BE1000263A4

BE1000263A4 - Tripeptide a activite immunostimulante.

Info

Publication number: BE1000263A4
Application number: BE8700377A
Authority: BE
Inventors: Brunetto Brunetti; Marco Prada
Original assignee: Ellem Ind Farmaceutica
Priority date: 1986-04-09
Filing date: 1987-04-09
Publication date: 1988-09-27
Also published as: ATA88387A; GB8708492D0; AU597048B2; IT8620027A1; DE3712050A1; AU7118287A; GB2189491B; FR2597107B1; JPH0645637B2; DE3712050C2; SE8701457L; CA1322715C; IT8620027A0; NL8700827A; KR870010080A; GR870568B; IE59806B1; AR242799A1; CH676467A5; IE870881L

Abstract

Le tripeptide Arg-Ala-Arg, synthétisé par des méthodes classiques en solution, et ses sels, présentent une activité immunostimulante. L'invention est utile dans la lutte contre une déficience immunitaire primaire et secondaire.

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 
 EMI1.1 
 



  TRIPEPTIDE A ACTIVITE On sait par la littérature que la L-analine est importante pour la 
IMMUNOSTIMl1LANTEfonction des lymphocytes T, étant donné qu'elle est essentielle pour que ces cellules puissent répondre in vitro aux stimuli mitogènes (Rotter V. et   al. :   J. Immunol. 123,1726,   1979} í   de plus, la L-analine est egalement essentielle pour la croissance in vitro de lymphocytes (Nordlind K. et   al. :  
Int Archs Allergy appl. Immunol. 59, 1979). 



   Les données de nos laboratoires cependant, établissent seulement une faible activité immunostimulante de cet acide amine, comme montre dans l'essai d'induction in vitro de Thy 1. 2 sur des cellules T immatures provenant de souris normales. 



   La L-arginine egalement est renseignée comme dotée d'activite immunostimulante a la fois in vitro et in vivo, en particulier chez les animaux blessés et fatigues (Barbul A. et al.   :.     Surg. Res.   29,228, 1980 ;
J. Parenteral Enteral Nutr. 4, 446, 1980 ; ibid. 5, 492, 1981) et sur des 
 EMI1.2 
 tumeurs induites experimentalement (Rettura G. Parenteral Enteral Nutrition 3, 409, 1979). 



  Dans notre essai d'induction de Thy. 2, la L-arginine    : J.également preuve   d'une activité peu importante, encore que statistiquement significative. 



   Nous avons synthétisé un tripeptide de séquence Arg-Ala-Arg (en abrégé ci-après ELS2), et avons compare dans notre essai son activité a celle d'un melange des deux aminoacides simples en proportion molaire   2Arg : lAla. Le   tripeptide resultant est de loin plus actif que le melange des deux acides aminés, puisqu'il induit 13% de cellules   (P < 0, 01), compares   à seulement 5% (non significatif statistiquement} avec le mélange. 



   La L-arginine a été choisie pour les deux positions terminales du tripeptide, en se basant sur le fait que, dans de nombreux tripeptid immunostimulants connus, cet acide aminé occupe soit la position N (conune 
 EMI1.3 
 dans le cas de la thymopentine), soit la position C (par exemple dans la tuftsine, l'ubiquitine, la thymopoietine). 



    CARACTERISTIQtJES   CHIMIQUES POIDS   MOLECULAIRE : 401, 49   ROTATION OPTIQUE: /d/20D = 3,69 (c = 1, acide acétique) ANALYSE HPLC : 

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Le tripeptide a été analyse par HPLC par appariement d'ions en utilisant les conditions de séparation décrites ci-après. 



  Eluant: NaH2O4 0,05 M pH 4,3 + SDS 5 x   10-4 M, MeOH ; 50 : 50.   



    Debit : i ml/min.    



  Detection : 225 nm Volume d'injection : 20 mol Echantillon : 20 mcg 
 EMI2.1 
 Colonne u Bondapack C18 (eaux), 300 x 
On utilise l'appareillage    suivant :   Chromatographe à liquide : SERIES 4 (Perkin Eimer) Clapet d'injection : Reodyne mod. 7125-075 à boucle de 20  l Détecteur: Spectrophotomètre LC 95 (Perkin Elmer) Intégrateur de calcul : Data station 3600 (Perkin Elmer)
La figure représente le profil HPLC du tripeptide. 



  RESISTANCE AU MILIEU GASTRIQUE SIMULE IN VITRO
Le tripeptide résiste au milieu gastrique simule in vitro. Dans cette étude, le suc gastrique simulé USP XXI (HCl + pepsine) a été utilise 
 EMI2.2 
 pendant 5 heures ä 
37'C.SYNTHESE 
 EMI2.3 
 
On a ajouté à du   Boc-Ala     (0, 1 mole) dissous   dans du chlorure de méthylène et refroidi ä   O* C i l,   du chloroformiate d'isobutyle (0, 1 mole), en agitant et en abaissant la temperature   à - 15'c.

   Après agitation   du 
 EMI2.4 
 mélange reactionnel à cette temperature pendant 15 minutes, une solution pe prérefroidie d'ester di-p-tosylate de NG-nitro-arginine-benzyle (0, et de N-méthylmorpholine (MNN) (0,2 mole) dans du diméthyl formamide a été ajoutée lentement et le melange réactionnel a été maintenu pendant une nuit 
 EMI2.5 
 sous agitation. Les solvants ont été éliminés sous pression réduite, et le résidu a ete repris dans l'acétate d'éthyle. L'acétate d'éthyle a été lavé à l'eau, a l'acide chlorhydrique IN, dans une solution aqueuse de bicarbonate de soude ä 5% et à l'eau. 11 a été seche sur du sulfate de sodium, et le solvant a été éliminé sous pression réduite. Le produit obtenu est un sirop. Systeme TLC CHCl3:MeOH:HOAc (90:8:2). Pureté 95%: Rendement 80%. 

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   Le produit   (1)   a été débloqué avec un   melange a   50% de chlorure de méthylène et d'acide trifluoroacétique   (1 : 1) à   raison de 10 ml par gramme pendant une demi-heure. 



   Ilaétéévaporésouspressionréduite, trituréàl'éther,filtré, lave ä l'éther et séché sous vide. 



  Rendement 98%
Le TFA-Ala-Arg-OBe a été neutralisé avec NMM et couplé à Z3-Arg dans un mélange de dimethyl formamide et de tetrahydrofuranne, en utilisant 
 EMI3.1 
 de la Nt1M et du chloroformiate d'i. puis a subi le même traitement sobutyle,qu'en (1). Rendement   60K.   Système TLC   CHC13     : MeOH (92 : 8).   Une tache importante. 



   Le tripeptide mentionné ci-dessus a été hydrogéné dans un mélange d'acide acétique, d'eau et de méthanol en présence de pd/c jusqu'à réaction complete. 



   11 a été séparé du catalyseur par filtration, et le filtrat a été mis à évaporer sous vide. 



   Le produit, un tripeptide, a été purifie par distribution à contre-courant en utilisant le système N-butanol : acide acétique : eau (4:1:5).Rendement50%.SystèmeTLCbutanol:acideacétique:eau:pyridine (32 : 6 : 22 : 20). Une tache importante. HPLC 97%. 



    ACTIVITES BIOLOGIQUES.    



  1. A. INDUCTION IN VITRO DE L'ANTIGENE   THY 1. 2  
La capacité du Arg-Ala-Arg à induire in vitro 1a différenciation de precurseurs de cellules T de souris en marqueurs de cellules T pour 
 EMI3.2 
 lymphocytes a été contrôlée en mettant en évidence l'induction de l'antigène de membrane Thy 1. 



  MATERIE Er METHODES SOURIS des souris athymiques (nu/nu) âgées de 8 
2.semaines, élevées dans un milieu C3H/He et maintenues dans des conditions particulières exemptes de germes pathogènes. 



   PREPARATION DES CELLULES : Les rates ont éte enlevées aseptiquement, divisées finement et passées   val   travers un tamis d'acier inoxydable a mailles fines dans du HBSS. Des splénocytes, lavés et remis en suspension dans le milieu 199 (Gibco Ltd. ) auquel on a ajouté 1% de BSA (Boehringer Mannheim) et de la gentamycine (100  g/ml) ont été soumis   ä   

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 incubation pendant 45 minutes dans des colonnes à laine de nylon   equilibrees,   suivant la methode de Julius et al. (Eur. J. Immunol. 3,645, 1973). Les populations de cellules de l'effluant enrichies avec le précurseur de cellules T ont été   utilisees   pour les essais biologiques. 



   ESSAIS BIOLOGIQUES D'INDUCTION : On a mis a incuber à 37'pendant 18 heures 0. 5x106 cellules d'effluant   dans 0. 1 nul   de support, avec 0, 1 ml de tripeptide ou avec le support seul. Les cultures ont été réalisées en double. A le fin de l'incubation, les cellules ont été lavées de chlorure d'ammonium à 0, 87% afin de provoquer l'hydrolyse des globules rouges, et ensuite avec le HBSS. 



   L'induction de l'antigène de membrane Thy   1. 2   a été déterminée par un essai direct    d'immunafluorescence.   



     IMMUNOFLUORESCENCE   DIRECTE : Les cellules ont été mises à incuber à 4* pendant 20 minutes avec un anticorps monoclonal conjugue à la fluorescéine (Bio-Yeda) à une dilution de   1 : 200.   Le mélange a été centrifugé à 300 g pendant 5 minutes, lavé deux fois dans du HBSS, puis mis en suspension en vue du comptage au microscope ä fluorescence   (Orthoplan  
Leitz). 



   La différence des pourcentages de cellules fluorescentes entre les cultures avec et sans tripeptide a donné une indication de l'activité d'induction du produit. 



   RESULTATS : Comme indiqué au tableau, le tripeptide provoque l'apparition du marqueur Thy   1. 2   sur des cellules'T immatures, avec une réponse optimale à 10 mcg/ml. La courbe donnant la relation entre la dose et la réponse présente une forme en cloche vu que les concentrations plus faibles et plus élevées du peptide donnent lieu à une induction plus faible. 

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  CONCENTRATION TRIPEPTIDE (mcg/ml) % THY 1. 2 + CELLULES 
 EMI5.1 
 
<tb> 
<tb> MOYENNE <SEP> + <SEP> E. <SEP> S <SEP> DIFFERENCE <SEP> 
<tb> 0 <SEP> 11 <SEP> +/- <SEP> 1,6
<tb> 0,001 <SEP> 13 <SEP> +/- <SEP> 3,9 <SEP> + <SEP> 2
<tb> 0, <SEP> 001 <SEP> 25 <SEP> + <SEP> {- <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP> + <SEP> 14
<tb> 0,01 <SEP> 36 <SEP> +/- <SEP> 3,7 <SEP> + <SEP> 25
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> 36 <SEP> +/- <SEP> 5, <SEP> 4 <SEP> + <SEP> 25
<tb> 1 <SEP> 41 <SEP> +/- <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> + <SEP> 30
<tb> 10 <SEP> 48 <SEP> +/- <SEP> 2,2 <SEP> + <SEP> 37
<tb> 20 <SEP> 33 <SEP> +/- <SEP> 3,3 <SEP> + <SEP> 22
<tb> 50 <SEP> 29 <SEP> +/- <SEP> 3, <SEP> 3 <SEP> + <SEP> 18
<tb> 100 <SEP> 19 <SEP> +/- <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> + <SEP> 8
<tb> 200 <SEP> 19 <SEP> +/- <SEP> 4,5 <SEP> + <SEP> 8
<tb> 
 1.

   8INDUCTIONINVIVODEL'ANTIGENEDETHY1.2 MATERIELETMETHODES
On administre le ELS2 pendant 4 jours consécutifs, puis les souris ont été maintenues au repos pendant 24 heures ; ensuite, les rates ont été enlevées et les cellules   ex. aminées   pour déterminer l'antigène de Thy   1. 2   par fluorescence. Les souris de contrôle ont reçu le support 199 (M 199), qui est le support dans lequel le produit avait été dissous. Les souris avaient un poids moyen d'environ 24g. 



  RESULTATS 
 EMI5.2 
 % OE THY 1- 
 EMI5.3 
 
<tb> 
<tb> 2, <SEP> 7. <SEP> CELLLLESOral <SEP> fizz
<tb> Controle <SEP> 2% <SEP> 4%
<tb> ELS2 <SEP> 42 <SEP>  g/kg <SEP> 3% <SEP> 4%
<tb> ELS2 <SEP> 420 <SEP>  g/kg <SEP> 6% <SEP> 7%
<tb> ELS2 <SEP> 1055 <SEP> pg/kg <SEP> 17% <SEP> 19%
<tb> ELS2 <SEP> 2110 <SEP> pg/kg <SEP> 16% <SEP> 17%
<tb> ELS2 <SEP> 4220 <SEP>  g/kg <SEP> 18% <SEP> 17%
<tb> ELS2 <SEP> 8440 <SEP>  g/kg <SEP> 17% <SEP> 20%
<tb> 
 
Les données indiquent que le ELS2 est en mesure de provoquer la maturation de   splénocytes après administration   par voie orale et intra peritoneal. 

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   Le dosage optimal est de 1055 pg/kg, tandis qu'une réponse en palier est observée pour des dosages plus élevés. 
 EMI6.1 
 



  ATIQ\/IN MATERIEL PREPARATION DE CELLULES MONONUCLéAIRES DU SANG HUMAIN PERIPHERIQUE (PBMC). 



   Du sang périphérique est obtenu de volontaires en bonne santé par ponction veineuse. Les érythrocytes du sang sont séparés des leucocytes sur gradiants de Ficoll-Hipaque. La couenne inflammatoire (PBMC) est enlevée et lavée, et les cellules sont remises en suspension à raison de   lxlCP     cellules/ml   dans du RPMI 1640 auquel on a ajoute 1% de pénicilline/streptomycine, 1% de glutamine et 1% de serum fetal de veau inactivé par la chaleur (FCS, 56'C 30    min.).   



  PREPARATION DU FACTEUR DE CROISSANCE
Le PBMC à   lxl (Y-   cellules/ml dans 1% de FCS inactive par la chaleur est mis ä incuber avec ou sans Phytohémagglutinine (PHA) a une concentration de 0. 75% (v/v). Le peptide à essayer est ajoute a la concentration de 1  g/ml   aux cultures appropriees.   La periode d'incubation 
 EMI6.2 
 est de 18 a 24 heures it 37'C en atmosphere humide. sont ensuite filtrées sur des filtres de 0, 22 mM et le produit surnageant est examiné pour détecter la présence de facteurs de croissance. 



  MESURE DES FACTEURS DE CROISSANCE DANS LES PRODUITS SURNAGEANT A. Cellules d'essais
Les cellules B utilisées pour détecter lÅa présence du facteur de croissance des cellules B (BCGF) sont des lignées de cellules de culture à long terme maintenues sur BCGF et sont EBV négatives. Ces cellules sont cultivées dans un support exempt de serum en utilisant du Nutridoma (Boehringer   Mannheim Biochemicals),   et ne répondent pas au IL-2. 



   Les cellules T utilisées pour l'essai de détection de la présence d'IL-2 sont fraichement isolées. Elles ont été stimulées initialement avec du PHA (0,   75%)   et sont maintenues en culture pendant au moins 10 jours avant leur utilisation (afin de diminuer l'effet du milieu et d'établir leur dependance par rapport à l'IL-2). 



  B. Préparation de cellules d'essai pour utiliser dans le contrôle. 



   1. Les cellules B sont généralement utilisées 4 jours après leur derniere alimentation avec BCGF. Elles sont   lavees   4 fois dans RPMI 1640 

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 pour éliminer toutes trace$ de BOGF et sont ajustées   it   15X104 cellules/ml 
 EMI7.1 
 dans RPMI pli et Nutridoma. (à la concentration finale de 1%). 



   2. Les cellules T sont utilisées 4 jours apres la dernière alimentation avec IL-2. Elles sont lavées 4 fois et ajustées à 50x104   cellules/ml   dans le RPMI 1640 avec 5% FCS. 



  C. Procédures de contrôle 
 EMI7.2 
 1. Des cellules B cultivées a long terme sont mises ä incuber avec   differentes   concentrations du produit surnageant provenant de cultures PBMC, dans 96 plaques de micro-titrage à fond plat. Chaque cuvette a un volume total de 200 cl et comporte 100  l de cellules B   (15xi0   cellules) et 100  l de produit surnageant. Nous avons examiné l'efficacité de nos cellules B d'essai en les faisant incuber avec différentes concentrations de BCGF purifié (Cellular Products, Inc. Buffalo,   N.     Y.).   



   Les cultures sont mises à incuber pendant 24 heures, puis on ajoute 1   ttCi   de/ : H-Tdr/ et on effectue une incubation supplémentaire pendant 12 heures. Les cultures sont   ensuite recoltees   et soumises à comptage dans un compteur à scintillation. 



   2. Les cellules T sont mises à incuber dans des cuvettes à fond plat. Le volume total de chaque cuvette est de 200   ul,   ce qui comprend   SOX103   cellules T par cuvette. 



   La periode d'incubation est de 72 heures et comprend 12 heures de marquage   avec/3H-Tdr/.   



  RESULTATS 1) PRODUCTION DU FACTEUR DE CROISSANCE EXPERIENCE 1   ACTIVITE   BCGF (C.P.M.) % Produit surnageant 
 EMI7.3 
 
<tb> 
<tb> Produit <SEP> surnageant <SEP> de <SEP> 3,05 <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 25 <SEP> 50
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PM <SEP> 424 <SEP> 1026 <SEP> 1674 <SEP> 3172 <SEP> 8392
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> + <SEP> ELS2 <SEP> 2772 <SEP> 4616 <SEP> 6336 <SEP> 8166 <SEP> 9818
<tb> ACTIVITE <SEP> TCGF <SEP> (C. <SEP> P. <SEP> M.) <SEP> 
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> 542 <SEP> 192 <SEP> 224 <SEP> 564 <SEP> 1144
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> + <SEP> ELS2 <SEP> 384 <SEP> 718 <SEP> 1832 <SEP> 4028 <SEP> 8338
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 EXPERIENCE 2   ACTIVISTE   BCGF (C. P.

   M.) % de liquide surnageant 
 EMI8.1 
 
<tb> 
<tb> produit <SEP> surnageant <SEP> de <SEP> 3,125 <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 25 <SEP> 50
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> 1369 <SEP> 2187 <SEP> 2894 <SEP> 4876 <SEP> 8104
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA+ELS2 <SEP> 2690 <SEP> 4214 <SEP> 7442 <SEP> 8730 <SEP> 11754
<tb> ACTIVITE <SEP> TCGF <SEP> (C. <SEP> P. <SEP> M.) <SEP> 
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA <SEP> 1482 <SEP> 3146 <SEP> 4322 <SEP> 7184 <SEP> 9012
<tb> PBL <SEP> + <SEP> PHA+ELS2 <SEP> 2968 <SEP> 6220 <SEP> 9354 <SEP> 12014 <SEP> 12984
<tb> 
 3. EFFET SUR LA SYNTHESE DE L'ARN EFFET DU ELS2 SUR LA SYNTHESE DE L'ARN DANS DES CELLULES T HUMAINES OBSERVE PAR INCORPORATION DE 3H-URIDINE. COMPTAGE PAR MINUTE (CPM). RESULTATS OBTENUS APRES 24 HEURES D'INCUBATION. 



  T 3732 T + PHA 20752   Concentration ELS2 t-'g/ml    
 EMI8.2 
 
<tb> 
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 20
<tb> T <SEP> + <SEP> ELS2 <SEP> 4741 <SEP> 4834 <SEP> 5086 <SEP> 5130
<tb> T <SEP> + <SEP> ELS2 <SEP> + <SEP> PHA <SEP> 31000 <SEP> 31413 <SEP> 32706 <SEP> 31494
<tb> 
 4. EFFET SUR LA SYNTHESE DE L'ADN EFFET DU ELS2 SUR LA SYNTHESE DE L'ADN DANS DES CELLULES T HUMAINES, OBSERVE PAR INCORPORATION DE 3H-THYMIDINE. COMPTAGE PAR MINUTE (CPM). 



  RESULTATS OBTENUS APRES 3 JOURS D'INCUBATION T 154 T + PHA 6076   Concentration ELS2 ng/ml    
 EMI8.3 
 
<tb> 
<tb> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> T <SEP> + <SEP> ELS2 <SEP> 152 <SEP> 166 <SEP> 190 <SEP> 234
<tb> T <SEP> + <SEP> ELS2 <SEP> + <SEP> PHA <SEP> 5758 <SEP> 6477 <SEP> 7548 <SEP> 12317
<tb> 
 5. AUGMENTATION DU NOMBRE DE CELLULES IN VITRO
Le tripeptide, ajouté aux cultures soit de lymphocytes T soit de mélanges de lymphocytes T et B tous les quatre jours à une concentration de 5   Hg/ml   pendant une période de 30 jours, est en mesure d'augmenter le nombre de cellules, avec un maximum de + 50% par rapport aux cultures témoin, observe entre le lOème et le 15eme jour de l'experience. 

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     ETUDES   TOXICOLOGIQUES   TOXICITE   AIGUE
Des études de toxicité aigue effectuées sur des souris et des rats ont montré que, jusqu'à des doses de 100 mg/kg/i. m., le tripeptide est totalement exempt d'effects toxiques. 



    TOLERABILITE  
Des études sur des lapins et des souris ont montré que le produit, A la dose de 100 mg/kg respectivement   i. v.   et   i. p.   ne produit aucune modification hémodynamique, et n'a pas d'effet sur le comportement. En particulier le temps d'endormissement ne présente qu'une légère augmentation. 



   ACTIVITE ALLERGENE
A la dose de 100 mg/kg   i. m.,   le produit ne provoque aucun phénomène de sensibilisation du cobaye. 
 EMI9.1 
 



  SELS DU TRIPEPTIDE Les recherches décrites ci-dessus ont ete effectuées avec un acétate du tripeptide, quoique l'on sache bien, dans l'état actuel de la technique, que des résultats semblables peuvent etre obtenus en utilisant d'autres sels, comme par exemple un trifluoroacétate, un chlorhydrate, un sulfate. E

Claims

REVENDICATIONS 1. Tripeptide constitue de L-Ala (alanine) et
2 L-Arg (arginine) et ayant la structure suivante : EMI10.1 2. Tripeptide selon la revendication 1 ayant une activité immunostimulante.
3. Tripeptide selon la revendication 1, ayant une utilisation thérapeutiques possibles comme médicament dans des pathologies caractérisées par une déficience primaire et secondaire du système immunitaire.
4. Tripeptide selon la revendication 1 capable d'exercer une activite immunostimulante après administration orale et parentérale.
5. Sels pharmaceutiquement acceptables du tripeptide ayant une utilisation possible comme medicament selon la revendication 3, par exemple un acetate, un trifluoroacétate, unn chlorhydrate, un sulfate.