MXPA06005537A - Uso de agentes biologicos parasitarios para la prevencion y control de enfermedades. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con un metodo para detectar una preparacion de parasitos helminticos que afecta la funcion de celulas T reguladoras y con un metodo para el tratamiento contra una enfermedad al alterar la actividad de celulas T reguladoras mediante la administracion de una preparacion parasitaria.

Description

parasitaria reduce la severidad de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) (Sewell et al., 2003, International Immunology, 15: 59-69). La encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) es un modelo experimental en animales para esclerosis múltiple (MS) caracterizado por una desmielinización inflamatoria crónica del sistema nervioso central (CNS) . Sewell informó que en ratones con inmunización de huevos de Schistosoma mansoní, la severidad de EAE se reduce según se cuantifica mediante las puntuaciones clínicas menores y los infiltrados celulares del CNS . Hay una reducción de los niveles de IFN-gama y un aumento de IL-4, factor beta de crecimiento transformante e IL-10 en sangre periférica y aumenta la frecuencia de células T específicas para el neuroantígeno productor de IL-4 en el cerebro. La enfermedad de Crohn es resultado de la inflamación de la mucosa tipo I (Th) debido a las células T colaboradoras desrreguladas . La enfermedad de Crohn es rara en países tropicales pero prevalece en países con climas templados, donde su incidencia se elevó luego de 1940. A diferencia, la exposición a parásitos helmínticos es común en países tropicales, pero rara en los países desarrollados. Elliot et al., (2003, Am. J. Physiol . Gastrointest . Liver. Physiol . , 284: G385-G391) demostraron que los helmintos pueden atenuar la inflamación excesiva tipo Thl . Para probar esa hipótesis, expusieron ratones a huevos del helminto Schistosoma mansoni y luego se desafiaron rectalmente con ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) para inducir colitis. La exposición a huevos de Schistosoma atenuó la colitis por TNBS y protegió a los ratones de inflamación letal . La exposición de huevos a Schistosoma disminuyó la producción de IFN-gamma y aumentó la producción de IL-4 a partir del bazo estimulado con anti-CD3 y células del nodulo linfático mesentérico de ratones tratados con TNBS . La exposición a huevos de Schistosoma disminuyó el IFN-gamma colónico pero aumentó la expresión para ARNm de UL-10 en ratones tratados con TNBS. Se requirió el transductor de señal intacto del activador de la transcripción 6 para la atenuación de colitis. Los autores demostraron que la exposición a helmintos puede disminuir la inflamación colónica en murinos . de Jong et al. (2002, J. Immunol . , 1368 : 1704-1709) demostraron que el extracto proteico derivado del helminto Schistosoma mansoni induce el desarrollo de DC2 que promovió el desarrollo de células Th2 por medio de la expresión potencializada del ligando 0X40. Asimismo, la toxina de la bacteria extracelular Vibrio cholerae también induce el desarrollo de DC2, sin embargo, por medio de un ligando OX40 independiente, que aún se desconoce su mecanismo. A diferencia, la toxina de bacteria extracelular Bordetella pertussis indujo el desarrollo de DC1 con una protección potencializada de IL-12 que promueve el desarrollo de células Thl. Poli(I:C) (ARNds, mímico de virus) indujo el desarrollo extremadamente potente de DCl inductor de Thl sin una producción potencializada de IL-12. La Solicitud de Patente de EE.UU. 2003/0103938 Al describe una composición farmacéutica que comprende IL-4 y SDF-?a, o IL-2 y SDF-? para prevenir o tratar enfermedades relacionadas con células TH1 o células Th2 en humanos o animales mediante la regulación de la proporción TH1/Th2. Doetze et al. (2000, International Immunology, 12: 623- 630) investigaron la hiposensibilidad al antigeno Ov (OvAg) a células T proliferativas en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de personas con infecciones crónicas por helmintos, es decir oncocercosis generalizada (GEO) , en comparación a PBMC de personas putativamente inmunes (PI) . En este estudio, se investigaron los mecanismos que intervienen en esta hiposensibilidad de células GEO: la baja respuesta proliferativa en PBMC de personas GEO fue asociada con la falta de producción de IL-4 y una producción significativamente menor de UL-5 en comparación a los de personas PI, argumentando contra un desplazamiento general hacia la respuesta T(h)2 como la caüsa de la hiposensibilidad. A diferencia, la IL-10 del factor de crecimiento transformante beta (TGF) -beta, dos citocinas asociadas con respecto a T (h) 3 , parecen intervenir en la hiposensibilidad: PBMC de personas con GEO produjeron una cantidad significativamente mayor de IL-10 y la hiposensibilidad de células T proliferativas en este grupo pudo revertirse mediante la adición de anticuerpos anti-IL-10 y anti TGF-beta. Los autores demostraron que la hiposensibilidad es específica para OvAg y no se observó al momento de estimularse con antígenos de nematodos relacionados, argumentando para una lentificación especifica para Ov y regulada por células T. Las células T específicas para Ov pudieron clonarse de GEO PBMC que tienen un perfil de citocina único (sin IL-2 pero con una alta producción de IL-10 y/o TGF-beta) , similar a los subconjuntos de células T conocidos por suprimir la inflamación corriente (T (h) 3 y T(r)l), indicando que este tipo celular, que no se ha encontrado hasta ahora en enfermedades infecciosas, puede estar involucrado en el mantenimiento de la hiposensibilidad específica para Ov. Las células Th3 son un subconjunto de células T reguladoras y se generaron originalmente y se identificaron originalmente en ratones con tolerancia adquirida oralmente a MBP y con inducción suprimida a la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) mediante un mecanismo dependiente de TGF-b (Chen et al., 1994, Science, 265: 1237-1240) . Los estudios recientes sugieren que las células T reguladoras pueden reducirse contra antígenos bacterianos, virales y parasitarios in vivo y pueden evitar enfermedades autoinmunitarias , inmunopatología inducida por infección o prolongar la persistencia del patógeno mediante la supresión de respuestas protectoras Thl (ver por ejemplo, cGuirk y Mills, 2002 Trends in Immunology, 23: 450-455; Tung et al., 2001, Immunological Revie s, 182: 135-148; y Maloy y Powrie, 2001 Nature Immunology, 2: 816-822). Generalmente se describen las células T reguladoras como linfocitos que suprimen las respuestas inmunitarias , es decir, las respuestas inmunitarias mediadas por anticuerpos y/o las mediadas por células (por ejemplo, para repasos ver McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol 2002; 23(9): 450-5; Field, A.C., L. Caccavelli, M. F. Bloch y B. Bellon. 2003. Regulatory CD5+ T cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoi munity. Journal of Immunology, 170: 2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. Antigen-induced regulatory T cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3(3): 189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. CD4(+) regulatory T cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dic; 14(6): 771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep; 23(9): 450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T-cell endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Ago; 182: 135-148; Read S, Powrie F. CD4(+) regulatory T cells. Curr Opin Immunol . 2001 Dic; 13 (6): 644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory T cells and allergic asthma. Microbes Infect . 2001 Sep; 3(11): 899-904) . Estas células T reguladoras (células Tr) expresan para una proteína transmembranal (llamada CD25) que es la cadena alfa del receptor para interleucina-2 (IL-2) . Al igual que otras células T, también expresan para el receptor celular de células T aß (alfa-beta) para el antígeno (TCR) y solo puede activarse si se une a la molécula MHC clase II del péptido, o en el caso de células reguladoras CD8 , MHC Clase I, para la cual es específica. Sin embargo, si se activa, comienzan a secretar grandes cantidades de interleucina 10 (IL-10) y normalmente también cierta cantidad de factor beta de crecimiento transformante (TGF-ß) . Ambas linfocinas son poderosas inmunosupresoras que inhiben la ayuda de T l para la inflamación e inmunidad mediada por células, la ayuda de Th2 para la producción de anticuerpos y posiblemente, la acción de linfocitos T citolíticos CD8+ (CTL) . Algunas otras células T reguladoras se difieren de células Tr. Por ejemplo, las células Trl se asemejan a células Tr en varias formas, aunque no expresan para grandes cantidades de CD25 sobre su superficie. Requieren de IL-10 para su formación y una vez maduras, secretan grandes cantidades de la misma. La linfocina principal para células Th3 es TGF-ß. Aún se desconoce si las células T reguladoras tienen una función para la prevención o tratamiento contra enfermedades relacionadas de Thl ó Th2 utilizando la preparación de parásitos helmínticos .

Breve Descripción de la Invención La presente invención está basada en el descubrimiento que toda preparación parasitaria puede alterar la actividad de células T reguladoras en el tratamiento contra enfermedades relacionadas con Thl ó Th2. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para detectar una preparación de parásitos helmínticos que alteran la actividad de células T reguladoras, el método comprende los pasos de: (a) obtener una preparación de parásitos helmínticos; (b) poner en contacto la preparación de parásitos helmínticos con un objetivo; y (c) determinar el nivel de marcador interno para la actividad de células T reguladoras en el objetivo luego de ponerse en contacto, donde un cambio en el nivel del marcador interno debe de hacer contacto es indicativo de que la preparación de parásitos helmínticos altera una actividad de células T reguladoras . En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para detectar una preparación de parásitos helmínticos que altera la actividad de células T reguladoras, el método comprende los pasos de: (a) obtener una preparación de parásitos helmínticos; (b) poner en contacto la preparación de parásitos helmínticos con un objetivo; y (c) determinar el nivel de un marcador de superficie celular para las células T reguladoras en el objetivo luego de hacer contacto, en donde un cambio en el nivel del marcador de superficie celular después de ponerse en contacto es indicativo de que la preparación de parásitos helmínticos altera la actividad de células T reguladoras. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de un animal con una enfermedad relacionada con Thl ó Th2 mediante la administración de una preparación de parásitos helmínticos que altera en el animal la actividad de células T reguladoras . En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para monitorizar la eficacia del tratamiento de una preparación de parásitos helmínticos para una enfermedad de alergia o enfermedad autoinmunitaria en un animal, que comprende: (a) administrar una composición que comprende una preparación de parásitos helmínticos o una fracción de la misma en el animal ; y (b) determinar el nivel de actividad de células T reguladoras en el animal después de la administraci n, donde un aumento en el nivel de actividad de células T reguladoras después de la administración es indicativo de la eficacia del tratamiento de la preparación de parásitos helmínticos. De preferencia, la enfermedad que se trata se selecciona a partir del grupo que comprende : enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, lupus, diabetes mellitus juvenil insulinodependiente (Tipo I) , sarcoidosis, esclerosis múltiple, asma y rinitis alérgica. El marcador de células T regulador puede ser un marcador interno, un marcador de superficie celular o un marcador secretado. De preferencia, el marcador interno es Escurfina, Smad7, Gata3, Tbet (Tbx21) . También de preferencia, el marcador de superficie celular se selecciona a partir del grupo que comprende: CD4, CD45Rb10, CD45Rc, antígeno 4 asociado a linfocito T citolítico (CTLA-4) , CD25, CD103, CD62L, integrina a?ß, péptido asociado a la latencia (LAP) o proteína relacionada a la familia de receptores TNF inducidos por glucocorticoide (GITR) , encefalitis alérgica experimental (EAE) , receptor de quimocina CCR5, T1-TS2. También de preferencia, el marcador secretado es IL-5, Breve Descripción de las Figuras Figura 1. La figura 1 describe las concentraciones de IFNy, IL-4 e IL-5 cuantificadas en el sobrenadante de células del bazo de ratones infectados con M. avium, S. mansoni o ambos organismos según una modalidad de la invención. Los esplenocitos (4 xl05/pocillo) fueron cultivados in vi tro durante 48 horas a 37°C en 200 µ? de medio en presencia o ausencia de concentraciones óptimas de PPD o SEA. La secreción de citocina fue cuantificada mediante ELISA. Figura 2. La Figura describe las concentraciones de IFNy e IL-4 en el sobrenadante de granulocitos de ratones infectados con M. avium, S. mansoni o ambos organismos según una modalidad de la invención. Los granulocitos (4 x 105/pocillo) en 200 µ? de medio fueron cultivados in vitro a 37 °C durante 48 horas en presencia o ausencia de la concentración óptima de PPD o SEA. Las concentraciones fueron cuantificadas mediante ELISA. Figura 3. La figura describe los niveles séricos de IgGl, IgE e IgG2a cuantificados en ratones infectados con M. avium, S. mansoni o ambos (concomítantemente) según una modalidad de la invención. La concentración de inmunoglobulina se determinó mediante ELISA. Figura 4. La figura muestra que el tratamiento con IL-4 puede curar ratones de una infección crónica de H. polygyrus según una modalidad de la invención. Los ratones recibieron tres inyecciones de un complejo IL-4 comenzando 12 días antes del sacrificio. Los datos fueron promedios +/- SE de múltiples determinaciones . Figura 5. Los datos representan la puntuación promedio de inflamación y + SD de tres experimentos separados analizando >4 WT ratón/grupo según una modalidad de la invención. Figura 6: Según una modalidad de la invención, los ratones WT sin IBD fueron colonizados con H. polygyrus. Los testigos recibieron una alimentación simulada por sonda. Los LPMC fueron aislados de TI y cultivados durante 48 horas in vitro con o sin una estimulación de anti-CD3/anti-CD28. El IFNy en sobrenadantes se cuantificó mediante ELISA. Los datos fueron +SE promedios de las 6 determinaciones de dos experimentos independientes . Figura 7 : Según una modalidad de la invención, los ratones WT fueron tratados como en la Figura 2. Los LPMC aislados fueron cultivados 48 horas in vitro con CpG para promover la producción IL-12. IL-12 fue cuantificado mediante ELISA. Los datos fueron +SE promedio de 6 determinaciones de dos experimentos independientes . Figura 8 : Según una modalidad de la invención, los ratones WT sin IBD fueron colonizados con H. polygyrus. Los controles recibieron alimentación por sonda simulada. LPMC fueron aislados y cultivados dos semanas después como en la Figura 2. Los datos fueron +SE promedio de 6 determinaciones de dos experimentos independientes . Figura 9 : Según una modalidad de la invención, los ratones WT fueron colonizados con H. polygyrus . Los LPMC fueron aislados y cultivados durante 48 horas in vitro con anti-CD3/anti-CD28 +/- alLlOR mAb. Se cuantificó el IFNy en sobrenadantes mediante ELISA. Los datos fueron +SE promedio de 3 determinaciones independientes . Figura 10: Según una modalidad de la invención, los ratones WT sin IBD fueron colonizados con H. polygyrus. Los testigos recibieron alimentación por sonda simulada. Los LPMC fueron aislados y cultivados 2 semanas después como en la Figura 2. Los datos fueron +SE promedio de 6 determinaciones de dos experimentos independientes . Figura 11: Según una modalidad de la invención, los ratones WT sin IBD fueron colonizados con H. polygyrus. Los testigos recibieron alimentación por sonda simulada. Los LPMC fueron aislados y cultivados 2 semanas después como en la Figura 2. Los datos fueron +SE promedio para 6 determinaciones de dos experimentos independientes . Figura 12 : Según una modalidad de la invención, los ratones WT sin IBD fueron colonizados con H. polygyrus. Los testigos recibieron alimentación por sonda simulada. Los LPMC fueron aislados y cultivados 2 semanas después como en la Figura 2. Los LPMC fueron aislados a partir de TI y cultivados durante 48 horas in vitro con o sin estimulación por LPS . Los datos f eron +SE promedio para 9 determinaciones de tres experimentos independientes . Figura 13 : Según una modalidad de la invención, las células T fueron aisladas de LPMC intestinal disperso utilizando perlas magnéticas. Las fracciones enriquecidas con células T (células T) y agotadas de células T (sin T) fueron cultivadas 48 horas in vitro con o sin estimulación por anti-CD3/anti-CD28 antes de valorarse el IFNy en el sobrenadante. Los datos fueron +SE promedio para 6 determinaciones de dos experimentos independientes . Figura 14 : Según una modalidad de la invención, los ratones no infectados por WT recibieron 2 x 107 células MLN de ratones colonizados con H. polygyrus. Una semana después, se aislaron LPMC de estos receptores y se cultivaron 48 horas con o sin estimulación con anti-CD3/anti-CD28 antes de valorar el IFNy en el sobrenadante. Los datos fueron 4-SE promedio para 6 determinaciones de dos experimentos independientes . Figuras 15A-15B: Según una modalidad de la invención, los ratones WT GFP fueron colonizados con H. polygyrus. Dos semanas después, las células MLN de estos ratones GFP condicionados con helmintos fueron transferidos en ratones normales C57BL/6 mediante inyección intraperitoneal . Siete días después, se dispersó la l mina propia y se examinó para encontrar células GFP+ T mediante microscopía de fluorescencia. A) GFP+ LP células T. B) Mismo campo bajo microscopía óptica. Figuras 16A-16B: Según una modalidad de la invención, los animales IL10-/- recibieron alimento que contiene piroxicam comenzando a la edad de 5 semanas . Luego de dos semanas de tratamiento, se finalizó el piroxicam y se evaluó colitis dos semanas después. La IL10-/- igualada a la edad/testigo no recibieron piroxicam (testigo) . Se dio una puntuación a la colitis en secciones histológicas por evaluadores ciegos usando una escala de 0-4 puntos. A) Colon de un ratón testigo ILIO"^". B) Colon de un ratón ILIO"^" igualado en edad luego del tratamiento con piroxicam. C) Infiltración de lámina propia colónica con células T CD4+ luego del piroxicam (H&E 10X, IHC 20X) . Los datos de la gráfica son promedio de cinco experimentos separados, cada uno con 5-6 ratones/grupo . Figuras 17A-17F: Según una modalidad de la invención, A, B y C muestran la inflamación colónica típica en ratones tratados con piroxicam que no recibieron H. polygyrus. D. E y F muestran la mejoría en colitis dos semanas después de recibir H. polygyrus (All H&E, 4X) . La colitis se califica en una escala de 0-4 puntos. Los datos son promedios +SE de 11 animales estudiados en dos experimentos separados . Figura 18 : Según una modalidad de la invención, los ratones eolíticos IL10-/- recibieron H. polygyrus o alimentación por sonda simulada como se describe por la Figura 12. Dos semanas después, se aisló LPMC y se cultivó 48 horas in vi tro con o sin estimulación por anti-CD3/anti-CD28 (IFNy) o con oligo CpG (IL-12) . Los datos son promedios +SE de 8-9 determinaciones de tres experimentos independientes. Figura 19: Según una modalidad de la invención, los ratones IL10~^~ eolíticos fueron tratados como en la Figura 13. Los datos son promedios +SE de 8-9 determinaciones de tres experimentos independientes . Figura 20A-20B: Según una modalidad de la invención, A) Células LN aisladas de ratones IL10-/~ dos semanas después de recibir H. polygyrua o alimentación por sonda simulada (Testigo) se transfirieron (20xl06) mediante inyección intraperitoneal a ratones tratados con piroxicam. Dos semanas después de la transferencia, se valuó la colitis como en la Figura 12. B) Las células T MLN aisladas de ratones colonizados o testigo fueron transferidas (5xl06) a ratones eolíticos. Los datos son promedios +SE de 9 ratones/grupo en dos experimentos separados . Figura 21: Según una modalidad de la invención, se extrajo ARNm de células MLN aisladas de ratones IL10"/_ dos semanas después de alimentación por sonda simulada o con H. polygyrus luego de dos semanas de tratamiento simulado o con piroxicam. Se normalizó PCR en tiempo real para Foxp3 en ARNm de HPRT (Métodos) . Observación: Una mayor expresión requiere dé menos ciclos PCR para alcanzar el umbral. Los datos son promedios +SE de tres experimentos independientes cada uno utilizando 4 ratones/grupo . Figura 22 : Según una modalidad de la invención, se extrajo ÁRNm de células MLN de ratones IL10_/~ de dos semanas de edad luego de alimentación por sonda simulada o con H. polygyrus. Una menor expresión requiere más ciclos PCR para alcanzar el umbral. Los datos son promedios +SE de tres experimentos independientes utilizando cada uno 4 ratones/grupo . Figura 23. Se muestra un diagrama esquemático para un procedimiento de preparación de antígeno según una modalidad de la invención.

Descripción Detallada de la Invención La invención abarca un método para detectar una preparación parasitaria que altera la actividad de células T reguladoras . Como se utiliza aquí, el término "preparación de parásitos helmínticos" incluye, entre otros, cualquiera incluido en parásitos completos, extracto de parásitos, huevos de parásitos, extracto de huevos de parásitos, ova de parásitos, extracto de ova de parásitos, larvas de parásitos, extracto de larvas de parásitos, cercarías de parásitos y extractos de cercarías de parásitos . Una "preparación de parásitos" también puede ser una proteína aislada, polinucleótido, carbohidrato o lípido derivado del parásito y su extracto . Como se utiliza aquí, el término "libre de patógenos específicos" aplicado en animales criados para usarse con la presente invención cuando se sabe que los animales están libres de un microorganismo patógeno específico que pueda causar una enfermedad en un humano o animal objetivo. Los métodos para criar animales libres de patógenos se conocen en la técnica, por ejemplo, ver las referencias compiladas por Brown et al . , ? Bibliography on the Culture and Maintenance Specific Pathogen-Free Organisms, disponible en http: //www. ctsa.org/upload/publication/CTSA_11663168120295909 2495.pdf (incorporado aquí para referencia). Brown et al. proporcionan referencias para criar diferentes animales de laboratorio y granja en un ambiente SPF, así como procedimientos y requisitos de manejo y diseño de instalaciones. Ver también M. Michael Swindle (J. Invest. Surg., 9: 267-271, 1996, incorporado aquí por referencia) para un procedimiento SPF y enumera varios patógenos bacterianos y virales potenciales en humanos que pudieran causar preocupación. Como se utiliza aquí, el término "células T reguladoras" se refiere a una población de células linfocitarias que secretan al menos dos veces más (por ejemplo, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces o más) de IL-10 y/o TGFp en comparación a células T no estimuladas. La determinación de la secreción de IL-10 o TGFp se conoce en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse mediante el cultivo de células in vitro durante 24 ó 48 horas con o sin un estimulante para células T como puede ser anti-CD3 y luego valorando el sobrenadante de cultivo para determinar estas citocinas utilizando análisis ELISA específicos para la citocina. Además, las células T reguladoras de la presente invención también se caracterizan por un elevado nivel del transcripto Foxp3 en comparación con otros tipos de células T (por ejemplo, células T no estimuladas) . Mediante el concepto "alto nivel de transcripto Foxp3" se da a entender al menos 4 veces de aumento en el nivel en comparación con otros tipos de células T. el Foxp3 es detectado mediante PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (por ejemplo, usando cebadores PCR CCCAGGAAAGACAGCAACCTT, TTCTCACAACCAGGCCACTTG (SEQ ID No . 1) y la sonda marcada 6FAM-ATCCTACCCACTGCTGGCAAATGGAGTC-TAMRA (SEQ ID No. 2) como se describe en Hori, S.,* T. Nomura y S. Sakaguchi . 200. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science, 299: 1057-1061). Los valores se normalizan para expresión HPRT, que es un gen de mantenimiento. Alternativamente, el producto de la proteína FoxP3 , Escurfina, puede detectarse mediante un análisis de transferencia Western conocidos en la técnica, por ejemplo mediante el uso del Anticuerpo Policlonal Anti-FoxP3 de Cabra (FoxP3) (Número de Catálogo ab2481, Novus Biologicals, Littleton, CO) . Opcionalmente, las células T reguladoras también pueden producir una cantidad mucho menor de IFNy en comparación con otras células T (por ejemplo, células T no estimuladas) , es decir, al menos 2 veces, preferiblemente 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 10 veces o menos. También opcionalmente, las células T reguladoras también pueden detectarse luego del uso de un análisis de flujo intracitoplásmico para detectar células T que expresan para IL10 y/o TGFft pero poco o nada de IFNy. Los marcadores opcionales adicionales como se describen aquí también pueden utilizarse para detectar las células T reguladoras o la actividad de células T reguladoras . Como se utiliza aquí, el término "células T no estimuladas" , se refiere a células T producidas a partir de la producción del sistema inmunitario de células recientes en la médula ósea. Las células T no estimuladas responden a patógenos nuevos que contienen antígenos que el sistema inmunitario no ha procesado con anterioridad. Las células T no estimuladas pueden identificarse según los métodos conocidos en la técnica (para repasos ver, por ejemplo, Tough et al., 1999, Immunol Rev. 170: 39-47; Itano et al., 2003, Nat Immunol. 4(8): 733-9; Berard et al., Immunology. 106(2): 127-38) .

Como se utiliza aquí, el término "preparación parasitaria que altera la actividad de células T reguladora" se refiere a una preparación parasitaria que cambia la actividad de células T reguladoras en el objetivo mediante al menos un 40%, por ejemplo, 50%, 80%, 100%, 2 veces, 4 veces, 6 veces,, 8 veces,, 10 veces o más al ponerse en contacto con el objetivo, en comparación con la actividad de células T reguladoras en el objetivo sin poner en contacto con la preparación de parásitos. La actividad de células T reguladora puede cuantificarse mediante la monitorizacion del nivel de un marcador interno para células T reguladoras (por ejemplo, un factor de transcripción como AR m de FoxP3 o su producto proteico, Escurfina, Smad7, Gata3 o Tbet (Tbx21) ) , o un marcador de superficie de células T reguladoras (por ejemplo, CD4, CD45Rb10, CD45RC, antígeno 4 asociado a linfocitos T citolíticos (CTLA-4) , CD25, CD103, CD62L, integrina ?ß, péptido asociado a la latencia (LAP) o proteína relacionada con la familia de receptores TNF inducidos por glucocorticoide (GITR) , encefalitis alérgica experimental (EAE) , receptor CCR5 de quimocina, T1-TS2) o un marcador secretado (por ejemplo, IL4, IL3 , IL-5, IL-10, GFP) . Una mayor actividad de células T reguladoras puede representarse mediante un aumento (por ejemplo, FoxP3 , Ox40, 4-IBB, CD4 , CTLA-4, CD25, CD103, CD62L, a?ß, integrina LAP, GITR, EAE, CCR5, T1-ST2, IL-10, TGFp) o una disminución (por ejemplo, D45Rc) , en el nivel del marcador de células T reguladoras mediante al menos un 40%, por ejemplo, 50%, 80%, 100%, 2 veces, 4 veces, 6 veces,, 8 veces,, 10 veces o más como se mide según los métodos conocidos en la técnica y como se describe aquí . De preferencia, una preparación parasitaria que altera la actividad de células T reguladoras cambia el nivel de dos o marcadores descritos aquí con anterioridad. Como se utiliza aquí, el término "el nivel del marcador de células T reguladoras" se refiere a la cantidad de marcador específico para células T reguladoras en un objetivo, por ejemplo, cuantificado por microorganismos o cantidades molares. Normalmente, el marcador para células T reguladoras es una proteína, para la cual la cantidad puede cuantificarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica para la cuanti icación proteica, por' ejemplo, mediante ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación, radioinmunoensayo o análisis FACS (por ejemplo, en Innis et al., (1990) Academic Press, Inc.; Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2 a edición, Sambrook et al. (1989); y Gurrent Protocols in Molecular Biology (1997, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc.). El nivel de un marcador proteico también puede cuantificarse en su nivel de ARNm según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante transferencia Northern, RT-PCR cuantitativa, análisis de microordenación de secuencias (por ejemplo, en Innis et al., (1990) Academic Press, Inc.; Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2a edición, Sambrook et al. (1989); y Current Protocols in Molecular Biology (1997, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc . ) . Como se utiliza aguí, el término "objetivo" se refiere a un sistema in vitro (por ejemplo, células de tejido cultivado, extractos de transcripción/traducción) o un sistema in vivo (por ejemplo, un animal) . De preferencia, el objetivo es un sistema in vivo que contiene una célula animal, incluyendo una célula humana. Con mayor preferencia, el objetivo es un animal. Incluso con más preferencia, el objetivo es un animal mamífero. Aún más preferiblemente, el objetivo es un humano. La invención también abarca un método para prevenir o tratar una enfermedad causada por una respuesta inmunitaria alterada en un animal que comprende administrarle una preparación de parásitos helmínticos en una cantidad suficiente para prevenir o tratar la enfermedad en el animal . Como se utiliza aquí, el término "enfermedad causada por una respuesta inmunitaria alterada" se refiere a una enfermedad que un animal desarrolla (por ejemplo, un humano) debido a una diferencia en su respuesta inmunitaria en comparación a un animal no enfermo. Por ejemplo, el animal enfermo puede tener una respuesta inmunitaria anormal (por ejemplo, excesiva o insuficiente) para un antígeno (por ejemplo, un autoantígeno o un antígeno extraño) en comparación con la respuesta al mismo antígeno en un animal normal y no deseada. Una "enfermedad causada por una respuesta inmunitaria alterada" , según la presente invención, incluye entre otras, enfermedades relacionadas con Thl ó Th2 como se describen aquí . Como se utiliza aquí, el término "enfermedad relacionada con Thl" se refiere a una enfermedad en donde las células de Thl soportan, causan o intervienen en el proceso de enfermedad en donde las células Thl están involucradas en la curación o alivio de los síntomas de la enfermedad, que pueden representarse mediante una actividad potenciada o reducida de Thl. mediante el término "intensificado o potencializado" se da a entender que el animal enfermo tiene un aumento (por ejemplo, de al menos 2 veces, y posiblemente 5 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces o más) en su actividad Thl, en comparación con otros animales no enfermos. Una actividad Thl potencializada puede cuantificarse mediante un aumento del nivel de citocinas secretadas (por ejemplo, IL-2, IFN-?, TNFoc, IgG2a, IL-12, IL-18, IL-23) o una disminución en el nivel de citocinas secretadas (por ejemplo, IL-4, IL-13) , según los métodos conocidos en la técnica. Mediante el término "reducido" se da a entender que el animal enfermo tiene una disminución (por ejemplo, al menos 50% menos o 2 veces, y posiblemente 5 veces, 6 veces, 8 veces, 210 veces o menos) en su actividad Thl, en comparación con otros animales sin la enfermedad. Una menor actividad Thl se puede cuantificar mediante una disminución en el nivel de citocinas secretadas (por ejemplo, ???-?, TNFa, IgG2a) o un aumento en el nivel de citocinas secretadas (por ejemplo, IL-4, IL-13) según métodos conocidos en la técnica y como se describe agui en las Solicitudes de EE.UU. con Números de Serie 09/209,732 y 09/362,598, de los cuales su totalidad se incorpora por referencia. Como se utiliza aquí, el término "reducido" se utiliza indistintamente con el" término "disminuido" y el término "aumentado" se utiliza indistintamente con el término "potencializado" . Como se utiliza aquí, el término "enfermedad relacionada con Th.2" se refiere a cualquier enfermedad en donde las células Th2 soportan, causan o intervienen en el proceso de enfermedad o en donde las células Th2 están involucradas en la curación o alivio de los síntomas de las enfermedades que pueden presentarse mediante una actividad Th2 potenciada o reducida. Mediante el término "potenciada" se da a entender que la enfermedad en el animal ha aumentado (por ejemplo, al menos 2 veces, y posiblemente 5 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces o más) en su actividad Th2, en comparación con otros animales sin la enfermedad. Una actividad Th2 potencializada puede cuantificarse mediante un aumento en el nivel de citocinas y anticuerpos secretados (por ejemplo, IL-4, IL-5, IgE e IgGl) según los métodos conocidos en la técnica. Mediante el término "reducido" se da a entender un animal enfermo que tiene una actividad disminuida (por ejemplo, al menos 50%, 2 veces, y posiblemente 5 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces o menos) en su respuesta Th2, en comparación con otro animal sin enfermedad. En una menor actividad Th2 puede cuantificarse mediante una disminución en el nivel de citocinas secretadas y anticuerpos (por ejemplo, IL-4, IL-5, IgE e IgGl) según los métodos conocidos en la técnica como se describe aquí en las Solicitudes de EE.UU. con Números de Serie 09/209,732 y 09/362,598, de los cuales su totalidad se incorpora por referencia. Como se utiliza aquí, el término "eficacia del tratamiento" se refiere a la efectividad de un tratamiento contra una enfermedad utilizando la preparación parasitaria. La "eficacia del tratamiento" normalmente se cuantifica por la respuesta clínica a una enfermedad específica para la cual el animal ha sido o está siendo tratado con una preparación parasitaria .

PARÁSITOS HELMINTICOS ÚTILES SEGÚN LA INVENCIÓN Los parásitos helmínticos incluyen, entre otros, dos grupos . El primer grupo son los parásitos helmínticos que colonizan naturalmente a los humanos y el segundo grupo son parásitos helmínticos que colonizan animales pero que pueden proporcionar protección a humanos . En el primer grupo, los parásitos helmínticos son gusanos multicelulares elaborados con ciclos vitales complejos y desarrollo complejo. Los nematodos (gusanos redondos no segmentados) y los platelmintos (gusanos planos) son dos grupos de helmintos que colonizan los intestinos de humano. Según la presente invención, cualquiera de una variedad de parásitos helmínticos que colonizan naturalmente a los humanos o animal puede proporcionar los resultados pretendidos . Los nematodos que habitan frecuentemente el intestino humano son Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis (oxiuro) , Trichuris trichiura (tricocéfalo) , Ancylostoma duodenale y Necator americanus (anquilostoma) y Strongyloides stercoralis. Tríchinella spiralis infesta brevemente el intestino delgado. Los platelmintos incluyen los tremátodos y cestodos . Los tremátodos adultos más comunes que residen en los intestinos de humano son especies de Fasciolopsis, Echinostoma y Heterophyes. Aquellos que viven en el sistema biliar incluyen Clonorchis sinensis, Opisthrchis viverrini y felineus y Fasciola hepática. Schistosoma reside en el sistema venoso pero varias especies afectan crónicamente el intestino por el paso de huevos a través de la pared intestinal. Los cestodos adultos que comúnmente infectan humanos son especies de Diphyllobothrium (tenias de pescado) , Taenia saginata (tenia de la carne) , Taenia solium (tenia de puerco) y Hymenolepsis nana (tenia enana) . Otros helmintos de interés incluyen los parásitos filariales y parásitos pulmonares. Estos no tienen una fase intestinal pero estimulan fuertes respuestas tipo Th2. El segundo grupo general de parásitos helmínticos que pueden utilizarse en la presente invención incluye helmintos que colonizan animales, pero que pueden proporcionar protección a los humanos contra enfermedades mediadas por la respuesta inmunitaria. Estos incluyen Trichuris uris (tricocéfalo de ratón) , Trichinella spiralis, Nippostrongylus brasiliensis, Heligmondomoides polygyrus e Hymenolepsis nana, de los cuales todos son helmintos intestinales que infectan ratones. Además, Angiostrongylus es un helminto de rata. Trichuris suis y Asearis suwn son helmintos de cerdo que pueden infectar humanos. Especies de Trichuris vulpis, Toxocara, Gnathostoma y Ancylostoma son helmintos de perro o gato que también pueden infectar humanos. Anisakis y Pseudoterranova son nematodos de mamíferos marinos que pueden transmitirse a humanos. Los esquistosomas de aves pueden infectar transitoriamente los humanos. Estos esquistosomas incluyen S. douthitti, Trichobilharzia ocellata, T. stagnicolae, T. physellae y Gigantobilharzia huronensis. La preparación helmíntica puede seleccionarse a partir del grupo que comprende helmintos que colonizan naturalmente a humanos y helmintos que colonizan animales pero que pueden proteger humanos o animales de una enfermedad causada por una respuesta inmunitaria alterada. En algunas modalidades de la invención, el parásito helminto es un nematodo y puede seleccionarse a partir del grupo que comprende Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ancylostoma duodenale y Necator americanus, Strongyloides stercoralis y Trichinella spiralis. En otras modalidades de la invención, el parásito helmíntico es un platelminto y puede seleccionarse a partir del grupo que comprende tremátodos y cestodos como Fasciolopsis, Echinostoma y especies de Heteropii es Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverríní, Opistorchis felineus, Fasciola hep tica, especies de Schistosoma, especies de Diphyllobothrium, Taenia saginata, Taenia solium e Hymenolepsís nana. En otras modalidades, el parásito helmíntico se selecciona a partir del grupo que comprende parásitos filariales y pulmonares . En modalidades preferidas, los parásitos helmínticos se seleccionan a partir del grupo que comprende Trichirus muris, Trichinella spiralis, Nippostrongylus prasiliensis, Heligmonsomoides polygyrus, Hymenolepsis nanan, especies de Anglostrongylus, Trichuris suis, Ascaris suu , Trichuris vulpis, especies de Toxocara, especies de Gnathostoma, especies de Ancylostoma, especies de Amisakis y especies de Pseudoterranova. Se prefiere que los animales para la preparación de la producción parasitaria sean criados en ambientes libres de patógenos específicos SPF) (por ejemplo, libres de patógenos específicos para humanos) .

ENFERMEDADES TRATABLES SEGÍJN LA INVENCIÓN Los ejemplos de enfermedades tratables según la invención incluyen, entre otros, enfermedades relacionadas con Thl y relacionadas con Th2 , incluyendo cánceres relacionados con Thl ó Th2.

Enfermedades Relacionadas con Thl Las enfermedades relacionadas con Thl comprenden los siguientes grupos de enfermedades: enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunitarias , cáncer y enfermedades de hipersensibilidad tipo retardada. El grupo de enfermedades infecciosas incluye enfermedades causadas por parásitos y virus como VIH. - El grupo de enfermedades autoinmunitarias incluyen las encefalomielopáticas, desmielinizantes y otras enfermedades autoinmunitarias . Los ejemplos de enfermedades encefalomielopáticas incluyen, entre otras, esclerosis múltiple (MS) ; esclerosis diseminada; esclerosis focalizada; esclerosis insular; tabes dorsalis (esclerosis posterior) ; encefalomielitis alérgica experimental aguda y crónica (o autoinmune) (EAE) , que es un modelo experimental de animal de MS; Síndrome Guillain-Barr; neuritis alérgica experimental (UN MODELO ANIMAL DEL Síndrome Guillain-Barr) ; encefalomielitis aguda diseminada; encefalomielitis miálgica (benigna y epidémica) ; encefalomielitis viral; encefalomielitis gramilomatosa; etc.

También se incluyen enfermedades en animales no limitándose a moquillo canino; . moquillo felino; encefalomielitis equina (del este, venezolana y del oeste) ; encefalomielitis aviar; encefalomielitis porcina; encefalomielitis bovina; encefalomielitis de ratón; etc. Los ejemplos de enfermedades desmielínizantes incluyen, entre otras, esclerosis múltiple (MS) , esclerosis diseminada (DS) , encefalomielitis diseminada aguda, leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) y panencefalitis esclerótica subaguda (SSPE) . Los ejemplos de otras enfermedades autoinmunitarias incluyen esclerosis múltiple MS) , poliarteritis nodoasmática, neumonitis por hipersensibilidad, enfermedad de pulmón intersticial, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar intersticial asociada con enfermedad de Cro n o colitis ulcerativa o enfermedad de Whipple, enfermedad pulmonar intersticial asociada con granuíornatosis de Wegeners o vasculitis por hipersensibilidad, Síndromes de vasculitis, púrpura Hennoch Scheonleins, Síndrome de Goodpastures, granulornatosis de Wegeners, enfermedades renales como glomerulopatía mediada por anticuerpos como la glomerulonefritis aguda, nefritis asociada con lupus eritematoso sistémico (SLE) , nefritis asociada con otras enfermedades sistémicas como granulornatosis de Wegeners y Síndrome de Goodpastures y enfermedades mixtas de tejido conectivo, nefritis intersticial crónica, glomerulonefritis crónica, enfermedades gastrointestinales (por ejemplo, IBD) como enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad coelíaca, enfermedad de Whipple, colitis colaginosa, colitis eosinofílica, colitis linfocítica, enfermedades hepatobiliares como hepatitis autoinmunitaria, hepatitis inducida por alcohol, fibrosis periportal, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerozante, enfermedades dérmicas como la psoriasis, dermatitis atópica, eczema, enfermedad alérgica de la piel, esclerosis sistémica progresiva (escleroderma) , dermatitis exfoliante, pémfigo vulgar, enfermedades de articulaciones como artritis reumatoide (RA) , espondilitis anquilosante, artritis asociada con psoriasis o enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedades musculoesqueléticas como miastenia gravis (MG) , polimiositis, enfermedades endócrinas como diabetes mellitus insulinodependiente (IDD ) , tiroiditis autoinmunitaria (Hashimoto) , tireotoxicosis, hipertiroidismo (enfermedad de Grave) , enfermedades del sistema hematopoyético como anemia autoinmunitaria, trombocitopenia autoinmunitaria y anemia aplástica autoinmunitaria, enfermedades cardiovasculares como cardiomiopatía, vasculitis, enfermedad cardiovascular asociada con enfermedades sistémicas como lupus eritematoso sistémico, poli artritis lodosa, artritis reumatoide, escleroderma y sarcoidosis . Una característica apreciable de enfermedades autoinmunitarias es la asociación y aglomeración familial con la expresión de genes particulares, particularmente genes del complejo principal de histocompatibilidad clase I y clase II (MHC) . Por ejemplo, una gran proporción de pacientes MS tienen el haplotipo HLA-DR2 (Beall S S, Concannon P, Charmley P, et al., J. Neuroimmunol . , vol . 21, p 59-66, 1989). Ya que no todos los pacientes con un genotipo susceptible desarrollan la enfermedad autoinmunitaria, parece ser que los factores ambientales tienen una función principal . Por ejemplo, MS parece ser más común en pacientes que viven en regiones de climas templados (Kurtzke J F, IN: Múltiple Sclerosis, Hallpike J F, Adams C W M, Tourtelotte W, editores, Williams y Wilkins, Baltimore, Md. , 1983, p 49-95). Se ha especulado desde hace tiempo que el factor ambiental de las enfermedades autoinmunitarias puede ser un agente infeccioso como un virus. La etiología de varias enfermedades en humanos y animales puede atribuirse a infección viral . Por ejemplo, la encefalomielitis murina de Theiler es una enfermedad desmielinizante con signos clínicos y patológicos similares a EAE. Aunque los anticuerpos están implicados en algunas respuestas efectoras de enfermedades autoinmunitarias, el evento desencadenante en la mayoría de los casos comienza con la activación de células T CD4 que son requeridas para la maduración de células B y expansión clonal . El grupo de hipersensibilidad tipo retardada incluye la hipersensibilidad de contacto con sustancias de bajo peso molecular . A. Enfermedades Inflamatorias del Intestino (CD y UC) : Los datos epidemiológicos sugieren una susceptibilidad genética al desarrollo de la enfermedad de Crohn (CD) y colitis ulcerativa (UC) . La incidencia de CD en sociedades industrializadas ha aumentado desde la década de los 50 hasta mediado de la década de los 80 y ahora es de 1 a 8 por cada 100,000 personas al año. Esto sugiere que los cambios desconocidos de nuestro medio ambiente han afectado la frecuencia de CD. Aunque la causa de IBD permanece indeterminada, se presume que es el resultado de la desregulación del sistema inmunitario de la mucosa intestinal . Las células inflamatorias en la mucosa normalmente nos protegen de los contenidos luminares . Esta inflamación crónica altamente efectiva está rigurosamente controlada para limitar la lesión tisular. IBD puede resultar de respuestas inmunitarias vigorosas e inapropiadas a factores luminales . CD parece ser una inflamación tipo Thl extremadamente vigorosa que produce IF -? y TNFoc. La naturaleza de UC está menos definida. La colitis ulcerativa (UC) y enfermedad de Crohn (CD) son trastornos de derivación compleja causados por la interacción de exposiciones ambientales mal definidas y, al menos en algunos casos, la herencia de genes con susceptibilidad. Normalmente se cita como evidencia para la predisposición genética a IBD la mayor y esperada ocurrencia de IBD en miembros de familias de pacientes con esta condición y de elevada prevalencia de la enfermedad en poblaciones judías de países occidentales (Roth MP, Petersen GM, McElree C et al . Geographic origins of Jewish patients with inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1989; 97(7): 900-4). No obstante, IBD es mucho menos prevalente en la población judía de Israel (Fireman Z, Grossman A, Lilos P et al. Epidemiology of Crohn's disease in the Jewish population of central Israel, 1970-1980. Am. J. Gastro 1989; 84 (3) : 255-8) con origen étnico similar (Grossman A, Fireman Z, Lilos P et al. Epidemiology of ulcerative colitis in the Jewish population of central Israel 1970-1980. Hepato-Gastroenterology 1989; 36(4) : 193-7) . Los estudios en gemelos proporcionan evidencia de predisposición genética para al menos CD (Halfvarson J, Bodin L, Tysk C et al. Inflammatory bowel disease in a Swedish twin cohort: a long-term follow-up of concordance and clinical characteristics . Gastroenterology 2003; 124 (7): 1767-73). Un defecto genético en CARD15/NOD2, una proteina intracelular que es sensible para el producto bacteriano dipéptido de muramilo (Inohara M, Ogura Y, Fontalba A et al. Jíost recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2 : implicatíons for Crohn's disease. J. Biol Chem 2003; Girardin SE, Boneca G, Víala J et al. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detection. J Biol Chem 2003) , hace que ciertas personas sean más susceptibles a la CD. Se proponen otras alteraciones genéticas diversas como factores de riesgo para IBD. No obstante, las predisposiciones genéticas no explican el rápido incremento de incidencia de la enfermedad. Existen varios modelos de animales experimentales para la inflamación intestinal crónica, por ejemplo, como se menciona en Elliott et al. (Elliott et al., 1998, Inflammatory Bowel Disea.se and Celiac Disease. In: The Autoí mune Diseases, 3a edición, N. . Eose e I.R. MacKay, editores. Academic Press, san Diego (GA) . Un avance importante es el reciente descubrimiento de que algunos ratones con supresiones génicas genéticamente manipuladas pueden desarrollar una inflamación crónica del intestino similar a IBD, ver Elson et al, 1995, Gastroenterology 109: 1344. Estos incluyen ratones mutantes con supresiones con especificidad de objetivo hacia IL-2, IL-10, HC clase II o genes TCR entre otros. Utilizando algunos de los modelos experimentales, Berg et al., 1996, J. of Clin. Investigation 98:1010, Ludviksson et al. 1997, J. of Immunol . 158: 104 y Mombarts et al., 1993, Cell 75: 274 han demostrado que un sistema inmunitario desregularizado por sí mismo puede intervenir en la lesión intestinal. La inflamación de la mucosa de varios de estos modelos genera grandes cantidades -de IFN-? y TNF-oc lo que sugiere que un exceso en la producción de citocinas tipo Thl es un mecanismo común subyacente a la patogénesis de la enfermedad. También, el bloqueo del circuito Thl evita la inflamación. CD es una respuesta a Thl. por lo tanto, estos modelos experimentales pueden ¦ tener implicaciones directas concernientes a la inmunopatología de estos procesos de enfermedad en humanos .

B. Artritis reumatoide (RA) Ra es una enfermedad crónica caracterizada por sinovitis inflamatoria persistente, normalmente involucrando las articulaciones periféricas con distribución simétrica. Esta inflamación puede llevar a erosiones óseas, daño al cartílago y destrucción de la articulación. Es una aflicción que ataca a aproximadamente 1% de la población. La preferencia aumenta conforme la edad y las mujeres son afectadas con más frecuencia que los hombres . La propagación de RA es un evento inmunologicamente mediado e impulsados por células Thl CD4+. C. Diabetes ellitus Juvenil Insulinodependiente (DM) (tipo 1) : La DM tipo 1 es una enfermedad que normalmente comienza durante el inicio de la edad adulta y es resultado de la incapacidad para producir insulina como respuesta a una mayor cantidad de azúcar en la sangre . Esta elevada azúcar en la sangre persistente y la incapacidad para metabolizar adecuadamente la glucosa causa alteraciones metabólicas que actualmente dañan los ojos, ríñones, corazón y otros órganos. La administración parenteral de insulina puede controlar parcialmente estos problemas metabólicos. DM tipo 1 es resultado de un ataque autoinmunitario en las células beta pancreáticas, que son la fuente de insulina. Los macrófagos activados y las células T citotoxicas rodean y destruyen las células beta pancreáticas. La susceptibilidad genética y un ambiente mal definido son eventos que desencadenan los procesos de enfermedad. D. Lupus eritematoso (LE) : LE es una enfermedad autoinmunitaria sistémica que es más frecuente en mujerea a comienzos y mediados de la edad adulta. El daño tisular causado por anticuerpos y células T regulatorias hiperreactivas . La respuesta inmunitaria normal permite la producción sostenida de anticuerpos patogénicos y complejos inmunitarios . Esto conlleva al daño del sistema músculo esquelético, cutáneo, hematológico, renal y otros. La respuesta inmunitaria anormal probablemente depende de la interacción de múltiples factores hereditarios y ambientales. ?. Sarcoidosis: La sarcoidosis es una enfermedad granulomatosa crónica de los pulmones y otros órganos debido a causas desconocidas . La mayoría de los pacientes que la presentan tienen edades entre 20-40 años. El síntoma más frecuente es el problema para respirar. La enfermedad es el resultado de una respuesta inmunitaria celular tipo Thl exagerada, probablemente a una cantidad limitada de antígenos . La sarcoidosis se desarrolla en todo el mundo, y afecta todas las razas. Sin embargo, hay una marcada diversidad de prevalencia de sarcoidosis entre ciertos grupos étnicos y raciales. Por ejemplo, la enfermedad es rara en Polonia, Sureste Asiático e India. F. Esclerosis Múltiple (MS) : MS es un trastorno inflamatorio multifocal con recaídas crónicas del sistema nervioso central que conlleva a la desmielinización focal y cicatrización del cerebro. Es una enfermedad frecuente que afecta aproximadamente a 350,000 norteamericanos y que comienza durante el inicio hasta la mitad de la edad adulta. MS es una enfermedad autoinmunitaria mediada al menos en parte por células Thl . Las lesiones por ; S se asemejan a aquellas inducidas por las respuestas de hipersensibilidad retardada que contienen células T activadas y macrófagos. Es una enfermedad de clima templado, aumentando su prevalencia conforme se aleja del Ecuador.

Enfermedades Relacionadas con Th2 Las enfermedades relacionadas con Th2 comprenden los siguientes grupos de enfermedades : enfermedades alérgicas y cáncer . Se sabe bien que las personas genéticamente predispuestas se sensibilizan (forman alergias) a los antígenos originados de una variedad de fuentes ambientales, a los cuales se exponen las personas. La reacción alérgica ocurre cuando una persona previamente sensibilizada vuelve a exponerse a un alérgeno igual u homólogo. Las respuestas alérgicas abarcan desde fiebre del heno, rinoconductivitis, rinitis y asma a anafilaxis sistemica y muerte como respuesta a, por ejemplo, picaduras por abeja o avispas o mordedura de insectos . La reacción es inmediata y puede ser causada por una variedad de alérgenos atópicos como compuestos que se originan del pasto, árboles, piedras, insectos, (polvo casero) , termitas, alimentos, fármacos, productos químicos y perfumes . El grupo de enfermedades alérgicas incluye fiebre del heno, rinoconjuntivitis, rinitis y asma. Los alérgenos más comunes a los cuales ocurren reacciones alérgicas incluyen inhalación de alérgenos que se originan, es decir, de árboles, pastos, hierbas, hongos, ácaros del polvo en el hogar, ácaros en almacenes, cucarachas y pelo de animal, plumas y caspa. Es importante el polen de alérgenos como árboles, pastos, hierbas como los originados de los cortes taxonómicos de Fágales, Oléales y Piñales, incluyendo, por ejemplo abedul (Betula) , aliso (Alnus) , avellano (Corylus) , carpe (Carpinus) y olivo (Olea) , el orden de Poales incluyendo, por ejemplo pastos del género Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis y Sécale, los órdenes de Asterales y Urticales incluyendo, por ejemplo hierbas del género Ambrosia y Artemisia. Es importante la inhalación de alérgenos de hongos como los originados del género Alternaría y Cladosporium. Otros alérgenos de inhalación importante son aquellos de los ácaros del polvo del género Dermatophagoides, ácaros de almacenes del género Lepidoglyphys destructor, aquellos de cucarachas y de mamíferos como el gato, perro, caballo, vaca y aves. También, las reacciones alérgicas hacia las picaduras o mordeduras de insectos como aquellos del orden taxonómico de Hymenoptera incluyendo abejas, avispas y hormigas se observan comúnmente . Se conocen por el experto en la técnica los alérgenos específicos y sus componentes, por ejemplo Bet i (B . verrucosa, abedul), Aln g 1 (Alnus glutinosa, aliso) , Cor a 1 (Corylus avelana, avellano) y Car b 1 (Carpinus betulus, carpe) del orden Fágales. Otros son Cry j 1 (Piñales), Amb a 1 y 2, Art v 1 (Asterales) , Par j 1 (Urticales) , Ole e 1 (Oléales) , Ave e 1, Cyn d 1, Dac g 1 Fes p 1, Hol 1 1, Lol p 1 y 5, Pas n 1, Phi p 1 y 5; Poa p 1, 2 y 5, Sec c 1 y 5 y Sor h 1 (diversos polen de pastos) , Alt a y Cha h 1 (hongos) , Der f 1 y 2, Der p 1 y 2, (ácaros del polvo en casas, D. farinae y D. pteronyssinus , respectivamente), Lep d 1, Bla g 1 y 2, Per a 1 (cucarachas, Blatella germánica y Periplaneta americana, respectivamente) , Fel d 1 (gato) , Can f 1 (perro) Equ e l, 2 y 3 (caballo) , Aspis m 1 y 2 (abeja mielera) , Ves g 1, 2 y 5, Pol a l, 2 y 5 (todas las avispas) y So i 1, 2 , 3 y 4 (hormiga roja) , por mencionar los más comunes. A. Asma En varias personas, el asma parece ser una reacción alérgica a sustancias comúnmente respiradas a través del aire, como es la caspa de animales, polen o caros del polvo y productos de desperdicio de las cucarachas . El nombre común para estas sustancias, alérgenos, se refiere a cualquier cosa que provoque una reacción alérgica. Algunas personas tienen una predisposición genética para reaccionar contra ciertos alérgenos. En 1998, un estimado de 17 millones de norteamericanos o 6.4% de la población tenían asma. Los niños son responsables de 4.8 millones de norteamericanos con asma. La información experimental y clínica disponible tanto en modelos experimentales en animales como la información clínica sobre la patología de asma en humanos indica la presencia de células Th2 en la patología de esta enfermedad.

Cánceres relacionados con Thl y Th2 En términos generales, las células cancerosas pueden desencadenar una respuesta inmunitaria a los antígenos específicamente expresados por la célula cancerosa. Ya que las respuestas inmunitarias tanto de Thl como de Th2 pueden impulsar otras respuestas inflamatorias que conlleven a la erradicación citotóxica del tejido, la modulación de las respuestas inmunitarias de Thl ó Th2 puede utilizarse en el tratamiento contra el cáncer. Los cánceres, que pueden tratarse con la composición según la invención, pueden clasificarse histogenéticamente como tumores epiteliales malignos, incluyendo carcinomas y adenocarcinomas como tumores malignos no epiteliales, incluyendo liposarcomas , fibrosarcomas , condrosarcomas , osteosarcomas , leiomiosarcomas , rabdomiosarcomas , gliomas, neuroblastomas , meduloblastomas , melanoma maligno, meningioma maligno, diversas leucemias, diversos trastornos mieloproliferativos , diversos linfornas (linforna de Hodgkin y linfoma que no es de Hodgkin) , hemangiosarcoma , sarcoma de Kaposi, linfoangiosarcoma , teratoma maligno, disgerminoma , seminoma y coricarcinoma . Los carcinomas y adenocarcinomas son los más abundantes (que dan cuenta de aproximadamente 90% de muertes por cáncer) y por lo tanto son enfermedades objetivo interesantes para el tratamiento/prevención según la invención. Los carcinomas y adenocarcinomas más importantes son aquellos de las cias respiratorias (especialmente de origen bronquial) , del pecho, del colorrecto y del estómago. Sin embargo, también los carcinomas y adenocarcinomas de la próstata, del ovario, el tejido linfoide y médula ósea, de útero, páncreas, del esófago, de la vejiga urinaria y del riñon causan una cantidad significativa de muertes y son por lo tanto de interés . El grupo de enfermedades cancerosas además incluye el Síndrome Sezary, linfoma cutáneo de células T, carcinoma hepático y cáncer pulmonar.

CÉLULAS T REGULADORAS EN ENFERMEDADES RELACIONADAS CON THl Ó TH2 Las células T reguladoras pueden inducir la tolerancia periférica y limitar la reactividad de la mucosa ( cGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl/Th2 paradigm in imm nity to infectious diseases. Trends Immunol 2002; 23(9): 450-5). En diversos modelos experimentales en animales, se han mencionado varios fenotipos de células T reguladoras. Las células T reguladoras que expresan para diversos marcadores han sido indicadas por estar involucradas en diferentes enfermedades (ver, por ejemplo, Fuelf, A. C, L. Caccavelli, M. F. Bloch, y B. Bellon. 2003. Regulatory CD8+ T cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoim unity. Journal of Immunology. 170: 2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3(3): 223-32; Francois Bach J. Regulatory T cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3(3) : 189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaiile JJ. CD4 (+) regulatory T cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dic; 14(6): 771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl/Th2 paradigm in iimnunity to infectious diseases. Trends Immunol . 2002 Sep; 23 (9): 450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T-cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Ago; 182: 135-148; Read S, Powrie P. CD4(+) regulatory T cells. Curr Opin Immunol. 2001 Dic; 13 (6): 644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory T cells and allergic asthma. Microbes Infect. 2001 Sep; 3(11): 899-904) . En algunos sistemas, se distinguen mediante un diferencial de expresión de moléculas superficiales como CD25 (Shevach, E. M. 2002. CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nature Reviews . Immunology. 2: 389-400), CD45RB (Annacker, O. y F. Powrie, 2002. Homeostasis of intestinal im une regulation. Microbes & Infection. 4: 567-574) y CTLA-4 (Read, S., V. Malmstrom y F. Powrie. 2000. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25 (+) CD4 (+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J. Exp. Med. 192: 295-302) . Este patrón de expresión para proteínas de superficie celular sugiere que pueden estar en un estado de memoria o en un estado efector. Estas células reguladoras pueden intervenir en ciertos efectos a través de la producción de IL10 y TGFP . Se describe una célula T reguladora anérgica (Trl) que produce elevados niveles de IL10 y TGFP . Otra célula llamada Th3 suprime la inducción de encefalomielitis autoinmunitaria experimental principalmente mediante la producción de TGFP . Aún otros no son dependientes de IL10 ó TGFp solubles, pero en vez expresan sobre su superficie del péptido asociado a la latencia, que es el dominio amino-terminal del péptido precursor TGF (Oida T, Zhang X. Goto M et al. CD4+CD25- T cells that express latency-associated peptide on the surface suppress CD4+CD45RBhigh-induced colitis hy a TGF-beta-dependent mechanism. J Immunol 2003; 170(5): 2516-22). También se han mencionado marcadores celulares internos para células T reguladoras (Schubert LA, Jeffery E, Zhang Y, Ramsdell F , Ziegler SF, Scurfin (FOXP3) acts a repressor of transcripción and regulates T cell activation. J Biol Chem. 2001 Oct 5; 276(40): 37672-9). Todas las referencias se incorporan aquí por referencia. Los ratones Rag reconstituidos con células T CD4+, CD45alta pueden desarrollar colitis severa, que puede evitarse mediante la transferencia simultánea de células T CD4+, CD45ba:ia (Annacker O, Powrie F . Homeostasis of intestinal immune regulation. Microbes & Infection 2002; 4(5): 567-74). GFP e IL10 se requieren para la protección en que sugiere una función de estas citocinas en los procesos reguladores .

PREPARACIONES DE PARÁSITOS HELMÍNTICOS SEGÚN LA INVENCIÓN Los helmintos son animales parasitarios (lombrices) que, dependiendo de la especie, viven en ubicaciones como el lumen intestinal, flujo sanguíneo o músculos del hospedero. Estos organismos, colonizan más de 1/3 de la población mundial. La colonización por helmintos es más común en menores que viven en climas cálidos y están sujetos a una mala higiene . Las formas infecciosas de estos organismos se diseminan mediante el contacto con agua, alimentos con suelos contaminados. Antes de la década de los 40, varios menores y adultos en los Estados Unidos de Norteamérica estaban infestados con helmintos. La infección por lombrices era particularmente común en áreas rurales del Sur y en poblaciones indigentes de las principales ciudades (Elliott DE, Urban JF, Jr. , Argo CK et al. Does the failure to acquire helminthic parasites predispose to Crohn's disease? FASEB J 2000; 14(12): 1848-55). En los Estados Unidos de Norteamérica y Europa, la colonización helmíntica ha declinado establemente . Se encuentran en inmigrantes recientes de países menos desarrollados (Salas SD, Heifetz R, Barrett-Connor E. Intestinal parasites in Central American immigrants in the United States. Arch Intern Med 1990; 150 (7) : 1514-6) y en poblaciones con desventaja económica que viven en regiones pobres de los Estados Unidos de Norteamérica como las reservaciones indias (Healy GR, Gleason NN, Bokar R et al. Prevalence of ascariasis and amebiasis in Cherokee Indian school children. Public Health Rep 1969; 84(10): 907-14). La prevalencia de helmintos es mayor en climas cálidos y en poblaciones sujetas al hacinamiento, mala higiene y suministro de alimentos contaminados . La enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , artritis reumatoide y enfermedades autoinmunitarias son raras en estas mismas regiones . Los nematodos que frecuentemente habitan el intestino humano son Ascaris lumbricoides , Enterobius vermicularis (oxiuros) , Trichuris trichiura (triquina) , Ancylostoma duodenale y Necator americanus (anquilostoma) y Strongyloides stecoralis. Trichinella spiralis infesta brevemente el intestino delgado. Los platelmintos incluyen los tremátodos y cestodos . Los tremátodos adultos más comunes que residen en los intestinos humanos son especies de Fasciolopsis, Echinostoma y Heterophyes. Aquellas que viven en el sistema biliar incluyen Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini y felineus y Fasciola hepática. Schistosoma abunda en el sistema venoso, pero varias especies afectan crónicamente el intestino mediante el paso de huevos a través de la pared intestinal . Los cestodos adultos que infestan comúnmente a humanos son especies de Diphylobothrium (tenia de pescado) , Taenia saginata (tenia de la vaca) , Taenia solium (tenia de cerdo) e Hymenolepsis nana (tenia enana) . El hospedero adquiere diversas especies de helmintos mediante el contacto con el suelo, alimentos o agua contaminados con la forma infecciosa del parásito. Los niños albergan con más frecuencia infecciones helmínticas debido a su cercano contacto con el suelo y prácticas higiénicas subóptimas . Los helmintos incitan una respuesta Th2 intestinal, que puede causar la expulsión de la lombriz o limitar la magnitud de la infección. La mayoría de los grupos que viven en países no industrializados tienen estos parásitos. Varias especies helmínticas sobreviven durante años dentro del intestino, árbol biliar o venas mesentéricas produciendo miles de huevos diariamente. Por lo tanto, al comenzar la niñez, estas lombrices y/o sus huevos liberan moléculas que dañan la superficie de la mucosa intestinal durante años incitando una inflamación tipo Th2.

A. Vacunas de Organismos Viables: Los organismos viables de parásitos helmínticos pueden proporcionar el acondicionamiento de la mucosa más profundo debido a su relativa longevidad en comparación a las vacunas componentes . Los organismos viables pueden administrarse en sus formas de huevo, larva, cercaría o larva enquistada dependiendo del helminto. Se pueden utilizar helmintos que pueden colonizar humanos y un animal preparativo. El animal preparativo puede necesitar de manipulación para permitir una elevada patencia helmíntica. Esta manipulación puede incluir · el tratamiento con agentes inmunosupresores como los glucocorticoides o azatioprina; agentes que impiden efectos de Th2 como los antihistamínicos, anticitocínicos o citocinas recombinantes ; y agentes que influyen sobre la motilidad intestinal como los anticolinérgicos u opiáceos . La dieta de animal será alterada para reducir el contenido de fibra cruda. El animal puede ser una rata, credo, hámster, ave u otro animal preparativo. Los animales preparativos se crían en ambientes libres de patógenos específicos (SPF) (por ejemplo, libres de patógenos específicos de humano) según métodos que se conocen en la técnica. Se analizan para asegurar la ausencia de patógenos bacterianos, microbacterianos y virales de humano. Se describen en la técnica los métodos para criar los animales en un ambiente SPF y sus ventajas, por ejemplo mediante . ichael Swindle (J. Invest. Surg., 9: 267-271, 1996, incorporado aquí por referencia) . Swindle también enumera diversos patógenos potenciales tanto bacterianos como virales de preocupación en humanos. En consecuencia, las preparaciones parasitarias derivadas de animales criados en un ambiente libre de patógenos específicos en humano no contienen estos patógenos de humano y como tales son patentablemente distintos a las preparaciones parasitarias que se preparan a partir de animales criados en cualquier ambiente SPF.

Huevos : Algunos helmintos intestinales son adquiridos mediante ingestión de huevos viables . Los helmintos se mantienen en animales preparatorios SPF, por ejemplo, perros SPF. Para recolectar huevos, a los animales se les proporciona una dieta especial baja en fibra áspera. A los animales se les administra un purgante oral para inducir la defecación. Se recolectan las heces y se digieren enzimáticamente para liberar los huevos. Los huevos son aislados de las heces licuadas mediante flotación sobre gradientes de densidad, filtración en malla, filtración Visser o elutriación centrífuga. La preservación de los huevos varía según el helminto utilizado. Los huevos de helmintos resistentes a la desecación se secan, se juntan con material inerte, se incorporan en una cápsula entérica y se refrigeran. Los huevos de helmintos susceptibles a la desecación se preservan mediante refrigeración en un medio líquido o agregando crioprotectores y congelándose en nitrógeno líquido. Los huevos viables se lavan, se mezclan con budín fino y deslactosado y otros vehículos en la ubicación de la administración. Los huevos almacenados en un crioprotector basado en glicerol no requieren de lavado. Los huevos de cada lote se analizan para determinar la velocidad de eclosión para determinar la dosificación efectiva. Se analizan los huevos de cada lote para determinar la ausencia de patógenos bacterianos y virales .

Larvas: Algunos helmintos (es decir, anquilostomas) requieren de una fase de maduración en el suelo antes de que puedan colonizar a humanos. Los huevos de estos agentes se incuban bajo condiciones óptimas para madurar el embrión o eclosionar el huevo y proporcionar las formas larvarias. Los pacientes pueden ser inoculados mediante inyección subcutánea o ingestión oral de las larvas viables. Cercarías: Algunos helmintos tienen ciclos vitales complejos que utilizan un hospedero intermedio. El hospedero intermedio despide la forma capaz de colonizar humanos. Las cercarías son la forma para los helmintos tremátodos /es decir, fasciolas) despedidas por los hospederos intermediarios como caracoles . Las cercarías son aisladas de caracoles colonizados cultivados en condiciones SPF. Las cercarías se lavan. Estas pueden preservarse agregando un crioprotector y congelándose en nitrógeno líquido. Las cercarías congeladas o frescas se lavan y se inyectan subcutáneamente para inocular a los pacientes. Las muestras de cada lote se crean para determinar la ausencia de patógenos y para determinar la dosis efectiva. Larva Enquistada: Algunos helmintos (por ejemplo, tenias) forman larvas enquistadas o cisticercos en huéspedes intermediarios. Es la forma de larva enquistada quien inicia la colonización en humanos. Las larvas enquistadas se retiran de los hospederos intermediarios, por ejemplo, ganado, peces o plantas cultivados en condiciones SPF. Los quistes se lavan para liberar el tejido restante del hospedero. Los quistes pueden conservarse agregando un crioprotector y congelándose en nitrógeno líquido. Los quistes se descongelan o se utilizan frescos, se lavan, se mezclan con budín frío y deslactosado u otro vehículo en la ubicación de la administración y se alimenta a los pacientes. La muestras de cada lote se analiza para determinar la ausencia de patógenos y determinar la dosis efectiva.

B . Vacunas de componentes no viables . Los componentes no viables de parásitos helmínticos proporcionan un acondicionamiento Th2 suficiente de respuesta inmunitaria para evitar la patología mediante por Thl . Los componentes no viables se derivan de huevos, larvas o gusanos adultos . Los huevos no viables e intactos de Schistosoma producen una fuerte respuesta Th2. Los huevos son aislados de hígados de animales preparativos · (es decir, hámsteres) criados bajo condiciones SPF. Los huevos son aislados mediante un método modificado descrito originalmente por Coker y Lichtenberg, 1956, Proceedings of the Soc . For. Exp. Biol . & Med. 92: 780. Las modificaciones consisten en el uso de solución salina amortiguada con fosfato con glucosa en vez de 1.7% solución salina para la incubación y los pasos de lavado junto con el tiempo de digestión autolitica. Estos cambios promueven el aislamiento de huevos viables. El método es el siguiente: Se infectan hámster dorados con 1000 a 1500 cercarías. Se deja que la infección madure (6 a 7 semanas) . Se retiran los hígados de los animales y se colocan en 600 mOsm de solución salina amortiguada con fosfato que contiene 5% glucosa, 100 U/ml penicilina y 100 mg/ml estreptomicina. Se les permite a los hígados autodigerirse durante 24 horas a temperatura ambiente. Se homogeniza por impulsos los hígados a una baja velocidad durante 3 minutos en una mezcla Waring fría. Se incuba el homogenizado con colagenasa (2mg/ml) y tripsina (2 mg/ml) a 32 °C durante una hora. Se filtra un producto homogenizado a través de tamices con número de malla 50 y 80-100 para retirar los grumos de tejido y detritus. Se recuperan los huevos del filtrado haciéndose pasar a través de un tamiz de malla 325. Los huevos no pasarán a través del tamiz. Se enjuagan los huevos para que se desprendan del tamiz hacia un tubo de centrífuga de polipropileno con capacidad de 50 mi. Se lavan los huevos mediante una centrifugación repetida a baja velocidad (400 x g) en una solución salina estéril amortiguada con fosfato con 5% de glucosa. Los huevos deberán estar libres de cualquier resto colaginoso. Se cuenta una alícuota de huevos en una cámara Sedwick de 1 mi para determinar la cantidad total de huevos. Los huevos aislados se suspenden en solución salina y se congelan rápidamente en nitrógeno liquido sin crioprotector . Esto mata al huevo. Los huevos descongelados se inyectan subcutáneamente, intramuscular o intravenosamente o en sitios de inflamación Thl para producir fuertes respuestas Th2. también se pueden utilizar huevos de otros helmintos. Las vacunas compuestas también pueden utilizarse y son las que emplean proteínas, lxpidos o carbohidratos aislados de huevos de parásitos. Un ejemplo son los antígenos de huevos solubles de Schistosoma (SEA) . El método para preparar el antigeno de huevo de Schistosoma ha sido previamente descrito por Boros y Warren, 1970, J. of Experimental Med. 132: 488 y a continuación se proporciona resumidamente. Los huevos lavados se vuelven a suspender a una densidad de 50,000 huevos/ml de solución salina amortiguada con fosfato. Estos se transfieren a un homogenizador tisular de vidrio. Los huevos se homogenizan sobre hielo. Para asegurar que todas las cáscaras se rompen y se interrumpen los miracidios, se retira una parte alícuota (5 mi) para inspección microscópica. Se transfiere el producto homogenizado a tubos de ultracentrifugadora . Se centrifuga a 100, 00 X g durante dos horas a 4°C. Se recupera la fracción acuosa (SEA) y se determina el contenido de proteína. Se almacenan los SEA en pequeñas partes alícuotas a -70°C. Este método puede requerir de modificación para aislar los productos de huevos parasitarios que promueven con mayor fuerza el acondicionamiento Th2, es decir, para lograr una concentración efectiva óptima, (100 µg SEA ó 100,000 huevos/animal) . Los huevos o componentes solubles de huevos se utilizan para iniciar respuestas Th2 o para estimular respuestas Th2 previamente iniciadas mediante la colonización con helmintos viables . Los huevos o sus componentes se analizan para confirmar la ausencia de patógenos y endotoxina . Las vacunas compuestas también pueden desarrollarse a partir de larvas y gusanos adultos de parásitos helmínticos . Las larvas o lombrices son aisladas a partir de animales preparativos cultivados en condiciones SPF. Las vacunas que emplean organismos intactos no viables o proteínas, lípidos o carbohidratos aislados de helmintos se preparan y utilizan en forma similar a la previamente descrita para huevos de helminto . En la presente invención también se abarcan vacunas que contienen fracciones o subfracciones de parásitos helmínticos así como vacunas que contienen proteínas aisladas, polinucleótidos , carbohidratos, lípidos, etc., derivados de parásitos helmínticos según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe en Williams et al., 1994, Leukocytes of patients with Schistosoma mansoni respond with a Th2 pattern of a citokine production to mitogen or egg antigens but with a ThO pattern to worm antigens . J. Infect .

Dis. 170: 946; Xu-Amano et al . , 1993, Helper T cell subsets for immunoglobulin A responses: oral immunization with tetanus toxoid and cholera toxin as adjuvant selectively induces Th2 cells in mucosa associated tissues. J. Exp. Med. 178: 1309; Ausiello et al . , 2000, Cell mediated immunity and antibody responses to Bordetella pertussis antigens in children with a history of pertussis infection and in recipients of an acellular pertussis vaccine. J. Infect. Dis., 181: 1989. Por ejemplo, se puede preparar las fracciones o subfracciones según el método descrito por Thaumaturgo et al . (2001, Preliminary Analysis of Sml4 in Distinct Fractions of Schistosoma mansoni Adult Worm Extract, Mem. Inst . Oswaldo Cruz Vol. 96 Suplemento Vol . 96, Suplemento: 79-83, incorporado aquí por referencia en su totalidad) . En este método, los parásitos S. mansoni se obtienen mediante perfusión retrógrada con solución salina eparinizada (solución 0.85% NaCl) , 45 días después de la infección (Pellegrino y Sigueira 1956, Técnica de perfusao para colheita de Schistosoma mansoni em cobaias experimentalmente infectadas. Rev Bras Mal D Trop 8: 589-597) y se utiliza para preparar los, diferentes extractos. -Preparación de extracto derivado de lombriz adulta (SE) - Los parásitos se enjuagan en PBS . Luego se permite que las lombrices vivan y se mantengan a temperatura ambiente (28°C a 30°C) en PBS fresco (solución salina amortiguada con fosfato) durante 2-3 horas y se congelan a -20°C. Después de descongelarse, las suspensiones PBS de las lombrices (1 g lombrices/10 mi PBS) se filtran a través de una malla de alambre y se centrifugan a 10,000 g durante una hora a 4°C (Tendler y Scapin 1981, Schistosoma mansoni antigenic extracte obtained by different extraction procedures . Mem Inst Oswaldo Cruz 76: 103-109; Tendler et al. 1982, Immunogene and protective activity of an extract of Schistosoma mansoni, Mem Inst Oswaldo Cruz 77: 275-283). El contenido proteico de SE fue evaluado mediante el método de Lowry (Lowry et al. 1951) y los lotes en existencia que contienen 1 mg/ml se almacenan a -20°C. Se preparan extractos de hembra y macho según la misma metodología, con parásitos separándose inmediatamente después de la perfusión. La preparación de una "fracción" de liberación rápida de extracto derivado de lombriz adulta (SEi) - preparación SEi que corresponde al paso inicial de SE: después de la perfusión como se describe para SE, las lombrices vivas se incuban durante 2-3 horas a temperatura ambiente (28°C a 30°C) en PBS. Después, las lombrices adultas se filtran de la solución de incubación (SE) en un tamiz de alambre. Preparación de SE2- Las lombrices de adultas restantes de la preparación inicial SE se vuelven a almacenar congeladas (-20°C) en PBS durante una semana (1 g lombrices/10 mi PBS) . Después de descongelarse, las suspensiones PBS se filtran a través de una malla de alambre y se centrifugan a 10,000 g durante una hora a 4°C. Los antigenos parasitarios también pueden extraerse como se describen en la Figura 1 de Thaumaturgo et al . (supra) (Reproducido como Figura 23) . Alternativamente, se pueden preparar antígenos parasitarios como se describe en Deedler et al. (1980. Applicability of different antigen preparations in the enzyme-linked immunosorbent assay for schistosomiasis mansoni . Am. J. Trop . Med. Hyg. 29: 401-410). Por ejemplo, los antígenos pueden prepararse a partir de SWAP preparada como fluidos de sobrenadante soluble de homogenizados de solución salina amortiguada de la etapa del ciclo de vida respectivo (Goes et al. 1989, Production and characterization of human monoclonal antibodies against Schistosoma mansoni. Parasite Immunol 11: 695-711). El SWAP se fracciona mediante cromatografía de intercambio anionico sobre FPLC cromatografía rápida de proteínas) , como se describe previamente (Hirsch y Goes 1996, Characterization of fractionated Schistosoma mansoni soluble adult worm antigens that elicit human cell proliferation and granuloma formation in vitro. Parasitology 112: 529-535). Brevemente, las proteínas se eluyen con 20 mM Tris-HCl, pH 9.6, en un gradiente cada vez mayor de forma gradual hasta 1 M NaCl, interrumpido en intervalos del mantenimiento del gradiente en O, 100, 280, 450, 600 y 700 mM. Las fracciones que fluyen a través se concentran mediante liofilización. El material concentrado se dializó con respecto a 0.15 M de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) , pH 7.4, se esteriliza mediante filtración y se almacena a -70 °C. Se cuantifica el contenido proteico según la microvaloración Bradford (Bradford 1976, A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Analyt Biochem 72: 248-254, incorporado aqui por referencia en su totalidad) . El análisis de las seis fracciones, separadas mediante 10% SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato sódico) bajo condiciones de reducción (Laemmli 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685, incorporado aqui por referencia en su totalidad) , mostraron múltiples bandas de proteínas, la fracción III contiene proteínas en la alta (97 y 100 KDa) , intermedia (52 y 56 Da) y baja (28 y 36 KDa) . Esta fracción se llamó Pili y se utilizó en diferentes ensayos inmunológicos . También pueden prepararse lípidos como se describe en la técnica, por ejemplo de Kleij et al. (1999, Recognition of Schistosome Glycolipids by Immunoglobuin E: Possible Role in Immunity Infection and Immunity, 67: 5946-5950, incorporado aquí por referencia en su totalidad) .

En una modalidad, se extrajeron los lípidos de lombrices adultas de S. mansoni (12 g [peso húmedo] ) y huevos (1.6 g [peso húmedo]) mediante el método descrito por Bligh y Dyer (1989. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J. Biochem. Physiol. 37: 911-917) . La fase orgánica se seca mediante evaporación centrifuga, se disuelve en 10 mi de cloroformo y se aplica una columna de 20 mi de la celulosa TEAE del intercambiador aniónico (Serva, Heidelberg, Alemania) que .se en su forma hidroxilo. Los lípidos se eluyen como se describe por Rouser et al. (1969, Diethyla inoethyl and triethylaminoethyl cellulose column chromatographic procedures for phospholipids, glycolipids, and pigments. ethods E zymol . 14: 272-317) . Según este protocolo, las fracciones contienen los siguientes lípidos: fracción 1, colesterol, glicéridos y otros lípidos neutros; fracción 2, cerebrósidos , diglicéridos de glicerol, fosfatidilcolina y esfingomielina; fracción 3, ceramidpolihexósidos ; fracción 4, sustancias inorgánicas; fracción 5, fosfatidiletanolamina y ácidos grasos libres; fracción 6, fosfatidilserina ; fracción 7, ninguna (paso de lavado) ; y fracción 8, ácido fosfatídico, cariolipina, fosfatidilglicerol , fosfatidilinositol y otros lípidos acídicos . La presencia de glicolípidos en las fracciones 2 y 3 fue confirmada mediante tinción en orcinol de las fracciones lipídicas sobre placas HPTLC (1956. Quanti tative estimation of cerebrosides in nervous tissue. J. Neurochem. 1: 42-53). C. Mantenimiento de Organismos Helmintos: Los helmintos se ciclan a través de animales intermedios y preparativos criados en condiciones SPF. Las muestras de poblaciones- de helmintos se prueban para asegurar la estabilidad fenotípica como tasas de colonización, fecundidad y susceptibilidad a fármacos antihelmínticos.

DOSIFICACIÓN, ADMINISTRACIÓN Y FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Los pacientes en necesidad de tratamiento reciben la forma infectada del parásito (huevo, cercaría o larva) oralmente o parenteralmente dependiendo del ciclo vital natural del parásito seleccionado. Alternativamente, los extractos solubles de lombriz o huevo pueden administrarse oralmente o parenteralmente para inducir respuestas Th2. Con respecto a los esquistosomas y helmintos intestinales y hepáticos, comienzan a producir huevos que aparecen en las heces aproximadamente 30-60 días postinoculación. La cuantificación de los huevos en las heces fue satisfactoria para evaluar la adecuabilidad e intensidad de la infección. Se procesan partes alícuotas de heces mediante flotación en sacarosa para determinar la cantidad total de huevos en cada espécimen. La flotación sobre solución de sacarosa es un método frecuentemente utilizado para aislar huevos de las heces para contar con exactitud como se menciona en Koontz y Weinstock, 1996, Gastroenterology Clinics of N. America, 25: 435. Los compuestos de parásitos helmínticos de la invención pueden formularse para su administración de cualquier forma conveniente y la invención por lo tanto incluye dentro de su alcance a composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto de parásitos helmínticos de conformidad con la invención adaptado para usarse en humanos. Estas composiciones pueden presentarse para su uso de forma convencional con ayuda de cualquiera de los excipientes o portadores farmacéuticos necesarios. El compuesto de parásitos helmínticos según la invención puede formularse para su inyección y, por lo tanto, usarse como vacuna y puede presentarse en forma de dosis unitaria en ampolletas o recipientes de dosis múltiples, si es necesario con un conservador. Las composiciones también pueden tener formas como suspensiones, soluciones o emulsiones de vehículos acuosos u oleosos y pueden contener agentes formuladores como pueden ser agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, el parásito helmíntico puede estar en forma de polvo o reconstituido como un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

Si se desea, esta formulación en polvo puede contener una base no tóxica apropiada haciendo asegurar que el polvo sea reconstituido con agua, el pH de la formulación acuosa resultante es fisiológicamente aceptable. Los compuestos de parásitos helmínticos también pueden formularse como supositorios, por ejemplo que contengan bases convencionales para supositorios como la manteca de cacao y otros glicéridos. Los compuestos de parásitos helmínticos también pueden formularse para su dosificación oral con cargas, portadores y excipientes convencionales . La cantidad de parásito administrado a la persona que lo necesita es una cantidad suficiente -para evitar o tratar una enfermedad autoinmunitaria. Esta cantidad puede variar dependiendo de la enfermedad siendo tratada o evitada y el parásito helmíntico, si se está siendo administrado en forma intacta o como huevo, larva, extracto o cercaría. Normalmente, cuando los parásitos se administran para todas las enfermedades autoinmunitarias mencionadas aquí, la cantidad abarca de aproximadamente 50 hasta aproximadamente 50,000. Más particularmente, esta cantidad puede abarcar desde aproximadamente 500 a 5,000. Cuando se utilizan huevos, de aproximadamente 500 hasta 5,000 pueden utilizarse para el tratamiento contra las enfermedades autoinmunitarias descritas aquí. Cuando se administran extractos, 6 aproximadamente 100 µg hasta 10, 000 g se utilizan para el tratamiento contra enfermedades autoinmunitarias . Cuando se administran larvas y cercarías, las dosis pueden abarcar desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 5,000 en cada caso. Para la prevención o uso como vacuna, las cantidades de parásitos pueden ser de 500-5,000. La dosis de una preparación de parásitos puede monitorizarse mediante la cuantificación de Thl, Th.2 -o las respuestas de células reguladoras. Alternativamente, la dosis puede monitorizarse al evaluar la patología o síntomas de una enfermedad particular como se describe en la técnica o como se describe aquí .

A. Determinación de respuestas Thl y Th2 Con el fin de mostrar la eficacia de la presente invención, se puede distinguir una respuesta Thl y Th2. Meta ali et al., 1996, J. of Immunol . 157: 4546 han demostrado que en ratones, es posible distinguir una respuesta de Thl de una que sea Th2 mediante análisis histológico y mediante análisis de perfiles de inmunoglobulina y citocina. Además, Sandor et al., 1990 J. of Exp . Med . 171: 2171 han demostrado que la expresión en superficie celular de Fcg3 y en moléculas MHC Clase II es en discriminación. En este procedimiento, se examina el colon e intestino delgado mediante histología para determinar el grado de inflamación de la mucosa, eosinofilia y mastocitosis . Estos últimos tipos celulares son indicativos de una respuesta Th2. los nodulos linfáticos mesentéricos (MLN) y el bazo puede disociarse en suspensiones de una sola célula para el cultivo in vitro sobre placas de micropocillos . Se cultivan células (1-2 x 106/pocillo) en un medio PMI completo hasta por 72 horas en presencia o ausencia de antígeno de lombriz o anti-CD3 y luego el sobrenadante se evalúa para determinar las citocinas e inmunoglobulinas . IFN-?, TNFcc e IgG2a caracterizan una respuesta Thl, mientras que IL-4, IL-5 IgE e IgGl tipifican una reacción Th2. También, se puede evaluar el suero para determinar las concentraciones de citocina e inmunoglobulina . Más aún, se examinan los leucocitos inflamatorios dispersos mediante citometría de flujo para determinar la expresión Fcy3 en macrófagos (Thl) y la expresión MHC Clase II en células B (Th2) . Los controles incluyen suero, MLN y bazos de ratones hermanos y de edades iguales que no albergaban parásito. Un análisis similar puede diferenciar una respuesta humana de Thl o de Th2. Se examina el tejido inflamado, se aislan leucocitos de regiones de inflamación y células de sangre periférica. Los leucocitos se cultivan in vitro solos o en presencia de un antígeno o mitógenos parasitarios para estimular la liberación de citocina. IgG2 sustituye a IgG2a.

B. Determinación de actividad de células T reguladoras Se conocen en la técnica los métodos de aislamiento de células T reguladoras de cultivos in vitro o de animales, por ejemplo como se describe en McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol 2002; 23(9): 450-5; Field, A. C, L. Caccavelli, M. F. Bloch y B. Bellon. 2003. Regulatory CD8+ T cells control neonatal tolerance to a TH2-mediated autoiimnunity. Journal of Immunology, 170: 2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. Antigen-induced regulatory T cells in autoim unity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3(3): 223-32; Francois Bach J. Regulatory G cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3(3): 189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. CD4(+) regulatory T cells in autoiimnunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dic; 14(6): 771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep; 23(9): 450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T-cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Ago; 182: 135-48; Read S, Po rie F. CD4 (+) regulatory T cells. Curr Opin Immunol. 2001 Dic; 13 (6) : 644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory T cells and allergic asthma. Microbes Infect . 2001 Sep; 3(11): 899-904; Shevach, E. M. 2002. CD4+ CD25+ suppressor T cells. More guestion than answers . Nature Revie s. Immunology, 2: 389-400; Annacker, O. y F. Powrie, 2002. Homeostasis of intestinal inmune regulation. Microbes & Infection, 4: 567-574; Read, S., V. Malmstrom y F. Powrie . 2000. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25 (+) CD4 (+) regulatory cells that control intestinal inflanmation. J. Ex . Med. 192: 295-302. La actividad de respuesta de células T reguladoras puede cuantificarse mediante un marcador interno, un marcador de superficie celular o un marcador secretado como se describen aquí . Los marcadores internos útiles para células T reguladoras incluyen, entre otros, factores de transcripción como Escurfina, Smad7, Gata3 , Tbet (Tbx21) . Los marcadores superficiales útiles para células T reguladoras incluyen, entre otros, CD4, CD45RB10, CD45Rc, antígeno 4 asociado a linfocito T citplitico (CTLA-4) , CD25, CD103, Ox40, 4-IBB, CD62L, integrina ?ß, péptido asociado a latencia (LAP) o proteína relacionada con la familia de receptores TNF inducidos por un glucocorticoide (GITR) , receptor de quimocina CCR5, TI-ST2. Los marcadores secretados útiles para las células reguladoras T incluyen, entre otros, IL-5, IL-10 y TGFp. C. Ejemplos no Limitantes de Métodos para la Cuantificación in vitro de Marcadores Detección de citocina mediante citometría de flujo: Los esplenocitos, LN o células inflamatorias del intestino en medio completo RPMI se colocan en placas de cultivo tisular de 24 pocilios a 2 x 106 células/pocilio. Las células se incuban durante 4-6 horas en presencia o ausencia de anti-CD3 o antigeno apropiado con brefeldina A a 10 µg/ml. La brefeldina evita la exocitosis de proteínas y promueve la acumulación de citocina dentro de la célula. Para una detección de citocina citoplásmica, las células se fijan en 2% para formaldehído a temperatura ambiente durante 5 minutos después de una tinción superficial para distinguir los subtipos celulares. Las células se lavan y se vuelven a suspender en 50 µ? PBS 0.2% Saponina y 1 µg anticuerpo anti-citocina y se incuban a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después, las células se lavan dos veces en Saponina y se resuspenden en PBS/FCS. La especificidad de la tinción del anticuerpo citocina se confirma mediante el bloqueo previo de células con una cantidad suficiente de anticuerpo no conjugado del mismo isotipo y especificidad de citocina o mediante la incubación de células en presencia de citocina recombinante . Los controles de anticuerpo irrelevante marcados con ficoeritrina (PE) también se incluyen para evaluar la tinción de fondo. Las células se analizan utilizando citometría de flujo. ELISA: ELISA mide las concentraciones de citocina y anticuerpo en el sobrenadante de células a partir de células cultivadas en placas de microtitulación y se manipulan como se describen anteriormente. Varias de estas valoraciones ya sean operacionales dentro de nuestro laboratorio. Las citocinas se valoran usando los anticuerpos monoclonales (mAb) en un ELISA en dos capas . Los mAb anticitocina se purifican mediante precipitación en amonio a partir de sobrenadantes de clones de hibridoma que secretan anticuerpos. Las placas de microtitulación se recubren con 50 µ? de 1 ug/ml anticuerpo de recubrimiento en PBS que contiene Tween 20 (PBS-T) y se incuban a 4°C durante la noche. Después, las células se bloquean mediante la adición de 150 µ? de 10% FCS en PBS incubándose a 37°C durante 30 minutos. Los patrones comprenden citocina recombinante o sobrenadantes que contienen citocina a partir de células del bazo activadas con antigeno o mitógeno mitogénicas de ratones infectados con esquistosomiasis . Se llevan a cabo diluciones de muestras y patrón en RPMI que contiene 10% FCS (RP I completo) en una placa de microtitulación de fondo plano con 96 pocilios por separado y de no menos de 50 µ? de volumen se transfieren a las. placas ELISA que han sido lavadas tres veces en PMS-T. Las muestras se incuban en las placas evaluadas durante una hora a 37°C. los mAb apropiados se conjugan a biotina. Luego de lavar tres veces con PBS-T, cada pocilio recibe 50µ1 de conjugado de anticuerpo-biotina a 0.5 µg/ml en 1% BSA/PBS-T. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante una hora después del lavarse tres veces con PBS-T. Se agrega el conjugado de peroxidasa de rábano-estreptavidina (75 µ?) a 1 µg/ml en 1% BSA/PBS-T y se incuba a temperatura ambiente durante una hora. Las placas se lavan 10 veces en PBS-T fresco y se agregan 100 µ? de sustrato (2.2 ' -azino (ácido 3-etilbenzotiazolinsulfónico) a 1 mg/ml en 44 mM Na2HP0 , 28 mM ácido cítrico y 0.003% ¾02. El producto coloreado se mide a una longitud de onda de 405 nm con una longitud de onda de referencia de 490 nm, utilizando un lector muítiexplorador de microplaca . Se cuantifican las inmunoglobulinas usando ELISA específicos para anti-isotipo . Se utiliza anti-IgM, IgGl, -IgG2a, -IgG2b, -IgG3, -IgA e -IgE de cabra purificado para afinidad como anticuerpos de captura y se absorben en placas de microtitulación de polivinilo flexible a 10 µg/ml. Luego de la adición del sobrenadante de cultivo, la incubación y lavado, se utiliza anti-inmunoglobulina de cabra conjugada con fosfatasa alcalina del isotipo apropiado para detectar la inmunoglobulina de ratón total unida a las placas. Las curvas estándar se generan usando inmunoglobulina purificada. Para medir el anticuerpo especifico para antígeno de parásito, en antlgenos solubles se biotinila y se usa para detectar la inmunoglobulina de ratón unida. Las placas se analizan en un vector ELISA a 410 nm y las concentraciones de la inmunoglobulina total se determinan usando curva estándar y el programa de cómputo "best-fit" . Las concentraciones de antígeno-anticuerpo específico se comparan en relación con las lecturas O.D., ya que el antígeno soluble de parásito no es un antígeno definido que permite la cuantificación precisa . Análisis ELISPOT: Los análisis ELISPOT se establecen para contar linfocitos que secretan ya sea anticuerpos policlonales o citocinas. Se recubren placas de microtitulación revestidas con microcelulosa de 96 pocilios durante la noche a 4°C con 1 µg/ml ya sea con anticuerpos anticitocina o anti-inmunoglobulina en PBS-T. Luego, se bloquean las placas con PBS que contiene 10% FCS y se lavan exhaustivamente con PBS-T. Se incuban diluciones en serie de una sola suspensión celular, comenzando con 5 x 104 células/pocilio, durante 5 horas a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% C02. Las placas se lavan con PBS-T y se recubren con anticuerpos biotinilados anti-inmunoglobulina o anti-citocina durante la noche a 4°C. Después, las placas se lavan y se someten a tratamiento con conjugado de oxidasa-glucosa y estreptavidina durante 2 horas y se lavan nuevamente .

El anticuerpo o citocina secretados por células individuales se visualiza con el sustrato. La reacción colorimétrica finaliza luego de 30 minutos mediante lavado y manchas enumeradas bajo una amplificación 30X. La dilución de células que producen 10-50 manchas/pocilios se utilizan para calcular la cantidad total de células secretadas por muestra. Los testigos incluyen pocilios recubiertos con un anticuerpo de cabra inapropiado o un antígeno inapropiado o se dejan sin recubrir . Una modificación del análisis usando antigenos solubles para recubrir los pocilios permite la cuantificacion también de las células B secretoras de inmunoglobulina, específicas para antigeno parasitario. En breve, por ejemplo, las placas se recubren con antígeno de T. muris adulto a 0.25 µg/pocillo o un antígeno testigo irrelevante apropiado. Las células se agregan a los pocilios luego de lavarse. Después de una incubación apropiada, las pacas se lavan nuevamente y se tratan como se describe con anterioridad.

D. Evaluación de Patología de Enfermedad Se necesita evidencia de la presencia de una enfermedad autoinmunitaria y su cura o alivio para determinar la necesidad de tratamiento y monitorizar el proceso del mismo. Los siguientes procedimientos se utilizan para medir los parámetros clínicos de las enfermedades indicadas . 1. Enfermedad inflamatoria del intestino Evaluación de Inflamación: En ratones, la evidencia clínica de enfermedad incluye pérdida de peso, diarrea, prolapso rectal y evidencia histológica de inflamación intestinal. Por lo tanto, el mejoramiento de estos parámetros significaría la mejora de la enfermedad. Para calificar la inflamación intestinal en modelos experimentales de animales, se retira tejido, se enrolla y sumerge en parafina siguiendo los métodos convencionales. Las secciones se tiñen con hematoxilina y eosina. El grado de inflamación colónica se califica semicuantitativamente de 0 a 4 en forma ciega por un solo patólogo y usando nuestra técnica normalizada usual: 0 = sin inflamación; 1 = bajo nivel de inflamación; 2 = nivel intermedio de inflamación; 3 = alto nivel de inflamación con engrosamiento de la pared; y 4 = infiltración transmural y pérdida de células caliciformes con engrosamiento de la pared. Al contar los mastocitos, las muestras de tejido intestinal de ratones individuales se preparan mediante la técnica de enrollado, se fijan en el fijador Carnoy, se sumergen en parafina y se procesan para su tinción con colorante Azul Alciano y safranina. Sen exploran 50 campos adyacentes de una sección determinada para mastocitos de la mucosa en la lámina propia y capas musculares. Los mastocitos se identifican mediante su tinción granular y transcelular distintiva con Azul Alciano. Todas las muestras se evalúan ciegamente . La actividad de enfermedad en humanos se monitoriza usando diversos criterios clínicos, de laboratorio e histológicos. Existen varios indicios bien establecidos de actividad de enfermedad IBD que monitorizan los parámetros clínicos como frecuencia de diarrea y dolor abdominal. Un índice particularmente útil para la evaluación de la enfermedad de Crohn es el Indice de la Actividad de la Enfermedad de Crohn o CDAI (Best et al., 1976, Gastroenterology, 70: 439) . El CDAI incorpora 8 variables relacionados con la actividad de enfermedad y han sido utilizados en los estudios más recientes de agentes terapéuticos en la enfermedad de Crohn. Incluye la cantidad de heces líquidas o muy suaves, severidad de dolor abdominal o calambres, el bienestar general, la presencia de manifestaciones extraintestinales de la enfermedad, presencia o ausencia de masa abdominal, uso de fármacos antidiarreicos, hematocrito y peso corporal . La puntuación compuesta abarca de 0 a 600. Las puntuaciones menores a 150 indican la remisión y las puntuaciones mayores a 450 indican enfermedad severa . Un cuestionario probado, aceptado y específico para enfermedad sobre la calidad de vida también puede administrarse antes y después del tratamiento para evaluar el progreso terapéutico. El Cuestionario Irvine sobre la Enfermedad Inflamatoria del Intestino es un cuestionario de 32 preguntas (Irvine et al., 1996, The Short Inflammatory Bowel Disea.se Questionnaire: a guality of Ufe instrument for community physicians managing inflammatory bowel disease. CCRPT Investigators . Canadian Crohn's Relapse Prevention Trial. Am J Gastroenterol . 1996, 91(8): 1571-8). Evalúa la calidad de vida con respecto a la función intestinal (por e emplo, heces suaves y dolor abdominal) , síntomas sistémicos (fatiga y patrones de sueño alterado) , función social (asistencia laboral y necesidad de cancelar eventos sociales) y estado emocional (enojado, deprimido o irritable) . La puntuación abarca de 32 a 224, las mayores puntuaciones indican una mejor calidad de vida. Los pacientes en remisión normalmente tienen puntuaciones mayores a 170. La evaluación endoscópica, rayos X e histológicas de actividad de enfermedad intestinal también pueden usarse para la evaluación. Los niveles de proteína C-reactiva y la tasa de sedimentación de células sanguíneas también pueden monitorizarse como indicadores sistémicos de inflamación. 2. Artritis reumatoide Evaluación de la Inflamación: Para ratones con artritis inducida por colágeno, los ratones se examinan en días alternados y se califican sus patas de la siguiente manera: O, normal; 1, eritema e hinchazón moderada confinada a la articulación del tobillo o los pies; 2, eritema e hinchazón moderada que se extienden desde el tobillo hasta el antepie; 3, eritema e hinchazón severa que se extiende desde el tobillo a las articulaciones del metatarso; y 4, deformación anquilosante con hinchazón de la articulación. Estos cuatro parámetros se pueden correlacionar con los cambios histológicos en las articulaciones artríticas. El éxito del tratamiento resulta en una disminución de la puntuación de artritis con un mejoramiento de la histología. Anthony DD. Haqqi T , Collagen-induced arthritis in mice: an animal model to study the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Clinical & Experimental Rheumatology, 17(2): 240-4, 1999. Para artritis inducida por pristano, las articulaciones pueden medirse con un micrómetro para detectar el hinchamiento . En humanos, RA se califica al medir el dolor, limitación de movimiento, eritema e hinchamiento de la articulación. Además, se puede analizar el líquido sinovial para determinar concentraciones de proteína inflamatoria y citocina y para la función y composición de leucocitos según métodos conocidos en la técnica. Las biopsias sinoviales proporcionan análisis histológicos y tisulares según métodos conocidos en la técnica. Felson Dt, Anderson JJ. Boers M. Bombardier C. Furst D. Goldsmith C. Katz L . Lighfoot R Jr.

Paulus H. Strand V. et al . American College of Rheumatology-Preliminary definition of improvement in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatism, 38(6): 727-35, 1995. Schiff M. A. rationale for the use of summary measurements for the assessment of the effects of rheumatoid arthritis therapies. Clinical Therapeutics, 25(3): 993-1001, 2003. 3. Lupus Evaluación de Inflamación: La función y desarrollo normales del sistema inmunitario dependen físicamente de células indeseadas mediante un proceso llamado apoptosis. Las interacciones célula a célula mediante moléculas especificas de superficie celular y sus receptores normalmente desencadenan estos procesos . Uno de estos sistemas se llama FAS y ligando FAS. Los ratones deficientes ya sea en FAS (LPR-/-) o ligando FAS (GLD-/-) desarrollan enfermedades autoinmunitarias como el lupus. Reilly CM, Gilkeson GS . Use of genetic knockouts to modulate disease expression in a murine model of lupus, MRL/lpr mice. Inmunologic Research 25(2): 143-53, 2002. Las colonias de ratones LPR o GLD se mantienen en unidades de alojamiento de microaislamiento bajo condiciones libres de patógenos específicos. Estos ratones pueden desarrollar autoinmunidad de manera espontánea pero es más predecible luego de la inducción artificial . Para inducir enfermedad, se inyectan ratones de 8 semanas de edad con un agente similar al pristano. Dentro de un período de dos meses, los ratones tienen enfermedades autoinmunitarias . Tales criterios clínicos, histológicos e inmunológicos útiles para juzgar la inducción de enfermedad y su mejoramiento tanto en ratones y humanos se conocen en la técnica. Satoh M. Richards HM. Saraheen VM." Yoshida H. Shaw M. Naim JO. ooley PH. Reeves WH. Widespread susceptibility among iríbred mouse strains to the induction of lupus autoantibodies by pristane. Clinical & Experimental Immunology, 121 (2) : 399-405, 2000. 4. Diabetes Mellitus Juvenil Insulinodependiente (Tipo 1) Evaluación de la Inflamación: El ratón NOD desarrolla diabetes mellitus tipo 1 similar a humanos debido a una destrucción autoinmunitaria de las células ß pancreáticas. El examen clínico, bioquímico, inmunológico e histológico según los métodos conocidos en la técnica permite la evaluación de la inducción de enfermedad y su mejoramiento en ratones. Ver, por ejemplo, Adorini L. Gregori S. Harrison LC. Understanding autoimmune diabetes: insights from mouse models. Trends in Molecular Medicine, 8 (1) : 31-8, 2002. 5. Sarcoidosis Evaluación de la Inflamación: En el modelo de embolización con perlas de la inflamación pulmonar, se acoplan antigenos (es decir, Thl ó Th.2) en perlas de Sefarosa, que se embolizan en los pulmones de ratones por medio de inyección en su vena cauda . Normalmente se presensibilizan los animales al antígeno acoplado. El sistema inmunitario del hospedero resulta de la especie inmunitaria vigorosa a la perla extraña. Estas respuestas inflamatorias focalizadas, que pueden durar varias semanas, pueden examinarse histológicamente debido a su tamaño. También, pueden aislarse a partir de tejido y estudiarse para determinar la composición celular y producción de citocina. Más aún, los nodulos linfáticos hilares y los bazos están fácilmente disponibles para la experimentación. Ver, por ejemplo, Kunkel SL. Lukacs NW. Strieter RM. Chensue SW. Animal models of granulomatous inflammation. Seminars in Respiratory Infections, 13(3): 221-8, 1998. La sarcoidosis, una enfermedad en humanos, normalmente implica el pulmón. La determinación de sarcoidosis y derivado de enfermedad pueden lograrse mediante métodos conocidos en la técnica, las pruebas de función pulmonar pueden evaluar la implicación del pulmón y la función. También, un lavado bronquiolar obtiene células inflamatorias que se han infiltrado al área bronquial durante los procesos inflamatorios . Estas células pueden estudiarse para determinar su composición y función. Los infiltrados pulmonares y la linfadenopatía hilar son características de la sarcoidosis. Por lo tanto, los barridos CT o las radiografías del pecho pueden ayudar a . evaluar la actividad de la enfermedad. Las pruebas e serológicas como la cuantificación o actividad de la enzima convertidora de angiotensina se mide en modelos conocidos en la técnica, pueden utilizarse para evaluar el grado y actividad de la enfermedad. Ver, por ejemplo, Hunninghake GW. Costabel U. Abdo M. Baughman R. Cordier JF. du Bois R. Eklund A. Kitaichi M. Lynch J. Rizzato G. Rose C. Selroos O. Semenzato G. Sharma OP. ATS/ERS/WASOG statement on sarcoidosis. American Thoracic Society/European Respiratory Society/World Association of Sarcoidosis and other Granulomatous Disorders. Sarcoidosis Vasculitis & Diffuse Lung Diseases, 16(2): 149-73, 1999. 6. Esclerosis Múltiple Evaluación de la Inflamación: La encefalomielitis autoinmunitaria experimental es inducida en ratones susceptibles mediante inyecciones repetidas de agentes apropiados sensibilizadores de mielina. Los ratones se evalúan clínicamente según los siguientes criterios: 0, sin enfermedad; 1, atonía de cola; 2, debilidad de cuartos traseros; 3, parálisis de cuartos traseros; 4, parálisis de cuartos traseros y debilidad o parálisis de cuartos delanteros; 5, moribundo. Para el análisis histológico, los cerebros y médulas espinales se retiran y fijan en formalina. Las secciones sumergidas en parafina se tiñen y examinan mediante microscopía óptica. Los esplenocitos dispersos y células de otras regiones pueden estudiarse in vitro como se explica anteriormente. Estos parámetros pueden ayudar a medir la disminución o mejoría de la enfermedad, ver por ejemplo, Sewell, Siane, Zing Qing, Emily Reinke, David Elliott, Joel Weinstock, Maytas Sandor y Zsuzsa Fabry. Immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis by helminth ova immunization. International Immunol. 15: 59-69, 2003. En humanos, la actividad de enfermedad MS se evalúa mediante la monitorizacion de la progresión y remisión de los síntomas y signos neurologicos. La medición de desenlaces más ampliamente utilizada se llama La Escala del Estado de Discapacidad Expandida. También se puede utilizar la composición proteica del líquido cerebroespinal y el contenido celular según los métodos conocidos en la técnica para monitorizar la actividad de la enfermedad. Más aún, los estudios MRI en serie muestran nuevas lesiones cerebrales potenciadas por gadolinio. McDonald I , Compston A. Edan G, Goodkin D, Hartung HP, Lublin FD, McFarland HF, Paty D , Polman CH, Reingold SC, Sandberg-Wollheim M, Sibbley W, 8 Thompson A, van der Noort S, Weinshenker BY, Wolinsky JS . Recommended diagnostic Gritería- for múltiple sclerosis: Guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Múltiple Sclerosis. Ann. Neurol . 50(1): 121-7, 2001. Poser C , Paty DW, Scheinberg L, et al. "New Diagnostic Criteria For Múltiple Sclerosis: Guidelines For Research Protocols" . Ann. Neurol. 1983: 13: 227-231. Métodos estadísticos: Algunos datos son analizados por la prueba -t usando una muestra para determinar si los valores promedio difieren significativamente de cero. Las pruebas-t se usaron para analizar diferencias entre medias de grupos. El análisis de la varianza y la prueba t de Dunnett se usa para analizar comparativamente múltiples datos .

MODELOS EXPERIMENTALES EN ANIMALES ÚTILES SEGUN LA INVENCIÓN La siguiente Tabla I ilustra ejemplos no limitantes de modelos experimentales en animales útiles según la presente invención. Los ejemplos adicionales no limitantes pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo como se describe en Current Protocols in Immunology (2001, editores John E. Coligan, Ada M. ruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, publicado por John Wiley & Sons) .

TABLA 1 ENFERMEDADES TRATABLES ALGUNOS MODELOS EXPERIMENTALES EN ANIMALES 1. Enfermedades Colitis TNBS (Neurat et inflamatorias del intestino al., 1995, J. of Exp. Med. 182: 1281) Ratones imitantes IL-2 (Ludviksson et al., 1997, of Immunol. 158 : 104) Ratones mutantes IL-10 (Berg et al., 1996, J. of Clin. Investigation 98 : 1010) Ratones transgénicos TCR (Mombaerts et al., 1993, Cell 75: 274) Células T +CD45 transferidas en ratones SCID (Powrie et al., 1994, Immunity 1: 553) 2. Artritis reumatoide Artritis inducida por pristano en murino (Stasluk et al., 1997, Immunol. 90: 81) Artritis inducida por colágeno en murino (Horsfall et al., 1997, of Immunol. 159: 5687) 3. Diabetes Ratón NOD (Cameron et al., insulinodependiente (Tipo 1997, J. of Immunol. 159: 1) 4686) 4. Lupus Modelos ?? (NZWXNZB) (Santiago et al., 1997, J. of Exp. Med. 185: 65) Ratones GRD, LPR (mutación FAS) (Bhandoola et al., 1994, Int. Rev. of Immunol. 11:231) 5. Sarcoidosis Berylliosis en murino (Pfeifer et al., 1994 Int Archives of Allergy & Immunol. 104: 332) Ratón M. avium (Chen et al., 1994, Science 265: 1237) 6. Esclerosis Múltiple Encefalomielitis alérgica experimental en ratones Owens T, Siram S. 1995, Neurol. Clin. 13(1) : 51-73. Repaso . Degaonkar et al., 2002, J. Magn Reson Imaging 16(2): 153-9. Duckers et al., 1996, Neuroscience 1(2) : 507-21.

EJEMPLOS La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes donde son empleados los siguientes métodos y materiales. Toda la descripción de cada referencia literaria citada de aqui en adelante se incorpora por referencia. emplo 1. Métodos Generales : Animales : Colonias de ratones mutantes 129/SV IL-10-/- y animales testigo apropiados se mantienen y alojan en instalaciones mantenidas como ambientes libres de patógenos específicos según métodos convencionales. Mantenimiento de parásitos, infección en animales, producción de huevos de Schistosoma: El mantenimiento de T. muris y el método usado para infección son como se describen en Else y Wakelin, 1990, Parasitology, vol . 100, parte 3: 479. Los huevos de esquistosoma se colectan de hígados de hámsteres infectados con esquistosoma y se almacenan como se describe en Elliott, 1996, Methods : A Companion to Methods in Enzimology, 9: 255. Cinco hámsteres infectados producen aproximadamente 2 x 106 huevecillos. Preparación de huevos de T. suis: Se utilizaron los siguientes procesos en la preparación y recolección de huevos de T. suis. Se aislaron lombrices adultas de T. suis del colon de cerdos de 7-8 semanas de exposición a una inoculación experimental de T. suis. Los huevos embrionados fueron obtenidos mediante el cultivo de lombrices adultas in vitro y luego los huevos excretados, se separaron del medio de cultivo mediante centrifugación y se colocaron en una solución de dicromato de potasio al 0.2% a 22°C durante 5-6 semanas con burbujeo para obtener una larva infectiva de primera etapa. Los huevos se lavaron dos veces en agua estéril mediante centrifugación a 1,200 x g durante 10 minutos, se contaron y se volvieron a suspender en la cantidad deseada de solución salina basada en una dosis calculada de 2,500. Los huevos se almacenaron para usarse en los pacientes . Los huevos son estables durante al menos un año en el refrigerador. Para asegurar su infectividad, monitorizamos los pacientes para determinar la apariencia de huevos en las heces después de la colonización. La cantidad de huevos en las heces es proporcional a la intensidad de la infestación. También, de tiempo en tiempo, infectamos cerdos con nuestros huevos almacenados para asegurar una infectividad continua. Infección con M. aviu ; Se infectaron ratones inyectando 10s unidades formadoras de colonias (CFU) de Mycobacterium avium (ATCC 25291) de manera intraperitoneal . En el día 60 de infección, algunos ratones también recibieron 35 cercarías de S. mansoni para inducir la infección dual. Infección por Esquistosoma y Aislamiento de Huevos: Algunos experimentos usaron ratones (18-20 g) infectados durante 8-9 semanas con S, mansoni. Los ratones fueron infectados subcutáneamente con 40 cercarías de la cepa Puerto Rico. Dispersión y aislamiento de Granuloma: Los granulomas se forman en ratones infectados con esquistosomas debido a la deposición natural de huevos, que comienza en la secta semana de infección. M. avium también induce granulomas. Estudiamos granulomas hepáticos aislados de ratones infectados como se describe (Elliott, 1996, supra) . Los granulomas se dispersaron para producir suspensiones unicelulares. Los granulomas aislados se agitaron durante 35 minutos a 37°C en un baño de agua con agitador en medio RP I que contiene 5 mg/ml colagenasa. Los granulomas residuales fueron absorbidos y expelidos a través de una jeringa con capacidad de 1 mi para inducir mayor disociación. La suspensión celular resultante se filtra a través de una gasa y se lavaron 3 veces. Se determinó la viabilidad celular mediante exclusión Y-eosina. Este protocolo dio como resultado una elevada producción de células inflamatorias viables que mostraron una expresión conservada de moléculas superficiales . Dispersión MLN y bazo: Se dispersaron los esplenocitos y MLN mediante la sacudida suave y lavado de tejido a través de una malla de acero inoxidable . Los eritrocitos contaminados se lisaron con H20 y las células se lavaron 3 veces en RPMI antes de usar. Inducción de colitis TNBS : La colitis se indujo mediante la instilación rectal de acido trinitrobencensulfónico (TNBS) como se describe por Neurath et al., 1995, J Exp . Med. , 182: 1281. En resumen, se ayunaron durante 30 horas ratones testigo o BALB/c expuestos a parásitos y luego se anestesiaron con metoxiflurano . Se introdujo un catéter de 1.2 mm a una distancia de 4 cm dentro del colon y se instiló 0.1 mi de solución TNBS (5 mg/ml TNBS (Sigma) en 50% etanol) . El animal se sostuvo por la cola durante 3 minutos para asegurar un contacto uniforme con la mucosa colónica. Evaluación de inflamación de la mucosa: Para evaluar la inflamación intestinal, se retiró tejido en los puntos temporales indicados, se enrolló y sumergió en parafina según métodos convencionales. Las secciones se tiñeron como hematoxilina y eosina. Se evaluó el grado de inflamación colónica de manera semicuantitativa de 0 a 4 en forma ciega por un solo patólogo usando nuestra técnica usual normalizada (1 9) . 0 = sin inflamación, 1 = bajo nivel de inflamación, 2 = nivel intermedio, 3 = alto nivel de inflamación con engrosamiento de la pared, 4 = infiltración transmural, pérdida de células caliciformes, engrosamiento de la pared. Aislamiento celular y enriquecimiento de células T: Se pueden aislar las células T reguladoras y Thl, Th2 según métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo se describe en Currents Protocols in Immunology (2001, editores John E. Coligan, Ada M. Kruisheek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, publicado por John Wiley & Sons) . En una modalidad, se preparan suspensiones unicelulares de MLN mediante agitación suave en un medio RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, Nueva York) . Estas células se resuspenden brevemente en agua destilada para lisar eritrocitos. Luego se lavó MLN 3 veces con una gran cantidad de RPMI . Se aislaron LPMC del intestino como se describe a continuación. Se lava exhaustivamente el tejido intestinal con RPMI y se retiran con tijeras todas las placas de Peyer. El intestino se abre longitudinalmente, se cortan pedazos de 5 mm y luego se incuban en 0.5 mM EDTA en solución de Hanks libre de calcio y magnesio durante 20 minutos a 37°C con agitación para liberar las células epiteliales y linfocitos intraepiteliales . Este se repite luego del lavado a conciencia. El tejido se incuba 20 minutos a 37°C en 20 mi RPMI que contienen 10% FCS, amortiguador 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 5 x 105 ß-mercaptoetanol , 1 mM piruvato de sodio, 100 U/ml penicilina, 5 mg/ml gentamicina y 100 mg/ml estreptomicina (todos de GIBCO) y 1 mg/ml colagenasa (Sigma #CO130) . Al final del período de incubación, el tejido se somete a otra interrupción mecánica usando una jeringa con capacidad de 1 mi. Al retirar los restos, las preparaciones LPMC se lavan a través de una gasa prehumedecida y colocada en un embudo con RPMI. Después, se lava una vez el LPMC y se tamizan a través de una columna de lana de náilon prehumedecida de 2 cm y cuidadosamente empacada en una jeringa de 10 mi. Después de lavarse, las células (hasta 2 x 107) se sedimentan en una columna de Percoll con un gradiente 30:70%. Las células se centrifugan a 220 X G a temperatura ambiente durante 20 minutos. El LPMC recolectado de la interconexión 30:70 se lavan y mantienen en hielo hasta usarse. La viabilidad celular es del 90% como se determina mediante exclusión por eosina Y. Para los experimentos de transferencia celular, se aislan células T del tipo MLN mediante selección negativa usando el procedimiento de enriquecimiento SpinSep empleando partículas densas recubiertas con anticuerpo como se describe por el fabricante (#17031, #17032, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá) . Se utiliza citometría de flujo luego de cada separación para asegurar la recuperación apropiada y pureza apropiada (> 98%) de las células T Thy+. Transferencia celular: Se aislan células MLN de ratones IL10-/- colonizados dos semanas con H. polygyrus o de ratones IL10-/- sanos y de edad igual sin esta colonización. Estas células MLN dispersas y sin fraccionar (2 x 107 células/ratón) o células T MLN (5 x 106 células/ratón) se transfieren en ratones IL10-/-colíticos 2 días después de descontinuar el tratamiento de piroxicam mediante inyección ip. La colitis fue evaluada 14 días después . Métodos adicionales para la preparación de células T reguladoras En algunas modalidades de la presente invención, se pueden preparar células T reguladoras a partir de células cultivadas o un animal para su análisis posterior según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en las Solicitudes de Patente de EE. UU. con Números de Serie 2003/017648, 2003/0157057, 2003/0133936, 2003/0064067, 2003/0049696, 2002/0182730, 2002/0090724, 2002/0090357, de las cuales se incorpora su totalidad como referencia. Las fuentes in vivo de poblaciones celulares útiles como fuente de células incluye, entre otros , la sangre periférica, producto sanguíneo por leucoféresis, producto sanguíneo por aféresis, nodulos linfáticos periféricos, tejido linfoide asociado al intestino, bazo, timo, sangre de cordón umbilical, nodulos linfáticos mesentéricos , hígado, sitios de lesiones inmunológicas , por ejemplo, líquido sinovial, páncreas, líquido cerebroespinal, muestras tumorales y lo similar. El donante es preferiblemente un humano, que puede ser fetal, neonato, niño, adulto y puede ser normal, enfermo o susceptible a enfermedades de interés.

Por ejemplo, las células T reguladoras de la presente invención pueden enriquecerse en base a la expresión de marcadores de superficie celular. En una modalidad, las células se seleccionan positivamente para la expresión de CD4 y CD25 y pueden seleccionarse negativamente por la ausencia de CD45RA. Opcionalmente, se pueden utilizar otros marcadores para separar aún más las subpoblaciones de células T reguladoras, incluyendo CD69, CCR6, CD30, CTLA-4, CD62L, CD45RB y CD45R0. Los métodos pueden incluir otros procesos de enriquecimiento o purificación o pasos para aislamiento celular o selección positiva para otros marcadores celulares específicos . En otra modalidad, las células T reguladoras se separan de una mezcla compleja de células mediante técnicas que enriquecen células con características de ser CD4+CD25+, y opcionalmente, CD45RA". Para el aislamiento de células de tejido, se puede utilizar una solución adecuada para dispersión o solución. Esta solución es generalmente una solución salina balanceada, por ejemplo solución salina normal, PBS, solución salina balanceada de Hanks, etc., suplementada convenientemente con suero fetal de bovino, BSA, suero normal de cabra u otros factores naturales en combinación con un amortiguador aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Los amortiguadores convenientes incluyen HEPES, amortiguadores fosfatados, amortiguadores lactados, etc. En otra modalidad, la separación de la población de células T reguladoras, utiliza separación por afinidad para proporcionar una población sustancialmente pura. Las técnicas de separación por afinidad pueden incluir separación magnética, usando perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos, cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o usados junto con anticuerpos monoclonales, por ejemplo, el complemento y citotoxinas y "detección panorámica" con un anticuerpo unido a una matriz sólida, por ejemplo una placa u otra técnica conveniente . Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificadores celulares activados por fluorescencia que pueden tener grados variables de sofisticación, como múltiples canales de color, canales de detección de difracción de luz obtusa o de ángulo agudo, canales de impedancia, etc. Las células pueden seleccionarse con respecto a células muertas empleando colorantes asociados con células muertas (cloruro de propidio, LDS) . Se puede emplear cualquier técnica que no sea innecesariamente nociva para la viabilidad de las células seleccionadas. Los reactivos de señal pueden ser receptores o ligandos específicos para las moléculas de superficie celular indicadas con anterioridad. Además de los reactivos de anticuerpos, se pueden utilizar pares de receptor de células T y antigeno péptido MHC; receptor y ligandos de péptido; moléculas receptoras y efectoras y los similar. Los receptores de células T y anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden producirse mediante animales transgénicos , animales inmunizados, células B de animal o de humano inmortalizadas, células transfectadas con vectores ADN que codifican para el receptor de célula T o anticuerpo, etc. Los detalles de la preparación de anticuerpos y su adecuabilidad pueden usarse como miembros de unión especifica se conocen bien por los expertos en la técnica. Es particularmente interesante el uso de anticuerpos como reactivos de afinidad. En forma conveniente, estos anticuerpos se conjugan con un marcador para usarse en la separación. Los indicadores incluyen perlas magnéticas, que permiten una separación directa, biotina, que puede retirarse con avidina o estreptavidina unida a un soporte, fluorocromos que pueden utilizarse como un clasificador celular activado por fluorescencia o similar, para permitir la fácil separación del tipo celular en particular. Los fluorocromos que tienen uso incluyen ficobiliproteinas , por ejemplo ficoeritrina y aloficocianinas , fluoresceina y rojo de Texas. En frecuencia, cada anticuerpo se maca con un fluorocromo diferente para permitir la clasificación independiente de cada marcador. En una modalidad, se agregan anticuerpos a una suspensión celular y se incuban durante un periodo de tiempo suficiente para unir los antigenos de superficie celular disponibles. La incubación normalmente dura aproximadamente 5 minutos y normalmente menos que aproximadamente 30 minutos. Se desea tener una concentración suficiente de anticuerpos en la mezcla de reacción de manera que la eficacia de la separación no esté limitada por la carencia de anticuerpos, es decir, usando una cantidad saturante de anticuerpos. La concentración apropiada también puede determinarse mediante titulación. En un medio en el cual las células se separan es cualquier medio que mantenga la viabilidad celular. Un medio preferido es solución salina amortiguadora con fosfato que contiene 0.1 a 0.5% BSA. Se comercializan diversos medios y pueden utilizarse según la naturaleza de las células, incluyendo Medio Eagle Modificado de Dulbecco (dMEM) , Solución Salina Básica de Hank (HBSS) , solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (dPBS) , RPMI; medio de Iscove, PBS con 5 M EDTA, etc., frecuentemente suplementados con suero fetal de bovino, BSA, HSA, etc. La intensidad de tinción de células puede monitorizarse mediante citometria de flujo, donde los láser detectan los niveles cuantitativos de fluorocromo (que es proporcional a la cantidad de antígeno de superficie celular unido por los anticuerpos) . La citometria de flujo o FACS también puede utilizarse para separar las poblaciones celulares basándose en la intensidad de tinción del anticuerpo, así como otros parámetros como tamaño de células y difracción de luz. Aunque el nivel absoluto de la invención puede diferir con una preparación particular de anticuerpo y fluorocromo, los datos pueden normalizarse para un control. Las células marcadas se separan conforme a la expresión de CD4 y CD25. Las células separadas pueden recolectarse en cualquier medio apropiado que mantenga la viabilidad celular, normalmente con un colchón de suero en el fondo del tubo de recolección. Se comercializan diversos medios y pueden utilizarse según la naturaleza de las células, incluyendo d EM, HBSS, dPBS, RPMI, medio Iscoves, etc., frecuentemente suplementados con suero fetal de bovino. De esta forma pueden hacerse composiciones muy enriquecidas para determinar la actividad Treg en humanos . La población del paciente es de aproximadamente 70% o más de la composición celular y normalmente aproximadamente 90% o más de las composición de células y puede ser tanto como del 95% o más de la población celular. La población celular enriquecida puede utilizarse inmediatamente. Las células también pueden congelarse, aunque se prefiere congelar las células antes del procedimiento de separación o se puede congelar a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo, luego de descongelarse y ser capaces de reutilizarse . Normalmente las células se almacenan en DMSO y/o FCS, combinadas con medio, glucosa, etc. Una vez descongeladas, las células pueden expandirse mediante el uso de factores de crecimiento, antígeno, estimulación, células dendríticas, etc., para sú proliferación y diferenciación. Cultivo celular: Para un análisis de citocinas, las células se cultivan durante 48 horas en placas de microtitulacion de 96 pocilios (Corning Cambridge, CA) con 200 µ? de medio (5 x 105 células/pocilio) a 37 °C. El medio de cultivo es RPMI que contiene 10% FCS, 25 m amortiguador HEPES, 2 mM L-glutamina, 5 x 105 M ß-mercaptoetanol , 1 mM piruvato de sodio, 100 U/ml penicilina, 5 mg/ml gentamicina y 100 mg/ml estreptomicina (todos de GIBCO) . Para la mayoría de los experimentos, las células se cultivan o con anti-CD3 (2C11, ATCC) y anti-CD28 mAb (P arminogen, San Diego, CA) (cada uno a 1 µg/ml) . Las células T aisladas se cultivan en pocilios previamente recubiertos con anti-CD3 y anti-CD28 mAb. Para el análisis e 1112, las células se cultivan con el oligonucleótido con estructura principal de fosforotioato sintético ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT) (SEQ ID No. 3) que contiene dos (subrayados) pequeños elementos estructurales CpG inmunoestimulantes (13; 14), proporcionados por Coley Pharmaceutical Group (Wellesley, A) y se utilizan a 0.6 para estimular la producción. ELISA para citocinas de murino : Se llevan a cabo ELISA como se describe en la sección VI anterior.

Ejemplo 2. Respuesta Th2 a S. mansoni lentifica una respuesta Thl actual para un antígeno inductor de Thl de bacterias no relacionadas : Está bien establecido que las respuestas inmunitarias de células Th pueden polarizarse en patrones Thl ó Th2. Esta polarización ocurre el día que el IFNy de células Thl inhibe la proliferación de células Th2, mientras que IL-4 e IL-10 de células Th2 inhibe el desarrollo de células Thl. Los recientes experimentos demostraron que la esquistosomiasis altera la respuesta Thl en murino para una infección micobacteriana establecida. Se infectan simultáneamente ratones con M.avium y S. mansoni para evaluar la respuesta del hospedero a estos estímulos inflamatorios distintamente diferentes de Thl y Th2. Los ratones BALB/cAnN desarrollan infección crónica por M. avium cuando se inyectan con este organismo (10s CFU) . Sesenta días después del establecimiento de infección micobacteriana, los ratones se infectan con S. mansoni (40 cercarías). Los ratones se sacrifican 60 días después. Los grupos testigo incluyen ratones que reciben solamente M. avium durante 120 días o solamente S. mansoni durante 60 días . Las células aisladas de granuloma o esplenocitos dispersos de estos animales se cultivan in vitro (4 x 105 células/pocilio) durante 48 horas en presencia o ausencia del antígeno de huevo de esguistosoma (SEA, un fuerte antígeno Th2) derivado de proteína purificada de antígenos micobacterianos (PPD, un fuerte antígeno inductor de Thl) usado a la concentración óptima. Luego del período de incubación, los sobrenadantes se determinan para analizar la producción de inmunoglobulina o citocina usando ELISA. Los datos en las Figuras 1-3 son valores promedio +/- SD de tres experimentos separados . Los esplenocitos de ratones infectados solo con M. avium secretaron grandes cantidades de IFNy seguido de la estimulación con PPDX (antígeno Thl) . Las células del bazo de ratones testigo no infectados no produjeron nada. De forma importante, no se detectó IFNy en cultivos celulares del bazo a partir de ratones concomitantemente infectados (solo con M. avium con respecto a infección concomitante, P<0.001, Figura 1) . El antígeno soluble de huevos de esquistosoma (SEA, Th2) solo estimuló liberación de IL-4 e IL-5 de esplenocitos de animales infectados con S. mansoni. Los ratones singularmente infectados con M. avium no produjeron IL-4 ni IL-5, en respuesta a PPD o SEA. Sin embargo, los esplenocitos de animales infectados simultáneamente si secretaron cierta cantidad de IL-4 luego con estimulación con PPD (Figura 1) . Los granulomas se aislaron a partir de hígados de ratones infectados con M. avium o S. mansoni, en animales que tuvieron fricción concomitante . Los animales con infección concomitante desarrollaron granulomas hepáticos que contienen tanto huevos descritos de esquistosoma como micobacterias fácilmente evidentes a partir de examen histológico. Las células de granuloma dispersas de estos animales se cultivaron in vitro durante 48 horas en presencia o ausencia de SEA o PPD usados a una concentración óptima. Las células de granuloma de ratones son infectados con . avium luego de la estimulación con PPD. No se detectó IFNcc en células de ratones infectados concomitantemente (solo con M. avium con respecto a otros, P<0.001) (Figura 2). SEA estimuló la liberación de IL-4 a partir de células de granuloma de animales infectados con M. avium. SEA no promovió secreción de IFNy bajo ninguna circunstancia. Los ratones singularmente infectados con M. avium no produjeron IL-4 en respuesta a PPD. Sin embargo, las células de granuloma a partir de animales infectados simultáneamente secretaron cierta cantidad de IL-4 seguido de la estimulación completa (Figura 2) . Las respuestas Thl promovieron la producción de IgG2a, mientras que las reacciones por Th2 potencializaron IgGl e IgE . La Figura 3 muestra que ratones infectados con M. avium tuvieron elevados niveles séricos de IgG2a. No obstante, los animales infectados simultáneamente tuvieron concentraciones normales de IgG2a, pero aumentaron los niveles de IgGl y IgE. Estos datos considerados conjuntamente muestran que la respuesta por Th2 a una infección helmíntica puede lentificar la respuesta de hospedero actual incluso a un fuerte organismo inductor de Thl como M. avium.

Ejemplo 3. La colonización con helmintos intestinales o exposición a sus huevos atenúa la inflamación intestinal tipo Thl en colitis de murino inducida por TNBS : La instilación rectal de TNBS en 50% de etanol que induce comparte características con la enfermedad de Crohn. La infamación o colonia que también está caracterizada por células T, CD4+ infiltrantes con una elevada expresión para ARNm e IFNy.- Las células T de la lámina propia de ratones tratados con TNBS secretan 50 veces más IFNy y 5veces menos IL4 que células T de testigos (Neurath et al., 1995, supra) . Las células mononucleares de la lámina propia secretan 30 veces más TNFoc que células de ratones testigo (Neurath et al., 1997, Eur . J . Immunol ¦ , 27: 1743). De forma importante, la colitis por TNBS puede evitarse o mejorarse mediante el tratamiento con anti-IL-12 (Neurath et al., 1995, supra), anti-TNFot (Neurath et al., 1997, supra) o rIL-10 (Duchmann et al., Eur . J . Immunol . , 26: 934). La colitis inducida por TNBS también puede evitarse mediante la exposición oral previa al hapteno (Elson et al., 1996, J. Immunol . , 157: 2174) probablemente al incrementar las respuestas de IL-4, IL-10 y TGFP de la mucosa (Neurath et al., 1996 J. Ex . Med . , 183: 2605) . Está establecido el modelo experimental de colitis TNBS usando ratones BALB/c. La administración recta de TNBS (0.1 mi de 5 mg/ml en existencia) en 50% etanol produce de manera reproducible colitis en estos animales. Para cada uno de los experimentos TNBS mencionados a continuación, se les administra a los animales testigo y a los expuestos a parásitos la misma preparación de TNBS en el mismo dia por el mismo operador que está ciego al grupo de tratamiento. A. La esquistosomiasis inhibe la liberación IFNy de MLN y células del bazo de ratones tratados con TNBS . Se investigó si la infección con esquistosoma alterna la respuesta Thl en animales tratados con TNBS usando un modelo experimental de ratón. Los ratones se infectaron con 35 cercarías de S. mansoni mediante inyección subcutánea. Los gusanos maduran y comienzan a ovar aproximadamente a 6 semanas después de la iniciación de la infección. Dos semanas después (a 8 semanas de la infección) , los ratones fueron tratados con TNBS. La capacidad de MLN y células del bazo para producir IFNy en respuesta a la estimulación de células T (anti-CD3) se examinó varios días después. Como se muestra en la Tabla 2, la infección natural por esquistosoma inhibe fuertemente la liberación de IFNy del nodulo linfático mesentérico (MLN) y células del bazo de ratón tratadas con TNBS. Tabla 2.

Esquistosomiasis inhibe producción IFNy de MLN y células T esplénicas de ratones tratados con TNBS Grupo 0C-CD3 estimuló IFNy (ng/ml) Células MLN Células de bazo ? ratones sin infección 3.2 + 0.7 44.1 + 2.3 se les administró TNBS A ratones infectados con 1.9 + 0.3a 4.2 + 0.4b esquistosoma se les administró TNBS Promedio de IFNy (ng/ml) + SE de determinaciones por triplicado cuantificados por ELISA. a) p<0.1 b)p<0.05. Cultivos que contenían 106 MLN o células del bazo dispersas/pocilio se incubaron en 200 µ? de medio durante 48 horas a 37 °C en presencia de anti-CD3 (1 µg/ml) (2C11) . Los resultados son representativos de dos experimentos .

B. La exposición a huevos de esquistosoma inhibe la liberación de IFNy a partir de células del bazo y MLN de ratones tratados con TNBS . En la esquistosomiasis, es la exposición a los huevos del parásito más que a los gusanos adultos lo que induce una respuesta a Th2. la infección por esquistosomas no induce fuertes respuestas Th2 hasta que los gusanos maduran y comienzan a ovar (Grzych et al., 1991, J. Immunol., 146: 1322) . Los ratones expuestos a huevos intactos de esquistosoma en ausencia de infección natural desarrollan una fuerte respuesta a Th2 (Oswald et al., 1994 J. Immunol . , 153: 1707) . Estas observaciones sugieren que la exposición a huevos de esquistosoma en ausencia de la infección natural puede inducir respuesta a Th2 y suprimir respuestas a Thl. Para examinar si la predisposición a huevos de esquistosoma puede inhibir respuestas a Thl sin requerir infección por gusanos adultos, se inocularon ratones dos veces con 104 huevos de esquistosoma mediante inyección intraperitoneal (ip) en 14 y 4 días antes del desafio rectal con TNBS. Se eligieron estos períodos de tiempo para evitar la deposición continua d huevos que ocurre en una infección natural. Los ratones no expuestos a huevos de parásito pero tratados con TNBS sirvieron como testigos. Los huevos fueron congelados previamente y no fueron viables al momento de la inyección. Nuevamente, la capacidad de MLN y células del bazo para producir IFNy en respuesta a la estimulación de células T (anti-CD3) fue examinada varios días después de la instilación de TNBS. Al igual que una infección natural de esquistosoma (Tabla 1), la exposición intraperitoneal a huevos inhibió la producción de IFNy a partir de células T esplénicas y MLN de ratones tratados con TNBS como se muestra en la Tabla 3. Tabla 3.

La exposición a huevos de esquistosoma inhibe producción de IFNy a partir de células T esplénicas y MLN de ratones tratados con TNBS Grupo 0C-CD3 estimuló IFNy (ng/ml) Células MLN Células de bazo solo TNBS 4.65 + 0.02 47.1 + 3.0 Huevos intraperitoneal y 2.19 + 0.11a 21.8 + 3.4b TNBS Promedio de IFNy (ng/ml) + SD de determinaciones por triplicado cuantificados mediante ELISA a) p<0.5. Cultivos que contienen 106 MLN o células del bazo dispersas/pocilio se incubaron en 200 µ? de medio durante 48 horas a 37°C en presencia de anti-CD3 (1 µg/ml) (2C11) . Los resultados son representativos de tres experimentos separados.

C. La exposición a huevos de esquistosoma protege a los ratones de colitis inducida por TNBS La inhibición del desarrollo de respuesta Thl de la mucosa puede atenuar la colitis inducida por TNBS. La exposición previa a huevos de esquistosoma inhibe la secreción de citocina de Thl por células T esplénicas y MLN. Para examinar si la inyección intraperitoneal de huevos de esquistosoma puede inhibir la colitis inducida por TNBS, los huevos se inyectaron de la siguiente manera siguiendo después un tratamiento con TNBS. El tratamiento con huevos redujo dramáticamente la mortalidad cumulativa en tres experimentos separados del 60% (16/27) en el grupo testigo hasta 22% (6/27) en ratones expuestos a huevos. La inflamación intestinal fue evaluada en una escala de 4 puntos como se detalla en los Métodos Generales con anterioridad. En los ratones que sobrevivieron, el tratamiento con huevos atenuó la inflamación intestinal de 3.1 + 0.5 (promedio + SD) y en el grupo testigo a 1.3 + 0.3 en ratones expuestos a huevos (p<0.05, Figura 4). Los experimentos subsiguientes demostraron que la mayor diferencia entre ambos grupos fue evidente tres dias después del tratamiento con TNBS . Otros experimentos llevados a cabo 14 días después de la instilación con TNBS mostraron que la exposición con huevos proporcionó una protección prolongada. Estos datos indican que los huevos de esquistosoma protegen a los ratones de una colitis fatal en desarrollo mediante inhibición de las respuestas Thl de la mucosa. D. Los helmintos intestinales reducen respuestas Th2 del hospedero Se examina si los parásitos helmínticos diferentes a S. mansoni pueden regular las respuestas Thl en el hospedero. La expresión de inmunidad protectora para nematodos intestinales es dependiente de células T CD4. Los ratones expelen gusanos o limitan la infección al montar una respuesta Th2. La expulsión de gusanos no parece depender exclusivamente de la eosinofilia intestinal ni de la mastocitosis de la mucosa. La IL-4 puede tener una función crítica en la expulsión de lombrices, ya que el tratamiento con el bloqueo de anti-IL-4 o receptor Ab para anti-IL-4 promueve la retención de lombrices (Else et al., 1994, J. Exp. Med. , 179: 347). A diferencia, el tratamiento con IL-4 promueve la eliminación de gusanos (Figura 4) .

T. muris vive en el colon del hospedero murino. Está relacionado con Trichurus trichiura, un parásito llevado por casi un billón de personas durante sus vidas (Grencis et al . , 1996, Gastroenterology Clinics of North America, 25: 579). La ingestión de huevos inicia la infección. Los huevos liberan larvas que penetran el epitelio cecal . Luego maduran para convertirse en lombrices adultas. El parásito no se replica dentro del hospedero, lo cual nos permite controlar la intensidad de la infección (Bancroft et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24: 3113). Se utilizó T. muris para lentificar la sensibilidad de Thl intestinal . La infección por T. muris se establece mediante administración por sonda oral con 250 huevos embrionarios que contienen larvas viables. Los ratones BALB/c pueden albergar T. muris y expeler naturalmente los gusanos dentro de un período de 4 semanas de infección. Los ratones infectados con T. muris o con infección simulada fueron tratados con instilación rectal del TNBS 4 semanas después del inicio de la infección. La colonización anterior con T. muris redujo la mortalidad cumulativa en dos experimentos separados de 58% (7/12) en el grupo altamente infectado a 21% (3/14) en el grupo expuesto a los parásitos. Más aún, los ratones previamente colonizados con T. muris desarrollaron una colitis por TNBS atenuada (0.92 + 0.5, media + SD) en comparación con ratones altamente infectados (3.13 +¦ 0.63, p<0.05) . Estos datos indican que la exposición previa a parásitos intestinales (T. muris) protegido de ratones del desarrollo de colitis severa mediada por Thl.

Ejemplo 4. La interrupción del gen de IL-10 no altera significativamente la interacción de hospedero/parásito La IL-10 es una citocina inmunorreguladora importante que lentifica la activación de macrófagos y la función de células accesorias (Moore et al., 1993, Ann. Rev. Immunol . , 11: 165) . Los ratones que se hicieron deficientes para la producción de IL-10 mediante una interrupción de la especificidad de objetivo hacia el gen (IL-10-/-) desarrollaron enterocolitis crónica influida por la flora colónica ( uhn et al., 1993 Cell , 75: 263) . La inflamación intestinal es atenuada con el tratamiento con el anticuerpo anti-IFNy demuestra que la colitis es resultado de respuestas Thl extremadamente exuberantes al contenido colónico (Berg, et al., 1996, J. Clin. Invest . , 98: 1010). Estos ratones sirven como excelentes modelos de colitis espontánea similar a la enfermedad de Crohn. En este ejemplo, se utilizaron ratones IL-10-/- en las referencias 129 y C57B1/6.

A. Ratones IL-10-/- pueden producir respuestas Th2 a los parásitos Los ratones infectados con el nematodo intestinal N. brasiliensis desarrollan inflamación tipo Th2 a los parásitos con producción de IL-4, IL-5 e IL-10. N. brasiliensis puede colonizar ratones IL-10-/- y estimular una respuesta Th2 intestinal apropiada (Kuhn et al., 1993, supra) . Los ratones IL-10-/- fueron infectados con S. mansoni para examinar si podían producir una respuesta TH2. La Tabla 4 muestra que los esplenocitos de los ratones interrumpidos en el gen IL-10 colonizados durante 8 semanas con S. mansoni segregan grandes cantidades de IL-4 al estimularse con antígeno de huevos de esquistosoma (SEA) o anti-CD3. Los granulomas que rodean los huevos de esquistosoma en estos ratones contienen el alto porcentaje usual (45-50%) de eosinofilos y producen IL-4 e IL-5. Por lo tanto, muestran una efectiva respuesta Th2. Estos datos indican que la exposición a parásitos helmínticos como S. mansoni induce una fuerte respuesta Th2 incluso en ausencia de IL-10. Tabla 4 Esquistosomiasis induce una respuesta Th2 en ratones deficien es de IL10 Células del bazo de un ratón infectado con esquistosoma Citocina No estimulado Estimulado Estimulado con SEA con 0C-CD3 IL-4 (ng/ml) 0.07 + 0.08 0.21 + 0.02 3.94 + 0.012 Tipo silvestre IL-10-/- 0.41 + 0.10 2.56 + 0.23 5.06 + 0.33 Media de IL-4 (ng/ml) + SD de determinaciones por triplicado como se miden mediante ELISA. Los cultivos contienen 106 células/pocilio incubadas durante 48 horas a 37 °C en 200 µ? de medio en ausencia o presencia de antigenos de huevos de esquistosoma (SEA 5 µg/ml) o anti- CD3 (1 µg/ml) (2C11) . Los resultados son representativos de dos experimentos separados usando un mínimo de cuatro ratones tipo silvestre y los que tienen KO anulados. ?. til aconaicionamiento neimimiico ae xn¿ mnioe ex desarrollo natural de la inflamación dé la mucosa en ratones IL-10-/-. Los ratones deficientes en IL-10-/- pueden albergar parásitos helmínticos y reducir una fuerte respuesta Th2. Debido a que los ratones IL-10-/- pueden desarrollar respuestas Th2 y albergar parásitos intestinales, sirven como excelentes modelos para estudiar el efecto de exposición a parásitos una colitis espontánea o actual. IL-10 es una citocina anti-inflamatoria importante. Es posible que la interrupción de este circuito inmunorregulador esencial evite el acondicionamiento Th2 de la mucosa por parásitos. La evidencia actual indica que la infección con T. muris impide la colitis espontánea que se desarrolla en ratones IL-10-/-. Los animales (6 semanas de edad) recibieron T. muris o infección simulada y se sacrif caron 6 semanas después . La inflamación colónica de T. muris o ratones IL-10-/- con infección simulada se calificaron en base a una escala de 4 puntos como se menciona anteriormente en Métodos Generales . La infección anterior con T. muris atenuó la inflamación intestinal de 3.0 + 0.3 (media + SE) en el grupo con infección simulada a 2.2 + 0.1 (p<0.05) en los ratones IL-10-/- expuestos a parásitos . Estos datos demuestran que la exposición previa a parásitos helmínticos atenúa la colitis espontánea en ratones deficientes con IL-10.

Ejemplo 6. Colonización intestinal con Trichuris suis lentifica la actividad de enfermedad en pacientes con enfermedad de Crohn Los pacientes con enfermedad de Crohn se colonizan con Trichuris suis y se evalúa el mejoramiento de la actividad de la enfermedad. T suis, la triquina porcina, está muy relacionada con T. trichiura, un helminto intestinal de humano común en países subdesarrollados . Esta triquina es un potencial agente de terapia. El parásito humano natural Trichuris trichiura es un organismo muy pequeño que reside en el colon fijándose a la mucosa. La colonización ordinaria normalmente no produce síntomas y no causa problemas de salud al hospedero. Este es el caso de millones de gentes donde personas colonizadas mundialmente, pero en una minoría, la infestación grave produce diarrea, sangrado y anemia con deficiencia de hierro. Es de interés que el ciclo vital del parásito es tal que el hospedero no se autoinfecta. Los huevos requieren de una fase en el suelo para su maduración y volverse infecciosos y luego deberán volverse a ingerir para aumentar una carga parasitaria de la persona. Por lo tanto, la infestación por T. trichiura no aumenta dentro del hospedero al menos que se ingieran los huevos del suelo. El agente se trata fácil y efectivamente con tres días de mebendazol. La triquina humana puede utilizarse para colonizar el hospedero y considerarse como un agente experimental para modificar los procesos inmunitarios en la enfermedad de Crohn. Sin embargo, Trichuris trichiura posee un potencial problema sanitario del hospedero . Debido a que el humano es el único hospedero natural, los huevos para uso experimental deberán recolectarse de otros humanos, creando el potencial de transmisión de otras enfermedades infecciosas de humanos al sujeto experimental. Por lo tanto, se utilizó un parásito animal muy relacionado. La triquina porcina {Trichuris suis) tiene el potencial de colonizar temporalmente un hospedero humano sin causar síntomas, enfermedad, una enfermedad infecciosa simultánea o un peligro de salubridad pública. La triquina porcina está muy relacionada con especies que infectan a humano. Ambos organismos son de la misma familia y son morfológicamente similares pero pertenecen a diferentes especies y pueden distinguirse morfológicamente, por su desarrollo y clínicamente. Los huevos de la triquina porcina son ligeramente mayores, tienen una espina morfológicamente diferente y la tasa de desarrollo desde el huevo al adulto es más lenta que en Trichuris trichiura (Beer, 1976, Res . Vet . Sci . , 20: 47) . De manera importante, podemos obtener huevos de parásitos infecciosos a partir de animales SPF . Un suministro de huevos infecciosos de T. suis se produjo como se describe anteriormente. Los huevos se analizaron para confirmar la ausencia de contaminación con patógenos entéricos (por ejemplo, Shigella, Salmonella, Campylobacter, Yershinia y E. coli enterotóxica) y virus (por ejemplo, CMV, HSV, VZV, adenovirus y enterovirus) . Se colonizaron a dos pacientes con enfermedad de Crohn avanzada y resistente a medicamentos con T. suis. Toleraron los parásitos con pocos o ningunos síntomas atribuibles a este organismo. La Tabla 5 muestra que después de elaborar la colonización, ambos participantes tuvieron una caída en valores CDAI, diarrea e índices inflamatorios. Este resultado indica que los helmintos son útiles para regular las respuestas inmunitarias anormales, incluyendo, entre otras la enfermedad de Crohn.

Tabla 5 Los pacientes con enfermedad de Crohn pueden beneficiarse de la colonización con T. suis. Paciente Parámetro Valor de Semana 2b Semana 4 referenciaa 1 CDAIC 250.2 269.9 147.4 Heces/semana 67 101 49 ESRd 17 11 4 Proteina C- <0.5 <0.5 <0.5 reactiva 2 CDAI 341.3 169.6 136.7 Heces/semana 77 27 25 ESR 19 7 ND Proteina C- 0.9 <0.5 <0.5 reactiva a) Valores estables al momento de entrar en el estudio, b) Valores a las 2 y 4 semanas después del inicio de la colonización con T. suis. c) índice de actividad de la enfermedad de Crohn. d) tasa de sedimentación de eritrocitos. ND; no determinado.

E emplo 7. H. polygyrus en la prevención y terapia contra enfermedad inflamatoria del intestino : Para investigar la función de células T reguladoras en una protección inducida por parásitos con respecto a la enfermedad inflamatoria, se llevaron a cabo más experimentos.

En los experimentos utilizaron el helminto intestinal de murino H. polygyrus. H. polygyrus habita el duodeno del hospedero sin causar inflamación o daño al colon o íleon terminal . TNBS en alcohol induce colitis cuando se instila en ratones intrarrectalmente . La Figura 5 muestra que este organismo protege los ratones de colitis inducida por TNBS. La colonización se estableció mediante administración por sonda oral de 200 larvas viables. Los ratones expulsan las lombrices aproximadamente 2 semanas después del inicio de la colonización. Los ratones infectados con H. polygyrus o con infección simulada fueron tratados con instilación rectal de 0.1 mi de TNBS (5 mg/ml EtOH) 4 semanas después del inicio de la colonización de las lombrices. La inflamación fue evaluada con secciones histológicas teñidas 3 días después de la inducción de la colitis. Los experimentos se llevaron a cabo para probar si la colonización helmíntica protege ratones de IBD inducida por TNBS mediante la limitación de la producción intestinal de citocinas Thl como IFNy, TNF e IL12. Las Figuras 6 y 7 muestran que al exponer ratones WT sanos libres de IBD a H. polygyrus hace que la mucosa del intestino distal sea menos capaz de producir IFNy e IL12. Las citocinas reguladoras como IL10, TGFP son capaces de restringir la función de células "Thl" . Se determinó si H. polygyrus promueve la producción de estas citocinas reguladoras dentro de la mucosa intestinal . La Figura 8 muestra que esta lombriz induce la producción de IL10 de la mucosa. IL10 lentifica una serie de mediadores proinflamatorios como TNFa, IL6 e IL12. Por lo tanto, es razonable asumir que la IL10 producida en la mucosa intestinal restringe la función de células "Thl" . La Figura 9 muestra que LPMC de ratones con H. polygyrus producen una cantidad sustancialmente mayor de IFNy cuando se cultivan con anti-IL10R mAb inhibitorio lo que apoya este postulado. Las citocinas inmunorreguladoras potencialmente importantes que pueden proteger de la enfermedad incluyen prostaglandina E2 (PgE2) , IL4, IL5, IL13 y TGF . Las Figuras 10-12 muestran que los helmintos inducen la producción de citocinas E2 protectoras (PgE2) , IL4, IL5, IL13 y TGFP en la mucosa intestinal . Las células T son la principal fuente de IFNy en la mucosa intestinal (Figura 13) . IFNy es importante para la inducción de colitis por TNBS. Los helmintos intestinales inducen células T reguladoras en el MLN que migran hacia el intestino para controlar localmente la reactividad inmunológica de la mucosa. Los experimentos revelaron (Figura 14) que LPMC de ratones WT no infectados y sin tratamiento previo muestran una capacidad disminuida para producir IFNy después de la transferencia de células T MLN de ratones infectados por lombrices . Algunos experimentos utilizan ratones transgénicos con proteína verde fluorescente (GFP) para experimentos de transferencia adoptiva para determinar si los subconjuntos de células T reguladoras MLN entran a la lámina propia intestinal o producen subsiguientemente citocinas reguladoras. Como se observa en la Figura 15, las células T reguladoras MLN putativas de ratones GFP+ que albergan H. polygyrus sí entran a la mucosa intestinal de receptores WT sanos . Este experimento muestra cómo los helmintos protegen de la enfermedad. Se descubrió en ensayos clínicos que la colonización helmíntica mejora IBD activo. También se analizó cómo la colonización con H. polygyrus revierte la colitis murina actual . Los ratones IL-10-/- desarrollan colitis Thl crónica que empeora gradualmente conforme los animales envejecen. Sin embargo, como es verdadero para la mayoría de los modelos IBD de enfermedad espontánea, los ratones IL-10-/- en instalaciones SPF desarrollan colitis con expresión variable solo después de varios meses. El modelo IBD se mejoró para hacerlo más útil para la experimentación. Se descubrió que al alimentar ratones IL-10-/- de cinco semanas de edad con NSAID (piroxicam) durante 2 semanas induce una colitis Thl severa que persiste indefinidamente incluso después de haber finalizado la administración del fármaco. La inflamación es muy predecible de ratón a ratón, involucrando el colon y con severidad uniforme (Figura 16) . Los ratones WT no desarrollan colitis con el tratamiento con piroxicam. Se descubrió que la colonización de ratones IL-10-/- con H. polygyrus resuelve previamente la colitis establecida (Figura 17) . Los ratones C57BL/6 IL-10-/- de cinco semanas de edad recibieron piroxicam (80 mg/250 g de alimentos) . Luego de 2 semanas, se terminó la administración de piroxicam. En este punto temporal, todos los ratones tuvieron colitis. Dos dias después de finalizar la administración de piroxicam, algunos ratones fueron colonizados con 200 H. polygyrus mediante administración por sonda oral, mientras que otros tuvieron una infección simulada. Luego de 2 semanas de colonización, la puntuación de colitis cayó de 3.6+0.4 (SE) en testigos a 0.55+0.5 en ratones colonizados (p = 0.01). La curación de colitis establecida por H. polygyrus está asociada con cambios en la producción de citocinas de LPMC. LPMC aislado de ratones eolíticos con colonización simulada o sin tratamiento previo (sin piroxicam) liberaron cantidades copiosas de IFNy al estimularse con anti-CD3/anti-CD28' (Figura 18) e IL12 al estimularse con oligonucleótido CpG (0.6 µg #1826/ml) . LPMC de ratones IL10-/- colonizados con H. polygyrus y tratados con piroxicam hacen poca o ninguna IFNy detectable mediante ELISA sensible (30 pg/ml) y tienen una liberación restringida de IL12 (Figura 18) . LPMC de ratones IL10-/- eolíticos o sin tratamiento previo no producen IL4 y muy poca IL3 (Figura 19) . A diferencia, LPMC de ratones colonizados con H. polygyrus producen cierta cantidad de IL4 y cantidades copiosas de IL13. La colonización helmíntica revierte la inflamación colonica pero el perfil de citocinas de LPMC no regresa al nivel de ratones IL10-/- sin tratamiento previo. En vez de esto, la colonización resulta en un perfil citocínico novedoso asociado con la cura de colitis. La colonización por H. polygyrus activa los circuitos reguladores en LPMC de ratones IL10-/-. Al mezclar LPMC que produce IFNy de ratones IL10-/- eolíticos 1:1 con LPMC de ratones colonizados con H. polygyrus da como resultado en cultivos simultáneos con producción inhibida de IFNy. H. polygyrus reside en el duodeno pero inicia los circuitos reguladores que revierten la colitis y alteran los perfiles distantes de citocina LPMC. Se demostró que la colonización helmíntica induce o activa las células reguladoras circulantes que residen dentro del compartimiento de células T MLN de ratones colonizados con H. polygyrus. La transferencia de 20 x 106 células MLN o 5 x 106 células T MLN de ratones IL10-/- colonizados con H. polygyrus en animales con colitis IL10-/- establecida da como resultado la resolución de la inflamación (Figura 20) . La Escurfina es un factor de transcripción, codificado por el gen Foxp3, importante para el desarrollo- o actividad de células T reguladoras. Los transcriptos de FoxP3 están aumentados en MLN de ratones colonizados con H. polygyrus en comparación con ratones IL10-/- libres de lombrices según se cuantifica mediante RT-PCR en tiempo real (Figura 21) . Cada disminución en el umbral del ciclo PCR es equivalente a un contenido Foxp3 doble normalizado para ARNm de HPRT . La colonización helmíntica da como resultado en un aumento de 3 a 5 veces la expresión de Foxp3 en células MLN. Foxp3 también aumenta (3 veces) en LPMC de ratones IL10-/- colonizados con H. polygyrus en comparación a los testigos libres de gusanos. Se sabe que solo las células T reguladoras expresan para Foxp3 (Hori, S., T. Nomuta y S. Sakaguchi, 2003. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science, 299: 1057-1061). El aumento en la expresión Foxp3 en MLN y LPMC apoya la hipótesis de que los helmintos inducen las células T reguladoras que manifiestan la resolución de la colitis establecida . Otros transcriptos de factores inmunorreguladores son alterados por la colonización por H. polygyrus. Smad7 es un factor de transcripción que bloquea la señalización de ?T?ß . La colonización por H. polygyrus disminuye en 4.5 veces la expresión de Smad7 para células LN como se mide mediante RT-PCR en tiempo real (Figura 22) . Los transcriptos Smad7 también disminuyen en LPMC . Una disminución de Smadl permitiría que las células fueran más sensibles al TGFp inmunorregulador . Más aun, la disminución para la expresión en Smadl muestra que probablemente múltiples mecanismos reguladores están funcionando para resolver la colitis por IL10-/-. Los cebadores y la sonda para Smad7 son TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC (SEQ ID No . 4), GAGTAAGGAGGAGGGGGAGA (SEQ ID No. 5) y FAM-TTGATCTTCCCGTAAGATTCACAGCAACA-TAMRA (SEQ ID No. 6) . La expresión para el ARNm de Foxp3 y Smad7 se normaliza con respecto a la de HPR . Los cebadores y las sondas para HPRT son TGAAGACGTACTGTAATGATCAGTCAAC (SEQ ID No. 7), GCAAGCTTGCAACCTTAACCAT (SEQ ID No. 8) y TET-TGCTTTCCCTGGTTAAGCAGTACAGCCC-TAMRA (SEQ ID No. 9) . OTRAS MODALIDADES Los ejemplos anteriores demuestran experimentos llevados a cabo y contemplados por los presentes inventores para hacer y llevar a cabo la invención. Se piensa que estos ejemplos incluyen una descripción de técnicas que sirven tanto para apreciar la técnica de la práctica de la invención como para demostrar su utilidad. Se apreciará por los expertos en la técnica que los métodos y modalidades descritas aquí son modalidades preferidas solo en que las numerosas técnicas y métodos generales y equivalentes pueden emplearse para lograr el mismo resultado. Todas las referencias identificadas anteriormente son expresamente y por este medio incorporadas aquí por referencia hasta la extensión que describen, exponen y proporcionan una base para o permiten que las composiciones y/o métodos que puedan ser importantes para la práctica de una o más modalidades de las presentes invenciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para detectar una preparación de parásitos helmínticos que altera la actividad de células T reguladoras, caracterizado, porque el método comprende los pasos de: (a) obtener una preparación de parásitos helmínticos; (b) poner en contacto la preparación de parásitos helmínticos con un objetivo; y (c) determinar el nivel de un marcador interno para la actividad de células T reguladoras en el objetivo después de ponerse en contacto, donde un cambio en el nivel del marcador interno después de haberse puesto en contacto es indicativo de que la preparación de parásitos helmínticos altera la actividad de células T reguladoras.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el marcador interno es un factor de transcripció .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque el factor de transcripción es Escurfxna, Smad7, Gata 3 o Tbet (Tbx21) .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque el nivel del factor de la transcripción se mide a su nivel proteico o de AR m.
5. 5. Un método para detectar una preparación de parásitos helmínticos que altera la actividad de células T reguladoras, caracterizado porque el método comprende los pasos de: (a) obtener una preparación de parásitos helmínticos; (b) poner en contacto la preparación de parásitos helmínticos con un objetivo; y (c) determinar el nivel de un marcador de superficie celular para la actividad de células T reguladoras en el objetivo después de ponerse en contacto, donde un cambio en el nivel del marcador de superficie celular después de haberse puesto en contacto es indicativo de que la preparación de parásitos helmínticos altera la actividad de células T reguladoras .
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el marcador de superficie celular se selecciona a partir del grupo que comprende: CD4, CD45Rbl0, « CD45Rc, antígeno 4 asociado a linfocitos T citplíticos (CTLA-4), 0x40, 4-IBB, CD25, CD103, CD62L, integrina a?ß, péptido asociado a la latencia (LAP) o proteína relacionada con la familia de receptores TNF inducida por glucocorticoide (GITR) , receptor de quimocina (CCR5, T1-ST2.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el nivel de marcador superficial se mide a su nivel proteico o ARNm.
8. 8. Un método para el tratamiento de un animal con enfermedad relacionada con Thl ó Th2 caracterizado porgue es mediante la administración de una preparación de parásitos helmínticos que altera la actividad de células T reguladoras del animal .
9. 9. Un método para monitorizar la eficacia del tratamiento de una preparación de parásitos helmínticos para una enfermedad alérgica autoinmunitaria en un animal, caracterizado porque comprende: (a) administrar una composición que comprende una preparación de parásitos helmínticos o una fracción de la misma al animal; y (b) determinar el nivel de actividad de células T reguladoras en el animal luego de haberse administrado, donde un incremento en el nivel de la actividad de células T reguladoras después de la administración es indicativo de la eficacia del tratamiento de la preparación de parásitos helmínticos .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la actividad de células T reguladoras se mide al determinar el nivel del marcador de células T reguladoras .
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el marcador de células T reguladoras es un marcador interno .
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el marcador interno es Escurfina, Smad7, Gata3 o Tbet (Tbx21) .
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el marcador de células T reguladoras es un marcador de superficie celular.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque el marcador de superficie celular se selecciona a partir del grupo que comprende CD4, CD45Rbl0, CD45Rc, antígeno 4 asociado a linfocitos T citplíticos (CTLA-4), Ox40, 4-IBB, CD25, CD103, CD62L, integrina a?ß, péptido asociado a latencia (LAP) o proteína relacionada con la familia de receptores TNF inducida por glucocorticoide (GITR) , receptor de quimocina CCR5, T1-ST2.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el marcador de células T reguladoras es un marcador segregado .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el marcador segregado es IL4, IL13, IL-5, IL-10 o ?T?ß, PgE2.