AT527882A1

AT527882A1 - Testvorrichtung und verfahren zur bestimmung von hämatokrit und/oder fibrinogen in einer blutprobe

Info

Publication number: AT527882A1
Application number: ATA51022/2023A
Authority: AT
Inventors: Selinger Msc Florian; Ertl Peter; Zipperle Johannes; Schobesberger Sillvia; Thumfart Helena
Original assignee: Univ Wien Tech
Priority date: 2023-12-19
Filing date: 2023-12-19
Publication date: 2025-07-15
Also published as: WO2025129226A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Hämatokritwertes in einer Blutprobe, das die folgenden Schritte um- fasst a) Bereitstellung einer Lateral-Flow-Vorrichtung mit einem Bluttrennkissen, b) Aufbringen einer Blutprobe auf das Bluttrennkissen der Lateral-Flow-Vorrichtung, und c) Bestimmung des Hämatokritwerts durch Vergleich des Verhältnisses der Laufstrecke der roten Blutkörperchen zur Gesamt- laufstrecke auf dem Bluttrennkissen mit einem Referenzverhältnis.

Description

TESTVORRICHTUNG UND VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON HÄMATOKRIT UND/ODER FIBRINOGEN IN EINER BLUTPROBE

TECHNISCHES GEBIET Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Bluta-

nalyse.

HINTERGRUND

Lateral Flow Assays (LFAs) sind schnell, kostengünstig und einfach zu handhaben, ohne dass zusätzliche Geräte benötigt werden, da alle Reagenzien in Membranen auf der Vorrichtung selbst gelagert sind. Der Ursprung der Lateral-Flow-Tests geht auf die 1950er Jahre zurück, als papierbasierte Dipstick-Tests für die Glukosemessung im Urin entwickelt wurden und parallel dazu Latex-Agglutinationstests und Radioimmunoassays, Pioniere des Nachweisverfahrens, aufkamen. Der erste LFA-Test, wie er heute bekannt ist, wurde in den 1980er Jahren entwickelt, um das Vorhandensein von humanem Choriongonadotropin (hCG) zur Bestätigung einer Schwangerschaft zu analysieren. Seitdem haben sich Lateral-Flow-Tests zu erfolgreichen Analvysegeräten für Point-of-Care-Tests in verschiedenen Anwendungsbereichen entwickelt, die vom Nachweis von Krankheits-Biomarkern, pathogenen Bakterien, Viren und Mykotoxinen bis hin zu chemischen Kontaminanten wie Tierarzneimittelrückständen oder Pestiziden reichen. Seit dem Ausbruch von SARS-CoV-2 im Jahr 2019 sind LFAs eines der am häufigsten verwendeten Diagnoseinstrumente, da sie als wichtige Maßnahme zur Kontrolle und Überwachung der Virusausbreitung und zur Umsetzung von Quarantänemaßnahmen etabliert wurden.

Fibrinogen spielt eine wichtige Rolle bei schweren Blutungen. Bei einer anhaltenden traumatischen Verletzung könnte eine Fibrinogen-Supplementierung das Sterberisiko bei Traumapatienten senken. Daher sind genaue und schnelle Tests zur Bestimmung der Fibrinogenkonzentration erforderlich, insbesondere in Notfallsituationen.

Die bisher entwickelten PoC-Geräte für den Nachweis von Fibrinogen beruhen hauptsächlich auf der Gerinnung. So wird beispielsweise das in der Probenauftragsöffnung einer papierbasierten Vorrichtung getrocknete Thrombin nach dem Blutauftrag freigesetzt und führt zur Fibrinbildung. Folglich hängt die Strecke, die das Blut zurückgelegt

hat, von der Fibrinogenkonzentration ab. Bei einem ähnlichen Ansatz

wird der Papierstreifen in ein Reservoir mit blauem Farbstoff gelegt, und die Elutionshöhe hängt von der Fibrinogenkonzentration ab. Um Fibrinogen direkt aus Blut nachzuweisen, wird vorgeschlagen, Blut mit Thrombin zu mischen, den Tropfen auf einen Objektträger zu geben und die Reaktion ablaufen zu lassen. Danach wird ein Papierstreifen hinzugefügt und die Dochtlänge gemessen, da die Dochtlänge von der Fibrinbildung abhängt, die wiederum von der Fibrinogenkonzentration abhängt. Bei einem anderen Ansatz wurden siebbedruckte Papierelektroden verwendet, um das Blut durch dielektrophoretische Kraft zu trennen und anschließend die Fibrinogenkonzentration auf der Grundlage einer Widerstandsänderung nach Thrombinapplikation und somit der Fibrinbildung zu messen.

Hämatokrit kann die Ergebnisse von Fibrinogenmessungen aus Blut beeinflussen. Ein hoher Hämatokritwert bedeutet eine geringere Menge an Plasma, die die Detektionszone passiert. Daher ist es von Vorteil, auch Hämatokrit in der Probe zu bestimmen.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Be-

stimmung des Hämatokritwertes in einer Blutprobe bereitzustellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Hämatokritwertes in einer Blutprobe, das die folgenden Schritte umfasst

a) Bereitstellung einer Lateral-Flow-Vorrichtung mit einem

Bluttrennkissen,

b) Aufbringen einer Blutprobe auf das Bluttrennkissen der Late-

ral-Flow-Vorrichtung, und

c) Bestimmung des Hämatokritwerts durch Vergleich des Verhält-

nisses der Laufstrecke der roten Blutkörperchen zur Gesamtlaufstrecke auf dem Bluttrennkissen mit einem Referenzverhältnis.

Blut, das direkt oder über ein Probenaufnahmekissen auf ein Bluttrennkissen aufgetragen/getropft wird, breitet sich von der Auftrage-/Tropfenposition aus durch das Kissen aus. Dabei werden die Erythrozyten (d. h. die roten Blutkörperchen) von Plasma und anderen Blutbestandteilen getrennt. Da Erythrozyten eine rote Farbe aufweisen und Plasma und andere Blutbestandteile eine andere Farbe haben,

sind die Lauffronten der Erythrozyten und des Plasmas und anderer

Blutbestandteile auf dem Bluttrennkissen sichtbar. Natürlich darf die Farbe des Bluttrennkissens nicht mit den Farben der verschiedenen Blutbestandteile interferieren.

Anhand der Lauffront der Blutbestandteile auf dem Bluttrennkissen lässt sich die Laufstrecke der Erythrozyten und des Plasmas auf dem Bluttrennkissen von der Auftrags-/Tropfposition nach einer vorgegebenen Zeit bestimmen. Die Laufstrecke des Plasmas von der Auftrags-/Tropfposition nach derselben vorgegebenen Zeit ist die Gesamtlaufstrecke.

Das Verhältnis der Laufstrecke der Erythrozyten einer Blutprobe, die auf ein Bluttrennkissen aufgetragen wird (Irse), zur Gesamtlaufstrecke (d. h. Lauf vor dem Plasma) (Irtotaı) korreliert mit dem Hämatokritwert der Blutprobe. Aufgrund dieser Korrelation zeigt das aus einer Blutprobe gewonnene Verhältnis Igrsc/Irotaıa den Hämatokritwert an.

Die Korrelation zwischen dem Verhältnis Irsc/Irtotaı und dem Hämatokritwert muss für jedes Bluttrennkissen mit einem Referenzverfahren bestimmt werden, da die Ausbreitungsgeschwindigkeit von Blutbestandteilen innerhalb eines Bluttrennkissens vom Material des Bluttrennkissens abhängt. Natürlich müssen auch das applizierte Blutvolumen und die Laufzeit identisch sein. Ein Referenzverfahren zur Bestimmung der Korrelation zwischen dem Verhältnis Igssc/Irotaı und dem Hämatokritwert ist ein hämatologisches Analysegerät oder die Mikrohämatokritmethode (CLSI (2000) Procedure for Determining Packed Cell Volume by the Microhematocrit Method; Approved Standard (3rd edn) CLSI document H7-A3 [ISBN 1-56238-413-9]). Sobald das Bluttrennkissen-spezifische Verhältnis Igsc/Irotaı bestimmt und mit dem mit einem Referenzverfahren bestimmten Hämatokritwert korreliert wurde, kann dieses Verhältnis als Referenzverhältnis in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder zur Feststellung, ob eine Blutprobe mehr oder weniger als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält, umfassend die Schritte

a) Bereitstellen einer Lateral-Flow-Vorrichtung, die ein Blut-

probenladekissen, das mit einem optionalen Konjugatkissen fluidisch verbunden ist, ein Detektionskissen und ein Ab-

sorptionskissen in Serie umfasst, wobei das Kon]ugatkissen

markierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfasst und das Detektionskissen mindestens zwei voneinander getrennte Bereiche umfasst, die daran immobilisierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfassen,

b) Aufbringen einer Blutprobe auf das Blutprobenladekissen der Lateral-Flow-Vorrichtung, und

c) Bestimmung des Vorhandenseins von Fibrinogen in der Blutprobe, wenn markierte Fibrinogen-bindende Moleküle an mindestens einen der mindestens zwei Bereiche binden und/oder des Vorhandenseins von mehr als 1,5 mg/ml Fibrinogen in der Blutprobe, wenn markierte Fibrinogen-bindende Moleküle an mindestens zwei der mindestens zwei Bereiche binden.

Ein niedriger Fibrinogenspiegel im Blut führt zu verschiedenen Störungen wie verlängerten und/oder spontanen Blutungen, leichten Blutergüssen, insbesondere nach Verletzungen oder Operationen, und Schwangerschaftskomplikationen. Menschen mit niedrigem Fibrinogenspiegel sind auch anfälliger für frei flottierende Gerinnsel, die die Blutgefäße verstopfen, da Fibrin, ein Abbauprodukt von Fibrinogen, nicht vorhanden ist, um die Bildung innerer Gerinnsel zu verhindern. Der Fibrinogenspiegel kann infolge von traumatischen Verletzungen und Blutverlusten, Lebererkrankungen, Leukämie, Medikamenten oder genetischen Störungen sinken. Die aktuellen Leitlinien empfehlen einen Fibrinogenersatz, wenn der Fibrinogenspiegel unter 1,5 mg/ml fällt. Wenn ein solcher Abfall bei Patienten auftritt, werden in der Regel Plasmaprodukte verwendet, um den Fibrinogenspiegel in akuten Situationen zu erhöhen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe, insbesondere die Bestimmung, ob eine Blutprobe mehr oder weniger als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält. Daher ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung hilfreich, um Patienten zu identifizieren, die eine Ergänzung von Fibrinogen benötigen.

Das Verfahren der vorliegenen Erfindung zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe ist besonders vorteilhaft, da es ermöglicht, das Vorhandensein von Fibrinogen in einer Blutprobe zu bestimmen und darüber hinaus festzustellen, ob der Fibrinogenspiegel in der Blutprobe höher oder niedriger als 1,5 mg/ml ist, was die benötigte Information ist, um zu entscheiden, ob ein Patient Medika-

mente zur Erhöhung des Fibrinogenspiegels benötigt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Hämatokritwertes in einer Blutprobe und zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine Blutprobe mehr als 1.5 mg/ml Fibrinogen enthält, umfassend ein Bluttrennkissen oder ein erstes Probenladekissen, das dem Bluttrennkissen vorgeschaltet ist und in £fluidischer Verbindung mit diesem steht, und ein zweites Blutprobenladekissen, wobei das zweite Blutprobenladekissen in fluidischer Verbindung mit einem KonJugatkissen, einem Detektionskissen und einem Absorptionskissen in Serie steht, wobei das Konjugatkissen markierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfasst und das Detektionskissen mindestens zwei voneinander getrennte Bereiche umfasst, die daran immobilisierte Fibrinogenbindende Moleküle umfassen.

Mit der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung können der Hämatokritwert und Fibrinogenspiegel bestimmt werden und/oder ob eine Blutprobe mehr als 1,5 mg/ml Fibrinogen in einer Blutprobe enthält. Die Messung beider Blutparameter mit derselben Vorrichtung (gleichzeitig oder in Serie) ist wichtig, da der Hämatokritwert die Ergebnisse der Bestimmung der Fibrinogenkonzentration in einer Blutprobe beeinflussen kann. Denn wenn dasselbe Blutvolumen aufgetragen wird, Hämatokrit aber unterschiedlich ist, kommt es zu Schwankungen des Plasmavolumens, das die Detektionszone passiert. Ein geringeres Plasmavolumen bedeutet, dass weniger Fibrinogenmoleküle die Detektionszone passieren als bei einem höheren Plasmavolumen, obwohl die Fibrinogenkonzentration die gleiche ist. Daher muss Hämatokrit bei der Messung der Fibrinogenkonzentration berücksichtigt werden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Hämatokritwertes in einer Blutprobe und zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine Blutprobe mehr als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält, umfassend den Schritt

a) Aufbringen einer Blutprobe auf ein Bluttrennkissen oder ein erstes Probenladekissen, das dem Bluttrennkissen und einem zweiten Blutprobenladekissen der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgeschaltet ist und mit diesen in fuidischer Verbindung steht, und

b) Bestimmung des Hämatokritwerts durch Vergleich des Ver-

hältnisses der Laufstrecke der roten Blutkörperchen zur

Gesamtlaufstrecke auf dem Bluttrennkissen mit einem Referenzverhältnis und/oder dem Vorhandensein von Fibrinogen in der Blutprobe.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung eines Hämatokritwertes in einer Blutprobe und zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine Blutprobe mehr als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Datenverarbeitungsvorrichtung mit Mitteln zur Durchführung von Schritt c) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung oder von Schritt b) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Computerprogramm, das Anweisungen enthält, die, wenn das Programm von einem Computer ausgeführt wird, den Computer veranlassen, Schritt c) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung oder Schritt b)

des Verfahrens der vorliegenden Erfindung auszuführen.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt den Hämatokrit-Test der vorliegenden Erfindung. A) Schematische Darstellung des verwendeten Verfahrens zur Charakterisierung verschiedener Probenkissen. B) Plasmastrecke verschiedener Probenkissen (GF, GX, GR, LF1) (Breite = 3mm) nach Applikation von 20 ul Blut (n = 10). C) Schematische Darstellung des Funktionsprinzips des Hämatokrit-PoC-Tests (lesc = Laufstrecke der roten Blutkörperchen; lLtotaı = Laufstrecke der roten Blutkörperchen und des Plasmas). D) Korrelation zwischen dem Hämatokrit-PoC-Test und dem mit dem Hämatologie-Analysegerät bestimmten Hämatokrit. E) Hämatokrit von Blutproben, bestimmt mit dem entwickelten PoC-Hämatokrit-Test (PoC) und dem Hämatologie-Analysegerät (Lab).

Fig. 2 zeigt die Charakterisierung der Eigenschaften der Detektionskissen mit Puffer (Hank's Balanced Salt Solution) und Plasma. A) Schematische Darstellung des verwendeten Verfahrens zur Charakterisierung. Durchflussprofil verschiedener Detektionskissen (AE99, RP, FP) mit B) Puffer und C) Plasma. D) Vergleich der Laufstrecke nach 35s (Breite = 3 mm). E) Auswirkung der Membranbreite (Detekti-

onskissen: RP). F) Auswirkung der Blockierung mit Bovines

Serumalbumin (BSA) in Wasser (H,O) oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (Detektionskissen: RP, nur Puffer).

Fig. 1 zeigt A) ein Schema für das verwendete Verfahren zur Prüfung der Wirksamkeit der Konjugation von Goldnanopartikeln (AUuNP) mit Antikörpern. Wenn AuNP mit Antikörpern (AB) modifiziert sind, wird die Aggregation von AuNP in Gegenwart von NaCl verhindert. B) Spektralscan von blanken (blau) und mit Antikörpern modifizierten (rot) AuNP in Gegenwart von NaCl. C) Einfluss des pH-Werts des KonJugationspuffers auf die Konjugation von Antikörpern mit AuNP. D) Schema der verwendeten Methode zur Untersuchung der Freisetzungseigenschaften von Kon]ugatkissen. Das Konjugatkissen wird mit AuNP getränkt und nach dem Trocknen wird ein Bild aufgenommen. Anschließend werden die gespeicherten Konjugate freigesetzt und nach dem Trocknen des Kissens erneut abgebildet. Der Intensitätsunterschied beschreibt die AuNP-Freisetzung. E) Konjugatfreisetzung verschiedener Konjugatkissen (F5, ST17, ST14) und Konj]ugatfreisetzungspuffer (BB: 5 mM Boratpuffer pH 9 mit 10% Saccharose, PBST: phosphatgepufferte Salzl6sung mit 0,05% TWEEN® 20 und 10% Saccharose). (C, E) Statistische Signifikanz durch Welch t-Test *p<0,033, **p<0,002, ***p<0,001 (n = 9 (C), n = 15 (E) aus 3 unabhängigen Experimenten).

Fig. 4 zeigt A) einen ELISA mit zwei verschiedenen Capture-Antikörpern (Klon KT9 und AB05-1F11). B) Bilder von LFA, die mit verschiedenen Fibrinogenkonzentrationen getestet wurden. Die zweite Linie (mit Pfeil gekennzeichnet) wird zur Bestimmung der Signalintensität verwendet. Wenn die Linie erscheint, liegt die Fibrinogenkonzentration unter dem Schwellenwert von 1,5 mg/ml. C) LFA getestet mit verschiedenen Fibrinogenkonzentrationen. Die Linie zeigt den Schwellenwert von 1,5 mg/ml an. (n > 6 aus 3 unabhängigen Experimenten). D) LFA, getestet mit verschiedenen Verdünnungen von Referenzplasma. Die Linie zeigt den Schwellenwert von 1,5 mg/ml. (n = 6 aus

2 unabhängigen Experimenten).

BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGS FORMEN

"Blut", wie hier verwendet, das als Probe zur Bestimmung des Hämatokritwerts und/oder des Fibrinogenspiegels verwendet wird, bezieht sich immer auf Vollblut. Im Zusammenhang mit der Bestimmung des Hämatokritwerts und des Fibrinogenspiegels kann Blut daher aus-

tauschbar mit Vollblut verwendet werden.

Die Laufstrecke der roten Blutkörperchen und des Plasmaanteils der Blutprobe kann mit Hilfe einer Skala und/oder elektronischer Mittel bestimmt werden. Wenn elektronische Mittel verwendet werden, können diese Mittel auch zwischen der Lauffront der roten Blutkörperchen und dem Plasma unterscheiden. Bei Verwendung einer Kamera zur Aufnahme eines Bildes der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, das die Lauffronten zeigt, kann die Vorrichtung auch einen oder mehrere Referenzpunkte oder eine Skala umfassen, um die elektronische Bestimmung der Laufstrecke zu erleichtern.

Das Bluttrennkissen besteht aus einem saugfähigen Material mit einem Hohlraumvolumen, das die Ausbreitung von Blut und seinen Bestandteilen durch das jeweilige Material ermöglicht. Das Hohlraumvolumen innerhalb des Bluttrennkissens ermöglicht das Passieren von roten Blutkörperchen und der Plasmafraktion mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten, so dass die Lauffronten zumindest dieser beiden Komponenten auf dem Bluttrennkissen sichtbar gemacht werden können. Derartige Bluttrennkissen sind der Fachperson wohl bekannt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das Bluttrennkissen aus einem porösen Material, vorzugsweise einem Fasermaterial und/oder einem thermoplastischen Material.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Fasermaterial ein Glasfasermaterial, vorzugsweise eine gebundene Glasfaser, und/oder das thermoplastische Material ist Polysulfon.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das poröse Material ein Hohlraumvolumen von 1x bis 3x, vorzugsweise 1x bis 2,5x, noch bevorzugter 1,5x bis 2,5x, noch bevorzugter 2x bis 2,5x.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Bluttrennkissen eine Dicke von 25 bis 300 um, vorzugsweise von 50 bis 250 wm.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Bluttrennkissen eine Länge von 1 bis 100 mm, vorzugsweise von 2 bis 80 mm, noch bevorzugter von 3 bis 60 mm, noch

bevorzugter von 3 bis 55 mm.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat das Bluttrennkissen eine Breite von 1 bis 10 mm, vorzugsweise von 2 bis 5 mm.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Bluttrennkissen ein Antikoagulans und/oder die Blutprobe wird vor Schritt b) mit einem Antikoagulans behandelt.

Um eine Gerinnung der auf das Bluttrennkissen aufgetragenen Blutprobe zu vermeiden, wird das Bluttrennkissen selbst oder die Blutprobe vor dem Auftragen des Blutes mit einem Antikoagulans behandelt. Wenn während der Bestimmung des Hämatokritwertes im Bluttrennkissen kein Antikoagulans vorhanden ist, besteht die Gefahr, dass das Blut gerinnt und der Test nicht funktioniert.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Antikoagulans ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), einem Citrat, Heparin, Hirudin und einem direkten Thrombininhibitor.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden 5 bis 100 ul, vorzugsweise 5 bis 80 ul, noch bevorzugter 10 bis 50 ul, noch bevorzugter 15 bis 30 ul, der Blutprobe auf das Bluttrennkissen oder ein dem Bluttrennkissen vorgeschaltetes und mit diesem in £fluidischer Verbindung stehendes Probenladekissen aufgebracht.

Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung des Hämatokritwertes und insbesondere ihr Bluttrennkissen sind so konziplert, dass sie das Auftragen einer relativ kleinen Blutmenge ermöglichen. So kann das auf das Bluttrennkissen aufgebrachte Blutvolumen im Bereich von 5 bis 200 ul, vorzugsweise 5 bis 100 ul, noch bevorzugter 10 bis 50 Wl, noch bevorzugter 10 bis 40 ul, noch bevorzugter 10 bis 30 ul, noch bevorzugter 15 bis 25 ul, noch bevorzugter 18 bis 22 ul Blut liegen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Lateral-Flow-Vorrichtung weiters ein optionales Blutprobenladekissen, das mit einem optionalen Konj]jugatkissen und einem Detektionskissen in Serie fluidisch verbunden ist, um Fibrinogen in der Blutprobe zu bestimmen und/oder festzustellen, ob die Blutprobe mehr oder weniger als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält, wobei ein Teil der Blutprobe auf das optionale Probenladekissen aufge-

bracht wird.

Zur gleichzeitigen oder seriellen Bestimmung des Fibrinogens in der Blutprobe und/oder zur Feststellung, ob die Blutprobe mehr oder weniger als 1,5 mg/ml Fibrinogen in der Blutprobe enthält, wird ein Teil der Blutprobe auf ein optionales Probenladekissen aufgebracht, das mit weiteren Mitteln zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Probe in fluidischer Verbindung steht.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Kon]ugatkissen markierte Fibrinogen-bindende Moleküle und das Detektionskissen mindestens zwei voneinander getrennte Bereiche mit daran immobilisierten Fibrinogen-bindenden Molekülen.

a) Bereitstellen einer Lateral-Flow-Vorrichtung, die ein Blutprobenladekissen, das mit einem optionalen Konjugatkissen fluidisch verbunden ist, ein Detektionskissen und ein Absorptionskissen in Serie umfasst, wobei das Kon]ugatkissen markierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfasst und das Detektionskissen mindestens zwei voneinander getrennte Bereiche umfasst, die daran immobilisierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfassen,

Die in den Kissen des Geräts verwendeten Materialien (d.h. Blutprobenladekissen, Konj]jugatkissen, Detektionskissen und Absorptionskissen) sind in der Technik bekannt und werden in bekannten Lateral-Flow-Vorrichtungen verwendet (Bahadır EB et al. TrAC - Trends in Analytical Chemistry 82(2016):286-306; https://doi.org/10.1016/).trac.2016.06.006).

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden der Blutprobe Fibrinogen-bindende Moleküle zugesetzt, bevor die Probe auf das Probenladekissen aufgetragen wird, wobei die Fibrinogen-bindenden Moleküle für die Anzeige des durchgeführten Tests benötigt werden. Die Fibrinogen-bindenden Moleküle können vormarkiert werden, um eine optische Ablesung zu ermöglichen, die visuell (z. B. durch Vergleich mit Referenzintensitätslinien) oder durch Abbildung der Linien und automatische Linienintensitätsanalyse analysiert werden kann. Alternativ können die Fibrinogen-bindenden Moleküle in einem separaten Schritt für die optische Auslesung markiert werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Fibrinogen-bindende Moleküle Antikörper oder funktionelle Fragmente davon oder Apatmer oder Jedes andere Molekül, das an Fibrinogen bindet.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht vor, dass die Fibrinogen-bindenden Moleküle des Konjugatkissens mit Gold-Nanopartikeln, farbigen Latexkügelchen, Kohlenstoff-Nanopartikeln, Selen-Nanopartikeln, Silber-Nanopartikeln, Quantenpunkten, organischen Fluorophoren, Polystyrol- oder Poly(methylmethacrylat)-Partikeln (PMMA), radioaktiven Markierungen oder Chemilumineszenz-Markierungen markiert werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die Bereiche der mindestens zwei Bereiche, die dem Kon]jugatkissen am nächsten liegen, Fibrinogen-bindende Moleküle in einer ausreichenden Menge, um ca. 1 mg bis ca. 1,5 mg Fibrinogen pro ml Blut zu binden, das auf das Blutprobenladekissen aufgebracht wird.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Detektionskissen einen Kontrollbereich, der den mindestens zwei Bereichen vorgeschaltet ist, wobei der Kontrollbereich immobilisierte Moleküle umfasst, die an die Fibrinogenbindenden Moleküle oder an Fibrinogen binden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die immobilisierten Moleküle, die an die Fibrinogen-bindenden Moleküle binden, Antikörper (z. B. Fibrinogen-bindende

Maus-Antikörper) oder funktionelle Fragmente davon.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Hämatokritwertes in einer Blutprobe und zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine Blutprobe mehr als 1.5 mg/ml Fibrinogen enthält, umfassend ein Bluttrennkissen oder ein erstes Probenladekissen, das dem Bluttrennkissen vorgeschaltet ist und in £fluidischer Verbindung mit diesem steht und ein zweites Blutprobenladekissen, wobei das zweite Blutprobenladekissen in fluidischer Verbindung mit einem KonJugatkissen, einem Nachweiskissen und einem Absorptionskissen in Serie steht, wobei das Kon]ugatkissen markierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfasst und das Detektionskissen mindestens zwei voneinander getrennte Bereiche umfasst, die daran immobilisierte Fibrinogenbindende Moleküle umfassen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Detektionskissen einen Kontrollbereich, der den mindestens zwei Bereichen vorgeschaltet ist, wobei der Kontrollbereich immobilisierte Moleküle umfasst, die an die Fibrinogen-bindenden Moleküle (z. B. ein Anti-Maus-Antikörper) oder Fibrinogen binden.

a) Aufbringen einer Blutprobe auf ein Bluttrennkissen oder ein erstes Probenladekissen, das dem Bluttrennkissen und einem zweiten Blutprobenladekissen der Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20 vorgeschaltet ist und mit diesen in fluidischer Verbindung steht, und

b) Bestimmung des Hämatokritwerts durch Vergleich des Verhältnisses der Laufstrecke der roten Blutkörperchen zur Gesamtlaufstrecke auf dem Bluttrennkissen mit einem Referenzverhältnis und/oder dem Vorhandensein von Fibrinogen in der Blutprobe.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zur Be-

stimmung eines Hämatokritwertes in einer Blutprobe und zur

Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine Blutprobe mehr als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält

Schritt c) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann mit einer Datenverarbeitungsvorrichtung durchgeführt werden. Die hier verwendete Datenverarbeitungsvorrichtung verwendet Daten, die beispielsweise von einer Kamera zur Bestimmung des Hämatokritwerts durch Vergleich des Verhältnisses der Laufstrecke der roten Blutkörperchen zur Gesamtlaufstrecke auf dem Bluttrennkissen mit einem Referenzverhältnis und/oder durch Bestimmung des Vorhandenseins von Fibrinogen in der Blutprobe, wenn markierte Fibrinogen-bindende Moleküle an mindestens einen der mindestens zwei Bereiche binden, und/oder des Vorhandenseins von mehr als 1,5 mg/ml Fibrinogen in der Blutprobe, wenn markierte Fibrinogen-bindende Moleküle an mindestens zwei der mindestens zwei Bereiche binden, gewonnen werden. Die Datenverarbeitungsvorrichtung führt ein Computerprogramm/Software zur Bestimmung dieser Werte aus, wie oben für die manuelle Bestimmung beschrieben.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Computerprogramm, das Anweisungen enthält, die, wenn das Programm von einem Computer ausgeführt wird, den Computer veranlassen, Schritt c) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung oder Schritt b) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung auszuführen.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher

erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

BEISPIEL

Materialien

Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), 40 nm Goldnanopartikel (AuNP), Boratpuffer (0,5 M, pH 9), Bovines Serumalbumin (BSA) und TWEEN® 20 sowie Saccharose wurden von Merck bezogen. 40 nm AuNP, modifiziert mit Streptavidin, wurden von Abcam bezogen. Cytiva stellte uns Whatman'“ Blutseparator LF1, Whatman’" Nitrocellulosemembranen Immunopore FP, Immunopore RP, AE99

und die Konjugatkissen Whatman’" Standard 14 (ST14), Standard 17

(ST17) und Fusion 5 (Fusion 5) zur Verfügung. Darüber hinaus stellte Pall die Vivid'" Plasmatrennmembranen GEF, GX und GR zur Verfügung. Das Klebeband ARflow 90469® wurde von Adhesive Research beschafft. Die monoklonalen Antikörper gegen menschliches Fibrinogen wurden entweder von Thermo Fisher Scientific Inc., Bio-Rad Laboratories, Inc. oder Absea Biotechnology Ltd. bezogen. Fibrinogen wurde von CSL Behring und STA® - QUALI-CLOT I von Stago beschafft.

Vorbereitung von Vollblutproben

Zur Gewinnung des Plasmas aus Vollblutproben wurde das Blut 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2500x g zentrifugiert. Danach wurde die Plasmafraktion gesammelt und ein zweiter Zentrifugationsschritt mit 2500x g für 10 Minuten durchgeführt. Das restliche Blut wurde in Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt und 15 Minuten lang bei 100x g zentrifugiert. Blutproben mit unterschiedlichen Hämatokritwerten wurden durch Kombination von Erythrozyten und reinem Plasma hergestellt. Zusätzlich wurden die Hämatokritwerte mit einem vom Ludwig Boltzmann Institut für Traumatologie zur Verfügung gestellten Zellzähler 0X-360 (Balio Diagnostics, Bidart) charakterisiert.

Charakterisierung des Detektionskissens

Es wurden drei Nitrocellulosemembranen (Immunopore FP, Immunopore RP, AE99) mit drei verschiedenen Breiten (5 x 30, 3 x 50, 2 x 75 mm) hergestellt. Die Membranstreifen wurden auf einem Klebeband (AR£low 90469°) immobilisiert. Zur Bestimmung des Durchflussprofils wurden 10 nl Puffer (HBSS) oder Plasma auf die Membran getropft und ein Video zur späteren Datenanalyse mit der Open-Source-Bildverarbeitungssoftware FIJI aufgezeichnet.

Für den Blockierungspuffer wurde Bovines Serumalbumin (0,1 und 1 w/v%) in PBS bzw. destilliertem Wasser aufgelöst. Membranstreifen von Immunopore RP mit einer Breite von 3 mm wurden 15 Minuten lang in die Blockierungslösung getaucht. Danach wurden die Streifen zweimal in PBS und Wasser gewaschen. Die Streifen wurden über Nacht getrocknet und dann auf ARflow 90469®° immobilisiert, bevor 10 ul HBSS hinzugefügt wurden. Es wurde ein Video aufgezeichnet und die Daten wurden mit FIJI analysiert.

Konjugation von Gold-Nanopartikeln mit Antikörpern

Für die Konjugation von 200 ul Gold-Nanopartikeln (OD1) wurden 8 ul 0,1M Boratpuffer mit pH 9 oder PBS mit pH 7,4 hinzugefügt. An-

schließend wurden 4 ul humaner monoklonaler Fibrinogen-Antikörper

mit einer Konzentration von 0,1, 0,5 oder 1 mg/ml hinzugefügt. Diese Mischung wurde 30 Minuten lang im ThermoMixer C (Eppendorf SE) bei 700 U/min inkubiert, gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation (1400 RCF). Der Überstand wurde verworfen und die Gold-Nanopartikel

Q

wurden in 0,1 % BSA (w/v) in PBS resuspendiert. Eine Probe der GoldNanopartikel wurde mit einer gleichen Menge von 10 % Natriumchlorid (NaCl) gemischt und die Absorption wurde gemessen (Spektrums-Scan mit einer Schrittweite von 5 nm).

Charakterisierung des Konjugatkissens

Drei verschiedene Kon]ugatkissen (ST14, ST17, Fusion 5) wurden mit einer Biopsiestanze (Durchmesser 3 mm) hergestellt. Für die Freisetzungsstudien wurden handelsübliche Goldnanopartikel verwendet, die mit Streptavidin kon]jugiert waren. Die Kon]ugate wurden zentrifugiert (1400 RCF, 10 min) und in PBST (PBS mit 0,05% TWEEN® 20) bzw. Boratpuffer (pH 9, 5 mM) mit 10% Saccharose resuspendiert, um eine optische Dichte von 5 (OD5) zu erreichen. Dann wurde Jedes Kissen mit 3 ul OD5-Konjugatlösung benetzt und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Am nächsten Tag wurde ein Teststreifen zusammengesetzt und die Freisetzung mit 10 ul HBSS eingeleitet. Die Bilder wurden vor und nach der Freisetzung der Konjugate aufgenommen (sobald die Kissen getrocknet waren). Die Intensität der Kissen wurde mit FIJI analysiert.

Charakterisierung des Probenkissens und PoC-Hämatokrit-Test

Vier Bluttrennkissen (GF, GX, GR - Vivid’ Plasmatrennmembran von Pall; LF1 - Whatman'" Blutseparator von Cytiva) mit einer Größe von 3 x 55 mm wurden mit einem Papierschneider (Novus Dahle GmbH) vorbereitet und die Streifen auf einem Klebeband, ARflow 90469®°, fixiert. Für die Blutaufnahmezeit wurden 20 ul Blut mit einer Pipette zugegeben und der Timer gestartet, nachdem die Pipette geleert wurde. Sobald kein überschüssiges Blut mehr sichtbar war, wurde der Timer gestoppt. Um die Plasmabildungsfähigkeit der verschiedenen Kissen zu bestimmen, wurden 20 vl Blut auf den Streifen aufgetragen und Bilder aufgenommen, sobald der Fluss stoppte. Für den PoC-Hämatokrit-Test wurden LF1-Streifen mit einer Größe von 3 x 30 mm auf einen klebenden ARflow 90469® aufgelegt. Um die Proben mit unterschiedlichen Hämatokritwerten zu testen, wurden 10 ul jeder Probe mit heparinisier-

ten Kapillaren (Servoprax GmbH) auf die LF1-Membran aufgetragen. Die

Länge der Erythrozytenfläche und des Plasmas wurden mit FIJI analysiert.

ELLISA

Eine hochbindende Mikroplatte (Greiner Bio-One International GmbH) wurde über Nacht mit 2 ug/ml Capture-Antikörper beschichtet und anschließend mit 1 % BSA blockiert. Eine Verdünnungsreihe von Fibrinogen wurde inkubiert, gefolgt von der Inkubation von 4 upg/ml biotinyliertem Detektionsantikörper. Dann wird Streptavidin-HRP inkubiert, um die Anwesenheit von Fibrinogen enzymatisch zu analysieren. HRP wandelt 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin um, und die Absorption wurde mit dem Plattenlesegerät EnSpire 2300 (Perkin Elmer Inc.) gemessen. Zwischen allen Inkubationsschritten wurden die Wells mehrfach gewaschen.

LFA-Vorbereitung und -Tests

Die Fibrinogen-Antikörper wurden mit dem AD1520" Aspirate Dispense System (BioDot, Inc.) auf die Nitrocellulosemembran aufgetragen. Danach wurde die Membran 1 Stunde lang bei 37 °C getrocknet, dann 15 Minuten lang in 1 % BSA blockiert und zweimal in PBST gewaschen. Schließlich wurde die Membran 1 Stunde lang bei 37 °C getrocknet und bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt. Für die LFA-Montage wurden Streifen mit einer Breite von 2,5 mm vorbereitet und auf einen Kleber gelegt. An einem Ende wurde das Konjugatkissen mit den gelagerten AuNP-Konjugaten und dem Probenkissen angebracht, am anderen Ende das Absorptionskissen. Für den Test wurden verschiedene Fibrinogenverdünnungen (2,5, 2, 1,5, 1, 0,5, 0,25 mg/ml) in PBS hergestellt und Referenzplasma (STA® - QUALI-CLOT I) mit einer bekannten Fibrinogenkonzentration von 2,475 mg/ml mit PBS verdünnt. Für den LFA wurden 10 vl Probe (Fibrinogenverdünnung oder Referenzplasma) in ein Eppendorf-Röhrchen mit 20 ul PBS gegeben und anschließend auf den LFA-Streifen aufgetragen. Für die quantitative Analyse wurden die LFA-Streifen mit einem Molecular Imager® ChemiDoc"* XRS System (Bio-Rad Laboratories, Inc.) und der Image Lab Software abgebildet. Die Linienintensität wurde mit FIJI analysiert.

Ergebnisse

Hämatokrit-Test

Das Material des Kissens wurde getestet, um die Fähigkeit des Kissens zu bestimmen, rote Blutkörperchen zurückzuhalten, was für

eine effiziente Fibrinogenmarkierung und -detektion entscheidend

ist. In einer vergleichenden Studie wurden ein Glasfaserseparator (LF1) und drei Polysulfonmembranen (GX, GF, GR) mit unterschiedli-

chem Hohlraumvolumen analysiert.

Kis- Material Dicke Zusätzliche Infor-

sen mationen

GE Polysulfon 330 um Leerraumvolumen: 1x Pro- . _

Cx Polysulfon 330 1m Bon Traum VOTnmeN 1 ben- 9X Kissen GR Polysulfon 330 1m Bon Traum VO nmen 2-

7 LF1 Gebundene 247 um (bei Glasfaser 53 kPa)

Die beiden Membrantypen unterscheiden sich in ihrem Trennmechanismus, da LF1 horizontal trennt, während GX, GF und GR vertikal trennen. Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung des verwendeten Verfahrens. 20 ul Blut werden zugegeben und die Plasmaextraktion wurde durch Messung der Laufstrecke des Plasmas untersucht. Neben der Bestimmung der Effizienz der Trennung wurde die ermittelte Laufstrecke des Plasmas genutzt, um die Kissengrößen entsprechend anzupassen. Im Vergleich der Polysulfonmembranen erzeugt GR das meiste Plasma und ist mit LF1 vergleichbar (Abbildung 1B).

Darüber hinaus beträgt die mit roten Blutkörperchen bedeckte Fläche 44 + 2,6% für LF1 und 46 + 2,5% für GR, was auf eine sehr effiziente Trennung hinweist, da der Hämatokrit der Blutprobe mit 41% bestimmt wurde.

Obwohl GR und LF1 in der Trennleistung vergleichbar sind, wurde der LF1 für die Hämatokritbestimmung verwendet, da er horizontal trennt und somit Blut und Plasma deutlich sichtbar ist, während der GR umgedreht werden muss, um den Abstand des Plasmas zu sehen. Zur Bestimmung des Hämatokrits wurde die gleiche Analysemethode wie bei der Hämatokritmessung mit Glaskapillaren angewandt, bei der die Kapillare mit Blut gefüllt und das Verhältnis der roten Blutkörperchen nach der Zentrifugation bestimmt wird. Beim vorliegenden PoC-Hämatokrit-Test wurde Blut in das Probenkissen gegeben, durch die Bluttrennmembran getrennt und das Verhältnis von roten Blutkörperchen (lese) und Gesamtlaufstrecke (lt:otaı) bestimmt, wie in Abbildung 1C dargestellt. Dieser Ansatz wurde durch die Messung von Proben mit

unterschiedlichem Hämatokrit und den Vergleich mit den von einem

Hämatologie-Analysegerät ermittelten Hämatokritwerten charakterisiert. Wie in Abbildung 1D zu sehen ist, ermöglicht die erhaltene lineare Korrelation eine genaue Bestimmung des Hämatokrits. Zur Validierung wurde Hämatokrit von 4 unbekannten Blutproben gemessen und mit den Ergebnissen verglichen, die mit einem Standardlaborverfahren erzielt wurden. Die ermittelte Genauigkeit lag bei 95 %.

Fibrinogen-Lateral-Flow-Assay

Assay-Design

Um den Test effizient und schnell mit einem Fingerpick durchführen zu können, wird ein Probenvolumen von 20 vl und eine Time-to-Result von 10 Minuten angestrebt. Die Nachweisgrenze sollte bei 1,5 mg/ml liegen, da niedrigere Fibrinogenkonzentrationen für die Patienten kritisch sind und eine sofortige Umstellung der Behandlung erfordern.

Im Allgemeinen bestehen LFAs aus vier verschiedenen Kissen, die unterschiedliche Funktionen erfüllen: (1) Probenkissen für den Probenauftrag und die Probenvorbereitung, (2) Konjugatkissen für die Lagerung von markierten Detektionsreagenzien, (3) Detektionskissen mit immobilisierten Auffang-Sonden für Test- und Kontrolllinie und (4) Absorptionskissen zum Aufsaugen überschüssiger Flüssigkeit. Daher wird für jedes Kissen ein Set Membranen entsprechend den Anforderungen der Probenmatrix ausgewählt. So wird beispielsweise für Blut eine Membran benötigt, die in der Lage ist, rote Blutkörperchen abzutrennen, sowie ein Detektionskissen, das für Plasma geeignet ist. Darüber hinaus wurden verschiedene Membranbreiten der Nitrocellulosemembran untersucht, da sie das Durchflussverhalten beeinflussen. Darüber hinaus muss das Assay-Format, Sandwich oder kompetitiv, ausgewählt werden. Ein Sandwich-Assay ist eher für große Moleküle wie Antikörper oder Proteine geeignet, während ein kompetitiver Assay für kleine Moleküle oder Peptide verwendet wird. Fibrinogen hat ein Molekulargewicht von 340 kDa, daher wird ein Sandwich-Assay bevorzugt.

Neben einem LFA zum Nachweis von Fibrinogen ist es vorteilhaft, eine Methode zur Bestimmung des Hämatokrits der Blutprobe zu integrieren. Wenn der Hämatokrit zusätzlich bestimmt wird, ist das Ergebnis des Fibrinogen-LFAs genauer. Außerdem gibt der Hämatokrit wertvolle Informationen über den Zustand des Patienten. Um die Anwend-

barkeit für den Endbenutzer zu gewährleisten, können der LFA und der

Hämatokrit-Test in ein und dieselbe Vorrichtung integriert werden. Das Blut wird aufgetragen, und nach Abschluss der Tests können die Ergebnisse mit einem PoC-Lesegerät (z. B. einem Smartphone) analysiert werden.

Auswahl von Detektionskissen und Durchflussmodulation in Nitrocellulosemembranen

Zur Immobilisierung von Fängersonden auf dem Detektionskissen wird meist eine Nitrocellulosemembran verwendet, da sie Proteine effizient bindet. Drei verschiedene Nitrocellulosemembranen, zwei mit einem Kunststoffrücken (RP und FP) und eine ohne Rückenbeschichtung (AE99), wurden mit Puffer und Plasma charakterisiert, indem die Auswirkungen von i) Membranzusammensetzung, ii) Geometrie und iii) BloCkierlösungen auf das Durchflussprofil untersucht wurden. Aliquote von 10 ul Probe wurden verwendet, um das ungefähre Plasmavolumen zu simulieren, das nach der Trennung der roten Blutkörperchen entsteht, wenn 20 ul Blutproben verwendet werden. Es ist wichtig zu beachten, dass in der aktuellen Versuchsanordnung eine hydrostatische Probenbelastung über einen Zeitraum von 5 Sekunden anstelle der Kapillarkräfte in der endgültigen LFA-Anordnung verwendet wird (Abbildung 2A). Die Ergebnisse der Durchflussstudie sind in den Abbildungen 2B und 2C dargestellt, wobei die Abstände der Durchflussfront alle 10 Sekunden visuell bestimmt werden. Während bei allen Nitrocellulosemembranen nichtlineare Durchflussraten beobachtet werden, die nach 60 Sekunden ein Plateau erreichen, sind die Durchflussraten bei der nicht beschichteten Membran AE99 höher. Ein direkter Vergleich der Durchflussraten zwischen Puffer- und Plasmaproben ergab, dass die Durchf£flussraten des Plasmas unabhängig von den verwendeten Membranen generell langsamer sind (Abbildung 2D), was auf die höhere Viskosität des Plasmas zurückzuführen ist. Die Plasmastrecke von AE99 ist im Vergleich zu RP und FP um das 1,6- bzw. 1,7-fache erhöht, wobei zu berücksichtigen ist, dass AE99 eine nicht beschichtete Membran ist und auf einem hydrophilen Klebstoff immobilisiert wurde, was die Durch£flussrate beeinflusst. RP zeigte die geringste Standardabweichung (Abbildung 2D; 17,9 +0,19 mm für RP im Vergleich zu 28,1 + 3,56 mm für AE99 und 16,4 + 0,68 mm für FP). Um ein tieferes Verständnis für andere Faktoren zu erlangen, die das Durchflussverhalten beeinflussen, wie z. B. die Geometrie, wurden die drei Nitrocel-

lulosemembranen mit einer Breite von 2, 3 bzw. 5 mm hergestellt. Die

Ergebnisse zeigen (Abbildung 2E), dass es eine lineare Korrelation zwischen Membranbreite und Durchflussrate gibt. Das bedeutet, dass bei kleinen Probenvolumina, wie z. B. bei Fingerpick-Anwendungen, eine gezielte Verringerung der Membranbreite zur Anpassung der Gesamtlänge der montierten Membranen innerhalb der LFA-Vorrichtung genutzt werden kann. Da schmalere Teststreifen auch ein schnelleres Durchflussprofil ermöglichen, wird die Interaktionszeit zwischen dem Analyten und dem Immunkonjugat verkürzt. Die Zugabe von Blockierungsmitteln wie Bovines Serumalbumin (BSA) wird üblicherweise zur Vorbehandlung der Membranen verwendet, um unspezifische Adsorption zu vermeiden. Die RP-Nitrocellulosemembran wurde in Lösungen mit ansteigenden BSA-Konzentrationen von 0% - 0,1% - 1 % getränkt, und die Laufstrecke nach 35 Sekunden wurden aufgezeichnet. Abbildung 2F zeigt, dass die Blockierung die Geschwindigkeit des Durchflusses um 35 % bzw. 43 % für 0,1 % und 1 % BSA in Wasser verringert. In PBS gelöstes BSA hingegen verringert die Durchflussraten noch stärker (59 % und 64 % für 0,1 % und 1 % BSA), was darauf hindeutet, dass das Salz eine zusätzliche blockierende Wirkung hat. Dies weist darauf hin, dass die Vorbehandlung der Membran nicht nur zur Verringerung der unspezifischen Adsorption eingesetzt werden kann, sondern auch eine Möglichkeit darstellt, das Durchflussprofil zu modulieren.

Kon]ugation von Goldnanopartikeln und Freisetzung des Konj]ugatkissens

Goldnanopartikel (AuNP) werden häufig in LFAs für ein optisches Readout verwendet und müssen zuvor mit Detektionsantikörpern modifiziert werden. AuNP-Aggregate führen in Gegenwart einer hohen Salzkonzentration zu einer Farbverschiebung von rot nach blau. Wenn jedoch Antikörper oder Proteine an den Goldnanopartikeln adsorbiert sind, ist eine Aggregation nicht mehr möglich. Daher wurden die Absorptionsspektren von bloßen (blaue Spur) und mit Fibrinogen-Antikörpern versehenen (rote Spur) 40 nm großen AuNP in Gegenwart von Natriumchlorid aufgezeichnet, wobei die nicht aggregierten Nanopartikel ein Absorptionsmaximum bei 530 nm aufwiesen (siehe Abbildung 3B). Da sich die Konjugationseffizienz verbessert, wenn der pH-Wert nahe oder leicht oberhalb des isoelektrischen Punkts des Proteins liegt, wurden verschiedene pH-Werte getestet. Hier wurden pH 7,4 (PBS) und pH 9 (Boratpuffer) verglichen, und es scheint, dass mit pH

9 stabilere Konjugate erzielt werden können (Abbildung 3C).

Die Materialien der Konj]jugatkissen wurden hinsichtlich der effizienten Freisetzung der AuNP-Konjugate verglichen, sobald die Probe in das Kissen eintritt. Insgesamt wurden zwei Glasfaserkissen (ST14 und ST17) und das firmeneigene Material Fusion 5 (F5) mit handelsüblichen Goldnanopartikel-Streptavidin-Konjugaten als kostengünstiges Modellkonjugat getestet. Dazu wurden die Kon]ugate im Kon]ugatkissen getrocknet und anschließend die Intensität des Konjugatkissens vor und nach der Freisetzung analysiert (Abbildung 3D). Darüber hinaus wurden Boratpuffer (BB) und PBS mit TWEEN® 20 (PBST) verglichen, die beide mit 10 % Saccharose angereichert waren, da Kohlenhydrate hinzugefügt werden, um die Stabilität der Antikörper und die effiziente Freisetzung der Konj]jugate zu erhöhen. Wie in Abbildung 3E dargestellt, wurde der größte Intensitätsunterschied (vor und nach der Freisetzung) für ST17 beobachtet, und PBST setzt die Konjugate in allen Fällen deutlich besser frei als der Boratpuffer (1,4-fach h6öhere Freisetzung für ST17).

Fibrinogen LFA-Entwicklung

Geeignete Antikörperpaare für den Sandwich-Assay wurden mittels ELISA getestet. Es wurden zwei verschiedene Fänger-Antikörper mit einem biotinylierten Detektionsantikörper getestet. Wie in Abb. 4A dargestellt, lieferten beide getesteten Antikörperpaare gute Ergebnisse, wobei AB05-1F11 zu etwas höheren Absorptionswerten führte. Bei der Übertragung des Assays auf den LFA wurde festgestellt, dass die Blockierung der Membran von Vorteil ist, da Fibrinogen an die Membran binden kann und AuNP unmittelbar nach der Freisetzung aus dem Kon]jugatkissen eingefangen werden kann. Die Blockierung der Membran verringerte jedoch die Durchflussrate, und aufgrund des hohen Fibrinogengehalts verstopfte die Membran bei hoher Fibrinogenkonzentration. Daher wurde die Probe vor dem Auftragen der Probe dreifach verdünnt, um die Proteinkonzentration zu senken und einen ordnungsgemäßen Flüssigkeitsstrom zu gewährleisten. Darüber hinaus wurden bei hohen Fibrinogenkonzentrationen geringere Bandenintensitäten beobachtet (Abb. 4B), doch wenn Probe und Konjugat getrennt zugegeben wurden, erschien die Linie. Dies deutet darauf hin, dass aufgrund der hohen Fibrinogenkonzentration sowohl die freigesetzten AuNP-Konjugate als auch der immobilisierte Capture-Antikörper mit Fibrinogen gesättigt sind. Es scheint, dass Fibrinogen ohne Konjugat

schneller wandert als das Konj]jugat und somit den Capture-Antikörper

sättigt. Diese Hypothese wird durch die Tatsache gestützt, dass die Intensität der Linie von der Position der Linie abhängt. Linien, die sich in der Nähe des Konj]jugatkissens befinden, weisen eine höhere Intensität auf als Linien, die weiter nachgeschaltet liegen. Daher wurden zwei identische Linien in den LFA integriert, um eine Linie in der Nähe des Kon]ugatkissens zu beobachten, wenn Fibrinogen vorhanden ist, und die zweite Linie zur Bestimmung der Fibrinogenkonzentration aufgrund der konzentrationsabhängigen Abnahme der Linienintensität zu verwenden. Zunächst wurde der LFA mit verschiedenen Fibrinogenverdünnungen getestet. Wie in Abbildung 4C dargestellt, lagen die Fibrinogenkonzentrationen von 0,25 und 0,5 mg/ml unter dem festgelegten Schwellenwert von 1,5 mg/ml, während 1 mg/ml noch im Bereich des Schwellenwertes lag. Da eine Zunahme der Matrixkomplexität zu einer Veränderung der Signalintensität führt, wurde der LFA mit Referenzplasma validiert, das eine bekannte Fibrinogenkonzentration von 2,5 mg/ml aufweist. Es wurde festgestellt, dass 0,25, 0,5 und 1 mg/ml Fibrinogen unter dem Schwellenwert liegen, was die Anwendbarkeit des entwickelten LFA belegt. Somit kann der entwickelte LFA zur Bestimmung von Fibrinogenkonzentrationen unterhalb eines festgelegten Schwellenwerts von 1,5 mg/ml mittels Bildgebung und Datenanalyse verwendet werden, was in einem nächsten Schritt in eine

Anwendung für ein PoC-Lesegerät integriert werden sollte.

ANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Bestimmung des Hämatokritwertes in einer Blutprobe, das die folgenden Schritte umfasst a) Bereitstellung einer Lateral-Flow-Vorrichtung mit einem Bluttrennkissen, b) Aufbringen einer Blutprobe auf das Bluttrennkissen der Lateral-Flow-Vorrichtung, und c) Bestimmung des Hämatokritwerts durch Vergleich des Verhältnisses der Laufstrecke der roten Blutkörperchen zur Gesamtlaufstrecke auf dem Bluttrennkissen mit einem Referenzver-

hältnis.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bluttrennkissen ein poröses Material, vorzugsweise ein faseriges Material und/oder ein thermo-

plastisches Material, umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Fasermaterial ein Glasfasermaterial, vorzugsweise eine gebundene Glasfaser, ist und/oder das

thermoplastische Material Polysulfon ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das poröse Material ein Hohlraumvolumen von 1x bis 3x, vorzugsweise 1x bis 2,5x, noch bevor-

zugter 1,5x bis 2,5x, noch bevorzugter 2x bis 2,5x aufweist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Bluttrennkissen eine Dicke von 25 bis 300 um, vorzugsweise von 50 bis 250 um,

aufweist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Bluttrennkissen eine Länge von 1 bis 100 mm, vorzugsweise von 2 bis 80 mm, noch bevorzugter von 3 bis 60 mm, noch bevorzugter von 3 bis 55 mm

aufweist. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Bluttrenn-

kissen ein Antikoagulans enthält und/oder die Blutprobe vor Schritt

b) mit einem Antikoagulans behandelt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Antikoagulans ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA),

einem Citrat, Heparin, Hirudin und einem direkten Thrombininhibitor.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei 5 bis 100 ul, vorzugsweise 5 bis 80 ul, noch bevorzugter 10 bis 50 ul, noch bevorzugter 15 bis 30 ul der Blutprobe auf das Bluttrennkissen oder ein dem Bluttrennkissen vorgeschaltetes und mit diesem in fluidischer

Verbindung stehendes Probenladekissen aufgebracht werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die LateralFlow-Vorrichtung weiters ein optionales Blutprobenladekissen um-

fasst, das in fluidischer Verbindung mit einem optionalen Kon]ugatkissen und einem Detektionskissen in Serie steht, um Fibrinogen in der Blutprobe zu bestimmen und/oder festzustellen, ob die Blutprobe mehr oder weniger als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält, wobei ein Teil

der Blutprobe auf das optionale Probenladekissen aufgebracht wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Kon]ugatkissen markierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfasst und das Detektionskissen mindestens zwei voneinander getrennte Bereiche mit daran immobilisier-

ten Fibrinogen-bindenden Molekülen umfasst.

12. Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine Blutprobe mehr oder weniger als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält, umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer Lateral-Flow-Vorrichtung, die ein Blutprobenladekissen, das mit einem optionalen Konjugatkissen fluidisch verbunden ist, ein Detektionskissen und ein Absorptionskissen in Serie umfasst, wobei das Kon]ugatkissen markierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfasst und das Detektionskissen mindestens zwei voneinander getrennte Bereiche umfasst, die daran immobilisierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfassen, b) Auftragen einer Blutprobe auf das Blutprobenladekissen der Lateral-Flow-Vorrichtung, und c) Bestimmung des Vorhandenseins von Fibrinogen in der Blut-

probe, wenn markierte Fibrinogen-bindende Moleküle an

mindestens einen der mindestens zwei Bereiche binden und/oder des Vorhandenseins von mehr als 1,5 mg/ml Fibrinogen in der Blutprobe, wenn markierte Fibrinogen-bindende Moleküle an mindestens zwei der mindestens zwei Bereiche bin-

den.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Blutprobe Fibrinogen-bindende Moleküle zugesetzt werden, bevor die Probe auf das Probenlade-

kissen aufgebracht wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei es sich bei den Fibrinogen-bindenden Molekülen um Antikörper oder funktionelle Fragmente

davon oder um Apatmere handelt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die Fibrinogen-bindenden Moleküle des Konjugatkissens mit Gold-Nanopartikeln, farbigen Latexkügelchen, Kohlenstoff-Nanopartikeln, Selen-Nanopartikeln, Silber-Nanopartikeln, Quantenpunkten, organischen Fluorophoren, Polystyrol- oder Poly (methylmethacrylat)-Partikeln (PMMA), radioaktiven Markierungen oder Chemilumineszenz-Markierungen markiert

sind.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die Bereiche der mindestens zwei Bereiche, die dem Kon]ugationskissen am nächsten liegen, Fibrinogen-bindende Moleküle in einer ausreichenden Menge umfassen, um ca. 1 mg bis ca. 1,5 mg Fibrinogen pro ml Blut zu bin-

den, das auf das Blutprobenladekissen aufgebracht wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei das Detektionskissen einen Kontrollbereich umfasst, der den mindestens zwei Bereichen vorgeschaltet ist, wobei der Kontrollbereich immobilisierte

Moleküle umfasst, die an die Fibrinogen-bindenden Moleküle oder Fib-

rinogen binden. 18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die immobilisierten Moleküle,

die an die Fibrinogen-bindenden Moleküle binden, Antikörper oder

funktionelle Fragmente davon sind.

19. Vorrichtung zur Bestimmung eines Hämatokritwertes in einer Blutprobe und zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine Blutprobe mehr als 1.5 mg/ml Fibrinogen enthält, umfassend ein Bluttrennkissen oder ein erstes Probenladekissen, das dem Bluttrennkissen vorgeschaltet und in fluidischer Verbindung mit diesem ist, und ein zweites Blutprobenladekissen, wobei das zweite Blutprobenladekissen in fluidischer Verbindung mit einem Konj]ugatkissen, einem Detektionskissen und einem Absorptionskissen in Serie steht, wobei das Konjugatkissen markierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfasst und das Detektionskissen mindestens zwei voneinander getrennte Bereiche umfasst, die daran immobilisierte Fibrinogen-bindende Mole-

küle umfassen.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei das Detektionskissen einen Kontrollbereich umfasst, der den mindestens zwei Bereichen vorgeschaltet ist, wobei der Kontrollbereich immobilisierte Moleküle um-

fasst, die an die Fibrinogen-bindenden Moleküle binden.

21. Verfahren zur Bestimmung eines Hämatokritwertes in einer Blutprobe und zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine Blutprobe mehr als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält, umfassend den Schritt a) Aufbringen einer Blutprobe auf ein Bluttrennkissen oder ein erstes Probenladekissen, das dem Bluttrennkissen vorgeschaltet und mit diesem fluidisch verbunden ist, und einem zweiten Blutprobenladekissen der Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20, und b) Bestimmung des Hämatokritwerts durch Vergleich des Verhältnisses der Laufstrecke der roten Blutkörperchen zur Gesamtlaufstrecke auf dem Bluttrennkissen mit einem Referenzverhältnis und/oder dem Vorhandensein von Fibrinogen in der

Blutprobe.

22. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20 zur Bestimmung eines Hämatokritwertes in einer Blutprobe und zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine Blutprobe

mehr als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält

23. Datenverarbeitungsvorrichtung mit Mitteln zur Durchführung von Schritt c) des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 12 oder von Schritt

b) des Verfahrens nach Anspruch 21.

24. Computerprogramm mit Anweisungen, die, wenn das Programm von einem Computer ausgeführt wird, den Computer veranlassen, Schritt c) des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 12 oder Schritt b) des Verfah-

rens nach Anspruch 21 auszuführen.

Claims

ANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Bestimmung des Hämatokritwertes in einer Blutprobe umfassend die Schritte a) Bereitstellung einer Lateral-Flow-Vorrichtung mit einem Bluttrennkissen, b) Aufbringen einer Blutprobe auf das Bluttrennkissen der Lateral-Flow-Vorrichtung, und Cc) Bestimmung des Hämatokritwerts durch Vergleich des Verhältnisses der Laufstrecke der roten Blutkörperchen zur Gesamtlaufstrecke auf dem Bluttrennkissen mit einem

Referenzverhältnis.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bluttrennkissen ein poröses Material, vorzugsweise ein faseriges Material und/oder

ein thermoplastisches Material, umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Fasermaterial ein Glasfasermaterial, vorzugsweise eine gebundene Glasfaser, ist

und/oder das thermoplastische Material Polysulfon ist.

4, Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das poröse Material ein Hohlraumvolumen von 1x bis 3x, vorzugsweise 1x bis 2,5x, noch bevorzugter 1,5x bis 2,5x, noch bevorzugter 2x bis 2,5x%

aufweist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Bluttrennkissen eine Dicke von 25 bis 300 um, vorzugsweise von

50 bis 250 um, aufweist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Bluttrennkissen eine Länge von 1 bis 100 mm, vorzugsweise von 2 bis 80 mm, noch bevorzugter von 3 bis 60 mm, noch

bevorzugter von 3 bis 55 mm aufweist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Bluttrennkissen ein Antikoagulans enthält und/oder die Blutprobe vor Schritt b) mit einem Antikoagulans behandelt

wird.

34/36 ZULETZT VORGELEGTE ANSPRÜCHE

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Antikoagulans ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), einem Citrat, Heparin,

Hirudin und einem direkten Thrombininhibitor.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei 5 bis 100 ul, vorzugsweise 5 bis 80 ul, noch bevorzugter 10 bis 50 ul, noch bevorzugter 15 bis 30 ul der Blutprobe auf das Bluttrennkissen oder ein dem Bluttrennkissen vorgeschaltetes und mit diesem in £fluidischer Verbindung stehendes

Probenladekissen aufgebracht werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Lateral-Flow-Vorrichtung weiters ein optionales Blutprobenladekissen umfasst, das in £fluidischer Verbindung mit einem optionalen Konjugatkissen und einem Detektionskissen in Serie steht, um Fibrinogen in der Blutprobe zu bestimmen und/oder festzustellen, ob die Blutprobe mehr oder weniger als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält, wobei ein Teil der Blutprobe auf

das optionale Probenladekissen aufgebracht wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Kon]ugatkissen markierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfasst und das Detektionskissen mindestens zwei voneinander getrennte Bereiche mit daran immobilisierten Fibrinogen-bindenden

Molekülen umfasst.

12. Vorrichtung zur Bestimmung eines Hämatokritwertes in einer Blutprobe und zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine Blutprobe mehr als 1.5 mg/ml Fibrinogen enthält, umfassend ein Bluttrennkissen oder ein erstes Probenladekissen, das dem Bluttrennkissen vorgeschaltet und in fluidischer Verbindung mit diesem ist, und ein zweites Blutprobenladekissen, wobei das zweite Blutprobenladekissen in fluidischer Verbindung mit einem Kon]ugatkissen, einem Detektionskissen und einem Absorptionskissen in Serie steht, wobei das Konjugatkissen markierte Fibrinogen-bindende

Moleküle umfasst und das Detektionskissen mindestens zwei

35/36 ZULETZT VORGELEGTE ANSPRÜCHE

voneinander getrennte Bereiche umfasst, die daran

immobilisierte Fibrinogen-bindende Moleküle umfassen.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das Detektionskissen einen Kontrollbereich umfasst, der den mindestens zwei Bereichen vorgeschaltet ist, wobei der Kontrollbereich immobilisierte Moleküle umfasst, die an die Fibrinogen-

bindenden Moleküle binden.

14. Verfahren zur Bestimmung eines Hämatokritwertes in einer Blutprobe und zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine Blutprobe mehr als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält, umfassend den Schritt a) Aufbringen einer Blutprobe auf ein Bluttrennkissen oder ein erstes Probenladekissen, das dem Bluttrennkissen vorgeschaltet und mit diesem fluidisch verbunden ist, und einem zweiten Blutprobenladekissen der Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, und b) Bestimmung des Hämatokritwerts durch Vergleich des Verhältnisses der Laufstrecke der roten Blutkörperchen zur Gesamtlaufstrecke auf dem Bluttrennkissen mit einem Referenzverhältnis und/oder dem Vorhandensein von

Fibrinogen in der Blutprobe.

15. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13 zur Bestimmung eines Hämatokritwertes in einer Blutprobe und zur Bestimmung von Fibrinogen in einer Blutprobe und/oder ob eine

Blutprobe mehr als 1,5 mg/ml Fibrinogen enthält

16. Datenverarbeitungsvorrichtung mit Mitteln zur Durchführung von Schritt c) des Verfahrens nach Anspruch 1 oder von Schritt

b) des Verfahrens nach Anspruch 14.

17. Computerprogramm mit Anweisungen, die, wenn das Programm von einem Computer ausgeführt wird, den Computer veranlassen, Schritt c) des Verfahrens nach Anspruch 1 oder Schritt b) des

Verfahrens nach Anspruch 14 auszuführen.

36/36 ZULETZT VORGELEGTE ANSPRÜCHE