MXPA05010823A - Metodos y medios para incrementar la tolerancia de plantas a condiciones de fatiga. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan metodos y medios para incrementar la tolerancia de plantas a fatiga abiotica o a condiciones de crecimiento adversas, que incluyen sequia, altas intensidades de iluminacion, altas temperaturas, limitaciones en los nutrientes y las similares por medio de la reduccion de la actividad de proteinas de PARG endogenas en plantas.

Description

METODOS Y MEDIOS PARA INCREMENTAR LA TOLERANCIA DE PLANTAS A CONDICIONES DE FATIGA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención concierne al uso de poli (ADP-ribosa) glicohidrolasas en plantas, para incrementar la tolerancia de las plantas a condiciones de crecimiento adversas, incluyendo sequías, altas intensidades de luz, altas temperaturas, limitaciones en los nutrientes y las similares. Se proporcionan medios y medios para producir plantas que sean tolerantes a condiciones de fatiga abiótica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Frecuentemente la fatiga abiótica conducirá ya sea directa o indirectamente a daño del ADN de las células de las plantas expuestas a las condiciones adversas, si se deja sin reparar, puede conducir a la muerte celular. La tolerancia a condiciones de fatiga exhibida por plantas es el resultado de la habilidad de las células vegetales expuestas a las condiciones adversas para reducir y/o reparar el daño, y sobrevivir. Las células vegetales, como las células diferentes a las eucarióticas, han desarrollado un sistema de reparación de ADN elaborado. La activación de de poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) por rompimiento de las hebras de ADN es a menudo una de las primeras respuestas celulares al daño al ADN. PARP cataliza la modificación post-translacional de proteínas por adición sucesivamente de moléculas de ADP-ribosa, obtenidas de la conversión del dinucleótido de nicotinamida (NAD), para formar polímeros multi-ramificados que contienen hasta 200 residuos de ADP-ribosa (aproximadamente 40 residuos en plantas). La dependencia de la síntesis de poli(ADP-ribosa) sobre el rompimiento de hebras de ADN, y la presencia de PARP en complejos multi-proteínicos que contienen adicionalmente efectores clave de la reacciones de reparación, replicación y transcripción de ADN, sugiere fuertemente que esta modificación post-translacional está involucrada en el metabolismo de ácidos nucleicos, y en la reparación de ADN. Hay también indicios de que la síntesis de poli(ADP-ribosa) está involucrada en la regulación del ciclo celular y de la muerte celular. La poli(ADP-ribosilación) de proteínas es transitoria en células vivientes. Los polímeros de poli(ADP-ribosa) son rápidamente invertidos, siendo convertidos a ADP-ribosa libre por medio de la actividad exoglicosidasa y endoglicosidasa de poli(ADP-ribosa) glicohidrolasa (PARG; E.C. 3.2.1.143). La mayoría de las unidades proximales de ADP ribosa sobre el receptor de proteínas son hidrolizados por la acción de otra enzima (proteína ligasa ADP-ribosil). Además de este efecto positivo (asociado con la reparación de ADN) de PARP sobre la supervivencia celular, hay también un efecto negativo de PARP. El procedimiento de activación de PARP a partir del daño al ADN está asociado con un rápido abatimiento de los niveles de NAD+, ya que cada unidad de ADP-ribosa transferida por PARP consume una molécula de NAD+. El agotamiento de NAD+ a su vez da como resultado el agotamiento del ATP, porque la re-síntesis de NAD+ requiere al menos (dependiendo de la ruta de la biosíntesis) tres moléculas de ATP por molécula de NAD+. Además, el agotamiento de NAD+ bloquea la actividad de gliceraldehido - 3- fosfato deshidrogenasa, la cual es requerida para re-sintetizar el ATP durante la gllcólisis. Finalmente, NAD+ es un portador clave de electrones necesarios para generar ATP vía el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa. La consecuencia fisiológica del agotamiento de NAD+ y ATP se ha establecido en el contexto de la muerte celular inducida por daño al ADN. Se ha mostrado que la terminación de la apoptosis es absolutamente dependiente de la presencia de ATP y que, en la ausencia de este nucleótido, el tipo de interrupciones de transmisión celular de apoptosis a necrosis. Puesto que la lisis celular asociada con la necrosis genera daño adicional en células de la vecindad, es preferible para organismos multicelulares para favorecer la muerte de células apoptóticas preferiblemente a la necrosis. Por consiguiente, es muy importante considerar el equilibrio delicado de efectos positivos y negativos de la poli(ADP ribosil)ación sobre el potencial de una célula para sobrevivir al daño al ADN. WO00/04173 describe métodos para modular la muerte celular programada (PCD) en células y organismos eucarióticos, particularmente células vegetales y plantas, por introducción de "genes quiméricos moduladores de PCD" que influyen en la expresión y/o la actividad aparente de genes de poli-(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) endógenos. La muerte celular programada puede ser inhibida o provocada. La invención concierne particularmente al uso de secuencias de nucleótidos que codifican a proteínas con actividad PARP para modular PCD, para mejoramiento de la velocidad de crecimiento o para producir células y organismos tolerantes a la fatiga. Los genes que codifican a PARG han sido identificados en numerosos animales tales como Rattus norvegicus (Números de Acceso: NM_031339, NW_043030, AB019366, ), Mus musculus (Números de Acceso: NT_039598, NM_003631 , AF079557), Homo sapiens (Números de Acceso: NT_017696; NMJD03631 , AF005043), Bos taurus (Números de Acceso: NM_174138, U78975) Drosophila melanogaster (Número de Acceso: AF079556). Se ha identificado en plantas, una poli(ADP-ribosa) glicohidrolasa por medio de clonación basado en mapeo del gen de tipo salvaje ¡nactivados en un muíante afectado en la transcripción de genes controlada por cronómetro en Arabidopsis y transición dependiente de fotoperíodos del crecimiento vegetativo par florecer (tej.). La secuencia de nucleótidos del gen puede ser obtenida de las bases de datos de nucleótidos bajo el Número de Acceso AF394690 (Panda y colaboradores, 2002 Dev. Cell. 3, 51-61 ).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención proporciona un método para producir una planta tolerante a condiciones de fatiga que comprende las etapas de proveer a células vegetales con un gen quimérico para crear células vegetales transgénicas, en donde el gen quimérico comprende los siguientes fragmentos de ADN operablemente unidos: un promotor expresable de plantas; una región de ADN, la cual cuando es transcrita produce una molécula de ARN inhibidora de ParG; y una región terminal 3' involucrada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación. Una población de líneas celulares vegetales regeneradas a partir de la célula vegetal transgénica; y una línea vegetal tolerante a la fatiga es identificada en la población de líneas vegetales transgénicas. La molécula de ARN inhibidora de ParG puede comprender una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en la célula vegetal (el gen de ParG endógeno). La molécula inhibidora de ParG puede también comprender una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos del complemento de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en la célula vegetal (el gen de ParG endógeno). En aún otra modalidad, el ARN inhibidor de parG puede comprender una región en el sentido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en la célula vegetal y una región antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos del complemento de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en la célula vegetal, en donde las regiones en el sentido y antisentido son capaces de formar una región de ARN de doble hebra que comprende los al menos 20 nucleótidos consecutivos. El gen quimérico puede comprender adicionalmente una región de ADN que codifica a una ribozima de auto-empalme entre la región de ADN que codifica para la molécula de ARN inhibidora de parG y la región terminal 3'. Las condiciones da fatiga pueden ser seleccionadas de calor, sequía, agotamiento de nutrientes, fatiga oxidativa o condiciones de alta iluminación. En otra modalidad de la invención, se proporciona un método para producir una planta tolerante a condiciones de fatiga que comprende las etapas de: aislar un fragmento de ADN de al menos 100 pb que comprende una parte del gen que codifica a parG de la planta de interés; producir un gen quimérico por unión operablemente de una región promotora expresable de plantas al fragmento de ADN aislado que comprende parte del gen que codifica a parG de la planta en orientación directa en comparación con la región promotora; y al fragmento de ADN aislado que comprende parte del gen que codifica a parG de dicha planta en orientación invertida en comparación con la región promotora, y una región terminal 3' involucrada en la terminación de la transcripción y poliadenilación. Estos genes quiméricos están entonces provistos de células vegetales para crear células vegetales transgénicas. Una población de líneas celulares transgénicas es regenerada a partir de células vegetales transgénicas; y una línea celular tolerante a la fatiga es identificada en la población de líneas vegetales transgénicas. La invención también concierne a células vegetales tolerantes a la fatiga y a plantas obtenidas por medio de este procedimiento. En aún otra modalidad de la invención, se proporciona un método para producir una planta tolerante a condiciones de fatiga que comprende las etapas de proporcionar células vegetales con un gen quimérico para crear células vegetales transgénicas, que comprenden una región de ADN, el cual cuando es transcrita produce una molécula de ARN inhibidora de ParG, por lo cual la región de ADN comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 21 a 100 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos que codifican a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 , 2 o 16 o al menos 21 a 100 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3, 4, 15 o 23 operablemente unida a un promotor expresable de plantas y una región terminal 3' involucrada en la terminación de la transcripción y poliadenilación; regenerar una población de líneas vegetales transgénicas a partir de la célula vegetal transgénica; e identificar una línea vegetal tolerante a la fatiga en la población de líneas vegetales transgénicas. La invención también proporciona moléculas de ADN que comprenden un promotor expresable de plantas, operablemente unido a una región de ADN, la cual cuando es transcrita produce una molécula de ARN inhibidora de ParG, y en la región terminal 35, involucrada en la terminación de la transcripción y poliadenilación. La molécula de ARN inhibidora de ParG puede comprender una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en la célula vegetal (el gen de ParG endógeno). La molécula de ARN inhibidora de ParG puede también comprender una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos del complemento de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en la célula vegetal (el gen de ParG endógeno). En aún otra modalidad, el ARN inhibidor de parG puede comprender una región en el sentido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en la célula vegetal y una región antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos del complemento de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en la célula vegetal, en donde las regiones en el sentido y antisentido son capaces de formar una región de ADN de doble hebra que comprende al menos 20 nucleótidos consecutivos. El gen quimérico puede comprender adicionalmente una región de ADN que codifica a una ribozima de auto-empalme entre la región de ADN que codifica para la molécula de ARN inhibidora de parG y la región terminal 3'. El gen quimérico puede comprender también una secuencia de nucleótidos de al menos 21 a 100 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 , 2 o 16 o al menos 21 a 100 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos de la SEC ID No: 3, 4, 15 o 23.

En aún otra modalidad, la invención concierne a células vegetales que comprenden la molécula de ADN de la invención y plantas que consisten esencialmente de dichas células vegetales, así como también para procedimientos para producir plantas tolerantes a la fatiga, que comprende la etapa de cruzar adicionalmente dichas plantas con otras plantas. También se proporciona las semillas y el material de propagación de dichas plantas que comprende los genes quiméricos de la invención. La invención también concierne a un método para obtener plantas tolerantes a la fatiga que comprende las etapas de someter a una línea celular vegetal o a una planta o línea vegetal, a mutagénesis; identificar aquellas células o plantas que tengan una mutación en un gen de ParG endógeno; someter a las células vegetales o plantas a condiciones de fatiga e identificar a las células vegetales o plantas que toleran dichas condiciones de fatiga mejor que las plantas control. De manera alternativa, células vegetales o plantas pueden ser seleccionados por resistencia a inhibidores de ParG y pueden ser tratados adicionalmente como se describe en este párrafo. La invención concierne a una célula vegetal o planta tolerante a la fatiga que tiene una mutación en el gen de ParG endógeno.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Representación esquemática del ciclo de polimerización/despolimerización de poli-ADP ribosa por medio de la acción de PARP/PARG en una célula eucariótica. Figura 2. Diagrama del contenido de NAD+ y ATP de líneas de Arabidopsis bajo fatiga por alta iluminación. Las cajas obscuras representan el contenido de NAD bajo condiciones de alta iluminación expresado como porcentaje del valor para el contenido de NAD determinado bajo condiciones de baja iluminación. Las cajas claras representan el contenido de ATP bajo condiciones de alta iluminación expresado como porcentaje del valor para el contenido de ATP determinado bajo condiciones de baja iluminación. Figura 3.Diagrama del contenido de NAD+ y ATP de líneas de maíz bajo fatiga por agotamiento de nitrógeno. Las cajas oscuras representan el contenido de NAD mientras que las cajas claras representan el contenido de ATP.

DESCRIPCION DETALLADA DE MODALIDADES PREFERIDAS La invención está basada, por un lado, en la demostración de que células a partir de líneas vegetales resistentes a la fatiga que comprenden un gen quimérico que reducen la expresión del gen PARP, exhibieron un más alto contenido de NAD/ATP bajo condiciones adversas que células a partir de líneas vegetales sin transformar. Por otro lado, se observó que el silenciador de la expresión del gen que codifica a PARG en el tabaco usando un vector de ARN silenciador transitorio basado en virus satélites dan como resultado un fenotipo similar al observado para silenciamiento del gen que codifica a PARP usando el mismo sistema silenciador. Además, el silenciamiento de la expresión del gen que codifica a PARG en plantas, tales como Arabidopsis y tabaco, da como resultado plantas que fueron más resistentes a condiciones de fatiga, tales como por ejemplo, las impuestas por condiciones de mucha claridad. Aunque no se pretende limitar la invención a una modalidad específica de acción, se espera que el silenciamiento de la expresión del gen de PARG da como resultado un fenotipo similar que el silenciamiento de la expresión del gen de PARP por las razones siguientes. Como puede verse de la Figura 1 , la polimerización de ADP ribosa catalizada por PARP, que consume NAD, es seguido por la despolimerización de poli ADP ribosa, catalizada por PARG. La poli ADP ribosilación de la proteína de PARP por sí misma, da como resultado la inactivación de la proteína de PARP. La velocidad a la cual tiene lugar el ciclo de polimerización /despolimerización de ADP ribosa en células vegetales, que conduce al agotamiento de NAD y consecuentemente al agotamiento del ATP puede ser disminuida o detenida por la reducción de la expresión genética de PARP o de la actividad enzimática de PARP. Como un resultado, células vegetales, y plantas que comprenden dichas células son más resistentes a condiciones adversas. Los datos proporcionados en la presente indican que puede obtenerse un efecto similar a través de la disminución de la velocidad o la detención del ciclo por reducción de la expresión genética o de la actividad de PARG. La invención concierne a la reducción de la muerte de células vegetales en respuesta a condiciones ambientales adversas, y consecuentemente a la resistencia a la fatiga mejorada, por alteración del nivel de expresión de genes de ParG, o por alteración de la actividad o de la actividad aparente de proteínas de PARG en las células vegetales. De manera conveniente, el nivel de expresión de genes de ParG puede ser controlado genéticamente por introducción de genes quiméricos que alteran la expresión de genes de ParG, o por alteración de genes endógenos que codifican a PARG, que incluyen las señales de expresión. En una modalidad de la invención, se proporciona un método para producir plantas tolerantes a condiciones de fatiga o a condiciones de crecimiento adversas, que comprende las etapas de: -proporcionar células vegetales con un gen quimérico para crear células vegetales transgénicas en donde el gen quimérico comprende los siguientes fragmentos de ADN operablemente unidos: ?un promotor expresable de plantas; ?una región de ADN, la cual cuando es transcrita produce una molécula de ARN inhibidor de ParG; ?una región terminal 3' involucrada en la terminación de la transcripción y poliadenilación; -regenerar una población de líneas vegetales transgénicas a partir de la célula vegetal transgénica; y -identificar una línea vegetal tolerante a la fatiga en dicha población de líneas vegetales transgénicas. Como se usa en la presente "una planta tolerante a la fatiga" o "una planta tolerante a condiciones de fatiga o a condiciones de crecimiento adversas" es una planta (particularmente una planta obtenida de conformidad con los métodos de la invención), el cual, cuando es sometido a condiciones de crecimiento adversas por un período de tiempo, tales como, pero no limitándose a sequía, temperaturas altas, suministro limitado de nutrientes (particularmente nitrógeno), altas intensidades luminosas, crecen mejor que una planta control no tratada de conformidad con los métodos de la invención. Usualmente, esto será obvio de la apariencia general de las plantas y puede medirse por ejemplo, por incremento de la producción de biomasa, crecimiento vegetativo continuo bajo condiciones adversas o producción de semillas más alta. Las plantas tolerantes a la fatiga tienen un espectro de crecimiento más amplio, es decir, son capaces de resistir un intervalo más amplio de cambios climatológicos y otros cambios abióticos, sin producir desventajas. Bioquímicamente, la tolerancia a la fatiga puede ser aparente cuando el contenido mayor de NAD+-NADH/ATP y la menor producción de especies de oxígeno reactivo de plantas tolerantes a la fatiga en comparación con las plantas control bajo condiciones de fatiga. La tolerancia a la fatiga puede ser también aparente cuando el contenido clorofílico más alto, mayor fotosíntesis y menor fluorescencia clorofílica bajo condiciones de fatiga en plantas tolerantes a la fatiga en comparación con las plantas control bajo las mismas condiciones. Será obvio que no se requiere tampoco que la planta haya crecido continuamente bajo condiciones adversas para que sea obvia la tolerancia a la fatiga. Usualmente, la diferencia en la tolerancia a la fatiga entre una planta o célula vegetal de conformidad con la invención y una planta o célula vegetal control será obvia aún cuando se haya encontrado solamente un período relativamente corto de condiciones adversas, durante el crecimiento. Como se usa en la presente, "una molécula de ARN inhibidora de ParG", es una molécula de ARN que es capaz de disminuir la expresión de los genes endógenos que codifican a PARG, de una célula vegetal, preferiblemente a través de silenciamiento post-transcripcional. Se aclara que aún cuando una molécula de ARN inhibidora de ParG disminuye la expresión de un gen que codifica a PARG a través del silenciamiento post-transcripcional, una molécula de ARN tal puede también ejercer otras funciones en una célula, tal como, por ejemplo, dirigir la metilación del ADN del gen de ParG endógeno, otra vez conduciendo finalmente a expresión disminuida de la expresión del gen que codifica a PARG. También, la expresión de los genes que codifican a PARG endógeno de una célula vegetal puede ser reducida por silenciamiento transcripcional, por ejemplo, por utilización de ARNi o de ARNds llevado a cabo contra la región promotora del gen de ParG endógeno. Como se usa en la presente, un "gen que codifica a PARG" o un "gen de ParG" es un gen capaz de codificar a una proteína ParG (poli ADP ribosa glicohidrolasa), en donde la proteína ParG cataliza la despolimerización de poli ADP-ribosa, por liberación de las unidades ADP ribosa libres ya sea por acción endoglicolítica o bien exoglicolítica. Los genes que codifican a PARG pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 {Arabidopsis thaliana) o de la SEC ID NO: 2 (Solanum tuberosum) o de la SEC ID NO: 16 (Oryza sativa) o partes de las mismas, tales como un fragmento de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3 o la SEC ID NO: 4 o la SEC ID NO: 15 o la SEC ID NO: 23 (Zea mays). No obstante, será claro que el experto en la materia puede aislar secuencias de ADN vanantes de otras especies vegetales; por hibridización con una sonda derivada de los genes que codifican a PARG mencionados anteriormente a partir de especies vegetales, o aún con una sonda derivada de los genes que codifican a PARG mencionados anteriormente a partir de especies animales. Para este fin, las sondas preferiblemente tendrían una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 40 nucleótidos consecutivos de la región codificadora de las secuencias de los genes que codifican a PARG mencionados, preferiblemente de la región codificadora de la SEC ID NO: 3 o la SEC ID NO: 4. Sin embargo, las sondas pueden comprender regiones más largas de secuencias de nucleótidos derivadas de los genes de ParG, tales como de aproximadamente 50, 60, 75, 100, 200 o 500 nucleótidos consecutivos de cualquiera de los genes de ParG mencionados. Preferiblemente, la sonda comprendería una secuencia de nucleótidos que codifica para una de las regiones muy conservadas del dominio catalítico, el cual ha sido identificado por alineación de las diferentes proteínas de PARG de animales. Estas regiones están también presentes en la proteína ParG identificada de Arabidopsis thaliana y comprende la secuencia de aminoácidos LXVDFANXXXGGG (correspondiente a la SEC ID NO: 1 del aminoácido en posición 252 al aminoácido en posición 264; X puede ser cualquier aminoácido) LXVD FANXXXGG GXXXXGXVQ E E I RF (correspondiente a la SEC ID NO: 1 del aminoácido en posición 252 al aminoácido en posición 277) o LXVDFANXXXGGGXXXXGXVQEEIRFXXXPE (correspondiente a la SEC ID NO: 1 del aminoácido en posición 252 al aminoácido en posición 282), TGXWGCGXFXGD (correspondiente a la SEC ID NO: 1 del aminoácido en posición 449 al aminoácido en posición 460) o TGXWGCGAFXGDXXLKXXXQ (correspondiente a la SEC ID NO: 1 del aminoácido en posición 449 al aminoácido en posición 468). Otras regiones conservadas tienen la secuencia de aminoácidos DXXXRXXXXAIDA (correspondiente a la SEC ID NO: 1 del aminoácido en posición 335 al aminoácido en posición 344) o REXXKAXXGF (correspondiente a la SEC ID NO: 1 del aminoácido en posición 360 al aminoácido en posición 369) o GXXXXSXYTGY (correspondiente a la SEC ID NO: 1 del aminoácido en posición 303 al amino en posición 313). La hibridización deberás ser preferiblemente bajo condiciones de severidad. "Las condiciones de hibridización de severidad" como se usa en la presente significa que la hibridización generalmente tendrá lugar si hay al menos 95 % y preferiblemente al menos 97 % de identidad de secuencia entre la sonda y la secuencia objetivo. Ejemplos de condiciones de hibridización de severidad son incubación toda la noche en una solución que comprenda 50 % de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH de 7.6), 5x solución de Denhardt's, sulfato de dextrano aMO %, y 20 pg/ml de ADN portador fragmentado, desnaturalizado tal como ADN de esperma de salmón, seguido por lavado del soporte de hibridización en 0.1 x SSC a aproximadamente 65 °C, por ejemplo por aproximadamente 10 minutos (dos veces). Se conocen bien otras condiciones de hibridización y de lavado y se ejemplifican en Sambrook y colaboradores Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente el capítulo 11. De manera alternativa, los genes que codifican a ParG o partes de los mismos pueden también ser aislados por técnicas basadas en PCR, usando como cebadores oligonucleótidos que comprenden al menos 20 nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos de los genes que codifican a PARG mencionados I el complemento de éstos. Dichos cebadores pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica a una región conservada, como se mencionó anteriormente, o es complementaria a dicha secuencia de nucieótidos. Los oligonucleotidos que pueden ser usados para dichos propósitos pueden comprender la secuencia de nucieótidos ya sea de la SEC ID NO: 5, la SEC ID NO: 6, la SEC ID NO: 7 o la SEC ID NO: 8. Los oligonucleotidos que pueden ser usados pueden también ser degenerados, tal como los oligonucleotidos cebadores de la SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21 o SEC ID NO: 22. Los fragmentos de PCR específicos de genes de ParG puede por ejemplo, ser obtenidos por utilización de combinaciones de los oligonucleotidos que tienen la secuencia de nucieótidos de la SEC ID NO: 5 y la SEC ID NO: 6 usando por ejemplo ADN o ADNc genómico de Arabidopsis como un ADN modelo, o usando combinaciones de los oligonucleotidos que tienen la secuencia de nucieótidos de la SEC ID NO: 7 y la SEC ID NO: 8 usando por ejemplo, ADN o ADNc de papa como un ADN modelo, bajo condiciones de fortalecimiento severas. Las secuencias aisladas pueden codificar a una proteína ParG funcional o a una parte de la misma. Preferiblemente las secuencias aisladas podrían comprender una secuencia de nucieótidos que codifica para una o más de las regiones muy conservadas del dominio catalítico de proteínas de PARG como se menciona en cualquier otra parte. No obstante, para el propósito de la invención no se requiere que las secuencias aisladas codifiquen a una proteína ParG funcional ni que una región codificadora completa sea aislada. Realmente, todo lo que se requiere para la invención es que un gen quimérico pueda ser diseñado o producido, con base en la secuencia identificada o aislada del gen de ParG endógeno de una planta, el cual es capaz de producir un ARN inhibidor de ParG. Están disponibles varios métodos alternativos para producir dichas moléculas de ARN inhibidoras de ParG. En una modalidad, la molécula de ARN inhibidora de ParG que codifica al gen quimérico está basado en la tecnología denominada antisentido. En otras palabras, la región codificadora del gen quimérico comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos del complemento de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG endógeno de la célula vegetal o de la planta, cuya expresión es llevada a cabo para ser reducida. Un gen quimérico tal puede ser construida convenientemente por unión operablemente de un fragmento de ADN que comprende al menos 20 nucleótidos del gen de ParG identificado o aislado, o parte de un gen tal, en orientación contraria, a un promotor expresable de planta y la región de formación del extremo 3' involucrada en la terminación de la transcripción y poliadenilación. Será inmediatamente claro que no hay necesidad de conocer la secuencia de nucleótidos exacta o secuencia de nucleótidos completa de un fragmento de ADN tal de un gen de ParG aislado. En otra modalidad la molécula de ARN inhibidora de ParG que codifica al gen quimérico está basada en la tecnología denominada de co-supresión. En otras palabras, la región codificadora del gen quimérico comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG endógeno de la planta o célula vegetal, cuya expresión se lleva a cabo para ser reducida. Un gen quimérico tal puede ser construido convenientemente uniendo operablemente un fragmento de ADN que comprende al menos 20 nucleótidos del gen de ParG identificado o aislado, o parte de un gen tal, en orientación directa, a un promotor expresable de plantas y la región de formación del extremo 3' involucrada en la terminación de la transcripción y poliadenilación. Otra vez, no se requiere conocer la secuencia de nucleótidos exacta del fragmento de ADN usado del gen de ParG aislado. La eficiencia de los genes quiméricos mencionados anteriormente en la reducción de la expresión del gen de ParG endógeno puede ser adicionalmente mejorada por inclusión de elementos de ADN la cual da como resultado la expresión de moléculas de ARN inhibidora de ParG no poliadenilado, aberrante. Un elemento de ADN tal, adecuado para ese propósito es una región de ADN que codifica a una ribozima de auto-empalme, como se describe en WO 00/01133. La eficiencia de los genes quiméricos anteriormente mencionados en la reducción de la expresión del gen de ParG endógeno de una célula vegetal puede también ser mejorada adicionalmente por inclusión en una célula vegetal simultáneamente de un gen quimérico como el descrito en la presente que codifica a una molécula de ARN inhibidora de ParG antisentido y un gen quimérico como el descrito en la presente que codifica a una molécula de ARN inhibidora de ParG en el sentido, en donde dichas moléculas de ARN inhibidoras de ParG en el sentido y antisentido son capaces de formar una región de ARN de doble hebra por emparejamiento de bases entre los al menos 20 nucleotidos consecutivos mencionados, como se describió en WO 99/53050. Como se describe adicionalmente en WO 99/53050, las regiones de ARN inhibidoras de ParG en el sentido y antisentido, capaces de formar una región de ADN de doble hebra pueden estar presentes en una molécula de ARN, preferiblemente separada por una región espaciadora. La región espaciadora puede comprender una secuencia de intrón. Un gen quimérico tal puede ser construido convenientemente por unión operablemente de un fragmento de ADN que comprende al menos 20 nucleotidos de gen de ParG endógeno identificado o aislado, cuya expresión se lleva a cabo para ser reducida, en una repetición invertida, a un promotor expresable de planta y la región de formación del extremo 3' involucrada en la terminación de la transcripción y poliadenilación. Para lograr la construcción de un gen quimérico tal, pueden usarse los vectores descritos en WO 02/059294. Una modalidad de la invención concierne así un método para obtener una línea vegetal tolerante a la fatiga que comprende las etapas de: - proporcionar células vegetales con un gen quimérico para crear células vegetales transgénicas en donde el gen quimérico comprende los siguientes fragmentos de ADN unidos operablemente: ? un promotor expresable de plantas; ? una región de ADN, que cuando es transcrita produce una molécula de ARN inhibidora de ParG que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en dicha célula vegetal; o ? una región de ADN, que cuando es transcrita produce una molécula de ARN inhibidora de ParG que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos del complemento de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en dicha célula vegetal; o ? una región de ADN, que cuando es transcrita produce una molécula de ARN inhibidora de ParG que comprende una región en el sentido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en dicha célula vegetal y una región antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos del complemento de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en dicha célula vegetal, en donde las regiones en el sentido y antisentido son capaces de formar una región de ARN de doble hebra que comprende los al menos 20 nucleótidos consecutivos mencionados. ? una región terminal 3' involucrada en la terminación de la transcripción y poliadenilación; - regenerar una población de líneas vegetales transgénicas de dicha célula vegetal transgénica; y - identificar una línea vegetal tolerante a la fatiga en dicha población de líneas vegetales transgénicas. Como se usa en la presente "que comprende" es para ser interpretado como que especifica la presencia de aspectos, totalidades, etapas o componentes establecidos, como mencionados en, pero no se excluye la presencia o adición de uno o más aspectos, totalidades, etapas o componentes, o grupos de los mismos. Así, por ejemplo, un ácido nucleico o proteína que comprende una secuencia de nucleotidos o de aminoácidos, puede comprender más nucleotidos o aminoácidos que los actualmente citados, es decir, ser incluidos en una proteína o ácido nucleico más grande. Un gen quimérico que comprende una región de ADN la cual está funcional o estructuralmente definida, puede comprender regiones de ADN adicionales, etc. Así, será claro que la secuencia de nucleotidos mínima de la región de ARN en el sentido o antisentido de aproximadamente 20 nt de la región que codifica a ParG puede estar comprendida en una molécula de ARN más grande, que varía de tamaño de 20 nt a una longitud igual al tamaño del gen objetivo. Las regiones de nucleotidos en el sentido y antisentido mencionadas pueden así ser de aproximadamente desde 21 nt a aproximadamente 5000 nt de largo, tal como 21 nt, 40 nt, 50 nt, 00 nt, 200 nt, 300 nt, 500 nt, 1000 nt, 2000 nt o aún aproximadamente 5000 nt o de longitudes más grandes. Además, no se requiere para el propósito de la invención que la secuencia de nucleotidos de la molécula de ARN inhibidora de ParG usada o la región codificadora del gen quimérico, sean completamente idénticas o complementarias al gen de ParG endógeno cuya expresión es llevada a cabo para ser reducida en la célula vegetal. A la secuencia más larga, para la identidad de secuencia total son menos severos los requerimientos. Así, las regiones en el sentido y antisentido pueden tener una identidad de secuencia total de aproximadamente 40 % o 50 %, o 60 %, o 70 %, o 80 %, o 90 %, o 100 % a la secuencia de nucleótidos del gen de ParG endógeno o el complemento del mismo. No obstante, como se mencionó las regiones en el sentido o antisentido podrían comprender una secuencia de nucleótidos de 20 nucleótidos consecutivos que tienen aproximadamente 100 % de identidad de secuencia a la secuencia de nucleótidos del gen de ParG endógeno. Preferiblemente, el intervalo de aproximadamente 100 % de identidad de secuencia sería de aproximadamente 50, 75 o 100 nt. Para el propósito de esta invención, la "identidad de secuencia" de dos secuencias de nucleótidos relacionadas, expresada como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias alineadas que tienen residuos idénticos (x 00) divididos entre el número de posiciones comparadas. Un espacio, es decir, una posición en la alineación donde un residuo está presente en una secuencia pero no en la otra es considerada como una posición con residuos no idénticos. La alineación de las dos secuencias se efectúa por medio del algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch 1970) la alineación de secuencias auxiliado por computadora, puede efectuarse convenientemente usando programas de "software" estándares tales como GAP, el cual es parte del Wisconsin Package Versión 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA), usando la matriz de evaluación de faltantes con una desventaja de creación de espacios de 50 y una desventaja de extensión de espacios de 3. Es claro que siempre que las secuencias de nucleótidos de moléculas de ARN son definidas con referencia a la secuencia de nucleótidos de moléculas de ADN correspondientes, la timina, (T) en la secuencia de nucleótidos sería reemplazada por uracilo (U). Si se hace referencia a moléculas de ARN o ADN será claro del contexto de la solicitud. Será también claro que genes quiméricos capaces de producir genes de ParG inhibidores para un gen de ParG particular en una variedad vegetal o especie vegetal particular, pueden también ser usados para inhibir la expresión genética de ParG en otras variedades o especies vegetales. Realmente, cuando existe suficiente homología entre la región de ARN inhibidora de ParG y el gen de ParG, o cuando los genes de ParG comparten el mismo intervalo de 19 nucleótidos, la expresión de los otros genes también será sub-regulada. En vista del papel potencial de PARG en el metabolismo del ácido nucleico, puede ser ventajoso que la expresión del gen de PARG endógeno por medio del ARN inhibidor de ParG no sea completamente inhibido. La sub-regulación de la expresión de un gen particular por el gen silenciador a través de la introducción de un gen quimérico que codifica al ARN inhibidor de ParG dará como resultado una población de diferentes líneas transgénicas, que exhiben una distribución de diferentes grados de silenciamiento del gen de ParG. La población contendrá así líneas vegetales transgénicas individuales, en donde el gen de ParG endógeno es silenciado al grado requerido de silenciamiento. Un experto en la materia podrá identificar fácilmente dichas líneas celulares, por ejemplo, sometiendo las líneas celulares a una condición adversa particular, tal como alta intensidad luminosa, fatiga oxidativa, sequía, calor, etc. y seleccionar aquellas plantas que se comportan de manera satisfactoria y sobreviven mejor al tratamiento. Como se usa en la presente, el término "promotor" denota cualquier ADN que sea reconocido y enlazado (directa o indirectamente) por un ARN-polimerasa dependiente de ADN durante la iniciación de la transcripción. Un promotor incluye el sitio de iniciación de transcripción, y sitios de enlace por factores de iniciación de transcripción y ARN polimerasa, y puede comprender otros varios sitios (por ejemplo, mejoradores), en los cuales se puede enlazar proteínas reguladoras de la expresión genética. El término "región reguladora", como se usa en la presente, quiere decir cualquier ADN, que está involucrado en activar la transcripción y controlar (es decir, regular) la duración y el nivel de la transcripción de una secuencia de ADN dada, tal como un ADN que codifica para una proteína o polipéptido. Por ejemplo, una región reguladora 5' (o "región promotora") es una secuencia de ADN localizada desde el extremo 5' hacia el extremo 3' en el sentido de la hebra de ADN dupleto (es decir, 5') de una secuencia codificadora y que comprende el promotor y la secuencia líder sin trasladar -5'. Una región reguladora 31 es una secuencia de ADN localizada desde el extremo 3' hacia el extremo 5' en el sentido de la hebra de ADN dupleto (es decir, 3') de la secuencia codificadora y que comprende señales de terminación (y/o regulación) de transcripción adecuadas, que incluyen una o más señales de poliadenilación. En una modalidad de la invención el promotor es un promotor constitutivo. En otra modalidad de la invención, la actividad del promotor es mejorada por estímulos externos o internos (promotor inducible), tal como pero no se limita a hormonas, compuestos químicos, impulsos mecánicos, condiciones de fatiga biótica o abiótica. La actividad del promotor puede también ser regulada de una manera temporal o espacial (promotores específicos de tejido; promotores reguladores del desarrollo). Para el propósito de la invención, el promotor es un promotor expresable de plantas. Como se usa en la presente, el término "promotor expresable de plantas", significa una secuencia de ADN que es capaz de controlar (iniciar) la transcripción en una célula vegetal. Esto incluye cualquier promotor de origen vegetal, pero también cualquier promotor de origen no vegetal que es capaz de dirigir la transcripción en una célula vegetal, es decir, ciertos promotores de origen viral o bacteriano tales como el CaMV35S (Hapster y colaboradores, 1988). El promotor del virus del trébol subterráneo No. 4 o No. 7 (WO9606932), o promotores del gen de T-ADN pero también promotores específicos de órganos o específicos de tejido que incluyen pero no se limitan a promotores específicos de semillas (por ejemplo, WO 89/03887), promotores específicos de los órganos primordiales (An y colaboradores, (1996), promotores específicos de vástagos (Keller y colaboradores, 1988), promotores específicos de hojas (Hudspeth y colaboradores, 1989), promotores específicos de la mesofilia (tales como los promotores de Rubisco ¡nducibles por la luz), promotores específicos de raíces (Keller y colaboradores, 1989), promotores específicos del tubérculo (Kell y colaboradores, 1989), promotores específicos de tejido vascular (Peleman y colaboradores, 1989), promotores selectivos del estambre (WO 89/10396, WO 92/13956), promotores específicos de la zona de dehiscencia (WO 97/13865) y los similares. Los métodos para la introducción de genes quiméricos en plantas son bien conocidos en el arte e incluyen la transformación mediada por Agrobacterium, liberación por pistola de partículas, micro-inyección, electroporación de células intactas, transformación de protoplasto mediada por polietilen glicol, electroporación de protoplastos, transformación mediada por protoplasto, electroporación de protoplastos, transformación mediada por liposoma, transformación mediada por triquitas de silicio, etc. Las células transformadas obtenidas de esta manera pueden ser entonces regeneradas en plantas fértiles maduras. Las células vegetales transgénicas y las líneas vegetales de conformidad con la invención pueden comprender adicionalmente genes quiméricos que reducirán la expresión de genes de PARP como se describe en WO 00/04173. Estos genes quiméricos adicionales pueden ser introducidos por ejemplo por cruza de las líneas vegetales transgénicas de la presente invención con plantas transgénicas que contienen genes quiméricos que reducen la expresión del gen de PARP. Las células vegetales o líneas vegetales Transgénicas pueden también ser obtenidas por introducción o transformación de los genes quiméricos de la invención en células vegetales transgénicas que comprenden los genes quiméricos que reducen la expresión del gen de PARP o viceversa. Alternativamente, las regiones de ARN inhibidora de PARG y PARP pueden ser codificadas por un gen quimérico y transcritas como una molécula de ARN. Los genes quiméricos de la invención (o las moléculas de ARN inhibidoras correspondientes a las mismas) pueden también ser introducidas en células vegetales de una manera transitoria, por ejemplo, usando los vectores virales, tales como vectores de ARN virales como se describe en WO 00/63397 o WO 02/13964. Habiendo leído esta especificación, será inmediatamente claro para los expertos en la materia, que células vegetales y líneas vegetales mutantes, en donde la actividad de PARG es reducida pueden usarse para el mismo efecto que las células vegetales y líneas vegetales transgénicas descritas en la presente. Los mutantes en el gen de ParG de una célula vegetal o una planta pueden ser fácilmente identificados usando los métodos de cribado conocidos en el arte, con lo que la mutagénesis química, tal como por ejemplo, mutagénesis EMS, combinados con métodos de detección sensibles (tales como por ejemplo HPLC desnaturalizante). Un ejemplo de una técnica tal es el denominado método de Lesiones Locales en Genomas, Inducidas por el Objetivo" ("Targeted Induced Local Lesions in Genomas") como se describe en McCallum y colaboradores, Plant Physiology 123 439-442 o WO 01/75167. No obstante, otros métodos para detectar mutaciones en regiones de genomas particulares o aún alelos, están también disponibles e incluyen cribado de bibliotecas de líneas vegetales mutantes por inserción generadas recientemente o existentes, con lo que conjuntos de ADN genómico de estas líneas celulares mutantes son sometidas a amplificación por PCR usando cebadores específicos para el fragmento de ADN insertado y cebadores específicos para la región genómica o alelo, en donde se espera la inserción (ver por ejemplo Maes y colaboradores, 1999, Trends in Plant Science, 4, págs. 90-96). Las líneas celulares vegetales y líneas vegetales pueden también ser sometidas a mutagénesis por selección por resistencia a inhibidores de ParG, tales como galotaninos. (Ying, y colaboradores (2001 ), Procc. Nati. Acad. Sci. USA 98(21), 12227-12232; Ying, W., Swanson, R. A. (2000), NeuroReport 1 1 (7), 1385-1386. Por consiguiente, están disponibles en el arte métodos para identificar células vegetales y líneas vegetales que comprendan una mutación en el gen ParG. Esta población de células o de líneas vegetales mutantes puede entonces ser sometidas a diferentes fatigas abióticas, y su fenotipo o la supervivencia pueden determinarse fácilmente. Adicionalmente, el contenido de NAD y/o el ATP de las células fatigadas pueden ser determinado y comparados a resultados de dichas determinaciones de células sin fatiga. En células tolerantes a la fatiga, la reducción del contenido de NAD bajo condiciones de fatiga cuando se compararon con células no fatigadas, sería inferior que para las células control correspondientes. Es también un objeto de la invención proporcionar células vegetales y plantas que contienen los genes quiméricos o las moléculas de ARN de conformidad con la invención. Gametos, semillas, embriones, ya sea zigóticos o somáticos, precursores o híbridos de plantas que comprenden los genes quiméricos de la presente invención, los cuales son producidos por métodos de reproducción tradicionales, se incluyen en el alcance de la presente invención. Las plantas obtenidas por medio de los métodos descritos en la presente pueden ser adicionalmente cruzados por medio de técnicas de reproducción tradicionales con otras plantas para obtener plantas precursoras tolerantes a la fatiga que comprenden los genes quiméricos de la presente invención. Se cree que los métodos y medios descritos en la presente son adecuados para todas las células vegetales y plantas, tanto células vegetales y plantas dicotiledóneas como monocotiledóneos que incluyen pero no se limitan a algodón, plantas de Brassica, aceite de semilla de colza, de trigo, maíz, cebada, alfalfa, cacahuate, girasol, arroz, avena, caña de azúcar, soya, hierbas para céspedes, centeno, sorgo, plantas (incluyendo chicoré, lechuga, tomate, zucchini, pimienta campaniforme, planta-huevo, pepino, melón, cebolla, puerro), tabaco, papa, remolacha, papaya, piña, , mango, Arabidopsis thaliana, sino también plantas usadas en horticultura, floricultura o forestales (álamo, pino, eucaliptos, etc.). Los siguientes ejemplos no limitantes describen métodos y medios para incrementar la tolerancia a la fatiga en plantas de conformidad con la invención. A menos que se establezca de otra manera en los ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinantes se llevan a cabo de conformidad con protocolos estándares como se describe en Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y colaboradores (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Los materiales y métodos estándares para el trabajo molecular en plantas se describe en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy publicado al mismo tiempo por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blakwell Scientific Publications, UK. Otras referencias para técnicas estándares de biología molecular incluyen Sambrook y Russell (2001 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology Labfax, Segunda Edición, Academic Press (UK). Los materiales y métodos estándares para reacciones en cadena de polimerasa pueden encontrarse en Dieffenbach & Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson y colaboradores (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primera Edición, Springer erlag, Alemania.

En el transcurso de la descripción y Ejemplos, se hace referencia a las secuencias siguientes: SEC ID NO: 1 , secuencia de aminoácidos de la proteína ParG de Arabidopsis thaüana. SEC ID NO: 2, secuencia de aminoácidos de parte de la proteína ParG de Solanum tuberosum. SEC ID NO: 3, secuencia de nucleótidos que codifica a la proteína ParG de Arabidopsis thaliana. SEC ID NO: 4: secuencia de nucleótidos que codifica la parte de la proteína de ParG de Solanum tuberosum. SEC ID NO: 5: secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido cebador adecuado para amplificación por PCR de la parte de un fragmento de ADN que codifica a la proteína ParG. SEC ID NO: 6: secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido cebador adecuado para amplificación por PCR de la parte del fragmento de ADN que codifica a la proteína ParG. SEC ID NO: 7: secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido cebador adecuado para amplificación por PCR de la parte del fragmento de ADN que codifica a la proteína ParG. SEC ID NO: 8: secuencia de nucleótidos de un cebador oligonucleótido adecuado para amplificación por PCR de la parte del fragmento de ADN que codifica a la proteína ParG. SEC ID NO: 9: secuencia de nucleótidos del vector de T-ADN que contiene el gen quimérico que reduce la expresión de ParG basado en la secuencia del gen de ParG de Arabidopsis. SEC ID NO: 10: secuencia de aminoácidos de la secuencia 1 conservada de las proteínas de PARG. SEC ID NO: 11 : secuencia de aminoácidos de la secuencia 2 conservada de las proteínas de PARG. SEC ID NO: 12: secuencia de aminoácidos de la secuencia 3 conservada de las proteínas de PARG. SEC ID NO: 13: secuencia de aminoácidos de la secuencia 4 conservada de las proteínas de PARG. SEC ID NO: 14: secuencia de aminoácidos de la secuencia 5 conservada de las proteínas de PARG. SEC ID NO: 15: secuencia de nucleótidos de la proteína ParG de Oryza sativa. SEC ID NO: 16: secuencia de aminoácidos de la proteína ParG de Oryza sativa. SEC ID NO: 17: secuencia de nucleótidos de un cebador oligonudeótido PG1 adecuado para amplificación por PCR de la parte del fragmento de ADN que codifica a la proteína ParG. SEC ID NO: 18: secuencia de nucleótidos de un cebador olignonucleótido PG2 adecuado para amplificación por PCR de la parte del fragmento de ADN que codifica a la proteína ParG. SEC ID NO: 19: secuencia de nucleótidos de un cebador oligonucleótido PG3 adecuado para amplificación por PCR de la parte del fragmento de ADN que codifica a la proteína ParG. SEC ID NO: 20: secuencia de nucleótidos de un cebador oligonucleótido PG4 adecuado para amplificación por PCR de la parte del fragmento de ADN que codifica a la proteína ParG. SEC ID NO: 21 : secuencia de nucleótidos de un cebador oligonucleótido PG5 adecuado para amplificación por PCR de la parte del fragmento de ADN que codifica a la proteína ParG. SEC ID NO: 22: secuencia de nucleótidos de un cebador oligonucleótido PG6 adecuado para amplificación por PCR de la parte del fragmento de ADN que codifica a la proteína ParG. SEC ID NO: 23: secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína ParG de Zea mays. SEC ID NO: 24: secuencia de nucleótidos de un vector de T-ADN que comprende un gen quimérico capaz de reducir la expresión de PARG. SEC ID NO: 25: secuencia de nucleótidos de un vector de T-ADN que comprende un gen quimérico capaz de reducir la expresión de PARG.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Análisis de la influencia de la fatiga sobre la eficiencia de la producción de energía de líneas vegetales tolerantes a la fatiga que contienen genes quiméricos que reducen la expresión del gen de PARP Se cultivaron por 5 días sobre un medio de crecimiento, los hipocotilos de plantas de Brassica napus transgénicos que comprenden genes quiméricos que reducen la expresión del gen de PARP como se describe en WO 00/ 04173. Los tejidos extirpados y mantenidos en cultivo se transfirieron entonces al medio líquido que comprende 30 mg/l de aspirina o ácido acetil salicílico (dando como resultado condiciones de fatiga oxidativa) por un día. En experimentos control, los hipocotilos de plantas N90-740 de Brassica napus no transgénicos se cultivaron sobre el mismo medio de crecimiento y luego se incubaron por un día en medio líquido que comprende 30 mg/l de aspirina. Además, los hipocotilos tanto de las líneas transgénicas como de la línea control fueron cultivados sobre el mismo medio de crecimiento sin aspirina. Después del período de cultivo, el contenido de ATP de 125 tejidos extirpados y mantenidos en cultivo se determinó para cada experimento. De manera adicional, se determinó el oxígeno consumido en 3 horas por 125 tejidos extirpados mantenidos en cultivo. Los resultados se resumen en el Cuadro 1. El error estándar de la media fue de menos de 6 %. Mientras que, la proporción de moles de ATP por mg de oxígeno consumido en las plantas control disminuyó en las plantas control cuando se aplicó la fatiga oxidativa, la misma proporción en las líneas vegetales transgénicas tolerantes a la fatiga actualmente incrementaron bajo condiciones de fatiga, y fue considerablemente mayor (aproximadamente 24 %) que en las plantas control. Las líneas transgénicas resistentes a la fatiga mantuvieron así una eficiencia de producción de energía constante, mientras que las líneas control exhibieron una eficiencia decreciente en la producción de energía. Además, la producción de superóxidos, expresada como un porcentaje de la producción de superóxido en plantas control no sometidos a la fatiga oxidativa, no incrementó en las plantas tolerantes a la fatiga sometidos a condiciones de fatiga.

CUADRO 1 Influencia de la fatiga sobre la eficiencia en ia producción de energía de tejidos extirpados de hipocotilos de Brassica napus mantenidos en cultivo 5 días En otro experimento, el contenido de NAD+ y ATP de 4 líneas de Arabidopsis transgénicas diferentes que comprenden genes quiméricos que reducen la expresión del gen de PARP como se describe en WO 00/ 04173, se determinó bajo condiciones de baja y de alta iluminación, y se comparó con los valores obtenidos para una línea control no transformada bajo las mismas condiciones. Las 4 líneas diferentes exhibieron diferentes grados de resistencia a la fatiga que exhibieron por ejemplo por su efectividad para soportar condiciones de calor y/o sequía. Los valores obtenidos para los contenidos de NAD y ATP bajo fatiga por alta iluminación se expresaron como un porcentaje de los valores para los contenidos de NAD y ATP bajo condiciones de baja iluminación, y se graficaron en la Figura 2. Los resultados mostraron que la alta iluminación conduce a una reducción significativa de NAD+ en células vegetales control y en la línea vegetal transgénica, la cual sea al menos resistente a la fatiga. Las líneas vegetales transgénicas más resistentes a la fatiga son, la reducción de NAD menos significativa es bajo condiciones de fatiga por baja iluminación. En otro experimento, el contenido de NAD+ y de ATP de una población segregadora que resultó de una cruza entre líneas de maíz transgénico que comprende genes quiméricos que reducen la expresión del gen de PARP como se describe en WO 00/ 04173 y una línea de maíz no transformada, se determinaron bajo condiciones de agotamiento de nutrientes (nitrógeno), y se compararon con los valores obtenidos para una línea control no transformada bajo las mismas condiciones. La Figura 3 es una representación gráfica de los resultados obtenidos. Las líneas hemizigóticas y azigóticas fueron discriminadas por verificación por la presencia del gen marcador seleccionable. Los contenidos de NAD y de ADP fueron significativamente mayores en el hemizigóticos, las plantas tolerantes a la fatiga en plantas control sin transformar o las plantas azigóticas.

EJEMPLO 2 Construcción de genes quiméricos que reducen la expresión del gen de ParG Para reducir la expresión del gen de PARG por ejemplo en Arabidopsis y plantas relacionadas, se construyó un gen quimérico que es capaz de expresar a un ARNds que comprende tanto regiones en sentido como antisentido que puede formar un ARN de doble hebra. Dicho ARNds es muy efectivo en la reducción de la expresión de los genes con los cuales es compartida la homología de secuencia, por silenciamiento post-transcripcional. El gen quimérico comprende los siguientes fragmentos de ADN: • Una región promotora del virus mosaico del coliflor (CaMV 35S); • Un fragmento de ADN que comprende 163 pb del gen de ParG de Arabidopsis thaliana en orientación directa (No. de Acceso Genbank AF394690 de los nucleótidos en las posiciones 973 a 1135); • Un fragmento de ADN que codifica al intrón 2 del gen pdk de Flaveria; • El fragmento de ADN que comprende 163 pb del gen de ParG de Arabidopsis thaliana en orientación invertida (No. de Acceso Genbank AF394690 en las posiciones 973 a 1135) • Un fragmento del extremo no trasladado 3' del gen de octopin sintetasa de Agrobacterium tumefaciens. Este gen quimérico se introdujo en un vector de T-ADN, entre las secuencias que limitan a la derecha y a la izquierda del T-ADN, junto con un gen marcador seleccionare que proporciona resistencia al herbicida fosfinotricina. Para reducir la expresión del gen de PARG, por ejemplo en papas y plantas relacionadas, se construyó un gen quimérico que es capaz de expresar a un ARNds que comprende tanto una región sentido como antisentido de una secuencia de ADNc de papa, que es capaz de codificar a una proteína que tiene alta identidad de secuencia con la parte N-terminal de la proteína de la proteína de PARG de Arabidopsis. El gen quimérico comprende los siguientes fragmentos de ADN: • Una región promotora del virus mosaico de Coliflor (CaMV 35S); · Un fragmento de ADN que comprende una secuencia de al menos 100 pb del ParG homólogo de Solanum tuberosum en orientación directa (No. de Acceso Genbank BE340510); • Un fragmento de ADN que codifica al intrón 2 del gen pdk de F lave ría; · El fragmento de ADN que comprende la secuencia de al menos 100 pb del ParG homólogo de Solanum tuberosum en orientación invertida (Número de Acceso Genbank BE3405 0); • Un fragmento del extremo 3' sin trasladar del gen de la octopin sintetasa de Agrobacterium tumefaciens. Este gen quimérico es introducido en un vector de T-ADN, entre las secuencias de los bordes izquierdo y derecho de T-ADN, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia al herbicida fosfinotricin.

EJEMPLO 3 Análisis de líneas vegetales transgénicas que comprenden genes quiméricos que reducen la expresión del gen de ParG Se introducen los genes quiméricos del Ejemplo 2 en Arabidopsis o papa respectivamente, por transformación mediada por Agrobacteríum. La población de líneas transgénicas obtenidas se sometió a las siguientes condiciones de fatiga, junto con plantas control: • calor creciente por un período de días (invernadero) u horas (Jn vitro) • sequía por un período de días • condiciones de alta iluminación por un período de días • agotamiento de nutrientes Se seleccionaron las líneas vegetales individuales que sobrevivieron bien a las condiciones de fatiga antes mencionadas. Se determinaron el contenido de NAD y el contenido de ADP para las plantas mencionadas anteriormente bajo condiciones de fatiga y control.

EJEMPLO 4 Determinación cuantitativa de NAD. ATP y radicales superóxido en células vegetales La cuantificación del ATP en tejidos vegetales se hizo básicamente como se describe en Rawyler y colaboradores (1999), Plant Physiol. 120, 293-300. El ensayo se usó para la determinación del contenido de ATP de tejidos extirpados mantenidos en cultivo de hipocotilo que fueron cultivados por 4-5 días sobre medio A2S3 o plantas de Arabidopsis cultivadas in vitro durante dos semanas. Todas las manipulaciones se efectuaron sobre hielo triturado a menos que se indique de otra manera.

Extracción de ATP - material vegetal congelado con nitrógeno líquido ? tejidos extirpados mantenidos en cultivo de 100 hipocotilos ? ± 700 mg de plantas >Arabidopsis (raíces + vástagos) (aproximadamente 32 - 37 de plantas de 18 días) - Se pusieron hipocotilos congelados en mortero y se añadieron 6 mi de ácido perclórico al 6 %. - Puede hacerse la extracción a temperatura ambiente usando la mano del mortero. Después de la extracción, las muestras se pusieron sobre hielo tan pronto como fue posible. - Se centrifuga a 24,000 rpm (Sorvall, rotor SS34 a 14,000 rpm) por 10 minutos a 4 °C. - Se neutralizó el sobrenadante con K2C03 5 M (se añadió 350 µ? de K2CO3 5 M a 3 mi de sobrenadante). - se removió el KCI04 por centrifugación como se describió anteriormente.

Determinación bioluminiscente cuantitativa del ATP - Se usó el equipo para el ensayo bioluminiscente de ATP de Sigma (FL-AA). - El extracto diluido 6000x (aproximadamente 6 mi de extracto de los cuales se tomaron 100 µ?, que se diluyeron 1000 veces). Las diluciones se elaboraron con el regulador de dilución de la mezcla de ensayo de ATP (FL-AAB) del equipo de ensayo bioluminiscente de ATP. - Se midió la cantidad de luz que se produce con el luminómetro TD-20/20 de Turner Designs (Sunnyvale, USA). - Curva Estándar: disolver el estándar de ATP del equipo (FL-AAS) en 10 mi de agua (2 x 10~6 moles). Se efectuó la cuantificación de NAD+ y NADH en tejidos vegetales, esencialmente como se describe por Karp y colaboradores (1983) o Filipovic y colaboradores (1999) sobre el siguiente material vegetal: Brasslca napus: 150 tejidos de hipocotilo extirpados y cultivados 5 días/muestra Arabidopsis: 1000 mg de plantas desarrolladas in vitro de 18 días (vástagos + raíces) /muestra ) corresponde a ± 60 plantas C24) Solución de ensayo (A) Para medir NADH: 25 mM de regulador de fosfato de potasio a pH de 7 0.1 mM de DTT 3 µ? de FMN (Fluka, 838 0) 30 µ? de n-decanal (Sigma, D-7384) (B) Para medir NAD+ + NADH: Idem que para medir NADH solo + 2 pg/ml de alcohol deshidrogenase (Roche, 102 717) Extracción - Se Congeló con nitrógeno líquido - Se puso material vegetal congelado en un mortero frío (enfriado a - 20 °C) y se añadieron 5 mi de regulador de extracción - Se trituró el material usando una mano de mortero - Se centrifugó a 24,000 rpm (Sorvall, rotor SS34 a 14,000 rpm) por 15 minutos a 4 °C - Se tomó 1 mi de sobrenadante para análisis.

Ensayo NADH - 390 µ? de Solución A de ensayo - + 10 µ? de extracto - + 2 µ? de NAD(P)H:FMN oxidoreductasa - + 100 µ? de solución de luciferasa NAD+ + NADH - 390 µ? de Solución B de ensayo - +10 µ? de extracto - 2 minutos a temperatura ambiente - + 2 µ? de NAD(P)H:FMN oxidoreductasa - + 100 µ? de solución de luciferasa La cantidad de luz que se produjo se midió con el luminómetro TD-20/20 de Turner Designs (Sunnyvale, USA) Estándar de NADH Solución madre de NADH: 1 mM (7.1 mg/10 mi de H20) NADH: sal disódica, Roche, 107 735 Serie de diluciones en 10 mM de regulador de fosfato de potasio a pH de 7: ( 0"2); 5 x 0"3; 2 x 10'3; 10'3; 5 x o"4 Se añadieron 10 µ? de las diluciones en 390 µ? de Solución A de ensayo y se efectuó la reacción Se hizo la curva estándar Se midió la producción de los radicales superóxidos por cuantificación de la reducción de XTT como se describe en De Block y De Brouver (2002) Plant Physiol. Blochem. 40, 845-852 BRASSICA NAPUS Reguladores de reacción y medios Sales de Muras ige y Skoog concentradas al 50 % Sacarosa al 2 % pH de 5.8 Agar al 0.6 % 250 mg/l de triaciclina Medio A2S3 de inducir callus Medio MS, 0.5 g/l de MES (pH de 5.8), sacarosa al 3 %, 40 mg/l de aden¡na-S04, agarosa al 0.5 %, 1 mg/l de 2,4-D, 0.25 mg/l de NAA, 1 mg/l de NAP, 250 mg/l de triaciclina Medio de incubación: 25 mM de regulador de fosfato de potasio a pH de 5.8 Sacarosa al 2 % 1 gota de Tween 20 por 25 mi de medio Regulador de Reacción: 50 mM de fosfato de potasio a pH de 7.4 1 mM de 3'-{1- [fenilamino-carbonil]- 3, 4- tetrazolio}- bis (4-metoxi- 6- nitro) = XTT (bts, Alemania, No. de Cat. 2525) 1 gota de Tween 20 por 25 mi de regulador.

Esterilización de semillas - pre-germinación de semillas -crecimiento de las plántulas Las semillas se impregnaron en etanol al 70 % por 2 minutos, luego se esterilizaron superficialmente por 15 minutos en una solución de hipoclorito de sodio (con aproximadamente 60 % de cloro activo) que contiene 0.1 % de Tween 20. Finalmente, las semillas se enjuagaron con 1 I de agua corriente estéril. Se incubaron las semillas por al menos 1 hora en agua corriente estéril (para permitir la difusión de las semillas de los componentes que puedan inhibir la geminación). Se pusieron las semillas en matraces erlen meyer que contenían 50 mi de agua corriente estéril (+ 250 mg/l de triaciclina). Se agitaron por aproximadamente 20 horas. Las semillas cuyas radículas sobresalieron se pusieron en contenedores Vitro Vent de Duchefa que contenían aproximadamente 125 mi de medio de siembra (10 semillas/recipiente, no demasiado para reducir la pérdida de semillas por contaminación). Las semillas germinaron a ± 24 °C y 10-30: Einstein/s"1m"2 con un día de 16 horas.

Pre-cultivo de los tejidos extirpados mantenidos en cultivo y la inducción de fatiga - 12-14 días después de siembra, se cortaron los hipocotilos en segmentos de aproximadamente 7-10 mm. - los tejidos extirpados de hipocotilo (25 hipocotilos/Placa de Petri Optilux, Falcon S1005, Dinamarca) se cultivaron por 5 días sobre medio A2S3 a 25 °C (a 10-30E i nstein/s 2nT2).

Ensayo con XTT - Se transfieren 150 tejidos extirpados de hipocotilos mantenidos en cultivo a un tubo de Falcon de 50 mi. - Se lava con regulador de reacción (sin XTT). - Se añaden 20 mi de regulador de reacción + XTT. (los tejidos extirpados y mantenidos en cultivo han sido sumergidos, pero no infiltrados al vacío) - Se incuban en la oscuridad a 26 °C por aproximadamente 3 horas - Se mide la absorción del medio de reacción a 470 nm.

ARABIDOPSIS THALIANA Medio vegetal: Sales de Murashige y Skoog a media concentración Vitaminas B5 Sacarosa al 1.5 % pH de 5.8 Agar Difco al 0.7 % Medio de Incubación 10 mM de regulador de fosfato de potasio a pH de 5.8 Sacarosa al 2 % Una gota de Tween 20 por 25 mi de medio Regulador de Reacción 50 mM de regulador de fosfato de potasio a pH de 7.4 1 mM de 3'-{1-[fenilamino-carbonil]- 3, 4- tetrazolio}- bis (4-metoxi- 6- nitro) = XTT (bts, Alemania, No. de Cat. 2525) 1 gota de Tween 20 por 25 mi de regulador Plantas de Arabldopsis - Líneas de Arabidopsis: control líneas para prueba - Esterilización de semillas de Arabidopsis 2 min con etanol al 70 % 10 minutos con blanqueados (cloro activo al 6 %) + 1 gota de Tween 20 por 20 mi de solución se lava 5 veces con agua corriente estéril - Pre-germinación de las semillas: En Placas de Petri Optilux (Falcon) que contienen 12 mi de agua corriente estéril. Baja luz toda la noche a 24 horas. - Crecimiento de las plantas de Arabidopsis Las semillas se sembraron en discos de Cultivo de Tejido Intergrid de Falcon (Nr.3025) que contienen + 125 mi de medio vegetal: 1 siembra /por rejilla. Las plantas se desarrollaron a 24 °C 30 pEinsteins" m"2 16 horas de luz - 8 horas de oscuridad Por aproximadamente 3 semanas (antes de tamizado) Ensayo con XTT Condiciones control (sin fatiga) - Se cosecharon vastagos (incluidas las raíces) de placas de agar y se pusieron directamente en un tubo de Falcon de 50 mi que contenía regulador de reacción (sin XTT) Vastagos fatigados - Se transfieren los vastagos a tubos de Falcon de 50 mi que contenían regulador de reacción (sin XTT) - Se reemplaza el regulador de reacción con regulador que contenía XTT (40 ml/tubo) - Se sumergieron los vástagos pero no se infiltraron al vacío - Se incubaron en la oscuridad a 26 °C por aproximadamente 3 horas - Se midió la absorción del medio de reacción a 470 nm La cuantificación de la respiración por medio del consumo de oxígeno usando un electrodo polarográfico de Clark se hizo de la siguiente manera: Material vegetal Brassica napus 150-200* tejidos de hipocotilo extirpados y mantenidos en cultivo Se cultivaron por 5 días a 25 °C (cfr. Ensayo con el protocolo en vigor) *Error en 150 tejidos extirpados < 10 %; error en 200 tejidos extirpados < 6 % Arabidopsis Para C24 ± 1000 mg* de plantas in vitro (plántulas + raíces) con responde con ~ 50 plantas de 18 días de edad) Se pre-germinaron las semillas antes de siembra Se dejaron crecer por 18 días a 24 °C (cfr. Protocolo de crecimiento in vitro de Arabidopsis) *para error de < 8% Medio de incubación Brasica napus 25 mM de regulador de fosfato de potasio a pH de 5.8 Sacarosa al 2% Tween 20 (1 gota/25 mi) Arabidopsis 10 mM de regulador de fosfato de potasio a pH de 5.8 Sacarosa al 2 % Tween 20 (1 gota/ 25 mi) Antes de uso, aerear bien el medio (saturado de oxígeno) por agitación por al menos unas cuantas horas.

Ensayo - Se ponen los tejidos extirpados y conservados en cultivo en botellas de vidrio de 1000 mi (Schott, Alemania), llenos con medio de incubación (± 700 mg) - Se llena la botella hasta rebosar y se cierra herméticamente (evitar grandes burbujas de aire) - Se llena también una botella con medio de incubación que no contenga tejidos extirpados conservados en cultivo (blanco)-Se incuba a 24 °C a bajo iluminación por: 3 - 4 horas (Brassica napus), 3 horas (Arabidopsis) - Se agita suavemente durante la incubación (para evitar el agotamiento de oxígeno del medio alrededor de los tejidos extirpados) - Se mide la concentración de oxígeno (mg/l) del medio de incubación usando un medidor de oxígeno disuelto manual (Cyberscan DO 310; Eutech Instruments, Singapur) - mg/l de oxígeno consumido = [oxígeno] blanco - [oxígeno] muestra.

EJEMPLO 5 Análisis de líneas vegetales transgénicas que comprenden genes quiméricos que reducen la expresión del gen de ParG Los genes quiméricos del ejemplo 2 se introdujeron en Arabidopsis una Nicotiana tabacum c.v. Petit Havana SR1 por transformación mediada para Agrobacterium. Las semillas transgénicas se hicieron germinar sobre un medio que contenía sales de MS/2; vitaminas B5; sacarosa al 1.5 %; pH de 5.8 y 0.7 % de agar Difco. Se sometieron las semillas germinadas a baja iluminación (flujo de fotones fotosintéticos de aproximadamente 30 pmoles m-1 s-1 por 14 a 18 días, después de los cuales se incrementó la intensidad de la luz aproximadamente 6 veces (flujo de fotones fotosintéticos de aproximadamente 190 pmoles m-1 s-1 ). Después del primer día, se determinaron los contenidos de NAD y de NADH usando el método de ciclizacion enzimática (Karp y colaboradores (1983) Anal. Biochem. 128, pág. 175-180). Una porción de las plántulas fueron cultivadas adicionalmente bajo condiciones de alta iluminación por aproximadamente 3 a aproximadamente días, después de los cuales se evaluó el daño. El daño fue visible como oscurecimiento de las hojas jóvenes y la punta de los vástagos, decoloración de las hojas más viejas y retardo en el crecimiento. Los resultados se resumen en el Cuadro 1 para Arabidopsis y en el Cuadro 2 para tabaco.

CUADRO 1 Análisis de Arabidopsis (Columbia). ± R indica que se observó alguna pigmentación oscura. ND: no determinado CUADRO 2 El análisis de Nicotiana tabacum c.v. Petit Havana SR1. ±R indica que se observó alguna zona de pigmentación oscura. R/S indica que el fenotipo de resistencia no fue muy claro Hay una correlación positiva entre la resistencia a fatiga por alta iluminación en las plantas transgénicas y el contenido de NAD+NADH de las células. Una correlación inversa puede haber entre la capacidad de reducir TTC y alta tolerancia a la luz EJEMPLO 6 Construcción de los genes quiméricos que reducen la expresión del gen de ParG adaptados para uso en plantas de cereales Para reducir la expresión del gen de PARG por ejemplo en cereales tales como arroz o maíz (maize) y plantas relacionadas, se construyó un gen quimérico que es capaz de expresar a un ARNds que comprende ambas regiones en el sentido y antisentido de la secuencia de nucleotidos de arroz, que sea capaz de codificar a una proteína que tiene alta identidad de secuencia con las secuencias de nucleotidos que codifican a la proteína de PARG. El gen quimérico comprende los siguientes fragmentos de ADN: • Una región promotora del virus mosaico de Coliflor (CaMV 35S); • Un fragmento de ADN que comprende una secuencia de al menos 100 pb del homólogo de ParG de Oriza sativa (SEC ID NO: 15) en orientación directa; • Un fragmento de ADN que codifica al intron 2 del gen pdk de Flaveria; • Un fragmento de ADN que comprende una secuencia de al menos 100 pb del homólogo de ParG de Oryza sativa (SEC ID No. 15) en orientación invertida; • Un fragmento del extremo 3' sin trasladar del gen de octopin sintetasa de Agrobacteríum tumefaciens. El gen quimérico es introducido en un vector de T-ADN, entre las secuencias limitantes a la izquierda y a la derecha del T-ADN, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a por ejemplo, el herbicida fosfinotricina. Para reducir la expresión de gen de PARG por ejemplo en cereales tales como arroz o maíz (malze) y plantas relacionadas, se construyó un gen quimérico que es capaz de expresar a un ARNds que comprende ambas regiones en el sentido y antisentido de la secuencia de nucleótidos de arroz, que es capaz de codificar a una proteína que tiene alta identidad de secuencia con las secuencias de nucleótidos que codifican a la proteína de PARG. El gen quimérico comprende los siguientes fragmentos de ADN: • Una región promotora del Virus mosaico de Coliflor (CaMV 35S); • Un fragmento de ADN que comprende a una secuencia de al menos 100 pb de! homólogo de ParG de Zea mays (SEC ID NO: 23) en orientación directa; • Un fragmento de ADN que codifica al intrón 2 del gen pdk de Fiaveria] • Un fragmento de ADN que comprende al menos una secuencia de al menos 100 pb del homólogo de ParG de Zea mays (SEC ID NO: 23) en orientación invertida; • Un fragmento del extremo 3' sin trasladar del gen de octopin sintetasa de Agrobacteríum tumefaciens. Este gen quimérico es introducido en un vector de T-ADN, entre las secuencias de los límites izquierdo y derecho del T-ADN, junto con un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a por ejemplo el herbicida fosfinotricina. La secuencia de nucleótidos de dos ejemplos de dichos vectores de T-ADN que comprenden dos diferentes genes quiméricos como se describen en los párrafos previos está representada en las SEC ID Nos. 24 y 25.

EJEMPLO 7 Análisis de las líneas vegetales transgénicas que comprenden los genes quiméricos que reducen la expresión del gen de ParG Los genes quiméricos del Ejemplo 6 se introdujeron en arroz o maíz respectivamente, por transformación mediada por Agrobacteríum. La población de las líneas transgénicas obtenidas se sometieron a las siguientes condiciones de fatiga, junto con plantas control: • calor creciente por un período de días (invernadero) u horas (in vitro) • sequía por un período de días • condiciones de alta iluminación por un período de días • agotamiento de nutrientes Se seleccionaron las líneas vegetales individuales que sobrevivieron bien a las condiciones de fatiga anteriormente mencionadas, o al menos una de las mismas. Se determinó el contenido de NAD y de ATP para las plantas anteriormente mencionados bajo condiciones de fatiga y control.

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para producir una planta tolerante a condiciones de fatiga, el cual que comprende las etapas de: (a) proporcionar células vegetales con un gen quimérico para crear células vegetales transgénicas, dicho gen quimérico comprende unidos operablemente, los siguientes fragmentos de ADN (i) un promotor expresable de plantas; (ii) una región de ADN, los cuales cuando son transcritos producen una molécula de ARN inhibidora de ParG; (iii) una región terminal 3' involucrada en la terminación de la transcripción y de poliadenilación; (b) regenerar una población de líneas vegetales transgénicas de dicha célula vegetal transgénica; y (c) identificar una línea vegetal tolerante a la fatiga en dicha población de líneas vegetales transgénicas.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha molécula de ARN inhibidora de ParG que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en dicha célula vegetal.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha molécula de ARN inhibidora de parG que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos del complemento de la secuencia de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en dicha célula vegetal.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado además porque el gen quimérico comprende adicionalmente una región de ADN que codifica a una ribozima de auto-empalme entre dicha región de ADN que codifica para dicha molécula de ARN inhibidora de parG y dicha región terminal 3'.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho ARN inhibidor de parG comprende una región en el sentido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en dicha célula vegetal y una región antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 20 nucleótidos consecutivos del complemento de la secuencia de nucleótidos del gen de ParG presente en dicha célula vegetal, en donde dichas regiones en el sentido y antisentido son capaces de formar una región de ARN de doble hebra que comprende los al menos 20 nucleótidos consecutivos.

6. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque dichas condiciones de fatiga son seleccionadas de calor, sequía, agotamiento de nutrientes, fatiga oxidativa o condiciones de alta iluminación.

7. - El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque comprende cruzar adicionalmente dicha línea vegetal transgénica con otra línea vegetal para obtener plantas precursoras tolerantes a la fatiga.

8. - Un método para producir una planta tolerante a condiciones de fatiga que comprende las etapas de: (a) aislar un fragmento de ADN de al menos 100 pb que comprenden una parte del gen que codifica a parG de dicha planta; (b) producir un gen quimérico por unión operablemente de los siguientes fragmentos de ADN; (i) una región promotora expresable de plantas; (¡i) dicho fragmento de ADN aislado que comprende parte del gen codificador de parG de dicha planta en orientación directa en comparación con la región promotora; (iii) dicho fragmento de ADN aislado que comprende parte del gen que codifica a parG de dicha planta en orientación invertida en comparación con la región promotora, (iv) una región terminal 3' involucrada en la terminación de la transcripción y en la poliadenilación; (c) proporcionar células vegetales con dicho gen quimérico para crear células vegetales transgénicas; (d) regenerar una población de líneas vegetales transgénicas de dicha célula vegetal transgénica; y (e) identificar una línea vegetal tolerante a la fatiga en dicha población de líneas vegetales transgénicas.

9. - Una molécula de ADN que comprende (i) un promotor expresable de plantas; (ii) una región de ADN, que cuando es transcrita produce una molécula de ARN inhibidora de ParG; (iii) una región terminal 31 involucrada en la terminación de la transcripción y en la poliadenilación.

10. - La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha región de ADN comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 21 a 100 nucleotidos de una secuencia de nucleotidos que codifica a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 , 2 o 16 o al menos 21 a 100 nucleotidos de una secuencia de nucleotidos de las SEC ID Nos: 3, 4, 15 0 23.

11.- Una célula vegetal que comprende la molécula de ADN que se reclama en la reivindicación 9 o 10.

12. - Una planta que consiste esencialmente de células vegetales de la reivindicación 11.

13. - Un procedimiento para producir plantas tolerantes a la fatiga, que comprende la etapa de cruzar adicionalmente una planta como la que se reclama en la reivindicación 12 con otra planta.

14. - Semillas y material de propagación de una planta como la que se reclama en la reivindicación 12, que comprenden el gen quimérico de la reivindicación 9 o 10.

15.- Plantas obtenibles u obtenidas por medio del procedimiento que se describe en la reivindicación 8.

16.- Un método para producir una planta tolerante a condiciones de fatiga, que comprende las etapas de: (a) proporcionar células vegetales con un gen quimérico para crear células vegetales transgénicas, dicho gen quimérico comprende unidos operablemente, los siguientes fragmentos de ADN (i) un promotor expresable de plantas; (ii) una región de ADN, la cual cuando es transcrita produce una molécula de ARN inhibidora de ParG, dicha región de ADN que comprende una secuencia de nucleotidos de al menos 21 a 100 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, 2 o 16 o al menos 21 a 100 nucleótidos de una secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3, 4, 15 o 23; (iii) una región terminal 3' involucrada en la terminación de la transcripción y en la poliadenilación; (b) regenerar una población de líneas vegetales transgénicas de dicha célula vegetal transgénica; y (c) identificar una línea vegetal tolerante a la fatiga en dicha población de líneas vegetales transgénicas.

17. - Un método para producir una planta tolerante a condiciones de fatiga, que comprende las etapas de: (a) someter a una línea celular vegetal o una planta o línea vegetal, a mutagénesís, (b) identificar aquellas células vegetales o plantas que tengan una mutación en un gen de ParG endógeno; (c) someter a las células vegetales o plantas identificadas a condiciones de fatiga; (d) identificar células vegetales o plantas que toleren dichas condiciones de fatiga mejor que plantas control.

18. - Un método para producir una planta tolerante a condiciones de fatiga, que comprende las etapas de: (a) seleccionar una línea celular vegetal o una planta o línea vegetal que sea resistente a un inhibidor de ParG; (b) identificar aquellas células vegetales o plantas que tengan una mutación en un gen de ParG endógeno; (c) someter a las células vegetales o plantas identificadas a condiciones de fatiga; (d) identificar células vegetales o plantas que toleran dichas condiciones de fatiga mejor que plantas control.

19. - Una célula vegetal o planta tolerante a la fatiga que comprende una mutación en un gen de ParG endógeno.