MXPA05001265A

MXPA05001265A - Composiciones de vacuna de neisserial que comprenden una combinacion de antigenos.

Info

Publication number: MXPA05001265A
Application number: MXPA05001265A
Authority: MX
Inventors: Karine Goraj
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2003-07-31
Publication date: 2005-04-28
Also published as: EP2258386A3; AU2003250204A1; CA2493124A1; JP2011142916A; DE20321890U1; EP2255826B1; ES2408251T3; DK1524993T3; EP1524993A2; US20120064119A1; JP5414651B2; KR101237329B1; NZ537181A; EP1524993B1; JP2006500963A; US7838014B2; IL166433A; WO2004014418A2; CY2013036I1; CA2493124C

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones inmunogenicas y vacunas para el tratamiento y prevencion de enfermedad Neisserial. Las composiciones inmunogenicas de la invencion contienen combinaciones de antigenos seleccionados de por lo menos dos diferentes clases de antigenos incluyendo adhesinas, proteinas autotransportadoras, toxinas, proteinas de adquisicion de hierro, y proteinas asociadas con membrana preferiblemente proteinas de membrana exterior integral). Dichas combinaciones de antigenos son capaces de activar la respuesta inmune contra diferentes aspectos del ciclo de vida Neisserial, dando como resultado una respuesta inmune mas efectiva.

Description

COMPOSICIONES DE VACUNA DE NEISSERIAL QUE COMPRENDEN UNA COMBINACION DE ANTIGENOS CAMPO TECNICO La presente invención se refiere al campo de composiciones inmunogénicas y vacunas de Neisserial, su fabricación y al uso de dichas composiciones en medicina. Más particularmente, se refiere a composiciones de vacuna que comprenden una combinación de antígenos que tienen cualidades que permiten a las vacunas de la invención provocar una respuesta inmune sorprendentemente buena según medido en un ensayo de protección o un ensayo bactericida de suero.

ANTECEDENTES Las cepas de Neisserial de bacteria son los agentes causantes de un número de patologías humanas, contra los cuales existe una necesidad de que se desarrollen vacunas efectivas. En particular la Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis causan patologías que podrían tratarse a través de vacunación. Neisseria gonorrhoeae es el agente etiológico de gonorrea, una de las enfermedades sexualmente transmitidas más frecuentemente reportadas en el mundo con una incidencia anual estimada de 62 millones de casos (Gerbase y otros, 1998 Lacet 351; (Supl. 3) 2-4).

Las manifestaciones clínicas de la gonorrea incluyen inflamación de las membranas mucosas del tracto urogenital, la garganta o recto e infecciones de ojo neonatales. El aumento de las infecciones por gonococo en las mujeres puede conducir a la infertilidad, embarazo extrauterino, enfermedad inflamatoria pélvica crónica, y formulación de abscesos tubo-ováricos. La septicemia, artritis, endocarditis y meningitis están asociadas con gonorrea complicada. El alto número de cepas gonocócicas con resistencia a antibióticos contribuye al aumento de la morbosidad y complicaciones asociadas con gonorrea. Una alternativa agradable para el tratamiento de gonorrea con antibióticos podría ser su prevención utilizando vacunación. Actualmente no existe ninguna vacuna para infecciones por N. gonorrhoeae. La Neisseria meningitidis es un patógeno importante, particularmente en niños y adultos jóvenes. La septicemia y la meningitis son las formas con más peligro de muerte de la enfermedad men i ng ocóci ca invasora (IMD). Esta enfermedad se ha convertido en un problema de salud mundial debido a su alta morbosidad y mortalidad. Trece serogrupos de N. meningitidis han sido identificados en base a las diferencias antigénicas en los polisacáridos capsulares, los más comunes siendo A, B y C, los cuales son reponsables del 90% de la enfermedades alrededor del mundo. El serogrupo B es la causa más común de la enfermedad meningocócica en Europa, EUA y varios países en América Latina.

Las vacunas basadas en el polisacárido capsular de los serogrupos A, C, W e Y han desarrollado y han mostrado que controlan los brotes de la enfermedad meningocócica (Peltola y otros, 1985 Pediatrics 76; 91-96). Sin embargo, el serogrupo B es pobremente inmunogénico e induce solamente una respuesta de anticuerpo temporal de un isotipo predominantemente Ig (Ala'Aldeen D y Cartwright K 1996, J. Infect. 33; 153-157). Por consiguiente no existe una vacuna ampliamente efectiva actualmente disponible contra los meningococos del serogrupo B, los cuales son responsables de la mayoría de las enfermedades en los países más templados. Esto es particularmente problemático ya que la incidencia de la enfermedad del serotipo B está aumentando en Europa, Australia y América, en su mayor parte en niños menores de 5 años. El desarrollo de una vacuna contra los meningococos del serogrupo B presenta dificultades particulares porque la cápsula del polisacárido es pobremente inmunogénico debido a su similitud inmunológica a la molécula de adhesión de la célula neural humana Las estrategias para la producción de vacunas tienen por consiguiente concentradas en la superficie, estructuras expuestas de la membrana exterior meningocócica pero han sido obstaculizadas a través de la variación marcada en estos antígenos entre las cepas.

Los desarrollos adicionales han conducido a la introducción de vacunas hechas de vesículas de membrana externas que contendrán un número de proteínas que forman el contenido normal de la membrana bacterial. Una de estas es la vacuna VA- ENGOC-BC® Cubana contra los serogrupos B y C de N. meningitidis (Rodríguez y otros 1999 Mem Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 94; 433-440). Esta vacuna fue diseñada para combatir un brote de la enfermedad meningocócica invasora en Cuba, la cual no había sido eliminada a través de un programa de vacunación utilizando una vacuna AC de polisacárido capsular. Los serogrupos B y C prevalentes y la vacuna VA-MENGOC-BC tuvieron éxito en el control del brote con una eficiencia de vacuna estimada de 83% contra las cepas del serogrupo B de N. meningitidis (Sierra y otros 1990 In Neisseria, Walter Gruyter, Berlín, m. Atchman y otros (eds) p 129-134, Sierra y otros 1991 , NIPH Ann 14; 195-210). Esta vacuna fue efectiva contra un brote específico, sin embargo la respuesta inmune provocada no protegería contra otras cepas de N. meningitidis. Los estudios de eficacia subsiguientes conducidos en América Latina durante las epidemias causadas por cepas meningococicas de serogrupo B homologas y heterologas han mostrado alguna eficacia en niños más grandes y adultos, pero su efectividad fue significativamente baja en niños más chicos que están en un riesgo mayor de infección (Milagres y otros 1994, Infect. Immun. 62; 4419-4424). Es cuestionable que tan efectiva dicha vacuna podría ser en países con enfermedad endémica multicepas tales como el Reino Unido. Los estudios de inmunogeneicidad contra cepas heterologas han demostrado solamente actividad bactericida de suero ¡nter-reactiva limitada, especialmente en infantes (Tappero y otro 1999, JAMA 281 ; 1520-1527).

Una segunda vacuna de vesícula membrana externa fue desarrollada en Noruega utilizando un serotipo B aislado típico de aquellos predominantes en Escandinava (Fredriksen y otros 1991, NIPH Ann, 14; 67-80). Esta vacuna se probó en evaluaciones clínicas y se probó que tiene una eficacia protectora después de 29 meses de 57% (Bjune y otro 1991, Lancet, 338; 1093-1096). Sin embargo, el uso de vesículas de membrana externa es vacunas está asociado son algunos problemas. Por ejemplo, el OVM contiene lipopolisacáridos tóxicos y pueden contener antígenos inmunodominantes los cuales son ya sea específicos de cepa o se expresan variablemente. Varios procesos han descrito que se podría utilizar para superar algunos de los problemas de las vacunas de preparación de vesícula de membrana externa. WO01/09350 describe los procesos que tratan algunos de estos problemas, por ejemplo reduciendo la toxicidad y modificando los antigenos presentes en sus vesículas de membrana externa. WO 01/52885 describe la posibilidad de combinar vesículas de membrana externa con otros antígenos y una lista de más de 2,000 proteínas Neisserial se incluye a partir de la cual se especula que una vacuna eficaz contra un rango más amplio de serotipos podría desarrollarse. Existen diversos problemas con las vacunas anti-meningocócicas actualmente disponibles. Las vacunas de membrana externa en base a proteína tienden a ser específicas y efectivas contra solamente unas cuantas cepas. Las vacunas de polisacárídos también son subóptimas ya que tienden a provocar respuestas pobres y cortas, particularmente contra el serogrupo B (Lepow y otros 1986; Peltola 1998, Pediatrics 76; 91-96). Las infecciones Neissería representan un problema del cuidado de la salud considerable para el cual no existen vacunas disponibles en el caso de N. gonorrhoeae o las vacunas con limitaciones en su eficacia y habilidad para proteger contra cepas heterólogas están disponibles contra infecciones Neisseria que mejorarán las vacunas actualmente disponibles y permitirán la protección contra un rango más amplio de cepas.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Detección de TbpA y Hsf en OMVs preparadas de un cepa de N. meningitidis regulada de manera ascendente para la expresión de tbpA y hsf. La separación de las preparaciones OVM (10 a través de análisis SDS-PAGE (4-20% geles de gradiente) se tiñó con azul brillante Coomassie. Figura 2. Detección del dominio pasajero Hsf recombinante producido en E. coli, 10 ug de proteína pasajera Hsf purificada (Carriles 2 y 3) se separó a través de SDS-PAGE en 12% de gel en comparación con un marcador de peso molecular (Carril 1). Figura 3. Análisis de la pureza del pasajero Hsf según detectado a través de (A) tinción Coomassie, (B) tinción plata, (C) tinción Western anti-His5 y (D) anti-E. coli 10 µg de antígenos purificados se separaron a través de SDS-PAGE en un gel gradiente de archilamida al 4-20%. Figura 4. Las regiones de la similitud de secuencia compartidas a través de proteínas FrpA y FrpC se aislaron de la cepa N. meningitidis FAM20. (A) Organización del dominio de la cepa de N. meningitidis FA 20 RTX proteínas FrpA y FrpC. (B) Productos de amplificación FrpA/C obtenidos de la cepa N. meningitidis H44/76.

Figura 5. Expresión del antígeno Frp23 recombinante (región conservada FrpA/C con 23 repeticiones) en análisis SDS-PAGE de E.coli de extractos de célula totales no inducidos (NI) e inducidos (I) de E. coli BL21DE3 transformado con vectores de control (pET24d) o construcciones recombinantes (Frp3, Frp13 y Frp23 respectivamente). Los geles se tiñeron con azul Coomassie (A) o se transfirieron a n itrocel u losa y suero de ratón anti-His6 inmuno-detectado. Figura 6. Secuencias de ADN preferidas del fragmento FHAB/2/3° expresadas en E. coli. Figura 7. Purificación de FHAB 2/3° de extractos de E. coli B121DE3. (A) Pasos principales en el proceso de purificación. (B) Análisis SDS-PAGE de fracciones de proteína amplificadas en diferentes pasos del proceso de purificación. Figura 8. Actividades de bloqueo de adhesión de anti-suero dirigido contra FHAB 2/3°, Hap, dominio pasajero Hap, Hsf y antígenos del dominio pasajero Hsf de N. meningitidis. Figura 9. Un gel teñido con Coomassie mostrando los niveles de expresión de Hsf, TbpA y NspA en las preparaciones de la vesícula de membrana exterior derivada de diferentes cepas de N. meningitidis . Carril 1 - marcadores de peso molecular; carril 2 -vesículas de la membrana exterior preparadas de la cepa H44/76 en la cual los polisacáridos capsulares fueron regulados de manera descendente; carril 3 - vesículas de membrana exterior preparadas de la cepa H44/76 en la cual los polisacáridos capsulares y PorA fueron regulados de manera descendente; carril 4 - vesículas de membrana exterior preparadas de la cepa H44/76 en la cual los polisacáridos capsulares y PorA fueron regulados de manera descendente y Hsf fue regulado de manera ascendente; carril 6-vesículas de membrana exterior preparadas de la cepa H44/76 en la cual los polisacáridos capsulares y PorA fueron regulados de manera descendente y TbpA fue regulado de manera ascendente; carril 7 -vesículas de membrana exterior preparadas de la cepa H44/76 en la cual los polisacáridos capsulares y PorA fueron regulados de manera descendente y TbpA y Hsf fueron regulados de manera ascendente; carril 8 - vesículas de membrana exterior preparadas de la cepa H44/76 en la cual los polisacáridos capsulares y PorA fueron regulados de manera descendente y TbpA y NspA fueron regulados de manera ascendente.

DESCRIPCION DETALLADA La presente invención describe combinaciones particulares de antígenos Neisserial que cuando se combinan, conducen a un mejoramiento sorprendente de la eficacia de la vacuna contra infección Neisserial. Las infecciones Neisserial progresan a través de varias diferentes etapas. Por ejemplo, el ciclo de vida meningocócica involucra colonización nasofaríngea, adhesión mucosal, cruzamiento dentro de la corriente sanguínea, multiplicación en la sangre, inducción de choque tóxico, cruce de la barrera sangre/cerebro, y multiplicación en el fluido cerebroespinal y/o las meninges. Diferentes moléculas sobre la superficie de las bacterias estarán involucradas en diferentes pasos del ciclo de la infección. La activación de la respuesta inmune contra una cantidad efectiva de una combinación de antígenos particulares, se involucra en diferentes procesos de infección Neisserial, una vacuna Neisserial son una sorprendentemente alta eficacia puede ser lograda. En particular, las combinaciones de ciertos antígenos de diferentes clases, algunas de las cuales están involucradas en la adhesión de células huésped, algunas de las cuales están involucradas en adquisición de hierro, algunas de las cuales son autotransportadoras y algunas de las cuales son toxinas, puede provocar una respuesta inmune que protege contra múltiples etapas de la infección. Dichas combinaciones de antigenos pueden sorprendentemente dirigirse hacia el mejoramiento (preferiblemente sinergísticamente mejorado) de la eficacia de la vacuna contra infección Neisserial, en donde se activa más de una función de la bacteria a través de la respuesta inmune en una forma óptima. La eficacia de las vacunas puede ser evaluada a través de una variedad de ensayos. Los ensayos de protección en modelos de animales con bien conocidos en la técnica. Además, el ensayo bactericida de suero (SBA) es el marcador inmunológico más comúnmente acordado para estimar la eficacia de una vacuna meningocócica (Perkins y otros, J. Infect. Dis. 1998, 177:683-691).

Algunas combinaciones de antígenos (por ejemplo, combinaciones de ciertas proteínas autotransportadoras y ciertas proteínas de adquisición de hierro) pueden conducir hacia una protección mejorada en ensayos de modelos de animales y/o dosificaciones SBS sinerg ísticamente más altas. Sin desear estar ligado por teoría, dichas combinaciones sinergísticas de antígenos son habilitadas mediante un número de características de la respuesta inmune a la combinación de antígenos. Los antígenos mismos son usualmente expuestos en la superficie sobre las células Neisserial y tienden a ser conservados, pero también tienden a estar presentes en una cantidad suficiente en la célula de superficie para que una respuesta bactericida óptima tome lugar utilizando anticuerpos provocados contra el antígeno solo. Al combinar los antígenos de la invención puede dar como resultado una formulación que provoca una combinación ventajosa de anticuerpos bactericidas que interactúan con la célula Neisserial más allá de un umbral crítico. En este nivel crítico, suficientes anticuerpos de suficiente calidad se enlazan a la superficie de las bacterias para permitir una aniquilación eficiente a través de complementos y se ven efectos bactericidas mucho más altos como una consecuencia. Ya que los ensayos bactericidas de suero (SBA) estrechamente reflejan la eficacia de los candidatos de vacuna que logran buenas dosificaciones de SBA a través de una combinación de antígenos es una buena indicación de la eficacia protectora de una vacuna que contiene esa combinación de antigenos. La invención se refiere al uso de una combinación de dos antígenos ya sea aislados o enriquecidos en una mezcla de otros antígenos. Cuando se combinan, dichas combinaciones de antigenos ¡nteractúan ventajosamente, y preferiblemente sinerg ísticamente provocan una respuesta inmune que es más alta en términos de actividad bactericida (por ejemplo, según medido a través del ensayo bactericida de suero o SBA), y preferiblemente más alta que la respuesta aditiva provocada por los antígenos individualmente, más preferiblemente por un factor de por lo menos 1.2, 1.5, dos. tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, más preferiblemente por un factor de por lo menos diez. Una ventaja adicional de la invención es que la combinación de antígenos de la invención de diferentes familias de proteínas en una composición inmunogénica puede habilitar la protección contra un rango más amplio de cepas. La invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden una pluralidad (dos o más) de proteínas seleccionadas de por lo menos dos diferentes categorías de proteína, que tienen diferentes funciones dentro de Neisseria. Ejemplos de dichas categorías de proteínas son adhesinas, proteínas autotransportadoras, toxinas, proteínas de membrana exteriores integrales, y proteínas de adquisición de Fe. Las combinaciones de vacunas de la invención muestran una sorprendente mejora en la eficacia de la vacuna contra cepas Neisserial homologas (cepas a partir de las cuales los antígenos se derivan) y preferiblemente también contar cepas Neisserial heterólogas. La invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden por lo menos o exactamente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez diferentes antígenos seleccionados de por lo menos o exactamente dos, tres, cuatro o las cinco categorías de antígenos seleccionados de los siguientes: • por lo menos una adhesina Neisserial; · por lo menos una autotransportadora Neisserial; • por lo menos una toxina Neisserial; • por lo menos una proteína de adquisición de Fe Neisserial; • por lo menos una proteína asociada con la membrana Neisserial (preferiblemente proteína de membrana exterior, particularmente proteína de membrana exterior integral). Preferiblemente, la invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden por lo menos o exactamente, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez diferentes antígenos Neisseria. Más preferiblemente estos antígenos se seleccionan del por los menos o exactamente dos, tres, cuatro o cinco grupos de proteínas seleccionados a partir de lo siguiente: • por lo menos una adhesina Neisserial seleccionada del grupo que consiste de FhaB, NspA, PilC, Hsf, Hap, MafA, MafB, Omp26, NMB 0315, N B 0995, NMB 1119 y NadA; • por lo menos un autotransportador de Neisserial seleccionado del grupo que consiste de Hsf, Hap, proteasa IgA, AspA y NadA; • por lo menos una toxina Neisserial seleccionada del grupo que consiste de FrpA, FrpC, FrpA/C, VapD, NM-ADPRT y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS e inmunotipo L3 de LPS; • por lo menos una proteina de adquisición de Fe Neisserial seleccionada del grupo que consiste de TbpA, TbpB, LbpA, LbpB. HpuA, HpuB, Lipo28 (GNA2132), Sibp, NMB0964, NMB0293, FbpA, Bcp, BfrA, BfrB y P2086 (XthA); y · por lo menos una proteína asociada con membrana Neisserial, preferiblemente proteína de membrana exterior, particularmente proteína de membrana exterior integral, seleccionada del grupo que consiste de PilQ, O P85, FhaC, NspA, TbpA, LbpA, TspA, TspB, TdfH, PorB, MltA, HpuB, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA (GNA1946), NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, y PldA (OmplA). Los antígenos de la presente invención todos están aislados, significando que están alterados a través de la mano del hombre. Preferiblemente están purificados el algún grado, más preferiblemente más de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, o 99% puros (antes de la combinación con los otros componentes de las composiciones inmunogénicas de la invención). Preferiblemente la composición inmunogénica de la invención comprende por lo menos una adhesina Neisserial y por lo menos un autotransportador Neisserial y opcionalmente una toxina Neisserial, una proteína de adquisición de Fe Neisserial o una proteína de membrana asociada con la membrana Neisserial (preferiblemente proteína de membrana exterior integral). Preferiblemente, los antígenos se seleccionan del los antígenos nombrados anteriormente. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la invención comprende por lo menos una adhesina Neisserial y por lo menos una toxina Neisserial y opcionalmente un autotransportador Neisserial, una proteína de adquisición de Fe Neisserial, o una proteína asociada con membrana Neisserial (preferiblemente proteína de membrana exterior integral). Preferiblemente, los antígenos se seleccionan del los antígenos nombrados anteriormente. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la invención comprende por lo menos una adhesina Neisserial y por lo menos una proteína de adquisición de Fe Neisserial, y opcionalmente una toxina Neisserial o una proteína asociada con membrana Neisserial (preferiblemente proteína de membrana exterior integral). Preferiblemente, los antígenos se seleccionan del los antígenos nombrados anteriormente. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la invención comprende por lo menos una adhesina Neisserial y por lo menos una proteína asociada con membrana Neisserial (preferiblemente proteina de membrana exterior integral) y opcionalmente una toxina Neisserial, una proteína de adquisición de Fe Neisserial, o un autotransportador Neisserial. Preferiblemente, los antígenos se seleccionan del los antígenos nombrados anteriormente. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la invención comprende por lo menos un autotransportador Neisserial y por lo menos una toxina Neisserial y opcionalmente una adhesina Neisserial, una proteína de adquisición de Fe Neisserial o una proteína asociada con membrana Neisserial (preferiblemente proteína de membrana exterior integral). Preferiblemente, los antígenos se seleccionan del los antígenos nombrados anteriormente. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la invención comprende por lo menos un autotransportador Neisserial y por lo menos proteína de adquisición de Fe Neisserial, y opcionalmente una adhesina Neisserial, una toxina Neisserial, o una proteína asociada con membrana Neisserial (preferiblemente proteína de membrana exterior integral). Preferiblemente, los antígenos se seleccionan del los antígenos nombrados anteriormente. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la invención comprende por lo menos un autotransportador Neisserial y por lo menos una proteína asociada con membrana Neisserial (preferiblemente proteína de membrana exterior integral) y opcionalmente una adhesina Neisserial, o pro teína de adquisición de Fe Neisserial o una toxina Neisserial. Preferiblemente, los antígenos se seleccionan del los antígenos nombrados anteriormente. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la invención comprende por lo menos una toxina Neisserial y por lo menos una proteína de adquisición de Fe Neisserial y opcionalmente una adhesina Neisserial, un autotransportador Neisserial o una proteína asociada con membrana Neisserial (preferiblemente proteína de membrana exterior integral). Preferiblemente, los antígenos se seleccionan del los antígenos nombrados anteriormente. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la invención comprende por lo menos una toxina Neisserial y por lo menos una proteína asociada con membrana Neisserial (preferiblemente proteína de membrana exterior integral) y opcionalmente una adhesina Neisserial, un autotransportador Neisserial o una toxina Neisserial. Preferiblemente, los antígenos se seleccionan del los antígenos nombrados anteriormente. Preferiblemente, la composición inmunogénica de la invención comprende por lo menos una proteina de adquisición de Fe Neisserial y por lo menos una proteína asociada con membrana Neisserial (preferiblemente proteína de membrana exterior integral) y opcionalmente una adhesina Neisserial, un autotransportador Neisserial o una toxina Neisserial. Preferiblemente, los antígenos se seleccionan del los antígenos nombrados anteriormente. Preferiblemente los cinco grupos de anfígeno se representan en la composición inmunogénica de la invención. En donde una proteína está específicamente mencionada aquí, es preferiblemente una referencia a una proteína de longitud completa, nativa, y a sus variantes naturales (es decir, a una proteína nativa que se obtiene de una Neisserial, preferiblemente cepa meningocócica) pero también puede abarcar fragmentos antigénicos de la misma (particularmente en el contexto de vacunas de subunidad). Estas son fragmentos (por lo general específicamente descritos aquí) que contienen o comprenden por lo menos 10 aminoácidos, preferiblemente 20 aminoácidos, más preferiblemente 30 aminoácidos, más preferiblemente 40 aminoácidos o de preferencia 50 aminoácidos tomados contiguamente de secuencias de aminoácido de la proteína. Además, los fragmentos antigénicos denotan fragmentos que son inmunológicamente reactivos con anticuerpos generados contra las proteínas de longitud completa Neisserial o con anticuerpos generados a través de infección de un huésped mamífero con Neisseria. Los fragmentos antigénicos también incluyen fragmentos que cuando se administran a una dosis efectiva, provocan una respuesta protectora contra infección Neisserial, más preferiblemente son protectoras contra N. meningitidis y/o N. gonorrhoeae, más preferiblemente son protectores contra infección del serogrupo B por N. meningitidis.

También se incluyen en la invención proteínas de fusión recombinantes de proteínas Neisserial de la invención, o fragmentos de las mismas. Estas pueden combinar diferentes proteínas Neisserial o fragmentos de las mismas en el mismo polipéptido. Alternativamente, la invención también incluye proteínas de fusión de proteínas Neisserial o fragmentos de las mismas, como una proteína de fusión con secuencias heterólogas tales como un proveedor de epítopos de células T o etiquetas de purificación, por ejemplo, ß-galactosidasa, glutationa-S-transferasa, proteínas fluorescentes verdes (GFP), etiquetas de epitopo tales como FLAG, etiqueta myg, poli histidina, o proteínas de superficie virales tales como hemaglutinina de virus de influenza, anatoxina del tétanos, anatoxina de difteria, CRM197.

Antiqenos de la invención Las referencias NMB se refieren a números de referencia de secuencias que pueden ser accedidas a partir de www.neisseria.org. 1. Adhesinas Las adhesinas incluyen FhaB (W098/02547), NadA (J. Exp. ed (2002) 195:1445; NMB 1994), Hsf también conocida como NhhA (NMB 0992)(W099/31132), Hap (NMB1985)(W099/55873), NspA(W096/29412), MafA (NMB 0652) y MafB (NMB 0643) (Annu Rev Cell Dev Biol. 16; 423-457 (2000); Nature Biotech 20;914-921 (2002)), Omp26 (NMB 0181), NMB 0315, NMB 0995, NMB 1119 y PilC (Mol. Microbiol. 1997,23; 879-892). Estas son proteínas que están involucradas en la unión de Neisseria a la superficie de células huésped. Hsf es un ejemplo de una adhesina, así como también una proteína autotransportadora. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden por consiguiente incluir combinaciones de Hsf y otras proteínas autotransportadoras en donde Hsf contribuye en su capacidad como una adhesina. Estas adhesinas pueden derivarse de Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoeae u otras cepas de Neisseria. La invención también incluye otras adhesinas de Neisseria.

FhaB Este antígeno ha sido descrito en WO98/02547 SEC ID NO: 38 (nucleótidos 3083-9025) - ver también NMB0497. Los inventores de la presente han encontrado a FhaB como siendo particularmente efectivo en la inducción de anticuerpos anti-adhesivos solos y en particular con otros antígenos de la invención. Aunque se puede utilizar FhaB de longitud completa, los inventores han encontrado que los truncados C-terminal particulares son sorprendentemente por lo menos tan efectivos y referiblemente aún más efectivos en términos de efecto ínter-cepa. Dichos truncados también han mostrado ventajosamente ser mucho más fáciles de clonar. Los truncados FhaB de la invención típicamente corresponden a dos tercios de N-terminal de la molécula FhaB, preferiblemente el nuevo C-término siendo situado en la posición 1200-1600, más preferiblemente en la posición 1300-1500, y más preferiblemente en la posición 1430-1440. Las modalidades específicas tiene el C-término en 1433 o 1436. Por consiguiente dichos truncados FhaB de la invención y las vacunas que comprenden dichos truncados son aspectos independientes de la presente invención asi como siendo componentes de las composiciones ¡nmunogénicas de combinación de la invención. El N-término también puede estar truncado hasta por 10, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos. 2. Proteínas autotransportadoras Las proteínas autotransportadoras típicamente están hechas de una secuencia de señal, un dominio pasajero y un dominio de anclaje para adherirse a la membrana exterior. Ejemplos de proteínas autotransportadoras incluye Hsf (W099/31132) (NMB 0992), HMW, Hia (van Ulsen y otros Immunol. Med. Microbiol. 2001 32; 53-64), Hap (NMB1985) (W099/55873; van Ulsen y otros Immunol. Med. Microbiol. 2001 32; 53-64), UspA, UspA2, NadA (NMB 1994) (Comanducci y otros J. Exp. Med. 2002 195; 1445-1454), AspA (Infection and Immunity 2002, 70(8); 4447-4461 ; NMB 1029), Aida-1 de tipo proteína, SSh-2 y Tsh. NadA (J. Exp. Med (2002) 195: 1445) es otro ejemplo de proteínas autotransportadoras, así como siendo un adhesina. Las composiciones ¡nmunogénicas de la invención pueden por lo tanto incluir combinaciones de NadA y adhesinas en donde NadA contribuye en su capacidad como una proteína autotransportadoras. Estas proteínas pueden derivarse de Neisseria miningitidis o Neisseria gonorrhoeae u otras cepas de Neisserial. La invención también incluye otras proteínas autotransportadoras de Neisseria.

Hsf Hsf tiene una estructura que es común con las proteínas autotransportadoras. Por ejemplo, Hsf de la cepa H44/76 deW. Meningitidis consiste de una secuencia de señal hecha de 1-51 aminoácidos, una región principal en al término amino de la proteína madura (aminoácidos 52-479) que está expuesta en la superficie y contiene regiones variables (aminoácidos 52-106, 121-124, 191-210, y 230-234), una región de cuello (aminoácidos 480-509), una región alfa-hélice hidrofóbica (aminoácidos 518-529) y un dominio de anclaje en donde cuatro estructuras de cadena de transmembrana se extienden hacia al membrana exterior (aminoácidos 539-591 ). Aunque las Hsf de longitud completa pueden ser utilizadas en las composiciones inmunogénícas de la invención, varios truncados de Hsf y elmininaciones también pueden ser ventajosamente utilizados dependiendo del tipo de vacuna. Cuando se utiliza Hsf en una vacuna de subunidad, se prefiere utilizar una porción del dominio pasajero soluble; por ejemplo el dominio completo de los aminoácidos 52 a 479, más preferiblemente una proteína conservada del mismo, por ejemplo la secuencia particularmente ventajosa de aminoácidos 134 a 479. Las formas preferidas de Hsf pueden ser truncadas para así eliminar las regiones variables de la proteína descrita en WO 01/55182. Las variantes preferidas podrían incluir la eliminación de una, dos, tres, cuatro o cinco regiones variables como se define en WO 01/55182. Las secuencias anteriores y aquellas descritas más adelante, pueden ser extendidas o truncadas a través de hasta 1, 3, 5, 7, 10 o 15 aminoácidos en cualquier o ambos términos N o C. Los fragmentos preferidos de Hsf por lo tanto incluyen la región principal completa de Hsf, preferiblemente conteniendo los aminoácidos 52-473. Los fragmentos preferidos adicionales de Hsf incluyen regiones expuestas en la superficie de la principal incluyendo una o más de las siguientes secuencias de aminoácido: 52-62,76-93, 116-134,147-157, 157- 75, 99-211, 230-252, 252-270, 284-306, 328-338, 362-391, 408-418, 430-440 y 469-479. En donde Hsf está presente en una preparación de vesícula de membrana exterior, puede ser expresada como la proteína de longitud completa o preferiblemente como una variante ventajosa hecha de una fusión de los aminoácidos 1-51 y 134-591 (produciendo una proteína de membrana exterior madura de la secuencia de aminoácido 134 al término C). Las formas preferidas de Hsf puede estar truncadas para así eliminar las regiones variables de la proteína descrita en WO 01/55182. Las variantes preferidas podrían incluir la eliminación de una, dos, tres, cuatro o cinco regiones variables como se define en WO 01/55182. Preferiblemente la primera y segunda región variable se elimina. Las variantes preferidas podrían eliminar residuos de entre la secuencia de aminoácido 52 a la 237 o de la 54 a la 237, más preferiblemente eliminar residuos entre el aminoácido 52 al 133 o del 55 al 133. La proteína madura podría carecer del péptído de señal.

Hap El análisis por computadora de la proteína de tipo Hap de Neisseria meningitidis reveló por lo menos tres dominios estructurales. Considerando la secuencia de tipo Hap de la cepa H44/76 como una referencia, el Dominio , comprende el aminoácido 1 a 42, codifica un péptido de señal dependiente de sec característico de la familia auto-transportadora, el Dominio 2 , comprende los aminoácidos 43 a 950, codifica el dominio pasajero probable de ser expuesto en la superficie y accesible al sistema inmune, el Dominio 3, comprende los residuos 951 al término C (1457), se pronostica que codifica cepas beta que probablemente se ensamblan dentro de la estructura de tipo barril y que van a ser ancladas en la membrana exterior. Dicho dominio 2 será probablemente expuesto en la superficie, bien conservado (más de 80% en todas las cepas probadas) y podría ser producido como antígenos de subunidad en E. coli, representa candidatos de vacuna interesantes. Ya que los dominios 2 y 3 probablemente van a estar expuestos en la superficie, están bien conservados (Pizza y otros (2000), Science 287: 1816-1820), representan candidatos de vacuna interesantes. El dominio 2 es conocido como el dominio pasajero.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender la proteína Hap de longitud completa, preferiblemente incorporada dentro de una preparación OV . Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender el domino pasajero de Hap el cual en la cepa H44/76 está compuesto de los residuos de aminoácido 43-950. Este fragmento de HAP podría ser particularmente ventajosamente utilizado en una composición de subunidad de la invención. La secuencia anterior para el dominio pasajero de Hap puede extenderse o truncarse a través de hasta 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 o 30 aminoácidos en cualquiera o ambos términos N o C. 3. Proteínas de adquisición de Hierro Las proteínas de adquisición de hierro incluyen TbpA (NMB 0461 ) (W092/03467, US5912336, W093/06861 y EP586266), TbpB (NMB 0460)(W093/06861 y EP586266), LbpA (NMB 1540) (Med Microbiol (1999) 32: 1117), LbpB (NMB 1541) (WO/99/09176), HpuA(U73112.2) (Mol Microbiol. 1997,23; 737-749), HpuB (NC_003116. 1 ) (Mol Microbiol. 1997,23 ;737-749), P2086 también conocida como XthA (NMB 0399) (13awo International Pathogenic Neisseria Conference 2002), FbpA (NMB 0634), FbpB, BfrA (NMB 1207), BfrB (NMB 1206), L¡po28 también conocida como GNA2132 (NMB 2132), Sibp (NMB 1882), HmbR, HemH, Bcp (NMB 0750), proteína de permeasa transportadora ABC de Hierro(lll) (Tettelin y otros, Science 287; 1809-1815 2000), transportadora-periplásmica ABC de Hierro(lll) (Tettelin et al Science 287; 1809-1815 2000), receptor dependiente de Ton B (NMB 0964 y NMB 0293) (Tettelin otros, Science 287 ; 1809-1815 2000) proteína relacionada con proteína de unión a transferina (Tettelin y otros, Science 287;1809-1815 2000). Estas proteínas pueden derivarse de Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, y otras cepas Neisserial. La invención también incluye otras proteínas de adquisición de hierro de Neisseria.

TbpA TbpA interactúa con TbpB para formar un complejo de proteína en la membrana exterior de Neisseria, la cual se une a transferina. Estructuralmente, TbpA contiene un dominio N-terminal intracelular con una caja TonB y dominio promotor, cepas beta de transmembrana múltiples enlazadas a través de un bucle intracelular corto y extracelular más largo. Se han distinguido dos familias de TbpB, que tienen un peso molecular alto y un peso molecular bajo respectivamente. Las formas de peso molecular alto y bajo de TbpB se asocian con diferentes familias de TbpA que son distinguibles sobre la bases de homología. A pesar del peso molecular similar, son conocidas como las famitas de peso molecular alto y peso molecular bajo debido a su asociación con la forma de peso molecular alto bajo de TbpB (Rokbi y otros: FEMS icrobiol. Lett. 100; 51, 1993). Los términos TbpA(alto) y TbpA(bajo) se utilizan para referirse a estas dos formas de TbpA, y similarmente para TbpB. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender TbpA y TbpB de los serogrupos A, B, C, Y y W-135 de N. meningitidis así como proteínas de adquisición de hierro de otras bacterias incluyendo N. gonorrhoeae. Las proteínas de unión a transferina TbpA y TbpB también han sido referidas como Tbp1 y Tbp2 respectivamente (Cornelissen y otros Infection and Immunity 65; 822, 1997). TbpA contiene varias regiones distintas. Por ejemplo, en el caso de TbpA de la cepa H44/76 de N. meningitidis, los 186 aminoácidos del término amino forman un dominio globular interno, 22 cepas beta se extienden en la membrana, formando una estructura de barril beta. Estas están enlazadas a través de bucles i ntracelulares cortos y bucles extracelulares largos. Los bucles extracelulares 2, 3, y 5 tiene el grado más alto de variabilidad de secuencia y el bucle 5 está expuesto en la superficie. Los bucles 5 y 4 están involucrados en la unión a ligando. Los fragmentos preferidos de TbpA incluyen los bucles extracelulares de TbpA. Al utilizar la secuencia de TbpA de la cepa H44/76 de N. meningitidis, estos bucles corresponden a los aminoácidos 200-202 del buclel, los aminoácidos 226-303 del bucle 2, los aminoácidos 348-395 del bucle 3, los aminoácidos 438-471 del bucle 4, los aminoácidos 512-576 del bucle 5, los aminoácidos 609-625 del bucle 6, los aminoácidos 661-671 del bucle 7, los aminoácidos 707-723 del bucle 8, los aminoácidos 769-790 del bucle 9, los aminoácidos 814-844 del bucle 10 y los aminoácidos 872-903 del bucle 11. Las secuencias correspondientes, después de la alineación de secuencia, en otras proteínas Tbp también podrían constituir fragmentos preferidos. Los fragmentos más preferidos podrían incluir las secuencias de aminoácido que constituyen el bucle 2, el bucle 3, el bucle 4, o el bucle 5 de Tbp.

Cuando las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden TbpA, es preferible incluir ambos TbpA(alto) y TbpA(bajo). Aunque TbpA preferiblemente se presenta en la vacuna OMV, también puede ser parte de una vacuna de subunidad. Por ejemplo, las proteínas de adquisición de hierro que podrían ser introducidas en una composición inmunogénica de la invención son bien conocidas en la técnica (WO 00/25811 ). Estas pueden ser expresadas en un huésped bacteriano, extraídas utilizando detergente (por ejemplo 2% de Elugent) y purificadas a través de cromatografía de afinidad o utilizando técnicas de cromatografía de columna estándares bien conocidas en la técnica (Oakhill y otros, Biochem J. 2002 363; 613-6). Cuando TbpA está presente en una vacuna OMV, su expresión puede ser regulada de manera ascendente a través de técnicas genéticas discutidas aquí, o puede preferiblemente ser regulada de manera ascendente a través del crecimiento de la cepa padre bajo condiciones de limitación de hierro como se describe más adelante. Este proceso también dará como resultado la regulación ascendente de las proteínas reguladas en hierro, particularmente FrpB, la cual se convierte en inmunodominante y es por consiguiente ventajosa para regular de manera descendente la expresión de (y preferiblemente eliminar los genes que codifican) dichas proteínas (particularmente FrpB) como se describe más adelante, para asegurar que la composición inmunogénica de la invención provoca una respuesta inmune contra los antigenos presentes en un amplio rango de cepas Neisserial. Se prefiere tener ambas, TpbA(alta) y TpbA(baja) presentes en la composición inmunogénica y es preferible lograrlo a través de la combinación de OMVs derivados de dos cepas, que expresan las formas alternativas de TpbA. 4. Toxinas Las toxinas incluyen FrpA (NMB 0585; NMB 1405), FrpA/C (ver definición a continuación), FrpC (NMB 1415; NMB 1405) (W092/01460), NM-ADPRT (NMB 1343) (13av0 International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani y otros p 135), VapD (NMB 1753), lipopolisacárido (LPS; también llamado lipooligosacárido LOS) inmunotipo L2 y inmunotipo L3. LPS FrpA y FrpC contienen una región que está conservada entre estas dos proteínas y un fragmento preferido de las proteínas podría ser un polipéptido que contiene este fragmento conservado, preferiblemente comprendiendo los aminoácidos 227-1004 de la secuencia FrpA/C. Estos antígenos puede derivarse de Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoeae y otras cepas Neisseria. La invención también incluye otras toxinas de Neisseria. En una modalidad alternativa, las toxinas pueden incluir antígenos involucrado en la regulación de la toxicidad, por ejemplo OstA el cual funciona en la síntesis de lipopolisacáridos.

FrpA y FrpC Neisseria meningitidis codifica dos proteínas TX, referidas como FrpA y FrpC secretadas dependiendo de la limitación del hierro (Thompson y otros, (1993) J. Bacteriol. 175: 811-818; Thompson y otros, (1993) Infect. Immun. 61: 2906-2911). La familia de proteínas RTX (Repetición de ToXin) que tiene en común series de 9 repeticiones de aminoácido cerca del término C con el consenso: Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp) Asp Xaa. (LXGGXGN/DDX). Las repeticiones en E. coli HlyA se cree que son el sitio de unión Ca2 + . Como se representa en la Figura 4, las proteínas meningocócicas FrpA y FrpC, como se caracterizan en la cepa FA 20, comparten una extensiva similitud de aminoácido en sus regiones central y C-terminal pero una similitud muy limitada (si hay alguna) en el término N. Además, las región conservada entre FrpA y FrpC exhiben algo de polimorfismo debido a la repetición (13 veces en FrpA y 43 veces en FrpC) de un motivo del aminoácido 9.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender la FrpA y/o FrpC de longitud completa o preferiblemente, un fragmento que comprende la secuencia conservada entre FrpA y FrpC. La secuencia conservada está formada de unidades de repetición de 9 aminoácidos. Las composiciones inmunogénicas de la invención preferiblemente comprenderán más de tres repeticiones, más de 10 repeticiones, más de 13 repeticiones, más de 20 repeticiones o más de 23 repeticiones. Dichos truncados tienen propiedades ventajosas sobre las moléculas de longitud completa y vacunas que comprenden dichos antígenos de un aspecto independiente de la invención tal como se venden como estando incorporados en las composiciones inmunogénicas de la invención. Las secuencias conservadas entre FrpA y FrpC se designan FrpA/C y donde quiera que FrpA y FrpC formen un constituyente de las composiciones inmunogénicas de la invención, FrpA/C podrá ser ventajosamente utilizada. Los aminoácidos 277-1004 de la secuencia FrpA es la región conservada preferida. Las secuencias anteriores pueden extenderse o truncarse por hasta 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25 o 30 aminoácidos en cualquiera o ambos términos N o C.

LPS LPS (lipopolisacárido, también conocido como LOS lipooligosacárido) es la endotoxina en la membrana exterior de Neisseria. La porción de polisacárido de LPS se sabe que induce anticuerpos bacterianos. La heterogeneicidad entre la porción del oligosacárido de LPS genera una diversidad estructura y antigénica entre las diferentes cepas neisserial (Griffiss y otros Inf. Immun. 1987; 55: 1792-1800).

Esta se ha utilizado para subdividir cepas meningocócicas en 12 inmunotipos (Scholtan y otros J ed icrobiol 1994, 41: 236-243).

Los inmunotipos L3, L7 y L9 son inmunológicamente idénticos y son estructuralmente similares (o aún el mismo) y por lo tanto han sido designados L3,7,9 (o, para los propósitos de esta especificación, genéricamente como "L3"). El LPS meningocócico L3,7,9 (L3), L2 y L5 pueden ser modificados a través de sialilación, o a través de la adición de ácido 5'-monofosfato-N-acetilneuramínico de citidina. Aunque los LPS L2, L4 L6 son inmunológicamente distinguibles, son estructuralmente similares dentro del alcance de la invención. Ver M.P. Jennings y otros, Microbiology 1999, 145, 3013-3021 y Mol Microbiol 2002, 43:931-43 para una ilustración adicional de la estructura y heterogenicidad de LPS. Cuando se incluye LPS, preferiblemente LPS meningocócico en una vacuna de la invención, preferiblemente y ventajosamente cualquiera o ambos de los inmunotipos L2 y L3 están presentes. LPS está preferiblemente presente en la vesícula de la membrana exterior (preferiblemente cuando la vesícula se extrae con un bajo porcentaje de detergente, más preferiblemente 0-0.5%, 0.02-0-4%, 0.04-0. 3%, 0.06-0.2%, 0.08-0.15% o 0.1%, más preferiblemente deoxicolato [DOC] pero también puede ser parte de una vacuna de subunidad. LPS puede ser aislado utilizando procedimientos bien conocidos incluyendo el procedimiento de agua caliente-fenol (Wesphal y Jann Meth. Carbo. Chem. 5; 83-91 1965). Ver también Galanos y otros 1969, Eur J Biochem 9: 245-249, y Wu y otros 1987, Anal Bio Chem 160: 281-289. LPS puede ser utilizado claro o conjugado a una fuente de epítopos de célula T como anatoxina de tétano, anatoxina de difteria, CRM-197 o proteínas de membrana exterior OMV. Las técnicas para conjugar LOS aislados también son conocidas (ver por ejemplo EP 941738 incorporada aquí por referencia).

Cuando LOS (en particular los LOS de la invención) están presentes en una formulación de ampolla los LOS están preferiblemente conjugados in situ a través de métodos que permiten la conjugación de LOS con una o más proteínas de membrana exteriores también presentes en la preparación de la ampolla (por ejemplo, PorA o PorB en meningococos). Este proceso puede ventajosamente mejorar la estabilidad y/o ¡nmunogeneicidad (proporcionando ayuda de célula T) y/o antigeneicidad del antígeno LOS dentro de la formulación de ampolla, de esta manera dando ayuda de célula T para el inmunógeno de oligosacárido independiente de T en su conformación más protectora, según LOS en su ambiente natural en la superficie de la membrana exterior meningocócica. Además, la conjugación de LOS dentro de la ampolla puede dar como resultado una desintoxicación de LOS (la porción A del lípido siendo establemente enterrada en la membrana exterior y de esta forma estando menos disponible para causar toxicidad). De esta forma los métodos de desintoxicación mencionados aquí de aislamiento de ampollas de mutantes htrB" o msbB', o a través de la adición de un equivalente funcional de péptido no tóxico de polimixina B [una molécula con alta afinidad al Lípido A] a la composición (ver WO 93/14115, WO 95/03327, Velucchi y otros (1997) J Endotoxin Res 4: 1-12, y EP 976402 para detalles adicionales de equivalentes de péptido funcional no tóxicos, de polimixina B, particularmente el uso del péptido SAEP 2 (de la secuencia KTKCKFLKKC en donde 2 cisteínas forman un puente de disulfuro)) pueden no ser requeridos (pero los cuales pueden ser agregados en combinación para una seguridad adicional). De esta forma los inventores han encontrado que una composición que comprende ampollas en donde LOS está presente en las ampollas ha sido conjugada en una forma ¡ntra-ampolla con las proteínas de la membrana exterior también presentes en la ampolla pueden formar las bases de una vacuna para el tratamiento o prevención de enfermedades causadas por el organismo a partir del cual las ampollas han sido derivadas, en donde dicha vacuna es substancialmente no tóxica y es capaz de inducir una respuesta bactericida dependiente de T contra LOS en su ambiente nativo.

La invención por consiguiente además proporciona dicha preparación de ampollas meningocócicas conjugadas de LOS i ntra-ampolla s . Dicha preparación de ampollas puede ser aislada de la bacteria en cuestión (ver WO 01/09350) y después sometida a químicas de conjugación conocidas para enlazar grupos (por ejemplo NH2 o COOH) en la porción del oligosacárido de LOS a grupos (por ejemplo, NH2 o COOH) en las proteínas de la membrana exterior de la ampolla. Las técnicas de entrelazamiento utilizando glutaraldehídoi, formaldeh ido, o mezclas de glutaraldehído/formaldehído pueden ser utilizadas, pero se prefiere que se utilicen químicas más selectivas tales como EDAC o EDAC/NHS (J. V. Staros, R. W. Wright y D. . Swingle. Mejoramiento a través de N-hidroxisuccinima de reacciones de acoplamiento mediadas por carbodiimida soluble en agua. Química Analítica 156: 220-222 (1986); y Técnicas de Bioconjugados. Greg T. Hermanson (1996) pp 173-176). Otras químicas de conjugación o tratamientos capaces de crear enlaces covalentes entre LOS y moléculas de proteína que podrían ser utilizadas se describen en EP 941738. Preferiblemente las preparaciones de ampolla se conjugan en ausencia del polisacárido capsular. Las ampollas pueden aislarse de una cepa que no produce polisacárido capsular (naturalmente o a través de mutación como se describe más adelante), o puede ser purificada a partir de la mayoría y preferiblemente de todos los polisacáridos capsulares contaminantes. En esta forma, la reacción de conjugación LOS de intra-ampollas es mucho más eficiente. Preferiblemente más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 79, 80, 90, o 95% de los LOS presentes en las ampollas son entrelazados/conjugados. La conjugación intra-ampolla deberá preferiblemente incorporar 1, 2 o los tres de los siguientes pasos del proceso: la conjugación del pH deberá ser mayor de pH 7.0, preferiblemente mayor de o igual a un pH de 7.5 (más preferiblemente bajo un pH 9); condiciones de 1-5% preferiblemente 2-4% más preferiblemente alrededor de 3% de sacarosa deberán ser mantenidas durante la reacción; el NaCI deberá ser minimizado en la reacción de conjugación, preferiblemente por debajo de 0.1 M, 0.05M, 0.01 , 0.005M, 0.001M, y más preferiblemente no estar presente para nada. Todas estas características del proceso aseguran que las ampollas permanezcan estables y en solución a lo largo del proceso de conjugación. El proceso de conjugación EDAC/NHS es un proceso preferido para conjugación intra-arnpolla. EDAC/NHS es preferido para formaldehído el cual puede entrelazarse a muy alto grado, de esta forma adversamente afecta la capacidad de filtración, EDAC reacciona con ácidos carboxilicos (tales como KDO en LOS) para crear un intermediario de éster activo. En presencia de un nucleófilo de amina (tales como Usinas en las proteínas de membrana exterior tal como PorB), se forma un enlace de amida con liberación de una isourea por producto. Sin embargo, la eficiencia de una reacción mediada por EDAC puede ser incrementada a través de la formación de un intermediario de éster Sulfo-NHS. El éster Sulfo-NHS sobrevive en una solución acuosa más tiempo que el éster activo formado de la reacción de EDAC solo con un carboxilato. De esta forma, se pueden realizar rendimientos más altos de formación de enlaces de amida utilizando este proceso de dos etapas. La conjugación EDAD/NHS se discute en J. V. Staros, R. W. Wright y D M. Swingle. El mejoramiento a través de N-hidroxisuccinimida de reacciones acopladas mediadas por carbodiimida soluble en agua. Química analítica 156: 220-222 (1986); y Bioconjugates Techniques. Greg T.Hermanson (1996) pp 173-176. Preferiblemente se utilizan ampollas de 0.01-5 mg de EDAC/mg en la reacción, más preferiblemente una ampolla de 0.05-1 mg EDAC/mg. La cantidad de EDAC utilizada depende de la cantidad de LOS presente en la muestra la cual a su vez depende del % de desoxicolato (DOC) utilizado para extraer las ampollas. A un % de DOC bajo (por ejemplo, 0.1%), se utilizan cantidades más altas de EDAC (1 mg/mg y más), sin embargo a un % más alto de DOC (por ejemplo, 0.5%), se utilizan cantidades menores de EDAC (0.025-0.1 mg/mg) para evitar muchos entrelazamiento inter-ampolla. Un proceso preferido de la invención es por consiguiente un proceso para producir LOS conjugados intra-ampolla (preferiblemente meningocócicos) que comprenden los pasos de conjugación de las ampollas en presencia de EDAC/NHS a un pH de entre 7.0 y un pH de 9.0 (preferiblemente alrededor de un pH de 7.5), en 1-5% (preferiblemente alrededor de 3%) de sacarosa, y opcionalmente en condiciones que substancialmente carecen de NaCI (como se describió anteriormente), y aislando las ampollas conjugadas de la mezcla de reacción. La reacción puede ser seguida en geles de separación Western de la mezcla de reacción utilzando mAbs anti-LOS (por ejemplo, anti-L2 o anti-L3) para mostrar el incremento del pero molecular de LOS para una proporción mayor de los LOS en las ampollas a medida que el tiempo de reacción transcurre. Utilizando dichas técnicas se pueden recuperar rendimientos del 99% de las ampollas. Se encontró que EDC es un excelente agente de entrelazamiento intra-ampolla, ya que entrelaza LOS a O P suficientemente para una inmunogenicidad dependiente de T de LOS mejorada, pero no se entrelaza a él a un alto grado que pueden ocurrir problemas tales como capacidad de filtración, agregación y entrelazamiento intra-ampolla. La morfología de las ampollas generadas es similar a aquella de ampollas no conjugadas (a través de microscopio electrónico). Además, el protocolo anterior evitó que se presentara un entrelazamiento demasiado alto (el cual puede reducir la inmunogenicidad fe OMPs protectores presentes sobre la superficie de la ampolla, por ejemplo TbpA o Hsf). Se prefiere que la cepa meningococica se la cual se derivan las ampollas sea una cepa mutante que no puede producir el polisacárido capsular (por ejemplo, una de las cepas mutantes descritas anteriormente, en particular siaD"). También se prefiere que las composiciones inmunogénicas efectivas contra la enfermedad meningococica comprendan ambas, una ampolla L2 y una L3, en donde las LOS L2 y L3 ambas se conjugan con las proteínas de membrana exterior. Además, se prefiere que la estructura de LOS dentro de la ampolla conjugada intra-ampolla sea consistente con ésta habiendo sido derivada de una cepa meningococica IgtB" (como se describe más adelante). Más preferiblemente las composiciones inmunogénicas comprenden ampollas intra-ampolla-conjugadas: derivadas de una cepa meningococica mutante que no puede producir el polisacárido capsular y es IgtB; comprendiendo ampollas L2 y L3 derivadas de las cepas meningocócicas mutantes que no pueden producir el polisacárido capsular; comprendiendo ampollas L2 y L3 derivadas de las cepas meningocócicas mutantes que son IgtB; o más preferiblemente comprendiendo ampollas L2 y L3 derivadas de las cepas meningocócicas mutantes que no pueden producir el polisacárido capsular y que son IgtB . La cepa meningocócica L3 típica que pueden ser utilizada para la presente invención es la cepa menB H44/76. Un cepa L2 típica es la cepa menú B16B6 o la cepa de tipo C meningocócica 39E. Como se manifestó anteriormente, las ampollas de la invención han sido d es i ntoxi cad as a un grado a través de la acción de la conjugación, y no necesitan ser desintoxicadas adicionalmente, sin embargo los métodos de desintoxicación adicionales pueden utilizarse para una seguridad adicional, por ejemplo utilizando ampollas derivadas de una cepa meningocócica que es htrB" o msbB" o agregando un equivalente funcional de péptido no tóxico de polimixina B [una molécula con alta afinidad al Lípido A] (preferiblemente SEAP 2) a la composición de la ampolla (como se describió anteriormente). En la forma anterior, las ampollas meningocócica y las composiciones inmunogénicas que comprenden ampollas son provistas, las cuales tienen como un antígeno importante LOS, el cual es substancialmente no tóxico, carece de problemas de autoinmunidad, tiene un carácter dependiente de T, está presente en su ambiente natural, y es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo bactericida contra más de 90% de las cepas meningocócicas (en el caso de composiciones L2 + L3). Preferiblemente la conjugación LOS intra-ampolla deberá incorporar 1, 2, o los 3 siguientes pasos del proceso: la conjugación del pH deberá ser mayor de un pH 7.0, preferiblemente mayor o igual a un pH de 7.5 (más preferiblemente un pH por debajo de 9); se deberán mantener condiciones de 1-5%, preferiblemente 2-4%, más preferiblemente alrededor de 3% de sacarosa durante la reacción: NaCI deberá se minimizado en la reacción de conjugación, preferiblemente por debajo de 0.1M, 0.05M, 0.01M, 0.005M, 0.001 M, y más preferiblemente no estar presente para nada. Todas estas características del proceso aseguran que las ampollas permanezcan estables y en solución a lo largo del proceso de conjugación. Aunque LOS puede ser conjugado dentro de las ampollas a proteínas de membrana exterior a través de varias técnicas y químicas, el proceso de conjugación EDAC/NHS es un proceso preferido para la conjugación intra-ampolla. EDAC/NHS es preferido para formaldehído, el cual puede entrelazarse a un alto grado, de esta forma adversamente afecta la calidad de filtración. EDAC reacciona con ácidos carboxílicos para crear un intermediario de éster activo. En presencia de un nucleófilo de amina, se forma un enlace de amida con liberación de una isourea por producto. Sin embargo, la eficiencia de una reacción mediada por EDAC puede ser incrementada a través de la formación de un intermediario de éster Sulfo-NHS. El éster Sulfo-NHS sobrevive en una solución acuosa más tiempo que el éster activo formado de la reacción de EDAC solo con un carboxilato. De esta forma, se pueden realizar rendimientos más altos de formación de enlaces de amida utilizando este proceso de dos etapas. La conjugación EDAD/NHS se discute en J. V. Staros, R. W. Wright y D. M. Swingle. El mejoramiento a través de N- idroxisuccinimida de reacciones de acoplamiento mediadas por carbodiimida soluble en agua. Química analítica 156: 220-222 (1986); y Bioconjugates Techniques. Greg T.Hermanson (1996) pp 173-176. Un proceso preferido de la invención es por consiguiente un proceso para la producción de LOS conjugado intra-ampolla (preferiblemente meningocócica) que comprende los paso de conjugar ampollas en presencia de EDAC/NHS a un pH de entre 7.0 y un pH de 9.0 (preferiblemente alrededor de un pH de 7.5), en 1-5% (preferiblemente alrededor de 3%) de sacarosa, y opcionalmente en condiciones que substancialmente carecen de NaCI (como se describió anteriormente), y aislando las ampollas conjugadas de la mezcla de reacción. Después de la reacción debe seguir la separación de geles de la mezcla de reacción utilizando mAbs anti-LOS (por ejemplo, anti-L2 o anti-L3) para mostrar el incremento del peso molecular de LOS para un proporción mayor de LOS en las ampollas cuando pasa el tiempo de reacción. Los rendimientos de 99% de ampollas pueden ser recuperados utilizando dichas técnicas. EDAC se encontró que es un agente de entrelazamiento de intra-ampollas excelente en que entrelaza LOS a OMP suficientemente para mejorar la inmunogeneicidad dependiente de T de LOS, pero no se entrelaza a dicho alto grado que puedan ocurrir problemas tales como una pobre capacidad de filtración y entrelazamiento inter-ampolla. Un entrelazamiento muy alto también deberá evitarse para evitar cualquier disminución en la inmunogeneicidad de las OMPs protectoras naturalmente presentes en la superficie de la ampolla, por ejemplo, TbpA. 5. Proteínas de membrana exterior integrales Otras categorías de proteínas Neisserial también pueden ser candidatas para la inclusión en las vacunas Neisserial de la invención y pueden ser capaces de combinarse con otros antígenos en una forma sorprendentemente efectiva. Las proteínas asociadas de membrana, particularmente proteínas de membrana integral y más ventajosamente proteínas de membrana exterior, especialmente proteínas de membrana exterior integral pueden ser utilizadas en las composiciones de la presente invención. Un ejemplo de dichas proteínas es P1dA también conocida como OmplA (NMB 0464) (WO 00/15801 ), la cual es una proteína de membrana exterior de fosfolipasa Neisserial. Ejemplos adicionales son TspA (NMB 0341) (Infect. Immun. 1999, 67; 3533-3541 ) y TspB (proteína que estimula la célula T) (WO 00/03003; NMB 1548, NMB1628 o NMB 1747). Los ejemplos adicionales incluyen PilQ (NMB 1812) (W099/61620), OMP85 - también conocida como D15- (NMB0182) (WO00/23593), NspA (U52066) (W096/29412) , FhaC (NMB 0496 o NMB 1780), PorB (NMB 2039) (Mol. Biol. Evol. 12; 363-370, 1995), HpuB (NC_003116. 1), TdfH (NMB 1497) (Microbiology 2001, 147; 1277-1290), OstA (NMB0280), MltA también conocida como GNA33 y Lipo30 (N B0033), HtrA (NMB 0532; WO 99/55872), HimD (N B 1302), HisD (NMB 1581), GNA 1870 (NMB 1870), HlpA (N B 1946), NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, TbpA (N B 0461) (W092/03467) (ver también bajo proteínas de adquisición de hierro) y LbpA (NMB 1541 ).

O P85 Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender la OMP85 de longitud completa, preferiblemente como parte de una preparación OMV. Los fragmentos de OMP85 también se pueden utilizar en composiciones inmunogénicas de la invención, especialmente, el dominio expuesto en la superficie de OMP85 hecho de los residuos de aminoácido 1-475 o 50-475 está preferiblemente incorporado dentro de un componente de subunidad de las composiciones inmunogénicas de la invención. La secuencia anterior para el dominio expuesto en la superficie de OMP85 puede ser extendido o truncado por hasta 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, o 30 aminoácidos en cualquiera o ambos de los términos N o C. Se prefiere que la secuencia de señal sea omitida del fragmento OMP85.

OstA OstA funciona en la síntesis de lipopolisacáridos y puede ser considerada como siendo un regulador de toxicidad. OstA puede alternativamente ser incluida en la categoría de toxinas en donde la categoría de toxina se amplia para contener reguladores de toxicidad asi como toxinas.

Composiciones inmunoqénicas Una composición inmunogénica es una composición que comprende por lo menos un antigeno que es capaz de generar una respuesta inmune cuando se administra a un huésped. referiblemente, dichas preparaciones ¡nmunogénicas son capaces de generar una respuesta inmune protectora contra Neisserial, preferiblemente infección por Neisserial meningitidis o Neisserial gonorrhoeae. La invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden por lo menos dos antígenos, las cuales preferiblemente provocan una o más de una respuesta bactericida sinergística, protectora o de bloqueo de adhesión.

Ensayos bactericidas SBA de la invención Dicha respuesta sinergística puede estar caracterizada por el SBA provocado por la combinación de antígenos siendo de por lo menos 50%, dos veces, tres veces, preferiblemente cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces y más preferiblemente diez veces mayor que el SBA provocado por cada antígeno separadamente. Preferiblemente SBA se mide contra una cepa homologa a partir de la cual se derivan los antigenos y preferiblemente también contra un panel de cepas heterólogas. (Ver a continuación un panel representativo por ejemplo BZ19 (B:2b:P1.2) perteneciente al grupo A-4, B16B6 (B: 2a: P1. 2) perteneciente al complejo ET-37; y H44/76 (B: 15 : P1. 7,16)). SBA es el marcador inmunológico más comúnmente acordado para estimar la eficacia de una vacuna meningocócica (Perkins y otros, J Infect Dis. 1998, 177:683-691 ). Satisfactoriamente SBA puede ser constatado por cualquier método conocido. SBA puede ser llevado a cabo utilizando suero obtenido de modelos de animales (ver ejemplos 17-20), o de sujetos seres humanos. Un método preferido para conducir SBA con suero de seres humanos es el siguiente. Una muestra de sangre se toma antes de la primera vacunación, dos meses después de la segunda vacunación y un mes después de la tercera vacunación (tres vacunaciones en un año siendo un agenda una vacunación primaria humana típica administrada en los 0, 2, y 4 meses, o 0, 1, y 6 meses). Dichas agendas de vacunación primaria humana pueden ser llevadas a cabo en infantes de menos de 1 año de edad (por ejemplo al mismo tiempo que se llevan a cabo las vacunaciones Hib) o de 2-4 años de edad o los adolescentes también pueden ser vacunados para la prueba SBA con dicha agenda de vacunación primaria. Se puede tomar una segunda muestra de sangre a los 6 a 12 meses después de la primera vacunación y un mes después de una dosis de defensa, si es aplicable. SBA será satisfactoria para una preparación de antígeno o de ampolla con actividad bactericida homologa si un mes después de la tercera dosis de vacunación (de la agenda de la vacunación primaria) (en infantes de 2-4 años de edad, o adolescentes, pero preferiblemente en infantes en el primer año de vida) el porcentaje de sujetos con un incremento de cuatro veces en términos de concentración de SBA (dilución del anticuerpo) (comparado con la concentración de la pre-vacunación) contra la cepa de meningococos a partir de la cual los antígenos de la invención se derivan, es mayor que 30%, preferiblemente mayor que 40%, más preferiblemente mayor que 50%, y de preferencia mayor que 60% de los sujetos.

Por supuesto una preparación de antígeno o ampolla con actividad bactericida heterologa también puede constituir la preparación de ampolla con actividad bactericida homologa si también puede provocar un SBA satisfactorio contra la cepa meningocócica a partir de la cual se deriva. SBA será satisfactoria para una preparación de antigeno o ampolla con actividad bactericida heterologa si uno mes después de la tercera dosis de vacuna (o de la agenda de vacunación primaria) (en infantes de 2-4 años de edad, o adolescentes, pero preferiblemente en infantes en el primer año de vida) el porcentaje de sujetos con un incremento de cuatro veces en términos de concentración de SBA (dilución del anticuerpo) (comparado con la concentración de la pre-vacunación) contra tres cepas heterólogas de meningococo es mayor que 20%, preferiblemente mayor que 30%, más preferiblemente mayor que 35%, y de preferencia mayor del 40% de los sujetos. Dicha prueba es una buena indicación de si la preparación de antígeno o ampolla con actividad bactericida heteróloga puede inducir anticuerpos bactericidas cruzados contra varias cepas meningocócicas. Las tres cepas heterólogas deberán preferiblemente tener un complejo de tipo (ET) o un patrón de inserción de secuencia multi-sitio (MLST) (ver Maiden y otros, PNAS EUA 1998, 95:3140-5) una con la otra y preferiblemente la cepa a partir de la cual la preparación de antígeno o ampolla con actividad bactericida heteróloga se forma o se deriva. Una persona con experiencia fácilmente será capaz de determinar tres cepas con diferentes completos ET que reflejan la diversidad genética observada entre meningocócica, particularmente cepas de tipo B meningocócicas que son reconocidas como siendo la causa de una carga de enfermedades importante y/o que representan linajes hiper-virulentos de MenB (ver, Maiden y otros, supra). Por ejemplo, tres cepas que podrían ser utilizadas son las siguientes: BZ10 (B:2b:P1. 2) que pertenecen al grupo A-4; B16B6 (B:2a:P1.2) que pertenecen al complejo ET-37; y H44/76 (B: 15: P .7, 16 ) que pertenecen al complejo ET-5, o cualesquiera otras cepas que pertenecen al mismo grupo ET. Dichas cepas pueden ser utilizadas para probar una preparación de antígeno o ampolla con actividad bactericida heteróloga hecha o derivada de, por ejemplo, la cepa meningocócica CU385 (B:4:P1.15) la cual pertenece al complejo ET-5. Otra cepa de muestra que podría ser utilizada es del clon epidémico del Linaje 3 (por ejemplo, NZ124 [B:4:P1.7,4]). Otra cepa ET-37 es NGP165 (B:2a:P1.2). Los procesos para medir la actividad SBA son conocidos en la técnica. Por ejemplo un método que podría ser utilizado se describe en WO 99/09176 en el Ejemplo 10C. En términos generales, un cultivo de una cepa que va a ser probada se hace crecer (preferiblemente en condiciones de reducción de hierro, a través de la adición de un quelatador de hierro tal como EDDA al medio de crecimiento) en una fase de registro de crecimiento. Esto se puede suspender en un medio con BSA (tal como el medio Hanks con 0.3% de BSA) con el fin de obtener una suspensión de célula trabajando ajustada a aproximadamente 20000 CFU/ml. Se pueden hacer series de mezclas de reacción mezclando series de diluciones dobles del suero que se va a probar (preferiblemente inactivado por calor a 56°C durante 30 minutos) [por ejemplo en un volumen de 50 µ?/cavidad], Los frascos de reacción deberán ser incubados (por ejemplo 37°C durante 15 minutos) y agitarse (por ejemplo a 210 rpm). La mezcla de reacción final [por ejemplo en un volumen de 100 µ?] adicionalmente contiene una fuente de complemento [tal como un volumen final de 25% del suero de conejo bebé preprobado] y se incuba como anteriormente [por ejemplo, 37°C durante 69 minutos]. Se puede utilizar una placa de microtitulación de 96 cavidades de fondo en forma de U de poliestireno estéril para este ensayo. Se puede tomar una alícuota [por ejemplo, 10 µ?] de cada cavidad utilizando una pipeta mutlicanal, y se deja caer dentro de placas de agar Mueller-Hinton (preferiblemente conteniendo 1% de Isovitalex y 1% de Suero de Caballo inactivado por calor), y se incuba (durante por ejemplo 18 horas a 37°C en 5% de C02). Preferiblemente, las colonias individuales pueden contarse hasta 80 CFU por alícuota.

Las siguientes tres muestras de prueba pueden ser utilizadas como controles: regulador de pH + bacteria + complemento; regulador de pH + bacteria + complemento inactivado; suero + bacteria + complemento inactivado. Las concentraciones de SBA pueden ser fácilmente calculadas utilizando un programa que procese datos para dar una medición de la dilución que corresponde a 50% de la aniquilación de células a través de un cálculo de regresión.

Ensayos de protección de animales Alternativamente, la respuesta sinergística puede estar caracterizada por la eficacia de la combinación de antígenos en ensayos de protección de animales. Por ejemplo, los ensayos descritos en el Ejemplo 12 o 13 pueden ser utilizados. Preferiblemente el número de animales protegidos por la combinación de antígenos es significativamente mejorado comparado con el uso de antigenos por sí solos, particularmente en dosis subóptimas de antígeno. Una vacuna exitosa para la prevención de infección por N. gono puede requerir más de uno de los siguientes elementos: generación de suero y/o anticuerpos mucosos para facilitar la aniquilación mediada por complemento de los gonococos, y/o para mejorar la fagocitosis y aniquilación microbiana a través de leucocitos tales como leucocitos polimorfonucleares, y/o prevenir la adhesión del gonococo a los tejidos del huésped; la inducción de la respuesta inmune mediada por célula también puede participar en la protección. El mejoramiento de la eficacia de una preparación de vacuna de gono de ampolla de la invención puede ser evaluada analizando la respuesta inmune inducida por suero y/o anticuerpos de la mucosa que tienen antiadherencia, y/o propiedades formadoras de proteína, y/o actividad bactericida, como se describe por otros (McChesney D y otros, Infect. Immun. 36: 1006, 1982 ; Boslego J y otros: Efficacy trial of a purified gonococci pilus vaccine, in Program and Abstracts of the 24a a Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, American Society for icrobiology, 1984; Siegel M y otros, J. Infect. Dis 145: 300, 1982; de la Pas, Microbiology, 141 (Pt4): 913-20, 1995). Un modelo de ratón de infección genital a través de N. gono ha sido recientemente descrito (Plante M, J. Infect. Dis., 182 :848-55, 2000). El mejoramiento de eficiencia de una vacuna de gono de ampolla de la invención también podría ser evaluada por su habilidad para prevenir o para reducir la colonización a través de N. gono en este modelo de ratón de infección.

Ensayo de bloqueo de adhesión Alternativamente, la respuesta sinergística puede ser caracterizadas por la eficacia de la combinación de antígenos en un ensayo de bloqueo de adhesión. Por ejemplo, el ensayo descrito en el ejemplo 11 puede ser utilizado. Preferiblemente, la extensión del bloqueo inducido por antisuero originado contra la combinación de antígenos es significativamente mejorado comparado con el uso de antisuero originado contra los antígenos por sí solos, particularmente en dosis subóptimas de anticuerpo.

Composiciones de subunidad La composición inmunogénica de la invención puede ser una composición de subunidad. Las composiciones de subunidad en las cuales los componentes han sido aislados y purificados en por lo menos 50%, preferiblemente por lo menos 60%, 70%, 80%, 90% puros antes de mezclar los componentes para formar la composición inmunogénica . La composición de subunidad antigénica de la invención preferiblemente comprende por lo menos 2 antígenos seleccionaos de la siguiente lista: FhaB, PilC, Hsf, Hap, NadA, O P85, porteasa I g A , AspA, dominio pasajero de AspA, dominio pasajero de Hsf, dominio pasajero de Hap, FrpA, FrpC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB, TspA, TspB, PldA, PilQ, FhaC, NspA, y cualquiera o ambos de el inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Las composiciones de subunidad pueden ser soluciones acuosas de proteínas solubles en agua. Pueden comprender detergente, preferiblemente detergente no iónico, zwiteriónico, o iónico con el fin de solubilizar porciones hidrofóbicas de antígenos. Estos pueden comprender lipidos para que se formen las estructuras de liposoma, permitiendo la presentación de antígenos con una estructura que abarca una membrana de lípido.

Preparaciones de vesícula de membrana exterior El serogrupo B de N. meningitidis (menB) excreta ampollas de membrana exterior en suficientes cantidades para permitir su fabricación a una escala industrial. Una vesícula de membrana exterior también puede ser preparada a través del proceso de extracción de detergente de las células bacterianas (ver, por ejemplo, EP 11243). La composición inmunogénica de la invención también puede comprender una preparación de vesícula de membrana exterior que tiene por lo menos dos antígenos que han sido regulados de manera ascendente, ya sea recombinantemente o a través de otros medios incluyendo crecimiento bajo condiciones de reducción de hierro. Ejemplos de antígenos que podrían regularse de manera ascendente en dicha preparación de vesícula de membrana exterior incluyen; NspA, Hsf, Hap, OMP85, TbpA (alto), TbpA (bajo), LbpA, TbpB, LbpB, PMQ, AspA, TdfH, PorB, HpuB, P2086, NM-ADPRT, MafA, MafB y PldA. Dichas preparaciones opc ion a I me n te también podrían contener cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. La fabricación de las preparaciones de ampolla de cepas de Neisserial puede ser lograda a través de cualquiera de los métodos bien conocidos por una persona con experiencia. Preferiblemente se utilizan los métodos descritos en EP 301992, EU 5,597,572, EP 11243 o EU 4,271, 147, Frederikson y otros (NIPH Annals

[1991], 14:67-80), Zollinger y otros (J. Clin. Invest.

[1979], 63:836-848), Saunders y otros (Infect. Immun.

[1999], 67: 113-119), Drabick y otros (Vaccine

[2000], 18: 160-172) o WO01/09350 (Ejemplo 8). En general, los OMVs se extraen con un detergente, preferiblemente desoxicolato, y los ácidos nucleicos son opcionalmente removidos enzimáticamente. La purificación se logra a través de ultracentrifugación opcionalmente seguida por cromatografía de exclusión de tamaño. Si 2 o más diferentes ampollas de la invención están incluidas, pueden ser combinadas en un contenedor individual para formar una preparación multivalente de la invención (aunque una preparación también se considera multivalente si las diferentes ampollas de la invención son composiciones separadas en contenedores separados, las cuales se administran al mismo tiempo [la misma visita a un practicante] a un huésped). Las preparaciones OMV son usualmente esterilizadas a través de filtración a través de un filtro de 0.2 µp?, y son preferiblemente almacenadas en una solución de sacarosa (por ejemplo, 3%) la cual se sabe que estabiliza las preparaciones de ampolla. La regulación ascendente de proteínas dentro de las preparaciones de vesícula de membrana exterior puede ser lograda a través de la inserción de una copia extra de un gen en una cepa Neisserial a partir de la cual la preparación OMV se deriva. Alternativamente, el promotor de un gen puede ser intercambiado por un promotor más fuerte en la cepa Neisserial, a partir de la cual la preparación OMV se deriva. Dichas técnicas se describen en WO 01/09350. La regulación ascendente de una proteína conducirá a una nivel más alto de proteina que está presente en OMV comparado con el nivel de proteína presente en OMV derivada de N. meningitidis no modificada (por ejemplo, la cepa H44/76). Preferiblemente el nivel será de 1.5, 2, 3, 4, 5, 7, 10 o 20 veces más alto. Cuando se pretende que LPS sea un antígeno adicional en el OMV, se puede utilizar preferiblemente un protocolo que utiliza una concentración baja de detergente de extracción (por ejemplo desoxicolato o DOC) en el método de preparación OMV para así conservar los altos niveles de enlace a LPS mientras se remueve el LPS pobremente enlazado, tóxico. La concentración de DOC utilizada es preferiblemente de 0-0.5% DOC, 0.02-0.4% DOC, 0.04-0.3% DOC más preferiblemente 0.06%-0.2% DOC o 0.08-0.15% DOC más preferiblemente alrededor de o exactamente 0.1% DOC. "Secuencia promotora fuerte" se refiere a un elemento de control regulador que incrementa la transcripción para un gen que codifica el antígeno de interés. "Expresión de la Regulación ascendente" se refiere a cualesquiera medios para mejorar la expresión de un antígeno de interés, con relación a esa ampolla no modificada (es decir, de existencia natural). Se entiende que la cantidad de "regulación ascendente" variará dependiendo del antígeno particular de interés pero no excederá una cantidad que afectará la integridad de la ampolla. La regulación ascendente de un antígeno se refiere a la expresión que es de por lo menos 10% mayor que aquella de la ampolla no modificada. Preferiblemente es de por lo menos 50% más alta. Más preferiblemente es de por lo menos 100% (dos veces) más alta. Más preferiblemente es de 3, 4, 5, 7, 10, 20 veces más alta. Alternativamente o adicionalmente, la expresión de la regulación ascendente puede referirse a la conversión de la expresión no condicional en cambios metabólicos o nutricionales, particularmente en el caso de TbpA, TbpB, LpbA y LpbB. Preferiblemente el nivel de expresión se evalúa cuando las ampollas se han derivado de crecimiento de bacterias en condiciones limitadas en hierro (por ejemplo en la presencia de un quelatador de hierro).

Otra vez para propósitos de claridad, los términos 'diseñando una cepa bacteriana para producir menos de dicho antígeno' o regulación descendente se refiere a cualesquiera medios para reducir la expresión de un antigeno (o la expresión de un producto de gen funcional) de interés, con relación a aquel del no modificado (es decir, ampolla de existencia natural), preferiblemente a través de eliminación, dicha expresión es de por lo menos 10% menor que aquella de la ampolla no modificada. Preferiblemente es por lo menos 50% más baja y de preferencia completamente ausente. Si la proteína regulada de manera descendente es una enzima o una proteína funcional, la regulación descendente puede lograrse introduciendo una o más mutaciones dando como resultado un 10%. 20%, 50%, 80% o preferiblemente un 100% de reducción en la actividad enzimática o funcional. Los pasos de ingeniería requeridos para modular la expresión de proteínas de Neísserial pueden ser llevados a cabo en una variedad de formas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, las secuencias (por ejemplo, promotoras o marcos de lectura abierta) pueden ser insertadas, y los promotores/genes pueden ser deteriorados a través de la técnica de la inserción de transposón. Por ejemplo, para regular de manera ascendente una expresión de gen, un promotor fuerte podría ser insertado a través de un transposón de hasta 2 kb en corriente ascendente del codón de iniciación del gen (más preferiblemente 200-600 bp en corriente ascendente, más preferiblemente aproximadamente 400 bp en corriente ascendente). La mutación o eliminación de punto también puede ser utilizada (particularmente para la expresión de la regulación descendente de un gen). Dichos métodos, sin embargo, pueden ser completamente inestables, y por consiguiente se prefiere que el paso de ingeniería sea llevado a cabo a través de un evento de recombinación homólogo. Preferiblemente, el evento toma lugar entre una secuencia (una región recombinogénica) de por lo menos 30 nucleótidos en el cromosoma bacteriano, y una secuencia (una segunda región recombinogénica) de por lo menos 30 nucleótidos en un vector transformado dentro de la cepa. Preferiblemente, las regiones son de 40-1000 nucleótidos, preferiblemente de 100-800 nucleótidos, más preferiblemente de 500 nucleótidos). Estas regiones recombinogénicas deberán ser lo suficientemente similares que son capaces de hibridízarse una a la otra bajo condiciones altamente rígidas. Los métodos utilizados para llevar a cabo los eventos de modificación genética aquí descritos (tales como la regulación ascendente o regulación descendente en un genoma Neisserial) como se describe en WO 01/09350. Los promotores fuertes típicos que pueden estar integrados en Neisseria son porA, porB, IgtF, Opa, p110, Ist, y hpuAB. PorA y PorB son preferidos como promotores fuertes, constitutivos. Se ha establecido que la actividad del promotor PorB está contenida en un fragmento correspondiente a los nucleótidos -1 a -250 en corriente ascendente del codón de iniciación de porB.

Regulación ascendente de la expresión de antí enos a través del crecimiento en un medio limitado en hierro La regulación ascendente de algunos antígenos en una preparación de vesícula de membrana exterior de la invención se logra preferiblemente a través del aislamiento de vesículas de membrana exterior de una cepa de los padres de Neisseria que crece bajo condiciones de limitación de hierro. Una baja concentración de hierro en el medio dará como resultado una expresión incrementada de proteínas involucradas en la adquisición de hierro incluyendo TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB y P2086. La expresión de estas proteínas es por lo tanto regulada en forma ascendente sin la necesidad de recombinantemente modificar el gen involucrado, por ejemplo a través de la inserción de un promotor más fuerte o insertando una copia adicional del gen. La invención también podría abarcar la regulación ascendente de proteínas de adquisición de hierro a través del crecimiento en medio con limitación de hierro en donde el gen ha sido recombinantemente modificado. La limitación de hierro se logra a través de la adición de un quelatador de hierro al medio de cultivo. Los quelatadores de hierro adecuados incluyen 2,2-Dipiridil, ácido EDDHA(etilenodiamina-di(o-hidroxifenilacético) y Desferal (mesilato de deferoxamina, Sigma). Desferal es el quelatador de hierro preferido y se agrega al medio de cultivo en una concentración de entre 10 y 100 µ?, preferiblemente 25-75 µ?, más preferiblemente 50-70 µ?, de preferencia a 60 µ . El contenido de hierro del medio viene principalmente de extracto de levadura y constituyentes de peptona de soya y la cantidad presente puede variar entre los lotes. Por lo tanto las diferentes concentraciones de Desferal pueden ser óptimas para lograr la regulación ascendente de proteínas de adquisición de hierro en diferentes lotes del medio. Las personas con experiencia en la técnica fácilmente serán capaces de determinar la concentración óptima. En términos básicos, se deberá agregar suficiente quilatador de hierro al medio para regular de manera ascendente la expresión de la protelna regulada con hierro deseada, pero no tanto que afecte adversamente el crecimiento de la bacteria. Preferiblemente, la regulación ascendente de las proteínas de adquisición de hierro a través del crecimiento bajo condiciones limitadas en hierro se combina con la regulación ascendente recombinante de otros antígenos para que la vesícula de la membrana exterior de la invención se logre.

Regulación descendente/Remoción de antíqenos inmunodominantes variables y no protectores Muchos antígenos de superficie son variables entre las cepas bacterianas y como una consecuencia son protectores solamente contra un grupo limitado de cepas estrechamente relacionadas. Un aspecto de esta invención cubre las vesículas de membrana exteriores de la invención en la cual la expresión de las proteínas exteriores está reducida, o, preferiblemente, el gen(es) que codifican la proteína(s) de superficie se elimina. Dicha eliminación da como resultado una cepa bacteriana que produce ampollas las cuales, cuando se administran en una vacuna, tienen un fuerte potencial para una reactividad cruzada contra varias cepas debido a una influencia más alta ejercida a través de proteínas conservadas (retenidas en las membranas exteriores) en el sistema inmune de las vacunas. Ejemplos de dichos antígenos variables en Neisseria que pueden ser regulados de manera descendente en las composiciones ¡nmunogénicas de ampolla de la invención incluyen PorA, PorB, Opa.

Otros tipos de genes que podrían ser regulados de manera descendente o desactivados son los genes que, in vivo, pueden fácilmente ser activados (expresados) o desactivados a través de la bacteria. Ya que las proteínas de membrana exterior codificadas a través de dichos genes no siempre están presentes en la bacteria, la presencia de dichas proteínas en las preparaciones de ampollas también puede ser perjudiciales para la efectividad de la vacuna por las razones anteriormente manifestadas. Un ejemplo preferido para regular de manera descendente o eliminar es la proteína Opc de Neisseria. La inmunidad anti-Opc inducida por una Opc que contiene la vacuna de ampolla solamente tiene capacidad protectora limitada según el organismo que infecta puede convertirse fácilmente Opc". Por ejemplo, estos genes variables o no protectores pueden ser regulados de manera descendente en la expresión, o terminalmente desactivados. Esto tiene la ventaja de concentrar el sistema inmune en mejores antígenos que están presentes en cantidades bajas en las ampollas de superficie. Por regulación descendente también significa que los bucles inmunodominantes, de superficie expuesta de las proteínas de membrana exterior anteriores puedan ser alteradas o eliminadas con el fin de hacer que la proteína de membrana exterior resultante sea menos inmunodominante. Los métodos para la regulación descendente de expresión se describen en WO 01/09350. Las combinaciones preferidas de proteínas que van a ser reguladas de manera descendente en las composiciones i n m u n og é n ica s de ampolla de la invención incluyen PorA y OpA; PorA y OpC; OpA y OpC; PorA y OpA y OpC. Cuatro genes Opa diferentes se sabe que existen en el genoma meningocócico (Ano y otros 1991 Mol. Microbiol. 5: 1429-37), por lo tanto cuando se dice que Opa va a ser regulado de manera descendente en la expresión quiere decir que preferiblemente 1, 2, 3, o (preferiblemente) los 4 genes presentes en el meningococo son así regulados de manera descendente. Dicha regulación descendente puede ser llevada a cabo genéticamente como se describe en WO 01/09350 o buscando cepas meningocócicas estables, naturales, que se encuentran fácilmente, que no tienen o tienen una baja expresión a partir del sitio Opa. Dichas cepas pueden encontrarse utilizando la técnica descrita en Poolman y otros (1985 J. Med. Micro. 19: 203-209) en donde las células que son Opa" tienen un fenotipo diferente a Opa que expresa las células lo cual se puede ver buscando la aparición de las células en las placas o bajo el microscopio. Una vez encontrada, la cepa pueden ser mostrada como siendo establemente Opa" llevando a cabo una tinción Western sobre el contenido de la célula después de una corrida de fermentación para establecer la carencia de Opa. Cuando la regulación ascendente de algunos antigenos en la vesícula de membrana exterior se logra a través del crecimiento bajo condiciones de limitación de hierro, la proteína variable FrpB (Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J. Bacteriol. 181; 2895-2901 (1999)) también será regulada de manera ascendente. Los inventores han encontrado que es ventajoso regular de manera descendente la expresión de FrpB bajo estas circunstancias regulando de manera descendente la expresión de la proteína completa como se describe en WO 01/09350 o eliminando la región(es) variable de FrpB. Esto asegurará que la respuesta inmune provocada por la composición inmunogénica se dirige hacia los antígenos que están presentes en un amplio rango de cepas. La regulación descendente de FrpB está preferiblemente combinada con la regulación descendente de PorA y OpA; PorA y OpC; OpA y OpC; PorA y OpA y Opc en las composiciones inmunogénicas de ampolla de la invención. En una modalidad alternativa de la invención, FrpB se regula de manera descendente en las vesículas de membrana exterior que han sido preparadas a partir de cepas de Neisseria no creciendo bajo condiciones de limitación de hierro.

Desintoxicación de LPS Las ampollas de las composiciones inmunogénicas de la invención pueden ser desintoxicadas a través de métodos para la desintoxicación de LPS los cuales se describen en WO 01/09350. En particular los métodos para la desintoxicación de LPS de la invención involucran la regulación descendente/eliminación de las enzimas hrtB y/o msbB que se describen en WO 01/09350. Los genes msbB y hrtB de Neisseria también son llamados IpxLI y lpxL2, respectivamente (WO 01/09350) y las mutaciones de eliminación de estos genes se caracterizaron fenotípicamente a través de LOS del mutante msbB que pierde una cadena de acilo secundaria), y de LOS del mutante hrtB que pierde ambas cadenas de acilo secundarias. WO 93/03327 describe equivalentes funcionales del péptido no tóxico de polimicina B que pueden ser utilizados en las composiciones de la invención.

Dichos métodos preferiblemente se combinan con métodos de extracción de ampollas que involucran bajos niveles de DOC, preferiblemente de 0-0.3% DOC, más preferiblemente 0.05%-0.5% DOC, más preferiblemente alrededor de o exactamente 0.1% DOC. Los métodos adicionales para la desintoxicación de LPS incluyen agregar a las preparaciones de ampolla un equivalente funcional de péptido no tóxico de polimixina B (preferiblemente SEAP 2) como se describe anteriormente.

Polisacáridos de reacción cruzada El aislamiento de ampollas de membrana exterior de bacteria Gram-negati va encapsulada por lo general da como resultado la co-purificación del polisacárido capsular. En algunos casos, este material "contaminante" puede probar ser útil ya que el polisacárido puede mejorar la respuesta inmune conferida a través de otros componentes de ampolla. En otros casos sin embargo, la presencia del material de polisacárido contaminante en preparaciones de ampolla bacterianas puede probar un deterioro en el uso de ampollas en una vacuna. Por ejemplo, se ha mostrado que por lo menos en el caso de N. meningitidis que el polisacárido capsular del serogrupo B no confiere inmunidad protectora y es susceptible de inducir una respuesta autoinmune adversa en seres humanos. Consecuentemente, las vesículas de membrana exterior de la invención pueden ser aisladas de una cepa bacteriana para producción de ampollas, la cual ha sido diseñada de tal forma que está libre de polisacárido capsular. Las ampollas entonces serán adecuadas para uso en seres humanos. Un ejemplo particularmente preferido de dicha preparación de ampolla es uno del serogrupo B de N. meningitidis de polisacárido capsular. Esto se puede lograr utilizando cepas de producción de ampollas modificadas en las cuales los genes necesarios para la biosintesis capsular y/o exportación han sido dañadas. La inactivación del gen que codifica la biosintesis del polisacárido capsular o exportación puede lograrse a través de la mutación (mutación de punto, eliminación o inserción) ya sea de la región de control, la región de codificación, o ambas (preferiblemente utilizando técnicas de recombinación homologas descritas anteriormente), o a través de cualquier otra forma para disminuir la función enzimática de dichos genes. Además, la inactivación de los genes de biosintesis capsular también se puede lograr a través de la sobre expresión antisentido o mutagénesis de transposón. Un método preferido es la eliminación de algunos o todos los genes cps de Neisseria meinigitidis requeridos para la biosintesis y exportación del polisacárido. Para este propósito, el plásmido de reemplazo pMF121 (descrito en Frosh y otros 1990, Mol. Microbiol. 4:1215-1218) puede ser utilizado para entregar una eliminación de la butacón del grupo de genes cpsCAD( + galE) . La seguridad de los anticuerpos originados para LPS L2 y L3 ha sido cuestionados, debido a que la presencia de una estructura similar al grupo de oligosacárido de N-neotetraosa (Gafi'\-4GlcNAcf!1 -3Gai i -4T??ß1 -) presente en glicofigolípidos humanos. Aun si un gran número de personas ha sido vacunado sin peligro con vacunas de vesícula extraídas de desoxicolato conteniendo una cantidad residual de LPS L3 (G. Bjune y otros, Lancet (1991 ), 338,1093-1096; GVG. Sierra y otros, NIPH ann (1991 ), 14,195-210), la eliminación de la parte terminal de el LOS sacaridico es ventajosa en la prevención de cualquier reacción cruzada con estructuras presente en la superficie de los tejidos humanos. En una modalidad preferida, la inactivación del gen IgtB en una estructura LPS intermedia en la cual el residuo de galactosa terminal y el ácido siálico están ausentes (la mutación deja una estructura 4GlcNAcpi-3Gai i-4Glcp1- en LOS L2 y L3). Dichos intermediarios podrán ser obtenidos en una cepa LPS L3 y L2. Una versión alternativa y menos preferida (corta) de LPS puede ser obtenida a través de la desactivación del gen Irte. Una versión alternativa adicional y menos preferida de LPS puede ser obtenida desactivando el gen lata. Si se selecciona dicha mutación IgtA" se prefiere también desactivar la expresión de AGTC para prevenir que sea formado el inmunotipo L1 no inmunogénico. Los mutantes LgtB" son más preferidos según los inventores que está es la truncación óptima para resolver el aspecto de seguridad mientras aún conserva un epítopo de oligosacárido protector LPS que aún puede inducir una respuesta de anticuerpo bactericida. Por consiguiente, las composiciones inmunogénicas de la invención además comprenden preparaciones L2 y L3 (ya sea purificadas o en una ampolla aislada) o preparaciones de ampolla meningocócicas en general son ventajosamente derivadas de una cepa Neisserial (preferiblemente meningocócica) que ha sido diseñada genéticamente para permanentemente regular de forma descendente la expresión del producto de gen funcional del gen IgtB, IgtA o Irte, preferiblemente desactivando el gen, más preferiblemente eliminando todo o parte del promotor y/o el marco de lectura abierta del gen. Cuando las composiciones inmunogénicas anteriores de la invención se derivan de una cepa B de meninogococo, además se prefiere que el polisacárido capsular (el cual también contiene estructuras de sacárido de tipo humano) también sea removido. Aunque muchos genes podrían ser desactivados para lograr esto, los inventores han mostrado ventajosamente que se prefiere que la cepa de producción de ampollas haya sido genéticamente diseñadas para permanentemente regular de manera descendente la expresión del producto de gen funcional del gen siaD (es decir, regulando de forma descendente la actividad de polisialitransferasa cx-2-8), preferiblemente desactivando el gen, más preferiblemente eliminando todo o parte del promotor y/o marco de lectura abierto del gen. Dicha inactivación se describe en WO 01/09350. La mutación siaD (también conocida como synD) es la más ventajosa de muchas mutaciones que pueden dar como resultado la remoción del epítopo de tipo humano del polisacárido capsular, debido a que es una de las únicas mutaciones que no tienen efecto en la biosíntesis de los epítopos protectores de LOS, de esta forma siendo ventajoso en un proceso que ayuda a finalmente al uso de LOS como un antígeno protector, y tiene un efecto mínimo en el crecimiento de la bacteria. Un aspecto preferido de la invención es por consiguiente una preparación inmunogénica de ampolla como se describió anteriormente la cual se deriva de una cepa mutante de meningococo B I g t E siaD , una IgtA siaD" o, preferiblemente, una IgtB siaD". La cepa por sí sola es un aspecto adicional de la invención. Aunque la mutación siaD" es preferible por las razones anteriores, otras mutaciones que desactivan la síntesis de polisacárido capsular de meningococo B pueden ser utilizadas. De esta forma la cepa de producción de ampollas puede ser genéticamente diseñada para permanentemente regular de manera descendente la expresión del producto de gen funcional de uno o más de los siguientes genes: genes ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA (equivalente a synX y siaA), synB (equivalente a siaB) o synC (equivalente a siaC), preferiblemente desactivando el gen, más preferiblemente eliminando todo o parte del promotor y/o marco de lectura abierto del gen. La mutación IgtE" puede ser combinada con una o más de estas mutaciones. Preferiblemente la mutación IgtB" se combina con una o más de estas mutaciones. Un aspecto adicional de la invención es por consiguiente una preparación inmunogénica de ampolla como se describió anteriormente la cual se deriva de dicha cepa mutante combinada de meningococo B. La cepa por sí misma es un aspecto adicional de la invención. Un centro Neisserial que contiene varios genes /gf, incluyendo IgtB e Irte, y su secuencia es conocido en la técnica (M. P. Jennings y otros, icrobiology 1999,145, 3013-3021 y referencias citadas ahí, y J. Exp. Med. 180: 2181-2190

[1994]).

Cuando se va a utilizar LOS de longitud completa (no truncado) en el producto final, es deseable para LOS que no estén s i a I i I a d o s (es decir LOS genera una respuesta inmune contra las cepas meningocócicas ¡nvasoras, más peligrosas las cuales también están desialiladas. En dicho caso al utilizar una cepa negativa de cápsula que tiene un gen synA elmininado (equivalente a synX y siaA), synB (equivalente a síaB) o synC (equivalente a siaC) es ventajoso, como tal una mutación también convierte menB LOS en incapaz de ser sialilado. En las preparaciones de ampolla, particularmente en preparaciones extraídas con concentraciones de DOC bajas, LPS puede ser utilizado como un antígeno en la composición inmunogénica de la invención. Es sin embargo ventajoso regular de manera descendente/eliminar/desactivar la función enzimática de cualquiera de Irte, IgtA (principalmente en combinación con IgtC), o, preferiblemente, productos de gen/genes IgtB con el fin de remover estructuras lacto-N-neotetraosa de tipo humano. El centro Neisserial (y secuencias del mismo) comprendiendo los genes Igt para la biosintesis de la estructura del oligosacárido LPS es conocido en la técnica (Jennings y otros icrobiology 1999, 145; 3013-3021 y referencias citadas ahí, y J. Exp. ed. 180: 2181-2190

[1994]). La regulación de forma descendente/eliminación de IgtB (o el producto de gen funcional) se prefiere ya que deja el epítopo protector de LPS intacto. En las preparaciones de ampollo del serogrupo B de N. meningitidis de la Invención, la regulación descendente/eliminación de ambos, siaD y IgtB es son preferidas, (aunque una combinación de IgtB" con cualquiera de ctrA", ctrB-, ctrC-, ctrD', synA-(equivalente a synX- y siaA-), synB- (equivalente a siaB-) o synC-(equivalente a siaC-) en una cepa de producción de ampolla de meningococo B también se pueden utilizar) conduciendo a una preparación de ampolla con una seguridad óptima y retención del epítopo protector de LPS. Un aspecto adicional de la invención es por consiguiente una preparación inmunogénica de ampolla como se describió anteriormente la cual se deriva de dicha cepa mutante combinada de meningococo B. La cepa por sí sola es un aspecto adicional de la invención . La composición inmunogénica de la invención puede comprender por lo menos uno, dos, tres, cuatro, o cinco diferentes preparaciones de vesícula de membrana exterior. Cuando dos o más preparaciones OMV están incluidas, por lo menos un antígeno de la invención es regulado de manera ascendente en cada OMV. Dichas preparaciones OMV pueden derivarse de cepas Neisserial de las mismas especies y serogrupo o preferiblemente de cepas Neisserial de diferentes clases, serogrupo, serotipo, subserotipo o inmunotipo. Por ejemplo, una composición inmunogénica puede comprender una o más preparaciones de vesícula de membrana exterior que contienen LPS del inmunotipo L2 y una o más preparaciones de vesícula de membrana exterior que contienen LPS del inmunotipo L3, L2 o preparaciones OMV L3 son preferiblemente derivadas de una cepa estable que tiene una variabilidad de fase mínima en el centro del gen de síntesis del oligosacárido de LPS.

Vesículas de membrana exterior combinadas con composiciones de subunidad Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender ambas, una composición de subunidad y una vesícula de membrana exterior. Existen varios antígenos que son particularmente adecuados para la inclusión en una composición de subunidad debido a su solubilidad. Ejemplos de dichas proteínas son: FhaB, NspA, dominio pasajero de Hsf, dominio pasajero de Hap, dominio pasajero de AspA, AspA, OMP85, FrpA, FrpC, TbpB, LbpB, PilQ. La preparación de vesícula de membrana exterior podría tener por lo menos un antígeno diferente seleccionado de la lista siguiente que ha sido recombinantemente regulado de forma ascendente en la vesícula de membrana exterior: NspA, Hsf, Hap, O P85, TbpA (alto), TbpA (bajo), LbpA, TbpB, LbpB, NadA, TspA, TspB, PilC, PilQ, TdfH, PorB, HpuB, P2086, NM-ADPRT, MafA, afB y PldA; y opcionalmente comprende cualquiera o ambos de los inmunotipo L2 de LPS o inmunotipo L3 de LPS.

Composiciones inmunogénicas especificas de la invención En las combinaciones especificas listadas a continuación, en donde las combinaciones de antígenos están presentes en una ampolla, dichas combinaciones de antígenos deberán ser reguladas en forma ascendente como se describió anteriormente. Una modalidad particularmente preferida de la invención comprende una proteína autotransportadora, más preferiblemente Hsf y TbpA (alta) y/o TbpA (baja). Dichas composiciones inmunogénicas pueden más preferiblemente además comprender por lo menos uno de O P 85, FrpA, FrpC, LbpA, LbpB, Lipo28, Sibp, N B0964, NMB0293, TspA, NadA, TspB, PilQ, FhaC, NspA, PldA, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HlpA, FhaB, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119, TdfH, PorB, HpuB, P2086, NM-ADPRT, VapD y Hap. Todas las composiciones inmunogénicas anteriores además pueden comprender cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Una modalidad adicional preferida de la invención comprende Hsf y por lo menos un antigeno adicional seleccionado del grupo que consiste de FrpA, FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, TbpA, P2086, HpuA, HpuB, Lipo28, Sibp, Hap, AspA, proteasa IgA, O P85, NspA, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HlpA, FhaC, NadA, PldA, TspA, TspB, TdfH, PorB y FhaB. Todas las composiciones inmunogénicas anteriores además pueden comprender cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Las combinaciones preferidas comprenden Hsf y OMP85 (opcionalmente con uno o más de Hap, FrpA y LbpB); Hsf y Hap (opcionalmente con uno o más de FrpA, LbpB u OMP85); Hsf y FrpA (opcionalmente con uno o más de Hap, LbpB u OMP85); Hsf y LbpB (opcionalmente co uno o más de Hap, OMP85 o FrpA). Mientras Hsf es una adhesina y una proteína autotransportadora, una combinación particularmente preferida comprende Hsf, OMP85, TbpA, el inmunotipo L2 de LPS y/o el inmunotipo L2, preferiblemente en una preparación de ampolla multivalente, que tiene miembros de los cinco grupos de antígenos representados. Preferiblemente ambos, TbpA(bajo) y TbpA (alto) están presentes. Una composición inmunogénica adicional de la invención comprende FhaB y por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de FrpA, FrpC, NM-ADP T, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, HpuA, HpuB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964,NMB0293, TdfH, PorB, PldA, Hap, proteasa IgA, AspA, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HlpA, OMP85, NspA, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB 1119, NadA, PldA, TbpA, Hsf, TspA y TspB, y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Las combinaciones preferidas comprenden FhaB y Hsf (opcionalmente con uno o más de OMP85, LbpB, Hap o FrpA); FhaB y O P85 (opcionalmente con uno o más de LbpB, Hap o FrpA); FhaB and LbpB (opcionalmente con uno o más de Hap o FrpA); FhaB y Hap (opcionalmente con FrpA). Una combinación preferida comprende FhaB, LbpB, Hsf (como un OMP) y FrpA la cual tiene miembros de los cinco grupos de antígenos presentados. Una composición inmunogénica adicional de la invención comprende NspA y por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de FrpA, FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, TbpA, HpuA, HpuB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, Hap, OMP85, PilQ, AspA, proteasa IgA, NadA, PldA, Hsf, Hap, TspA, TspB, TdfH, PorB, y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.. Las combinaciones preferidas comprenden NspA y Hsf (opcionalmente con uno o más de OMP85, Hap, LbpA o TbpA); NspA y OMP85 (opcionalmente con uno o más de Hap, LbpA o TbpA); NspA y Hap (opcionalmente con uno o más de LbpA o TbpA); NspA y LbpA (opcionalmente con TbpA). Una combinación particularmente preferida comprende NspA, Hsf, TbpA, inmunotipo L2 y/o L3 de LPS, preferiblemente en una preparación de ampolla multivalente, la cual tiene miembros de los cinco grupos de antígeno representados. Preferiblemente tanto TbpA (bajo) como TbpA (alto) están presentes. Las composiciones inmunogénicas con combinaciones individualizadas de antígenos descritos en WO 00/25811 no se reclaman en esta invención. Preferiblemente, las composiciones inmunogénicas o vacunas no están cubiertas a través de la presente invención si tienen un contenido de antígeno que consiste solamente de proteína de unión a transferina y NspA (o en el caso de una vacuna de ampolla, tiene un contenido de antígeno regulado en forma ascendente o enriquecido que consiste solamente de proteína que se une a transferina y NspA), sin embargo las combinaciones específicas de antígenos (o antígenos regulados en forma ascendente) que consisten de o incluyen NspA así como ambos TbpA (alto) y TbpA (bajo) pueden ser incluidos. Opcionalmente, las composiciones o vacunas comprenden una combinación (subunidad) o regulación en forma ascendente (ampolla) de proteína que se une a transferina y NspA no se reclama. Una composición inmunogénica adicional de la invención comprende NadA y por lo menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste de FrpA, FrpC, N -ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, TbpA, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, Hap, OMP85, NspA, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HIpA, HpuA, HpuB, AspA, proteasa IgA, PldA, Hsf, TspA, TspB, TdfH, PorB, y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Una composición inmunogénica de la invención comprende TbpA(bajo) y por lo menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste de FrpA, FrpC, NM- ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, proteasa IgA, NspA, HpuA, HpuB, Hap, OMP85, NspA (cuando además está combinado con TbpA (alto)), PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HIpA, PMC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119, afA, afB, AspA, NadA, PldA, Hsf, TspA, TspB, TdfH, PorB y FhaB, y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Las combinaciones preferidas comprenden TbpA (bajo) y Hsf y LbpA; TbpA (bajo) y OMP85 (opcionalmente con ambos o cualquiera de LbpA y Hap); TbpA (bajo) y LbpA y Hap. Una composición inmunogénica adicional de la invención comprende TbpA (alto) y por lo menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste de FrpA, FrpC, NM- ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, Hap, OMP85, NspA (cuando además se combina con TbpA (bajo)), PilC, Omp26, NMB0315, N B0995, NMB1119, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HIpA, MafA, afB, AspA, proteasa IgA, PldA, FhaB, NadA, PldA, Hsf, TspA, TspB, TdfH, PorB and FhaB, y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Las combinaciones preferidas comprenden TbpA (alto) y Hsf y LbpA; TbpA (alto) y O P85 (opcionalmente con cualquiera o ambos de LbpA y Hap); TbpA(alto) y LbpA y Hap. Una composición ¡nmunogénica adicional de la invención comprende LpbA y por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de FrpA, FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpB, TbpB, Hap, OMP85, NspA, PilC, Omp26, N B0315, NMB0995.NMB 1119, NadA, PldA, TbpA, Hsf, TspA, TspB, MafA, MafB, proteasa IgA, AspA, FhaB, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HIpA, TdfH, PorB y FhaB y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Las combinaciones preferidas comprenden LbpA y Hsf (opcionalmente con Hap). Una composición inmunogénica adicional de la invención comprende LpbB y por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de FrpA, FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpA, TbpB, Hap, OMP85, NspA, PilC,, Omp26, NMB0315, N B0995.NMB 1119, NadA, PldA, TbpA, Hsf, TspA, TspB, MafA. MafB. proteasa IgA, AspA, FhaB, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HIpA, TdfH, PorB y FhaB, y FhaB y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Las combinaciones preferidas comprenden LbpB y Hsf (opcionalmente con uno o más de OMP85, Hap o FrpA); LbpB y OMP85 (opcionalmente con uno o más de Hap o FrpA); LbpB y Hap (opcionalmente con FrpA). Una composición inmunogénica adicional de la invención comprende OMP85 y por lo menos un antigeno adicional seleccionado del grupo que consiste de FrpA, FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, TbpA, HpuA, HpuB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, Hap, proteasa IgA, AspA, Hsf, NspA, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119, afA, MafB, NadA, PldA, Hsf, TspA, TspB, PilQ, TdfH, PorB y FhaB, y FhaB, y FhaB y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Las combinaciones preferidas comprenden OMP85 y Hsf (opcionalmente con uno o más de LbpA o NspA); OMP85 y LbpA (opcionalmente con uno o más de Hap y NspA); OMP85 y Hap (opcionalmente con NspA). Una composición inmunogénica adicional de la invención comprende Hap y por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de FrpA, FrpC, NM-ADPRT, VapD, LbpB, LbpA, TbpB, TbpA, HpuA, HpuB, P2086, Lipo28, Sibp, N B0964, NMB0293, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HIpA, NspA, proteasa IgA, AspA, OMP85, NspA, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, N B1119, MafA, MafB, NadA, PldA, Hsf, TspA, TspB, TdfH, Poro y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Una composición inmunogénica adicional de la invención comprende FrpA y por lo menos un antigeno adicional seleccionado del grupo que consiste de LbpB, LbpA, TbpA, TbpB, HpuA, HpuB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HIpA, TspA, TspB, Hap, proteasa IgA, AspA, NadA, FhaB, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HIpA, OMP85, NspA, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMBI 119, afA, MafB, PldA, Hsf, TspA, TspB, TdfH, PorB y FhaB, y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Una composición inmunogénica adicional de la invención comprende FrpC y por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de LbpB, LbpA, TbpA, TbpB, HpuA, HpuB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, N B0293, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HIpA, TspA, TspB, Hap, proteasa IgA, AspA, NadA, FhaB, OMP85, NspA, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB 1119, MafA, MafB, PldA, Hsf, TspA, TspB, TdfH, PorB y FhaB, y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. Una composición inmunogénica adicional de la invención comprende cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS y por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de LbpB, LbpA, TbpA, TbpB, HpuA, HpuB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, PilQ, HimD, HisD, GNA1870, OspA, HIpA, TspA, TspB, Hap, proteasa IgA, AspA, NadA, FhaB, OMP85, NspA, PilC, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB1119, MafA, MafB, PldA, Hsf, TspA, TspB, TdfH, PorB y FhaB.

Las combinaciones preferidas de antígenos en una composición inmunogénica de la invención incluyen combinaciones que comprenden una proteína de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y FhaB; una proteína de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y PilC; y una proteína de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y FrpA; una proteína de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y Pilq; una proteína de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y TspA; una proteína de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y TspB; una proteína de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y NspA; una proteína de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y FrpC; más preferiblemente comprende una proteína de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y Hap; una proteína de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y FrpA/C; una proteina de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y LbpB; una proteina de adquisición de hierro, una proteína autotransportadora y OMP85 (D15). Más preferiblemente, OMP85(D15) podría ser incorporada como parte de una preparación de vesícula de membrana exterior. Las composiciones inmunogénicas de la invención que contienen LPS preferiblemente tendrán el LPS conjugado con una fuente de epítopos ayudantes T, preferiblemente proteínas, y en el caso de LPS en OMVs, preferiblemente proteínas de membrana exterior. Una modalidad particularmente preferida contiene LPS que ha sido (preferiblemente intra-ampolla) conjugada con OMP in situ en la preparación de la vesícula de membrana exterior (por ejemplo como se describió anteriormente). Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender antígenos (proteínas, LPS y polisacaridos) derivados de los serogrupos A, B, C, Y, W-135 de Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoeae. Preferiblemente las composiciones inmunogénicas o vacunas de la invención no consistes de y/o comprenden las combinaciones particulares de SEC IDs listadas en el Cuadro que abarca de la página 3, línea 18 a la página 52, línea 2 de WO 00/71725 y/o cualquier combinación individual descrita en los ejemplos 1-11 de WO 00/71725. Preferiblemente, cualesquiera combinaciones individualizadas descrita en WO 01/52885 no se reclaman en esta invención.

Combinaciones adicionales La composición inmunogénica de la invención además puede comprender polisacaridos u oligosacáridos capsulares bacterianos.

Los polisacáridos u oligosacáridos capsulares pueden ser derivados de uno o más de los serogrupos A, B, C, Y, W-135 de Neisseria meningitidis , Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Streptococci Grupo A, Streptococci Grupo B, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. Un aspecto adicional de la invención son las combinaciones de vacunas que comprenden la composición antigénica de la invención con otros antígenos que son ventajosamente utilizados contra ciertos estados de las enfermedades incluyendo aquellos asociados con bacteria viral o Gram-positiva. En una combinación preferida, las composiciones antigénicas de la invención se formulan con 1, 2, 3, o preferiblemente los cuatro polisacáridos u oligosacaridos capsulares meningocócicos siguientes, los cuales pueden ser puros o conjugados a un portador de proteína; A, C, Y o W-135. Preferiblemente las composiciones inmunogénicas de la invención se formulan con A y C; o C; o C y Y.

Dicha vacuna contiene proteínas de N. meningitidis, preferiblemente del serogrupo B puede se ventajosamente utilizada como una vacuna meningocócica global. En una modalidad adicional, las composiciones antigénicas de la invención, preferi lemente formuladas con 1, 2, 3, o los cuatro polisacáridos u oligosacaridos capsulares meningocócicos puros o conjugados A, C, y o W-135 (como se describió anteriormente) se formulan con un polisacárido u oligosacárido capsular de H. influenza b, y/o uno o más polisacáridos u oligosacáridos capsulares neumocócicos puros o conjugados. Opcionalmente, la vacuna también puede comprender uno o más antígenos de proteína que pueden proteger un huésped contra infección por Streptococcus pneumonie. Dicha vacuna puede ser ventajosamente utilizada como una vacuna de meningitis global. En aún otra modalidad preferida, la composición inmunogénica de la invención se formula con polisacáridos u oligosacáridos capsulares derivados de una o más de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Streptococci Grupo A, Streptococci Grupo B, Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis. Los antígenos de pol'isacárido capsulares neumocócicos preferiblemente se seleccionan de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F (más preferiblemente de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F). Una modalidad adicional preferida podría contener los polisacáridos capsulares PRP de Haemophilus influenzae. Una modalidad preferida adicional podría contener el Tipo 5, Tipo 8 o 336 de polisacáridos capsulares de Streptococcus aureus. Una modalidad preferida adicional podría contener el Tipo I, Tipo II o Tipo II de polisacáridos capsulares de Streptococcus epidermis. Una modalidad preferida adicional podría contener el Tipo la, Tipo le, Tipo II o Tipo III de polisacáridos capsulares de streptococcus del Grupo B. Una modalidad preferida adicional podría contener los polisacáridos capsulares del stre tococcus del Grupo A, preferiblemente además comprendiendo por lo menos una proteína M y más preferiblemente múltiples tipos de proteína . Dichos polisacáridos capsulares de la invención pueden estar no conjugados o conjugados con una proteína portadora tal como la anatoxina del tétanos, el fragmento de la anatoxina del tétanos C, la anatoxina de difteria, CR 197, pneumolisina, Proteína D (US6342224). El polísacárido conjugado puede ser preparado a través de cualquier técnica de acoplamiento conocida. Por ejemplo el polisacárido puede ser acoplado a través de un linaje de tioéter. El método de conjugación se basa en la activación del polisacárido con tetrafluoroborato de 1 -ciano-4-dimetilamino piridinio (CDAP) para formar un éster de cianato. El polisacárido activado de esta forma puede ser acoplado directamente a través de un grupo espaciador a un grupo amino en la proteína portadora. Preferiblemente, el éster de cianato está acoplado con hexano de diamina y el polisacárido derivatizado de amino se conjuga a la proteína portadora utilizando química de heteroligación involucrando la formación del linaje de tioéter. Dichos conjugados se describen en la aplicación PCT publicada WO 93/15760 de la Universidad de Servicios Uniformados.

Los conjugados también pueden ser preparados a través de métodos de animación reductiva directa como se describe en US 4365170 (Jennings) y US 4673574 (Anderson). Otros métodos se describen en EP-0-161-188, EP-208375 Y EP-0-477508. Un método adicional involucra el acoplamiento de un polisacárido activado de bromuro de cianógeno derivatizado con hidracida de ácido atípico (ADH) a la proteína portadora a través de condensación de carbodiimida (Chu C. y otros Infecí. Immunity, 1983 245 256). Cuando los oligosacáridos están incluidos, se prefiere que estén conjugados. Los antígenos de proteínas pneumocócicas preferidos son aquellas proteínas pneumocócicas que están expuestas en la superficie exterior de los pneumococos (capaces de ser reconocidas a través de un sistema inmune del huésped durante por lo menos parte del ciclo de vida del pneumococo), o son proteínas que se secretan o liberan a través del pneumococo. Más preferiblemente, la proteína es una toxina, adhesina, transductor de señal de 2 componentes, o lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, o fragmentos del mismo. Las proteínas particularmente preferidas incluyen, pero no se limitan a: pneumolisina (preferiblemente desintoxicada a través del tratamiento químico o mutación) [Mitchell y otros Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11; 18 (13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2, "Mitchell y otros Biochem Biophys Acta 1989 Enero 23; 1007(1 ): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purifícation and biological properties. ", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Patón y otros), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA y variantes de eliminación del mismo (US 5804193-Briles y otros) ; PspC y variantes de eliminación del mismo (WO 97/09994-Briles y otros); PsaA y variantes de eliminación del mismo (Berry & Patón, Infect Immun 1996 Dic; 64 (12): 5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcuspraeumoniae"); proteínas de unión a colina pneumococcíca y variantes de eliminación del mismo; CbpA y variantes de eliminación del mismo (WO 97/41151; WO 99/51266); Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (Infect. Immun. 1996 64: 3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato y otros, FEMS Microbiol Lett 1998, 164: 207-14); proteína de tipo M, (EP 0837130) y adhesina 18627, (EP 0834568). Los antígenos de proteína pneumocócicos preferidos adicionales son aquellos descritos en WO 98/18931, particularmente aquellos seleccionados en WO98/18930 y PCT/US99/30390. La composición/vacuna inmunogénica de la invención también puede opcionalmente comprender preparaciones de vesícula de membrana exterior hechas de otras bacterias Gram negativas, por ejemplo, Moraxella catarrhalis o Haemop ilus influenzae.

Preparaciones de ampollas Moraxella catarrhalis Las composiciones de la invención además pueden comprender preparaciones OMV derivadas de Moraxella catarrhalis. Las preparaciones OMV diseñadas pueden derivarse de Moraxella catarrhalis como se describe en WO 01/09350. Uno o más de los siguientes genes (codificando los antígenos protectores) son preferidos para la regulación ascendente: OMP106 (WO 97/41731 & WO 96/34960), HasR (PCT/EP99/03824), PilQ (PCT/EP99/03823), OMP85(PCT/EP00/01468), Iipo06 (GB 9917977.2), lipo 10 (GB 9918208.1 ), ! ¡ po 11 (GB 9918302.2), i i po 18 (GB 9918038.2), P6 (PCT/EP99/03038), ompCD, CopB (Helminen ME, y otros (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010), D15 (PCT/EP99/03822), Omp1A1 (PCT/EP99/06781 ), Hly3 ( PCT/E P99/03257 ) , LbpA y LbpB (WO 98/55606), TbpA y TbpB (WO 97/13785 & WO 97/32980), OmpE, UspA1 y UspA2 (WO 93/03761 ), y Omp21. También son preferidos como genes que pueden ser heterológicamente introducidos dentro otras bacterias G ram-negativas.

Uno o más de los siguientes genes son preferidos para la regulación descendente: CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA, y LbpB. Uno o más de los siguientes genes son preferidos para la regulación descendente: htrB, msbB y 1pxK. Uno o más de los siguientes genes son preferidos para la regulación ascendente: pmrA, pmrB, pmrE y pmrF.

Preparaciones de ampollas Haemophilus influenzae Las composiciones inmunogénicas de la invención además comprenden preparaciones OMV derivadas de Haemophilus influenzae . Las preparaciones OMV diseñadas pueden derivarse de Haemophilus influenzae como se describe en WO 01/09350 Uno o más de los siguientes genes (codificando los antígenos protectores) son preferidos para la regulación ascendente: D15 (WO 94/12641 ), P6 (EP 281673), TbpA (W096/40929; W095/13370), TbpB (W096/40929; W095/13370), P2, P5 (WO 94/26304), O P26 (WO 97/01638), H W1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47, y Hif (todos los genes en este gen operador deberán ser regulados de manera ascendente con el fin de regular de manera ascendente pilin). También son preferidos como genes que pueden ser heterológicamente introducidos en otras bacterias Gram-negativas.

Uno o más de los siguientes genes son preferidos para la regulación descendente: P2, P5, Hif, proteasa I g Al - , HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, htrB, msbB e IpxK.

Uno o más de los siguientes genes son preferidos para la regulación ascendente: pmrA, pmrB, pmrE, y pmrF. Las composición/vacuna inmunogénica de la invención también puede opcionalmente comprender antígenos que proveen protección contra una o más infecciones por Difteria, tétanos y Bordetella pertusis. El componente de tosferina puede ser la célula B. pertussis completa aniquilada (Pw) o tos ferina acelular (Pa) que contiene por lo menos un antígeno (preferiblemente 2 o los 3) de PT, FHA y peractina 69kDa. Típicamente, los antígenos que proveen protección contra Difteria y tétanos podrían ser anatoxinas de difteria y anatoxinas de tétanos. Las anatoxinas pueden químicamente inactivar toxinas o toxinas inactivadas por la introducción de mutaciones de punto. Las composición/vacuna inmunogénica de la invención también puede opcionalmente comprender uno o más antígenos que pueden proteger a un huésped contra Haemophillus influenzae , RSV y/o uno o más antígenos que pueden proteger a un huésped contra el virus de la influenza. Dicha vacuna puede ser ventajosamente utilizada como una vacuna de medio de otitis global. Los antígenos de proteína de H. influenzae no tipificables preferidos incluyen la proteína de Fimbrina (US 5766608) y fusiones que comprenden péptidos de las mismas (por ejemplo, Fusión LB1) (US 5843464-Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, proteína D, TbpA, TbpB, Hia, Hmwl, Hmw2, Hap, y D15. Los antígenos del virus de influenza preferidos incluyen virus completo, vivo o inactivado, virus de influencia dividido, crecido en huevos o células MDCK, o células Vero o virosomas de gripe completas (como se describe por R. Gluck, Vaccine, 1992,10, 915-920) o proteínas purificadas o recombinantes, tales como las proteínas HA, NP, o M, o combinaciones de las mismas. Los antígenos RSV preferidos (Virus Sincitial Respiratorio) incluyen la glicoproteína F, la glicoproteína G, la proteína NH, la proteína M o derivados de la misma. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden incluir proteínas de Moraxella catarrhalis que incluyen TbpA (W097/13785; W099/52947), TbpB (W097/13785; W099/52947; athers y otros FEMS Immunol Med Microbiol 1997 19; 231-236; Myers y otros Infect Immun1998 66; 4183-4192), LbpA, LbpB (Du y otros Infect Immun 1998 66; 3656-3665), UspA1, UspA2 (Aebi y otros Infect Immun. 1997 65; 4367-4377), OMP106 (US6214981), receptor dependiente de Ton-B (WO00/78968), CopB (Sethi y otros, Infect. Immun.1997 65; 3666-3671 ), y receptor de HasR (WO00/78968); las proteínas de Haemop ilus influenzae incluyen HMW (St Geme y otros, Infect Immun 1998 66;364-368), Hia (St Geme y otros J. Bacteriol. 2000 182; 6005-6013), Tbp1 (W096/40929; W095/13370), Tbp2 (W096/40929; W095/13370; Gray-Owen y otros Infect Immun 1995 63; 1201-1210), LbpA, LbpB (Schryvers y otros 1989,29: 121-130), HasR, receptor dependiente de TonB (Fleishmann y otros Science 1995 269; 496-512), proteína de unión a hemoglobina, HhuA (Cope y otros Infect Immun 2000 68; 4092-4101), HgpA (Maciver y otros, Infect Immun 1996 64; 3703-3712), HgbA, HgbB y HgbC (Jin y otros Infecí Immun 1996 64; 3134-3141), HxuA (Cope y otros, Mol icrobiol 1994 13; 863-873), HxuC (Cope y otros, Infect Immun 2001 69; 2353-2363); las proteínas de Neisseria meningitidis incluyen Tbp1, Tbp2, FbpA, FbpB, BfrA, BfrB (Tettelin y otros, Science 2000 287; 1809-1815), LbpA, LbpB y HmbR.

Formulaciones de vacuna Una modalidad preferida de la invención es la formulación de la composición inmunogénica de la invención en una vacuna que también puede comprender un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. La fabricación de las preparaciones de vesícula de membrana exterior de cualquiera de las cepas anteriormente mencionadas puede ser lograda a través de cualquier método bien conocido para alguien con experiencia en la técnica. Preferiblemente se utilizan los métodos descritos en EP 301992, US 5,597,572, EP 11243 o US 4,271,147. Más preferiblemente se utiliza el método descrito en WO01/09350. La preparación de vacuna generalmente se describe en El Diseño de Vacuna ("La subunidad y el método auxiliar" (eds. Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). Las composiciones antigénicas de la presente invención pueden ser auxiliadas en la formulación de la vacuna de la invención. Los auxiliares adecuados incluyen sal de aluminio tal como hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio (particularmente carbonato de calcio), hierro o zinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos deri vatizados catiónicamente o aniónicamente, o polifosfacenos. Los sistemas auxiliares Th1 adecuados que pueden ser utilizados incluyen, lípido A de monofosforilo, particularmente lípido A de monofosforilo 3-de-O-acilado, y una combinación de lípido A de monofosforilo, lípido A de monofosforilo 3-de-O-acilado (3D- MPL) junto con una sal de aluminio (preferiblemente fosfato de aluminio). Un sistema mejorado involucra la combinación de un lípido A de monofosforilo y un derivado de saponina particularmente la combinación de QS21 y 3D- PL como se describe en WO 94/00153, o una composición menos reconocida en donde QS21 se extingue con colesterol como se describe en WO 96/33739. Una formulación auxiliar potente que involucra QS21 3D-MPL y tocoferol es un aceite en emulsión de agua se describe en WO 95/17210 y es una formulación preferida. La vacuna puede comprender una saponina, más preferiblemente QS21. También puede comprender un aceite en emulsión de agua y tocoferol. CpG no metilado conteniendo oligonucleótidos (WO 96/02555) también son inductores preferenciales de una respuesta TH1 y son adecuados para uso en la presente invención. La preparación de la vacuna de la presente invención puede ser utilizada para proteger o tratar un mamífero susceptible a infección, a través de medios de la administración de dicha vacuna a través de una ruta sistémica o mucosidad. Estas administraciones pueden incluir inyección a través de rutas intramusculares, intraperitoneales, intradérmicas o subcutáneas; o a través de administración por mucosa a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. De esta forma un aspecto de la presente invención es un método para inmunizar un huésped humano contra una enfermedad causada por infección de una bacteria gram-negativa, cuyo método comprende la administración al huésped de una dosis inmunoprotectora de la preparación O V de la presente invención. La cantidad de antígenos en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos laterales adversos, significativos, en vacunas típicas. Dicha cantidad variaría dependiendo del inmunógeno específico empleado y de cómo se presenta. Generalmente, se espera que cada dosis comprende 1-100 µg del antígeno de proteína o preparación OMV, preferiblemente 5-50 y más típicamente en el rango de 5-25 µg. Una cantidad óptima para una vacuna particular puede ser constatada a través de estudios estándares que involucran la observación de las respuestas inmunes apropiadas en los sujetos. Después de la vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de defensa adecuadamente espaciadas.

Las vacunas de la invención son preferiblemente inmunoprotectoras y no tóxicas adecuadas para uso pediátrico y en adolescentes. Por uso pediátrico se quiere dar a entender el uso en infantes de menos de 4 años de edad. Por uso inmunoprotector se da a entender que el SBA y/o modelo de protección animal y/o ensayo de bloqueo de adhesión descrito anteriormente son logrados de manera satisfactoria. Por no tóxico se da a entender que no hay más de un nivel satisfactorio de la actividad de la endotoxina en la vacuna según medido por LAL y ensayos de pirogeneicidad bien conocidos.

Polinucleótidos de la invención "Polinucleótido" generalmente se refiere a cualquier poliribonucléotido o polidesoxiribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Los "polinucleótidos" incluyen, sin limitación, ADN de estructura de cadena doble e individual que es una mezcla de regiones de estructura de cadena doble, e individual y ARN de estructura de cadena doble e individual y ARN que es una mezcla de regiones de estructura de cadena individual y doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser de estructura de cadena individual, o más típicamente, de estructura de cadena doble o una mezcla de regiones de estructura de cadena individual y doble. Además, "polinucleótido" se refiere a regiones de estructura de cadena triple que comprenden ARN o ADN o tanto ADN como ARN. El término polinucleótido también incluye ADNs o ARNs que contienen una o más bases modificadas y ADNs o ARNs con ejes modificados para estabilidad u para otras razones. Bases "modificadas" incluye, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inopina. Una variedad de modificaciones se han hecho al ADN y ARN; de esta forma, "polinucleótido" abarca formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas de polinucleótidos como se encuentran típicamente en la naturaleza, así como las formas químicas de ARN y ADN características de los virus y células. "Polinucleótido" también abarca polinucleótidos relativamente cortos, por lo general referidos como oligonucleótidos. Otro aspecto de la invención se refiere a una formulación inmunológica/vacuna que comprende uno o más polinucleótidos. Dichas técnicas son bien conocidas en la técnica, ver por ejemplo, Wolff y otros, Science (1990) 247: 1465-8. Dichas vacunas comprenden uno o más polinucleótidos que codifican una pluralidad de proteínas correspondientes a las combinaciones de proteínas de la invención descritas anteriormente. La expresión de proteínas de dichos polinucleótidos debería estar bajo el control de un promotor eucariótico capaz de conducir la expresión dentro de una célula de mamífero. El polinucleótido puede adicionalmente comprender una secuencia que codifica otros antígenos. Ejemplos de promotores eucarióticos que podrían conducir la expresión incluyen promotores virales de virus que codifican promotores adenovirales, promotores retrovirales. Alternativamente, los promotores de mamíferos podrían utilizarse para conducir la expresión.

Aspectos adicionales de la invención Otro aspecto de la invención involucra un método para el tratamiento o prevención de enfermedad Neisserial que comprende la administración de una dosis protectora (o cantidad efectiva) de la vacuna de la invención a un huésped en la necesidad de la misma. Los serogrupos A, B, C, Y o W-135 de Neisseria meningitidis y/o infección por Neisseria gonorrhoeae podrían ser ventajosamente prevenidos o tratados. La invención también incluye un uso de la vacuna de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de prevención de infección Neisserial. Otra vez la infección Neisserial abarca Infección mediante los serogrupos A, B, C, Y o W-135 de Neisseria meningitidis y/o infección por Neisseria gonorrhoeae . Otro aspecto de la invención es una cepa Neisserial genéticamente diseñada a partir de la cual una vesícula de membrana exterior de la invención (que tiene por lo menos dos proteínas de la invención recombinantemente reguladas en forma ascendente, como se describió anteriormente) puede ser derivada. Dicha cepas de Neisserial pueden ser Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoeae.

La cepa también puede haber sido diseñada (como se describió anteriormente) para regular de manera descendente la expresión de otras proteínas de Neisserial incluyendo la expresión de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, u ocho de LgtB, LgtE, SiaD, OpC, OpA, PorA, FrpB, msbB y HtrB. Las combinaciones preferidas para la regulación descendente incluyen la regulación descendente (preferiblemente eliminación) de por lo menos LgtB y SiaD, la regulación descendente de por lo menos PorA y OpC, la regulación descendente de por lo menos PorA y OpA, y la regulación descendente de por lo menos PorA, OpA, y OpC. Los aspectos de la invención son métodos para hacer la composición inmunogénica o vacuna de la invención. Estos incluyen un método que comprende un paso para mezclar juntos por lo menos dos antígenos o proteínas aisladas de Neisseria, las cuales pueden estar presentes en la forma de ampollas derivadas de cepas de Neisserial de la invención, para hacer una composición inmunogénica de la invención, y un método para hacer la vacuna de la invención que comprende un paso para combinar la composición inmunogénica de la invención con un portador farmacéuticamente aceptable. También se incluye en la invención métodos para hacer la composición inmunogénica de la invención que comprende un paso para aislar las vesículas de membrana exterior de la invención de un cultivo de Neisserial. Dicho método puede involucrar un paso adicional de combinar por lo menos dos preparaciones de vesícula de membrana exterior, preferiblemente en donde por lo menos una preparación de la vesícula de membrana exterior contiene LPS del inmunotipo L2 y por lo menos también incluye dichos métodos en donde las vesículas de membrana exterior se aislan a través de la extracción con una concentración de DOC de 0-0.5%. Las concentraciones de DOC de 0.3%-0.5% se utilizan para minimizar el contenido de LPS. En las preparaciones OMV en donde LPS se va ha conservar como un antígeno, las concentraciones DOC de 0-0.3%, preferiblemente 0.05%- 0.2%, más preferiblemente de alrededor de 10% se utilizan para la extracción.

Vacunas de célula Entera Fantasma o Aniquiladas Los inventores consideraron que las mejoras anteriores a las preparaciones de ampollas y vacunas pueden ser fácilmente extendidas a preparaciones y vacunas de célula completa fantasma o aniquilada (con ventajas idénticas). Las cepas Gram-negativas de la invención a partir de las cuales las preparaciones de ampolla se hacen, también se pueden utilizar para hacer preparaciones de célula completa fantasma o aniquilada. Los métodos para hacer preparaciones fantasma (células vacías con envolturas intactas) de cepas Gram-negativas son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, WO 92/01791). Los métodos para aniquilar células completas para hacer preparaciones de célula inactivadas para uso en vacunas también son bien conocidos. Los términos 'preparaciones de ampolla' [u OMV] y 'vacunas de ampolla' [u OMV] así como los procesos descritos a lo largo de este documento son por lo tanto aplicables a los términos "preparación fantasma" y "vacuna fantasma", y "preparación de célula fantasma" y "vacuna de célula completa aniquilada", respectivamente, para los propósitos de esta invención.

Anticuerpos e inmunización pasiva Otro aspecto de la invención es un método para preparar una globulina inmune para uso en la prevención o tratamiento de infección Neisserial que comprende los pasos de inmunizar un receptor con la vacuna de la invención y aislar la globulina inmune del receptor. Una globulina inmune preparada a través de este método es un aspecto adicional de la invención. Una composición farmacéutica que comprende la globulina inmune de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable es un aspecto adicional de la invención que podría ser utilizado en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la enfermedad Neisserial. Un método para el tratamiento o prevención de infección Neisserial que comprende un paso de administración a un paciente de una cantidad efectiva de la preparación farmacéutica de la invención es un aspecto adicional de la invención. La inoculación de la producción de anticuerpos policlonales se preparar típicamente a través de la dispersión de la composición antigénica en un diluyente fisiológicamente tolerable tal como salina u otros auxiliares adecuados para uso en seres humanos para formar una composición acuosa. Una cantidad inmunoestimuladora se administra a un mamífero y el mamífero inoculado entonces se mantiene durante un tiempo suficiente para que la composición antigénica induzca anticuerpos protectores. Los anticuerpos pueden ser aislados a la extensión deseada a través de técnicas bien conocidas tales como cromatografía de afinidad (Harlow y Lañe Antibodies; a laboratory manual 1988). Los anticuerpos pueden incluir preparaciones de suero de una variedad de animales comúnmente utilizados, por ejemplo, cabras, primates, burros, cerdos, caballos, conejillos de India, ratas o el hombre. Los animales son sangrados y se recupera el suero. Una globulina inmune producida de acuerdo con la presente invención puede incluir anticuerpos completos, fragmentos o subfragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas completas de cualquier clase, IgG, IgM, IgA, I g D , o IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especificidad doble a dos o más antígenos de la invención. Estos también pueden estar formados de F(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares incluyendo fragmentos híbridos. Una globulina inmune también incluye proteínas diseñadas de forma natural, sintética o genéticamente que actúan como un anticuerpo a través de la unión a antígenos específicos para formar un complejo. Una vacuna de la presente invención puede ser administrada a un receptor que entonces actúa como una fuente de globulina inmune, producido en respuesta a un desafío de una vacuna. Un sujeto de esta forma tratado podría donar plasma a partir de la cual podría ser obtenida la globulina hiperinmune a través de metodología de fraccionamiento de plasma. La globulina hiperinmune podría ser administrada a otro sujeto con el fin de impartir resistencia contra o tratar infección Neisserial. Las globulinas hiperinmunes de la invención son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de la enfermedad Neisserial en infantes, individuos comprometidos inmunes, o en donde el tratamiento es requerido y no hay tiempo para que un individuo produzca anticuerpos en respuesta a la vacunación. Un aspecto adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos monoclonales (o fragmentos del mismo, preferiblemente humanos o humanizados) reactivos contra por lo menos dos constituyentes de la composición inmunogénica de la invención, los cuales podrían ser utilizados para tratar o prevenir infección a través de bacteria Gram negativa, preferiblemente Neisseria, más preferiblemente Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoeae y más preferiblemente el serogrupo B de Neisseria meningitidis. Dichas composiciones farmacéuticas comprenden anticuerpos monoclonales que pueden ser inmunoglobulinas completas de cualquier clase, por ejemplo, IgG, IgM, I g A , I g D o I g E , anticuerpos quiméricos, anticuerpos híbridos con especificidad de dos o más antígenos de la invención. También pueden ser fragmentos por ejemplo, F(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares incluyendo fragmentos híbridos. Los métodos para hacer anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica y pueden incluir la fusión de esplenocitos con células de mieloma (Kohler y Milstein 1975 Nature 256; 495; Antibodies-a laboratory manual Harlow and Lañe 1988). Alternativamente, los fragmentos Fv monoclonales pueden ser obtenidos a través de la clasificación de una colección de exhibición de fago adecuada (Vaughan TJ y otros 1998 Nature Biotechnology 16; 535). Los anticuerpos monoclonales pueden ser humanizados o humanizados en parte a través de métodos conocidos. Todas las referencias o solicitudes de patente citadas dentro de esta especificación de patente se incorporan aquí por referencia.

Los términos "comprendiendo", "comprende" y "abarca" aquí pretenden mediante los inventores ser opcionalmente substituibles con los términos "consistiendo de", "consiste de", y "abarca", respectivamente, en cada instancia.

Método de Aplicación Industrial de la Invención Los ejemplos siguientes pueden llevarse a cabo utilizando técnicas estándares, las cuales son bien conocidas y son de rutina para aquellos con experiencia en la técnica, excepto cuando por el contrario se describen en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

EJEMPLO 1 Métodos para construir cepas del seroqrupo B de Neisseria meninqitidis utilizados en preparaciones de vesícula de membrana exterior WO 01/09350 proporciona métodos detallados para la preparación de vesículas de membrana exterior y para la manipulación de cepas bacterianas a partir de las cuales las vesículas de membrana exterior se derivan. Cuando las vesículas de membrana exterior son para retener lipoproteínas tales como TbpB y/o lipopolisacáridos, los métodos para el aislamiento con bajos niveles o no desoxicolato son preferidos.

EJEMPLO 2 Regulación ascendente del antígeno de la proteína Hsf en una cepa del seroqrupo B de Neisseria meninqitidis que carece de genes cps funcionales pero expresa PorA Como se describe en los ejemplos de WO 01/09350, en ciertos países, la presencia de PorA en vesículas de membrana exterior puede ser ventajoso, y puede fortalecer la eficacia de la vacuna de ampollas mejoradas recombinantes. En el siguiente ejemplo, se ha utilizado un vector pCMK( + ) modificado para regular de manera ascendente la expresión del antígeno de la proteína Hsf en una cepa que carece de genes cps funcionales pero expresa PorA. El vector pCMK( + ) original contiene un promotor porA/lacO quimérico reprimido en lacl" expresando el huésped E. coli pero transcripcionalmente activo en Neisseria meningitidis. En el pC K( + ) modificado, el promotor porA nativo fue utilizado para conducir la transcripción del gen hsf. El gen que codifica Hsf fue amplificado en PCR utilizando los iniciadores de nucleotido HSF 01-Wdel y HSF 02-Nde\, presentados en el siguiente cuadro. Debido a la secuencia del iniciador HSF 01-Wdel la proteína Hsf expresada contendrá dos residuos de metionina en el extremo 5'. Las condiciones utilizadas par la amplificación PCR fueron aquellas descritas por el proveedor (polimerasa de ADN HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). La permutación cíclica fue la siguiente: 25 veces (94 C 1 min., 48°C 1 min.,72°C 3 min.) y 1 vez (72°C 10 min., 4°C hasta la recuperación). El amplicon correspondiente fue subsecuentemente clonado en los sitios de restricción correspondientes del vector de entrega pCMK( + ). En este plásmido recombinante, pCMK( + )-Hsf diseñado, se eliminó el ¡acO presente en el promotor porA/lacO quimérico a través de una estrategia PCR recombinante. El plásmido pCMK( + )-Hsf se utilizó como una plantilla para la amplificación PCR de 2 fragmentos de ADN separados: -fragmento 1 contiene la región recombinogénica porA 5', el gen resistente a canamicina y el promotor porA. Los iniciadores de oligonucleótido utilizados, RPI(Sacll) y RP2, se presentan en el siguiente Cuadro 2. El iniciador RP1 es homólogo a la secuencia justo en la corriente ascendente del operador lac. -fragmento 2 contiene la secuencia Shine-Dalgarno del gen porA, el gen hsf y la región recombinogénica A 3'. Los iniciadores del oligonucleótido utilizados, RP3 y RP4{Apa\), se presentan en el cuadro siguiente. El iniciador RP3 es homólogo a la secuencia simplemente en corriente descendente del operador lac. El extremo 3' del fragmento 1 y el extremo 5' del fragmento 2 tienen 48 bases traslapadas. Se utilizaron 500 ng de cada PCR (1 y 2) para una reacción de PCR final utilizando los iniciadores RP1 y RP4. El amplicón final obtenido se subclonó en el vector pSL1180 restringido con Sacll y Apa\. El plásmido modificado pCMK( + )-Hsf se purificó a una gran escala utilizando el equipo QIAGEN maxiprep y 2 µ§ de este material se utilizó para transformar una cepa del serogrupo B de Neisseria rneningitidis que carece de genes cps funcionales. Con el fin de conservar la expresión de porA, la integración resultante de un cruzamiento individual se seleccionó a través de una combinación de PCR y procedimientos de clasificación de tinción Western. Los clones resistentes a canamicina se probaron como positivos a través de PCR específico de porA y la tinción Western se almacenó a -70°C como existencias de glicerol y se utilizaron para estudios adicionales. La bacteria (correspondiente a alrededor de 5.108 bacterias) se volvió a suspender en 50 µ? de regulador de pH SDS-PAGE, se congeló (-20°C) / hirvió (100°C) tres veces y después se separó a través de electroforesis PAGE-SDS en un gel al 12.5%. La expresión de Hsf se examinó en lisatos bacterianos de célula completa (WCBL) derivados de NmB [Cps-, PorA + ] o NmB [Cps-, PorA+, Hsf+]. La tinción coomassie detectó un incremento importante en la expresión de Hsf (con respecto al nivel de Hsf endógeno). Estos resultados confirman que el vector pCMK( + )-Hsf modificado es funcional y puede ser utilizado exitosamente para regular en forma ascendente la expresión de las proteínas de membrana exterior, sin abolir la producción del antígeno de proteína de membrana exterior PorA principal. Oligonucleótidos utilizados en este trabajo EJEMPLO 3 Regulación ascendente del gen tbpA del seroqrupo B de N. meningitidis mediante el reemplazo del promotor El propósito del experimento fue reemplazar la región promotora endógena del gen tbpA por un promotor porA, con el fin de regular en forma ascendente la producción del antigeno TbpA. Para ese propósito, un plásmido de reemplazo del promotor fue construido utilizando metodologías de clonación de E. coli. La región de ADN (731bp) localizada en corriente ascendente a partir de la secuencia de codificación tbpA se descubrió en la base de datos Incyte PathoSeq privada de la cepa ATCC 13090 de Neisseria meningitidis. Este ADN contiene la secuencia de codificación para el antígeno TbpB. Los genes se organizaron en un operón. El gen tbpB será eliminado y reemplazado por el cásete promotor CmR/porA. Para ese propósito, un fragmento de ADN de 3218bp correspondiente a la región de flanqueo 5' 509bp del gen tbpB, la secuencia de codificación tbpB 2139bp, la secuencia intergénica 87bp y los primeros 483 nucleótidos de la secuencia de codificación tbpA se amplificaron a través de PCR a partir del ADN genómico del serotipo B de Neisseria meningitidis utilizando los oligonucleótidos BAD16 (5'-GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC-3') y BAD17 (5'-GGC CAA GCT TC A GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC- 3') conteniendo las secuencias aplicadas y los sitios de restricción Nhe\ y Hindi (subrayados). Este fragmento de PCR se purificó con un Equipo High Puré (Boerhinger Mannheim, Alemania), y se clonó directamente en un vector pGemT (Promega, EUA). Este plásmido se sometió a mutagénesis PCR de círculo (Jones & Winistofer (1992)) con el fin de (i) insertar los sitios de restricción adecuados permitiendo la clonación de un cásete promotor CmR/PorA y (ii) eliminar 209bp de la secuencia de flanqueo 5' de tbpB y la secuencia de codificación tbpB. La PCR de círculo se llevó a cabo utilizando los oligonucleótidos BAD 18 (5'-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3') y el BAD 19 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G-3') conteniendo los sitios de restricción adecuados Xma), BglW y Soy (subrayados). El cásete promotor Cmr/PorA se amplificó a partir del plásmido pUC D15/lmp85 previamente descrito, utilizando los iniciadores BAD 21 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3') y BAD20 (5'-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') conteniendo los sitios de restricción adecuados Xma\, Spel, BglW y Soy (subrayados). Este fragmento de PCR se clonó en el plásmido PCR de círculo. Este plásmido se utilizará para transformar las cepas B [cps-] y [cps-porA] del serogrupo B de Neisseria meningitidis. La integración a través del cruzamiento doble en la región en corriente ascendente de tbpA dirigirá la inserción del promotor porA directamente en corriente ascendente del ATG tbpA.

EJEMPLO 4 Construcción de una cepa del serogrupo B de N. meningitidis regulada en forma ascendente para la expresión de dos antígenos: TbpA y Hsf El propósito del experimento fue regular en forma ascendente la expresión de TbpA y Hsf simultáneamente en la misma cepa del serogrupo B de N. meningitidis. La producción de TbpA se reguló en forma ascendente reemplazando su región promotora endógena a través del promotor porA fuerte (reemplazo del promotor). En este contexto, el gen tbpB, localizado en corriente ascendente de tbpA se eliminó, y la proteína TbpB ya no está presente en la membrana exterior. La expresión de Hsf se reguló de forma ascendente a través de la inserción (recombinación homologa) de una segunda copia del gen correspondiente en el sitio porA (entrega del gen). Ambas cepas han sido descritas en una patente separada referido como en WO 01/09350. Los marcadores de selección utilizados en ambas estrategias (CmR y KamR) permitieron la combinación de ambas integraciones dentro del mismo cromosoma. El ADN genómico total fue extraído de la cepa Nm.B cps- /TbpA + /PorA+ recombinante a través del protocolo tip 500-G de Qiagen Genomic. Se restringieron 10 µg de ADN o/n con la enzima de restricción Dralll y se utilizaron para transformar el serogrupo B de Neisseria meningitidis a través del protocolo de transformación clásico. Las células utilizadas para la transformación fueron cualquier Nm.B cps-/Hsf+/PorA+ recombinante (recombinación homologa a través de un cruzamiento dentro del sitio porA) o NmB cps-/Hsf + /PorA+ recombinante (Intercambio alélico/recombinación homologa a través de 2 cruzamientos dentro del sitio porA). Estos se colocaron en placas durante la noche en agar GC conteniendo 200 µg/ml de canamicina, diluido a DO = 0.1 en medio líquido GC 10 mM de MgCI2, y se incubaron durante 6 horas a 37°C bajo agitación vigorosa con 10 µ9 de ADN genómico restringido Dralll. La Neisseria meningitidis recombinante resultante de un cruzamiento doble sobre a través del evento (clasificación PCR) se seleccionó en medio GC conteniendo 200 µ9/??? de canamicina y 5 µ9 )? de cloranfenicol y se analizó para la expresión de TbpA y Hsf en preparaciones OMV. Como se representa en la Figura 1, la producción de ambas, TbpA y Hsf fue significativamente incrementada en el OMV preparado de la cepa NmB recombinante de TbpA/Hsf cuando se comparó con el OMV preparado de las cepas NmB cps de control. El nivel de la sobre expresión de cada proteína en la recombinante doble es comparable con el nivel de la expresión obtenida en los recombinantes individuales correspondientes. El nivel de la sobre expresión de TbpA y Hsf fue comparable en las cepas PorA+ y PorA- (datos no mostrados). Todos juntos, estos datos demostraron que: (i) la expresión de TbpA y Hsf puede ser conjuntamente y concomitantemente regulada en forma ascendente dentro de N. meningitidis y (ii) las ampollas recombinantes enriquecidas para TbpA y Hsf pueden ser obtenidas y utilizadas para inmunización.

EJEMPLO 5 Construcción de una cepa del seroqrupo B de N. meningitidis regulada en forma ascendente para la expresión de dos antíqenos: TbpA y NspA El propósito del experimento fue regular en forma ascendente la expresión de TbpA y NspA simultáneamente en la misma cepa del serogrupo B de N. meningitidis. La producción de TbpA se reguló en forma ascendente reemplazando su región promotora endógena a través del promotor porA fuerte (reemplazo del promotor). La expresión de NspA se reguló de forma ascendente a través de la inserción (recombinación homologa) de una segunda copia del gen correspondiente en el sitio porA (entrega del gen). Ambas cepas individuales han sido descritas en una patente separada WO 01/09350. Los marcadores de selección utilizados en ambas estrategias (CmR o KanR) permitieron la combinación de ambas integraciones dentro del mismo cromosoma. El ADN genómico total fue extraído de la cepa NmB cps-/TbpA + /PorA+ recombinante a través del protocolo tip 500-G de Qiagen Genomic. Se restringieron 10 µg de ADN o/n con la enzima de restricción Afall y se utilizaron para transformar el serogrupo B de Neisseria meningitidis a través del protocolo de transformación clásico. Las células utilizadas para la transformación fueron cualquier NmB cps-/NspA + /PorA-recombinante Estas se colocaron en placas durante la noche en agar GC conteniendo 200 µ9/?t?? de canamicina, diluido a DOe50 = 0.1 en medio líquido GC 10 mM de gCI2l y se incubaron durante 6 horas a 37°C bajo agitación vigorosa con 10 9 de ADN genómico restringido Aat\\\. La Neisseria meningitidis recombinante resultante de un cruzamiento doble a través del evento (clasificación PCR) se seleccionó en medio GC conteniendo 200 µg/ml de canamicina y 5 µg ml de cloranfenicol y se analizó para la expresión de TbpA y NspA en preparaciones O V. La producción de ambas, TbpA y Nspa fue significativamente incrementada en el OMV preparado de la cepa NmB recombinante de TbpA/NspA cuando se comparó con el OMV preparado de las cepas NmB cps de control. El nivel de la sobre expresión de cada proteína en la recombinante doble es comparable con el nivel de la expresión obtenida en los recombinantes individuales correspondientes. Todos juntos, estos datos demostraron que: (i) la expresión de TbpA y NspA puede ser conjuntamente y concomitantemente regulada en forma ascendente dentro de N. meningitidis y (ii) las ampollas recombinantes enriquecidas para TbpA y Hsf pueden ser obtenidas y utilizadas para inmunización.

EJEMPLO 6 Construcción de una cepa del seroqrupo B de N. meningitidis regulada en forma ascendente para la expresión de dos antíqenos: NspA y D15/Omp85 El propósito del experimento fue regular en forma ascendente la expresión de NspA y D15/Omp85 simultáneamente en la misma cepa del serogrupo B de N. meningitidis. La producción de D15/Omp85 se reguló en forma ascendente reemplazando su región promotora endógena a través del promotor porA fuerte (reemplazo del promotor). La expresión de NspA se reguló de forma ascendente a través de la inserción (recombinación homologa) de una segunda copia del gen correspondiente en el sitio porA (entrega del gen). Ambas cepas fian sido descritas en una patente separada WO 01/09350. Los marcadores de selección utilizados en ambas estrategias (CmR o KanR) permitieron la combinación de ambas integraciones dentro del mismo cromosoma. El ADN genómico total fue extraído de la cepa NmB cps-/D 15/Omp85/PorA+ recombinante a través del protocolo tip 500-G de Qiagen Genomic. Se restringieron 10 µ9 de ADN o/n con la enzima de restricción AatW y se utilizaron para transformar el serogrupo B de Neisseria meningitidis a través del protocolo de transformación clásico. Las células utilizadas para la transformación fueron cualquier NmB cps-/NspA + /PorA- recombinantes. Estas se colocaron en placas o/n sobre agar GC conteniendo 200 µg/ml de canamicina, diluido a DO650=0.1 en medio líquido GC 10 mM de MgCI2, y se incubaron durante 6 horas a 37°C bajo agitación vigorosa con 10 µ9 de ADN genómico restringido AaflI. La Neisseria meningitidis recombinante resultante de un cruzamiento doble a través del evento (clasificación PCR) se seleccionó en medio GC conteniendo 200 ng/ml de canamicina y 5 µg/ml de cloranfenicol y se analizó para la expresión de NspA y D15/Om85 en preparaciones OMV. La producción de ambas, NspA y D15/Omp85 fue significativamente incrementada en el OMV preparado de la cepa NmB recombinante de NspA/D15-Omp85 cuando se comparó con el OMV preparado de las cepas NmB cps de control. El nivel de la sobre expresión de cada proteina en la recombinante doble es comparable con el nivel de la expresión obtenida en los recombinantes individuales correspondientes. Todos juntos, estos datos demostraron que: (i) la expresión de NspA y Omp85 puede ser conjuntamente y concomitantemente regulada en forma ascendente dentro de N. meningitidis y (¡i) las ampollas recombinantes enriquecidas para NspA y Omp85 pueden ser obtenidas y utilizadas para inmunización EJEMPLO 7 Producción y purificación de formas Hsf recombinantes en E. coli El análisis de computadora de la proteína de tipo Hsf de Neisseria meningitidis reveló por lo menos cuatro dominios estructurales. Considerando que la secuencia Hsf de la cepa H44/76 como una referencia, el Dominio 1, que comprende los aminoácidos 1-51, codifica un péptido de señal dependiente de sec característico de la familia auto-transportadora, el Dominio 2, comprendiendo los aminoácidos 52 a 473, codifica el dominio pasajero probablemente para estar expuesto en la superficie y accesible al sistema inmune, el Dominio 3, comprendiendo los aminoácidos 474 a 534, codifica un dominio enrollado-espiral putativo requerido para la oligomerización de la proteína y una bisagra (cuello), el Dominio 4, comprendiendo los residuos 535 del término C, se pronostica que codifica estructuras de cadena beta probablemente dentro de la estructura de tipo barril y que van a ser ancladas dentro de la membrana exterior (Henderson y otros (1998), Trends icrobiol. 6: 370-378 ; Hoiczyk y otros, (2000), EMBO 22: 5989-5999). Ya que los dominios 2 y 3 probablemente van a estar expuestos en la superficie, están bien conservados (más de 80% en todas cepas probadas, como se describe en Pizza et al. (2000), Science 287: 1816-1820), representan interesantes candidatos de vacuna. Para ese propósito, el dominio 2 (referido como un dominio pasajero Hsf) y el dominio 2 + 3 (referido como un cuello Hsf + dominio de enrollado-espiral) fueron expresados en y purificados de E. coli. Los fragmentos de ADN que codifican los aminoácidos 52-473 (Hsf pasajero) y 52-534 (Hsf n + cc) fueron amplificados mediante PCR utilizando oligonucleótidos que agregan los sitios de restricción Real terminal (iniciador hacia delante) y Xho\ (iniciador en reversa). Los amplicones purificados fueron digeridos con RcallXho\ en las condiciones recomendadas por el proveedor, y fueron subsecuentemente clonados en los sitios Nco\ (compatible con real) / Xho\ del vector de expresión de E. coli pET24d (Novagen, Inc. Madison Wl). Los plásmidos recombinantes fueron seleccionados y utilizados para preparar plásmidos recombinantes purificados. Para el estudio de expresión, estos vectores (pET-Hsf pas & pET-Hsf nec) fueron introducidos dentro de la cepa B121DE3 de Escherichia coli (Novagen), en la cual, el gen para la polimerasa T7 se colocó bajo el control del promotor lac regulable de tiogalactosida (IPTG) de ¡sopropil-beta-D. Los cultivos líquidos (700 mi) de la cepa recombinante de E. coli Novablue (DE3) [pET-24b/BASB029] se hicieron crecer a 37°C bajo agitación hasta que se alcanzó la densidad óptica de 600 nm (OD600). En ese punto del tiempo, se agregó IPTG a una concentración final de 1 mM, y el cultivó se hizo crecer durante 4 horas más. El cultivo después se centrifugó a 10,000 rpm y la pella se congeló a -20°C durante por lo menos 10 horas. Después de descongelar, la pella (680 mi del cultivo) se volvió a suspender durante 30 minutos a 22°C en 20 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0 antes de la lisis de las células a través de dos pasadas a través de un desestabilizador Rannie. Las células lisadas se formaron en pellas 30 minutos a 15,000 rpm (centrifugadora Beckman J2-HS, rotor JA-20) a 4°C. El sobrenadante se cargó en una columna de flujo rápido de Q-Sepharose (Pharmacia) equilibrada con 20 mM de regulador de pH de Tris-HCI pH 8.0. Después de la pasada del flujo, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de 20 mM de Tris-regulador de pH de HCI pH 8.0. La proteína recombinante se eluyó a partir de la columna a través de 250 mM de NaCI en 20 mM de Tris-regulador de pH de HCI pH 8.0. Las fracciones positivas del antígeno se agruparon y se dializaron durante la noche contra 20 mM de regulador de fosfato pH 7.0, 0.5 M de NaCI y se agregaron 20 mM de Imídazol a la muestra dializada. La muestra después se amplificó sobre una columna de Agarosa Ni-NTA (Qiagen) equilibrada con 20 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0 conteniendo 500 mM de NaCI y 20 mM de Imidazol. Después de la pasada del flujo, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de 20 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0 conteniendo 500 mM de NaCI y 20 mM de Imidazol. Los contaminantes se eluyeron a través de 100 mM de Imidazol en 20 mM de regulador de pH de fosfato pH 7.0. La proteína recombinante se eluyó a partir de la columna a través de 250 mM de Imidazol en 20 mM de regulador de pH de fosfato, pH 7.0. Las fracciones positivas del antígeno se agruparon y se dializaron contra 10 mM de regulador de pH de fosfato pH 6.8 conteniendo 150 mM de NaCI. Como se muestra en la Figura 2, una proteína pasajera de tipo Hsf enriquecida (pureza estimada en más de 90% pura en SDS-PAGE teñida con CBB), migrando a alrededor de 47 kDa (masa molecular relativa estimada) se eluyó de la columna. Este polipéptido fue reactivo contra un anticuerpo monoclonal de ratón producido contra el motivo 5-histidina. Tomados juntos, estos datos indican que ambos genes, Hsf pasajero y Hsf ncc pueden ser expresados y purificados bajo una forma recombinante en E. coli.

EJEMPLO 8 Producción y purificación de Hap pasajero recombinante en E. coli El análisis de computadora de la proteína de tipo Hap de Neisseria meningitidis reveló por lo menos tres dominios estructurales. Considerando que la secuencia Hap de la cepa H44/76 como una referencia, el Dominio 1 , que comprende los aminoácidos 1-42, codifica un péptido de señal dependiente de sec característico de la familia auto-transportadora, el Dominio 2, comprendiendo los aminoácidos 43 a 950, codifica el dominio pasajero probablemente para estar expuesto en la superficie y accesible al sistema inmune, el Dominio 3, comprendiendo los 951 residuos del término C (1457), se pronostica que codifica estructuras de cadena beta probablemente dentro de la estructura de tipo barril y que van a ser ancladas dentro de la membrana exterior. Ya que el dominio 2 probablemente va a estar expuesto en la superficie, está bien conservados (más de 80% en todas cepas probadas) y podría ser producido como antígenos de subunidad en E. coli., representa interesantes candidatos de vacuna. Ya que los dominios 2 y 3 probablemente van a estar expuestos en la superficie, están bien conservados (más de 80% en todas cepas probadas, como se describe en Pizza et al. (2000), Science 287: 1816-1820), representan interesantes candidatos de vacuna. Para ese propósito, el dominio 2 (referido como un dominio pasajero Hap fue expresado en y purificado a partir de E. coli). Un fragmento de ADN que codifica los aminoácidos 43-950 (Hap pasajero) se amplificó mediante PCR utilizando oligonucleótidos que agregan los sitios de restricción Nco\ terminal (iniciador hacia delante) y Xho\ (iniciador en reversa). Los amplicones purificados fueron digeridos con NcollXhoi en las condiciones recomendadas por el proveedor, y fueron subsecuentemente clonados en los sitios Wcol / Xho\ del vector de expresión de E. coli pET24d (Novagen, Inc. Madison Wl). Los plásmidos recombinantes fueron seleccionados y purificados a gran escala. Para el estudio de expresión, estos vectores (pET-Hap pass) fueron introducidos dentro de la cepa B121DE3 de Escherichia coli (Novagen), en la cual, el gen para la polimerasa T7 se colocó bajo el control del promotor lac regulable de tiogalactosida (IPTG) de isopropil-beta-D.

Cultivo de E. coli BL21 fpET-Hap passl en fermentador. Una fracción de alícuota (100 µ?) de la semilla maestra se difundió en placas FEC013AA (peptona de soja A3 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCI 5 g/l, Agar 18 g/l, H20 destilada hasta 1 I), y se dejó crecer durante 20 horas a 37°C. El césped de bacteria se cosechó y se volvió a suspender en agua estéril conteniendo NaCI 0.9%. Esta solución se utilizó para inocular un fermentador de 20 I utilizado en el modo de lotes en medio FEC011AC (Peptona de soja 24 g/l, extracto de levadura 48 g/l, MgS04/7H20 0.5 g/l, K2HP04/2H20 0.45 g/l, glicerol (87%) 40 g, y H20 destilada hasta 1 I). Temperatura (30°C), pH 6.8, NaOH 25%/H3P04 25%), presión (500 mbarias), se mantuvo constante y la aeración se fijó a 20 l/minuto. En estas condiciones la presión del oxígeno disuelto se mantuvo a 20% activando la agitación (100 a 1000 rpm). El Inductor (IPTG, 1 mM) se agregó después de 8 horas de crecimiento (OD = 27.8). Las Muestras (6 I) se recolectaron después de 6 horas (OD = 49.2) y 10H30 (OD = 48.6), la biomasa se cosechó a través de centrifugación y la pellas correspondientes se almacenaron a -20°C.

Purificación del Hap pasajero: El HAP pasajero se purificó de un fermentador en el modo por lotes. Se desarrolló un esquema de purificación (ver a continuación): Prensa Francesa (Tris 50 mM/EDTA 5 mM, pH 8.0) l 30'a 10000 rpm (JA10) i solubilizar pella en Pi 20 mM/urea 8M, pH 7.0 1H agitación a 'temperatura ambiente i 30' a 10000 rpm (JA10) i SP-Sepharose-XL i Pi 20mM/Urea 8M; elución +/-50 mM NaCI l Quelatación Sepharose -FF-Cu + + Pi 20 mM/NaCI 0.5 M/Urea 8M; elución +/-100 mM imidazol l Diálisis (PBS pH 6. 8/arginina 0.5 M) 1 filtración estéril La mayoría del Hap pasajero se recuperó en la pella de centrifugación después de la ruptura de las células. La solubilización fue hecha posible a través de 8 M de urea. A pesar de que el término N de His-cola, IMAC no fue operativo como en el primer paso, pero estuvo bien después de un primer paso en intercambiador de catión SP-XL. En este SP-Sepharose-XL, la proteína se eluyó cuantitativamente en la mitad del gradiente NaCI lineal (0-250 mM). IMAC se hizo con Quelatación Sepharose cargado en Cu**, como para FHAb. Esta vez, contrario a FHAb, IMAC mostró un factor de purificación importante. En SDS-PGE, HAP2/3 parece puro después de IMAC. El pico HAP2/3 fue sin embargo muy amplio en 0-200 mM de gradiente de imidazol, por lo que se trató la elución a través de los pasos de imidazol (10 mM -100 mM); el modo de gradiente parece sin embargo más eficiente en términos de pureza. Como paso final, se trató el intercambio de regulador de pH de urea a arginina a través de permeacion de gel sin embargo en este caso la proteína se eluyó en dos picos. Estos dos picos mostraron un perfil comparable en SDS-PAGE; por lo que se puede hipotetizar que es debido a un redoblamiento parcial del HAP pasajero. Cuando se regresó a la diálisis clásica como paso final par el intercambio de regulador de pH. El análisis SDS-PAGE mostró una buena pureza del material final (ver Figura 3). La pureza del HAP pasajero además se confirmó a través de WB anti-his. Se reconoce a través de anti-E. coli. Se encontró un peso molecular de 96.1 KD.

EJEMPLO 9 Producción v purificación de formas FrpA/C recombinantes en E. coli Neisseria meningitidis codifica dos proteínas RTX, referidas como FrpA y FrpC secretadas dependiendo de la limitación de hierro (Thompson y otros, (1993) J. Bacteriol. 175: 811-818; Thompson y otros, (1993) Infect. Immun. 61: 2906-2911 ). La familia de proteína RTX (Repetición de toxina) tiene en común series de 9 aminoácidos repetidos cerca de su término C con los consensos: Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp) AspXaa. (LXGGXGN/DDX). Las repeticiones en E. coli HlyA se cree que son el sitio de la unión de Ca2 + . Como se representa en la Figura 4, las proteínas FrpA y FrpC meningocócicas, según caracterizadas en la cepa FAM20, comparten una similitud de aminoácido extensiva en sus regiones central y C-terminal pero similitud muy limitada (si hay alguna) en el término N. Además, la región conservada entre FrpA y FrpC exhiben algo de polimorfismo debido a la repetición (13 veces en FrpA y 43 veces en FrpC) de un motivo de aminoácido 9. Para evaluar el potencial de la vacuna de FrpA y FrpC, se reprodujeron recombinantemente en regiones de proteína de E. coli conservadas entre FrpA y FrpC. Para ese propósito, un segmento de ADN cubriendo los aminoácidos 277 a 1007 (con respecto a la secuencia de péptido FAM20 de N. meningitidis) se amplificaron mediante PCR a partir del genoma H44/76 del serogrupo B de N. meningitidis utilizando el iniciador hacia delante FrpA-19 (5'-CTCGAGACCATGGGCAAA TATCATGTCTACG ACCCCCTCGC-3' ) y el iniciador en reversa FrpA-18 (3'-GTG CATAGTGTCAGAGTTTTTGTCGACGTCGTAATTATAGACC-3'). Tres amplicones de aproximadamente 1530 bp respectivamente (3 repeticiones), aproximadamente} 2130 bp (13 repeticiones) y 2732 bp (23 repeticiones) se obtuvieron y se digirieron con endonucleasas de restricción ?/col y Ss/I. Estos fragmentos después fueron insertados en los sitios Nco\IXho\ (compatible con Sa/I) de pET24d y plásmidos recombinantes (pET-Frp3, pET-Frpl3 y pET-Frp23 respectivamente) se seleccionaron y se utilizaron para transformar células BL21DE3 de E. coli. Como se representa en la Figura 5, los tres dominios conservados FrpA/C recombinantes producidos de construcciones dependen de la inducción. Además, la incrementar el número de repeticiones se incrementa la solubilidad de la proteína recombinante, según determinado por el análisis de fragmentación de célula (datos no mostrados).

Purificación del dominio conservado FrpA/C conteniendo 23 repeticiones del nonapéptido LXGGXGC/DDX (911 aa en total): 3.5 litros de E.coli B121DE3 [pET- Frp23] se cultivaron y se indujeron durante 4 horas a través de la adición de 2 mM de IPTG cuando se alcanzó un OD de 0.6. La célula se cosechó a través de centrifugación y la pella correspondiente se desestabilizó con presión, se clarificó a través de centrifugación y el sobrenadante de cultivo correspondiente se cargó en una columna de afinidad de ión de metal Ni2+ (Ni-NTA-agarosa, Qiagen GmBh). Se utilizó Imidazol () para la elución y finalmente se removió a través de diálisis extensiva contra 10 mM de fosfato de Na pH 6.8, 150 mM de NaCI.

EJEMPLO 10 Producción y purificación de formas FHA recombinantes en E. coli Clonación de un FhaB truncado de N. meningitidis Se extrajo ADN genómico de 1010 células de la cepa H44/76 del serogrupo B de N. meningitidis utilizando el equipo de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagen Gmb ). Este material (1 g) después se sometió a amplificación de de ADN de Reacción de Cadena de Polimerasa utilizando los siguientes iniciadores específicos del gen FhaB: JKP: 5??? GGA ATA CAT ATG AAT AAA GGT TTA CAT CGC ATT ATC3' y 57JKP 5' CCA ACT AGT GTT TTT CGC TAC TTG GAG CTG T3\ Un fragmento de ADN de aproximadamente 4200 bp, codificando los primeros 1433 aminoácidos N-terminal de la proteína, se obtuvieron, se digirieron a través de endonucleasas de restricción Nde\ISpe\ y se insertaron dentro de los sitios correspondientes de pMG CS (derivado p G, Proc Nati Acad Sci Ela Enero 1985; 82(1 ):88-92) utilizando técnicas de biología molecular estándar (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Segunda Edición, Eds: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989). La secuencia de ADN del fragmento FhaB clonado se determinó utilizando el equipo de Secuenciación Big Dye Cycle (Perkin-Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 373A/PRISM (ver Figura 1 ). El plásmido pMG-FhaB recombinante (1 µ9) después fue sometido a amplificación de ADN de Reacción de Cadena de Polimerasa utilizando los iniciadores específicos FhaB (X J KP035'AATGGAATACATATG AATAAAGGTTTACATCGCATTATCTTT AG 3' y XJKP57025'GGGGCCACTCGAGGTTTTTCGCTACTTGGA GCTGTTTCAGATAGG3'). Un fragmento de ADN de 4214 bp se obtuvo, se digirió a través de endonucleasas de restricción Nde\IXho\ y se insertó dentro de los sitios correspondientes del vector de expresión/clonación pET-24b (Novagen) usando técnicas de biología molecular (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Segunda Edición, Eds: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press1989). La secuenciación confirmatoria del pET-24b recombinante conteniendo FhaB truncado (pET23b/FhaB2/3) se llevó a cabo utilizando el equipo Big Dyes (Applied biosystems) y el análisis en un secuenciador de ADN ABI 373/A en las condiciones descritas por el proveedor. La secuencia de nucleótido resultante se presenta en la Figura 6.

Expresión y purificación de la proteína FhaB recombinante en Escherichia coli. La construcción del vector de expresión/clonación pET24b/FhaB2/3 se describe anteriormente. Este vector contiene el gen FhaB truncado aislado de la cepa H44/76 fusión con un tramo de 6 residuos de Histidina (en el término C del producto recombinante), colocado bajo el control del promotor 10 del gen T7 bacteriófago fuerte. Para el estudio de expresión, este vector se introdujo en la cepa de Escherichia coli Novablue (DE3) (Novagen), en la cual el gen para la polimerasa T7 se colocó bajo el control del promotor lac regulable a través de tiogalactosida de isopropil-beta-D (IPTG). Los cultivos líquidos (100 mi) de la cepa recombinante de E. coli Novablue (DE3) [pET24b/FhaB2/3) se hicieron crecer a 37°C bajo agitación hasta que se alcanzó la densidad óptica a 600 nm (OD600). En ese punto del tiempo, se agregó IPTG a una concentración final de 1 mM, y el cultivó se hizo crecer durante 4 horas más. El cultivo después se centrifugó a 10,000 rpm y la pella se congeló a -20°C durante por lo menos 10 horas. Después de descongelar, la pella se volvió a suspender durante 30 minutos a 22°C en regulador de pH (6 de clorhidrato de guanidina, 0.1 de NaH2P04, 0.01 M de Tris, pH 8.0) se pasaron tres veces a través de una aguja y se purificaron a través de centrifugación (20000 rpm, 15 minutos). La muestra después se cargó a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto en una columna Hitrap cargada con NÍ2+ (Pharmacia Biotech). Después de la pasada del flujo, la columna se lavó con 40 mi de regulador de pH B (8 de urea, 0.1 M de NaH2P04, 0.01 M Tris, pH 8.0),40ml de regulador de pH C (8M Urea, 0.1 M de NaH2P04, 0.01 M Tris, pH 6.3). La proteína recombinante FhaB/3/His6 después se eluyó a partir de la columna con 30 mi de regulador de pH D (8N de urea, 0.1 de NaH2P04, 0.01 M Tris, pH 6.3) conteniendo 500 mM de imidazol y se recolectaron fracciones con un tamaño de 3 mi. Como se presenta en la Figura 7, una proteína FhaB-2/3/His6 altamente enriquecida, que migra alrededor de 154 kDa (masa molecular relativa estimada), se eluyó de la columna. Este polipéptido fue reactivo contra un anticuerpo monoclonal de ratón surgido contra el motivo de histidina 5. Tomados juntos, estos datos indican que Fhab/2/3 pueden ser expresados y purificados bajo una forma recombinante en E. coli.

Inmunización de ratones con FhaB2/3His recombinante La proteína FhaB2/3/His6 recombinante parcialmente purificada expresada en E. coli se inyectó tres veces en ratones Babl/C en los días 0, 14, y 29 (10 animales/grupo). Los animales se inyectaron mediante ruta subcutánea con alrededor de 5 ig de AIP04, o formulado en emulsión SBAS2 (emulsión de SBAS2 conteniendo 5 de MPL y 5 de QS21 por dosis). Un grupo de control negativo consistiendo de ratones inmunizados con la emulsión SBAS2 solamente también se agregó al experimento. Los ratones se sangraron en el día 29 (15 días Post II) y el día 35 (6 días Post III) con el fin de detectar anticuerpos anti-FhaB específicos. Los anticuerpos anti-FhaB específicos se midieron en suero combinado (de 10 ratones/grupo) a través de ELISA en FhaB2/3/his recombinante purificado.

EJEMPLO 11 Actividades de bloqueo de adhesión de suero de ratón y conejo contra los antíqenos FHA, Hap y Hsf Las proteínas homologas a la meningocócica de tipo FHAB, de tipo Hsf y tipo Hab han sido descritas previamente como siendo determinantes virulentas importantes y para mediar la adhesión bacterial de Bordetella pertussis (FHA) y Haemop ilus influenzae (Hap y Hsf). La adhesión a células epiteliales y endoteliales se sabe que es crucial para la colonización de los nasofaringeos y el cruce de la barrera de sangre-cerebro mediante los meningococos. De esta manera la interferencia con la adhesión de N. meningitidis representa un método valioso para controlar la colonización e infección meningocócica. Aquí se probó si el anti-suero dirigido contra los antigenos FHAB 2/3° meningocócico, de tipo Hap y de tipo Hsf fue capaz de interferir la adhesión de Neisseria meningitidis a células endoteliales. Se utilizó el siguiente procedimiento experimental.

Inhibición de adhesión a HUVECs: la cepa de prueba meningocócica en este estudio fue un derivado Opa- y Opc- no piliado, no encapsulado de la cepa NmA8013. Las células meningocócicas (la colonia 2.10E5 que forma unidades (CFU) del derivado NmA8013) se incubaron durante 30 minutos a 37°C en un medio compuesto de 400 µ? de RPMI, 50 µ? de suero de bovino fetal y 50 µ? de suero que va ser probado para las propiedades de bloqueo de adhesión. Esta mezcla después se colocó en una cavidad conteniendo monocapas confluentes de células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVECs) cuyo medio de cultivo has sido previamente removido. Las células de bacteria y de HUVEC fueron incubadas durante 4 horas a 37°C, bajo C02 al 5%. Las monocapas de células después se lavaron tres veces con suero RMPI fresco y subsecuentemente se eliminaron de la placa. CFU asociado con las células HUVEC después fueron determinadas como dilución serial y se colocaron en placas del lisato de célula sobre placas GC. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37°C para permitir la recuperación y crecimiento de meningococo asociado con célula.

Actividades de adhesión-bloqueo de suero de ratón y conejo cultivado contra los antíqenos HFAB2/3°, Hap y Hsf recombinantes: los anticuerpos anti-FHA 2/3, anti-Hsf de longitud completa (descrito en WO 99/58683) y anti-Hap de longitud completa (WO 99/55873), asi como anti-suero dirigido contra los dominios pasajeros Hsf y Hap correspondientes, interfieren con la adhesión meningocócica a células HUVEC endoteliales. La Figura 8 ilustra que los anticuerpos específicos inducidos a través de FHA 2/3 formulados en AIP04, fueron capaces de inhibir la adhesión a Neisseria meningitidis B a células HUVEC comparado con el auxiliar solo. Cuando se compararon con el auxiliar SBAS2 solo (sin antígeno, grupo 4 )e I anti-FHA 2/3 abs (formulación SBAS2) aún es efectivo, pero menos potente que AIP04. El auxiliar SBAS2 solo (sin antígeno) no induce anticuerpos capaces de interferir con la adhesión. Comparado con el grupo 4, los anticuerpos anti-Hap (grupo 1) pueden tener un ligero efecto inhibidor. En el grupo 5, cuando se prueba una mezcla de anticuerpos anti-FHA 2/3, anti-Hsf, y anti-Hap, la inhibición de la adhesión es más fuerte que con anti-FHA 2/3 solo, sugiriendo un efecto sinergístico dado a través de los anticuerpos anti-Hap y anti-Hsf. En un segundo experimento de inhibición (Figura 2) , un antisuero de conejo específico dirigido contra anti OMVs que sobre-expresa Hsf (como una proteína candidato) fue capaz de inhibir parcialmente la fijación de Neisseria meningitidis B a las células endoteliales comparado con el control negativo (grupo 3 contra 4). Este antisuero de conejo ha demostrado que contiene una concentración de anticuerpo anti-Hsf específico alto. Los anticuerpos contra rec Hsf (Hsf pasajero y Hsf de longitud completa) también son capaces de inhibir la adhesión de la bacteria en las células HUVEC. Esto es cierto tanto con suero de ratones (grupos 5-6) así como con suero de conejo (en una extensión láser) (grupos 7-8). En este segundo experimento, los anticuerpos anti-rec FHA 2/3 específicos (grupo 1) ya probados en el primer experimento confirman su efecto inhibidor muy alto. Estos resultados indican que estos antígenos específicos (Hap, FHA2/3, y Hsf), aislados o en combinación, son antigenos de vacuna interesantes.

EJEMPLO 12 Efecto Protector de OMVs recombinantes en el modelo de ataque de ratón Han sido evaluados varios OMVs recombinantes en ratones Balb/C en su efecto protector después de un ataque letal. Este modelo de inmunización activo involucra la inyección intraperitoneal de meningococos de varias cepas (suspendidas en medio TSB reducido en hierro) en ratones Balb/C y OF1 adultos (de 6 a 8 semanas de edad), después de series de inmunizaciones a través de la ruta subcutánea. La dextrana de hierro, utilizada como una fuente de hierro externa parece ser necesaria para mantener la bacteriemia e inducir la mortalidad en el animal infectado. Aunque este modelo IP en ratones ha mostrado ser efectivo para evaluar la virulencia, la protección inmune y el papel del hierro en la infección, no incorporan la fase de transporte faríngeo, la cual precede la bacteriemia y la meningitis en humanos. Este modelo ha sido utilizado para clasificar nuestros varios candidatos OMV que sobre expresan NspA, TbpA, o Hsf. En los siguientes experimentos, se inmunizaron ratones Balb/C (endogámicos) u OF 1 (no congénitos) tres veces en los días 0, 14, y 28 a través de la ruta subcutánea con 3 (PVOON049) a 5 µ? (experimentos PV00N035 y PV00N043) de rec. OMV sobre-expresando Hsf, NspA o TbpA formulado en A1(OH)3 (100 µg A1 (OH)3/an¡mal) (PV00N035 y PVOON043) o en A1 P04 (100 µ? A1 P04/animal). Después, los animales se sangraron en los días 28 (día 14 después de II) y día 35 (día 7 después de III) para la evaluación Ab específica. En el día 35, 10 mg de dextrana de hierro se inyectó intraperitonealmente una hora antes del ataque. Los ataques se hicieron con las cepas H44/76 (B:15:P1. 7,16) o CU- 385 (B:4:P1. 19,15), con alrededor de 1.10 e7 de CFU/animal (ver el cuadro de resultados para la dosis de ataque exactas). La cepa heteróloga hecha con la cepa CU-385 es más estricta que cuando se utiliza la cepa homologa. Las mortalidades se registraron a partir de los días 1 a 5. El cuadro 1 a continuación ilustra que cuando se compara con OMV, porA(-) y con OMV TbpA ( + ) en una extensión más corta, ya existe una mejor protección observada con OMV TbpA ( + ) y 3/5 para porA (-) y 9/10 y 3/5 para porA( + )), con OMV NspA ( + ) (4/10 y 4/5) y con OMV Hsf ( + ) (3/10,2/10 y 3/5). Esta es la observación global que se puede hacer es estos tres experimentos. Estos datos soportan que los antígenos TbpA, Hsf y HspA, expresados en la superficie de la ampolla, sean de interés para una vacuna men futura.

CUADRO 1 Actividad protectora en el modelo de ratón de vesículas de membrana exterior El cuadro resume los resultados obtenidos durante tres experimentos (PV00N035, PV00N043 y PV00N049) O Vs (Ampollas) NT: No probado EJEMPLO 13 Efecto protector de antiqenos de subunidad recombinantes en el modelo de ataque de ratón Han sido evaluadas varias proteínas purificadas recombinantes en ratones Balb/C por su efecto protector después del ataque letal. Este modelo de inmunización activo involucra la inyección intraperitoneal de meningococos de varias cepas (suspendidas en medio TSB reducido en hierro) en ratones Balb/C y OF1 adultos (de 6 a 8 semanas de edad), después de series de inmunizaciones a través de la ruta subcutánea. La dextrana de hierro, utilizada como una fuente de hierro externa parece ser necesaria para mantener la bacteriemia e inducir la mortalidad en el animal infectado. Aunque este modelo IP en ratones ha mostrado ser efectivo para evaluar la virulencia, la protección inmune y el papel del hierro en la infección, no incorporan la fase de transporte faríngeo, la cual precede la bacteriemia y la meningitis en humanos. Este modelo ha sido utilizado para clasificar nuestros varios candidatos de vacuna de sub-unidad menú de tipo moléculas recombinantes FrpC, TbpA, FHA2/3 y Hap O V que sobre expresan NspA, TbpA, o Hsf. En este experimento, se inmunizaron ratones OF 1 (no congénitos) tres veces en los días 0, 14, y 28 a través de la ruta subcutánea con 5 µ9 (PV00N050) de estas proteínas formuladas en A1 P04 (100 9) en presencia de 10 µ9 de MPL (por animal). Después, los animales se sangraron en los días 28 (día 14 después de II) y día 35 (día 7 después de III) para la evaluación Ab especifica, mientras se atacaron en el día 35. En el día del ataque se inyectaron 10 mg de dextrana de hierro intraperitonealmente una hora antes del ataque. Los ataques se hicieron con las cepas CU-385 (B:4 : P 1.19, 15) , las cuales son heterólogas en este caso, ciertamente, la secuencia de los antigenos que vienen de H44/76 (B: 15:p 1.7, 16), excepto para TbpA para el cual la secuencia viene de la cepa B16B6 (B:2a:P1.2). Los resultados ilustrados en el cuadro 2 indican que FrpC, TbpA, FHAB2/30, Hap indujeron una protección significativa en este modelo: de 2 a 4 de 5 ratones sobrevivieron después del ataque, comparado con solamente 1/5 con el auxiliar solo. En todos los grupos menos uno, la concentración del anticuerpo específico fue alto (la concentración de anti-TbpA específica fue moderada). Todos estos datos soportan que FrpC, FrpA, el dominio conservado FrpA/C, TbPA, FHAB2/3", Hap presentados como antígenos de sub-unidad, aislados o en combinación, son de interés para el desarrollo de una vacuna menB.

CUADRO 2 Actividad Protectora en el modelo de ratón de vesículas de membrana exterior recombinantes El cuadro resume los resultados obtenidos durante un experimento (PV00N050).

Antígenos de Sub-unidad EJEMPLO 14 Método para mostrar el efecto sinerqístico de combinaciones de antígenos de vacuna Diferentes OMVs recombinantes disponibles (OMVs porA ( + )rmp-LbpB, OMVs porA (-) TbpA ( + ) Hsf ( + ), OMVs porA (-) TbpA ( + ), OMVs porA (-) NspA ( + ), OMVs porA (-) Hsf ( + ), OMVs porA (-) TbpA ( + ) NspA ( + )) pueden ser probados solos o en combinación para determinar estadísticamente las mejores combinaciones, en términos de detección de un efecto sinergístico con combinaciones de antigenos de subunidad, así como la combinación de antígenos de subunidad + OMVs recombinantes. 32 grupos de 5 OF1 ratones/grupo pueden ser inyectados y probados para actividad del suero bacterial y actividad opsónica, protección activa y pasiva en el modelo de ratón (si necesitar estar utilizando cantidades subóptimas de antígenos individuales). Una indicación de las combinaciones de antígeno sinergísticas es si el nivel protector conferido después de la inmunización combinada es mayor que la suma de los antígenos individuales.

EJEMPLO 15 Análisis del contenido de Hsf y TbpA de Vesículas de Membrana Exterior SDS-PAGE teñido con Coomassie azul Se diluyeron 15 µ9 de proteína en las preparaciones de vesícula de membrana exterior con regulación ascendente de Hsf o TbpA o ambas, Hsf y TbpA, en un regulador de pH de muestra conteniendo ß-mercaptoetanol y se calentó a 95°C durante 10 minutos. Las muestras después se corrieron en gel de poliacrilamída SDS-PAGE (Novez 4-20% de Tris-glicina, 1.5 mm 2Dcavidad de SDS-PAGE), se tiñeron en Commassie azul durante una hora y de destiñeron en varios lavados de desmanchador. Los resultados se muestran en la Figura 9, la cual muestra que el nivel de Hsf y TbpA es considerablemente mayor en las preparaciones de vesícula de membrana exterior, derivadas de N. meníngitidis en donde su nivel de expresión ha sido mejorado.

EJEMPLO 16 Inmunoqeneicidad de OMVs con regulación ascendente de Hsf y/o TbpA Se inmunizaron grupos de 20 ratones tres veces con OMV a través de la ruta intramuscular en los días 0, 21 y 28. Cada inoculación fue hecha de 5 ng (contenido de proteína) de OMVs formulados en AIP04 con MPL. Los OMVs se derivaron de la cepa H44/76 de N. meníngitidis, diseñada para que los polisacáridos capsulares y PorA fueran regulados de manera descendente. Se hizo una comparación de OMVs en los cuales Hsf, TbpA, ambos Hsf y TbpA o ninguno fue regulado de manera ascendente. En el día 41, las muestras sanguíneas se tomaron para análisis a través de ELISA o a través del ensayo bactericida del suero.

ELISA para detectar anticuerpos contra Hsf Se recubrieron microplacas de 96 cavidades (Nunc, Maxisorb) durante la noche a 4°C con 100 µ? de 1 µ?/??? de antigeno específico en PBS. Después de lavar con NaCI 150 n de Tween 20 0.05%, las placas se saturaron con 100 µ? de PBS-BSSA 1% bajo agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Entre cada paso (realizado bajo agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos y con PBS-BSA 0.2% como regulador de pH diluyente), los reactivos en exceso se removieron a través de lavado con NaCI-Tween 20. Se agregaron cien micro-litros de muestras de suero diluido por micro-cavidad. Los anticuerpos enlazados se reconocieron a través de Ig de anti-ratón bioteñidos (Prosan) (1/2000). El complejo de antigeno-anticuerpo se reveló a través de incubación con conjugado de peroxidasa bioteñida de estreptavidina (Amersham) (1/4000). Se utilizó OrtoFenilenoDiamina/H202 (4 mg/10 mi de regulador de pH de citrato 0.1M pH 4.5 + 5 µ? de H202) para revelar el ensayo. Las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad antes de detener la reacción a través de la adición de 50 I de 1N de HCI. La absorbancia se leyó a 490 nm.

Punto medio de concentración (en el suero sondeado) g1, ampollas TbpA-Hsf, IM 15471 g2, ampollas TbpA, IM 15.41 g3, ampollas HSF, IM 14508 g4, ampollas CPS(-)PorA(-), IM - g5, MPL/AIP04, IM - Los resultados mostrados en el cuadro anterior, muestran que las concentraciones de anticuerpo altas y equivalentes contra Hsf fueron creadas a través de la inmunización con OMVs con regulación ascendente de Hsf o ambos Hsf y TpbA. Virtualmente ningún anticuerpo contra Hsf pudo ser detectado en el suero creado después de la inoculación con el auxiliar solo u OMV en el cual ningún Hsf ni ningún TbpA habían sido regulado en forma ascendente u OMV en el cual solamente TbpA había sido regulado en forma ascendente.

EJEMPLO 17 Actividad Bactericida del Suero de antisuero cultivado contra OMVs con regulación ascendente de Hsf v/o TbpA La actividad bactericida de suero de los ratones inoculados con OMVs con regulación ascendente de Hsf, TbpA, tanto Hsf y TbpA o sin regulación ascendente se compararon en ensayos utilizando cualquiera de las cepas homologas H44/76 o la cepa heteróloga Cu385. El ensayo bactericida del suero había mostrado que muestra una buena correlación con la protección y por consiguiente una buena indicación de que tan efectiva sería una composición candidato en la provocación de una respuesta inmuno protectora. Las cepas de tipo silvestre del serogrupo B de Neisseria meningitidis (cepa H44/76 =B: 15P1.7.16 L3, 7, 9 y la cepa CU385 =B : 4P1.19, 15 L3,7,9) se cultivaron durante la noche en MH + 1% de Polivitex + 1% de suero de caballo en platos de Petri a 37°C + 5% de C02. Se sub-cultivaron durante 3 horas en un medio TSB liquido suplementado con 50 µ9 de Desferal (quelatador de hierro) a 37° durante la noche para lograr una densidad óptica de aproximadamente 0.5 a 470 nm. El suero agrupado o solo se inactivo durante 40 minutos a 56°C. Las muestras de suero se diluyeron 1/100 en HBSS-BSA 0.3% y después se diluyeron serialmente dos veces (8 diluciones) en un volumen de 50 µ? en microplacas de fondo redondo. La bacteria, al OD apropiado, se diluyó en HBSS-BSA 0.3% para producir 1.3 10e4 CFU por mi, se agregaron 37.5 µ? de esta solución a las diluciones de suero y las microplacas se incubaron durante 15 minutos a 37°C bajo agitación. Después, se agregaron 12.5 µ? de complemento de conejo a cada cavidad. Después de 1 hora de incubación a 37°C y bajo agitación, las microplacas se colocaron sobre hielo para detener la aniquilación. Al utilizar el método de inclinación, 20 µ? de cada cavidad se colocaron en placas en MH + 1% de Polivitex + 1% de suero de caballo en platos de Petri y se incubaron durante la noche a 37°C + C02. Los CFUs se contaron y se calculó el porcentaje de aniquilación. La concentración bactericida del suero es la última dilución produciendo > 50% de aniquilación.

H44/76 CU385 OMV GMT % de GMT %de respondedores respondedores Se obtuvieron similares resultados a aquellos mostrados en el cuadro anterior en otros dos experimentos similares. Un incremento dramático en las concentraciones bactericidas (GMT) contra la cepa homologa y la cepa heterologa se vio después de la vacunación con OMV en el cual ambas Hsf y TbpA se regularon de manera ascendente. A través de la comparación, los GMTs bactericidas medidos en ratones vacunados con OVMs de Hsf o TbpA regulados de manera ascendente fueron similares a aquellos obtenidos con los ratones vacunados con OMVs de control. El beneficio de doble regulación ascendente también fue claramente observado en el porcentaje de ratones que producen un nivel significativo de anticuerpos bactericidas (concentraciones mayores de 1/100), particularmente en experimentos utilizando la cepa heterologa.

EJEMPLO 18 Efecto de mezclar suero anti-Hsf y anti-TbpA en actividad bactericida Se inmunizaron grupos de 20 ratones con OMV a través de la ruta ¡ntra-muscular en los días 0, 21 y 28. Cada inoculación fue hecha de 5 g (contenido de proteína) de OMVs formulados en AIP04 con MPL. Los OMVs se derivaron de la cepa H44/76 de N. meningitidis , diseñada para que los polisacáridos capsulares y PorA fueran regulados de manera descendente. Un grupo de ratones se inmunizó con OMVs de control en los cuales no hubo regulación ascendente de proteínas. En un segundo grupo, la expresión de Hsf se reguló de manera ascendente, en un tercer grupo la expresión de TbPA se reguló de forma ascendente y en un cuarto grupo, la expresión de ambos, Hsf y Hipa se reguló de manera ascendente.

El suero se agrupó, ya sea utilizando suero de ratones en el mismo grupo o mezclando suero aislado del grupo en donde el Hsf solo o TbpA solo ha sido regulado de manera ascendente. La actividad bactericida del suero se midió para cada suero agrupado y los resultados se muestran en el siguiente cuadro.

Los resultados en el cuadro anterior muestra que la mezcla de antisuero anti-Hsf y anti-Tbpa da como resultado un actividad bactericida mucho más alta que la lograda a través de cualquier suero individualmente. El efecto sinergístico parece ser logrado a través de la presencia de anticuerpos contra ambos, Hsf y TbpA.

EJEMPLO 19 Proteínas Hsf tru ncadas pueden combinarse sinerqísticamente con TbpA Se produjeron series de construcciones Hsf truncadas utilizando procedimientos de biología molecular estándares. Estos incluyen una construcción que codifica los aminoácidos 1 a 54 que contienen la secuencia de señal de Hsf y los aminoácidos 134 y 592 de Hsf (TrIHsf). Un segundo Hsf truncado conteniendo los aminoácidos 1-53 de la secuencia de señal de Hsf seguido por los aminoácidos 238-592 de Hsf (Tr2Hsf). Estas dos construcciones Hsf truncadas y Hsf de longitud completa se introdujeron en Mc58 siaD-, Opc-, PorA- de la cepa B de N. Meningitidis por lo que su expresión podría ser regulada de forma ascendente y se produjeron las vesículas de membrana exterior utilizando los métodos descritos anteriormente. Las preparaciones de vesícula de membrana exterior se adsorbieron en AI(OH)3 y se inyectaron dentro de los ratones en los días 0, 21, y 20. En el día 42, los ratones se sangraron y se preparó el suero. El suero se mezcló con suero de ratones vacunados con O Vs de TbpA regulados de forma ascendente y los ensayos bactericidas de suero se llevaron a cabo como se describió anteriormente.

Resultados Concentraciones Bactericida dei Suero Los resultados mostrados en el cuadro anterior revelan que la primera truncacion (TrlHsf) provoca una respuesta inmune que es capaz de combinarse con antisuero contra TbpA para producir una actividad bactericida de suero más grande que cuando se utiliza Hsf de longitud completa. Sin embargo, la extensión de la truncacion es importante y la truncacion producida en Tr2 tiene un efecto de deterioro comparado con el Hsf de longitud completa. La actividad bactericida mejorada de TrlHsf ha sido vista contra ambas cepas utilizadas.

EJEMPLO 20 Actividad bactericida del suero de anticuerpos contra TbpA, Hsf y una tercera proteína meninqocócica La cepa H44/76 de N. meningitidis en la cual PorA y los polisacáridos se regulador en forma descendente como se describió anteriormente, se utilizaron como la cepa base para regular de forma ascendente TbpA y Hsf, LbpB, D15, PilQ y NspA utilizando el procedimiento descrito anteriormente. Las vesículas de membrana exterior se prepararon de cada cepa como se describió anteriormente. FHAb, FrpC, FrpA/C y Hap se prepararon utilizando técnicas descritas aquí anteriormente y conocidas en la técnica (como se describe en PCT/EP99/02766, W092/01460 y W098/02547). Las preparación de vesícula de membrana exterior y proteínas recombinantes se adsorbieron en AI(OH)3 y se inyectaron en los ratones en los días 0, 21, y 28. En el día 42, los ratones se sangraron y se prepararon. El suero contra O Vs regulados de forma ascendente de TbpA y Hsf se mezcló con suero de ratones vacunados con OMVs conteniendo los OMVs de LbpB, D15, PilQ o NspA regulados en forma ascendente o FHAb, FrpC, FrpA/C, o Hap y los ensayos bactericidas de suero se llevaron a cabo como se describió anteriormente Resultados Los resultados se muestran en el siguiente cuadro. En los ensayos que utilizan la cepa H44/76 homologa, la adición de anticuerpos contra un tercer antígeno meningocócico, con la excepción de FrpC, no produjeron una concentración bactericida de suero más alta que la producida utilizando anticuerpos contra TpbA y Hsf solos. Sin embargo, la adición de anticuerpos contra un tercer antígeno se ventajosa en ensayos bactericidas de suero utilizando la cepa heteróloga. Los anticuerpos contra D15 (OMP85), Hap, FrpA/C y LbpB fueron particularmente efectivos en el incremento de concentración bactericida de suero contra la cepa CU385.

Concentración Bactericida del suero Mezcla de antisuero H44/76 CU385 anti-TbpA- Hsf y suero autoinmune 5378 2141 anti-TbpA- Hsf y suero anti-FHA 5260 2563 anti-TbpA- Hsf y suero anti-Hap 4577 5150 anti-TbpA- Hsf y suero anti-FrpA/C 5034 4358 anti-TbpA- Hsf y suero anti-LbpB 5400 4834 anli-TbpA- Hsf y suero anti-D15 4823 4657 anti-TbpA- Hsf y suero anti-PilQ 4708 2242 anti-TbpA- Hsf y suero anti-NspA 4738 2518 anti-TbpA- Hsf y suero anti-FrpC 6082 2300 EJEMPLO 21 Efecto de FrB KO en vesículas de membrana exterior en su habilidad para provocar una respuesta inmune bactericida en cepas homologas y heteróloqas Se utilizaron dos cepas de H44/76 de N. meningitidis para preparar preparaciones de vesícula de membrana exterior como se describe en WO 01/09350, utilizando 0.1% de extracción de DOC por lo que el contenido de LOS fue de alrededor de 20%. La cepa B1733 es siaD(-), PorA(-). tiene regulación ascendente de Tr1 Hsf (Ejemplo 19) e IgtB está aniquilado. La cepa B1820 B1733 es siaD(-), PorA(-), tiene regulación ascendente de Tr1 , Hsf, IgtB está aniquilada y FrpB también está aniquilada. Ambas cepas se cultivaron en medio suplementado con 60 µ? de Desferal por lo que las proteínas reguladas en hierro tales como LbpA/B y TbpA/B están reguladas en forma ascendente. Las preparaciones de ampollas fueron adsorbidas en AI(OH)3 y se inyectaron 5 µ9 intramuscularmente en grupos de 30 ratones en el día 0 y en el día 2. Las muestras sanguíneas se tomaron en el día 28. Los ensayos bactericidas de suero se llevaron a cabo en las tres cepas L3 (la cepa del tipo silvestre homologa H44/76 y dos cepas L3 heterólogas; NZ124 y M972505687), como se describe en el Ejemplo 17.

Resultados GMT indica la concentración de la media geométrica del suero en SBA. SC indica el número de ratones convertidos a cero (concentración SBA >1/100).

Los resultados claramente muestran que las ampollas FrpB KO (B1820) inducen una mejor respuesta cruzada-bactericida heteróloga que las ampollas FrpB( + ) (B1733). Las concentraciones de SBA fueron mayores y una proporción más alta de ratones convertidos a cero en las cepas M97250687 y NZ124. Los resultados en la cepa homologa no fueron completamente buenos cuando se eliminó FrpB. Estos datos sugieren que FrpB conduce la respuesta inmune, pero ya que su proteína de membrana exterior es altamente variable, los anticuerpos contra esta proteína solamente son capaces de inducir la aniquilación de la cepa homologa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende dos o más antígenos diferentes en donde los antígenos se seleccionan de por lo menos dos de las siguientes categorías: a) por lo menos una ad esina Neisserial; b) por lo menos una autotransportadora Neisserial; c) por lo menos una toxina Neisserial; d) por lo menos una proteina de adquisición de Fe Neisserial; e) por lo menos una proteína asociada con la membrana Neisserial, preferiblemente proteína de membrana exterior.

2. La composición inmunogénica de acuerdo con la rei indicación 1, en donde los antígenos se seleccionan de por lo menos dos de las siguientes categorías: a) por lo menos una adhesina Neisserial seleccionada del gripo que consiste de FhaB, NspA, PilC, Hsf, Hap, MafA, MafB, Omp26, NMB0315, NMB0995, NMB 1119 y NadA; b) por lo menos una autotransportadora Neisserial seleccionada del grupo que consiste de Hsf, Hap, proteasa IgA, AspA y NadA; c) por lo menos una toxina Neisserial seleccionada del gripo que consiste de FrpA, FrpC, FrpA/C, VapD, NM-ADPRT, y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS o el inmunotipo L2 de LPS; d) por lo menos una proteína de adquisición de Fe Neisserial seleccionada del grupo que consiste de TbpA alta, TbpA baja, TbpB alta, TbpB baja, LbpA, LbpB, P2086, HpuA, HpuB, Lipo28, Sibp, FbpA, BfrA, BfrB, Bcp, NMB0964 y NMB0293; o e) por lo menos una proteina asociada con la membrana Neisserial seleccionada del grupo que consiste de PilQ, OMP85, FhaC, NspA, TbpA (alta), TbpA (baja), LbpA, HpuB, TspA, TspB, TdfH, PorB, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HIpA, MltA, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA y PldA.

3. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, la cual es una composición de subunidad.

4. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende por lo menos 2 antígenos seleccionados del grupo que consiste de: FhaB, NspA, el dominio pasajero de Hsf, el dominio pasajero de Hap, el dominio de superficie expuesta de OMP85, FrpA, FrpC, TbpB, LbpB, PldA, PilC, Lipo28 y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.

5. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende una preparación de vesicula de membrana exterior, en donde los antígenos han sido regulados en forma ascendente (preferiblemente recombinantemente) en la vesicula de membrana exterior.

6. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende por lo menos dos antígenos seleccionados de la siguiente lista los cuales han sido regulados en forma ascendente en la vesícula de membrana exterior: NspA, Hsf, Hap, O P85, AspA, HpuA, HpuB, TspA, TspB, FhaC, TbpA (alto), TbpA (bajo), LbpA, TbpB, LbpB, PilQ, NM-ADPRT, P2086, TdfH, PorB, afA, afB, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HIpA, MltA y PldA; y opcionalmente comprende cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el ¡nmunotipo L3 de LPS.

7. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende una composición de subunidad que tiene uno o más de los antígenos, y una preparación de vesícula de membrana exterior que tiene por lo menos un antígeno el cual ha sido regulado en forma ascendente en la vesícula de membrana exterior.

8. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende una composición de subunidad y una preparación de vesícula de membrana exterior, en donde la composición de subunidad comprende por lo menos un antígeno seleccionado de la siguiente lista: FhaB, NspA, el dominio pasajero de Hsf, el dominio pasajero de Hap, el dominio de superficie expuesta de OMP85, FrpA, FrpC, TbpB, LbpB, PMC, Lipo28 y la preparación de la vesícula de membrana exterior que tiene por lo menos un antígeno seleccionado de la siguiente lista, el cual ha sido recombinantemente regulado en forma ascendente en la vesícula de membrana exterior: NspA, Hsf, Hap, OMP85, AspA, HpuA, HpuB, TspA, TspB, FhaC, TbpA (alto), TbpA (bajo), LbpA, TbpB, LbpB, PilQ, NM-ADPRT, P2086, TdfH, PorB, MafA, MafB, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, ltA y PIDA ; y opcionalmente comprende cualquiera o ambos del inmunotipo L 2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS, preferiblemente dentro de la preparación de la vesícula de membrana exterior.

9. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 5-8, que comprende por lo menos dos diferentes preparaciones de vesícula de membrana exterior de acuerdo con la reivindicación 5 o 6.

10. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la preparación de la vesícula de membrana exterior es del inmunotipo L2 y una preparación de la vesícula de membrana exterior es del inmunotipo L3.

11. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 en donde se seleccionan Hsf y TbpA (alto).

12. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-2 o 5-11, en donde se seleccionan Hsf o TbpA(bajo).

13. La composición inmunogénica de acuerdo con la rei indicación 11 o 12, en donde además se seleccionan uno o más antígenos adicionales de una lista que consiste de Hap, LbpB, OMP 85 y FrpA.

14. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 11-13, en donde además se selecciona el inmunotipo L2 de LPS.

15. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 11-14, en donde además se selecciona el inmunotipo L3 de LPS.

16. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-15, en donde FhaB se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, Hsf, LbpB, FrpA, FrpC, FrpA/C, NadA, OMP85, PldA, LbpA, TbpA (bajo), TbpA (alto), TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, Hap, proteasa I g A , AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HIpA, NspA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT, VapD y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.

17. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-16, en donde NspA se selecciona junto con por lo menos un antigeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, Hsf, LbpB, FrpA, FrpC, FrpA/C, NadA, OMP85, PldA, LbpA, TbpA (bajo), TbpA (alto), TbpB (bajo), TbpB(alto), HpuA, HpuB, Hap, proteasa IgA, AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HIpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, N B1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT, VapD y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.

18. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-17, en donde NadA se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, afA, afB, Omp26, N B0995, F aC, FbpA, Bcp, NMB 1124, 5 NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, Hsf, LbpB, FrpA, FrpC, FrpA/C, OMP85, PldA, LbpA, TbpA (bajo), TbpA(alto), TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, Hap, proteasa IgA, AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, 10 NM-ADPRT, VapD y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.

19. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-18, en donde TbpA(bajo) se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que ¡5 consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, Hsf, LbpB, FrpA, FrpC, FrpA/C, OMP85, PldA, LbpA, TbpA (alto), TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, Hap, proteasa IgA, AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, TspA, TspB, P2086,

20 Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT, VapD y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS. 20. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-19, en donde TbpA(alto) se selecciona junto con 5 por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, Hsf, LbpB, FrpA, FrpC, FrpA/C, OMP85, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, Hap, proteasa IgA, AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, N M-ADPRT, VapD y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.

21. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-20, en donde LbpB se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, Hsf, FrpA, FrpC, FrpA/C, OMP85, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, Hap, proteasa IgA, AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT, VapD y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.

22. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-21 , en donde OMP85 se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, Hsf, FrpA, FrpC, FrpA/C, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, Hap, proteasa IgA, AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT, VapD y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.

23. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-22, en donde Hap se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, Hsf, FrpA, FrpC, FrpA/C, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT, VapD y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.

24. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-23, en donde Hsf se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, FrpA, FrpC, FrpA/C, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT, VapD y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.

25. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-24, en donde FrpA se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, N B 1124, N B 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA. FrpC, FrpA/C, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa I g A , AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HIpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT, VapD y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.

26. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-25, en donde FrpC se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124. NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HIpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT, VapD y cualquiera o ambos del inmunotipo L2 de LPS y el inmunotipo L3 de LPS.

27. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-26, en donde el inmunotipo L2 de LPS se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT, VapD y el ¡nmunotipo L3 de LPS.

28. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-27, en donde el ¡nmunotipo L3 de LPS se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, afA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, N B 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa Ig A, AspA, PilQ, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB 1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT y VapD.

29. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-28, en donde PilQ se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT y VapD.

30. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-29, en donde HlpA se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, N B 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, MltA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, N B0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT y VapD.

31. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-30, en donde MltA se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa I g A , AspA, HimD, HisD, GNA1870, OstA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB 1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT y VapD.

32. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-31, en donde GNA1870 se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, HimD, HisD, OstA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, NM-ADPRT y VapD.

33. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-32, en donde NM-ADPRT se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafA, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA,

LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, HimD, HlsD, OstA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD. 34. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-33, en donde MafA se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa I g A, AspA, HimD, HisD, OstA, TspA, TspB, P20B6, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD.

35. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-34, en donde MafB se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, HimD, HisD, OstA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB0315, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD.

36. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-35, en donde NMB0315 se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, HimD, HisD, OstA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, N B0293, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD.

37. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-36, en donde NMB1119 se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafB, Omp26, N B0995, FhaC, FbpA , Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, HimD, HisD, OstA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD.

38. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-37, en donde HisD se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB1220, NMB1313, NMB 1953, HtrA, PldA, LbpA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, HimD, OstA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD.

39. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-38, en donde LbpA se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafB, Omp26, NMB0995, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, HimD, OstA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD.

40. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-39, en donde NMB 0995 se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafB, Omp26, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, HimD, OstA, TspA, TspB, P2086, Lipo28, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD.

41. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-40, en donde Lipo28 se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafB, Omp26, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, HimD, OstA, TspA, TspB, P2086, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD.

42. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-41, en donde HimD se selecciona junto con por lo menos un antigeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafB, Omp26, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA, PldA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, OstA, TspA, TspB, P2086, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD.

43. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-42, en donde NMB1313 se selecciona junto con por lo menos un antígeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, afB, Omp26, 'FhaC, FbpA, Bcp, N B 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1953, HtrA, PldA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, OstA, TspA, TspB, P2086, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD.

44. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-43, en donde NMB1953 se selecciona junto con por lo menos un antigeno adicional seleccionado del grupo que consiste de: PilC, MafB, Omp26, FhaC, FbpA, Bcp, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, HtrA, PldA, TbpB (bajo), TbpB (alto), HpuA, HpuB, proteasa IgA, AspA, OstA, TspA, TspB, P2086, Sibp, NMB0964, NMB0293, NMB1119, TdfH, PorB, y VapD.

45. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 5-44, en donde la célula huésped a partir de la cual se deriva la preparación de la vesícula de membrana exterior ha sido diseñada para así regular de manera descendente la expresión de uno o más de IgtB o Igte, preferiblemente el primero.

46. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 5-45, en donde la célula huésped a partir de la cual se deriva la preparación de la vesícula de membrana exterior es incapaz de sintetizar el polisacárido capsular y ha sido preferiblemente diseñada para así regular de manera descendente la expresión de uno o más de siaD, crtA, ctrB, ctrC, ctrD, synA (equivalente a synX y siaA) o synB (equivalente de Sian) y synC (equivalente de siaC), preferiblemente siaD.

47. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 5-46, en donde una célula huésped a partir de la cual se deriva la preparación de la vesícula de membrana exterior ha sido diseñada para así regular de manera descendente la expresión de uno o más de OpC, OpA, o PorA, preferiblemente PorA.

48. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 5-47, en donde una célula huésped a partir de la cual se deriva la preparación de la vesícula de membrana exterior ha sido diseñada para así regular de manera descendente la expresión de FrpB.

49. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 5-48, en donde una célula huésped a partir de la cual se deriva la preparación de la vesícula de membrana exterior ha sido diseñada para así regular de manera descendente la expresión de msbB y/o hrtB, preferiblemente msbB.

50. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 5-49, en donde una célula huésped a partir de la cual se deriva la preparación de la vesícula de membrana exterior que contiene LPS, el cual se conjuga con una proteína de membrana exterior (OMP).

51. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 50, en donde el LPS se conjuga (preferiblemente inter-ampolla) con OMP in situ en la preparación de la vesícula de membrana exterior.

52. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-51, que comprende un antígeno derivado de Neisseria meningitidis, preferiblemente el serogrupo B.

53. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-52, que comprende un antígeno derivado de Neisseria gonorr oeae.

54. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-52, en donde todos los antígenos neisserial se derivan de N. meningitidis. preferiblemente del serogrupo B.

55. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-54, en donde todos los antígenos neisserial comprenden uno o más polisacáridos u oligosacáridos capsulares bacterianos.

56. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 55, en donde los polisacáridos u oligosacáridos capsulares se derivan de bacterias seleccionadas del grupo que consiste de: serogroupo A, C, Y y W-135 de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Grupo A de Streptococci, Grupo B de Streptococci, Stap ylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis.

57. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 55-56, en donde el polisacárido u oligosacárido capsular está conjugado a una proteína.

58. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-57, que comprende un auxiliar.

59. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 58, que comprende sales de aluminio, preferiblemente fosfato de aluminio.

60. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 58 o 59, que comprende 3D-MPL.

61. Una vacuna que comprende la composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-60, y un portador farmacéuticamente aceptable.

62. Una vacuna que comprende uno o más polinucleótido(s) que codifican dos o más diferentes proteínas cuya expresión se conduce a través de un promotor eucariótico, en donde las proteínas se seleccionan de por lo menos dos de las siguientes categorías: a) por lo menos una adhesina Neisserial seleccionada del grupo que consiste de FhaB, NspA, PilC, Hsf, Hap, afA, MafB, Omp26, NMB0315, N B0995, NMB 1119 y NadA; b) por lo menos una autotransportadora Neisserial seleccionada del grupo que consiste de Hsf, Hap, proteasa IgA, AspA y NadA; c) por lo menos una toxina Neisserial seleccionada del grupo que consiste de FrpA, FrpC, FrpA/C, VapD y NM-ADPRT; d) por lo menos una proteína de adquisición de Fe Neisserial seleccionada del grupo que consiste de TbpA alto, TbpA bajo, TbpB alto, TbpB bajo, LbpA, LbpB, P2086, HpuA, HpuB, Lipo28, Sibp, FbpA, BfrA, BfrB, Bcp, NMB0964 y NMB0293; o e) por lo menos una proteína asociada con membrana Neisserial, preferiblemente una proteína de membrana exterior integral seleccionada del grupo que consiste de PilQ, O P85, FhaC, NspA, TbpA (alto), TbpA (bajo), LbpA, HpuB, TspA, TspB, TdfH, PorB, HimD, HisD, GNA1870, OstA, HlpA, ltA, NMB 1124, NMB 1162, NMB 1220, NMB 1313, NMB 1953, HtrA y PldA.

63. Un método para el tratamiento o prevención de enfermedad Neisserial que comprende la administración de una dosis protectora de la vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 61-62 a un huésped en la necesidad de la misma.

64. El método de acuerdo con la reivindicación 63, en el cual se previene o trata una infección por Neisseria meningitidis.

65. El método de acuerdo con la reivindicación 63, en el cual se previene o trata una infección por Neisseria gonorrhoeae.

66. Un uso para la vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 61-62, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de infección Neisserial.

67. El uso de acuerdo con la reivindicación 66, en el cual se previene o trata infección por Neisseria meningitidis.

68. El uso de acuerdo con la rei indicación 66, en el cual se previene o trata infección por Neisseria gonorrhoeae.

69. Una cepa Neisserial genéticamente diseñada a partir de la cual se deriva la preparación de la vesícula de membrana exterior de acuerdo con las reivindicaciones 5-60.

70. Un método para hacer la composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 1-60, que comprende un paso para mezclar junto con por lo menos dos antígenos de Neisseria.

71. Un método para hacer la composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 5-60, que comprende un paso para aislar las vesículas de membrana exterior de un cultivo Neisserial.

72. El método de acuerdo con la reivindicación 71, que comprende un paso adicional para combinar por lo menos dos preparaciones de vesícula de membrana exterior.

73. El método de acuerdo con la reivindicación 72, en donde por lo menos una preparación de vesícula de membrana exterior contiene LPS del inmunotipo L2 y por lo menos una preparación de vesícula de membrana exterior contiene LPS del inmunotipo L3.

74. El método de acuerdo con las reivindicaciones 71-73, en donde las vesículas de membrana exterior se aislan a través de la extracción con una concentración de DOC de 0-0.5%.

75. El método de acuerdo con la reivindicación 74, en donde las vesículas de membrana exterior se aislan a través de extracción con una concentración de DOC de 0.02%-0.4%, 0.04%-0.3%, 0.06%-0.2%, 0.08%-0.15% o preferible o exactamente alrededor de 0.1%.

76. Un método para hacer la vacuna de acuerdo con la reivindicación 61, que comprende el paso de combinar la composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-60 con un portador farmacéuticamente aceptable.

77. Un método para preparar una globulina inmune para uso en la prevención o tratamiento de infección Neisserial que comprende los pasos de inmunizar un receptor con la vacuna de la reivindicación 60 y aislar globulina inmune del receptor.

78. Una globulina inmune preparada a través del método de la reivindicación 77.

79. Una composición farmacéutica que comprende la globulina inmune de la reivindicación 78 y un portador farmacéuticamente aceptable.

80. Un método para el tratamiento de infección Neisserial que comprende un paso para administrar a un paciente una cantidad efectiva de la preparación farmacéutica de la reivindicación 79.

81. Un uso de una preparación farmacéutica de la reivindicación 79, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedad Neisserial.

82. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 5-60, que comprende una ampolla meningocócica del inmunotipo L2 y una ampolla meningocócica del inmunotipo L3.

83. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 82, en donde TbpA(alto) se regula de manera ascendente en una de las ampollas.

84. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 82 u 83, en donde la TbpA(baja) se regula de manera ascendente en una de las ampollas.

85. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 82-84, en donde Hsf se regula de manera ascendente en una de las ampollas.

86. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 82-85, en donde OMP85 se regula de manera ascendente en una de las ampollas.

87. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 82-86, en donde las ampollas se aislan de cepas meningocócicas incapaces de formar polisacáridos capsulares, preferiblemente siaD',

88. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 82-87, en donde las estructuras de oligosacárido de LPS L2 y/o L3 son truncadas de acuerdo con las ampollas que han sido aisladas de cepas meningocócicas que son IgtB".

89. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 82-87, en donde las ampollas se aislan de cepas meningocócicas que tiene expresión de manera descendente de msbB.

90. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 82-89, en donde las porciones de oligonucleótidos de LPS L2 y/o L3 se conjugan de forma intra-ampolla a las proteínas de membrana exterior integrales a la ampolla.

91. La composición inmunogénica de acuerdo con las reivindicaciones 82-90, en donde las ampollas se derivan de cepas meningocócicas que tienen expresión regulada de manera descendente de uno o más de: FrpB, PorA, Opa u Opc.