BRPI0814670B1 - Método para realizar diagnóstico pré-natal de uma aneuploidia cromossômica fetal e meio legível por computador. - Google Patents

Abstract

método para realizar diagnóstico pré-natal de uma aneuploidia cromossômica fetal as formas de realização desta invenção fornecem métodos, sistemas e aparelho para determinar se uma aneuploidia cromossômica fetal existe a partir de uma amostra biológica obtida de uma fêmea grávida. as moléculas de ácido nucleico da amostra biológica são sequenciadas, tal que uma fração do genoma é sequenciada. as respectivas quantidades de um cromossoma clinicamente relevante e de cromossomas de segundo plano são determinadas a partir de resultados do sequenciamento. um parâmetro derivado destas quantidades (por exemplo, uma razão) é comparada com um ou mais valores de corte, determinando deste modo uma classificação de se uma aneuploidia cromossômica fetal existe.

Description

“MÉTODO PARA REALIZAR DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL DE UMA ANEUPLOIDIA CROMOSSÔMICA FETAL E MEIO LEGÍVEL POR COMPUTADOR”

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

O presente pedido reivindica prioridade da e é um pedido não provisório do Pedido Provisório U.S. N^o 60/951438, intitulado “DETERMINING A NUCLEIC ACID SEQUENCE IMBALANCE” depositado em 23 de julho de 2007 (Documento do Representante N^o 016285-005200US), os conteúdos totais do qual são aqui incorporados por referência para todos os propósitos.

REFERÊNCIAS AOS PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido também está relacionado com o pedido não provisório concorrentemente depositado intitulado “DETERMINING A NUCLEIC ACID SEQUENCE IMBALANCE,” (Documento do Representante N^o 016285-005210US) os conteúdos totais do qual são aqui incorporados por referência para todos os propósitos.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção no geral diz respeito ao teste de diagnóstico de aneuploidia cromossômica fetal pela determinação de desequilíbrios entre sequências de ácido nucleico diferentes e mais particularmente à identificação de trissomia 21 (síndrome de Down) e outras aneuploidias cromossômicas via teste de uma amostra materna (por exemplo, sangue).

FUNDAMENTOS

A aneuploidia cromossômica fetal resulta da presença de dose(s) anormal(is) de um cromossoma ou região cromossômica. A(s) dose(s) anormal(is) pode(m) ser anormalmente alta(s), por exemplo, a presença de um cromossoma 21 extra ou região cromossômica na trissomia 21; ou anormalmente baixa, por exemplo, a ausência de uma cópia do cromossoma X na Síndrome de Turner.

Os métodos de diagnóstico pré-natal convencionais de uma

Petição 870180160643, de 10/12/2018, pág. 7/43 aneuploidia cromossômica fetal, por exemplo, a trissomia 21, envolve a amostragem de materiais fetais pelos procedimentos invasivos tais como amniocentese ou amostragem do vilo coriônico, que apresenta um risco finito de perda fetal. Procedimentos não invasivos, tais como a triagem pela ultrassonografia e marcadores bioquímicos, têm sido usados para mulheres gestantes para classificar os riscos antes dos procedimentos de diagnóstico invasivos definitivos. Entretanto, estes métodos de triagem tipicamente medem o epifenômeno que está associado com a aneuploidia cromossômica, por exemplo, a trissomia 21, ao invés da anormalidade cromossômica de núcleo e assim têm precisão de diagnóstico subótima e outras desvantagens, tais como ser altamente influenciado pela idade gestacional.

A descoberta de DNA fetal isento de célula circulante no plasma materno em 1997 ofereceu novas possibilidades para o diagnóstico pré-natal não invasivo (Lo, YMD e Chiu, RWK 2007 Nat Rev Genet 8, 7177). Embora este método tenha sido facilmente aplicado para o diagnóstico pré-natal de distúrbios ligados ao sexo (Costa, JM et al. 2002 N Engl J Med 346, 1502) e certos distúrbios de gene único (Lo, YMD et al. 1998 N Engl J Med 339, 1734-1738), a sua aplicação para a detecção pré-natal de aneuploidias cromossômicas fetais tem representado um desafio considerável (Lo, YMD e Chiu, RWK 2007, supra). Primeiro, os ácidos nucleicos fetais co-existem no plasma materno com um alto fundo de ácidos nucleicos de origem materna que pode frequentemente interferir com a análise de ácidos nucleicos fetais (Lo, YMD et al. 1998 Am J Hunz Genet 62, 768-775). Segundo, os ácidos nucleicos fetais circulam no plasma materno predominantemente em uma forma isenta de célula, tomando difícil derivar informação de dosagem de genes ou cromossomas dentro do genoma fetal.

Desenvolvimentos significantes que superam estes desafios foram recentemente feitos (Benachi, A & Costa, JM 2007 Lancet 369, 440442). Um método detecta ácidos nucleicos específicos de feto no plasma materno, superando assim o problema de interferência de fundo materno (Lo, YMD e Chiu, RWK 2007, supra). A dosagem do cromossoma 21 foi deduzida a partir das razões de alelos polimórfícos nas moléculas de DNA/RNA derivados de placenta. Entretanto, este método é menos preciso quando as amostras contêm quantidade mais baixa do ácido nucleico alvejado e apenas pode ser aplicado a fetos que são heterozigotos para os polimorfismos alvejados, que são apenas um subconjunto da população se um polimorfismo é usado.

Dhallan et al (Dhallan, R, et al. 2007, supra Dhallan, R, et al. 2007 Lancet 369, 474-481) descreveram uma estratégia alternativa de enriquecer a proporção de DNA fetal circulante pela adição de formaldeído ao plasma materno. A proporção de sequências de cromossoma 21 contribuídas pelo feto no plasma materno foi determinada pela avaliação da razão de alelos específicos do feto patemalmente herdados para alelos específicos não fetais para polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no cromossoma 21. As razões de SNP foram similarmente computadas quanto a um cromossoma de referência. Um desequilíbrio do cromossoma 21 fetal foi depois deduzido detectando-se uma diferença estatisticamente significante entre as razões de SNP para o cromossoma 21 e aquelas do cromossoma de referência, onde significante é definido usando um valor p fixo de < 0,05. Para garantir alta cobertura da população, mais do que 500 SNPs foram alvejados por cromossoma. Entretanto, tem havido controvérsias com respeito à eficácia do formaldeído para enriquecer DNA fetal a uma alta proporção (Chung, GTY, et al. 2005 Clin Chem 51, 655-658) e assim a reprodutibilidade do método precisa ser ainda avaliada. Também, como cada feto e mãe seria informativo quanto a um número diferente de SNPs para cada cromossoma, o poder do teste estatístico para comparação de razão de SNP seria variável de caso para caso (Lo, YMD & Chiu, RWK. 2007 Lancet 369, 1997). Além disso, visto que estes métodos dependem da detecção de polimorfismos genéticos, eles são limitados a fetos heterozigotos quanto a estes polimorfismos.

Usando a reação da cadeia da polimerase (PCR) e quantificação de DNA de um local de cromossoma 21 e um local de referência em culturas de amniócito obtidas da trissomia 21 e fetos euplóides, Zimmermann et al (2002 Clin Chem 48, 362-363) foram capazes de distinguir os dois grupos de fetos com base no aumento de 1,5 vezes de aumento nas sequências de DNA do cromossoma 21 no anterior. Visto que uma diferença de 2 vezes na concentração de padrão de DNA constitui uma diferença de apenas um ciclo de limiar (Ct), a discriminação de uma diferença de 1,5 vezes foi o limite da PCR em tempo real convencional. Para se obter graus mais finos de discriminação quantitativa, estratégias alternativas são necessárias.

A PCR digital foi desenvolvida para a detecção da razão alélica distorcida em amostras de ácido nucleico (Chang, HW et al. 2002 J Natl Cancer Inst 94, 1697-1703). A PCR digital é uma amplificação com base na técnica de análise de ácido nucleico que requer a distribuição de um espécime contendo ácidos nucleicos em uma multidão de amostras separadas onde cada amostra contendo em média não mais do que cerca de uma sequência alvo por amostra. Os alvos de ácido nucleico específicos são amplificados com iniciadores específicos de sequência para gerar amplicons específicos pela PCR digital. Os locais de ácido nucleico a serem alvejados e as espécies de ou painel de iniciadores específicos de sequência a serem incluídos nas reações são determinadas ou selecionadas antes da análise do ácido nucleico.

Clinicamente, a mesma foi mostrada ser útil para a detecção de perda de heterozigosidade (LOH) em amostras de DNA de tumor (Zhou, W. et al. 2002 Lancet 359, 219-225). Para a análise de resultados de PCR digital, o teste da razão da probabilidade sequencial (SPRT) foi adotado pelos estudos anteriores para classificar os resultados experimentais como sendo sugestivos da presença de LOH em uma amostra ou não (El Karoui et al. 2006 Stat Med

25,3124-3133).

Em métodos usados nos estudos anteriores, a quantidade de dados coletados da PCR digital é muito baixa. Assim, a precisão pode ser comprometida devido ao número pequeno de pontos de dados e flutuações estatísticas típicas.

E, portanto desejável que testes não invasivos tenham alta sensibilidade e especificidade para minimizar falsos negativos e falsos positivos, respectivamente. Entretanto, o DNA fetal está presente em concentração absoluta baixa e representa uma porção menor de todas as sequências de DNA no plasma e soro matemos. Portanto também é desejável ter métodos que permitam a detecção não invasiva de aneuploidia cromossômica fetal pela maximização da quantidade de informação genética que pudesse ser deduzida a partir da quantidade limitada de ácidos nucleicos fetais que existam como uma população menor em uma amostra biológica contendo ácidos nucleicos de fundo materno.

SUMÁRIO REDUZIDO

As formas de realização desta invenção fornecem métodos, sistemas e aparelhos para determinar se um desequilíbrio de sequência de ácido nucleico (por exemplo, desequilíbrio de cromossoma) existe dentro de uma amostra biológica obtida de uma mulher gestante. Esta determinação pode ser feita pelo uso de um parâmetro de uma quantidade de uma região cromossômica clinicamente relevante em relação a outras regiões cromossômicas não clinicamente relevantes (regiões de fundo) dentro de uma amostra biológica. Em um aspecto, uma quantidade de cromossomas é determinada a partir de um sequenciamento de moléculas de ácido nucleico em uma amostra materna, tal como urina, plasma, soro e outras amostras biológicas adequadas. As moléculas de ácido nucleico da amostra biológica são sequenciadas, tal que uma fração do genoma seja sequenciada. Um ou mais valores de corte são escolhidos para determinar se uma mudança comparada a uma quantidade de referência existe (isto é, um desequilíbrio), por exemplo, com respeito à razão de quantidades de duas regiões cromossômicas (ou conjuntos de regiões).

De acordo com uma forma de realização exemplar, uma amostra biológica recebida de uma mulher gestante é analisada para realizar um diagnóstico pré-natal de uma aneuploidia cromossômica fetal. A amostra biológica inclui moléculas de ácido nucleico. Uma porção das moléculas de ácido nucleico contidas na amostra biológica é sequenciada. Em um aspecto, a quantidade de informação genética obtida é suficiente para o diagnóstico preciso embora não demasiadamente excessivo de modo a conter custos e a quantidade de entrada de amostra biológica requerida.

Com base no sequenciamento, uma primeira quantidade de um primeiro cromossoma é determinada a partir das sequências identificadas como originando do primeiro cromossoma. Uma segunda quantidade de um ou mais cromossomas secundários é determinada a partir das sequências identificadas como originando de um dos cromossomas secundários. Um parâmetro da primeira quantidade e da segunda quantidade é depois comparado a um ou mais valores de corte. Com base na comparação, uma classificação de se uma aneuploidia cromossômica fetal existe para o primeiro cromossoma é determinada. O sequenciamento vantajosamente maximiza a quantidade de informação genética que seria deduzida da quantidade limitada de ácidos nucleicos fetais que existem como uma população menor em uma amostra biológica contendo ácidos nucleicos de fundo materno.

De acordo com uma forma de realização exemplar, uma amostra biológica recebida de uma mulher gestante é analisada para realizar um diagnóstico pré-natal de uma aneuploidia cromossômica fetal. A amostra biológica inclui moléculas de ácido nucleico. Uma porcentagem de DNA fetal na amostra biológica é identificada. Um número N de sequências a serem analisadas com base em uma precisão desejada é calculada com base na porcentagem. Pelo menos N das moléculas de ácido nucleico contidas na amostra biológica é aleatoriamente sequenciado.

Com base no sequenciamento aleatório, uma primeira quantidade de um primeiro cromossoma é determinada a partir das sequências identificadas como originando do primeiro cromossoma. Uma segunda quantidade de um ou mais cromossomas secundários é determinada a partir das sequências identificadas como originando de um dos cromossomas secundários. Um parâmetro da primeira quantidade e da segunda quantidade é depois comparado a um ou mais valores de corte. Com base na comparação, uma classificação de se uma aneuploidia cromossômica fetal existe para o primeiro cromossoma é determinada. O sequenciamento aleatório vantajosamente maximiza a quantidade de informação genética que seria deduzida da quantidade limitada de ácidos nucleicos fetais que existe como uma população menor em uma amostra biológica contendo ácidos nucleicos de fundo materno.

Outras formas de realização da invenção são direcionadas aos sistemas e meios legíveis em computador associados com os métodos aqui descritos.

Um melhor entendimento da natureza e vantagens da presente invenção pode ser obtido com referência à seguinte descrição detalhada e aos desenhos anexos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

A FIG. 1 é um diagrama de fluxo de um método 100 para realizar o diagnóstico pré-natal de uma aneuploidia cromossômica fetal em uma amostra biológica obtida a partir de uma paciente do sexo feminino gestante de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

A FIG. 2 é um diagrama de fluxo de um método 200 para realizar diagnóstico pré-natal de uma aneuploidia cromossômica fetal usando sequenciamento aleatório de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

A FIG. 3 A mostra uma plotagem da representação percentual das sequências do cromossoma 21 nas amostras de plasma materno envolvendo a trissomia 21 ou fetos euplóides de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

A FIG. 3B mostra uma correlação entre as concentrações de DNA fetal fracionário no plasma materno determinada pelo sequenciamento maciçamente paralelo e microfluídicas da PCR digital de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

A FIG. 4A mostra uma plotagem da representação percentual de sequências alinhadas por cromossoma de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

A FIG. 4B mostra uma plotagem da diferença (%) na representação percentual por cromossoma entre o caso de trissomia 21 e o case euplóide mostrado na FIG. 4A.

A FIG. 5 mostra uma correlação entre grau de representação excessiva nas sequências do cromossoma 21 e as concentrações de DNA fetal fracionário no plasma materno envolvendo fetos com a trissomia 21 de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

A FIG. 6 mostra uma tabela de uma porção do genoma humano que foi analisada de acordo com uma forma de realização da presente invenção. T21 denota uma amostra obtida de uma gestação envolvendo um feto com a trissomia 21.

A FIG. 7 mostra uma tabela de um número de sequências requeridas para diferenciar fetos com euploidia de trissomia 21 de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

A FIG. 8A mostra uma tabela das dez melhores posições de partida de rótulos sequenciados alinhados para o cromossoma 21 de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

A FIG. 8Β mostra uma tabela das dez melhores posições de partida de rótulos sequenciados alinhados para o cromossoma 22 de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

A FIG. 9 mostra um diagrama de bloco de um aparelho de computador exemplar utilizável com sistema e métodos de acordo com as formas de realização da presente invenção.

DEFINIÇÕES

O termo “amostra biológica” como aqui usado refere-se a qualquer amostra que é tirada de um paciente (por exemplo, um ser humano, tal como uma mulher gestante) e contém uma ou mais moléculas de ácido nucleico de interesse.

O termo “ácido nucleico” ou “polinucleotídeo” refere-se a um ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA) e um polímero deste na forma de filamento único ou duplo. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares como o ácido nucleico de referência e são metabolizados em uma maneira similar aos nucleotídeos que ocorrem naturalmente. A menos que de outro modo indicado, uma sequência de ácido nucleico particular também implicitamente abrange variantes desta conservativamente modificadas (por exemplo, substituição de códon degenerado), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complementares assim como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, a substituição de códon degenerado pode ser obtida pela geração de sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com base mista e/ou resíduos de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). O termo ácido nucleico é usado intercambiavelmente com gene, cDNA, mRNA, RNA não codificador pequeno, micro RNA (miRNA), RNA que interage com Piwi e RNA de grampo de cabelo curto (shRNA) codificados por um gene ou local.

O termo “gene” significa o segmento de DNA envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeo. Este pode incluir regiões precedentes e a seguir da região codificadora (líder e reboque) assim como sequências interpostas (íntrons) entre segmentos codificadores individuais (éxons).

O termo “reação” como aqui usado refere-se a qualquer processo envolvendo uma ação química, enzimática ou física que é indicativa da presença ou ausência de uma sequência de polinucleotídeo particular de interesse. Um exemplo de uma “reação” é uma reação de amplificação tal como uma reação da cadeia da polimerase (PCR). Um outro exemplo de uma “reação” é uma reação de sequenciamento, pela síntese ou por ligação. Uma “reação informativa” é uma que indica a presença de uma ou mais sequências de polinucleotídeo particulares de interesse e em um caso onde apenas uma sequência de interesse está presente. O termo “reservatório” como aqui usado refere-se a uma reação em um local predeterminado dentro de uma estrutura confinada, por exemplo, um frasco, célula ou câmara na forma de reservatório em um arranjo de PCR.

O termo “sequência de ácido nucléico clinicamente relevante” como aqui usado pode referir-se a uma sequência de polinucleotídeo que corresponde a um segmento de uma sequência genômica maior cujo desequilíbrio potencial está sendo testado ou à própria sequência genômica maior. Um exemplo é a sequência do cromossoma 21. Outros exemplos incluem o cromossoma 18, 13, X e Y. Outros exemplos incluem ainda sequências genéticas mutadas ou polimorfismos genéticos ou variações de número de cópia que um feto pode herdar de um ou ambos de seus pais. Ainda outros exemplos incluem sequências que são mutadas, deletadas ou amplificadas em um tumor maligno, por exemplo, sequências em que a perda de heterozigosidade ou duplicação de gene ocorrem. Em algumas formas de realização, sequências de ácido nucleico clinicamente relevantes múltiplas, ou marcadores equivalentemente múltiplos da sequência de ácido nucleico clinicamente relevantes, podem ser usados para fornecer dados para a detecção do desequilíbrio. Por exemplo, os dados de cinco sequências não consecutivas no cromossoma 21 podem ser usados em uma maneira aditiva para a determinação de possível desequilíbrio no cromossoma 21, reduzindo eficazmente a necessidade de volume de amostra para 1/5.

O termo “sequência de ácido nucleico de fundo” como aqui usado refere-se a uma sequência de ácido nucleico cuja razão normal para a sequência de ácido nucleico clinicamente relevante é conhecida, por exemplo, uma razão de 1 para 1. Como um exemplo, a sequência de ácido nucleico de fundo e a sequência de ácido nucleico clinicamente relevante são dois alelos do mesmo cromossoma que são distintos devido à heterozigosidade. Em um outro exemplo, a sequência de ácido nucleico de fundo é um alelo que é heterozigoto a um outro alelo que é a sequência de ácido nucleico clinicamente relevante. Além disso, alguns de cada uma das sequências de ácido nucleico de fundo e a sequência de ácido nucleico clinicamente relevante pode vir de indivíduos diferentes.

O termo “sequência de ácido nucleico de referência” como aqui usado refere-se a uma sequência de ácido nucleico cuja concentração média por reação é conhecida ou equivalentemente foi medida.

O termo “sequência de ácido nucleico excessivamente representada” como aqui usado refere-se à sequência de ácido nucleico entre duas sequências de interesse (por exemplo, uma sequência clinicamente relevante e uma sequência de fundo) que está em mais abundância do que a outra sequência em uma amostra biológica.

O termo “com base em” como aqui usado significa “com base pelo menos em parte em” e refere-se a um valor (ou resultado) que é usado na determinação de um outro valor, tal como ocorre na relação de uma entrada de um método e a saída deste método. O termo “derivam” como aqui usado também se referem à relação de uma entrada de um método e a saída deste método, tal como ocorre quando a derivação é o cálculo de uma fórmula.

O termo “dados quantitativos” como aqui usado significa dados que são obtidos a partir de uma ou mais reações e que fornecem um ou mais valores numéricos. Por exemplo, o número de reservatórios que mostram um marcador fluorescente para uma sequência particular seria um dado quantitativo.

O termo “parâmetro” como aqui usado significa um valor numérico que caracteriza um conjunto de dados quantitativos e/ou uma relação numérica entre conjuntos de dados quantitativos. Por exemplo, uma razão (ou função de uma razão) entre uma primeira quantidade de uma primeira sequência de ácido nucleico e uma segunda quantidade de uma segunda sequência de ácido nucleico é um parâmetro.

O termo “valor de corte” como aqui usado significa um valor numérico cujo valor é usado para arbitrar entre dois ou mais estados (por exemplo, doente e não doente) de classificação para uma amostra biológica. Por exemplo, se um parâmetro é maior do que o valor de corte, uma primeira classificação dos dados quantitativos é feita (por exemplo, estado doente); ou se o parâmetro é menor do que o valor de corte, uma classificação diferente dos dados quantitativos é feita (por exemplo, estado não doente).

O termo “desequilíbrio” como aqui usado significa qualquer desvio significante como definido por pelo menos um valor de corte em uma quantidade da sequência de ácido nucleico clinicamente relevante de uma quantidade de referência. Por exemplo, a quantidade de referência pode ser uma razão de 3/5 e assim um desequilíbrio ocorrería se a razão medida é 1:1.

O termo “aneuploidia cromossômica” como aqui usado significa uma variação na quantidade quantitativa de um cromossoma daquele de um genoma diplóide. A variação pode ser um ganho ou uma perda. Isto pode envolver o todo de um cromossoma ou uma região de um cromossoma.

O termo “sequenciamento aleatório” como aqui usado referese ao sequenciamento por meio do qual os fragmentos de ácido nucleico sequenciados não foram especificamente identificados ou alvejados antes do procedimento de sequenciamento. Iniciadores específicos de sequência para alvejar locais de gene específicos não são requeridos. As reuniões de ácidos nucleicos sequenciados variam de amostra para amostra e mesmo de análise para análise para a mesma amostra. As identidades dos ácidos nucleicos sequenciados são apenas reveladas a partir da saída de sequenciamento gerada. Em algumas formas de realização da presente invenção, o sequenciamento aleatório pode ser precedido pelos procedimentos para enriquecer uma amostra biológica com populações particulares de moléculas de ácido nucleico que compartilham certas características comuns. Em uma forma de realização, cada um dos fragmentos na amostra biológica tem uma probabilidade igual de ser sequenciada.

O termo “fração do genoma humano” ou “porção do genoma humano” como aqui usado refere-se a menos do que 100 % das sequências de nucleotídeo no genoma humano que compreende de alguns 3 bilhões de pares de base de nucleotídeos. No contexto de sequenciamento, isto se refere a uma cobertura de menos do que 1 vez das sequências de nucleotídeo no genoma humano. O termo pode ser expressado como uma porcentagem ou número absoluto de nucleotídeos/pares de base. Como um exemplo de uso, o termo pode ser usado para se referir à quantidade real de sequenciamento realizado. As formas de realização podem determinar o valor mínimo requerido para a fração sequenciada do genoma humano para se obter um diagnóstico preciso. Como um outro exemplo de uso, o termo pode se referir à quantidade de dados sequenciados usados para derivar um parâmetro ou quantidade para a classificação de doença.

O termo “rótulo sequenciado” como aqui usado refere-se a série de nucleotídeos sequenciados de qualquer parte ou toda de uma molécula de ácido nucleico. Por exemplo, um rótulo sequenciado pode ser uma série curta de nucleotídeos sequenciada de um fragmento de ácido nucleico, uma série curta de nucleotídeos em ambas as extremidades de um fragmento de ácido nucleico ou o sequenciamento do fragmento de ácido nucleico inteiro que existe na amostra biológica. Um fragmento de ácido nucleico é qualquer parte de uma molécula de ácido nucleico maior. Um fragmento (por exemplo, um gene) pode existir separadamente (isto é, não conectado) às outras partes da molécula de ácido nucleico maior.

DESCRIÇÃO DETALHADA

As formas de realização desta invenção fornecem métodos, sistemas e aparelhos para determinar se um aumento ou diminuição (estado doente) de uma região cromossômica clinicamente relevante existe comparado(a) com um estado não doente. Esta determinação pode ser feita pelo uso de um parâmetro de uma quantidade de uma região cromossômica clinicamente relevante em relação a outras regiões cromossômicas não clinicamente relevantes (regiões de fundo) dentro de uma amostra biológica. As moléculas de ácido nucleico da amostra biológica são sequenciadas, tal que uma fração do genoma é sequenciado e a quantidade pode ser determinada a partir dos resultados do sequenciamento. Um ou mais valores de corte são escolhidos para determinar se uma mudança comparada a uma quantidade de referência existe (isto é, um desequilíbrio), por exemplo, com respeito à razão de quantidades de duas regiões cromossômicas (ou conjuntos de regiões).

A mudança detectada na quantidade de referência pode ser qualquer desvio (para cima ou para baixo) na relação da sequência de ácido nucleico clinicamente relevante para as outras sequências não clinicamente relevantes. Assim, o estado de referência pode ser qualquer razão ou outra quantidade (por exemplo, outra que não uma correspondência de 1-1) e um estado medido significa que uma mudança pode ser qualquer razão ou outra quantidade que difere da quantidade de referência como determinada por um ou mais valores de corte.

A região cromossômica clinicamente relevante (também chamada de uma sequência de ácido nucleico clinicamente relevante) e a sequência de ácido nucleico de fundo pode se originar de um primeiro tipo de células e de um ou mais tipos secundários de células. Por exemplo, sequências de ácido nucleico fetais que se originam de células fetais/placentárias estão presentes em uma amostra biológica, tal como plasma materno, que contém um fundo de sequências de ácido nucleico maternas que se originam das células maternas. Em uma forma de realização, o valor de corte é determinado com base pelo menos em parte em uma porcentagem do primeiro tipo de células em uma amostra biológica. Observe que a porcentagem de sequências fetais em uma amostra pode ser determinada em qualquer local derivado do feto e não limitado a medir as sequências de ácido nucleico clinicamente relevantes. Em uma outra forma de realização, o valor de corte é determinado pelo menos em parte na porcentagem de sequências de tumor em uma amostra biológica, tal como plasma, soro, saliva ou urina, que contenha um fundo de sequências de ácido nucleico derivado das células não malignas dentro do corpo.

I. MÉTODO GERAL

A FIG. 1 é um diagrama de fluxo de um método 100 para realizar diagnóstico pré-natal de uma aneuploidia cromossômica fetal em uma amostra biológica obtida de uma paciente do sexo feminino gestante de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

Na etapa 110, uma amostra biológica da mulher gestante é recebida. A amostra biológica pode ser plasma, urina, soro ou qualquer outra amostra adequada. A amostra contém moléculas de ácido nucleico do feto e da mulher gestante. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico podem ser fragmentos de cromossomas.

Na etapa 120, pelo menos uma porção de uma pluralidade das moléculas de ácido nucleico contidas na amostra biológica é sequenciada. A porção sequenciada representa uma fração do genoma humano. Em uma forma de realização, as moléculas de ácido nucleico são fragmentos de cromossomas respectivos. Uma extremidade (por exemplo, 35 pares de base (bp)), ambas as extremidades ou o fragmento inteiro podem ser sequenciados. Todas as moléculas de ácido nucleico na amostra podem ser sequenciadas ou apenas um subconjunto pode ser sequenciado. Este subconjunto pode ser aleatoriamente escolhido, como será descrito em mais detalhes mais tarde.

Em uma forma de realização, o sequenciamento é feito usando sequenciamento maciçamente paralelo. Sequenciamento maciçamente paralelo, tal como aquele obtenível na plataforma 454 (Roche) (Margulies, M. et al. 2005 Nature 437, 376-380), Illumina Genome Analyzer (ou plataforma Solexa) ou SOLiD System (Applied Biosystems) ou a tecnologia de sequenciamento de DNA de Molécula Única Verdadeira Helicos (Harris TD et al. 2008 Science, 320, 106-109), a tecnologia de molécula única, em tempo real (SMRT®) da Pacific Biosciences e sequenciamento de nanoporo (Soni GV e Meller A. 2007 Clin Chem 53: 1996-2001), permite o sequenciamento de muitas moléculas de ácido nucleico isoladas de um espécime em altas ordens de multiplexação em uma maneira paralela (Dear Brief Funct Genomic Proteomic 2003; 1: 397-416). Cada uma destas plataformas sequencia moléculas clonalmente expandidas ou mesmo únicas não amplificadas de fragmentos de ácido nucleico.

Como um alto número de leituras de sequenciamento, da ordem de centenas de milhares a milhões ou ainda possivelmente centenas de milhões ou bilhões, é gerado de cada amostra em cada rodada, as leituras sequenciadas resultantes formam um perfil representativo da mistura de espécies de ácido nucleico no espécime original. Por exemplo, o haplotipo, trascriptoma e perfis de metilação das leituras sequenciada se parecem com aqueles do espécime original (Brenner et al Nat Biotech 2000; 18: 630-634; Taylor et al Cancer Res 2007; 67: 8511-8518). Devido à amostragem grande de sequências de cada espécime, o número de sequências idênticas, tais como aquelas geradas do sequenciamento de uma reunião de ácido nucleico em diversas vezes de cobertura ou alta redundância, também é uma boa representação quantitativa da contagem de uma espécie ou local de ácido nucleico particular na amostra original.

Na etapa 130, com base no sequenciamento (por exemplo, os dados do sequenciamento), uma primeira quantidade de um primeiro cromossoma (por exemplo, o cromossoma clinicamente relevante) é determinada. A primeira quantidade é determinada a partir das sequências identificadas como originando do primeiro cromossoma. Por exemplo, um procedimento de bioinformática depois pode ser usado para localizar cada uma destas sequências de DNA para o genoma humano. É possível que uma proporção de tais sequências seja descartada da análise subsequente porque elas estão presentes nas regiões repetidas do genoma humano ou em regiões submetidas às variações inter-individuais, por exemplo, variações de número de cópia. Uma quantidade do cromossoma de interesse e de um ou mais outros cromossomas pode ser assim determinada.

Na etapa 140, com base no sequenciamento, uma segunda quantidade de um ou mais cromossomas secundários é determinada a partir das sequências identificadas como originando de um dos cromossomas secundários. Em uma forma de realização, os cromossomas secundários são todos dos outros cromossomas além do primeiro (isto é, o que é testado). Em uma outra forma de realização, o segundo cromossoma é apenas um outro cromossoma único.

Existem vários modos de determinar as quantidades dos cromossomas, incluindo mas não limitado a contar o número de rótulos sequenciados, o número de nucleotídeos sequenciados (pares de base) ou os comprimentos acumulados de nucleotídeos sequenciados (pares de base) originando de cromossoma(s) ou regiões cromossômicas particulares.

Em uma outra forma de realização, as regras podem ser impostas nos resultados do sequenciamento para determinar o que é contado. Em um aspecto, uma quantidade pode ser obtida com base em uma proporção da saída sequenciada. Por exemplo, a saída de sequenciamento que corresponde aos fragmentos de ácido nucleico de uma faixa de tamanho especificada seria selecionada depois da análise de bioinformática. Os exemplos das faixas de tamanho são de cerca de < 300 bp, < 200 bp ou < 100 bp.

Na etapa 150, um parâmetro é determinado da primeira quantidade e da segunda quantidade. O parâmetro pode ser, por exemplo, uma razão simples da primeira quantidade para a segunda quantidade ou da primeira quantidade para a segunda quantidade mais a primeira quantidade. Em um aspecto, cada quantidade seria um argumento para uma função ou funções separadas, onde uma razão pode ser depois tirada destas funções separadas. Uma pessoa habilitada na técnica avaliará o número de parâmetros adequados diferentes.

Em uma forma de realização, um parâmetro (por exemplo, uma representação fracionária) de um cromossoma potencialmente envolvido em uma aneuploidia cromossômica, por exemplo, cromossoma 21 ou cromossoma 18 ou cromossoma 13, pode ser depois calculado a partir dos resultados do procedimento de bioinformáticas. A representação fracionária pode ser obtida com base em uma quantidade de todas as sequências (por exemplo, algumas medidas de todos os cromossomas incluindo o cromossoma clinicamente relevante) ou um subconjunto particular de cromossomas (por exemplo, apenas um outro cromossoma além daquele que é testado).

Na etapa 150, o parâmetro é comparado a um ou mais valores de corte. Os valores de corte podem ser determinados a partir de qualquer número de modos adequados. Tais modos incluem o método da probabilidade do tipo Bayesian, teste da razão da probabilidade sequencial (SPRT), descoberta falsa, intervalo de confidência, características de operação de recebedor (ROC). Os exemplos de aplicações destes métodos e métodos específicos de amostra são descritos no pedido concorrentemente depositado “DETERMINING A NUCLEIC ACID SEQUENCE INBALANCE,” (Documento do Representante N° 016285-005210US), que é incorporado por referência.

Em uma forma de realização, o parâmetro (por exemplo, a representação fracionária do cromossoma clinicamente relevante) é depois comparado a uma faixa de referência estabelecida em gestações envolvendo fetos normais (isto é, euploida). É possível que em algumas variantes do procedimento, a faixa de referência (isto é, os valores de corte) seria ajustada de acordo com a concentração DNA fetal fracionário (f) em uma amostra de plasma materno particular. O valor de f pode ser determinado a partir do conjunto de dados de sequenciamento, por exemplo, usando sequências mapeáveis para o cromossoma Y se o feto for masculino. O valor de f também pode ser determinado em uma análise separada, por exemplo, usando marcadores epigenéticos fetais (Chan KCA et al 2006 Clin Chem 52, 2211-8) ou a partir da análise de polimorfismos de nucleotídeo único.

Na etapa 160, com base na comparação, uma classificação de se uma aneuploidia cromossômica fetal existe para o primeiro cromossoma é determinada. Em uma forma de realização, a classificação é um sim ou não definitivo. Em uma outra forma de realização, uma classificação pode ser desclassificável ou incerta. Já em uma outra forma de realização, a classificação pode ser uma contagem que deva ser interpretada em uma data posterior, por exemplo, por um médico.

II. SEQUENCIAMENTO, ALINHAMENTO E DETERMINAÇÃO DE QUANTIDADES

Como mencionado acima, apenas uma fração do genoma é sequenciado. Em um aspecto, mesmo quando uma reunião de ácidos nucleicos em um espécime é sequenciada a < 100 % de cobertura genômica ao invés de em diversas vezes de cobertura e entre a proporção de moléculas de ácido nucléico capturadas, a maior parte de cada espécie de ácido nucléico é apenas sequenciada uma vez. Também, o desequilíbrio de dosagem de um cromossoma particular ou regiões cromossômicas pode ser quantitativamente determinada. Em outras palavras, o desequilíbrio de dosagem do cromossoma ou regiões cromossômicas é deduzido da representação percentual do dito local entre outros rótulos mapeáveis sequenciados do espécime.

Isto é contrastado de situações onde a mesma reunião de ácidos nucleicos é sequenciada múltiplas vezes para se obter alta redundância ou diversas vezes de cobertura por meio da qual cada espécie de ácido nucléico é sequenciada múltiplas vezes. Em tais situações, o número de vezes que uma espécie de ácido nucléico particular foi sequenciada em relação àquela de uma outra espécie de ácido nucléico correlaciona-se com as suas concentrações relativas na amostra original. O custo de sequenciamento aumenta com o número de vezes de cobertura requerido para se obter representação precisa da espécie de ácido nucléico.

Em um exemplo, uma proporção de tais sequências seria do cromossoma envolvido em uma aneuploidia tal como o cromossoma 21 neste exemplo ilustrativo. Já outras sequências de um tal exercício de sequenciamento seriam derivadas dos outros cromossomas. Levando-se em conta o tamanho relativo do cromossoma 21 comparado com os outros cromossomas, poder-se-ia obter uma frequência normalizada, dentro de uma faixa de referência, de sequências específicas do cromossoma 21a partir de um tal exercício de sequenciamento. Se o feto tem trissomia 21, então a frequência normalizada de sequências derivadas do cromossoma 21 de um tal exercício de sequenciamento aumentará, permitindo assim a detecção da trissomia 21. O grau de mudança na frequência normalizada será dependente da concentração fracionária de ácidos nucleicos fetais na amostra analisada.

Em uma forma de realização, nós usamos o Illumina Genome Analyzer para o sequenciamento de extremidade única de DNA genômico humano e amostras de DNA de plasma humano. As moléculas de DNA único clonalmente expandidas em sequências no Illumina Genome Analyzer capturadas em uma superfície sólida chamada de uma célula de fluxo. Cada célula de fluxo tem 8 linhas para o sequenciamento de 8 espécimes ou agrupamento de espécimes individuais. Cada linha é capaz de gerar ~ 200 Mb de sequência que é apenas uma fração dos 3 bilhões de pares de base de sequências no genoma humano. Cada DNA genômico ou amostra de DNA plasmático foi sequenciado usando uma linha de uma célula de fluxo. Os rótulos de sequência curta gerados foram alinhados com a sequência de genoma de referência humano e a origem do cromossoma foi anotadas. O número total de rótulos individuais sequenciados alinhados a cada cromossoma foram tabulados e comparados com o tamanho relativo de cada cromossoma como esperado do genoma de referência humano ou espécimes representativos não doentes. Os ganhos ou perdas de cromossoma foram depois identificados.

O método descrito é apenas uma exemplificação da estratégia de dosagem de gene/cromossoma presentemente descrita. Altemativamente, o sequenciamento de extremidade emparelhada pode ser realizado. Ao invés de comparar o comprimento dos fragmentos sequenciados daquele esperado no genoma de referência como descrito por Campbell et al (Nat Genet 2008; 40: 722-729), o número de rótulos sequenciados alinhados foi contado e classificado de acordo com a localização de cromossoma. Os ganhos ou perdas das regiões cromossômicas ou cromossomas inteiros foram determinados comparando-se as contagens de rótulo com o tamanho de cromossona esperado no genoma de referência ou aquele de um espécime representativo não doente. Como sequenciamento de extremidade emparelhado permite que se deduza o tamanho do fragmento de ácido nucleico original, um exemplo é focalizar na contagem do número de rótulos sequenciados emparelhados que correspondem aos fragmentos de ácido nucleico de um tamanho especificado, tal como < 300 bp, < 200 bp ou < 100 bp.

Em uma outra forma de realização, a fração da reunião de ácido nucleico que é sequenciada em uma rodada é ainda sub-selecionada antes do sequenciamento. Por exemplo, a hibridização com base em técnicas tais como arranjo de oligonucleotídeo pode ser usada para primeiro subselecionar quanto a sequências de ácido nucleico de certos cromossomas, por exemplo, um cromossoma potencialmente aneuplóide e outro(s) cromossoma(s) não envolvidos na aneuploidia testada. Um outro exemplo é que uma certa sub-população de sequências de ácido nucleico da reunião de amostra é sub-selecionada ou enriquecida antes do sequenciamento. Por exemplo, como debatido acima, foi relatado que as moléculas de DNA fetal no plasma materno são compreendidas de fragmentos mais curtos do que as moléculas de DNA de fundo materno (Chan et al Clin Chem 2004; 50: 8892). Assim, pode-se usar um ou mais métodos conhecidos por aqueles de habilidade na técnica para fracionar as sequências de ácido nucleico na amostra de acordo com o tamanho da molécula, por exemplo, pela eletroforese em gel ou colunas de exclusão de tamanho ou pelos métodos com base ma microfluídica. Contudo, alternativamente, no exemplo de analisar DNA fetal isento de célula no plasma materno, a porção de ácido nucleico fetal pode ser enriquecida por um método que suprime o fundo materno, tal como pela adição de formaldeído (Dhallan et al JAMA 2004; 291: 1114-9). Em uma forma de realização, uma porção ou subconjunto da reunião pré23 selecionada de ácidos nucleicos é sequenciada aleatoriamente.

Outras estratégias de sequenciamento de molécula única tal como aquela pela plataforma Roche 454, pela plataforma SOLiD da Applied Biosystems, a tecnologia de sequenciamento de Molécula DNA Única 5 Helicos True, a tecnologia de molécula única, em tempo real (SMRT®) da Pacific Biosciences e sequenciamento de nanoporo podem ser similarmente usadas neste pedido.

III. DETERMINAÇÃO DAS QUANTIDADES DE CROMOSSOMAS DA SAÍDA DE SEQUENCIAMENTO [0074] Depois do sequenciamento maciçamente paralelo, a análise de bioinformática foi realizada para localizar a origem do cromossoma dos rótulos sequenciados. Depois deste procedimento, os rótulos identificados como originando do cromossoma potencialmente aneuplóide, isto é, cromossoma 21 neste estudo, são comparados quantitativamente com todos os 15 rótulos sequenciados ou rótulos que se originam de um ou mais cromossomas não envolvidos na aneuploidia. A relação entre a saída de sequenciamento do cromossoma 21 e outros cromossomas que não o 21 para um espécime de teste é comparado com valores de corte derivados com os métodos descritos na seção acima para determinar se o espécime foi obtido de uma gestação 20 envolvendo um feto euplóide ou com trissomia 21.

Um número de quantidades diferentes inclui mas não é limitado aos seguintes pode ser derivado dos rótulos sequenciados. Por exemplo, o número de rótulos sequenciados, isto é, a contagem absoluta, alinhada a um cromossoma particular pode ser comparado à contagem 25 absoluta de rótulos sequenciados alinhados a outros cromossomas.

Altemativamente, a contagem fracionária da quantidade de rótulos sequenciados do cromossoma 21 com referência a todos ou algum outro dos rótulos sequenciados pode ser comparada com aquela de outros cromossomas não aneuplóides. No presente experimento, porque 36 bp foram sequenciados de cada fragmento de DNA, o número de nucleotídeos sequenciado de um cromossoma particular pode ser facilmente derivado de 36 bp multiplicado pela contagem de rótulo sequenciado.

Além disso, como cada espécime de plasma materno foi sequenciado apenas usando uma célula de fluxo que pode sequenciar apenas uma fração do genoma humano, pelas estatísticas, a maior parte das espécies de fragmento de DNA de plasma materno podería apenas cada um Ter sido sequenciado para gerar uma contagem de rótulo sequenciado. Em outras palavras, os fragmentos de ácido nucleico presentes no espécime de plasma 10 materno foram sequenciados em cobertura de menos do que 1 vez. Assim, o ♦· * número total de nucleotídeos sequenciados para qualquer cromossoma particular correspondería principalmente à quantidade, proporção ou comprimento da parte do dito cromossoma que foi sequenciado. Por este motivo, a determinação quantitativa da representação do cromossoma 15 potencialmente aneuplóide seria derivado de uma fração do número ou comprimento equivalente de nucleotídeos sequenciados daquele cromossoma com referência a uma quantidade similarmente derivada para outros cromossomas.

IV. ENRIQUECIMENTO PARA REUNIÕES DE ÁCIDOS NUCLEICOS 20 PARA SEQUENCIAMENTO

Como mencionado acima e estabelecido na seção de exemplo abaixo, apenas uma porção do genoma humano precisa ser sequenciada para diferenciar a trissomia 21 de casos euplóides. Assim, seria possível e eficaz em custo enriquecer a reunião de ácidos nucleicos a serem sequenciados antes 25 do sequenciamento aleatório de uma fração da reunião enriquecida. Por exemplo, as moléculas de DNA fetal no plasma materno são compreendidas de fragmentos mais curtos do que as moléculas de DNA de fundo materno (Chan et al Clin Chem 2004; 50: 88-92). Assim, pode-se usar um ou mais métodos conhecidos por aqueles de habilidade na técnica para fracionar as sequências de ácido nucleico na amostra de acordo com o tamanho da molécula, por exemplo, pela eletroforese em gel ou colunas de exclusão de tamanho ou pelos métodos com base na microfluídica.

Contudo, altemativamente, no exemplo de analisar DNA fetal isento de célula no plasma materno, a porção de ácido nucleico fetal pode ser enriquecida por um método que suprime o fundo materno, tal como pela adição de formaldeído (Dhallan et al JAMA 2004; 291: 1114-9). A proporção de sequências derivadas de feto pode ser enriquecida na reunião de ácido nucleico compreendida de fragmentos mais curtos. De acordo com a FIG. 7, o 10 número de rótulos sequenciados requeridos para diferenciar os casos de euploidia dos de trissomia 21 reduziría conforme a concentração DNA fetal fracionário aumenta.

Altemativamente, as sequências originando de um cromossoma potencialmente aneuplóide e um ou mais cromossomas não 15 envolvidos na aneuploidia podem ser enriquecidos pelas técnicas de hibridização, por exemplo, em microarranjos de oligonucleotídeo. As reuniões enriquecidas de ácidos nucleicos seriam depois submetidas ao sequenciamento aleatório. Isto permitiría a redução nos custos de sequenciamento.

V, SEQUENCIAMENTO ALEATÓRIO

A FIG. 2 é um diagrama de fluxo de um método 200 para realizar diagnóstico pré-natal de uma aneuploidia cromossômica fetal usando sequenciamento aleatório de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Em um aspecto para o método de sequenciamento maciçamente 25 paralelo, os dados representativos de todos os cromossomas podem ser gerados ao mesmo tempo. A origem de um fragmento particular não é selecionado antes do tempo. O sequenciamento é feito aleatoriamente e depois uma pesquisa de base de dados pode ser realizada para observar de onde um fragmento particular é proveniente. Isto está contrastado de situações quando um fragmento específico do cromossoma 21 e um outro do cromossoma 1 são amplificados.

Na etapa 210, uma amostra biológica da mulher gestante é recebida. Na etapa 220, o número N de sequências a ser analisado é calculado 5 para uma precisão desejada. Em uma forma de realização, uma porcentagem de DNA fetal na amostra biológica é primeiro identificada. Isto pode ser feito por qualquer meio adequado como será conhecido por uma pessoa habilitada na técnica. A identificação pode ser simplesmente a leitura de um valor que foi medido por uma outra entidade. Nesta forma de realização, o cálculo do 10 número N de sequências a serem analisadas está fundamentado na porcentagem. Por exemplo, o número de sequências necessárias a serem analisadas seria aumentado quando a porcentagem de DNA fetal cai e seria diminuída quando o DNA fetal sobe. O número N pode ser um número fixo ou um número relativo, tal como uma porcentagem. Em uma outra forma de 15 realização, sequenciar-se-ia um número N que fosse conhecido ser adequado para o diagnóstico de doença preciso. O número N pode ser feito suficiente mesmo em gestações com concentrações de DNA fetal que estão na extremidade inferior da faixa normal.

Na etapa 230, pelo menos N de uma pluralidade das moléculas 20 de ácido nucleico contidas na amostra biológica é aleatoriamente sequenciado. Uma característica deste método descrito é que os ácidos nucléicos a serem sequenciados não são especificamente identificados ou alvejados antes da análise da amostra, isto é, sequenciamento. Iniciadores específicos de sequência para alvejar locais de gene específicos não são 25 necessários para o sequenciamento. Os grupos de ácidos nucléicos sequenciados varia de amostra para amostra e mesmo de análise para análise para a mesma amostra. Além disso, das descrições abaixo (FIG. 6), a quantidade de saída de sequenciamento requerido para o diagnóstico de casos variaria entre os espécimes testados e a população de referência. Estes aspectos estão em contraste acentuado com a maioria dos métodos de diagnóstico molecular, tal como aqueles com base na hibridização in situ em fluorescência, PCR de fluorescência quantitativa, PCR quantitativa em tempo real, PCR digital, hibridização genômica comparativa, hibridização genômica comparativa de microarranjo e assim por diante, onde os locais de gene a serem alvejados requerem antes a predeterminação, requerendo assim o uso de iniciadores específicos de local ou conjuntos de sonda ou painéis de tal.

Em uma forma de realização, o sequenciamento aleatório é realizado em fragmentos de DNA que estão presentes no plasma de uma mulher gestante e pode-se obter sequências genômicas que originalmente originar-se-iam do feto ou da mãe. O sequenciamento aleatório envolve amostragem (sequenciamento) de uma porção aleatória das moléculas de ácido nucleico presentes na amostra biológica. Como o sequenciamento é aleatório, um subconjunto diferente (fração) das moléculas de ácido nucleico (e assim do genoma) pode ser sequenciado em cada análise. Formas de realização funcionarão mesmo quando este subconjunto varia de amostra para amostra e de análise para análise, que pode ocorrer mesmo usando a mesma amostra. Os exemplos da fração são de cerca de 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 %, 20 % ou 30 % do genoma. Em outras formas de realização, a fração é pelo menos qualquer um destes valores.

O resto das etapas 240-270 pode prosseguir em uma maneira similar como o método 100.

VI. SELEÇÃO PÓS-SEQUENCIAMENTO DE REUNIÕES DE RÓTULOS SEQUENCIADOS

Como descrito nos exemplos II e III abaixo, um subconjunto dos dados sequenciados é suficiente para distinguir a trissomia 21 de casos euplóides. O subconjunto de dados sequenciados pode ser a proporção de rótulos sequenciados que passaram certos parâmetros de qualidade. Por exemplo, no exemplo II, os rótulos sequenciados que foram exclusivamente alinhados ao genoma humano de referência mascarado com repetição foram usados. Altemativamente, pode-se sequenciar uma reunião representativa de fragmentos de ácido nucleico de todos os cromossomas, mas focaliza na comparação entre os dados relevantes ao cromossoma potencialmente aneuplóide e os dados relevantes a um número de cromossomas não aneuplóide.

Contudo altemativamente, um subconjunto da saída de sequenciamento abrangendo rótulos sequenciados gerados a partir dos fragmentos de ácido nucleico que correspondem a uma janela de tamanho especificado no espécime original pode ser sub-selecionado durante a análise de pós-sequenciamento. Por exemplo, usando o analisador Illumina Genome, poder-se-ia usar sequenciamento de extremidade emparelhada que se refere a sequenciamento das duas extremidades de fragmentos de ácido nucleico. Os dados sequenciados de cada extremidade emparelhada são depois alinhados com a sequência do genoma humano de referência. A distância ou número de nucleotídeos que transpõem entre as duas extremidades seriam depois deduzidos. O comprimento total do fragmento de ácido nucleico original também pode ser deduzido. Altemativamente, as plataformas de sequenciamento tais como a plataforma 454 e possivelmente algumas técnicas de sequenciamento de molécula única são capazes de sequenciar o comprimento inteiro de fragmentos de ácido nucleico curtos, por exemplo, 200 pares de base. Desta maneira, o comprimento real do fragmento de ácido nucleico seria imediatamente conhecido a partir dos dados sequenciados.

Tal análise de extremidade emparelhada também é possível usando outras plataformas de sequenciamento, por exemplo, o sistema SOLiD da Applied Biosystems. Para a plataforma Roche 454, por causa do seu comprimento de leitura aumentado comparado com outros sistemas de sequenciamento maciçamente paralelo, também é possível determinar o comprimento de um fragmento da sua sequência completa.

A vantagem de focalizar a análise de dados no subconjunto de rótulos sequenciados que correspondem aos fragmentos de ácido nucleico curtos no espécime de plasma materno original por causa do conjunto de dados eficazmente seria enriquecido com sequências de DNA derivadas do feto. Isto é porque as moléculas de DNA fetal no plasma materno são compreendidas de fragmentos mais curtos do que as moléculas de DNA de fundo materno (Chan et al Clin Chem 2004; 50: 88-92). De acordo com a FIG. 7, o número de rótulos sequenciados requeridos parra diferenciar casos de euploidia dos de trissomia 21 reduziría conforme a concentração DNA fetal fracionário aumenta.

A seleção de pós-sequenciamento de subconjuntos de reuniões de ácido nucleico é diferente de outras estratégias de enriquecimento de ácido nucleico que são realizadas antes da análise de espécime, tal como o uso da eletroforese em gel ou colunas de exclusão de tamanho para a seleção de ácidos nucléicos de tamanhos particulares, que requerem a separação física da reunião enriquecida da reunião de fundo de ácidos nucléicos. Os procedimentos físicos introduziríam mais etapas experimentais e podem estar propensos aos problemas tais como contaminação. A seleção in silico póssequenciamento de subconjuntos de entrada de sequenciamento também permitiría que se variasse a seleção dependendo da sensibilidade e especificidade requeridos para a determinação de doença.

A bioinformática, métodos computacionais e estatísticos usados para determinar se um espécime de plasma materno é obtido de uma mulher gestante concebida com um feto com trissomia 21 ou euploidia pode ser compilado em um produto de programa de computador usado para determinar parâmetros da saída de sequenciamento. A operação do programa de computador envolvería a determinação de uma quantidade quantitativa do cromossoma potencialmente aneuplóide assim como quantidade(s) de um ou mais dos outros cromossomas. Um parâmetro seria determinado e comparado com valores de corte apropriados para determinar se uma aneuploidia cromossômica fetal existe para o cromossoma potencialmente aneuplóide.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada.

I. DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL DE TRISSOMIA 21 FETAL

Oito mulheres gestantes foram recrutadas para o estudo. Todas as mulheres gestantes estavam no l°ou 2^o trimestre de gestação e tiveram uma gestação única. Quatro delas estavam cada uma carregando um feto com trissomia 21 e as outras quatro estavam cada uma carregando um feto euplóide. Vinte mililitros de sangue venoso periférico foram coletados de cada paciente. O plasma materno foi colhido depois de centrifugação a 1600 x g por 10 minutos e centrifugado ainda a 16000 x g por 10 minutos. O DNA foi depois extraído de 5-10 ml de cada amostra de plasma. O DNA do plasma materno foi depois usado para o sequenciamento maciçamente paralelo pela Analisador Illumina Genome de acordo com as instruções do fabricante. Os técnicos que realizaram o sequenciamento foram cegos dos diagnósticos fetais durante o sequenciamento e análise de dados de sequência.

Em resumo, aproximadamente 50 ng de DNA de plasma materno foi usado para a preparação de biblioteca de DNA. É possível começar com quantidades menores tais como 15 ng ou 10 ng de DNA de plasma materno. Os fragmentos de DNA de plasma materno foram abruptamente terminados, ligados a adaptadores Solexa e fragmentos de 150 a 300 pares de base foram selecionados pela purificação em gel. Altemativamente, os fragmentos de DNA de plasma materno abruptamente terminados e ligados a adaptador podem ser passados através de colunas (por exemplo, AMPure, Agencourt) para remover adaptadores não ligados sem seleção de tamanho antes da geração de grupo. O DNA ligado a adaptador foi hibridizado à superfície de células de fluxo e grupos de DNA foram gerados usando a estação de aglomeração Illumina, seguido por 36 ciclos de sequenciamento no Analisador Illumina Genome. O DNA de cada espécime de plasma materno foi sequenciado por uma célula de fluxo. As leituras sequenciadas foram compiladas usando a Fonte de Informação de Análise Solexa. Todas as leituras foram depois alinhadas com a sequência genômica humana de referência mascarada com repetição, a montagem NCBI 36 (números de acesso no GenBank: NC 000001 a NC 000024), usando a aplicação Eland.

Neste estudo, para reduzir a complexidade da análise de dados, apenas sequências que foram mapeadas para uma única localização na referência de genoma humano mascarado em repetição são ainda considerados. Outros subconjuntos ou o conjunto inteiro dos dados sequenciados puderam ser altemativamente usados. O número total de sequências unicamente mapeadas para cada espécime foi contado. O número de sequências unicamente alinhadas para o cromossoma 21 foi expressada como uma proporção para a contagem total de sequências alinhadas para cada espécime. Como o plasma materno contém DNA fetal entre um fundo de DNA de origem materna, o feto com a trissomia 21 contribuiría com rótulos sequenciados extras que se originam do cromossoma 21 devido à presença de uma cópia extra do cromossoma 21 no genoma fetal. Por este motivo, a porcentagem de sequências do cromossoma 21 no plasma materno de uma gestação que carrega um feto com a trissomia 21 seria mais alta do que aquela de uma gestação com um feto euplóide. A análise não requer o alvejamento de sequências específicas de feto. A mesma também não requer a separação física anterior de ácidos nucleicos fetais dos matemos. A mesma também não requer a necessidade de distinguir ou identificar sequências fetais das maternas depois do sequenciamento.

A FIG. 3A mostra a porcentagem de sequências mapeadas para o cromossoma 21 (representação percentual do cromossoma 21) para cada uma das 8 amostras de DNA do plasma materno. A representação percentual do cromossoma 21 foi significantemente mais alta no plasma materno de gestações com a trissomia 21 do que naquele de gestações euplóides. Estes dados sugerem que o diagnóstico pré-natal não invasivo de aneuploidia fetal pode ser obtido pela determinação da representação percentual do cromossoma aneuplóide comparado com aquele de uma população de referência. Altemativamente, a representação excessiva do cromossoma 21 pôde ser detectada comparando-se a representação percentual do cromossoma 21 obtido experimentalmente com a representação percentual das sequências do cromossoma 21 esperada para um genoma humano euplóide. Isto pode ser feito mascarando-se ou não se mascarando as regiões repetidas no genoma humano.

Cinco das oito mulheres gestantes estavam cada um carregando um feto do sexo masculino. As sequências mapeadas para o cromossoma Y podem ser específicas do feto. A porcentagem de sequências mapeadas para o cromossoma Y foi usada para calcular a concentração fracionária do DNA fetal no espécime de plasma materno original. Além disso, a concentração DNA fetal fracionário também foi determinada pelo uso da PCR digital microfluídica envolvendo os genes parálogos de proteína de dedo de zinco, ligado a X (ZFX) e proteína de dedo de zinco, ligada a Y (ZFY).

A FIG. 3B mostra a correlação das concentrações de DNA fetal fracionário como deduzida pela representação percentual do cromossoma Y pelo sequenciamento e aquela determinada pela PCR digital microfluídica ZFY/ZFX. Houve uma correlação positiva entre as concentrações de DNA fetal fracionário no plasma materno determinadas por estes dois métodos. O coeficiente de correlação (r) foi 0,917 na análise de correlação de Pearson.

As porcentagens de sequências de DNA de plasma materno alinhados a cada um dos 24 cromossomas (22 autossomas e cromossomas X e

Y) para dois casos representativos são mostradas na FIG. 4A. Uma mulher gestante estava carregando um feto com a trissomia 21 e a outra estava carregando um feto euplóide. A representação percentual de sequências mapeadas para o cromossoma 21 é mais alta na mulher gestante que carrega um feto com a trissomia 21 quando comparada com a mulher gestante que carrega um feto normal.

As diferenças (%) da representação percentual por cromossoma entre os espécimes de DNA de plasma materno dos dois casos acima são mostradas na FIG. 4B. A diferença percentual para um cromossoma particular é calculada usando a fórmula abaixo:

Diferença percentual (%) = (P₂r P_E)/ Pe x 100 %, onde

P₂i = porcentagem de sequências de DNA plasmático alinhadas com o cromossoma particular na mulher gestante que carrega um feto com a trissomia 21 e;

P_E = porcentagem de sequências de DNA plasmático alinhadas com o cromossoma particular na mulher gestante que carrega um feto euplóide.

Como mostrado na FIG. 4B, existe uma representação excessiva das sequências do cromossoma 21 em 11 % no plasma da mulher gestante que carrega um feto com a trissomia 21 quando comparada com a mulher gestante que carrega um feto euplóide. Para as sequências alinhadas a outros cromossomas, as diferenças entre os dois casos estavam dentro de 5 %. Como a representação percentual para o cromossoma 21 é aumentada na trissomia 21 comparado com as amostras de plasma materno euplóides, a diferença (%) pode ser altemativamente aludida como o grau de representação excessiva nas sequências do cromossoma 21. Além das diferenças (%) e diferenças absolutas entre a representação percentual do cromossoma 21, as razões das contagens das amostras de teste e referência também podem ser calculadas e são indicativas do grau de representação excessiva do cromossoma 21 na trissomia 21 comparada com amostras euplóides.

Para as quatro mulheres gestantes cada uma carregando um feto euplóide, uma média de 1,345 % de suas sequências de DNA plasmático foram alinhadas para o cromossoma 21. Nas quatro mulheres gestantes que carregam um feto com a trissomia 21, três de seus fetos foram do sexo masculino. A representação percentual do cromossoma 21 foi calculada para cada um destes três casos. A diferença (%) na representação percentual do cromossoma 21 para cada um destes três casos de trissomia 21 da representação percentual do cromossoma 21 média derivada de valores dos quatro casos euplóide foi determinada como descrito acima. Em outras palavras, a média dos quatro casos que carregam um feto euplóide foi usada como a referência neste cálculo. As concentrações de DNA fetal fracionário para estes três casos de trissomia 21 do sexo masculino foram deduzidas da sua respectiva representação percentual de sequências de cromossoma Y.

A correlação entre o grau de representação excessiva para sequências do cromossoma 21 e as concentrações de DNA fetal fracionário é mostrada na FIG. 5. Houve uma correlação positiva significante entre os dois parâmetros. O coeficiente de correlação (r) foi 0,898 na análise de correlação de Pearson. Estes resultados indicam que o grau de representação excessiva de sequências do cromossoma 21 no plasma materno está relacionado com a concentração fracionária de DNA fetal na amostra de plasma materno. Assim, os valores de corte no grau de representação excessiva da sequência do cromossoma 21 relevante para as concentrações de DNA fetal fracionário puderam ser determinados para identificar gestações envolvendo fetos com a trissomia 21.

A determinação da concentração fracionária de DNA fetal no plasma materno também pode ser feita separada da rodada de sequenciamento. Por exemplo, a concentração de DNA do cromossoma Y pode ser predeterminada usando a PCR em tempo real, PCR microfluídica ou espectrometria de massa. Por exemplo, nós demonstramos na FIG. 3B que existe boa correlação entre as concentrações de DNA fetal estimada com base na contagem do cromossoma Y gerada durante a rodada de sequenciamento e a razão ZFY/ZFX extemamente gerada em relação à rodada de sequenciamento. De fato, a concentração de DNA fetal pôde ser determinada usando locais outro que não o cromossoma Y e aplicável aos fetos do sexo feminino. Por exemplo, Chan et al mostraram que as sequências de RASSF1A metiladas derivadas de feto podem ser detectadas no plasma de mulheres gestantes no fundo de sequências de RASSF1A não metiladas matemalmente derivadas (Chan et al, Clin Chem 2006;52:2211-8). A concentração de DNA fetal fracionário pode ser assim determinada dividindose a quantidade de sequências de RASSF1A metiladas pela quantidade de sequências RASSF1A total (metiladas e não metiladas).

E esperado que o plasma materno possa ser preferido em relação ao soro materno para praticar nossa invenção porque o DNA é liberado das células de sangue materno durante a coagulação do sangue. Assim, se soro é usado, é esperado que a concentração fracionária de DNA fetal seja mais baixa no plasma materno do no soro materno. Em outras palavras, se soro materno é usado, é esperado que mais sequências necessitem ser geradas para a aneuploidia cromossômica fetal ser diagnosticada, quando comparado com uma amostra de plasma obtida da mesma mulher gestante ao mesmo tempo.

Já um outro modo alternativo de determinar a concentração fracionária de DNA fetal seria através da quantificação de diferenças polimórficas entre a mulher gestante e o feto (Dhallan R, et al. 2007 Lancet, 369, 474-481). Um exemplo deste método seria alvejar sítios polimórficos no qual a mulher gestante é homozigota e o feto é heterozigoto. A quantidade de alelo específico do feto pode ser comparada com a quantidade do alelo comum para determinar a concentração fracionária de DNA fetal.

Ao contrário das técnicas existentes para a detecção de aberrações cromossômicas, incluindo a hibridização genômica comparativa, hibridização genômica comparativa de microarranjo, reação da cadeia da polimerase em tempo real quantitativa, que detecta e quantifica uma ou mais sequência(s) específica(s), o sequenciamento maciçamente paralelo não é dependente da detecção ou análise de conjunto predeterminado ou um prédefinido de sequências de DNA. Uma fração representativa aleatória de moléculas de DNA do grupo de espécime é sequenciada. O número de rótulos sequenciados alinhados diferentes para várias regiões cromossômicas é comparado entre espécimes contendo ou não contendo a espécie de DNA de interesse. As aberrações cromossômicas seriam reveladas pelas diferenças no número (ou porcentagem) de sequências alinhadas para qualquer região cromossômica dada nos espécimes.

Em um outro exemplo a técnica de sequenciamento no DNA isento de célula plasmático pode ser usada para detectar as aberrações de cromossoma no DNA plasmático para a detecção de um câncer específico. Cânceres diferentes têm um conjunto de aberrações cromossômicas típico. As mudanças (amplificações e deleções) em múltiplas regiões cromossômicas podem ser usadas. Assim, havería uma proporção aumentada de sequências alinhadas com as regiões amplificadas e uma proporção diminuída de sequências alinhadas com as regiões diminuídas. A representação percentual por cromossoma pode ser comparada com o tamanho para cada cromossoma correspondente em um genoma de referência expressada como porcentagem da representação genômica de qualquer cromossoma dado em relação ao genoma inteiro. As comparações diretas ou comparações com um cromossoma de referência também podem ser usadas.

II. SEQUENCIAMENTO DE APENAS UMA FRAÇÃO DO GENOMA HUMANO

No experimento descrito no Exemplo I acima, o DNA do plasma materno de cada espécime individual foi sequenciado usando apenas uma célula de fluxo. O número de rótulos sequenciados gerados a partir de cada um dos espécimes testados pela rodada de sequenciamento é mostrado na FIG. 6. T21 denota uma amostra obtida de uma gestação envolvendo um feto com a trissomia 21.

Como 36 pares de base foram sequenciados de cada um dos fragmentos de DNA de plasma materno sequenciado, o número de nucleotídeos/pares de base sequenciado de cada espécime pôde ser determinado pelos 36 pares de base multiplicados pela contagem de rótulo sequenciado e também é mostrado na FIG. 6. Como existem aproximadamente 3 bilhões de pares de base no genoma humano, a quantidade de dados de sequenciamento gerada a partir de cada espécime de plasma materno representou apenas uma fração, variando de uns 10 % a 13 %.

Além disso, neste estudo, apenas os rótulos sequenciados exclusivamente mapeáveis, denominados U0 na nomenclatura do software da Eland, foram usados para demonstrar a presença de representação excessiva na quantidade de sequências do cromossoma 21 nos espécimes de plasma materno a partir de gestações que carregam cada um feto com a trissomia 21, como descrito no exemplo I acima. Como mostrado na FIG. 6, as sequências U0 apenas representam um subconjunto de todos os rótulos sequenciados gerados de cada espécime e representam ainda uma proporção ainda menor, uns 2 %, do genoma humano. Estes dados indicam que o sequenciamento de apenas uma porção das sequências genômico humanas presentes no espécime testado é suficiente para se obter o diagnóstico de aneuploidia fetal.

III. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE SEQUÊNCIAS REQUERIDAS

O resultado de sequenciamento do DNA plasmático de uma mulher gestante que carrega um feto euplóide do sexo masculino é usado para esta análise. O número de rótulos sequenciados que podem ser mapeados sem desemparelhamentos com a sequência do genoma humano de referência foi

1.990.000. Subconjuntos de sequências foram aleatoriamente escolhidos destes 1.990.000 rótulos e a porcentagem de sequências alinhadas para o cromossoma 21 foi calculada dentro de cada subconjunto. O número de sequências nos subconjuntos foi variada de 60.000 a 540.000 sequências. Para cada tamanho de subconjunto, subconjuntos múltiplos do mesmo número de rótulos sequenciados foram compilados pela seleção aleatória dos rótulos sequenciados da reunião total até que nenhuma outra combinação fosse possível. A porcentagem média das sequências alinhadas para o cromossoma 21 e o seu desvio padrão (SD) foram depois calculados a partir dos subconjuntos múltiplos dentro de cada tamanho de subconjunto. Estes dados foram comparados através de tamanhos de subconjunto diferentes para determinar o efeito de tamanho de subconjunto na distribuição da porcentagem de sequências alinhadas para o cromossoma 21. O 5^o e 95° percentis das porcentagens foram depois calculadas de acordo com a média e SD.

Quando uma mulher gestante está carregando um feto com a trissomia 21, os rótulos sequenciados alinhados para o cromossoma 21 devem ser representados em excesso no plasma materno devido a uma dose extra de cromossoma 21 do feto. O grau de representação excessiva é dependente da porcentagem de DNA fetal na amostra de DNA de plasma materno seguindo a equação abaixo:

PerT21 = Per_Eu x (1 + fr2) onde

Per_T2i representa a porcentagem de sequências alinhadas para o cromossoma 21 em uma mulher com um feto com a trissomia 21; e

Per_Eu representa a porcentagem de sequências alinhadas para o cromossoma 21 em uma mulher com um feto euplóide; e f representa a porcentagem de DNA fetal no DNA do plasma materno

Como mostrado na FIG. 7, o desvio padrão para as porcentagens de sequências alinhadas para o cromossoma 21 diminuem com o número crescente de sequências em cada subconjunto. Portanto, quando o número de sequências em cada subconjunto aumenta, o intervalo entre o 5^o e 95° percentis diminui. Quando o intervalo de 5 % a 95 % para os casos euplóide e com trissomia 21 não se sobrepõem, então a diferenciação entre os dois grupos de casos pode ser possível com uma precisão de > 95 %.

Como mostrado na FIG. 7, o tamanho de subconjunto mínimo para a diferenciação de casos de trissomia 21 de casos euplóides é dependente da porcentagem de DNA fetal. Os tamanhos de subconjunto mínimos para diferenciar casos de trissomia 21 de casos euplóides foram 120.000, 180.000 e 540.000 sequências para as porcentagens de DNA fetal de 20 %, 10 % e 5 %, respectivamente. Em outras palavras, o número de sequências necessárias para serem analisadas seria de 120.000 para determinar se um feto tem trissomia 21 quando uma amostra de DNA de plasma materno contém 20 % de DNA fetal. O número de sequências necessárias para serem analisadas seria aumentado para 540.000 quando a porcentagem de DNA fetal cai para 5 %.

Como os dados foram gerados usando o sequenciamento de 36 pares de base, 120.000, 180.000 e 540.000 sequências correspondem a 0,14 %, 0,22 % e 0,65 % do genoma humano, respectivamente. Como a faixa mais baixa de concentrações de DNA fetal no plasma materno obtidas de gestações iniciais foram relatadas ser de uns 5 % (Lo, YMD et al. 1998 Am J Hum Genet 62, 768-775), o sequenciamento de cerca de 0,6 % do genoma humano pode representar a quantidade mínima de sequenciamento requerida para o diagnóstico com pelo menos 95 % de precisão na detecção da aneuploidia cromossômica fetal para qualquer gestação.

IV. SEQUENCIAMENTO ALEATÓRIO

Para ilustrar que os fragmentos de DNA sequenciados foram aleatoriamente selecionados durante a rodada de sequenciamento, nós obtivemos os rótulos sequenciados gerados a partir de oito amostras de plasma materno analisadas no exemplo I. Para cada espécime de plasma materno, nós determinamos as posições de partida em relação à sequência de genoma humano de referência, a montagem de NCBI 36, de cada um dos 36 pares de base sequenciados nos rótulos que foram alinhados exclusivamente para o cromossoma 21 sem desemparelhamentos. Nós depois ordenamos o número de posição de partida para as reuniões de rótulos sequenciados alinhados de cada espécime na ordem ascendente. Nós realizamos uma análise similar para o cromossoma 22. Para propósitos ilustrativos, as dez melhores posições de partida para o cromossoma 21 e cromossoma 22 para cada um dos espécimes de plasma materno são mostrados nas FIGS. 8A e 8B, respectivamente. Como pode ser avaliado a partir destas Tabelas, as reuniões sequenciadas de fragmentos de DNA não foram idênticas entre as amostras.

Qualquer um dos componentes de software ou funções descritas neste pedido, podem ser implementados como código de software a ser executado por um processador usando qualquer linguagem de computador adequada tal como, por exemplo, Java, C++ ou Perl usando, por exemplo, técnicas convencionais ou orientadas a objeto. O código de software pode ser armazenado como uma série de instruções ou comandos em um meio legível por computador para armazenagem e/ou transmissão, os meios adequados incluem memória de acesso aleatório (RAM), uma memória apenas de leitura (ROM), um meio magnético tal como um disco rígido ou um disquete ou um meio óptico tal como um disco compacto (CD) ou DVD (disco versátil digital), memória flash e outros. O meio legível por computador pode ser qualquer combinação de tais dispositivos de armazenagem ou transmissão.

Tais programas também podem ser codificados e transmitidos usando sinais carregadores adaptados para a transmissão via fios, ópticos, e/ou redes sem fio conformando a uma variedade de protocolos, incluindo a Internet. Como tal, um meio legível por computador de acordo com uma forma de realização da presente invenção pode ser criada usando um sinal de dados codificados com tais programas. Meios legíveis em computador codificados com o código de programa podem ser empacotados com um dispositivo compatível ou fornecidos separadamente de outros dispositivos (por exemplo, via download pela Internet). Qualquer um de tais meios legíveis por computador pode residir em ou dentro de um único produto de programa de computador (por exemplo, um disco rígido ou um sistema de computador inteiro) e pode estar presente no ou dentro de produtos de programa de computador diferentes dentro de um sistema ou rede. Um sistema de computador pode incluir um monitor, impressora ou outro dispositivo de demonstração adequado para fornecer qualquer um dos resultados aqui mencionados a um usuário.

Um exemplo de um sistema de computador é mostrado na FIG. 9. Os subsistemas mostrados na FIG. 9 são interconectados via um sistema bus 975. Subsistemas adicionais tais como uma impressora 974, teclado 978, disco fixo 979, monitor 976, que é ligado ao adaptador de demonstração 982 e outros são mostrados. Periféricos e dispositivos de entrada/saída (I/O), que se ligam ao controlador de I/O 971, podem ser conectados ao sistema de computador por qualquer número de meios conhecidos na técnica, tais como a porta em série 977. Por exemplo, a porta em série 977 ou a interface externa 981 pode ser usada para conectar os aparelhos de computador a uma rede de área ampla tal como a Internet, um dispositivo de entrada de mouse ou um escâner. A interconexão via sistema bus permite que o processador central 973 se comunique com cada subsistema e controle a execução de instruções a partir da memória do sistema 972 ou do disco fixo 979, assim como a troca de informação entre os subsistemas. A memória do sistema 972 e/ou o disco fixo 979 pode incorporar um meio legível por computador.

A descrição acima das formas de realização exemplares da invenção foi apresentada para os propósitos de ilustração e descrição. Não é intencionado a ser exaustiva ou limitar a invenção à forma exata descrita e muitas modificações e variações são possíveis considerando-se as divulgações acima. As formas de realização foram escolhidas e descritas de modo a 5 melhor explicar os princípios da invenção e as suas aplicações práticas para deste modo permitir outros habilitados na técnica melhor utilizar a invenção em várias formas de realização e com várias modificações como são adaptadas para o uso particular considerado.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui 10 citadas são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para realizar diagnóstico pré-natal de uma aneuploidia cromossômica fetal em uma amostra biológica de uma paciente do sexo feminino grávida de pelo menos um feto, em que a amostra biológica é plasma ou soro materno e em que a amostra inclui moléculas de ácido nucleico isenta de células da paciente do sexo feminino e do pelo menos um feto, caracterizado pelo fato de que compreende:

   realizar um sequenciamento aleatório em pelo menos uma porção de uma pluralidade de moléculas de ácido nucleico contidas na amostra biológica para obter um número pré-determinado de sequências, em que as sequências representam uma fração do genoma humano;

   alinhar, com um sistema de computador, cada sequência a um genoma humano;

   baseado no sequenciamento:

   pelo menos um processador para determinar uma primeira quantidade de um primeiro cromossoma a partir de sequências identificadas como alinhando ao primeiro cromossoma; e pelo menos um processador para determinar uma segunda quantidade de um ou mais segundos cromossomas a partir das sequências identificadas como alinhando a um ou mais dos segundos cromossomas;

   determinar um parâmetro da primeira quantidade e da segunda quantidade;

   em que, o parâmetro é determinado a partir da razão da primeira quantidade e da segunda quantidade;

   comparar o parâmetro a um ou mais valores de corte, em que os um ou mais valores de corte são valores de referência conhecidos estabelecidos a partir de gravidezes normais; e com base na comparação, determinar uma classificação de se uma aneuploidia cromossômica fetal existe para o primeiro cromossoma.

   Petição 870190062081, de 03/07/2019, pág. 12/15
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro cromossoma é o cromossoma 21, cromossoma 18, cromossoma 13, cromossoma X ou cromossoma Y.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a razão é obtida de qualquer um ou mais de uma contagem fracionária do número de sequências, um número fracionário de nucleotídeos sequenciados, e um comprimento fracionário de sequências acumuladas.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sequências que alinham ao primeiro cromossomo são selecionadas para serem menores do que um número especificado de pares de bases.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o número especificado de pares de bases é de 300 pares de base, 200 pares de bases ou 100 pares de bases.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ácido nucleico da amostra biológica foram enriquecidas quanto às sequências que se originam de pelo menos um cromossoma particular.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ácido nucleico da amostra biológica foram enriquecidas quanto às sequências menores do que 300 pares de bases.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ácido nucleico da amostra biológica foram enriquecidas quanto às sequências menores do que 200 pares de bases.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas de ácido nucleico da amostra biológica foram amplificadas usando uma reação em cadeia de polimerase.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a porção sequenciada representa pelo menos uma fração

    Petição 870190062081, de 03/07/2019, pág. 13/15 predeterminada do genoma humano.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a fração representa pelo menos 0,1 % do genoma humano.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a fração representa pelo menos 0,5 % do genoma humano.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um dos valores de corte é dependente da concentração fracionária de DNA fetal na amostra biológica.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a concentração fracionária de DNA fetal na amostra biológica é determinada por qualquer uma ou mais de uma proporção de sequências do cromossoma Y, um marcador epigenético fetal ou usando a análise de polimorfismo de nucleotídeo único.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:

    identificar uma quantidade de DNA fetal na amostra biológica, e calcular um número N de sequências a serem analisadas com base em uma precisão desejada e a quantidade de DNA fetal na amostra biológica.