BRPI0511325B1 - Product of analysis and respective method of detection - Google Patents

Description

“Produto de análise e respectivo método de detecção” Relatório Descritivo Antecedentes da Invenção Campo da Invenção A presente invenção refere-se genericamente ao campo da detecção de produtos de análise. Mais particularmente, a presente invenção refere-se à utilização de alterações nos perfis do Modo de Galeria de Sussurros (Whispering Gallery Mode - WGM) de partículas microesferoi-dais induzidas pela ligação do produto de análise a um parceiro ligante imobilizado na partícula, para, desta forma, detectar a presença do produto de análise. A presente invenção refere-se adicionalmente a protocolos de multiplexação e a produtos de análise detectados pelas alterações no perfil WGM.

Descrição do Estado da Técnica Os detalhes bibliográficos das referências providas no presente relatório estão listados ao final do Relatório Descritivo. A referência a qualquer estado da técnica neste relatório não é e não deve der encarada como reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que o estado da técnica faz parte do conhecimento geral comum em qualquer país.

Os rápidos avanços na genômica e proteônica destacaram as inadequações dos métodos trabalhosos tradicionais para o exame e detecção de interação entre duas moléculas. Ocorre uma necessidade de se divisar métodos extremamente sensíveis para a análise da interação entre moléculas diferentes e a detecção de produtos de análise numa amostra. O desenvolvimento de métodos que permitam essas análises sem a necessidade de se rotular um ou outro ou ambos produtos de análise e/ou seus parceiros ligantes é particularmente desejável.

Atualmente, os chips genéticos provêem um meio para a análise de ácido nucléico de alta performance utilizando conjuntos de oligonucle- otídeos imobilizados em lâminas. No entanto, esta tecnologia depende de rotulagem de pelo menos uma das moléculas.

Tentativas para se desenvolver métodos e dispositivos para o exame da interação de moléculas que não dependem da rotulagem de uma ou mais das moléculas incluem biossensores, que são muito fre-qüentemente utilizados para o exame de DNA e/ou proteínas com base em métodos óticos. Ver, por exemplo, Baird e Myszka, J. Mol Recognit. 14:261-268, 2001, Rich e Myszka, J. Mol Recognit 15:352-376, 2002, Li e colaboradores Science 299:840-843, 2003 e Lin e colaboradores Science 278:840-843, 1997, que descrevem métodos óticos incluindo dispositivos interferométricos. Malmqvist, Nature 361:186-187, 1993 descreve sensores de ressonância de plasma de superfície (Surface Plasmon Resonance -SPR). A SPR detecta um limite de <10 pg.mm'2 (Karlsson e Stahlberg, Anal Biochem. 228:274-280, 1995) e permite uma detecção em tempo real de interações biomoleculares. No entanto, a SPR requer instrumentação específica e dispendiosa e a capacidade de determinações multiple-xadas é limitada. A presente invenção provê reagentes e métodos para, inter alia, a detecção de interações entre produtos de análise e seus parceiros ligantes sem a necessidade de rotulagem de qualquer das moléculas.

Sumário da Invenção A presente invenção provê métodos e reagentes para, inter alia, detectar moléculas numa amostra. As moléculas são chamadas aqui de produtos de análise. A presença ou estrutura dos produtos de análise não necessita ser conhecida e, assim, o método em questão é ideal da a detecção de parceiros ligantes desconhecidos até o momento de receptores órfãos e moduladores potenciais da expressão de ácido nucléico ou proteína incluindo atividade, dobramento, antigenicidade ou função enzimáticas. Os métodos da presente invenção são baseados em parte no fenômeno de que rótulos oticamente detectáveis contidos em ou sobre uma partícula microesferoidal irão apresentar um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) distinto. A referência a “oticamente detectã-veis" inclui detecção por meios espectrométricos. Quando um produto de análise alvo interage com um parceiro ligante imobilizado a uma partícula microesferoidal, o perfil WGM se altera, possibilitando uma detecção muito sensível mesmo de eventos de ligação raros.

Os WGMs permitem apenas que certos comprimentos de onda luminosa sejam emitidos pela partícula. O resultado deste fenômeno é que as bandas de emissão amplas usuais (10-100 nm de extensão), por exemplo, de um fluoróforo, se tornam restritas e aparecem como uma série de picos agudos correspondendo efetivamente a padrões de modo estacionário de luz na partícula. De acordo com a presente invenção, foi determinado que o perfil WGM é extremamente sensível a alterações na superfície da partícula microesferoidal e que o perfil WGM se altera, quando a partícula microesferoidal interage com produtos de análise ou moléculas dentro de seu ambiente.

Da mesma forma, um aspecto da presente invenção contempla um método para a detecção de um produto de análise, compreendendo o referido método o contato de pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais com uma amostra supostamente compreendendo o dito produto de análise, em que cada partícula num conjunto de partículas microesferoidais compreende um rotulo oticamente detectável e um parceiro ligante supostamente imobilizado do citado produto de análise, em que cada conjunto de partículas apresenta um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) em que a ligação do dito produto de análise ao referido parceiro ligante imobilizado resulta numa alteração no citado perfil WGM do dito pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais, o que indica a presença do referido produto de análise.

Os métodos da presente invenção podem ser aplicados para a detecção de modulação no perfil WGM de uma partícula microesferoidal, em que a citada modulação resulta da detecção de ligação ou outra associação de moléculas, numa amostra, a partículas ligantes potenciais imobilizadas à superfície da partícula microesferoidal. A detecção de reações de ligação entre um produto de análise e seu parceiro ligante com base em alterações sensíveis em perfis WGM possibilita a identificação e isolamento dos produtos de análise.

Uma característica da presente invenção é que as partículas microesferoidais podem ser excitadas com uma ampla variedade de fontes luminosas, facilitando a determinação em muitos perfis WMG diferentes.

Um “rótulo oticamente detectáveP pode ser qualquer molécula, átomo ou íon que emita fluorescência, fosforecência e/ou incandescência. numa realização preferida da presente invenção, o rótulo oticamente detectável é um fluoróforo, o que pode englobar uma faixa de rótulos oticamente detectáveis tais como fluoróforos químicos e corantes bem como pontos quânticos. A presente invenção provê também uma partícula microesferoidal conforme descrita aqui imobilizada num suporte sólido, por exemplo, um suporte sólido pode incluir uma lâmina microscópica.

Numa realização específica, a presente invenção provê uma partícula microesferoidal que compreende uma partícula de látex ou sílica com de 1 pra a 100 pm de diâmetro, rotulada com um rótulo oticamente detectável, tal como um fluoróforo ou ponto quântico, compreendendo a partícula adicionalmente um suposto parceiro ligante de um produto de análise a ser detectado. O rótulo oticamente detectável é detectável em comprimentos de onda visíveis e a partícula microesferoidal exibe um ou mais perfis WGM. Um ou mais dos perfis WGM da partícula microesferoidal modula de forma detectável, quando os produtos de análise interagem com o parceiro ligante imobilizado na partícula. Qualquer de tais alterações no perfil WGM é indicativa da presença de um produto de análise que se ligou a seu parceiro ligante.

Exemplos de produtos de análise e parceiros ligantes incluem moléculas químicas, moléculas de ácido nucléico, proteínas, lipídeos, ácidos graxos e carboidratos. O método da presente invenção não requer nenhum conhecimento da existência, presença ou estrutura do produto de análise. Por exemplo, se se pretende encontrar uma molécula (isto é, um produto de análise) que interage com uma enzima ou o sítio catalítico de uma enzima no epitopo antigênico ou próximo a este de uma enzima ou proteína, então, o método descrito não requer o conhecimento de esse produto de análise existe. Neste caso, a partícula microesferoidal irá carregar o parceiro ligante alvo em sua superfície ou próxima a esta e as alterações nos perfis WGM são utilizados para detectar um produto de análise numa amostra tal como uma biblioteca combinatória, biblioteca química ou fonte de produto natural (por exemplo, amostra ambiental, soro, plasma ou extrato biológico) o qual interage com o parceiro ligante alvo. A presente invenção possibilita a multiplexação pela incorporação de conjuntos múltiplos de partículas microesferoidais em que cada conjunto compreende partículas de diferentes tamanhos e/ou rotuladas com diferentes fluorocromos e/ou diferentes parceiros ligantes. A presente invenção provê adicionalmente produtos de análise identificados pelo método em questão e kits úteis para a prática do método em questão.

Por todo este relatório, a não ser que o contexto exija diferentemente, a palavra "compreendem” ou variações desta tais como “compreende” ou “compreendendo” devem ser entendidas como implicando na inclusão de um elemento citado ou integrador ou grupo de elementos ou integradores, mas, não a exclusão de qualquer outro elemento ou integrador ou grupo de elementos ou integradores.

Uma lista de abreviações é provida na Tabela 1.

Tabela 1 - Abreviações Breve Descrição das Figuras A Figura 1 é uma representação gráfica que mostra um esquema do procedimento utilizado para produzir partículas microesferoidais rotuladas por ponto quântico. A Figura 2 é uma representação gráfica que mostra uma curva calculada mostrando como pequenas alterações no raio de uma partícula microesferoidal de sílíca leva a alterações claras no perfil WGM calculado da partícula microesferoidal. A Figura 3 é uma representação gráfica que mostra partículas microesferoidais compreendendo rótulos oticamente detectáveis de ponto quântico (QD), que exibem fluorescência distinta clara e perfis WGM definidos. A Figura 4 é uma representação gráfica que mostra espectros experimentais mostrando a troca observada no perfil WGM de partícula microesferoidal, quando uma mono-camada de um biopolímero é adsorvida nas partículas microesferoidais. QD = Controle de ponto quântico de partícula microesferoidal não revestida; PSS = partícula microesferoidal com mono-camada de sulfonato de poliestireno adsorvida (PSS); PVP = partícula microesferoidal com mono-camada de polivinilpirrolidona adsorvida (PVP). A Figura 5 é uma representação gráfica de perfis WGM para: (a) DNA conjugado como 48-meros a partícula Q-Sand; (b) pérolas Q-Sand hibridizadas a um DNA Transprobe, o complemento reverso de Transpro-be; e (c) pérolas Q-Sand hibridizadas a um produto de PCR.

Descrição Detalhada das Modalidade Preferidas A presente invenção provê métodos, inter alia, para a detecção de uma molécula chamada aqui de um produto de análise capaz de apresentar uma interação de ligação com uma outra molécula, chamada de seu parceiro ligante, imobilizada na superfície de uma partícula microesferoidal com um rótulo oticamente detectável que confere à partícula um perfil WGM definido. A referência a “oticamente detectável” inclui detecção por meios espectrométricos. Uma interação entre o produto de análise e o parceiro ligante induz uma alteração no perfil WGM. Os métodos descritos aqui podem ser utilizados para a detecção de produtos de análise em amostras e interações entre produtos de análise. Ressalte-se que nem o produto de análise nem o parceiro ligante requerem um rótulo. A interação induz uma alteração no perfil WGM da partícula microesferoidal. Os métodos da presente invenção são baseados, em parte, no fenômeno de que emissores de fluorescência contidos em ou sobre uma partícula microesferoidal estabelecem perfis WGM definidos. As partículas microesferoidais podem ser excitadas por uma ampla variedade de fontes luminosas. Isto facilita a determinação em muitas configurações diferentes e facilita a multiplexação.

Os WGMs permitem que apenas certos comprimentos de onda luminosa sejam emitidos por uma partícula. O resultado deste fenômeno é que as bandas de emissão amplas (10-100 nm de extensão) de um fluoróforo se tornam restritas e aparecem como uma série de picos agudos correspondendo efetivamente a padrões de modo estacionário da luz na partícula. O perfil WGM é extremamente sensível a interações ou associações com a superfície de uma partícula mícroesferoidal. Assim, mesmo eventos raros de ligação podem ser detectados devido à alteração no perfil WGM.

Deve ficar entendido que, a não ser que de outra forma indicado, a matéria da invenção não está limitada a formulações de partícula mi-croesferoidal, métodos de fabricação, protocolos de diagnóstico ou ensaio, ou semelhantes específicos, na medida em que podem variar. Deve ficar entendido também que a terminologia utilizada aqui tem o propósito de descrever realizações particulares apenas, e não se pretende que seja limitante. A referência a “um produto de análise” e a um “parceiro ligan-te” não deve ser entendida como se qualquer conhecimento da estrutura do produto de análise seja tido ou que necessário ser tido Deve ser observado que, conforme utilizadas no relatório em questão, as formas singulares “um” “uma”, “a” e “o” incluem os aspectos no plural, a não ser que o contexto já determine de forma diferente. Desta forma, por exemplo, a referência a “um pico” ou a “um perfil” inclui um pico ou perfil únicos bem como a dois ou mais picos ou perfis; uma “partícula microesferoidal” inclui uma partícula única bem como a duas ou mais partículas; e assim em diante.

Num aspecto, a presente invenção contempla um método para a detecção de um produto de análise, compreendendo o referido método o contato de pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais com uma amostra supostamente compreendendo o citado produto de análise, em que cada partícula no conjunto de partículas microesferoidais compreende um rótulo oticamente detectãvel e um suposto parceiro ligante do dito produto de análise imobilizado, em que cada conjunto de partícula apresenta um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) definido, onde a ligação do referido produto de análise ao citado parceiro ligante imobilizado resulta numa alteração no dito perfil WGM do referido pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais, o que é indicativo da presença do citado produto de análise.

As “partículas microesferoidais” contempladas pela presente invenção incluem partículas que compreendem qualquer material, homogêneo ou que, de outra forma possa, produzir um ou mais perfis WGM com base em seu rótulo oticamente detectável. Como será evidente aos especialistas na técnica, quase qualquer material, homogêneo ou não, pode ser utilizado como partícula microesferoidal. As partículas microesferoidais contempladas aqui podem compreender também mais de uma substância, e como tal pode compreender cápsulas, ligas ou misturas de substâncias orgânicas e/ou inorgânicas. É vantajoso para a quantificação dos dados gerados pelos métodos da presente invenção que a partícula microesferoidal compreenda um material substancialmente homogêneo com um índice de refração isotrópico e que seja também não absorvente (outro que não o rótulo oticamente detectável, que é descrito posteriormente abaixo).

Materiais particularmente úteis que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção e que representam realizações específicas da presente invenção incluem materiais selecionados da lista consistindo em: sílica (por exemplo, quartzo ou vidro), látex, óxido de titânio, dióxido de estanho, óxido de ítrio, alumina e outros óxidos de metal binário (tal como ZnO), perovskitas e outros óxidos de metal piezoelétrico (tais como BaTiOa), ZnS, sacarose, agarose e outras pérolas poliméricas. Numa realização particularmente preferida, a “partícula" e/ou a “partícula microesferoidal” compreende sílica.

Adicionalmente, as partículas contempladas pela presente invenção podem ser produzidas em qualquer formato tridimensional regular ou > irregular conveniente. No entanto, embora muitos formatos do material possam sustentar perfil WGM, é em geral prático se sintetizar pequenas esferas ou partículas esferoidais. Essas esferas ou partículas esferoidais são também chamadas aqui de “partículas microesferoidais” ou “microes-feras”. Da mesma forma, em realizações preferidas da presente invenção, as “partículas” e “partículas microesferoidais” da presente invenção são substancialmente esféricas ou esferoidais ou compreendem uma “micro-esfera”.

Embora as partículas da presente invenção possam ser chamadas de “microesferas”, o tamanho real das partículas microesferoidais depende de uma variedade de fatores e as partículas podem ou não apresentar medidas reais na faixa micrométrica. Numa realização preferida, as partículas microesferoidais da presente invenção apresentam um diâmetro (ou medida equivalente numa partícula não esferoidal) de cerca de 1 pm a cerca de 100 pm, incluindo 1 pm, 2 pm, 3 pm, 4 pm, 5 pm, 6 pm, 7 pm, 8 pm, 9 pm, 10 pm, 11 pm, 12 pm, 13 pm, 14 pm, 15 pm, 16 pm, 17 pm, 18 pm, 19 pm, 20 pm, 21 pm, 22 pm, 23 pm, 24 pm, 25 pm, 26 pm, 27 pm, 28 pm, 29 pm, 30 pm, 31 pm, 32 pm, 33 pm, 34 pm, 35 pm, 36 pm, 37 pm, 38 pm, 39 pm, 40 pm, 41 pm, 42 pm, 43 pm, 44 pm, 45 pm, 46 pm, 47 pm, 48 pm, 49 pm, 50 pm, 51 pm, 52 pm, 53 pm, 54 pm, 55 pm, 56 pm, 57 pm, 58 pm, 59 pm, 60 pm, 61 pm, 62 pm, 63 pm, 64 pm, 65 pm, 66 pm, 67 pm, 68 pm, 69 pm, 70 pm, 71 pm, 72 pm, 73 pm, 74 pm, 75 pm, 76 pm, 77 pm, 78 pm, 79 pm, 80 pm, 81 pm, 82 pm, 83 pm, 84 pm, 85 pm, 86 pm, 87 pm, 88 pm, 89 pm, 90 pm, 91 pm, 92 pm, 93 pm, 94 pm, 95 pm, 96 pm, 97 pm, 98 pm, 99 pm e 100 pm. As referências a estes tamanhos de microesferas incluem frações dos números inteiros. Por exemplo, frações entre 1 e 2 μηα incluem 1,05, 1,1, 1,15, 1,2, 1,25, 1,3, 1,35, 1,4, 1,45, 1,5, 1,55, 1,6, 1,65, 1,7, 1,75, 1,8, 1,85, 1,9, 1,95 ou 2,0.

Numa realização particular, as partículas microesferoidais são microesferas.

Um conjunto de partículas microesferoidais incluindo um conjunto de microesferas inclui uma multiplicidade (isto é, duas ou mais) partículas ou microesferas apresentando um rótulo ou um tamanho comuns ou um parceiro ligante imobilizado.

Conforme utilizado aqui, o termo “rótulo oticamente detectável” refere-se a qualquer molécula, átomo ou íon que emita fluorescência, fosforescência e/ou incandescência. O rótulo oticamente detectável pode ser escolhido para emitir em qualquer comprimento de onde no qual o perfil WGM possa ser facilmente resolvido. Isto depende da razão do comprimento de onda da emissão em relação ao raio da partícula. Dado que o raio da esfera é arbitrário, a emissão pode ser adequadamente escolhida a partir do ultravioleta (faixa de comprimento de onde de cerda de 350 nm a cerca de 3 nm), visível (faixa de comprimento de onde de cerca de 350 nm a cerca de 800 nm), próximo a infravermelho (NIR) (faixa de comprimento de onde de cerca de 800 nm a cerca 1500 nm) e/ou infravermelho (IR) (faixa de comprimento de onde de cerca de 1500 nm a cerca de 10 pm). Entretanto, devido à facilidade de detecção, numa realização particular, o rótulo oticamente detectável é detectável na faixa de comprimento de onda visível.

Numa realização particular, o rótulo oticamente detectável pode ser um rótulo oticamente detectável que emite radiação visível em resposta a excitação infravermelha. Esses rótulos oticamente detectáveis são aqui chamados também de “conversores de subida”.

Da mesma forma, outro aspecto da presente invenção provê um método para a detecção de um produto de análise, compreendendo o referido método o contato de pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais com uma amostra supostamente compreendendo o citado produto de análise, em que cada partícula num conjunto de partículas microesferoidais compreende um rótulo que emite radiação visível em resposta a excitação infravermelha e um suposto parceiro ligante do dito produto de análise imobilizado, em que cada conjunto de partícula apresenta um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) definido, onde a ligação do dito produto de análise ao referido parceiro ligante imobilizado resulta numa alteração do citado perfil WGM do dito pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais, o que é indicativo da presença do referido produto de análise. A única restrição quanto ao rótulo oticamente detectável é que a emissão do rótulo escolhido deve resultar em emissão de modo da cavidade.

Em realizações adicionais da invenção em questão, o rótulo oticamente detectável compreende um ou mais rótulos selecionados da lista consistindo num fluoróforo, uma partícula semicondutora, partícula de luminóforo, uma partícula dopada, ou um nanocristal e um ponto quân-tico. Além disto, a luz espalhada de pequenas partículas de metal (emissão de plasma de superfície) pode ser utilizada como um rótulo oticamente detectável, Da mesma forma, um aspecto adicional da presente invenção é direcionado para um método para a detecção de um produto de análise, compreendendo o referido método o contato de pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais com uma amostra supostamente compreendendo o citado produto de análise, em que cada partícula num conjunto de partículas microesferoidais compreende um rótulo oticamente detectável selecionado da lista que consiste em fluoróforo, partícula semicondutora, partícula de luminóforo, uma partícula dopada, ou um nanocristal e um ponto quântico e um suposto parceiro ligante do dito produto de análise imobilizado, em que cada conjunto de partícula apresenta um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) definido, onde a ligação do referido produto de análise ao citado parceiro ligante imobili- zado resulta numa alteração do dito perfil WGM do referido pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais, o que é indicativo da presença do citado produto de análise.

Noutra realização da presente invenção, o rótulo oticamente de-tectável é um fluoróforo. Conforme utilizado aqui, o termo “fluoróforo’ refere-se a qualquer moléculas que exibe propriedade de fluorescência. Para os propósitos aqui, o termo “fluorescência” pode ser definido com a propriedade de uma molécula em absorver luz com um comprimento de onda particular e re-emitir luz com um comprimento de onde maior. A alteração relaciona-se a uma perda de energia que ocorre no processo. O termo “fluoróforo” pode englobar uma variedade de rótulos oticamente detectáveis tais como fluoróforos químicos e corantes, bem como pontos quânticos.

Numa realização particular, a presente invenção provê um método para a detecção de um produto de análise, compreendendo o referido método o contato de pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais com uma amostra supostamente compreendendo o citado produto de análise, em que cada partícula num conjunto de partículas microesferoidais compreende um fluoróforo na forma de um ponto quântico e um suposto parceiro ligante do dito produto de análise imobilizado, onde cada conjunto de partícula apresenta um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) definido, em que a ligação do referido produto de análise ao citado parceiro ligante imobilizado resulta numa alteração do dito perfil WGM do referido pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais, o que é indicativo da presença do citado produto de análise.

Um rótulo oticamente detectável particularmente conveniente que pode ser utilizado de acordo com a presente invenção é se incorporar partículas fluorescentes sobre ou na partícula microesferoidal. Estas partículas de rótulo oticamente detectável podem ser tão pequenas que suas propriedades e a emissão se tornam dependentes do tamanho. Essas partículas pequenas de rótulo oticamente detectável são chamadas na técnica de nanopartículas semicondutoras, pontos quânticos, fios quânticos, bastões quânticos ou nanocristais ou partículas Q. Portanto, conforme utilizado aqui, o termo “ponto quântico” ou “QD” deve ser entendido como englobando todas tais partículas. Além disto, os rótulos oticamente detectáveis compreendendo QDs podem compreender partículas aproximadamente esféricas ou esferoidais, ou partículas esféricas ou esferoídais revestidas. Entretanto, o termo QD não deve ser considerado de forma alguma limitado a uma morfologia esférica, esferoidal, circular, cilíndrica ou qualquer outra morfologia de um “ponto”. Por exemplo, conforme utilizado aqui QDs podem compreender também outras morfo-logías incluindo, inter alia, partículas em forma de bastão, elipsoidais, ou semelhantes a bastão ou elipsoidais revestidas. QDs consistem num núcleo cristalino em escala nanométrica de material semicondutor; versões biologicamente ativas ou tipicamente circundadas por uma casca protetora e revestimento externo. Por exemplo, QDs podem compreender cristalitos que apresentam cerca de 2 nm a cerca de 30 nm de diâmetro (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nm) e podem conter aproximadamente 50-500.000 átomos no cristal, incluindo cristais luminescentes compreendendo materiais tais como ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, PbS, PbSe, PbTe, HgS, HgSe, HgTe, Si, ZnO. QDs fluorescem com um espectro de absorção amplo e um espectro de emissão estreito. Diferentemente de outros fluoróforos, que apresentam espectros de absorção distintos, QDs absorvem luz numa faixa espectral ampla, o que permite que os pontos quânticos sejam excitados com uma variedade de fontes luminosas, tais como lasers, lâmpadas de arco, ou LEDs. Além disto, uma coleção de diferentes QDs pode ser utilizada em aplicações de multiplexação utilizando-se uma única fonte de excitação. Entretanto, os espectros de emissão para cada ponto são tipicamente muito estreitos, da ordem de cerca de 30 nm, a cor exata dependendo do diâmetro da partícula e da composição. Além disto, o espectro de emissão estreito dos QDs permite a resolução espectral dos pontos adjacentes. Em adição aos benefícios acima, os QDs são relativamente fotoestáveis, mesmo durante excitação intensa, e são mais brilhantes que os fluoróforos. À luz do mencionado acima, deve ser entendido que a presente invenção engloba a utilização de QDs com tamanhos diferentes de maneira a otimizar os comprimentos de onda em que os perfis WGM podem ser gerados numa partícula microesferoidal.

Além disto, a presente invenção contempla QDs que são tratados com procedimentos tais como tratamento térmico, modificação de superfície, formação de liga, passívação de superfície ou capeamento com revestimentos de superfície para possibilitar ao QD emitir com alto rendimento quântico e aumentar a fotoestabilidade por períodos de tempo longos. QDs estão também disponíveis comercialmente de companhias tais como Quantum Dot Corp. (QDC), que produz QDs tais como o conjugado de estreptavidina Qdot [marca registrada] 605, contendo um núcleo de seleneto de cádmio que emite a 605 nm. Os conjugados Qdot que emitem a 525, 565, 585 e 655 nm estão também disponíveis. No entanto, deve ser entendido que a presente invenção não está limitada de forma alguma pela composição particular do QD (ou qualquer outro rótulo oticamente detectável) e qualquer QD (comercial ou não) pode ser compatível com a presente invenção.

Existem também muitos corantes fluorescentes que estão disponíveis na técnica e que podem ser utilizados como fluoróforos de acordo com a presente invenção. Uma propriedade importante de um corante fluorescente ou outro fluoróforo, que determina seu potencial para utilização, é o comprimento de onde de excitação do fluoróforo; este deve ser compatível com os comprimentos de onda disponíveis da fonte luminosa. Entretanto, muitos corantes fluorescentes diferentes e outros fluoróforos são familiares aos especialistas na técnica, e a escolha do marcador fluorescente de forma alguma limita a invenção em questão. “Fluoróforos” convenientes que podem ser utilizados para a rotulagem de uma partícula microesferoidal compreendem qualquer marcador fluorescente que seja excitável pela utilização de uma fonte luminosa selecionada do grupo abaixo: (i) Lasers de íon argônio - compreendem uma linha de 488 nm azul que é adequada para a excitação de muitos corantes e fluorocro-mos que fluorescem na região verde para vermelho. Estão também disponíveis lasers de argônio ajustáveis que emitem numa variedade de comprimentos de onda (458 nm, 488 nm, 496 nm, 515 nm, entre outros). (ií) Lasers de diodo - têm um comprimento de onde da emissão de 63 nm. Outros lasers de diodo que estão hoje disponíveis operam a 532 nm. Este comprimento de onda excita iodeto de propídeo (IP) idealmente. Lasers de diodo azuis que emitem luz em torno de 476 nm estão também disponíveis. Esses lasers de diodo podem ser convenientemente empregados para excitar WGMs nas partículas microesferoidais. (iii) Lasers a gás de HeNe - operam a 325 nm. Esses lasers podem ser convenientemente empregados para excitar WGMs nas partículas microesferoidais. (iv) Lasers de HeCd - operam a 325 nm. Esses lasers podem ser convenientemente empregados para excitar WGMs nas partículas microesferoidais. (v) Lâmpada de arco de mercúrio de 100 W - a fonte luminosa mais eficiente para a excitação de corantes UV como Hoechst e DAPI. (vi) Lâmpadas de arco de Xe e lâmpadas de quartzo de halogênio podem semelhantemente serem utilizadas como meio para excitar WGMs e assim utilizar as partículas como sensores.

Numa modalidade particular da presente invenção, os marcadores fluorescentes são selecionados de: corantes Alexa Fluor; corantes BoDipy, incluindo BoDipy 630/650 e BoDipy 650/665; corantes Cy, particularmente Cy3, Cy5 e Cy 5.5; 6-FAM (íluoresceína); fluoresceína dT; Hexaclo-rofluoresceína (HEX); ô-carboxi-^^-dicloro-^J’- dimetoxi-fluoresceína (JOE); corantes verde de Oregon, incluindo 488-X e 514; corantes de rodamina, incluindo verde de rodamina, vermelho de rodamina e ROX; carboxitetrametilrodamina (TAMRA); tetraclorofluores-ceína (TET); e vermelho do Texas.

Duas técnicas de coloração são comumente utilizadas para partículas microesferoidais rotuladas fluorescentes, coloração interna e coloração externa (rotulagem de superfície). As duas técnicas produzem partículas com propriedades singulares, cada uma benéfica para aplicações diferentes. A coloração interna produz partículas extrema-mente estáveis com emissões de fluorescência tipicamente estreitas. Estas partículas freqüentemente mostram uma maior resistência ao fotobran-queamento. Como o fluoróforo está no interior das pérolas, os grupos superficiais estão disponíveis para uso na conjugação dos ligantes (proteínas, anticorpos, ácidos nucléicos etc.) à superfície da pérola. Por esta razão, as pérolas rotuladas internamente são tipicamente utilizadas em aplicações de detecção de produto de análise e imunoensaios. A rotulagem de superfície envolve a conjugação do fluoróforo à superfície da partícula microesferoidal. Como os fluoróforos estão na superfície da partícula, são capazes de interagir com seu ambiente tal como os fluoróforos numa célula marcada. O resultado é um padrão de partícula que exibe as mesmas propriedades de excitação e emissão que as amostras de célula marcada, sob uma variedade de diferentes condições, tais como a presença de contaminantes ou alterações no pH. A natureza “ambientalmente responsiva” das partículas rotuladas de superfície os torna idealmente adequadas para mimetizar amostras biológicas. Partículas rotuladas externamente são freqüentemente utilizadas como controles e padrões numa variedade de aplicações utilizando detecção de fluorescên- cia. Entretanto, a presente invenção contempla a associação de uma partícula com um rótulo fluorescente por qualquer meio.

Os termos “partículas fosforescentes”, “partículas de luminóforo” ou “luminóforos” são utilizados aqui de forma intercambiável. O que constitui um rótulo oticamente detectável fosforescente deve ser prontamente entendido por um especialista na técnica. No entanto, como exemplo, que de forma alguma limita a invenção, luminóforos adequados incluem partículas pequenas de ZnS, ZnS:Cu, óxido de Eu e outros luminóforos utilizados em dispositivos mostradores.

Um rótulo oticamente detectável que compreende uma “partícula dopada” pode incluir uma partícula compreendendo quantidades absorvidas de um ou mais íons de terras raras, tais como Eu, Y, Yb, Sm e semelhantes.

Conforme utilizado aqui, o termo “rótulo oticamente detectável” deve ser entendido como englobando também rótulos oticamente detectá-veis múltiplos, misturas de rótulos oticamente detectáveis, nanocristais revestidos, ligas e outras misturas complexas que são evidentes ao especialista na técnica. A utilização de todos estes rótulos oticamente detectáveis em partículas microesferoidais deve ser considerada como dentro do escopo dos métodos e reagentes aqui descritos.

De acordo com a presente invenção, foi mostrado que a emissão de qualquer rótulo particular depende da distribuição do rótulo na partícula microesferoidal, do tipo de rótulo e da concentração do rótulo. No entanto, os métodos da presente invenção são ainda praticáveis independentemente de se o rótulo oticamente detectável está na superfície da partícula microesferoidal, presente como uma casca na partícula microesferoidal, localizado no núcleo da partícula microesferoi-dal ou está presente em mais de uma das localizações citadas.

Deve ser observado que os métodos da presente invenção não se baseiam na interrupção da emissão proveniente do rótulo oticamente detectável. Os métodos da presente invenção, entretanto, são baseados, em parte, numa modulação (isto é, alteração) no perfil WGM do rótulo oticamente detectável como resultado de uma interação ou associação de um produto de análise com um parceiro ligante imobilizado na superfície de uma partícula microesferoidal. WGMs, quando se trata de radiação eletromagnética, são as ressonâncias eletromagnéticas que podem ser estabelecidas quando a luz incidente interage com uma partícula de índice de refração mais alto que seu meio circundante. Os WGMs ocorrem em comprimentos de onda de luz ressonantes para um dado tamanho de partícula, e a natureza do WGM pode se alterar com, inter alia, o tamanho da partícula contendo o WGM e os índices de refração de ambas as partículas e o meio circundante. Além disto, o tamanho da partícula pode afetar também o WGM estabelecido. Os WGMs são estabelecidos quando a luz incidente é submetida a reflexão interna total na superfície da partícula. A reflexão interna total (TIR) pode ocorrer na interface entre dois meios não absorventes. Quando a luz que se propaga no meio com maior índice de refração encontra uma interface num meio de índice de refração mais baixo num ângulo de incidência acima de um ângulo crítico, a luz é totalmente refletida na interface e se propaga de volta para o meio de maior índice de refração. Como é evidente para um especialista na técnica, num meio tridimensional a luz pode ser refletida muitas vezes na partícula de maior índice de refração. Num WGM, a luz é concentrada próxima à circunferência da partícula e pode ser especificado um número modal ou uma ordem modal. O número modal, n, provê o número de comprimentos de onda em torno da circunferência da partícula, e a ordem modal, l, provê o número de máximos na dependência radial do campo eletromagnético na partícula.

Os emissores de fluorescência incorporados sobre ou numa partícula, conforme definido aqui, apresentam perfis WGM definidos. Estes modos permitem apenas que certos comprimentos de onde sejam emitidos pela partícula. O resultado deste fenômeno é que o espectro de emissão relativamente amplo usual de um rótulo oticamente detectável (por exemplo, fluoróforos tipicamente emitem numa banda larga de ΙΟΙ 00 nm) se torna restrito e aparece como uma série de “picos” agudos correspondendo efetivamente aos padrões do modo estacionário de luz na partícula. As séries de picos gerados como resultado do estabelecimento de um WGM na partícula microesferoidal da presente invenção são chamados aqui de “Perfis de Modo de galeria de Sussurros” ou “Perfis WGM”. O perfil WGM é extremamente sensível tanto à posição do rótulo oticamente detectável incorporado quando de sua concentração e configuração espacial em relação entre si. Além disto, o tamanho da partícula e o índice de refração são também importantes na determinação dos comprimentos de onda de emissão vistos num perfil WGM. É proposto que a posição e a amplitude de um ou mais dos picos num perfil WGM podem ser fortemente influenciadas pelas interações ou associações da partícula microesferoidal com moléculas numa amostra ou ambiente externo.

Num exemplo, a associação ou ligação de uma molécula a uma partícula microesferoidal altera o índice de refração efetivo da partícula microesferoidal alterando o perfil WGM gerado pela partícula microesferoidal. O termo “índice de refração” é prontamente entendido por um especialista na técnica. Em resumo, o índice de refração de um meio é um valor calculado a partir do razão da velocidade da luz num vácuo em relação a um segundo meio de maior densidade. No caso de uma partícula microesferoidal, uma alteração no “índice de refração efetivo” pode ser uma alteração no índice de refração da partícula microesferoidal completa, ou uma alteração no índice de refração efetivo pode ser uma alteração no índice de refração de uma região ou parte da partícula microesferoidal. Por exemplo, uma alteração no índice de refração efetivo de uma partícula microesferoidal pode compreender uma alteração no índice de refração da superfície e/ou periferia da partícula microesferoi- dal.

Numa realização particular, a presente invenção contempla um método para a detecção da ligação ou associação de uma molécula a, ou proximal com, a superfície ou sub-superfície da partícula microesferoidal onde a ligação ou associação da molécula a um parceiro ligante imobilizado da molécula provoca uma alteração no índice de refração efetivo na superfície da partícula microesferoidal.

Uma “sub-superfície” inclui bolsas ou poros que circundam a partícula ou que formam uma interface contínua entre um ambiente interno da partícula e um ambiente externo.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se à aplicação do método da presente invenção para a detecção de alterações da morfo-logia, formato ou tamanho de uma partícula microesferoidal, onde a partícula microesferoidal compreende uma partícula rotulada com um rótulo oticamente detectável e carrega uma molécula imobilizada à superfície ou sub-superfície da partícula, onde a referida partícula microesferoidal exibe um ou mais perfis WGM, e onde um ou mais perfis WGM baseados no rótulo da citada partícula microesferoidal se alteram de forma detectável com uma alteração na morfologia, formato ou tamanho da partícula microesferoidal, quando um produto de análise interage com a molécula imobilizada; compreendendo o método: (i) a determinação do perfil WGM inicial da partícula microesferoidal; (ii) a submissão da partícula microesferoidal a uma suposta alteração na morfologia, formato ou tamanho da partícula microesferoidal após uma interação potencial entre um produto de análise e a molécula imobilizada; (iii) a determinação de um ou mais perfis WGM subseqüentes da partícula microesferoidal; em que a modulação de um ou mais perfis WGM da partícula microesferoidal, em relação ao perfil inicial, é indicativa de uma alteração na morfologia, formato ou tamanho da partícula microesferoidal e da presen- ça de um produto de análise associado com a molécula imobilizada.

Conforme referido aqui “morfologia, formato ou tamanho” de uma partícula microesferoidal refere-se às dimensões espaciais da partícula microesferoidal. Da mesma forma, alterações da morfologia, formato ou tamanho da partícula microesferoidal incluem alterações em qualquer dimensão espacial da partícula microesferoidal incluindo, mas, sem limitação, alterações na altura, largura, profundidade, raio, diâmetro, circunferência e semelhantes.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção está direcionada para uma partícula microesferoidal que compreende uma partícula rotulada com um rótulo oticamente detectável, em que a partícula microesferoidal exibe um perfil WGM e onde o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado de forma detectável, quando um produto de análise interage com uma molécula imobilizada à dita partícula microesferoidal.

Conforme aqui utilizado, a molécula ou parceiro ligante imobilizado numa partícula microesferoidal ou o produto de análise numa amostra, referem-se a qualquer entidade química. Essas entidades químicas incluem, mas, sem limitação, moléculas químicas pequenas; peptí-deos, polipeptídeos e proteínas ou análogos destes, moléculas de ácido nucléíco ou análogos destas, átomos ou íons metálicos ou compostos compreendendo tais átomos ou íons. Das moléculas de ácido nucléico, RNAs interferentes curtos (de fita simples ou dupla) [siRNAs], complexos de RNA interferente (RNAi) e oligonucleotídeos de DNA e RNA, são particularmente contemplados. Compostos químicos incluem entidades produzidas numa biblioteca combinatória ou numa biblioteca química. Adicionalmente, é contemplada a seleção de produto natural a partir de uma fonte biológica. A referência uma fonte biológica inclui uma amostra ambiental, extrato de organismo, extrato de planta ou animal, soro, urina, sêmen, exsudato, plasma, amostra de solo, amostra fluvial ou marinha, amostra extraterrestre, entre outras fontes.

Conforme utilizada aqui, a frase “ligada a ou de alguma outra forma associado com” refere-se a qualquer processo pelo qual uma molécula pode ser associada com uma partícula microesferoidal. Modos típicos pelos quais essas associações podem ser mediadas incluem, mas, sem limitação; ligação covalente, ponde de hidrogênio, forças de van der Waals, ligação iônica, ligação metálica, ligação polar e ligação dativa (covalente) e semelhantes.

Uma molécula que inclui um parceiro ligante pode também ser fixada a uma partícula microesferoidal por meio de um agente que promova ou aumente a adsorção ou ligação da molécula à superfície da partícula microesferoidal, esse agente é aqui chamado de “ligante”. Por exemplo, polinucleotídeos podem ser associados com uma partícula microesferoidal por meio de um ligante que compreende um grupo tiol, amino ou carboxil. Exemplos de ligantes adequados incluem silanos terminados em amino tais como amino-propiltrimetoxisilano ou amino-propiltríetoxisilano. Em adição aos silanos, compostos tais como poli-L-lisina que se ligam de forma não covalente a superfícies tais como vidro e adsorvem eletrostaticamente os grupos fosfato de um polinucleotídeo estão também dentro do escopo da presente invenção. Por esta razão, outras moléculas, incluindo outros silanos, que são adequados para promover a ligação ou associação de um polinucleotídeo, polipeptídeo ou outro composto à superfície de uma partícula microesferoidal, serão prontamente identificadas por um especialista na técnica e a presente invenção não está limitada à escolha do ligante.

Numa modalidade, a presente invenção contempla uma partícula microesferoidal que compreende uma partícula rotulada com um rótulo otícamente detectável, em que a referida partícula microesferoidal exibe um perfil WGM e em que o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado de forma detectável, quando uma molécula se liga ou se associa com a partícula microesferoidal, tal como por meio de uma molécula compreendendo uma molécula de ácido nucléico ligada à, ou de outra forma associada com a superfície da partícula microesferoidal.

Os termos “ácido nucléico”, “nucleotídeo” e “polinucleotídeo” incluem RNA, cDNA, DNA genômico, formas sintéticas e polímeros mistos, fitas tanto senso quanto anti-senso e que podem ser modificados quimicamente ou bioquimicamente ou podem conter bases de nucleotí-deos não naturais ou derivatizadas, como será prontamente observado pelos especialistas na técnica. Essas modificações incluem, por exemplo, rótulos, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos naturais por um análogo (tal como um anel morfolino), modificações intra nucleotídeos tais como ligações não carregadas (por exemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos etc.), ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos etc.), radicais anexos (por exemplo, polipeptídeos), intercalantes (por exemplo, acridina, psoraleno etc.), quelantes, alquilantes e ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucléi-cos α-anoméricos etc.). Também incluídas então moléculas sintéticas que mimetizam polinucleotídeos em sua capacidade de ligação a uma sequência designada por meio de ponte de hidrogênio e outras interações químicas. Essas moléculas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, aquelas nas quais ligações peptídicas são substituídas por ligações fosfato no esqueleto da molécula.

Outra realização da presente invenção contempla uma partícula microesferoidal conforme descrita anteriormente, em que a partícula microesferoidal compreende adicionalmente DNA ligado a ou, de outra forma, associado com a superfície da partícula microesferoidal.

Ainda uma realização adicionalmente preferida da presente invenção contempla uma partícula microesferoidal conforme descrita anteriormente, em que a partícula microesferoidal compreende adicional-mente RNA ou um complexo de RNA (por exemplo, complexo RNA-RNAse) ligado a ou, de outra forma, associado com a superfície da partícula microesferoidal.

Numa modalidade alternativa, a presente invenção contempla uma partícula microesferoidal compreendendo uma partícula rotulada com um rótulo oticamente detectável, em que a partícula microesferoidal exibe um perfil WGM e onde o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado de forma detectável, quando um peptídeo, polipeptídeo ou proteína ou análogos destes se ligam ou de outra forma se associam com a superfície da partícula microesferoidal.

Em uma realização, o peptídeo, polipeptídeo ou proteína é uma enzima.

Noutra modalidade, o peptídeo, polipeptídeo ou proteína é um anticorpo. O termo “anticorpo” refere-se a uma proteína da família da imu-noglobulinas que é capaz de se combinar, interagir ou de outra forma se associar com um antígeno. Um anticorpo é, desta forma, uma molécula que se liga a um antígeno. O termo “antígeno” é utilizado aqui em seu sentido mais amplo para se referir a uma substância que é capaz de reagir com ou se ligar a um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo. Com referência à presente invenção, um antígeno inclui também o idioti-po de um anticorpo. O termo “imunoglobulina” é aqui utilizado para se fazer referência a uma proteína consistindo num ou mais polipeptídeos substancialmente codificados pelos genes da imunoglobulina. As moléculas de imunoglo-bulinas incluem as regiões constantes κ, λ, α, γ (IgGi, IgG2, IgG3, IgG4), δ, ε e μ, cadeias leves (κ e 1), bem como as muitas regiões variáveis das imunoglobulinas, Uma forma de imunoglobulina constitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Esta forma é um tetrâmero e consiste em dois pares idênticos de cadeias de imunoglobulina, cada par apresentando uma cadeia leve e uma pesada. Em cada par, as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada são em conjunto responsáveis pela ligação a um antígeno e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efetoras do anticorpo. Em adição aos anticorpos, as imunoglo-bulinas podem existir numa variedade de outras formas incluindo, por exemplo, Fv, Fab, Fab’ e (Fab j2 e anticorpos quiméricos e todas estas variantes são englobadas pelo termo “anticorpo”, conforme utilizado aqui. Adicionalmente, imunoglobulinas de outros animais (por exemplo, aves, mamíferos, peixes, anfíbios, e répteis) apresentam funções semelhantes, apesar da nomenclatura diferente, são também consideradas como “anticorpos”. A presente invenção contempla também partículas microesferoi-dais compreendendo anticorpos anti-ideotípicos ligados a ou, de outra forma, associados com essas. Conforme utilizado aqui, o termo “anticorpo anti-ideotípico” refere-se a um anticorpo que reconhece e se liga a determinantes antigênicos dentro da região variável, por exemplo, os domínio Vh e/ou Vl, de um anticorpo alvo. Estes determinantes antigênicos dentro da região variável de um anticorpo são chamadas de “ideoti-po” de um anticorpo. Da mesma forma, um anticorpo específico para estas regiões é chamado de um “anticorpo anti-ideotípico”. “Análogos” de peptídeos, polipeptídeos e/ou proteínas contemplados aqui incluem, mas, sem limitação, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas compreendendo uma modificação nas cadeias laterais, peptídeos sintéticos que incorporam aminoácidos não naturais e/ou seus derivados durante a síntese e a utilização de reticuladores e outros métodos que provoquem restrições conformacionais no peptídeo, polipeptídeo ou proteína em questão.

Exemplos de modificações de cadeia lateral incluem modificações dos grupos amino tais como por alquilação redutora por reação com um aldeído seguida da redução com NaBfh; amidinação com metilaceti-midato; acilação com anidrido acético; carbamoilação dos grupos amino com cianato; trinitrobenzilação dos grupos amino com ácido 2,4,6-trinitrobenzenosulfôníco (TNBS); acilação dos grupos amino com anidrido succínico e anidrido tetrahidroftálico; e piridoxilação de lisina com piri-doxal-5-fosfato seguido da redução com NaBH4. O grupo guanidino dos resíduos de arginina pode ser modificado pela formação de produtos de condensação heterocíclica com reagentes tais como 2,3-butadiona, fenilglioxal e glioxal. 0 grupo carboxil pode ser modificado por ativação de carbo-diimida por meio da formação de O-aciüsouréia seguida de derivatização subsequente, por exemplo, para a amida correspondente.

Os grupos sulfidril podem ser modificados por métodos tais como carboximetilação com ácido iodoacético ou iodoacetamida; oxidação de ácido perfórmico a ácido cisteico; formação de um dissulfeto misto com outros compostos tiol; reação com maleimída, anidrido maleico, ou outra maleimida substituída; formação de derivados mercuriais utilizando-se 4-cloromercurobenzoato, ácido 4-cloromercurofenilsulfônico, cloreto de fenilmercúrio, 2-cloromercuro-4-nitrofenol e outros mercuriais; carba-moilação com cianato em pH alcalino.

Os resíduos de triptofano podem ser modificados, por exemplo, por oxidação com N-bromosuccinimida ou alquilação do anel indol com brometo de 2-hidroxi-5-nitrobenzila ou haletos de sulfonila para formar um derivado 3-nitrotirosina.

As modificações do anel imidazol de um resíduo de hístidina podem ser realizadas por alquilação com derivados de ácido iodoacético ou N-carbetoxilação com dietilpirocarbonato.

Exemplos de incorporação de aminoácidos não naturais e derivados durante a síntese de peptídeo incluem, mas, sem limitação, a utilização de norleucina, ácido 4-aminobutírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanóico, ácido 6-aminohexanóico, t-butilglicina, norvalina, fenil-glicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-õ-metilhepta-nóico, 2-tienilalanima e/ou D-isômeros de aminoácidos. Uma lista de aminoácidos não naturais contemplados aqui, é mostrada na Tabela 2.

Tabela 2 - Códigos Para Aminoácidos Não Convencionais Aminoácido Códi- Aminoácido Códi- não convencional__________go_________não convencional__________go ácido α-aminobutírico Abu L-N-metilalanina Nmala a-amino-a-metilbutirato Mgabu L-N-metilarginina Nmarg aminopropano-carboxilato Cpro ácido L-N-metil-aspártico Nmasp ácido aminoisobutírico Aib L-N-metilcisteína Nmcys aminonorbornil- Norb ácido L-N-metil-glutâmico Nmglu carboxilato ciclohexilalanina Chexa L-N-metilhistidina Nmhis ciclopetilalanina Cpen L-N-metilisoleucina Nmile D-alanima Dal L-N-metilleucina Nmleu D-arginina Darg L-N-metillisina Nmlys ácido D-aspãrtico Dasp L-N-metilmetionina Nmmet D-cisteína Dcys L-N-metilnorleucina Nmnle D-glutamina Dgln L-N-metilnorvalina Nmnva ácido D-glutâmico Dgíu L-N-metilornitina Nmom D-histidina Dhis L-N-metilfenilalanina Nmphe D-isoleucina Dile L-N-metilprolina Nmpro D-leucina Dleu L-N-metilserina Nmser D-lisina Dlys L-N-metiltreonina Nmthr D-metionaína Dmet L-N-metiltriptofano Nmtrp D-ornitina Dom L-N-metiltirosina Nmtyr D-fenilalanina Dphe L-N-metilvalina Nmval D-prolina Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg D-serina Dser L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug D-treonina Dthr L-norleucina Nle D-triptofano Dtrp L-norvalina Nva D-tirosina Dtyr α-metil-aminoisobutirato Maib D-valina Dval a-metil-y-aminobutirato Mgabu Aminoácido Códi- Aminoácido Códi- não convencional_____________go___________nào convencional_____________go D-a-metilalanina Dmala α-metilciclohexilalanina Mchexa D-a-metilarginina Dmarg a-metilciclopentílalanina Mcpen D-a-matilasparagina Dmasn α-metil-a-naftilalanina Manap D-a-metilaspartato Dmasp α-metilpenicilamina Mpen D-a-metilcisteína Dmcys N-(4-aminobutil)glicína Nglu D-a-metilglutamina Dmgln N-(2-aminoetil)glicina Naeg D-a-metilhistidina Dmhis N-(3-aminopropii)glicina Nom D-a-metilisoleucina Dmile N-amino-a-metilbuíirato Nmaabu D-a-metíl-leucina Dmleu α-naftilalanina Anap D-a-metil-lisina Dmlys N-benzilglicina Nphe D-a-metilmetionina Dmmet N-(2-carbamüetü)gEdna Ngln D-a-metilmetilornitina Dmorn N-(carbamilmetil)glicina Nasn D-a-metilfenilalanina Dmphe N-(2-carboxietil)glicma Nglu D-a-metilprolina Drapro N-(carboximetil)glicina Nasp D-a-metilserina Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut D-a-metiltreonina Dmthr N-cicloheptilglicina Nchep D-d-metiltriptofano Dmtrp N-ciclohexilglicina Nchex D-a-metiltirosina Dmly N-ciclodecilglicina Ncdec D-a-metilvalina Dmval N-ciclododecilglicina Ncdod D-N-metilalanina Dnmala N-ciclioctilglicina Ncoct D-N-metilarginina Dnmarg N-ciclopropilgHcina Ncpro D-N-metilasparagina Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund D-N-metilaspartato Dnmasp N-{2;2-difeniletil)gl.icina Nbhm D-N-metilcisteína Dnmcys N-(3,3<ffenilpropI)glic^ Nbhe D-N-metilglutamina Dnmgln N^3^uanidinopropi^i(±ia Narg D-N-metilglutamato Dnmglu N-(l-hidroxietil)glicina Nthr D-N-metilhistidina Dnmhis N-(hidroxietil)glicina Nser D-N-metilisoleucina Dnmile N-(imidazoliletil)glicina Nhis D-N-metil-leucina Dnmleu N-(3-indolileti])glicina Nhtrp Aminoácido Códi- Aminoácido Códi- não convencional____________go__________nâo convencional____________go D-N-metil-lisina Dnmlys N-metil-y-aminobutirato Nmgabu N-metiiciclohexilalanina Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet D-N-metilornitina Dnmom N-metildclopentilalanina Nmcpen N-metilglicina Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe N-metílaminoisobutimto Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro N- (1 -metilpropiljglicina Nile D-N-metilserina Dnmser N-(2-metilpropil)glicina Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr D-N-metiltriptofano Dnmtrp N-(l-metiletil)glicina Nval D-N-metiltirosina Dnmtyr N-metilnaftilalanina Nmanap D-N-metilvalina Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen ácido γ-aminobutírico Gabu N-(p-hidroxÍfenil)glicina Nhtyr L-í-butilglicina Tbug N-(tiometil)glicina Ncys L-etilglicina Etg penicilamina Pen L-homofenilalanina Hphe L-a-metilalanína Mala L-a-metilarginina Marg L-a-metilasparagina Masn L-a-metilaspartato Masp L-a-metil-í-butilglicina Mtbug L-a-metilcisteína Mcys L-metiletilglicina Metg L-a-metilglutamina Mgln L-a-metilglutamato Mglu L-a-metilhistidina Mhis L·α-meti]homofeni]alanina Mhphe L-a-metilisoleucina Mile N-(2-metiltioetil)glicina Nmet L-a-metil-leucina Mleu L-a-metil-lisina Mlys L-a-metilmetionina Mmet L-a-metilnorleucina Mnle L-a-metilnorvalina Mnva L-a-metilornitina Mom L-a-metilfenilalanina Mphe L-a-metilprolina Mpro L-a-metilserina Mser L-a-metiltreonina Mthr L-a-metiltriptofano Mtrp L-a-metilmetiltirosina Mtyr L-a-metilvalina Mval L·N-metilhomofenilalanina Nmhphe N-(N-(2,2-difeniletil- N-(N-(3,3-difenilpropil- Nnbhm Nnbhe carbamilmeíiljglicina carbamilmetil) glicina Aminoácido Códi- Amínoácido Códi- não convencional___________go_________não convencional___________go l-carboxi-l-(2,2-difenil- Nmbe etüarninojciclopropano____________________________________________________ Os reticuladores podem ser utilizados, por exemplo, para estabilizar as conformações 3D, utilizando-se reticuladores homo-bifuncionais tais como os ésteres imido bifuncionais contendo grupos espaçadores (CH2)n com n=l a n=6, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida e reagentes hetero-bifuncionais os quais usualmente contém um radical amino reativo tal como N-hidroxisuccinimida e um outro radical reativo específico de grupo tal como maleimido ou radical ditio (SH) ou carbodii-mida (COOH). Adicionalmente, peptídeos podem ser restritos em sua conformação, por exemplo, pela incorporação de ácidos CQ e Na-metilamíno, introdução de duplas ligações entre os átomos C0 e Cp dos aminoácidos e a formação de peptídeos cíclicos ou análogos, pela introdução de ligações covalentes tais como pela formação de uma ligação amida entre os N e C terminais, entre duas cadeias laterais ou entre uma cadeia lateral e os N ou C terminais.

Em ainda uma outra modalidade preferida alternativa, a presente invenção contempla uma partícula microesferoidal compreendendo uma partícula rotulada com um rótulo oticamente detectável, onde a partícula microesferoidal exibe um perfil WGM e em que o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado de forma detectável quando uma molécula de carboidrato ou análogo deste se liga ou, de outra forma, se associa com a superfície da partícula microesferoidal.

Em uma modalidade particularmente preferida, a molécula de carboidrato é uma molécula de glicosamino-glicano (GAG) ou molécula semelhante a GAG.

Os GAGs são onipresentes e representam papéis fundamentais em muitos dos processos inflamatórios no corpo humano. Estes polissaca- rídeos de alto peso molecular contribuem para processos tais como me-tástase em câncer, artrite, rejeição de transplante e asma e, desta forma, uma maior compreensão destes processos pode levar a drogas aperfeiçoadas para tratamento eventual de tais condições. Atualmente, um dos GAGs mais conhecidos é a família das heparinas de polissacarídeos sulfatados e a atividade anti-coagulante destas moléculas é bem entendida.

Os GAGs semelhantes a heparina (HLGAGs) são um grupo heterogêneo de moléculas (Conrad, “Heparin binding proteins”. Academic Press, San Diego, 1998; Lander e Selleck, J. Cell Biol 148^:227-232, 2000). Heparina e sulfato de heparano, como todos os HLGAGs, são polissacarídeos lineares longos (Sasisekharan e Venkataraman, Curr. Opin. Chem. Biol 4^:626-631, 2000; Casu, Ann. NYAcad. Sei 556:1-17, 1989; Casu, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 43:51-134, 1985). São sintetizados como cadeias não sulfatadas de unidades de dissacarídeo repetidas compreendendo ácido glicurônico (GlcA) e glicosamina (GlcN) que, no aparelho de golgi, são modificadas em vários locais ao longo de seu comprimento. A heparina é mais extensivamente modificada que o sulfato de heparano e a maioria das unidades GlcN são modificadas por um grupo sulfato para se tornarem GlcN JV-sulfatados e a maioria das unidades GlcA são convertidas a ácido idurônico (IdoA) pela ação de epímerase. HLGAGs são heterogêneos uma vez que as modificações nas cadeias de sulfato são freqüentemente incompletas. O resultado são regiões extensas de modificação intermediária.

Desta forma, por exemplo, cadeias de sulfato de heparano consistem em domínios estruturalmente flexíveis altamente sulfatados ricos em IdoA 2-O-sulfatados alternando com regiões de baixa sulfatação consistindo predominantemente em JV-acetil GlcN e GlcA, que apresentam uma estrutura rígida. Os padrões de sulfatação de HLGAGs são complexos especialmente no que diz respeito ao posicionamento dos 6-O-sulfatos. Conseqüentemente, nem todas as moléculas de HLGAG são idênticas. É o padrão de sulfatação que determina grandemente as características de ligação da proteína de um HLGAG particular.

Algumas proteínas se ligam apenas a motivos estruturais particulares de uma cadeia HLGAG e inversamente alguns GAGs se ligam ape-5 nas a sítios ou regiões particulares numa proteína. A anti-trombina III, por exemplo, se liga a uma seqüência de pentassacarídeo única contendo uma disposição particular de grupos sulfato e a pentassacarí-deo-heparína se liga a um sítio específico na proteína anti-trombina III (Whisstock e colaboradores J. Mol. Biol 301:1287-1305, 2000). O fator ) de crescimento derivado de fíbroblasto básico (FGF-2) e o fator de crescimento de hepatócito (HGF) se ligam ambos à heparina, no entanto as estruturas de heparina que são essenciais para a ligação são bem diferentes para cada um e são diferentes das requeridas pela anti-trombina III (Maccarana e colaboradores J. Biol Chem, 268(32,):23898-23905, ; 1993; Lyon e colaboradores J. Biol Chem. 269:11216-11223, 1994), Além disto, mostrou-se que a heparina se liga a uma região particular no FGF-2 (Faham e colaboradores Science 271:1116-1120, 1996). O FGF-2 reconhece um motivo contendo um único IdoA 2-0-sulfato numa posição definida, enquanto que para o HGF, o posicionamento dos grupos GlcN 6-O-sulfato são críticos. Algumas moléculas de heparina numa preparação conterão os tanto o pentassacarídeo de ligação da anti-trombina III quanto o motivo ligante do FGF-2, enquanto que outras conterão o motivo ligante do HGF e o motivo do FGF-2 e não o pentassacarídeo de ligação da anti-trombina III. De fato, em média apenas um terço das moléculas numa preparação de heparina contém o pentassacarídeo de ligação de nati-trombina III (Conrad, 1998, supra).

As moléculas semelhantes a GAG podem ser também derivadas de fontes não mamíferas. Por exemplo, o polissacarídeo capsular de E. coli K5 é composto de uma unidade a-N-acetil-glicosamina (α-GlcNAc) e uma unidade de ácido β-glicurônico (β-GlcA) e não contém sulfato ou outro grupo carregado. O esqueleto de heparina consiste no seguinte motivo a- GlcNAc, β-GlcA, α-GlcNAc, ácido β-idurônico (β-IdoA) com graus variantes de sulfatação. A única diferença entre GlcA e IdoA é a configuração do grupo ácido carboxílico em C-5, desta forma o esqueleto de heparina e o esqueleto da B. coli K5 são extremamente semelhantes em estrutura. 5 Ainda noutro aspecto, a presente invenção provê um método para a detecção de uma molécula capaz de entrar numa interação ligante entre uma molécula imobilizada a, ou de outra forma associada com, uma partícula microesferoidal compreendendo um rótulo oticamente detectável, conforme descrito anteriormente, e um suposto parceiro ligan-) te de produto de análise da dita molécula numa amostra, o dito método compreendendo: (i) determinação de um perfil WGM inicial da partícula microesferoidal compreendendo a molécula imobilizada sobre, ou de outra forma associada com, a mesma; e i (ii) contato da partícula microesferoidal compreendendo a dita molécula imobilizada sobre, ou de outra forma associada com, a mesma, com uma amostra compreendendo um suposto parceiro ligante de produto de análise da dita molécula; em que uma alteração detectável do perfil WGM da partícula microesferoidal, em relação ao perfil WGM inicial, é indicativa de ligação ou interação entre a molécula e o parceiro ligante de produto de análise da molécula.

Conforme utilizada aqui, a expressão "uma alteração detectável do perfil WGM” pode compreender qualquer diferença que possa ser observada entre quaisquer dois perfis WGM.

Numa modalidade preferida, a alteração detectável pode compreende uma mudança para vermelho ou uma mudança para azul de um ou mais picos num perfil WGM em relação a um outro perfil WGM.

Conforme utilizado aqui, o termo “mudança para vermelho” refere-se à mudança do ponto de amplitude máxima de um ou mais picos num perfil WGM para um comprimento de onda mais longo. Apesar do nome “vermelho”, uma “mudança para vermelho” pode ocorrer em qualquer parte de um espectro eletromagnético e não se limita à luz visível. Conforme utilizado aqui, o termo “mudança para vermelho” inclui qualquer mudança de um pico para um comprimento de onda mais longo. Inver-í samente, o termo “mudança para azul” refere-se a qualquer movimento de um pico para um comprimento de onda mais curto.

Em uma modalidade particularmente preferida, a mudança para vermelho ou a mudança para azul de um pico num perfil WGM tipicamente compreende uma alteração do comprimento de onda da amplitude máxima do pico de aproximadamente 1 a 100 nm. A referência a 1 a 100 nm inclui comprimentos de onda de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100 nm. numa realização particular, a mudança para vermelho ou a mudança para azul de um pico num perfil WGM compreende uma alteração no comprimento de onda da amplitude máxima do pico de aproximadamente 1 a 20 nm, o que inclui comprimentos de onda de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 nm. Embora específicamente exemplificada no que diz respeito às mudanças de comprimento de onda em picos de luz visível, a invenção contempla também mudanças para vermelho e mudanças para azul equivalentes e/ou proporcionais em outras regiões do espectro eletromagnético.

Numa modalidade adicional da presente invenção, a alteração num ou mais perfis WGM de uma partícula microesferoidal, provocada por uma interação de uma molécula imobilizada sobre a partícula microesferoidal com um produto de análise, compreende o aparecimento de um ou mais picos num ou mais perfis WGM ou o desaparecimento de um ou mais picos num ou mais perfis WGM. m perfil WGM de uma partícula microesferoidal conforme descri->ode ser confirmado utilizando-se qualquer método conve-niente evidente a um especialista na técnica. Essencialmente, qual-odo de detecção que possa detectar um ou mais comprimentos de radiação eletromagnética pode ser utilizado para detectar um rM. Preferivelmente, o meio de detecção é suficientemente sensí-il forma que possa diferenciar picos no perfil WGM, com maior :ia,, o meio de detecção pode diferenciar entre dois picos que jarados em pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 5, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 4, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 3, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 2, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e/ou 100 nm. Meios particular-mvenientes que podem ser utilizados para determinar o perfil uma partícula microesferoidal incluem um citõmetro de fluxo, array e um microscópio confocal. mforme utilizado aqui, o termo “microscópio confocal” inclui em )o microscópios confocais de varredura a laser (LSCM) e micros-nfocais multifóton. presente invenção provê também uma partícula microesferoidal ia a um suporte sólido. i mesma forma, noutro aspecto, a presente invenção provê uma microesferoidal compreendendo uma partícula rotulada com :amente detectável, em que a partícula microesferoidal exibe um M e onde o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado detectável com a referida partícula microesferoidal que está ia num suporte sólido e/ou com um produto de análise que :om um parceiro ligante capturado na partícula imobilizada, mforme aqui utilizado, o termo “suporte sólido” refere-se a matriz sólida sobra a qual uma partícula microesferoidal pode ser imobilizada. Em realizações preferidas da invenção, o suporte sólido compreende um suporte sólido que permita ao perfil WGM da partícula microesferoidal imobilizada sobre o mesmo ser detectado. Da mesma forma, suportes sólidos preferidos são aqueles que podem ser utilizados para imobilizar uma partícula microesferoidal para análise utilizando-se um microscópio confocal. Numa modalidade particularmente preferida, o suporte sólido é uma lâmina de microscópio.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção contempla uma lâmina de microscópio compreendendo um ou mais chanfros, onde cada chanfro é adaptado para imobilizar uma partícula microesferoidal como descrita aqui. Preferivelmente, uma partícula microesferoidal é imobilizada sobre a dita lâmina, pelo depósito ou incorporação da dita partícula num chanfro da dita lâmina.

Noutro aspecto, a presente invenção provê um método para a detecção de um produto de análise supostamente contido numa amostra, compreendendo o referido método: (i) a determinação de um perfil WGM inicial de uma partícula microesferoidal compreendendo uma partícula rotulada com rótulo oti-camente detectável e uma molécula imobilizada ou, de outra forma, associada com a mesma, onde a partícula microesferoidal exibe o perfil WGM e onde o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado de forma detectável, quando a dita partícula microesferoidal se liga ou, de outra forma, interage com o produto de análise supostamente contido na referida amostra; (ii) aplicação da citada amostra à dita partícula microesferoidal por um tempo e sob condições que permitam a interação do produto de análise com a molécula imobilizada ou, de outra forma, associada com, a partícula microesferoidal; (iii) determinação subseqüente do perfil WGM da partícula microesferoidal; em que a alteração detectável num perfil WGM em relação a um perfil WGM inicia] é indicativa da presença do referido produto de análise e uma ausência de uma alteração detectável num perfil WGM em relação a um perfil WGM inicial é indicativa da ausência do citado produto de análise na referida amostra.

Numa modalidade, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da dita partícula microesferoidal e/ou o referido produto de análise compreendem uma molécula de ácido nucléico. Ainda com maior preferência,, a molécula de ácido nucléico é DNA ou RNA.

Em uma outra modalidade preferida deste aspecto da presente invenção, as moléculas ligadas ou, de outra forma, associadas com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o referido produto de análise compreendem um peptídeo, polipeptídeo ou proteína ou análogo destes conforme aqui definidos.

Ainda noutra realização preferida deste aspecto da presente invenção, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o citado produto de análise compreendem uma molécula de carboidrato. Em ainda uma realização de maior preferência, a molécula de carboidrato é uma molécula de GAG.

Ainda noutra realização preferida deste aspecto da invenção, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o dito produto de análise compreendem uma molécula que se liga ou, de outra forma, interage com um ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, proteína e/ou molécula de carboidrato.

Ainda noutro aspecto da invenção, é provido um método para a identificação de parceiros ligantes de uma molécula de interesse, compreendendo o referido método: (i) a determinação de um perfil WGM inicial de uma partícula microesferoidal compreendendo uma partícula rotulada com rótulo oti-camente detectável e uma molécula imobilizada nesta, ou de outra forma associada com esta; (ii) a aplicação de uma ou mais amostras compreendendo parceiros ligantes potenciais da citada molécula de interesse à partícula mi-croesferoidal por um tempo de sob condições que permitam a interação da molécula de interesse com o(s) parceiro(s) ligante(s) potenciais); > (iií) determinação subsequente do perfil WGM da partícula microesfe-roidal; em que a modulação do dito perfil WGM em relação a um perfil WGM inicial é indicativa da presença de um ou mais parceiros ligantes na referida amostra e uma ausência de uma alteração detectável no perfil WGM em relação ao perfil WGM inicial é indicativa da ausência de um ou mais parceiros ligantes na citada amostra.

Em uma modalidade preferida, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o dito produto de análise compreendem uma ácido nucléico. Ainda com maior preferência,, a molécula de ácido nucléico é DNA ou RNA.

Noutra modalidade preferida deste aspecto da invenção, as moléculas ligadas a, ou de outra forma associadas com, a superfície da partícula microesferoidal e/ou o referido produto de análise compreendem um peptídeo, polipeptídeo ou proteína ou análogos destes, conforme aqui definidos.

Ainda noutra realização preferida deste aspecto da invenção, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o cítadoto de análise compreendem uma molécula de carboidrato. numa realização ainda de maior preferência, a molécula de carboidrato é uma molécula de GAG.

Ainda noutra realização preferida deste aspecto da invenção, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o citado produto de análise compreendem uma molécula que se liga ou, de outra forma, interage com um ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, proteína e/ou molécula de carboidrato.

As partículas microesferoidais da presente invenção podem ser utilizadas para as seguintes aplicações: monitoramento ambiental, tal como qualidade da água (Legionella, Giardia, Ciyptosporidium, na fonte) e diagnósticos de ponto de atenção, patógenos e toxinas aéreos, varredura de interações proteína:proteína, varredura de interações proteí-i na:carboidrato e varredura de drogas, e varredura de bibliotecas de moléculas pequenas. A presente invenção possibilita a multiplexação devido à capacidade de conter dois ou mais conjuntos de partículas microesferoidais. As partículas em qualquer um dos conjuntos contêm um rótulo oticamente detectável em comum e/ou um tamanho em comum e/ou uma partícula ligante imobilizada era comum. Assim, múltiplos produtos de análise podem ser detectados pela utilização de uma multiplicidade de conjuntos de partículas microesferoidais. A presente invenção provê adicionalmente produtos de análise detectados pelo método da presente invenção.

Adicionalmente a presente invenção provê também kits que compreendem partículas microesferoidais rotuladas ou pré-rotuladas. As partículas podem ser utilizadas na geração de um ensaio para a detecção de alterações num meio em torno da partícula. A presente invenção é adicionalmente descrita por meio dos exemplos não limitantes a seguir: Exemplo 1 Produção e Rotulagem de Partículas Microesferoidais Rotuladas com Ponto Quântico Tipicamente, partículas microesferoidais podem ser preparadas pela deposição de pontos quânticos sobre pérolas comerciais de qualquer composição ou tamanho desejados. Para materiais mais robustos, devem ser revestidos com outra camada de sílica para minimizar interações com o meio ou adsorbatos.

Sem se limitar as várias possibilidades, é aqui descrito um processo típico utilizado para preparar partículas microesferoidais utilizan- zando-se pérolas de vidro /sílica. 0,1 g de pérolas de sílica comerciais com diâmetro de cinco micra foram colocados em 20 ml de 2-propanol e foram adicionados 20 microli-tros ou de mercaptopropilsilano (MPS) ou de amínopropilsilano (APS). A 5 solução foi posta em refluxo a 80°C para permitir a quimíossorção do MPS ou APS, o que levou à criação de grupos mercaptano ou amino na superfície da pérola. O excesso de MPS ou APS foi removido por centrifu-gação.

Em vez de uma pérola funcionalizada de silano, as pérolas podem i ser também ativadas pela adsorção de um polímero catiônico. Por exemplo, sem restrição e para ilustrar o método, 0,1 g de pérolas de sílica foram misturados com 20 ml de uma solução aquosa de PEI (po-li(etilenoimina)) (1 g/1, 0,5 M NaCl). Após reação por uma hora, a solução foi centrifugada para remoção do excesso de polímero, e re-suspendida em água pura. Este procedimento foi repetido 3 vezes.

Os QDs foram adsorvidos sobre as pérolas revestidas com APS ou PEI pela adição de uma suspensão de QDs em clorofórmio a uma suspensão das pérolas em 2-propanol seco. A quantidade adicionada foi suficiente para revestir as pérolas com cerca de 10 mono-camadas. As pérolas e QDs foram equilibrados por 10 minutos num tambor rotativo. Então, as pérolas revestidas foram separadas por centrifugação.

As pérolas rotuladas com QD podem ser adicionalmente estabilizadas por revestimento com mais sílica. Isto foi feito de duas formas: Primeíramente, 5 μΐ de APS em água alcalina ou clorofórmio (1 ml) foram adicionados às partículas microesferoidais de QD revestidas com sílica e deixadas reagir por 1 hora sob agitação utilizando-se um tambor rotativo a 0,2 Hz. Após a remoção do excesso de APS por ciclos de centrifugação/re-suspensão repetidos em água alcalina ou clorofórmio, foram adicionados 5 ml de “sílica ativa” (5 μΐ de silicato de sódio a 2% em peso em 5 ml de água em pH 8,7) às partículas e deixou-se reagir por uma noite. Isto resultou em cerca de 3-5 nm de sílica depositados sobre as partículas. 0 excesso de sílica nucleada livre foi separado por meio de centrifugação e as partículas re-dispersas em 2-propanol:água (4:1). Finalmente, a camada de sílica foi aumentada utilizando-se TEOS e amônia como requerido para se obter a espessura desejada. O segundo procedimento envolveu o crescimento direto de sílica em etanol sem uma etapa preliminar de deposição em água. isto consiste na adsorção de PVP e então o crescimento da sílica. Foi adicionado suficiente PVP (PM 30.000) para prover 60 moléculas de PVP por nm2 de superfície, por sua dissolução em clorofórmio:2-propanol (9:1). Este foi imedíatamente adicionado às microesferas, a mistura foi sonicada e deixada reagir durante a noite sob agitação.

As microesferas foram centrifugadas (5 segundos a 3800 rpm para sílica de 5 micra) e re-dispersas em 2-propanol (primeira vez). Foi adicionado NH3 (4,2%) seguido de TEOS (10% em volume em 2-propanol) sob agitação e deixada depositar durante 12 horas.

Um esquema mostrando 0 procedimento para a produção de partículas microesferoidais rotuladas com QD é mostrado na Figura 1. Este protocolo genérico permite a preparação de microesferas de sílica fotoestáveis de qualquer tamanho prático de 1 micra até 100 micra, rotuladas com uma ou mais nanopartículas diferentes rotuladas com diferentes propriedades de emissão.

Exemplos de partículas microesferoidais rotuladas com QD como vistas através de um microscópio confocal são mostrados na Figura 2.

Exemplo 2 Detecção de DNA Pérolas Q-Sand foram conjugadas a DNA, formando um complexo com uma pérola Q-Sand e DNA 48-mero imobilizado. A posição da quinta base do 48-mero foi uma base timidina com uma amina incorporada. Esta amina foi utilizada para rotular 0 DNA com um éster BODIPY*630/650 NHS utilizando-se uma reação de condensação padrão. O perfil WGM para a pérola Q-Sand conjugada ao DNA de 48-mero é mostrado na Figura 5, painel a. O painel b da Figura 5 mostra o perfil WGM da pérola Q-sand do painel a conjugada a um DNA α-Transprobe que hibridiza com as bases 6-24 do DNA conjugado à pérola Q-Sand. O perfil WGM resultante, como visto no painel b da Figura 5, apresentou uma troca de aproximadamente 2,4 nm para todos os picos, Adicionalmente, a redução do fator Q (a medida da qualidade do micro-ressonador) foi de aproximadamente 5x.

Finalmente, as pérolas Q-sand mostradas na Figura 5, painel a, foram hibridizadas a um produto de PCR contendo uma região complementar às bases 25-48 do DNA 48-mero. O produto de PCR foi gerado a partir de DNA de célula HeLa e preparado para hibridização por digestão como Exol e Lambda Exo. O perfil WGM resultante foi alterado em 2,4 nm para todos os picos. A queda do fator Q foi de aproximadamente lOx do controle apenas com Q-Sand.

Exemplo 3 Funcionalização da Superfície das Partículas Microesferoidais de Sílica A funcionalização das partículas microesferoidais de sílica pode ser realizada da mesma maneira utilizada para as partículas microesferoidais de sílica iniciais por refluxo das partículas microesferoidais de QD-sílica em 2-propanol contendo MPS ou APS ou outro silano para ativar a superfície e adicionar grupos funcionais que reagem com o bio-adsorbato alvo.

Preparação de Conjugados Partículas microesferoidais de 5 micra rotuladas com QDs laranja emitindo a 560 nm e super-revestidas com 10 nm de sílica foram tratadas com MPS, centrifugadas e lavadas. As microesferas foram deixadas reagir em água com o conjugado, tal como um ácido nucléico, polipeptí-deo, anticorpo, carboidrato ou semelhante, por cerca de 1 hora. Foram então centrifugadas e lavadas para produzir microesferas de QD bioativas (BQDM).

Ensaios de Ligação: Várias BQDM foram colocadas numa lâmina de microscópio sob um microscópio confocal. Uma gota de solução de referência foi colocada sobre as microesferas e os espectros coletados utilizando-se excitação a laser e 488 nm. Foi, então, adicionado um microlitro de uma solução contendo um agente que supostamente interage com o conjugado na BQDM, à gota e deixou-se reagir durante meia hora. O espectro é coletado e qualquer alteração no perfil WGM, tal como uma mudança para vermelho ou uma mudança para azul de um ou mais picos, é detectada, onde uma alteração observada é indicativa de interação entre o conjugado na partícula microesferoidal e o agente externo adicionado.

Exemplo 4 Diferenciação das Partículas Microesferoiáais Utilizando-se Perfil WGM

Diferenciação por tamanho Partículas microesferoidais de diferentes tamanhos foram produzidas utilizando-se os métodos descritos aqui. Os perfis WGM de cada um dos diferentes tamanhos de partícula foram determinados utilizando-se um microscópio confocal.

Como mostrado na Figura 3, o perfil WGM exibido por cada uma das partículas de diferentes tamanhos se altera com o raio da partícula microesferoidal.

Diferenciação pela superfície composto composto Partículas microesferoidais rotuladas com QD compreendendo diferentes moléculas ligadas às suas superfícies foram produzidas utilizando-se os métodos descritos aqui. Os perfis WGM de cada uma das diferentes partículas microesferoidais foram determinados utilizando-se um microscópio confocal.

Como mostrado na Figura 4, QD refere-se a uma partícula microesferoidal rotulada com QD sem composto ligado à superfície, PSS refere-se a uma partícula microesferoidal compreendendo sulfonato de poliesti- reno (PSS) ligado, enquanto PVP refere-se a partícula microesfe-roidal com uma mono-camada de polivinil pirrolidona (PVP) adsorvido.

Como fica evidente a partir destes dados, as partículas microesfe-roidais rotuladas com QD são sensíveis à ligação de um composto a suas superfícies. Além disto, a mudança no perfil WGM se mostra também sensível â natureza do composto ligando à superfície.

Exemplo 5 Detecção de um Suposto Parceiro Ligante Numa Amostra Microesferas de sílica com superfície funcional de grupos sulfidrila são conjugadas, por meio de uma molécula de 5’-Acrydite, a oligonucleo-tídeos de fita única, que foram previamente rotulados com corante fluorescente.

As microesferas com oligonucleotídeo rotulado fixado são então hibridizadas a oligonucleotídeos complementares não relacionados ou produtos de PCR.

As microesferas hibridizadas e não hibridizadas são extensivamente lavadas em água Milli Q e colocadas numa cobertura de microscópio e deixadas secar ao ar.

As microesferas secas são, então, examinadas num microscópio confocal com laser e filtros de comprimento de onda, apropriado para os corantes fluorescentes sendo utilizados. Os modos de galeria de sussurros são registrados e comparados para se determinar a troca do comprimento de onda no padrão de modo de galeria de sussurros entre as microesferas com DNA adicional hibridizado sobre a superfície da microes-fera e as microesferas com apenas oligonucleotídeo rotulado fixado. A troca resultante no padrão de comprimento de onda dos modos de galeria de sussurros pode ser potencialmente utilizada para se determinar a presença ou ausência de seqüências de DNA complementar nas amostras de teste.

Exemplo 6 Varredura dos Compostos de Teste São produzidas partículas microesferoidais utilizando-se os protocolos descritos aqui. Diferentes pérolas são identificáveis pelo perfil WGM. Mesmo embora exista alguma variabilidade entre pérolas de um tipo particular, o perfil WGM para um dado alvo com um dado emissor fluorescente numa pérola de tamanho dado, será aproximadamente equivalente. Pelo menos 50 diferentes pérolas Q-Sand podem ser testadas simultaneamente.

As partículas microesferoidais são dispostas em veículos de reação. Estes veículos são lâminas de vidro gradeado com regiões para diferentes compostos. As grades são varridas e os WGMs são calculados e salvos. Esta leitura é o WGM de controle do pré-composto.

Cada veículo de reação é testado com uma ou mais das moléculas de teste. A ligação não específica é minimizada pela(s) etapa(s) de lavagem.

Após a lavagem o veículo de reação é varrido novamente. Os positivos são identificados por trocas no WGM em comparação com os WGMs de controle da molécula de pré-teste.

Exemplo 7 Protocolo de Síntese de Microesfera Materiais: (3-aminopropil)trimetoxisilano (APS 99%), (3-mercaptopropil)tri-metoxisilano (MPS, 95%), tetraetil ortosilicato (TEOS, 98%), polivinilpirro-lidona (PVP, PM 40.000), Hidróxido de Amônio (29,1% em peso de NH3 em água) (Sigma-Aldrich). Partículas de sílica de 5 pm (Bangs Laboratories, Inc.), Clorofórmio (CH3CI3) e 2-propanol (AnalaR, Merck, Kilsyth, Victoria).

Instrumentos: Microscópio de fluorescência Olympus (Olympus, Bonn, Alemanha), Agitador Rotativo Motorizado (Thermohybaid, Glochester, UK), Cleaner Ultrassônico (Cole-Parmer Instrument Company, Illinois, EUA).

Notas Gerais Importantes: * Esterilizar todos os frascos de vidro e agitadores magnéticos com etanol e secá-los completamente. * Utilizar ponteiras com filtro para todas as pipetagens. * Todos os frascos de vidro devem ser de fundo chato e com tampa de rosca com entre 1,5 - 5 ml de volume. * Utilizar parafilme e todos os frascos de vidro de reação de tampa de rosca quando a reação requerer agitação durante a noite. * A funcionalízação da superfície das pérolas de vidro foram realizadas como prescrito por Brendan Toohey. * A ultra-sonicação durante as etapas de lavagem e a dissolução do PVP não são essenciais.

Funcionalização da Superfície das Pérolas de Sílica: 1. Limpar totalmente um frasco de fundo redondo lx com ceto-na e 2x com 2-propanol. 2. Adicionar 20 ml de 2-propanol ao frasco de fundo redondo limpo e ajustar numa manta de aquecimento, utilizar prendedores de tampa para manter as tampas fixas e iniciar a pressionar a água através da linha de Schlenk. 3. O 2-propanol deve ser aquecido para 80°C sob agitação constante para que a reação ocorra de forma ideal, desta forma, monitorar constantemente com um termômetro a temperatura do 2-propanol até que alcance a temperatura, assegurar que o termômetro seja lavado com etanol antes de cada verificação da temperatura. 4. Uma vez a temperatura alcançada, adicionar 20 μΐ de APS e 0,1 g de pérolas de Bang não tratadas, o que equivale a 1 ml da solução de pérolas do fabricante, e cozinhar por 2 horas sob agitação constante. 5. Após o cozimento, transferir os conteúdos do frasco para frascos apropriados para lavagem. 6. Lavar 2x em 2-propanol, então re-suspender em 10 ml de água Mílli-Q e vedar o frasco com parafilme.

Parte A __________________________Preparação de FVP_________________________ Parte B

Passivação de Nanocristais para Pérolas de Sílica Funcionalizadas de 5 pm Parte C

Revestimento TEOS de Microesferas de Nanocristal Dopado Capeado com PVP

Os especialistas na técnica irão observar que a invenção descrita é susceptível de variações e modificações outras que não aquelas especificamente descritas. Deve ficar entendido que a invenção inclui todas estas variações e modificações. A invenção inclui também todas as etapas, características, composições e compostos a que faz referência ou indicados neste relatório, individualmente ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações de qualquer ou mais das ditas etapas ou características.

BIBLIOGRAFIA

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REIVINDICAÇÕES

Claims (34)

1. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, caracterizado por que compreende: (a) contatar múltiplos conjuntos de partículas microsferoidais com uma amostra que compreende os referidos analitos, em que cada partícula dentro de um conjunto de partículas microsferoidais compreende uma etiqueta oticamente detectável e uma parte imobilizada ligante ou partes ligantes do referido analito em que cada conjunto de partículas microsferoidais tem uma parte ligante imobilizada diferente ou conjunto de partes ligantes de um analito e um ou ambos dentre: (i) um diferente tamanho de partícula microsferoidal; e (ii) uma diferente etiqueta oticamente detectável e em que cada conjunto de partículas tem um perfil definido do Modo de Galeria de Sussuros (WGM), em que a ligação de um analito a dita parte de ligação imobilizada ou partes de ligação resulta numa mudança no referido perfil de WGM indicada por um desvio espectral na etiqueta oticamente detectável de um conjunto de partículas microsferoidais que é indicativo da presença de dito analito; e (b) detectar a ligação de analitos aos referidos conjuntos múltiplos de partículas microesferoidais por detecção de desvios específicos nos perfis WGM de cada conjunto de partículas microsferoidais, em que os citados desvios espectrais estão em um ou mais picos de emissão de cada etiqueta oticamente detectável.

2. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a etiqueta oticamente detectável é um fluorcromo.

3. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que cada conjunto microsferoidal de partículas é marcado com um fluorcromo diferente.

4. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que cada conjunto microsfe-roidal de partículas é de tamanho diferente.

5. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as referidas partículas mi-crosferoidais compreendem um material selecionado da lista que consiste em: sílica, látex, titània, dióxido de estanho, ítria, alumina e outros óxi-dos binários de metal, perovs quitas e per oxido s e outros oxido s piezoelé-tricos de metal, sacar o se, agarose e outros polímeros.

6. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que a referida partícula compreende sílica,

7. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que as referidas partículas sáe substancialmente esféricas ou esferoidais.

8. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por que as referidas partículas compreendem um diâmetro de cerca de 300 nm até cerca de 30 pm,

9. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida etiqueta otica-mente detectável é uma molécula, átomo ou íon que emite fluorescência.

10. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida etiqueta otica-mente detectável é uma molécula, átomo ou íon que emite fosforescência.

11. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida etiqueta eticamente detectável é uma molécula, átomo ou íon que emite incandescén-cia.

12. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida etiqueta eticamente detectável é detectável em qualquer uma ou mais das faixas de comprimento de onda de ultravioleta, visível, infravermelho próximo (NIR) e/ou infravermelho (IR),

13. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que a referida etiqueta otica-mente detectável é detectãvel na faixa de comprimento de onda do visível.

14. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida etiqueta otica-mente detectãvel compreende uma etiqueta selecionada do a lista grupo que consiste: num fluoróforo, numa partícula semicondutora, numa partícula de fósforo, numa partícula dopada, um nanocristal e um ponto quântico {quantum cfof).

15. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por que a referida etiqueta otica-mente detectãvel é um fluoróforo,

16. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por que a referida etiqueta eticamente detectável é um ponto quântico.

17. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida partícula parte de ligação imobilizada ou partes de ligação compreende uma molécula de ácido nucléico.

18. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por que a referida molécula de ácido nucléico compreende DNA.

19. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por que a referida molécula de ácido nucléico compreende RNA.

20. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida partícula parte de ligação imobilizada ou partes de ligação compreende um peptideo, polí peptídio ou proteína.

21. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que o referido peptídeo, poli-peptídio ou proteína é uma enzima.

22. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que o referido peptídeo, poli-peptídio ou proteína é um anticorpo.

23. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida partícula imobilizada de ligação compreende uma molécula de carboidrato.

24. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 23, caracterizado por que as referidas moléculas de carboidrato são moléculas de glicosaminoglican.

25. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a mudança do referido perfil de WGM compreende um desvio para o vermelho de um ou mais picos no citado perfil.

26. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a mudança do referido perfil de WGM compreende um desvio para o azul de um ou mais picos no perfil.

27. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por que o desvio para o vermelho compreende uma mudança de comprimento de onda do referido pico ou picos entre 1 e 100 nm.

28. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 27, caracterizado por que o desvio para o vermelho compreende uma mudança de comprimento de onda do referido pico ou picos entre 1 e 20 nm.

29. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a mudança do referido perfil de WGM compreende o aparecimento de um ou mais picos em um ou mais dos citados perfis de WGM.

30. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a mudança do referido perfil de WGM compreende o desaparecimento de um ou mais picos em um ou mais do referido perfil de WGM.

31. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o perfil de WGM é determinado usando um microscópio confocal em conjunto com um espectrô-metro.

32. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o perfil de WGM é determinado usando um escaneador de arranjo em conjunto com um espec-trômetro.

33. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o perfil de WGM é determinado por um dispositivo que mede a luz a partir de partículas individuais em conjunto com um espectrômetro

34. Método de Detecção de Múltiplos Analitos em Amostra, de acordo com a Reivindicação 33, caracterizado por que o dispositivo é um citô-metro de fluxo.