MXPA06009222A

MXPA06009222A - Particulas terapeuticas de fosfato de calcio y metodos para elaborar y utilizar los mismos.

Info

Publication number: MXPA06009222A
Application number: MXPA06009222A
Authority: MX
Inventors: William W Lee
Original assignee: Nod Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2004-02-13
Filing date: 2005-02-11
Publication date: 2007-03-08
Also published as: JP2007522228A; RU2006132735A; BRPI0507680A; ES2344303T3; EP1720520B1; ATE470433T1; US7651694B2; KR20070002014A; WO2005084637A2; CA2555921A1; WO2005084637A3; DE602005021756D1; US20050234114A1; JP5103022B2; AU2005219372A1; CN1993113B; CN1993113A; EP1720520A2

Abstract

La presente invencion proporciona nanoparticulas de fosfato de calcio encapsuladas con macromoleculas biologicamente activas. Las particulas pueden ser usadas como portadoras de macromoleculas biologicamente activas para entrega de las macromoleculas. La invencion tambien proporciona metodos para elaborar y usar las particulas.

Description

PARTÍCULAS TERAPÉUTICAS DE FOSFATO DE CALCIO Y MÉTODOS PARA ELABORAR Y UTILIZAR LOS MISMOS Campo de la Invención La presente invención se relaciona a partículas de fosfato de calcio novedosas, métodos para elaborarlas, y métodos para utilizarlas como portadores para suministro de macromoléculas biológicamente activas. Antecedentes de la Invención Las sustancias farmacéuticas de macromolécula, incluyendo proteínas, péptido, polisacárido, ácido nucleico, lípidos o la combinación, son una clase cada vez más importante de fármacos para tratar varias condiciones médicas. La ruta primaria para la administración de sustancias farmacéuticas macromoleculares es la inyección, la cual es desagradable, costosa y frecuentemente da por resultado la pobre conformidad del paciente. El suministro oral es una ruta preferida para administrar la medicina. Sin embargo, los fármacos macromoleculares se absorben pobremente a través de los intestinos y se pueden destruir fácilmente por el ácido estomacal o las enzimas gastrointestinales. Un procedimiento prometedor para superar las barreras para el suministro de macromoléculas oral es usar nano-partículas, las cuales pueden ofrecer protección de la degradación y facilitar la absorción de los fármacos de macromolécula. Ha sido reportado que las nano-partículas cargadas con insulina se pueden utilizar para suministrar insulina bioactiva a animales. Por ejemplo, se ha mostrado la prevención de la elevación de la glucosa en el plasma mediante la insulina cargada en las nano-partículas de poli (lacturo-co-glicoluro) con oligómero de anhídrido fumárico y aditivos de óxido de hierro. Carino y colaboradores, Controlled Reléase 65:261, (2000). Otro ejemplo de suministro oral de insulina con nano-partículas de Quitosan se proporciona por Pan y colaboradores, Intl. J. Pharmaceutics, 249:139, (2002). Además, las nanocápsulas de polialquilcianoacrilato también se han reportado por ser un portador efectivo para suministro oral de insulina en animales diabéticos. Damge y colaboradores, Diabetes, 37:246, (1988) . La captación de materiales particulados mediante la ruta gastrointestinal es documentada y se involucran los parches de Peyer linfáticos. Hussain y colaboradores, Adv. Drug Delivery Rev. 50:107, (2001). Entre los factores que afectan la absorción de partículas, el tamaño de partícula se manifiesta que es el factor principal. Por ejemplo, Jani y colaboradores (J. Pharm. Pharmacol. 42:821, 1990) estudió la absorción intestinal de partículas de poliestireno de varios tamaños en ratas. La eficiencia de absorción de partículas de poliestireno es claramente dependiente del tamaño. Las partículas menores que 100 nm mostraron absorción significante, mientras que las partículas grandes (500 nm o más) únicamente mostraron absorción moderada a baja. La dependencia de tamaño en la absorción intestinal de las partículas también se observa en las partículas de poli (lacturo-co-glicoluro) o PLGA por Desai y colaboradores (Pharm. Res. 13:1838, 1996). En este estudio, las partículas de PLGA mayores que 500 nm no mostraron virtualmente captación por la vía del tracto intestinal, se absorbió todavía el 36% de la partícula de PLGA de 100 nm. Las partículas de escala de nanómetro han sido propuestas para el uso como partículas portadoras para macromoléculas biológicas tales como proteínas y ácidos nucleicos. Ver las patentes norteamericanas 5,178,882; 5,219,577; 5,306,508; 5,334,394; 5,460,830; 5,460,831; 5,462,750; 5,464,634, 6,355,271. Las partículas de fosfato de calcio son bio-adhesivas/biocompatibles y han sido rutinariamente utilizadas como portadoras para suministrar ácido nucleico en compartimientos intracelulares in vitro. Chen y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 7:2745-52, (1987): Welzel y colaboradores, J. Mater. Chem. 14:2213-2217 (2004); Jordán y colaboradores Nucleic Acids Research 24:596-601 (1996): Loyter y colaboradores, Exp. Cell Res. 139:223-234 (1982). Además, el fosfato de calcio también ha sido probado como portador para terapia genética para suministrar ácido nucleico grande in vivo. Roy y colaboradores, Intl. J. Pharmaceutics 250:25, (2003). Se han descrito las partículas de fosfato de calcio terapéuticas. Patentes norteamericanas Nos. 6,355,271: . 6,183,803; publicaciones norteamericanas Nos. 2004/0258763: 2002/0054914; 2002/0068090; 2003/0185892; 2001/0048925; WO 02/06112; WO 03/051394; WO 00/46147; WO 2004/050065; Cherian y colaboradores, Drug Development and Industrial Pharmacy 26:459-463 (2000). El efecto de la formulación oral de las partículas de fosfato de calcio cargadas de insulina se probaron en ratones diabéticos y se ha mostrado el control de glucosa en la sangre. Morcol y colaboradores, Intl. J. Pharmaceutics 277:91, (2004). Las partículas de fosfato de calcio divulgadas tienen tamaño de partícula entre 300 nm a 100 um. El estudio animal utilizó tamaño de partícula en el intervalo de 2-4 um en promedio. Estos tamaños de partículas claramente no son óptimos . Para elaborar las partículas de fosfato de calcio con tamaño deseado, se requiere la sonicación extensiva (Cherian y colaboradores Drug Dev. Ind. Pharmacy, 26:459, 2000; Roy y colaboradores Intl. J. Pharmaceutics 250:25, 2003) , la cual puede dañar los fármacos de macromolécula encapsulados y no es compatible al procedimiento de co-precipitación . Además, la eficiencia de encapsulación de las macromoléculas - en las partículas de fosfato de calcio frecuentemente es baja. Por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,355,271 divulga la eficiencia de absorción de aproximadamente 40% si la insulina se adiciona a las partículas de fosfato de calcio preformadas; y aproximadamente 89%, si la insulina se mezcla durante la formación de la partícula. Estos métodos reportados ya sea que dieron por resultado partículas con menos tamaño óptimo, o requieren condiciones severas tales como la sonicación extendida que no es compatible a la formulación de la macromolécula. Por lo tanto, permanece una necesidad para un sistema de suministro de macromoléculas oral que sea altamente eficiente y se produzca fácilmente con costo bajo. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona una partícula que comprende: a) un núcleo de nano-partícula de fosfato de calcio; b) una macromolécula biológicamente activa encapsulada en la partícula de núcleo; y c) un agente modificador de superficie que comprende un ácido biliar encapsulado en la partícula de núcleo. En algunas modalidades, el diámetro de la partícula de núcleo es menor que aproximadamente 1000 nm, menor que aproximadamente 300 nm o menor que aproximadamente 200 nm. En algunas modalidades, el ácido biliar se selecciona del grupo que consiste de colato, deoxicolato, taurocolato, glicocolato, taurodeoxicolato, ursodeoxicolato, tauroursodeoxicolato y quenodeoxicolato. En algunas modalidades, la partícula además comprende un recubrimiento entérico. En algunas modalidades, la macromolécula activa biológica se selecciona del grupo que consiste de una proteína, un polipéptido, un polisacárido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un lípido y un carbohidrato. En algunas modalidades, la proteína o el polipéptido se seleccionan del grupo que consiste de una insulina, un eritropoyetina, un interferón, una hormona de crecimiento, y un factor de estimulación de la colonia de granulocitos (G-GSF) . En algunas modalidades, la macromolécula biológicamente activa es un alérgeno seleccionado del grupo que consiste de polvo casero de ratones, caspa animal, mohos, polen, ambrosia, látex, veneno véspido y alérgenos derivados de insectos, y cualquier combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la partícula se adapta en la forma de un aerosol. En algunas modalidades, la partícula se adapta para suministrar la macromolécula biológicamente activa a una superficie mucosal. En algunas modalidades, la partícula se adapta para suministrar la macromolécula biológicamente activa a una superficie ocular de un sujeto en la necesidad de la misma para el tratamiento de una enfermedad ocular. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una nano-partícula de fosfato de calcio descrita en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención es un método para elaborar una o más partículas de fosfato de calcio, el método que comprende: a) poner en contacto una solución acuosa de una sal de calcio con una solución acuosa de una sal de fosfato en la presencia de un agente modificador de superficie que comprende un ácido biliar; b) mezclar la solución hasta que se obtienen las partículas de fosfato de calcio de un tamaño deseado; y c) recuperar las partículas. En algunas modalidades, la concentración de la sal de calcio es de aproximadamente 5 mM y aproximadamente 200 mM. En algunas modalidades, la concentración de la sal de fosfato está entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 200 mM. En algunas modalidades, el método además comprende adicionar una macromolécula biológicamente activa en la solución acuosa de la sal de fosfato o la solución acuosa de la sal de calcio antes de poner en contacto la solución acuosa de la sal de calcio concia solución acuosa de la sal de fosfato en la presencia de un agente modificador de superficie que comprende un ácido biliar, mediante el cual la partícula de fosfato de calcio se co-cristaliza con la macromolécula . La invención también proporciona un método para tratar a un sujeto en la necesidad de una macromolécula biológicamente activa, el método que comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una nano-partícula de fosfato de calcio descrita en la presente al sujeto. En algunas modalidades, la composición farmacéutica se administra por la ruta oral. En algunas modalidades, la composición farmacéutica se administra a una superficie mucosal. En algunas modalidades, la composición farmacéutica se administra a una superficie ocular. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una gráfica que muestra los conteos de glóbulos blancos en ratas tratadas con el vehículo ("V") inyección se de G-CSF ("G") o G-CSF oral en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas ("D") . La Figura 2 es una gráfica que muestra las concentraciones de interferón de suero en ratas después del tratamiento con la inyección se de interferón ("SC1.6M") o el interferón oral en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas ("016M") . La Figura 3 muestra la imagen de las nanopartículas de fosfato de calcio bajo el microscopio electrónico de exploración. La Figura 3A muestra una imagen de las nano-partículas de fosfato de calcio de blanco en aumento de 5000 veces. La Figura 3B muestra una imagen de las nano-partículas de fosfato de calcio cargadas de insulina en aumento de 5000 veces. La Figura 4 es una gráfica que muestra el por ciento de cambio de la glucosa en la sangre en ratas diabéticas tratadas con la solución de insulina oral ("Control") , inyección de insulina subcutánea ("Inyección") e insulina oral en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas ("Oral") . La Figura 5A es una gráfica que muestra el cambio de glucosa en la sangre de un voluntario sano después de la ingestión de 68 g de glucosa oral con ("Insulina Oral") o sin 200 1U de insulina oral ("No Rx") en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas. La Figura 5B es una gráfica que muestra el por ciento de cambio de glucosa en la sangre en dos voluntarios sanos después de la ingestión de 68 g de glucosa oral con ("Insulina Oral") o sin 200 IU de insulina oral ("NoRx") en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas. La Figura 6 es una gráfica que muestra el por ciento de cambio de glucosa en la sangre en voluntarios con diabetes con ningún tratamiento ("Blanco") , 10 IU de inyección de insulina ("SC10") , o 100 IU ("PO100") o 200 IU ("PO200") de insulina oral en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas . La Figura 7 es una gráfica que muestra la ganancia de peso del cuerpo neto en las ratas hipofisectomizadas tratadas con el vehículo ("V") , inyección de hormona de crecimiento ("SC20") o la hormona de crecimiento oral en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas ("PO50") . Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona nano-partículas de fosfato de calcio novedosas encapsuladas con macromoléculas biológicamente activas, métodos para elaborar las nano-partículas y métodos para utilizar las nanopartículas para el tratamiento de condiciones médicas que requieren la administración de las macromoléculas biológicamente activas. Como se utiliza en la presente, "encapsulado", "incrustado" o . "incorporado" significa en complejo, encajonado, unido a, relacionado a, recubierto con, en capas con, o encerrado por una sustancia. Así, una sustancia encapsulada en una partícula significa que la sustancia se incorpora en la estructura de la partícula, o se recubre o se une a la superficie de la partícula, o ambas. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos, utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones referidas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad. Si una definición establecida en esta sección es contraria a, o de otra manera es inconsistente con una -definición establecida en las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones que se incorporan en la presente por referencia, la definición establecida en esta sección prevalece sobre la definición que se incorpora en la presente por referencia. Como se utiliza en la presente, "un" o "una" significa "por lo menos uno" o "uno o más". A. Nano-partículas de Fosfato de Calcio con Macromoléculas Activas Biológicas Encapsuladas La invención proporciona una nano-partícula de fosfato de calcio que comprende: a) un núcleo de nano-partícula de fosfato de calcio; b) una macromolécula biológicamente activa encapsulada en la partícula de núcleo; y e) un agente modificador de superficie que comprende un ácido biliar encapsulado en la partícula de núcleo. Las partículas de núcleo de fosfato de calcio de la presente invención tienen un tamaño de .partícula promedio (diámetro) menor que aproximadamente 8000 nm, menor que aproximadamente 1000 nm, más preferiblemente, menor que aproximadamente 300 nm. Las partículas -pueden tener un diámetro entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 8000 nm, entre aproximadamente 100 nm y aproximadamente 3000 nm, o entre aproximadamente 100 nm y aproximadamente 1000 nm. En algunas modalidades, el tamaño de partícula promedio es menor que 200 nm. En algunas modalidades, el tamaño de partícula promedio es menor que 100 nm. Las partículas de núcleo de la presente invención generalmente tienen una morfología que es generalmente y sustancialmente esférica en conformación y el tamaño de las nano-partículas es sustancialmente mono-dispersada. La mono-dispersión se refiere a la distribución del tamaño reducido observado en estas nano-partículas, por ejemplo, dentro del intervalo de aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, o aproximadamente 50% de diferencia en tamaño. La superficie de las partículas puede ser sustancialmente lisa. El término "sustancialmente esférica" se utiliza en la presente para referirse a partículas que son sustancialmente redondas u ovaladas en conformación, e incluye partículas que no son facetadas y lisas, o que tienen muy pocas facetas, así como partículas que son poliédricas que tienen varias o numerosas facetas. El término "sustancialmente liso" se utiliza en la presente se propone esencialmente a características no de superficie con irregularidades que tienen un tamaño de 100 nm o más grandes.

Las partículas de núcleo pueden ser facetadas o angulares y todavía caen dentro de esta definición, mientras que las facetas no contengan muchas irregularidades de superficie del tipo descrito anterior. Las Figuras 3A y 3B muestran las imágenes del microscopio electrónico de exploración de ejemplos de nanopartículas preparadas de acuerdo a los métodos descritos en • la presente. La Figura 3A muestra las nano-partículas de blanco sin macromoléculas recubiertas o dispersadas con un diámetro de aproximadamente 200 nm. La Figura 3B muestra las nano-partículas con macromoléculas de insulina dispersadas dentro de las nano-partículas con un diámetro promedio de aproximadamente 70 nm. Estas nano-partículas demuestran conformación esférica y distribución de tamaño reducido. Las nano-partículas de fosfato de calcio de la presente invención contienen un agente modificador de superficie que comprende un ácido biliar el cual tiene doble función. Como se muestra en el Ejemplo 1, la encapsulación de macromoléculas biológicamente activas en las nano-partículas de fosfato de calcio se aumenta cuando las partículas se forman en la presencia de un ácido biliar. El ácido biliar también puede aumentar la bio-adhesividad de las nanopartículas y afecta el tamaño de las nano-partículas. Se puede utilizar cualquier ácido biliar. Ejemplos de ácido biliar incluyen, pero no se limitan a, colato, deoxicolato, taurocolato, glicocolato, taurodeoxicolato, ursodeoxicolato, tauroursodeoxicolato, y quenodeoxicolato. En algunas modalidades, las nano-partículas de fosfato de calcio de la presente invención además comprenden un polietilenglicol (PEG) . El PEG puede tener un peso molecular de aproximadamente 500 daltons a aproximadamente 20,000 daltons, por ejemplo, aproximadamente 500, aproximadamente 1000, aproximadamente 5000, aproximadamente 10,000, aproximadamente 15,000, aproximadamente 20,000 daltons. Cualquiera de las macromoléculas biológicamente activas se puede encapsular en nano-partículas de fosfato de calcio de núcleo. Tales macromoléculas biológicamente activas, incluyen, pero no se limitan a, una proteína, un polipéptido, un polisacárido, un ácido nucleico, un lípido, un carbohidrato, y una combinación de los mismos. En algunas modalidades, la macromolécula biológicamente activa es una insulina, una eritropoyetina, un interferón, una hormona de crecimiento, y un factor de estimulación de la colonia de granulocitos (G-CSF) . En algunas modalidades, la macromolécula biológicamente activa es un alérgeno o un material antigénico. Ejemplos de alérgenos son polvo casero de ratones, caspa animal, mohos, polen, ambrosia, látex, venenos véspidos y alérgenos derivados de insectos, y cualquiera de las combinaciones de los mismos.

Las macromoléculas biológicamente activas incluyen cualquiera de los agentes terapéuticos, tal como alfa-1-antitripsina, esteroides, fármacos para tratar osteoporosis, factores de coagulación de la sangre, fármacos anti-cáncer, antibióticos, anticuerpos terapéuticos, lipasa, beta-bloqueadores, anti-asma, oligonucleótidos anti-sentido, enzima DNasa para enfermedades respiratorias y otras, fármacos anti-inflamatorios, antivirales, antihipertensivos, cardioterapéuticos tales como fármacos anti-arritmia, y terapias de genes, diuréticos, químicos anticoagulantes tales como heparina, y combinaciones de los mismos. El agente puede ser un aislado natural o un agente sintético, químico o biológico. Las nano-partículas de fosfato de calcio además pueden comprender un recubrimiento. Por ejemplo, las nanopartículas recubiertas y/o impregnadas con macromoléculas biológicamente activas se recubren adicionalmente con un polímero entérico tal como ftalato de acetato de celulosa, Eudragit y Aquateric. El proceso de recubrimiento entérico ha sido bien descrito en la técnica y las referencias se incorporan en la presente. Beyger y colaboradores, J. Pharm. Sci. 75:573-578 (1986); Maharaj y colaboradores, J. Pharm. Aci. 73:39-42 (1984) . La invención también proporciona nano-partículas de fosfato de calcio que comprenden un núcleo de nano-partículas de fosfato de calcio y una macromolécula biológicamente activa encapsulada en la partícula de núcleo, en donde el tamaño de partícula promedio (diámetro) de la partícula de núcleo es menor que aproximadamente 300 mn, con la condición de que la macromolécula biológicamente activa no sea un ácido nucleico, un polinucleótido, una proteína, o un polipéptido. La invención también proporciona nano-partículas de fosfato de calcio que comprenden un núcleo de nano-partícula de fosfato de calcio y una macromolécula biológicamente activa encapsulada en la partícula de núcleo, en donde el tamaño de partícula promedio (diámetro) de la partícula de núcleo es menor que aproximadamente 300 nm, y en donde la macromolécula biológicamente activa es un anticuerpo. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una nano-partícula de fosfato de calcio descrita en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. Portadores adecuados y sus formulaciones se conocen en la técnica y se describen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000. La composición farmacéutica se puede formular en la forma de solución, cápsula, tableta, polvo, y aerosol; y se puede formular en la forma deseada para suministro oral, suministro mucosal, o suministro a una superficie ocular. La composición puede incluir otros componentes, tales como reguladores, conservadores, surfactantes no iónicos, agentes solubilizadores, agentes estabilizadores, emolientes, lubricantes, y agentes de tonicidad. La composición se puede formular para lograr la liberación controlada para las macromoléculas . B. Métodos para Elaborar Nano-particulas de Fosfato de Calcio La invención también proporciona un método para elaborar una o más partículas de fosfato de calcio, el método que comprende: a) poner en contacto una solución acuosa de una sal de calcio con una solución acuosa de una sal de fosfato en la presencia de un agente modificador de superficie que comprende un ácido biliar; b) mezclar la solución hasta que se obtengan las partículas de fosfato de calcio de un tamaño deseado; y c) recuperar las partículas. Las nano-partículas de fosfato de calcio de la presente invención típicamente se preparan como una suspensión en medio acuoso al poner en contacto una sal de calcio soluble, con una sal de fosfato soluble, preferiblemente, en la presencia de un agente modificador de superficie que comprende un ácido biliar. En algunas modalidades, una solución de agua destilada de fosfato de sodio dibásico que tiene una concentración entre aproximadamente 1 nm y aproximadamente 100 nm, y un agente modificador de superficie tal como deoxicolato que tiene una concentración de 0.01-1% (p/v) se preparan y se mezclan en un recipiente. En algunas modalidades, otro excipiente tal como polietilenglicol que tiene concentración de 1-30% (p/v) también se incluye. El pH de la solución se controla mediante • el sistema regulador de fosfato. Los valores de pH afectan en tamaño de la nano-partículas y debe ser compatible con el requerimiento de estabilidad de la macromolécula que va a ser encapsulada. El valor del pH puede ser entre aproximadamente 4.0 a aproximadamente 9.0, o más preferiblemente, entre aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0. El tamaño de la partícula se afecta mediante las concentraciones de diversos componentes, que incluyen, calcio, fosfato, y macromoléculas. En general, mientras más alta es la concentración del calcio o fosfato, más grande son las nano-partículas. Para generar las nano-partículas, se mezcla una solución acuosa de sal de calcio tal como cloruro de calcio que tiene una concentración entre 1 nm y aproximadamente 100 nm en la solución acuosa de fosfato descrita en lo anterior. Las formas de turbiedad inmediatamente indican la formación de nano-partículas de fosfato de calcio. El mezclado generalmente se continua durante un minuto a una hora, o aun más largo (por ejemplo, 2-48 horas) . El tamaño de las partículas se puede reducir al incrementar la velocidad de mezclado o mediante la sonicación.

Las nano-partículas de fosfato de calcio generadas se pueden recuperar adicionalmente y/o purificar. En algunas modalidades, las nano-partículas de fosfato de calcio formadas que tienen macromolécula encapsulada se recuperan mediante la centrifugación. La solución se centrifuga a 3000-1000 x g durante 5-15 minutos y las nano-partículas recolectadas se secan bajo vacío. En algunas modalidades, las nano-partículas de fosfato de calcio formadas que tienen macromoléculas encapsuladas se recuperan mediante la filtración. La solución se adiciona a un dispositivo de filtración tal como un embudo buchel con vacío. La membrana de filtración tal como Anodisc de 20 nm (Whatman) se puede utilizar para recuperar las nano-partículas, las cuales se secan adicionalmente bajo vacío. Las partículas de la presente invención se forman en la presencia de un agente modificador de superficie que comprende un ácido biliar para incrementar la eficiencia del atrapamiento de materiales biológicamente activos. Ejemplo de ácido biliar que se puede utilizar en la presente invención son, colato, deoxicolato, taurocolato, glicocolato, taurodeoxicolato, ursodeoxicolato, tauroursodeoxicolato y quenodeoxicolato. La concentración del ácido biliar generalmente va a ser de 0.01% a 5%. Generalmente, este procedimiento dará por resultado eficiencia sustancialmente más alta del recubrimiento e impregnación de las partículas .

Por ejemplo, la eficiencia de carga de insulina en la presencia del agente modificador de superficie puede aproximarse al 100%, mientras que solamente el 50-60% en la en la ausencia del agente modificador de superficie bajo las mismas condiciones. La carga de las nano-partículas con unas macromoléculas biológicamente activas se lleva a cabo preferiblemente al mezclar una solución de calcio acuosa con la macromolécula biológicamente activa que se va a incorporar antes de combinar y mezclarla con solución de fosfato en la presencia de un ácido biliar y excipientes, o mezclar una solución de sal de fosfato acuosa con la macromolécula biológicamente activa que se va a incorporar antes de combinar y mezclarla con la solución de calcio en la presencia de un ácido biliar y excipientes. La macromolécula biológicamente activa que se va a encapsular puede tener una concentración de aproximadamente 0.1-20 mg/ml. Las nanopartículas se mantienen por un período adecuado de tiempo, generalmente de un minuto a una hora. Las nano-partículas se pueden separar de la suspensión ya sea mediante la centrifugación o medíante la filtración y luego secarse bajo vacío. Las nano-partículas de la invención se pueden recubrir adicionalmente, por ejemplo, con un recubrimiento entérico. El proceso del recubrimiento entérico y materiales son bien conocidos y practicados en la técnica. Es bien reconocido que la selección de diferentes polímeros entéricos puede dar por resultado cambios de área objetivo del tracto gastrointestinal y comportamiento farmacocinética de las macromoléculas. En algunas modalidades, las nano-partículas de fosfato de calcio encapsuladas con macromoléculas biológicamente activas se suspenden en una solución de polímero entérica. El solvente más común utilizado es acetona, etanol o combinación. Por ejemplo, las nanopartículas se pueden suspender en una concentración de 10-100 mg/ml. La relación del polímero recubridor y las nanopartículas del núcleo puede ser entre 3:1 a 0.5:1 o preferiblemente 2:1 a 1:1. Las nano-partículas se pueden dispersar mediante la sonicación de luz y el aceite de parafina de volumen 1-5 x se pueden adicionar a la mezcla. Después de completar el mezclado por vórtice o sonicación, 2-10 x de volumen de cloroformo se puede adicionar para solidificar el polímero de recubrimiento. Las partículas recubiertas se pueden recuperar mediante un filtro de papel tal como Whatman Chr 3MM y lavarse con cloroformo. El producto recuperado se puede secar adicionalmente bajo vacío y molerse para tamaño homogéneo. En algunas modalidades, las nano-partículas de fosfato de calcio se suspenden en una solución de polímero entérica que tiene una concentración entre 20-100 mg/ml y la relación del polímero de recubrimiento a las nano-partículas en entre 2:1 a 1:1. La suspensión se sónica ligeramente y se adiciona directamente a un solvente que no disuelve el polímero entérico y mezclable con solvente para disolver el polímero entérico. La relación de volumen entre la mezcla y el solvente de dispersión es 1:10 a 500:1. Las partículas se recuperan mediante filtración en un filtro de papel tal como Whatman Chr 3MM. Las partículas se secan bajo vacío y se muelen para tamaño homogéneo. Las partículas de la invención se pueden recubrir adicionalmente o impregnar, o ambas con otros agentes modificadores de superficie. Tales agentes modificadores de superficie adecuados para el uso en la presente invención incluyen sustancias que facilitan la unión o atrapamiento de las macromoléculas biológicamente activas a la partícula, sin desnaturalizar la macromolécula. Ejemplos de agentes modificadores de superficie adecuados se describen en las patentes norteamericanas 5,460,830, 5,46,751, 5,460,831 y 5,219,577. Otros ejemplos de agentes modificadores de superficie adecuados pueden incluir azucares básicos modificados, tal como celobiosa, u oligonucleótidos descritos en la patente norteamericana No. 5,219,577. Los agentes modificadores de superficie adecuados también incluyen carbohidratos, derivados de carbohidratos, y otras macromoléculas con componentes similares al carbohidratos caracterizados por la abundancia de grupos laterales—OH, como es descrito, por ejemplo, en la patente norteamericana No. 5,460,830. El polietilenglicol (PEG) es un agente modificador de superficie particularmente adecuado. El recubrimiento de las partículas de fosfato de calcio se puede preparar al adicionar una solución de extracto de un agente modificador de superficie, tal como celobiosa o PEG (por ejemplo alrededor de 292 mM) a una suspensión de partículas de núcleo de fosfato de calcio en una relación de aproximadamente 1 ml de solución de extracto a aproximadamente 20 ml de suspensión de partícula. La mezcla se puede remolinear y dejarla asentarse durante la noche para formar por lo menos partículas de núcleo parcialmente recubiertas. Generalmente, este procedimiento dará por resultado el recubrimiento sustancialmente completo de las partículas, aunque algunas partículas parcialmente recubiertas o no recubiertas pueden estar presentes. C. Métodos para Utilizar Nano-particulas de Fosfato de Calcio . La invención también proporciona un método para tratar a un sujeto en la necesidad de una macromolécula biológicamente activa, el método que comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una nano-partícula de fosfato de calcio descrita en la presente al sujeto.

La administración de la composición de la invención puede ser mediante cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo: oralmente, intravenosamente, subcutáneamente, por la vía de inhalación, intraarterialmente, intramuscularmente, intracardiacamente, intraventricularmente, parenteral, intratecalmente e intraperitonealmente. La administración puede ser sistémica, por ejemplo intravenosamente o localizada. Las nano-partículas y composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar a un sujeto en la necesidad de los mismos. Un "sujeto" es un mamífero, más preferiblemente un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a animales de granja (tales como vacas) , animales deportivos, mascotas (tales como gatos, perros, caballos) , primates, ratones y ratas. En algunas modalidades, las nano-partículas de fosfato de calcio de la composición' farmacéutica comprenden un recubrimiento entérico. Las partículas entéricamente recubiertas se pueden administrar adecuadamente por medio de la ruta oral. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende una nano-partícula de fosfato de calcio recubierta entérica encapsulada con insulina. La composición farmacéutica se puede administrar a un sujeto oralmente en la forma de solución, cápsula, tableta y polvo para tratar diabetes o hiperglicemia. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende una nano-partícula de fosfato de calcio recubierta entérica encapsulada con inte ferón. La composición farmacéutica se puede administrar un sujeto oralmente en la forma de solución, cápsula tableta y polvo para tratar infecciones virales, cáncer y enfermedades auto-inmunes. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende una nano-partícula de fosfato de calcio recubierta entérica encapsulada con eritropoietina. La composición farmacéutica se puede administrar a un sujeto oralmente en la forma de solución, cápsula, tableta o polvo para tratar anemia o para elevar los niveles de glóbulos rojos. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende una nano-partícula de fosfato de calcio recubierta entérica encapsulada con G-CSF. La composición farmacéutica se puede administrar a un sujeto oralmente en la forma de solución, cápsula, tableta o polvo para tratar neutropenia causada por la quimioterapia u otras razones. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende una nano-partícula de fosfato de calcio recubierta entérica encapsulada con hormona de crecimiento humano. La composición farmacéutica se puede administrar a un sujeto oralmente en la forma de solución, cápsula, tableta o polvo para tratar condiciones que necesitan el suplemento de la hormona de crecimiento tal como enanismo, deficiencia de la hormona de crecimiento adulta, agotamiento, y lesiones severas . En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende una partícula de fosfato de calcio recubierta entérica encapsulada con hormona paratiroide (PTH) . La composición farmacéutica se puede administrar oralmente a un sujeto peroral en la forma de solución, cápsula, tableta y polvo. La composición de PTH oral se puede utilizar para tratar osteoporosis u otras enfermedades que requieren administración de PTH. Las partículas de la presente invención se pueden utilizar para suministrar alérgenos u otro material antigénico. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende una nano-partícula de fosfato de calcio encapsulada con un alérgeno o un antígeno. La composición farmacéutica se puede administrar a un sujeto para inducir una respuesta inmune en el sujeto, proporcionando una liberación controlada de alérgeno al sujeto, o induciendo la desensibilación alérgica en el sujeto. La partícula se puede administrar subcutáneamente a través de inhalación o a través de una superficie mucosal. La partícula se puede administrar como un rocío, un aerosol, una pomada, unas gotas para ojos, un gel, una suspensión, una cápsula, un supositorio, un tampón impregnado, o combinaciones de los mismos. Las partículas de la invención se pueden utilizar para suministrar las macromoléculas biológicamente activas a una superficie mucosal para la protección inmune mucosal, suministro de vacuna mucosal, o suministro de fármaco mucosal. Ejemplos no limitativos de macromoléculas biológicamente activas incluyen uno o más de lo siguiente: material antigénico, factores inmunomej oradores naturales, polipéptidos inmunogénicos de codificación de material de polinucleótido, fármacos terapéuticos, tales como insulina, o cualquier otra composición capaz de tener un efecto terapéutico cuando se administra a una superficie mucosal. Las partículas pueden ser complejas con cualquier excipiente aceptable fisiológico y administrado a través de la superficies mucosales tal como oralmente, intrapulmonarmente, nasalmente, rectalmente, u ocularmente. Las partículas de la invención se pueden utilizar para suministrar las macromoléculas biológicamente activas a una superficie ocular para tratamiento de una enfermedad ocular, por ejemplo, las proteínas o péptidos terapéuticos u otros componentes capaces de tener un efecto terapéutico se pueden encapsular en las partículas y administrar a una superficie ocular. Las enfermedades o condiciones oculares que se pueden tratar incluye, pero no se limitan a, glaucoma, uveítis, retinitis pigmentosa, degeneración macular, retinopatía, enfermedades vasculares retínales, y otras anomalías vasculares, endoctalmitis, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias pero no infecciosas, síndrome de isquemia ocular, degeneraciones retínales periféricas, degeneraciones retínales, desordenes y tumores coroidales, desórdenes vitreos, y neuropatías ópticas inflamatorias . Los siguientes ejemplos se incluyen para propósitos, ilustrativos únicamente y no se proponen limitar el alcance de la invención. Las nano-partículas de fosfato de calcio se pueden preparar en diferentes modalidades como se detalla en la presente aplicación. Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran los resultados típicos de diferentes modalidades . Ejemplos Ej emplo 1 Fabricación de Nano-partículas de Fosfato de Calcio Cargadas con Albúmina de Suero Bovino (BSA) Preparación de partículas de fosfato de calcio con sonicación Se disolvieron doscientos miligramos de polietilenglicol (PEG, MW, 10000, Fluka), 23.2 mg de BSA, 1 ml de Na2HP04 125 mM, 3 ml de solución de BBS (que contiene Na2HP04 1.4 mM, KCl 10 mM, Glucosa 12 mM, NaCl 275 mM, y BES 40 mM, pH 6.964) en 20 ml de solución acuosa. La solución tuvo una OD280 de 0.615. Se adicionaron bajo agitación, 0.3 ml de CaCl2 2.5 M. La precipitación inmediatamente se observó y la agitación se continuó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se sonificó durante 15 minutos y se giró a 8000 rpm durante 15 minutos. Las partículas recolectadas se secaron bajo vacío y se midió la recuperación. La OD280 del sobrenadante fue 0.084. La eficiencia de atrapamiento se estimó mediante la siguiente ecuación: Eficiencia (%) - [1 - D280 de sobrenadante/OD280 de solución de partida] x 100 En este caso la eficiencia de atrapamiento fue de 86%. Se evaluó la liberación del BSA de las partículas de fosfato de calcio. Las partículas de fosfato de calcio cargadas con 20.6 mg de BSA se adicionaron a 2 ml de solución salina reguladora de fosfato (PBS) . Después del mezclado, 22 tubos de microcentrífuga se colocaron para cada alícuota de 0.8 ml. Todas las lícuotas se oscilaron a 37°C. En cada punto' de tiempo mostrado en la Tabla 1 enseguida, tres tubos de alícuotas se tomaron y se giraron a 14000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se removió y La OD280 se midió y los datos se muestran en la Tabla 1. La liberación del BSA de las partículas de fosfato de calcio se completó esencialmente en 4-8 horas en PBS. Tabla 1 Evaluación de la liberación del BSA de las partículas de fosfato de calcio Preparación de nano-partículas de fosfato de calcio cargadas con BSA sin sonicación Se disolvieron doscientos miligramos de polietilenglicol (PEG, MW, 10000, Fluka), 10 mg de BSA, 1 ml de Na2HP04125 mM, 3 ml de solución BBS en 200 ml de solución acuosa. La solución tuvo un OD280 de 0.350. Se adicionaron bajo agitación, 0.3 ml de CaCl22.5 M. La precipitación se observó inmediatamente y . las partículas se removieron al girarlas a 8000 rpm durante 15 minutos. Las partículas recolectadas se secaron bajo vacío.

La OD280 del sobrenadante fue 0.224 y la eficiencia de atrapamiento estimada fue 36%. Preparación de las nano-partículas de fosfato de calcio cargadas de BSA en la presencia deoxicolato Se disolvieron doscientos mg de polietilenglicol (PEG, MW 10000, Fluka) 10 mg de BSA, 1 ml de Na2HP04125 mM, 3 ml de solución BBS y 40 mg deoxicolato en 20 ml de solución acuosa. La OD 280 fue 0.296. Se adicionaron bajo agitación, 0.3 ml de CaCl22.5 M. La precipitación se observó inmediatamente y las partículas se recuperaron al girarlas a 8000 rpm durante 15 minutos. Las partículas recolectadas se secaron bajo vacío. La OD280 del sobrenadante fue 0.084 y la eficiencia del atrapamiento estimado fue 72%. Estos dos ejemplos ilustran que el deoxicolato aumenta sustancialmente la eficiencia de la encapsulación bajo las mismas condiciones. Preparación de nano-partículas de fosfato de calcio cargadas de BSA con filtración Se disolvió un gramo de polietilenglicol (PEG, MW 10000, Fluka) 40 mg de BSA, 12 ml de fosfato de sodio, pH 6.6, y 160 mg deoxicolato de sodio en 20 ml de agua. El deoxicolato se disolvió en 1 ml de etanol antes de la adición. La OD 280 fue 1A49. Se adicionaron bajo vacío, 20 ml de CaCl2 72 mM. Después de 2 minutos, la mezcla se filtró sobre una membrana Anodisc de 20 nm bajo vacío. La membrana se secó bajo vacío y se recuperaron las nano-partículas de calcio. La OD280 del filtrado fue de 0.142 y la eficiencia de encapsulación fue 82%. Ejemplo 2 Fabricación de Nano-partículas de Fosfato de Calcio Recubiertas Entéricas Cargadas de Eritropoyetina (EPO) La muestra de EPO (1 ml en 1.2 mg/ml) se dializó contra 1 L de agua durante la noche durante 4°C y el volumen final fue 1.3 ml . Se mezclaron 400 mg de PEG (MW 10000, Fluka) 1.3 ml de EPO, 6 ml de BBS, pH de 6.964, y 2 ml de Na2HP04 125 mM en la solución de 40 ml total. La OD280 fue 0.070. Se adicionaron bajo agitación, 6 ul de CaCl2 2.5 M. La precipitación se observó inmediatamente y la agitación se continuó durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución se giró a 8000 g durante 10 minutos para recolectar las partículas. La OD280 de la solución se midió para ser 0.033 y todas las partículas se secaron bajo vacío. La eficiencia del atrapamiento se estimó para ser 53%. Las nano-partículas de fosfato de calcio cargadas de EPO se recubrieron con ftalato de acetato de celulosa. Se suspendieron 30 mg de nano-partículas de fosfato de calcio cargadas de EPO en 0.5 ml de 10% de ftalato de celulosa de acetato en acetona: etanol (95:5). Se adicionaron 1.5 ml de aceite de parafina y se mezclaron por vórtice, seguido por la adición de 6 ml de cloroformo. Las partículas se recuperaron con papel de filtración Whatman (Chr 3mm) y se lavaron con cloroformo. Las partículas se secaron bajo vacío y se molieron para tamaño homogéneo. La carga de EPO se midió al tomar 1 mg de partícula recubierta de • nano-partículas de fosfato de calcio y se resuspendieron en 0.5 ml de PVS a temperatura ambiente durante 4 horas. Después del giro a 14000, la concentración de EPO en el sobrenadante se midió con un equipo ELISA comercial (R&D System) . La carga de EPO fue 3600 IU/mg.

Ej emplo 3 Actividad In Vivo de la Eritropoyetina oral (EPO) en Nanopartículas de Fosfato de Calcio Recubiertas Entéricas La actividad del EPO oral en las nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas se evaluó en los ratones Balb/C normales al medir el hematocrito. Animales . Nueve ratones Balb/C hembras de 6-8 semanas de edad se enjaularon en un cuarto ventilado. Se les suministró alimento y agua ad librium. El ciclo de luz se ajustó para cada 12 horas. Tratamiento. Los ratones se dividieron arbitrariamente en tres grupos con tres ratones en cada grupo. El grupo de vehículo se cebó con 0.5 ml de solución de vehículo (acetato de sodio 10 mM, pH 4.0) una vez diariamente durante 5 días. El grupo de inyección subcutánea (SC) se inyectó con 50 IU de EPO en el vehículo una vez diariamente durante 5 días. El grupo oral se cebó con 1000 IU de EPO en 0.5 ml de solución de vehículo una vez diariamente durante 5 días. A todos los ratones se les dio la inyección i.p de 10 mg de dextrano de hierro en el día 2. En el día 10, las muestras de sangre se extrajeron de la punción retrobubar y los tubos capilares hepatizados se utilizaron para recolectar la muestra de sangre. Los tubos capilares se giraron a 3000 rpm durante 20 minutos y el hematocrito (HCT) se calculó mediante la relación de la fracción de glóbulos rojos en la sangre total. El resultado se muestra en la Tabla 2 enseguida. La prueba T de variación de dos extremos y desigual se realizó con la función construida en el programa de hoja de cálculo de Excel. Tabla 2 Valor HCT en Animales Los datos sugieren que el EPO suministrado oral en las nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas fue activo y se incrementó el valor de HCT significantemente. Ejemplo 4 Fabricación de Nano-partículas de Fosfato de Calcio Cargadas con el Factor de Estimulación de la Colonia de Granulocitos (G-CSF) Recubiertas Entéricas El efecto dual del deoxicolato en la encapsulación y en la actividad biológica se ilustra en los siguientes dos ejemplos . Fabricación, de nano-partículas de fosfato de calcio cargadas con G-CSF en la ausencia de deoxicolato 20 ml de G-CSF en la muestra de 1.9 mg/ml se dializaron contra 3 L de agua a 4°C durante la noche y la concentración de G-CSF final fue 1.5 mg/ml. Se mezclaron 200 mg de PEG (MW 10000, Fluka), 2.5 ml de G-CSF, 3 ml de BBS, pH 6.964, 1 ml de Na2HP0 125 mM y se ajustó a 20 ml en agua destilada. La OD280 fue 0.145. Se adicionaron bajo agitación, 300 ul de CaCl2 2.5 M y la precipitación se observó inmediatamente. La agitación se continúo durante 10 minutos y las partículas se homogeneizaron con un homogeneizador polytron durante 10 minutos y se recuperó al girarlos a 8000 g durante 10 minutos. La OD280 del sobrenadante fue 0.033 y la eficiencia de encapsulación fue 77%. Las partículas se secaron bajo vacío. Las nano-partículas de fosfato de calcio cargadas con G-CSF se recubrieron con ftalato de acetato de celulosa de polímero entérico. 17 mg de partículas se suspendieron en 400 ul al 10% de ftalato de acetato de celulosa en 95:5 acetona: etanol después del mezclado por vórtice, 20 ml de aceite de parafina se adicionaron mientras se agita y 7.5 m de cloroformo se adicionaron después de 1 minuto. Las partículas recubiertas se recuperaron mediante la filtración sobre papel de filtro (Chr 3 mm) y se lavaron con cloroformo. Las partículas recubiertas se secaron bajo vacío y se molieron. Fabricación de partículas de fosfato cargadas con G-CSF en presencia de deoxicolato. Se disolvieron 200 mg de PEG (MW 10000, Fluka), 2.5 ml de GCSF, 65.9 mg de deoxicolato, 3 ml de solución de BBS, pH 6.964, y 1 ml de Na2HP04 125 mM y se ajustaron a 20 ml . El deoxicolato se disolvió en 1 ml de etanol antes de la adición. La OD280 fue 0.106. Se adicionaron bajo agitación, 300 ul de CaCl2 2.5 M y la precipitación se observó inmediatamente. La agitación se continúo durante 10 minutos, las partículas se homogeneizaron con un homogeneizador polytron durante 5 minutos y se recuperaron mediante el giro a 8000 g durante 10 minutos. La OD280 del sobrenadante fue 0.008. La eficiencia de la encapsulación fue 92%. Las partículas se secaron bajo vacío. Las nano-partículas de fosfato de calcio cargadas con G-CSF se retuvieron con ftalato de acetato de celulosa de polímero entérico. 58 mg de partículas se suspendieron en 1.2 ml al 5% de ftalato de acetato de celulosa de 95:5 acetona: etanol . Después del mezclado con vórtice, 20 ml de aceite de parafina se adicionaron mientras se agita y 7.5 ml de cloroformo se adicionaron después de un minuto. Las partículas recubiertas se recuperaron mediante la filtración sobre papel filtro Whatman (Chr 3 mm) y se lavaron con cloroformo. Las partículas recubiertas se secaron bajo vacío y se molieron. Los ejemplos demuestran que la eficiencia del atrapamiento puede ser significantemente mejorado si las partículas se preparan en la presencia de deoxicolato. Ej emplo 5 Actividad In Vivo del G-CSF Oral en Nano-partículas de Fosfato de Calcio Recubiertas Entéricas La actividad del G-CSF oral se determinó al contar los números de glóbulos blancos después del tratamiento en ratones Balb/C normales. Animales . Dieciocho ratones Balb/c de 6-8 semanas de edad se enjaularon en un cuarto ventilado. Se les suministró alimento y agua ad librium. El ciclo de luz se ajustó para cada 12 horas. Tratamiento. Los ratones se dividieron arbitrariamente en cuatro grupos . Los grupos de vehículo y SCG tuvieron 4 ratones y los grupos CAP y CAPD tuvieron cinco ratones, respectivamente. El grupo de vehículo se trató con 0.5 ml de NaAc 10 mM, pH 4.0. El SCG se trató con 0.1 ml de inyección subcutánea de 100 ug/kfg de g-CSF en vehículo. El grupo CAP con G-CSF oral en partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas en 1 ml de vehículo a 2 mg/kkg de G-CSF. El CAPD fue G-CSF oral en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas preparadas en la presencia de deoxicolato. La dosificación fue la misma como el grupo CAP. Los ratones se trataron diariamente durante 4 días y las muestras de sangre se extrajeron en el día 5 para determinar el conteo de glóbulos blancos total. Los glóbulos rojos se lizaron y el conteo de los glóbulos blanco total se determinaron utilizando un microscopio. Los datos se analizaron utilizando el programa de hoja de cálculo de Excel con la función incorporada de la prueba T. Tabla 3 Medición de los conteos de glóbulos blancos total .

Los datos sugieren que el G-CSF suministrado oral o inyectado logró conteos de glóbulos blancos significantemente más altos. Además, las nano-partículas de fosfato de calcio preparadas en la presencia de deoxicolato suministraron más actividad G-CFS y se logró el conteo de glóbulos blancos más alto que aquel sin deoxicolato. Ej emplo 6 Bio-Equivalencia del G-CSF Oral en Nano-partículas de Fosfato de Calcio Recubiertas Entéricas Animales . Diez ratas Sprague-Dawley de 8-10 semanas de edad se enjaularon en un cuarto ventilado. Se les suministró alimento y agua ad librium. El ciclo de luz se ajustó para cada 12 horas. Tratamiento . Las ratas se dividieron arbitrariamente en tres grupos, con dos ratas en el grupo de Vehículo (V) y cuatro ratas en los grupos de tratamiento de G-CSF oral (D) de inyección (G) . El programa de tratamiento se lista en la Tabla 4 enseguida. El V fue el vehículo de NaAc A0 mM, pH 4.0. El G fue el grupo de inyección subcutánea. El D fue el G-CSF oral en las partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas preparadas en la presencia de deoxicolato. Tabla 4 Programa de tratamiento Las ratas se trataron y las muestras de sangre se extrajeron como puntos de tiempo predeterminados en 9, 4, 8, 12 y 26 horas. Los glóbulos rojos se lizaron y el conteo de glóbulos blancos total se determinó utilizando un microscopio. La Figura 1 muestra los conteos de glóbulos blancos en cada uno de los puntos de tiempo. El área bajo la curva para el G-CSF inyectado y suministrado oral se estimó y la bio-equivalencia del G-CSF suministrado oral se estimó para ser 8.5% de la ruta subcutánea. Ejemplos 7 Fabricación de Nano-partículas de Fosfato de Calcio Cargadas con alfa Interferón (ÍFN) Recubiertas Entéricas Se mezclaron 400 mg de PEG (MW 10000, Fluka), 1.3 ml de IFN, 6 ml de solución de BBS, pH 6.964, y 2 ml de Na2HP0 125 mM en 40 ml de solución acuosa total. La OD280 fue 0.082. Se adicionaron bajo agitación, 600 ul de CaCl2 2.5 M y la precipitación se observó inmediatamente. La agitación se continuó durante 10 minutos y las partículas se sonicaron durante 15 minutos y se giraron a 8000 g durante 10 minutos. La OD280 del sobrenadante fue 0.033. La eficiencia de encapsulación fue 60%. Después del secado bajo vacío, se recuperó 32.2 mg de partículas. Las nano-partículas de fosfato de calcio cargadas con IFN se recubrieron con ftalato de acetato de celulosa de polímero entérico. 32 mg de partículas se suspendieron en 640 ul al 5% de ftalato de acetato de celulosa y 95:5 acetona: etanol. Después del mezclado por vórtice, 20 ml de aceite de parafina se adicionaron mientras se agita y 7.5 ml de cloroformo se adicionaron después de un minuto. Las partículas recubiertas se removieron mediante filtración sobre papel de filtro Whatman (Chr 3mm) y se lavaron con cloroformo. Las partículas recubiertas se secaron bajo vacío y se molieron.

Ejemplo 8 Bio-Disponibilidad del IFN Oral en Nano-partículas de Fosfato de Calcio Recubiertas Entéricas Animales . Dos ratas Sprague-Dawley de 8-10 semanas de edad se enjaularon en un cuarto ventilado. Se les suministró alimento y agua ad librium. El ciclo de luz se ajustó para cada 12 horas. Tratamiento . Una rata se trató con 1.6 millones de IU de IFN por la vía de inyección subcutánea en 100 ul de Nac 10 Mm, pH 4.0. La otra rata se cebó con 16 millones de IU de IFN en partículas de fosfato de calcio en 1 ml de solución de vehículo. Las muestras de sangre se extrajeron como puntos de tiempo predeterminados en -0.5, 05, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24 horas. El suero se guardó para el análisis ELISA. La Figura 2 muestra los niveles -de IFN de suero en cada uno de los puntos de tiempo. El área bajo la curva para el IFN inyectado y suministrado oral se estimó y la biodisponibilidad del IFN suministrado oral se estimó para ser el 10.2% de la ruta subcutánea. Ej emplo 9 Fabricación de Nano-partículas de Fosfato de Calcio Cargadas de Insulina Recubiertas Entéricas La Humulina (Eli Lilly) se adquirió en una farmacia. 180 ml de la muestra de insulina (642 mg) se intercambiaron en agua destilada con la columna Sephadex G-25 (volumen de lecho de 1.7 L, 4.6 cm x 100 cm) . La OD280 se monitoreó y el primer pico se recolectó. La muestra de 300 ml total se recuperó y La OD280 fue de 2.022. Se mezclaron 5 g de PEG (MW 10000, Fluka), 600 mg de insulina, 1.6 g de deoxicolato, 40 ml de solución de BBS, pH 6.964, 19.2 ml de Na2HP04 125 mM y se ajustaron a 400 ml con agua destilada. El deoxicolato se disolvió en 10 ml de etanol antes de la adición. La OD280 fue 1.868. Se mezclaron bajo agitación, 400 ml de CaCl 36 mM y las partículas formadas se filtraron sobre una membrana Anodisc de 20 nm inmediatamente. La OD280 del filtrado fue 0.022 y la eficiencia de encapsulación fue 98.2%. Las partículas se secaron bajo vacío y la cantidad total de las partículas recuperadas fue 1.8 g. Las partículas del blanco se prepararon con el mismo procedimiento excepto la omisión del componente de proteína. Tanto las nano-partículas de fosfato de calcio cargadas con insulina como las nano-partículas de fosfato de calcio el blanco se sometieron a la examinación de microscopía de exploración de electrón (SEM) por el Material Testing Labs. Las imágenes de la SEM se muestran en la Figura 3A y 3B. Las nano-partículas de fosfato de calcio del blanco exhibieron una morfología esférica, monodispersada y hueca con diámetro promedio de 200 ml (Figura 3A) . Un contraste, las nano-partículas de fosfato de calcio cargadas con insulina demostraron morfología esférica y monodispersada con diámetro promedio de aproximadamente 70 nm (Figura 3B) . Para el recubrimiento entérico, se suspendieron 0.5 g de nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas con insulina en 5 ml de acetona: etanol (95:5) que contienen 0.5 g de ftalato de acetato de celulosa. Después del mezclado se adicionaron 15 ml de aceite de parafina y se mezclaron, seguidos por la adición de 50 ml de cloroformo. Las partículas se recolectaron mediante la filtración sobre papel de filtración Whatman (Chr 3mm) y se lavaron con cloroformo. Las partículas se secaron bajo vacío y se molieron para tamaño homogéneo. El contenido de insulina fue medido al tomar la liberación de insulina de 1 mg de partículas en 1 ml de PBS la temperatura ambiente durante 3 horas. Se utilizó el análisis de proteína Lowry con insulina como estándar para determinar la concentración de insulina en el medio de liberación. Ejemplo 10 Bio-Equivalencia de Insulina oral en Nano-partículas de Fosfato de Calcio Recubiertas Entéricas Animal Modelo . Treinta y cinco ratas Sprague-Dawley de 8-10 semanas de edad se enjaularon en un cuarto ventilado. Se les suministró alimento y agua ad librium. El ciclo de luz se ajustó para cada 12 horas.

Las ratas se inyectaron con 60 mg/kg de estreptozocina ip en solución reguladora de citrato 20 mM, pH , 4.5. 1 ml de glucosa al 5% se les dio ip a 8 horas después de la estreptozocina. Después de dos semanas, se midieron los registros de los niveles de glucosa en la sangre. El registro de la glucosa en la sangre fue >300 mg/Dl en 24 ratas, las cuales se utilizaron para la prueba subsecuente. Tratamiento. Dieciséis ratas se dividieron arbitrariamente en tres grupos. Tanto los grupos de solución de insulina (OI-50, "Control") como de inyección de insulina (SCI-5, "Inyección") tuvieron 4 ratas diabéticas, respectivamente. El grupo de tratamiento (PO-50, "Oral") tuvo 8 ratas. Al grupo de Control se le dio 50 IU de insulina/kg en 0.5 ml de solución de vehículo oralmente. El grupo de inyección recibió inyección SC con 5 IU de insulina/kg en 0.5 ml de vehículo. Al grupo oral se le dio 50 IU de insulina/kg formulada en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas oralmente en 0.5 ml de solución de vehículo. La solución de vehículo fue 2% carboximetil-celulosa en 10 mM de ácido Acético, pH 4.0. Tabla 5 Programa e tratamiento de insulina Después del ayuno durante la noche las ratas se trataron y las muestras de sangre se extrajeron por la vía de la vena de la cola en los puntos de tiempo de 0, 1, 3, 6, 12 y 24 horas. La glucosa en la sangre se midió con un glucómetro (SureStep) . La Figura 4 muestra el cambio de glucosa en la sangre por ciento en cada punto de tiempo después del tratamiento con insulina oral o subcutánea en ratas diabéticas. La insulina subcutánea bajo los niveles de glucosa en la sangre rápidamente y regresó a lo normal dentro de 12 horas. La insulina oral suministrada con partículas de fosfato de calcio mostraron más efecto de reducción de glucosa en la sangre gradual y prolongado. La bio- equivalencia de insulina oral fue 12% comparado con la insulina subcutánea. Ejemplo 11 Reducción de Glucosa en la Sangre en Voluntarios Sanos Mediante la Insulina Oral y Nano-partículas de Fosfato de Calcio Recubiertas Entéricas Para estimar la actividad de insulina oral en las nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas, se probaron 2 voluntarios humanos sanos. Se realizó la prueba de tolerancia de glucosa estándar. Cada voluntario ayunó por más de 12 horas ingirió 68 g de glucosa. La glucosa en la sangre se midió con un glucómetro SureStep a -30, 0, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 minutos con respecto a la ingestión de glucosa. Se realizaron dos ciclos de medición para cada voluntario. El primer ciclo fue la prueba de tolerancia de glucosa estándar para estabilizar la línea base. Cada voluntario tomó 200U de insulina oral en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas a -30 minutos durante el segundo ciclo de medición. El cambio de glucosa en la sangre en el primer voluntario se muestra en la Figura 5A. La insulina oral suministrada por la vía de nano-partículas de fosfato de calcio recubiertos entéricas redujo tanto el pico como a través de los niveles de glucosa en la sangre. El cambio de glucosa en la sangre por ciento en el segundo voluntario se muestra en la Figura 5A. La insulina oral derivada por la vía de nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas redujo el pico de nivel de glucosa en la sangre y reduce la curva de glucosa en la sangre por todo el período de medición. Este estudio muestra que la insulina oral en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas es activas en sujetos humanos y pueden reducir la glucosa en la sangre. Ningunas reacciones adversas se registraron mediante la medición. Ejemplo 12 Control de Glucosa en la Sangre de Ayuno de Pacientes Diabéticos Mediante la Insulina Oral en Nano-partículas de Fosfato de Calcio Recubiertas Entéricas La viabilidad de la insulina oral en las nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas se evaluó adicionalmente en pacientes diabéticos. Diecinueve pacientes diabéticos de tipo II quienes estuvieron regularmente en tratamiento de insulina para controlar sus niveles de glucosa en la sangre fueron voluntarios para el estudio. Tres ciclos de evaluación se realizaron para cada paciente. El en primer ciclo, cada paciente ayunó por más de 12 horas. Los niveles de glucosa en la sangre se midieron la siguiente mañana por cada 30 minutos. Se utilizó un glucómetro SureStep para determinar el nivel de glucosa en la sangre. Ningún tratamiento se realizó en este ciclo para estabilizar la línea base. En el segundo ciclo, cada paciente ayunó por más de 12 horas. Los niveles de glucosa en la sangre se midieron la siguiente mañana por cada 30 minutos. Se utilizó un glucómetro SureStep para terminar el nivel de glucosa en la sangre. A cada paciente se le dio una inyección subcutánea de 10IU Humulina en el tiempo 0 en este ciclo. En el tercer ciclo, cada paciente ayunó por más de 12 horas. Los niveles de glucosa se midieron la siguiente mañana por cada 30 minutos. Un glucómetro SureStep se utilizó para determinar el nivel de glucosa en la sangre. Se les dio ya sea 100IU o 200IU de insulina oral en nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas para cada paciente en el tiempo 0 en este ciclo. La secuencia de medición para cada paciente fue arbitraria y hubo un período de lavado de 48 horas después de la medición de insulina oral antes del siguiente ciclo. Después del estudio, hay 17 datos de pacientes usables para la medición de la línea base, 19 datos de pacientes para inyección de insulina, 6 datos de pacientes para tratamiento de 100IU de insulina oral y 11 datos de pacientes para tratamiento de 200IU de insulina oral. El cambio de glucosa en la sangre por ciento de cada ciclo de medición se muestra en la Figura 6. Sin tratamiento, el nivel de glucosa en la sangre se elevó y se mantuvo relativamente estable durante el período de observación. La inyección de insulina produjo reducción drástica de glucosa en al sangre. De hecho, 7 pacientes desarrollaron hipoglucemia y sus niveles de glucosa en la sangre disminuyeron debajo de 50 mg/dL y tuvieron que ser tratados con glucosa oral. Encontraste, el paciente quien tomó 100IU o 200IU de insulina oral mostró reducción estadísticamente significante todavía gradual del nivel de glucosa en la sangre- comparado con la línea base y no se observó hipoglucemia. Además, los pacientes tratados con 200IU de insulina oral mostraron reducción mayor de glucosa en la sangre. Este estudio muestra que la insulina oral en nanopartículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas y puede efectivamente y dependientemente de dosis controlar el nivel de glucosa en la sangre en pacientes diabéticos. Ejemplo 13 Fabricación de Nano-partículas de Fosfato de calcio Cargadas con Hormona de Crecimiento Humana (hGH) Recubiertas Entéricas La muestra de hGH se intercambió en agua destilada con la columna de desalificación Sephadex G25. La cantidad de hGH se calculó con la medición OD280 y el coeficiente óptico de 0.68. Se disolvieron 200 mg de PEG (MW 10000, Fluka), 84 mg de hGH. El Fosfato 12 mM, y 320 mg de deoxicolato en 40 ml de solución. La OD280 se determinó como 1.307. Bajo agitación, se mezcló 40 ml de 72 mM de CaCl2 y la precipitación se filtró sobre una membrana- Anodis de 20 nm (Whatman) inmediatamente. La OD280 del filtrado fue 0.039. Las partículas se secaron bajo vacío y la eficiencia del atrapamiento fue 95% basado en la medición de OD280 antes y después de la formación de la partícula.

Para el recubrimiento entérico, se suspendieron 300 mg de nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas de hGH en 4 ml de ftalato de acetato de celulosa al 10% en 95:5 acetona: etanol . Se adicionaron 6 ml de aceite de parafina u 5 se mezclaron, seguidos por 18 ml de cloroformo. Las partículas se filtraron sobre papel Whatman ( Chr 3mm) y se lavaron con cloroformo. Las partículas se secaron bajo vacío y se molieron para tamaño homogéneo. El contenido de hGH se midió al adicionar 1 mg de partículas en 1 mí de PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas. El análisis de proteína Lowry con hGH como estándar se utilizó para determinar la concentración de hGH en el medio de liberación. Ejemplo 14 15 Promoción del Peso del Cuerpo Ganado por la Hormona de Crecimiento Humano Oral en Nano-partículas de fosfato de Calcio Recubiertas Entéricas La actividad de la hGH oral en las nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas se probó en ratas 20. hipofisectomizadas, un análisis estándar para la actividad de la hormona de crecimiento. Animal Modelo. Veinte ratas Sprague-Dawley de 6 semanas de edad se sometieron a cirugía de hipofisectomia (Taconic Farms) se enjaularon en un cuarto ventilado. Se les suministró agua y alimento ad librium. El ciclo de luz se ajustó para cada 12 horas. El peso del cuerpo de cada rata se monitoreó diariamente. Tratamiento . Se dividieron veinte ratas arbitrariamente en 3 grupos . Fueron cuatro ratas de los grupos de vehículo de inyección, respectivamente. El grupo de tratamiento tuvo 12 ratas . El grupo de vehículo se trató con aceite de parafina. Las ratas se trataron cada mañana y los pesos del cuerpo se midieron cada tarde. Tabla 5 Programa de tratamiento de la hGH La Figura 7 muestra el peso de cuerpo neto ganado después del tratamiento con la hGH oral o subcutánea en ratas hipofisectomizadas. La hGH subcutánea dio por resultado peso del cuerpo sustancial ganado mientras el tratamiento de vehículo produce ligera reducción del peso de cuerpo. La hGH oral suministrada con nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas produjo peso de cuerpo significante, que indica que la hGH oral en las nano-partículas de fosfato de calcio recubiertas entéricas es biológicamente activa. Ejemplo 15 Fabricación de Nano-partículas de Fosfato de Calcio Cargadas con Hormona Paratiroide (PTH) Se intercambio la hormona paratiroide 1-34 (PTH) en agua destilada con la columna de desalificación Sephadex G25.

Se mezclaron 400 mg de PEG (MW 10000, Fluka), 6 ml de solución de BBS de pH 6.964 y 2 ml de Na2HP04 125 mM en 40 ml de solución. La OD280 se determinó como 0.082. Se adicionaron bajo agitación, 600 ul de 2.5 M de CaCl2 la precipitación se observó inmediatamente y las partículas se giraron a 8000 g durante 10 minutos. La OD280 del sobrenadante fue 0.033. Las partículas se secaron bajo vacío. La eficiencia del atrapamiento se estimó para ser 59% basado en la medición de la OD280 antes y después de la formación de la partícula. Ejemplo 16 Fabricación del Polisacárido y Extracto de Acido Nucleico de Nano-partículas de Fosfato de Calcio Recargadas de BCG El extracto de polisacárido y ácido nucleico de Bacillus Calmette-Guerin (BCG-PSN) tiene actividad de modulación inmune. EL BCG-PSN contiene tanto polisacárido como ácido nucleico que se utiliza para demostrar la utilidad de nano-partículas de fosfato de calcio en esta clase de compuestos . • El BCG-PSN se obtuvo en forma de polvo de Chengdu Rongsheng Pharmaceutical Ltd. (Chengdu, China) . Se mezclaron 1 mg de BCG-PSN, 50 mg de PEG (Fluka, MW 10000) 0.25 ml de BBS, pH 9.964, y 0.75 ml y 0.75 ml de Na2HP04 125 mM en 20 ml de solución. La OD280 fue 0.22 y el contenido de polisacáridos se midió mediante el método Anthrone. Se adicionaron bajo agitación, 75 ul de 5 M de CaCl2 y la agitación se continuó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las partículas se giraron a 8000 g durante 10 minutos. El OD260 del sobrenadante fue 0.0 y la concentración de polisacárido fue 22.1 ug/ml. La eficiencia de encapsulación fue 100% para el componente de ácido nucleico y aproximadamente 63% para el componente de polisacárido. Las partículas se secaron bajo vacío. Los ejemplos anteriores se incluyen para propósitos ilustrativos únicamente y no se proponen limitar el alcance de la invención. Muchas variaciones a aquellas descritas en lo anterior son posibles. Puesto que las modificaciones y variaciones para los ejemplos descritos en lo anterior serán evidentes para aquellos de habilidad en esta técnica, se propone que esta invención sea limitada únicamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Referencias Patentes norteamericanas Nos. 3,925,545; 4016252; 4350686; 4500512; 4552756; 5178882; 5219577; 5306508; 5334394; 5364838; 5460830; 5460831; 5462750; 546*2751; 5464634; 5506203; 5549973; 5580859; 5593875; 5595762; 5620896; 5629021; 5641515; 5648097; 5695617; 5747001; 5785975; 5827822; 5866553; 5891420; 5898028; 5902789. Pat.

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Una partícula, caracterizada porque comprende: a) un núcleo de nano-partícula de fosfato de calcio; b) una macromolécula biológicamente activa encapsulada en la partícula de núcleo; y c) un agente modificador de superficie que comprende un ácido biliar encapsulado en la partícula de núcleo.
2. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el diámetro de la partícula de núcleo es menor que aproximadamente 300 nm.
3. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido biliar se selecciona del grupo que consiste de colato, deoxicolato, taurocolato, glicocolato, taurodeoxicolato, ursodeoxicolato, tauroursodeoxicolato y quenodeoxicolato.
4. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la partícula además comprende un recubrimiento entérico.
5. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la macromolécula biológica activa se selecciona del grupo que consiste de una proteína, un polipéptido, un polisacárido, un ácido nucleico, un polinucleótido, un lípido y un carbohidrato.
6. La partícula de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteína o el polipéptido se seleccionan del grupo que consiste de una insulina, una eritropoyetina, un interferón, una hormona de crecimiento, y un factor de estimulación de la colonia de granulocitos (G-CSF) .
7. La partícula de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la macromolécula biológicamente activa se selecciona del grupo que consiste de una insulina, una eritropoyetina, un interferón, una hormona de crecimiento, y un G-CSF.
8. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la macromolécula biológicamente activa es un alérgeno seleccionado del grupo que consiste de polvo casero de ratones, caspa animal, moho, polen, ambrosia, látex, venenos véspidos y alérgenos derivados de insectos, y cualquiera de las combinaciones de los mismos.
9. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la partícula se adapta en la forma de un aerosol.
10. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la partícula se adapta para suministrar la macromolécula biológicamente activa a una superficie mucosal.
11. La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la partícula se adapta para suministrar la macromolécula biológicamente activa a una superficie ocular de un sujeto en necesidad de la misma para el tratamiento de una enfermedad ocular.
12. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la partícula de conformidad con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
13. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la partícula de conformidad con la reivindicación 4 y un portador farmacéuticamente aceptable.
14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la partícula de conformidad con la reivindicación 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.
15.- Un método para elaborar una o más partículas de fosfato de calcio, el método caracterizado porque comprende : a) poner en contacto una solución acuosa de una sal de calcio con una solución acuosa de una sal de fosfato en la presencia de un agente modificador de superficie que comprende un ácido biliar; b) mezclar la solución hasta que se obtienen las partículas de fosfato de calcio de un tamaño deseado; y c) recuperar las partículas.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la concentración de la sal de calcio está entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 200 mM.
17. El método de conformidad con, la reivindicación 15, caracterizado porque la concentración de fosfato está entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 200 mM.
18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque las partículas tienen un diámetro menor que 300 nm.
19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende adicionar una macromolécula biológicamente activa en la solución acuosa en la sal de fosfato o la solución acuosa de la sal de calcio antes de poner en contacto la solución acuosa de la sal de calcio con la solución acuosa de la sal de fosfato en la presencia de un agente modificador de superficie que comprende un ácido biliar, mediante lo cual la partícula de fosfato de calcio se co-cristaliza con la macromolécula.
20. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el ácido biliar se selecciona del grupo que consiste de colato, deoxicolato, taurocolato, glicocolato, taurodeoxicolato, ursodeoxicolato, tauroursodeoxicolato y quenodeoxicolato.
21. Un método para tratar a un sujeto en necesidad de una macromolécula biológicamente activa, el método caracterizado porque comprende administrar una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 al sujeto.