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CN117143899B - 一种合成p34hb3hp的菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种合成p34hb3hp的菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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CN117143899B
CN117143899B CN202311377262.5A CN202311377262A CN117143899B CN 117143899 B CN117143899 B CN 117143899B CN 202311377262 A CN202311377262 A CN 202311377262A CN 117143899 B CN117143899 B CN 117143899B
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Abstract

本发明公开了一种合成P34HB3HP的菌株及其构建方法和应用。所述菌株的构建方法包括如下步骤：S1：体外扩增xylB‑xylD‑Kivd‑Yqhd目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；S2：体外扩增ppdA‑ppdC‑ppdB‑aldD‑orfZ目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；S3：体外扩增dhaB1‑ dhaB2‑dhaB3‑gdrA‑gdrB‑PduP‑PhaC目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；S4：将S1、S2和S3所述载体质粒共同导入菌株中。本发明的方法能够高效生产热学性能和机械性能优良的P34HB3HP材料，可将其作为生物降解材料使用。

Description

一种合成P34HB3HP的菌株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种合成P34HB3HP的菌株及其构建方法和应用。
背景技术
生物可降解聚合物在现代可持续发展的背景下具有极大的潜力，能够替代传统塑料，减少对环境的负面影响。聚羟基脂肪酸酯（简称PHA）是一类由羟基脂肪酸作为单体组成的生物聚酯。作为一种生物可降解塑料，PHA具有从刚性材料到弹性体的性能，可应用于各种包装材料和日常消费用塑料制品以及纺织纤维等。共聚物中单体种类的不同以及其比例的不同，给PHA结构变化带来了无限可能，赋予了PHA性能的多样化，如聚（3-羟基丁酸酯）（简称P3HB）、聚（3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯（简称P34HB）等，属于双聚物类型，这些双聚物聚合物在性能上存在一些限制，例如裂时延伸能力较低、材料易碎、韧性较差以及在高温下熔化不稳定等，因此在生物降解材料使用中具有一定的局限。
因此，亟需一种能够提高材料热力学性能和机械性能、生物相容好、降低生产成本、提高生产效率的方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种合成聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸-co-4-羟基丙酸）（P34HB3HP）的菌株及其构建方法和应用。
本发明提供一种合成聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸-co-4-羟基丙酸）的菌株的构建方法，包括如下步骤：
S1：体外扩增xylB-xylD-Kivd-Yqhd目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；
S2：体外扩增ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；
S3：体外扩增dhaB1-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；
S4：将S1、S2和S3所述载体质粒共同导入菌株中；
所述菌株为。
本申请中使用的菌株已于2021年8月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070）。保藏号为GDMCC NO:61850。菌株名称为/>，分类命名为盐单胞菌（Halomonas lutescens）。
进一步的，所述步骤S1使用的载体为pSEVA321，步骤S2使用的载体为pSEVA341，步骤S3使用的载体为pRSF。
进一步的，所述步骤S1、S2和S3中目的基因序列的扩增程序为：
（1）预变性：温度95℃，时间3 min；
（2）变性：温度95℃，时间15 sec；
（3）退火：温度56~60℃，时间15 sec；
（4）延伸：温度72℃，时间30~60 sec/kb；
（5）步骤（2）~（4）循环35次；
（6）彻底延伸：温度72℃，时间5 min。
本发明还提供一种合成聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸-co-4-羟基丙酸）的菌株，所述的构建方法得到。
本发明还提供一种使用所述的菌株合成聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸-co-4-羟基丙酸）的方法，包括如下步骤：（1）菌种活化后进行一级、二级种子培养，获得种子液；
（2）将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养。
进一步的，所述步骤（2）中发酵培养的温度为36~38℃，pH为8.2~8.5，时间为45~50h。
进一步的，所述步骤（2）中发酵培养基包括如下组分：甘油10 g/L、木糖10 g/L、葡萄糖10 g/L、氯化钠50 g/L、酵母粉1.2 g/L、尿素0.2~3 g/L、无水硫酸镁0.2 g/L、磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L、CaCl2·2H2O 2 g/L、HCl 12 mol/L、ZnSO4·7H2O 0.1 g/L、MnCl2·4H2O 0.03 g/L、、CoCl2·6H2O 0.2 g/L、CuSO4·5H2O 0.01 g/L、NiCl2·6H2O 0.02 g/L、NaMoO4·2H2O 0.03 g/L。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
（1）本发明的重组菌利用自身能生产3HB的特性，引入生产4HB和3HP的代谢途径，合成P34HB3HP三聚合物，提高了聚合物单体的应用领域。
（2）本发明的P34HB3HP为三聚合物，与传统双聚合物相比，分子量高，具有更强的热学性能更强和机械性能。
（3）本发明利用重组菌发酵生产P34HB3HP，生产工艺简单，实现高效可控的聚合物生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的利用4-羟基丁酸途径和3-羟基丙酸途径生产P34HB3HP的通路图；
图2为本发明实施例1中构建过程使用的pSEVA321xylB-xylD-Kivd-Yqhd质粒图谱；
图3为本发明实施例1中xylB-xylD-Kivd-Yqhd目的片段电泳图；
图4为本发明实施例1中构建过程使用的pSEVA341ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ质粒图谱；
图5为本发明实施例1中ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ目的片段电泳图；
图6为本发明实施例2中构建过程使用的pRSFdhaB123-gdrAB-PduP-PhaC质粒图谱；
图7为本发明实施例2中dhaB1-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC目的片段电泳图；
图8为本发明实施例4的P34HB3HP材料透明度展示图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明主要引入不同单体代谢途径并聚合形成不同聚合物，首先在中引入生产4-羟基丁酸和3-羟基丙酸单体代谢途径菌株，基于自身能合成3-羟基丁酸的基础上，促进/>合成P34HB3HP聚合物，具体途径如图1所示。
本发明的P34HB3HP聚合物构建方法：
S1：体外扩增xylB-xylD-Kivd-Yqhd和ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ引入，成功获得生产4HB的菌株MDF-9-4HB；
S2：体外扩增dhaB1-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC，导入MDF-9-4HB中，成功获得生产P34HB3HP的菌株MDF-9-34BP。
利用改造菌生产P34HB3HP其步骤方法如下：
（1）平板种子培养：菌种活化；
（2）摇瓶种子培养；
（3）溶氧和pH电极校正；
（4）发酵参数的设定；
（5）接种；
（6）发酵过程控制；
（7）菌体中PHA的提取。
发酵罐温度：36～38℃；pH 8.2～8.5。
实施例1 4-羟基丁酸代谢途径构建
1、xylB-xylD-Kivd-Yqhd基因表达
（1）质粒构建：PCR扩增的xylB-xylD-Kivd-Yqhd目的基因片段和质粒pSEVA321骨架，在Gibson连接酶的作用下，xylB-xylD-Kivd-Yqhd片段和pSEVA321骨架重组形成新的质粒，命名为pSEVA321xylB-xylD-Kivd-Yqhd，通过重叠延伸PCR以pSEVA321xylB-xylD-Kivd-Yqhd为模板得到xylB-xylD-Kivd-Yqhd，取部分产物送生物公司测序，质粒信息如图2所示。
（a）利用PCR扩增xylB-xylD-Kivd-Yqhd片段和pSEVA321骨架的引物如下（5’-3’）：
xylB-F：见SEQ ID No.1；
xylB-R：见SEQ ID No.2；
xylD-F：见SEQ ID No.3；
xylD-R：见SEQ ID No.4；
Kivd-F：见SEQ ID No.5；
Kivd-R：见SEQ ID No.6；
Yqhd-F：见SEQ ID No.7；
Yqhd-R：见SEQ ID No.8；
pSEVA321-F：见SEQ ID No.9；
pSEVA321-R：见SEQ ID No.10。
（b）其扩增体系和扩增程序见表1和表2：
表1 扩增体系表
表2 扩增程序表
PCR反应完成后，配制相应浓度的琼脂糖凝胶，进行电泳以便观察DNA条带的大小，将凝胶置于紫外灯下，迅速的切下目的DNA片段的凝胶，尽可能的将多余的凝胶切掉。
（c）Gibson Assembly法连接
将回收的DNA检测其浓度，再根据目的片段和pSEVA321骨架的长度、浓度计算DNA的添加比例，并利用Gibson混合酶进行连接，其Gibson Assembly连接体系和程序如表3和表4所示：
表3 Gibson Assembly连接体系表
表4 Gibson Assembly连接程序
（2）S17-1大肠杆菌转化
步骤1：将提前制备好的S17-1大肠杆菌感受态细胞从-80℃拿出，在冰上解冻，5min后待菌块融化；
步骤2：往感受态细胞中加入5 μL连接产物，轻轻的弹管壁将反应液混匀（请勿振荡混匀）。注：连接产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10；
步骤3：冰上冰浴30 min，42℃水浴热激2 min后，立即置于冰上冷却2 min，注：晃动会降低转化效率；
步骤4：向离心管中加入400 μL LB培养基（不含抗生素），混匀后放入37℃摇床中200 rpm复苏60 min；
步骤5：5000 rpm离心5 min收菌，弃掉350 μL上清留取100 μL轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上；
步骤6：将培养基倒置到37℃培养箱中培养12-16 h。
（3）单克隆菌落阳性验证
在相对应的抗性LB板上挑出菌落，并进行菌落PCR验证，将条带大小正确的PCR产物送至生物公司进行测序。
（4）选择序列正确的单菌落进行扩培，12-16 h后与在20LB平板中进行接合，8 h后挑取少量接合后菌体涂布于相对应抗性的60LB板上；36-48 h后再进行一次单克隆菌落验证。
（5）测序鉴定
测序结果表明本实施例菌株中成功转入了xylB-xylD-Kivd-Yqhd基因，并命名为MDF-9-1，通过目的产物的大小进行验证，如图3所示，目的片段为5412 bp，符合预期结果。
2、ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ基因表达
（1）质粒构建：利用重叠延伸PCR扩增ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ及pSEVA341骨架，ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ及pSEVA341骨架在Gibson连接酶作用下，组成新的质粒并标记为pSEVA341ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ，质粒信息如图4所示；以pSEVA341ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ为模板得到ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ序列，取部分产物送生物公司进行测序。参考实施例1的步骤，将SEVA341ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ转入MDF-9-1菌株中。结果表明MDF-9-1菌株中成功转入了ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ基因，通过目的产物的大小进行验证，如图5所示，目的片段为5360 bp，符合预期结果，将菌株命名为MDF-9-4HB。
（2）利用PCR扩增ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ及pSEVA341骨架的引物如下（5’-3’）：
ppdA-ppdC-ppdB-F：见SEQ ID No.11；
ppdA-ppdC-ppdB-R：见SEQ ID No.12；
aldD-F：见SEQ ID No.13；
aldD-R：见SEQ ID No.14；
orfZ-F：见SEQ ID No.15；
orfZ-R：见SEQ ID No.16；
pSEVA341-F：见SEQ ID No.17；
pSEVA341-R：见SEQ ID No.18。
实施例2 3-羟基丙酸代谢途径的构建及聚合物的生成
1、dhaB1-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC基因表达
质粒构建：利用重叠延伸PCR扩增dhaB1-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC及pRSF骨架；dhaB1-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC及pRSF骨架在Gibson连接酶作用下，组成新的质粒并标记为pRSFdhaB123-gdrAB-PduP-PhaC，以pRSFdhaB123-gdrAB-PduP-PhaC为模板得到dhaB1-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC序列，取部分产物送生物公司进行测序，质粒信息如图6所示。
具体步骤参考实施例1中xylB-xylD-Kivd-Yqhd基因表达，将pRSFdhaB123-gdrAB-PduP-Pha转入MDF-9-4HB中。通过目的产物的大小进行验证，如图7所示，目的片段为8254 bp，符合预期结果，结果表明本实施例MDF-9-4HB菌株中成功转入了dhaB1- dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC基因，将该菌命名为MDF-9-34BP。
2、利用PCR扩增dhaB1-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC及pRSF骨架的引物如下（5’-3’）：
pRSF-F：见SEQ ID No.19；
pRSF-R：见SEQ ID No.20；
dhaB1-dhaB2-dhaB3-F：见SEQ ID No.21；
dhaB1-dhaB2-dhaB3-R：见SEQ ID No.22；
gdrA-gdrB-F：见SEQ ID No.23；
gdrA-gdrB-R：见SEQ ID No.24；
PduP-F：见SEQ ID No.25；
PduP-R：见SEQ ID No.26；
PhaC-F：见SEQ ID No.27；
PhaC-R：见SEQ ID No.28。
实施例3 改造菌发酵结果
（1）培养基：
60LB平板培养基：酵母浸粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化钠60g/L、琼脂粉1.8 g/100 mL、氨苄青霉素50 μg/mL、卡那霉素30 g/mL，pH 8.0。
组分I：硫酸镁0.2 g/L、尿素1.0 g/L（配50倍浓缩的母液：10 g/L硫酸镁、3 g/L尿素）；
组分II：磷酸二氢钾5.2 g/L，配50倍母液260 g/L、葡萄糖溶液30 g/L：配葡萄糖母液500 g/L；
组分III（10 mL/L）：柠檬酸铁铵5 g/L，无水氯化钙1.5 g/L，12 mol/L盐酸41.7ml/L；
组分IV（1 mL/L）：七水硫酸锌100 mg/L、四水硫酸锰30 mg/L、硼酸300 mg/L、五水硫酸铜10 mg/L、钼酸钠30 mg/L。
发酵培养基（50MM培养基）：甘油10 g/L，木糖10 g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L，CaCl2·2H2O 2 g/L，HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.03 g/L，，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L。
（2）种子液制备
使用实施例1~2构建的两种菌进行发酵。
①菌种活化：
于实验室-80℃冰箱取菌种，用枪头挑取菌液划线接种于平板固体培养基（酵母粉5 g/L；胰蛋白胨10 g/L；氯化钠60 g/L，pH为8.5）上，37℃培养24 h。
②一级种子培养：
挑取单菌落接种于12 mL摇菌管（5 mL 60LB培养基：酵母粉5 g/L；胰蛋白胨10 g/L；氯化钠60 g/L；pH为8.5）中，将培养液置于摇床37℃、220 rpm培养12 h。
③二级种子培养：
吸取一级菌液200 μL（1％接种量），接种于150 mL锥形瓶（20 mL 60LB培养基）中，将置于摇床37℃、220 rpm培养12 h。
（3）发酵培养基准备
发酵培养基（50MM培养基）：甘油10 g/L、木糖10 g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠50 g/L、酵母粉1.2 g/L、尿素0.2~3 g/L、无水硫酸镁0.2 g/L、磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L、CaCl2·2H2O 2 g/L、HCl 12 mol/L、ZnSO4·7H2O 0.1 g/L、MnCl2·4H2O 0.03 g/L、、CoCl2·6H2O 0.2 g/L、CuSO4·5H2O 0.01 g/L、NiCl2·6H2O 0.02 g/L、NaMoO4·2H2O 0.03 g/L。
（4）发酵培养
将种子液按5%接种（2.5 mL）于500 mL锥形瓶内，置于摇床37℃、220 rpm培养48h。
（5）细胞干重及PHA含量测定
细胞干重（CDW）：将30~35 mL发酵后菌液置于50 mL离心管中，室温离心6分钟，转速为8000 rpm，倒掉上清；加入适量去离子水恢复原体积，重悬，保证沉淀完全消失，同等条件下离心，倒掉上清液；封口膜封口离心管置于-80℃冰箱冻存2 h；将离心管于真空冷冻干燥机内干燥12~16 h；称重，计算细胞干重（g/L）。
测定PHA含量：称取0.05 g研磨后的发酵得到的样品干菌体，3HB、4HB、3HP的标品3-羟基丁酸、γ-丁内酯、3-羟基丙酸同样品一样的处理置于密封性良好的酯化管中，加入2mL氯仿、1700 μL甲醇及300 μL浓硫酸，在100℃油浴下反应1 h，室温冷却后加入1 mL的ddH2O，充分震荡混匀后，静置分层。待水相和有机相完全分离后，取氯仿层（一般为下层）采用0.22 μm的有机滤膜过滤至液相瓶中，进行GC检测采用GC-7800气相色谱仪、毛细管色谱柱（Rtx-5型，长30 m，内径0.25 mm和固定相0.25 μm）和氢火焰离子检测（FID）。载气采用高纯氮。程序升温设定如表5所示：
表5 程序温度设定
进样体积为1 μL，采用外标法对PHA进行定量分析，根据峰面积计算PHA的产量，单体的检测通过标品的检测浓度计算出样品中的单体浓度。
（6）发酵结果
发酵结果如表6所示：
表6 改造菌的发酵结果
菌株 细胞干重（g/L） PHA（wt%） 3HB（wt%） 4HB（wt%） 3HP（wt%）
MDF-9 9.77 52.45 50.02 0 0
MDF-9-4HB 10.43 81.15 69.02 20.84 0
MDF-9-34BP 11.52 88.82 42.11 21.63 22.76
由上述结果表明，通过引入4HB和3HP代谢途径后，细胞干重和PHA含量分别提高到了11.52 g/L和88.82%，同时也促进了3HB、4HB、3HP比例的提升，其含量分别为42.11%、21.63%、22.76%。
实施例4 P34HB3HP材料的提取和性能测定
1、PHA材料提取
发酵后的菌液经离心后，冷冻干燥得到菌体，如实施例3（5）。菌体使用索氏提取仪提取出材料。随后材料重溶于氯仿，用无水乙醇沉淀后完成进一步提纯。提纯后的材料放置培养皿中于室温下自然除去乙醇备用可获得材料P（3HB-co-4HB-co-3HP），如图8。
2、P34HB3HP透明度展示
如图8所示，含有P34HB3HP聚合的PHA材料在透光性具有较好的透光性，可用作生物相容性好，可降解的透明材料。
3、热力学性能检测
（1）实验条件：实验使用差示扫描量热法（DSC），在温度范围从-80℃~200℃进行热分析。实验时使用氮气作为流体，并保持流量为每分钟50 mL。
（2）样品准备：每次实验样品的重量在5~10 mg；实验过程中先将温度降至-80℃，然后以每分钟10℃的速度升温至180℃，重复一次，以确保结果的可靠性。
（3）测量结果如表7所示，Tg为玻璃化温度、Tc为结晶温度、Tm为熔融温度。
表7 P34HB3HP热力学性能检测
由上述结果表明，三聚物P34HB3HP的Tg、Tc、Tm值均比二聚物P3HB和P34HB高，分别为6.8℃、47.2℃、168.2℃。
4、机械性能检测
（1）样品制备：取0.5~1.0 g纯化的PHA样品，将其充分溶解在20 mL氯仿中。将溶液装入玻璃平皿中，静置展开成薄膜。等待PHA膜完全干燥后，使用模具敲击以制备所需的测试样品形状。
（2）测量几何参数：使用游标卡尺测量每个样品的厚度、长度、宽度等几何参数数据。
（3）拉伸测试：使用GOTECH公司的AI-7000S型拉力机进行材料性能分析。将样品夹入模具中，并微调以确保样品拉直。测试程序的设置为：以10毫米/分钟的速度拉伸样品，断裂敏感度设为50最大百分比，力量极限点为18千克力，变形极限点为500毫米。
（4）分析结果：系统会自动计算出杨氏模量（E）、抗拉强度（σt）、断裂伸长率（εb）等材料性能参数。
（5）测量结果如表8所示：
表8 P34HB3HP机械性能检测
结果表明：P34HB3HP三聚物材料具有更低的杨氏模量和较高的抗拉强度和断裂伸长率，说明该材料更具有较强的塑性、延展性及较好的韧性。
5、热降解性测定
（1）样品准备：每次实验将纯化的PHA样品取5~10 mg，以控制样品的重量。
（2）气氛和升温速率：实验过程中使用氮气作为填充气体，以防止样品在分析中与氧气反应。升温速率设置为每分钟10℃。
（3）升温至600℃：将样品放置在实验装置中，然后以10℃/min的速率升温至600℃。
（4）分析结果：通过热失重分析，可以得出样品的热降解特性。在不同的PHA材料中，分解温度（Td）都在280℃左右。同时，随着4HB和3HP的比例升高，分解温度略微上升，从278℃上升至287℃。
（5）检测结果如表9所示。
表9 P34HB3HP热降解性能检测
结果显示：P34HB3HP三聚物热降解温度与二聚物P3HB和P34HB相比更高，可达289.73℃，说明P34HB3HP材料更耐高温。
6、分子量的测定
（1）样品溶解和准备：PHA样品被溶解在色谱纯氯仿中，使得终浓度达到2 g/L。
（2）杂质去除：样品经过凝胶渗透色谱（GPC）分析后，通过使用孔径为0.22微米的尼龙膜进行过滤，以去除可能存在的杂质。
（3）流动相和流速：在色谱分析中，作为流动相的是色谱纯氯仿，流速设定为1 mL/min，分析温度为35℃。
（4）上样量：每次样品的上样量为40 μL。
（5）标准样品：为了确定PHA的分子量，使用不同分子量的聚苯乙烯作为标准样品，通过标准曲线来确定PHA的分子量。
检测结果如表10所示，Mw是重均分子量，Mn是数均分子量，PDI是聚合物分散性指数。
表10 P34HB3HP分子量检测
结果显示：P34HB3HP的分子量高于P3HB和P34HB，Mw为430027，Mn为210315，PDI为2.044681。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQ ID No.29为xylB的核苷酸序列、SEQ ID No.30为xylD的核苷酸序列、SEQ IDNo.31为kivD的核苷酸序列、SEQ ID No.32为yqhD的核苷酸序列、SEQ ID No.33为xylB-xylD-Kivd-Yqhd的核苷酸序列、SEQ ID No.34为ppdA-ppdC-ppdB的核苷酸序列、SEQ IDNo.35为orfZ的核苷酸序列、SEQ ID No.36为aldD的核苷酸序列、SEQ ID No.37为dhaB1- dhaB2-dhaB3的核苷酸序列、SEQ ID No.38为gdrA-gdrB的核苷酸序列、SEQ ID No.39为Pdup的核苷酸序列、SEQ ID No.40为PhaC的核苷酸序列、SEQ ID No.41为ppdA-ppdC-ppdB- aldD-orfZ的核苷酸序列、SEQ ID No.42为dhaB1-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC的核苷酸序列。

Claims (6)

1.一种合成聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸-co-3-羟基丙酸）的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：体外扩增xylB-xylD-Kivd-Yqhd目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；
S2：体外扩增ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；
S3：体外扩增dhaB1-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；
S4：将S1、S2和S3所述载体质粒共同导入菌株中；
步骤S4所述菌株为Halomonas lutescens MDF-9，保藏编号为GDMCC NO:61850；
所述xylB-xylD-Kivd-Yqhd目的基因序列如SEQ ID No.33所示；
所述ppdA-ppdC-ppdB-aldD-orfZ目的基因序列如SEQ ID No.41所示；
所述dhaB1-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB-PduP-PhaC目的基因序列如SEQ ID No.42所示；
所述步骤S1使用的载体为pSEVA321，步骤S2使用的载体为pSEVA341，步骤S3使用的载体为pRSF。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1、S2、S3中目的基因序列的扩增程序为：
（1）预变性：温度95℃，时间3 min；
（2）变性：温度95℃，时间15 sec；
（3）退火：温度56~60℃，时间15 sec；
（4）延伸：温度72℃，时间30~60 sec/kb；
（5）步骤（2）~（4）循环35次；
（6）彻底延伸：温度72℃，时间5 min。
3.一种合成聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸-co-3-羟基丙酸）的菌株，其特征在于，由权利要求1~2任一项所述的构建方法得到。
4.一种使用权利要求3所述的菌株合成聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸-co-3-羟基丙酸）的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）菌种活化后进行一级、二级种子培养，获得种子液；
（2）将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中发酵培养的温度为36~38℃，pH为8.2~8.5，时间为45~50 h。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中发酵培养基包括如下组分：甘油10 g/L、木糖10 g/L、葡萄糖10 g/L、氯化钠50 g/L、酵母粉1.2 g/L、尿素0.2~3 g/L、无水硫酸镁0.2 g/L、磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L、CaCl2·2H2O 2 g/L、HCl 12 mol/L、ZnSO4·7H2O 0.1 g/L、MnCl2·4H2O 0.03 g/L、H2BO3 0.3 g/L、CoCl2·6H2O 0.2 g/L、CuSO4·5H2O 0.01 g/L、NiCl2·6H2O 0.02 g/L、NaMoO4·2H2O 0.03g/L。
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