NL2001377C2 - Werkwijze voor het isoleren van siaalzuur bevattende oligosachariden, alsmede de hiermee verkrijgbare siaalzuur bevattende oligosachariden bevatttende samenstellingen. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze voor het isoleren van siaalzuur bevattende oligosachariden, alsmede de hiermee verkrijgbare siaalzuur bevattende oligosachariden bevattende samenstellingen MAS/P83078NL00

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het isoleren van oligosachariden die een van siaalzuur afgeleid substituent bevatten, (hierna: siaalzuurbevattende oligosachariden) en bij voorkeur van sialyllactose houdende samenstellingen en met name dergelijke 5 samenstellingen waarin de verhouding tussen siaalzuur bevattende oligosachariden en fosfor, en bij voorkeur de verhouding tussen sialyllactose en fosfor, relatief hoog is. Daarnaast heeft de uitvinding betrekking op de verkrijgbare en verkregen samenstellingen en de toepassing van die samenstellingen, in met name kindervoedingen.

10 Sialyllactose is een melk-oligosacharide dat in melk van zoogdieren voorkomt. Het is bekend dat de concentratie van dit melk-oligosacharide in bijvoorbeeld koemelk erg laag is; in humane melk komt het sialyllactose in concentraties voor die in absolute zin aanzienlijk hoger zijn.

Sialyllactose heeft een aantal belangrijke functionaliteiten. Zo is 15 bekend dat het een prebiotische activiteit bezit en er zijn bifïdogene effecten beschreven. Daarnaast is het sialyllactose een anti-adhesief, waardoor het een belangrijke rol kan spelen in het remmen dan wel voorkomen van darminfecties door pathogene bacteriën en/of virussen en/of vrijkomende toxinen te binden waardoor kolonisatie enerzijds en het effect van de 20 toxinen anderzijds kan worden voorkomen. Ook is beschreven dat sialyllactose de hersengroei bij zuigelingen kan bevorderen.

Ook aan andere siaalzuurbevattende oligosachariden worden dergelijke positieve effecten toe geschreven.

Omdat er in de regel naar gestreefd wordt zuigelingen-, baby- en 25 kindervoedingen zoveel mogelijk op humane melk te laten lijken, is er een 2 behoefte (met name bij infant milk formulators) om dergelijke voedingen met siaalzuurbevattende oligosachariden en bij voorkeur met sialyllactose te verrijken. Dit is ook één van de doelstellingen van de onderhavige uitvinding.

5 Om siaalzuurbevattende oligosachariden in het algemeen en sialyllactose in het bijzonder te verkrijgen zijn er al verschillende werkwijzen in de stand der techniek voorgesteld. Een groot aantal van die werkwijzen richten zich op het enzymatisch bereiden van sialylgroep bevattende verbindingen zoals sialyllactose, en met name onder toepassing 10 van enzymen verkregen uit genetisch gemodificeerde organismen, waarbij met bijvoorbeeld een sialidase, sialyltransferase en/of neuraminidase de gewenste sialylgroep bevattende oligosachariden kunnen worden gevormd en die vervolgens via downstream processing kunnen worden geïsoleerd.

Daarnaast is er een aantal werkwijzen bekend, waarbij siaalzuur 15 en sialyllactose uit melk worden geïsoleerd middels combinaties van chromatografische technieken en/of membraanfiltratietechnieken.

Een belangrijk nadeel van de bestaande methoden voor het winnen van sialyl oligosachariden en siaalzuur is dat deze de gewenste verbindingen in relatief lage gehalten c.q. concentraties geven, terwijl 20 bovendien bij deze methoden een hoog fosforgehalte in de sialyl- oligosacharide-samenstelling aanwezig is. Er zijn publicaties bekend waarin is beschreven dat voedingsmiddelen die in hoge mate gefosforyliseerd zijn, slecht, althans minder goed verteerd worden, een ongunstige invloed kunnen hebben op de calcium- en ijzerabsorptie in het systeem, en in het 25 algemeen met divalente kationen complexeren die voor gebruikelijke fysiologische processen in het maag-darmkanaal nodig zijn, terwijl bovendien de werking van bepaalde enzymen in het maag-darmkanaal kan worden geremd. Met name bij zuigelingen en kindervoeding kan dit tot problemen leiden.

3

In een infant milk formula wordt de hoeveelheid fosfor met name bepaald door de eiwittoevoegingen. Extra fosfortoevoegingen door andere ingrediënten worden niet aanbevolen en zelfs afgeraden. Mede daarom wordt beoogd siaalzuur bevattende oligosacharide samenstellingen en in het 5 bijzonder siallyllactose bevattende samenstellingen te verschaffen waarin de ratio tussen sialylgroepen en fosfor zo hoog als mogelijk is.

Een doel van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is te voorzien in een werkwijze waarbij scheidingstechnieken worden toegepast die leiden tot een product met relatief weinig fosforverbindingen in relatie 10 tot de siaalzuur bevattende oligosacharide. Dit maakt het product zeer geschikt om te worden toegepast in kindervoedingen.

Een dergelijke werkwijze wordt ook beschreven in US-B1-6,623,954. Hierin wordt een werkwijze beschreven waarin een zuivelstroom die lactose en sialyloligosachariden bevat in aanraking wordt gebracht met 15 fytase en een β-galactosidase, waarna de zuivelstroom wordt onderworpen aan nanofiltratie en/of ultrafiltratie, waarbij het gewenste sialyllactose in de peptidefractie achterblijft; na een denaturatiestap en een daarop volgende microfiltratie wordt een sialyllactosefractie verkregen. Eventueel kan voor de stap waarin de zuivelstroom in contact wordt gebracht met de enzymen, 20 een stap worden uitgevoerd waarin de positief geladen materialen verwijderd worden, bijvoorbeeld met een kationenwisselaar of met omgekeerde osmose.

Een belangrijk nadeel van deze werkwijze is dat er als gevolg van de gebruikte membranen een belangrijk deel van het sialyloligosachariden 25 inclusief siallyllactose niet gewonnen kan worden en dat het lang kan duren voordat er een product wordt verkregen dat voldoet aan een lage verhouding fosfor tot sialyloligosachariden.

De onderhavige uitvinding wordt uitgevoerd zonder dat het nodig is om enzymen toe te passen om een laag fosforgehalte te krijgen. Verder 4 maakt de uitvinding het mogelijk sialyloligosachariden te winnen met een hoge mate van efficiëntie (hoge opbrengst) en selectiviteit (hoge zuiverheid).

Daartoe betreft de uitvinding in een eerste aspect een werkwijze voor het isoleren van sialyllactose uit een ontvette, en bij voorkeur eiwit-5 vrije, melkstroom, waarbij de melkstroom aan een anionenwisselingsstap wordt onderworpen onder toepassing van een anionenwisselingshars, bij voorkeur in de vrije base vorm. De hars wordt verder gekarakteriseerd door een vochtgehalte van 30-48%. In de volgende stap wordt het sialyllactose gebonden aan een anionenwisselingshars, bij voorkeur van het 10 macroporeuze of geltype. De macroporeuze of geltype anionenwisselingshars heeft bij voorkeur een vochtgehalte hoger dan 45% en het liefst tussen 50 en 70%.

Het eerste type anionenwisselingshars, gekarakteriseerd door het vochtgehalte van 30-48%, is bij voorkeur een geltype anionwisselaar die de 15 melkstroom ontzout, doch zonder daarbij de sialylgroep bevattende oügosachariden en in het bijzonder het sialyllactose, welke oligosachariden eveneens in zoutvorm voorliggen, te binden. In andere woorden betreft het hier een anionenwisselingshars die wel selectiviteit heeft voor negatief geladen mineralen, doch niet voor sialyllactose. Daartoe is het noodzakelijk 20 dat het vochtgehalte, oftewel het watergehalte, niet groter is dan 48%, en liever niet groter is dan 45%. Bij vochtgehalten lager dan 35% en meer nog bij vochtgehalten lager dan 30%, begint de ontzoutingscapaciteit te laag te worden om een effectief proces te geven.

Het vochtgehalte in de anionenwisselaar wordt bepaald op de 25 volgende wijze: voor de meting van het vochtgehalte van de hars wordt aanhangend water verwijderd bijvoorbeeld door de hars in een doek te wikkelen en vervolgens aan centrifugeren te onderwerpen (centrifuge: 30 cm diameter; 3000 rpm); de hars wordt vervolgens gewogen, bijvoorbeeld in een weegfles; waarna de hars gedurende 4 uur gedroogd wordt bij een constante 30 temperatuur van 105°C; de hars wordt vervolgens afgekoeld in een 5 exsiccator gedurende 30 minuten; waarna wederom het gewicht van de droge hars wordt bepaald; het vochtpercentage (gew.%) = [(gewichtsverlies na drogen (g)) / (gewicht van de natte hars)] * 100%.

Door deze ontzouting wordt een belangrijk deel van de negatief 5 geladen ionen verwijderd zonder dat daarbij substantiële hoeveelheden sialyllactose (ondanks de negatieve lading) worden verwijderd.

Genoemde anionenwisselingshars is bij voorkeur en gebruikelijk in de vrije base-vorm (hydroxidevorm) omdat aldus een zo groot mogelijk ontzoutend vermogen ontstaat. Geschikte anionenwisselingsharsen zijn 10 sterk gecross-linkte polystyreen-divinylbenzeen gelen, zoals Diaion SA20A, Diaion WA20A (ex Mitsubishi).

De uitvinders hebben gevonden dat het vochtgehalte van de anionenwisselingshars die gebruikt wordt voor de ontzouting van belang is voor enerzijds het verwijderen van as (negatief geladen mineralen) en 15 anderzijds het niet binden van sialyllactose (SL). Hierbij zijn een groot aantal harsen onder geconditioneerde omstandigheden getest.

Leverancier Hars Watergehalte (%) SL-recovery

Mitsubishi DIAION SA10A 43-47 80

Mitsubishi DIAION SA20A 38-44 97

Applexion XA4013 50-60 70

Applexion XA4023 40-48 95

Applexion XA3112 56-64 40 DOW Dowex 1-X8 43-48 74 DOW Marathon A2 50-60 70 6

Bij deze bepalingen waren de geconditioneerde omstandigheden als volgt:

Er wordt een opstelling gemaakt bestaande uit twee kolommen. De eerste kolom bevat 15 ml Marathon C hars (ex Dow; kationenwisselaar H+-5 vorm) de tweede kolom bevat de te onderzoeken anionenwisselaar in de hydroxide vorm. De kolommen worden getest door onthard NF-concentraat (zie ook voorbeeld 1) over te leiden met een snelheid van 0,5 ml/minuut. Nadat ongeveer 5 bedvolume opgebracht zijn, kan de recovery van SL bepaald worden. De relatie tussen het vochtgehalte en de verkregen SL-10 recovery wordt verder weergegeven in figuur 1.

Om tijdens dit proces geen verlies aan sialyllactose te verkrijgen, ligt de pH van het verkregen product bij voorkeur tussen pH=3 en pH=9. Om dit te bewerkstelligen worden in een voorkeursuitvoeringsvorm ook met een kationenwisselingshars de aanwezige kationen (met name natrium en 15 kalium) verwijderd. De kationenwisselingshars bevindt zich in de H+- vorm. In een voorkeursconfiguratie worden eerst de kationen verwijderd en daarna de anionen.

Na de ontzoutingsstap wordt de gedemineraliseerde melkstroom in aanraking gebracht met bij voorkeur een macroporeuze of geltype 20 anionenwisselingshars, die in staat is sialyllactose in te vangen en te binden. Theoretisch kan sialyllactose aan iedere anionenuitwisselingshars worden gebonden, omdat de minerale zouten thans verwijderd zijn. Om de effectiviteit te vergroten is bij voorkeur het vochtgehalte van de macroporeuze of geltype anionwisselingshars groter dan 45% en liever ligt 25 deze tussen 50 en 70%. In dergelijke harsen zijn grotere poriën aanwezig dan in de anionenwisselaar die in de voorafgaande stap gebruikt wordt. Het sialyllactose laat zich met een klein volume van een keukenzout- of andere zoutoplossing, bij voorkeur een zure zoutoplossing, eenvoudig van de anionenwisselingshars elueren.

7

Het verkregen eluaat wordt bij voorkeur met behulp van verdund zuur, bijvoorbeeld zoutzuur, geneutraliseerd naar een pH die ligt tussen pH=3 en pH=9. Bij voorkeur is de pH van het eindproduct pH=6,5.

Voorbeelden van geschikte anionenwisselaars voor het binden van 5 sialyllactose zijn: DIAION SA21A watergehalte: 55-65%; DIAION HPA25 58-68%; DIAION WA10 63-69%; DOWEX1X4 55-63%; 10 DOWEX Marathon A 60-72%.

Om sialyllactose te adsorberen dienen de harsen zich bij voorkeur in de vrije-base vorm te bevinden. De temperatuur van de anionenwisselingsstap is bij voorkeur lager dan 20°C en liever lager dan 15 10°C.

Na de elutie van sialyllactose van de anionenwisselingshars kan een product worden verkregen met een sialyllactose gehalte van meer dan 4 gew.%, liever meer dan 5 gew.%, liefst meer dan 8 gew.%, bijvoorbeeld ongeveer 10%, betrokken op de droge stof. Overigens kan het gehalte 20 sialyllactose betrokken op de droge stof onder toepassing van gebruikelijke technieken, zoals bijvoorbeeld nanofiltratie, verder worden verhoogd. In het algemeen varieert het sialyllactosegehalte van het product verkregen volgens de werkwijze van de uitvinding tussen 8 en 15%, hoewel het nog steeds mogelijk is nog hogere concentraties te bereiken. Eén methode om tot 25 nog hogere concentraties te komen is om meer lactose van de anionenwisselingshars weg te spoelen. Dit kan worden bewerkstelligd door het spoelen van de kolom met water, voorafgaand aan de elutie met zout, te verlengen.

De met de anionenuitwisselingshars te behandelen melkstroom 30 bevat geen vet, althans minder dan 0,5, liever minder dan 0,2 en liefst 8 minder dan 0,1 gew.% vet. Bij zeer grote voorkeur is deze melkfractie vrij van eiwit. Met name is het van voordeel uit te gaan van een weistroom en liever nog van een weipermeaat. Overigens is het niet kritisch van welk zoogdier de melk afkomstig is en kunnen goede resultaten worden 5 verkregen wanneer wordt uitgegaan van koemelk, schapenmelk, geitenmelk, kamelenmelk of paardenmelk.

De melkstroom, en liever de weistroom, en het liefst de weipermeaatstroom, wordt, alvorens deze aan een van beide anionenwisselingsstappen wordt onderworpen, in een 10 voorkeursuitvoeringsvorm onthard. In deze onthardingsstap worden meerwaardige ionen, bijvoorbeeld calciumionen en fosfaationen, uit de melkstroom verwijderd. Dit kan bijvoorbeeld plaatshebben door de betreffende ionen neer te slaan; ofwel door deze ionen uit te wisselen met bijvoorbeeld natrium- en chloride-ionen door ionwisselingsstappen. Deze 15 uitvoeringsvorm wordt hieronder in voorbeeld 1 geïllustreerd.

In een verdere voorkeursuitvoeringsvorm betreft de uitvinding een werkwijze, waarbij de ontharde melkstroom alvorens deze aan een van beide anionenwisselingsstappen wordt onderworpen, wordt onderworpen aan een nanofiltratie, zodanig dat er een concentraat ontstaat met een in 20 absolute hoeveelheid lager (in vergelijking met de uitgangsstroom voor nanofiltratie) aantal enkelvoudige ionen, en non-protein-nitrogenverbindingen, en met name ureum. Deze uitvoeringsvorm wordt in voorbeeld 2 geïllustreerd.

Onder toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding wordt 25 een samenstelling met daarin sialyllactose verkregen met een hoge gewichtsverhouding sialyllactose/fosfor. In de regel is deze verhouding volgens de uitvinding ten minste groter dan of gelijk aan 6, liever groter dan of gelijk aan 7, nog bever groter dan of gebjk aan 9, en bever nog groter dan of gebjk aan 10.

9

Voor het berekenen van deze verhouding wordt het gehalte aan sialyllactose gedefinieerd als zijnde de som van het gehalte aan 3’-SL en 6’-SL per gewichteenheid product.

In het bijzonder wordt de concentratie van sialyllactose bepaald 5 met behulp van een chromatografische techniek op een anionenwisselaar (PA-1 kolom, Dionex). Het sialyllactose wordt gedetecteerd met behulp van een gepulseerd ampèrometrische detector. Het sialyllactose gehalte wordt berekend als de som van het gehalte aan 3’-sialyllactose en 6’-sialyllactose.

Het fosforgehalte wordt gedefinieerd als het totaal gehalte aan 10 fosfor (na destructie met salpeterzuur) per gewichtseenheid product volgens “AOAC official method 973.55 (analysis of phosphorous in water)”.

Vervolgens kan de verhouding tussen sialyllactose en fosfor berekend worden.

Overigens leiden de bekende werkwijzen die sialyllactose isoleren 15 uit melk in de regel tot producten waarin de ratio sialyllactose/fosfor lager is dan 5.

Volgens de uitvinding wordt in de onthardingsstap ongeveer 50-60% van de fosforverbindingen verwijderd; wordt in de stap waarbij de anionenwisselaar met een vochtgehalte tussen 30 en 48% wordt toegepast 20 zo’n 30% van de fosforverbindingen verwijderd; en wordt in de stap waarin de anionenwisselaar van bij voorkeur het macroporeuze of geltype wordt toegepast nog eens zo’n 10% van de fosforverbindingen verwijderd.

In een tweede aspect heeft de uitvinding betrekking op een siaalzuur bevattende oligosachariden-houdende of zure oligosachariden 25 houdende samenstelling, bij voorkeur sialyllactose houdende samenstelling, verkrijgbaar onder toepassing van de werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met een gehalte sialyllactose betrokken op de droge stof van ten minste 4 gew.%, en met een sialyllactose / fosfor gewichtsverhouding groter dan 6. In deze samenstelling zijn naast sialyllactose ook aanwezig: 30 siaalzuur, lactose, non-protein-nitrogenverbindingen, en eventueel eiwit.

10

Voorkeursuitvoeringsvormen hebben de hierboven beschreven gehalten en gewichtsverhoudingen.

In een derde aspect betreft de uitvinding de toepassing van de siaalzuur bevattende oligosachariden en met name de sialyllactose 5 houdende samenstelling volgens de uitvinding in kinder- en zuigelingenvoeding, en met name zodanig dat sialyllactosegehalten worden verkregen die overeenkomen met de gehalten daarvan in humane melk.

Dit betekent overigens niet dat de sialyllactose niet toe te passen zou zijn in andere toepassingen, zoals klinische en enterale voedingen of 10 voor bijvoorbeeld cosmetische toepassing als ingrediënt in huidconditioners, gerelateerd aan modulering pigment activiteit en/of vermindering van huidbeschadigingen.

Thans zal de onderhavige uitvinding worden toegelicht aan de hand van de volgende niet beperkende voorbeelden. Waar in de voorbeelden 15 of in de bovenstaande tekst percentages of ppm’s worden gebruikt, dan zijn dat - tenzij anders aangegeven - respectievelijk gewichtspercentages en gewichtsdelen per miljoen van een bestanddeel betrokken op het gewicht van de samenstelling waar dat bestanddeel in is opgenomen.

20 Voorbeeld 1:

Een weipermeaatstroom met een drogestofgehalte van 6,66%, werd achtereenvolgens over een anionenwisselingshars (XA3112 {ex Applexion); in chloride vorm) en over een kationenwisselingshars (XA 2033 {ex Applexion); in natrium vorm) geleid. In dit proces bleek afhankelijk van de 25 opgelegde belading een hoeveelheid fosfaat en calcium te worden uitgewisseld tegen resp. chloride- en natriumionen. Wanneer ongeveer 25 bedvolumes (BVs) weipermeaat worden opgebracht, werd ongeveer 90% van de aanwezige calciumionen en ongeveer 50-60% van het aanwezige fosfaat te worden verwijderd. Experimentele gegevens van een typische permeaat 30 ontharding staan vermeld in tabel 1.

11

Tabel 1: Experimentele gegevens over de softening weipermeaat (Volume kationenwisselingshars= 35 ltr, volume anionenwisselingshars = 35 ltr) 5

Weipermeaat Softened product

Volume (ltr) 800 820

Droge stof (%) 6,66 6,37

Sialyllactose (SL (ppm) 103 102

As (%) 0,63 0,58

Fosfaat (ppm) 470 250

Calcium (ppm) 460 0,3

Natrium (ppm) 520 2300

Chloride (ppm) 1500 2800

Voorbeeld 2:

Het in voorbeeld 1 verkregen product werd door het toepassen van nanofiltratie geconcentreerd. Nanofiltratie werd uitgevoerd met een NF-10 2540 membraan (DOW). Tijdens het filtratieproces werd een druk over het membraan van tussen 20-25 bar toegepast. Het concentraat werd verkregen door het voortdurend recirculeren van het uitgangsmateriaal over het membraan. Als gevolg hiervan nam het drogestofgehalte in het concentraat toe. Zo kon het drogestofgehalte van het concentraat op >15% worden 15 ingesteld, terwijl het ook mogelijk was om filtratie te stoppen wanneer een drogestofgehalte van 20% werd bereikt. Op deze wijze werd een groot deel van de aanwezige mineralen verwijderd. De experimentele resultaten van een typische nanofiltratiestap staan vermeld in tabel 2.

12

Tabel 2

Softened product NF-concentraat

Volume (ltr) 820 242

Droge stof (%) 6,37 17,31

As (%) 0,58 0,71 SL (ppm) 102 314

Voorbeeld 3:

Van het in voorbeeld 2 verkregen product werd 200 liter met een 5 drogestofgehalte van ongeveer 20% overgeleid over achtereenvolgens de volgende kolommen.

Kolom 1 bevatte 25 liter kationenwisselaar (Applexion 748H). Kolom 2 bevatte 25 liter anionenwisselaar (DIAION SA20).

De harsen werden in resp. H+ en OH' vorm gebracht. De flowrate 10 waarmee het product werd opgebracht bedroeg 100-125 ltr/uur. Exclusief “sweet-on” en inclusief “sweet-off’ kon ongeveer 220-230 ltr product worden verkregen.

Het aldus verkregen product was volledig ontzout en bevatte nog vrijwel al het sialyllactose. In het algemeen bleek de opbrengst groter dan 15 90%. Een typisch resultaat van deze stap staat vermeld in tabel 3.

Tabel 3 Typisch resultaat ontzouting van NF-concentraat NF-concentraat Product

Volume (ltr) 200 220

Droge stof (%) 19,36 16,56

As (%) 0,74 0,03 SL (ppm) 380 325 13

Voorbeeld 4:

In de volgende stap werd het aanwezige sialyllactose in het product van voorbeeld 3 gebonden op een andere anionenwisselaar. Hiertoe werd het verkregen product (220 ltr) over een anionenwisselaar geleid (kolomvolume 5 = 51tr, hars= XA90OH, ex Applexion). Als gevolg van deze behandeling werd in hoofdzaak al het aanwezige sialyllactose op de anionenwisselingshars gebonden.

Na spoelen van de kolom kon het gebonden SL gewonnen worden door de anionenwisselaar met een hoeveelheid zout te elueren (40 ltr; 0,2M 10 NaCl). Tijdens elutie werd de pH m.b.v. zoutzuur geneutraliseerd tot ongeveer pH=6,5. Een typisch resultaat wordt weergegeven in tabel 4:

Tabel 4 Typische resultaten van het invangen en de daaropvolgende elutie van SL van de anionenuitwisselingshars.

Demineralisatie SL-vrij product SL-product Volume (ltr) 220 230 40

Droge stof (%) 16,56 15,26 1,23

As (%) 0,03 0,019 0,26 SL (ppm) 325 5 1520 P* (ppm) 105 3 125 15 * fosforgehalte volgens AOAC 973.55

Claims (8)

1. Werkwijze voor het isoleren van siaalzuur bevattende koolhydraten, en met name sialyllactose, uit een ontvette, en bij voorkeur eiwit-vrije, melkstroom, waarbij de melkstroom aan een anionenwisselingsstap wordt onderworpen onder toepassing van een 5 anionenhars, bij voorkeur in de vrije basevorm, met een vochtgehalte van 30-48%; gevolgd door een anionenwisselingsstap, bij voorkeur met een macroporeuze of geltype anionenwisselingshars.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de tweede anionenwisselingshars een vochtgehalte heeft hoger dan 45%, en bij 10 voorkeur tussen 50 en 70%.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij als melkstroom een weistroom, en bij voorkeur een weipermeaat wordt toegepast.

4. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, waarbij de melkstroom alvorens deze aan een van beide anionenwisselingsstappen 15 wordt onderworpen, wordt onthard, bij voorkeur onder gebruikmaking van ionenwisselaars in natrium/chloride vorm.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij de ontharding wordt uitgevoerd door calcium- en fosfaationen neer te slaan.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 4 of 5, waarbij de melkstroom 20 alvorens deze aan een van beide anionenwisselingsstappen wordt onderworpen, wordt onderworpen aan nanofiltratie zodanig dat een concentraat ontstaat met een in absolute hoeveelheid lager aantal enkelvoudige ionen, en non-protein-nitrogenverbindingen.

7. Siaalzuurbevattende oligosachariden, en in het bijzonder 25 siallyllactose houdende samenstelling, verkrijgbaar onder toepassing van de werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met een gehalte sialyllactose betrokken op de droge stof van ten minste 4 gew.%, en met een sialyllactose / fosfor gewichtsverhouding groter dan 6.

8. Toepassing van de samenstelling volgens conclusie 7 in zuigelingenvoeding, kindervoeding, klinische of enterale voedingen.