MXPA06011286A

MXPA06011286A - Peptido de procineticina 2beta y su uso.

Info

Publication number: MXPA06011286A
Application number: MXPA06011286A
Authority: MX
Inventors: Changlu Liu; Jingcai Chen
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2005-03-29
Publication date: 2007-03-26
Also published as: US7612163B1; AU2005230886A1; WO2005097826A2; JP2008505852A; WO2005097826A3; EP1756153A2; CA2562969A1

Abstract

Se describe un peptido de PK2(, el cual, como un agonista del receptor 1 de proquineticina es util para tratar enfermedades y trastornos pulmonares y gastrointestinales mediados por la actividad de PKR1.

Description

PEPTIDO DE PROCINETICINA 2BETA Y SU USO REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad a la Solicitud Provisional de los E.U.A. No. 60/557,733, presentada el 29 de marzo de 2004.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al péptido designado PK2ß, el cual es un producto procesado a partir del pro-péptido PK2ß. PK2ß, un ligando selectivo para PKR1 , es útil en el tratamiento de trastornos gastrointestinales (por ejemplo, constipación), trastornos del pulmón (por ejemplo, movimiento ciliar insuficiente en el pulmón y las vías aéreas), y ciertos cánceres (por ejemplo, cánceres ováricos y cánceres testiculares) en donde se expresa PKR1.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se han identificado dos péptidos ricos en cisteína, procineticina 1 (PK1 ) y procineticina 2 (PK2). Las procineticinas (PKs) son péptidos multifuncionales, los cuales se ha mostrado que estimulan las contracciones del músculo liso gastrointestinal (Gl) (Li et al., "Identification of two procineticina cADNs: Recombinant proteins potently contract gastrointestinal smooth muscle", Mol Pharmacol 59: 692-698 (2001)). PK1 , también conocida como factor de crecimiento endotelial vascular de la glándula endocrina (EG-VEGF), estimula la proliferación y migración de las células derivadas a partir de las glándulas endocrinas, y promueve la angiogénesis en el ovario del ratón (LeCouter et al., "Identification of an angiogenic mitogen selective for endocrine gland endothelíum", Nature 412: 877-884 (2001 )). PK2, o Bv8 de mamífero, se cree que afecta los ritmos circadianos conductuales en el núcleo supraquiasmático (SCN) y promueve la angiogénesis en el testículo (Cheng et al., "Prokineticin 2 transmite the behavioural circadian rhythm of the suprachiasmatic nucleus", Nature 417: 405-410 (2002); LeCouter et al., "The endocrine-gland-derived VEGF homologue Bv8 promotes angiogenesis in the testis: Localization of Bv8 receptors to endothelial cells", Proc Nati Acad Sci USA 100: 2685-2690 (2003)). PK1 y PK2 están cercanamente relacionadas y comparten homología de secuencia significativa con respecto a la proteína intestinal mamba (MIT) (Schweitz et al., "Purification and pharmacological characterization of peptide toxin from the black mamba (Dendroaspis polylepis) venom", Toxicon 28: 847-856 (1990); Schweitz et al., "MIT(1 ), a black mamba toxin with a new and highly potent activíty on intestinal contraction", FEBS Lett 461 : 183-188 (1999)) y una proteína secretada por la piel de rana, Bv8. Bv8 es un potente estimulante de las contracciones del músculo liso Gl (Mollay et al. "Bv8, a small protein from frog skin and its homologue from snake venom induce hyperalgesia in rats", Eur J Pharmacol 374:189-196 (1999)) y estimula la sensibilidad de los nociceptores periféricos (Negri et al., "Nociceptive sensitization by the secretory protein Bv8", Br J Pharmacol 137: 1147-1154 (2002)). PKs se unen y activan dos receptores acoplados a la proteína G cercanamente relacionados (GPCRs), receptor 1 (PKR1 ) y 2 de procineticina (PKR2), los cuales son 87% idénticos mediante secuencia (Lin et al., 2002, mencionado a continuación; Masuda et al., "Isolation and identification of EG-VEGF/prokineticins as cognate ligands for two orphan G-protein-coupled receptors", Biochem Biophys Res Commun 293: 396-402 (2002); Soga et al., "Molecular cloning and characterization of prokineticin receptors", Biochim. Biophys. Acta 1579: 173-179 (2002)). PKs estimulan la mobilización de Ca2+ en las células que expresan el receptor PK (PKR), presumiblemente a través de la interacción de la proteína Gq con el receptor (Lin et al., "Identification and molecular characterization of two closely related G protein-coupled receptors activated by prokineticin/endocrine gland vascular endothelial growth factor", J Biol Chem 277: 19276-19280 (2002a)). La toxina de pertussis (PTX) inhibe la señalización de la proteína cinasa activada por mítógeno inducido por PK1 (MAPK) (Lin et al., "Characterization of endocrine gland-derived vascular endothelial growth factor signalíng in adrenal cortex capillary endothelial cells", J Biol Chem 277: 8724-8729 (2002b)), sugiriendo que PKRs también se pueden acoplar a las proteínas G¡. Los alineamientos de secuencia han sugerido que ias PKs tienen distintos dominios N y C terminales (Bullock et al., "Structural determinants required for the bioactivities of prokineticins and identification of prokinectin receptor antagonists", Mol. Pharmacology 65: 582-588 (2004)). El dominio N terminal contiene seis aminoácidos (AVITGA) conservados entre las PKs a partir de especies mamíferos y no mamíferos (id.). La región C terminal contiene diez cisteínas conservadas formando cinco pares de enlaces disulfuro (id.). También se ha estudiado la actividad farmacológica de una variante de procesamiento de PK2 que contiene 21 aminoácidos extra insertados entre los exones 2 y 3 (id.).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención se dirige a un péptido que consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de AVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIWVKSIRICTPMGKLGDSCHPLTRKNNFG NGRQE (SEQ.ID.NO.:1 ) y AVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIVWKSIRICTPMGQVGDSCHPLTRKSHVA NGRQE (SEQ.ID.NO.:2). En una modalidad preferida, la invención se dirige al péptido PK2ß de humano que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ. ID. NO. :1. En otra modalidad preferida, la invención se dirige al péptido PK2ß de ratón o de rata que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ.ID.NO.:2. En otro aspecto, la invención también se dirige a los métodos para el tratamiento de un paciente diagnosticado con una enfermedad o trastorno mediado por la actividad PK1 , que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente activa de un péptido PK2ß en forma sustancialmente pura. En una modalidad preferida, la enfermedad o trastorno es una enfermedad del estómago/intestino o trastorno gastrointestinal. En otra modalidad preferida, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno pulmonar. Diversas modalidades diferentes, características, y ventajas de la invención se entenderán más completamente con referencia a la descripción detallada y las figuras anexas dibujadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1A provee una comparación de secuencia de aminoácidos entre PK2 y PK2L de humano, sin péptido señal (los 21 aminoácidos adicionales en PK2L están resaltados en letras negritas; las secuencias para reconocimiento de furina están subrayadas; los sitios potenciales para la escisión de la furina se indican por las flechas). La figura 1 B muestra una comparación de secuencia de aminoácidos entre los péptidos PK2L de humano y de rata/ratón (los péptidos PK2L de rata y de ratón son idénticos; las secuencias putativas de reconocimiento de la furina están subrayadas). La figura 1C ilustra la estructura del gen de PK2 y el uso diferencial del exón por el ARNm de PK2 y PK2L (los números indican las posiciones de los nucleótidos en las regiones codificantes de PK2 y de PK2L, respectivamente; ATG y STP representan los codones de inicio y de paro de la traducción, respectivamente). La figura 2 ilustra los perfiles de expresión del ARNm de PKs y PKRs. Los productos de RT-PCR para PKR1 , PKR2, PK1 , PK2 y PK2L se corrieron en geles de agarosa transferidos a membrana de nitrocelulosa y se hibridaron con sondas específicas, respectivamente. La detección por RT-PCR de la expresión del ARNm de la ß-actina de humano se utilizó como un control interno. La figura 3 muestra los resultados del análisis por Western blot de PKs recombinantes expresadas en las células COS-7 (PK1 , PK2 y PK2L marcadas con FLAG ya sea a partir de medio condicionado por la célula (líneas 1-5) o a partir de lisados de célula (líneas 6-10) se analizaron mediante Western Blot utilizando anticuerpo anti-FLAG M2; las líneas 1 y 6 muestran las células control, las líneas 2 y 7 muestran los resultados de las células que expresan PK1 , las líneas 3 y 8 muestran las células que expresan PK2, las líneas 4 y 9 muestran las células que expresan PK2L; las líneas 5 y 10 muestran las células que co-expresan PK2L y furina). Las figuras 4A y 4B ilustran gráficamente que las PKs se unen a PKR1 y PKR2 con diferentes afinidades. Las células COS-7 que transitoriamente expresan PKR1 o PKR2 se sembraron en placas de 96 pozos. PK2-f marcado con 125l se añadió a cada pozo a una concentración final de 100 pM. Se añadieron diferentes concentraciones de PK1 , PK2 o PK2ß a los ensayos como los competidores. Todos los ensayos se llevaron a cabo por triplicado. Los resultados son los valores medios (± S.E.M) de triplicados. La figura 4A provee los resultados del ensayo de unión utilizando las células que expresan PKR1. La figura 4B muestra los resultados del ensayo de unión en células que expresan PKR2 (leyenda: u, PK1 ; Á, PK2; T , PKß). Las figuras 5A y 5B ilustran gráficamente que las PKs estimulan la movilización de Ca2+ en las células HEK 293 que expresan PKR1 o PKR2 a potencias diferentes. Las células HEK 293 que transitoriamente expresan PKR1 o PKR2 se sembraron en placas de 96 pozos, se cargaron con el colorante Ca2+ Fluo-3 y luego se estimularon con diferentes concentraciones de PK1 , PK2 o PK2ß. La liberación de Ca2+ se midió con un lector de placas por formación de imagen fluorescente (FLIPR). Los resultados son los valores medios (± S.E.M) de experimentos por triplicado. La figura 5A muestra los resultados para movilización de Ca + en células que expresan PKR1. La figura 5B provee los resultados para movilización de Ca2+ en células que expresan PKR2 (leyenda: m, PK1 ; Á , PK2; T , PK2ß). La figura 6 muestra que Gq¡5 mejora la movilización de Ca2+ inducida por PK en células 293 que expresan PKR2. Las células 293 se transfectaron ya sea con Gq¡5 o PKR2, o se co-transfectaron con PKR2 y Gq¡5. Dos días después de la transfección, las células se evaluaron en ensayos de movilización de Ca2+ en respuesta a la estimulación por PK2. Las figuras 7A y 7B ilustran resultados experimentales que muestran que las procineticinas estimulan la acumulación de AMPc en las células SK-N-MC/ß-gal que expresan PKR1 (figura 7A) y PKR2 (figura 7B). Las células se sembraron en placas de 96 pozos la noche antes del ensayo. Se añadieron diferentes concentraciones de PK1 o PK2 al medio y se incubaron a 37°C por 6 horas (h). Se midieron las concentraciones de AMPc mediante el ensayo de la actividad de la ß-galactosidasa en las células utilizando CPRG como el sustrato. Los resultados de los ensayos se leyeron en un lector de microplaca a 570 nm (leyenda: m, PK1 ; A , PK2; T, PK2ß). La figura 8A muestra resultados que demuestran la estimulación de la acumulación de AMPc en células que expresan PKR1 y PKR2 (las células HEK293 fueron ya sea no transfectadas o transfectadas por PKR1 , PKR2, Gs o se co-transfectaron por Gs con PKR1 o PKR2; las células transfectadas se estimularon por 1 M de PK2; el AMPc acumulado se midió utilizando un equipo de ensayo para AMPc [125I] FlashPlate). Las figuras 8B y 8C ilustran resultados a partir de células HEK 293 que co-expresan PKR1/Gs (figura 8B) o PKR2/Gs (figura 8C) estimuladas con diferentes PKs a diversas concentraciones (el AMPc acumulado se midió mediante un equipo de ensayo para AMPc [125l] FlashPlate; los resultados son los valores medios (± S.E.M) de experimentos por triplicado (leyenda: m, PK1 ; A , PK2; T, PK2ß).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Y SUS MODALIDADES PREFERIDAS El ADNc para un ARNm de PK2 alterativamente procesado, designado en la presente invención como PK2L, codifica 21 aminoácidos adicionales en comparación con PK2. Actualmente se ha descubierto que la expresión de PK2L resulta en la producción de una forma corta del péptido designado en la presente invención como PK2ß. La caracterización funcional de PK2ß en comparación con PK1 y PK2 indica que PK2ß exhibe una fuerte selectividad del receptor por PKR1 contra PKR2. Además, los estudios de transducción de la señal muestran que PKs estimulan la adenil ciclasa en células que expresan PKR, indicando que PKRs también se acoplan a las proteínas Gs. Como se describe en los ejemplos a continuación, PK2L se expresó de manera recombinante en las células de mamífero y se caracterizó farmacológicamente en comparación con PK1 y PK2. La caracterización bioquímica indica que la proteína PK2L secretada se procesa adicionalmente hasta un péptido más pequeño mediante escisón proteolítica, presumiblemente mediante escisión en los dos sitios putativos para escisión de furina, designados PK2ß. La co-expresión de furina con PK2L incrementó significativamente la eficiencia en el procesamiento de PK2ß. Los estudios funcionales mostraron que los péptidos PK1 , PK2, y PK2ß estimulan la respuesta intracelular del Ca2+ en células que expresan PKR1 con potencias similares. No obstante, el estímulo por PK2ß de la respuesta de Ca2+ en células que expresan PKR2 es aproximadamente 50 veces menos potente que PK1 y PK2. El estímulo diferencial de la respuesta del Ca2+ por PK2ß en comparación con PK2 sobre las células que expresan PKR1 y PKR2, combinado con diferentes patrones de expresión de PK2 y PK2L, indica que estos péptido pueden tener diferentes funciones in vivo. Los resultados, los cuales se discuten a continuación, indican que PKs no solamente estimulan la movilización del Ca2+, sino que también inducen la acumulación de AMPc en células que expresan PKR. La expresión funcional y purificación de PKß provee un agente útil para la activación selectiva de PKR1 ¡n vivo. Por lo tanto, PK2ß debe ser útil como un terapéutico para activar selectivamente a PKR1. La activación selectiva de PKR1 por PK2ß también facilita la identificación y selección de compuestos que se unen a o que modulan la actividad de PKß, o que son competidores de unión de PK2ß, de manera que al sobre-regular o sub-regular la actividad de PKR1 , dichos compuestos se pueden utilizar (por ejemplo, como inhibidores, agonistas, o antagonistas de la actividad de PK2ß) en el tratamiento de enfermedades o trastornos mediados por la actividad de PKR1. Las condiciones médicas ejemplares, enfermedades, u otras indicaciones que se pueden tratar con el péptido de la invención o compuestos que modulan su actividad ¡ncluyen, pero no se limitan a, el tratamiento para mejorar la función y motilidad gastrointestianal (Gl), función pulmonar y del pulmón, función inmune, función placental, función vascular, nutrición pre- y postnatal, ritmos circadianos, y producción de leche. Las enfermedades pulmonares ejemplares incluyen asma, sarcoidosis, enfermedad pulmonar intersticial, neumonía intersticial, síndrome de Sjogren, síndrome de bronquiolitis obliterans (BOS), enfermedad fibrótica de pulmón, enfermedad crónica obstructiva pulmonar (COPD), y síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) (véase, por ejemplo, Efthimiou et al, 2005, South Med. J., 98 (2): 192-204; Hachem et al., 2004, Semin. Thorac. Cardiovasc. Surg., 16 (4): 350-355; y Medford et al., 2005, Thorax., 60 (3): 244-248). Las enfermedades ejemplares del Gl incluyen síndrome de intestino irritable, gastroparesis diabética, íleon postoperativo, constipación crónica, enfermedad de reflujo gastroesofágico, dispepsia crónica, y gastroparesis (véase, por ejemplo, Samsom et al., 1997, Dig. Dís. 1997, 15 (4-5): 263-274; Tonini et al, 1996, Pharmacol. Res., 33 (4-5): 217-226; Achem et al., 1998, Dig. Dis., 16 (1 ): 38-46; y Briejer et al, 1999, Trends Pharmacol. Sci. 20 (1 ): 1-3). Los trastornos ejemplares relacionados con la preñez y con la función placental incluyen disfunción placental, preeclampsia, síndrome de respuesta inflamatoria fetal, y síndrome antifosfolípido (LPS) (véase, por ejemplo, Weissgerber et al., 2004, Med. Sci. Sports Exero, 36 (12): 2024-2031 ; Arad et al., 2004, Isr. Med. Assoc. J., 6 (12): 766-769; y Hickey et al., 2000, Baíllieres Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol., 14 (6): 937-51 ). Las enfermedades ejemplares asociadas con la regulación aberrante de la angiogénesis ¡ncluyen ciertos cánceres, tales como, cánceres ováricos, cánceres cervicales, cánceres testiculares, y cánceres adrenales (véase, por ejemplo, LeCouter et al., 2002, Coid Spring Harb. Symp. Quant. Biol, 67: 217-221 ; Kisliouk et al., 2003, J. Clin. Endocrinol. Metab., 88 (8): 3700-3707; LeCouter et al, 2003, Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 100 (5)': 2685-2690; Zhang et al., 2003, Clin. Cáncer Res., 9 (1 ): 264-272; LeCouter et al., 2002, Nat. Med., 8 (9): 913-917; Ferrara et al., 2003, Am. J. Pathol., 162 (6): 1881-1893; y LeCouter et al., 2003, Endocrinology, 144 (6): 2606-2616). La dosis apropiada o cantidad efectiva para el tratamiento de dichas enfermedades, condiciones médicas, u otras indicaciones se pueden determinar rutinariamente utilizando técnicas conocidas para determinar dosis apropiadas. A continuación se ilustra la preparación del material PK2ß, el cual se puede utilizar como un terapéutico o para identificar compuestos terapéuticos.

Materiales y Métodos Clonación del ADNc de PKR1 y PKR2. Las regiones codificantes de ADNc de longitud total tanto para PKR1 como para PKR2 se amplificaron medíante PCR a partir de ADNc de cerebro fetal de humano (Clontech, Palo Alto, CA). Los iniciadores utilizados para PKR1 fueron P1 : 5' ACG TGA ATT CGC CAC CAT GGA GAC CAC CAT GGG GTT CAT G 3' (SEQ.ID.N0..3), y P2: 5' ACG TAG CGG CCG CTT ATT TTA GTC TGA TGC AGT CCA CCT C3' (SEQ.ID.N0..4). Los iniciadores utilizados para PKR2 fueron P3: 5' ACG CGA ATT CGC CAC CAT GGC AGC CCA GAA TGG AAA CAC 3" (SEQ.ID.N0..5), y P4: 5' ACG CAT GCG GCC GCG TCA CTT CAG CCT GAT ACA GTC CAC 3' (SEQ. ID. NO. :6). Las condiciones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) fueron 94°C por 40 segundos (segundo), 65°C por 40 segundos y 72°C por 3 minutos (minuto) (40 ciclos). Los productos de PCR se clonaron dentro del vector pCIneo (Promega, Madison, Wl) y las regiones del inserto se secuenciaron utilizando un secuenciador de ADN automatizado (ABl, Foster City, CA).

Expresión y purificación de procineticinas. La región codificante del péptido maduro de PK1 de humano se amplificó mediante PCR a partir del ADNc de cerebro fetal de humano (Clontech) utilizando dos iniciadores P5: 5 TCA TCA CGA ATT CGA TGA CGA CGA TAA GGC TGT GAT CAC AGG GGC CTG TGA GCG GGA TG 3' (SEQ.ID.N0..7), y P6: 5* ACG ATA GGA TCC CTA AAA ATT GAT GTT CTT CAA GTC CAT G 3' (SEQ.ID.N0..8). Los ADNc de PK2 y PK2L sin la región codificante del péptido señal se amplificaron mediante PCR a partir del ADNc de cerebro fetal de humano (Clontech) utilizando dos iniciadores P7: 5' CAT CAC GAA TTC GAT GAC GAC GAT AAG GCC GTG ATC ACC GGG GCT TGT GAC AAG 3' (SEQ.ID.N0..9) y P8: 5' ACG ATA GGA TCC TTA CTT TTG GGC TAA ACA AAT AAA TCG 3' (SEQ.ID.NO.JO). Las condiciones de PCR fueron 94°C por 40 segundos, 65°C por 40 segundos y 72°C por 1 minuto (40 ciclos). Los productos de PCR para PK1 , PK2, y PK2L se clonaron dentro de un vector de expresión pCMV-sportl modificado (Invitrogen), el cual codifica una secuencia señal del péptido alfa seguido por una marca FLAG. Los ADNc de PK se clonaron en marco después de la secuencia codificante FLAG y las regiones del inserto se secuenciaron para confirmar las identidades. Los vectores de expresión resultantes codificaron proteínas quiméricas con un péptido señal de la proteína secretada de mamífero seguido por un péptido FLAG, un sitio de escisión de enterocinasa, y PK1, PK2 y PK2L sin sus secuencias naturales de péptido señal, respectivamente. Los plásmidos PK1 , PK2 y PK2L se transfectaron dentro de células COS-7 utilizando LipofectAmine (Invitrogen). Tres días después de la transfección, se recolectaron los sobrenadantes del cultivo celular y se procesaron a través de columnas de afinidad de agarosa ANTI-FLAG M2 (Sigma, St. Louis, MO). Las columnas se lavaron con solución salina con pH regulado con fosfato (PBS) y se eluyó con OJ mM de glicina HCl, pH 3.0. Las fracciones eluídas de proteína se neutralizaron inmediatamente con 1 M de Tris-HCl, pH 8.0 y se escindieron con enterocinasa (Novagen, Madison, Wl). Luego las proteínas escindidas se purificaron adicionalmente mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (CLAR) utilizando una columna C4 (Vydac, Hispevia, CA).

Western Blot. La expresión de proteína PK recombinante se monitoreó mediante Western Blot. En un tubo de 1.5 mi, se añadieron 20 µl de una pasta aguada de glóbulos de agarosa ANTI-FLAG M2 a 1 ml del medio de cultivo celular a partir de células COS-7 que expresan PK1 , PK2, PK2L, coexpresan PK2L y furina, o a partir de células COS-7 control. Al mismo tiempo, las muestras celulares correspondientes se usaron con regulador de pH para lisis (100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCI, 1 % de Tritón X-100, 1 % de cóctel inhibidor de proteasa, Sigma) y se mezcló con los glóbulos ANTI-FLAG. Los tubos se incubaron a 4°C en una plataforma móvil durante toda la noche. Los glóbulos se centrifugaron y se lavaron dos veces con TBST enfriado con hielo (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% de Tween 20). Las proteínas inmuno-precipitadas se procesaron sobre un gel de SDS-PAGE al 4-20% bajo condiciones reductoras y se transfirieron sobre una membrana de PVDF (Invitrogen). La membrana se sometió a blot primero con un anticuerpo ANTI-FLAG M2 (Sigma) y ¡uego con igG de cabra anti-ratón (conjugado con peroxidasa de rábano, Sigma). La membrana para Western blot se desarrolló entonces con un equipo Amersham ECL.

Expresión, purificación, y iodinación de PK2 C-terminal marcada con FLAG. PK2 C- terminal marcada con FLAG (PK2-f) se construyó como se describió (Soga et al., 2002). Dos iniciadores P9: ATC GAG AAT TCG CCA CCA TGA GGA GCC TGT GCT GCG CCC (SEQ.ID.NO.J 1 ) y P10: GGA TCC CTA CTT ATC GTC GTC ATC CTT ATA ATC CTT TTG GGC TAA ACA (SEQ. ID. NO.: 12) se utilizaron para amplificar ADNc de cerebro total de humano (Clontech). El PK2-f amplificado mediante PCR se clonó dentro de un vector de expresión de mamífero pCMV-sponJ (ínvitrogen). Las clonas resultantes se secuenciaron para confirmar las identidades y se transfectaron dentro de las células COS-7 utilizando LipofectAmine (Invitrogen). Tres días después de la transfección, se recolectó el sobrenadante del cultivo celular y se procesó a través de una columna de afinidad de agarosa ANTI-FLAG M2 (Sigma). La columna se lavó con PBS y se eluyó con OJ mM de glicina HCl, pH 3.0. La fracción de proteína eluída se neutralizó inmediatamente con 1 M de Tris-HCl, pH 8.0 y luego se purificó adicionalmente mediante CLAR en fase reversa utilizando una columna C4 (Vydac). La proteína PK2-f recombínante purificada se yodó utilizando el reactivo lodogen (Pierce, Rockford, IL) y 125l-Nal (PerkinElmer, Boston, MA) como se describe por Pierce. El PK2-f yodado se purificó mediante una columna de G-50 (Amersham Pharmacia Biotech) para filtración en gei.

Ensayos de unión al radioligando. PKR1 y PKR2 en el vector de expresión pCIneo (Promega) se transfectaron dentro de células COS-7 utilizando LipofectAmine (Invitrogen). Dos días después de la transfección, las células se separaron a partir de los platos de cultivos mediante 10 mM de EDTA en PBS, se lavaron con Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) y se sembraron en placas opacas de 96 pozos revestidas con polilisina (BD Biosciences, San José, CA) a una densidad de 50,000 células por pozo. Dos horas después de la siembra, los ensayos de unión por competencia se llevaron a cabo en las placas de 96 pozos en la presencia de 100 pM de PK2-f marcado con 125l y diversas concentraciones de PK1 , PK2 o PK2ß no marcados como competidores. Los ensayos de unión se llevaron a cabo en DMEM plus 50 mM de HEPES, pH 7.2 y 1 % de albúmina de suero de bovino en un volumen final de 100 µl. Los ensayos de unión se llevaron a cabo a temperatura ambiente por 1 hora. Después las placas se lavaron tres veces con PBS enfriado con hielo, se añadió Microscint-40 (Packard, Meriden, CT) y las placas se contaron en un Topcount (Packard).

Ensayos de movilización intracelular de Ca2+. PKR1 y PKR2 en el vector de expresión pCIneo (Promega) se transfectaron dentro de células HEK293 utilizando LipofectAmine (Invitrogen). Dos días después de la transfección, las células se separaron utilizando PBS que contiene 10 mM de EDTA y se sembraron en placas negras para cultivo de tejido de 96 pozos revestidas con poli-D-lisina (BD Biosciences). La movilización de Ca2+ estimulada por el ligando se ensayó utilizando el colorante Fluo-3 Ca2+ (TEF Labs, Austin, TX) en FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) como se describió previamente (Liu et al., "Comparison of human, mouse, rat and guinea pig histamine H4 receptors reveáis substantial pharmacological species variation", J Pharmacol Exp Ther 299: 121-130 (2001a)).

Estimulación de la acumulación de AMPc en células que expresan PKR mediante PKs. Los ensayos de acumulación de AMPc estimulada por PK se llevaron a cabo utilizando células SK-N-MC que expresan establemente PKR1 y PKR2 que portan un gen reportero de la ß-galactosidasa bajo el control del promotor CRE. Las líneas celulares estables se crearon bajo selección de 400 mg/L de G418 (Sigma) siguiendo a la transfección de los vectores de expresión PKR1 o PKR2. El incremento de la concentración intracelular de AMPc lleva a la mayor expresión de la ß-galactosidasa, cuya actividad se midió utilizando clorofenol rojo-ß-D-galactopiranósido (CPRG) como el sustrato. Las células se sembraron en placas para cultivo de tejidos de 96 pozos, estimuladas con diferentes concentraciones de PK1 , PK2 o PKß. Las concentraciones intracelulares de AMPc se midieron indirectamente mediante el ensayo de las actividades de la ß-galactosidasa en las células como se describió (Liu et al., "Cloning and pharmacological characterization of a fourth histamíne receptor (H4) expressed in bone marrow", Mol Pharmacol 59: 420-426 (2001b)). En un experimento diferente, PKR1 y PKR2 en el vector de expresión pCIneo (Promega) se co-transfectaron con el plásmido de expresión de Gs dentro de las células HEK293 utilizando LipofectAmine (Invitrogen). Dos días después de la transfección, las células se separaron con 10 mM de EDTA en PBS, se resuspendieron en Medio Eagle Modificado por Dulbecco/F12 (DMEM/F12), y luego se sembraron sobre placas de 96 pozos a una densidad de 50,000 células por pozo. Dos horas después de la siembra, el medio de cultivo de células se reemplazó con DMEM/F12 que contiene 2 mM de ¡sobutilmetilxantina (Sigma) y se incubó por 30 minutos. Se añadieron diferentes concentraciones de PK1 , PK2 o PKß a las células y se incubaron por 30 minutos adicionales en un volumen final de 200 µl/pozo. La reacción se detuvo y se extrajo el AMPc mediante la adición de 20 µl de 0.5N de HCl a cada pozo. Los medios de cultivo celulares se evaluaron para las concentraciones de AMPc mediante el equipo de ensayo para AMPc [125l] FlashPlate (PerkinElmer) como se describe por el fabricante.

La detección por RT-PCR de la expresión del ARNm de PK2L en diferentes tejidos de humano. Once agrupamientos de ADNc de humano (Clontech) a partir de tejidos de humano se analizaron para la expresión de ARNm para PK1 , PK2, PK2ß, PKR1 y PKR2 utilizando el método de amplificación por PCR. Los iniciadores de PCR utilizados en las reacciones son P7 y P8 como se describieron anteriormente para PK2 y PK2ß; P11: 5'ACG TAA GAA TTC GCC ACC ATG AGA GGT GCC ACG CGA GTC TCA3' (SEQ.ID.N0..13) y P12: 5'ACG TAA GAA TTC CTA AAA ATT GAT GTT CTT CAA GTC CAT GGA3' (SEQ.ID.N0..14) para PK1 ; P13: 5'CAA CTT CAG CTA CAG CGA CTA TGA TAT GCC TTT GG3' (SEQ.ID.N0..15) y P14: 5'GAC GAG GAC CGT CTC GGT GGT GAA GTA GGC GGA AG3' (SEQ.ID.NO.:16) para PKR1 ; y P15: 5TCT CCT TTA ACT TCA GTT ATG GTG ATT ATG ACC TC3' (SEQ.ID.N0..17) y P16:5' CGA TGG GAT GGC AAT GAG AAT GGA CAC CAT CCA GA3' (SEQ.ID.N0..18) para PKR2. Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo a las condiciones de 94°C por 40 segundos, 65°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto, por 40 ciclos utilizando la ADN polimerasa Platinum Taq (Invitrogen). Los productos de PCR se procesaron en geles de agarosa, se transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa y se híbridaron con sondas de oligonucleótidos marcadas con 32P específicas para PK1 (5'ACC TGT CCT TGC TTG CCC AAC CTG CTG TGC TCC AGG TTC3'-- SEQ. ID.N0..19), PK2 y PKß (5TGG GCA AAC TGG GAG ACA GCT GCC ATC CAC TGA CTCGTA3'-SEQ.ID.NO.:20), PKR1 (5'CTG ATT GCC TTG GTG TGG ACG GTG TCC ATC CTG ATC GCC ATC C3'~ SEQ. ID.NO.:21 ), y PKR2 (5'CGG ATG AAT TAT CAA ACG GCC TCC TTC CTG ATC GCC TTG G3'- SEQ.ID.NO.:22), respectivamente. La detección por PCR para la expresión del gen de la ß-actina de humano se utilizó para todo el tejido como un control para la calidad de los ADNc. Los iniciadores para la detección por PCR de la expresión de ARNm de ß-actina de humano fueron 5'GAG AAG AGC TAC GAG CTG CCT GAC GGC CAG GTC3' (SEQ.ID.NO.:23) y 5'AAG GGT GTA ACG CAA CTA AGT CAT AGT CCG CCT A 3' (SEQ.ID.NO.:24).

Resulados Identificación de ADNc de PK2L y caracterización molecular del patrón de expresión en tejido del ARNm de PK2L. En el curso de la caracterización del perfil de expresión en tejido del ARNm de PK2 utilizando RT-PCR, se identificó un producto de PCR con un tamaño ligeramente mayor que el producto pronosticado de PCR de PK2. La clonación molecular y secuenciación de ADN de ese producto de PCR indicó que éste tuvo una inserción de 63 pares de bases con respecto a la región codificante de PK2, lo cual resulta en una proteína 21 residuos más larga (figura 1A) y se designa como PK2L. La búsqueda Genbank indicó que la secuencia de los inventores codifica una proteína que es idéntica con respecto a una secuencia de proteína en la base de datos de proteína NCBI (Número de acceso Genbank Q9HC23, Wechselberger, et al., "The mammalian homologues of frog Bv8 are mainly expressed in spermatocytes", FEBS Lett 462: 177-181 (1999)). Utilizando un método similar, también se aisló un ADNc de PK2L de rata a partir del agrupamiento de ADNc de pulmón de rata. Las secuencias de ADNc completas para PK2L de humano y de rata han sido sometidas a Genbank (Número de acceso Genbank: AY349131 ; AY348322). La comparación de la secuencia de proteína indica que las proteínas PK2L de rata y de ratón (Número de acceso Genbank: NP_056583) son esencialmente idénticas, con excepción de las secuencias señal, y están altamente relacionadas con la PK2L de humano con 90% de identidad de aminoácidos (figura 1 B). La comparación de secuencia de ADN entre PK2, PK2L y ADN genómico de humano muestra que el gen PK2 contiene una región de exón putativo que no se utiliza por PK2 (figura 1C), indicando que el ARNm de PK2L puede ser una isoforma alternativamente procesada a partir del gen PK2. El perfil de expresión del ARNm de PK2L se analizó en paralelo con aquel de PK1 , PK2, PKR1 y PKR2 en 11 diferentes tejidos de humano utilizando el método de RT-PCR. Como se muestra en la figura 2, los resultados indican que cada uno de ellos tiene su patrón de expresión único. Se encontró que el ARNm de PK1 se expresa principalmente en la placenta mientras que el ARNm de PK2 se encuentra en todos los tejidos. El ARNm de PK2L se detectó en la mayoría de los tejidos evaluados y se encontró que se expresa mucho más en el pulmón y en el bazo, se detectó levemente en el cerebro y no se detectó en el riñon, en donde se detectó el ARNm de PK2. El ARNm de PKR1 se detectó en el cerebro, pulmón, hígado, bazo, y glándula mamaria. El ARNm de PKR2 tiene una expresión muy dominante en el cerebro con menores niveles de expresión en el bazo y en la glándula mamaria.

Expresión, purificación, y caracterización bioquímica de PKs. PK1 , PK2 y PK2L se expresaron como proteínas de fusión secretadas con una marca FLAG N-terminal a partir de las células COS-7. Las proteínas de fusión secretadas en sobrenadantes de cuitivo de céluias se purificaron utilizando columnas de afinidad ANTl-FLAG M2. Las proteínas purificadas por afinidad se escindieron con enterocinasa, y se purificaron adicionalmente por CLAR en fase reversa. Las proteínas purificadas mediante CLAR son mayores de 98% puras. Los tamaños de PK1 (10 kDa) y PK2 (9 kDa) son consistentes con la predicción de los inventores. No obstante, el tamaño de la proteína purificada a partir de las células COS-7 que expresan PK2L (6 - 7 kDa) es mucho más pequeña de lo que se pronosticó (11.5 kDa) de conformidad con la región codificante del ADNc de PK2L. Puesto que la región codificante de PK2L codifica 21 aminoácidos adicionales en comparación con PK2, los inventores esperaban que PK2L debía tener un peso molecular más elevado (MW) que PK2. No obstante, el ADNc de ia proteína PK2L purificada de ias células COS-7 transfectadas tiene un PM menor que PK2, indicando que existe un procedimiento de escisión de la pro-proteína para la proteína PK2L.

El análisis de Western blot del lisado de células que expresan PK2L y del medio de cultivo celular indicó que FLAG-PK2L se produjo en las células como el tamaño pronosticado (13.5 kDa), el cual es mayor que FLAG-PK1 (11.7 kDa) y FLAG-PK2 (10.8 kDa) (figura 3). Aunque se detectaron cantidades traza de FLAG-PK2L en el medio de cultivo, la mayoría de FLAG-PK2L presente en el medio condicionado parece ser procesado hacia una forma más pequeña, es decir PK2ß (8 - 9 kDa) (figura 3). Basándose en el tamaño de PK2ß, el sitio de escisión de la proteasa se pronostica en la extensión de 21 aminoácidos adicionales presentes en FLAG-PK2L. La mayoría de esos 21 aminoácidos son aminoácidos básicos, formando así una secuencia con unos pocos sitios putativos para escisión de la pro-hormona convertasa, incluyendo dos sitios furina. Las bandas dobles de la FLAG-PK2ß procesada indican el procesamiento diferencial de la FLAG-PK2L en los dos sitios diferentes de escisión de la furina. Puesto que la furina se expresa en muchas células diferentes incluyendo COS-7, la furina puede ser responsable de la escisión de PK2L. La co-expresión de la furina adicional con PK2L lleva al procesamiento completo de PK2L hacia PK2ß (figura 3). La banda inferior de las PK2ß fue la mayoría de la forma procesada y se purificó adicionalmente por CLAR en fase reversa y se utilizó para caracterizaciones farmacológicas.

Las procinetícinas se unen a PKR1 y PKR2 con diferentes afinidades. Con la PK2ß purificada disponible, se investigó si PK2ß se une a PKR1 o PKR2 en comparación con PK1 y PK2. PK2 C-terminal marcada con FLAG se marcó con 125l y se utilizó con el radioligando, el cual se ha reportado que se une a los receptores de procineticina a una alta afinidad (Soga et. al., 2002). Las membranas a partir de las células COS-7 que expresan transitoriamente PKR1 y PKR2 se utilizaron en los ensayos de unión por competencia. Los resultados (figura 4A) indican que PK1 , PK2, y PK2ß todas se unen a PKR1 con altas afinidades, con el orden de clasificación de potencia de PK2 > PK2ß = PK1. Para PKR2, solamente PK1 y PK2 mostraron una alta afinidad en los ensayos de unión, mientras que PK2ß fue marginalmente activo a altas concentraciones (figura 4B). El orden de la clasificación del ligando de la potencia para PKR2 es PK2 > PK1 » PK2ß.

Los valores IC50 de PK1 , PK2, y PK2ß para PKR1 y PKR2 se listan en el cuadro 1.

CUADRO 1 Comparación de los valores ICgn de PK1 , PK2 y PK2ß sobre PKR1 y PKR2 PKR1 PKR2 RK1 27.6 + 8.2 52.2 ± 16.4 4.5 ± 0.8 6.4 ± 1.3 PK2 PK2ß 34.6 ± 13.5 > 1 ,000 a Los valores IC50 se expresaron como nM (media ± S.E.) a partir de experimentos por triplicado en ensayos de unión por competencia del radioligando.

La selectividad de PK2ß activa PKR1. Se ha reportado que PK1 y PK2 estimulan la movilización de Ca2+ en células PKR que expresan (Lin et. al., 2002a; Soga et. al., 2002). Este estudio se diseñó para comparar PK1 , PK2 y PK2ß en la estimulación de la movilización de Ca2+ en células que expresan PKR. Los resultados muestran que PK1 , PK2 y PK2ß estimulan la movilización de Ca2+ en células HEK293 que expresan PKR1 a concentraciones nanomolares (figura 5A). A diferencia de PK1 y PK2, los cuales tienen alta potencia para ambos receptores, PK2ß solamente es activo en PKR1 (figura 5A, 5B), consistente con los resultados de unión. Las EC50 para todos los ensayos de Ca2+ se resumen en el cuadro 2.

CUADRO 2 Valores ECgna de PK1, PK2 y PK2ß para la moviíización de Ca2* en células HEK 293 que expresan PKR PKR1 PKR2 PK1 1 J ± 0.4 7.7 ± 2.1 PK2 0.8 ± 0.23 3.6 ± 1.6 PK2ß 1.5 ± 0.56 80 ± 9.7 a Los valores se expresaron en nM (media ± S.E.) a partir de experimentos por triplicado.

Los receptores de procineticina están acoplados a múltiples rutas de transducción de la señal. Se ha reportado que PTX inhibe la señalización de MAP cínasa estimulada por PK (Lin et al., 2002b), sugiriendo que PKR activa a la MAP cinasa a través de la activación de proteínas relacionadas con Gi. Para llevar a cabo los ensayos de movilización de Ca2+ se observó que la movilización máxima de Ca2+ estimulada por el ligando en células que expresan PKR2 es significativamente menor de manera consistente con aquella en las células que expresan PKR1 , lo cual es consistente con lo que se ha reportado (Lin et al., 2002a). No obstante, cuando PKR2 se co-expresó con una proteína G quimérica Gq¡5, la cual modifica el acoplamiento del receptor/Gi a la señalización de movilización de Ca2+ (Conklin et al., "Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqa to that of Gia", Nature 363: 274-280 (1993)), la movilización máxima de Ca2+ estimulada por el ligando en células que expresan PKR2 se incrementó (figura 6) a aproximadamente el mismo nivel que aquel a partir de las células que expresan PKR1 , sugiriendo que PKR2 también se puede acoplar con proteínas G relacionadas con Gi, de conformidad con el reporte previo por Lin et al. (2002b). Otros datos obtenidos mostraron que la movilización de Ca2+ en células que expresan PKR1 no se afecta significativamente por la coexpresión de Gq¡5.

Para investigar adicionalmente las rutas de transducción de la señal utilizadas por PKR1 y PKR2, se examinaron los efectos de las PKs sobre Ja estimulación de la acumulación de AMPc en células que expresan PKR1 y PKR2. Las líneas celulares PKR1 y PKR2 se establecieron en células SK-N- MC que contienen un gen de la ß-galactosidasa bajo el control del promotor CRE (Liu et al. 2001 b). En la células hospederas, el incremento de la concentración de AMPc lleva a la expresión incrementada de la ß-galactosidasa, cuya actividad enzimática, la cual refleja la concentración de AMPc en las células, se midió utilizando CPRG como el sustrato. Los resultados indicaron que PK1 y PK2 estimularon la actividad de la ß-galactosidasa en células que expresan PKR de maneras dependientes de la dosis (figura 7A, 7B). Otros datos obtenidos demostraron que, sin la expresión de PKR, las células SK-N- MC no mostraron respuesta a las PKs. Los valores EC50 para las PKs para estimular la actividad de la ß-galactosidasa en las células que expresan PKR se muestran en el cuadro 3.

CUADRO 3 Valores ECñn de PK1. PK2 v PK2ß para la estimulación de la acumulación de AMPc en células que expresan PKR Células S-N-MC Células HEK 293 PKR1 PKR2 PK41 PKR2 PK1 8.24 ± 2.3a 20 ± 4.2 16.8 ± 3.4 60 ± 6.5 PK2 1.27 ± 0.4 12.1 ± 2.8 3.17 ± 1.6 41 ± 5.3 PK2 ß ND b ND 23.4 ± 4.4 >1 ,000 aLos valores EC 0 se expresaron como nM (media ± S.E.) de experimentos por triplicado. bND: no determinado.

Los ensayos de acumulación de AMPc se llevaron a cabo en células HEK293 que transitoriamente expresan PKR1 o PKR2. Los resultados indicaron que PK estimula la acumulación de AMPc en células que expresan PKR. La acumulación del AMPc estimulada por el ligando se incrementa significativamente si la proteína Gs se co-expresa con PKRs (figura 8A). En los ensayos de acumulación de AMPc, el orden de clasificación de potencia para PK1 , PK2, y PK2ß es similar a aquel a partir de los ensayos de Ca2+. Todas las PKs mostraron altas potencias para PKR1 (figura 8B). Para las células que expresan PKR2, solamente PK1 y PK2 parecieron ser ligando de alta potencia, PK2ß solamente mostró actividad marginal a altas concentraciones (figura 8C). Las células HEK293 sin expresión de PKR no respondieron a la estimulación por PK. Los valores EC50 para PKs en la estimulación de la acumulación de AMPc en células HEK293 que expresan PKR1 o PKR2 se muestran en el cuadro 3.

Discusión El análisis de la estructura del gen de PK2 indica que el procesamiento alternativo putativo se presenta en el tercer exón del gen PK2. En comparación con PK2, el ARNm de PK2L tiene un exón adicional (63 pb) que lleva a una inserción de 21 aminoácidos entre Lys47 y Va148 de la proteína PK2. Una variante de procesamiento muy similar también se encontró en la rata y se ha reportado en el ratón (Wecheselberger et al., 1999), y por lo tanto la función de PK2L parece estar conservada entre las especies. El análisis de expresión de ARNm de PK2L indica que los patrones de expresión del ARNm de PK2L son diferentes en comparación con aquellos de PK2, y por lo tanto PK2L puede funcionar de manera diferente. La expresión del ARNm de PK2L relativamente abundante en el pulmón y el bazo, en donde el ARNm de PKR1 también se expresó, indica que PK2L puede funcionar en algunas funciones pulmonares y del sistema inmune. Se sabe que las PKs estimulan las contracciones del músculo liso. El alto nivel de expresión del ARNm de PK2L se puede relacionar con la activación del movimiento ciliar en el pulmón para repeler las partículas de polvo y de fluido fuera del pulmón. Un efecto quimioatrayente de las PKs se ha mostrado para las células endoteliales de capilares adrenales corticales (ACE) que expresan PKR (LeCouter et al., 2003). El alto novel de expresión de PK2L en el bazo aumenta el interés para ver si las células inmunes expresan PKR y quimioatrayentes en respuestas a PKs. Para investigar los papeles funcionales de PK2L, el ADNc PK2L se expresó en células de mamífero en paralelo con PK1 y PK2 y se purificaron las proteínas expresadas. Los péptidos recombinantes se elaboraron mediante la expresión de las proteínas marcadas con FLAG, escindiendo las marcas, y purificando los productos finales mediante CLAR. Aunque los productos finales para la expresión de PK1 y PK2 fueron como sospechaban los investigadores, el péptido purificado a partir de las células que expresan el ADNc de PK2L fue significativamente menor que el esperado por los inventores. La comparación de los péptidos PK2L en el lisado celular (no secretado) y el medio (secretado) indicó que PK2L se elabora en las células como se esperaba pero se procesa adicionalmente hacia la forma más pequeña mediante escisón proteolítica. El análisis de secuencia de proteína de PK2L indicó que existen dos sitios putativos de escisión de la furina (Arg-Arg-Lys-Arg60 y Arg-Ser-Lys-Arg65), los cuales se ajustan al motivo Arg-X-Lys-Arg o Arg-X-Arg-Arg para los sitios de escisión de la furina (Steiner et al., "The new enzymology of precursor processing endoproteases", J Biol Chem 267: 23435-23438 (1992); Nakayama, "Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins", Biochem J 327: 625-635 (1997)). Los sitios similares de escisión de la furina también están presentes en PK2L de ratón y de rata, pero están ausentes en los péptidos PK1 y PK2. Puesto que la furina se expresa por muchas células diferentes incluyendo células COS-7 (Yanagita et al., "Processing of mutated proinsulin with tetrabasic cleavage sites to mature insulin reflects the expression of furin in nonendocrine cell lines", Endocrinology 133: 639-644 (1993)), PK2L probablemente se escindió mediante la furina endógena durante la secreción a partir de las células COS-7. De hecho, la co-expresión de furina facilita el proceso de escisión. Puesto que PK2ß es la forma madura de PK2L, el estudio descrito en la presente invención se enfoca en PK2ß. Las propiedades farmacológicas de PK2ß se compararon con aquellas de PK1 y PK2. Los resultados indican que aunque ambos PK1 y PK2 activan de manera potente la movilización de Ca2+ en ambas células que expresan PKR1 y PKR2, PK2ß estimula de manera mucho más potente PKR1 en comparación con PKR2. PK2ß también se evaluó en comparación con PK1 y PK2 en ensayos de unión de radioligando. A partir de un intento por marcar a PK1 utilizando 125l en Tyr75 en PK1 de humano como el radioligando, el radioligando resultante produjo muy poca unión específica en los ensayos de unión utilizando ya sea células que expresan PKR1 o PKR2. Puesto que PK2 no tiene un Tyr, el C-terminal marcado con FLAG PK2, el cual tiene un Tyr en la marca FLAG, se expresó y marcó con 125l. La 125I-PK2-FLAG se une a PKR1 y PKR2 con altas afinidades y produce una relación promedio de señal a ruido de fondo de 8:1 en los ensayos de unión. Por lo tanto se utilizó 125I-PK2-FLAG como el trazador en los ensayos de competencia para caracterizar PK1 , PK2, y PK2ß no marcado. Los resultados de unión muestran que PK2ß preferencialmente se une a PKR1 sobre PKR2, lo cual coincide con los experimentos de movilización de Ca2+ de los inventores. PK2 mostró una afinidad mucho mayor tanto para PKR1 como para PKR2 en los ensayos de unión en comparación con cualquier PK1 o PK2ß. PK1 mostró una mayor potencia en los ensayos de Ca2+ pero mostró una potencia mucho menor en los ensayos de unión. La potencia disminuida de PK1 en los ensayos de unión puede explicar la unión reducida observada cuando se utiliza 125I-PK1 como el radioligando. Las diferencias de los valores EC50 e IC50 podría ser un resultado de las diferencias en los mecanismos del ensayo. El péptido maduro PK2ß posee solamente 47 aminoácidos del N-terminal de PK2 y aún así actúa como un agonista potente total para PKR1 , indicando que el dominio funcional de PK se localiza en el N-terminal. De hecho, las comparaciones de secuencia entre PK1 , PK2, MIT, y BV8 indican que comparten muchas más conservaciones en el N-terminal que en el C-terminal. Se ha mostrado que algunos receptores acoplados a proteína G interactúan con diferentes proteínas G, incluyendo proteínas Gq, G¡ y Gs (Chabre et al., " Coupling of the alpha 2A-adrenergic receptor to múltiple G-proteins. A simple approach for estimating receptor-G-protein coupling efficiency in a transient expression system", J Biol Chem 269: 5730-5734 (1994); Liu et al., "Involvement of both Gq/11 and Gs proteins in gonadotropin- releasing hormone receptor-mediated signaling ¡n LßT2 cells", J Biol Chem 277: 32099-32108 (2002); Lin et. al., 2002a, anteriormente mencionado; Sago et. al., 2002, anteriormente mencionado), y por lo tanto PKRs parecen estar acoplados con las proteínas Gq. El hecho de que la activación de MAPK inducida por PK es sensible a PTX (Lin et al., 2002b, anteriormente mencionado) indica que PKR también se puede acoplar con las proteínas G¡. De hecho, los estudios de los inventores muestran que la co-expresión de Gq¡5 con PKR2 incrementa la respuesta de Ca2+ estimulada por PK en células que expresan PKR2. Los resultados a partir de una investigación acerca de si PK estimula AMPc en células que expresan PKR indican que PK1 , PK2, y PK2ß estimularon la acumulación de AMPc en células que expresan PKR de manera dosis dependiente. Se obtuvieron resultados consistentes cuando se llevaron a cabo los ensayos de acumulación de AMPc en cualesquiera células estables SK-N-MC o células HEK293 que transitoriamente expresan PKR1 y PKR2. La co-expresión de la proteína Gs con PKRs mejoró la acumulación de AMPc estimulada por PK, reflejando que PKR puede acoplarse con las proteínas Gs. Puesto que los receptores PK se pueden acoplar a diferentes rutas de transducción de la señal a través de diferentes clases de proteínas G, las células naturales que expresan PKR con diferentes patrones de expresión de la proteína G pueden responder a PK de manera diferente, permitiendo así que esas células lleven a cabo diferentes funciones fisiológicas.

PK2ß actúa como un antagonista para PKR1 y por lo tanto es útil para el tratamiento de enfermedades o trastornos mediados por la actividad de PKR1. Los compuestos peptídicos de la invención se pueden administrar en formulaciones convencionales para péptidos, tales como aquellos descritos en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company (Easton, PA). Preferiblemente, un péptido se administra mediante inyección, preferiblemente intravenosamente, utilizando utilizando una formulación adecuada para esta ruta de administración. Alternativamente, el péptido se puede administrar mediante infusión constante durante un periodo de tiempo extendido hasta que se obtiene el beneficio terapéutico deseado. Otros modos de administración incluyen, por ejemplo, supositorios, aerosoles intranasales, y, en donde es adecuado, formulaciones orales. Las composiciones de la invención preferiblemente contienen una cantidad efectiva del péptido PK2ß -por ejemplo, una cantidad efectiva para lograr un efecto terapéutico deseado a través de la modulación de PKR1. Los niveles de dosis ejemplares son de aproximadamente 0.001 a 1000 g/kg del sujeto, más preferiblemente de 0.001 a 100 g/kg, con la selección de una dosis apropiada estando dentro de la capacidad de un experto en la técnica. Por lo tanto, la invención también provee composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efecfiva de los péptidos de la invención o sales de adición no tóxicas, amidas, o esteres de los mismos. Las sales farmacéuticamente aceptables, no tóxicas incluyen, por ejemplo, sales de adición acida formadas con los grupos amino libres utilizando ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídricos o fosfóricos, o ácidos orgánicos, tales como ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico y los similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres se pueden derivar a partir de bases inorgánicas, tales como sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxidos férricos, y bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, y los similares. Preferiblemente, las composiciones comprenden además del compuesto peptídico uno o más diluyentes líquidos, geles, o sólidos, adyuvantes, excipientes, vehículos, y/o portadores fisiológicamente tolerables o farmacéuticamente aceptables. Los diluyentes y excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, y los similares, y combinaciones de los mismos. Adicionalmente, si se desea las composiciones pueden contener además cantidades menores de ingredientes auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes estabilizantes o reguladores de pH, y los similares. Opcionalmente, las composiciones pueden contener otros ingredientes activos o se pueden coadministrar con otra composición farmacéutica. Los péptidos de la invención también se pueden utilizar para la preparación de antisuero para uso en inmunoensayos empleando reactivos marcados, por ejemplo, anticuerpos. Los compuestos peptídicos se pueden conjugar a un vehículo que confiere antigenicidad, como sea apropiado, por medios de dialdehídos, carbodiimida, o utilizando enlazadores comercialmente disponibles. Los compuestos y reactivos inmunológicos se pueden marcar con diversas marcas, por ejemplo, cromóforos, fluoróforos (tales como fluoresceína o rodamina), radioisótopos (tales como 125l, 5S, 14C, o 3H) o partículas magnetizadas utilizando medios conocidos en la técnica. Estos compuestos y reactivos marcados, o reactivos marcados capaces de recocerse y unirse específicamente a éstos, pueden encontrar uso como reactivos diagnósticos. Las muestras derivadas a partir de especímenes biológicos se pueden ensayar para la presencia o para la cantidad de sustancias que tienen un determinante antigénico en común con compuestos de la invención. Adícionalmente, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando técnicas conocidas, dichos anticuerpos pueden tener uso terapéutico, por ejemplo, para neutralizar la sobreproducción de compuestos inmunológicamente relacionados in vivo. Aunque la invención se ha descrito con referencia a la descripción detallada y sus modalidades preferidas, se entenderá que el alcance de la invención no se define por la descripción precedente, sino por las reivindicaciones anexas que se han elaborado de manera adecuada bajo los principios de la ley de patentes.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un péptido aislado y purificado que consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de AVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIWVKSIRICTPMGKLGDSCHPLTRKNNFG NGRQE (SEQ.ID.N0..1 ) y AVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIWVKSIRICTPMGQVGDSCHPLTRKSHVA NGRQE (SEQ. ID. NO. :2), o una sal, amida, o éster del mismo.

2.- Un péptido PK2ß aislado y purificado que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ. ID. NO.: 1.

3.- Un péptido PK2ß aislado y purificado que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ. ID. NO. :2.

4.- El uso de un péptido PK2ß que consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de AVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIWVKSIRICTPMGKLGDSCHPLTRKNNFG NGRQE (SEQ.ID.N0..1 ) y AVITGACDKDSQCGGGMCCAVSIWVKSIRICTPMGQVGDSCHPLTRKSHV ANGRQE (SEQ. ID. NO. :2), o una sal, amida, o éster de dicho péptido en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente diagnosticado con una enfermedad o trastorno mediado por la actividad PK1.

5.- El uso que se reclama en la reivindicación 4, en donde el péptido tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ.ID.N0..1.

6.- El uso que se reclama en la reivindicación 4, en donde el péptido tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEQ.ID.NO.:2.

7.- El uso que se reclama en la reivindicación 4, en donde la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno pulmonar.

8.- El uso que se reclama en la reivindicación 7, en donde la enfermedad o trastorno pulmonar se selecciona a partir del grupo que consiste de asma, sarcoídosís, enfermedad pulmonar intersticial, neumonía intersticial, síndrome de Sjogren, síndrome de bronquiolitis obliterans, enfermedad fibrótica de pulmón, enfermedad crónica obstructiva pulmonar, y síndrome de dificultad respiratoria aguda.

9.- El uso que se reclama en la reivindicación 4, en donde la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno gastrointestinal.

10.- El uso que se reclama en la reivindicación 9, en donde la enfermedad o trastorno gastrointestinal se selecciona a partir dei grupo que consiste de síndrome de intestino irritable, gastroparesís diabética, íleon postoperativo, constipación crónica, enfermedad de reflujo gastroesofágico, dispepsia crónica, y gastroparesis.