BRPI0719342A2 - Mutante de poli-hidroxialcanoato sintase, gene, vetor recombinante, célula ou planta, e, método para preparar polímero de lactato ou copolímero de lactato - Google Patents
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Description
"MUTANTE DE POLI-HIDROXIALCANOATO SINTASE, GENE, VETOR RECOMBINANTE, CÉLULA OU PLANTA, E, MÉTODO PARA PREPARAR POLÍMERO DE LACTATO OU COPOLÍMERO DE LACTATO" [CAMPO TÉCNICO] A presente invenção refere-se a mutante de poli-
hidroxialcanoato sintases derivado de Pseudomonas sp. 6-19, em que os mutantes podem usar Iactil-CoA como um substrato para produzir polímero de lactato e/ou copolímero de lactato. A presente invenção refere-se também a um método para preparar o polímero de lactato e/ou copolímero de lactato, em que o método usa o mutante de poli-hidroxialcanoato sintases. [TÉCNICA ANTECEDENTE]
Polilactato (PLA) é um polímero biodegradável típico originado do lactato, o qual tem uma variedade de aplicações como um polímero comum ou medicinal. No momento, PLA está sendo preparado por polimerização de lactato o qual é produzido através da fermentação de microorganismos, mas somente PLA de peso molecular baixo (1000-5000 daltons) é produzido através de polimerização direta de lactato. Para sintetizar peso molecular alto (>100.000 daltons) de PLA, um método de polimerização de PLA de peso molecular baixo obtido por polimerização direta de lactato com um agente de copulação de cadeia pode ser usado. No entanto, ele tem desvantagens como que o processo para a preparação de PLA de peso molecular alto é complicado devido à adição de um solvente ou um agente de copulação de cadeia, e também não é fácil removê-lo. No momento, o processo para a preparação de PLA comercialmente disponível de peso molecular alto, um método, no qual lactato é convertido em lactídeo para sintetizar PLA por ciclo desidratação do anel lactídeo, está sendo usado.
O homopolímero de PLA pode ser facilmente obtido de método de síntese química usando lactato, mas o copolímero de lactato tendo várias unidades de monômero é difícil de ser produzido e sua disponibilidade comercial é muito baixa.
Entretanto, poli-hidroxialcanoato (PHA) é um poliéster cujos microorganismos se acumulam no mesmo como um carbono e composto de armazenamento de energia quando outros elementos nutritivos, por exemplo, fósforo, nitrogênio, magnésio, oxigênio, são deficientes enquanto a fonte de carbono está em excesso. PHA é reconhecido como um material alternativo para plásticos sintetizados porque ele tem propriedades similares aos polímeros sintéticos originados do petróleo, e, ao mesmo tempo, mostra uma excelente propriedade biodegradável. Para produzir PHA em microorganismos, uma enzima que
converte metabólitos de microorganismos em um monômero de PHA e PHA sintase que sintetiza um polímero de PHA usando os monômeros de PHA são requeridos. Quando produzindo PLA e copolímero de lactato com microorganismos, o mesmo sistema é necessário e uma enzima sendo capaz de prover Iactil-CoA é também necessária além de uma enzima provendo hidroxiacil-CoA, substrato original de PHA sintase.
Nesta consideração, os presentes inventores desenvolveram um sistema usando propionil-CoA transferase originada de Clostridium propionicum para prover Iactil-CoA e alcançaram sucesso na produção de copolímero de lactato de PLA (Pedido de patente coreana acessível ao público No. 10-2006-0121555). No entanto, ele tem uma pequena atividade de PHA sintase em hidroxialcanoato que é hidroxilado em posição 2. Foram feitos relatos de atividade de PHA sintase em Iactil-CoA medida in vitro, mas a atividade de PHA sintase em Iactil-CoA é relatada como sendo muito fraca, como dito acima (Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001; Valentin e Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994; Yuan et al. Arch Biochem Biophys. 394:87, 2001). Assim, se uma PHA sintase não pode usar Iactil-CoA de modo eficiente e a PHA sintase por usada para produzir PLA e copolímero de lactato, a eficiência da síntese deve ser baixa. Isto é, porque lactato, hidroxialcanoato que é hidroxilado em posição de carbono 2, não é um substrato apropriado para a PHA sintase, sendo a PHA sintase capaz de usar Iactil-CoA de modo eficiente, é muito importante sintetizar copolímero de lactato e PLA modo eficiente.
[DESCRIÇÃO]
[PROBLEMA TÉCNICO]
Consequentemente, o objeto da presente invenção é prover PHA sintase sendo capaz de usar eficientemente Iactil-CoA como um substrato.
Outro objeto da presente invenção é prover um método para a
preparação de PLA e copolímero de lactato, em que o método usa uma célula ou planta compreendendo genes de PHA sintase sendo capazes de usar lactil- CoA como um substrato e propionil-CoA transferase. [SOLUÇÃO TÉCNICA] Para alcançar o objeto, a presente invenção provê um mutante
de poli-hidroxialcanoato sintase usando Iactil-CoA como um substrato para produzir polímero de lactato ou copolímero de lactato e tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ. ID No: 10, em que a glutamina em posição 481 da seqüência de aminoácidos de SEQ. ID No: 10 é mudada. Preferivelmente, apresente invenção provê o mutante de poli-
hidroxialcanoato sintase, em que pelo menos um aminoácido selecionado dentre o grupo consistindo de glutamato em posição 130; serina em posição 325; e serina em posição 477 é ainda mudada.
Mais preferivelmente, A presente invenção provê um mutante de poli-hidroxialcanoato sintase usando Iactil-CoA como um substrato para produzir polímero ou copolímero de lactato de lactato e tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ. ID No: 10, em que a seqüência de aminoácidos tem qualquer mutação de: a) S325T e Q481M; b) E130D e Q481K;
c) S325T e Q481K;
d) E130D e Q481M;
e) E130D e Q481R;
f) E130D, S325T e Q481M;
g) E130D, S325T e Q481K;
h) E130D, S477R e Q481K;
i) E130D, S477R e Q481M; j) E130D, S477R e Q481R;
k) E130D, S477H e Q481K; 1) E130D, S477H e Q481M; m) E130D, S477H e Q481R; n) E130D, S477F e Q481K; o) E130D, S477F e Q481M; p) E130D, S477F e Q481R; q) E130D, S477Y e Q481K; r) E130D, S477Y e Q481M; s) E130D, S477Y e Q481R; t) E130D, S325T, S477R e Q481M; u) E130D, S325T, S477R e Q481K; v) E130D, S325T, S477F e Q481M; w) E130D, S325T, S477G e Q481M; ou x) E130D, S325T, S477F e Q481K.
Os presentes inventores confirmaram que alguns mutantes de poli-hidroxialcanoato sintase de Pseudomonas sp. 6-19 podem usar Iactil-CoA como um substrato e produzir polímero e/ou copolímero de lactato de modo muito eficiente, assim completando a presente invenção.
A presente invenção também provê um gene codificando o mutante de poli-hidroxialcanoato sintase. A presente invenção também provê um vetor recombinante contendo o gene para sintetizar o polímero ou copolímero de lactato.
Mais preferivelmente, a presente invenção provê o vetor recombinante, ainda compreendendo um gene codificando propionil-CoA transferase (pct).
A presente invenção também provê uma célula ou planta transformada com o vetor recombinante acima.
A presente invenção também provê um célula ou planta obtida a partir da transformação com o vetor recombinante acima, em que a célula ou planta original não tem um gene codificando propionil-CoA transferase.
A presente invenção também provê um método para preparar o polímero ou copolímero de lactato, em que o método compreende cultivar a célula ou planta.
Mais preferivelmente, a presente invenção provê o método, em que o cultivo é realizado em um meio de cultura compreendendo 3- hidroxibutirato (3-HB) e o copolímero obtido é um copolímero compreendendo unidade de monômero de 3-hidroxibutirato e unidade de monômero de lactato.
O termo "copolímero," como usado aqui, significa incluir bipolímero consistindo de dois monômeros distintos, terpolímero consistindo de três monômeros distintos ou tetrapolímero consistindo de quatro monômeros distintos.
Na presente invenção, o hidroxialcanoato é pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo de 3-hidroxibutirato, 3- hidroxivalerato, 4-hidroxibutirato, ácido (D)-3-hidroxicarboxílico com comprimento de cadeia médio (C6-H), ácido 3-hidroxipropiônico, ácido 3- hidroxihexanóico, ácido 3-hidroxiheptanóico, ácido 3-hidroxioctanóico, ácido 3-hidroxinonanóico, ácido 3-hidroxidecanóico, ácido 3-hidroxiundecanóico, ácido 3-hidroxidodecanóico, ácido 3-hidroxitetradecanóico, ácido 3- hidroxihexadecanóico, ácido 4-hidroxivalérico, ácido 4-hidroxihexanóico, ácido 4-hidroxiheptanóico, ácido 4-hidroxioctanóico, ácido 4- hidroxidecanóico, ácido 5-hidroxivalérico, ácido 5-hidroxihexanóico, ácido 6- hidroxidodecanóico, ácido 3-hidroxi-4-pentenóico, ácido 3-hidroxi-4-trans- hexenóico, ácido 3-hidroxi-4-cis-hexenóico, ácido 3-hidroxi-5-hexenóico, ácido 3-hidroxi-6-trans-octenóico, ácido 3-hidroxi-6-cis-octenóico, ácido 3- hidroxi-7-octenóico, ácido 3-hidroxi-8-nonenóico, ácido 3-hidroxi-9- decenóico, ácido 3-hidroxi-5-cis-dodecenóico, ácido 3-hidroxi-6-cis- dodecenóico, ácido 3-hidroxi-5-cis-tetradecenóico, ácido 3-hidroxi-7-cis- tetradecenóico, ácido 3-hidroxi-5,8-cis-cis-tetradecenóico, ácido 3-hidroxi-4- metilvalérico, ácido 3-hidroxi-4-metilhexanóico, ácido 3-hidroxi-5- metilhexanóico, ácido 3-hidroxi-6-metilheptanóico, ácido 3-hidroxi-4- metiloctanóico, ácido 3-hidroxi-5-metiloctanóico, ácido 3-hidroxi-6- metiloctanóico, ácido 3-hidroxi-7-metiloctanóico, ácido 3-hidroxi-6- metilnonanóico, ácido 3-hidroxi-7-metilnonanóico, ácido 3-hidroxi-8- metilnonanóico, ácido 3-hidroxi-7-metildecanóico, ácido 3-hidroxi-9- metildecanóico, ácido 3-hidroxi-7-metil-6-octenóico, ácido málico, metil éster de ácido 3-hidroxi-succínico, metil éster de ácido 3-hidroxiadipínico, metil éster de ácido 3-hidroxi-subérico, metil éster de ácido 3-hidroxiazeláico, metil éster de ácido 3-hidroxi-sebácico, etil éster de ácido 3-hidroxi-subérico, etil éster de ácido 3-hidroxi-sebácico, propil éster de ácido 3-hidroxipimélico, benzil éster de ácido 3-hidroxi-sebácico, ácido 3-hidroxi-8-acetoxioctanóico, ácido 3-hidroxi-9-acetoxinonanóico, ácido fenóxi-3-hidroxibutírico, ácido fenóxi-3 -hidroxivalérico, ácido fenóxi-3-hidroxiheptanóico, ácido fenóxi-3- hidroxioctanóico, ácido para-cianofenóxi-3-hidroxibutírico, ácido para- cianofenóxi-3 -hidroxivalérico, ácido para-cianofenóxi-3 -hidroxihexanóico, ácido para-nitrofenóxi-3-hidroxihexanóico, ácido 3-hidroxi-5-fenilvalérico, ácido 3-hidroxi-5-ciclohexilbutírico, ácido 3,12-di-hidroxidodecanóico, ácido 3,8-di-hidroxi-5-cis-tetradecenóico, ácido 3-hidroxi-4,5-epoxidecanóico, ácido 3-hidroxi-6,7-epoxidodecanóico, ácido 3-hidroxi-8,9-epoxi-5,6-cis- tetradecanóico, ácido 7-ciano-3-hidroxiheptanóico, ácido 9-ciano-3- hidroxinonanóico, ácido 3-hidroxi-7-fluoroheptanóico, ácido 3-hidroxi-9- fluorononanóico, ácido 3-hidroxi-6-clorohexanóico, ácido 3-hidroxi-8- clorooctanóico, ácido 3-hidroxi-6-bromo-hexanóico, ácido 3-hidroxi-8- bromo-octanóico, ácido 3-hidroxi-l 1-bromoundecanóico, ácido 3-hidroxi-2- butenóico, ácido 6-hidroxi-3-dodecenóico, ácido 3-hidroxi-2-metilbutírico, ácido 3-hidroxi-2-metilvalérico e ácido 3-hidroxi-2,6-dimetil-5-heptenóico.
A presente invenção também provê um método para preparar o polímero ou copolímero de lactato de lactato, em que o método compreende cultivar a célula ou planta.
O termo "vetor" como usado aqui, significa uma construção de DNA compreendendo seqüência de DNA ligada operativamente a uma seqüência de controle apropriada capaz de expressar o DNA em um hospedeiro apropriado. Na presente invenção, vetor pode ser plasmídeo, bacteriófago, ou uma inserção de genoma simples. Se o hospedeiro apropriado por transformado com o mesmo, o vetor pode se auto-replicar e operar sem levar em conta o genoma hospedeiro, ou em alguns casos, o vetor se funde com o genoma hospedeiro. Porque o plasmídeo é atualmente usado com maior freqüência como o vetor, o plasmídeo aqui é usado de modo interpermutável para vetor. No entanto, o vetor, de acordo com a invenção, inclui um tipo diferente de vetor tendo a mesma função, que já é conhecida ou será conhecida do versado na técnica.
A frase "seqüência de controle de expressão" significa uma seqüência de DNA essencial para a expressão de uma seqüência de codificação em um hospedeiro específico. Esta seqüência de controle compreende um promotor para realizar a transcrição; uma seqüência de operador arbitrária para controlar a transcrição; uma seqüência codificando sítio de ligação de um mRNA ribossômico apropriado, e uma seqüência para controlar a terminação de transcrição e tradução. Por exemplo, a seqüência de controle apropriada para procarioto compreende um promotor, uma seqüência de operador arbitrária e sítio de ligação de ribossomo. Um promotor, um sinal de poliadenilação e um melhorador são compostos para eucariotes. Em plasmídeo, o promotor é um fator que afeta mais severamente a quantidade de expressão de gene. Preferivelmente, um promotor SRa, promotor derivado de citomegalovírus, etc, são usados como um promotor para expressão elevada.
Qualquer uma dentre as várias seqüências de controle de expressão pode ser usada no vetor para expressar a seqüência de DNA da presente invenção. Os exemplos de seqüência de controle de expressão utilizável, por exemplo, incluem o SV40 ou os promotores prematuro e tardio de adenovírus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, os promotores de T3 e T7, a região de operador e promotor principal de fago lambda, a região de controle de proteína de codificação fd, o promotor de 3- fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores das fosfatases, por exemplo Pho5, o promotor de sistema de alfa-união de levedura, e a seqüência de construção conhecida para controlar a expressão de genes de eucarioto, procarioto, ou vírus dos mesmos, e suas várias combinações.
O ácido nucleico é "ligado operativãmente" quando ele é
colocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Isto pode significar o modo em que a(s) seqüência(s) de gene e de controle são ligadas, em que a expressão do gene é possível quando uma molécula apropriada (por exemplo proteína de ativação de transcrição) é combinada com a(s) seqüência (s) de controle. Por exemplo, DNA para um líder pressequência ou secretório é ligado operativamente a DNA para um polipeptídeo, se ele por expressado como uma preproteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou melhorador é ligado operativamente a uma seqüência de codificação se ele afetar a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossoma é ligado operativamente a uma seqüência de codificação, se ela por posicionada de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "ligado operativamente" significa que as seqüências de DNA sendo ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretório, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os melhoradores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em sítios de restrição convenientes. Se estes sítios não existirem, os adaptadores ou ligados de oligonucleotídeo sintético são usados de acordo com a prática convencional.
O termo "vetor de expressão", como usado aqui, geralmente indica fragmento de DNA de filamento duplo como um veículo recombinante em que fragmento de DNA tipicamente heterólogo é inserido. O DNA heterólogo significa um DNA de tipo hetero, que não está ocorrendo naturalmente nas células hospedeiras. Uma vez que o vetor de expressão é incorporado na célula hospedeira, ele pode ser replicado indiferente do DNA cromossômico hospedeiro para produzir várias cópias e DNA heterólogo inserido nos mesmos.
Como bem conhecido na técnica relacionada, para aumentar o nível de expressão do gene transfectado na célula hospedeira, o gene correspondente deve ser conectado operativamente a seqüência para controlar a transcrição e decodificar a expressão, que funciona em um hospedeiro de expressão selecionado. Preferivelmente, a seqüência de controle de expressão e gene correspondente estão contidos em um vetor de expressão compreendendo marcador de seleção de vírus e origem de replicação juntos. Se o hospedeiro de expressão por eucariótico, o vetor de expressão deve ainda compreender marcador de expressão utilizável em hospedeiro de expressão eucariótico.
Na presente invenção, vários vetores, como vetor de plasmídeo, vetor de bacteriófago, vetor de cosmídeo, ou vetor de YAC
r
(cromossomo artificial de levedura) podem ser usados como o vetor acima. E preferível usar o vetor de plasmídeo para os fins da presente invenção. Os vetores de plasmídeo típicos, que podem ser usados para estes fins tem (a) uma origem de replicação de modo que ela leva a uma replicação efetiva, de modo que cada célula hospedeira contém várias centenas de cópias de vetor de plasmídeo, (b) um gene de resistência a antibiótico, de modo que uma célula hospedeira transformada com um vetor de plasmídeo pode ser selecionada e (c) uma seqüência compreendendo um sítio de enzima de restrição onde um fragmento de DNA estrangeiro deve ser inserido. Mesmo na ausência de um sítio de enzima de restrição apropriado, um vetor ou DNA estrangeiro pode ser facilmente ligado por uso e um adaptador de oligonucleotídeo sintético ou um ligador de acordo com métodos convencionais.
Um vetor recombinante da presente invenção pode ser transformado em uma célula hospedeira apropriada de acordo com métodos conhecidos na arte. A célula hospedeira preferível da presente invenção é uma célula procariótica, mais preferivelmente E. coli. As cepas preferíveis de E. Coli incluem: E. coli DH5a, E. coli JMlOl, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli Xl776, E. coli XLl-Blue (Stratagene) e E. coli B. No entanto, outras cepas de E. coli como FMB101, NM522, NM538 e NM539 e outras espécies e gêneros procarióticos também podem ser usados. Além de E. coli referido acima, o gênero Agrobacterium, como Agrobacterium A4, o gênero Bacilli, como Bacillus subtilis, várias enterobactérias, como Salmonella typhimurium ou Serratia marcescens e os vários gêneros Pseudomonas podem ser usados aqui como células hospedeiras, mas o escopo da presente invenção não é limitado aos exemplos referidos acima.
Além disso, a transformação de procarióticos pode ser facilmente realizada de acordo com o método de cloreto de cálcio descrito na seção 1,82 de Sambrook et al. (supra). Alternativamente, a eletroporação (Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982)) também pode ser usada para transformar estes tipos de células.
Transformação de plantas para preparar planta compreendendo genes de transferase e sintase pode ser realizada por métodos convencionais usando Agrobactérias ou vetores de vírus. Por exemplo, plantas transformadas são obtidas transformando uma Agrobactéria com um vetor recombinante contendo o gene inventivo e infectando um tecido, etc. da planta alvo com uma Agrobactéria transformada. Mais especificamente, a planta transformada pode ser preparada por (a) pré-cultivando um explante de planta de interesse, e então transformando o explante co-cultivando o explante e uma Agrobactéria transformada; (b) cultivando referidos explantes infectados para induzir calos; e (c) excisando o calo obtido, e cultivando o mesmo em meio indutor de brotos.
O termo "explante," como usado aqui, significa um fragmento de tecido cortado de uma planta, e inclui cotilédone ou hipocótilo. Cotilédone ou hipocótilos podem ser usados como o explante da presente invenção. E mais preferível usar cotilédone obtido desinfetando e lavando as sementes da planta, e germinado as mesmas em meio de cultura MS
Plantas transformadas úteis para a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, tabaco, tomate, pimentas vermelhas, feijões, arroz, e milho. Também, mesmo que uma planta transformada seja uma que propaga sexualmente, será óbvio para o versado na técnica que tal planta pode ser reproduzida assexuadamente usando cultura de tecido de planta, etc. [BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS]
Figura 1 é um diagrama mostrando o processo de preparação de um vetor de expressão recombinante compreendendo o gene de poli- hidroxialcanoato sintase originada de Peudomonas sp. 6-19.
Figura 2 apresenta os resultados de FACS (classificação células ativada por fluorescência) após o cultivo de E. Coli transformado com vetores recombinantes (pPs619C I-ReAB, pPs619C1200-ReAB e pPs619C 13OO-ReAB) compreendendo mutantes de phaClPs6-i9 sintase e SCL (phaClpS6-i9200 e phaClPs6.19300), na condição de serem capazes de sintetizar PHB.
Figura 3 é um diagrama simples de vetor de expressão constitutivo expressando PHA sintase e CP-PCT juntos.
Figura 4 é um diagrama mostrando o processo de preparação de um vetor de expressão recombinante compreendendo os genes de PHA sintase originados de Pseudomonas sp. 6-19, mutante SCL e CP-PCT. [MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO] Em seguida, a presente invenção é descrita em considerável
detalhe. Os exemplos a seguir são oferecidos como forma de ilustração para ajudar os versados na arte a compreender a presente invenção, e não são destinados a limitar o escopo da invenção.
Particularmente, embora a síntese de poli(3-hidroxibutirato-co- lactato) (P(3HB-co-LA)) obtido por adição de 3-hidroxibutirato (3-HB) durante a preparação copolímero de lactato com mutante de PHA sintase seja exposta nos exemplos seguintes, será óbvio para os versados na técnica da presente invenção que diversos copolímeros compreendendo hidroxialcanoato e lactato diferentes podem ser preparados adicionando outro hidroxialcanoato exceto 3-HB.
<Exemplo 1> Clonagem de gene de PHA sintase originada de Pseudomonas sp. 6-19 e construção de vetor de expressão
Para separar o gene de PFIA sintase (phaClPs6-i9) originado de Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP), DNA total de Pseudomonas sp. 6- 19 foi extraído, e os iniciadores de SEQ ID NO: 1 e 2 foram preparados baseados na seqüência de gene phaClPs6.i9 (Ae-jin Song, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004) e PCR foi realizado para obter o gene de phaClPs6.]9.
SEQ ID NO: 1: 5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG -3
SEQ ID NO: 2: 5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC -3
Como resultado do exame do produto de reação PCR por eletroforese em gel de agarose, fragmento de gene de 1,7 Kbp correspondendo ao gene phaClPs6_i9 foi observado. O operon da enzima expressando sistema de expressão constitutivo fornecendo monômero e sintase foi construído por expressão de phaClPs6-i9SÍntase (Figura 1).
O fragmento de DNA compreendendo o operon sintetizando PHB originado de Ralstonia eutropha Hl6 foi excisado com BamHI/EcoRI a partir do vetor pSYL105 (Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347), e foi inserido dentro do sítio de reconhecimento BamHI/EcoRI do pBluescript II (Stratagene) para construir o vetor recombinante pReCAB.
Vetor pReCAB é conhecido como expressando constitutivamente PHA sintase (phaCRE) e enzima fornecendo monômero (phaARE e phaBRE) por promotor de operon PHB e também conhecido como operando bem em E. Coli (Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347). Vetor pReCAB foi excisado com BstBI/Sbfl para deletar R.eutropha Hl6 PHA sintase (phaCRE), e depois o gene phaClPs6-i9 acima foi inserido dentro do sítio BstBI/Sbfl para produzir o vetor recombinante pPs619C I-ReAB (Figura 1).
Os sítios BstBI contidos no mesmo foram removidos por método SDM (mutagênese sítio-dirigida) sem mutação do aminoácido para produzir fragmento de gene de phaClPs6-i9 sintase tendo dois sítios BstBI/Sbfl em ambas extremidades, e PCRs de sobreposição foram realizados com os iniciadores de SEQ ID NO: 3 e 4, SEQ ID NO: 5 e 6, e SEQ ID NO: 7 e 8 para adicionar sítio de reconhecimento BstBI/Sbfí SEQ ID NO: 3: 5- atg ccc gga gcc ggt tcg aa - 3
SEQ ID NO: 4: 5- CGT TAC TCT TGT TAC TCA TGA TTT GAT TGT CTC TC - 3
SEQ ID NO: 5: 5- GAG AGA CAA TCA AAT CAT GAG TAA CAA GAG TAA CG - 3
SEQ ID NO: 6: 5- CAC TCA TGC AAG CGT CAC CGT TCG TGC ACG TAC-3
SEQ ID NO: 7: 5- GTA CGT GCA CGA ACG GTG ACG CTT GCA TGA GTG-3
SEQ ID NO: 8:5- aac ggg agg gaa cct gca gg - 3
A seqüência do gene phaClPs6-i9 do vetor recombinante pPs619C I-ReAB foi confirmada pelo sequenciamento e o resultado foi mostrado em SEQ ID NO: 9, pelo que a seqüência de aminoácidos codificada foi mostrada em SEQ ID NO: 10.
O teste de similaridade das seqüências mostrou que o gene tem 84,3% de identidade de seqüência nucleotídica e 88,9% de identidade de seqüência de aminoácidos com phaCl originado a partir de Pseudomonas sp. cepa 61-3 (Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998), a partir do que foi confirmado que as duas sintases eram muito parecidas. A partir destes resultados, a phaClPs6-i9 sintase obtida na presente invenção foi confirmada sendo PHA sintase tipo II.
Para confirmar se a phaClPs6.i9 sintase sintetiza PHB ou não, XL-IBlue de E.coli (Stratagene) foi transformado com o vetor recombinante pPs619C I-ReAB, e cultivado no meio de detecção de PHB (LB agar, glicose 20g/L, Vermelho Nilo 0,5ug/ml). Como resultado, a síntese de PHB não foi observada.
<Exemplo 2> Preparação do mutante específico de substrato de PHA sintase originada de Pseudomonas sp. 6-19
PHA sintase tipo II, dentre os vários tipos de PHA sintases, é conhecida como sendo MCL-PHA (PHA com comprimento de cadeia médio) sintase sendo capaz de polimerizar o substrato tendo cadeia de carbono relativamente longa. Essa MCL sintase é esperada para ser útil na preparação do polímero de lactato. Mesmo phaCl sintase originada de Pseudomonas sp. 61-3, o qual tendo alta identidade com phaClPs6-i9 sintase da presente invenção, é sintase tipo II, phaCl sintase é relatada para ter relativamente amplo alcance de especificidade de substrato (Matsusaki et al., J. Bacteriol., 180:6459, 1998), e um estudo a partir desse mutante apropriado para preparação SCL-PHA (PHA com comprimento de cadeia curto) foi relatado (Takase et al., Biomacromolecules, 5:480, 2004). Baseado nesses resultados, três posições do aminoácido afetando atividade SCL foram descobertas devido a seqüência análises de alinhamento, e mutantes de phaClpS6-19 sintase mostrados na tabela 1 abaixo foram preparados por método SDM usando os iniciadores da SEQ ID NO: 11 to 14.
Tabela 1
Vetor recombinante Substituição de ácido nucleico Substituição de aminoácido Iniciador pPsó 19C1200-ReAB AGC —>ACC S325T SEQ ID NO 11/12 CAG —>ATG Q481M SEQ ID NO 13/14 pPsó 19C13 OO-ReAB GAA —>GAT E130D SEQ ID NO 15/16 AGC —»ACC S325T SEQ ID NO 11/12 CAG —>ATG Q481M SEQ ID NO 13/14
SEQ ID NO: 11: 5- CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC-3
SEQ ID NO: 12: 5- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT CAG-3
SEQ ID NO: 13: 5- CGA GCA GCG GGC ATA TC A TGA GCA TCC TGA ACC CGC- 3
SEQ ID NO: 14: 5- GCG GGT TCA GGA TGC TCA TGA TAT GCC CGC TGC TCG- 3
SEQ ID NO: 15:5- ate aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3 SEQ ID NO: 16: 5- ggt cgg cgc cat cgc ate ggt cat gag gtt gat- 3
XL-IBlue de E.coli foi transformado com esse vetor recombinante, e cultivado em meio de detecção de PHB (LB agar, glicose 20g/L, Vermelho Nilo 0,5ug/ml). A síntese de PHB foi observada em tanto XL-IBlue de E.coli transformado com pPs619C1200-ReAB e XL-IBlue de E.coli transformado com pPs619C 13OO-ReAB. Isto é, 3HB-CoA foi produzido a partir da glicose por enzimas fornecendo monômero de phaARE e phaBRE, e o 3HB-CoA foi usado como substrato por mutantes de phaClPs6-i9 sintase SCL (phaClPs6-i9200 e phaClPs6.i9300) para produzir PHB. Para análise quantitativa, XLl-Blue de E. Coli transformado recombinante foi cultivado por 4 dias no meio de cultura LB compreendendo glicose (20g/L) a 37°C. E. Coli cultivado recombinante recebeu um choque de sacarose e colorido com Vermelho Nilo , o qual foi analisado por FACS (Classificação de células ativadas por fluorescência) (Figura 2).
XLl-Blue de E. Coli transformado com vetor pPs619Cl- ReAB compreendendo sintase selvagem não foi colorida com Vermelho Nilo , enquanto XLl-Blue de E. Coli transformado com pPs619C1200-ReAB ou pPs619C 13OO-ReAB mostrou alta fluorescência devido ao PHB colorido com vermelho Nilo na célula. Além disso, o teor de PHB produzido na célula foi avaliado por coleta de microorganismo cultivado através centrifugação, secando durante 48 horas em secadora a 80°C, e então realizando a análise de cromatografia de gás. O teor de PHB foi 29,7% (peso/peso) e 43,1% (peso/peso) em XLl-Blue de E. Coli transformado com pPs619C1200-ReAB e pPs619C1300-ReAB, respectivamente, e PHB não foi detectado no caso de pPs619C I-ReAB.
<Exemplo 3> Construção de E. Coli recombinante sendo capaz de expressar PHA sintase originada de Pseudomonas sp. 6-19 e propionil-CoA transferase, e preparação de PLA ou copolímero de lactato usando o mesmo.
Neste exemplo, propionil-CoA transferase originada de Clostridium propionicum (CP-PCT) foi usada para prover Iactil-CoA, um monômero necessário por síntese de PLA e copolímero de lactato. O operon do sistema de expressão constitutivo expressando PHA sintase e CP-PCT juntos foi construído como na figura 3. CP-PCT foi bem conhecido por ter toxicidade para microorganismos. Isto é, no sistema de expressão de promotor tac ou Promotor T7 induzido por IPTG (esse sistema é bastante usado na expressão de proteína recombinante), todos os microorganismos morreram logo após a adição do indutor. Devido a esta razão, pensa-se como apropriado usar sistema de expressão em que ele é fracamente expressado, mas continuamente expressado de acordo com o crescimento do microorganismo. O fragmento obtido através de PCR realizado com DNA cromossômico de Clostridium propionicum e os iniciadores de SEQ ID NO: 17 e 18 foram usados como cp-pct, e sítio NdeI de CP-PCT selvagem foi removido pelo método SDM para facilidade de clonagem (Figura 4).
SEQ ID NO: 17: 5-ggaattcATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA SEQ ID NO: 18: 5-gc tctaga tta gga ctt cat ttc-ctt cag acc cat taa gcc ttc tg
Além disso, PCR sobreposto foi realizado com os iniciadores de SEQ ID NO: 19 e 20 para adicionar o sítio de reconhecimento de Sbfl/Ndel.
SEQ ID NO: 19: 5-agg cct gca ggc gga taa caa ttt cac aca gg- 3 SEQ ID NO: 20: 5-gcc cat atg tct aga tta gga ctt cat ttc c- 3
Vetor pPsó 19C1300-ReAB compreendendo mutante de SCL de phaClPs6-i9 sintase, phaClPs6_i93 00, foi excisado com Sbfl/Ndel para remover enzimas fornecendo monômero (phaARE e phaBRE) originadas de Ralstonia eutrophus Hl 6, e então o gene de CP-PCT clonado por PCT foi inserido em sítio Sbfl/Ndel para produzir vetor recombinante pPs619C1300- CPPCT (Figura 4).
Além disso, vetor recombinante pPs619C1200-CPPCT compreendendo outro mutante de SCL de phaClPs6_i9 sintase, phaClPs6-i9200, e vetor recombinante pPs619CI-CPPCT compreendendo phaClPs6-i9 sintase selvagem foram produzidos pelo mesmo método acima. Para confirmar se o polímero é feito ou não através do suprimento de monômero por CP-PCT, XL-IBlue de E.coli foi transformado com vetor recombinante de pPsó 19C1200-CPPCT e pPs619C1300-CPPCT, foi cultivado no meio de detecção de PHB (agar LB, glicose 20g/L, 3HB 2g/L, Vermelho Nilo O^g/ml). Como resultado, a síntese de PHB foi observada em ambos.
Com o vetor recombinante pPs619C1300-CPPCT, culturas em frascos foram realizadas em diversas condições para produzir PLA e copolímero de lactato. Resultados foram mostrados na tabela 2 abaixo.
Tabela 2
Cepa Meio de cultura Cultura Substrato Teor de PHB (%) Teor de PLA (%) XLl-Blue LB glicose (lOg/L) aeróbica lactato (5 g/L) - 0,6 XLl-Blue LB->MR glicose (20g/L) 2 etapas (aeróbica anaeróbica) 1 ToplO LB->MR glicose (20g/L) 2 etapas (aeróbica anaeróbica) 0,3 XLl-Blue LB->MR glicose (20g/L) 2 etapas (aeróbica anaeróbica) 3 HB (2 g/L) 3,19 2,75 ToplO LB-»MR glicose (20g/L) 2 etapas (aeróbica anaeróbica) 3 HB (2g/L) 2,84 3,1 ToplO LB glicose (20g/L) aeróbica 3HB (0,05g/L) Lactato (5g/L) 0,07 1,97 ToplO LB glicose (20g/L) aeróbica 3 HB (0,2g/L) lactato(5g/L) 0,31 3,18
As cultura em 2 etapas foi realizada substituindo meio de
cultura com meio de cultura de MR e então tentando cultura anaeróbica para produzir lactato em célula. Como um resultado de cultivar E. Coli recombinante em diversas condições, homopolímero de PLA foi preparado com cerca de 1%, e copolímero de lactato produzido adicionando 3HB como substrato foi preparado com cerca de 6%, com base no peso das células secas. A composição de meio de cultura MR usado na cultura de batelada alimentada de acordo com a presente invenção foi mostrada na tabela 3 abaixo.
Tabela 3
Ingrediente R Modificado (MR) (/L) KH2PO4 6,67 g (NH4)2HPO4 4g Citrato 0,8 g MgSO4-H2O 0,8 g 3 HB 0 ou 0,2 g Glicose 50 g Microingrediente* 5 mL
*Microingrediente (/L): FeSO4-H2O, IOg; ZnSO4-H2O, 2,25g; CuSO4 H2O, lg; MnSO4-H2O, 0,5g; CaCl2-H2O, 2g; Na2B4O7 H2O, 0,23g; (NH4)6Mo7O24, 0,1 g; 3 5 % HCl, 1 OmL.
<Exemplo 4> Preparação de copolímero P(3HB-co-LA) através cultura em batelada alimentada de E. Coli recombinante
E. Coli recombinante (transformado com vetor pPs619C1300- CPPCT) foi cultivado a 37°C, durante 12 horas, na velocidade de agitação de 200 rpm em 3 mL de meio de cultura LB compreendendo 20 g/L de glicose, 100 mg/L de ampicilina, etc. Esse meio de cultura foi inoculado em 100 mL do mesmo meio de cultura, e cultivado por 6 horas na mesma condição. O meio de cultura final foi usado como cultura de semente da cultura em batelada alimentada. O meio de cultura MR foi usado como meio de partida para a cultura em batelada alimentada. A cultura em batelada alimentada foi iniciada inoculando-se 100 mL da cultura de semente em 2,4L de meio de cultura MR. A temperatura do meio de cultura foi 37°C , e o pH foi ajustado a 6,8-6,9 com 14% solução aquosa de amônia, e oxigênio dissolvido foi mantido por mais de 20% de ar saturado controlando o fornecimento do ar e velocidade de agitação. Neste momento, a velocidade de fornecimento de ar foi lwm. Quando a glicose contida no meio de partida foi exaurida, 20 g de glicose e 5 g de 3-Mdroxibutirato (3HB) foram fornecidos, e no mesmo momento a velocidade de agitação foi levada a 200rpm e a velocidade de fornecimento de ar foi diminuída a 0,1 wm para mudar a condição aeróbica para condição anaeróbica. Para cultura total, glicose foi fornecida 5 vezes. 5 g de 3HB foram supridos juntos na primeira e terceira vez dentre as 5 vezes. Após o término de cultura, as células foram coletadas por centriíugação, e secadas por congelamento.
Para refinar o polímero preparado, o polímero foi extraído a partir de células secadas por congelamento por um extrator Soxhlet usando clorofórmio. Então, uma grande parte do clorofórmio foi retirada da solução clorofórmio dissolvendo o polímero por um evaporador rotativo, e metanol foi adicionado à solução restante para precipitar o polímero. O polímero precipitado foi filtrado, e secado durante 12 horas em um secador a vácuo. Além disso, alguma parte das células obtidas por centrifugação
foi secada em uma secadora a 80°C durante 48 horas, e o teor de copolímero P(3HB-co-LA) nas células foi analisado por cromatografia de gás. O homopolímero de PLA e copolímero de P(3HB-co-3HV), em que o teor de 3HV é de 12 % em peso, foram usados como padrão. Como um resultado, o teor de P(3HB-co-LA) sintetizado em
E. Coli foi cerca de 10% com base no peso das células secas, e o teor de PLA no copolímero foi 88 mol%.
A partir deste exemplo representando cromatografia de gás do polímero finalmente obtido, o polímero obtido foi confirmado como sendo copolímero P(3HB-co-LA) e o teor de PLA no copolímero foi confirmado como sendo de 88 mol%.
<Exemplo 5> Preparação de homopolímero de PLA por cultura alimentada em batelada de E. Coli recombinante
De acordo com o método do exemplo 4, a cultura de semente do Ε. Coli recombinante transformado com vetor pPs619C 13 OO-CPPCT foi realizada, e cultura alimentada em batelada foi iniciada, inoculando-se 100 mL de meio de cultura de semente em 2,4 L de meio MR. A temperatura do meio de cultura foi 37°C , e o pH foi ajustado a 6,8-6,9 com 14% solução aquosa de amônia, e oxigênio dissolvido foi mantido a mais de 20% de ar saturado controlando o fornecimento de ar e velocidade de agitação. No mesmo momento, a velocidade de fornecimento de ar foi 1 vvm. Quando glicose contida no meio de partida foi exaurida, 20 g de glicose foram fornecidos, e ao mesmo tempo a velocidade de agitação foi levada a 200rpm e a velocidade de fornecimento de ar foi diminuída a 0,1 vvm para mudar a condição aeróbica para condição anaeróbica. Para a cultura total, glicose foi fornecida 5 vezes. Após terminar a cultura, as células foram coletados por centrifugação, e secadas por congelamento. O polímero foi coletado de acordo com o método do exemplo 4. Além disso, alguma parte da célula obtida através de
centrifugação foram secadas em uma secadora a 80°C durante 48 horas, e o teor de PLA na célula foi analisado por cromatografia de gás. Metil-4HB, homopolímero PLA e copolímero P(3HB-co-3HV), em que o teor de 3HV é 12 % em peso, foram usados como padrão. Como um resultado, 3HB e 4HB não foram detectados, e
somente PLA foi observado. O teor de PLA sintetizado em E. Coli foi cerca de 10% com base no peso das células secas. A partir dos resultados de cromatografia de gás do polímero finalmente obtido, o polímero obtido foi observado como sendo o polímero de polilactato em que o teor de PLA foi 99,1 mol%.
<Exemplo 6> Preparação de diversos mutantes Vários mutantes de PHA sintase foram preparados de acordo com o mesmo método descrito no exemplo 2 acima com os iniciadores abaixo. Os mutantes obtidos foram mostrados nas tabelas 4, 5, 6 e 7. E130D
SEQ ID NO: 15: 5'-ate aac ctc atg acc gat gcg atg gcg ccg acc- 3' SEQ ID NO: 16: 5' -ggt cgg cgc cat cgc ate ggt cat gag gtt gat- 3' S325T
SEQ ID NO: 11: 5'-CTG ACC TTG CTG GTG ACC GTG CTT GAT ACC ACC- 3'
SEQ ID NO: 12: 5'- GGT GGT ATC AAG CAC GGT CAC CAG CAA GGT
CAG- 3'
S477R
SEQ ID NO: 21: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg age cgc ggg cat ate- 3' SEQ ID NO: 22: 5'-gat atg ccc gcg gct cga cag cac gaa ttc- 3' S477H
SEQ ID NO: 23: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg age cat ggg cat ate- 3' SEQ ID NO: 24: 5'-gat atg ccc atg gct cga cag cac gaa ttc- 3' S477F
SEQ ID NO: 25: 5'- gaa ttc gtg ctg tcg age ttt ggg cat ate- 3' SEQ ID NO: 26: 5'- gat atg ccc aaa gct cga cag cac gaa ttc- 3' S477Y
SEQ ID NO: 27: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg age tat ggg cat ate- 3' SEQ ID NO: 28: 5-gat atg ccc ata gct cga cag cac gaa ttc- 3' S477G
SEQ ID NO: 29: 5'-gaa ttc gtg ctg tcg age ggc ggg cat ate- 3' SEQ ID NO: 30: 5'-gat atg ccc gcc gct cga cag cac gaa ttc- 3' Q481K
SEQ ID NO: 31: 5'-ggg cat ate aaa age ate ctg aac ccg c- 3' SEQ ID NO: 32: 5'-gcg ggt tca gga tgc ttt tga tat gcc c- 3' Q481M
SEQ ID NO: 33: 5'-ggg cat ate atg age ate ctg aac ccg c- 3' SEQ ID NO: 34: 5'-gcg ggt tca gga tgc tca tga tat gcc c- 3' Q481R
SEQ ID NO: 35: 5'-ggg cat ate cgc age ate ctg aac ccg c- 3' SEQ ID NO: 36: 5'-gcg ggt tca gga tgc tgc gga tat gcc c- 3' Tabela 4
Sintase recombinante Substituição de ácido nucleico Substituição de aminoácido Iniciadores pPs619C1200 AGC ACC S325T SEQ ID NO: 11, 12 CAG -> ATG Q481M SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1202 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 CAG —> AAA Q481K SEQ ID NO: 31, 32 pPs619C1203 AGC -f ACC S325T SEQ ID NO: 11, 12 CAG —>■ AAA Q481K SEQ ID NO: 31, 32 pPs619C1204 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 CAG -> ATG Q481M SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1205 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 CAG -»■ CGC Q481R SEQ ID NO: 35, 36 Tabela 5 Sintase recombinante Substituição de ácido nucleico Substituição de aminoácido Iniciadores pPs619C1300 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC ACC S325T SEQ ID NO: 11, 12 CAG ATG Q481M SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1301 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -»> ACC S325T SEQ ID NO: 11, 12 CAG AAA Q481K SEQ ID NO: 31, 32 pPs619C1304 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -> CGC S477R SEQ ID NO: 21, 22 CAG -»· AAA Q481K SEQ ID NO: 31,32 pPs619C1305 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -»· CGC S477R SEQ ID NO: 21, 22 CAG -»· ATG Q481M SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1306 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC CGC S477R SEQ ID NO: 21, 22 CAG CGC Q481R SEQ ID NO: 35,36 pPs619C1307 GAA -»· GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -»· CAT S477H SEQ ID NO: 23, 24 CAG —» AAA Q481K SEQ ID NO: 31, 32 pPs619C1308 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -> CAT S477H SEQ ID NO: 23, 24 CAG ATG Q481M SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1309 GAA -»· GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -»■ CAT S477H SEQ ID NO: 23, 24 CAG -> CGC Q481R SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1310 GAA -)- GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC TTT S477F SEQ ID NO: 25, 26 CAG —> AAA Q481K SEQ ID NO: 31, 32 Tabela 6 Sintase Substituição de Substituição de Iniciadores recombinante ácido nucleico aminoácido pPs619C1311 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -»· TTT S477F SEQ ID NO: 25, 26 CAG -»■ ATG Q481M SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1312 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC TTT S477F SEQ ID NO: 25, 26 CAG CGC Q481R SEQ ID NO: 35, 36 pPs619C1313 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -»· TAT S477Y SEQ ID NO: 27, 28 CAG AAA Q481K SEQ ID NO: 31, 32 pPs619C1314 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -> TAT S477Y SEQ ID NO: 27, 28 CAG ATG Q481M SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1315 GAA -»· GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC TAT S477Y SEQ ID NO: 27, 28 CAG -> CGC Q481R SEQ ID NO: 35, 36 Tabela 7
Sintase recombinante Substituição de ácido nucleico Substituição de aminoácido Iniciadores pPs619C1400 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC ACC S325T SEQ ID NO: 11, 12 AGC -»· CGC S477R SEQ ID NO: 21, 22 CAG -»· ATG Q481M SEQ ID NO: 33,34 pPs619C1401 GAA -> GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC ACC S325T SEQ ID NO: 11, 12 AGC -»■ CGC S477R SEQ ID NO: 21, 22 CAG —> AAA Q481K SEQ ID NO: 31, 32 pPs619C1334 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC ACC S325T SEQ ID NO: 11, 12 AGC -» TTT S477F SEQ ID NO: 25, 26 CAG -> ATG Q481M SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1336 GAA -»· GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC ACC S325T SEQ ID NO: 11, 12 AGC GGC S477G SEQ ID NO: 29, 30 CAG -> ATG Q481M SEQ ID NO: 33, 34 pPs619C1339 GAA GAT E130D SEQ ID NO: 15, 16 AGC -»· ACC S325T SEQ ID NO: 11, 12 AGC -»· TTT S477F SEQ ID NO: 25, 26 CAG AAA Q481K SEQ ID NO: 31,32
<Exemplo 7> Síntese de P(3HB-co-LA) usando diversos
mutantes
De acordo com o mesmo método como descrito no exemplo 3 acima, E. coli recombinante sendo capaz de expressar mutante de PHA sintase originada de Pseudomonas sp. 6-19 e propionil-CoA transferase foi construído, e P(3HB-co-LA) foi preparado com o E. Coli recombinante através do mesmo método como descrito no exemplo 4 acima. Resultados são mostrados nas tabela 8, 9 e 10. Tabela 8
Mutação Teor (% peso) LA mol% WT E130 S325 S477 Q481 Dupla C1-202 D K 36,6 35,3 C1-204 D M 28,2 19,7 C1-204 D M 42,9 10,7 C1-205 D R 22,9 35,1 Tabela 9 Mutação Teor (% peso) LA mol% WT E130 S325 S477 Q481 tripla C1-300 D T M 43,8 31,9 C1-304 D R K 20,2 22,0 Cl-305 D R M 51,8 15,2 Cl-306 D R R 23,5 26,8 Cl-307 D H K 36,9 31,0 Cl-308 D H M 47,0 27,6 C1-309 D H R 28,5 39,8 Cl-310 D F K 60,4 15,0 C1-311 D F M 49,2 32,3 Cl-312 D F R 57,9 13,2 C1-313 D Y K 51,3 18,5 Cl-314 D Y M 50,8 29,3 Cl-315 D Y R 46,1 17,1 Tabela 10 Mutação Teor (% peso) LA mol% WT E130 S325 S477 Q481 Quádrupla C1-400 D T R M 15,8 15,4 Cl-401 D T R K 12,9 12,5 Cl-334 D T F M 1,6 20,8 Cl-336 D T G M 10,3 17,5
Como mostrado nas tabelas 8, 9 e 10, mutantes da PHA sintase da presente invenção são capazes de preparar eficientemente copolímeros de lactato com Iactil-CoA como substrato. [APLICABILIDADE INDUSTRIAL]
Como mostrado acima, mutantes de poli-hidroxialcanoato sintase da presente invenção originados de Pseudomonas sp. 6-19 podem preparar eficientemente polímero e/ou copolímero de lactato usando, como substrato, Iactil-CoA que é difícil de ser usado como substrato por poli- hidroxialcanoato sintase convencional.
Claims (12)
1. Mutante de poli-hidroxialcanoato sintase usando Iactil-CoA como um substrato para produzir polímero de lactato ou copolímero de lactato e tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ. ID No: 10, caracterizado pelo fato de que a glutamina em posição 481 da seqüência de aminoácidos de SEQ. ID No: 10 é mudada.
2. Mutante de poli-hidroxialcanoato sintase de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos um aminoácido selecionado dentre o grupo consistindo de glutamato em posição 130; serina em posição 325; e serina em posição 477 é ainda mudado.
3. Mutante de poli-hidroxialcanoato sintase de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos tem qualquer mutação dentre: a) S325T e Q481M; b) E130D e Q481K; c) S325T e Q481K; d) E130D e Q481M; e) E130D e Q481R; f) E130D, S325T e Q481M; g) E130D, S325T e Q481K h) E130D, S477R e Q481K i) E130D, S477R e Q481M: j) E130D, S477R e Q481R; k) E130D, S477H e Q481K; 1) E130D, S477H e Q481M; m) E130D, S477H e Q481R; n) E130D, S477F e Q481K; o) E130D, S477F e Q481M; ρ) E130D, S477F e Q481R; q) E130D, S477Y e Q481K; r) E130D, S477Y e Q481M; s) E130D, S477Y e Q481R; t) E13 OD, S325T, S477R e Q481M; u) E130D, S325T, S477R e Q481K; v) E130D, S325T, S477F e Q481M; w) E130D, S325T, S477G e Q481M; ou x) E130D, S325T, S477F e Q481K.
4. Gene, caracterizado pelo fato de codificar o mutante de poli- hidroxialcanoato sintase como definido na reivindicação 1.
5. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de compreender o gene como definido na reivindicação 4, para sintetizar o polímero ou copolímero de lactato.
6. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender ainda um gene codificando propionil-CoA transferase (pct).
7. Célula ou planta, caracterizada pelo fato de ser transformada com o vetor recombinante como definido na reivindicação 5.
8. Célula ou planta, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir da transformação com o vetor recombinante como definido na reivindicação 6, em que a célula ou planta original não tem um gene codificando propionil-CoA transferase.
9. Método para preparar polímero de lactato ou copolímero de lactato, caracterizado pelo fato de que o método compreende cultivar a célula ou planta como definido na reivindicação 7 ou 8.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado em um meio compreendendo hidroxialcanoato e o copolímero é um copolímero compreendendo unidade de monômero de hidroxialcanoato e unidade de monômero de lactato.
11.
Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o hidroxialcanoato é pelo menos um selecionado dentre o grupo consistindo de 3-hidroxibutirato, 3- hidroxivalerato, 4-hidroxibutirato, ácido (D)-3-hidroxicarboxílico com comprimento de cadeia médio (Có-h), ácido 3-hidroxipropiônico, ácido 3- hidroxihexanóico, ácido 3-hidroxiheptanóico, ácido 3-hidroxioctanóico, ácido 3-hidroxinonanóico, ácido 3-hidroxidecanóico, ácido 3-hidroxiundecanóico, ácido 3-hidroxidodecanóico, ácido 3-hidroxitetradecanóico, ácido 3- hidroxihexadecanóico, ácido 4-hidroxivalérico, ácido 4-hidroxihexanóico, ácido 4-hidroxiheptanóico, ácido 4-hidroxioctanóico, ácido 4- hidroxidecanóico, ácido 5-hidroxivalérico, ácido 5-hidroxihexanóico, ácido 6- hidroxidodecanóico, ácido 3-hidroxi-4-pentenóico, ácido 3-hidroxi-4-trans-hexenóico, ácido 3-hidroxi-4-cis-hexenóico, ácido 3-hidroxi-5-hexenóico, ácido 3-hidroxi-6-trans-octenóico, ácido 3-hidroxi-6-cis-octenóico, ácido 3- hidroxi-7-octenóico, ácido 3-hidroxi-8-nonenóico, ácido 3-hidroxi-9- decenóico, ácido 3-hidroxi-5-cis-dodecenóico, ácido 3-hidroxi-6-cis- dodecenóico, ácido 3-hidroxi-5-cis-tetradecenóico, ácido 3-hidroxi-7-cis- tetradecenóico, ácido 3-hidroxi-5,8-cis-cis-tetradecenóico, ácido 3-hidroxi-4- metilvalérico, ácido 3-hidroxi-4-metilhexanóico, ácido 3-hidroxi-5- metilhexanóico, ácido 3-hidroxi-6-metilheptanóico, ácido 3-hidroxi-4- metiloctanóico, ácido 3-hidroxi-5-metiloctanóico, ácido 3-hidroxi-6- metiloctanóico, ácido 3-hidroxi-7-metiloctanóico, ácido 3-hidroxi-6- metilnonanóico, ácido 3-hidroxi-7-metilnonanóico, ácido 3-hidroxi-8- metilnonanóico, ácido 3-hidroxi-7-metildecanóico, ácido 3-hidroxi-9- metildecanóico, ácido 3-hidroxi-7-metil-6-octenóico, ácido málico, metil éster de ácido 3-hidroxi-succínico, metil éster de ácido 3-hidroxiadipínico, metil éster de ácido 3-hidroxi-subérico, metil éster de ácido 3-hidroxiazeláico, metil éster de ácido 3-hidroxi-sebácico, etil éster de ácido 3-hidroxi-subérico, etil éster de ácido 3-hidroxi-sebácico, propil éster de ácido 3-hidroxipimélico, benzil éster de ácido 3-hidroxi-sebácico, ácido 3-hidroxi-8-acetoxioctanóico, ácido 3-hidroxi-9-acetoxinonanóico, ácido fenóxi-3-hidroxibutírico, ácido fenóxi-3-hidroxivalérico, ácido fenóxi-3-hidroxiheptanóico, ácido fenóxi-3- hidroxioctanóico, ácido para-cianofenóxi-3-hidroxibutírico, ácido para- cianofenóxi-3-hidroxivalérico, ácido para-cianofenóxi-3-hidroxihexanóico, ácido para-nitrofenóxi-3-hidroxihexanóico, ácido 3-hidroxi-5-fenilvalérico, ácido 3-hidroxi-5-ciclohexilbutírico, ácido 3,12-di-hidroxidodecanóico, ácido 3,8-di-hidroxi-5-cis-tetradecenóico, ácido 3-hidroxi-4,5-epoxidecanóico, ácido 3-hidroxi-6,7-epoxidodecanóico, ácido 3-hidroxi-8,9-epoxi-5,6-cis- tetradecanóico, ácido 7-ciano-3-hidroxiheptanóico, ácido 9-ciano-3- hidroxinonanóico, ácido 3-hidroxi-7-fluoroheptanóico, ácido 3-hidroxi-9- fluorononanóico, ácido 3-hidroxi-6-clorohexanóico, ácido 3-hidroxi-8- clorooctanóico, ácido 3-hidroxi-6-bromo-hexanóico, ácido 3-hidroxi-8- bromo-octanóico, ácido 3-hidroxi-l 1-bromoundecanóico, ácido 3-hidroxi-2- butenóico, ácido 6-hidroxi-3-dodecenóico, ácido 3-hidroxi-2-metilbutírico, ácido 3-hidroxi-2-metilvalérico e ácido 3-hidroxi-2,6-dimetil-5-heptenóico.
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