MXPA06012041A

MXPA06012041A - Inmunizacion contra el serogrupo y meningococico usando proteinas.

Info

Publication number: MXPA06012041A
Application number: MXPA06012041A
Authority: MX
Inventors: Mario Contorni; Marzia Giuliani; Mariagrazia Pizza
Original assignee: Chiron Srl
Priority date: 2004-04-22
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2007-01-25
Also published as: US10195264B2; RU2006140958A; GB0408977D0; BRPI0510104A8; JP2007533729A; ES2401481T3; ES2401481T5; JP2011105777A; CN1946420A; EP1737486B1; JP4918479B2; US20100143418A1; RU2378009C2; AU2005235265A1; EP1737486A2; BRPI0510104A; CY1114179T1; EP1737486B2; CA2566509A1; CA2566509C

Abstract

La presente invencion se relaciona con el dogma establecido para el meningococo que consiste en la inmunizacion contra los serogrupos A, C, W135 e Y que se basara en los cuatro diferentes sacaridos capsulares, y que la inmunizacion contra el serogrupo B no se basara en el sacarido capsular. Por el contrario, la invencion usa antigenos polipeptidicos y/o OMVs para inmunizar contra los serogrupos A, C, W135 e Y (y contra el serogrupo Y en particular). Los polipeptidos del serogrupo B pueden lograr esta proteccion, permitiendo de esta manera que vacuna simple basada en un polipeptido se use para la proteccion contra todos los serogrupos A, B, C, W135 e Y.

Description

los países desarrollados. Después del serogrupo, la clasificación incluye serotipo, serosubtipo y después inmunotipo y la nomenclatura estándar lista al serogrupo, serotipo, serosubtipo e inmunotipo cada uno separado por un colon, por ejemplo B: 4 : Pl .15 :L3, 7, . Dentro del serogrupo B, algunos linajes causan a menudo enfermedad (hiperinvasora) , algunos linajes causan formas más graves de enfermedades que los otros (hipervirulentos ) y otros causan raramente una enfermedad. Se reconocen siete linajes hipervirulentos, es decir, los subgrupos I, III y IV-1, complejo ET-5, complejo ET-37, grupo ?4 y linaje 3. Estos se han definido por electroforesis enzimática multilocus (MLEE, por sus siglas en inglés) , pero el listado de secuencias multilocus (MLST, por sus siglas en inglés) también se ha usado para clasificar los meningococos [ref. 1] . Hasta la fecha, las vacunas contra el serogrupo A, C, W135 e Y han usado sus sacáridos capsulares como antigenos. Se ha conocido durante muchos años una licencia de vacuna de polisacárido de humano contra estos cuatro serogrupos [ref. 2,3]. Más recientemente, el foco ha permanecido sobre los sacáridos, pero en la conjugación para portar proteínas. Las vacunas conjugadas contra el serogrupo C se han aprobado para el uso humano, e incluyen Menjugate™ [4] , Meningitec™ y NeisVac-C™. Las mezclas de los conjugados de los serogrupos A+C son conocidas [5,6] y se han reportado de los serogrupos A+C+W135+Y [7-10] . El sacárido capsular del serogrupo B no puede usarse para la vacunación porque es un auto-antigeno en los humanos. Los sacáridos del serogrupo B químicamente modificado se han propuesto [11], pero no se han adoptado para el uso clínico. Las vacunas a base de vesículas de membrana externa también se han probado [por ejemplo, ver la ref. 34], pero la protección proporcionada por estas vacunas se restringe típicamente a la cepa usada para hacer la vacuna. Las secuencias genómicas para los serogrupos A [12] y B [13,14] se han reportado, y la secuencia del serogrupo B se ha estudiado para identificar los antígenos de vacunas [por ejemplo, refs. 15 a 20]. Los antígenos candidatos se han manipulado para mejorar la expresión heteróloga [refs. 21 a 23] . De esta manera, el dogma establecido para el meningococo es que la inmunización contra los serotipos A, C, W135 e Y se basará en los cuatro diferentes sacáridos capsulares y que la inmunización contra el serogrupo B no será basada en el sacárido capsular.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En contraste con este dogma, los inventores han encontrado que la inmunización contra los serogrupos A, C, W135 e Y (y contra el serogrupo Y en particular) puede lograrse usando los antigenos polipeptidicos . Además, han encontrado que los polipéptidos del serogrupo B pueden alcanzar esta protección, permitiendo de esta manera que se use una vacuna a base de polipéptido simple para la protección contra todos los serogrupos A, B, C, W135 e Y. De esta manera, la invención proporciona un método para inmunizar a un paciente contra la infección por el serogrupo Y de Neisseria meningitidis, que comprende administrar al paciente una composición que comprende uno o más polipéptidos inmunogénicos . De manera similar, la invención proporciona el uso de uno o más polipéptidos inmunogénicos en la manufactura de un medicamento para inmunizar a un paciente contra la infección por el serogrupo Y de N. meningitidis. La invención también proporciona un método para inmunizar a un paciente contra la infección por el serogrupo Y de Neisseria meningitidis, que comprende administrar al paciente una composición que comprende OMVs meningocócicas . De manera similar, la invención proporciona el uso de OMVs meningocócicas en la manufactura de un medicamento para inmunizar a un paciente contra la infección por el serogrupo Y de N. meningitidis. Los métodos y usos son de preferencia para inmunizar a un paciente contra la infección por el serogrupo Y y también contra por lo menos uno de los serogrupos A, B, C y W135. Cuando un paciente está siendo inmunizado contra un serogrupo dado de meningococo, entonces la composición de preferencia no incluye un sacárido capsular de tal serogrupo (ya sea conjugado o no conjugado) . De esta manera, las composiciones preferidas no incluyen un sacárido capsular del serogrupo Y, y tampoco . pueden incluir un sacárido capsular de los serogrupos ?, B, C y/o W135. Las composiciones para el uso de acuerdo con la invención pueden prepararse usando las técnicas conocidas, tales como las técnicas para preparar antigenos de polipéptido meningocócico descritos en las referencias 15-24, o las técnicas conocidas para preparar OMVs descritas en las referencias 34-38. Se prefiere el uso de los antigenos de polipéptidos purificados al uso de otras vesículas de membrana exterior. Las vacunas contra los patógenos, tales como virus de hepatitis B, difteria y tétanos contienen por lo regular un antígeno de proteína simple (por ejemplo, el antígeno de superficie HBV o un toxoide de tétanos) . Por el contrario, las vacunas para la tos- ferina acelular contienen por lo regular por lo menos tres proteínas de B. pertussis y la vacuna neumocócica Prevenar™ contiene siete antígenos de sacáridos conjugados separados. Otras vacunas, tales como las vacunas de tos ferina celular, la vacuna de sarampión, la vacuna de polio inactivada (IPV) las vacunas OMV meningocócicas son por sus mezclas de complejos muy naturales, de un gran número de antígenos. Si la protección puede obtenerse por un antígeno simple, un número pequeño de antígenos definidos o una mezcla compleja de antígenos indefinidos, en consecuencia depende de un número de factores .

El o los pollpeptidos iimmnogénicos En algunas modalidades, la invención involucra la administración de por lo menos un polipéptido un polipéptido inmunogénico a pacientes, para proporcionar protección contra la infección por Neisseria meningitidis. Estos polipéptidos inmunogénicos en general incluirán secuencias de aminoácidos meningocócicas, tales como secuencias de aminoácidos encontradas en las cepas del serogrupo B, tales como la cepa MC58 secuenciada [13] . Puede usarse un número pequeño de antígenos definidos. Por lo tanto, en lugar de consistir de un solo antígeno, se prefiere que la composición de la invención comprenda una mezcla de 10 o menos (por ejemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) antígenos purificados, y se prefiere particularmente que la composición no deberá incluir mezclas complejas o indefinidas de antígenos, por ejemplo, se prefiere no incluir las vesículas de membrana exterior en la composición. Los polipéptidos inmunogénicos preferidos para el uso con la invención son los descritos en la referencia 24: (1) una proteina ^NadA' ; (2) una proteina x741f ; (3) una proteina 936' ; (4) una proteína ?953' y (5) una proteina ?287' . Estos antigenos se refieren en la presente como los cinco antígenos básicos' . La invención puede usar 1, 2, 3, 4 o todos estos 5 antígenos.

Proteína NadA ANadA' (adhesina A de Neisseria) del serogrupo B de N. meningitidís se describe como la proteína ?961' en la referencia 17 (SEC IDs 2943 & 2944) y como ????1994' en la referencia 13 (ver también GenBank número de acceso: 11352904 & 7227256) . Una descripción detallada de la proteína puede encontrarse en la referencia 25. No se observó una proteína correspondiente en el genoma del serogrupo A [12, 25] , pero se han reportado las cepas NadA+ del serogrupo A [25] . Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, NadA puede tomar varias formas . Las formas preferidas de NadA son las variantes de la truncación o eliminación, tales como las descritas en las referencias 21 a 23. En particular, se prefiere NadA sin su ancla de membrana C terminal (por ejemplo, eliminación de los residuos 351-405 para la cepa 2996 [SEC ID NO: 1] ) , que en ocasiones se distingue en la presente por el uso de un superíndice C , por ejemplo NadA(c) . La expresión de NadA sin sus dominio de ancla de membrana (por ejemplo, SEC ID NO: 1) en E. coli resulta en la secreción de la proteina en el sobrenadante de cultivo con la remoción concomitante de su péptido lider 23mer (por ejemplo, para dejar un 327mer para la cepa 2996 [SEC ID NO: 2]). Los polipéptidos sin sus péptidos líderes se distinguen algunas veces en la presente mediante el uso de un superíndice ??? , por ejemplo, NadA(NL) o NadA(c) (KL) . Las secuencias NadA preferidas tienen 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a la SEC ID NO: 2. Esto incluye las variantes NadA (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.). Las formas alélicas de NadA se muestran en la Figura 9 de la referencia 26. Otras secuencias NadA preferidas comprenden por lo menos n aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 1, en donde n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de NadA. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) de término C y/o término N de la SEC ID NO: 1 (por ejemplo, NadA(c), NadA(NL), NadA(C) (NL) ) . Cuando se eliminan los residuos del término N, se prefiere que la eliminación no debiera remover la capacidad de NadA de adherir a las células epiteliales humanas. Un fragmento preferido de la SEC ID NO: 1 es la SEC ID NO: 2.

NadA se usa de preferencia en una forma oligomérica (por ejemplo, forma trimérica) .

Proteína 741 La proteina 741' del serogrupo B se describe en la referencia 17 (SEC IDs 2535 & 2536) y como ???1870' en la referencia 13 (ver también GenBank número de acceso GI: 7227128). La proteina correspondiente en el serogrupo A [12] tiene GenBank número de acceso 7379322. 741 es naturalmente una lipoproteina . Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteina 741 puede tomar varias formas. Las formas preferidas de 741 son las variantes de truncación y eliminación, tales como las descritas en las referencias 21 a 23. En particular, el término N de 741 puede eliminarse e incluir su secuencia de poli-glicina (es decir, eliminación de los residuos 1 a 72 para la cepa MC58 [SEC ID NO: 3]), que a menudo se distingue en la presente mediante el uso de un prefijo AG' . Esta eliminación puede mejorar la expresión. La eliminación también remueve el sitio de lapidación de 741. Las secuencias 741 preferidas tienen 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a la SEC ID NO: 3. Esto incluye las variantes 741 (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.). Las formas alélicas de 741 pueden encontrarse en las SEC IDs 1 a 22 de la referencia 23 y en las SEC IDs 1 a 23 y 123-141 de la referencia 27. Las SEC IDs 1-299 de la referencia 28 dan las secuencias 741 adicionales.

Otras secuencias de 741 preferidas comprenden por lo menos n aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 3, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epitopo de 741. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) de término C y/o término N de la SEC ID NO: 3. La proteina 741 es un antigeno extremadamente efectivo para provocar respuestas de anticuerpo anti-meningocócico, y se expresa a través de todos los serogrupos meningocócicos . El análisis filogenético muestra que la proteina se divide en dos grupos, y que uno de estos se divide nuevamente para dar tres variantes en total [29] , y mientras que el suero surgido contra una variante dada es bactericida dentro del mismo grupo variante, no es activo contra las cepas que expresan una de las otras dos variantes, es decir, hay una protección cruzada intra-variante, pero no una protección cruzada intervariante. Para una eficacia de cepa cruzada máxima, por lo tanto, se prefiere que una composición debiera incluir más de una variante de la proteina 741. Un ejemplo de una secuencia de cada variante se da en la SEC ID NOs : 10, 11 y 12 en la presente, comenzando con un residuo de cisterna N terminal, al que un lipido se enlazará covalentemente en la forma de la lipoprotexna de 741. Por lo tanto, se prefiere que la composición debiera incluir por lo menos dos de: (1) una primera proteina, que comprende una secuencia de aminoácido que consiste de un fragmento de por lo menos x aminoácidos contiguos de la SEC ID NO: 10; (2) una segunda proteina, que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos b% de identidad de secuencia a la SEC ID NO: 11 y/o que comprende una secuencia de aminoácido que consiste de un fragmento de por lo menos y aminoácidos contiguos de la SEC ID NO: 1; y (3) una tercera proteina, que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos c% de identidad a la SEC ID NO: 2 y/o que comprende una secuencia de aminoácido que consiste de un fragmento de por lo menos z aminoácidos contiguos de la SEC ID NO: 12. El valor de a es de por lo menos 85, por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 o más. El valor de b es de por lo menos 85, por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 o más. El valor de c es de por lo menos 85, por ejemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 o más. Los valores de ar b y c no se relacionan intrínsecamente entre sí.

El valor de x es de por lo menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . El valor de y es de por lo menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . El valor de y es de por lo menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). El valor de z es de por lo menos 7, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . Los valores de x, y y z no se relacionan intrínsecamente entre sí. Se prefiere que cualquier secuencia de aminoácido 741 no caiga en más de una de las categorías (1) , (2) y (3) . De esta manera, cualquier secuencia 741 dada caerá en únicamente una de las categorías (1), (2) y (3). De esta manera, se prefiere que: la proteína (1) tenga menos de i% de identidad de secuencia a la proteína (2) ; la proteína (1) tenga menos de j% de identidad de secuencia a la proteína (3) ; y la proteína (2) tenga menos de k% de identidad de secuencia a la proteína (3) . El valor de i es de 60 o más (por ejemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc.) y es a lo más a. El valor de j es de 60 o más (por ejemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc.) y es a lo más b. El valor de 7c es de 60 o más (por ejemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc.) y es a lo más c. Los valores de i, j y 7c no se relacionan intrínsecamente entre sí.

Proteína 936 La proteína ?936'' del serogrupo B se describe en la referencia 17 (SEC IDs 2883 & 2884) y como ????2091' en la referencia 13 (ver también GenBank número de acceso GI.7227353). El gen correspondiente en el serogrupo A [12] tiene GenBank número de acceso 7379093. Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteína 936 puede tomar varias formas. Las formas preferidas de 936 son las variantes de truncación y eliminación, tales como las descritas en las referencias 21 a 23. En particular, el péptido líder de término N de 936 puede eliminarse (es decir, eliminación de los residuos 1 a 23 para la cepa MC58 [SEC ID NO: 4]) para dar 936(NL). Las secuencias 936 preferidas tienen 50% o- más de identidad (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a la SEC ID NO: 4. Esto incluye las variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.). Las formas secuencias de 936 preferidas comprenden por lo menos n aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 4, en donde n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos comprenden un epitopo de 936. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del término C y/o el término N de la SEC ID NO: 4.

Proteína 953 La proteina 953' del serogrupo B se describe en la referencia 17 (SEC IDs 2917 y 2918) y como ????1030' en la referencia 13 (ver también GenBank número de acceso GI:7226269). La proteina correspondiente en el serogrupo A [12] tiene GenBank número de acceso 7380108. Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteina 953 puede tomar varias formas. Las formas preferidas de 953 son las variantes de truncación o eliminación, tales como las descritas en las referencias 21 a 23. En particular, el péptido líder de término N de 953 puede eliminarse (es decir, eliminación de los residuos 1 a 19 para la cepa MC58 [SEC ID NO: 5]) para dar 953™L). Las secuencias 953 preferidas tienen 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a la SEC ID NO: 5. Esto incluye las variantes 953 (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.)- Las formas alélicas de 953 pueden observarse en la Figura 19 de la referencia 19. Otras secuencias 953 preferidas comprenden por lo menos n aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 5, en donde n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos comprenden un epitopo de 953. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) de término C y/o término N de la SEC ID NO: 5.

Proteína 287 La proteina ?287' del serogrupo B se describe en la referencia 17 (SEC IDs 3103 y 3104) como ???2132' en la referencia 13, y como ?T??2132' en la referencia 20 (ver también GenBank número de acceso GI:7227388). La proteina correspondiente en el serogrupo A [12] tiene GenBank número de acceso 7379057. Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la proteina 287 puede tomar varias formas. Las formas preferidas de 287 son las variantes de truncación y eliminación, tales como las descritas en las referencias 21 a 23. En particular, el término N de 287 puede eliminarse e incluir su secuencia de poli-glicina (es decir, eliminación de los residuos 1 a 24 para la cepa MC58 [SEC ID NO: 6] ) , que a menudo se distingue en la presente mediante el uso de un prefijo AG' . Esta eliminación puede mejorar la expresión. Las secuencias 287 preferidas tienen 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a la SEC ID NO: 6. Esto incluye las variantes 287 (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.) . Las formas alélicas de 287 pueden encontrarse en las Figuras 5 y 15 de la referencia 19 y en el Ejemplo 13 y la figura 21 de la referencia 17 (SEC IDs 3179 a 3184). Otras secuencias de 287 preferidas comprenden por lo menos n aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 6, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epitopo de 287. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) de término C y/o término N de la SEC ID NO: 6.

Proteínas de fusión Los cinco antígenos pueden estar presentes en la composición como cinco polipéptidos separados, pero se prefiere que por lo menos dos de los antígenos se expresen como una cadena polipeptídica simple (una proteína ''híbrida'' [refs. 21 a 24]), por ejemplo, de modo que los cinco antígenos formen menos de cinco polipéptidos. Las proteínas híbridas ofrecen dos ventajas principales: primero, una proteína que puede ser inestable o expresada pobremente en sí misma, puede auxiliarse adicionando una pareja híbrida apropiada que supere el problema; segundo, la manufactura comercial se simplifica sólo como una expresión que necesita emplearse para producir dos proteínas útiles separadamente. Una proteína híbrida incluida en una composición de la invención puede comprender dos o más (es decir, 2, 3, 4 ó 5) de los cinco antígenos básicos. Se prefieren los híbridos que consisten de dos de los cinco antígenos básicos. Dentro de la combinación de los cinco antígenos básicos, un antígeno puede estar presente en más de una proteína híbrida y/o como una proteína no híbrida. Sin embargo, se prefiere que un antígeno esté presente como un híbrido o como un no híbrido, pero no como ambos, aunque puede ser útil incluir la proteína 741 como un antígeno híbrido y uno no híbrido (de preferencia lipoproteína) , en particular cuando se usa más de una variante de 741.

Los híbridos de dos antígenos para el uso en la invención comprenden: NadA y 741; NadA y 953; NadA y 287; 741 y 936; 741 y 953; 741 y 287; 936 y 953; 936 y 287; 953 y 287. Los híbridos de dos antígenos preferidos comprenden: 741 y 936; 953 y 287. Ver los detalles adicionales en la referencia 24. Las proteínas híbridas pueden representarse por la fórmula NH2-A- [-X-L-] n-B-COOH, en donde: X es una secuencia de aminoácido de uno de los cinco antígenos básicos; L es una secuencia de aminoácido de enlazador opcional; A es una secuencia de aminoácido N terminal opcional; B es una secuencia de aminoácido C terminal opcional; y .n es 2, 3, 4 ó 5. Si un radical -X- tiene una secuencia peptidica líder en su forma de tipo silvestre, esta puede incluirse u omitirse en la proteína híbrida. En algunas modalidades, los péptidos líderes serán eliminados, excepto para el radical -X-localizado en el término N de la proteína híbrida, es decir, el péptido líder de ?? será mantenido, pero los péptidos líderes de X2... Xn serán omitidos. Esto es equivalente a eliminar todos los péptidos líderes y usar el péptido líder de Xi como el radical -A- . Para cada uno de los casos n de [-X-L-] , la secuencia del aminoácido enlazador -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n=2 el híbrido puede ser NH2-Xi-Li-X2-L2- COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-Xi-Lx-X2-COOH, NH2-Xi-X2-L2-COOH, etc. La o las secuencias del aminoácido enlazador -L- serán por lo regular cortas (por ejemplo 20 o menos aminoácidos, es decir, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Ejemplos comprenden secuencias peptidicas cortas que facilitan la clonación, enlazadores de poli-glicina (es decir, que comprenden Glyn, en donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) y marcas de histidina (es decir, Hisn, en donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) . Otras secuencias de aminoácidos enlazadoras apropiadas serán evidentes para los experimentados en la técnica. Un enlazador útil es GSGGGG (SEC ID NO: 9) , con el dipéptido Gly-Ser que se forma de un sitio de restricción BamKL, ayudando de esta manera a la clonación y manipulación y el tripéptido (Gly)4 que es un enlazador de poli-glicina típico. Si Xn+i es una proteína AG y Ln es un enlazador de glicina, esto puede ser equivalente a Xn+1 no estando una proteína AG y Ln estando ausente. -A- es una secuencia de aminoácido N terminal opcional. Ésta será por lo regular corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Ejemplos incluyen las secuencias líderes para dirigir el tráfico de proteínas o las secuencias peptidicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, marcas de histidina, es decir, Hisn, en donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) . Otras secuencias de aminoácidos N terminales apropiadas serán evidentes para los experimentados en la técnica. Si Xi carece de su propia metionina de término N, -A- es de preferencia un oligopéptido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) que proporciona una metionina de término N. -B- es una secuencia de aminoácido C terminal opcional. Ésta será por lo regular corta (por ejemplo de 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Ejemplos incluyen las secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, las secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprende marcas de histidina, es decir, Hisn, en donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) o las secuencias que mejoran la estabilidad de la proteína. Otras secuencias de aminoácidos C terminales apropiadas serán evidentes para los experimentados en la técnica. Más preferentemente, n es 2. Dos proteínas preferidas de este tipo son: Xi es una 936 y X2 es una 741; ? es una 287 y X2 es .una 953. Dos proteínas híbridas particularmente preferidas de la invención son como sigue: n A Xi Lx X2 L2 B [SEC ID NO.] 2 MA AG287 SEC ID NO: 9 953 (NL) — — 7 2 M 936(NL) SEC ID NO: 9 ?T741 — — 8 Estas dos proteínas pueden usarse en combinación con NadA (particularmente con la SEC ID NO: 2) [24]. Se prefieren las mezclas que excluyen OMVs y/o que excluyen los lipooligosacáridos .

Vesículas de membrana exterior Como una alternativa para usar los antígenos del polipéptido purificado, la invención puede emplear preparaciones de microvesículas de N. meningitidis [30] , "OMVs nativas' [31] , ampolletas u otras vesículas de membrana [por ejemplo, refs. 32 a 37 etc.]'. Todas estas diferentes preparaciones se refieren en la presente por el término general ^OMVs' . En algunas modalidades, las OMVs pueden prepararse de bacterias que se han manipulado genéticamente [38-41] , por ejemplo, para aumentar la inmunogenicidad (por ejemplo, hiper-expresión de inmunógenos) , para reducir la toxicidad, para inhibir la síntesis de polisacáridos capsulares, para sub-regular o disminuir la expresión de PorA, para sub-regular o disminuir la expresión de IgtB [42], etc. Pueden prepararse a partir de cepas de hiper-vesiculas [43-46] . Pueden incluirse las vesículas de Nexsseria no patogénica [47] . Las OMVs pueden prepararse sin el uso de detergentes [48, 49] . Pueden expresar las proteínas de no Nexsseria sobre su superficie [50] . Pueden ser agotadas con LPS. Pueden mantener los lipooligosacáridos como un antígeno importante [42, 51] . Pueden mezclarse con antígenos recombinantes [32, 52] . Pueden tratarse para reducir la variabilidad de fase del inmunotipo de lipooligosacáridos [53] . La mezcla de OMVs puede usarse [30] , que incluye mezclas de diferentes serotipos y/o serosubtipos [30, 54] . Pueden usarse las vesículas de las bacterias con subtipos de proteína de membrana exterior de clase I, por ejemplo, seis subtipos diferentes [55, 56] usando dos poblaciones de vesículas diferentes diseñadas genéticamente, exhibiendo cada una tres subtipos, o nueve subtipos diferentes, usando tres poblaciones de vesículas diferentes diseñadas genéticamente, que exhibe cada una tres subtipos, etc. Los subtipos útiles incluyen: Pl.7, 16; Pl.5-1, 2-2; Pl.19, 15-1; Pl.5-2,10; Pl.12-1, 13; Pl.7-2,4; Pl.22,14; P1.7-1,1; Pl.18-1, 3, 6.

Resultado de la inmunización El resultado de la inmunización será la generación de anticuerpos en el paciente que (a) reconocen el polipéptido inmunogénico y (b) son protectores contra la infección por serotipos meningocócicos múltiples. Un resultado típico de la inmunización será la generación de una respuesta de anticuerpo que es bactericida contra por los menos el meningococo del subtipo Y, y más típicamente contra cada uno de los serogrupos A, B, C, 135 e Y. Un resultado preferido es la inmunización efectiva contra: (a) los serogrupos Y y A; (b) los serogrupos Y y B; (c) los serogrupos Y y C; (d) los serogrupos Y y W135; etc. Se prefiere la inmunización contra por los menos los serogrupos A, B, C e Y. La protección también puede proporcionarse contra otros serogrupos (no patogénicos) , por ejemplo, H, I, K, L, X, Z, 29E, etc. La protección también puede proporcionarse contra otras especies de Neisseria, por ejemplo, lactamica, gonorrea, cinérea, etc. Después de la inmunización, un suero tiene preferentemente un título bactericida de por lo menos 1024 (por ejemplo, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o mayor, de preferencia por lo menos 214) , es decir, el suero es capaz de matar por lo menos 50% de las bacterias de prueba de una cepa particular cuando se diluye 1/1024, como se describe en la referencia 20.

Serograpos y cepas Los métodos y usos de la invención son preferentemente para inmunizar a un paciente contra una infección por el serogrupo Y y también contra por lo menos uno de los serogrupos A, B, C y W135. Las proteínas preferidas de la invención comprenden una secuencia de aminoácido encontrada en el serogrupo B de N. meningitidis. Dentro del serogrupo B, las cepas preferidas son 2996, MC58, 95N477, y 394/98. La cepa 394/98 a menudo se refiere como ???' ya que es una cepa de Nueva Zelanda. La proteina 287 es de preferencia de la cepa 2996 o, más preferentemente, de la cepa 394/98. La proteina 741 es de preferencia de las cepas MC58, 2996, 384/98 ó 95N477 de serotipo B, o de la cepa 90/18311 del serogrupo C. Se prefiere más la cepa MC58. Las proteínas 936, 953 y NadA son de preferencia de la cepa 2996. Las cepas pueden indicarse como un subíndice, por ejemplo, 741Mc58 es la proteína 741 de la cepa MC58. A menos que se establezca lo contrario, las proteínas mencionadas en la presente (por ejemplo, sin subíndice) son de la cepa 2996 de N. meningitidis, que puede tomarse como una cepa de deferencia' . Sin embargo, se apreciará que la invención en general no se limita por la cepa. Como se mencionó anteriormente, las referencias generales a una proteína (por ejemplo, 287', ?919', etc.) pueden tomarse para incluir tal proteína de cualquier cepa. Por lo regular, esta tendrá una identidad de secuencia a 2996 de 90% o más (por ejemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) . Cuando una composición incluye un antigeno de proteina particular (por ejemplo 741 ó 287), la composición puede incluir tal antígeno en más de una forma variante,,- por ejemplo, la misma proteína, pero de más de una cepa. Estas proteínas pueden incluirse como proteínas tándem o separadas .

Cuando se usan las proteínas híbridas, los antígenos individuales dentro del híbrido (es decir, los radicales -X- individuales ) pueden ser de una o más cepas. Cuando n — 2, por ejemplo, X2 puede ser de la misma cepa que Xi o de una cepa diferente. Cuando n = 3, las cepas pueden ser (i) Xl=X2=X3 (Ü) Xl=X2?X3 (Üí) Xl7¾= 3 (ÍV) Xi7¾2?X3 o (v) Xi=X3?X2, etc.

Linajes hipervirulentos y respuestas de anticuerpo bactericida En general, las composiciones de la invención son capaces de inducir las respuestas del anticuerpo bactericida en suero después de administrarse a un paciente. Estas respuestas se miden convenientemente en ratones y son un indicador estándar de la eficacia de la vacuna [por ejemplo, ver la nota final 14 de la referencia 20] . La actividad bactericida en suero (SBA) mide las bacterias muertas mediadas por el complemento, y puede probarse usando el complemento de humano o de conejo bebé. Los estándares de WHO requieren una vacuna para inducir por lo menos un aumento de 4 veces en SBA en más de 90% de los destinatarios. En lugar de ofrecer una protección estrecha, las composiciones de la invención pueden inducir las respuestas del anticuerpo bactericida contra más de un serogrupo de meningococo. Dentro de los serogrupos, las composiciones pueden inducir las respuestas del anticuerpo contra más de un linaje hipervirulento . En particular, pueden inducir las respuestas bactericidas contra dos o tres de los siguientes tres linajes hipervirulentos : (i) grupo A4; (ii) complejo ET5 y (iii) linaje 3. Pueden inducir además las respuestas del anticuerpo bactericida contra uno o más linajes hipervirulentos del subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-1 o complejo ET-37 y contra otros linajes, por ejemplo linajes hiperinvasores . Sin embargo, las composiciones no necesitan inducir los anticuerpos bactericidas contra cada cepa de un linaje hipervirulento particular. Las composiciones preferidas pueden inducir las respuestas bactericidas contra: (a) la cepa 860800, ES13822, ES15085 y/o ES14487 de meningococo del serogrupo Y; (b) la cepa F612 del meningococo del serogrupo A; (c) la cepa LPN17592 del meningococo del serogrupo W135; (d) la cepa Cll del meningococo del serogrupo C; (e) dentro del meningococo del serogrupo B; (i) del grupo A4, la cepa 961-5945 (B:2b:Pl.21, 16) y/o la cepa G2136 (B:-); (ii) del complejo ET5 , la cepa MC58 (B : 15 : Pl .7 , 16b) y/o la cepa 44/76 (B:15:P1.7,16) ; (iii) del linaje 3, la cepa 394/98 (B:4:P1.4) y/o la cepa BZ198 (B : T : -) . La cepa 860800 del serogrupo Y se observa en el renglón 29 de la referencia 1 y en la referencia 57. La cepa F6124 del serogrupo A se observa en las referencias 20, 57 y 58. La cepa Cll del serogrupo C es una de las cepas de referencia descritas en la ref. 59. Las cepas 961-5945 y G2136 del serogrupo B son de las cepas de referencia MLST de Neisseria [ids 638 y 1002 en la ref. 60] . La cepa MC58 está ampliamente disponible (por ejemplo, ATCC BAA-335) y fue la cepa secuenciada en la referencia 13. La cepa 44/76 se ha usado y caracterizado ampliamente (por ejemplo, ref. 61) y es una de las cepas de referencia MLST de Neisseria [id 237 en la ref. 60; renglón 32 de la Tabla 2 en la ref. 1] . La cepa 394/98 se aisló originalmente en Nueva Zelanda en 1998 y se han publicado diversos estudios usando esta cepa (por ejemplo, refs. 62 y 63) . La cepa BZ198 es otra cepa de referencia MLST (id 409 en la ref. 60; renglón 41 de la Tabla 2 en la ref. 1] · Composiciones y medicamentos inmunogrénicos Las composiciones de la invención son inmunogénicas, y más preferentemente composiciones de vacunas. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir infecciones) o terapéuticas (es decir, para tratar una infección), pero serán típicamente profilácticas.

El pH de la composición es de preferencia entre 6 y 8, de preferencia aproximadamente 7. El pH estable puede mantenerse mediante el uso de un amortiguador. Cuando una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere usar un amortiguador de histidina [64] . La composición puede ser estéril y/o libre de pirógeno. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los humanos . Las composiciones pueden presentarse en ampolletas, o pueden presentarse en jeringas pre-llenadas . Las jeringas pueden suministrarse con o sin agujas, üna jeringa incluirá una dosis simple de la composición, mientras que una ampolleta puede incluir una dosis simple o dosis múltiples. Las composiciones inyectables usualmente serán soluciones o suspensiones líquidas. Como una alternativa, pueden presentarse en forma sólida (por ejemplo, secadas por congelado) para una solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. Las composiciones de la invención pueden envasarse en una forma de dosis unitaria o una forma de dosis múltiple. Para las formas de dosis múltiples, se prefieren las ampolletas a las jeringas pre-llenadas. Los volúmenes de dosificación efectivos pueden establecerse de manera rutinaria, pero una dosis humana típica de la composición para inyección tiene un volumen de 0.5 mi. Cuando una composición de la invención va a prepararse extemporáneamente antes del uso (por ejemplo, cuando se presenta un componente en la forma liofilizada) y se presenta como un kit, el kit puede comprender dos ampolletas, o puede comprender una jeringa pre-llenada y una ampolleta, siendo los contenidos de la jeringa usados para reactivar los contenidos de la ampolleta antes de la inyección. La inmunización de la invención es en un mamífero, de preferencia en un humano. Cuando la vacuna es para el uso profiláctico, el humano es de preferencia un niño (por ejemplo, un niño que empieza a caminar o un infante); cuando la vacuna es para el uso terapéutico, el humano es de preferencia un adulto. Una vacuna destinada para los niños también puede administrarse a los adultos, por ejemplo, para valorar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc. Estos usos y métodos son de preferencia para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por una Neisseria (por ejemplo, meningitis, septicemia, bacteremia, gonorrea, etc.). Se prefiere la prevención y/o tratamiento de la meningitis bacteriana o meningocócica. Una manera de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico involucra monitorear la infección por Neisseria después de la administración de la composición de la invención. Una manera de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico involucra monitorear las respuestas inmunes contra los antigenos administrados. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención puede determinarse administrándolas a los pacientes de prueba (por ejemplo, niños de 12-16 meses de edad o modelos animales [65] ) y después determinando los parámetros estándares incluyendo los anticuerpos bactericidas en suero (SBA) y los títulos de ELISA (GMT) de IgG total y de alta avidez. Estas respuestas inmunes en general serán determinadas alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición, y serán comparados los valores determinados antes de la administración de la composición. Se prefiere un aumento en SBA de por lo menos 4 veces u 8 veces. Cuando se administra más de una dosis de la composición, puede realizarse más de una determinación de post-administración. Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpo en un paciente que es superior al criterio para la seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de pacientes humanos. Son bien conocidos los antígenos con un título de anticuerpo asociado, por encima del cual un huésped se considera que es seroconvertido contra el antígeno y, tales títulos se publican por organizaciones tales como WHO.

De preferencia, más de 80% de una muestra estadísticamente significativa de pacientes es seroconvertida, más preferentemente más de 90%, aún más preferentemente más de 93% y más preferentemente 96-100%. En general, las composiciones serán administradas directamente a un paciente. La liberación directa puede realizarse por inyección parenteral (por ejemplo, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente o al espacio intersticial de un tejido) o mediante la administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra mucosa. Se prefiere la administración intramuscular en el muslo o antebrazo. La inyección puede ser por medio de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica) , pero puede usarse alternativamente la inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0.5 mi. La invención puede usarse para provocar una inmunidad sistémica y/o mucosal. El tratamiento de la dosificación puede ser de un esquema de dosis simple o un esquema de dosis múltiple. Las dosis múltiples pueden usarse en un esquema de inmunización primaria y/o en un esquema de inmunización de refuerzo. Un esquema de dosis primaria puede seguirse por un esquema de dosis de refuerzo. Puede determinarse de manera rutinaria el tiempo apropiado entre las dosis de cebado (por ejemplo entre 4-16 semanas) y entre el cebado y refuerzo. Las infecciones por Neisseria afectan a varias áreas del cuerpo y de esta manera las composiciones de la invención pueden prepararse de diferentes formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones liquidas. También pueden prepararse las formas sólidas apropiadas para la solución en, o suspensión en, los vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, composición liofilizada) . La composición puede prepararse para la administración tópica, por ejemplo, como un ungüento, crema o polvo. La composición puede prepararse para la administración oral, por ejemplo, como una tableta o cápsula, o como un jarabe (opcionalmente saborizado) . La composición puede prepararse para la administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un atomizador. La composición puede prepararse como un supositorio o pesario. La composición puede prepararse para la administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, atomización, gotas, gel o polvo [por ejemplo, refs. 66 y 67]. Ha sido reportado el éxito con la administración nasal de sacáridos neumocócicos [68, 69] , polipéptidos neumocócicos [70] , sacáridos Hib [71] , sacáridos MenC [72] y mezclas de conjugados de sacáridos Hib y MenC [73] . Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de antigeno (s) , asi como cualesquiera otros componentes, conforme sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva", se entiende que la administración de tal cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varia dependiendo de la salud y condición física del individuo que va a tratarse, edad, el grupo taxonómico de individuo que va a tratarse (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración del médico tratante de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse a través de pruebas de rutina, y una cantidad típica de cada antígeno de sacárido meningocócico por dosis está entre 1 µ? y 20 g, por ejemplo, aproximadamente 1 pg, aproximadamente 25 xq, aproximadamente 4 µgr aproximadamente 5 pg o aproximadamente 10 pg (expresada como sacárido) .

Componentes no antigenos adicionales de la composición Por lo regular, la composición de la invención, además de los componentes mencionados anteriormente, comprenderá uno o más "vehículos farmacéuticamente aceptables", que incluyen cualquier vehículo que no induce la producción de anticuerpos dañinos al individuo que recibe la composición. Los vehículos apropiados son típicamente macromoléculas grandes, que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarosa [74], trehalosa [75], lactosa y agregados de lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas) . Estos vehículos son bien conocidos por los experimentados en la técnica. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Además, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes de humectación o emulsificación, sustancias amortiguadoras de pH y similares. Es un vehículo típico la solución salina fisiológica amortiguada con fosfato, libre de pirógeno, estéril. Una descripción minuciosa de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 76. Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se envasan en un formato de dosis múltiple. Las composiciones de la invención pueden comprender un detergente, por ejemplo, Tween (polisorbato) , tal como T een 80. En general, los detergentes están presentes a niveles bajos, por ejemplo, <0.01%. Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad.

Es típica una concentración de 10+2 mg/ml de NaCl. Las composiciones de la invención en general incluirán un amortiguador. Es típico un amortiguador de fosfato. Las composiciones de la invención pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo manitol) o un disacárido (por ejemplo, sacarosa o trehalosa) , por ejemplo, aproximadamente 15-30 mg/ml (por ejemplo, 25 mg/ml) , en particular si van a liofilizarse y si incluyen un material que se ha reconstituido del material liofilizado. El pH de una composición para la liofilización puede ajustarse a aproximadamente 6.1 antes de la liofilización. Las vacunas de la invención pueden administrarse en conjunto con otros agentes inmunorreguladores . En particular, las composiciones incluirán usualmente un adyuvante. Los adyuvantes que pueden usarse en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a: A. Composiciones que contienen minerales Las composiciones que contienen minerales apropiadas para el uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos) , fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos) , sulfatos, etc. [por ejemplo, ver los capítulos 8 y 9 de la ref. 77] o mezclas de los diferentes compuestos minerales, con los compuestos que toman cualquier forma apropiada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.) y siendo preferida la adsorción. Las composiciones que contienen minerales también pueden formularse como una partícula de sal metálica [78] . Los fosfatos de aluminio se prefieren particularmente, en particular en las composiciones que incluyen un antígeno de sacárido de H. influenzae, y un adyuvante típico es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar PO4/AI entre 0.84 y 0.92, incluida a 0.6 mg de Al3+/ml. La adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio puede usarse, por ejemplo, entre 50 y 100 µg de Al3+ por conjugado por dosis. Cuando hay más de un conjugado en una composición, no todos los conjugados necesitan adsorberse.

B. Emulsiones de aceite Las composiciones de emulsiones de aceite apropiadas para el uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 [Capítulo 10 de ref. 77; ver también la ref. 79] (5% de escualeno, 0.5% de Tween 80 y 0.5% Span 85, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador) . También puede usarse el adyuvante de Freund Completo (CEA, por sus siglas en inglés) y el adyuvante de Freund incompleto (IFA, por sus siglas en inglés) .

C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de la ref. 77] Las formulaciones de saponina también pueden usarse como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos tripertenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso en las flores de una amplia variedad de especies de plantas. La saponina de la corteza del árbol Molina Quillaia saponaria se han estudiado ampliamente como adyuvantes. La saponina también puede obtenerse comercialmente de Smilax ornata (zarzaparrilla) , Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officialis (raíz de jabón) . Las formulaciones del adyuvante de saponina incluyen las formulaciones purificadas, tales como QS21, así como las formulaciones de lípidos, tales como ISCOMs. QS21 se comercializa como Stimulon™1. Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Las fracciones purificadas específicas usando estas técnicas se han identificado, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. De preferencia, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 se describe en la ref. 80. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [81] . Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden usarse para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOMs, por sus siglas en inglés) [capitulo 23 de la ref. 77] . ISCOMs también incluyen típicamente un fosfolípido, tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina . Puede usarse cualquier saponina conocida en ISCOMs. De preferencia, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOMs se describen adicionalmente en las refs. 81-83. Opcionalmente, los ISCOMS pueden estar desprovistos de un detergente adicional [84] . üna revisión del desarrollo de los adyuvantes a base de saponina puede encontrarse en las refs. 85 y 86.

D. Virosomas y partículas similares a virus. Los virosomas y las partículas similares a virus (VLPs) también pueden encontrarse como adyuvantes en la invención. En general, estas estructuras contienen una o más proteínas de un virus combinado o formulado opcionalmente con un fosfolípido. En general, no son patógenas, no replicantes y en general, no contienen ningún genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden producirse o aislarse de manera recombinante de los virus completos. Estas proteínas virales apropiadas para el uso en los virosomas o VLPs incluyen proteínas derivadas del virus influenza (tales como HA o NA) . El virus de hepatitis B (tales como las proteínas de núcleo o cápside) , el virus de hepatitis E, virus de sarampión, virus Sindbis, rotavirus, virus de enfermedad de pies y boca, retrovirus, virus de Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fago 0_ß (tales como proteínas de recubrimiento) , fago GA, fago fr, fago AP205 y Ty (tales como proteína pl de retrotransposón Ty) . Los VLPs se describen además en las refs. 87-92. Los virosomas se describen además en, por ejemplo, ref. 93.

E. Derivados bacterianos o microbianos Los adyuvantes apropiados para el uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos, tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) , derivados del lipido A, oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxinas de ribosilación de ADP y derivados destoxificados . Los derivados no tóxicos de LPS incluyen el lipido A de monofosforilo (MPL) y MPL 3-0-desacilado (3dMPL) . 3dMPL es una mezcla de lipido A de monofosforilo 3 de-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas . Una forma de "partícula pequeña" preferida del lipido A de monofosforilo 3 de-O-acilado se describe en la ref. 94. Tales "partículas pequeñas" de 3dMPL son suficientemente pequeñas para filtrarse estériles a través de una membrana de 0.22 µt [94]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen imitadores del lipido A de monofosforilo, tales como derivados de fosfato de aminoalquil glucosaminida, por ejemplo, RC-529 [95, 96] . Los derivados del lipido A incluyen derivados del lipido A de Escherichia coli, tales como OM-174. OM-174 se describe, por ejemplo, en las refs. 97 y 98. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes apropiados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias nucleotídicas que contienen un motivo CpG (una secuencia dinucleotídica que contiene una citosina no metilada enlazada por un enlace de fosfato a una guanosina) . Los ARNs de doble hebra y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) también se han mostrado que son inmunoestimulantes. Las CpG's pueden ' incluir modificaciones/análogos nucleotidicos , tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble hebra o de hebra simple. Las referencias 99, 100 y 101 describen las posibles sustituciones del análogo, por ejemplo, reemplazamiento de guanosina con 2'-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se describe además en las refs. 102-107.

La secuencia de CpG puede dirigirse a TLR9, tal como la porción GTCGTT o TTCGTT [108] . La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune Thl, tal como un CpG-A ODN, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como CpG-B ODN. CpG-A y CpG-B ODNs se describen en las refs. 109-111. De preferencia, el CpG es un CpG-A ODN. De preferencia, el oligonucleótido de CpG se construye de modo que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, pueden enlazarse dos secuencias oligonucleotidicas CpG en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Ver, por ejemplo, refs. 108 y 112-114.

Las toxinas de ribosilación de ADP bacterianas y los derivados detoxificados de las mismas pueden encontrarse como adyuvantes en la invención. De preferencia, la proteina se deriva de E. col! (enterotoxina XLT" lábil con calor de E. coli) , cólera ("CT") o tos ferina ("PT") . El uso de toxinas de ribosilación de ADP detoxificadas como adyuvantes mucosales se describe en la ref. 115 y como adyuvantes parenterales en la ref. 116. La toxina o toxoide es de preferencia en la forma de una holotoxina, que comprende las subunidades A y B. De preferencia, la subunidad A contiene una mutación de detoxificación; de preferencia la subunidad B no está mutada. De preferencia, el adyuvante es un mutante LT detoxificado, tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de las toxinas de ribosilación de ADP y los derivados detoxificados de las mismas, en particular LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes, puede encontrarse en las refs. 117-124. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas de ribosilación de ADP establecidas en la ref. 125, incorporada específicamente en la presente por referencia en su totalidad.

F. Inmunomoduladores de humano Los inmunomoduladores de humano apropiados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-12 [126], etc.) [127], interferones (por ejemplo, interferón-?) , factor de estimulación de colonia de macrofago y factor de necrosis tumoral.

G. Bioadhesivos v mucoadhesivos Los bioadhesivos y mucoadhesivos también pueden usarse como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos apropiados incluyen microesferas del ácido hialurónico esterificado [128] o mucoadhesivos, tales como derivados reticulados de ácido poli (acrilico) , alcohol polivinilico, polivinil pirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa . También pueden usarse guitosana y derivados de la misma como adyuvantes en la invención [129] .

H. Micropartículas Las micropartículas también pueden usarse como adyuvantes en la invención. Se prefieren las micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 nm de diámetro, más preferentemente ~ 200 nm a ~ 30 nm de diámetro, y más preferentemente ~ 500 nm a ~ 10 um de diámetro) formadas de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli (a-hidroxiácido) o ácido polihidroxibutirico, un poliortoéster, un polianhidrido, una policaprolactona, etc.)/ con poli (lacturo-co-glicoluro) , tratados opcio almente para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB) .

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la ref. 77) Ejemplos de las formulaciones de liposomas apropiadas para el uso como adyuvantes se describen en las refs. 130- 132.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno Los adyuvantes apropiados para el uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [133] . Estas formulaciones incluyen además surfactantes de éster de polioxietilen sorbitan en combinación con un octoxinol [134] asi como éteres de polioxietilen alquilo o surfactantes de éster en combinación con por lo menos un surfactante no iónico adicional, tal como un octoxinol [135] . Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietilen-9-laurilo (laureth 9), éter de polioxietilen-9-esteorilo, éter de polioxietilen-8-esteorilo, éter de polioxietilen-4-laurilo, éter de polioxietilen-35-laurilo y éter de polioxietilen-23~laurilo.

K. Polifosfaceno (PCPP) Las formulaciones de PCPP se describen, por ejemplo, en las refs. 136 y 137..

L. Péptidos de muramilo Ejemplos de los péptidos de muramilo apropiados para el uso en la invención incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1' -2' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina TP-PE) .

M. Compuestos de imidazoquinolona Ejemplos de los compuestos de imidazoquinolona apropiados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo, "Resiquimod 3M") , descrito además en las referencias 138 y 139. La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, pueden usarse las siguientes composiciones de adyuvantes en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [140]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) [141]; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3d PL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [142]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [143]; (6) SAF, que contiene 10% de escualeno, 0.4% de Tween 80™, 5% de polímero de bloque plurónico L121 y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrométrica o en vórtice para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) sistema de adyuvante Ribi™ (RAS) , (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualeno,, 0.2% de Tween 80 y uñó o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforilípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS) , de preferencia MPL + CWS (DetoxM) y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL) . Otras sustancias apropiadas que actúan como agentes inmunoestimulantes se describen en el capítulo 7 de la ref . 77. En particular, se prefiere el uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, y en general, los antígenos se adsorben en estas sales. El hidróxido de aluminio se evita de preferencia como un adyuvante si la composición incluye un antígeno Hib. Cuando se usa fosfato de aluminio y no se desea adsorber un antigeno al adyuvante, esto se favorece incluyendo iones de fosfato libres en solución (por ejemplo, mediante el uso de un amortiguador de fosfato) . La prevención de la adsorción también puede lograrse seleccionando el pH correcto durante el mezclado del antigeno/adyuvante, un adyuvante con un punto apropiado de carga cero, y un orden apropiado de mezclado para diferentes antigenos en una composición [144] . El fosfato de calcio es. otro adyuvante preferido.

Antígenos adicionales Las composiciones de la invención contienen antigenos de proteínas meningocócicas básicas. También pueden incluir antígenos adicionales, aunque no pueden contener antígenos de proteínas meningocócicas además de los cinco antígenos básicos. Los antígenos adicionales para la inclusión pueden ser, por ejemplo: - un antígeno de sacárido de Haemophilus influezae B. - un antígeno de sacárido del serogrupo A, C, W135 e/o Y de N. meningitidis, tal como el sacárido descrito en la ref. 5 del serogrupo C o los sacáridos de la ref. 8 (ver a continuación) . - un antígeno de sacárido de Streptococcus penumoniae [por ejemplo, 180, 181, 182] . - un antígeno del virus de hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo 145, 146] . - un antígeno del virus de hepatitis B, tal como los antigenos de superficie y/o centro [por ejemplo, 146, 147] . - un antigeno de difteria, tal como un toxoide de difteria [por ejemplo, capitulo 3 de la ref. 148], por ejemplo el mutante CRM197 [por ejemplo, 149] . - un antigeno de tétanos, tal como un toxoide de tétanos [por ejemplo, capitulo 4 de la ref. 148] . un antigeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de tos ferina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, refs . 150 y 151] . Puede usarse el antígeno de tos ferina celular. - una preparación de vesícula de membrana exterior (OMV) del serogrupo B de N. meningitidis, tal como los descritos en las refs. 34, 35, 37, 152. antígeno (s) de polio [por ejemplo, 153, 154] tales como OPV o, de preferencia, IPV. La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales. Los antígenos estarán presentes por lo regular a una concentración de por lo menos 1 µg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para provocar una respuesta inmune contra tal antígeno. Se prefiere que la eficacia protectora de los antígenos de sacáridos individuales no se remueva combinándolos, aunque puede reducirse la inmunogenicidad real (por ejemplo, títulos de ELISA) . Cuando se incluye un antígeno de difteria en la composición, también se prefiere incluir un antigeno de tétanos y antígenos de tos ferina. De manera similar, cuando un antígeno de tétanos se incluye, también se prefiere incluir los antígenos de difteria y tos ferina. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de tos ferina, también se prefiere incluir los antígenos de difteria y tétanos. Tales combinaciones de DTP pueden usarse para reconstituir los conjugados liofilizados . Cuando se usa un antígeno de sacárido o carbohidrato, de preferencia se conjuga con una proteína de vehículo para mejorar la inmunogenicidad (ver posteriormente) . Los antígenos de proteínas tóxicas pueden destoxificarse cuando sea necesario (por ejemplo, destoxificación de la toxina de tos ferina por medios químicos y/o genéticos [151]) . Como una alternativa para usar los antígenos de proteínas en la composición de la invención, puede usarse el ácido nucleico que codifica el antígeno [por ejemplo, refs . 155 a 163] . De esta manera, los componentes proteínicos de las composiciones de la invención pueden reemplazarse por un ácido nucleico (de preferencia ADN, por ejemplo, en la forma de un plásmido) que codifica la proteína. De manera similar, las composiciones de la invención pueden comprender proteínas que imitan los antígenos de sacáridos [164] o anticuerpos anti-idiotipos, Estos pueden reemplazar los componentes de sacáridos individuales o pueden suplementarios . Como un ejemplo, la vacuna puede comprender un péptido que imita el polisacárido capsular MenC [165] o MenA [166] en lugar del sacárido mismo. Las composiciones particularmente preferidas de la invención incluyen ya sea uno o ambos de: [a) un antigeno sacárido de Haemophilus influenzas tipo B; y/o (b) un antigeno de Streptococcus pneumoniae. También pueden incluir antígenos de sacáridos de los serogrupos Y, W135, C y A de meningococos , excepto que el sacárido de un serogrupo dado puede incluirse únicamente cuando el o los polipéptidos y/o OMVs no proporcionan protección contra tal serogrupo.

Haemophilus influenzae de tipo B Cuando la composición incluye un antígeno de tipo B de H. influenzae, será típicamente un antígeno de sacárido capsular Hib. Los antígenos sacáridos de H. influenzae b son bien conocidos. De manera ventajosa, el sacárido Hib se conjuga covalentemente con una proteína de vehículo, para mejorar su inmunogenicidad, especialmente en niños . Está bien documentada la preparación de los conjugados de polisacáridos en general, y del polisacárido capsular Hib en particular [por ejemplo, referencias 167 a 175 etc.]. La invención puede usar cualquier conjugado Hib apropiado. Las proteínas de vehículo apropiadas se describen a continuación, y los vehículos preferidos para los sacáridos Hib son CRMig7 ( ¾HbOC ) , toxoide de tétanos ( XPRP-1" ) y el complejo de membrana exterior de N. meningitidis ( ^PRP-OMP' ) . El radical del sacárido del conjugado puede ser un polisacárido (por ejemplo, un fosfato de polirribosilrribitol de longitud total (PRP) ) , pero se prefiere hidrolizar los polisacáridos para formar oligosacáridos (por ejemplo, PM de ~ 1 a ~ 5 kDa) . Un conjugado preferido comprende un oligosacárido de Hib enlazado de manera covalente a CRMi97 por medio de un enlazador de ácido adípico [176, 177] . También puede ser un vehículo preferido el toxoide de tétanos. La administración del antígeno Hib resulta de preferencia en una concentración de anticuerpo anti-PRP de 0.15 µg/ml, y más preferentemente = 1 µg/ml. Las composiciones de la invención pueden comprender más de un antígeno Hib. Cuando una composición incluye un antígeno de sacárido Hib, se prefiere que tampoco incluya un adyuvante de hidróxido de aluminio. Si la composición incluye un adyuvante de fosfato de aluminio entonces el antígeno Hib puede adsorberse al adyuvante [178] o puede ser no adsorbido [179] .

Los antígenos Hib pueden liofilizarse, por ejemplo, junto con los antígenos meningocócicos .

Streptococcus pneumoniae Cuando la composición incluye un antígeno de S. pneumoniae, será típicamente un antígeno de sacárido capsular que se conjuga de preferencia a una proteína de vehículo [por ejemplo, refs. 180 a 182]. Se prefiere incluir los sacáridos de más de un serotipo de S. pneumoniae. Por ejemplo, las mezclas de los polisacáridos de 23 serotipos diferentes se usan ampliamente, como son las vacunas conjugadas con los polisacáridos de entre 5 y 11 serotipos diferentes [183] . Por ejemplo, PrevNar™ [184] contiene antígenos de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) con cada sacárido conjugado individualmente a CRMig7 por aminación reductiva, con 2 g de cada sacárido por 0.5 mi de dosis (4 g de serotipo 6B) y con los conjugados adsorbidos en un adyuvante de fosfato de aluminio. Las composiciones de la invención incluyen de preferencia por lo menos los serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Los conjugados pueden adsorberse sobre un fosfato de aluminio. Como una alternativa para usar los antígenos de sacáridos de neumococo, la composición puede incluir uno o más antígenos polipeptídicos . Las secuencias genómicas para las diferentes cepas de neumococo están disponibles [185, 186] y pueden someterse a una vacunologia inversa [187-190] para identificar los antigenos polipeptidicos apropiados [191, 192] . Por ejemplo, la composición puede incluir uno o más de los siguientes antigenos: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 y Spl30, como se define en la referencia 193. La composición puede incluir más de uno (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14) de estos antigenos. En algunas modalidades, la composición puede incluir los antigenos de sacáridos y antigenos de neumococo. Estos pueden usarse en una mezcla simple, o el antigeno de sacárido de nuemocócico puede conjugarse a una proteina neumocócica. Las proteínas de vehículo apropiadas para tales modalidades incluyen los antígenos listados en el párrafo anterior [193] .

Los antígenos neumocócicos pueden liofilizarse, por ejemplo, junto con antígenos eningocócicos y/o antígenos de Hib.

Serogrupos Y, W135, C y A de meningococo Como se mencionó anteriormente, las vacunas de polisacáridos contra los serotipos A, C, W135 e Y se han conocido durante muchos años . Estas vacunas (MENCEVAX ACWY™ y ENOMUNE™) se basan en los polisacáridos capsulares del organismo y, aunque son efectivas en los adolescentes y adultos, proporcionan una respuesta inmune pobre y una duración de protección corta, y no pueden usarse en infantes.

En contraste con los antigenos de polisacáridos no conjugados en estas vacunas, las vacunas del serogrupo C aprobadas recientemente (Menjugate™ [4], Meningitec™ y NeisVac-C™) incluyen sacaridos conjugados. Menjugate™ y Meningitec™ tienen antigenos de oligosacáridos conjugados a un vehículo de CRMi97, mientras que NeisVac-C™ usa el polisacárido completo (de-O-acetilado) conjugado a un vehículo toxoide de tétanos. Las composiciones de la presente invención incluyen de preferencia antígenos de sacáridos capsulares de uno o más serogrupos Y, W135, C y A de meningococo, en donde los antígenos se conjugan a la o las proteínas de vehículo y son opcionalmente oligosacáridos. Los polisacáridos capsulares meningocócicos y sus conjugados pueden prepararse como se describe en las referencias 7 y 8. Una cantidad típica de cada antígeno de sacárido meningocócico por dosis está entre 1 g y 20 µg, por ejemplo, aproximadamente 1 µg, aproximadamente 2.5 µg, aproximadamente 4 µg, aproximadamente 5 µg, o aproximadamente 10 g (expresada como sacárido) . Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares de los serogrupos A, C, la relación (p/p) de sacárido MenA: sacárido MenC puede ser mayor de 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor). Cuando una mezcla comprende los sacáridos capsulares del serogrupo Y y uno o ambos serogrupos C y W135, la relación (p/p) de sacárido MenY: sacárido MenW135 puede ser mayor de 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor) y/o la relación (p/p) de sacárido MenY: sacárido MenC puede ser menor de 1 (por ejemplo, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 o menor). Las relaciones preferidas (p/p) para los sacáridos de los serogrupos A:C:W135:Y son: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2 y 2:2:2:1. Las relaciones preferidas (p/p) para los sacáridos de los serogrupos C:W135:Y son: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1 y 2:1:1. Se prefiere usar una masa sustancialmente igual de cada sacárido. En general, los sacáridos capsulares se usarán en la forma de oligosacáridos . Estos se forman convencionalmente por fragmentación del polisacárido capsular purificado (por ejemplo, por hidrólisis) , que usualmente será seguido de purificación de los fragmentos del tamaño deseado. La fragmentación de los polisacáridos se realiza de preferencia para dar un grado de polimerización (DP, por sus siglas en inglés) promedio final en el oligosacárido menor de 30 (por ejemplo, entre 10 y 20, de preferencia alrededor de 10 para el serogrupo A; entre 15 y 25 para los serogrupos W135 e Y, de preferencia alrededor de 15-20; entre 12 y 22 para el serogrupo C; etc.). El DP puede medirse convenientemente por pruebas de cromatografía de intercambio iónico o colorimétricas [194] . Si se -realiza la hidrólisis, en general, el hidrolizado será dimensionado para remover los oligosacáridos de longitud corta [195] . Esto puede lograrse de diferentes maneras, tales como ultrafiltración seguido de cromatografía de intercambio iónico. Los oligosacáridos con un grado de polimerización menor o igual a aproximadamente 6 se remueven de preferencia del serogrupo A, y los de alrededor de 4 se remueven de preferencia para los serogrupos 135 e Y. Los antígenos del sacárido MenC preferidos se describen en la referencia 5, como se usa en Menjugate™. Los sacáridos se preparan de preferencia de forma separada (incluyendo cualquier fragmentación, conjugación, modificación, etc.) y después se mezclan para dar una composición de la invención. Sin embargo, cuando la composición comprende un sacárido capsular del serogrupo A, se prefiere que el sacárido del serogrupo A no se combine con otro(s) sacárido (s), hasta un poco antes del uso, para minimizar el potencial para la hidrólisis. Esto puede realizarse convenientemente teniendo el componente del serogrupo A (típicamente junto con los excipientes apropiados) en la forma liofilizada y el o los otros componentes del serogrupo en la forma líquida (también con los excipientes apropiados) , siendo los componentes líquidos usados para reconstituir el componente MenA liofilizado cuando están listos para usarse. Cuando se usa un adyuvante de una sal de aluminio, se prefiere incluir el adyuvante en la ampolleta que contiene la vacuna líquida, y liofilizar el componente MenA sin el adyuvante. De esta manera, una composición de la invención puede prepararse de un kit que comprende: (a) un sacárido capsular del serogrupo ? de N. meningitidis, en la forma liofilizada y (b) los antígenos adicionales de la composición en la forma líquida.

Conjugación covalente Los sacáridos capsulares en las composiciones de la invención usualmente serán conjugados a la o las proteínas de vehículo. En general, la conjugación mejora la inmunogenicidad de los sacáridos ya que los convierte de los antígenos T independientes a antígenos T dependientes, permitiendo de esta manera el cebado para la memoria inmunológica . La conjugación es particularmente útil para las vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida (por ejemplo, revisado en las refs. 196 y 167-175]. Las proteínas de vehículo preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoide de difteria o toxoide de tétanos. Se prefiere particularmente la mutante de la toxina de difteria CRM197 [197-199] . Otras proteínas de vehículo apropiadas incluyen la proteína de membrana exterior de N. meningitidis [200], péptidos sintéticos [201, 202] , proteínas de choque térmico [203, 204] , proteínas, de tos ferina [205, 206], citocinas [207], linfocinas [207], hormonas [207], factores de crecimiento [207], proteínas artificiales que comprenden epítopos múltiples de células T CD4+ de humano de diferentes antígenos derivados de patógenos [208], proteína D de H. influenzae [209, 210], proteína de superficie neumocócica PspA [211] , proteínas de captación de hierro [212] , toxina A o B de C. difficile [213] , etc. Los vehículos preferidos son toxoide de difteria, toxoide de tétanos, proteína D de H. influenzae y CRMi97. Dentro de una composición de la invención, es posible usar más de una proteína de vehículo, por ejemplo, para reducir el riesgo de la supresión del vehículo. De esta manera, las proteínas de vehículo diferentes pueden usarse para diferentes serogrupos, por ejemplo, los sacáridos del serogrupo A pueden conjugarse a CRMi97 mientras que los sacáridos del serogrupo C pueden conjugarse al toxoide de tétanos. También es posible usar más de una proteína de vehículo para un antígeno de sacárido particular, por ejemplo, los sacáridos del serogrupo A pueden estar en dos grupos, con algunos conjugados a CRMig7 y otros conjugados al toxoide de tétanos. En general, sin embargo, se prefiere usar la misma proteína de vehículo para todos los sacáridos. Una proteína de vehículo simple puede portar más de un antigeno de sacárido [214] . Por ejemplo, una proteína de vehículo simple puede tener haber conjugado a los sacáridos de los serogrupos A y C. Para lograr este objetivo, los sacáridos pueden mezclarse antes ¦ de la reacción de conjugación. En general, sin embargo, se prefiere tener conjugados separados para cada serogrupo. Se prefieren los conjugados con una relación de sacárido :proteína (p/p) de entre 1:5 (es decir, proteína en exceso) y 5:1 (es decir, sacárido en exceso). Las relaciones entre 1:2 y 5:1 se prefieren, como se prefieren más las relaciones entre 1:1.25 y 1:2.5. La proteína del vehículo en exceso puede preferirse para MenA y MenC. Los conjugados pueden usarse en conjunto con la proteína libre de vehículo [215] . Cuando está presente una proteína de vehículo dado en la forma libre y conjugada de la invención, la forma no conjugada es de preferencia no mayor de 5% de la cantidad total de la proteína de vehículo en la composición como una totalidad, y más preferentemente está presente en menos de 2% en peso. Puede usarse cualquier reacción de conjugación apropiada, con cualquier enlazador apropiado cuando sea necesario . El sacárido será típicamente activado o funcionalizado antes de la conjugación. La activación puede involucrar, por ejemplo, reactivos de cianilación, tales como CDAP (por ejemplo, tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino piridinio [216, 217, etc.]). Otras técnicas apropiadas usan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTÜ; ver también la introducción a la referencia 173) . Los enlaces por medio de un grupo enlazador pueden hacerse usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 218 y 219. Un tipo de enlace involucra la aminación reductiva del polisacárido, el acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo enlazador de ácido adipico, y después el acoplamiento de una proteina al otro extremo del grupo enlazador del ácido adipico [171, 220, 221] . Otros enlazadores incluyen B-propionamido [222] , nitrofenil-etilamina [223], haluros de haloacilo [224], enlaces glucosidicos [225] , ácido 6-aminocaproico [226] , ADH [227] , radicales C4 a Ci2 [228] , etc. Como una alternativa para usar un enlazador, puede usarse el enlace directo. Los enlaces directos a la proteina pueden comprender oxidación del polisacárido seguido de aminación reductiva con la proteina, como se describe en, por ejemplo, las referencias 229 y 230.

Se prefiere un proceso que involucra la introducción de grupos amino en el sacárido (por ejemplo, reemplazando los grupo =0 terminales con -NH2) seguido de derivación con un diéster adipico (por ejemplo, diéster N-hidroxisuccinimido del ácido adipico) y la reacción con una proteina de vehículo. Otra reacción preferida usa la activación de CDAP con un vehículo de proteína D, por ejemplo, para enA o MenC.

Después de la conjugación, pueden separarse los sacáridos libres y conjugados. Hay muchos métodos apropiados, que incluyen cromatografía hidrofóbica, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc. [ver también las refs. 231 y 232, etc. ] . Cuando la composición de la invención incluye un oligosacárido conjugado, se prefiere que la preparación del oligosacárido preceda la conjugación. Como una alternativa para la purificación, los sacáridos capsulares pueden obtenerse por la síntesis total o parcial, por ejemplo, la síntesis de Hib se describe en la ref. 233 y la síntesis de MenA en la ref. 234.

Antígenos polipeptídicos del serogxrupo B adicionales y alternativos La invención usa una composición que, después de la administración a un paciente, es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo en tal paciente, en donde la respuesta del anticuerpo es protectora contra por lo menos el serogrupo Y de meningococo. Aunque NadA, 741, 936, 953 y 287 son antígenos preferidos para lograr esta protección, otros antígenos polipeptídicos de MenB que pueden incluirse en las composiciones de la invención (opcionalmente en combinación con uno o más de los cinco antigenos básicos) incluyen los que comprenden una de las siguientes secuencias de aminoácidos : SEC ID NO: 650 de la ref. 15; SEC : ID NO: í 378 de la ref. 15; SEC ID NO: 8 84 de la ref. 15; SEC ID NO: 4 de la ref. 16; SEC ID NO: 598 de la ref. 17; SEC ID NO: 818 de la ref. 17; SEC ID NO: 864 de la ref. 17; SEC ID NO: 866 de la ref. 17; SEC ID NO: 1196 de la ref. 17; SEC ID NO: 1272 de la ref. 17; SEC ID NO: 1274 de la ref. 17; SEC ID NO: 1640 de la ref . 17; SEC ID NO: 1788 de la ref. 17; SEC ID NO: 2288 de la ref . 17; SEC ID NO: 2466 de la ref. 17; SEC ID NO: 2554 de la ref. 17; SEC ID NO: 2576 de la ref. 17; SEC ID NO: 2606 de la ref. 17; SEC ID NO: 2608 de la ref. 17; SEC ID NO: 2616 de la ref . 17; SEC ID NO: 2668 de la ref . 17; SEC ID NO: 2780 de la ref. 17; SEC ID NO: 2932 de la ref. 17; SEC ID NO: 2958 de la ref. 17; SEC ID NO: 2970 de la ref. 17; SEC ID NO: 2988 de la ref. 17 o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácido que: (a) tiene 50% o más de identidad (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a estas secuencias; y/o (b) comprende un fragmento de por lo menos n aminoácidos consecutivos de estas secuencias, en donde n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos para (b) comprenden un epitopo de la secuencia relevante. Puede incluirse más de uno (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6) de estos polipéptidos . También puede usarse la proteina de unión de transferrina de antigenos y/o proteina Hsf [235] . La proteina NspA también puede usarse [236] , de preferencia expresada y purificada recombinantemente como en la referencia 237.

General El término "que comprende" abarca "que incluye" asi como "que constituye", por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X -i- Y. El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico significa, por ejemplo, x + 10%. El término "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, el término "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención. Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando se alinean, este porcentaje de aminoácidos es el mismo comparando las dos secuencias . Esta alineación y el por ciento de homología o la identidad de la secuencia pueden determinarse usando los programas de elementos de programación (software) conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos en · la sección 7.7.18 de la referencia 238. Una alineación preferida se determina por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de espacio afín con una penalidad de espacio abierto de 12 y una penalidad de extensión de espacio de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se muestra en la referencia 239. En general, el término "polipéptido" se refiere a un polímero de residuos de aminoácidos, y no se limita a una longitud mínima del producto. De esta manera, los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares, se incluyen dentro de la definición. Las proteínas de longitud total y los fragmentos de las mismas se abarcan por la definición. Por lo regular, los polipéptidos útiles en esta invención pueden tener una longitud máxima apropiada para la aplicación destinada. En general, la longitud máxima no es crítica y puede seleccionarse fácilmente por un experimentado en la técnica . Los polipéptidos de la invención pueden prepararse de muchas maneras, por ejemplo, por síntesis química (por lo menos en parte) , por digestión de polipéptidos grandes usando proteasas, por traducción de ARN, por purificación del cultivo celular (por e emplo, de la expresión recombinante) , del organismo mismo (por ejemplo, después del cultivo bacteriano) , de una fuente de línea celular, etc. Un método preferido para la producción de péptidos <40 aminoácidos de longitud involucra la síntesis química in vitro [240, 241] . La síntesis de péptidos en fase sólida se prefiere particularmente, tales como los métodos basados en la química de tBoc o Fmoc [242] . La síntesis enzimática [243] también puede usarse en parte o totalmente. Como una alternativa a la síntesis química, la síntesis biológica puede usarse, por ejemplo, los polipéptidos pueden producirse por traducción. Esto puede llevarse a cabo in vitro o in vivo. Los métodos biológicos se restringen en general a la producción de polipéptidos basados en L-aminoácidos, pero la manipulación de la maquinaria de traducción (por ejemplo, de las moléculas de ARNt de aminoacilo) puede usarse para permitir la introducción de D-aminoácidos (o de otros aminoácidos no naturales, tales como yodotirosina o metilfenilalanina, azidohomoalanina, etc.) [244]. Cuando se incluyen los D-aminoácidos, sin embargo, se prefiere usar la síntesis química. Los polipéptidos de la invención pueden tener modificaciones covalentes en el término C y/o término N. Los polipéptidos de la invención pueden tomar diferentes formas (por ejemplo, nativas, fusiones, glucosiladas, no glucosiladas, lipidadas, no lipidadas, fosforiladas, no fosforiladas, miristoiladas, no miristoiladas, monoméricas, multiméricas, particuladas, desnaturalizadas, etc.). ün polipéptido purificado es separado o discreto del organismo completo en el que se expresó. El término "ácido nucleico" incluye en términos generales, una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que contienen desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Incluye ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN. También incluye análogos de ADN o ARN, tales como los que contienen estructuras modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) o fosforotioatos) o bases modificadas. De esta manera, la invención incluye ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADN, ADNc, ácidos nucleicos recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plásmidos, vectores, sondas, cebadores, etc. Cuando el ácido nucleico de la invención toma la forma de ARN, puede o no puede tener una cubierta 5' . Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse de muchas maneras, por ejemplo, por síntesis química (por lo menos en parte) , por digestión de ácidos nucleicos largos usando nucleasas (por ejemplo enzimas de restricción) , uniendo ácidos nucleicos cortos (por ejemplo, usando ligasas o polimerasas) de bibliotecas genómicas o ADNc, etc. Las secuencias incluidas en los ácidos nucleicos y polipéptidos para facilitar la clonación o purificación, etc., no contribuyen necesariamente a la invención y pueden omitirse o retirarse.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Polipéptidos El polipéptido híbrido ?T287~953, el polipéptido híbrido 936-AG741 y el polipéptido NadA(NL> (c> se prepararon como se describe en la referencia 24. Estos polipéptidos se codifican por secuencias tomadas de los genomas de las cepas del serogrupo B de meningococo. Los tres polipéptidos se mezclaron para dar una formulación combinada, que incluye un adyuvante de hidróxido de aluminio. La formulación se usó para inmunizar ratones, y los títulos bactericidas de sueros inmunes se valoraron contra cepas meningocócicas en los serogrupos A, B, C, W135 e Y. Los resultados contra 11 cepas fueron como sigue: De esta manera la composición mezclada fue efectiva en los sueros extraídos, que fueron bactericidas contra el serogrupo B, que es el serogrupo de origen para las secuencias de aminoácidos incluidas en el polipéptido. Los títulos en el mismo intervalo se observaron contra los serogrupos A y C, y se observaron títulos ligeramente menores contra el serogrupo W. De manera sorprendente, los títulos más altos se observaron contra las cepas en los serogrupos Y.

Además, los títulos observados contra las cepas del serogrupo Y fueron equivalentes a los obtenidos usando una vacuna de conjugado A/C/W135 Y tetravalente [8] : De esta manera, por primera vez, los inventores han logrado respuestas inmunes efectivas contra las cepas meningocócicas de cada uno de los serogrupos patogénicos (A, B, C, W135 e Y) usando los antígenos polipeptídicos y sin usar sacáridos capsulares . Se entenderá que la invención se ha descrito únicamente por medio de ejemplos y que pueden hacerse modificaciones mientras que se mantengan dentro del alcance y espíritu de la invención.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para inmunizar a un paciente contra una infección por el serogrupo Y de Neisseria meningitidis, caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición que comprende uno o más polipéptidos inmunogénicos .
2. Un método para inmunizar a un paciente contra una infección por el serogrupo Y de Neisseria meningitidis, caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición que comprende OMVs meningococica.
3. El uso de uno o más polipéptidos inmunogénicos en la manufactura de un medicamento para inmunizar a un paciente contra una infección por el serogrupo Y de Neisseria meningi tidis .
4. El uso de OMVs meningococica en la manufactura de un medicamento para inmunizar a un paciente contra una infección por el serogrupo Y de Neisseria meningitidis .
5. El método o uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para inmunizar a un paciente también contra una infección por el serogrupo A, B, C y/o W135 o N. meningi tidis .