen av celleveg-ger i vann ble det tilsatt 227 1 50% vekt/vekt NaOH for å danne en kaustisk konsentrasjon på omkring 3%. Den resulterende blanding ble derpå omrørt i en periode på omkring 4 timer ved en temperatur på omkring 60°C.

Etter den initielle ekstraksjonsperiode ble suspensjonen så fortynnet med 8000 kg vann ved en temperatur på omkring 65°C i en omrørt rustfri stål-vasketank, slik at vekten av blandingen ble fordoblet. Den resulterende fortynnede blanding ble deretter holdt ved en temperatur på omkring 60°C, mens den ble omrørt i en periode på ca. 15 minutter. Deretter ble den resulterende blandede fortynnede suspensjon sentrifugert i en dysesentrifuge (Alfa Laval DX 2 09). Supernatanten ble kastet. Den resulterende konsentrerte celleveggsuspensjon ble kontinuerlig innført i en andre omrørt stål-vasketank inneholdende 8000 kg vann, og blandingen ble justert ved tilsetningen av vann for å gi en endelig vekt på 14500 kg. Den resulterende suspensjon ble så blandet i en periode på 15 minutter ved en tmeperatur på 60-65°C. Deretter ble den omrørte blanding sentrifugert.

Den resulterende celleveggsuspensjon ble kontinuerlig tilsatt til en tredje beholder inneholdende 80 0 0 kg vann. Ytterligere vann ved 60°C ble tilsatt for å gi en endelig vekt på 14500 kg. Den resulterende suspensjon ble omrørt i en periode på 15 minutter ved 60-65°C og deretter sentrifugert .

Etter sentrifugering ble det resulterende celleveggkonsen-trat overført til en lagringstank av rustfritt stål, hvor suspensjonen ble avkjølt til en temperatur på omkring 5-10°C. Den resulterende avkjølte suspensjon ble behandlet med fosforsyre (H3P04) i en omrørt tank av rustfritt stål i en mengde til å gi en suspensjon av fast materiale med en pH på 5,5-7,5.

Etter nøytralisering ble den resulterende nøytraliserte blanding utsatt for pasteurisering ved oppvarmning til en temperatur på 75°C over en periode på 18 sekunder ved å passere blandingen gjennom en i-linje plate- og rammevarme-veksler.

Etter pasteurisering ble den resulterende pasteuriserte blanding så spray-tørket i en spray-tørker holdt ved en innløpslufttemperatur på minst 140-150°C og en utløpstempe-ratur på omkring 65-70°C, hvorved det ble oppnådd 3 00 kg tørt glukanprodukt.

EKSEMPEL 6

Dette eksempel gir fremgangsmåten og effekten av behandling med f 6rgradglukan med en jS-1, 6-glukanase .

25 g forgradglukan fremstilt i samsvar med eksempel 5 ble

suspendert i 1,25 liter 50 mM natriumacetat, pH 5,0, i en 2 liters konisk kolbe. Glukanpartikler ble holdt i suspensjon ved risting, suspensjonen ble varmet til 30°C og renset ( 3-1,6-glukanase fra Trichoderma harzianum ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 1,8 enheter/g glukan.

For å følge tidsforløpet av den enzymatiske fjerning av /S-1,6-bundet glukose fra glukanpartiklen ble 1 ml porsjoner av suspensjonen fjernet ved forskjellige tidspunkter, sentrifugert ved 20 00 x g, og 0,2 ml av supernatantene ble analysert for fritt, reduserende karbohydrat (Nelson et al.

(1944), Journal of Bioloqical Chemistrv, 153:315-80). Glu-kansuspensjonen ble inkubert i 28 timer, ved hvilket tids-punkt hastigheten for frigjøring av fritt reduserende karbohydrat ble iakttatt til å være meget lav. Glukanpartiklene ble deretter pellettert ved sentrifugering ved 2000 x g, vasket én gang i 50 mM natriumacetat, pH 5,0 og én gang i vann.

En fint tørt pulver egnet for bruk som et foradditiv ble fremstilt fra det våte glukan ved først å dehydrere pelletten fire ganger med etanol ved romtemperatur, fulgt av lufttørking ved romtemperatur.

Resultater fra behandling av et forgrad-glukan med /S-1,6-glukanase fra Tj_ harzianum som beskrevet ovenfor er vist i tabell 3.

Sammenligningsforsøk 1 - Intraperitonealt injisert glukan Forskjellige glukaner (enzym-behandlet glukan ("MacroGard") ifølge foreliggende oppfinnelse, solubilisert glukan ("MacroGard") ifølge foreliggende oppfinnelse, skleroglukan, laminarin, pustulan og glykogen samt fysiologisk saltvann som"kontroll) ble undersøkt for sin evne til å stimulere immunsystemet hos fisk. Resultatene av forsøk utført med laks i vektstørrelsen 50-70 g injisert med 3 mg av de ulike glukanene eller med fysiologisk saltvann som referanse hvor resultatene er angitt som lysozym-aktivitet i enheter pr. ml er satt opp i fig. 1. Figuren viser effekten av de ulike glukaner på lysozylaktiviteten i blod 10 og 20 dager etter intraperitoneal injeksjon. Hver enkeltverdi representerer gjennomsnittlig lysozymaktivitet i serum fra 10 ulike fisk. Resultatene er presentert med standardavvik. Fra forsøkene går det klart frem at de beste resultater blir oppnådd med enzymbehandlet samt med enzymbehandlet og sulobilisert glukan ifølge foreliggende oppfinnelse.

Sammenlianinqsforsøk 2 - Glukan benyttet for å sensitivi-sere makrofager

De forskjellige glukantyper som er nevnt i sammenlignings-forsøk 1 ble undersøkt for sin evne til å sette makrofager i beredskapstilstand. Resultatene er satt opp i fig. 2, som viser superoksydproduksjonen i makrofager fra atlanterhavslaks stimulert med 1,0 ptg/ml glukan i cellemedium. Hode-nyre-makrofager ble inkubert med de ulike glukanene i 5 dager før superoksydproduksjonen ble målt som reduksjon av nitro-blått tetrazolium (NBT) etter stimulering med PMA (forbol-myristat-acetat). Målingene er satt opp som den respiratoriske aktivitetsøkning representert ved målinger av OD620 pr. 10<5>celler. Resultatene<*> er presentert som reduksjon av NBT pr. 10<5> celler med standardavvik fra 6 paral-lelle målinger. Også disse resultater viser den forbedrede effekt av materialene ifølge oppfinnelsen. Sammenligningsforsøk 3 - Glukan benyttet som adjuvant Innvirkningen av de forskjellige glukantyper som er nevnt i sammenligningsforsøk 1, på antistoffproduksjon som tilsats i vaksiner som adjuvans ble undersøkt. Resultatene er satt opp i fig. 3 som viser adjuvant-effekt av glukaner på antistoffproduksjon i laks etter intraperitoneal injeksjon med A-lags positiv Aeromonas salmonieida-vaksine. Antistoff mot A-lag ble målt 6, 10 og 18 uker etter injeksjon. Laks (20-40 g) ble injisert med 0,1 ml vaksine med 0,5 ml av de ulike glukanene. Effekten av de ulike adjuvantene er sammenlignet med vaksine uten noen tilsetning av glukan. Hver verdi er gjennomsnittlig aktivitet i serum fra 10 fisk ved en 1:2000 fortynning av serum. Resultatene, som er presentert med standardavvik, viser den forbedrede adjuvans-effekt av materialene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Claims (3)

1. Solubilisert forgrenet £-1,3-glukan med 0-1,3-bundne sidekjeder som er bundet via en 0-1,6-binding og som er fritt for 0-1,6-bundne kjeder, karakterisert ved at det fremstilles ved å sette et uoppløselig glukan, som er et forgrenet 0-1,3-glukan med 0-1,3-bundne sidekjeder som er bundet via en 0-1,6-binding og som er fritt for 13- 1,6-bundne kjeder, i kontakt med et solubiliseringsmiddel såsom maursyre ved en temperatur i området 70-90°C.

2. Kjemisk forbindelse til bruk som et immunstimulerende middel hos fisk og andre dyr, karakterisert ved at den er et usolubilisert forgrenet 0-1,3-glukan med 0-1, 3-bundne sidekjeder som er bundet via en /3-1,6-binding og som er fritt for 0-1,6-bundne k j e de r.

3. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 eller 2 ved fremstilling av et medikament eller forprodukt med immunstimulerende egenskaper.