NL1028208C1

NL1028208C1 - Bereiding van aldesleukine voor farmaceutisch gebruik.

Info

Publication number: NL1028208C1
Application number: NL1028208A
Authority: NL
Inventors: Maninder Hora
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 2005-02-07
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2005-05-26

Description

é * '*

BEREIDING VAN ALDESLEUKINE VOOR FARMACEUTISCH GEBRUIK

5

Alle hierin geciteerde on-line informatie en documenten worden in hun geheel opgenomen als referentie.

TECHNISCH GEBIED

10 Deze uitvinding ligt op het gebied van het bereiden en ‘ formuleren van interleukine-2 voor farmaceutisch gebruik.

STAND DER TECHNIEK

Interleukine-2 (IL-2) is een cytokine dat de groei en 15 differentiatie van T-cellen in vivo bevordert en ook de cytotoxiciteit van CD8+ T-cellen en natural killercellen versterkt. Toediening aan patiënten produceert meerdere immunologische effecten op een dosisafhankelijke manier, waaronder activering van de cellulaire immuniteit met 20 heftige lymfocytose, eosinofilie, trombocytopenie en de productie van cytokinen, waaronder TNF, IL-1 en interferon-y. Verdere details over IL-2 kunnen worden gevonden in zijn 'GeneCard' onder inschrijvingsnummer GC04M123831.

25 11-2 is goedgekeurd voor menselijk farmaceutisch gebruik in verschillende landen. De aanbevolen internationale niet-gedeponeerde naam is ALDESLEUKINE en een formulering wordt op de markt gebracht door Chiron Corporation onder de handelsnaam PROLEUKIN™. De FDA van de Verenigde Staten 30 heeft PROLEUKIN™ IL-2 goedgekeurd voor gebruik bij de behandeling van volwassenen met metastatisch niercelcarci-noom (metastatisch RCC) of metastatisch melanoom.

Zoals vermeld in zijn US voorgeschreven informatie bestaat 35 PROLEUKIN™ uit biologisch actieve, niet-covalent gebonden microaggregaten met een gemiddelde grootte van 27 recombi-nante IL-2-moleculen. Het wordt geleverd als een steriele, 1028208 i 2 wit-tot-vaalwitte gevriesdroogde koek in flesjes voor eenmalig' gebruik, die bedoeld is voor intraveneuze (IV) toediening. Indien gereconstitueerd met 1,2 ml steriel water voor injectie, bevat elk flesje 18 miljoen (IE) (1,1 5 mg) PROLEUKIN™ IL-2, 50 mg mannitol en 0,18 mg dibasisch natriumdodecylsulfaat (SDS), gebufferd met ongeveer 0,17 mg monobasisch en 0,89 dibasisch natriumfosfaat tot pH 7,5. Het eenvoudig mengen van deze bestanddelen geeft echter niet dezelfde microgeaggregeerde vorm van IL-2 als gevonden 10 in het product PROLEUKIN™.

De microaggregatie van IL-2 in het product PROLEUKIN™ is belangrijk voor zijn in vivo werkzaamheid. De farmacokine-tische en farmacodynamische eigenschappen van ongeaggre-15 geerd (vrij monomeer) IL-2 zijn heel verschillend van die van microgeaggregeerd IL-2 en de twee vormen hebben verschillende therapeutische indicies: aggregaten die te klein zijn, worden door het lichaam te snel geklaard; aggregaten die te groot zijn, kunnen onoplosbaar en minder actief 20 zijn. Microaggregatie is dus een sleutelkenmerk van het product INTERLEUKIN™.

De werkwijze waarmee de biologisch actieve microaggregaten van PROLEUKIN™ worden gevormd, is niet eerder beschikbaar 25 gemaakt voor het publiek, hoewel er een aantal werkwijzen voor het bereiden van farmaceutische IL-2-formuleringen in de stand der techniek beschreven is [zie bijv. de referenties 1 - 30]. Referentie 9 in het bijzonder heeft als strekking de beschrijving van het productieproces voor 30 PROLEUKIN™, inclusief details van de expressie, winning, zuivering, formulering en afwerking, maar deze openbaarmaking is in verschillende opzichten incompleet.

Het weten hoe dezelfde actieve microgeaggregeerde vorm van 35 IL-2 als gevonden wordt in het product PROLEUKIN™ bereikt kan worden, zou nuttig zijn voor iedereen die een IL-2-product vergelijkbaar met PROLEUKIN™ wil maken. Het is 1028208 * 1 3 r daarom een doelstelling van de uitvinding om een werkwijze t te verschaffen voor het bereiden van IL-2 in microgeaggre-geerde vorm zoals gevonden wordt in het product PROLEUKIN™ en ook om dergelijk microgeaggregeerd IL-2 te verschaffen. 5 Het is een verdere doelstelling van de uitvinding om een werkwijze te verschaffen voor het bereiden van IL-2 als aanvulling op de openbaarmaking van referentie 9.

BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

10 De werkwijze waarmee het product PROLEUKIN™ wordt bereid, omvat de volgende sleutel stappen: (i) zuivering van tot.

expressie gebracht IL-2 uit een celkweek; (ii) in oplossing brengen van IL-2 met behulp van SDS als detergens; (iii) verkleining van IL-2 tot de monomere vorm; (iv) zuivering, 15 oxidatie en precipitatie van IL-2; (v) opnieuw in oplossing brengen van IL-2 met behulp van een hoge concentratie van het detergens SDS; (vi) zuivering om oligomeer IL-2 te verwijderen; (vii) diafiltratie om de concentratie van het detergens SDS te verlagen, zonder complete verwijdering, 20 tot een optimaal bereik voor het verkrijgen van een geschikt microgeaggregeerd IL-2-preparaat; (viii) formulering met mannitol en buffer; en (ix) vriesdrogen en verpakken.

De stappen (i) , (iv), (vi), (viii) en (ix) van deze werk-25 wijze worden beschreven in referentie 9, maar de stappen (ii), (iii), (v) en (vii) niet, hoewel het gebruik van een ongespecificeerd detergens om IL-2 in oplossing te brengen vóór stap (vi) beschreven wordt. Bovendien suggereert referentie 9 dat SDS wordt toegevoegd aan het IL-2 na 30 zuivering in stap (vi), terwijl het in feite verwijderd wordt.

Van de negen stappen zijn de meest kritische waarmee microaggregaten worden gevormd, (v) en (vii). Geen van de 35 stroomafwaartse stappen (viii) en (ix) heeft enig significant effect op de microaggregatie en de zuiveringswerkwij-zen in de stappen (i), (ii) , (iii) en (vi) hebben ook 1028208

I I

4 * weinig effect. Zodra SDS is toegevoegd in stap (v), gaat IL-2 echter in oplossing en het is de daaropvolgende verlaging in SDS-concentraties in stap (vii) die de vorming van de microaggregaten aanwezig in het uiteindelijke 5 product PROLEUKIN™ veroorzaakt. Er moet voldoende SDS toegevoegd worden om het geprecipiteerde IL-2 opnieuw in oplossing te brengen in een nagenoeg monomere oplosbare vorm en daarna moet dit worden verwijderd (maar niet compleet) om de gewenste microaggregaten te geven.

10

De uitvinding verschaft daarom een werkwijze voor het bereiden van interleukine-2 voor farmaceutisch gebruik, die de stappen omvat van: (a) het toevoegen van natriumdodecyl-sulfaat (SDS) aan een preparaat dat interleukine-2 bevat, 15 tot een uiteindelijke SDS-concentratie van ten minste 500 μg SDS per mg IL-2; (b) het verwijderen van een gedeelte, maar niet alle SDS uit het preparaat om een preparaat met 95 - 250 μg SDS per mg interleukine-2 te geven. Deze werkwijze van SDS-toevoeging en daarna gedeeltelijke 20 verwijdering levert optimale omstandigheden op voor nauwe interactie van IL-2 en SDS-moleculen om microaggregaten van IL-2 en SDS te vormen zoals die gevonden worden in het product PROLEUKIN™ en, voor een bepaalde IL-2/SDS-verhou-ding, levert dit een ander product op dan dat wat verkregen 25 wordt door het eenvoudig mengen van SDS en IL-2.

Het waterige preparaat dat voorkomt uit de werkwijze, kan worden gevriesdroogd voor distributie en het gevriesdroogde materiaal kan tenslotte worden gereconstitueerd met een 30 waterige drager voor toediening aan patiënten. Na het oplossen heeft het preparaat bij voorkeur een troebelheid (τ) van minder dan 1,1 cm2/g en/of het bevat SDS-IL-2-aggregaten met een gemiddelde hydrodynamische diameter tussen 8 nm en 20 nm. De werkwijze kan dus verder de 35 stappen omvatten van het vriesdrogen van het preparaat en eventueel het reconstitueren van het preparaat met een 1 0282 0 8 ♦

• I

5 waterig medium. Het preparaat kan deze τ en/of hydrodynami-sche kenmerken ook hebben vóór de vriesdroogstap.

De uitvinding verschaft een preparaat dat interleukine-2 en 5 natriumdodecylsulfaat bevat, waarin interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat aanwezig zijn als aggregaten en waarbij de aggregaten verkregen kunnen worden met de werkwijze van de uitvinding. Deze preparaten zijn geschikt voor farmaceutisch gebruik, zoals aangetoond met het product 10 PROLEUKIN™.

De uitvinding verschaft ook een preparaat dat interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat bevat, waarin interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat aanwezig zijn in de vorm van aggrega-15 ten en waarbij het preparaat een specifieke troebelheid (r) heeft van minder dan 1,1 cm2/g. Deze preparaten zijn geschikt voor farmaceutisch gebruik, zoals is aangetoond met het product PROLEUKIN™.

20 De uitvinding verschaft ook een preparaat dat interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat bevat, waarin interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten en waarbij de aggregaten een gemiddelde hydrodynamische diameter hebben tussen 8 nm en 20 nm. Deze preparaten zijn 25 geschikt voor farmaceutisch gebruik, zoals is aangetoond met het product PROLEUKIN™.

De uitvinding verschaft ook een preparaat dat interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat bevat, waarin interleukine-2 en 30 natriumdodecylsulfaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten en waarbij het gemiddelde aantal interleukine-2-moleculen per aggregaat tussen 10 en 50 is. Deze preparaten zijn geschikt voor farmaceutisch gebruik, zoals is aangetoond met het product PROLEUKIN™.

35

De uitvinding verschaft een gevriesdroogd preparaat dat interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat bevat, waarbij het 1 028208

4 I

6 ι preparaat kan worden gereconstitueerd om een waterige oplossing1 te geven waarin het interleukine-2 en het natri-umdodecylsulfaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten en dat een specifieke troebelheid (r) heeft van minder dan 1,1 5 cm2/g. Wanneer naar de r gekeken wordt, kunnen de aggregaten daarentegen of eveneens een gemiddelde hydrodynamische diameter tussen 8 nm en 20 nm hebben. Deze preparaten zijn geschikt voor farmaceutisch gebruik, zoals is aangetoond met het product PROLEUKIN™.

10

De uitvinding verschaft een werkwijze voor het bereiden van een gevriesdroogd preparaat dat interleukine-2 en natrium-dodecylsulfaat bevat, waarbij: (i) het gevriesdroogde, preparaat kan worden gereconstitueerd om een waterig 15 preparaat te geven, waarin interleukine-2 en natriumdode-cylsulfaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten en dat een specifieke troebelheid , (r)· heeft van minder dan 1,1 cm2/g; en (ii) de werkwijze de stappen omvat van (a) het toevoegen van natriumdodecylsulfaat aan een preparaat dat 20 interleukine-2 bevat, waarbij er voldoende natriumdodecylsulfaat wordt toegevoegd om een monomeer opgelost interleukine-2 te geven, (b) het verlagen van de concentratie natriumdodecylsulfaat tot een niveau waarbij het interleukine-2 aggregaten vormt met natriumdodecylsulfaat, en (c) 25 het vriesdrogen van het preparaat.

De uitvinding verschaft een werkwijze voor het bereiden van een gevriesdroogd preparaat dat interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat bevat, waarbij: (i) het gevriesdroogde 30 preparaat kan worden gereconstitueerd om een waterig preparaat te geven waarin interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten met een gemiddelde hydrodynamische diameter tussen 8 nm en 20 nm; en (ii) de werkwijze de stappen omvat van (a) het toevoegen 35 van natriumdodecylsulfaat aan een preparaat dat interleukine-2 bevat, waarbij voldoende natriumdodecylsulfaat wordt toegevoegd om een monomeer opgelost interleukine-2 te 1028208 Λ t 7 ι geven, (b) het verlagen van de concentratie natriumdodecyl- sulfaat tot een niveau waarbij het interleukine-2 aggregaten vormt met natriumdodecylsulfaat, en (c) het vriesdrogen van het preparaat.

5

De uitvinding verschaft ook een werkwijze voor het bereiden van een gevriesdroogd preparaat dat interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat bevat, waarbij: (i) het gevriesdroogde preparaat kan worden gereconstitueerd om een waterig 10 preparaat te geven waarin interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten en dat een specifieke troebelheid (r) heeft van minder dan 1,1 cm2/g; en (ii) de werkwijze de stappen omvat van (a) het mengen van natriumdodecylsulfaat en interleukine-2 om een mengsel 15 te vormen waarin natriumdodecylsulfaat aanwezig is in een eerste concentratie, (b) het verwijderen van het natriumdodecylsulfaat uit het mengsel ' om zijn concentratie te verlagen tot een tweede concentratie en (c) het vriesdrogen van het preparaat, waarmee dit preparaat verschaft wordt. 20 De tweede concentratie is lager dan de eerste concentratie. De eerste concentratie zal in het algemeen ten minste 500 μg SDS per mg IL-2 in het mengsel zijn en de tweede concentratie zal in het algemeen tussen 95 en 250 μg SDS per mg IL-2 zijn.

25

De uitvinding verschaft ook een werkwij ze voor het bereiden van een gevriesdroogd preparaat dat interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat bevat, waarbij: (i) het gevriesdroogde preparaat kan worden gereconstitueerd om een waterig 30 preparaat te geven waarin interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten met een gemiddelde hydrodynamische diameter tussen 8 nm en 20 nm; en (ii) de werkwijze de stappen omvat van (a) het mengen van natriumdodecylsulfaat en interleukine-2 om een mengsel 35 te geven waarin natriumdodecylsulfaat aanwezig is in een eerste concentratie, (b) het verwijderen van natriumdodecylsulfaat uit het mengsel om zijn concentratie te verlagen 1 028208 ♦ 8

I I

tot een tweede concentratie en (c) het vriesdrogen van het preparaat, waarmee dit preparaat verschaft wordt. De tweede concentratie is lager dan de eerste concentratie. De eerste concentratie zal in het algemeen ten minste 500 μg SDS per 5 mg IL-2 zijn en de tweede concentratie zal in het algemeen liggen tussen 95 en 250 μg SDS per mg IL-2.

De uitvinding verschaft ook een werkwijze voor het bereiden van een gevriesdroogd preparaat dat interleukine-2 en 10 natriumdodecylsulfaat (SDS) bevat, waarbij: (i) het ge vriesdroogde preparaat kan worden gereconstitueerd om een preparaat te geven waarin interleukine-2 en SDS aanwezig zijn de vorm van aggregaten en dat een specifieke troebelheid (t) heeft van minder 1,1 cm2/g en waarin de concentra-15 tie SDS ' x' μg SDS per mg IL-2 is, waarbij x ligt tussen 95 en 250; en (ii) de werkwijze de stappen omvat van (a) het mengen van SDS en interleukine-2 om een mengsel te geven waarin de concentratie SDS ten minste 4 keer hoger is dan 'x' , en (c) het vriesdrogen van het preparaat. De concen-20 tratie is bij voorkeur 5 keer hoger dan ·x', met meer voorkeur ten minste 8 keer hoger, 10 keer hoger, 15 keer hoger of zelfs 20 keer hoger.

De uitvinding verschaft ook een werkwijze voor het bereiden 25 van een preparaat dat interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat (SDS) bevat, waarbij: (i) interleukine-2 en SDS in het preparaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten, waarbij de aggregaten een gemiddelde hydrodynamische diameter tussen 8 nm en 20 nm hebben en waarbij de concentratie van 30 SDS 'x' μg SDS per mg IL-2 is, waarbij x ligt tussen 95 en

250; en (ii) de werkwijze de stappen omvat van (a) het mengen van SDS en interleukine-2 om een mengsel te geven waarin de concentratie van SDS ten minste 4 keer hoger is dan ‘x’ , (b) het verwijderen van iets, maar niet alle SDS

35 uit het mengsel om een preparaat te geven waarin de SDS- concentratie ’x' is en (c) het vriesdrogen van het prepa raat. De concentratie is bij voorkeur ten minste 5 keer 1028208

t I

9 hoger dan ' x', met meer voorkeur ten minste 8 keer hoger, i 10 keer hoger, 15 keer hoger of zelfs 20 keer hoger.

Wanneer een werkwijze van de uitvinding het verlagen van de 5 SDS-concentratie tot binnen het bereik van 95 - 250 μg SDS per mg IL-2 omvat, is het in sommige uitvoeringsvormen mogelijk om de concentratie te verlagen tot beneden de 95 /zg/ml (bijv. tot tussen 50 en 95 jig/mg) en om daarna de concentratie opnieuw te verhogen totdat zij binnen het 10 bereik van 95 - 250 /ig/mg ligt. Deze verhoging tot binnen het bereik van 95 - 250 ^g/mg kan op geschikte wijze plaatsvinden tijdens het reconstitueren van het gevriesdroogde materiaal; de werkwijze kan bijv. omvatten verwijdering van SDS tot < 95 Mg/mg, gevolgd door vriesdrogen, 15 gevolgd door reconstitutie met een waterige SDS-oplossing zodanig dat de SDS-concentratie valt binnen het bereik van 95 - 250 ^g/mg.

Het detergens 20 De werkwijzen van de uitvinding omvatten het gebruik van natriumdodecylsulfaat (SDS), dat ook bekend is als natrium-laurylsulfaat. De formule van dit anionische detergens is CH3 (CH2) u0S03'Na+ en het heeft CAS-nummer 151-21-3 en EC-nummer 205-788-1.

25 SDS is een standaard reagens dat gebruikt wordt om eiwitten in oplossing te brengen en, als IL-2 aanwezig is in geprecipiteerde vorm voordat SDS wordt toegevoegd, dan wordt het voor dit doel gebruikt in stap (a) van de werkwijze van de 30 uitvinding. Uitgaande van een preparaat dat geprecipiteerd IL-2 bevat, zal voldoende SDS worden toegevoegd om te garanderen dat praktisch alle geprecipiteerde IL-2 oplosbaar wordt gemaakt (met uitzondering van enige covalent gekoppelde IL-2-multimeren in het precipitaat, die voorna-35 melijk geprecipiteerd zullen blijven, zelfs in de aanwezigheid van SDS). Microaggregatie van IL-2 in een concentratie van 1 mg/ml is hoofdzakelijk afwezig wanneer SDS aanwezig 1028208 * * * i 10 is in een concentratie hoger dan ongeveer 500 μg/mg en dus is het logisch om SDS toe te voegen tot een eindconcentra- tie van SDS van ten minste 500 ^g SDS per mg IL-2 (bijv. ten minste 550, ten minste 600, ten minste 700, ten minste 5 800, ten minste 900, ten minste 1000, ten minste 1200, ten minste 1400, ten minste 1600, ten minste 1800 of ten minste 2000 μg SDS per mg IL-2) . Het gebruik van ongeveer 910 μg SDS per mg IL-2 heeft de voorkeur.

10 De uitgangsconcentratie SDS in een monster zal in het algemeen bekend zijn, omdat SDS niet van nature in cellen aanwezig is en de hoeveelheid SDS die toegevoegd werd tijdens de opwerking van materiaal afkomstig van cellen, zal gemeten zijn. In het geval dat de cpncentratie van SDS 15 niet bekend is, kan deze echter gemeten worden met gebruikelijke bepalingstechnieken, ofwel uitgevoerd op het materiaal als geheel of op een monster van het materiaal. Bijvoorbeeld: referentie 31 beschrijft een capillaire elektroforesewerkwijze voor de scheiding en bepaling van 20 oppervlakte-actieve stoffen, waaronder SDS; referentie 32 beschrijft een ééndruppel-werkwijze voor de bepaling van het dodecyl sulfaat ion in het bereik van 0,2 - 100 μΜ met behulp van een piëzo-elektrisch kwartskristal zonder elektrode; referentie 33 vergelijkt drie werkwijzen voor 25 een geschikte bepaling van SDS in waterige oplossingen, namelijk titratie met cetyltrimethylammoniumbromide met behulp van ofwel een ionselectieve elektrode of de troebelheid om het eindpunt te meten, of de meting van troebelheid in de aanwezigheid van myristyltrimethylammoniumbromide; 30 referentie 34 beschrijft een werkwijze voor de bepaling van SDS gebaseerd op zijn interactie met fluorescente kleurstoffen zoals ethidiumbromide enz. De voorkeursbepalings-werkwijze voor het meten van SDS-concentraties is een spectrofotometrische bepaling gebaseerd op de reactie met 35 acridine-oranje, zoals in meer detail beschreven in de voorbeelden en in ref. 35.

1028208 11 * )

Als een alternatief voor het meten van het SDS-gehalte in verhouding tot de IL-2-massa kan het gemeten worden in verhouding tot de IL-2-activiteit. Op basis van een IL-2-activiteit van 18 x 106 IE in 1,1 mg IL-2 (zoals gevonden 5 in PROLEUKIN™) is 100 μg SDS per mg IL-2 equivalent aan 6,111 /ig SDS per MIU IL-2.

In plaats van SDS te gebruiken in de werkwijzen en producten van de uitvinding is het ook mogelijk om natriumlau-10 rethsulfaat (SLS) of ammoniumlaurylsulfaat (ALS) te gebruiken. Mengsels van SLS, ALS en/of SDS kunnen ook worden gebruikt. In voorkeursuitvoeringsvormen van de uitvinding wordt echter SDS gebruikt.

15 Verwijdering van detergens

Nadat SDS toegevoegd is aan het IL-2-preparaat, omvat de werkwijze van de uitvinding verwijdering van een gedeelte van (maar niet alle) het SDS, waarmee een microgeaggregeer-de vorm van IL-2 en SDS wordt verschaft.

20 SDS kan worden verwijderd met diverse technieken. Ionenuit-wisselingschromatografie kan negatief geladen SDS verwijderen eh gelfiltratie kan ook gebruikt worden. Met de meeste voorkeur wordt SDS echter verwijderd door middel van 25 diafiltratie. In diafiltratie worden oplosmiddel en/of opgeloste microstoffen (bijv. zouten) vervangen door een ander oplosmiddel en/of opgeloste microstoffen. In het algemeen vindt verwijdering en vervanging plaats in dezelfde snelheid en het volume van de oplossing kan dus prak-30 tisch constant gehouden worden en het totale effect is dus de vervanging van originele oplosmiddelen/opgeloste microstoffen door nieuwe oplosmiddelen/opgelost microstoffen.

Diafiltratie tegen een SDS-vrije buffer is de voorkeursma-35 nier voor het verwijderen van SDS, bijv. tegen een 10 mM natriumfosfaatbuffer van pH 7,5.

1028208 4 » 12 ι SDS-verwijdering wordt voortgezet totdat het preparaat tussen 95 M9 en 250 M9 SDS bevat op elke mg interleukine-2, bijv. tussen 118 en 210 Mg/mg, tussen 135 en 180' /ig/mg of ongeveer 160 Mg/mg. De farmacokinetische eigenschappen van 5 IL-2 zijn nagenoeg consistent over dit bereik en de SDS-concentratie is niet zo hoog dat dit leidt tot zorgen over toxiciteit. Als de SDS-concentratie daalt beneden ongeveer 95 μg/mgt stijgt de grootte van de microaggregaten echter, scherp (Figuur 1), waarbij deze stijgt van een gemiddelde 10 van - 60 IL-2-moleculen per aggregaat bij 95 Mg/mg tot een gemiddelde van - 180 bij 75 Mg/mg.

Toevoeging en daarna incomplete verwijdering van SDS resulteert in de biologisch actieve IL-2-microaggregaten 15 die gevonden worden in het product PROLEUKIN™. Het eenvoudig mengen van SDS en IL-2 in de concentraties die gevonden worden in het product PROLEUKIN™ geeft geen microaggregaten. Referentie 36 beschrijft een studie waarbij SDS wordt toegevoegd aan IL-2-preparaten die, evenals het product 20 PROLEUKIN™, 1,1 mg IL-2 bevatten. Het bleek dat SDS het IL-2 precipiteert bij detergensconcentraties tussen 0,02% en 0,05%. Daarentegen precipiteert IL-2 niet bij deze SDS-concentraties tijdens SDS-verwijdering volgens de uitvinding - zelfs als SDS daalt van 1200 M9/ro9 (ongeveer 0,1% 25 SDS op basis van 1,1 mg IL-2) tot 70 M9/ra9 (<0,01%), wordt geen precipitatie van IL-2 gezien.

Tijdens de verwijdering kan de SDS-concentratie worden bepaald zoals hierboven beschreven. Wanneer de verwijde-30 ringswerkwijze gestandaardiseerd en reproduceerbaar is, dan hoeft het volgen van de SDS-concentraties tijdens de SDS-verwijdering niet noodzakelijk te zijn, omdat in het algemeen hetzelfde resultaat verwacht kan worden elke keer dat de werkwijze wordt uitgevoerd (hoewel er uiteindelijke 35 bevestigende metingen kunnen worden uitgevoerd). Wanneer echter de verwijderingswerkwijze variabel is of wanneer regelmatig meten vanwege andere redenen vereist is, kan 1028208 « » 13 regelmatige of continue meting van de SDS-concentraties uitgevoerd worden, totdat de gewenste eindconcentratie bereikt is.

5 Verdere stappen In de werkwijze

Zoals hierboven vermeld, zijn de sleutelstappen in de werkwijze voor de vorming van IL-2/SDS-microaggregaten (a) de toevoeging en daarna (b) de daaropvolgende verwijdering van SDS. Hoewel deze twee stappen IL-2 geven in een vorm 10 die geschikt is voor gebruik als een actief bestanddeel in een farmaceuticum, zijn ze alleen niet geschikt voor het bereiden van een uiteindelijk farmaceutisch preparaat en er zijn andere stappen vereist. Deze stappen kunnen plaatsvinden vóór de stappen (a) en (b), na de stappen (a) en (b) 15 en/of tussen de stappen (a) en (b).

De eerste stap in een werkwijze ‘voor het bereiden van IL-2 voor farmaceutisch gebruik zal in het algemeen expressie van het eiwit zijn. Dit zal in het algemeen het gebruik 20 omvatten van een gastheercel die een gen coderend voor IL-2 van belang bevat, zoals een bacteriële gastheercel, een gistgastheercel of een zoogdiergastheercel. Als een alternatief voor de recombinante route is het echter ook mogelijk om de expressie van een endogeen IL-2-gen in het 25 genoom van een gastheercel te activeren of opwaarts te reguleren (bijv. door middel van promoteractivering), of om het hormoon te zuiveren uit een natuurlijke bron (bijv. uit bloed).

30 Expressie van IL-2 in een recombinante E. coli is een voorkeursroute voor het verkrijgen van IL-2, waarbij IL-2 inclusielichaampjes vormt. Geschikte E. coli werd gedeponeerd volgens de voorwaarden van het Verdrag van Boedapest bij de ATCC in 1984 onder de inschrijvingsnummers 39452 en 35 39626.

1028208 ί <, 1 14

Werkwijzen voor het kweken, oogsten, openbreken of extraheren van IL-2 uit diverse celtypen zijn bekend in het vakgebied; zie bijv. de referenties 19 - 30 en 37 - 41.

5 Na de expressie of wanneer uitgegaan wordt van tot expressie gebracht materiaal, zal een eerste stap voor zuivering van IL-2 worden gebruikt. Als IL-2 in cellen aanwezig is, dan zal de zuiveringsstap het openbreken van de cellen omvatten (bijv. door middel van een osmotische shock, 10 homogenisatie, sonificatie enz.) teneinde het eiwit vrij te maken; als IL-2 reeds in oplossing aanwezig is (bijv. het werd afgescheiden na expressie), dan is openbreken niet nodig. Inactivering van levende cellen kan ook worden uitgevoerd, zoals centrifugatie. Aan .het einde van de 15 eerste zuiveringsstap zal IL-2 in het algemeen in geprecipiteerde vorm zijn, in het bijzonder als het gezuiverd is uit inclusielichaampjes, maar het zal afgescheiden moeten worden van celafbraakproducten om een IL-2-rijke pasta te geven voor daaropvolgende behandeling.

20

Na de bereiding van geprecipiteerd, gezuiverd IL-2, of wanneer wordt uitgegaan van geprecipiteerd materiaal, kan IL-2 in oplossing gebracht worden om het af te scheiden van andere gastheereiwitten enz. Het in oplossing brengen kan 25 worden bereikt door het toevoegen van een detergens zoals SDS, bij voorkeur tot een eindconcentratie tussen 4 en 4,5%. Dit kan op geschikte wijze bereikt worden door het toevoegen van een 5%-ige SDS-oplossing.

30 Na het in oplossing brengen of wanneer wordt uitgegaan van opgelost materiaal, kan het IL-2 worden gereduceerd om alle disulf idebruggen in het eiwit te verbreken en in het bijzonder om alle intermoleculaire disulfidebruggen te verbreken. Alle covalente IL-2-aggregaten die gevormd 35 worden door intermoleculaire disulfidebruggen, worden daardoor omgezet in monomere vorm. Reducerende middelen die gewoonlijk gebruikt worden om disulfidebruggen te reduce- 1 028208 15 ren, omvatten j8-mercaptoethanol en dithiotreitol (DTT) . De aanwezigheid van detergens zal in het algemeen worden aangehouden om de oplosbaarheid van IL-2 te garanderen, 5 Na de reductie of wanneer wordt uitgegaan van gereduceerd materiaal, kan het IL-2 opnieuw worden geoxideerd om monomeer IL-2 met intramoleculaire disulfidebruggen te geven.

10 Nadat het opnieuw geoxideerd is of wanneer uitgegaan wordt van opnieuw geoxideerd materiaal, kan het IL-2 dan verder worden gezuiverd teneinde reagentia zoals het oxiderende middel te verwijderen, endotoxine te verwijderen, DNA en/of eiwitten van de gastheercel te verwijderen, isovormen en 15 conformers van IL-2 te verwijderen (bijv. geoxideerde vormen van IL-2) enz. Deze zuivering kan op geschikte wijze tot stand worden gebracht met behulp van HPLC op omgekeerde fase.

20 Na zuivering met RP-HPLC of wanneer wordt uitgegaan van oplosbaar met RP-HPLC gezuiverd materiaal, kan het IL-2 worden geprecipiteerd, bijv. door het toevoegen van 0,8 N natriumhydroxide. Evenals precipitatie van IL-2 maakt dit het mogelijk om het eiwit af te scheiden van alle organi-25 sche oplosmiddelen die gebruikt werden tijdens de RP-HPLC. Geprecipiteerd materiaal kan op geschikte wijze worden verzameld door middel van centrifugatie.

Materiaal verkregen na expressie, zuivering, oplossen, 30 reductie, oxidatie, RP-HPLC en precipitatie (zoals hierboven beschreven) is ideaal voor het opnieuw in oplossing brengen en diafiltratie volgens de werkwijze van de uitvinding, hoewel IL-2 dat via andere zuiveringsroutes bereid wordt, ook gebruikt kan worden. In het algemeen zal het IL-35 2 echter in een geprecipiteerde vorm zijn voordat SDS wordt toegevoegd in stap (a) van de werkwijze van de uitvinding.

1028208 • ♦ 16 ι

Zoals hierboven vermeld blijven covalent gekoppelde IL-2-multimeren geprecipiteerd, zelfs in de aanwezigheid van SDS. Omdat deze multimeren veel groter zijn dan riet SDS in oplossing gebrachte IL-2-eiwitten (omdat ze niet disso-5 cieerbaar zijn), kunnen ze op geschikte wijze worden verwijderd tussen de stappen (a) en (b) (d.w.z. na SDS-toevoeging, maar vóór diafiltratie) door middel van gelfil-tratie. De aanwezigheid van SDS moet gedurende de gelfiltratie aangehouden worden om precipitatie van het IL-2 te 10 voorkomen.

Na diafiltratie om SDS te verwijderen en microaggregaten te vormen kan een IL-2-oplossing worden onderworpen aan één of meer van de volgende stappen: verdunning tot een gewenste 15 uiteindelijke dosis; sterilisatie, in het algemeen door middel van steriele filtratie door bijv. een 0,22 μτα filter; farmaceutische formulering (zie hieronder); vriesdrogen; verpakken; enz.

20 Microaggregaten

Het resultaat van het in oplossing brengen met SDS en diaf iltratie met de werkwijze van de uitvinding is de vorming van biologisch actieve microaggregaten van SDS en IL-2, zoals die gezien worden in het product PROLEUKIN™.

25

De precieze moleculaire structuur van de SDS/IL-2-microaggregaten is niet bepaald, maar vermoedelijk zijn het micellaire of micelvormige structuren. Bij een SDS-concentratie van -160 ^g/mg bevat een kenmerkende micel -30 IL-2-30 moleculen en -150 SDS-moleculen. Het SDS en IL-2 in de microaggregaten interageren niet-covalent en de hydrofobe staart van IL-2 (de resten 121 - 133) kan interageren met het alkylskelet van SDS onder de vorming van micellen. Iets van het SDS blijft vrij in oplossing.

35

De microaggregaten kunnen worden gedetecteerd met lichtverstrooiing en deze techniek maakt het ook mogelijk hun 1028208 17 grootte te meten (zie hieronder). De relatie tussen SDS-concentratie en gemiddelde grootte van de microaggregaten, gemeten met de klassieke lichtverstrooiing, is empirisch vastgesteld, zoals getoond in Figuur 1.

5

Naarmate de verwijdering van SDS voortgaat, wordt een concentratie bereikt beneden welke de grootte van de aggregaten exponentieel begint toe te nemen (zie Figuur 1). Volgens de uitvinding wordt SDS verwijderd totdat zijn 10 concentratie ligt tussen 95 μg en 250 μg per mg IL-2. Over dit bereik ligt de specifieke troebelheid (r) tussen -0,05 en -1,00 cm2/g, hetgeen een gemiddelde van minder dan 50 IL-2-moleculen per aggregaat impliceert. Bij 160 /xg SDS per mg IL-2 is de specifieke troebelheid (r) ongeveer 0,48 15 (ongeveer 27 IL-2-moleculen).

De vakman zal begrijpen dat een bepaald preparaat van SDS/IL-2 volgens de uitvinding zelden of nooit een enkele soort microaggregaat zal bevatten. Daarentegen onthullen 20 lichtverstrooiingsmetingen dat de microaggregaten een verscheidenheid aan groottes hebben, die vallen binnen een verdeling, en metingen kunnen een gemiddelde grootte onthullen. Wanneer een preparaat microaggregaten met een vermelde gemiddelde grootte omvat, zullen er daarom in het 25 algemeen enkele kleinere microaggregaten en enkele grotere microaggregaten zijn.

Voorkeurspreparaten van de uitvinding omvatten SDS/IL-2-microaggregaten, zodanig dat het preparaat een specifieke 30 troebelheid (r) heeft tussen 0,3 en 0,6, bijv. tussen 0,4 en 0,5, of ongeveer 0,45. Deze preparaten hebben in het bijzonder betrekking op preparaten die gereconstitueerd zijn na vriesdrogen, en de waarde voor τ kan lager zijn vóór het vriesdrogen en reconstitutie (Figuur 14).

35 1028208 Λ Φ 18

Voorkeurspreparaten van de uitvinding omvatten SDS/IL-2- i microaggregaten met een hydrodynamische diameter tussen 11 nm en 13 nm.

5 Voorkeursmicroaggregaten van de uitvinding bevatten tussen 10 en 50 IL-2-moleculen, bijv. tussen 20 en 35 en bij voorkeur ongeveer 27.

In voorkeurspreparaten is praktisch alle IL-2 aanwezig in 10 de vorm van microaggregaten. De preparaten kunnen nagenoeg vrij zijn van monomeer IL-2.

Specifieke troebelheid (r)

Omdat SDS/IL-2-microaggregaten van de uitvinding worden 15 beïnvloed door de heersende omstandigheden, kunnen technieken zoals op grootte scheidende chromatografie en analytische centrifugatie niet gebruikt: worden om hun grootte vast te stellen. Daarentegen kan klassieke (of' statische) lichtverstrooiing worden gebruikt om microaggregaten te 20 detecteren en te analyseren door het meten van hun troebelheid. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) kan ook worden gebruikt. Metingen kunnen worden uitgevoerd op specifieke instrumenten of ze kunnen worden uitgevoerd in een fluori-meter met excitatie- en emissie-monochrometers, die gesteld 25 worden op dezelfde golflengte (bijv. 467 nm uit een xenon-lamp of 488 nm uit een argonlamp, die beide ver van de golflengtes liggen die worden geabsorbeerd door de analyt) en/of met behulp van geschikte filters (bijv. gele filters) , zodat de fluorimeter werkt als een 90° CLS-fotome-30 ter.

Wanneer lichtverstrooiing wordt gemeten, is een standaard spectroscopische parameter de 'Rayleigh-verhouding' (R0) . Wanneer lichtverstrooiing wordt gemeten onder een hoek van 35 90° ten opzichte van het invallende licht (d.w.z. wanneer Θ = 90°) , is de Rayleigh-verhouding bekend als R90 [zie 1028208 • t 19 bijv. ref. 42] en de 90° verstrooiing wordt gebruikt voor de troebelheidsmetingen.

Troebelheidsmetingen (verstrooiingsintensiteit onder 90°) 5 kan worden genormaliseerd ten opzichte van optisch zuivere tolueen, d.w.z. de troebelheidsmeting voor een standaard tolueenmonster wordt gedeeld door de Rj0 van tolueen. Door op deze manier te normaliseren kan de absolute waarde van de verstrooide lichtintensiteit worden bepaald.

10

Voor IL-2-microaggregaten van de uitvinding kan de troebelheid worden gemeten bij 467 nm of 488 nm bij 25°C. Vóór het vaststellen van de troebelheid kunnen de preparaten worden gecentrifugeerd of gefiltreerd om grote deeltjes te verwij-15 deren (bijv. geprecipiteerd eiwit), die anders de gegevens zullen verstoren. Wanneer ze gecentrifugeerd zijn, behouden de IL-2-preparaten van de uitvinding bij voorkeur ten minste 97% (bijv. & 98%, a 99%) van het totale IL-2 in de bovenstaande vloeistof.

20

Troebelheidsmetingen voor SDS/IL-2-mengsels kunnen als volgt worden omgezet in absolute waarden voor de specifieke troebelheid (r): 25 Tt - 0,98Ti 3,2 X 102 T'-__----------x ----------

Ti C

waarin: 30 Ti de troebelheidsintensiteit van het IL-2-prepa raat is

Tt de troebelheidsintensiteit van een tolueencon-trole is, C de concentratie van IL-2 in het IL-2-preparaat 35 is.

1 02820 8 ( 20

Wanneer Tt en Tt worden gemeten in cm*1 en C wordt gemeten in g/ml (d.w.z. g/cm3), dan is de eenheid van τ cmVg. Dit is de voorkeursmaat voor het vaststellen van de troebelheid van IL-2-preparaten van de uitvinding.

5 Preparaten van de uitvinding kunnen een specifieke troebelheid (r) hebben van minder dan 1,1 cm2/g, maar bij voorkeur groter dan 0,1 cm2/g. Voorkeurspreparaten hebben een τ kleiner dan 0,7 cm2/g. De preparaten van de uitvinding hebben bij voorkeur een r in het bereik van 0,3 - 0,6 10 cm2/g.

Dynamische lichtverstrooiing

Zoals beschreven in referentie 43, in het bijzonder in hoofdstuk 10, kan dynamische lichtverstrooiing (DLS) worden 15 gebruikt om de hydrodynamische diameter (of straal) van deeltjes in een oplossing te bepalen. SDS/IL-2-aggregaten van de uitvinding kunnen worden gedetecteerd met dynamische lichtverstrooiing (DLS). Wanneer gebruikt wordt gemaakt van DLS, hebben voorkeursaggregaten een gemiddelde hydrodynami-20 sche diameter tussen 8 nm en 20 nm, bij voorkeur tussen 10 nm en 15 nm, met meer voorkeur tussen 11 nm en 13 nm en met de meeste voorkeur ongeveer 12 nm. Zoals getoond in Figuur 17 zullen aggregaten diameters verdeeld rond dit gemiddelde hebben.

25

In de praktijk kunnen enkele grotere deeltjes worden gedetecteerd met DLS (bijv. de piek bij 54 nm in Figuur 17), maar de hierboven genoemde hydrodynamische diameter is die van de hoofdpiek in DLS, die in het algemeen zal staan 30 voor ten minste 98% (bijv. ten minste 95%, ten minste 97%, ten minste 99%, ten minste 99,5% of meer) in het DLS-spectrum. Ten minste 90% van de met DLS gedetecteerde deeltjes zullen dus het gespecificeerde gemiddelde hebben.

35 Interpretatie van DLS-gegevens kan gecompliceerd worden door de aanwezigheid van langzaam variërende componenten, zoals stofdeeltjes of mengverschijnselen. Om deze complica- 1028208 21 ties te vermijden zijn de IL-2-preparaten van de uitvinding voor de DLS-meting bij voorkeur vrij van deeltjes met een diameter groter dan ongeveer 1 μπ» (bijv. stofvrij) en dit kan tot stand gebracht worden door het gebruik van geschik-5 te filters, bijv. 0,22 μτη filters. De preparaten moeten ook goed gemengd zijn vóór de DLS-meting. Als DLS-meting een langzaam variërende component in het preparaat onthult, moeten de resultaten verworpen worden en moet de meting herhaald worden op een nieuw monster.

10

Het £nterleuklne-2 IL-2 is een welbekend eiwit en in werkwijzen en producten van de uitvinding kunnen alle geschikte vormen van IL-2 gebruikt worden. Het IL-2 zal gewoonlijk menselijk IL-2 15 zijn of het zal een IL-2-derivaat zijn dat zijn biologische activiteit in mensen behouden heeft.

IL-2 wordt van nature in mensen getranslateerd als een voorlopereiwit (bijv. het 153-meer in GenBank onder ins-20 chrijvingsnummer NP_000577.2). De voorloper wordt gesplitst (bijv. na Ser-20 in NP_000577.2) onder de vorming van een rijp product met een N-terminaal alanine (SEQ ID Nr. 4).

Wanneer het tot expressie wordt gebracht in E. coli, is het 25 gebruikelijk om het natuurlijke signaalpeptide te vervangen door een enkele N-terminale methioninerest (bijv. SEQ ID Nr. 3 en 4) . Indien tot expressie gebracht, wordt dit methionine zonder ingrijpen afgesplitst, waardoor de natuurlijke menselijke N-terminale alaninerest overblijft 30 (bijv. SEQ ID Nr. 3 wordt omgezet in SEQ ID Nr. 1).

Het IL-2 in PROLEUKIN™ mist de natuurlijke rest Ala-1. De afwezigheid van het gewone N-terminale alanine betekent dat het IL-2 in PROLEUKIN™ formeel een "des-alanyl-l"-vorm van 35 IL-2 wordt genoemd. Des-alanyl-l-vormen van IL-2 hebben de voorkeur voor gebruik in de uitvinding.

1 028208 * · 22 t

Het IL-2 in PROLEUKIN™ wordt ook zo ontworpen dat het twee interne cysteineresten heeft in plaats van de natuurlijke drie. Dit verlaagt het aantal mogelijke paringen van cysteineresten (en dus de intramoleculaire disulfidebrug-5 gen) van drie tot één [46] en verbetert het resultaat van opnieuw vouwen van het eiwit en de opslagstabiliteit. Deze vervanging van de natuurlijke rest Cys-125 door een serine-rest [44] betekent dat het IL-2 in PROLEUKIN™ formeel een "serine-125"-vorm van IL-2 wordt genoemd. Serine-125-vormen 10 van IL-2 hebben de voorkeur voor gebruik in de uitvinding. De drie-dimensionele kristalstructuur van een Ser-125-vorm van menselijk IL-2 dat in E. coli tot expressie wordt gebracht, is beschikbaar in de structuurgegevensbanken onder inschrijving '3INK'.

15

Er kunnen andere substituties in de aminozuursequentie van IL-2 aangebracht worden, in het bijzonder die waarbij de substitutie conservatief is, d.w.z. die welke’behoren tot een familie van aminozuren die in hun zij ketens verwant 20 zijn. Aminozuren kunnen worden verdeeld in vier families: (1) zure - aspartaat, glutamaat; (2) basische - lysine, arginine, histidine; (3) apolaire - alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, fenylalanine, methionine, tryptofaan; (4) ongeladen polaire - glycine, asparagine, 25 glutamine, cysteine, serine, treonine, tyrosine. Fenylalanine, tryptofaan en tyrosine worden soms geclassificeerd als de familie van aromatische aminozuren. Er kan bijvoorbeeld op redelijke wijze voorspeld worden dat een geïsoleerde vervanging van leucine door isoleucine of valine, 30 een aspartaat door een glutamine, een treonine door een serine, of een vergelijkbare conservatieve vervanging van een aminozuur door een structureel verwant aminozuur, geen groot effect zal hebben op de biologische activiteit. De vakman kan gemakkelijk gebieden van IL-2 bepalen die een 35 verandering kunnen tolereren op basis van natuurlijke variatie, uitlijning van actieve vormen van eiwitten enz.

1028208 23 en gesubstitueerde eiwitten kunnen worden getest op biologische activiteit, bijv. met standaard 86/504.

Een richtlijn voor gebieden van het IL-2^eiwit die veran-5 derd kunnen worden via substituties, deleties of inserties van resten, kan ook in het vakgebied gevonden worden (bijv. structuur/functie-relaties en/of bindingsstudies), zoals in de referenties 45 - 52 enz. Referentie 53 beschrijft een verscheidenheid aan IL-2-mutanten, waaronder: Ans-26-Gln; 10 Trp-121-Phe; deletie van alle resten na Agr-120; en de Met- 1-vormen daarvan. Referentie 44 beschrijft IL-2 met deletie of substitutie van Cys-125, met of zonder N-terminaal Ala. Referentie 54 beschrijft substitutie of deletie van resten, waaronder 2, 3, 4, 5, 6, 104 en 125. Met-104 is ontvanke-15 lijk voor oxidatie, zodat mutatie van deze rest (bijv. substitutie door Glu, Val, Ala enz.) de stabiliteit kan verbeteren [55]. Referentie 56 beschrijft substituties in IL-2 op Asp-20 (door His of Ile), op Asn-88 (door Arg, Gly of Ile) en/of op Gin-126 (door Leu of Glu) , die naar 20 vermeld een verlaagde toxiciteit en selectiviteit hebben voor IL-2-receptoren met hoge affiniteit. Referentie 57 beschrijft de substituties Arg-38-Ala en Phe-42-Lys om de toxiciteit te verlagen voor gebruik bij immuuntherapie. Referentie 58 beschrijft een mutatie van een natieve 25 tripeptidesequentie Xaa*-Asp-Xaa2, waarin Xaa1 Leu, Ile, Gly of Val is en Xaa2 Val, Leu of Ser is, teneinde vasculair lekken te verminderen. Referentie 59 beschrijft peptiden met een N-terminaal methionine gefuseerd aan de eerste 30 resten van IL-2, eventueel met een substitutie van Asp-20-30 Lys, waarvan gezegd wordt dat ze IL-2-achtige activiteit behouden hebben.

Andere bekende substituties omvatten: T7A, T7D, T7R, KSL, K9D, K9R, K9S, K9V, K9W, T10K, T10N, QUA, Q11R, E15A, 35 H16D, H16E, L19D, L19E, D20E, I24L, K32A, K32W, N33E, P34E, P34S, P34T, P34V, K35D, K35I, K35L, K35M, K35N, K35P, K35Q, K35T, L36A, L36D, L36E, L36F, L36G, L36H, L36I, L36K, L36M, 1028208 24 L36N, L36P, L36R, L36S, L36W, L36Y, R38D, R38N, R38P, R38S, L40D, L40G, L40N, L40S, T41E, F42A, F42E, F42R, F42T, F42V, K43H, F44K, M46I, E61K, E61M, E61R, E62T, E62Y, K64D, K64E, K64G, K64L, K64Q, P65D, P65E, P65F, P65G, P65H, P65I, P65K, 5 P65L, P65N, P65Q, P65R, P65S, P65T, P65V, P65Y, L66A, L66F, E67A, L72G, L72N, L72T, F78S, F78W, H79F, H79M, H79N, H79P, H79Q, H79S, H79V, L80E, L80G, L80K, L80N, L80R, L80T, L80V, L80W, L80Y, R81E, R81L, R81M, R81N, R81P·, R81T, D84R, S87T, N88D, N88H, N88T, V91A, V91D, V91E, V91F, V91G, V91N, V91Q, 10 L94A, L94I, L94T, L94V, E95D, E95G, E95M, T102S, T102V, · M104G, E106K, Y107H, Y107K, Y107L, Y107Q, Y107R, Y107T, E116G, N119Q, T123S, T123C, Q126I en Q126V.

Biologisch actieve varianten van IL-2 zullen in het alge-15 meen ten minste ongeveer 70% (bijv. a 80%, a 90%, a 95%, a 98%, a 99%) identiteit in aminozuren hebben met de amino-zuursequentie van het referentiepolypeptidemolecuul voor IL-2, zoals het hierboven besproken natieve menselijke IL- 2. Een variant kan bijvoorbeeld verschillen met slechts 1 -20 15 aminozuurresten, slechts 1-10 resten, zoals 6 - 10, slechts 5, slechts 4, 3, 2 of zelfs slechts 1 aminozuur-rest.

C-terminale verlenging van IL-2 is beschreven [60]. Het in 25 de uitvinding gebruikte IL-2 heeft bij voorkeur geen enkele C-terminale verlenging.

Andere vormen van IL-2 die gebruikt kunnen worden, omvatten niet^menselijke sequenties. Het IL-2 kan bijvoorbeeld 30 af stammen van: de resusaap (Mucucu mulatto; GenBank

Inschrijving P51598); "olive baboon" (Papio unubis; GenBank Q865Y1); "sooty mangabey" (Cercocebus torguatus atys; P46649); krabetende makaak (Macaca fascicularis; Q29615); gewone gibbon (Hylobates lar; ICG12); gewone "squirrel 35 monkey" (Saimiri sciureus; Q8MKH2); koe (Bos taurus; P05016 of NP-851340; rijpe sequenties die worden voorgesteld door de resten 24 - 158 van GenBank Inschrijvingsnummer NP- 1028208 • 25 851340);.waterbuffel (Bubalus bubalis; P19114); varken (sus scrofu; P26891); hert (Cervus elaphus; P51747); hond (Cania familiaris; Q29416); kat (Felis catus; 407885); konijn (Oryctolagus cuniculus; 077620); orka (Orcinus orca; 5 097513); "northern elephant seal" (Miroungu angustirostris; 062641); huismuis (Mus musculus; MP-032392); veldmuis (Mus spretus; 408867); Noorse rat (Rattus norvegicus; P17108); Mongoolse woestijnrat (Meriones unguiculatus; Q08081). Elk van de variante vormen die beschreven worden in deze 10 invoeren in GenBank, kunnen ook gebruikt worden. Deze invoeren in GenBank beschrijven in het algemeen de voorlo-persequenties die, zoals hierboven beschreven voor de menselijke sequentie, worden bewerkt onder de vorming van een uitëindelijke, biologisch actieve vorm, bijv. door 15 afsplitsing van de eerste 20 aminozuren.

Des-alanyl-1-, serine-125-vbrmen van menselijk IL-2 hebben in het bijzonder de voorkeur voor gebruik in de uitvinding. De vorm van IL-2 met de meeste voorkeur heeft de in Figuur 20 2 getoonde 132-meer aminozuursequentie (SEQ ID Nr. 1), zoals die gevonden wordt in PROLEUKIN™. Preparaten zijn bij voorkeur vrij van IL-2 dat geen N-terminaal Ala heeft. Het eiwit van Figuur 2 kan tot expressie gebracht worden met behulp van de in Figuur 4 getoonde nucleïnezuursequentie 25 (SEQ ID Nr. 2) na afsplitsing van het getranslateerde N-terminale methionine.

Het IL-2 in het product PROLEUKIN™ is ongeglycosyleerd als gevolg van de expressiegastheer E. coli. Ongeglycosyleerd 30 IL-2 heeft de voorkeur voor gebruik in de uitvinding.

Werkwijzen voor het detecteren van de aanwezigheid van IL-2 in een preparaat en voor het kwantificeren zijn bekend in het vakgebied. Immunologische detectie met behulp van anti-35 IL-2 antilichamen (bijv. ELISA) is de meest gangbare detectiewerkwijze en deze werkwijzen kunnen ook kwantitatief gebruikt worden. Andere kwantitatieve werkwijzen 1028208 * \ t 26 omvatten aminozuuranalyse, de eiwitbepaling volgens Lowry met een regulatoir goedgekeurde eiwitstandaard, HPLC-bepalingen en metingen van de intrinsieke ultravioletab-sorptie.

5

De standaard kwantitatieve maat voor IL-2 is de Internationale Eenheid (IE), die niet gebaseerd is op de massa van het eiwit, maar op zijn activiteit in' een biologische bepaling. Volgens standaard 86/504 is 1 IE de hoeveelheid 10 IL-2 die 50% van de maximale proliferatie van een gevestigde IL-2-afhankelijke cellijn produceert [61], CTLL-2. Kwantificering van IL-2-activiteit in andere preparaten wordt tot stand gebracht door het vergelijken van dosis-respons-curven van het preparaat met beschikbare standaar-15 den (bijv. de standaard ampul met IL-2 van de WHO, die 100 ΙΕ/ml bevat na reconstitutie) met behulp van een analyse van parallelle lijnen, of met computersoftware zoals het programma ALLFIT [62, 63]. In de praktijk, wanneer de productie gestandaardiseerd is, is een omzetting tussen 20 gewicht van het geneesmiddel en IE's mogelijk. Voor het product PROLEUKIN™ is de omzetting bijvoorbeeld: 1,1 mg IL-2 is gelijk aan 18 x 106 IE.

De activiteit kan worden omgezet in een specifieke activi-25 teit (d.w.z. de activiteit per massaeenheid van IL-2, bijv. ΙΕ/mg) door deze te delen door de massa van het IL-2 dat aanwezig is. Een voorkeurspreparaat van dé uitvinding heeft een specifieke activiteit tussen 16 en 17 MlU/mg.

30 Farmaceutische preparaten

De werkwijzen van de uitvinding geven IL-2/SDS-microaggre-gaten die geschikt zijn voor farmaceutisch gebruik in, mensen en derhalve verschaft de uitvinding een farmaceutisch preparaat dat IL-2/SDS-microaggregaten van de uitvin-35 ding bevat. In plaats van microaggregaten direct na diafil-tratie te gebruiken, zullen ze echter in het algemeen vóór toediening aan patiënten worden geformuleerd.

1028208 27

De microaggregaten kunnen bijvoorbeeld worden verdund om een standaard concentratie te geven, terwijl de verhouding IL-2/SDS behouden wordt. Verdunning tot een IL-2-concentratie van ongeveer 1,1 mg/ml is gebruikelijk.

5

De microaggregaten (bijv. na verdunning) kunnen worden gemengd met stabiliserende middelen, in het bijzonder als ze gevriesdroogd moeten worden. De toevoeging van suikers (bijv. saccharose, trehalose) is gebruikelijk om stabili-10 teit tijdens het vriesdrogen te geven en een stabiliserend middel met voorkeur is mannitol. Deze suikeralcohol kan worden toegevoegd tot een eindconcentratie tussen 40 en 50 (bijv. ongeveer 45,5) mg mannitol per mg IL-2 (50 mg voor 1,1 mg IL-2). Menselijk serumalbumine (bij voorkeur recom-15 binant) kan ook toegevoegd worden als stabiliserend middel. Mengsels van suikers kunnen ook gebruikt worden, bijv. saccharose & mannitol, trehalose & mannitol, enz.

Er kan een buffer aan het microaggregaatpreparaat worden; 20 toegevoegd, bijv. een Tris-buffer, een histidinebuffer, een glycinebuffer of, bij voorkeur, een fosfaatbuffer (die bijv. natriumdiwaterstoffosfaat en dinatriumwaterstoffosfaat bevat). Toevoeging van buffer tot een pH tussen 7,2 en 7,8 heeft de voorkeur en in het bijzonder een pH van 25 ongeveer 7,5.

Preparaten die de microaggregaten bevatten, kunnen worden gesteriliseerd, in het algemeen door middel van filterste-rilisatie, bijv. door een 0,22 μπι filter. Dit kan worden 30 voorafgegaan door filtratie door een filter met grotere poriën.

Waterige preparaten die de microaggregaten bevatten, kunnen direct worden verpakt in spuiten, klaar voor injectie. Ze 35 kunnen ook worden verpakt in vernevelaars, klaar voor inhalatie.

1028208 % » 28 ι

Waterige preparaten die de microaggregaten bevatten, kunnen worden gevriesdroogd vóór distributie. Waterig of gevriesdroogd materiaal kan worden verpakt in houders (bijv. flesjes), die daarna hermetisch kunnen worden afgesloten.

5 Vriesdrogen zal in het algemeen plaatsvinden in flesjes, waarbij deze na het vriesdrogen worden afgesloten. Gevriesdroogd materiaal equivalent aan 22 x 106 IE IL-2 kan verpakt worden in een enkel flesje als een eenheidsdosis voor reconstitutie in een uiteindelijk waterig volume van 10 ongeveer 1,1 ml onder de vorming van ongeveer 18 x 10* IE/ml. Fractionele hoeveelheden (bijv. 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/8) daarvan kunnen ook worden verpakt als eenheidsdoses. In het bijzonder kunnen eenheidsdoses van ongeveer 9 x 10* IE, ongeveer 4,5 x 106 IE en ongeveer 14 x 106 IE worden 15 gebruikt.

Voor reconstitutie na het vrièsdrogen kan steriel water voor injectie worden gebruikt. Het is ook mogelijk om een gevriesdroogde koek te reconstitueren met een waterig 20 preparaat dat menselijk serumalbumine (bij voorkeur recombinant) bevat. Reconstitutie in een waterig volume tussen 1,0 ml en 1,2 ml heeft de voorkeur (d.w.z. IL-2 kan worden verdund om dezelfde concentratie te geven als vóór het vriesdrogen). Dit gereconstitueerde materiaal kan daarna 25 aseptisch worden verdund in een groter volume vloeistof voor intraveneus infuus, bijv. in ongeveer 50 ml van een D5W-oplossing (5% Dextrose Injection). De specifieke troebelheid blijft nagenoeg constant tijdens verdunning in D5W, totdat de IL-2-concentratie daalt beneden ongeveer 0,1 30 mg/ml. De verdunning kan plaatsvinden in diverse houders, bijv. glazen flessen, plastic (bijv. polyvinylchloride) zakken enz. Verdunning tot een uiteindelijke IL-2-concentratie buiten het bereik van 30 - 70 Mg/ml moet vermeden worden. Omstandigheden die veranderingen in de microaggre-35 gatie veroorzaken, moeten vermeden worden, bijv. reconsti tutie met Bacteriostatisch Water voor Injectie of met 0,9% Natriumchloride voor Injectie.

1028208 * · 29 (

Een eerste farmaceutisch preparaat met voorkeur is dus een t waterig preparaat met een pH van ongeveer 7,5, dat 1,1 mg/ml IL-2, 0,18 mg SDS, 50 mg/ml mannitol en fosfaatbuffer omvat, waarbij het IL-2 en SDS microaggregaten vormen 5 waarin het gemiddelde aantal IL-2-moleculen per aggregaat tussen 10 en 50 ligt. Deze preparaten kunnen vanuit gevriesdroogd materiaal weer gereconstitueerd worden.

Een tweede farmaceutisch preparaat met voorkeur is het 10 product van de verdunning van het eerste farmaceutisch preparaat met voorkeur in een D5W-oplossing.

Voorkeurspreparaten zijn vrij van conserveermiddel, vrij van antibiotica en vrij van eiwitten anders dan IL-2 15 (inclusief vrij van BSA), d.w.z. deze materialen zijn ondetecteerbaar.

i

Farmaceutische werkwijzen en toepassingen

De uitvinding verschaft een werkwijze voor het behandelen 20 van een patiënt, die het toedienen van een farmaceutisch preparaat van de uitvinding aan de patiënt omvat. De patiënt is bij voorkeur een mens en het kan een kind zijn (bijv. een dreumes of een peuter), een tiener of een volwassene, maar het zal in het algemeen een volwassene 25 zijn.

De uitvinding verschaft ook SDS/IL-2-microaggregaten van de uitvinding voor gebruik als een geneesmiddel.

30 De uitvinding verschaft ook het gebruik van microaggregaten van de uitvinding bij de productie van een geneesmiddel voor het behandelen van een patiënt.

Deze toepassingen, werkwijzen en geneesmiddelen zijn bij 35 voorkeur voor de behandeling van een kanker, in het bijzonder die met vaste tumoren, zoals niercelcarcinoom of melanoom, welke kanker metastatisch kan zijn. De toepassin- 1028208 30 gen, werkwijzen en geneesmiddelen kunnen ook worden gebruikt voor de behandeling van patiënten die een weefsel-of orgaantransplantaat hebben ontvangen of die op het punt staan om er een te ontvangen. De toepassingen, werkwijzen 5 en geneesmiddelen kunnen ook worden gebruikt voor de behandeling van patiënten die geïnfecteerd zijn met HIV, inclusief die met en zonder AIDS.

Patiënten voor behandeling met de uitvinding zullen daarom 10 gediagnostiseerd zijn met een kanker. Patiënten die niet behandeld moeten worden volgens de uitvinding, kunnen echter omvatten: (1) patiënten met overgevoeligheid voor IL-2 of een willekeurige andere component van het farmaceutische preparaat; (2) patiënten met een prestatiestatus van 15 de ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) % 2; (3) patiënten met tegelijkertijd een prestatiestatus van de ECOG >1 en meer dan één orgaan met metastatische zieke plaatsen en een periode van < 24 maanden tussen de eerste diagnose van een primaire tumor en de datum dat de patiënt 20 beoordeeld wordt voor IL-2-behandeling; (4) patiënten met een aanzienlijke geschiedenis of huidig bewijs van ernstige hartziekte; (5) patiënten met bewijs van een actieve infectie die antibioticumtherapie vereist; (6) patiënten met een Pa02 < 60 mm Hg in rust; (7) patiënten met reeds 25 bestaande ernstige dysfunctie van belangrijke organen; en (8) patiënten met metastasen van het centraal zenuwstelsel of attaquestoornissen, met uitzondering van patiënten met succesvol behandelde hersenmetastasen.

30 Werkwijzen voor het controleren van de werkzaamheid van een therapeutische IL-2-behandeling zijn bekend in het vakgebied.

De curven van de half waarde ti jd van IL-2 in het serum van 35 mensen na intraveneuze bolustoediening of infuus kunnen beschreven worden als bi-exponentieel. Voor een bolus is de Tx/2a 8 minuten en de Τ1/2β is 88 minuten; voor een infuus is 1028208 ♦ 31 de τι/2α 15 minuten en de T1/2j5 is 96 minuten. Waargenomen serumconcentraties zijn evenredig aan de IL-2-dosis.

Kenmerken van geschikte geneesmiddelen zijn hierboven 5 gegeven in de paragraaf getiteld 'Farmaceutische preparaten' . Deze preparaten zullen in het algemeen direct aan een patiënt worden toegediend. Direct aanlevering kan tot stand gebracht worden door parenterale injectie (d.w.z. intraveneus, subcutaan, intraperitoneaal, intramusculair of in de 10 interstitiële ruimte van een weefsel), of door rectale, orale, vaginale, topische, transdermale, intranasale, oculaire, aurale, pulmonale of een andere toediening aan slijmvliezen. In het algemeen wordt IL-2 echter toegediend door intraveneuze injectie (bijv. continu infuus of bolus) 15 of door subcutane injectie (bijv. continu infuus of bolus).

De IL-2-dosis wordt gewoonlijk aangepast aan de lichaams-grootte van de patiënt, die gemeten wordt ofwel aan de hand van het lichaamsgewicht (kg) of aan de hand van het li-20 chaamsoppervlak (BSA; gemeten in m2, gemeten of geschat aan een hand van de combinatie van de lengte en het gewicht van een patiënt). Hoewel er geen exacte omzetting tussen gewicht en BSA is, kan dit goed geschat worden: voor een persoon met een gemiddeld gewicht en lengte (50ste percen-25 tiel voor elk), 25000 IE/kg = 1 MIU/m2.

De behandeling kan een schema, van een enkele dosis of een schema van meerdere doses zijn. Doses kunnen worden gegeven in een bolus of door een infuus. Een kenmerkend behandelre-30 giem voor IL-2 is om 18 x 106 IE per m2 per 24 uur toe te dienen als een continu infuus gedurende 5 dagen, gevolgd door 2-6 dagen zonder IL-2 te ontvangen, daarna nog eens 5 dagen van intraveneus IL-2 als een continu infuus zoals hiervoor en dan 3 weken zonder IL-2 te ontvangen. Dit is 35 een enkele 'inductiecyclus' voor IL-2. Na de rustperiode van 3 weken in de eerste cyclus kan een tweede inductiecy-clus beginnen. Er kunnen tot vier onderhoudscycli gegeven 1 02820 8 % · 32 worden met intervallen van 4 weken aan patiënten die reageren of stabilisatie van de ziekte vertonen. Als een patiënt dit doseringsregiem niet kan tolereren, moet de dosis echter verlaagd worden of moet de toediening onder-5 broken worden totdat de toxiciteit afgenomen is. Een ander behandelregiem voor IL-2 is om elke 8 uur 6 x 105 IE per kg toe te dienen in een intraveneuze bolus, 14 doses over 5 dagen, waarbij een tweede behandeling na een rustperiode van 9 dagen wordt gegeven.

10

Voorkeurstoedieningen omvatten: intraveneus infuus voor de behandeling van metastatisch niercelcarcinoom; intraveneus infuus voor de behandeling van metastatisch melanoom; subcutane bolus voor de behandeling van metastatisch 15 niercelcarcinoom; subcutaan infuus voor de behandeling van metastatisch niercelcarcinoom; pulmonale toediening door « inhalatie voor de behandeling van metastatisch niercelcarcinoom met longmetastasen.

20 Combinatietherapieën IL-2-microaggregaten van de uitvinding kunnen worden gebruikt als het actieve bestanddeel van farmaceutica. Dergelijke farmaceutica kunnen als zodanig worden gebruikt om patiënten te behandelen of ze kunnen worden gebruikt 25 samen met andere actieve bestanddelen. In het algemeen zal het IL-2 niet worden gemengd met het andere actieve bestanddeel vóór toediening; het IL-2 en het andere actieve bestanddeel zullen daarentegen toegediend worden als afzonderlijke onafhankelijke medicijnen in een gecombineerd 30 protocol. Combinatietherapie is bijzonder geschikt om kankers te behandelen, waaronder kwaadaardige en metastati-sche kankers.

De uitvinding verschaft dus (a) IL-2-microaggregaten van de 35 uitvinding en (b) een tweede farmaceutisch middel voor gelijktijdige afzonderlijke of achtereenvolgende toediening.

1028208 ♦ 33

De uitvinding verschaft ook een farmaceutisch preparaat of systeem dat omvat (a) een eerste farmaceutisch middel, dat IL-2-microaggregaten van de uitvinding bevat; en (b) een tweede farmaceutisch middel, waarbij deze eerste en tweede 5 middelen ofwel gemengd zijn of afzonderlijke preparaten zijn, bijv. voor gelijktijdige afzonderlijke of achtereenvolgende toediening.

De uitvinding verschaft ook een kit die omvat (a) een 10 eerste farmaceutisch middel, dat IL-2-microaggregaten van de uitvinding bevat; en (b) een tweede farmaceutisch middel.

De uitvinding verschaft ook het gebruik van (a) IL-2-15 microaggregaten van de uitvinding en (b) een tweede farmaceutisch middel bij de bereiding van een combinatiegenees-middel.

De uitvinding verschaft ook het gebruik van IL-2-microag-20 gregaten van de uitvinding bij de productie van een geneesmiddel, waarbij dit geneesmiddel bedoeld is voor toediening aan een patiënt die vooraf behandeld werd met een tweede farmaceutisch middel. Evenzo verschaft de uitvinding het gebruik van een tweede farmaceutisch middel bij de produc-25 tie van een geneesmiddel, waarbij het geneesmiddel bedoeld is voor toediening aan een patiënt die vooraf behandeld werd met IL-2-microaggregaten van de uitvinding. De voorbehandeling kan recent zijn (bijv. binnen 24 voorafgaand aan toediening van dit geneesmiddel), ertussenin (bijv. meer 30 dan 24 uur ervoor, maar niet langer dan 4 weken), langer geleden (bijv. ten minste, 4 weken ervoor), of zeer lang geleden (bijv. ten minste 6 maanden ervoor), waarbij deze tijdstippen verwijzen naar de meest recente voorbehandeldo-sis. De patiënt kan ongevoelig zijn voor behandeling met 35 het farmaceutisch middel dat in de voorbehandeling werd toegediend.

1028208 * 34 ι

De uitvinding verschaft ook het gebruik van IL-2-microag- gregaten van de uitvinding bij de productie van een geneesmiddel, waarbij het geneesmiddel wordt toegedierid tegelijk met een tweede farmaceutisch middel. Op vergelijkbare wijze 5 verschaft de uitvinding het gebruik van een tweede farmaceutisch middel bij de productie van een geneesmiddel, waarbij het geneesmiddel tegelijk met IL-2-microaggregaten van de uitvinding wordt toegediend. De twee middelen worden bij voorkeur binnen 4 uur na elkaar toegediend.

10

Tweede farmaceutische middelen met voorkeur worden gekozen uit de volgende tabel, die ook details over de aandoeningen omvat waarvoor de combinatietherapie gebruik kan worden om te behandelen (en indien passend, basale details over hoe 15 de combinatietherapie toegediend kan worden): ! 1028208 35

Tweede middel Voor behandeling van

Een anti-CD20 antili- Non-Hodgkins lymfoom. Chroni-chaam, zoals rituximab, sche Lymfocytenleukemie. In ibritumomab of tositumo- het bijzonder wanneer een NHL-5 mab, bijv. Rituxan™, patiënt ongevoelig is voor

Mabthera™, Zevaliri™, behandeling met rituximab

HuMax-CD20™, Bexxar™

Een anti-CD40 antili- Non-Hodgkins lymfoom. Multipel chaam myeloom. Chronische lymfocy- tenleukemie 10 Een anti-Her2 antili- Borstkanker. In het bijzonder chaam, zoals trastuzu- wanneer de patiënt ongevoelig mab, bijv. Herceptin™ is voor behandeling met tras- tuzumab

Een anti-EGFR antili- Niet-kleine cel-longkanker of

chaam, zoals cetuximab, dikkedarmkanker. In het bij-15 bijv. Erbitux™ zonder wanneer een tumor EGFR

in overmaat tot expressie brengt. In het bij zonder wanneer een patiënt ongevoelig is voor behandeling met cetuximab .

Een anti-VEGF antili- Dikkedarmkanker.

chaam, zoals bevacizu-mab, bijv. Avastin™

Een anti-CD52 antili- Chronisch lymfocytenleukemie.

20 chaam, zoals alemtuzu-mab,.bijv. Campath™

Een anti-CD33 antili- Acute myeloide leukemie, chaam, zoals gemtuzumab, bijv. Mylotarg™ 1028208 » 36

Een H2-receptoragonist, Voortgeschreden kwaadaardig zoals histamine of een melanoom (bijv. in stadium farmaceutisch aanvaard- IV), acute myelogene leukemie baar zout van histamine, of niercelcarcinoom. In het 5 bijv. histamine-dihydro- bijzonder als de patiënt le-chloride vermetastase heeft.

Beide middelen kunnen worden gegeven via subcutane injectie .

Voor een melanoom: IL-2 sub-cutaan twee keer per dag (BID) op dag 1 & 2 van week 1 & 3, en dag 1-5 van week 2 & 4; histamine-diHCl subcutaan over 10-30 min. op dag 1 - 5 in alle 4 de weken.

Voor acute myelogene leukemie, start na autologe stamcel-transplantatie of na chemotherapie .

Bacille Calmette-Guerin Blaaskanker.

(BCG) IL-2 kan worden toegediend via een Foley-katheter.

Thalidomide Non-Hodgkins lymfoom.

10 Lenalidomide Multipele myeloom.

Proteasoomremmers, zoals Non-Hodgkins lymfoom.

bortezomib, bijv. Velca- de™ 'CVP', dat een combina- Non-Hodgkins lymfoom.

15 tie is van: cyclofosfa- Gegeven via intraveneuze in-mide, vincristine en jectie.

prednison ------ 1028208 ( 37 'CHOP', dat een combine- Non-Hodgkins lymfoom. tie is van: cyclofosfa- Cyclofosfamide, hydroxydoxoru-mide, hydroxydoxorubici- bicine, vincristine worden ne, vincristine en pred- gegeven door middel van intra-5 nison veneuze injectie; prednison wordt gegeven als orale tablet.

'CHOP-R', dat een combi- Non-Hodgkins lymfoom.

natie is van 'CHOP' met In het bijzonder voor pati- een rituximab. enten die ongevoelig zijn voor 'CHOP' of 'R' alleen.

'CVP-R', dat een combi- Non-Hodgkins lymfoom.

10 natie is van 'CVP' met In het bijzonder voor pati- een rituximab. enten die ongevoelig zijn voor 'CVP' of 'R' alleen.

Interferon-α ('IFNa') Borstkanker, dikkedarmkanker of niercelcarcinoom.

Interferon-γ ('IFNy') Kanker 5-fluoruracil ('5-FU') Borstkanker, dikkedarmkanker of niercelcarcinoom.

15 Combinatie van 5-FU & Borstkanker, dikkedarmkanker IFNor of niercelcarcinoom.

Anti-retrovirale verbin- HIV.

dingen

Een tyrosinekinaserem- Niercelkanker of melanoom.

20 mer, zoals Bay43-9006 of SU11248

Decitabine Schildklierkanker, myelodys- plastische syndromen, melanoom of niercelcarcinoom.

Wanneer het tweede middel een antilichaam is, is het bij 25 voorkeur een monoklonaal antilichaam, met meer voorkeur een 1028208 38 gehumaniseerd of menselijk antilichaam. Antilichamen zullen in het algemeen worden toegediend door middel van injectie, bijv. subcutaan of intraveneus. Antilichamen kunnen geconjugeerd zijn aan andere actieve middelen, bijv. tiuxetan, 5 ozogamicine, radionucliden, mI enz., in het bijzonder voor kankertherapie.

In het algemeen kan het tweede middel elk antilichaam zijn dat ADCC (antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxici-10 teit) verschaft. Op IL-2 gebaseerde combinatietherapie is nuttiger met antilichamen die ADCC veroorzaken om kanker te behandelen dan met middelen die kanker behandelen door remming van de vascularisatie of door de signaaltransductie in de celcyclus te veranderen.

15

Definities

De term ^omvatten" omvat "omvatten" alsook "bestaan uit", bijv. een preparaat dat X "omvat" kan uitsluitend bestaan uit X of het kan daarnaast nog iets anders omvatten, bijv. 20 X + Y.

De term "ongeveer" in verband met een numerieke waarde x betekent bijvoorbeeld x ± 10%. Indien noodzakelijk kan de term "ongeveer" weggelaten worden.

25

Het woord "nagenoeg" sluit "compleet" niet uit, bijv. een preparaat dat "nagenoeg vrij is" van Y, kan compleet vrij zijn van Y. Indien noodzakelijk kan het woord "nagenoeg" worden weggelaten uit de definitie van de uitvinding.

30

Het percentage sequentie-identiteit kan worden bepaald met behulp van de homologiezoekalgoritme van Smith-Waterman, waarbij gebruik wordt gemaakt van een zoektocht naar een affiene tussenruimte met een "gap open penalty" van 12 en 35 een "gap extension penalty" van 2, een BLOSUM matrix van 62. De homologiezoekalgoritme van Smith-Waterman wordt geleerd in referentie 64.

1028208 39

KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN

Figuur 1 toont de toename in specifieke troebelheid (r) naarmate SDS wordt verwijderd tijdèns diafiltratié.

5 Figuur 2 en 3 tonen de aminozuur sequentie van IL-2 in het product PROLEUKIN™ (SEQ ID Nr. 1). Deze sequentie (i) mist het N-terminale methionine van SEQ ID Nr. .3, (ii) mist de alaninerest die gevonden wordt op het N-uiteinde van natuurlijk/ rijp, menselijk IL-2, dat te zien is in SEQ ID 10 Nr. 4; en (iii) heeft een serinesubstitutie op de rest Cys-125 die te zien is in SEQ ID Nr. 4.

Figuur 4 toont een nucleotidensequentie die codeert voor de sequentie in Figuur 2 (SEQ ID Nr. 2, die de start- en 15 stopcodons omvat en tot expressie wordt gebracht als SEQ ID Nr. 3 vóór afsplitsing van het N-terminale methionine). De getallen aan de linkerkant geven het getal van de eerste base in elke rij aan, geteld vanaf het 5'-uiteinde van de (+)-DNA-streng van het IL-2-gen. De getallen onder de 20 aminozuursequentie geven de nummers van de resten aan, geteld vanaf het N-uiteinde van natief menselijk IL-2. De pijlen duiden op nucleotideverschillen ten opzichte van menselijk IL-2 (d.w.z. de verschillen tussen SEQ ID Nr. 2 en 5) .

25

Figuur 5 toont de specifieke troebelheid (r, cm2/g) van zeven monsters die gebruikt werden voor farmacokinetisch testen, met verschillende SDS-concentraties (μg SDS per mg IL-2), en Figuur 6 toont het aandeel van totaal IL-2, dat 30 in de zeven monsters kon worden afgecentrifugeerd.

Figuur 7 toont de biologische plasma-activiteit voor zes van de zeven monsters. Figuur 8 vergelijkt de monsters met 160 μg/τng en 25 μg/mg; en Figuur 9 is een samenvoeging van 35 Figuur 7 en 8. De X-assen tonen de tijd (uren) na injectie; de Y-assen tonen de biologische plasma-activiteit (ng/ml).

1028208 ♦ 40

Figuur 10 toont de τ (cm2/g) tegen de SDS-concentratie (mg/^g) tijdens diafiltratie en Figuur 11 zet r om in MW (kDa).

5 Figuur 12 toont de daling in SDS-concentratie tijdens diafiltratie.

In Figuur 13 zijn de troebelheidsresultaten van Figuur 10 bij het profiel van SDS-verwijdering van Figuur 12 gevoegd.

10

Figuur 14 toont het effect van vriesdrogen op de τ (cma/g). Vierkantjes tonen de waarden vóór het vriesdrogen en rondjes tonen de waarden na vriesdrogen. De X-as toont de SDS-concentratie van de monsters (μg/mg).

15

Figuur 15 toont de biologische activiteit van IL-2-microag-gregaten vóór en na verdunning met serum en een vergelijking met monomeer IL-2.

20 Figuur 16 en 17 toont lichtverstrooiingsspectra voor IL-2-microaggregaten. Figuur 16 is verdeeld naar massa van de componenten in de oplossing en Figuur 17 is verdeeld naar aantal.

25 WIJZEN VOOR HET UITVOEREN VAN DE UITVINDING 1/ Bereiding van IL-2-microaggregaten E. coli getransformeerd met een plasmide dat de nucleoti-densequentie van Figuur 4 herbergt, werden gekweekt onder standaard omstandigheden, zodanig dat IL-2-eiwit met de 30 sequentie van Figuur 2 tot expressie werd gebracht. Na de kweek was IL-2 hoofdzakelijk in de vorm van inclusieli-chaampjes.

De eerste winning van IL-2 omvatte concentrering, openbre-35 ken van de cellen, diafiltratie, inactivering, opnieuw openbreken en suspenderen in saccharose. Concentrering van de geoogste cellen werd uitgevoerd met behulp van kruis- 1 028208 « * 41 stroomfilters om het werkvolume te verlagen met ongeveer ♦ een factor vijf. De cellen werden opengebroken door middel van homogenisatie om isolatie van de IL-2-inclusielichaam-pjes te vergemakkelijken. Zouten van de fermentatiemedia 5 werden verwijderd door middel van diafiltratie en de gastheerbacteriên in de gediafiltreerde oplossing werden gedood door de toevoeging van een alcohol. Na de alcoholbe-handeling werden de cellen opengebroken door middel van homogenisatie. Er werd saccharose toegevoegd om een mengsel 10 van hogere dichtheid te verkrijgen om afscheiding van de IL-2-inclusielichaampjes van de celafbraakproducten tijdens centrifugatie mogelijk te maken. De pasta met IL-2-deeltjes werd verzameld door centrifugatie, in porties verdeeld en bewaard bij -70°C of kouder tot verdere opwerking.

15

De pasta met IL-2-deeltjes werd in oplossing gebracht met SDS en gereduceerd met dithiotrèitol (DTT) om een monomere vorm van oplosbaar IL-2 te verkrijgen zonder enige disulfi-debinding. Deze bewerkingsstap werd uitgevoerd om de 20 opbrengst te verhogen wanneer het IL-2 wordt gechromato-grafeerd in de volgende stap.

De monomere oplosbare vorm van IL-2 werd gezuiverd met een werkwijze die de stappen omvatte van op grootte scheidende 25 chromatografie (SEC), oxidatie, concentrering, RP-HPLC, precipitatie en centrifugatie. De eerste chromatografische stap met SEC werd uitgevoerd om IL-2 af te scheiden van gastheereiwitten en nucleïnezuren. De fracties met IL-2 werden verzameld en samengevoegd. Het IL-2 werd geoxideerd 30 om de intramoleculaire disuifidebinding te verkrijgen. Concentrering van de IL-2-oplossing werd uitgevoerd met behulp van ultrafiltratie teneinde het werkvolume te verkleinen. De tweede chromatografische stap, preparatieve RP-HPLC, werd uitgevoerd om IL-2 af te scheiden van bacte-35 riële endotoxinen, nucleïnezuren en gastheereiwitten, en om isovormen van IL-2 te verwijderen, waaronder geoxideerde vormen. De fracties met IL-2 wérden verzameld en samenge 1028208 ♦ 42 voegd. Het IL-2 werd geprecipiteerd door de toevoeging van natriumhydroxide (NaOH) en verzameld door centrifugatie. Deze bewerkingsstap werd uitgevoerd om oplosmiddelen die in de zuivering met RP-HPLC werden gebruikt, te verwijderen. 5 Het materiaal in dit stadium wordt de "HPLC-pasta" genoemd.

De HPLC-pasta werd daarna opnieuw in oplossing gebracht door het toevoegen van een oplossing van '0,05 M Na2HP04 + 1% SDS. Wanneer SDS wordt toegevoegd tot een voldoende hoge 10 concentratie, dan bevat het preparaat voornamelijk monomeer opgelost IL-2, maar een kleine hoeveelheid geoligomeriseerd IL-2 (d.w.z. covalent gekoppelde IL-2-moleculen in de vorm van oligomeren) kan zich gevormd hebben tijdens de zuivering. Deze oligomeren werden verwijderd door middel van 15 gelfiltratie, hetgeen ook alle resterende organische oplosmiddelen uit de vorige stappen verwijdert.

Omdat SDS toxisch kan zijn voor cellen, wordt het uit het in oplossing gebrachte IL-2 verwijderd. De oplossing wordt 20 gediafiltreerd tegen 10 mM natriumfosfaatbuffer van pH 7,5, totdat het SDS-niveau ongeveer 160 /ig/mg IL-2 bereikt. Microaggregaten van IL-2 en SDS beginnen zich te vormen bij ongeveer 500 - 600 Mg/mg en hun grootte neemt geleidelijk toe naarmate de hoeveelheid SDS verder a£neemt tot het 25 doelniveau van 160 Aig/mg (Figuur 1). Deze verwijdering van SDS, wat de sleutel is voor de vorming van microaggregaten, is de laatste stap in de zuiveringswerkwijze van IL-2 vóór formulering.

30 2/ Vorming van IL-2-microaggregaten voor farmaceutisch gebruik

Het gediafiltreerde SDS/IL-2-mengsel dat microaggregaten bevatte, werd getest op eiwitconcentratie (mg/ml) door de absorptie bij 280 nm te delen door de extinctiecoêfficiênt 35 van IL-2 (0,79). Het volume van de gediafiltreerde IL-2-oplossing werd ook gemeten (ml). De totale hoeveelheid IL- 2-eiwit (mg) werd berekend door het volume van de gediafil- 1028208 t 43 treerde IL-2-oplossing te vermenigvuldigen met de eiwitcon-centratie. Het uiteindelijke werkvolume (ml) voor formulering werd berekend door het totaal aantal mg eiwit te vermenigvuldigen met een factor 0,909. Door deze factor 5 wordt rekening gehouden met verlies van IL-2 tijdens filtratie.

Om het IL-2 te stabiliseren tijdens het' vriesdrogen werd 1/4 volume van een 20%-ige mannitoloplossing toegevoegd tot 10 een uiteindelijke mannitolconcentratie van 5% (d.w.z. 50 mg/ml) . Er werd ook 10 mM natriumfosfaatbuffer van pH 7,5 toegevoegd tot het uiteindelijke werkvolume. Nadat de mannitol en buffer waren toegevoegd, werd de IL-2-concentratie in de geformuleerde oplossing bepaald door de 15 absorptie bij 280 nm te meten.

Het eindresultaat na formulering was een groot volume oplossing van pH 7,5, die bevatte: IL-2 in een eindconcen-tratie van 1,1 ± 0,05 mg/ml; 0,18 mg/ml SDS; 50 mg/ml 20 mannitol; 0,17 mg/ml monobasisch natriumfosfaat; en 0,89 mg/ml dibasisch natriumfosfaat.

De geformuleerde IL-2-bulkoplossing werd via een filter gesteriliseerd in een steriele bulktank. Materiaal wordt 25 uit deze tank overgebracht in steriele flesjes. In elk flesje werd 1,2 ml bulkoplossing gebracht. De flesjes werden vervolgens in een vriesdroger geplaatst en gevriesdroogd. Vervolgens werden stoppen aangebracht en de stoppen werden oversealed. De flesjes werden vervolgens van een 30 etiket voorzien en verpakt.

3/ Effect van de SDS-concentratie op de troebelheid

Voordat het voorkeursconcentratiebereik van SDS werd bereikt, werd IL-2 bereid met de hierboven beschreven 35 werkwijze, behalve dat grote monsters (-300 mg IL-2) op diverse tijdstippen werden verwijderd tijdens de diafiltra- 1028208 « · 44 tie voor onderzoek naar de troebelheid teneinde het effect van SDS op IL-2-aggregaten vast te stellen.

Figuur 12 toont de SDS-concentratie tijdens diafiltratie 5 van het uitgangsmateriaal. De concentratie daalt als een rechte lijn op de logaritmische as. Monsters werden verwijderd bij de volgende SDS-concentraties (/xg/mg IL-2) : 1195, 536, 351, 217, 173, 137, 123, 104 en 72.

10 De zuiverheid van het IL-2 was in elk monster hetzelfde (100% volgens SDS-PAGE, 2 98,5% volgens HPLC). De troebelheid werd gemeten bij 488 nm en omgezet in een absolute specifieke troebelheid (r) zoals hierboven beschreven, gebaseerd op de IL-2-concentratie in de monsters. De 15 resultaten worden getoond in Figuur 10 en in Figuur 13 zijn de troebelheidsresultaten samengevoegd met het profiel van SDS-verwijdering van Figuur.12.'

Beneden ongeveer 300 /zg/ml neemt de troebelheid geleidelijk 20 toe en de toename wordt zeer steil beneden ongeveer 95 Mg/mg.

De τ-waarden kunnen worden omgezet in afgeleide molucuulge-wichten met de volgende formule: 25 r x 107 MW --------- 8,1 + 2r

De resultaten van deze omzetting voor monsters vóór het 30 vriesdrogen worden getoond in Figuur 11. Deze en andere gegevens tonen aan dat een MW overeenkomend met monomeer IL-2 wordt gezien bij een waarde hoger dan 600 μg/mg en het MW begint significant te stijgen wanneer SDS beneden ongeveer 300 /xg/mg komt, waarbij de toename zeer steil 35 wordt wanneer het SDS daalt beneden ongeveer 100 Mg/mg.

1028208 45 I »

Op basis van het MW van monomeer IL-2 (15,3 kDa voor natief \ IL-2) kan het molecuulgewicht van een aggregaat worden omgezet in een afgeleid getal voor IL-2-monofneren per . aggregaat.

5 4/ Vriesdrogen en specifieke troebelheid

Tijdens de diafiltratie voor de verwijdering van SDS werden monsters van 15 ml verwijderd bij de volgende SDS-concen-traties: 1155; 840; 585; 400; 190; en 155 μg/m^ IL-2. De 10 troebelheid van deze monsters werd bepaald zowel vóór als na formulering (d.w.z. na de toevoeging van mannitol, fosfaatbuffer, vriesdrogen en reconstitutie). In beide gevallen werden de troebelheidsmetingen voorafgegaan door filtratie door een 0,2 /«n filter om alle grote aggregaten 15 te verwijderen.

Figuur 14 toont het effect van 'vriesdrogen op de τ (logaritmische schaal) voor deze monsters. De grafiek laat zien dat vriesdrogen de microaggregaten niet vernietigt, maar 20 dat dit vaak de specifieke troebelheid iets kan verhogen (d.w.z. de aggregaten nemen toe in grootte), zonder de afhankelijkheid van de SDS-concentratie te beïnvloeden. Het effect is in het algemeen klein over het voorkeursbereik van SDS.

25 5/ Dynamische lichtverstrooiing IL-2-microaggregaten werden bereid zoals hierboven beschreven, met een SDS-concentratie van 160 μg/mg, en ze werden geanalyseerd met DLS. De resultaten worden getoond in 30 Figuur 16 en 17. Figuur 16 toont de DLS-resultaten verdeeld over de massa van de componenten in de oplossing en Figuur 17 toont ze naar aantal.

In Figuur 16 heeft de hoofdpiek een gemiddelde dynamische 35 diameter van 12,7 nm en deze stelt 99,02% van de totale massa voor. Er is ook een piek stroomafwaarts met een gemiddelde diameter van 55,6 nm, die de resterende 0,98% 1028208 46 van massa voorstelt. In Figuur 17 heeft de hoofdpiek een gemiddelde hydrodynamische diameter van 11,7 nm en deze stelt 99,99% van het totale aantal voor. Er is ook een piek stroomafwaarts met een gemiddelde diameter van 53,7 nm, die 5 de resterende 0,01% van de deeltjes voorstelt.

6/ Vergelijking van microaggregaten va. monomeer IL-2

Micro-geaggregeerd IL-2 werd vergeleken met monomeer IL-2 in diverse tests. IL-2-microaggregaten werden bereid zoals 10 hierboven beschreven. Voor verlijkingsdoëleinden werd IL-2 bereid in monomere vorm, waarbij Tween 80 werd gebruikt als het detergens in plaats van SDS. Dit detergens vormt geen microaggregaten met IL-2, maar het detergens brengt het IL-2 wel in oplossing en geeft een biologisch actief monomeer 15 product.

Van beide vormen van IL-2 werd bevestigd dat ze biologisch actief zijn. Het geaggregeerde IL-2 heeft een activiteit rond 20 MlU/mg. Indien ex vivo verdund met serum, daalde de 20 activiteit iets. In beide gevallen was de activiteit iets hoger dan die van monomeer IL-2 (Figuur 15). IL-2-microaggregaten van de uitvinding zijn dus in staat te dissociëren onder de vorming van een biologisch actief product en de biologische activiteit is equivalent aan die van IL-2 dat 25 niet geaggregeerd is.

De in vivo verdeling van radioactief gemerkt IL-2 werd vergeleken na intraveneuze toediening van het eiwit ofwel in de vorm van microaggregaten met SDS of in monomere vorm. 30 De microaggregaatvorm werd met voorkeur verdeeld naar longen, lever en nier, terwijl het monomere product voor bijna 100% verdeeld werd naar de nier. Microaggregatie heeft daarom een belangrijke invloed op de in vivo verdeling.

Micro-geaggregeerd en monomeer IL-2 werden ook vergeleken in een tumormetastasemodel. B16F10 tumorcellen werden 35 1028208 47 intraveneus geïnjecteerd in de staarten van muizen en 14 dagen later werden de longen geïnspecteerd op tumoren. Behandelde dieren ontvingen dagelijks IL-2 van dag 3 tot 10. Het mediane aantal longmetastasen op dag 14 was als 5 volgt:

Dosis (mg/kg) IL-2/SDS-microag- IL-2/Tween 80 gregaten xnonoxneer 15 1 16 10 3 26 10 7,5 4,5 49 5 24 53,5 1 60 59,5 0,1 88,5 72 15 De microaggregaatvorm van IL-2 is dus effectiever in het tumormodel dan de monomeré vorm, omdat metastasen voorkomen kunnen worden met behulp van veel lagere dosis IL-2. Omdat IL-2 zelf toxisch kan zijn, zijn de gegevens niet direct vergelijkbaar; 10 mg/kg IL-2 in microaggregaten kan bijv.

20 ongeveer 1/2 van een testpopulatie doden. De meest betekenisvolle vergelijking is dus met de hoogste niet-letale dosis, namelijk bij 7,5 mg/kg. In deze equitoxische dosis was het mediane aantal metastasen dat gezien werd met microaggregaten 4,5 (bereik 1 - 18), vergeleken met 16 25 (bereik 4 - 57) met monomeer IL-2, waarbij het verschil statistisch significant is. Dit verschil staat voor een 3-tot 5-voudige betere therapeutische index voor de microaggregaatvorm van IL-2.

30 Verdere studies met dit kunstmatige B16 metastasemodel onthulde dat SDS-concentraties in het eindproduct de werkzaamheid niet blijken te beïnvloeden. Een preparaat met 160 μ9/ιη1 SDS presteerde op dezelfde manier als een met 181 1028208 4 t 48 »

Mg/mg. Met SDS in het bereik van 95 - 250 μg/mg blijft dus de anti-tumor activiteit optimaal, terwijl de SDS-gerela-teerde toxiciteit vermeden wordt.

5 7/ Farmacokinetieche effecten van de ultelndelijke 8DS- concentratie

Zoals hierboven getoond, neemt de troebelheid van IL-2/SDS-mengsels toe naarmate de SDS-concentraties dalen tijdens diafiltratie. In een farmacokinetische test werd de diafil-10 tratie voortgezet ver voorbij het kenmerkende doeleinde van 160 μg/mgl tot zelfs 25 μg/mg^ In diverse stadia tijdens het diafiltratieproces werden monsters genomen: 1090 μg/mg; 200 Mg/mg; 160 Mg/mg; 125 μg/mg; 95 μg/mg} 65 μg/xng} en 25 Mg/mg.

15

Alle monsters behalve het meest verdunde (25 μg/ml) waren zichtbaar helder en Figuur 5 tóont de specifieke troebelheid (r) van de zeven monsters. De daling in τ in de laagste concentratie weerspiegelt een enorme toename in 20 eiwitprecipitatie bij 25 jug/mg, wat met het oog zichtbaar was. Figuur 6 toont het aandeel van totaal IL-2 dat kon worden af gecentrifugeerd in de zeven monsters en een grote toename is te zien bij de laagste SDS-concentratie, terwijl de hogere concentraties in wezen constant zijn. Dit gepre-25 cipiteerde materiaal bezonk en veroorzaakte dus geen troebelheid, hetgeen de lage τ-waarde in Figuur 5.

In tegenstelling tot de variërende troebelheid en precipi-tatie was de biologische activiteit (IE) in wezen constant 30 voor de zeven monsters (rond 19 IE/mg).

Om de farmacokinetiek te onderzoeken werden alle monsters, behalve de meest verdunde, geïnjecteerd als een bolus in de staartader van ratten (drievoud per SDS-dosis, 18 ratten in 35 totaal) in een hoeveelheid van 0,2 mg IL-2 per kg lichaamsgewicht, gebaseerd op een allometrische extrapolatie van een menselijke dosis. Bloedmonsters werden genomen 1, 3, 5, 1028208 49

I I

7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 en 60 minuten na de injectie en geanalyseerd op biologische IL-2-activiteit. Figuur 7 toont de biologische plasma-activiteit (ng/ml) van deze monsters. Tussen 0,5 uur en 1 uur is de bovenste lijn de dosis 160 5 Mg/mg () en de onderste lijn is 65 Mg/mg (δ), hoewel alle lijnen zeer vergelijkbaar zijn.

In een tweede studie werd het monster mèt de hoogste lijn in het eerste experiment (160 Mg/mg) vergeleken met het 10 meest verdunde monster (25 Mg/mg). De farmacokinetische parameters van het 160 μg/mg monster in de tweede studie kwamen overeen met die uit de eerste studie. Hoewel de lijnen in Figuur 7 alle vergelijkbare vormen hebben, gaf echter het meest verdunde monster zeer verschillende 15 resultaten (Figuur 8) . De klaringsnelheid berekend aan de hand van de curven verschilde met ongeveer een factor 30: 12,7 ml/minuut/kg voor de dosis 160 μg/vDg en 362 ml/mi-nuut/kg voor de dosis 25 M9/m9· 20 Wanneer de resultaten van de twee experimenten worden vergeleken, is het meest verdunde monster duidelijk verschillend van de andere zes monsters (Figuur 9).

De aggregatiestatus van IL-2 heeft dus een duidelijk effect 25 op zijn in vivo farmacokinetiek.

8/ Vrij 8DS

In de bovenstaande experimenten wordt de totale SDS-concen-tratie in SDS/IL-2-mengsels gemeten. Er werden experimenten 30 uitgevoerd om te kijken hoeveel van het totaal aan SDS geassocieerd was met IL-2 en hoeveel vrij in oplossing bleef.

Flesjes met het product PROLEUKIN™ werden gereconstitueerd 35 volgens de aanwijzingen en ze werden geültrafiltreerd door Centricon 30 membranen (grenswaarde 10 kDa) door twee keer te centrifugeren bij 3000 rpm gedurende steeds 30 minuten.

1028208 » t 50

Het uitgangsmonster en het filtraat werden getest op SDS-en IL-2-concentraties. SDS werd gemeten met de acridine- oranje-bepaling [35]. In het kort gezegd omvat deze bepaling: neem 0,5 ml monster; voeg 0,1 ml 1,75 M NaHS04-oplos-5 sing toe; voeg 0,1 ml 1% (w/v) acridine-oranjeoplossing toe; voeg 1,5 ml tolueen toe; sluit af; vortex gedurende 3 minuten; scheidt organische en waterige fasen, bijv. door middel van centrifugatie gedurende 5 minuten bij 3000 rpm en omgevingstemperatuur; meet de absorptie van de bovenste 10 oranje laag bij 499 nm. De monsters kunnen vóór de bepaling verdund worden (bijv. met zuiver water) om ze binnen het bereik van een standaardcurve te brengen; bijv. als de standaardcurve gebaseerd is op bekende SDS-concentraties tot 25 /xg/ml, dan moet het monster verdund worden om de 15 SDS-concentratie in dit bereik te brengen. De blanco voor de spectrofotometrische stap moet een standaard zonder SDS zijn, die op dezelfde manier behandeld is als het experimentele monster.

20 De resultaten toonden aan dat IL-2 totaal werd vastgehouden door de ultrafiltratiemembranen (niet detecteerbaar in het filtraat), terwijl ongeveer 35% van het SDS in staat was het membraan te passeren.

25 Het zal duidelijk zijn dat de uitvinding enkel beschreven is aan de hand van een voorbeeld en dat er modificaties in details kunnen worden aangebracht zonder af te wijken van de geest en het kader van de uitvinding.

1028208

« I

51 REFERENTIES (waarvan de volledige inhoud hierin wordt » opgenomen als referentie) [1] Hora et al. (1990) Biotechnology (N Y) Ö: 755-8.

[2] Amerikaans octrooischrift 4.569.790.

5 [3] Meyers et al. (1991) Clin. Pharmacol. Ther. 49: 307-13.

[4] Amerikaans octrooischrift 4.604.377.

[5] Hora et al. (1992) Dev. Biol. Stand. 74: 295-306.

[6] WO 85/04328.

10 [7] Amerikaans octrooischrift 4.748.234.

[8] Ho et al. (1992) Vaccine 10: 209-13.

[9] Geigert et al. (1993) Hoofdstuk 8 van Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs: Case Histories (red. Wang & Pearlman). ISBN 0-306- 15 44365-1.

[10] Vemuri (1992) Dev. Biol. Stand. 74: 341-51.

[11] Anderson et al. (1992) Am. J. Hosp. Pharm. 49: 608-12.

[12] Johnston et al. (1992) Pharm. Res. 9: 425-34.

20 [13] Anderson et al. (1992) J. Immunother. 12: 19-31.

[14] Anderson & Sorenson (1994) Clin. Pharmacokinet.

27: 19-31.

[15] Konigsberg et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1370: 243-51.

25 [16] Kanaoka et al. (2001) J. Pharm. Pharmacol. 53: 295-302.

[17] Ozbas-Turan et al. (2002) J. Pharm. Sci. 91: 1245-51.

[18] Bergmann et al. (1991) Mol. Immunol. 28(1-2): 99- 30 105.

[19] Amerikaans octrooischrift 4.908.434.

[20] Amerikaans octrooischrift 4.925.919.

[21] Amerikaans octrooischrift 4.853.332.

[22] Amerikaans octrooischrift 5.464.939.

35 [23] Amerikaans octrooischrift 5.824.330.

[24] Amerikaans octrooischrift 4.778.879.

[25] Amerikaans octrooischrift 4.992.271.

1028208

4 I

t 52 [26] Amerikaans octrooischrift 5.037.644.

[27] Amerikaans octrooischrift 5.078.997.

[28] Amerikaans octrooischrift 4.816.440.

[29] EP-B-0268110 .

5 [30] EP-B-0217645.

[31] Heinig & Vogt (1999) Electrophoresis 20: 3311-28.

[32] Nomura & Murakami (1999) Bunseki Kagaku 48: 111-6.

[33] Fielden & Claesson (1998) J. Colloid Interface Sci. 198: 261-5.

10 [34] Gabor & May (1996) Abstract # C-04, 1996 PDA

Science Forum Poster Abstracts.

[35] Sokoloff & Frigon (1981) Analytical Biochem. 118: 138-41.

[36] Arakawa et al. (1994) Jut. «7.. Pept. Protein Res.

15 43: 583-7.

[37] Amerikaans octrooischrift 4.738.927.

[38] Amerikaans octrooischrift 4.656.132.

[39] Amerikaans octrooischrift 4.530.787.

[40] Amerikaans octrooischrift 4.572.798.

20 [41] Amerikaans octrooischrift 4.931.543.

[42] Hoofdstuk 8 van Biological Spectroscopy (Campbell & Dwek). ISBN 0-8053-1849-6.

[43] Piccora (1985) Dynamic Light Scattering. Plenum

Press, New York.

25 [44] Amerikaans octrooischrift 4.518.584.

[45] Bazan (1992) Science 257: 410-2.

[46] Wang et al. (1984) Science 224: 1431-3.

[47] McKay (1992) Science 257: 412.

[48] Theze et al. (1996) Immunol. Today 17: 481-6.

30 [49] Buchli & Ciardelli (1993) Arch. Biochem. Biophys.

307: 411-5.

[50] Collins et al. (1988) PNAS USA 85: 7709-13.

[51] Kuziel et al. (1993) J. Immunol. 150: 5731.

[52] Eckenberg et al. (1997) Cytokine 9: 488-98.

35 [53] EP-A-0136489.

[54] Amerikaans octrooischrift 4.752.585.

[55] EP-A-0200280 1028208 ( 53 [56] WO 99/60128.

[57] Amerikaans octrooischrift 5.229.109.

[58] WO 00/58456.

[59] Amerikaans octrooischrift 6.168.785.

5 [60] Ahmad et al. (1994) J. Protein Chem. 13: 591-8.

[61] Rossio (1997) Cytokinea and immune cell producta.

Pagina 348-356 van Manual of Clinical and Labora-tory Immunology, 5de uitgave (red. Rosé, deMaca-rio, Folds, Lane, Nakamura).

10 [63] Wadha et al. (2000) Quantitative biological aseaya 4 for individual cytokines. Pagina 207-239 van Cytokine Cell Biology: A Practical Approach (red. Balkwill). ISBN 0-19-96360-8.

[64] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-9.

15 1 02820 8 • 54 ‘ • » φ , SEQLIST (final).txt

SEQUENCE LISTING

<110> CHIRON CORPORATION

<120> PREPARING ALDESLEUKIN FÖR PHARMACEUTICAL USÉ <13 0> NLP174889 <160> 5 <170> SeqWin99, version 1.02 <210> 1 <211> 132

<212> PRT

<213> Artificial Sequence <220> <223> Mature des-alanyl-1 serine-125 variant of human interleukin-2 <400> 1

Pro Thr ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu 1 5 10 . 15

Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile LeuAsn Gly ile Asn Asn Tyr Lys Asn 20 25 30

Pro Lys Leü Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pró Lys Lys 35 40 45

Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glü Glu Leu Lys Pro 50 55 60

Leu Glu Glu val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 65 70 75 80

Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn val Ile val Leu Glu Leu Lys 85 90 95

Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 100 105 110

Ile val Glu Phe. Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe ser Gin ser Ile ile ' 115 120 125

Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 402

<212> DNA

<213> Artiflcial Sequence <220> <223> Des-alanyl-1 serine-125 variant of human interleukin-2 <400> 2 atgcctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct tttctcagag catcatctca aicactgactt ga 402 <210> 3 <211> 133

<212> PRT

1028208 55 , SEQLIST (final).txt <213> Artificial Sequence <220> ' <22B> Nascent des-alanyl-1 serine-125 variant of human interleukin-2 i . . · ' <400> 3

Met Pro Thr Ser Ser ser Thr Lyis Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His 1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gin Mét He Leu Asn Gly He Asn Asn Tyr Lys 20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 ' . Arg Pro Arg Asp Leu He ser Asn Hé Asn val He val Leu Glu Leu 85 90 95

Lys Gly ser Glu Thr Thr Phe Met cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110

Thr He val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Thr phe ser Gin Ser He 115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Ala Pro Thr ser ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu Gin Leu Glu His 1 5 10 15

Leu Lèu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gin cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gin ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn ile Asn Val Ile val Leu Glu Leu 85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Thr Phe cys Gin Ser ile 115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 405 1028208 ♦ « ' * * 56 ' I · .

SEQLIST (final).txt

<212> DNA

<213> Artificia! Sequence <220> <223> Human il-2 sequence with Met in place of signa! <400> 5 atggcaccta cttcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 60 gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 120 ctcacattta agttttacat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta. 180 gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatttag ctcaaagcaa aaactttcac · 240 ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 300 gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 360 agatggatta ccttttgtca aagcatcatc tcaacactaa cttga 405 1028208

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van inter'leukine-2 voor farmaceutisch gebruik, die de volgende stappen omvat: 5 (a) het toevoegen van natriumdodecylsulfaat (SDS) aan een. preparaat dat interleukine-2 omvat, tot een uiteindelijke: SDS-concentratie van ten minste 500 /xg SDS per mg IL-2; (b) het verlagen van de SDS-concentratie om het SDS gedeeltelijk maar niet geheel uit het preparaat te verwijderen, ter 10 verkrijging van een preparaat dat tussen 95 en 250 μg SDS per mg interleukine-2 bevat.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de uiteindelijke SDS-concentratie in stap (a) ten minste 900

15 Aig/mg is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of conclusie 2, waarbij het product van stap (b) een SDS-concentratie heeft tussen 135 en 180 Mg/mg. 20

4. Werkwi j ze voor het bereiden van een preparaat dat interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat omvat, waarbij: (i) interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat in het preparaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten; en (ii) de 25 werkwijze de volgende stappen omvat: (a) het toevoegen van natriumdodecylsulfaat aan een preparaat dat interleukine-2 omvat, waarbij voldoende natriumdodecylsulfaat wordt toegevoegd om monomeer in oplossing gebracht interleukine-2 te geven, en (b) het verlagen van de concentratie natrium- 30 dodecylsulfaat tot een niveau waarbij het interleukine-2 aggregaten vormt met natriumdodecylsulfaat, zodat het preparaat na vriesdrogen en reconstitutie een specifieke troebelheid (t) heeft van minder dan 1,1 cma/g.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij de aggregaten een gemiddelde hydrodynamische diameter tussen 8 nm en 20 nm hebben. 1028208 * ·

6. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij de SDS-concentratie wordt verlaagd door middel van diafiltratie.

7. Werkwij ze volgens één van de voorgaande conclu sies, omvattende een gelfiltratiestap tussen de stappen (a) en (b) teneinde alle geprecipiteerde covalente IL-2-multi-meren te verwijderen.

8. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclu sies, die verder een stap omvat van: toevoeging van manni- tol.

9. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclu- 15 sies, die verder een stap omvat van: vriesdrogen.

10. Preparaat dat interleukine-2 en natriumdode- cylsulfaat omvat, waarbij interleukine-2 én natriumdode-cyl sulfaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten en 20 waarbij de aggregaten verkregen kunnen worden met de werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies.

11. Preparaat dat interleukine-2 en natriumdode-cylsulfaat omvat, waarbij interleukine-2 en natriumdode- 25 cylsulfaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten en waarbij het preparaat één of meer van de volgende kenmerken heeft: (i) het preparaat heeft een specifieke troebelheid (r) lager dan 1,1 cm2/g; 30 (ii) het preparaat bevat SDS/IL-2-aggregaten met een gemiddelde hydrodynamische diameter tussen 8 nm en 20 nm; en/of (iii) het preparaat bevat tussen 95 en 250 ^g SDS per mg interleukine-2. 35

12. Gevriesdroogd preparaat dat interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat omvat, waarbij het preparaat kan 1028208 ♦ • * worden gereconstitueerd met een waterig medium om het preparaat van conclusie 11 te geven.

13. Werkwijze of preparaat volgens één van de 5 voorgaande conclusies, waarbij de specifieke troebelheid van het preparaat minder dan 0,7 cm2/g is.

14. Werkwijze of preparaat volgens conclusie 13, waarbij de specifieke troebelheid van het preparaat tussen 10 0,3 cm2/g en 0,6 cm2/g ligt.

15. Werkwijze of preparaat volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het preparaat SDS/IL-2- microaggregaten met een hydrodynamische diameter tussen 11 15 nm en 13 nm omvat.

16. Werkwijze of preparaat volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het preparaat mannitol bevat in een concentratie tussen 40 en 50 mg mannitol per mg IL- 20 2.

17. Werkwijze of preparaat volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het IL-2 een menselijk IL-2 is. 25

18. Werkwijze of preparaat volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het IL-2 een des-alanyl-1-IL-2 is. 3 0 19. Werkwijze of preparaat volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het IL-2 een serine-125-IL-2 is.

20. Werkwijze of preparaat volgens één van de 35 voorgaande conclusies, waarbij het IL-2 menselijk des-ala-nyl-l,serine-125-IL-2 is. 1 028208 • »

21. Werkwijze of preparaat volgens één van de voorgaande' conclusies, waarbij het IL-2 de aminozuursequentie SEQ ID Nr. 1 heeft.

22. Werkwijze of preparaat volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij het IL-2 ongeglycosyleerd is.

23. Werkwijze of preparaat volgens één van de 10 voorgaande conclusies, waarbij het IL-2 gezuiverd wordt na expressie in een recombinante prokaryotische gastheer.

24. Preparaat volgens één van de conclusies 10 -23, met een IL-2-concentratie van ongeveer 1,1 mg/ml. 15

25. Gevriesdroogd farmaceutisch preparaat dat, wanneer wordt gereconstitueerd met 1,2 ml steriel water voor injectie, in elke milliliter bevat: 1,1 mg ongeglycosyleerd menselijk des-alanyl-1,serine-125-IL-2; 50 mg 20 mannitol; 0,18 mg natriumdodecylsulfaat (SDS); 0,17 mg monobasisch natriumfosfaat; en 0,89 mg dibasisch natrium-fosfaat tot pH 7,5, waarbij het IL-2 en SDS in de vorm van aggregaten zijn, zodanig dat het gereconstitueerde preparaat een specifieke troebelheid (r) lager dan 1,1 cm2/g 25 heeft.

26. Waterig farmaceutisch preparaat, dat verkregen kan worden door het gevriesdroogde preparaat volgens conclusie 25 te reconstitueren met 1,2 ml steriel water 30 voor injectie.

27. Preparaat volgens één van de conclusies 10 -26 en een tweede farmaceutisch middel voor gelijktijdige afzonderlijke of opeenvolgende toediening. 35 1 028208 ♦ >

28. Kit die omvat: (a) het preparaat volgens één van de conclusies 10 - 26; en (b) een tweede farmaceutisch middel.

29. Preparaat volgens één van de conclusies 10 - 26 voor gebruik in de geneeskunde.

30. Gebruik van microaggregaten van (a) interleu-kine-2 en (b) natriumdodecylsulfaat bij de bereiding van 10 een geneesmiddel voor toediening aan een patiënt, waarbij de microaggregaten een gemiddelde hydrodynamische diameter tussen 8 nm en 20 nm hebben.

31. Gebruik van een preparaat dat zowel interleu-15 kine-2 als natriumdodecylsulfaat omvat, bij de bereiding van een geneesmiddel voor toediening aan een patiënt, waarbij het interleukine-2 en natriumdodecylsulfaat aanwezig zijn in de vorm van aggregaten en waarbij hét preparaat één of meer van de volgende kenmerken heeft: 20 (i) het preparaat heeft een specifieke troebelheid (t) lager dan 1,1 cm2/g; (ii) het preparaat bevat SDS/IL-2-aggregaten met een gemiddelde hydrodynamische diameter tussen 8 nm en 20 nm; en/of 25 (iii) het preparaat bevat tussen 95 en 250 μg SDS per mg interleukine-2.

32. Gebruik volgens conclusie 30 of conclusie 31, waarbij het geneesmiddel bedoeld is voor het behandelen van 30 kanker.

33. Gebruik volgens conclusie 32, waarbij de kanker niercelcarcinoom is.

34. Gebruik volgens conclusie 32, waarbij de kan ker melanoom is. 1 028208 » % >

35. Gebruik volgens één van de conclusies 30 - 34, waarbij de patiënt voorbehandeld is met een tweede farmaceutisch middel.

36. Gebruik volgens één van de conclusies 30-34, waarbij het geneesmiddel gelijktijdig met een tweede farmaceutisch middel wordt toegediend.

37. Gebruik van een tweede farmaceutisch middel 10 bij de bereiding van een combinatiegeneesmiddel voor toediening aan een patiënt, waarbij de patiënt voorbehandeld is met het preparaat volgens één van de conclusies 10 - 26.

38. Gebruik van een tweede farmaceutisch middel bij de bereiding van een combinatiegeneesmiddel voor toediening aan een patiënt, waarbij het geneesmiddel gelijktijdig met het preparaat volgens één van de conclusies 10 - 26 wordt toegediend. 20

39. Gebruik van (a) microaggregaten van interleu-kine-2 en natriumdodecylsulfaat en (b) een tweede farmaceutisch middel bij de bereiding van een combinatiegeneesmiddel, waarbij de microaggregaten een gemiddelde hydrody- 25 namische diameter tussen 8 nm en 20 nra hebben.

40. Preparaat volgens conclusie 27, kit volgens conclusie 28 of gebruik volgens één van de conclusies 35 -39, waarbij het tweede farmaceutische middel een monoklo- 30 naai antilichaam is.

41. Preparaat volgens conclusie 27, kit volgens conclusie 28 of gebruik volgens één van de conclusies 35 -39, waarbij het tweede farmaceutische middel een antili- 35 chaam is dat ADCC verschaft. 1028208 • ♦

42. Preparaat volgens conclusie 27, kit volgens » conclusie 28 of gebruik volgens één van de conclusies 35 -39, waarbij het tweede farmaceutische middel wordt gekozen uit de groep die bestaat uit: een anti-CD20-antilichaam; .5 een anti-CD40-anti lichaam; een anti-Her2-antilichaam; een anti-EGFR-antilichaam; een anti-VEGF-antilichaam; een anti CD52-antilichaam; een anti-CD33-antilichaam; een H2-recep-toragonist; Bacille Calmette-Guerin; thalidomide; Lenalido-mide; een proteasoomremmer; een combinatie van cyclofosfa-10 mide, vincristine en prednison; een combinatie van cyclo-fosfamide, hydroxydoxorubicine, vincristine en prednison; een cytokine; interferon-a; interferon-γ; 5-fluoruracil; een anti-retrovirale verbinding; een tyrosinekinaseremmer; en Decitabine. 15

43. Preparaat, kit of gebruik volgens conclusie 42, waarbij de H2-receptoragonist histamine of een farmaceutisch aanvaardbaar zout van histamine zoals histamine-dihydrochloride is. 20 -o-o-o- 1028208