BRPI0511325B1

BRPI0511325B1 - PRODUCT OF ANALYSIS AND RESPECTIVE METHOD OF DETECTION

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Publication number: BRPI0511325B1
Authority: BR
Publication date: 2017-07-25

Description

“Produto de análise e respectivo método de detecção” Relatório Descritivo Antecedentes da Invenção Campo da Invenção A presente invenção refere-se genericamente ao campo da detecção de produtos de análise. Mais particularmente, a presente invenção refere-se à utilização de alterações nos perfis do Modo de Galeria de Sussurros (Whispering Gallery Mode - WGM) de partículas microesferoi-dais induzidas pela ligação do produto de análise a um parceiro ligante imobilizado na partícula, para, desta forma, detectar a presença do produto de análise. A presente invenção refere-se adicionalmente a protocolos de multiplexação e a produtos de análise detectados pelas alterações no perfil WGM.Background of the Invention Field of the Invention The present invention relates generally to the field of detection of analysis products. More particularly, the present invention relates to the use of changes in the Whispering Gallery Mode (WGM) profiles of microspheroid particles induced by binding of the analyte to a particle immobilized binder partner to thus detect the presence of the analyte. The present invention further relates to multiplexing protocols and analysis products detected by changes in the WGM profile.

Descrição do Estado da Técnica Os detalhes bibliográficos das referências providas no presente relatório estão listados ao final do Relatório Descritivo. A referência a qualquer estado da técnica neste relatório não é e não deve der encarada como reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que o estado da técnica faz parte do conhecimento geral comum em qualquer país.Description of the Prior Art The bibliographic details of the references provided in this report are listed at the end of the Descriptive Report. Reference to any state of the art in this report is not and should not be construed as a recognition or suggestion that the state of the art is common knowledge in any country.

Os rápidos avanços na genômica e proteônica destacaram as inadequações dos métodos trabalhosos tradicionais para o exame e detecção de interação entre duas moléculas. Ocorre uma necessidade de se divisar métodos extremamente sensíveis para a análise da interação entre moléculas diferentes e a detecção de produtos de análise numa amostra. O desenvolvimento de métodos que permitam essas análises sem a necessidade de se rotular um ou outro ou ambos produtos de análise e/ou seus parceiros ligantes é particularmente desejável.Rapid advances in genomics and proteomics have highlighted the inadequacies of traditional laborious methods for examining and detecting interaction between two molecules. There is a need to devise extremely sensitive methods for analyzing the interaction between different molecules and detecting analytes in a sample. The development of methods that permit such analyzes without the need to label one or both or both analytes and / or their binding partners is particularly desirable.

Atualmente, os chips genéticos provêem um meio para a análise de ácido nucléico de alta performance utilizando conjuntos de oligonucle- otídeos imobilizados em lâminas. No entanto, esta tecnologia depende de rotulagem de pelo menos uma das moléculas.Genetic chips now provide a medium for high-performance nucleic acid analysis using slide-immobilized oligonucleotide assemblies. However, this technology depends on labeling at least one of the molecules.

Tentativas para se desenvolver métodos e dispositivos para o exame da interação de moléculas que não dependem da rotulagem de uma ou mais das moléculas incluem biossensores, que são muito fre-qüentemente utilizados para o exame de DNA e/ou proteínas com base em métodos óticos. Ver, por exemplo, Baird e Myszka, J. Mol Recognit. 14:261-268, 2001, Rich e Myszka, J. Mol Recognit 15:352-376, 2002, Li e colaboradores Science 299:840-843, 2003 e Lin e colaboradores Science 278:840-843, 1997, que descrevem métodos óticos incluindo dispositivos interferométricos. Malmqvist, Nature 361:186-187, 1993 descreve sensores de ressonância de plasma de superfície (Surface Plasmon Resonance -SPR). A SPR detecta um limite de <10 pg.mm'2 (Karlsson e Stahlberg, Anal Biochem. 228:274-280, 1995) e permite uma detecção em tempo real de interações biomoleculares. No entanto, a SPR requer instrumentação específica e dispendiosa e a capacidade de determinações multiple-xadas é limitada. A presente invenção provê reagentes e métodos para, inter alia, a detecção de interações entre produtos de análise e seus parceiros ligantes sem a necessidade de rotulagem de qualquer das moléculas.Attempts to develop methods and devices for examining the interaction of molecules that do not depend on the labeling of one or more of the molecules include biosensors, which are very often used for the examination of DNA and / or proteins based on optical methods. See, for example, Baird and Myszka, J. Mol Recognit. 14: 261-268, 2001, Rich and Myszka, J. Mol Recognit 15: 352-376, 2002, Li and collaborators Science 299: 840-843, 2003 and Lin and collaborators Science 278: 840-843, 1997, which describe optical methods including interferometric devices. Malmqvist, Nature 361: 186-187, 1993 describes Surface Plasmon Resonance -SPR sensors. SPR detects a threshold of <10 pg.mm'2 (Karlsson and Stahlberg, Anal Biochem. 228: 274-280, 1995) and allows real-time detection of biomolecular interactions. However, SPR requires specific and expensive instrumentation and the ability for multiple-xed determinations is limited. The present invention provides reagents and methods for, inter alia, detecting interactions between analytes and their linker partners without the need for labeling of either molecule.

Sumário da Invenção A presente invenção provê métodos e reagentes para, inter alia, detectar moléculas numa amostra. As moléculas são chamadas aqui de produtos de análise. A presença ou estrutura dos produtos de análise não necessita ser conhecida e, assim, o método em questão é ideal da a detecção de parceiros ligantes desconhecidos até o momento de receptores órfãos e moduladores potenciais da expressão de ácido nucléico ou proteína incluindo atividade, dobramento, antigenicidade ou função enzimáticas. Os métodos da presente invenção são baseados em parte no fenômeno de que rótulos oticamente detectáveis contidos em ou sobre uma partícula microesferoidal irão apresentar um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) distinto. A referência a “oticamente detectã-veis" inclui detecção por meios espectrométricos. Quando um produto de análise alvo interage com um parceiro ligante imobilizado a uma partícula microesferoidal, o perfil WGM se altera, possibilitando uma detecção muito sensível mesmo de eventos de ligação raros.Summary of the Invention The present invention provides methods and reagents for, inter alia, detecting molecules in a sample. The molecules here are called analytical products. The presence or structure of the assay products need not be known and thus the method in question is ideal for the detection of unknown binding partners at the moment of orphan receptors and potential modulators of nucleic acid or protein expression including activity, folding, enzyme antigenicity or function. The methods of the present invention are based in part on the phenomenon that optically detectable labels contained on or on a microspheroidal particle will have a distinct Whisper Gallery Mode (WGM) profile. Reference to "optically detectable" includes detection by spectrometric means. When a target analytical product interacts with a binder partner immobilized to a microspheroidal particle, the WGM profile changes, allowing very sensitive detection even of rare binding events.

Os WGMs permitem apenas que certos comprimentos de onda luminosa sejam emitidos pela partícula. O resultado deste fenômeno é que as bandas de emissão amplas usuais (10-100 nm de extensão), por exemplo, de um fluoróforo, se tornam restritas e aparecem como uma série de picos agudos correspondendo efetivamente a padrões de modo estacionário de luz na partícula. De acordo com a presente invenção, foi determinado que o perfil WGM é extremamente sensível a alterações na superfície da partícula microesferoidal e que o perfil WGM se altera, quando a partícula microesferoidal interage com produtos de análise ou moléculas dentro de seu ambiente.WGMs only allow certain light wavelengths to be emitted by the particle. The result of this phenomenon is that the usual broad emission bands (10-100 nm in length), for example, of a fluorophore, become restricted and appear as a series of sharp peaks effectively corresponding to steady-state light patterns in the particle. . According to the present invention, it has been determined that the WGM profile is extremely sensitive to changes in the surface of the microspheroidal particle and that the WGM profile changes when the microspheroidal particle interacts with analytes or molecules within its environment.

Da mesma forma, um aspecto da presente invenção contempla um método para a detecção de um produto de análise, compreendendo o referido método o contato de pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais com uma amostra supostamente compreendendo o dito produto de análise, em que cada partícula num conjunto de partículas microesferoidais compreende um rotulo oticamente detectável e um parceiro ligante supostamente imobilizado do citado produto de análise, em que cada conjunto de partículas apresenta um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) em que a ligação do dito produto de análise ao referido parceiro ligante imobilizado resulta numa alteração no citado perfil WGM do dito pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais, o que indica a presença do referido produto de análise.Likewise, an aspect of the present invention contemplates a method for detecting an analyte, said method comprising contacting at least one set of microspheroidal particles with a sample supposedly comprising said analyte, wherein each particle A microspheroidal particle assembly comprises an optically detectable label and a supposedly immobilized binder partner of said analyte, wherein each particle assembly has a Whispering Gallery Mode (WGM) profile wherein the binding of said analyte to the said immobilized binder partner results in a change in said WGM profile of said at least one set of microspheroidal particles, indicating the presence of said analyte.

Os métodos da presente invenção podem ser aplicados para a detecção de modulação no perfil WGM de uma partícula microesferoidal, em que a citada modulação resulta da detecção de ligação ou outra associação de moléculas, numa amostra, a partículas ligantes potenciais imobilizadas à superfície da partícula microesferoidal. A detecção de reações de ligação entre um produto de análise e seu parceiro ligante com base em alterações sensíveis em perfis WGM possibilita a identificação e isolamento dos produtos de análise.The methods of the present invention may be applied for detecting modulation in the WGM profile of a microspheroidal particle, wherein said modulation results from the detection of binding or other association of molecules in a sample to potential binder particles immobilized to the surface of the microspheroidal particle. . Detection of binding reactions between an analyte and its binding partner based on sensitive changes in WGM profiles enables the identification and isolation of analytes.

Uma característica da presente invenção é que as partículas microesferoidais podem ser excitadas com uma ampla variedade de fontes luminosas, facilitando a determinação em muitos perfis WMG diferentes.A feature of the present invention is that microspheroidal particles can be excited with a wide variety of light sources, facilitating determination in many different WMG profiles.

Um “rótulo oticamente detectáveP pode ser qualquer molécula, átomo ou íon que emita fluorescência, fosforecência e/ou incandescência. numa realização preferida da presente invenção, o rótulo oticamente detectável é um fluoróforo, o que pode englobar uma faixa de rótulos oticamente detectáveis tais como fluoróforos químicos e corantes bem como pontos quânticos. A presente invenção provê também uma partícula microesferoidal conforme descrita aqui imobilizada num suporte sólido, por exemplo, um suporte sólido pode incluir uma lâmina microscópica.An optically detectable label may be any molecule, atom or ion that emits fluorescence, phosphorescence and / or incandescence. In a preferred embodiment of the present invention, the optically detectable label is a fluorophore, which may comprise a range of optically detectable labels such as chemical fluorophores and dyes as well as quantum dots. The present invention also provides a microspheroidal particle as described herein immobilized on a solid support, for example, a solid support may include a microscopic slide.

Numa realização específica, a presente invenção provê uma partícula microesferoidal que compreende uma partícula de látex ou sílica com de 1 pra a 100 pm de diâmetro, rotulada com um rótulo oticamente detectável, tal como um fluoróforo ou ponto quântico, compreendendo a partícula adicionalmente um suposto parceiro ligante de um produto de análise a ser detectado. O rótulo oticamente detectável é detectável em comprimentos de onda visíveis e a partícula microesferoidal exibe um ou mais perfis WGM. Um ou mais dos perfis WGM da partícula microesferoidal modula de forma detectável, quando os produtos de análise interagem com o parceiro ligante imobilizado na partícula. Qualquer de tais alterações no perfil WGM é indicativa da presença de um produto de análise que se ligou a seu parceiro ligante.In a specific embodiment, the present invention provides a microspheroidal particle comprising a 1 to 100 µm diameter latex or silica particle, labeled with an optically detectable label, such as a fluorophore or quantum dot, the particle further comprising a supposed binding partner of an analyte to be detected. The optically detectable label is detectable at visible wavelengths and the microspheroidal particle exhibits one or more WGM profiles. One or more of the microspheroidal particle WGM profiles detectably modulate when the analytes interact with the binder partner immobilized on the particle. Any such changes in the WGM profile is indicative of the presence of an analyte that has bound to its binding partner.

Exemplos de produtos de análise e parceiros ligantes incluem moléculas químicas, moléculas de ácido nucléico, proteínas, lipídeos, ácidos graxos e carboidratos. O método da presente invenção não requer nenhum conhecimento da existência, presença ou estrutura do produto de análise. Por exemplo, se se pretende encontrar uma molécula (isto é, um produto de análise) que interage com uma enzima ou o sítio catalítico de uma enzima no epitopo antigênico ou próximo a este de uma enzima ou proteína, então, o método descrito não requer o conhecimento de esse produto de análise existe. Neste caso, a partícula microesferoidal irá carregar o parceiro ligante alvo em sua superfície ou próxima a esta e as alterações nos perfis WGM são utilizados para detectar um produto de análise numa amostra tal como uma biblioteca combinatória, biblioteca química ou fonte de produto natural (por exemplo, amostra ambiental, soro, plasma ou extrato biológico) o qual interage com o parceiro ligante alvo. A presente invenção possibilita a multiplexação pela incorporação de conjuntos múltiplos de partículas microesferoidais em que cada conjunto compreende partículas de diferentes tamanhos e/ou rotuladas com diferentes fluorocromos e/ou diferentes parceiros ligantes. A presente invenção provê adicionalmente produtos de análise identificados pelo método em questão e kits úteis para a prática do método em questão.Examples of analytical products and binding partners include chemical molecules, nucleic acid molecules, proteins, lipids, fatty acids and carbohydrates. The method of the present invention requires no knowledge of the existence, presence or structure of the analyte. For example, if a molecule (i.e. an analyte) is to be found that interacts with an enzyme or the catalytic site of an enzyme at or near the antigenic epitope of an enzyme or protein, then the method described does not require Knowledge of this analytics product exists. In this case, the microspheroidal particle will carry the target binding partner on or near its surface and changes in WGM profiles are used to detect an analyte in a sample such as a combinatorial library, chemical library or natural product source (eg environmental sample, serum, plasma or biological extract) which interact with the target binding partner. The present invention enables multiplexing by incorporating multiple sets of microspheroidal particles wherein each set comprises particles of different sizes and / or labeled with different fluorochromes and / or different binder partners. The present invention further provides analytical products identified by the method in question and kits useful for practicing the method in question.

Por todo este relatório, a não ser que o contexto exija diferentemente, a palavra "compreendem” ou variações desta tais como “compreende” ou “compreendendo” devem ser entendidas como implicando na inclusão de um elemento citado ou integrador ou grupo de elementos ou integradores, mas, não a exclusão de qualquer outro elemento ou integrador ou grupo de elementos ou integradores.Throughout this report, unless the context otherwise requires, the word "understand" or variations thereof such as "understand" or "understanding" shall be construed as including a quoted element or integrator or group of elements or integrators. , but not the exclusion of any other element or integrator or group of elements or integrators.

Uma lista de abreviações é provida na Tabela 1.A list of abbreviations is provided in Table 1.

Tabela 1 - Abreviações Breve Descrição das Figuras A Figura 1 é uma representação gráfica que mostra um esquema do procedimento utilizado para produzir partículas microesferoidais rotuladas por ponto quântico. A Figura 2 é uma representação gráfica que mostra uma curva calculada mostrando como pequenas alterações no raio de uma partícula microesferoidal de sílíca leva a alterações claras no perfil WGM calculado da partícula microesferoidal. A Figura 3 é uma representação gráfica que mostra partículas microesferoidais compreendendo rótulos oticamente detectáveis de ponto quântico (QD), que exibem fluorescência distinta clara e perfis WGM definidos. A Figura 4 é uma representação gráfica que mostra espectros experimentais mostrando a troca observada no perfil WGM de partícula microesferoidal, quando uma mono-camada de um biopolímero é adsorvida nas partículas microesferoidais. QD = Controle de ponto quântico de partícula microesferoidal não revestida; PSS = partícula microesferoidal com mono-camada de sulfonato de poliestireno adsorvida (PSS); PVP = partícula microesferoidal com mono-camada de polivinilpirrolidona adsorvida (PVP). A Figura 5 é uma representação gráfica de perfis WGM para: (a) DNA conjugado como 48-meros a partícula Q-Sand; (b) pérolas Q-Sand hibridizadas a um DNA Transprobe, o complemento reverso de Transpro-be; e (c) pérolas Q-Sand hibridizadas a um produto de PCR.Table 1 - Abbreviations Brief Description of the Figures Figure 1 is a graphical representation showing a scheme of the procedure used to produce quantum dot labeled microspheroidal particles. Figure 2 is a graphical representation showing a calculated curve showing how small changes in radius of a silica microspheroidal particle lead to clear changes in the calculated WGM profile of the microspheroidal particle. Figure 3 is a graphical representation showing microspheroidal particles comprising optically detectable quantum dot (QD) labels, which exhibit clear distinct fluorescence and defined WGM profiles. Figure 4 is a graphical representation showing experimental spectra showing the observed change in the microspheroidal particle WGM profile when a monolayer of a biopolymer is adsorbed onto microspheroidal particles. QD = Quantum dot control of uncoated microspheroidal particle; PSS = microspheroidal particle with adsorbed polystyrene sulfonate monolayer (PSS); PVP = microspheroidal particle with adsorbed polyvinylpyrrolidone (PVP) monolayer. Figure 5 is a graphical representation of WGM profiles for: (a) DNA conjugated as 48-mer to Q-Sand particle; (b) Q-Sand beads hybridized to a Transprobe DNA, the reverse complement of Transpro-be; and (c) Q-Sand beads hybridized to a PCR product.

Descrição Detalhada das Modalidade Preferidas A presente invenção provê métodos, inter alia, para a detecção de uma molécula chamada aqui de um produto de análise capaz de apresentar uma interação de ligação com uma outra molécula, chamada de seu parceiro ligante, imobilizada na superfície de uma partícula microesferoidal com um rótulo oticamente detectável que confere à partícula um perfil WGM definido. A referência a “oticamente detectável” inclui detecção por meios espectrométricos. Uma interação entre o produto de análise e o parceiro ligante induz uma alteração no perfil WGM. Os métodos descritos aqui podem ser utilizados para a detecção de produtos de análise em amostras e interações entre produtos de análise. Ressalte-se que nem o produto de análise nem o parceiro ligante requerem um rótulo. A interação induz uma alteração no perfil WGM da partícula microesferoidal. Os métodos da presente invenção são baseados, em parte, no fenômeno de que emissores de fluorescência contidos em ou sobre uma partícula microesferoidal estabelecem perfis WGM definidos. As partículas microesferoidais podem ser excitadas por uma ampla variedade de fontes luminosas. Isto facilita a determinação em muitas configurações diferentes e facilita a multiplexação.DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention provides methods, inter alia, for detecting a molecule called herein an analyte capable of exhibiting a binding interaction with another molecule, called its binding partner, immobilized on the surface of a molecule. microspheroidal particle with an optically detectable label that gives the particle a defined WGM profile. Reference to "optically detectable" includes detection by spectrometric means. An interaction between the analyte and the binding partner induces a change in the WGM profile. The methods described herein may be used for detection of sample analytes and interactions between analytes. Note that neither the analytical product nor the binding partner requires a label. The interaction induces a change in the WGM profile of the microspheroidal particle. The methods of the present invention are based in part on the phenomenon that fluorescence emitters contained in or on a microspheroidal particle establish definite WGM profiles. Microspheroidal particles can be excited by a wide variety of light sources. This facilitates determination in many different configurations and facilitates multiplexing.

Os WGMs permitem que apenas certos comprimentos de onda luminosa sejam emitidos por uma partícula. O resultado deste fenômeno é que as bandas de emissão amplas (10-100 nm de extensão) de um fluoróforo se tornam restritas e aparecem como uma série de picos agudos correspondendo efetivamente a padrões de modo estacionário da luz na partícula. O perfil WGM é extremamente sensível a interações ou associações com a superfície de uma partícula mícroesferoidal. Assim, mesmo eventos raros de ligação podem ser detectados devido à alteração no perfil WGM.WGMs allow only certain light wavelengths to be emitted by a particle. The result of this phenomenon is that the broad emission bands (10-100 nm in length) of a fluorophore become restricted and appear as a series of sharp peaks effectively corresponding to stationary mode patterns of light in the particle. The WGM profile is extremely sensitive to interactions or associations with the surface of a microspheroidal particle. Thus, even rare binding events can be detected due to the change in WGM profile.

Deve ficar entendido que, a não ser que de outra forma indicado, a matéria da invenção não está limitada a formulações de partícula mi-croesferoidal, métodos de fabricação, protocolos de diagnóstico ou ensaio, ou semelhantes específicos, na medida em que podem variar. Deve ficar entendido também que a terminologia utilizada aqui tem o propósito de descrever realizações particulares apenas, e não se pretende que seja limitante. A referência a “um produto de análise” e a um “parceiro ligan-te” não deve ser entendida como se qualquer conhecimento da estrutura do produto de análise seja tido ou que necessário ser tido Deve ser observado que, conforme utilizadas no relatório em questão, as formas singulares “um” “uma”, “a” e “o” incluem os aspectos no plural, a não ser que o contexto já determine de forma diferente. Desta forma, por exemplo, a referência a “um pico” ou a “um perfil” inclui um pico ou perfil únicos bem como a dois ou mais picos ou perfis; uma “partícula microesferoidal” inclui uma partícula única bem como a duas ou mais partículas; e assim em diante.It should be understood that, unless otherwise indicated, the subject matter of the invention is not limited to specific microspheresoidal particle formulations, manufacturing methods, diagnostic or assay protocols, or the like, as they may vary. It should also be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to be limiting. Reference to “an analytical product” and a “binding partner” should not be understood as if any knowledge of the analytical product structure is had or should be had. It should be noted that as used in the report in question. , the singular forms "one" "one", "a" and "o" include the plural aspects, unless the context already determines otherwise. Thus, for example, reference to "a peak" or "a profile" includes a single peak or profile as well as two or more peaks or profiles; a "microspheroidal particle" includes a single particle as well as two or more particles; and so on.

Num aspecto, a presente invenção contempla um método para a detecção de um produto de análise, compreendendo o referido método o contato de pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais com uma amostra supostamente compreendendo o citado produto de análise, em que cada partícula no conjunto de partículas microesferoidais compreende um rótulo oticamente detectãvel e um suposto parceiro ligante do dito produto de análise imobilizado, em que cada conjunto de partícula apresenta um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) definido, onde a ligação do referido produto de análise ao citado parceiro ligante imobilizado resulta numa alteração no dito perfil WGM do referido pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais, o que é indicativo da presença do citado produto de análise.In one aspect, the present invention contemplates a method for detecting an analyte, said method comprising contacting at least one set of microspheroidal particles with a sample supposedly comprising said analyte, wherein each particle in the set of microspheroidal particles comprise an optically detectable label and an alleged binding partner of said immobilized analysis product, wherein each particle set has a defined Whispering Gallery Mode (WGM) profile, wherein the binding of said analyte to said partner immobilized binder results in a change in said WGM profile of said at least one microspheroidal particle assembly, which is indicative of the presence of said analyte.

As “partículas microesferoidais” contempladas pela presente invenção incluem partículas que compreendem qualquer material, homogêneo ou que, de outra forma possa, produzir um ou mais perfis WGM com base em seu rótulo oticamente detectável. Como será evidente aos especialistas na técnica, quase qualquer material, homogêneo ou não, pode ser utilizado como partícula microesferoidal. As partículas microesferoidais contempladas aqui podem compreender também mais de uma substância, e como tal pode compreender cápsulas, ligas ou misturas de substâncias orgânicas e/ou inorgânicas. É vantajoso para a quantificação dos dados gerados pelos métodos da presente invenção que a partícula microesferoidal compreenda um material substancialmente homogêneo com um índice de refração isotrópico e que seja também não absorvente (outro que não o rótulo oticamente detectável, que é descrito posteriormente abaixo)."Microspheroidal particles" contemplated by the present invention include particles comprising any material, homogeneous or otherwise capable of producing one or more WGM profiles based on their optically detectable label. As will be apparent to those skilled in the art, almost any material, whether homogeneous or not, can be used as a microspheroidal particle. The microspheroidal particles contemplated herein may also comprise more than one substance, and as such may comprise capsules, alloys or mixtures of organic and / or inorganic substances. It is advantageous for the quantification of the data generated by the methods of the present invention that the microspheroidal particle comprises a substantially homogeneous material with an isotropic refractive index and is also non-absorbent (other than the optically detectable label, which is described below).

Materiais particularmente úteis que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção e que representam realizações específicas da presente invenção incluem materiais selecionados da lista consistindo em: sílica (por exemplo, quartzo ou vidro), látex, óxido de titânio, dióxido de estanho, óxido de ítrio, alumina e outros óxidos de metal binário (tal como ZnO), perovskitas e outros óxidos de metal piezoelétrico (tais como BaTiOa), ZnS, sacarose, agarose e outras pérolas poliméricas. Numa realização particularmente preferida, a “partícula" e/ou a “partícula microesferoidal” compreende sílica.Particularly useful materials which may be used in accordance with the present invention and which represent specific embodiments of the present invention include materials selected from the list consisting of: silica (e.g. quartz or glass), latex, titanium oxide, tin dioxide, oxide of yttrium, alumina and other binary metal oxides (such as ZnO), perovskites and other piezoelectric metal oxides (such as BaTiOa), ZnS, sucrose, agarose and other polymeric beads. In a particularly preferred embodiment, the "particle" and / or "microspheroidal particle" comprises silica.

Adicionalmente, as partículas contempladas pela presente invenção podem ser produzidas em qualquer formato tridimensional regular ou > irregular conveniente. No entanto, embora muitos formatos do material possam sustentar perfil WGM, é em geral prático se sintetizar pequenas esferas ou partículas esferoidais. Essas esferas ou partículas esferoidais são também chamadas aqui de “partículas microesferoidais” ou “microes-feras”. Da mesma forma, em realizações preferidas da presente invenção, as “partículas” e “partículas microesferoidais” da presente invenção são substancialmente esféricas ou esferoidais ou compreendem uma “micro-esfera”.Additionally, the particles contemplated by the present invention may be produced in any convenient regular or irregular three-dimensional shape. However, although many shapes of the material can support WGM profile, it is generally practical to synthesize small spheres or spheroidal particles. These spheres or spheroidal particles are also referred to herein as "microspheroidal particles" or "microspheres". Likewise, in preferred embodiments of the present invention, the "particles" and "microspheroidal particles" of the present invention are substantially spherical or spheroidal or comprise a "microsphere".

Embora as partículas da presente invenção possam ser chamadas de “microesferas”, o tamanho real das partículas microesferoidais depende de uma variedade de fatores e as partículas podem ou não apresentar medidas reais na faixa micrométrica. Numa realização preferida, as partículas microesferoidais da presente invenção apresentam um diâmetro (ou medida equivalente numa partícula não esferoidal) de cerca de 1 pm a cerca de 100 pm, incluindo 1 pm, 2 pm, 3 pm, 4 pm, 5 pm, 6 pm, 7 pm, 8 pm, 9 pm, 10 pm, 11 pm, 12 pm, 13 pm, 14 pm, 15 pm, 16 pm, 17 pm, 18 pm, 19 pm, 20 pm, 21 pm, 22 pm, 23 pm, 24 pm, 25 pm, 26 pm, 27 pm, 28 pm, 29 pm, 30 pm, 31 pm, 32 pm, 33 pm, 34 pm, 35 pm, 36 pm, 37 pm, 38 pm, 39 pm, 40 pm, 41 pm, 42 pm, 43 pm, 44 pm, 45 pm, 46 pm, 47 pm, 48 pm, 49 pm, 50 pm, 51 pm, 52 pm, 53 pm, 54 pm, 55 pm, 56 pm, 57 pm, 58 pm, 59 pm, 60 pm, 61 pm, 62 pm, 63 pm, 64 pm, 65 pm, 66 pm, 67 pm, 68 pm, 69 pm, 70 pm, 71 pm, 72 pm, 73 pm, 74 pm, 75 pm, 76 pm, 77 pm, 78 pm, 79 pm, 80 pm, 81 pm, 82 pm, 83 pm, 84 pm, 85 pm, 86 pm, 87 pm, 88 pm, 89 pm, 90 pm, 91 pm, 92 pm, 93 pm, 94 pm, 95 pm, 96 pm, 97 pm, 98 pm, 99 pm e 100 pm. As referências a estes tamanhos de microesferas incluem frações dos números inteiros. Por exemplo, frações entre 1 e 2 μηα incluem 1,05, 1,1, 1,15, 1,2, 1,25, 1,3, 1,35, 1,4, 1,45, 1,5, 1,55, 1,6, 1,65, 1,7, 1,75, 1,8, 1,85, 1,9, 1,95 ou 2,0.Although the particles of the present invention may be called "microspheres", the actual size of microspheroidal particles depends on a variety of factors and the particles may or may not have actual measurements in the micrometer range. In a preferred embodiment, the microspheroidal particles of the present invention have a diameter (or equivalent measurement on a non-spheroidal particle) of from about 1 pm to about 100 pm, including 1 pm, 2 pm, 3 pm, 4 pm, 5 pm, 6 pm, 7 pm, 8 pm, 9 pm, 10 pm, 11 pm, 12 pm, 13 pm, 14 pm, 15 pm, 16 pm, 17 pm, 18 pm, 19 pm, 20 pm, 21 pm, 22 pm, 23 pm, 24 pm, 25 pm, 26 pm, 27 pm, 28 pm, 29 pm, 30 pm, 31 pm, 32 pm, 33 pm, 34 pm, 35 pm, 36 pm, 37 pm, 38 pm, 39 pm , 40 pm, 41 pm, 42 pm, 43 pm, 44 pm, 45 pm, 46 pm, 47 pm, 48 pm, 49 pm, 50 pm, 51 pm, 52 pm, 53 pm, 54 pm, 55 pm, 56 pm, 57 pm, 58 pm, 59 pm, 60 pm, 61 pm, 62 pm, 63 pm, 64 pm, 65 pm, 66 pm, 67 pm, 68 pm, 69 pm, 70 pm, 71 pm, 72 pm, 73 pm, 74 pm, 75 pm, 76 pm, 77 pm, 78 pm, 79 pm, 80 pm, 81 pm, 82 pm, 83 pm, 84 pm, 85 pm, 86 pm, 87 pm, 88 pm, 89 pm , 90 pm, 91 pm, 92 pm, 93 pm, 94 pm, 95 pm, 96 pm, 97 pm, 98 pm, 99 pm and 100 pm. References to these microsphere sizes include fractions of integers. For example, fractions between 1 and 2 μηα include 1.05, 1.1, 1.15, 1.2, 1.25, 1.3, 1.35, 1.4, 1.45, 1.5, 1.55, 1.6, 1.65, 1.7, 1.75, 1.8, 1.85, 1.9, 1.95 or 2.0.

Numa realização particular, as partículas microesferoidais são microesferas.In a particular embodiment, the microspheroidal particles are microspheres.

Um conjunto de partículas microesferoidais incluindo um conjunto de microesferas inclui uma multiplicidade (isto é, duas ou mais) partículas ou microesferas apresentando um rótulo ou um tamanho comuns ou um parceiro ligante imobilizado.A set of microspheroidal particles including a set of microspheres includes a multiplicity (i.e. two or more) particles or microspheres having a common label or size or an immobilized binder partner.

Conforme utilizado aqui, o termo “rótulo oticamente detectável” refere-se a qualquer molécula, átomo ou íon que emita fluorescência, fosforescência e/ou incandescência. O rótulo oticamente detectável pode ser escolhido para emitir em qualquer comprimento de onde no qual o perfil WGM possa ser facilmente resolvido. Isto depende da razão do comprimento de onda da emissão em relação ao raio da partícula. Dado que o raio da esfera é arbitrário, a emissão pode ser adequadamente escolhida a partir do ultravioleta (faixa de comprimento de onde de cerda de 350 nm a cerca de 3 nm), visível (faixa de comprimento de onde de cerca de 350 nm a cerca de 800 nm), próximo a infravermelho (NIR) (faixa de comprimento de onde de cerca de 800 nm a cerca 1500 nm) e/ou infravermelho (IR) (faixa de comprimento de onde de cerca de 1500 nm a cerca de 10 pm). Entretanto, devido à facilidade de detecção, numa realização particular, o rótulo oticamente detectável é detectável na faixa de comprimento de onda visível.As used herein, the term "optically detectable label" refers to any molecule, atom or ion that emits fluorescence, phosphorescence and / or incandescence. The optically detectable label can be chosen to emit at any length from which the WGM profile can be easily resolved. This depends on the ratio of the emission wavelength to the particle radius. Since the radius of the sphere is arbitrary, the emission can be suitably chosen from the ultraviolet (bristle wavelength range of 350 nm to about 3 nm), visible (wavelength range from about 350 nm to about 800 nm), near infrared (NIR) (wavelength range from about 800 nm to about 1500 nm) and / or infrared (IR) (wavelength range from about 1500 nm to about 10 nm) pm). However, due to the ease of detection, in a particular embodiment, the optically detectable label is detectable in the visible wavelength range.

Numa realização particular, o rótulo oticamente detectável pode ser um rótulo oticamente detectável que emite radiação visível em resposta a excitação infravermelha. Esses rótulos oticamente detectáveis são aqui chamados também de “conversores de subida”.In a particular embodiment, the optically detectable label may be an optically detectable label that emits visible radiation in response to infrared excitation. These optically detectable labels are also referred to herein as "upconverters".

Da mesma forma, outro aspecto da presente invenção provê um método para a detecção de um produto de análise, compreendendo o referido método o contato de pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais com uma amostra supostamente compreendendo o citado produto de análise, em que cada partícula num conjunto de partículas microesferoidais compreende um rótulo que emite radiação visível em resposta a excitação infravermelha e um suposto parceiro ligante do dito produto de análise imobilizado, em que cada conjunto de partícula apresenta um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) definido, onde a ligação do dito produto de análise ao referido parceiro ligante imobilizado resulta numa alteração do citado perfil WGM do dito pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais, o que é indicativo da presença do referido produto de análise. A única restrição quanto ao rótulo oticamente detectável é que a emissão do rótulo escolhido deve resultar em emissão de modo da cavidade.Similarly, another aspect of the present invention provides a method for detecting an analyte, said method comprising contacting at least one set of microspheroidal particles with a sample supposedly comprising said analyte, wherein each particle A set of microspheroidal particles comprises a label that emits visible radiation in response to infrared excitation and a supposed binder partner of said immobilized analysis product, wherein each particle set has a defined Whispering Gallery Mode (WGM) profile where attachment of said analyte to said immobilized binder partner results in a change in said WGM profile of said at least one set of microspheroidal particles, which is indicative of the presence of said analyte. The only restriction on the optically detectable label is that emission of the chosen label should result in mode emission from the cavity.

Em realizações adicionais da invenção em questão, o rótulo oticamente detectável compreende um ou mais rótulos selecionados da lista consistindo num fluoróforo, uma partícula semicondutora, partícula de luminóforo, uma partícula dopada, ou um nanocristal e um ponto quân-tico. Além disto, a luz espalhada de pequenas partículas de metal (emissão de plasma de superfície) pode ser utilizada como um rótulo oticamente detectável, Da mesma forma, um aspecto adicional da presente invenção é direcionado para um método para a detecção de um produto de análise, compreendendo o referido método o contato de pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais com uma amostra supostamente compreendendo o citado produto de análise, em que cada partícula num conjunto de partículas microesferoidais compreende um rótulo oticamente detectável selecionado da lista que consiste em fluoróforo, partícula semicondutora, partícula de luminóforo, uma partícula dopada, ou um nanocristal e um ponto quântico e um suposto parceiro ligante do dito produto de análise imobilizado, em que cada conjunto de partícula apresenta um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) definido, onde a ligação do referido produto de análise ao citado parceiro ligante imobili- zado resulta numa alteração do dito perfil WGM do referido pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais, o que é indicativo da presença do citado produto de análise.In further embodiments of the subject invention, the optically detectable label comprises one or more labels selected from the list consisting of a fluorophore, a semiconductor particle, a luminophore particle, a doped particle, or a nanocrystal and a quantum dot. In addition, scattered light from small metal particles (surface plasma emission) can be used as an optically detectable label. Likewise, an additional aspect of the present invention is directed to a method for detecting an analyte. said method comprising contacting at least one set of microspheroidal particles with a sample supposedly comprising said analyte, wherein each particle in a microspheroidal particle assembly comprises an optically detectable label selected from the list consisting of fluorophore, semiconductor particle. , luminophore particle, a doped particle, or a nanocrystal and a quantum dot and a supposed binder partner of said immobilized analysis product, wherein each particle set has a defined Whispering Gallery Mode (WGM) profile, where the binding said analyte to said immobilizing binder partner This result results in an alteration of said WGM profile of said at least one set of microspheroidal particles, which is indicative of the presence of said analyte.

Noutra realização da presente invenção, o rótulo oticamente de-tectável é um fluoróforo. Conforme utilizado aqui, o termo “fluoróforo’ refere-se a qualquer moléculas que exibe propriedade de fluorescência. Para os propósitos aqui, o termo “fluorescência” pode ser definido com a propriedade de uma molécula em absorver luz com um comprimento de onda particular e re-emitir luz com um comprimento de onde maior. A alteração relaciona-se a uma perda de energia que ocorre no processo. O termo “fluoróforo” pode englobar uma variedade de rótulos oticamente detectáveis tais como fluoróforos químicos e corantes, bem como pontos quânticos.In another embodiment of the present invention, the optically detectable label is a fluorophore. As used herein, the term 'fluorophore' refers to any molecules that exhibit fluorescence property. For purposes herein, the term "fluorescence" may be defined with the property of a molecule to absorb light of a particular wavelength and re-emit light of a longer wavelength. The change relates to a loss of energy that occurs in the process. The term "fluorophore" may encompass a variety of optically detectable labels such as chemical fluorophores and dyes, as well as quantum dots.

Numa realização particular, a presente invenção provê um método para a detecção de um produto de análise, compreendendo o referido método o contato de pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais com uma amostra supostamente compreendendo o citado produto de análise, em que cada partícula num conjunto de partículas microesferoidais compreende um fluoróforo na forma de um ponto quântico e um suposto parceiro ligante do dito produto de análise imobilizado, onde cada conjunto de partícula apresenta um perfil de Modo de Galeria de Sussurros (WGM) definido, em que a ligação do referido produto de análise ao citado parceiro ligante imobilizado resulta numa alteração do dito perfil WGM do referido pelo menos um conjunto de partículas microesferoidais, o que é indicativo da presença do citado produto de análise.In a particular embodiment, the present invention provides a method for detecting an analyte, said method comprising contacting at least one set of microspheroidal particles with a sample supposedly comprising said analyte, wherein each particle in an array The microspheroidal particle composition comprises a fluorophore in the form of a quantum dot and a supposed binding partner of said immobilized analysis product, wherein each particle set has a defined Whispering Gallery Mode (WGM) profile, wherein the binding of said product of analysis to said immobilized binder partner results in a change of said WGM profile of said at least one set of microspheroidal particles, which is indicative of the presence of said analyte.

Um rótulo oticamente detectável particularmente conveniente que pode ser utilizado de acordo com a presente invenção é se incorporar partículas fluorescentes sobre ou na partícula microesferoidal. Estas partículas de rótulo oticamente detectável podem ser tão pequenas que suas propriedades e a emissão se tornam dependentes do tamanho. Essas partículas pequenas de rótulo oticamente detectável são chamadas na técnica de nanopartículas semicondutoras, pontos quânticos, fios quânticos, bastões quânticos ou nanocristais ou partículas Q. Portanto, conforme utilizado aqui, o termo “ponto quântico” ou “QD” deve ser entendido como englobando todas tais partículas. Além disto, os rótulos oticamente detectáveis compreendendo QDs podem compreender partículas aproximadamente esféricas ou esferoidais, ou partículas esféricas ou esferoídais revestidas. Entretanto, o termo QD não deve ser considerado de forma alguma limitado a uma morfologia esférica, esferoidal, circular, cilíndrica ou qualquer outra morfologia de um “ponto”. Por exemplo, conforme utilizado aqui QDs podem compreender também outras morfo-logías incluindo, inter alia, partículas em forma de bastão, elipsoidais, ou semelhantes a bastão ou elipsoidais revestidas. QDs consistem num núcleo cristalino em escala nanométrica de material semicondutor; versões biologicamente ativas ou tipicamente circundadas por uma casca protetora e revestimento externo. Por exemplo, QDs podem compreender cristalitos que apresentam cerca de 2 nm a cerca de 30 nm de diâmetro (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nm) e podem conter aproximadamente 50-500.000 átomos no cristal, incluindo cristais luminescentes compreendendo materiais tais como ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, PbS, PbSe, PbTe, HgS, HgSe, HgTe, Si, ZnO. QDs fluorescem com um espectro de absorção amplo e um espectro de emissão estreito. Diferentemente de outros fluoróforos, que apresentam espectros de absorção distintos, QDs absorvem luz numa faixa espectral ampla, o que permite que os pontos quânticos sejam excitados com uma variedade de fontes luminosas, tais como lasers, lâmpadas de arco, ou LEDs. Além disto, uma coleção de diferentes QDs pode ser utilizada em aplicações de multiplexação utilizando-se uma única fonte de excitação. Entretanto, os espectros de emissão para cada ponto são tipicamente muito estreitos, da ordem de cerca de 30 nm, a cor exata dependendo do diâmetro da partícula e da composição. Além disto, o espectro de emissão estreito dos QDs permite a resolução espectral dos pontos adjacentes. Em adição aos benefícios acima, os QDs são relativamente fotoestáveis, mesmo durante excitação intensa, e são mais brilhantes que os fluoróforos. À luz do mencionado acima, deve ser entendido que a presente invenção engloba a utilização de QDs com tamanhos diferentes de maneira a otimizar os comprimentos de onda em que os perfis WGM podem ser gerados numa partícula microesferoidal.A particularly convenient optically detectable label that may be used in accordance with the present invention is to incorporate fluorescent particles onto or into the microspheroidal particle. These optically detectable label particles may be so small that their properties and emission become size dependent. Such small optically detectable label particles are referred to in the art as semiconductor nanoparticles, quantum dots, quantum wires, quantum rods or nanocrystals or Q particles. Therefore, as used herein, the term "quantum dot" or "QD" shall be understood to include all such particles. In addition, optically detectable labels comprising QDs may comprise approximately spherical or spheroidal particles, or coated spherical or spheroidal particles. However, the term QD should not be considered in any way limited to a spherical, spheroidal, circular, cylindrical or any other morphology of a "point". For example, as used herein QDs may also comprise other morphologies including, inter alia, rod-shaped, ellipsoidal, or rod-like or coated ellipsoidal particles. QDs consist of a nanoscale crystalline core of semiconductor material; biologically active versions or typically surrounded by a protective shell and outer covering. For example, QDs may comprise crystallites which are about 2 nm to about 30 nm in diameter (e.g. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 nm) and may contain approximately 50-500,000 atoms in the crystal, including luminescent crystals comprising materials such as such as ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, PbS, PbSe, PbTe, HgS, HgSe, HgTe, Si, ZnO. QDs fluoresce with a broad absorption spectrum and a narrow emission spectrum. Unlike other fluorophores, which feature distinct absorption spectra, QDs absorb light over a wide spectral range, which allows quantum dots to be excited with a variety of light sources such as lasers, arc lamps, or LEDs. In addition, a collection of different QDs can be used in multiplexing applications using a single excitation source. However, the emission spectra for each point are typically very narrow, on the order of about 30 nm, the exact color depending on particle diameter and composition. In addition, the narrow emission spectrum of QDs allows spectral resolution of adjacent points. In addition to the above benefits, QDs are relatively photostable, even during intense arousal, and are brighter than fluorophores. In light of the above, it should be understood that the present invention encompasses the use of QDs of different sizes in order to optimize the wavelengths at which WGM profiles can be generated in a microspheroidal particle.

Além disto, a presente invenção contempla QDs que são tratados com procedimentos tais como tratamento térmico, modificação de superfície, formação de liga, passívação de superfície ou capeamento com revestimentos de superfície para possibilitar ao QD emitir com alto rendimento quântico e aumentar a fotoestabilidade por períodos de tempo longos. QDs estão também disponíveis comercialmente de companhias tais como Quantum Dot Corp. (QDC), que produz QDs tais como o conjugado de estreptavidina Qdot [marca registrada] 605, contendo um núcleo de seleneto de cádmio que emite a 605 nm. Os conjugados Qdot que emitem a 525, 565, 585 e 655 nm estão também disponíveis. No entanto, deve ser entendido que a presente invenção não está limitada de forma alguma pela composição particular do QD (ou qualquer outro rótulo oticamente detectável) e qualquer QD (comercial ou não) pode ser compatível com a presente invenção.In addition, the present invention contemplates QDs which are treated with procedures such as heat treatment, surface modification, alloying, surface passivation or surface coating capping to enable QD to emit high quantum yield and increase photostability over time. long time. QDs are also commercially available from companies such as Quantum Dot Corp. (QDC), which produces QDs such as streptavidin conjugate Qdot [trademark] 605, containing a cadmium selenide core that emits at 605 nm. Qdot conjugates emitting at 525, 565, 585 and 655 nm are also available. However, it should be understood that the present invention is in no way limited by the particular composition of QD (or any other optically detectable label) and any QD (commercial or otherwise) may be compatible with the present invention.

Existem também muitos corantes fluorescentes que estão disponíveis na técnica e que podem ser utilizados como fluoróforos de acordo com a presente invenção. Uma propriedade importante de um corante fluorescente ou outro fluoróforo, que determina seu potencial para utilização, é o comprimento de onde de excitação do fluoróforo; este deve ser compatível com os comprimentos de onda disponíveis da fonte luminosa. Entretanto, muitos corantes fluorescentes diferentes e outros fluoróforos são familiares aos especialistas na técnica, e a escolha do marcador fluorescente de forma alguma limita a invenção em questão. “Fluoróforos” convenientes que podem ser utilizados para a rotulagem de uma partícula microesferoidal compreendem qualquer marcador fluorescente que seja excitável pela utilização de uma fonte luminosa selecionada do grupo abaixo: (i) Lasers de íon argônio - compreendem uma linha de 488 nm azul que é adequada para a excitação de muitos corantes e fluorocro-mos que fluorescem na região verde para vermelho. Estão também disponíveis lasers de argônio ajustáveis que emitem numa variedade de comprimentos de onda (458 nm, 488 nm, 496 nm, 515 nm, entre outros). (ií) Lasers de diodo - têm um comprimento de onde da emissão de 63 nm. Outros lasers de diodo que estão hoje disponíveis operam a 532 nm. Este comprimento de onda excita iodeto de propídeo (IP) idealmente. Lasers de diodo azuis que emitem luz em torno de 476 nm estão também disponíveis. Esses lasers de diodo podem ser convenientemente empregados para excitar WGMs nas partículas microesferoidais. (iii) Lasers a gás de HeNe - operam a 325 nm. Esses lasers podem ser convenientemente empregados para excitar WGMs nas partículas microesferoidais. (iv) Lasers de HeCd - operam a 325 nm. Esses lasers podem ser convenientemente empregados para excitar WGMs nas partículas microesferoidais. (v) Lâmpada de arco de mercúrio de 100 W - a fonte luminosa mais eficiente para a excitação de corantes UV como Hoechst e DAPI. (vi) Lâmpadas de arco de Xe e lâmpadas de quartzo de halogênio podem semelhantemente serem utilizadas como meio para excitar WGMs e assim utilizar as partículas como sensores.There are also many fluorescent dyes which are available in the art and which can be used as fluorophores according to the present invention. An important property of a fluorescent dye or other fluorophore, which determines its potential for use, is the length of the fluorophore excitation wave; This must be compatible with the available wavelengths of the light source. However, many different fluorescent dyes and other fluorophores are familiar to those skilled in the art, and the choice of fluorescent label in no way limits the invention in question. Suitable "fluorophores" that may be used for labeling a microspheroidal particle comprise any fluorescent marker that is excitable by use of a light source selected from the group below: (i) Argon ion lasers - comprise a blue 488 nm line which is suitable for the excitation of many dyes and fluorochromes that fluoresce in the green to red region. Adjustable argon lasers that emit in a variety of wavelengths (458 nm, 488 nm, 496 nm, 515 nm, among others) are also available. (ii) Diode lasers - have an emission wavelength of 63 nm. Other diode lasers that are available today operate at 532 nm. This wavelength excites propidium iodide (IP) ideally. Blue diode lasers that emit light around 476 nm are also available. These diode lasers can be conveniently employed to excite WGMs in microspheroidal particles. (iii) HeNe gas lasers - operate at 325 nm. These lasers can be conveniently employed to excite WGMs in microspheroidal particles. (iv) HeCd lasers - operate at 325 nm. These lasers can be conveniently employed to excite WGMs in microspheroidal particles. (v) 100 W mercury arc lamp - the most efficient light source for excitation of UV dyes such as Hoechst and DAPI. (vi) Xe arc lamps and quartz halogen lamps may similarly be used as a means to excite WGMs and thus use the particles as sensors.

Numa modalidade particular da presente invenção, os marcadores fluorescentes são selecionados de: corantes Alexa Fluor; corantes BoDipy, incluindo BoDipy 630/650 e BoDipy 650/665; corantes Cy, particularmente Cy3, Cy5 e Cy 5.5; 6-FAM (íluoresceína); fluoresceína dT; Hexaclo-rofluoresceína (HEX); ô-carboxi-^^-dicloro-^J’- dimetoxi-fluoresceína (JOE); corantes verde de Oregon, incluindo 488-X e 514; corantes de rodamina, incluindo verde de rodamina, vermelho de rodamina e ROX; carboxitetrametilrodamina (TAMRA); tetraclorofluores-ceína (TET); e vermelho do Texas.In a particular embodiment of the present invention, fluorescent labels are selected from: Alexa Fluor dyes; BoDipy dyes, including BoDipy 630/650 and BoDipy 650/665; Cy dyes, particularly Cy3, Cy5 and Cy 5.5; 6-FAM (Fluorescein); fluorescein dT; Hexachlorofluorescein (HEX); 6-carboxy-dichloro-4'-dimethoxy-fluorescein (JOE); Oregon green dyes, including 488-X and 514; rhodamine dyes including rhodamine green, rhodamine red and ROX; carboxytetramethylrodamine (TAMRA); tetrachlorofluorescein (TET); and red from Texas.

Duas técnicas de coloração são comumente utilizadas para partículas microesferoidais rotuladas fluorescentes, coloração interna e coloração externa (rotulagem de superfície). As duas técnicas produzem partículas com propriedades singulares, cada uma benéfica para aplicações diferentes. A coloração interna produz partículas extrema-mente estáveis com emissões de fluorescência tipicamente estreitas. Estas partículas freqüentemente mostram uma maior resistência ao fotobran-queamento. Como o fluoróforo está no interior das pérolas, os grupos superficiais estão disponíveis para uso na conjugação dos ligantes (proteínas, anticorpos, ácidos nucléicos etc.) à superfície da pérola. Por esta razão, as pérolas rotuladas internamente são tipicamente utilizadas em aplicações de detecção de produto de análise e imunoensaios. A rotulagem de superfície envolve a conjugação do fluoróforo à superfície da partícula microesferoidal. Como os fluoróforos estão na superfície da partícula, são capazes de interagir com seu ambiente tal como os fluoróforos numa célula marcada. O resultado é um padrão de partícula que exibe as mesmas propriedades de excitação e emissão que as amostras de célula marcada, sob uma variedade de diferentes condições, tais como a presença de contaminantes ou alterações no pH. A natureza “ambientalmente responsiva” das partículas rotuladas de superfície os torna idealmente adequadas para mimetizar amostras biológicas. Partículas rotuladas externamente são freqüentemente utilizadas como controles e padrões numa variedade de aplicações utilizando detecção de fluorescên- cia. Entretanto, a presente invenção contempla a associação de uma partícula com um rótulo fluorescente por qualquer meio.Two staining techniques are commonly used for fluorescent labeled microspheroidal particles, internal staining and external staining (surface labeling). Both techniques produce particles with unique properties, each beneficial for different applications. Internal coloration produces extremely stable particles with typically narrow fluorescence emissions. These particles often show greater resistance to photobleaching. Since fluorophore is within the beads, surface groups are available for use in conjugating ligands (proteins, antibodies, nucleic acids, etc.) to the surface of the beads. For this reason, internally labeled beads are typically used in analytical product detection and immunoassay applications. Surface labeling involves the conjugation of fluorophore to the surface of the microspheroidal particle. Because fluorophores are on the surface of the particle, they are able to interact with their environment just like fluorophores in a labeled cell. The result is a particle pattern that exhibits the same excitation and emission properties as labeled cell samples under a variety of different conditions, such as the presence of contaminants or changes in pH. The “environmentally responsive” nature of surface labeled particles makes them ideally suited to mimic biological samples. Externally labeled particles are often used as controls and standards in a variety of applications using fluorescence detection. However, the present invention contemplates associating a particle with a fluorescent label by any means.

Os termos “partículas fosforescentes”, “partículas de luminóforo” ou “luminóforos” são utilizados aqui de forma intercambiável. O que constitui um rótulo oticamente detectável fosforescente deve ser prontamente entendido por um especialista na técnica. No entanto, como exemplo, que de forma alguma limita a invenção, luminóforos adequados incluem partículas pequenas de ZnS, ZnS:Cu, óxido de Eu e outros luminóforos utilizados em dispositivos mostradores.The terms "phosphorescent particles", "luminophore particles" or "luminophores" are used interchangeably herein. What constitutes a phosphorescent optically detectable label should be readily understood by one of ordinary skill in the art. However, by way of example, which in no way limits the invention, suitable luminophores include small particles of ZnS, ZnS: Cu, Eu oxide and other luminophores used in display devices.

Um rótulo oticamente detectável que compreende uma “partícula dopada” pode incluir uma partícula compreendendo quantidades absorvidas de um ou mais íons de terras raras, tais como Eu, Y, Yb, Sm e semelhantes.An optically detectable label comprising a "doped particle" may include a particle comprising absorbed amounts of one or more rare earth ions such as Eu, Y, Yb, Sm and the like.

Conforme utilizado aqui, o termo “rótulo oticamente detectável” deve ser entendido como englobando também rótulos oticamente detectá-veis múltiplos, misturas de rótulos oticamente detectáveis, nanocristais revestidos, ligas e outras misturas complexas que são evidentes ao especialista na técnica. A utilização de todos estes rótulos oticamente detectáveis em partículas microesferoidais deve ser considerada como dentro do escopo dos métodos e reagentes aqui descritos.As used herein, the term "optically detectable label" should be understood to also encompass multiple optically detectable labels, mixtures of optically detectable labels, coated nanocrystals, alloys and other complex mixtures that are apparent to one skilled in the art. The use of all such optically detectable labels on microspheroidal particles should be considered to be within the scope of the methods and reagents described herein.

De acordo com a presente invenção, foi mostrado que a emissão de qualquer rótulo particular depende da distribuição do rótulo na partícula microesferoidal, do tipo de rótulo e da concentração do rótulo. No entanto, os métodos da presente invenção são ainda praticáveis independentemente de se o rótulo oticamente detectável está na superfície da partícula microesferoidal, presente como uma casca na partícula microesferoidal, localizado no núcleo da partícula microesferoi-dal ou está presente em mais de uma das localizações citadas.According to the present invention, it has been shown that the emission of any particular label depends on the label distribution in the microspheroidal particle, the label type and the concentration of the label. However, the methods of the present invention are still practicable regardless of whether the optically detectable label is on the surface of the microspheroidal particle, present as a shell on the microspheroidal particle, located on the microspheroidal particle core, or present in more than one of the locations. cited.

Deve ser observado que os métodos da presente invenção não se baseiam na interrupção da emissão proveniente do rótulo oticamente detectável. Os métodos da presente invenção, entretanto, são baseados, em parte, numa modulação (isto é, alteração) no perfil WGM do rótulo oticamente detectável como resultado de uma interação ou associação de um produto de análise com um parceiro ligante imobilizado na superfície de uma partícula microesferoidal. WGMs, quando se trata de radiação eletromagnética, são as ressonâncias eletromagnéticas que podem ser estabelecidas quando a luz incidente interage com uma partícula de índice de refração mais alto que seu meio circundante. Os WGMs ocorrem em comprimentos de onda de luz ressonantes para um dado tamanho de partícula, e a natureza do WGM pode se alterar com, inter alia, o tamanho da partícula contendo o WGM e os índices de refração de ambas as partículas e o meio circundante. Além disto, o tamanho da partícula pode afetar também o WGM estabelecido. Os WGMs são estabelecidos quando a luz incidente é submetida a reflexão interna total na superfície da partícula. A reflexão interna total (TIR) pode ocorrer na interface entre dois meios não absorventes. Quando a luz que se propaga no meio com maior índice de refração encontra uma interface num meio de índice de refração mais baixo num ângulo de incidência acima de um ângulo crítico, a luz é totalmente refletida na interface e se propaga de volta para o meio de maior índice de refração. Como é evidente para um especialista na técnica, num meio tridimensional a luz pode ser refletida muitas vezes na partícula de maior índice de refração. Num WGM, a luz é concentrada próxima à circunferência da partícula e pode ser especificado um número modal ou uma ordem modal. O número modal, n, provê o número de comprimentos de onda em torno da circunferência da partícula, e a ordem modal, l, provê o número de máximos na dependência radial do campo eletromagnético na partícula.It should be noted that the methods of the present invention are not based on stopping emission from the optically detectable label. The methods of the present invention, however, are based in part on a modulation (i.e. change) in the optically detectable label WGM profile as a result of an interaction or association of an analyte with a binder partner immobilized on the surface of a microspheroidal particle. WGMs, when it comes to electromagnetic radiation, are the electromagnetic resonances that can be established when incident light interacts with a higher refractive index particle than its surroundings. WGMs occur at resonant wavelengths of light for a given particle size, and the nature of WGM can change with, inter alia, the size of the WGM-containing particle and the refractive indices of both particles and the surrounding medium. . In addition, particle size may also affect the established WGM. WGMs are established when the incident light is subjected to total internal reflection on the particle surface. Total internal reflection (TIR) can occur at the interface between two non-absorbent media. When light propagating in the medium with the highest refractive index encounters an interface in a lower refractive index medium at an angle of incidence above a critical angle, the light is fully reflected in the interface and propagates back into the medium. highest refractive index. As is apparent to one skilled in the art, in a three-dimensional medium light can often be reflected in the higher refractive index particle. In a WGM, light is concentrated near the particle circumference and a modal number or modal order can be specified. The modal number, n, provides the number of wavelengths around the particle's circumference, and the modal order, l, provides the number of maxima in the radial dependence of the electromagnetic field on the particle.

Os emissores de fluorescência incorporados sobre ou numa partícula, conforme definido aqui, apresentam perfis WGM definidos. Estes modos permitem apenas que certos comprimentos de onde sejam emitidos pela partícula. O resultado deste fenômeno é que o espectro de emissão relativamente amplo usual de um rótulo oticamente detectável (por exemplo, fluoróforos tipicamente emitem numa banda larga de ΙΟΙ 00 nm) se torna restrito e aparece como uma série de “picos” agudos correspondendo efetivamente aos padrões do modo estacionário de luz na partícula. As séries de picos gerados como resultado do estabelecimento de um WGM na partícula microesferoidal da presente invenção são chamados aqui de “Perfis de Modo de galeria de Sussurros” ou “Perfis WGM”. O perfil WGM é extremamente sensível tanto à posição do rótulo oticamente detectável incorporado quando de sua concentração e configuração espacial em relação entre si. Além disto, o tamanho da partícula e o índice de refração são também importantes na determinação dos comprimentos de onda de emissão vistos num perfil WGM. É proposto que a posição e a amplitude de um ou mais dos picos num perfil WGM podem ser fortemente influenciadas pelas interações ou associações da partícula microesferoidal com moléculas numa amostra ou ambiente externo.Fluorescence emitters incorporated into or into a particle as defined herein have defined WGM profiles. These modes only allow certain lengths from which they are emitted by the particle. The result of this phenomenon is that the usual relatively broad emission spectrum of an optically detectable label (eg fluorophores typically emit within a numa00 nm band) becomes restricted and appears as a series of sharp “peaks” effectively meeting the standards. of the stationary mode of light in the particle. The peak series generated as a result of the establishment of a WGM in the microspheroidal particle of the present invention are referred to herein as "Whisper Gallery Mode Profiles" or "WGM Profiles". The WGM profile is extremely sensitive to both the position of the incorporated optically detectable label and its concentration and spatial configuration in relation to each other. In addition, particle size and refractive index are also important in determining the emission wavelengths seen in a WGM profile. It is proposed that the position and amplitude of one or more of the peaks in a WGM profile may be strongly influenced by the interactions or associations of the microspheroidal particle with molecules in a sample or external environment.

Num exemplo, a associação ou ligação de uma molécula a uma partícula microesferoidal altera o índice de refração efetivo da partícula microesferoidal alterando o perfil WGM gerado pela partícula microesferoidal. O termo “índice de refração” é prontamente entendido por um especialista na técnica. Em resumo, o índice de refração de um meio é um valor calculado a partir do razão da velocidade da luz num vácuo em relação a um segundo meio de maior densidade. No caso de uma partícula microesferoidal, uma alteração no “índice de refração efetivo” pode ser uma alteração no índice de refração da partícula microesferoidal completa, ou uma alteração no índice de refração efetivo pode ser uma alteração no índice de refração de uma região ou parte da partícula microesferoidal. Por exemplo, uma alteração no índice de refração efetivo de uma partícula microesferoidal pode compreender uma alteração no índice de refração da superfície e/ou periferia da partícula microesferoi- dal.In one example, associating or binding a molecule to a microspheroidal particle alters the effective refractive index of the microspheroidal particle by altering the WGM profile generated by the microspheroidal particle. The term "refractive index" is readily understood by one of skill in the art. In summary, the refractive index of a medium is a value calculated from the ratio of the speed of light in a vacuum to a second medium of higher density. In the case of a microspheroidal particle, a change in the “effective refractive index” may be a change in the refractive index of the complete microspheroidal particle, or a change in the effective refractive index may be a change in the refractive index of a region or part. of the microspheroidal particle. For example, a change in the effective refractive index of a microspheroidal particle may comprise a change in the refractive index of the microspheroidal particle surface and / or periphery.

Numa realização particular, a presente invenção contempla um método para a detecção da ligação ou associação de uma molécula a, ou proximal com, a superfície ou sub-superfície da partícula microesferoidal onde a ligação ou associação da molécula a um parceiro ligante imobilizado da molécula provoca uma alteração no índice de refração efetivo na superfície da partícula microesferoidal.In a particular embodiment, the present invention contemplates a method for detecting binding or associating a molecule to or proximal with the surface or subsurface of the microspheroidal particle where binding or associating the molecule to an immobilized binding partner of the molecule causes a change in the effective refractive index on the microspheroidal particle surface.

Uma “sub-superfície” inclui bolsas ou poros que circundam a partícula ou que formam uma interface contínua entre um ambiente interno da partícula e um ambiente externo.A "subsurface" includes pockets or pores that surround the particle or form a continuous interface between an internal particle environment and an external environment.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se à aplicação do método da presente invenção para a detecção de alterações da morfo-logia, formato ou tamanho de uma partícula microesferoidal, onde a partícula microesferoidal compreende uma partícula rotulada com um rótulo oticamente detectável e carrega uma molécula imobilizada à superfície ou sub-superfície da partícula, onde a referida partícula microesferoidal exibe um ou mais perfis WGM, e onde um ou mais perfis WGM baseados no rótulo da citada partícula microesferoidal se alteram de forma detectável com uma alteração na morfologia, formato ou tamanho da partícula microesferoidal, quando um produto de análise interage com a molécula imobilizada; compreendendo o método: (i) a determinação do perfil WGM inicial da partícula microesferoidal; (ii) a submissão da partícula microesferoidal a uma suposta alteração na morfologia, formato ou tamanho da partícula microesferoidal após uma interação potencial entre um produto de análise e a molécula imobilizada; (iii) a determinação de um ou mais perfis WGM subseqüentes da partícula microesferoidal; em que a modulação de um ou mais perfis WGM da partícula microesferoidal, em relação ao perfil inicial, é indicativa de uma alteração na morfologia, formato ou tamanho da partícula microesferoidal e da presen- ça de um produto de análise associado com a molécula imobilizada.In yet another aspect, the present invention relates to the application of the method of the present invention for detecting changes in morphology, shape or size of a microspheroidal particle, wherein the microspheroidal particle comprises a particle labeled with an optically detectable label and carries a molecule immobilized to the surface or subsurface of the particle, wherein said microspheroidal particle exhibits one or more WGM profiles, and where one or more WGM profiles based on the label of said microspheroidal particle change detectably with a change in morphology, microspheroidal particle shape or size when an analyte interacts with the immobilized molecule; the method comprising: (i) determining the initial WGM profile of the microspheroidal particle; (ii) subjecting the microspheroidal particle to an alleged change in morphology, shape or size of the microspheroidal particle following a potential interaction between an analyte and the immobilized molecule; (iii) determining one or more subsequent WGM profiles of the microspheroidal particle; wherein the modulation of one or more WGM profiles of the microspheroidal particle relative to the initial profile is indicative of a change in the morphology, shape or size of the microspheroidal particle and the presence of an analyte associated with the immobilized molecule.

Conforme referido aqui “morfologia, formato ou tamanho” de uma partícula microesferoidal refere-se às dimensões espaciais da partícula microesferoidal. Da mesma forma, alterações da morfologia, formato ou tamanho da partícula microesferoidal incluem alterações em qualquer dimensão espacial da partícula microesferoidal incluindo, mas, sem limitação, alterações na altura, largura, profundidade, raio, diâmetro, circunferência e semelhantes.As referred to herein the "morphology, shape or size" of a microspheroidal particle refers to the spatial dimensions of the microspheroidal particle. Similarly, changes in microspheroidal particle morphology, shape or size include changes in any spatial dimension of the microspheroidal particle including, but not limited to, changes in height, width, depth, radius, diameter, circumference, and the like.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção está direcionada para uma partícula microesferoidal que compreende uma partícula rotulada com um rótulo oticamente detectável, em que a partícula microesferoidal exibe um perfil WGM e onde o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado de forma detectável, quando um produto de análise interage com uma molécula imobilizada à dita partícula microesferoidal.In yet another aspect, the present invention is directed to a microspheroidal particle comprising a particle labeled with an optically detectable label, wherein the microspheroidal particle exhibits a WGM profile and where the microspheroidal particle WGM profile is detectably modulated when a product of analysis interacts with a molecule immobilized to said microspheroidal particle.

Conforme aqui utilizado, a molécula ou parceiro ligante imobilizado numa partícula microesferoidal ou o produto de análise numa amostra, referem-se a qualquer entidade química. Essas entidades químicas incluem, mas, sem limitação, moléculas químicas pequenas; peptí-deos, polipeptídeos e proteínas ou análogos destes, moléculas de ácido nucléíco ou análogos destas, átomos ou íons metálicos ou compostos compreendendo tais átomos ou íons. Das moléculas de ácido nucléico, RNAs interferentes curtos (de fita simples ou dupla) [siRNAs], complexos de RNA interferente (RNAi) e oligonucleotídeos de DNA e RNA, são particularmente contemplados. Compostos químicos incluem entidades produzidas numa biblioteca combinatória ou numa biblioteca química. Adicionalmente, é contemplada a seleção de produto natural a partir de uma fonte biológica. A referência uma fonte biológica inclui uma amostra ambiental, extrato de organismo, extrato de planta ou animal, soro, urina, sêmen, exsudato, plasma, amostra de solo, amostra fluvial ou marinha, amostra extraterrestre, entre outras fontes.As used herein, the binding molecule or partner immobilized on a microspheroidal particle or the analyte in a sample refers to any chemical entity. These chemical entities include, but are not limited to, small chemical molecules; peptides, polypeptides and proteins or analogs thereof, nucleic acid molecules or analogs thereof, metal atoms or ions or compounds comprising such atoms or ions. Of nucleic acid molecules, short (single or double stranded) interfering RNAs [siRNAs], interfering RNA (RNAi) complexes, and DNA and RNA oligonucleotides are particularly contemplated. Chemical compounds include entities produced in a combinatorial library or chemical library. Additionally, selection of natural product from a biological source is contemplated. Reference to a biological source includes an environmental sample, organism extract, plant or animal extract, serum, urine, semen, exudate, plasma, soil sample, fluvial or marine sample, extraterrestrial sample, among other sources.

Conforme utilizada aqui, a frase “ligada a ou de alguma outra forma associado com” refere-se a qualquer processo pelo qual uma molécula pode ser associada com uma partícula microesferoidal. Modos típicos pelos quais essas associações podem ser mediadas incluem, mas, sem limitação; ligação covalente, ponde de hidrogênio, forças de van der Waals, ligação iônica, ligação metálica, ligação polar e ligação dativa (covalente) e semelhantes.As used herein, the phrase "bound to or otherwise associated with" refers to any process by which a molecule may be associated with a microspheroidal particle. Typical ways in which these associations can be mediated include, but are not limited to; covalent bonding, hydrogen bonding, van der Waals forces, ionic bonding, metal bonding, polar bonding and dative bonding (covalent) and the like.

Uma molécula que inclui um parceiro ligante pode também ser fixada a uma partícula microesferoidal por meio de um agente que promova ou aumente a adsorção ou ligação da molécula à superfície da partícula microesferoidal, esse agente é aqui chamado de “ligante”. Por exemplo, polinucleotídeos podem ser associados com uma partícula microesferoidal por meio de um ligante que compreende um grupo tiol, amino ou carboxil. Exemplos de ligantes adequados incluem silanos terminados em amino tais como amino-propiltrimetoxisilano ou amino-propiltríetoxisilano. Em adição aos silanos, compostos tais como poli-L-lisina que se ligam de forma não covalente a superfícies tais como vidro e adsorvem eletrostaticamente os grupos fosfato de um polinucleotídeo estão também dentro do escopo da presente invenção. Por esta razão, outras moléculas, incluindo outros silanos, que são adequados para promover a ligação ou associação de um polinucleotídeo, polipeptídeo ou outro composto à superfície de uma partícula microesferoidal, serão prontamente identificadas por um especialista na técnica e a presente invenção não está limitada à escolha do ligante.A molecule that includes a binder partner may also be attached to a microspheroidal particle by means of an agent that promotes or increases the adsorption or binding of the molecule to the surface of the microspheroidal particle, which agent is referred to herein as a "binder". For example, polynucleotides may be associated with a microspheroidal particle by means of a binder comprising a thiol, amino or carboxyl group. Examples of suitable binders include amino terminated silanes such as amino propyltrimethoxysilane or amino propyltriethoxysilane. In addition to silanes, compounds such as poly-L-lysine that non-covalently bind to surfaces such as glass and electrostatically adsorb the phosphate groups of a polynucleotide are also within the scope of the present invention. For this reason, other molecules, including other silanes, which are suitable for promoting the attachment or association of a polynucleotide, polypeptide or other compound to the surface of a microspheroidal particle will be readily identified by one of skill in the art and the present invention is not limited. the choice of binder.

Numa modalidade, a presente invenção contempla uma partícula microesferoidal que compreende uma partícula rotulada com um rótulo otícamente detectável, em que a referida partícula microesferoidal exibe um perfil WGM e em que o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado de forma detectável, quando uma molécula se liga ou se associa com a partícula microesferoidal, tal como por meio de uma molécula compreendendo uma molécula de ácido nucléico ligada à, ou de outra forma associada com a superfície da partícula microesferoidal.In one embodiment, the present invention contemplates a microspheroidal particle comprising a particle labeled with an optically detectable label, wherein said microspheroidal particle exhibits a WGM profile and wherein the microspheroidal particle WGM profile is detectably modulated when a molecule binds or associates with the microspheroidal particle, such as by means of a molecule comprising a nucleic acid molecule attached to or otherwise associated with the surface of the microspheroidal particle.

Os termos “ácido nucléico”, “nucleotídeo” e “polinucleotídeo” incluem RNA, cDNA, DNA genômico, formas sintéticas e polímeros mistos, fitas tanto senso quanto anti-senso e que podem ser modificados quimicamente ou bioquimicamente ou podem conter bases de nucleotí-deos não naturais ou derivatizadas, como será prontamente observado pelos especialistas na técnica. Essas modificações incluem, por exemplo, rótulos, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos naturais por um análogo (tal como um anel morfolino), modificações intra nucleotídeos tais como ligações não carregadas (por exemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos etc.), ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos etc.), radicais anexos (por exemplo, polipeptídeos), intercalantes (por exemplo, acridina, psoraleno etc.), quelantes, alquilantes e ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucléi-cos α-anoméricos etc.). Também incluídas então moléculas sintéticas que mimetizam polinucleotídeos em sua capacidade de ligação a uma sequência designada por meio de ponte de hidrogênio e outras interações químicas. Essas moléculas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, aquelas nas quais ligações peptídicas são substituídas por ligações fosfato no esqueleto da molécula.The terms "nucleic acid", "nucleotide" and "polynucleotide" include RNA, cDNA, genomic DNA, synthetic forms and mixed polymers, sense and antisense strands which may be chemically or biochemically modified or may contain nucleotide bases. unnatural or derivatized oils, as will be readily appreciated by those skilled in the art. Such modifications include, for example, labels, methylation, substitution of one or more of the natural nucleotides for an analog (such as a morpholino ring), intra-nucleotide modifications such as uncharged bonds (e.g., methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoamidates, carbamates etc. .), charged bonds (eg phosphorothioates, phosphorodithioates etc.), attached radicals (eg polypeptides), intercalants (eg acridine, psoralen etc.), chelators, alkylators and modified bonds (eg nucleic acids). α-anomeric cos, etc.). Also included are synthetic molecules that mimic polynucleotides in their ability to bind to a designated sequence by hydrogen bridge and other chemical interactions. Such molecules are known in the art and include, for example, those in which peptide bonds are replaced by phosphate bonds in the backbone of the molecule.

Outra realização da presente invenção contempla uma partícula microesferoidal conforme descrita anteriormente, em que a partícula microesferoidal compreende adicionalmente DNA ligado a ou, de outra forma, associado com a superfície da partícula microesferoidal.Another embodiment of the present invention contemplates a microspheroidal particle as described above, wherein the microspheroidal particle further comprises DNA bound to or otherwise associated with the surface of the microspheroidal particle.

Ainda uma realização adicionalmente preferida da presente invenção contempla uma partícula microesferoidal conforme descrita anteriormente, em que a partícula microesferoidal compreende adicional-mente RNA ou um complexo de RNA (por exemplo, complexo RNA-RNAse) ligado a ou, de outra forma, associado com a superfície da partícula microesferoidal.Still a further preferred embodiment of the present invention contemplates a microspheroidal particle as described above, wherein the microspheroidal particle further comprises RNA or an RNA complex (e.g., RNA-RNAse complex) attached to or otherwise associated with. the surface of the microspheroidal particle.

Numa modalidade alternativa, a presente invenção contempla uma partícula microesferoidal compreendendo uma partícula rotulada com um rótulo oticamente detectável, em que a partícula microesferoidal exibe um perfil WGM e onde o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado de forma detectável, quando um peptídeo, polipeptídeo ou proteína ou análogos destes se ligam ou de outra forma se associam com a superfície da partícula microesferoidal.In an alternative embodiment, the present invention contemplates a microspheroidal particle comprising a particle labeled with an optically detectable label, wherein the microspheroidal particle exhibits a WGM profile and wherein the microspheroidal particle WGM profile is detectably modulated when a peptide, polypeptide or protein or analogs thereof bind or otherwise associate with the surface of the microspheroidal particle.

Em uma realização, o peptídeo, polipeptídeo ou proteína é uma enzima.In one embodiment, the peptide, polypeptide or protein is an enzyme.

Noutra modalidade, o peptídeo, polipeptídeo ou proteína é um anticorpo. O termo “anticorpo” refere-se a uma proteína da família da imu-noglobulinas que é capaz de se combinar, interagir ou de outra forma se associar com um antígeno. Um anticorpo é, desta forma, uma molécula que se liga a um antígeno. O termo “antígeno” é utilizado aqui em seu sentido mais amplo para se referir a uma substância que é capaz de reagir com ou se ligar a um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo. Com referência à presente invenção, um antígeno inclui também o idioti-po de um anticorpo. O termo “imunoglobulina” é aqui utilizado para se fazer referência a uma proteína consistindo num ou mais polipeptídeos substancialmente codificados pelos genes da imunoglobulina. As moléculas de imunoglo-bulinas incluem as regiões constantes κ, λ, α, γ (IgGi, IgG2, IgG3, IgG4), δ, ε e μ, cadeias leves (κ e 1), bem como as muitas regiões variáveis das imunoglobulinas, Uma forma de imunoglobulina constitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Esta forma é um tetrâmero e consiste em dois pares idênticos de cadeias de imunoglobulina, cada par apresentando uma cadeia leve e uma pesada. Em cada par, as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada são em conjunto responsáveis pela ligação a um antígeno e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efetoras do anticorpo. Em adição aos anticorpos, as imunoglo-bulinas podem existir numa variedade de outras formas incluindo, por exemplo, Fv, Fab, Fab’ e (Fab j2 e anticorpos quiméricos e todas estas variantes são englobadas pelo termo “anticorpo”, conforme utilizado aqui. Adicionalmente, imunoglobulinas de outros animais (por exemplo, aves, mamíferos, peixes, anfíbios, e répteis) apresentam funções semelhantes, apesar da nomenclatura diferente, são também consideradas como “anticorpos”. A presente invenção contempla também partículas microesferoi-dais compreendendo anticorpos anti-ideotípicos ligados a ou, de outra forma, associados com essas. Conforme utilizado aqui, o termo “anticorpo anti-ideotípico” refere-se a um anticorpo que reconhece e se liga a determinantes antigênicos dentro da região variável, por exemplo, os domínio Vh e/ou Vl, de um anticorpo alvo. Estes determinantes antigênicos dentro da região variável de um anticorpo são chamadas de “ideoti-po” de um anticorpo. Da mesma forma, um anticorpo específico para estas regiões é chamado de um “anticorpo anti-ideotípico”. “Análogos” de peptídeos, polipeptídeos e/ou proteínas contemplados aqui incluem, mas, sem limitação, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas compreendendo uma modificação nas cadeias laterais, peptídeos sintéticos que incorporam aminoácidos não naturais e/ou seus derivados durante a síntese e a utilização de reticuladores e outros métodos que provoquem restrições conformacionais no peptídeo, polipeptídeo ou proteína em questão.In another embodiment, the peptide, polypeptide or protein is an antibody. The term "antibody" refers to a protein of the immunoglobulin family that is capable of combining, interacting or otherwise associating with an antigen. An antibody is thus a molecule that binds to an antigen. The term "antigen" is used herein in its broadest sense to refer to a substance that is capable of reacting with or binding to an antigen binding site of an antibody. With reference to the present invention, an antigen also includes the idiotype of an antibody. The term "immunoglobulin" is used herein to refer to a protein consisting of one or more polypeptides substantially encoded by the immunoglobulin genes. The immunoglobulin molecules include the constant regions κ, λ, α, γ (IgGi, IgG2, IgG3, IgG4), δ, ε and μ, light chains (κ and 1), as well as the many variable regions of immunoglobulins, One form of immunoglobulin constitutes the basic structural unit of an antibody. This form is a tetramer and consists of two identical pairs of immunoglobulin chains, each pair having one light and one heavy chain. In each pair, the light chain and heavy chain variable regions together are responsible for binding to an antigen and the constant regions are responsible for the effector functions of the antibody. In addition to antibodies, immunoglobulins may exist in a variety of other forms including, for example, Fv, Fab, Fab 'and (Fab 12 and chimeric antibodies) and all of these variants are encompassed by the term "antibody" as used herein. In addition, immunoglobulins from other animals (e.g., birds, mammals, fish, amphibians, and reptiles) perform similar functions, although different nomenclature, are also considered as “antibodies.” The present invention also contemplates microspherical particles comprising anti-antibodies. -ideotypic-linked to or otherwise associated therewith.As used herein, the term "anti-ideotypic antibody" refers to an antibody that recognizes and binds to antigenic determinants within the variable region, e.g. Vh and / or Vl of a target antibody These antigenic determinants within the variable region of an antibody are called "ideotypes". Similarly, an antibody specific for these regions is called an "anti-ideotypic antibody." Peptide, polypeptide and / or protein "analogs" contemplated herein include, but are not limited to, peptides, polypeptides or proteins comprising a side chain modification, synthetic peptides incorporating unnatural amino acids and / or derivatives thereof during synthesis and use cross-linkers and other methods that cause conformational restrictions on the peptide, polypeptide or protein in question.

Exemplos de modificações de cadeia lateral incluem modificações dos grupos amino tais como por alquilação redutora por reação com um aldeído seguida da redução com NaBfh; amidinação com metilaceti-midato; acilação com anidrido acético; carbamoilação dos grupos amino com cianato; trinitrobenzilação dos grupos amino com ácido 2,4,6-trinitrobenzenosulfôníco (TNBS); acilação dos grupos amino com anidrido succínico e anidrido tetrahidroftálico; e piridoxilação de lisina com piri-doxal-5-fosfato seguido da redução com NaBH4. O grupo guanidino dos resíduos de arginina pode ser modificado pela formação de produtos de condensação heterocíclica com reagentes tais como 2,3-butadiona, fenilglioxal e glioxal. 0 grupo carboxil pode ser modificado por ativação de carbo-diimida por meio da formação de O-aciüsouréia seguida de derivatização subsequente, por exemplo, para a amida correspondente.Examples of side chain modifications include amino group modifications such as by reducing alkylation by reaction with an aldehyde followed by reduction with NaBfh; methylacetidate amidination; acyl anhydride acylation; carbamoylation of amino groups with cyanate; trinitrobenzylation of amino groups with 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS); acylation of amino groups with succinic anhydride and tetrahydrophthalic anhydride; and pyridoxylation of lysine with pyri-doxal-5-phosphate followed by reduction with NaBH4. The guanidino group of the arginine residues can be modified by the formation of heterocyclic condensation products with reagents such as 2,3-butadione, phenylglyoxal and glyoxal. The carboxyl group may be modified by carbo-diimide activation by formation of O-acylsurea followed by subsequent derivatization, for example, to the corresponding amide.

Os grupos sulfidril podem ser modificados por métodos tais como carboximetilação com ácido iodoacético ou iodoacetamida; oxidação de ácido perfórmico a ácido cisteico; formação de um dissulfeto misto com outros compostos tiol; reação com maleimída, anidrido maleico, ou outra maleimida substituída; formação de derivados mercuriais utilizando-se 4-cloromercurobenzoato, ácido 4-cloromercurofenilsulfônico, cloreto de fenilmercúrio, 2-cloromercuro-4-nitrofenol e outros mercuriais; carba-moilação com cianato em pH alcalino.Sulfhydryl groups may be modified by methods such as carboxymethylation with iodoacetic acid or iodoacetamide; oxidation of performic acid to cysteic acid; formation of a mixed disulfide with other thiol compounds; reaction with maleimide, maleic anhydride, or other substituted maleimide; formation of mercurial derivatives using 4-chloromercurobenzoate, 4-chloromercurophenylsulfonic acid, phenylmercury chloride, 2-chloromercuro-4-nitrophenol and other mercurials; carbanylation with cyanate at alkaline pH.

Os resíduos de triptofano podem ser modificados, por exemplo, por oxidação com N-bromosuccinimida ou alquilação do anel indol com brometo de 2-hidroxi-5-nitrobenzila ou haletos de sulfonila para formar um derivado 3-nitrotirosina.Tryptophan residues may be modified, for example, by oxidation with N-bromosuccinimide or alkylation of the indole ring with 2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide or sulfonyl halides to form a 3-nitrotirosine derivative.

As modificações do anel imidazol de um resíduo de hístidina podem ser realizadas por alquilação com derivados de ácido iodoacético ou N-carbetoxilação com dietilpirocarbonato.Modifications of the imidazole ring of a histidine residue may be effected by alkylation with iodoacetic acid derivatives or N-carbetoxylation with diethylpyrocarbonate.

Exemplos de incorporação de aminoácidos não naturais e derivados durante a síntese de peptídeo incluem, mas, sem limitação, a utilização de norleucina, ácido 4-aminobutírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanóico, ácido 6-aminohexanóico, t-butilglicina, norvalina, fenil-glicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-õ-metilhepta-nóico, 2-tienilalanima e/ou D-isômeros de aminoácidos. Uma lista de aminoácidos não naturais contemplados aqui, é mostrada na Tabela 2.Examples of incorporation of unnatural amino acids and derivatives during peptide synthesis include, but are not limited to, the use of norleucine, 4-aminobutyric acid, 4-amino-3-hydroxy-5-phenylpentanoic acid, 6-aminohexanoic acid, t butylglycine, norvaline, phenylglycine, ornithine, sarcosine, 4-amino-3-hydroxy-6-methylheptaenoic acid, 2-thienylalanime and / or amino acid D-isomers. A list of unnatural amino acids contemplated herein is shown in Table 2.

Tabela 2 - Códigos Para Aminoácidos Não Convencionais Aminoácido Códi- Aminoácido Códi- não convencional__________go_________não convencional__________go ácido α-aminobutírico Abu L-N-metilalanina Nmala a-amino-a-metilbutirato Mgabu L-N-metilarginina Nmarg aminopropano-carboxilato Cpro ácido L-N-metil-aspártico Nmasp ácido aminoisobutírico Aib L-N-metilcisteína Nmcys aminonorbornil- Norb ácido L-N-metil-glutâmico Nmglu carboxilato ciclohexilalanina Chexa L-N-metilhistidina Nmhis ciclopetilalanina Cpen L-N-metilisoleucina Nmile D-alanima Dal L-N-metilleucina Nmleu D-arginina Darg L-N-metillisina Nmlys ácido D-aspãrtico Dasp L-N-metilmetionina Nmmet D-cisteína Dcys L-N-metilnorleucina Nmnle D-glutamina Dgln L-N-metilnorvalina Nmnva ácido D-glutâmico Dgíu L-N-metilornitina Nmom D-histidina Dhis L-N-metilfenilalanina Nmphe D-isoleucina Dile L-N-metilprolina Nmpro D-leucina Dleu L-N-metilserina Nmser D-lisina Dlys L-N-metiltreonina Nmthr D-metionaína Dmet L-N-metiltriptofano Nmtrp D-ornitina Dom L-N-metiltirosina Nmtyr D-fenilalanina Dphe L-N-metilvalina Nmval D-prolina Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg D-serina Dser L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug D-treonina Dthr L-norleucina Nle D-triptofano Dtrp L-norvalina Nva D-tirosina Dtyr α-metil-aminoisobutirato Maib D-valina Dval a-metil-y-aminobutirato Mgabu Aminoácido Códi- Aminoácido Códi- não convencional_____________go___________nào convencional_____________go D-a-metilalanina Dmala α-metilciclohexilalanina Mchexa D-a-metilarginina Dmarg a-metilciclopentílalanina Mcpen D-a-matilasparagina Dmasn α-metil-a-naftilalanina Manap D-a-metilaspartato Dmasp α-metilpenicilamina Mpen D-a-metilcisteína Dmcys N-(4-aminobutil)glicína Nglu D-a-metilglutamina Dmgln N-(2-aminoetil)glicina Naeg D-a-metilhistidina Dmhis N-(3-aminopropii)glicina Nom D-a-metilisoleucina Dmile N-amino-a-metilbuíirato Nmaabu D-a-metíl-leucina Dmleu α-naftilalanina Anap D-a-metil-lisina Dmlys N-benzilglicina Nphe D-a-metilmetionina Dmmet N-(2-carbamüetü)gEdna Ngln D-a-metilmetilornitina Dmorn N-(carbamilmetil)glicina Nasn D-a-metilfenilalanina Dmphe N-(2-carboxietil)glicma Nglu D-a-metilprolina Drapro N-(carboximetil)glicina Nasp D-a-metilserina Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut D-a-metiltreonina Dmthr N-cicloheptilglicina Nchep D-d-metiltriptofano Dmtrp N-ciclohexilglicina Nchex D-a-metiltirosina Dmly N-ciclodecilglicina Ncdec D-a-metilvalina Dmval N-ciclododecilglicina Ncdod D-N-metilalanina Dnmala N-ciclioctilglicina Ncoct D-N-metilarginina Dnmarg N-ciclopropilgHcina Ncpro D-N-metilasparagina Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund D-N-metilaspartato Dnmasp N-{2;2-difeniletil)gl.icina Nbhm D-N-metilcisteína Dnmcys N-(3,3<ffenilpropI)glic^ Nbhe D-N-metilglutamina Dnmgln N^3^uanidinopropi^i(±ia Narg D-N-metilglutamato Dnmglu N-(l-hidroxietil)glicina Nthr D-N-metilhistidina Dnmhis N-(hidroxietil)glicina Nser D-N-metilisoleucina Dnmile N-(imidazoliletil)glicina Nhis D-N-metil-leucina Dnmleu N-(3-indolileti])glicina Nhtrp Aminoácido Códi- Aminoácido Códi- não convencional____________go__________nâo convencional____________go D-N-metil-lisina Dnmlys N-metil-y-aminobutirato Nmgabu N-metiiciclohexilalanina Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet D-N-metilornitina Dnmom N-metildclopentilalanina Nmcpen N-metilglicina Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe N-metílaminoisobutimto Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro N- (1 -metilpropiljglicina Nile D-N-metilserina Dnmser N-(2-metilpropil)glicina Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr D-N-metiltriptofano Dnmtrp N-(l-metiletil)glicina Nval D-N-metiltirosina Dnmtyr N-metilnaftilalanina Nmanap D-N-metilvalina Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen ácido γ-aminobutírico Gabu N-(p-hidroxÍfenil)glicina Nhtyr L-í-butilglicina Tbug N-(tiometil)glicina Ncys L-etilglicina Etg penicilamina Pen L-homofenilalanina Hphe L-a-metilalanína Mala L-a-metilarginina Marg L-a-metilasparagina Masn L-a-metilaspartato Masp L-a-metil-í-butilglicina Mtbug L-a-metilcisteína Mcys L-metiletilglicina Metg L-a-metilglutamina Mgln L-a-metilglutamato Mglu L-a-metilhistidina Mhis L·α-meti]homofeni]alanina Mhphe L-a-metilisoleucina Mile N-(2-metiltioetil)glicina Nmet L-a-metil-leucina Mleu L-a-metil-lisina Mlys L-a-metilmetionina Mmet L-a-metilnorleucina Mnle L-a-metilnorvalina Mnva L-a-metilornitina Mom L-a-metilfenilalanina Mphe L-a-metilprolina Mpro L-a-metilserina Mser L-a-metiltreonina Mthr L-a-metiltriptofano Mtrp L-a-metilmetiltirosina Mtyr L-a-metilvalina Mval L·N-metilhomofenilalanina Nmhphe N-(N-(2,2-difeniletil- N-(N-(3,3-difenilpropil- Nnbhm Nnbhe carbamilmeíiljglicina carbamilmetil) glicina Aminoácido Códi- Amínoácido Códi- não convencional___________go_________não convencional___________go l-carboxi-l-(2,2-difenil- Nmbe etüarninojciclopropano____________________________________________________ Os reticuladores podem ser utilizados, por exemplo, para estabilizar as conformações 3D, utilizando-se reticuladores homo-bifuncionais tais como os ésteres imido bifuncionais contendo grupos espaçadores (CH2)n com n=l a n=6, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxisuccinimida e reagentes hetero-bifuncionais os quais usualmente contém um radical amino reativo tal como N-hidroxisuccinimida e um outro radical reativo específico de grupo tal como maleimido ou radical ditio (SH) ou carbodii-mida (COOH). Adicionalmente, peptídeos podem ser restritos em sua conformação, por exemplo, pela incorporação de ácidos CQ e Na-metilamíno, introdução de duplas ligações entre os átomos C0 e Cp dos aminoácidos e a formação de peptídeos cíclicos ou análogos, pela introdução de ligações covalentes tais como pela formação de uma ligação amida entre os N e C terminais, entre duas cadeias laterais ou entre uma cadeia lateral e os N ou C terminais.Table 2 - Codes For Unconventional Amino Acids Codine Amino Acid Codon Amino Acid Unconventional Codon __________ go _________ unconventional__________go α-aminobutyric acid Abu LN-methylalanine Nmala α-amino-α-methylbutyrate Mgabu LN-methylarginine Nmarg aminopropane carboxylate Acid N-acid Acid Lpro aminoisobutyric Aib LN-methylcysteine Nmcys aminonorbornyl-Norb LN-methyl-glutamic acid Nmglu carboxylate cyclohexylalanine Chexa LN-methylstylidine Nmhis cyclopetylalanine Cpen LN-methylisoleucine Nmile D-alanine Dal Ln-methyl Densinamine-Laminin Acid LN-Methylmethionine Nmmet D-Cysteine Dcys LN-Methylnorleucine Nmnle D-Glutamine Dgln LN-Methylnorvaline Nmnva D-Glutamic Acid Dgiu LN-Methylornithine Nmom D-Histidine Dhis LN-Methylphenylalanine Nmphe D-Nine Luthenine Ducnine -methylserine Nmser D-lysine Dlys LN-methyltreonine Nmthr D-methionine Dmet LN-methyl tryptophan Nmtrp D-ornithine Dom LN-methylthyrosine Nmtyr D-phenylalanine Dphe LN-methylvaline Nmval D-proline Dpro LN-methylethylglycine Nmetg D-serine Dser LN-methyl-t-butylglycine Nmtbug D-threonine Dthr L-norleucin L-norvaline Nva D-tyrosine Dtyr α-methyl-aminoisobutyrate Maib D-valine Dval α-methyl-y-aminobutyrate Mgabu Amino Acid Codi- Amino Acid Unconventional Coded _____________ go ___________ unconventional_____________go D-Methylalanine Dmala α-Methylcyclineyl-methylcycline-methylcycline Amino acid Mcpen Da-matilasparagine Dmasn α-methyl-a-naphthylalanine Manap Da-methylaspartate Dmasp α-methylpenicillamine Mpen Da-methylcysteine Dmcys N- (4-aminobutyl) glycine Nglu Da-methylglutamine Dmgln N- (2-aminoethyl) glycine Naeg Daeg Da-methyl Dmhis N- (3-aminopropii) glycine Nom Da-methylisoleucine Dmile N-amino-a-methylbuirate Nmaabu Da-methyl leucine Dmleu α-naphthylalanine Anap Da-methyl-lysine Dmlys N-benzylglycine Nphe Da-methylm Ethionine Dmmet N- (2-carbamüetü) gEdna Ngln Da-methylmethylornithine Dmorn N- (carbamylmethyl) glycine Nasn Da-methylphenylalanine Dmphe N- (2-carboxyethyl) glycine Nglu Da-methylproline Drapro N- (carboxymethyl) glycine Nasp Da-methylserine N-Cyclobutylglycine Ncbut D-Methyltreonine Dmthr N-Cycloheptyglycine Nchep Dd-Methyltryptophan Dmtrp N-Cyclohexylglycine Nchex Da-Methylthyrosine Dmly N-Cyclodecylglycine Ncdec N-Cyclodecylglycine Ndcycline Dna Ncycline Glycine cyclopropylg Hcina Ncpro DN-Methylsparagine Dnmasn N-cycloundecylglycine Ncund DN-Methylpartpartate Dnmasp N- (2,2-diphenylethyl) glycine Nbhm DN-methylcysteine Dnmcys N- (3,3'-phenylpropI) glycyl Nbhe DN-methylglutamine 3 Naanidinopropyl (±) Narg DN-methylglutamate Dnmglu N- (1-hydroxyethyl) glycine Nthr DN-methylstylidine Dnmhis N- (hydroxyethyl) glycine Nser DN-methylisoleucine Dnmile N- (imidazolylethyl) glycine Nhis DN-methyl-leucine Dnmle - (3-indolylethyl]) Glycine Nhtrp Amino Acid Codi- Amino Acid Codex Unconventional ____________ go __________ unconventional____________go DN-methyl-lysine Dnmlys N-methyl-y-aminobutyrate Nmgabu N-Methylcyclohexylalanine Nmchexa DN-methylmethionine N-methylnityl-methylnathenine N-methylnathine N-methylnathine -methylaminoisobutimto Nmaib DN-methylproline Dnmpro N- (1-methylpropylglycine Nile DN-methylserine Dnmser N- (2-methylpropyl) glycine Nleu DN-methyltreonine Dnmthr DN-methyltryptophan Dnmtrp N- (1-methylethyl) glycine Nvalnylnyrrine Nval methylnaphtylalanine Nmanap DN-methylvaline Dnmval N-methylpenicillamine Nmpen γ-aminobutyric acid Gabu N- (p-hydroxyphenyl) glycine Nhtyr L-t-butylglycine Ncys L-ethylglycine Etg Penicillin La-penicillamine Mala La-Methylginginine Marg La-Methylparagine Masn La-Methylpartate Masp La-Methyl-Butylglycine Mtbug La-Methylcysteine Mcys L-Methylethylglycine Metg La-methylglutamine Mgln La-methylglutamate Mglu La-methylstylidine Mhis L · α-methyl] homopheni] alanine Mhphe La-methylisoleucine Mile N- (2-methylthioethyl) glycine Nmet La-methyl-leucine Mleu La-methyl-lysine Mlys La -methylmethionine Mmet La-methylnorleucine Mnle La-methylnorvaline Mnva La-methylornithine Mom La-methylphenylalanine Mphe La-methylproline Mpro La-methyltreonine Mser La-methyltriptophan Mtrp La-methylmethyl tyrosine Mtyr La-methylvaline Mnp La-methylvaline Mnp - (N- (2,2-diphenylethyl-N- (N- (3,3-diphenylpropyl-Nnbhm Nnbhe carbamylmethylglycine carbamylmethyl) glycine Códi- Unconventional Amino Acid ___________ go _________ unconventional___________go l-carboxy-1- (2,2-diphenyl) - Nmbe etüarninojciclopropane ____________________________________________________ Crosslinkers can be used, for example, to stabilize 3D conformations using homo-bifunctional crosslinkers such as imido esters. bifunctional groups containing spacer groups (CH2) n with n = lan = 6, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters and hetero-bifunctional reagents which usually contain a reactive amino radical such as N-hydroxysuccinimide and another group-specific reactive radical such as maleimido or dithio radical (SH) or carbodiimide (COOH). In addition, peptides may be restricted in their conformation, for example by the incorporation of CQ and Na-methylamino acids, introduction of double bonds between amino acid C0 and Cp and formation of cyclic peptides or analogs, by introduction of covalent bonds such as as by forming an amide bond between the terminal N and C, between two side chains or between a side chain and the terminal N or C.

Em ainda uma outra modalidade preferida alternativa, a presente invenção contempla uma partícula microesferoidal compreendendo uma partícula rotulada com um rótulo oticamente detectável, onde a partícula microesferoidal exibe um perfil WGM e em que o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado de forma detectável quando uma molécula de carboidrato ou análogo deste se liga ou, de outra forma, se associa com a superfície da partícula microesferoidal.In yet another preferred alternative embodiment, the present invention contemplates a microspheroidal particle comprising a particle labeled with an optically detectable label, wherein the microspheroidal particle exhibits a WGM profile and wherein the microspheroidal particle WGM profile is detectably modulated when a molecule carbohydrate or analog thereof binds or otherwise associates with the surface of the microspheroidal particle.

Em uma modalidade particularmente preferida, a molécula de carboidrato é uma molécula de glicosamino-glicano (GAG) ou molécula semelhante a GAG.In a particularly preferred embodiment, the carbohydrate molecule is a glycosamino glycan (GAG) molecule or GAG-like molecule.

Os GAGs são onipresentes e representam papéis fundamentais em muitos dos processos inflamatórios no corpo humano. Estes polissaca- rídeos de alto peso molecular contribuem para processos tais como me-tástase em câncer, artrite, rejeição de transplante e asma e, desta forma, uma maior compreensão destes processos pode levar a drogas aperfeiçoadas para tratamento eventual de tais condições. Atualmente, um dos GAGs mais conhecidos é a família das heparinas de polissacarídeos sulfatados e a atividade anti-coagulante destas moléculas é bem entendida.GAGs are ubiquitous and play key roles in many of the inflammatory processes in the human body. These high molecular weight polysaccharides contribute to processes such as cancer metastasis, arthritis, transplant rejection and asthma, and thus a greater understanding of these processes may lead to improved drugs for eventual treatment of such conditions. One of the best known GAGs today is the sulfated polysaccharide heparin family and the anti-coagulant activity of these molecules is well understood.

Os GAGs semelhantes a heparina (HLGAGs) são um grupo heterogêneo de moléculas (Conrad, “Heparin binding proteins”. Academic Press, San Diego, 1998; Lander e Selleck, J. Cell Biol 148^:227-232, 2000). Heparina e sulfato de heparano, como todos os HLGAGs, são polissacarídeos lineares longos (Sasisekharan e Venkataraman, Curr. Opin. Chem. Biol 4^:626-631, 2000; Casu, Ann. NYAcad. Sei 556:1-17, 1989; Casu, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 43:51-134, 1985). São sintetizados como cadeias não sulfatadas de unidades de dissacarídeo repetidas compreendendo ácido glicurônico (GlcA) e glicosamina (GlcN) que, no aparelho de golgi, são modificadas em vários locais ao longo de seu comprimento. A heparina é mais extensivamente modificada que o sulfato de heparano e a maioria das unidades GlcN são modificadas por um grupo sulfato para se tornarem GlcN JV-sulfatados e a maioria das unidades GlcA são convertidas a ácido idurônico (IdoA) pela ação de epímerase. HLGAGs são heterogêneos uma vez que as modificações nas cadeias de sulfato são freqüentemente incompletas. O resultado são regiões extensas de modificação intermediária.Heparin-like GAGs (HLGAGs) are a heterogeneous group of molecules (Conrad, Heparin binding proteins. Academic Press, San Diego, 1998; Lander and Selleck, J. Cell Biol 148: 227-232, 2000). Heparin and heparan sulfate, like all HLGAGs, are long linear polysaccharides (Sasisekharan and Venkataraman, Curr. Opin. Chem. Biol 4: 626-631, 2000; Casu, Ann. NYAcad. Sci 556: 1-17, 1989 (Casu, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 43: 51-134, 1985). They are synthesized as unsulfated chains of repeated disaccharide units comprising glucuronic acid (GlcA) and glycosamine (GlcN) which, in the golgi apparatus, are modified at various locations along their length. Heparin is more extensively modified than heparan sulfate and most GlcN units are modified by a sulfate group to become Jc-sulfated GlcN and most GlcA units are converted to iduronic acid (IdoA) by the action of epimerase. HLGAGs are heterogeneous since modifications to sulfate chains are often incomplete. The result is extensive regions of intermediate modification.

Desta forma, por exemplo, cadeias de sulfato de heparano consistem em domínios estruturalmente flexíveis altamente sulfatados ricos em IdoA 2-O-sulfatados alternando com regiões de baixa sulfatação consistindo predominantemente em JV-acetil GlcN e GlcA, que apresentam uma estrutura rígida. Os padrões de sulfatação de HLGAGs são complexos especialmente no que diz respeito ao posicionamento dos 6-O-sulfatos. Conseqüentemente, nem todas as moléculas de HLGAG são idênticas. É o padrão de sulfatação que determina grandemente as características de ligação da proteína de um HLGAG particular.Thus, for example, heparan sulfate chains consist of highly sulfated IdoA-rich 2-O-sulfated structurally flexible domains alternating with low sulfation regions consisting predominantly of JV-acetyl GlcN and GlcA which have a rigid structure. The sulfation patterns of HLGAGs are complex especially with regard to the positioning of 6-O-sulfates. Consequently, not all HLGAG molecules are identical. It is the sulfation pattern that greatly determines the protein binding characteristics of a particular HLGAG.

Algumas proteínas se ligam apenas a motivos estruturais particulares de uma cadeia HLGAG e inversamente alguns GAGs se ligam ape-5 nas a sítios ou regiões particulares numa proteína. A anti-trombina III, por exemplo, se liga a uma seqüência de pentassacarídeo única contendo uma disposição particular de grupos sulfato e a pentassacarí-deo-heparína se liga a um sítio específico na proteína anti-trombina III (Whisstock e colaboradores J. Mol. Biol 301:1287-1305, 2000). O fator ) de crescimento derivado de fíbroblasto básico (FGF-2) e o fator de crescimento de hepatócito (HGF) se ligam ambos à heparina, no entanto as estruturas de heparina que são essenciais para a ligação são bem diferentes para cada um e são diferentes das requeridas pela anti-trombina III (Maccarana e colaboradores J. Biol Chem, 268(32,):23898-23905, ; 1993; Lyon e colaboradores J. Biol Chem. 269:11216-11223, 1994), Além disto, mostrou-se que a heparina se liga a uma região particular no FGF-2 (Faham e colaboradores Science 271:1116-1120, 1996). O FGF-2 reconhece um motivo contendo um único IdoA 2-0-sulfato numa posição definida, enquanto que para o HGF, o posicionamento dos grupos GlcN 6-O-sulfato são críticos. Algumas moléculas de heparina numa preparação conterão os tanto o pentassacarídeo de ligação da anti-trombina III quanto o motivo ligante do FGF-2, enquanto que outras conterão o motivo ligante do HGF e o motivo do FGF-2 e não o pentassacarídeo de ligação da anti-trombina III. De fato, em média apenas um terço das moléculas numa preparação de heparina contém o pentassacarídeo de ligação de nati-trombina III (Conrad, 1998, supra).Some proteins bind only to particular structural motifs of an HLGAG chain and conversely some GAGs only bind to particular sites or regions in a protein. Anti-thrombin III, for example, binds to a single pentasaccharide sequence containing a particular arrangement of sulfate groups and pentasaccharide de-heparin binds to a specific site on anti-thrombin III protein (Whisstock et al. J. Mol. Biol 301: 1287-1305, 2000). Basic fibroblast-derived growth factor (FGF-2) and hepatocyte growth factor (HGF) both bind to heparin, however the heparin structures that are essential for binding are quite different for each other and are different from those required by antithrombin III (Maccarana et al. J. Biol Chem. 268 (32): 23898-23905; 1993; Lyon et al. J. Biol Chem. 269: 11216-11223, 1994). Heparin has been shown to bind to a particular region in FGF-2 (Faham et al. Science 271: 1116-1120, 1996). FGF-2 recognizes a motif containing a single IdoA 2-0 sulfate at a defined position, whereas for HGF, the positioning of the GlcN 6-O sulfate groups is critical. Some heparin molecules in a preparation will contain both the antithrombin III binding pentasaccharide and the FGF-2 binding motif, while others will contain the HGF binding motif and the FGF-2 motif and not the anti-thrombin III. In fact, on average only one third of the molecules in a heparin preparation contain the natri-thrombin III-binding pentasaccharide (Conrad, 1998, supra).

As moléculas semelhantes a GAG podem ser também derivadas de fontes não mamíferas. Por exemplo, o polissacarídeo capsular de E. coli K5 é composto de uma unidade a-N-acetil-glicosamina (α-GlcNAc) e uma unidade de ácido β-glicurônico (β-GlcA) e não contém sulfato ou outro grupo carregado. O esqueleto de heparina consiste no seguinte motivo a- GlcNAc, β-GlcA, α-GlcNAc, ácido β-idurônico (β-IdoA) com graus variantes de sulfatação. A única diferença entre GlcA e IdoA é a configuração do grupo ácido carboxílico em C-5, desta forma o esqueleto de heparina e o esqueleto da B. coli K5 são extremamente semelhantes em estrutura. 5 Ainda noutro aspecto, a presente invenção provê um método para a detecção de uma molécula capaz de entrar numa interação ligante entre uma molécula imobilizada a, ou de outra forma associada com, uma partícula microesferoidal compreendendo um rótulo oticamente detectável, conforme descrito anteriormente, e um suposto parceiro ligan-) te de produto de análise da dita molécula numa amostra, o dito método compreendendo: (i) determinação de um perfil WGM inicial da partícula microesferoidal compreendendo a molécula imobilizada sobre, ou de outra forma associada com, a mesma; e i (ii) contato da partícula microesferoidal compreendendo a dita molécula imobilizada sobre, ou de outra forma associada com, a mesma, com uma amostra compreendendo um suposto parceiro ligante de produto de análise da dita molécula; em que uma alteração detectável do perfil WGM da partícula microesferoidal, em relação ao perfil WGM inicial, é indicativa de ligação ou interação entre a molécula e o parceiro ligante de produto de análise da molécula.GAG-like molecules may also be derived from non-mammalian sources. For example, the E. coli K5 capsular polysaccharide is composed of an α-N-acetyl glycosamine unit (α-GlcNAc) and a β-glucuronic acid (β-GlcA) unit and does not contain sulfate or other charged group. The heparin backbone consists of the following motif α-GlcNAc, β-GlcA, α-GlcNAc, β-iduronic acid (β-IdoA) with varying degrees of sulfation. The only difference between GlcA and IdoA is the configuration of the C-5 carboxylic acid group, so the heparin backbone and the B. coli K5 backbone are extremely similar in structure. In yet another aspect, the present invention provides a method for detecting a molecule capable of engaging in a binder interaction between a molecule immobilized on or otherwise associated with a microspheroidal particle comprising an optically detectable label as described above, and an alleged analyte binding partner of said molecule in a sample, said method comprising: (i) determining an initial WGM profile of the microspheroidal particle comprising the molecule immobilized on or otherwise associated with it; and (ii) contacting the microspheroidal particle comprising said molecule immobilized on or otherwise associated with it, with a sample comprising an alleged analyte binder partner of said molecule; wherein a detectable change in the microspheroidal particle WGM profile from the initial WGM profile is indicative of binding or interaction between the molecule and the binding partner of the analyte of the molecule.

Conforme utilizada aqui, a expressão "uma alteração detectável do perfil WGM” pode compreender qualquer diferença que possa ser observada entre quaisquer dois perfis WGM.As used herein, the term "a detectable change in the WGM profile" may comprise any difference that may be observed between any two WGM profiles.

Numa modalidade preferida, a alteração detectável pode compreende uma mudança para vermelho ou uma mudança para azul de um ou mais picos num perfil WGM em relação a um outro perfil WGM.In a preferred embodiment, the detectable change may comprise a change to red or a change of blue of one or more peaks in a WGM profile relative to another WGM profile.

Conforme utilizado aqui, o termo “mudança para vermelho” refere-se à mudança do ponto de amplitude máxima de um ou mais picos num perfil WGM para um comprimento de onda mais longo. Apesar do nome “vermelho”, uma “mudança para vermelho” pode ocorrer em qualquer parte de um espectro eletromagnético e não se limita à luz visível. Conforme utilizado aqui, o termo “mudança para vermelho” inclui qualquer mudança de um pico para um comprimento de onda mais longo. Inver-í samente, o termo “mudança para azul” refere-se a qualquer movimento de um pico para um comprimento de onda mais curto.As used herein, the term "change to red" refers to changing the maximum amplitude point of one or more peaks in a WGM profile to a longer wavelength. Despite the name "red", a "change to red" can occur anywhere in an electromagnetic spectrum and is not limited to visible light. As used herein, the term "change to red" includes any change from a peak to a longer wavelength. Conversely, the term "change to blue" refers to any movement from a peak to a shorter wavelength.

Em uma modalidade particularmente preferida, a mudança para vermelho ou a mudança para azul de um pico num perfil WGM tipicamente compreende uma alteração do comprimento de onda da amplitude máxima do pico de aproximadamente 1 a 100 nm. A referência a 1 a 100 nm inclui comprimentos de onda de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100 nm. numa realização particular, a mudança para vermelho ou a mudança para azul de um pico num perfil WGM compreende uma alteração no comprimento de onda da amplitude máxima do pico de aproximadamente 1 a 20 nm, o que inclui comprimentos de onda de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 nm. Embora específicamente exemplificada no que diz respeito às mudanças de comprimento de onda em picos de luz visível, a invenção contempla também mudanças para vermelho e mudanças para azul equivalentes e/ou proporcionais em outras regiões do espectro eletromagnético.In a particularly preferred embodiment, changing to red or turning blue of a peak in a WGM profile typically comprises a change in peak peak wavelength from approximately 1 to 100 nm. The reference to 1 at 100 nm includes wavelengths of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100 nm. in a particular embodiment, changing to red or turning blue of a peak in a WGM profile comprises a change in maximum peak amplitude wavelength from approximately 1 to 20 nm, which includes wavelengths of 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 and 20 nm. While specifically exemplified with respect to wavelength changes in visible light peaks, the invention also contemplates equivalent and / or proportional red changes and blue shifts in other regions of the electromagnetic spectrum.

Numa modalidade adicional da presente invenção, a alteração num ou mais perfis WGM de uma partícula microesferoidal, provocada por uma interação de uma molécula imobilizada sobre a partícula microesferoidal com um produto de análise, compreende o aparecimento de um ou mais picos num ou mais perfis WGM ou o desaparecimento de um ou mais picos num ou mais perfis WGM. m perfil WGM de uma partícula microesferoidal conforme descri->ode ser confirmado utilizando-se qualquer método conve-niente evidente a um especialista na técnica. Essencialmente, qual-odo de detecção que possa detectar um ou mais comprimentos de radiação eletromagnética pode ser utilizado para detectar um rM. Preferivelmente, o meio de detecção é suficientemente sensí-il forma que possa diferenciar picos no perfil WGM, com maior :ia,, o meio de detecção pode diferenciar entre dois picos que jarados em pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 5, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 4, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 3, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 2, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e/ou 100 nm. Meios particular-mvenientes que podem ser utilizados para determinar o perfil uma partícula microesferoidal incluem um citõmetro de fluxo, array e um microscópio confocal. mforme utilizado aqui, o termo “microscópio confocal” inclui em )o microscópios confocais de varredura a laser (LSCM) e micros-nfocais multifóton. presente invenção provê também uma partícula microesferoidal ia a um suporte sólido. i mesma forma, noutro aspecto, a presente invenção provê uma microesferoidal compreendendo uma partícula rotulada com :amente detectável, em que a partícula microesferoidal exibe um M e onde o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado detectável com a referida partícula microesferoidal que está ia num suporte sólido e/ou com um produto de análise que :om um parceiro ligante capturado na partícula imobilizada, mforme aqui utilizado, o termo “suporte sólido” refere-se a matriz sólida sobra a qual uma partícula microesferoidal pode ser imobilizada. Em realizações preferidas da invenção, o suporte sólido compreende um suporte sólido que permita ao perfil WGM da partícula microesferoidal imobilizada sobre o mesmo ser detectado. Da mesma forma, suportes sólidos preferidos são aqueles que podem ser utilizados para imobilizar uma partícula microesferoidal para análise utilizando-se um microscópio confocal. Numa modalidade particularmente preferida, o suporte sólido é uma lâmina de microscópio.In a further embodiment of the present invention, the change in one or more WGM profiles of a microspheroidal particle caused by an interaction of an immobilized molecule on the microspheroidal particle with an analyte comprises the appearance of one or more peaks in one or more WGM profiles. or the disappearance of one or more peaks in one or more WGM profiles. A WGM profile of a microspheroidal particle as described may be confirmed using any method conveniently apparent to one skilled in the art. Essentially, any detection method that can detect one or more lengths of electromagnetic radiation can be used to detect an rM. Preferably, the sensing means is sufficiently sensitive that it can differentiate peaks in the WGM profile, with greater frequency, the sensing means can differentiate between two peaks that are spiked in at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 5, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 4, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 3, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 2, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and / or 100 nm. Particularly useful means that can be used to profile a microspheroidal particle include a flow cytometer, array and a confocal microscope. As used herein, the term "confocal microscope" includes in) laser scanning confocal microscopes (LSCM) and multifoton microsfocal microscopes. The present invention also provides a microspheroidal particle to a solid support. Similarly, in another aspect, the present invention provides a microspheroidal comprising a detectably labeled particle, wherein the microspheroidal particle exhibits an M and where the WGM profile of the microspheroidal particle is detectable with said microspheroidal particle which is in a solid support and / or with an analyte which: as a binder partner captured on the immobilized particle, as used herein, the term "solid support" refers to the solid matrix left over to which a microspheroidal particle may be immobilized. In preferred embodiments of the invention, the solid support comprises a solid support which allows the WGM profile of the immobilized microspheroid particle to be detected therein. Similarly, preferred solid supports are those that can be used to immobilize a microspheroidal particle for analysis using a confocal microscope. In a particularly preferred embodiment, the solid support is a microscope slide.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção contempla uma lâmina de microscópio compreendendo um ou mais chanfros, onde cada chanfro é adaptado para imobilizar uma partícula microesferoidal como descrita aqui. Preferivelmente, uma partícula microesferoidal é imobilizada sobre a dita lâmina, pelo depósito ou incorporação da dita partícula num chanfro da dita lâmina.In yet another aspect, the present invention contemplates a microscope slide comprising one or more chamfers, wherein each chamfer is adapted to immobilize a microspheroidal particle as described herein. Preferably, a microspheroidal particle is immobilized on said blade by depositing or incorporating said particle into a chamfer of said blade.

Noutro aspecto, a presente invenção provê um método para a detecção de um produto de análise supostamente contido numa amostra, compreendendo o referido método: (i) a determinação de um perfil WGM inicial de uma partícula microesferoidal compreendendo uma partícula rotulada com rótulo oti-camente detectável e uma molécula imobilizada ou, de outra forma, associada com a mesma, onde a partícula microesferoidal exibe o perfil WGM e onde o perfil WGM da partícula microesferoidal é modulado de forma detectável, quando a dita partícula microesferoidal se liga ou, de outra forma, interage com o produto de análise supostamente contido na referida amostra; (ii) aplicação da citada amostra à dita partícula microesferoidal por um tempo e sob condições que permitam a interação do produto de análise com a molécula imobilizada ou, de outra forma, associada com, a partícula microesferoidal; (iii) determinação subseqüente do perfil WGM da partícula microesferoidal; em que a alteração detectável num perfil WGM em relação a um perfil WGM inicia] é indicativa da presença do referido produto de análise e uma ausência de uma alteração detectável num perfil WGM em relação a um perfil WGM inicial é indicativa da ausência do citado produto de análise na referida amostra.In another aspect, the present invention provides a method for detecting an analyte supposedly contained in a sample, said method comprising: (i) determining an initial WGM profile of a microspheroidal particle comprising an optically labeled particle. detectable and an immobilized or otherwise associated molecule where the microspheroidal particle exhibits the WGM profile and where the WGM profile of the microspheroidal particle is detectably modulated when said microspheroidal particle binds or otherwise interacts with the analytical product supposedly contained in said sample; (ii) applying said sample to said microspheroidal particle for a time and under conditions which permit the interaction of the analyte with the immobilized molecule or otherwise associated with the microspheroidal particle; (iii) subsequent determination of the microspheroidal particle WGM profile; wherein the detectable change in a WGM profile from a WGM profile begins] is indicative of the presence of said analyte and an absence of a detectable change in a WGM profile from an initial WGM profile is indicative of the absence of said analyte product. analysis in that sample.

Numa modalidade, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da dita partícula microesferoidal e/ou o referido produto de análise compreendem uma molécula de ácido nucléico. Ainda com maior preferência,, a molécula de ácido nucléico é DNA ou RNA.In one embodiment, the molecule bound or otherwise associated with the surface of said microspheroidal particle and / or said analyte comprises a nucleic acid molecule. Even more preferably, the nucleic acid molecule is DNA or RNA.

Em uma outra modalidade preferida deste aspecto da presente invenção, as moléculas ligadas ou, de outra forma, associadas com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o referido produto de análise compreendem um peptídeo, polipeptídeo ou proteína ou análogo destes conforme aqui definidos.In another preferred embodiment of this aspect of the present invention, the molecules attached or otherwise associated with the microspheroidal particle surface and / or said analyte comprise a peptide, polypeptide or protein or analog thereof as defined herein.

Ainda noutra realização preferida deste aspecto da presente invenção, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o citado produto de análise compreendem uma molécula de carboidrato. Em ainda uma realização de maior preferência, a molécula de carboidrato é uma molécula de GAG.In yet another preferred embodiment of this aspect of the present invention, the molecule bound or otherwise associated with the microspheroidal particle surface and / or said analyte comprises a carbohydrate molecule. In still a more preferred embodiment, the carbohydrate molecule is a GAG molecule.

Ainda noutra realização preferida deste aspecto da invenção, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o dito produto de análise compreendem uma molécula que se liga ou, de outra forma, interage com um ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, proteína e/ou molécula de carboidrato.In yet another preferred embodiment of this aspect of the invention, the molecule bound or otherwise associated with the surface of the microspheroidal particle and / or said analyte comprises a molecule that binds or otherwise interacts with a nucleic acid. , peptide, polypeptide, protein and / or carbohydrate molecule.

Ainda noutro aspecto da invenção, é provido um método para a identificação de parceiros ligantes de uma molécula de interesse, compreendendo o referido método: (i) a determinação de um perfil WGM inicial de uma partícula microesferoidal compreendendo uma partícula rotulada com rótulo oti-camente detectável e uma molécula imobilizada nesta, ou de outra forma associada com esta; (ii) a aplicação de uma ou mais amostras compreendendo parceiros ligantes potenciais da citada molécula de interesse à partícula mi-croesferoidal por um tempo de sob condições que permitam a interação da molécula de interesse com o(s) parceiro(s) ligante(s) potenciais); > (iií) determinação subsequente do perfil WGM da partícula microesfe-roidal; em que a modulação do dito perfil WGM em relação a um perfil WGM inicial é indicativa da presença de um ou mais parceiros ligantes na referida amostra e uma ausência de uma alteração detectável no perfil WGM em relação ao perfil WGM inicial é indicativa da ausência de um ou mais parceiros ligantes na citada amostra.In yet another aspect of the invention, there is provided a method for identifying binding partners of a molecule of interest, said method comprising: (i) determining an initial WGM profile of a microspheroidal particle comprising an optically labeled particle labeled detectable and a molecule immobilized on or otherwise associated with it; (ii) applying one or more samples comprising potential binding partners of said molecule of interest to the microspheresoidal particle for a time under conditions that permit the interaction of the molecule of interest with the binding partner (s). ) potentials); (iii) subsequent determination of the WGM profile of the microsporeidal particle; wherein the modulation of said WGM profile with respect to an initial WGM profile is indicative of the presence of one or more linker partners in said sample and an absence of a detectable change in the WGM profile relative to the initial WGM profile is indicative of the absence of one. or more binding partners in said sample.

Em uma modalidade preferida, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o dito produto de análise compreendem uma ácido nucléico. Ainda com maior preferência,, a molécula de ácido nucléico é DNA ou RNA.In a preferred embodiment, the molecule bound or otherwise associated with the surface of the microspheroidal particle and / or said analyte comprises a nucleic acid. Even more preferably, the nucleic acid molecule is DNA or RNA.

Noutra modalidade preferida deste aspecto da invenção, as moléculas ligadas a, ou de outra forma associadas com, a superfície da partícula microesferoidal e/ou o referido produto de análise compreendem um peptídeo, polipeptídeo ou proteína ou análogos destes, conforme aqui definidos.In another preferred embodiment of this aspect of the invention, molecules attached to or otherwise associated with the microspheroidal particle surface and / or said analyte comprise a peptide, polypeptide or protein or analogs thereof as defined herein.

Ainda noutra realização preferida deste aspecto da invenção, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o cítadoto de análise compreendem uma molécula de carboidrato. numa realização ainda de maior preferência, a molécula de carboidrato é uma molécula de GAG.In yet another preferred embodiment of this aspect of the invention, the molecule bound or otherwise associated with the microspheroidal particle surface and / or the analysis cytad comprises a carbohydrate molecule. In an even more preferred embodiment, the carbohydrate molecule is a GAG molecule.

Ainda noutra realização preferida deste aspecto da invenção, a molécula ligada ou, de outra forma, associada com a superfície da partícula microesferoidal e/ou o citado produto de análise compreendem uma molécula que se liga ou, de outra forma, interage com um ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, proteína e/ou molécula de carboidrato.In yet another preferred embodiment of this aspect of the invention, the molecule bound or otherwise associated with the surface of the microspheroidal particle and / or said analyte comprises a molecule that binds or otherwise interacts with a nucleic acid. , peptide, polypeptide, protein and / or carbohydrate molecule.

As partículas microesferoidais da presente invenção podem ser utilizadas para as seguintes aplicações: monitoramento ambiental, tal como qualidade da água (Legionella, Giardia, Ciyptosporidium, na fonte) e diagnósticos de ponto de atenção, patógenos e toxinas aéreos, varredura de interações proteína:proteína, varredura de interações proteí-i na:carboidrato e varredura de drogas, e varredura de bibliotecas de moléculas pequenas. A presente invenção possibilita a multiplexação devido à capacidade de conter dois ou mais conjuntos de partículas microesferoidais. As partículas em qualquer um dos conjuntos contêm um rótulo oticamente detectável em comum e/ou um tamanho em comum e/ou uma partícula ligante imobilizada era comum. Assim, múltiplos produtos de análise podem ser detectados pela utilização de uma multiplicidade de conjuntos de partículas microesferoidais. A presente invenção provê adicionalmente produtos de análise detectados pelo método da presente invenção.The microspheroidal particles of the present invention can be used for the following applications: environmental monitoring such as water quality (Legionella, Giardia, Ciyptosporidium, at source) and point-of-care diagnostics, airborne pathogens and toxins, protein: protein interaction scanning , protein interaction interactions: carbohydrate and drug scanning, and small molecule library scanning. The present invention enables multiplexing due to the ability to contain two or more sets of microspheroidal particles. The particles in either set contain a common optically detectable label and / or a common size and / or a common immobilized binder particle. Thus, multiple analytes can be detected by using a plurality of microspheroidal particle assemblies. The present invention further provides analytical products detected by the method of the present invention.

Adicionalmente a presente invenção provê também kits que compreendem partículas microesferoidais rotuladas ou pré-rotuladas. As partículas podem ser utilizadas na geração de um ensaio para a detecção de alterações num meio em torno da partícula. A presente invenção é adicionalmente descrita por meio dos exemplos não limitantes a seguir: Exemplo 1 Produção e Rotulagem de Partículas Microesferoidais Rotuladas com Ponto Quântico Tipicamente, partículas microesferoidais podem ser preparadas pela deposição de pontos quânticos sobre pérolas comerciais de qualquer composição ou tamanho desejados. Para materiais mais robustos, devem ser revestidos com outra camada de sílica para minimizar interações com o meio ou adsorbatos.Additionally the present invention also provides kits comprising labeled or pre-labeled microspheroidal particles. The particles may be used in generating an assay for detecting changes in a medium around the particle. The present invention is further described by way of the following non-limiting examples: Example 1 Production and Labeling of Quantum Dot Labeled Microspheroidal Particles Typically, microspheroidal particles may be prepared by depositing quantum dots on commercial beads of any desired composition or size. For more robust materials, they should be coated with another layer of silica to minimize interactions with the medium or adsorbates.

Sem se limitar as várias possibilidades, é aqui descrito um processo típico utilizado para preparar partículas microesferoidais utilizan- zando-se pérolas de vidro /sílica. 0,1 g de pérolas de sílica comerciais com diâmetro de cinco micra foram colocados em 20 ml de 2-propanol e foram adicionados 20 microli-tros ou de mercaptopropilsilano (MPS) ou de amínopropilsilano (APS). A 5 solução foi posta em refluxo a 80°C para permitir a quimíossorção do MPS ou APS, o que levou à criação de grupos mercaptano ou amino na superfície da pérola. O excesso de MPS ou APS foi removido por centrifu-gação.Without limiting the various possibilities, a typical process used to prepare microspheroidal particles using glass / silica beads is described herein. 0.1 g of five micron diameter commercial silica beads were placed in 20 ml of 2-propanol and 20 microliters of either mercaptopropylsilane (MPS) or aminopropylsilane (APS) were added. The solution was refluxed at 80 ° C to allow chemosorption of MPS or APS, which led to the creation of mercaptan or amino groups on the bead surface. Excess MPS or APS was removed by centrifugation.

Em vez de uma pérola funcionalizada de silano, as pérolas podem i ser também ativadas pela adsorção de um polímero catiônico. Por exemplo, sem restrição e para ilustrar o método, 0,1 g de pérolas de sílica foram misturados com 20 ml de uma solução aquosa de PEI (po-li(etilenoimina)) (1 g/1, 0,5 M NaCl). Após reação por uma hora, a solução foi centrifugada para remoção do excesso de polímero, e re-suspendida em água pura. Este procedimento foi repetido 3 vezes.Instead of a functionalized silane bead, the beads may also be activated by adsorption of a cationic polymer. For example, without restriction and to illustrate the method, 0.1 g of silica beads were mixed with 20 ml of an aqueous PEI (po-li (ethyleneimine)) solution (1 g / 1, 0.5 M NaCl). . After reaction for one hour, the solution was centrifuged to remove excess polymer, and resuspended in pure water. This procedure was repeated 3 times.

Os QDs foram adsorvidos sobre as pérolas revestidas com APS ou PEI pela adição de uma suspensão de QDs em clorofórmio a uma suspensão das pérolas em 2-propanol seco. A quantidade adicionada foi suficiente para revestir as pérolas com cerca de 10 mono-camadas. As pérolas e QDs foram equilibrados por 10 minutos num tambor rotativo. Então, as pérolas revestidas foram separadas por centrifugação.QDs were adsorbed onto APS or PEI coated beads by adding a suspension of QDs in chloroform to a suspension of beads in dry 2-propanol. The amount added was sufficient to coat the beads with about 10 single layers. The beads and QDs were equilibrated for 10 minutes on a rotating drum. Then the coated beads were separated by centrifugation.

As pérolas rotuladas com QD podem ser adicionalmente estabilizadas por revestimento com mais sílica. Isto foi feito de duas formas: Primeíramente, 5 μΐ de APS em água alcalina ou clorofórmio (1 ml) foram adicionados às partículas microesferoidais de QD revestidas com sílica e deixadas reagir por 1 hora sob agitação utilizando-se um tambor rotativo a 0,2 Hz. Após a remoção do excesso de APS por ciclos de centrifugação/re-suspensão repetidos em água alcalina ou clorofórmio, foram adicionados 5 ml de “sílica ativa” (5 μΐ de silicato de sódio a 2% em peso em 5 ml de água em pH 8,7) às partículas e deixou-se reagir por uma noite. Isto resultou em cerca de 3-5 nm de sílica depositados sobre as partículas. 0 excesso de sílica nucleada livre foi separado por meio de centrifugação e as partículas re-dispersas em 2-propanol:água (4:1). Finalmente, a camada de sílica foi aumentada utilizando-se TEOS e amônia como requerido para se obter a espessura desejada. O segundo procedimento envolveu o crescimento direto de sílica em etanol sem uma etapa preliminar de deposição em água. isto consiste na adsorção de PVP e então o crescimento da sílica. Foi adicionado suficiente PVP (PM 30.000) para prover 60 moléculas de PVP por nm2 de superfície, por sua dissolução em clorofórmio:2-propanol (9:1). Este foi imedíatamente adicionado às microesferas, a mistura foi sonicada e deixada reagir durante a noite sob agitação.QD-labeled beads can be further stabilized by coating with more silica. This was done in two ways: First, 5 μΐ of APS in alkaline water or chloroform (1 ml) was added to the silica-coated QD microspheroidal particles and allowed to react for 1 hour with stirring using a 0.2 rotating drum. Hz. After removal of excess APS by repeated centrifugation / resuspension cycles in alkaline water or chloroform, 5 ml of "active silica" (5 μΐ 2 wt% sodium silicate in 5 ml water) was added. at pH 8.7) to the particles and allowed to react overnight. This resulted in about 3-5 nm of silica deposited on the particles. Excess free nucleated silica was separated by centrifugation and the particles redispersed in 2-propanol: water (4: 1). Finally, the silica layer was increased using TEOS and ammonia as required to obtain the desired thickness. The second procedure involved the direct growth of silica in ethanol without a preliminary deposition step in water. This consists of PVP adsorption and then silica growth. Sufficient PVP (MW 30,000) was added to provide 60 PVP molecules per nm2 surface by dissolving it in chloroform: 2-propanol (9: 1). This was immediately added to the microspheres, the mixture was sonicated and allowed to react overnight with stirring.

As microesferas foram centrifugadas (5 segundos a 3800 rpm para sílica de 5 micra) e re-dispersas em 2-propanol (primeira vez). Foi adicionado NH3 (4,2%) seguido de TEOS (10% em volume em 2-propanol) sob agitação e deixada depositar durante 12 horas.The microspheres were centrifuged (5 seconds at 3800 rpm for 5 micron silica) and re-dispersed in 2-propanol (first time). NH 3 (4.2%) was added followed by TEOS (10% by volume in 2-propanol) under stirring and allowed to settle for 12 hours.

Um esquema mostrando 0 procedimento para a produção de partículas microesferoidais rotuladas com QD é mostrado na Figura 1. Este protocolo genérico permite a preparação de microesferas de sílica fotoestáveis de qualquer tamanho prático de 1 micra até 100 micra, rotuladas com uma ou mais nanopartículas diferentes rotuladas com diferentes propriedades de emissão.A scheme showing the procedure for producing QD-labeled microspheroidal particles is shown in Figure 1. This generic protocol allows the preparation of photostable silica microspheres of any practical size from 1 micron to 100 microns, labeled with one or more different labeled nanoparticles. with different emission properties.

Exemplos de partículas microesferoidais rotuladas com QD como vistas através de um microscópio confocal são mostrados na Figura 2.Examples of QD-labeled microspheroidal particles as viewed through a confocal microscope are shown in Figure 2.

Exemplo 2 Detecção de DNA Pérolas Q-Sand foram conjugadas a DNA, formando um complexo com uma pérola Q-Sand e DNA 48-mero imobilizado. A posição da quinta base do 48-mero foi uma base timidina com uma amina incorporada. Esta amina foi utilizada para rotular 0 DNA com um éster BODIPY*630/650 NHS utilizando-se uma reação de condensação padrão. O perfil WGM para a pérola Q-Sand conjugada ao DNA de 48-mero é mostrado na Figura 5, painel a. O painel b da Figura 5 mostra o perfil WGM da pérola Q-sand do painel a conjugada a um DNA α-Transprobe que hibridiza com as bases 6-24 do DNA conjugado à pérola Q-Sand. O perfil WGM resultante, como visto no painel b da Figura 5, apresentou uma troca de aproximadamente 2,4 nm para todos os picos, Adicionalmente, a redução do fator Q (a medida da qualidade do micro-ressonador) foi de aproximadamente 5x.Example 2 DNA Detection Q-Sand beads were conjugated to DNA, forming a complex with a Q-Sand bead and immobilized 48-mer DNA. The fifth base position of the 48-mer was a thymidine base with an incorporated amine. This amine was used to label DNA with a BODIPY * 630/650 NHS ester using a standard condensation reaction. The WGM profile for the 48-mer DNA conjugated Q-Sand bead is shown in Figure 5, panel a. Panel b of Figure 5 shows the WGM profile of panel Q-sand bead conjugated to an α-Transprobe DNA that hybridizes to bases 6-24 of Q-Sand bead conjugated DNA. The resulting WGM profile, as seen in panel b of Figure 5, showed an exchange of approximately 2.4 nm for all peaks. In addition, the reduction of Q factor (the measure of micro resonator quality) was approximately 5x.

Finalmente, as pérolas Q-sand mostradas na Figura 5, painel a, foram hibridizadas a um produto de PCR contendo uma região complementar às bases 25-48 do DNA 48-mero. O produto de PCR foi gerado a partir de DNA de célula HeLa e preparado para hibridização por digestão como Exol e Lambda Exo. O perfil WGM resultante foi alterado em 2,4 nm para todos os picos. A queda do fator Q foi de aproximadamente lOx do controle apenas com Q-Sand.Finally, the Q-sand beads shown in Figure 5, panel a, were hybridized to a PCR product containing a complementary region to bases 25-48 of 48-mer DNA. The PCR product was generated from HeLa cell DNA and prepared for digestion hybridization as Exol and Lambda Exo. The resulting WGM profile was changed at 2.4 nm for all peaks. The Q factor fall was approximately 10x from the Q-Sand control only.

Exemplo 3 Funcionalização da Superfície das Partículas Microesferoidais de Sílica A funcionalização das partículas microesferoidais de sílica pode ser realizada da mesma maneira utilizada para as partículas microesferoidais de sílica iniciais por refluxo das partículas microesferoidais de QD-sílica em 2-propanol contendo MPS ou APS ou outro silano para ativar a superfície e adicionar grupos funcionais que reagem com o bio-adsorbato alvo.Example 3 Surface Functionalization of the Silica Microspheroidal Particles The functionalization of the silica microspheroidal particles can be performed in the same manner as for the initial silica microspheroidal particles by refluxing the QD-silica microspheroidal particles into MPS or APS or other containing silane to activate the surface and add functional groups that react with the target bio-adsorbate.

Preparação de Conjugados Partículas microesferoidais de 5 micra rotuladas com QDs laranja emitindo a 560 nm e super-revestidas com 10 nm de sílica foram tratadas com MPS, centrifugadas e lavadas. As microesferas foram deixadas reagir em água com o conjugado, tal como um ácido nucléico, polipeptí-deo, anticorpo, carboidrato ou semelhante, por cerca de 1 hora. Foram então centrifugadas e lavadas para produzir microesferas de QD bioativas (BQDM).Conjugate Preparation 5 micron microspheroidal particles labeled with orange QDs emitting at 560 nm and overcoated with 10 nm silica were treated with MPS, centrifuged and washed. The microspheres were allowed to react in water with the conjugate, such as a nucleic acid, polypeptide, antibody, carbohydrate or the like, for about 1 hour. They were then centrifuged and washed to produce bioactive QD microspheres (BQDM).

Ensaios de Ligação: Várias BQDM foram colocadas numa lâmina de microscópio sob um microscópio confocal. Uma gota de solução de referência foi colocada sobre as microesferas e os espectros coletados utilizando-se excitação a laser e 488 nm. Foi, então, adicionado um microlitro de uma solução contendo um agente que supostamente interage com o conjugado na BQDM, à gota e deixou-se reagir durante meia hora. O espectro é coletado e qualquer alteração no perfil WGM, tal como uma mudança para vermelho ou uma mudança para azul de um ou mais picos, é detectada, onde uma alteração observada é indicativa de interação entre o conjugado na partícula microesferoidal e o agente externo adicionado.Binding Assays: Several BQDMs were placed on a microscope slide under a confocal microscope. A drop of reference solution was placed on the collected microspheres and spectra using laser excitation and 488 nm. One microliter of a solution containing an agent supposedly interacting with the conjugate in BQDM was then added dropwise and allowed to react for half an hour. The spectrum is collected and any change in the WGM profile, such as a change to red or a change to blue of one or more peaks, is detected where an observed change is indicative of interaction between the microspheroidal particle conjugate and the added external agent. .

Exemplo 4 Diferenciação das Partículas Microesferoiáais Utilizando-se Perfil WGMExample 4 Differentiation of Microspheroial Particles Using WGM Profile

Diferenciação por tamanho Partículas microesferoidais de diferentes tamanhos foram produzidas utilizando-se os métodos descritos aqui. Os perfis WGM de cada um dos diferentes tamanhos de partícula foram determinados utilizando-se um microscópio confocal.Size Differentiation Microspheroidal particles of different sizes were produced using the methods described herein. WGM profiles of each of the different particle sizes were determined using a confocal microscope.

Como mostrado na Figura 3, o perfil WGM exibido por cada uma das partículas de diferentes tamanhos se altera com o raio da partícula microesferoidal.As shown in Figure 3, the WGM profile displayed by each of the different size particles changes with the microspheroidal particle radius.

Diferenciação pela superfície composto composto Partículas microesferoidais rotuladas com QD compreendendo diferentes moléculas ligadas às suas superfícies foram produzidas utilizando-se os métodos descritos aqui. Os perfis WGM de cada uma das diferentes partículas microesferoidais foram determinados utilizando-se um microscópio confocal.Compound Surface Differentiation QD-labeled microspheroidal particles comprising different molecules attached to their surfaces were produced using the methods described herein. The WGM profiles of each of the different microspheroidal particles were determined using a confocal microscope.

Como mostrado na Figura 4, QD refere-se a uma partícula microesferoidal rotulada com QD sem composto ligado à superfície, PSS refere-se a uma partícula microesferoidal compreendendo sulfonato de poliesti- reno (PSS) ligado, enquanto PVP refere-se a partícula microesfe-roidal com uma mono-camada de polivinil pirrolidona (PVP) adsorvido.As shown in Figure 4, QD refers to a QD-labeled microspheroidal particle without surface bound compound, PSS refers to a microspheroidal particle comprising bound polystyrene sulfonate (PSS), while PVP refers to microspheroid particle -roidal with an adsorbed polyvinyl pyrrolidone (PVP) monolayer.

Como fica evidente a partir destes dados, as partículas microesfe-roidais rotuladas com QD são sensíveis à ligação de um composto a suas superfícies. Além disto, a mudança no perfil WGM se mostra também sensível â natureza do composto ligando à superfície.As is apparent from this data, QD-labeled microspheroidal particles are sensitive to the binding of a compound to their surfaces. In addition, the change in WGM profile is also sensitive to the nature of the surface binding compound.

Exemplo 5 Detecção de um Suposto Parceiro Ligante Numa Amostra Microesferas de sílica com superfície funcional de grupos sulfidrila são conjugadas, por meio de uma molécula de 5’-Acrydite, a oligonucleo-tídeos de fita única, que foram previamente rotulados com corante fluorescente.Example 5 Detection of a Supposed Binding Partner In a Sample Functional surface silica microspheres of sulfhydryl groups are conjugated by means of a 5'-Acrydite molecule to single-stranded oligonucleotides which have been previously labeled with fluorescent dye.

As microesferas com oligonucleotídeo rotulado fixado são então hibridizadas a oligonucleotídeos complementares não relacionados ou produtos de PCR.The fixed labeled oligonucleotide microspheres are then hybridized to unrelated complementary oligonucleotides or PCR products.

As microesferas hibridizadas e não hibridizadas são extensivamente lavadas em água Milli Q e colocadas numa cobertura de microscópio e deixadas secar ao ar.Hybridized and unhybridized microspheres are extensively washed in Milli Q water and placed on a microscope cover and allowed to air dry.

As microesferas secas são, então, examinadas num microscópio confocal com laser e filtros de comprimento de onda, apropriado para os corantes fluorescentes sendo utilizados. Os modos de galeria de sussurros são registrados e comparados para se determinar a troca do comprimento de onda no padrão de modo de galeria de sussurros entre as microesferas com DNA adicional hibridizado sobre a superfície da microes-fera e as microesferas com apenas oligonucleotídeo rotulado fixado. A troca resultante no padrão de comprimento de onda dos modos de galeria de sussurros pode ser potencialmente utilizada para se determinar a presença ou ausência de seqüências de DNA complementar nas amostras de teste.The dried microspheres are then examined under a confocal laser microscope and wavelength filters, appropriate for the fluorescent dyes being used. Whisper gallery modes are recorded and compared to determine wavelength exchange in the whisper gallery mode pattern between microspheres with additional DNA hybridized on the surface of the microsphere and microspheres with only fixed labeled oligonucleotide. The resulting shift in the whisper gallery mode wavelength pattern can potentially be used to determine the presence or absence of complementary DNA sequences in the test samples.

Exemplo 6 Varredura dos Compostos de Teste São produzidas partículas microesferoidais utilizando-se os protocolos descritos aqui. Diferentes pérolas são identificáveis pelo perfil WGM. Mesmo embora exista alguma variabilidade entre pérolas de um tipo particular, o perfil WGM para um dado alvo com um dado emissor fluorescente numa pérola de tamanho dado, será aproximadamente equivalente. Pelo menos 50 diferentes pérolas Q-Sand podem ser testadas simultaneamente.Example 6 Scanning Test Compounds Microspheroidal particles are produced using the protocols described herein. Different pearls are identifiable by the WGM profile. Even though there is some variability between beads of a particular type, the WGM profile for a given target with a given fluorescent emitter on a given size bead will be approximately equivalent. At least 50 different Q-Sand pearls can be tested simultaneously.

As partículas microesferoidais são dispostas em veículos de reação. Estes veículos são lâminas de vidro gradeado com regiões para diferentes compostos. As grades são varridas e os WGMs são calculados e salvos. Esta leitura é o WGM de controle do pré-composto.The microspheroidal particles are arranged in reaction vehicles. These vehicles are meshed glass slides with regions for different compounds. Grids are scanned and WGMs are calculated and saved. This reading is the precomposite control WGM.

Cada veículo de reação é testado com uma ou mais das moléculas de teste. A ligação não específica é minimizada pela(s) etapa(s) de lavagem.Each reaction vehicle is tested with one or more of the test molecules. Non-specific binding is minimized by the wash step (s).

Após a lavagem o veículo de reação é varrido novamente. Os positivos são identificados por trocas no WGM em comparação com os WGMs de controle da molécula de pré-teste.After washing the reaction vehicle is swept again. Positives are identified by WGM exchanges compared to pre-test molecule control WGMs.

Exemplo 7 Protocolo de Síntese de Microesfera Materiais: (3-aminopropil)trimetoxisilano (APS 99%), (3-mercaptopropil)tri-metoxisilano (MPS, 95%), tetraetil ortosilicato (TEOS, 98%), polivinilpirro-lidona (PVP, PM 40.000), Hidróxido de Amônio (29,1% em peso de NH3 em água) (Sigma-Aldrich). Partículas de sílica de 5 pm (Bangs Laboratories, Inc.), Clorofórmio (CH3CI3) e 2-propanol (AnalaR, Merck, Kilsyth, Victoria).Example 7 Microsphere Synthesis Protocol Materials: (3-Aminopropyl) trimethoxysilane (APS 99%), (3-mercaptopropil) tri-methoxysilane (MPS, 95%), tetraethyl orthosilicate (TEOS, 98%), polyvinylpyrrolidone (PVP) , MW 40,000), Ammonium Hydroxide (29.1 wt% NH 3 in water) (Sigma-Aldrich). 5 pm silica particles (Bangs Laboratories, Inc.), Chloroform (CH3 Cl3) and 2-propanol (AnalaR, Merck, Kilsyth, Victoria).

Instrumentos: Microscópio de fluorescência Olympus (Olympus, Bonn, Alemanha), Agitador Rotativo Motorizado (Thermohybaid, Glochester, UK), Cleaner Ultrassônico (Cole-Parmer Instrument Company, Illinois, EUA).Instruments: Olympus Fluorescence Microscope (Olympus, Bonn, Germany), Motorized Rotary Shaker (Thermohybaid, Glochester, UK), Ultrasonic Cleaner (Cole-Parmer Instrument Company, Illinois, USA).

Notas Gerais Importantes: * Esterilizar todos os frascos de vidro e agitadores magnéticos com etanol e secá-los completamente. * Utilizar ponteiras com filtro para todas as pipetagens. * Todos os frascos de vidro devem ser de fundo chato e com tampa de rosca com entre 1,5 - 5 ml de volume. * Utilizar parafilme e todos os frascos de vidro de reação de tampa de rosca quando a reação requerer agitação durante a noite. * A funcionalízação da superfície das pérolas de vidro foram realizadas como prescrito por Brendan Toohey. * A ultra-sonicação durante as etapas de lavagem e a dissolução do PVP não são essenciais.Important General Notes: * Sterilize all glass vials and magnetic stirrers with ethanol and dry them completely. * Use filter tips for all pipetting. * All glass vials should be flat-bottomed and screw-capped to 1.5 - 5 ml in volume. * Use parafilm and all screw cap reaction glass vials when reaction requires overnight stirring. * The surface functionalization of the glass beads was performed as prescribed by Brendan Toohey. * Ultrasound during the washing steps and PVP dissolution are not essential.

Funcionalização da Superfície das Pérolas de Sílica: 1. Limpar totalmente um frasco de fundo redondo lx com ceto-na e 2x com 2-propanol. 2. Adicionar 20 ml de 2-propanol ao frasco de fundo redondo limpo e ajustar numa manta de aquecimento, utilizar prendedores de tampa para manter as tampas fixas e iniciar a pressionar a água através da linha de Schlenk. 3. O 2-propanol deve ser aquecido para 80°C sob agitação constante para que a reação ocorra de forma ideal, desta forma, monitorar constantemente com um termômetro a temperatura do 2-propanol até que alcance a temperatura, assegurar que o termômetro seja lavado com etanol antes de cada verificação da temperatura. 4. Uma vez a temperatura alcançada, adicionar 20 μΐ de APS e 0,1 g de pérolas de Bang não tratadas, o que equivale a 1 ml da solução de pérolas do fabricante, e cozinhar por 2 horas sob agitação constante. 5. Após o cozimento, transferir os conteúdos do frasco para frascos apropriados para lavagem. 6. Lavar 2x em 2-propanol, então re-suspender em 10 ml de água Mílli-Q e vedar o frasco com parafilme.Functionalization of the Silica Pearls Surface: 1. Thoroughly clean a 1x round bottom flask with keto-na and 2x with 2-propanol. 2. Add 20 ml of 2-propanol to the clean round-bottomed flask and adjust on a warming blanket, use cap fasteners to hold the caps in place and start pressing water through the Schlenk line. 3. The 2-propanol must be heated to 80 ° C under constant agitation for the reaction to occur optimally, so constantly monitor with a thermometer the temperature of 2-propanol until it reaches the temperature, ensure that the thermometer is washed with ethanol before each temperature check. 4. Once the temperature is reached, add 20 μΐ APS and 0.1 g of untreated Bang pearls, which equals 1 ml of the manufacturer's pearl solution, and cook for 2 hours under constant stirring. 5. After cooking, transfer the contents of the bottle to appropriate wash bottles. 6. Wash 2x in 2-propanol, then resuspend in 10 ml of M-1 Q water and seal the flask with parafilm.

Parte A __________________________Preparação de FVP_________________________ Parte BPart A __________________________ Preparation of FVP_________________________ Part B

Passivação de Nanocristais para Pérolas de Sílica Funcionalizadas de 5 pm Parte CNanocrystals Passivation for 5 pm Functionalized Silica Pearls Part C

Revestimento TEOS de Microesferas de Nanocristal Dopado Capeado com PVPTEOS PVP Capped Doped Nanocrystal Microsphere Coating

Os especialistas na técnica irão observar que a invenção descrita é susceptível de variações e modificações outras que não aquelas especificamente descritas. Deve ficar entendido que a invenção inclui todas estas variações e modificações. A invenção inclui também todas as etapas, características, composições e compostos a que faz referência ou indicados neste relatório, individualmente ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações de qualquer ou mais das ditas etapas ou características.Those skilled in the art will appreciate that the disclosed invention is susceptible to variations and modifications other than those specifically described. It should be understood that the invention includes all these variations and modifications. The invention also includes all the steps, features, compositions and compounds referred to or indicated in this report, individually or collectively, and any and all combinations of any or more of said steps or features.

BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAPHY

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REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Multiple Sample Analyte Detection Method, characterized in that it comprises: (a) contacting multiple microspheroidal particle assemblies with a sample comprising said analytes, wherein each particle within a microsferoidal particle assembly comprises an optically detectable label. and an immobilized binder moiety or binder moieties of said analyte wherein each microspheroidal particle assembly has a different immobilized binder moiety or assembly of an analyte binder moiety and one or both of: (i) a different microsferoidal particle size; and (ii) a different optically detectable label and wherein each particle set has a defined Whispering Gallery Mode (WGM) profile, wherein the binding of an analyte to said immobilized binding part or binding parts results in a change said WGM profile indicated by a spectral shift in the optically detectable label of a microspheroidal particle array that is indicative of the presence of said analyte; and (b) detecting the binding of analytes to said multiple microspheroidal particle assemblies by detecting specific deviations in the WGM profiles of each microsferoidal particle assembly, wherein said spectral deviations are at one or more emission peaks of each optically detectable label. .

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that the optically detectable label is a fluorochrome.

Multiple Sample Analyte Detection Method according to Claim 2, characterized in that each microspheroidal set of particles is labeled with a different fluorochrome.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that each microspherical set of particles is of different size.

Multiple Sample Analyte Detection Method according to Claim 1, characterized in that said microspheroidal particles comprise a material selected from the list consisting of: silica, latex, titania, tin dioxide, yttria, alumina and other binary metal oxides, quenched peroxides and other metal piezoelectric oxides, sucrose, agarose and other polymers.

Method of Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 5, characterized in that said particle comprises silica,

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that said particles are substantially spherical or spheroidal.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 4, characterized in that said particles comprise a diameter of from about 300 nm to about 30 pm,

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that said optically detectable label is a molecule, atom or ion that emits fluorescence.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that said optically detectable label is a molecule, atom or ion that emits phosphorescence.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that said ethically detectable label is a molecule, atom or ion that emits incandescence.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that said ethically detectable label is detectable in any one or more of the visible, near infrared (NIR) and ultraviolet wavelength ranges. / or infrared (IR),

Method of Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 11, characterized in that said optically detectable label is detectable in the visible wavelength range.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that said optically detectable label comprises a label selected from the group consisting of: a fluorophore, a semiconductor particle, a phosphorus particle. , in a doped particle, a nanocrystal and a quantum dot (quantum cfof).

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 14, characterized in that said optically detectable label is a fluorophore,

Multiple Sample Analyte Detection Method according to Claim 14, characterized in that said ethically detectable label is a quantum dot.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that said immobilized binding part or binding parts comprises a nucleic acid molecule.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 17, characterized in that said nucleic acid molecule comprises DNA.

Multiple Sample Analyte Detection Method according to Claim 17, characterized in that said nucleic acid molecule comprises RNA.

Method of Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that said immobilized binding particle or binding parts comprises a peptide, polypeptide or protein.

Multiple Sample Analyte Detection Method according to Claim 20, characterized in that said peptide, polypeptide or protein is an enzyme.

Method of Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 20, characterized in that said peptide, polypeptide or protein is an antibody.

Multiple Sample Analyte Detection Method according to Claim 1, characterized in that said immobilized binding particle comprises a carbohydrate molecule.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 23, characterized in that said carbohydrate molecules are glycosaminoglycan molecules.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that the change of said WGM profile comprises a redshift of one or more peaks in said profile.

Multiple Sample Analyte Detection Method according to Claim 1, characterized in that the change of said WGM profile comprises a blue shift of one or more peaks in the profile.

Method of Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 25, characterized in that the redshift comprises a wavelength change of said peak or peaks between 1 and 100 nm.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 27, characterized in that the redshift comprises a wavelength change of said peak or peaks between 1 and 20 nm.

Method for Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that the change of said WGM profile comprises the appearance of one or more peaks in one or more of said WGM profiles.

Method of Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that the change of said WGM profile comprises the disappearance of one or more peaks in one or more of said WGM profile.

Multiple Sample Analyte Detection Method according to Claim 1, characterized in that the WGM profile is determined using a confocal microscope in conjunction with a spectrometer.

Method of Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 1, characterized in that the WGM profile is determined using an array scanner in conjunction with a spectrometer.

A multiple sample analyte detection method according to Claim 1, characterized in that the WGM profile is determined by a device that measures light from individual particles together with a spectrometer.

Method of Detecting Multiple Sample Analytes according to Claim 33, characterized in that the device is a flow cytometer.