MXPA04011210A - Particulares similares a virus empacadas para uso como adyuvantes: metodo de preparacion y uso. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al hallazgo de que particulas similares a virus (VLPs) pueden cargarse y empacarse, respectivamente, con oligonucleotidos de ADN ricos en C y G no metilante (CpGS). Si tales CpG-VLPs se mezclan con antigenos, la inmunogenicidad de estos antigenos se aumenta dramaticamente. Ademas, las respuestas de las celulas T contra los antigenos se dirige especialmente al tipo Th1. Sorprendentemente, no se requiere un enlace covalente del antigeno a la VLP; es suficiente con mezclar las VLPs con los adyuvantes para la co-administracion. Ademas, se ha encontrado que las VLPs no aumentan las respuestas inmunes salvo que se carguen y empaquen, respectivamente, con CpGS. Los antigenos mezclados con VLPs empacadas con CpG pueden, pro lo tanto, ser vacunas ideales para vacunacion profilactica o terapeutica contra alergias, tumores y otras enfermedades virales cronicas y de auto-moleculas.

Description

PARTICULAS SIMILARES A VIRUS EMPACADAS PARA USO COMO ADYUVANTES: METODO DE PREPARACION Y USO Campo de la Invención La presente invención se relaciona a los campos de las vacunas, inmunología y medicina. La invención provee composiciones y métodos para mejoramiento de repuestas inmunológicas contra antígenos mezclados con partículas similares a virus (VLP, por sus siglas en inglés) empacados con sustancias inmunoestimuladoras , preferiblemente ácidos nucleicos inmunoestimuladores , y aún más preferiblemente oligonucleótidos que contienen por lo menos una secuencia CpG no metilada. La invención puede ser usada para inducir respuestas fuertes de anticuerpos y de células T particularmente útiles para el tratamiento de alergias, tumores y enfermedades virales crónicas así como · otras enfermedades crónicas. Antecedentes de la Invención La esencia del sistema inmune se construye en dos pilares de cimentación separados: uno es inmunidad específica o adaptiva lo cual se caracteriza por una cinética de respuesta relativamente lenta y la capacidad para recordar, la otra es inmunidad no específica o innata que exhibe respuesta cinética rápida pero carece de memoria. Los linfocitos son los jugadores clave del sistema inmune adaptivo. Cada linfocito expresa receptores de antígeno de especificidad única. En el reconocimiento de un antigeno vía el receptor, los linfocitos proliferan y desarrollan función de efector. Pocos linfocitos exhiben especificidad para un antigeno o patógeno dado, y la proliferación masiva usualmente se requiere antes de que se pueda medir una respuesta de efector, esto es, la cinética lenta del sistema inmune adoptivo. Puesto que una proporción significante de los linfocitos expandidos sobrevive y puede mantener alguna función de efector que sigue la eliminación del antigeno, el sistema inmune adaptivo reacciona más rápido cuando se encuentra el antigeno una segunda vez. Eso es la base de su capacidad para recordar. En contraste a la situación con linfocitos, donde la especificidad para un patógeno está confinada a pocas células que deben expandirse para ganar función, las células y moléculas del sistema inmune innato usualmente están presentes en números masivos, y reconocen un número limitado de características no variantes asociadas con patógenos (Medzhitov, R. y Jane ay, C. A. Jr., Cell 91:295-298 (1997)). Ejemplos de los patrones incluyen lipopolisacáridos (LPS) , ADN rico en CG no metilado (CpG) o ARN de doble hebra, el cual es específico para infecciones bacteriales y virales, respectivamente. La mayoría de la investigación en inmunología se enfoca en el sistema inmune adaptivo y solamente recientemente el sistema inmune innato introduce el foco de interés. Históricamente, el sistema inmune adaptivo e innato se trató y analizó como dos entidades separadas que tienen poco en común. Tal fue la disparidad que pocos investigadores se preguntaron el porqué los antigenos fueron mucho más inmunogénicos para el sistema inmune especifico cuando fueron aplicados con adyuvantes que estimularon la inmunidad innata (Sotomayor, E. M. y colaboradores, Nat. Med. 5:780 (1999); Dile, L., y colaboradores, Nat. Med. 5:774 (1999); Weigle, W. O. Adv. Immunol . 30:159 (1980)). Sin embargo, la respuesta planteada por esta pregunta es critica para el entendimiento del sistema inmune y para comprensión del balance entre la inmunidad protectora y autoinmunidad . La manipulación racionalizada del sistema inmune innato y en particular la activación de APC involucrados en el cebado de células T para inducir deliberadamente -una respuesta de células T autoespecifica provee un medio para terapia de tumor basada en células T. En consecuencia, el enfoque de la mayoría de las terapias actuales está en el uso de células dendríticas activadas (DC, por sus siglas en inglés.) como portadores de antígeno para la inducción de respuestas de células T sostenidas (Nestle y colaboradores, Nat. Med. 4:328 (1998)). Similarmente, los activadores in vivo del sistema inmune innato, tales como anticuerpos CPPS o anti-CD40, son aplicados juntos con células de tumor con el propósito de mejorar su inmunogenicidad (Sotomayor, E. M. y colaboradores, Nat. Med. 5:780 (1999); Dile, L., y colaboradores, Nat. Med. 5:774 (1999)). La activación generalizada de APC por factores que estimulan la inmunidad innata puede a menudo ser la causa del disparo de linfocitos autoespecificos y autoinmunidad . Esta visión es compatible con la observación de que la administración de LPS juntos con extractos de tiroides puede superar tolerancia y provocar tiroiditis autoinmune (Weigle, . Q., Adv. Inmunol. 30:159 (1980)). Más aún, en un modelo de ratón transgénico, recientemente se mostró que la administración del auto péptido solo, falló para provocar autoinmunidad a menos que los APC fueran activados por una vía separada (Garza, K. M. y colaboradores, J. Exp. Med. 191:2021 (2000)). El enlace entre inmunidad innata y enfermedad autoinmune es además subrayado por la observación de que los LPS, infecciones virales o la activación generalizada de APC, retrasa o previene el establecimiento de tolerancia periférica (Vella, A. T. y colaboradores, Immunity 2:261 (1995); Ehl, S., y colaboradores, J. Exp. Med. 187:763 (1998); Maxwell, J. R. y colaboradores, J. Immunol . 162:2024 (1999)). De esta forma, la inmunidad innata no solamente mejora la activación de los linfocitos autoespecificos sino que también inhibe su eliminación subsecuente. Estos hallazgos pueden extenderse a biología de tumor y el control de enfermedades virales crónicas.

La inducción de respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) después de inmunización con antigenos de histocompatibilidad menor, tales como el antigeno HY, requieren la presencia de las células ayudadoras T (células Th) (Husmann, L. A., y M. J. Bevan, Ann . NY. Acad. Sci. 532:158 (1988); Guerder, S., y P. Matzinger, J. Exp . Med. 176:553 (1992)). Las respuestas CTL inducidas por cebado cruzado, esto es, por cebado con antigenos exógenos que alcanzaron la trayectoria clase I, también se ha demostrado que requieren la presencia de las células Th (Bennett, S. R. M. y colaboradores, J. Exp. Med. 186: 65 (1997)). Estas observaciones tienen consecuencias importantes para terapia de tumor donde la ayuda T puede ser critica para la inducción de respuestas CTL protectoras por 'células de tumor (Ossendorp, F., y colaboradores, J. Exp. Med. 187:693 (1998)). Una molécula efectora importante en células Th activadas es el ligando CD40 (CD40L) que interacciona con CD40 en células B, macrófagos y células dendriticas (DC) (Foy T. M., y colaboradores, Annu . Rev. Immunol. 14:591 (1996)). El disparo de CD40 en células B es esencial para intercambio de isotipos y la generación de memoria de célula B (Foy T. M., y colaboradores, Annu. Rev. Immunol. 14:591 (1996)). Más recientemente, se demostró que la estimulación de CD40 en macrófagos y DC lleva a su activación y maduración (Celia, M., y colaboradores, Curr. Opin. Immunol. 9:10 (1997); Banchereau, J. y R. M. Steinman Nature 392:245 (1998)). Específicamente, las DC regulan las moléculas co-estimulatoriamente y producen citocinas tales como 11-12 en activación. De forma interesante, esta maduración de CD40L mediada "por CD parece ser responsable del efecto auxiliador en respuestas CTL. En efecto, recientemente se ha demostrado que el disparo de CD40 por las células Th produce DC disponibles para iniciar una respuesta CTL (Ridge, J. P., y colaboradores, Nature 393:474 (1998); Bennett, S. R. M. y colaboradores, Nature 393:478 (1998);, Schoenenberger , S. P., y colaboradores, Nature 393:480 (1998)). Esto es consistente con la observación más temprana de que las células Th tienen que reconocer sus ligandos en el mismo APC como la CTL, que indica que una interacción afín se requiere (Bennett, S. R. . y colaboradores, J. Exp. Med. 186:65 (1997)). Así la estimulación mediada CD40L por las células Th lleva a la activación de CD, los cuales subsecuentemente son capaces de cebar respuestas CTL. En contraste a estas respuestas CTL dependientes de Th, los virus a menudo son capaces de inducir respuestas CTL protectoras en la ausencia de ayuda T (para revisar, ver (Bachmann, M. F., y colaboradores, - J. Immunol. 161:5791 (1998)). Específicamente, los virus de coriomeningitis linfocíticos (LCMV) (Leist, T. P., y colaboradores, J.

Iramunol . 138:22788 (1987); Ahmed, R . , y colaboradores, J. virol. 62:2102 (1988); Battegay, M . , y colaboradores, Cell Immunol . 167:115 (1996); Borrow, P., y colaboradores, J. Exp . Med. 183. ed. 183:2129 (1996); Whitmire, J. K. y colaboradores, . J. Virol. 70:8375 (1996)), virus de estomatitis vesicular (VSV) ( ündig, T. M . , y colaboradores, Immunity 5:41 (1996)), virus de influenza (Tripp, R. A., y colaboradores, J. Immunol . 155:2955 (1995)), virus vaccinia (Leist, T. P., y colaboradores, Scand. J. Immunol. 30:679 (1989)) y virus ectromelia (Buller, R. , y colaboradores, Nature. 328:77 (1987)) pudieron cebar respuestas CTL en ratones agotados de células CD4+T o deficientes para la expresión de la clase II o CD40. El mecanismo para este cebado de CTL independiente de la células Th por virus no es entendido actualmente. Más aún, la mayoría de los virus no estimulan completamente las respuestas CTL independientes de la células Th, pero la actividad de CTL de virus específico se reduce en ratones deficientes de células Th. Así, las células Th pueden mejorar las respuestas CTL antivirales pero el mecanismo de esta ayuda todavía no se entiende completamente. Los DC recientemente han demostrado estar presentes en la influenza derivada de antígenos por cebado cruzado (Albert, M. L., y colaboradores, Exp. Med. 188:1359 (1998); Albert, M. L., y colaboradores, Nature 392:86 (1998) ) . Por lo tanto es posible que, similarmente como se mostró para antígenos de histocompatibilidad y antigenos de tumor (Ridge, J. P., y colaboradores, Nature 393:474 (1998); Bennett, S. R. M . , y colaboradores, Nature 393:474 (1998); Schoennenberger, S. P, y colaboradores, Nature 393:480 (1998)), las células Th pueden ayudar en la inducción de CTL vía CD40 que dispara los DC . Asi, la estimulación de CD40 que usa CD40L o anticuerpos antiCD40 puede mejorar la inducción de CTL después de la estimulación con virus o células de tumor . Sin embargo, a pesar de que CD40L es un activador importante de DC, parecen haber moléculas adicionales que pueden estimular la maduración y activación de DC durante respuestas inmunes. En efecto, el CD40 no está involucrado de forma que se pueda medir en la inducción de CTL específicos para LCMV o VSV (Ruedl, C, y colaboradores, J. Exp. Med. 189:1875 (1999)) . Así, aunque las respuestas de CTL de VSV específicos son en parte dependientes de la presencia de células CD4+ T ( ündig, T. M., y colaboradores, Immunity 5:41 (1996)), este efecto auxiliador no está mediado por CD40L. Los candidatos para moléculas efectoras que provocan maduración de los DC durante respuestas inmunes incluyen Trance y TNF (Bachmann, M. F., y colaboradores, J. Exp. Med. 189:1025 (1999); Sallusto, F . , y A. Lanzavecchia , U. Exp Med 179:1109 (1994)), pero es posible que haya más proteínas con propiedades similares tales como, por ejemplo, CpGs .

Está bien establecido que la administración de proteínas purificadas solas usualmente no es suficiente para provocar una respuesta inmune fuerte; el antígeno aislado generalmente debe ser dado junto con substancias auxiliadoras llamadas adyuvantes. Dentro de estos adyuvantes, el antígeno administrado está protegido contra degradación rápida, y el adyuvante provee una liberación extendida de un bajo nivel de antígeno . A diferencia de las proteínas aisladas, los virus inducen respuestas inmunes eficientes y prontas en la ausencia de cualquier adyuvante, con y sin la ayuda de células T (Bachmann & Zinkernagel, Ann . Rev. Immunol. 15:235-270 (1997)). Aunque los virus a menudo consisten de pocas proteínas, están disponibles para provocar respuestas inmunes mucho más fuertes que sus componentes aislados. Para respuestas de células B, se sabe que un factor crucial para la inmunogenicidad de virus es la receptividad y orden de epítopos de superficie. Muchos virus exhiben una superficie quasi cristalina que despliega un arreglo regular de epítopos los cuales enlazan en cruz eficientemente las inmunoglobulinas de epítopo específico en células B (Bachmann & Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996)). Este enlace en cruz de las inmunoglobulinas de superficie en células B es una señal de activación fuerte que induce directamente la progresión de ciclo de célula y la producción de anticuerpos Ig . Además, tales células B provocadas son capaces de activar células auxiliadoras B, las cuales a su vez inducen un intercambio desde producción de anticuerpo IgM a IgG en células B y la generación de memoria de célula B de vida larga -la meta de cualquier vacunación (Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol . 15:235-270 (1997)). La estructura viral está aún enlazada a la generación de antianticuerpos en enfermedad autoinmune y como una parte de la respuesta natural a patógenos (ver Fehr, T., y colaboradores, J. Exp. MEd. 1785-1792)). Asi, los antigenos en partículas virales que son ordenados en un arreglo ordenado y repetitivo son altamente inmunogénicos debido a que pueden activar directamente células B. Sin embargo, los antígenos solubles no enlazados a una superficie repetitiva son pobremente inmunogénicos en la ausencia de adyuvantes. Puesto que los patógenos, extractos alergénicos y también tumores usualmente contienen una multitud de antígenos que no todos pueden fácilmente ser expresados y conjugados a estructuras repetitivas tales como VLP, sería deseable tener formulaciones adyuvantes que pueden simplemente ser mezcladas con las preparaciones de antígeno sin la necesidad de procedimientos de conjugación de complejos. Además de las respuestas fuertes de células B, las partículas virales también son capaces de inducir la generación de una respuesta de células T citotóxicas, otra parte crucial del sistema inmune. Estas células T citotóxicas son particularmente importantes para la eliminación de virus no citopáticos tales como VIH o virus de hepatitis B y para la erradicación de tumores. Las células T citotóxicas no reconocen antigenos nativos sino más bien reconocen sus productos de degradación en asociación con las moléculas I clase MHC (Townsend & Bodmer, Ann Rev. Immunol . 7:601-624 (1989)) . Los macrófagos y células dendriticas son capaces de tomar y procesar partículas virales exógenas (pero no sus conponentes aislados solubles) y presentar el producto de degradación generado a las células T citotóxicas, llevando a su activación y proliferación (Kovacsovics-Banko ski y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:4942-4946 (1993); Bachmann y colaboradores, Eur. J. Immunol. 26:2595-2600 (1996)). Además, los DC activados también son capaces de procesar y presentar proteínas solubles . Las partículas virales como antígenos muestran dos ventajas sobre sus componentes aislados: (1) debido a su estructura de superficie altamente repetitiva, son capaces de activar directamente células B, llevando a concentraciones de anticuerpo altas y memoria de célula B de larga duración;' y (2) partículas virales pero no proteínas solubles que pueden inducir una respuesta de células T citotóxica, aún si los virus no son infecciosos y los adyuvantes están ausentes. Varias estrategias de vacunas nuevas explotan la inmunogenicidad inherente de virus. Algunas de estas aproximaciones se enfocan en la naturaleza particular de la partícula de virus; (ver Harding, C. y colaboradores, J. Immunology 153:4925 (1994)), la cual desglosa una vacuna que consiste de gotas de látex y antígeno; Kovacsovics-Bankowski, . , y colaboradores, (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:4942-4946 (1993)), que desglosa una vacuna que consiste de gotas de óxido de hierro y antígeno; la Patente de EÜA No. 5,334,394 a Kossovsky, N., y colaboradores, que desglosa partículas centrales recubiertas con antígenos; la Patente de EUA No. 5,871,747, que desglosa las partículas de polímero sintético que portan sobre la superficie una o más proteínas unidas covalentemente ahí; y una partícula central con un enlazamiento no covalente que recubre, la cual por lo menos cubre parcialmente la superficie de la partícula central, y por lo menos un agente biológicamente activo en contacto con la partícula central recubierta (ver, por ejemplo, O 94/15585) . En un desarrollo más, las partículas similares a virus (VLP) se explotan en el área de producción de vacuna debido a tanto a sus propiedades estructurales y su naturaleza no infecciosa (ver, por ejemplo, WO 98/50071). Las VLP son estructuras supermoleculares construidas en manera simétrica desde muchas moléculas de proteína de uno o más tipos. Carecen del genoma viral y, por lo tanto, no son infecciosos. Las VLP a menudo pueden ser producidas en grandes cantidades por expresión heterogénea y pueden ser fácilmente purificadas.

Además, el ADN rico en porciones de CG no metiladas (CpG), como están presentes en bacterias y ¦ en la mayoría de invertebrados, exhibe una actividad estimuladora potente en células B, las células dendríticas y otras APC in vitro así como in vivo. A pesar de que el ADN bacterial es inmunoestimulador a través de muchas especies vertebradas, las porciones de CpG individuales pueden diferir. En efecto, las porciones de CpG que estimulan células inmunes de ratón pueden no necesariamente estimular células inmunes humanas y viceversa. A pesar de que los oligonucleótidos de ADN ricos en porciones de CpG pueden exhibir la capacidad inmunoestimuladora, su eficiencia a menudo es limitada, ya que son inestables in vitro e in vivo. Así, ellos exhiben farmacocinética desfavorable. Con el propósito de producir oligonucleótidos de CpG más potentes, es por lo tanto usualmente necesario estabilizarlos mediante introducción de modificaciones de fosforotioato de la columna vertebral de fosfato . Una segunda limitación para el uso de CpG para estimular respuestas inmunes es su carencia de especificidad, puesto que todos los APC y las células B en contacto con CpG se vuelven estimuladas. Así, la eficiencia y especificidad de los oligonucleótidos de ADN que contienen CpG pueden ser improvisadas por estabilización de ellos o empacamiento de ellos en una forma que restringe la activación celular a aquellas células que también presentan el antigeno relevante.

Además, los oligodesoxinucleótidos de CpG inmunoestimuladores inducen efectos colaterales fuertes mediante la provocación de hemopoiesis extramedular acompañada por esplenomegalia y linfadenopatia en ratones (Sparwasser y colaboradores, J. Immunol . (1999) , 162 :2368-74) . Evidencia reciente demuestra que las VLP que contienen CpG empacados son capaces de provocar respuestas de células T muy potentes contra antigenos conjugados para los VPL (WO03/024481) . Además, el empaque de CpG mejoró su estabilidad y esencialmente removieron sus efectos colaterales antes mencionados tales como la provocación de hemopioesis extramedular acompañada por esplenomegalia y linfadenopatia en ratones. En particular los CpG empacados no inducen esplenomegalia. Sin embargo, como se mencionó arriba, la mayoría de patógenos, tumores y extractos alergénicos contienen una multitud de antígenos y pueden a menudo ser difíciles de expresar todos estos antígenos recombinantemente antes de la conjugación a los VLP. De ahí, puede ser deseable tener formulaciones de adyuvantes que pueden simplemente ser mezcladas con las preparaciones de antígeno sin la necesidad de procedimientos de conjugación del complejo. Han sido notables los avances hechos en estrategias de vacunación recientemente, aunque todavía permanece una necesidad de mejorar en estrategias existentes. En particular, permanece una necesidad en la técnica para el desarrollo de vacunas nuevas y mejoradas que permitan la inducción de respuestas de células T y B fuertes sin serios efectos colaterales y sin la necesidad para la conjugación de los antigenos a una sustancia portadora. Breve Descripción de la Invención Esta invención está basada en el hallazgo sorpresivo de que sustancias inmunoestimuladoras tales como oligonucleótidos de ADN pueden ser empacados en VLP los cuales resultan en ellos más inmunegénicos . Inesperadamente, los ácido nucleicos y oligonucleótidos, respectivamente, presentes en VLP pueden ser remplazados específicamente por las sustancias inmunoestimuladoras y oligonucleótidos de ADN que contienen porciones de CpG, respectivamente. Sorpresivamente, estas sustancias inmunoestimuladoras empacadas, en particular ácido nucleico inmunoestimulador así como oligonucleótidos que contienen CpG no metilado retuvieron su capacidad inmunoestimuladora sin activación extendida del sistema inmune innato. Las composiciones que comprenden VLP. y las sustancias inmunoestimuladoras de acuerdo con la presente invención, y en particular los CpG-VLP dramáticamente más inmunogénicos que sus contrapartes libres de CpG y mejoran dramáticamente las respuestas de la células T y B a antígenos aplicados juntos, esto es mezclados sin las VLP empacados. Inesperadamente, el acoplamiento de los antigenos a las VLP no fue requerido para mejoramiento de la respuesta inmune. Más aún, debido al empacamiento, del enlazamiento CpG a las VLP no se indujeron efectos colaterales sistémicos, tales como esplenomegalia . En una primera modalidad, la invención provee una composición para mejoramiento de una respuesta inmune en un animal que comprende una partícula similar a virus y una sustancia inmunoestimuladora , preferiblemente un ácido nucleico inmunoestimuladora, aún más preferiblemente un oligonucleótido que contiene CpG no metilado, donde la sustancia, el ácido nucleico o el oligonucleótido está acoplado a, fusionado, o de otra manera acoplado o acercado, esto es, .enlazado, y preferiblemente empacado con la partícula similar a virus. La composición además comprende un antígeno mezclado con la partícula similar a virus. En una modalidad preferida de la invención, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores , en particular los oligonucleótidos que contienen CpG no metilados son estabilizados por modificaciones de fosforotioato de la columna, vertebral del fosfato. En otra modalidad preferida, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores, en particular los oligonucleótidos que contienen CpG no metilados son empacados en las VLP por digestión del ARN dentro de las VLP y adición simultánea de los oligonucleótidos de ADN que contienen CpG de selección. En una modalidad igualmente preferida, las VLP pueden ser desunidos antes de que ellos sean nuevamente unidos en la presencia de los CpGs . En una modalidad preferida más, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores no contienen porciones de CpG sin embargo muestran actividades inmunoestimuladoras . Tales ácidos nucleicos están descritos en WO 01/22972. Todas las secuencias descritas ahí están incorporadas aquí a manera de referencia . En una modalidad preferida de la invención, el oligonucleótido que contienen CpG no metilado no está estabilizado por modificaciones fosforotioato de la columna vertebral de fosfodiéster . En una modalidad preferida, el oligonucleótido que contienen CpG no metilado induce IFN-alfa en células humanas. En otra modalidad preferida, la IFN-alfa que induce oligonucleótido es flanqueado por repeticiones ricas en guanosina y contiene una secuencia palindrómica . En una modalidad preferida más, la partícula similar a virus es una partícula similar de virus recombinante . También preferida, la partícula similar de virus es libre de una envolvente de lipoproteína . Preferiblemente, la partícula similar de virus recombinante comprende, o alternativamente consiste de, proteínas recombinantes de virus de Hepatitis B, virus de sarampión, virus de Sindbis, Rotavirus, virus de Enfermedad de Pie y Boca, Retrovirus, virus de Norwalk o virus de Papiloma humano, fagos de ARN, Qp-fago, GA-fago, fr-fago y Ty. En una modalidad especifica, la partícula similar de virus comprende, o alternativamente consiste de, uno o más proteínas de núcleo (cápsida) de virus de Hepatitis B (HBcAgs) diferentes. En una modalidad preferida más, la partícula similar de virus comprende proteínas recombinantes, o fragmentos de estas, de un fago de ARN. Los fagos de ARN preferidos son ?)ß-fago, AP 205-fago, GA-fago, fr-fago. En otra modalidad, el antígeno, antígenos o mezcla de antígenos son un antígeno recombinante . En otra modalidad, el antígeno, antígenos o mezcla de antígeno se extrae desde una fuente natural, la cual incluye pero no está limitada a: polen, polvo, hongos, insectos, alimentos, epidermales de mamíferos, cabello, saliva, suero, abejas, tumores, patógenos y plumas. En todavía otra modalidad, el antígeno- puede ser seleccionado del grupo que consiste de: (1) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune contra células de cáncer (2) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune contra enfermedades infecciosas; (3) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune contra alérgenos; (4) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune contra los mismos antígenos; y (5) un polipéptido apropiado para inducir una respuesta inmune en animales de granja o mascotas. En una modalidad más, el antigeno, antigenos o mezcla de antigeno puede ser seleccionado del grupo que consiste de: (1) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta inmune contra células de cáncer; (2) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta inmune contra enfermedades infecciosas; (3) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta inmune contra alérgenos; (4) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta inmune contra los mismos antigenos; (5) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta inmune en animales de granja o mascotas; y (6) una molécula orgánica apropiada para inducir una respuesta contra un fármaco, una hormona o un compuesto tóxico. En una modalidad particular, el antigeno comprende, o alternativamente consiste de, una célula citotóxica o epitopo de células Th. En una modalidad relacionada, el antigeno comprende, o alternativamente consiste de, un epitopo de célula B. En una modalidad relacionada, la partícula similar de virus comprende la proteína de núcleo de virus de Hepatitis B. En otro aspecto de la invención, se provee un método de mejoramiento de una respuesta inmune en un humano u otras especies animales que comprende la introducción en el animal de una composición que comprende una partícula similar de virus y substancias inmunoestimuladoras , preferiblemente un ácido nucleico inmunoestimulador, aún más preferiblemente un oligonucleótido que contiene CpG no metilado donde la sustancia, preferiblemente el ácido nucleico, y aún más preferiblemente el oligonucleótido está enlazado a (esto es acoplado, anexado o encerrado) , y preferiblemente empacada con la partícula similar de virus y la partícula similar de virus está mezclada con un antígeno, varios antígenos o una mezcla de antígenos. En todavía otra modalidad de la invención, la composición es introducida en un animal subcutáneamente, intramuscularmente, intranasalmente , intradermalmente , intravenosamente o directamente en un ganglio linfático. En una modalidad igualmente preferida, la composición de mejoramiento inmune se aplica localmente, cerca de un tumor o embalse viral local contra el cual uno desea ser vacunado. En un aspecto preferido de la invención, la respuesta inmune es una respuesta de células T, y la respuesta de células T contra el antígeno se mejora. En una modalidad espécíf.ica,_ la respuesta de células T es una respuesta de células T citotóxica, y la respuesta de células T citotóxica contra el antígeno se mejora. En otra modalidad de la invención, la respuesta inmune es una respuesta de célula B, y la respuesta de célula B contra el antígeno se mejora. La presente invención también se relaciona a una vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición de mejoramiento inmune de la presente invención junto con un diluente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, la vacuna además comprende por lo menos un adyuvante, tal como Alum o adyuvante de Freund incompleto. La invención también provee un método de inmunización y/o tratamiento de un animal que comprende administración al animal de una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna descrita. En una modalidad de la invención, las VLP que contienen una sustancia inmunoestimuladora, preferiblemente son usadas las VLP que contienen ácido nucleico inmunoestimuladora, aún más preferiblemente las VLP de oligonucleótido que contienen CpG no metilada para vacunación de animales o humanos contra antigenos mezclados con las VLP modificadas. Las VLP modificadas pueden ser usadas para vacunar contra tumores, enfermedades virales, o las mismas moléculas, por ejemplo. La vacunación puede ser para propósitos profilácticos o terapéuticos, o ambos. También, las VLP modificadas pueden ser usadas para vacunar contra alergias, o enfermedades relacionadas a alergia tal como asma, con el propósito de inducir respuestas de desviación inmune y/o anticuerpo contra el alérgeno. La vacunación y tratamiento, respectivamente, pueden luego llevar, por ejemplo a una desensibilización de un formador alérgico animal y paciente, respectivamente. En la mayoría de los casos, la respuesta inmune deseada será dirigida contra antígenos mezclados con las VLP que contienen sustancias inmunoestimuladoras , preferiblemente las VLP que contienen el ácido nucleico inmunoestimulador , aún más preferiblemente las VLP de oligonucleótido que contienen los CPG no metilados. Los antígenos pueden ser péptidos, proteínas o dominios así como mezclas de estos. La ruta de inyección es preferiblemente subcutánea o intramuscular, pero también puede ser posible aplicar las VLP que contienen CpG intradermalmente, intranasalmente, intravenosamente o directamente en el ganglio linfático. En una modalidad igualmente preferida, las VLP que contienen CpG mezcladas con el antígeno son aplicadas localmente cerca de un tumor o en embalse viral local contra el cual uno desea ser vacunado. Se entiende que la descripción general anterior y la descripción detallada que sigue son ejemplares y explicativas solamente y están proyectadas para proveer más explicación de la invención como se reivindica.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1B muestran las VLP en una electroforesis de gel agarosa nativa (agarosa 1%) después de incubación de control o después de digestión con RNasa A en teñido con bromuro de etidio (A) o azul de Coomassie (B) con el propósito de evaluar la presencia de ARN o proteina. Las VLP producidas recombinantemente se diluyen en una concentración final de proteina de 0.5 ug/ul en solución amortiguadora PBS e incubado en la ausencia (pista 1) o presencia (pista 2) de RNasa A (100 ug/ml) (Sigma, División of Fluka AG, Suiza) por 2 horas a 37°C. Las muestras fueron substancialmente completadas con 6 múltiplos concentrados de solución amortiguadora cargando ADN (MBS Fermentas GMBH, Heidelberg, Alemania) y corre por 30 min a 100 volts en un gel de agarosa nativa 1%. El marcador Gene Ruler (MBS Fermentas GMBH, Heidelberg, Alemania) fue usado como referencia para velocidad de migración de las VLP (pista M) . Las filas están indicando la presencia de ARN encerradas en las VLP (A) o las mismas VLP (B) . Los resultados idénticos fueron obtenidos en 3 experimentos independientes. Las Figuras 2A-2B muestran las VLP . en una electroforesis de gel agarosa nativa (agarosa 1%) después de incubación de control o después de digestión con RNasa A en la presencia de solamente solución amortiguadora u oligonucleótidos de ADN que contienen CpG en teñido con bromuro de etidio (A) o azul de Coomassie (B) con el propósito de evaluar la presencia de ARN/ADN o proteina. Las VLP recombinantes se diluyen en una concentración final de proteina 0.5 ug/ul en solución amortiguadora PBS e incubado en la ausencia (pista 1) o presencia (pista 2 y 3) de RNasa A (100 ug/ml) (Sigma, División of Fluka AG, Suiza) por 2 horas a 37°C. Los oligonucleótidos de CpG 5 nmol (que contienen modificaciones de fosforotioato de la columna vertebral de fosfato) se agregó a la muestra 3 antes de digestión de RNasa A. El - marcador Gene Ruler (MBS Fermentas GMBH, Heidelberg, Alemania) se usó como referencia para velocidad de migración de las p33-VLP (pista M) . Las filas están indicando la presencia de ARN/CpG-ADN encerradas en las p33-VLP (A) o las mismas p33-VLP (B) . Los resultados comparables fueron obtenidos cuando los oligonucleótidos CpG con enlaces de fósforo normal se usaron para co-incubación de las VLP con RNasa A. Las Figuras 3A-3B muestran las p33-VLP en una electroforesis de gel agarosa nativa (agarosa 1%) antes y después de digestión con RNasa A en la presencia de oligonucleótidos de ADN que contienen CpG y diálisis subsecuente (para la eliminación de oligonucleótidos de CpG- sin enlazamiento de VLP) en teñido con bromuro de etidio (A) o azul de Coomassie (B) con el propósito de evaluar la pr-egencia de ADN o proteina. Las VLP recombinantes se diluyen en una concentración final de proteina 0.5 ug/ul en solución amortiguadora PBS e incubado en la ausencia (pista 1) o presencia (pista 2 a 5) de RNasa A (100 ug/ml) (Sigma, División of Fluka AG, Suiza) por 2 horas a 37°C. Los oligonucleótidos de CpG 5 nmol (que contienen enlaces de fosforotioato : pistas 2 y 3, que contienen modificaciones de fósforo normales de la columna vertebral de fosfato: pistas 4 y 5) se agregaron a las VLP antes de digestión de RNasa A. Las muestras tratadas se dializaron extensivamente por 24 horas contra PBS (dilución de 4500 múltiplos) con una membrana de diálisis de MWCO de 300 kDa (Spectrum Medical Industries Inc., Houston, USA) para eliminar el ADN de exceso (pistas 3 y 5) . El marcador Gene Ruler (MBS Fermentas GMBH, Heidelberg, Alemania) se usó como referencia para velocidad de migración de las p33-VLP (pista M) . Las filas están indicando la presencia de ARN/CpG-ADN encerradas en las VLP (A) o las mismas VLP (B) . Las Figuras 4A-4B muestran las VLP en una electroforesis de gel agarosa nativa (agarosa 1%) después de incubación de control o después de digestión con RNasa A donde los oligonucleótidos de ADN que contienen CpG fueron agregados solamente después de completar la digestión de ARN en teñido con bromuro de etidio (A) o azul de Coomassie (B) con el propósito de evaluar la presencia de ARN o proteína. Las VLP recombinantemente -se diluyen en una concentración final de proteína 0.5 ug/ul en solución amortiguadora PBS e incubado en la ausencia (pista 1) o presencia (pista 2 y 3) de RNasa A (100 ug/ml) (Sigma, División of Fluka AG, Suiza) por 2 horas a 37°C. Los oligonucleótidos de CpG 5 nmol (que contienen modificaciones de fosforotioato de la columna vertebral de fosfato) , fueron agregadas a la muestra 3 solamente después de la digestión de RNasa A. El marcador Gene Ruler (MBS Fermentas GMBH, Heidelberg, Alemania) se usó como referencia para velocidad de migración de las p-33VLP (pista M) . Las filas- están indicando la presencia de ARN/CpG-ADN encerradas en las VLP (A) o las mismas VLP (B) . Resultados similares se obtuvieron cuando los oligonucleótidos CpG con enlaces de fósforo se usaron para reensamble de los VLP. La Figura 5 muestra que las VLP tratados de RNasa A derivados de HBcAg que llevan dentro ADN rico en CpG (que contiene porciones de fosfodiéster normal), dializados de oligonucleótidos de CpG no enlazados son efectivos en mejoramiento de respuestas de IgG contra alérgenos de veneno de abeja (BV) . Los ratones fueron cebados subcutáneamente con 5 g de veneno de abeja (ALK Abello) ya sea solo o mezclado con una de las siguientes: 50 pg de VLP solo, 50 µg de VLP cargado y empacado, respectivamente, con oligonucleótidos CpG o 50 pg de VLP mezclado con oligonucleótidos de CpG 20 nmol . Alternativamente, los ratones se cebaron con 5 µg de veneno de abeja mezclado con VLP solo o VLP cargado y empacado, respectivamente, con oligonucleótidos CpG en conjunto con hidróxido de aluminio. 14 días después, los ratones se estimularon con las mismas preparaciones de vacuna y sangraron en el día 21. Las repuestas de IgG especificas de veneno de abeja en suero fueron evaluadas por ELISA. Los resultados como se mostraron como densidades ópticas para diluciones de suero indicadas. Se muestran los promedios de cada dos ratones. La Figura 6 muestra que las VLP tratadas de RNasa A (HBc) que portan dentro ADN rico en CpG (que contienen enlaces de fósforo normal) , dializados de oligonucleótidos de CpG no enlazados son efectivos en la inducción de respuestas IGG2a más que en IgGl contra el alérgeno de veneno de abeja PLA2 (Fosfolipasa A2 ) . Los ratones fueron cebados subcutáneamente con 5 pg de veneno de abeja (ALK Abello) ya sea solo o mezclado con una de las siguientes: 50 pg de VLP solo, 50 pg de VLP cargado y empacado, respectivamente, con oligonucleótidos CpG o 50 pg de VLP mezclado con oligonucleótidos de CpG 20 nmol . Alternativamente, los ratones se cebaron con 5 pg de veneno de abeja mezclado con VLP solo o VLP cargado y empacado, respectivamente, con oligonucleótidos CpG en conjunto con hidróxido de aluminio. 14 días después, los ratones se estimularon con las mismas preparaciones de vacuna y sangraron en el dia 21. Las subclases de IgG especificas de PLA2 en suero del dia 21 fueron evaluadas por ELISA. Se nota que la presencia de Alum favorece la inducción de IgGl aún en la presencia de VLP de CpG-empacados o CpG libres. Los resultados como se mostraron como densidades ópticas para muestras de suero diluidas de 20 múltiplos. Se muestran los promedios de cada dos ratones. La Figura 7 muestra que los CpG libres y no los CpG empacados en VLP (HBc) incrementan dramáticamente el tamaño del bazo después de vacunación. Los ratones se inmunizaron con 100 µg de VLP solo, CpG solo (20 nmol) , 100 ]ig de VLP mezclados con 20 nmol de CpG, o que contienen CpG empacados. Los números de linfocitos Totales/bazo fueron medidos 12 dias después . La Figura 8 muestra la caída de temperatura de cuerpo alérgico en ratones vacunados con VLP (CpG) + Veneno de Abeja. Se han evaluado dos conjuntos de ratones. El Grupo 1 (n = 7) recibió VLP (CpG) mezclado junto con veneno de abeja como vacuna. El Grupos 2 (n = 6) recibió solamente VLP (CpG). Después una prueba inmunogénica con una dosis mayor de veneno de abeja (30 ug) , la reacción alérgica se evaluó en términos de cambios en la temperatura del cuerpo del ratón. En el grupo 1 que recibió el veneno de Abeja junto con VLP (CpG) no se observaron cambios significantes de la temperatura del cuerpo en ninguno de los ratones evaluados. En contraste,' el grupo 2 que recibió solamente VLP (CpG) como una vacuna de desensibilización mostró una caída de temperatura de cuerpo pronunciada en 4 de los 6 animales. Por lo tanto, estos ratones no fueron protegidos de reacciones alérgicas. Nota: Los símbolos en la figura representan el promedio de 6 (para VLP (CpG) ) o 7 (VLP (CpG) + Veneno de Abeja) ratones individuales que incluye desviación estándar (SD) . las figuras 9A-9C muestran la detección de anticuerpos de suero IgE e IgG específicos en ratones antes y después de la desensibilización. Todos los ratones se han sensibilizado con cuatro inyecciones de veneno de Abeja en adyuvante (Alum) . Luego, los ratones se han vacunado con VLP(CpG) + veneno de Abeja con el propósito de inducir una repuesta inmune protectora o como un control con VLP(CpG) solamente. Las muestras de sangre de todos los ratones fueron tomadas antes y después de desensibilización y evaluadas en ELISA para anticuerpos de IgE específico de veneno de Abeja (Fig. 9A) , anticuerpos IgGl (Fig. 9B) y anticuerpos IgG2a (Fig. 9C) , respectivamente. Como se muestra en la Figura 9a, se observó una concentración IgE incrementado para ratones vacunados de VLP(CpG) + veneno de Abeja después de desensibilización. Los resultados están presentados como la densidad óptica (OD450nm) en dilución de suero 1:250. El promedio de 6 (VLP(CpG)) o 7 (VLP(CpG) + Veneno de Abeja) ratones individuales que incluye desviación estándar (SD) se muestra en la figura. La Figura 9B revela una concentración de suero de IgGl de anti veneno de Abeja incrementado después de desensibilización solamente para ratones vacunados con VLP(CpG) + Veneno de Abeja. Lo mismo es verdad para la Figura 9C donde las concentraciones de suero IgG2a se han determinado. Como se espera por una desensibilización exitosa, el incremento en concentraciones de anticuerpos IgG2a fue más pronunciado. Los resultados se muestran como promedio de 2 (VLP(CpG)) o 3 (VLP(CpG) + Veneno de Abeja) ratones que incluye SD para diluciones de suero de 1:12500 (IgGl) o 1:500 (IgG2a), respectivamente. La Figura 10 muestra las respuestas de anticuerpo de ratones Balb/c inmunizados con extracto de polen de pasto ya sea mezclado con Qb VLP, Qb VLP cargado y empacado, respectivamente, con CpG-2006 o con Alum. El suero obtenido de 5 ratones por grupos se usó. Se realizó un ensayo de ELISA con extracto obtenido recubierto a la placa. Los pozos se incubaron con una dilución de 1:60 del suero de ratón respectivo desde el día 21 para detección de IgGl, IgG2a, Ig2b o con una dilución de 1:10 para la detección de anticuerpos de isotipo IgE y la detección se realizó con los anticuerpos secundarios anti ratón específicos de isotipos que corresponden acoplados a peroxidasa de raíz de rábano. Las densidades ópticas en 450 nm se dibujan después de reacción de color. Las Figuras 11A-11B muestran las respuestas de anticuerpo de ratones Balb/c los cuales fueron sensibilizados con extracto de polen de pasto mezclado con Alum y subsecuentemente desensibilizado con extracto de polen de pasto ya sea mezclado con Qb VLP o con Qb VLP cargado y empacado, respectivamente, con CpG-2006 o con Alum. Un grupo de ratones fue dejado sin tratar después de sensibilización. Se realizó un ensayo de ELISA con extracto obtenido recubierto a la placa. Los pozos se incubaron con unas diluciones seriales del suero de ratón respectivo y la detección se realizó con los anticuerpos secundarios antiratón específicos de isotipo IgGl e IgG2a acoplados a peroxidasa de raíz de rábano. Las concentraciones de ELISA se calcularon como el recíproco de la dilución dada 50% de las densidades ópticas en saturación. La Figura 11A muestra las concentraciones de IgGl, la figura 11B las concentraciones de IgG2b. Las Figuras 12A-12B representa el análisis de empaque de gl0gacga-PO dentro de VLP de HBc33 en una gel agarosa 1% teñida con bromuro de etidio (A) y Azul de Coomassie (B) , Cargados en el gel están 15 pg de las muestras que siguen: 1.1 kb ADN fermentos MBI escalera; 2. VLP de HBc33 no tratada; 3, VLP de HBc33 tratada con RNasa A; 4. VLP de HBc33 tratada con RNasa A y empacada con gl0gacga-PO; 5. VLP de HBc33 tratada con RNasa A, empacada con gl0gacga-PO, tratada con Benzonasa y dializada. Las Figuras 13A-13H muestran micrográficas de electrón de ?)ß VLP que fueron reensamblados en la presencia de oligodesoxinucleótidos diferentes. las VLP se han reensamblado en la presencia de los oligodesoxinucleótidos indicados o en la presencia de tRNA pero no se han purificado a una suspensión homogénea por cromatografía de exclusión de tamaño. Como control positivo sirvió la preparación de ?ß VLP "intacto" que se ha purificado de E. coli. Las Figuras 14A-14B muestran el análisis de contenido de ácido nucleico del ?)ß VLP reensamblado por tratamiento de nucleasa y electroforesis de gel de agarosa: 5 g de ?)ß VLP reensamblada y purificada y 5 µg de ?)ß VLP el cual se ha purificado de E. coli, respectivamente, se trató como se indicó. Después de este tratamiento, las muestras se mezclaron con tinta cargada y se cargó en una gel de agarosa 0.8%. Después de la corrida el gel se tiñó primero con bromuro de etidio (A) y después de documentación el mismo gel se tiñó con Azul de Coomassie (B) . Las Figuras 15A-15B muestran una micrográfica de electrón de la proteína de AP205 VLP desensamblada mientras la Figura 15 B muestra las partículas reensambladas antes de purificación. La Figura 15C muestra una micrográfica de electrón del reensamble purificado VLP AP205. La ampliación de la Figura 15 A-C es 200 000 X. Las Figuras 16A y 16B muestran las VLP AP205 reensambladas analizadas por electroforesis de gel de agarosa. Las muestras cargadas en el gel de ambas figuras fueron, desde izquierda a derecha: VLP AP205 no tratadas, 3 muestras con cantidad de diferenciación de VLP AP205 reensamblada con CyCpG y purificadas, y VLP ?)ß no tratadas.

El gel en la Figura 16A se tiñó con bromuro de etidio, mientras el mismo gel se tiñó con azul de Coomassie en la Figura 16 B. La figura 17 muestra el análisis de SDS-PAGE que demuestra bandas de acoplamiento múltiple qué consisten de uno, dos o tres péptidos acoplados al monómero <2ß (Flechas, Figura 17). Para el bien de la simplicidad del producto de acoplamiento del péptido p33 y los <2ß VLP se terminaron, en particular, a través de la sección de muestra Qbx33. Las figuras 18A-18G representan el análisis de empacamiento de B-CpGpt en Qbx33 VLP en una gel de agarosa 1% teñida con bromuro de etidio (A) y Azul de Coomassie (B) . (C) muestra el análisis de la cantidad de oligo empacado extraído de la VLP en un TBE/urea 15% teñido con SYBR Oro. Cargadas en gel están las siguientes muestras: 1. contenido de oligo BCpGpt de 2 µg de Qbx33 VLP después de digestión K de proteinasa y tratamiento de RNasa A; 2. control B-CpGpt 20 pmol; 3. control B-CpGpt 10 pmol; 4.5 control B-CpGpt 4.5 pmol. La Figura 18 D y E muestran el análisis de empacamiento de gl0gacga-PO en Qbx33 VLP en un gel de agarosa 1% teñido ¦ con bromuro de etidio (D) y Azul de Coomassie (E) . Cargado en el gel están 15 g de las siguientes muestras: 1. MBI Fermentantes 1 kb ADN escalera; 2. Qbx33 VLP no tratado; 3. Qbx33 VLP tratado con RNasa A; 4. Qbx33 VLP tratado con RNasa A y empacado con gl0gacga-PO; 5. Qbx33 VLP tratado con RNasa A, empacado con glOgacga-PO, tratado con Benzonasa y dializado. La Figura 18 E y F muestra el análisis de empacamiento de dsCyCpG-253 en Qbx33 VLP en un gel de agarosa 1% teñido con bromuro de etidio (E) y Azul de Coomassie (F) . Cargado en el gel están 15 µg de las siguientes muestras: 1. Escalonamiento de MBI Fermentas de 1 kb de'ADN; 2. Qbx33 VLP no tratado; 3. Qbx33 VLP tratado con RNasa A; 4. Qbx33 VLP tratado con RNasa A, empacado con dsCyCpG-253 y tratado con DNasel; 5. Qbx33 VLP tratado con RNasa A, empacado con dsCyCpG-253, tratado con DNasal y dializado.

Descripción Detallada de la Invención A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen los mismos significados como se entienden comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí pueden ser usados en la práctica o evaluación de la invención, los métodos y materiales preferidos están descritos aquí. -1. Definiciones Animal: Como se usa aquí, el término "animal" está pensado para incluir, por ejemplo, humanos, ovejas, caballos, reses, cerdos, perros, gatos, ratas, ratones, pájaros, reptiles, peces, insectos y arácnidos.

Anticuerpo: Como se usa aquí, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas que son capaces de enlazar un epítopo o antigénico determinante. El término está pensado para incluir todos los anticuerpos y fragmentos de enlazamiento de antígeno de estos, que incluyen anticuerpos de cadena única. Más preferiblemente los anticuerpos con antígenos de humano que enlazan fragmentos de anticuerpo e incluyen, pero no están limitados a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv de cadena única (scFv) , anticuerpos de cadena única, Fv enlazados de disulfuro (sdFV) y fragmentos que comprenden cualquiera de un dominio VL o VH. Los anticuerpos pueden ser desde cualquiera de origen animal que incluye pájaros y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son humanos, murinos, conejos, cabra, conejillos de indias, camello, caballo o pollo. Gomo se usa aquí, los anticuerpos "humano" incluyen anticuerpos que tienen secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describió, por ejemplo, en la Patente de EUA No. 5,939,598 por Kucherlapati y colaboradores. En una modalidad preferida de la invención, las composiciones de la invención pueden ser usadas en el diseño de vacunas para el tratamiento de alergias. Los anticuerpos del isotipo IgE son componentes importantes en reacciones alérgicas. Los mastocitos enlazan anticuerpos IgE en su superficie y libera histaminas y otros mediadores de respuesta alérgica en enlazamiento de antigeno especifico a las moléculas IgE enlazadas en la superficie del mastocito. La inhibición de producción de anticuerpos IgE, por lo tanto, es un objetivo que promete proteger contra alergias. Esto debe ser posible por realización de una respuesta de célula auxiliadora T deseada. Las respuestas de célula auxiliadora T pueden ser divididas en tipo 1 (TH1) y tipo 2 (TH2) respuestas de célula auxiliadora T (Romagnani, Immunol Today 18:263-266 (1997)). Las células TH1 secretan interferon gama y otras citocinas las cuales provocan células B para producir anticuerpos IgG. En contraste, una citocina critica producida por células TH2 es IL-4, la cual - deriva células B para producir IgE. En muchos sistemas experimentales, el desarrollo de respuestas TH1 y TH2 es mutualmente exclusiva puesto que las células TH1 suprimen la inducción de células TH2 y viceversa. Asi, los antigenos que provocan una respuesta TH1 fuerte suprimen simultáneamente el desarrollo de. respuestas TH2 y de ahi, la producción de anticuerpos IgE. La presencia de concentraciones altas de anticuerpos IgG pueden prevenir enlazamiento de alérgenos a mastocitos enlazados a IgE, por lo tanto inhibición de la liberación de histamina. Asi, la presencia de anticuerpos IgG puede proteger de reacciones alérgicas mediadas de IgE. Comúnmente las sustancias que provocan alergias incluyen, pero no están limitadas a: pólenes (por ejemplo, pasto, ambrosia, abedul o cedro de montaña) ; polvo de casa y ácaro de polvo; alérgenos epidermales de mamífero y caspas de animales; moho y hongos; cuerpos de insectos y veneno de insecto; plumas; alimento y fármacos (por ejemplo penicilina). Ver Shough, H. y colaboradores, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th edition (Chap. 82), Mac Publiching Company, Mack Publishing Group, Easton, Pennsylvania (1995), los contenidos completos de los cuales están incorporados aquí por referencia. Así, la inmunización de individuos con alérgenos mezclados con partículas similares de virus que contienen ADN empacado rico en porciones de CG no metiladas debe ser' benéfico no solamente antes sino también después del inicio de las alergias . Antígeno: Como se usa aquí, el término "antígeno" se refiere a una molécula capaz de ser enlazada por un anticuerpo o un receptor de células T (TCR) si está presente por las moléculas MHC . El término "antígeno", como se usa aquí, también abarca epítopos de células T. Un antígeno es adicionalmente capaz de ser reconocido por el sistema inmune y/o es capaz de inducción de una respuesta inmuno humoral y/o respuesta inmune celular que lleva a la activación de linfocitos T y/o B. Esto puede, sin embargo, requerir que, por lo menos en ciertos casos, el antigeno contenga o esté enlazado a un epitopo de células Th y esté dado en adyuvante. Un antigeno puede tener uno o más epitopos (epitopos B y T) . La reacción especifica referida arriba está pensada para indicar que el antigeno preferiblemente reaccionará, comúnmente en una manera ' altamente selectiva, con su anticuerpo que corresponde o TCR y no con la multitud de otros anticuerpos o TCR los cuales pueden ser evocados por otros antigenos. Los antigenos como se usaron aquí también pueden ser mezclados de varios antigenos individuales. Un "antigeno microbial" como se usa aquí es un antigeno de un microorganismo e incluye, pero no está limitado a, virus infecciosos, parásitos y hongos infecciosos. Tales antigenos incluyen los microorganismos intactos asi como aislados naturales y fragmentos o- derivados de estos y también compuestos sintéticos o recombinantes los cuales son idénticos a o similar a antigenos de microorganismos naturales e induce una respuesta inmune especifica para aquel microorganismo. Un compuesto es similar a un antigeno de microorganismo natural si este induce una respuesta inmune (humoral y/o celular) a un antigeno de microorganismo natural. Tales antigenos se usan rutinariamente en la técnica y son bien conocidos por los técnicos expertos. Ejemplos de virus infecciosos que se han encontrado en humanos incluyen pero no están limitados a: Retroviridae (por ejemplo virus de inmunodeficiencia humana, tales como VIH-1 (también referidos como HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV, o VIH-III); y otros aislados, tales como VIH-LP) ; Picornaviridae (por ejemplo virus de polio, virus de hepatitis A; enterovirus, virus de Coxsackie humano, rhinovirus, echovirus) ; Calciviridae (por ejemplo, cepas que provocan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de encefalitis de equino, virus de rubéola) ; Flaviridae (por ejemplo, virus de dengue, virus de encefalitis, virus de fiebre amarilla); Coronoviridae (por ejemplo coronavirus) ; Rhabdoviradae (por ejemplo virus de estomatitis vesicular, virus de rabias); Filoviridae (por ejemplo, virus de ébola) ; Paramixoviridae (por ejemplo, virus de parainfluenza, virus de paperas, virus de sarampión, virus sincitial respiratorio) ; Orthomixoviridae (por ejemplo virus de. influenza) ; Bungaviridae (por ejemplo, virus de Hantaan, virus de bunga, flebovirus y virus de Nilo) ; Arena viridae (virus de fiebre hemorrágica) ; Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus) ; Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de Hepatitis B) ; Parvovirida (parvovirus) ; Papovaviridae (virus de papiloma, virus de polioma) ; Adenoviridae (más adenovirus); Herpesviridae (virus de herpes simple (HSV) 1 y 2, virus zoster de varicela, citomegalovirus (C V) , virus de herpes) ; Poxviridae (virus de varióla, virus de vaccinia, virus de viruela) ; e Iridoviridae (por ejemplo, virus de fiebre de cerdo de África); y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de encefalopatías espongiformes, el agente de hepatitis delta (pensando en ser un satélite defectuoso de virus de hepatitis B) , los agentes de hepatitis no A y no B (clase l=transmitido internamente;- clase 2=transmitido parenteralmente (esto es Hepatitis C) ; Norwalk y virus relacionados, y astrovirus) . Ambas bacterias gram negativo y gram positivo sirven como antígenos en animales vertebrados. Tales bacterias gram 0 positivas incluyen, pero no están limitadas a, especies Pasteurella, especies Estafilococo y especies Estreptococo. Las bacterias gram negativo incluyen, pero no están limitadas a, Escherichia coli, especies Pseudomonas, y especies de Salmonela. Ejemplos específicos de bacteria infecciosa 5 incluyen pero no están limitados a: Helicobacter pyloris, Morelia burgdorferi , Legionella pneumophilia , especies de Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis , M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae) , Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis . 0 histeria monocytogenes , Streptococcus pyogenes (Grupo A - ¦ Estreptococcus) , Streptococcus agalactiae (Grupo B Streptococcus), Streptococcus (grupo de viridans) , Streptococcus faecalis, Streptococcus Bovis, Streptococcus (especies anaeróbicas) , Streptococcus pneumoniae, especia 5 Campylobacter patogénica, especies Enterococcus, Haemophilus influenzae, Bacillus antracis , Corynebacterium diphtheriae, especies Corynebacterium, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes , Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida , Especies Bacteroides, Fusojbacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis , Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, Actinomyces israelli y Chalmydia . Ejemplos de hongos infecciosos incluyen: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis , Chlamydia trachomatis y Candida albicans. Otros organismos infecciosos (esto es, protists) incluye: Plasmodium tal como Plasmodium falciparum, Plamodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii y Shistosoma . Otros microorganismos médicamente relevantes se han descrito extensivamente en la literatura, por ejemplo, ver C. G. A. Thomas, "Microbiología Médica", Bailliere Tindall, Gran Bretaña 1983, los contenidos completos de los cuales están incorporados aquí por referencia. Las composiciones y métodos de la invención también son usadas para tratamiento de cáncer por estimulación de una respuesta inmune antiespecífica contra un antígeno de cáncer. Un "antígeno de tumor" como se usa aquí es un compuesto, tal como un péptido, asociado con un tumor o cáncer y el cual es capaz de provocar una respuesta inmune. En particular, el compuesto es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se presentó en el contexto de una molécula de HC. Los antigenos de tumor pueden ser preparados de células de cáncer ya sea por preparación de extractos crudos de células de cáncer, por ejemplo, como se describió en Cohén, y colaboradores, Cáncer Research, 54:1055 (1994), por purificación parcial de los antigenos, por tecnología recombinante o por síntesis de novo de antígenos conocidos. Los antígenos de tumor incluyen antígenos que son porciones antigénicas de o son un polipéptido de tumor o cáncer completo. Los antígenos pueden ser aislados o preparados recombinantemente o por cualquier otro medio conocido en la técnica. Los tipos de cáncer o tumores incluyen, pero no están limitados a, cáncer de tracto biliar; cáncer de cerebro; cáncer de mama; cáncer cervical; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer endometrial; cáncer esofagal; cáncer gástrico; neoplasma intraepitelial; linfornas; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (por ejemplo célula pequeña y célula no pequeña) ; melanoma; neuroblastomas ; cáncer oral; cáncer de ovario; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas; cáncer de piel; cáncer testicular; cáncer de tiroides; y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. Los alérgenos también sirven como antígenos en animales vertebrados. El término "alérgeno", como se usa aquí, también abarca "extractos de alérgenos" y "epítopos alergénicos" . Los ejemplos de alérgenos incluyen, pero no están limitados a: polens (por ejemplo de pasto, ambrosia, abedul y cedro de montaña) ; polvo de casa y ácaro de polvo; alérgenos epidemiales mamíferos y caspas de animales; mohos y hongos; cuerpos de insectos y veneno de insecto; plumas; alimento, y fármacos (por ejemplo, penicilina) . Determinante antigénico: Como se usa aquí, el término "determinante antigénico" está pensado para referirse a aquella porción de un antígeno que es reconocido específicamente por ya sea linfocitos B o T. Los linfocitos B que responden a determinantes antigénicos producen anticuerpos, si los linfocitos T responden a determinantes antigénicos por proliferación y establecimiento de funciones de efector críticas para la mediación de inmunidad celular y/o humoral. Célula que presenta Antígeno: Como se usa aquí, el término "célula que presenta antígeno" está pensado para referirse a una población heterogénea de leucocitos o células derivadas de médula de hueso los cuales poseen una capacidad inmunoestimuladora . Por ejemplo, estas células con capaces de generación de péptidos enlazados a moléculas de MHC que pueden ser reconocidos por células T. El término es sinónimo con el término "célula accesoria" e incluye, por ejemplo, células de Langerhans, las células de interdigitalización, células dendríticas , células B y macrófagos. Bajo algunas condiciones, las células epiteliales, células endoteliales y otros, células derivadas de médula no de hueso también puede servir como célula que presenta antigeno. Enlace: como se usa aquí, el término "enlace" se refiere a enlazamiento que puede ser covalente, por ejemplo, por acoplamiento químico del oligonucleótido que contiene CpG no metilado a una partícula similar a virus, o no covalente, por ejemplo interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno, etc. Los enlaces covalentes pueden ser, por ejemplo, ésteres, éter, fosfoéster, amida péptido, imida, enlaces de carbón-azufre, enlaces de carbón-fósforo, y lo similar. El término también incluye el encerrar o encerrar parcialmente, de una substancia. El término "enlace" es más amplio e incluye términos tales como "acoplado", "fusionado", "encerrado" y "anexado". Más aún, con respecto a la sustancia inmunoestimuladora que se enlaza a la partícula similar a virus el término "enlace" también incluye el encerramiento, o encerramiento parcial, de la sustancia inmunoestimuladora. Por lo tanto, con respecto a la sustancia inmunoestimuladora que se enlaza a la partícula similar de virus el término "enlace" es más amplio e incluye términos tales como "acoplado", "fusionado", "encerrado", "empacado" y "anexado". Por ejemplo, la sustancia inmunoestimuladora tal como el oligonucleótido que contiene CpG no metilado puede ser encerrado por la VLP sin la existencia de un enlazamiento actual, ni covalentemente ni no covalentemente , de manera que el oligonucleótido es mantenido en el lugar por mero "empacamiento". Fusión: Como se usa aquí, el término "fusión" se refiere a la combinación de secuencias de aminoácido de origen diferente en una cadena de polipéptido por combinación en cuerpo de sus secuencias de nucleótido que codifica. El término "fusión" explícitamente abarca fusiones internas, esto es, inserción de secuencias de origen diferente dentro de una cadena de polipéptido, además a fusión de uno de sus \ términos. CpG: Como se usa aquí, el término "CpG" se refiere a un oligonucleótido el cual contiene en por lo menos una secuencia de dinucleótido guanina de citosina no metilada (por ejemplo, "oligonucleótidos CpG" o ADN que contiene una citosina seguida, por guanosina y enlazado por un enlace de fosfato) y estimula/activa, por ejemplo, tiene un efecto mitogénico, o induce o incremente la expresión de citosina, una célula derivada de médula de hueso de vertebrado. Por ejemplo, los CpG pueden ser útiles en la activación de células B, células NK y células que están presentes en antígeno, así como células dendríticas, monocitos y macrófagos. Los CpG pueden incluir nucleotidos análogos tales como análogos que contienen enlaces de fosforotioéster y pueden ser de doble hebra o hebra única. Generalmente, las moléculas de doble hebra son más estables in vivo, mientras que las moléculas de hebra única tienen actividad inmune incrementada . Proteína (s) de Recubrimiento: Como se usa aquí, el término "proteína (s) de recubrimiento" se refiere" a la(s) proteínas (s) de un bacteriófago o un ARN-fago capaces de ser incorporadas dentro del ensamble cápsida del bacteriófago o el ARN-fago. Sin embargo, cuando se refiere al producto de gen específico del gen de proteína de recubrimiento de ARN-fagos se usa el término "CP". Por ejemplo, el producto de gen específico del gen de proteína de recubrimiento de ARN-fago <2ß se refiere como "<2ß CP", considerando que las "proteínas de recubrimiento" de bacteriófago Qb comprenden el "? CP" así como la proteína Al. La cápsida de Bacteriófago ?)ß está compuesta principalmente del ?)ß CP, con un contenido menor de la proteína Al. De la misma manera, la proteína de recubrimiento ?)ß VLP contiene principalmente ?)ß CP, con un menor contenido de proteína Al. Epítopo: Como se usa aquí, el término "epítopo" se refiere a porciones continuas o , discontinuas de un polipéptido que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferiblemente un mamífero, y más probablemente en un humano. Un epítopo se reconoce por un anticuerpo o una célula T a través de su receptor de células T en el contexto de una molécula MHC. Un "epitopo inmunogénico", como se usa aquí, se define como una porción de un polipéptido que provoca una respuesta de anticuerpo o induce una respuesta de células T en un animal, como se determinó por cualquier método conocido en la técnica. (Ver, por ejemplo, Geysen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983) ) . El término "epitopo antigénico", como se usa aquí, se definió como una porción de una proteína a la cual un anticuerpo puede enlazar inmunoespecíficamente su antígeno como está determinado por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. El enlazamiento inmunoespecífico excluye enlazamiento no específico pero no es necesario excluir reactividad cruzada con otros antígenos . Los epítopos antigénicos no necesariamente deben ser inmunogénicos . Los epítopos antigénicos también pueden ser epítopos de células T, en tal caso ellos pueden ser enlazados inmunoespecíficamente por un receptor de células T dentro del contexto de una molécula MHC. Un epitopo puede comprender 3 aminoácidos en una conformación espacial la cual es única para el epitopo. Generalmente, un epitopo consiste de por lo menos alrededor de 5 de los aminoácidos, y más comúnmente, consiste de por lo menos alrededor de 8-10 aminoácidos. Si el epitopo es una molécula orgánica, esta puede ser tan pequeña como el Nitrofenil.

Respuesta Inmune: Como se usa aquí, el término "respuesta inmune" se refiere a una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que lleva a la activación o proliferación de linfocitos B y T y/o células que presentan antigeno. En algunos ejemplo, sin embargo, las respuestas inmunes pueden ser de baja densidad y se vuelven detectables solamente cuando usan por lo menos una sustancia de acuerdo con la invención. Las referencias "inmunogénicas" a un agente usado para estimular el sistema inmune de un organismo viviente, de manera que una o más funciones del sistema inmune son incrementadas y dirigidas hacia el agente inmunogénico . Un "polipéptido inmunogénico" es un polipéptido que provoca una respuesta inmune celular y/o humoral, si está solo o enlazado a un portador en la presencia o ausencia de un adyuvante. Preferiblemente, la célula que presenta antígeno puede ser activada. Inmunización: Como se usa aquí, los términos "inmunizar" o "inmunización" o términos relacionados se refieren a conferir la capacidad de aumentar una respuesta inmune sustancial (que comprende inmunidad de anticuerpos y/o celular- tal como efector CTL) contra un antígeno o epítopo objetivo. Estos términos no requieren que la inmunidad completa sea creada, sino más bien que sea producida una respuesta inmune la cual es sustancialmente más grande que la línea base. Por ejemplo, un mamífero puede ser considerado que es inmunizado contra un antigeno objetivo si la respuesta inmuno celular y/o humoral al antigeno objetivo ocurre después de la aplicación del método de la invención. El ácido nucleico Inmunoestimulador : Como se usa aquí, el término ácido nucleico inmunoestimulador se refiere a un ácido nucleico capaz de inducir y/o -mejorar una respuesta inmune. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores , como se usaron aquí, comprenden ácidos ribonucléicos y en particular ácidos deoxiribonucléicos . Preferiblemente, ácidos nucleicos inmunoestimuladores que contienen por lo menos una porción de CpG por ejemplo dinucleótido de CG en el cual C es no metilado. El dinucleótido CG puede ser parte de una secuencia o puede estar abarcado dentro de una secuencia no palindrómica . Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores no contienen porciones de CpG como se describió arriba, a manera de ejemplo, los ácidos nucleicos que carecen de dinucleótidos CpG, asi como los ácidos nucleicos que contienen porciones de CG con un dinucleótido CG metilado. El término "ácido nucleico inmunoestimulador" como se usa aquí también debe referirse a ácidos nucleicos que contienen bases modificadas tales como 4-bromo-citosina . Sustancia Inmunoestimuladora : Como se usa aquí, el término "sustancia inmunoestimuladora" se refiere a una sustancia capaz de inducir y/o mejorar una respuesta inmune. Las sustancias inmunoestimuladoras, como se usa aquí, incluyen, pero no están limitadas a, sustancias de activación de receptor similar a cuota y sustancias que inducen secreción de citosina. Las sustancias de activación de receptor similar a cuota incluyen, pero no están limitadas a, ácidos nucleicos inmunoestimuladoras , péptidoglicanos, lipopolisacáridos , ácidos lipeteicónicos, compuestos de imidazoquinolina, flagelinas, lipoproteinas, y sustancias orgánicas inmunoestimuladoras tales como taxol. Mezcla: Como se usa aquí, el término "mezcla" se refiere a la combinación de dos o más sustancias, ingredientes, o elementos que son agregados juntos, no están combinados químicamente uno con otro y son capaces de ser separados. Oligonucleótido: Como se usa aquí, los términos "oligonucleótido" u "oligómero" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende 2 o más nucleótidos, generalmente por lo menos alrededor de 6 nucleótidos a alrededor de 100,000 nucleótidos, preferiblemente alrededor de 6 a alrededor de 2000 nucleótidos, y más preferiblemente alrededor de 6 a alrededor de 300 nucleótidos, aún más preferiblemente alrededor de 20 a ¦ alrededor de 300 nucleótidos, y aún más preferiblemente alrededor de 20 a alrdedor de 100 nucleótidos. Los términos "oligonucleótido" o "oligómero" también se refieren a una secuencia de ácido nucleico que comprende más de 100 a alrededor de 2000 nucleótidos, preferiblemente más de 100 a alrededor de 1000 nucleótidos, y más preferiblemente más de 100 a alrededor de 500 nucleótidos. "Oligonucleótido" generalmente también se refiere a cualquier poliribonucleótido o polidesoxiribonucleótido, el cual puede ser ARN no modificado o ADN o ARN o ADN no modificados. La modificación puede comprender la columna vertebral o análogos de nucleótido. "Oligonucleótido" incluye, sin limitación, ADN de hebra sencilla y doble, el ADN que es una mezcla de regiones de hebras sencillas y dobles, ARN de hebra sencilla o doble, y ARN que es mezcla de regiones de hebras sencillas y dobles, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de hebras sencillas o, más comúnmente, de hebras dobles y una mezcla de regiones de hebras sencillas .y dobles. Además, "oligonucleótido" se refiere a regiones de hebras triples que comprenden ARN o ADN o ambos AR y ADN. Además, un oligonucleótido puede ser sintético, genómico o recombinante , por ejemplo, ADN-?, ADN cósmido, cromosoma bacterial artificial, cromosoma artificial de levadura y fago filamentoso tal como M13. El término "oligonucleótido" también incluye ADN o ARN que contienen uno o más bases modificadas y ADN o ARN con columnas vertebrales modificadas para estabilidad o por otras razones. Por ejemplo, modificaciones/análogas de nucleótido apropiadas incluyen ácido nucleico de péptido, inosin, bases tritiladas, fosforotioatos, alquilfosforotioatos, 5-nitroindol desoxiribofuranosil , 5-metildesoxicitosina y 5,6-dihidro-5 , 6-dihidroxideoxitimidina . Se han hecho una variedad de modificaciones al ADN y ARN; asi, el "oligonucleótido" abraza química, enzimática o metabólicamente pistas modificadas de polinucleótidos como comúnmente se encontraron en la naturaleza, asi como las pistas químicas de características de ADN y ARN de virus de células. Otros análogos/modificaciones de nucleótido serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. Empacado: El término "empacado" como se usa aquí se refiere al estado de una sustancia inmunoestimuladora, en particular un ácido nucleico inmunoestimulador con relación al VLP. El término "empacado" como se usa aquí incluye enlazamiento que puede ser covalente, por ejemplo, por acoplamiento químico, o no covalente, por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas , enlaces de hidrógeno, etc. Los enlaces covalentes pueden ser, por ejemplo, éster, éter, fosfoéster, amida, péptido, imida, enlaces carbono-azufre, enlaces carbono-fósforo, y .lo similar. El término "empacado" incluye términos tales como "acoplado" y "anexado", y en particular, y preferiblemente, el término "empacado" también incluye el encerramiento, o encerramiento parcial, de una sustancia. Por ejemplo, la sustancia inmunoestimuladora tal como el oligonucleótido que contien CpG no metilado pueden estar encerrado por la VLP sin la existencia de un enlace actual, ni covalente o no covalmentemente . Por lo tanto, en el significado preferido, el término "empacado", y por este medio en particular, si los ácidos nucleicos inmunoestimuladores son las sustancias inmunoestimuladoras, el término "empacado" indica que el ácido nucleico en un estado empacado no es accesible a la hidrólisis de ADN o ARN . En modalidades preferidas, el ácido nucleico inmunoestimulador se empaca dentro del lado de cierre de la VLP, más preferiblemente en una manera no covalente . Producto PCR: Como se usa aquí, el término "producto PCR" se refiere a copias amplificadas de secuencias de ADN objetivo que actúan como material inicial para una PCR. Las secuencias objetivo pueden incluir, por ejemplo, ADN de hebra doblemente. La fuente de ADN para una PCR puede ser ADN complementariamente, también referido como "cADN", el cual puede ser el producto de conversión de mARN que usa la transcriptasa inversa. La fuente de ADN para una PCR puede ser el ADN genómico total extraído dé células. La fuente de células de las cuales el ADN puede ser extraído para una PCR incluye, pero no está limitada a, muestras de sangre; tejidos humanos, animales, o de plantas; hongos; y bacterias. El material de inicio de ADN para una PCR puede ser no purificado, parcialmente purificado, o altamente purificado. La fuente de ADN para una PCR puede ser de insertos clonados en vectores, los cuales incluyen, pero no están limitados a, vectores plásmidos y vectores bacteriófagos. El término "producto PCR" es intercambiable con el término "producto de reacción de cadena de polimerasa". Las composiciones de la invención pueden ser combinadas, opcionalraente, con un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador farmacéuticamente aceptable" como se usa aquí significa uno o más rellenos, diluentes o sustancias de encapsulación sólidas o liquidas compatibles, los cuales son apropiados para administración en humanos u otro animal. El término "portador" denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el cual el ingrediente activo se combina para facilitar la aplicación. Polipéptido: Como se usa aquí, el término " polipéptido" se refiere a una molécula compuesta de monómeros (amino ácidos) enlazados linealmente por enlaces de amida (también conocidos como enlaces de péptido) . Esto indica cadenas moleculares de aminoácidos y no se refiere a una longitud especifica del producto. Asi, los péptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidas dentro de la definición de polipéptido. Este término también está proyectado para referirse a modificaciones post expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones , acetilaciones , fosforilaciones, y lo similar. Un polipéptido recombinante o derivado no necesariamente es trasladado desde una secuencia de ácido nucleico designada. Este también puede ser generado en muchas formas, incluyendo síntesis química. Una sustancia que "mejora" una respuesta inmune se refiere a una sustancia en la cual una respuesta inmune se 5 observa que es mayor o intensificada o desviada en cualquier forma con la adición de la sustancia cuando es comparada con la misma respuesta inmune medida sin la adición de la sustancia. Por ejemplo, la actividad lítica de células T citotóxicas puede ser medida, por ejemplo, usando un ensayo 0 de liberación de 51Cr, con y sin la sustancia. La cantidad de la sustancia en la cual la actividad lítica de CTL es mejorada en comparación con la actividad lítica de CTL sin la sustancia es tal para ser una cantidad suficiente para mejorar la respuesta inmune del animal al antígeno. En una 5 modalidad preferida, la respuesta inmune es mejorada por un factor de por lo menos alrededor de 2, más preferiblemente por un factor de alrededor de 3 o más. La cantidad o tipo de citocinas secretadas también pueden ser alteradas. Alternativamente, la cantidad de anticuerpos inducidos o sus 0 subclases pueden ser alteradas. • ·' La Cantidad Efectiva: Como se usa aquí, el término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Una cantidad efectiva de la composición puede ser la cantidad que 5 logra este resultado seleccionado, y así una cantidad puede ser determinada como un asunto de rutina por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, una cantidad efectiva para tratamiento de una deficiencia de sistema inmune puede ser que la cantidad necesariamente provoca activación del sistema inmune, que resulta en el desarrollo de una respuesta inmune especifica de antigeno en exposición al antígeno. El término también es sinónimo con "cantidad suficiente". La cantidad suficiente para cualquier aplicación puede variar dependiendo de los factores como la enfermedad o condición a ser tratada, la composición particular que es administrada, el tamaño del sujeto, y/o la severidad de la enfermedad o condición. Un experto ordinario en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad efectiva de una composición particular de la presente invención sin necesitar experimentación indebida. Tratamiento: Como se usa aquí, los términos "tratamiento", "tratar", "tratado" o "tratando" se refieren a profilaxis y/o terapia. Cuando se usa con respecto a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, el término se refiere a un tratamiento profiláctico el cual aumenta la . resistencia de un sujeto a infección con un patógeno o, en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto se vuelva infectado con el patógeno o muestre signos de enfermedad atribuibles a la infección, además de que un tratamiento después de que el sujeto ha sido infectado con el propósito de combatir la infección, por ejemplo, reduce o elimina la infección o previene que esta se vuelva peor. Vacuna: Como se usa aquí, el término "vacuna" se refiere a una formulación la cual contiene la composición de la presente invención y la cual está en una forma que es capaz de ser administrada a un animal. Comúnmente, la vacuna comprende un medio de solución acuosa salina o solución amortiguadora convencional el cual la composición de la presente invención se suspende o disuelve. En esta forma, la composición de la presente invención puede ser usada convenientemente para prevenir, aminorar, o de otra manera tratar una condición. Al introducirse en un hospedador, la vacuna es capaz de provocar una respuesta inmune que incluye, pero no está limitada a, la producción de anticuerpos y/o citocinas y/o la activación de células T citotóxicas, células que presentan antigeno, células T auxiliadoras, células dendriticas y/u otras respuestas celulares. Opcionalmente la vacuna de la presente invención adicionalmente incluye un adyuvante el cual puede estar presente en ya sea una menor o mayor proporción relativa al compuesto de la presente invención. El término "adyuvante" como se usa aquí se refiere a estimuladores no específicos de la respuesta inmune o sustancias que permiten la generación de un depósito en el hospedador el cual cuando se combina con la vacuna de la presente invención provee para una respuesta inmune aún más mejorada. Puede ser usada una variedad de adyuvantes. Los ejemplos incluyen adyuvantes de Freund incompletos, hidróxido de aluminio y muramildipéptido modificado . Partícula similar a virus: Como se usa aquí, el término "partícula similar a virus" (VLP) se refiere a una estructura que se asemeja a un virus pero la cual no ha demostrado ser patogénica. Comúnmente, una partícula similar a virus de acuerdo con la invención no porta información genética que codifica para las proteínas de la partícula similar a virus. En general, las partículas similares a virus carecen del genoma viral y, por lo tanto, son no infecciosas. También, las partículas similares a virus pueden a menudo ser producidas en grandes cantidades por expresión de heterologos y pueden ser fácilmente purificadas. Algunas partículas similares a virus pueden contener ácido nucleico distinto de su genoma. Comúnmente, una partícula similar a virus de acuerdo con la invención es no replicativa y no infecciosa puesto que carece toda o en parte del genoma viral, en particular los componentes replicativos e infecciosos del genoma viral. Una partícula similar a virus de acuerdo con la invención puede contener ácido nucleico distinto de su genoma. Un modalidad común y preferida de una partícula similar a virus de acuerdo con la presente invención es una cápsida viral tal como la cápsida viral del virus que corresponde, bacteriófago, o ARN-fago. Los términos "cápsida viral" o "cápsida", como intercambiablemente se usaron aquí, se refieren a un ensamble macromolecular compuesto de subunidades de proteína viral. Común y preferiblemente, las subunidades de proteína viral en una cápsida viral o cápsida, respectivamente, tienen una estructura* con una organización repetitiva inerte, en donde la estructura es, comúnmente, esférica o tubular. Por ejemplo, los cápsidas de ARN-fagos o HBcAg s tienen una forma esférica o simetría icosahedral. El término "estructura similar a cápsida" como se usa aquí, se refiere a un ensamble macromolecular compuesto de subunidades de proteína viral que reensamblan la morfología de la cápsida en el sentido definido anteriormente pero la desviación desde el ensamble simétrico común mientras mantiene un grado suficiente de orden y repetitividad . La VLP de proteína de recubrimiento de fago de ARN: La estructura de cápsida formada desde el mismo ensamble de 180 subunidades de proteína de recubrimiento de fago de ARN y opcionalmente contienen ARN hospedados se refiere como un "VLP de proteína de recubrimiento de ARN de fago". Un ejemplo específico es la VLP de - proteína de recubrimiento <2ß . En este caso particular, la VLP de proteína de recubrimiento de ARN de fago puede ser ya sea exclusivamente ensamblado desde subunidades CP <2ß (SEQ ID: No 1) generado por expresión de un gen de CP <2ß que contienen, por ejemplo, un codon para detener TAA que evita cualquier expresión de la proteina Al más larga a través de supresión, ver Kozlovska, T. M. y colaboradores, Intervirology 39:9-15 (1996), o adicionalmente contiene subunidades de proteina Al (SEQ ID: No. 2) en el ensamble de cápsida. El proceso de lectura a través tiene una eficiencia baja y se lleva a una sola cantidad muy baja de proteina Al en las VLP. Un número extensivo de ejemplos se han realizado con diferentes combinaciones de ISS empacados y antigeno acoplado. No se han observado diferencias en la eficiencia de acoplamiento y el empacamiento cuando las VLP de proteina de recubrimiento <2ß ensambladas exclusivamente de subunidades Cp ?ß o VLP de proteina de recubrimiento <2ß que contienen adicionalmente subunidades de proteina Al en las cápsidas que son usados. Además, no fue observada diferencia de la respuesta inmune entre estas preparaciones de VLP ?)ß . Por lo tanto, para el bien de la claridad del término "VLP <2ß" se usa en todas partes la descripción de los ejemplos ya sea para las VLP de proteina de recubrimiento ?ß ensambledas exclusivamente de subunidades de CP <2ß o VLP de proteina de recubrimiento ?)ß que contienen adicionalmente subunidades de proteina Al- en las cápsidas. El término "partícula de virus" como se usa aquí se refiere a la forma morfológica de un virus. En algunos tipos de virus estos comprenden un genoma rodeado por una cápsida de proteína; otros tienen estructuras adicionales (por ejemplo, envolturas, colas, etc.). Las partículas virales no envueltas se preparan de una cápsida proteinácea que rodea y protege el genoma viral. Los virus envueltos también tienen una estructura de cápsida que rodea el material genético del virus pero, además, tienen una envoltura bicapa de lipido que rodea- la cápsida. En una modalidad preferida de la invención, las VLP son libres de una envoltura de lipoproteína o una envoltura que contiene lipoproteína. En una modalidad más preferida, las VLP son libres de una envoltura junta. Uno, una, un: Cuando los términos "uno", "una", "un" son usados en este desglose, ellos significan "por lo menos uno" o "uno o más",- salvo que se indique de otra manera. Como será claro por aquellos expertos en la técnica, ciertas modalidades de la invención involucran el uso de tecnologías de ácido nucleico recombinante tales como clonación, reacción de cadena de polimerasa, la purificación de ADN y ARN, la expresión de proteínas recombinantes en células procarióticas y eucarióticas , etc. Tales metodologías son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y pueden ser encontradas convenientemente en manuales de métodos de laboratorio publicados (por ejemplo Sambrook, J. y colaboradores, eds . MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel, F. y colaboradores, eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997)). Técnicas de laboratorio fundamentales para trabajar con lineas de célula de cultivo de tejido (Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2nd edition, (1998)) y tecnologías basadas en anticuerpos (Harlow, E. y Lañe, D.,- "Antibodies: A- Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1988); Deutscher, M. P., "Guide to Protein Purification, " Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego (1990); Scopes, R.K., "Protein Purification Principies and Practice," 3rd ed., Springer-Verlag, New York- (1994)) también se describe adecuadamente en la literatura, todas las cuales se incorporan aquí como referencia. 2. Composiciones y Métodos para Mejorar una Respuesta Inmune . La invención descrita proporciona composiciones y métodos para mejorar una respuesta inmune contra uno o más antígenos en un animal. Las composiciones de la invención comprenden o existen alternativamente de una partícula de tipo virus y una substancia inmunoestimuladora, preferiblemente un ácido nucleico inmunoestimulador y aun más preferiblemente un oligonucleótido no metilado que contiene CpG, en donde el oligonucleótido se enlaza a las partículas de tipo virus y la partícula de tipo virus resultante modificada se mezcla con un antígeno, varios antígenos o una mezcla de antígeno. Además, la invención permite convenientemente al practicante construir tal composición para diversos propósitos de tratamiento y/o prevención, que incluyen la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas así como enfermedades infecciosas crónicas, la prevención y/o tratamiento de cánceres, y la prevención y/o tratamiento de alergias o enfermedades relacionadas con alergia tales como el asma por ejemplo. Las partículas de tipo virus en el contexto de la solicitud actual, se refieren a estructuras que se asemejan a una partícula de virus que no son patogénicas. En general las partículas de tipo virus carecen del genoma viral y por lo tanto no son infecciosas. También se pueden producir las partículas de tipo virus en grandes cantidades por la expresión heteróloga y se pueden purificar fácilmente. En una modalidad preferida la partícula de tipo virus en una partícula de tipo virus recombinante . El técnico experimentado puede producir VLP usando tecnología de AD recombinante y secuencias codificadoras de virus que están fácilmente disponibles para el público. Por ejemplo, la secuencia de codificación de una envolvente de virus o una proteína de núcleo se puede preparar por ingeniería para la expresión en un vector de expresión de baculovirus usando un vector de baculovirus comercialmente disponible, bajo el control regulador de un promotor de virus con modificaciones adecuadas de la secuencia para permitir la ligadura funcional de la secuencia de codificación a la secuencia reguladora. La secuencia de codificación de una envolvente de virus o una proteína de núcleo también se puede preparar por ingeniería para la expresión en un vector de expresión bacteriano por e emplo . Los ejemplos de VLP incluyen pero no se limitan a las proteínas cápsidas del virus de la hepatitis B (Ulrich, et al., Virus Res .50 : 141-182 ( 1998 )) , virus del sarampión ( arnes, et al., Gene 160:173-178 (1995)), virus Sindbis, rotavirus (patentes de E.U.A Nos. 5,071,651 y 5,374,426), virus de la enfermedad de la boca y de los pies (Twomey et al.,Vaccine 13:1603-1610, (1995)), virus Norwalk (Jiang, X., et al., Science 250:1580-1583 (1990); atsui, S.M.,et al.,J. Clin. Invest. 87:1456-1461 (1991)), la proteína retroviral GAG (PCT Patent Appl . No. WO 96/30523), la proteína del retrotransposon Ty pl, la proteína del virus de la hepatitis B de superficie (WO 92/11291) , virus del papiloma humano (WO 98/15631), fagos de ARN, Ty, fago Fr, fago GA, fago AP 205 y en. particular el fago Q3. Como será fácilmente evidente para aquellos expertos en la técnica las VLP de la invención no se limitan a ninguna forma específica. La partícula se puede sintetizar químicamente o a través de un proceso biológico que puede ser natural o no natural. A manera de ejemplo este tipo de modalidad incluye una partícula de tipo virus o una forma recombinante de la misma. En una modalidad más específica la VLP puede comprender o consistir alternativamente esencialmente o consistir alternativamente de polipéptidos recombinantes o fragmentos de los mismos que se seleccionan de los péptidos recombinantes del rotavirus polipéptidos recombinantes del virus Norwalk, polipéptidos recombinantes del virus alfa, polipéptidos recombinantes del virus de la enfermedad de la boca y los pies, polipéptidos recombinantes del virus del sarampión, polipéptidos recombinantes del virus sindbis, polipéptidos recombinantes del virus del polioma, polipéptidos recombinantes del retrovirus, polipéptidos recombinantes del virus de la hepatitis B (por ejemplo, un HBcAg) , polipéptidos recombinantes del virus mosaico del tabaco, polipéptidos recombinantes del virus Flock House, polipéptidos recombinantes del papilomavirus humano, polipéptidos recombinantes de bacteriófagos, polipéptidos recombinantes de fagos de ARN, polipéptidos recombinantes del Ty, polipéptidos recombinantes del fago fr, polipéptidos recombinantes del fago GA, polipéptidos recombinantes del fago AP205 y polipéptidos recombinantes del fago QP . La partícula de tipo virus puede además comprender o consistir esencialmente de forma alternativa, o consistir alternativamente de uno o más fragmentos de tales polipéptidos así como variantes de tales polipéptidos . Las variantes de los polipéptidos puede compartir por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% de identidad al nivel del aminoácido con sus contra partes del tipo silvestre. En una modalidad preferida, la partícula de tipo virus comprende consiste esencialmente ' de o consiste alternativamente de proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas de un fago de ARN. Preferiblemente el fago de ARN se selecciona del grupo que consiste del bacteriófago <2ß; b) bacteriófago R17; c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bacteriófago SP; f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago Mil; h) bacteriófago MXl; i) bacteriófago NL95; k) bacteriófago f2 1) bacteriófago PP7; y m) bacteriófago AP205. En otra modalidad preferida de la presente invención, la partícula de tipo virus comprende, consiste esencialmente de, o consiste alternativamente de proteínas recombinantes o fragmentos de la mismas del bacteriófago del ARN ?ß, del bacteriófago de ARN fr o de el bacteriófago de ARN AP205. En una modalidad adicional preferida de la presente invención, las proteínas recombinantes comprenden consiste esencialmente de o consisten alternativamente de proteínas de recubrimiento de los fagos de ARN. Las proteínas de recubrimientos de fago de ARN que forman cápsidas o VLP o fragmentos de las proteínas de recubrimiento de bacteriófagos compatibles con autoensamble en una cápsida o en un VLP, son por lo tanto modalidades adicionales preferidas de la presente invención. Las proteínas de recubrimiento de bacteriófago ?ß por ejemplo, se pueden expresar recombinantemente en E.coli. Además con tal expresión estas proteínas forman espontáneamente cápsidas. Adicionalmente estas cápsidas forman una estructura con una organización repetitiva inherente. Los ejemplos preferidos específicos de proteínas de recubrimiento de bacteriófagos que se pueden usar para preparar las composiciones de la invención, incluyen las proteínas de recubrimiento de los bacteriófagos de ARN tales como los bacteriófagos ?)ß (SEQ ID NO: 1; base de datos PIR No. de acceso VCBPQP que se refiere a QP y SEQ ID NO: 2 No. Acceso AAA16663 que se refiere a la proteína ?ß Al), bacteriófago R17 (SEQ ID NO: 3; PIR No. de acceso VCBPR ) , bacteriófago fr (SEQ ID NO: 4; No. de acceso PIR VCBPFR) , bacteriófago GA (SEQ ID NO: 5; GenBank- No de acceso NP-040754), bacteriófago SP (SEQ ID NO: 6; GenBank No de acceso CAA30374 que se refiere a SP CP y SEQ ID NO: 7 No de acceso NP -695026 que se refiere a SP proteína Al), bacteriófago MS2 (SEQ ID NO: 8, No de acceso PIR VCBPM2), bacteriófago Mil (SEQ ID NO: 9; No. de Acceso GenBank AAC06250) , bacteriófago MX1 (SEQ ID NO: 10, No. de acceso GenBank AAC14699) , bacteriófago NL95 (SEQ ID NO: 11; No. de Acceso GenBank Aacl4704), bacteriófago f2 (SEQ ID NO: 12; No. de Acceso GenBank P03611), bacteriófago PP7 (SEQ ID NO: 13), bacteriófago AP205 (SEQ ID NO: 90) . Adicionalmente, la proteina Al del bacteriófago QP (SEQ ID NO: 2) o las formas truncadas en las terminal C que les faltan tantos como 100, 150 o 180 aminoácidos en su terminación C, se pueden incorporar en un ensamble de cápsida de las proteínas de rescubrimiento Qp. Generalmente el porcentaje de la proteína Al con relación a Q CP en ensamble de cápsida estará limitado con objeto de asegurar la formación de cápsida. También se ha encontrado que la proteína de recubrimiento Q se autoensambla en cápsidas cuando se expresa en E. coli (Kozlovska TM. et al., GENE.137: 133-137 (1993)). La cápsida contiene 180 cápsidas de la proteína de recubrimiento que se ligan en pentámeros y hexámeros covalentes por puentes de bisulfuro (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)) lo que conduce a una estabilidad notable de la cápsida de la proteína de recubrimiento Q . Las cápsidas o VLP. hechos de la proteína de recubrimiento Q recombinante pueden sin embargo contener subunidades que no se ligan por medio de ligaduras bisulfuro a otras subunidades dentro de la cápsida o que ligan de manera incompleta. Así, al cargar la cápsida recombinante Qp o el SDS-PAGE no reductor, las bandas que corresponden a la proteina de recubrimiento ?)ß monomérica asi como bandas que corresponde al hexámero o pentámero de la proteina de recubrimiento ?ß son visibles. Las subunidades ligadas incompletamente a bisulfuro puede aparecer como un dimero, trímero o aun una banda de tetrámero en un SDS-PAGE no reductor. La proteína cápsida ?ß también muestra una resistencia inusual a los solventes orgánicos y los agentes desnaturalizadores . Sorprendentemente, se ha observado que las concentraciones de D SO y de acetonitrilo tal altas como 30% y las concentraciones de Guanidinio tan altas como 1 M no afectan la estabilidad de la cápsida. Una elevada estabilidad de la cápsida de la proteína de recubrimiento QP es una característica importante que se refiere a su uso para la inmunización y vacunación de mamíferos y humanos en particular. Con la expresión de E.coli, la metionina en la terminal N o la proteína de recubrimiento ?)ß se retira usualmente como se observa por la formación de secuencias de Edman en la terminal N como se describe en Stoll, E.,et al., J. Biol. Chem. 252-990-993 (1977). El VLP compuesto de las proteínas de recubrimiento QP en donde no se ha retirado la metionina en la terminal N o las VLP que comprenden una mezcla de las proteínas de recubrimiento ?ß en donde la metionina en la terminal N se desdobla o esta presenta también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Las partículas de tipo virus adicionales preferidas de los fagos de ARN en particular de QP de acuerdo con esta invención se describen en WO 02/056905, la descripción de lo cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Además las proteínas de recubrimiento de fagos de ARN también han demostrado un auto ensamble con la expresión de un hospedador bacteriano (Kastelein, RA. et al., Gene 23: 245-254 (1983), Kozlovskaya , TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170: 238-242 (1989), Ni, CZ., et al., Protein Sci . 5:2485-2493 (1996), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249: 283-297 (1995)) . La cápsida de fago Q contiene además de la proteína de recubrimiento la denominada proteína Al de lectura de paso y la proteína de maduración A2. Al se genera por la supresión del codón de paro UGA y tiene una longitud de 329aa. La cápsida de la proteína de recubrimiento recombinante de fago QP usada en la invención está desprovista de la proteína de lisis A2 y contiene ARN del hospedador. La proteína de recubrimiento de los fagos de ARN es una proteína de enlace de ARN e interactúa con el circuito troncal del sitio de enlace de ribosomas del gen de replicasa que actúa como un represor de la traducción durante el ciclo de vida del virus. Los elementos estructurales y de secuencia de la interacción se conocen (Witherell, G . & Uhlenbeck, OC . Biochemistry 28: 71-76 (1989); Lim F . et al., J. Biol . Chem. 271: 31839-31845 (1996) ) . El circuito troncal y el ARN en general se sabe que están involucrados en el ensamble del virus (Golmohammadi , R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)). En una modalidad adicional de la presente invención, la partícula de tipo virus comprende o consiste alternativamente de esencialmente, o consiste alternativamente de proteínas de recombinantes o fragmentos de las mimas de un fago de ARN en donde las proteínas recombinantes contienen, consisten esencialmente de, o consisten alternativamente de proteínas de recubrimiento mutantes de fagos de ARN. En otra modalidad preferida las proteínas de recubrimiento mutantes se han modificado por la eliminación de al menos un residuo de lisina a manera de substitución o por la adición de al menos un residuo de lisina a manera de substitución. Alternativamente, las proteínas de recubrimiento mutantes se han modificado por eliminación de al menos un residuo de lisina o por la adición de al menos un residuo de lisina a manera de inserción. En otra modalidad preferida, la partícula de tipo virus comprende, consiste esencialmente de o consiste alternativamente de proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas del bacteriófago <2ß del ARN, en donde las proteínas recombinantes comprenden consisten esencialmente o consisten alternativamente de proteínas de recubrimiento que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una mezcla de proteínas de recubrimiento que tiene secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y de SEQ ID NO: 2 o mutantes de SEQ ID NO: 2 y en donde se desdobla preferiblemente la metionina en la terminal N. En una modalidad adicional preferida de la presente invención, las partículas de tipo virus comprenden, consisten esencialmente de, o consiste alternativamente de proteínas recombinantes de QP o fragmentos de las mimas, en donde las proteínas recombinantes comprenden, consisten esencialmente 'de, o consisten alternativamente de proteínas de recubrimiento QP mutantes. En otra modalidad preferida estas proteínas de recubrimiento mutantes de han modificado por la eliminación de al menos un residuo de lisina a manera de substitución o por adición de al menos un residuo de lisina a manera de substitución. Alternativamente estas proteínas de recubrimiento mutantes se han modificado por eliminación de al menos una residuo de lisina o por adición de al menos un residuo de lisina a manera de inserción. Se exponen cuatro residuos de lisina en la superficie de la cápsida de la proteína de recubrimiento Q - Los mutantes Qp para los cuales se reemplazan los residuos expuestos de lisina por argininas también se pueden usar para la presente invención, Los siguientes mutantes de proteína de recubrimiento ?ß y los VLP Qp mutantes se pueden usar asi en la practica de la invención: "?)ß-240" (Lysl3-Arg; SEQ ID NO: 14), ?ß-243" (Asn 10-Lys; SEQ ID NO: 15), "Qp-250" (Lys-2-Arg, Lysl3-Arg; SEQ ID NO: 16), "Qp-251" (SEQ ID NO: 17) y "?ß-259" (Lys 2-Arg, Lysl6-Arg; SEQ ID NO: 18) . Asi, en una modalidad adicional preferida de la presente invención, las partículas de tipo virus comprenden y existen esencialmente de o consiste alternativamente de proteínas recombinantes de las proteínas de recubrimiento QP mutantes que comprende proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; b) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 15 c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; d) la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 17 y e) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 18. La construcción expresión y purificación de las proteínas de recubrimiento QP antes indicadas VLP de proteína de recubrimiento QP mutante y cápsida respectivamente se describen en WO 02/056905. En particular se refiere por ello al ejemplo 18 de la solicitud antes mencionada. En una modalidad adicional preferida de la presente invención, la partícula de tipo virus comprende consiste esencialmente de o cosiste alternativamente de proteínas recombinantes de Qp o fragmentos de las mismas, en donde las proteínas recombinantes comprende consisten esencialmente de o consisten alternativamente de una mezcla de una los mutantes anteriores Qp y la proteína correspondiente Al. En una modalidad adicional preferida la partícula de tipo virus comprende, o consiste alternativamente de proteínas recombinantes o fragmentos de los mismos de ARN-fago AP205. El genoma AP205 consiste de una proteína de maduración, una proteína de recubrimiento, una replicasa y dos estructuras de lecturas abiertas que no están presentes en los fagos relacionados, un gen de lisis o una estructura de lectura abierta que juega un papel en la traducción del gen de maduración (Klovins, J., et al., J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002)). La proteína de recubrimiento AP205 se puede expresar a partir del plásmido pAP283-58 (SEQ ID NO: 91) que es un derivado de pQblO (Kozlovska, T. M., et al., Gene 137: 133-37 (1993)), y que contiene un sitio de enlace ribosomal AP205. Alternativamente se puede clonar en la proteína de recubrimiento AP205 en pQbl85, en dirección descendente del sitio de enlace ribosomas presentes en el vector. Ambos métodos conducen a la expresión de la proteína y la formación de cápsidas. Los vectores pQblO y pQbl85 son vectores derivados del vector pGE , y la expresión de los genes clonados en estos vectores se controlan por el vector trp (Kozlovska, T. M. et al., Gene 137: 133-37 (1993)). El plásmido pAP283-58 (SEQ ID NO: 91) comprende un sitio de enlace ribosomal supuesto AP205 en la siguiente secuencia que es en dirección descendente del sitio Xbal e inmediatamente en dirección ascendente del codón de partida ATG de la proteina de recubrimiento AP205: tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATACatg (77-133 bases de SEQ ID NO: 91) . El vector pQbl85 comprende una secuencia Shine Delagarmo en dirección descendente del sitio Xbal y en dirección ascendente del codón de partida { tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAG TCAGGCCatg, (SEQ ID NO: 92), secuencia Shine Delagarmo subrayada) . En una modalidad adicional preferida de la presente invención, la partícula de tipo virus comprende, o consiste alternativamente o esencialmente de, o consiste de alternativamente de proteínas de recubrimiento recombinantes o fragmentos de las mismas de ARN-fago AP205. Esta modalidad preferida de la presente invención comprende así las proteínas de recubrimiento AP205 que forman cápsidas. Tales proteínas se expresan recombinantemente o se prepararan a partir de fuentes naturales, proteínas de recubrimiento AP-205 producidas en bacterias espontáneamente forman cápsidas como es evidente por la microscopía de electrones (EM) y la inmunodifusión . Las propiedades estructurales de la cápsida formada por la proteína de recubrimiento AP205 (SEQ ID NO: 90) y aquellas formadas por la proteína de recubrimiento de fago de ARN AP205, son casi indistinguibles cuando se observan en EM. las VLP de AP205 son altamente inmunogénicos y se pueden ligar con antígenos y/o determinantes antigénicos para generar constructos que despliegan los antígenos y/o determinantes antigénicos orientados de una forma repetida. Se producen altas concentraciones con los antígenos así desplegados que muestran los antígenos enlazados y/o determinantes antigénicos que son accesibles para interactuar con las moléculas de anticuerpos y que son inmunogénicos. En una modalidad adicional preferida de la presente invención, la partícula de tipo virus comprende o consiste alternativamente de o consiste alternativamente de proteínas de recubrimiento imitantes recombinantes o fragmentos de las mismas del ARN-fago AP205. Las formas mutantes competentes en el ensamble de las VLP de AP205 incluyendo la proteína de recubrimiento AP205 con la substitución de la prolina en el aminoácido 5 a una treonina (SEQ ID NO: 93) , también se puede usar en la práctica de la invención y conduce a una modalidad adicional preferida de la invención. Estos VLP, las VLP AP205 derivados de fuentes naturales o partículas naturales de AP205 se pueden unir a antígenos para producir configuraciones repetitivas ordenadas de los antígenos de acuerdo con la presente invención.

La proteina de recubrimiento mutante AP205 P5-T se puede expresar a partir del plásmido pAP281-32 (SEQ ID NO: 94), que se deriva directamente de pQbl85 y que contiene el gen de la proteina de recubrimiento AP205 mutante en lugar del gen de la proteína de recubrimiento ?ß. Los vectores para la expresión de la proteína de recubrimiento AP205 se transfectan en E. coli para la expresión de la proteína de recubrimiento AP205. Los métodos para la expresión de la proteína de recubrimiento y la proteína de -recubrimiento mutante respectivamente, que conducen al autoensamble en VLP se describen en los ejemplos 16 y 17. Las cepas adecuadas de E.coli incluyen pero no se limitan a E.coli K802, JM 109, RR1. Los vectores adecuados y cepas y combinaciones de los mismos se pueden identificar la probar la expresión de la proteína recubierta y la proteína recubierta mutante respectivamente por SDS-PAGE y formación de cápsidas y el ensamble al purificar opcionalmente primero las cápsidas por filtración de gel y posteriormente probarlas en un ensayo de inmunodifusión (prueba Ouchterlony) o Microscopio de electrones (Kozlovska, T.M., et al., Gene 137:133-37 (1993).).

Las proteínas de recubrimiento AP205 expresadas a partir de los vectores pAP283-58 y pAP281-32 pueden estar desprovistos del aminoácido inicial de metionina debido al procesamiento del citoplasma de E. coli. Las formas desdobladas y no desdobladas de AP205 VLP o mezclas de los mismos son además modalidades preferidas de la invención. En una modalidad adicional preferida de la presente invención la partícula de tipo virus comprende, o consiste alternativamente esencialmente de, o consiste alternativamente "de una mezcla de proteínas de recubrimiento recombinantes o fragmentos de la misma del fago AP205 de ARN y de proteínas de recubrimiento mutantes recombinantes o fragmentos de las mismas del fago AP205 de ARN En una modalidad adicional preferida de la presente invención, las partículas de tipo virus comprenden o consisten alternativamente esencialmente de, o consisten alternativamente de fragmentos de proteínas de recubrimientos recombinantes o proteínas de recubrimiento mutantes recombinantes del ARN fago AP205. Los fragmentos de proteína recombinante AP205 de recubrimiento que pueden ensamblarse en un VLP y una cápsida, son también respectivamente útiles en la práctica de la invención. Estos fragmentos se pueden generar por eliminación ya sea internamente o en las terminaciones de la proteína de recµbrimiento y la proteína de recubrimiento mutante respectivamente. Las inserciones en la proteína de recubrimiento y la secuencia de proteína de recubrimiento mutante o las fusiones de secuencias de antígenos a la proteína de recubrimiento y la secuencia de proteína de recubrimientos mutantes y compatibles con el ensamble VLP son modalidades adicionales de la invención y conducen a proteínas de recubrimiento AP205 quiméricas y partículas respectivamente. El producto de las inserciones, eliminaciones y fusiones a la secuencia de proteína de recubrimiento y si es compatible con el ensamble en VLP se puede determinar por microscopio de electrones. Las partículas formadas por la proteína de recubrimiento AP205, fragmentos de proteína de recubrimiento y proteína de recubrimiento quiméricas antes descritas se pueden aislar en forma pura por una combinación de etapas de fraccionamiento por precipitación y de etapas de purificación por filtración en gel usando por ejemplo columnas de sefarosa CL-4B, sefarosa CL-2B, sefarosa CL-6B y combinaciones de las mismas. Se conocen en el arte de otros métodos de aislamiento de partículas tipo virus se pueden usar para aislar las partículas de tipo virus (VLPs) del bacteriófago AP205. Por ejemplo el uso de ultra centrifugación para aislar VLPs del retrotransposon de levadura Yy se describe en la patente de EUA No. 4, 918, 166 que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. . La estructura de cristal de diversos bacteriófagos de ARN se ha determinado (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996)). Al usar tal información, alguien experto en la técnica puede fácilmente identificar los residuos expuestos en la superficie y modificar las proteínas de recubrimiento de bacteriófagos de manera tal que uno o más residuos activos de aminoácidos se puedan insertar. Así, alguien experto en la técnica puede fácilmente generar e identificar formas modificadas de proteínas de recubrimiento de bacteriófagos que se pueden usar para la presente invención. Así, variantes de proteínas que forman cápsidas o estructuras de tipo cápsidas (por ejemplo proteínas de recubrimiento del bacteriófago ?)ß, bacteriófago R17, bacteriófago fr, bacteriófago GA, bacteriófago SP, bacteriófago MS2 y bacteriófago AP205) , también se pueden usar para preparar las composiciones de la presente invención . Aunque la secuencia de las proteínas variantes antes discutidas diferirá de sus contrapartes de tipo silvestre, estas proteínas variantes conservarán generalmente la capacidad para formar cápsidas o estructuras de tipo cápsidas. Así, la invención incluye además composiciones y composiciones de vacuna respectivamente, que incluyen además variantes de proteínas que forman cápsidas o estructuras de tipo cápsidas, así como métodos para la preparación de composiciones tales y composiciones de vacuna respectivamente, subunidades individuales de proteínas usadas para preparar tales composiciones y moléculas de ácido nucleico que codifican estas subunidades de proteína. Así se incluyen dentro del alcance de la invención formas variantes del tipo silvestre que forman cápsidas o estructuras de tipo cápsidas y conservan la capacidad de asociarse y formar cápsidas o estructuras de tipo cápsidas. Como resultado, la invención incluye además composiciones y composiciones de vacuna respectivamente que comprenden proteínas que comprenden o consisten alternativamente esencialmente de o consisten alternativamente de secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ó 99% idénticas a las proteínas de tipo silvestre que forman configuraciones ordenadas y que , tienen una estructura repetitiva inherente respectivamente. En muchos casos estas proteínas se procesarán para eliminar péptidos de señal (por ejemplo, péptidos de señal heterólogos ) . Se incluyen además dentro del alcance de la invención moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas usadas para preparar composiciones de la presente invención. En modalidades particulares la invención incluye además composiciones que comprenden proteínas, que comprenden o ·¦' consisten alternativamente esencialmente de, o consisten alternativamente de secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ó 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID Nos: 1-11.

Las proteínas adecuadas para su uso en la presente invención también incluyen mutantes de truncamiento en la terminal C de proteínas que forman cápsidas o estructuras de tipo cápsidas así como otras configuraciones ordenadas. Los ejemplos específicos de tales mutantes de truncamiento incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de SEQ ID Nos: 1-11 en donde 1, 2, 5, 1, 9, 10, 12, 14, 15, ó 17 aminoácidos se han eliminado de la terminación C. Típicamente estos mutantes de truncamiento de la terminal C conservaran la capacidad de formar cápsidas o estructuras de tipo cápsidas. Las proteínas adicionales adecuadas para su uso en- la presente invención también incluyen mutantes de truncamiento en la terminal N de proteínas que forman cápsidas o estructuras de tipo cápsidas. Ejemplos específicos de tales mutantes de truncamiento incluyen proteínas que incluyen una secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de SEQ ID Nos.1-11 en donde 1, ,2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15 ó 17 aminoácidos se han eliminado de la terminación N. Típicamente estos mutantes de truncamiento en la terminal N conservarán la capacidad de formar cápsidas o estructuras de tipo cápsidas . Las proteínas adicionales adecuadas para su uso en la presente invención incluyen mutantes de truncamiento en la terminal N y C que forman cápsidas o estructuras de tipo cápsidas. Las mutantes de truncamiento adecuadas incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de SEQ ID Nos: 1-11 en donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, ó 17 aminoácidos se han retirado de la terminación N y 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, ó 17 aminoácidos se han retirado de la terminación C. Típicamente estos mutantes de truncamiento de la terminal C y la terminal N conservaran la capacidad de formar cápsidas o estructuras de tipo cápsidas. La invención incluye además composiciones que comprenden proteínas las cuales comprenden o consisten alternativamente esencialmente de o consisten alternativamente de secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ó 99% idénticas a las mutantes de truncamiento antes descritas. La invención incluye así composiciones y composiciones de vacuna preparadas de proteínas que formar configuraciones ordenadas, métodos de preparación para estas composiciones a partir de subunidades individuales de proteínas VLP o cápsidas, métodos para la preparación de estas subunidades de proteína individuales, moléculas de ácido nucleico que codifican estas subunidades, métodos para la vacunación y/o producción de respuestas inmunológicas en individuos utilizando estas composiciones de la presente invención. Los fragmentos de VLP que conservan la capacidad de inducir una respuesta inmune pueden comprender o consistir alternativamente de polipéptidos que tienen alrededor de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ó 500 aminoácidos de longitud pero que dependerán obviamente de la longitud de la secuencia de la subunidad que compone el VLP. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen fragmentos de proteina aquí discutidos que son adecuados para la preparación de una composición que mejora la respuesta inmune. En otra modalidad preferida de la invención, las VLP están libres de una envolvente de lipoproteina o una envolvente que contiene lipoproteina. En una modalidad adicional preferida las VLP están libres en conjunto de una envolvente . La falta de una envolvente de la lipoproteina de la envolvente que contiene lipoproteinas y en particular, la falta de una envolvente conduce a una partícula tipo virus más definida en su estructura y composición. Tales partículas más definidas de tipo virus por lo tanto pueden minimizar los efectos laterales. Además la falta de una envolvente que contiene lipoproteina o en particular, la falta de una envolvente, evita o minimiza la incorporación de moléculas potencialmente tóxicas y pirógenos dentro de la partícula de tipo virus. Como se estableció previamente, la invención incluye partículas de tipo virus o formas recombinantes de las mismas. Los técnicos experimentados tienen el conocimiento para producir tales partículas y mezclar antígenos con ellas. A manera de suministrar otros ejemplos, la invención proporciona aquí la producción de partículas de_tipo virus de la hepatitis B como partículas de tipo virus (ejemplo 1). En una modalidad, las partículas usadas en las composiciones de la invención, están compuestas de una proteína de (núcleos) cápsida de hepatitis B (HBcAG) o un fragmento de HBcAG. En una modalidad adicional las partículas usadas en las composiciones de la invención están compuestas de una proteína cápsida de hepatitis B (núcleo) (HBcAG) o un fragmento de una proteína HBcAG que se ha modificado para eliminar o reducir el número de residuos libres de cisteína. Zhou et al. (J. Virol, 66:5393-5398 (1992)) demostró que HBcAGs que se ha modificado para eliminar los residuos de cisteína naturalmente residentes conserva la capacidad para asociarse y formar estructuras muí timéricas . Así, las partículas de núcleo adecuadas para su uso en las composiciones de la invención, incluyen aquellas que comprenden HBcAGs modificados, o fragmentos de los mismos en los cuales uno o más de los residuos de cisteína naturalmente residentes se ha eliminado o substituido con otro residuo de aminoácido (por ejemplo un residuo de cerina) .

La HBcAG es una proteína generada por el procesamiento de una proteína precursora del antígeno del núcleo de la hepatitis B. Se han identificado diversos isotipos del HBcAG y sus secuencias de aminoácidos están fácilmente disponibles para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo la proteína HBcAG que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 71 tiene 183 aminoácidos de longitud y se genera por el procesamiento de una proteína precursora del antígeno del núcleo de la hepatitis B de 212 aminoácidos. Este procesamiento resulta en la eliminación de 29 aminoácidos de la terminación N de la proteína precursora del antígeno de núcleo de la hepatitis B. Similarmente la proteína HBcAG que tiene 185 aminoácidos de longitud se genera por . el procesamiento de una proteína precursora del antígeno de núcleo de hepatitis B de 214 aminoácidos. En la mayoría de los casos las composiciones y composiciones de vacuna . respectivamente de la invención se preparan usando la forma procesada de un HBcAg esto es un HBcAg a partir de la secuencia líder de la terminal N de la proteína precursora del antígeno del núcleo de la hepatitis B que se ha eliminado. Además cuando se produce HBcAgs bajo condiciones en donde el procesamiento no sucederá los HBcAgs se expresarán generalmente en forma procesada. Por. ejemplo cuando un sistema de expresión de E. coli que dirige la expresión de la proteina al citoplasma se usa para producir HBcAgs de la invención, estas proteínas se expresarán generalmente de manera tal que la secuencia líder en la terminal N de la proteína precursora de antígeno de núcleo de la hepatitis B no esté presente. La preparación de las partículas del tipo del virus de la hepatitis B que se pueden usar para la presente invención se describen por ejemplo, en WO 00/32227 y en la presente en particular en los ejemplos 17 a 19 y 21 a 24 así como en WO 01/85208, y por ello en particular en los ejemplos 17 a 19, 21 a 24, 31 y 41 y en WO 02/056905. Para la solicitud última se refiere en particular a los ejemplos 23, 24, 31 y 51. Todos los tres documentos se incorporan explícitamente en la presente como referencia. La presente invención también incluye variantes de HBcAgs que se han modificado para eliminar o substituir uno o más residuos adicionales de cisteína. Así, las composiciones de vacuna de invención incluyen composiciones que comprenden HBcAgs en las cuales los residuos de cisteína no están presentes en la secuencia de aminoácidos que se muestra en ¦ SEQ ID NO: 71 se han eliminado. Es bien conocido en el arte que los residuos libres de cisteína pueden estar involucrados en diversas reacciones químicas laterales. Estas reacciones laterales incluyen intercambios de bisulfuro, reacción con substancias o metabolitos químicos que son por ejemplo, inyectados o formados en una terapia de combinación con otras substancias, u oxidación directa y reacción con nucleótidos con exposición a luz ultravioleta. Los aductos tóxicos se pueden así generar especialmente generando el hecho de que HBcAgs tiene una fuerte tendencia a enlazarse con ácido nucleicos . Los aductos tóxicos de distribuirían así entre una multiplicidad de especies que puede cada una en lo individual estar presente a una concentración baja pero alcanzar niveles tóxicos cuando este junta. En vista de lo anterior una ventaja del uso del HBcAgs en composiciones de vacuna que se han modificado para eliminar los residuos de cisteína naturalmente residentes es que los sitios a los cuales las especies tóxicas se pueden enlazar cuando se colocan antígenos o determinantes antigénicos, se reduciría en número o se eliminaría en conj unto . Diversas variantes de HBcAgs que de presentan naturalmente para su uso en la práctica de la presente invención se han identificado. Yuan et al., (J. Virol. 73:10122-10128 (1999)), por ejemplo, describen variantes en las cuales el residuo de isoleucina en la posición que corresponde a la posición 97 en SEQ ID NO: 19 se reemplaza con un residuo de leucina o un residuo de fenilalanina . Las secuencias de aminoácidos de diversas variantes HBcAgs así como diversas variantes del precursor antígeno del núcleo de hepatitis B se describen en los informes del GenBank AAF121240 (SEQ ID NO: 20), AF12139 (SEQ ID NO: 21), X85297 (SEQ ID NO: 22) , X02496 (SEQ ID NO: 23) , X85305 (SEQ ID NO: 24) , X85303 (SEQ ID NO: 25), AF151735 (SEQ ID NO: 26) , X85259 (SEQ ID NO: 27) , X85286 (SEQ ID NO: 28) , X85260 (SEQ ID NO: 29) , X85317 (SEQ ID NO: 30) , X85298 (SEQ ID NO: 31) , AF043593 ? SEQ ID NO: 32) , 20706 (SEQ ID NO: 33) , X85295 (SEQ ID NO: 34) , X80925 (SEQ ID NO: 35) , X85284 (SEQ ID NO: 36) , X85275 (SEQ ID NO: 37) , X72702 (SEQ ID NO: 38) , X85291 (SEQ ID NO: 39) , X65258 (SEQ ID NO: 40) , X85302 (SEQ ID NO: 41) , M32138 (SEQ ID NO: 42) , X85293 (SEQ ID NO: 43) , X85315 (SEQ ID NO: 44) , U95551 (SEQ ID NO: 45) , X85256 (SEQ ID NO: 46) , X85316 (SEQ ID NO: 47) , X85296 (SEQ ID NO: 48), AB033559 (SEQ ID NO: 49) , X59795 (SEQ ID NO: 50) , X85299 (SEQ ID NO: 51) , X85307 (SEQ ID NO: 52) , X65257 (SEQ ID NO: 53) , X85311 (SEQ ID NO: 54) , X85301 (SEQ ID NO: 55) , X85314 (SEQ ID NO: 56) , X85287 (SEQ ID NO: 57) , X85272 (SEQ ID NO: 58) , X85319 (SEQ ID NO: 59) , AB010289 (SEQ ID NO: 60) , X85285 (SEQ ID NO : 61), AB010289 (SEQ ID NO: 62), AF121242 (SEQ ID NO: 63), M90520 (SEQ ID NO: 64), P03153 (SEQ ID NO: 65), AF110999 (SEQ ID NO: 66), y M95589 (SEQ ID NO: 67), las descripciones de las cuales se incorporan aqui como referencia. Estas variantes HBcAgs difieren en la secuencia de aminoácidos en diversas posiciones incluyendo residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos localizados en las posiciones 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64, 66, 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121, 126, 130, .133, 135, 141, 147, 149, 157, 176, 178, 182 y 183 en SEQ ID NO: 68. Las variantes adicionales de HBcAgs para su uso en las composiciones de la invención y que se pueden además modificar de acuerdo con la descripción de esta especificación se describe en WO 01/98333, WO 00/1777158 y WO 00/214478. Los HBcAgs adecuados para su uso en la presente invención se pueden derivar de cualquier organismo con tal de que puedan encerrar o se acoplen o se coloquen de otra manera a un oligonucleótido que contiene CpG sin metilar e inducir una respuesta inmune. Como se observa arriba los HBcAgs generalmente procesados (esto es, aquellos que carecen de secuencias líderes) se usarán en las composiciones y composiciones de vacuna respectivamente de la invención. La presente invención incluye composiciones de vacuna así como métodos para el uso de estas composiciones, que emplean la variantes antes descrita HBcAgs. • Se incluyen además dentro del alcance de la invención, variantes adicionales de HBcAgs que pueden asociarse para formar estructuras diméricas o multiméricas . Así, la invención incluye además composiciones y composiciones de vacuna respectivamente, que comprende polipéptidos HbcAgs que comprende, o consisten alternativamente de secuencias de aminoácidos que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de tipo silvestre y forman estas proteínas que se han procesado en donde es adecuado para eliminar la secuencia líder en la terminal N. Ya sea que la secuencia de aminoácidos de un polipéptido tenga una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% idéntica a una de las secuencias anteriores de aminoácidos de tipo silvestre, o una subporción del mismo, se puede determinar convencionalmente usando programas de computadora conocidos tales como el programa Bestfit. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia en particular es por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de aminoácidos, los parámetros se establecen de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y que hace espacios en la homología de hasta un 5% del número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia y. se permite. Las variantes HBcAg y precursores que tienen las secuencias de aminoácidos establecidas SEQ ID Nos: 20-36 y 64-67 son relativamente similares uno con el otro. Así, la referencia a un residuo de aminoácido de una variante HBcAgs localizada en una posición que corresponde a una posición particular en SEQ ID NO: 68, se refiere a una residuo de aminoácidos que está presente en esa posición en la secuencia de aminoácidos que se muestra SEQ ID NO: 68. La homología entre estas variantes HBcAg es para la mayor parte lo suficientemente alta entre los virus de hepatitis B que infectan mamíferos, se manera que alguien experto en la técnica tendría poca dificultad al revisar las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 68 y aquella de una variante particular HBcAg e identificado los residuos correspondientes de aminoácidos. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos HBcAg que se muestra en SEQ ID NO: 64, que muestra la secuencia de aminoácidos de un HBcAg derivado de un virus que infecta a los pájaros carpinteros tiene suficiente homología con el HBcAg que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 68 que es fácilmente evidente que un inserto de un residuo de tres aminoácidos este presente en SEQ ID NO: 64 entre los residuos de aminoácidos 155 y 156 de SEQ ID NO: 68. La invención también incluye composiciones de vacuna que comprenden variantes de HBcAg del virus de la hepatitis B que infecta a los pájaros así como a composiciones de vacuna que comprenden fragmentos de estas variantes HBcAgs. Para estas variantes HBcAg uno, dos o tres de los residuos de cisteína naturalmente presentes en estos polipéptidos pueden substituirse con otro residuo de aminoácidos o eliminarse previo a su inclusión en composiciones de vacuna de la invención . Como se discute arriba la eliminación de residuos libres de cisteina reduce el numero de .sitios en donde los componentes tóxicos se pueden unir a HBcAg y también elimina sitios en donde el reticulado de lisina y los residuos de cisteina de moléculas iguales o vecinas de HBcAg pueden suceder. Por lo tanto, en otra modalidad de la presente invención, uno o más residuos de cisteina de la proteina cépsida del virus de la hepatitis B se han eliminado o substituido con otros residuos de aminoácidos. En otras modalidades, las composiciones y composiciones de vacuna respectivamente de la invención, contendrán HBcAgs a partir de los cuales la región en la terminal C (por ejemplo, residuos de aminoácidos 145-185 o 150-185 de SEQ ID NO: 68) se han eliminado. Asi, los HBcAgs adicionales modificados adecuados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen mutantes de truncamiento en la terminal C. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen HBcAgs en donde 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35, aminoácidos se han eliminado de la terminación C. Los HBcAgs adecuados para uso en la práctica de la presente invención también incluyen mutantes de truncamiento en la terminal N. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen HBcAgs modificados en donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, o 17 de aminoácidos se han eliminado de la . terminación N. HBcAgs adicionales adecuados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen mutantes de truncamiento de la terminación C y en la terminal N. Los mutantes de truncamiento adecuados incluyen HBcAgs en donde 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, y 17 se han eliminado de la terminación N y 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35, aminoácidos se han eliminado de la terminación C con tal de que el truncamiento en la terminación C sea compatible con el enlace de los oligonucleótidos que contienen CpG. La invención incluye además composiciones de vacuna que comprenden polipéptidos HBcAg, que comprenden o consisten alternativamente de secuencias de aminoácidos que están al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% idénticas a los mutantes de truncamiento antes descritos. En ciertas modalidades de la invención, se introduce un residuo de lisina en un polipéptido HBcAg para mediar el enlace del antigeno o determinante antigénico de VLP de HBcAg. En modalidades preferidas las composiciones de la invención se preparan usando un HBcAg que comprende o consiste alternativamente de los aminoácidos de 1-144, o 1-149 o 1-185 de SEQ ID NO: 68, que se modifican de manera que los aminoácidos que corresponden a las posiciones 79 y 80 se reemplazan con un péptido que tiene las secuencias de aminoácidos de Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO: 95), lo que resulta en una variante de HBcAg que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 96. En modalidades adicionales preferidas los residuos de cisteina en las posiciones '48 y 107 de SEQ ID NO: 68 se mutan a la serina- (SEQ' ID NO: 97) . La invención incluye además composiciones que comprende los polipéptidos correspondientes que tiene la secuencias de aminoácidos que se muestran en cualquiera de SEQ ID NOs: 20-67 que también tiene las alteraciones anteriores señaladas de aminoácidos. Se incluyen además dentro del alcance de la invención las variantes adicionales de HBcAg que pueden asociarse para formar una cápsida o VLP y tener las alteraciones antes señaladas de aminoácidos. Asi la invención incluye además composiciones que comprenden polipéptidos HBcAg que comprenden o consisten alternativamente de, secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% idénticas a cualquiera de los aminoácidos de tipo silvestre y formas de estas proteínas que se han procesado en donde es adecuado para eliminar la secuencia líder ' en la terminal N y modificarse con las alteraciones ántes señaladas. Las composiciones de la invención pueden comprender mezclas de diferentes HBcAgs. Así estas composiciones pueden estar compuestas de HBcAgs lo cual difiere en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, se pueden preparar composiciones que comprendan un HBcAg de tipo silvestre y un HBcAg modificado en el cual uno o más residuos de aminoácidos se han alterado (por ejemplo, eliminado insertado o substituido) . Además, las composiciones de vacuna preferidas de la invención son aquellas que presentan configuraciones de antigenos altamente ordenadas y repetitivas. En un aspecto de la invención una partícula de tipo virus a la cual se enlaza un oligonucleótido que contiene CpG sin metilar, se mezcla con un antígeno/inmunógeno contra el cual se desea una respuesta inmune mejorada. En algunos casos se mezclará un antígeno sencillo con la partícula de tipo virus así modificada. En otros casos las VLP así modificados se mezclaran con diversos antígenos o aun mezclas complejas de antígenos. Los antígenos se pueden producir recombinantemente o se pueden extraer de fuentes naturales' las cuales incluyen pero no se limitan a polen, polvo, hongos, insectos, alimentos, piel de mamíferos, plumas, abejas, tumores, patógenos, y plumas. Como se describió previamente, la invención se basa en el hallazgo sorprendentemente de que las VLP modificados esto es» las VLP a los cuales las substancias inmunoestimuladoras , preferiblemente ácidos nucleicos inmunoestimuladores y aun más preferiblemente oligonucleótidos de ADN o alternativamente poli (I:C) se enlazan, y preferiblemente a los cuales se enlazan las substancias inmunoestimuladoras preferiblemente ácidos nucleicos inmunoestimuladores y aun más preferiblemente oligonucleótidos de ADN o alternativamente poli (I:C) para llevar a VLPs empacados, pueden mejorar respuestas de células T y B contra antigenos únicamente a través del mezclado de las VLP asi modificados con antigeno. Sorprendentemente, ninguna ligadura o acoplamiento covalentemente del antigeno al VLP se requiere. Además las respuestas de células T contra ambos VLP y antigenos se dirigen especialmente al tipo Thl. Además los ácidos nucleicos empacados en CpGs respectivamente se protegen de la degradación, esto es, son más estables. Además una activación no especifica de células del sistema inmune se reduce dramáticamente. El sistema inmune inato tiene la capacidad de reconocer un patrón molecular no variable compartido con patógenos microbianos. Los estudios resientes han revelado que este reconocimiento es una etapa crucial en la inducción de respuestas inmunes efectivas. El mecanismo principal por el cual los productos microbianos aumentan las respuestas inmunes es estimular el APC especialmente las células de-ndríticas para producir citocinas proliferadoras y para expresar altos niveles de moléculas coestimuladoras para las células T. Estas células dendriticas estimuladas posteriormente inician respuestas primarias de células T y dictan el tipo de función del efector mediadas por células T.

Dos clases de ácidos nucleicos, nominalmente 1) ADN bacteriano que contiene secuencias inmunoestimuladoras y di nucleótidos CpG particulares no metilados dentro de bases especificas de flanqueo (referidas como porciones CpG) y 2) el ARN de hebra doble ' sintetizado por diversos tipos de virus representan miembros importantes de los componentes microbianos que mejoran las respuestas inmunes. Los ARN sintéticos de hebra doble (ds) tales como el ácido poliinosinico-policitidilico (poly I:C) pueden inducir a las células dendriticas a producir citocinas proliferadoras y expresar altos niveles de moléculas coestimuladoras . Una serie de estudios por Tokunaga and Yamamoto et al. ha demostrado que el ADN bacteriano o los oligodeoxinucleótidos sintéticos incluyen PBMC humano y células de bazo de ratón para introducir el interferón de tipo I (IFN) (revisado en Yamamoto et al., Springer Semin Immunopathol . 22:11-19) . Poly (I:C) se sintetizó originalmente como un inductor potente del IFN de tipo I pero también induce otra citocinas tales como IL-12. El ácido ribonucleico preferido abarca un ARN de hebra doblé de ácido poliinosinico-policitidilico (poly I:C). Los ácidos ribonucleicos y modificaciones de los mismos asi como métodos para su producción se han descrito por Levy, H.B (Methods Enzymol . 1981, 78:242-251), DeClercq, E (Methods Enzymol. 1981, 78:227-236) and Torrence, P.F. (Methods Enzymol 1981; 78:326-331) y referencias en ellos. Los ácidos ribonucleicos adicionales preferidos comprenden polinucleótidos del ácido inosinico y el ácido citidilico tales como poly (I:C) de los cuales dos hebras forma un ARN de hebra doble. Los ácidos ribonucleicos se pueden aislar de organismos . Los ácidos ribonucleicos también se abarcan ácidos ribonucleicos sintéticos adicionales en particular los oligonucleótidos sintéticos poly (I:C) que han resultado resistentes a la nucleasa por modificación de la estructura de fosfodiéster en particular por modificaciones de fosforotioato . En una modalidad adicional la estructura de ribosa del poly (I:C) se reemplaza por una desoxiribosa . Aquellos expertos en la técnica conocen procedimientos para sintetizar los oligonucleótidos sintéticos. En otra modalidad preferida de la invención se encierran moléculas que activan los receptores tipo cuota (TLR) . Se conocen hasta la fecha diez receptores humanos de tipo cuota. Se activan por una diversidad de ligandos . El TLR2 se activan por los péptidoglicanos , lipoproteínas , lipopolisacáridos , ácido lipoteicónico y Zimosan, y un lipopéptido activador del macrófago MALP-2; TLR3 se activan por un ARN de hebra doble tal como poly (I:C); el TLR4 se activa por el lipopolisacárido, ácidos lipoteicoicos y taxol y proteínas de choque por calor tal como la proteína de choque por calor HSP-60 y Gp96; el TLR5 se activa por flagelos bacterianos especialmente la proteína de flagelina; TLR6 se activa por péptido glicanos, TLR7 se activa por compuestos imiquimoides y de imidazoquinolina tales como R-848, loxoribina y bropirimina y TLR9 se activa por el ADN bacteriano en particular CpG u oligonucleótidos . Los ligandos para TLR1 , TLR8 Y TLR10 no se conocen hasta ahora. Sin embargo, los reportes recientes indican que los mismos receptores pueden reaccionar con ligandos diferentes y que están presentes receptores adicionales. La lista anterior de ligandos no es exhaustiva y ligandos adicionales se encuentran dentro del conocimiento de la persona experta en la técnica. En general el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar comprende la secuencia: 5'X1X2CGX3XÍ 3' en donde Xi, X2, 3 y 4 son cualquier nucleótido. Además el oligonucleótido pueden comprender alrededor de 6 hasta 100,000 nucleótidos, preferiblemente alrededor de 6 hasta alrededor de 2000 nucleótidos, más preferiblemente alrededor de 20 alrededor de 2000 nucleótidos, y aun más preferiblemente comprende alrededor de 20 hasta alrededor 300 nucleótidos. Además, el oligonucleótido puede comprender más de 100 hasta alrededor de 2000 nucleótidos, preferiblemente más de 100 hasta alrededor de 1000 nucleótidos, y más preferiblemente más 100 hasta alrededor de 500 nucleótidos.

En una modalidad preferida el oligonucleótido que contiene CpG contiene una o más modificaciones de fosfotioéster de la estructura de fosfato. Por ejemplo, se incluyen dentro del alcance de la presente invención un oligonucleótido que contiene CpG que tiene una o más modificaciones en la estructura de fosfato o que tiene toda la estructura de fosfato modificada, y un oligonucleótido que contiene CpG, en donde una, algunas o todas las modificaciones de la estructura de fosfato de nucleótidos son modificaciones de fosforotioato . El oligonucleótido que contiene CpG también puede ser un ADNc sintético genómico recombinante derivado de plásmidos y de hebras sencilla o doble. Para su uso en la invención actual, los ácidos nucleicos se pueden sintetizar de novo usando cualquiera de diversos procedimientos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, el método de la b-cianoetil fosforamidita (Beaucage, S.L., and Caruthers, M. H., Tet Let 22:1859 (1981)); el método del nucleósido H fosfonato (Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H . , Tet. Let. 27:4051-4054 (1986)); Froehler et al., Nucí. Acid. Res. 14:5399-5407 (1986); Garegg et al., Tet. Let. 27:4055-4058 (1986), Gaffney et al., Tet. Let. 29:2619-2622 (1988)). Estas químicas se pueden efectuar por una diversidad de sintetizadores automatizados de oligonucleótidos disponibles en el mercado. Adicionalmente se pueden producir CpGs en una gran escala en plásmidos (ver Sambrook, T., et al., "Molecular Cloning. ? Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) que después de que se administran a un sujeto se degradan a un oligonucleótido . Los oligonucleótidos se pueden preparar a partir de secuencias existentes de ácido nucleico (por ejemplo, genómico o ADNc) usando técnicas conocidas tales como aquellas que emplean enzimas de restricción, exonucleasas o endonucleasas . Las substancias inmunoestimuladoras, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores asi como el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar se puede enlazar al VLP por cualquier forma conocida en el arte, con tal de que la composición mejore una respuesta inmune en un animal. Por ejemplo el oligonucleótido se puede enlazar covalentemente o no covalentemente. Además, el VLP puede encerrar completa o parcialmente las substancias inmunoestimuladoras, los ácidos nucleicos inmunoestimuladores asi como el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar. Preferiblemente el ácido nucleico inmunoestimulador asi como el oligonucleótido sin metilar que contiene CpG, se puede enlazar a un sitio VLP tal como un sitio de enlace de oligonucleótido (ya sea naturalmente o que no se presenta naturalmente) , un sitio de enlace de ADN o un sitio de enlace de ARN . En otra modalidad, el sitio VLP comprende una repetición rica en arginina o una repetición rica en lisina. Un uso especifico para las composiciones de la invención es activar las células dendriticas para el propósito de mejorar una respuesta inmune especifica contra los antigenos. Las células dendriticas se pueden mejorar usando técnicas ex vivo o in vivo. El procedimiento ex vivo se puede usar en células autólogas o heterologas pero se usa preferiblemente en células autólogas. En modalidades preferidas, las células dendriticas se aislan de la sangre periférica o la médula ósea pero se pueden aislar de cualquier fuente de células dendriticas. La manipulación ex vivo de células dendriticas para los propósitos de inmunoterapia de cáncer se han descrito en diversas referencias en el arte incluyendo Engleman, E.G., Cytotechnology 25:1 (1997), Van Schooten, W., et al., Molecular Medicine Today, junio, 255 (1997); Steinman, R.M., Experimental Hematology 24 :849 (1996); and Gluckman, J. C, Cytokines, Cellular and Molecular Therapy 3: 187 (1997). Las células dendriticas también pueden hacer contacto con las composiciones de la invención usando métodos in vivo. Con objeto de lograr esto, los CpGs se administran en combinación con el VLP mezclado con antigeno directamente a un sujeto que necesita de inmunoterapia. En algunas modalidades se prefiere que los VLPs/CpGs se administren en la región local del tumor que se puede lograr en cualquier forma conocida en el arte por ejemplo, inyección directa en el tumor.

En una modalidad adicional muy preferida de la presente invención, el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar comprende o consiste alternativamente esencialmente de, o consiste alternativamente de la secuencia GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: -122) . La última se encontró previamente que podía estimular las células de sangre in vitro (Kuramoto E. et al., Japanese Journal Cáncer Research 83, 1128-1131 (1992). En otra modalidad preferida de la presente invención, la substancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG sin metilar, en donde la porción CpG del oligonucleótido que contiene CpG son metilar es parte de una secuencia palindrómica . Preferiblemente la secuencia palindrómica es GACGATCGTC (SEQ ID NO: 105) . En otra modalidad preferida la secuencia palindrómica está flanqueada en su terminación 3' y en su terminación 5' por menos de 10 entidades de guanosina en donde preferiblemente la secuencia palindrómica es GACGATCGTC (SEQ ID NO: 105) . En una modalidad adicional preferida la secuencia palindrómica se flanquea en su terminación N por al menos 3 o como máximo 9 entidades de guanosina, y en donde la secuencia palindrómica se flaquea en su terminación C por al menos 6 como máximo 9 entidades de guanosina. Estas substancias inmunoestimuladoras de la invención se ha encontrado inesperadamente que se empacan muy eficientemente en las VLP. La capacidad de empaque se mejora con ello en comparación con la substancia inmunoestimuladora correspondiente que tiene la secuencia GACGATCGTC (SEQ ID NO: 105) flanqueada por 10 entidades de guanosina en las terminaciones 5' y 3' . En una modalidad preferida de la presente invención, la secuencia palindrómica comprende, o consiste alternativamente esencialmente de, o consiste alternativamente de, o es GACGATCGTC (SEQ ID NO: 105), en donde la secuencia palindrómica está flanqueada en su terminación 5' por al menos 3 o como máximo 9 entidades de guanosina y en donde la secuencia palindrómica está flanqueada en su terminación 3' por al menos 6 y como máximo 9 entidades de guanosina. En una modalidad adicional muy preferida de la presente invención, la substancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido sin metilar que contiene CpG, en donde la porción CpG del oligonucleótido que contiene CpG sin metilar es parte de una secuencia palindrómica en donde el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada de (a) GGGGACGATCGTCGGGGGG ( (SEQ ID NO: 106) ; y se abrevia típicamente en la presente como G3 -6), (b) GGGGGACGATCGTCGGGGGG ( (SEQ ID NO: 107) , y se abrevia típicamente en la presente como G4 -6), (c) GGGGGGACGATCGTCGGGGGG ( (SEQ ID NO : 108); y se abrevia típicamente en la presente como G5 -6), (d) GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG ( (SEQ ID NO: 109); y se abrevia típicamente en la presente como G6-6) , (e) GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG ((SEQ ID NO: 110); y se abrevia típicamente en la presente como G7-7), (f) GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG ((SEQ ID NO: 111); y se abrevia típicamente en la presente como G8-8), (g) GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG ( (SEQ ID NO: 112); y se abrevia típicamente en la presente como G9-9) , y (h) GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGG ( (SEQ ID NO: 113); y se abrevia típicamente en la presente como G6) . En una modalidad adicional preferida de la presente invención, la substancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG sin metilar, en donde la porción CpG del oligonucleótido que contiene CpG sin metilar es parte de una secuencia palindrómica, en donde la secuencia palindrómica es GACGATCGTC (SEQ ID NO: 105), y en donde la secuencia palindrómica es su terminación 5' de al menos 4 y como máximo 9 entidades de guanosina y en donde la secuencia palindrómica esta flanqueada en su terminación 3' de al menos 6 y como máximo 9 entidades de guanosina. En una modalidad adicional preferida de la presente invención, la substancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG sin metilar, en donde la porción CpG del oligonucleótido que contiene CpG sin metilar es parte de una secuencia palindrómica en donde el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada de (a) GGGGGACGATCGTCGGGGGG ( ( SEQ ID NO: 107) , y se abrevia típicamente en la presente como G4 -6) (b) GGGGGGACGATCGTCGGGGGG ( (SEQ ID NO: -108) , y se abrevia típicamente en la presente como G5 -6) (c) GGGGGGGACGATCGTCGGGGG ( (SEQ ID NO: 109) ; y se abrevia típicamente en la presente como G6 -6) (d) GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG ( (SEQ ID NO : 110), y se abrevia típicamente en la presente como G7 -7) (e) GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG ( (SEQ ID NO: 111), y se abrevia típicamente en la presente como G8-8) (f) GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG ( (SEQ ID NO: 112), y se abrevia típicamente en la presente como G9-9) . En una modalidad adicional preferida de la presente invención, la substancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG sin metilar, en donde la porción CpG . del oligonucleótido que contiene CpG sin metilar es parte de una secuencia palindrómica en donde la secuencia palindrómica es GACGATCGTC (SEQ ID NO: 105), y en donde la secuencia palindrómica está flanqueada en su terminación 5' de al menos 5 y como máximo 8 entidades de guanosina y en donde la secuencia palindrómica está flanqueada en su terminación 3' de al menos 6 y como máximo 8 entidades de guanosina.

Los datos experimentales muestran que la facilidad de empaque de las substancias inmunoestimuladoras de la invención preferidas esto es¿ los oligonucleótidos que contiene CpG sin metilar y palindrómicos flanqueados por guanosina, e donde la secuencia palindrómica es GACGATCGTC (SEQ ID NO: 105), y en donde la secuencia palindrómica se flanquea en su terminación 3' y su terminación 5' por menos de 10 entidades de guanosina en VLP se incrementan si las secuencias palindrómicas se flanquean por menores entidades de guanosina. Sin embargo, la disminución del número de entidades de guanosina que flanquea las secuencias palindrómicas conduce a la disminución de las células lineas estimuladoras in vitro. Asi, La capacidad de empaques se paga por una actividad biológica disminuida de las substancias inmunoestimuladoras de la invención indicadas. Las modalidades preferidas representa asi, un compromiso entre la capacidad de empaque y la actividad biológica. En otra modalidad preferida de la presente invención, la substancia inmuoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG sin metilar en donde la porción CpG del oligonucleótido que contiene CpG sin metilar es parte de una secuencia palindrómica en donde el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar tiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada de (a) GGGGGGACGATCGTCGGGGGG ((SEQ ID NO: 108), y se abrevia típicamente en la presente como G5-6) ; (b) GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG ( (SEQ ID NO : 109) y se abrevia típicamente en la presente como G6-6) ; (c) GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG ( (SEQ ID NO: 110), y se abrevia típicamente en la presente como G7-7); (d) GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG ( (SEQ ID NO: 111), y se abrevia típicamente en la presente como G8-8). En una modalidad muy preferida de la presente invención, la substancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido sin metilar que contiene CpG en donde la porción CpG del oligonucleótido que contiene CpG sin metilar es parte de una secuencia palindrómica en donde el no metilado tiene la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 111, esto es la substancia inmunoestimuladora es G8-8. Como se menciona arriba la secuencia óptima usada para empacarse en las VLP es un compromiso entre la capacidad de empaque y la actividad biológica. Al tomar esto es consideración, la substancia inmunoestimuladora G8-8 es una modalidad adicional muy preferida de la presente invención ya que es biológicamente altamente activa mientras que está razonablemente bien empacada. .- · La composición de la invención comprende además un antígeno o determinante antigénico mezclado con la partícula de tipo virus modificada. La invención proporciona composiciones que varían de acuerdo con el antígeno o el determinante antigénico seleccionado en consideración del efecto terapéutico deseado. Los determinantes antigénicos o antigeno adecuados para su uso en la presente invención se describen en WO 00/32227, en O 01/85208 y en WO 02/056905, las descripciones de la cual se incorporan aquí como referencia en sus totalidades . El antigeno puede ser cualquier antigeno de procedencia conocida o aun desconocida. Se puede aislar de bacterias virus u otros patógenos, tumores o árboles, pastos, yerbas, plantas, hongos, mohos, ácaros del polvo, alimentos o animales desconocidos que disparen respuestas alérgicas en pacientes en civilizados. Alternativamente el antigeno puede ser un antigeno recombinante obtenido de la expresión de la codificación adecuadas del ácido nucleico para ellos. En una modalidad preferida el antigeno es un antigeno recombinante. La selección del antigeno es por supuesto dependiente de la respuesta inmunologica deseada en el hospedador. La presente invención aplica una amplia variedad de antigeno. En una modalidad preferida, el antigeno es una proteina, polipéptido o péptido. Los antigenos de la invención se pueden seleccionar del grupo que consiste de los siguientes: (a) polipéptidos adecuados para inducir una respuesta inmune contra células de cáncer; (b) polipéptidos adecuados para inducir una respuesta inmune contra enfermedades infecciosas; (c) polipéptidos adecuados para inducir una respuesta inmune contra alérgenos (d) polipéptidos adecuados para inducir una respuesta inmune en animales de granja o mascota; (e) carbohidratos presente naturalmente en los polipéptidos y (f) fragmentos (por ejemplo, un dominio) de cualquiera de los polipéptidos establecidos en (a) -(e)-. . . Los antigenos preferidos incluye aquellos de un patógeno (por ejemplo virus, bacterias, parásitos, hongos) tumores (especialmente antigenos asociados con tumor o marcadores de tumor) y alérgicos. Otros antigenos preferidos son autoantigenos y antigenos mismos respectivamente. En modalidades específicas descritas en los ejemplos, el antígeno es un veneno de abeja. Hasta el 3% de la población es alérgica al veneno de abeja y es posible sensibilizar ratones al veneno de abeja con objeto de hacerlos alérgicos. Así, el veneno de abeja es una mezcla ideal de alérgenos que permite el estudio de respuestas inmunes inducidas por tales mezclas en la presencia o ausencia de diversos adyuvantes tales como VLP empacados con CpG (ver en otros ejemplo 4 y ejemplo 9) . En algunos ejemplos las VLP que contienen el péptido p33 -·. se usaron. Se debe observar que las VLP que contienen el péptido p33 se usaron solamente por razones de conveniencia y que las VLP de tipo silvestre pueden usarse similarmente en la presente invención. El péptido p33 derivado del virus coriomeningitis linfocítico (LCMV) . El péptido p33 representa uno de los epítopos CTL mejor estudiados (Pircher et al., "Tolerance induction in double specific T cell receptor transgenic mice varíes with antigen," Nature 342:559 (1989); Tissot et al., "Characterizing the functionality of recombinant T-cell receptors in vitro: a -pMHC tetramer based approach, " J Immunolo Methods 236:147 (2000); Bachamann et al., "Four types of Ca2+ signáis after stimulation of naive T cells with T cell agonists, partial agonists and antagonists, " Eur. J. Immunol . 27:3414 (1997); Bachmann et al., "Functional maturation of an anti-viral cytotoxic T cell response," J. Virol. 71:5764 (1997); Bachmann et al., "Peptide induced TCR-down regulation on naive T cell predicts agonist/partial agonist properties and strictly correlates with T cell activation," Eur. J. Immunol. 27:2195 (1997); Bachmann et al., "Distinct roles for LFA-1 and CD28 during activation of naive T cells: adhesión versus costimulation, " Immunity 7:549 (1997)). Las células T específicas de p33 se ha demostrado que inducen una enfermedad diabética letal en los ratones transgénicos (Ohashi et al., "Ablation of ^tolerance' and induction of diabetes by virus infection in viral antigen transgenic mice" Cell 65:305 (1991)) así como que pueden prevenir el crecimiento de células de tumor que expresan p33 (Kündig et al., "Fibroblasts act as efficient antigen-presenting cells in lymphoid organs," Science 268:1343 (1995); Speiser et al., "CTL tumor therapy specific for an endogenous antigen does not cause autoimmune disease," J. Exp. Med. 186:645 (1997)). Este epitopo específico por lo tanto es particularmente bien adecuado para estudiar la autoinmunidad, inmunología de tumores así como enfermedades virales. · ¦ « En una modalidad específica de la invención, el antígeno o determinante antigénico es uno que es útil para la prevención de la enfermedad infecciosa. Tal tratamiento será útil para tratar una variedad de enfermedades infecciosas que afectan un amplio rango de hospedadores por ejemplo, humanos, vacas, ovejas, cerdos, perros, gatos, otras especies de mamíferos y también especies que no son de mamíferos. Las enfermedades infecciosas son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, y los ejemplos incluyen infecciones de etiología viral tales como VIH, influenza, Herpes, hepatitis viral, Epstein Bar, polio, encefalitis, viral sarampión, viruela, virus del papiloma, etc., o infecciones de etiología bacteriana tales como neumonía y tuberculosis, sífilis, etc. o infecciones de etiología de parásito tales como paludismo, tripanosomiasis, leismaniasis , tricomoniasis, ámibiasis, etc. Así, los antígenos o determinantes antigénicos seleccionados para las composiciones de la invención serán bien conocidos por aquellos en las artes medicas, ejemplos de los antígenos o determinantes antigénicos incluyen los siguientes: los antígenos del VIH gpl40 y gpl60; los antigenos de influenza hemaglutinina, proteina M2 y neuraminidasa , antigeno de superficie de hepatitis B o proteina de núcleo circumsporozoita de malaria o fragmentos de las mismas. Como se . discutió arriba, los antigenos incluyen microbios infecciosos tales como virus, bacterias y hongos y fragmentos de los mismos derivados de fuentes naturales o sintéticamente. Los virus infecciosos de vertebrados humanos o no humanos incluyen retrovirus, virus del ARN y virus del AD . El grupo de retrovirus incluye retrovirus sencillos y retrovirus complejos. Los retrovirus sencillos incluyen los subgrupos de retrovirus de tipo B retrovirus de tipo C y retrovirus de tipo D. Un ejemplo de retrovirus de ejemplo B es el virus de tumor mamario de ratón (MMTV) . Los retrovirus de tipo C incluyen los subgrupos grupo A tipo C (que incluye el virus del sarcoma de Rous (RSV) , virus de leucemia de las aves (ALV) y virus de mieloblastosis de las aves (A V) ) y del grupo B tipo C (que incluye virus de leucemia murino ( LV) , virus de leucemia de felinos (FeLV) , virus de sarcoma murino (MSV) , virus de leucemia del mono gibón (GALV) , virus de necrosis del bazo (SNV) , virus de retículo endoteliosis (RV) y virus del sarcoma de simios (SSV) ) . Los retrovirus de tipo D incluyen el virus del mono Mason-Pfizer (MPMV) y el retrovirus simio de tipo 1 (SRV-1) . Los retrovirus complejos incluyen los subgrupos de los lentivirus, virus de leucemia de células T y los virus esponjosos. Los lentivirus incluyen el VIH-1 pero también incluyen el VIH-2, SIV, virus Visna, virus de inraunodeficiencia de felino (FIV) y virus de anemia infecciosa de equino (EIAV) . Los virus de leucemia de células T incluyen HTLV-1, HTLV-II, virus de leucemia de células T de simios (STLV) y virus de leucemia de bovino (BLV) . Los virus espumosos incluyen virus espumoso humano (HFV) , virus espumoso de simios (SFV) , y virus espumosos de bovino (BFV) .

Los ejemplos de los virus de ARN que son antigenos en animales vertebrados incluyen pero no se limitan a los siguientes: miembros de la familia Reoviridae que incluyen el género Ortoreovirus (serotipos múltiples de retrovirus de mamífero y de aves), el género Orbivirus (virus Bluetongue, virus Eugenangee, virus Kemerovo, virus de la enfermedad del caballo africano y virus de la fiebre Colorado Tick) , el género rotavirus (rotavirus humano) , virus de diarrea de becerro de Nebraska, rotavirus murino, rotavirus de simio, rotavirus de bovino o de ovino, rotavirus de aves), la familia Picomaviridae, incluyendo los géneros enterovirus (virus de la polio, virus A y B de Coxsackie, virus huérfano humano citopático entérico (ECHO), virus de la hepatitis A, C, D, E Y G, enterovirus de simios, virus de encefalomielitis de murina (ME) , virus de polio, enterovirus de bovino, enterovirus porcino, el género cardiovirus (virus de la encefalomielitis (EMC) , mengovirus) , el género Rhinovirus (rinovirus humano que incluye al menos 113 subtipos, otros rinovirus), el género Apthovirus (enfermedad de los pies y la boca (FMDV) ; la familia Calciviridae, incluyendo el exantema vesicular del virus de los cerdos, virus de león marino de San Miguel, picornavirus felino y virus Norwalk, ¦ la familia Togaviridae incluyendo el género alfavirus (virus de encefalitis equina oriental, virus del bosque Semliki, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus O' yong-Nyong, Virus Ross river, virus de la encefalitis equina Venezolana, virus de la encefalitis equina occidental), el género Flavirius ( virus de la fiebre amarilla transportada por mosquitos, virus del dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis Murria Valley, virus West Nile, virus Kunjin, virus transportado por la garrapata de Europa Central, virus transportado por la garrapata del lejano oriente, virus del bosque Kyasanur, virus Louping III, virus Powassan, virus de fiebre hemorrágica de Omsk) , el género Rubivirus (virus de la Rubéola) , el género pestivirus (virus de la enfermedad de la mucosa, virus del cólera porcino, virus de la enfermedad de Border):, la familia Bunyaviridae incluyendo el género Bunyvirus (virus Bunyamware y virus relacionado, virus del grupo de la encefalitis de California) , el género' flebovirus (virus siciliano de la fiebre de la mosca de la arena, virus de la fiebre del valle Rift) , el género Nairovirus (virus de la fiebre hemorrágica del Congo y de Crimea, virus de la enfermedad de las ovejas de Nairobi, y el género Uukuvirus (virus Uukuniemi y virus relacionados) , la familia de Orthomyxoviridae incluyendo el virus del género de la influenza (virus . de influenza tipo A, muchos subtipos humanos), virus de la influenza de los cerdos y virus de la influenza Aviaria y equina, influenza tipo B (muchos subtipos humanos) e influenza tipo C (género posible separado); la familia de paramyxoviridae incluyendo el género Paramyxovirus (virus tipo 1 de la parainfluenza , virus Sendai, virus de Hemadsorción, virus de la parainfluenza tipos 2 a 5, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la paperas) , el género Morbillivirus (virus del sarampión, virus de la panencefalitis subaguda esclerotizante, virus del destemple, virus Rinderpest) , el género de neumovirus (virus sincitial respiratorio (RSV) , virus sincitial respiratorio de bovinos y virus de la neumonía de ratones), virus del bosque, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus O' Nyong-Nyong, virus Ross river, virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la . encefalitis equina occidental) , el género Flavirius ( virus ¦ de la fiebre amarilla transportada por mosquitos, virus del dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis Murria Valley, virus West Nile, virus Kunji, virus transportado por la garrapata de Europa Central, virus transportado por la garrapata del lejano oriente, virus del bosque Kyasanur, virus Louping III, virus Powassan, virus de fiebre hemorrágica de Omsk) , el género Rubivirus (virus de la Rubéola) , el género pestivirus (virus de la enfermedad de la mucosa, virus del cólera porcino, virus de la 'enfermedad de Border) , la familia Bunyaviridae incluyendo el género Bunyvirus (virus Bunyamware y virus relacionado, virus del grupo de la encefalitis de California) , el género flebovirus (virus siciliano de la fiebre de la mosca de la arena, virus de la fiebre del valle Rift) , el género Nairovirus (virus de la fiebre hemorrágica del Congo y de Crimea, virus de la enfermedad de las ovejas de Nairobi, y el género Uukuvirus (virus Uukuniemi y virus relacionados) , la familia de Orthomyxoviridae incluyendo el virus del género de la influenza (virus de influenza tipo A, muchos subtipos humanos) , virus de la influenza de los cerdos y virus de la influenza Aviaria y equina, influenza tipo B (muchos subtipos humanos) e influenza tipo C (género posible separado) ; la familia de paramyxoviridae incluyendo el género Paramyxovirus (virus tipo 1 de la parainfluenza, virus Sendai, virus de Hemadsorción, virus de la parainfluenza tipos 2 a 5, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de las paperas) , el género Morbillivirus (virus del sarampión, virus de la panencefalitis subaguda esclerotizante, virus del destemple, virus Rinderpest) , el género de neumovirus (virus sincitial respiratorio (RSV) , virus sincitial respiratorio de bovinos y virus de la neumonía de ratones), la familia de los rabdovirus incluyendo el género Vesiculovirus (VSV) , virus Chandipura, virus Flanders-Hart Park) , el género Lyssavirus (virus de la rabia) , rabdovirus de los peces, y filovirus-(virus Marburg y virus Ebola) , la familia Arenaviridae incluyendo el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCM) , complejo del virus Tacaribe y virus Lassa, la familia Coronoaviridae incluyendo el virus de la bronquitis infecciosa (IBV) , virus de la hepatitis de ratón, virus corona entérico humano y peritonitis infecciosa de felino (coronavirus de felino) . Los virus ilustrativos de ADN que son antígenos en animales invertebrados incluyen pero no se limitan a la familia Poxviridae incluyendo el género Orthopoxvirus (viruela mayor, viruela menor, vacuna de viruela de monos, viruela de la vaca, viruela del búfalo, viruela del conejo, ectromelia) , los géneros Leporipoxvirus (Myxoma, Fibroma) , los géneros de viruelas de virus de aves (viruela de las aves de corral, otros virus de viruela de aves), el género de Capripoxvirus (viruela de las ovejas, viruela de las cabras) , el género Suipoxvirus (viruela de los cerdos), el género Parapoxvirus (virus de la dermatitis postular contagiosa, seudo viruela de las vacas, virus de estomatitis popular de bovino) , la familia Iridoviridae (virus de la fiebre de cerdo africano, virus de la rana 2 y 3, virus de la linfocistisis de peces), la familia de los virus del herpes incluyendo el virus del herpes alfa (herpes simples tipos 1 y 2, varicela-soster, virus del aborto equino, virus 2 y 3 del herpes equino, virus de pseudorabia, virus de queratoconjuntivitis de bovino infecciosa, virus de rinotraqueitis de felino infecciosa, virus de rinotraqueitis de felino, virus de laringotraqueitis infecciosa) , el virus del herpes beta ( citomegalovirus humano y citomegalovirus de cerdos, monos y roedores), los virus del herpes gamma (virus Epstein-Barr (EBV) , virus de la enfermedad de Marek, herpes Saimirí, átelos del virus del herpes, Herpes virus Sylvilagus, virus del herpes de conejillos de indias, virus del tumor de Lucke) ; la familia de Adenoviridae, incluyendo el género Mastadenovirus (subgrupos humanos A, B, C, D Y E y sin agrupar; adenovirus de simios (al menos 23 serotipos) , hepatitis infecciosa canina y adenovirus del ganado, cerdos, ovejas, ranas y muchas otras especies, el género de los virus aviadeno (adenovirus de las aves) , y adenovirus que no se cultivan; la familia Papoviridae incluyendo el género del papiloma virus (virus del papiloma humano, virus del papiloma bovino, virus del papiloma de conejo Shope y diversos virus de papiloma patogénico de otras especies), el género Polyomavirus (polioma virus, agente vacuolante de simios (SV-40), agente vacuolante de conejo (RKV) , virus K, virus BK, virus JC y otros virus de polioma primate tales como papiloma linfotrófico) , la familia parvoviridae incluyendo el género asociado con adeno, el género parvorirus (virus de la panleucopenia de felinos, parvovirus bovino, parvovirus canino, virus de. la- enfermedad del mink de las Aleutianas, etc.) . Finalmente, los virus de ADN pueden incluir virus que no se ajustan en las familias anteriores tales como virus de la enfermedad de Kuru y Creutzfeldt-Jacob y agentes neuropáticos infecciosos crónicos (virus CHINA) . Cada una de las listas anteriores es ilustrativa, y no se pretende que sea limitativa. En una modalidad especifica de la invención, el antigeno comprende uno o más epitopos de las células T citotóxicas, epitopos de células Th, o una combinación de epitopos de células T citotóxicas y epitopos de células Th. Además de mejorar una respuesta inmune especifica de antigenos en humanos, los métodos de las modalidades preferidas son particularmente adecuados para el tratamiento de otros mamíferos u otros animales por ejemplo aves tales como gallinas, pollos, pavos, patos, gansos, codornices y faisanes. Las aves son los objetivos primarios de muchos tipos de infecciones. Un ejemplo de una infección común en pollos es la enfermedad de la anemia infecciosa del pollo (CIAV) . El CIAV se aisló primero en Japón en 1979 durante una investigación de un brote de la vacunación de la enfermedad de Marek (YuaSA et al., Avian Dis. 23:366-385 (1979)). Desde ese tiempo, El CIAV se ha detectado en las aves comerciales y en todos los países productores comerciales principales de aves (van Vulgo et al., pp. 690-699 in "Diseases of Poultry", 9th- editiony Iowa State University Pres 1991) ¦- ¦ ; La vacunación de aves como otros animales vertebrados se puede efectuar a cualquier edad. Normalmente las vacunaciones se efectúan hasta las 12 semanas de edad para un microorganismo vivo y entre 14 y 18 semanas para un microorganismo inactivado u otro tipo de vacuna. Para una vacunación in ovo la vacunación se puede efectuar en el último trimestre del embrión. La vacuna se puede administrar subcutáneamente por rocío, oralmente, intraocularmente, intratecalmente, nasalmente in ovo o por otros métodos aquí descritos. El ganado y las reses también son susceptibles a la infección. La enfermedad que afecta a estos animales puede producir severas pérdidas económicas, especialmente entre las reses . Los métodos de la invención se pueden usar para proteger contra la infección en ganado tales como vacas, cab llos, cerdos, ovejas y cabras. Las vacas se pueden infectar por virus de bovino. El virus de diarrea viral de bovino (BVDV) , es un virus de ARN de hebra positiva envuelto pequeño y se clasifica junto con el virus de cólera porcino (HOCV) y el virus de la enfermedad de frontera de las ovejas (BDV) , en los géneros de los virus de la peste. Aunque los virus de la peste se clasifican previamente en la familia Togaviridae, algunos estudios han sugerido se reclasificación dentro de la familia Flaviviridae junto con el flavivirus y los grupos de la hepatitis de los virus C (HCV) . El virus del herpes equino (EHV) comprende un grupo de diferentes agentes biológicos antigénicamente que provocan una diversidad de infecciones en caballos que van desde la enfermedad subclinica hasta fatal. Estos incluyen el herpes 1 de equino (EHV-1), un patógeno particular en los caballos. El EHV-1 se asocia con la epidemia de aborto, enfermedad del tracto respiratorio, y trastornos del sistema nerviosos central. Otros EHV incluyen EHV-2, o el citomegalovirus del equino, EHV-3, virus del exantema costal del equino y EHV-4 clasificado previamente como el subtipo de EHV-1. Las ovejas y las cabras se pueden infectar por una biodiversidad de microorganismos peligrosos que incluyen los visna-maedi . Los primates tales como los monos, simios y macacos se pueden infectar por un virus de inmunodeficiencia de simios. Las vacunas para inmunodeficiencia de simios enteras, libres de células y virus con células inactivados se han reportado que otorgan protección a los macacos (Stott et al., Lancet 36:1538-1541(1990); Desrosiers et al., PNAS USA 86:6353-6357 (1989) ; Murphey-Corb et al., Science 246:1293-1297 (1998); and Carlson et al., AIDS Res. Human Retroviruses 6:1239-1246 (1990) ) . Una vacuna gpl20 del VIH recombinante se ha reportado que otorga protección a los chimpancés (Berman et al., Nature ,345 : 622-625 (1990)). . . . . Los gatos tanto domésticos como silvestres, son susceptibles a una infección por una diversidad de microorganismos. Por ejemplo, la peritonitis infecciosa de los felinos es una enfermedad que se presenta en los gatos domésticos y silvestres tales como leones, leopardos, chitas y jaguares. Cuando es deseable evitar la infección con este y otros tipos de organismos patogénicos en los gatos, se pueden usar los métodos de la invención para vacunar los gatos para prevenirlos contra la infección. Los gatos domésticos se pueden infectar con diversos retrovirus incluido pero no limitado al virus de leucemia de felinos (FeLV), virus del sarcoma felino (FeSV) o un oncomavirus de tipo C endógeno (RD-114), y virus formador de la sincitia en felinos (FeSFV) . El descubrimiento del lentivirus linfotrópico T de felinos (también referido como inmunodeficiencia en felinos) se reportó primero en Pederser et al., Science 235:790-793 (1987). La peritonitis infecciosa de felinos (FIP) es una enfermedad esporádica que se presenta de manera no predecible en los felinos domésticos y silvestres. Aunque le (FIP) es principalmente una enfermedad de los gatos domésticos, se ha diagnosticado en leones, leones de la montaña, leopardos, chitas y jaguar. Los gatos salvajes más pequeños que han padecido el FIP incluyen el lince y el caracal/ para el gato de arena y el gato pallas. Las enfermedades virales y -bacterianas en peces con aletas, mariscos u otra forma de vida acuática plantean un gran problema para la industria de la acuacultura. Debido a la gran densidad de animales en los tanques de cultivo o en las áreas de granjas marinas encerradas, las enfermedades infecciosas pueden erradicar una gran proporción de la reserva en por ejemplo instalaciones en peces de aletas, mariscos u otras formas de vida acuáticas. La prevención de la enfermedad es un remedio más deseado para estas amenazas para los peces que la intervención una vez que la enfermedad está en proceso. La vacunación del pez es el único método preventivo que puede ofrecer una protección de largo plazo a través de la inmunización. Las vacunas basadas en ácidos nucleicos de los peces se describen por ejemplo en la patente EUA No. 5, 780,448. El sistema inmune de los peces tiene muchas c-aracterísticas. parecidas al sistema inmune de los mamíferos tales como la presencia de células B, células T, linfocinas, complemento e inmunoglobulina . Los peces tienen subclases de linfocitos con roles similares en muchos aspectos a aquellas células T y B de mamíferos. Las vacunas se pueden administrar oralmente, por inmersión o inyección. Las especies de acuacultura incluyen pero no se limitan a peces de aletas, mariscos y otros animales acuáticos. Los peces de aletas incluyen todos los peces invertebrados que pueden ser peces, óseos o cartilaginosos, tales como por ejemplo salmones, carpas, bagres, cola amarilla, el besugo y el róbalo. Los salmónidos son una familia de peces de aleta que incluyen a la trucha (incluyendo la trucha arco iris), el salmón y la trucha de escamas del ártico. Los ejemplos de los mariscos incluyen pero no se limitan a almejas, langosta, camarón, cangrejo y ostiones. Otros animales acuáticos cultivados incluyen pero no se limitan a las anguilas, calamares y pulpos. Los polipéptidos de los patógenos de acuacultura viral incluyen pero no se limitan a la glicoproteina o nucleoproteina del virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV) ; proteínas G o N del virus de necrosis hematopoyética (IHNV) ; VP1, VP2, VP3, o N proteínas estructurales del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV); proteína G de la viremia de primavera de la carpa (SVC) ; y una proteína asociada a la membrana, tegumina o proteína cápsida o glicoproteina del virus de bagre de canal (CCV) . Los polipéptidos de patógenos bacterianos incluyen pero no se limitan a una proteína de membrana exterior regulada por el hierro (IROMP), una proteína de membrana exterior (O P) y una proteina A de Aeromonis salmonicida que provoca la furunculosis, la proteína p57 de Renibacterium salmoninarum que provoca la enfermedad bacteriana del riñon (BKD) , antígeno asociado con la superficie principal (msa) , una citotoxina expresada en la superficie, (mpr) , una hemolisina expresada en la superficie (ish) , y un antígeno flagelar de Yersiniosis; una proteína extracelular (ECP) , una proteína de membrana exterior regulada por el hierro (IROMP) y una proteína estructural de Pasteurellosis , una OMP y una proteína flagelar de Vibrosis anguillarum y V. ordalii, una proteína flagelar, una proteína OMP, aroA and purA de edwardsiellosis ictaluri and E. tarda, y un antígeno de la superficie de Ictioftirius, y un proteína estructural y regulatoria de cytophaga columnari , y una proteína estructural y regulatoria de Rickettsia. Los polipéptidos de patógenos de parásitos incluyen pero no se limitan a los antígenos de superficie de Ichtyophtririus . En otro aspecto de la invención, se suministran composiciones de vacunas adecuadas para su uso en métodos para prevenir y/o atenuar enfermedades o condiciones que se provocan o se exacerban por productos de "auto"genes (por ejemplo factores de necrosis de tumor). Así, las composiciones de vacuna de la invención incluyen composiciones que conducen a la producción de anticuerpos que evitan y/o atenúan enfermedades o condiciones provocadas o exacerbadas por productos de "auto"genes. Los ejemplos de tales enfermedades o condiciones incluyen enfermedad de injerto contra hospedador, reacciones alérgicas mediadas por IgE anafilaxis, síndrome de distensión respiratoria en adultos, enfermedad de Crohn, asma alérgica, leucemia linfoblástica aguda (ALL) linfoma que no es Hodgkin (NHL) , enfermedad de Grave, lupus eritematoso sistémico (SLE) , enfermedades autoinmunes inflamatorias, miastenia gravis, enfermedad inmunoproliferativa de linfoadenopatía (ILP), linfoadenopatía angioinmunoproliferativa (AIL) , linfoadenopatía de inmunoblastos (IBL), artritis reumatoide, diabetes, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer y osteoporosis . En modalidades específicas relacionadas, las composiciones de la invención son un innumoterapéutico que se puede usar para el tratamiento y/o prevención de alergias, cáncer o adicción a las drogas. La selección de antígenos o determinantes antigénicos para la preparación de composiciones y para el uso en métodos de tratamiento para alergias se conocería por aquellos expertos en las artes médicas que tratan tales trastornos. Los ejemplos representativos de los antígenos o determinantes antigénicos incluyen los siguientes: fosfolipasa A2 del veneno de la abeja, Amb a 1 (alérgeno del polen de la am risoa), Bet v I (alérgeno del polen' del abedul); 5 Dol m V (alérgeno del veneno del avispón de cara blanca) , Der p 1, Der f 2 and Der 2 (alérgeno de los ácaros del polvo de las casas); Lep d 2 (alérgeno de los ácaros del polvo); Alt a 1, Asp f 1, and Asp f 16 (alérgenos de los hongos),,; Ara h 1,-Ara h 2, and Ara h3 (alérgenos del cacahuate) así como fragmentos de los cuales se puede usar para producir respuestas inmunológicas . Adicionalmente la invención es particularmente útil para el uso de mezclas de alérgenos que se han aislado de organismos o partes de organismos, tales como los extractos de polen o veneno de abeja. En una modalidad preferida, los extractos de polen comprenden o consisten alternativamente de árboles, pastos, hierbas y plantas de jardín. Los ejemplos de los extractos de polen de árboles incluyen pero no se limitan a los siguientes: acacia, aliso (gris), almendra, manzana, albaricoque, árbol de la vida, fresno, álamo, árbol de la cera, haya, abedul (primavera) , abedul (blanco) , arbusto de botella, saúco de caja, árbol del algarrobo, cedro incluyendo pero no limitado al cedro japonés, cereza, avellana, chopo, ciprés, saúco, olmo (Americano) , eucalipto, abeto, aligonero, avellano, cicuta, nogal americano, carpe de lúpulo, palo de hierro, enebro, acacia blanca, maple, melaleuca, mezquite, jeringuilla, moral, roble (blanco), olivo, naranja, naranja osaje, palo verde, durazno, pera, nogal pecanero, árbol de la pimienta, pino, ciruelo, álamo blanco, aligustre, secoya, olivo ruso, pisea, goma dulce, sicómoro, alerce americano, árbol del cielo, nuez y sauce. Ejemplos de los extractos de polen de pasto incluyen pero no se limitan a lo siguientes: bahía, cebada, . aceituna de color gris -claro, agrostis, pasto - de bermuda, hierba azulada y sedosa (Kentucky) , bromo, racimo, pasto canario, bromo, maíz, cañuela (praderas), grama, pasto Johnson, poa de los prados, koeler, avena, pasto del huerto, granilla colorada, agrostis alba, pasto del centeno (perenne), sales, sorgo, sorgo del sudan, pasto bernal dulce, pasto fleo, pasto terciopelo, trigo y pasto de trigo. Ejemplos de los extractos de pastos de jardín y hierbas incluyen pero no se limitan a los siguientes: alfalfa, amaranto, áster, raíz de bálsamo, bassia, mata espinosa del barrón, hiniesta, arbusto de madriguera, hierba descuidada, semilla del ricino, chamise, clavo, mata espinosa de la cizaña, coreopsis, cosmos, narciso, dalia, margarita, diente de león, muñón, hinojo, chamico o liguera loca, gladiolo, vara de San José, madera grasa, cáñamo, madreselva, lúpulo, arbusto de ionodona, roble de Jerusalén, coquia, pata de cordero, lili, magnolia, una variedad del arándano agrio, epazote, artemisa pegajosa, mostaza, ortiga, hierba de encurtido, quenopodio blanco, plántano (inglés) , amapola, hierba de la pobreza, arbusto codorniz, ambrosía (gigante) , ambrosía (corta) , ambrosía (occidental) , rosa, cardo ruso, artemisa, salado, escama, escoba escocesa, sargadilla, acetosa, boca de dragón, remolacha, girasol, grasa de invierno, santónico y ajenjo. En una modalidad preferida los extractos de polen comprenden o consisten alternativamente de centeno.- - La aparición estacional de polen de ambrosia (septiembre-Octubre) produce el asma en muchos individuos (Marshall, J. et al., J. ñllergy Clin. Immunol. 108:191-197 (2201)). El asma se caracteriza por una inflamación pulmonar, obstrucción reversible del flujo de aire y una hiperrespuesta de las vías aéreas. Una cascada compleja de respuestas inmunológicas a los aeroalergenos conduce a un reclutamiento de leucocitos en las vias aéreas. Específicamente los linfocitos, macrófagos, eosinófilos, neutrófilos, células de plasma y mastocitos se infiltran en la mucosa bronquial (Redman, T. et al., Exp. Luna Res. 27:433-451 (2001)). El reclutamiento de eosinófilos se asocia con la producción creciente de las citocinas TH2 IL-4 y IL-5, factores claves en la patogénesis de plasma que apoyan el proceso inflamatorio crónico (Justice, J et al., Am J. Physiol. Luna Ceel Mol. Physiol 282 : L302-L309 (2002), los contenidos completos de la cual se incorporan aquí como referencia) . El alérgeno inmunodominante de ambrosía en la ambrosía corta [Ambrosia artemisiifolia) es el Amb a 1 (Santeliz, J. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 109:455-462 (2002)). En una modalidad específica de la invención la composición comprende la Amb a 1 mezclada con la partícula de tipo virus (ver el ejemplo 6) . Todavía en otra modalidad preferida, los extractos de polvo comprenden o consisten alternativamente de polvos de „ casa y ácaros jdel, polvo. Los ejemplos -de polvo de casa incluyen pero no se limitan a polvo de casa, polvo de colchones y polvo de tapicería. Los ejemplos de ácaros de polvo incluyen pero no se limitan a D. farniae, D. ptreronysiinus, mezclas de ácaros y L. destructor . Los extractos de polvo incluyen pero no se limitan a cedro y polvo de cedro rojo, polvo de ginebra de algodón, polvo de roble, polvo de grano (elevador), polvo paduk y polvo de madera . Los ácaros del polvo son una fuente importante de alérgenos interiores, perennes en casas en climas húmedos de países desarrollados (Arlian, L., Current Allergy and Asthma Reports 1:581-586 (2001)). Alrededor de 60-85% de todos los pacientes con asma bronquial alérgica se sensibilizan a los ácaros de casa Dermatophogoldes pteronyssinus (Arlian, L., Current Allegy and Asthma Reports 1:581-586 (2001)) . Los alérgenos de ácaros de polvo inmunodominantes de D. pteronyssinus incluyen Der p 1, Der f2r and Der 2 (Kircher, M. et al., J. Allergy Clin. Immunol . 109:517-523 (2002) and Clarke, A. et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 120:126-134 (1999), los contenidos completos de la cual se incorporan en la presente como referencia) . En una modalidad especifica de la invención, la composición comprende los Der p 1, Der f2, Der 2 o fragmentos de los mismos y una mezcla antigénica de los mismos mezclada con la partícula del tipo virus. Una causa . importante » de las causas alérgicas al polvo especialmente en comunidades agrícolas es Lepidoglyphus destructor (Ericksson, T. et al., Clinical and Exp. Allergy 31:1181-1890 (2001)). Un alérgeno del ácaro L . destructor inmunodominante es Lep d 2 (Ericksson, T. et al., Clinical and Exp. Allergy 31:1181-1890 (2001)). En una modalidad específica de la invención, la composición comprende el Lep d 2 mezclado con la partícula de tipo virus (ver ejemplo 8). En una modalidad preferida, los extractos de hongos comprenden o consisten alternativamente de alternaría, aspergillus, botrytis, candida, cephalosporium, cephalothecium, chaetomium, cladosporium, critococcus, curvularia, epicoccum, epidermophyton, fusarium, gelasinospora , geotrichum, gliocladium, helminthosporium, hormodendrum, microsporium, mucor, mycogone, nigraspora, paecilomyces, penicillium, phoma, pullularia, rhizopus, rhodotorula, mohos, saccharomyces , royas, spondylocladium, stemphylium, trichoderma, trichophyton y verticillium. Alternaría alternata se considera que es uno de los hongos más importantes que provoca enfermedades alérgicas en los Estados Unidos. Alternaría es el principal alérgeno asociado con el asma en regiones desérticas de los Estados Unidos y Australia y se ha reportado que provoca lesión respiratoria seria y muerte en el medio oeste de los Estados Unidos (Vailes, L. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 107:641 (2001) and .Shampain, M. et al., Am Rev. Respir. Dis 126:493-498 (1982), los contenidos completos de la cual se incorporan aquí como referencia) . El antígeno inmuno dominante Alternaría alternata es Alt a 1 (Vailes, L. et al., J. Allergy Clin. Immunol 107:641 (2001)). Más del 80% de los individuos sensibilizados con Alternaría tienen un anticuerpo Ig E contra Alt a 1 (Vailes, L. et al., Clinical and Exp. Allergy 31:1891-1895 (2001)). En una modalidad específica de la invención la composición comprende Alt a 1 mezclado con una partícula de tipo virus (ver ejemplo 7). Otros hongos oportunistas son Aspergillus fumigatus, que se involucra en un gran espectro de enfermedades pulmonares que incluyen el asma alérgico. Los antígenos inmunodominantes Aspergillus fumigatus incluyen Asp f 1 and Asp f 16 (vailes, L. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 107:641 (2001)). En una modalidad específica de la invención la composición comprende el Asp f i ó Asp f 16 o una mezcla antigénica del mismo mezclada con una partícula de tipo virus (ver ejemplo 7). Todavía en otra modalidad preferida, los extractos de insectos comprenden o consisten alternativamente de, insectos que pican cuyo cuerpo completo induce reacciones alérgicas, insectos que pican cuyas proteínas de veneno inducen reacciones alérgicas e insectos que inducen reacciones alérgicas inhaladas. Ejemplos de los insectos que pican cuyos cuerpos completos inducen reacciones alérgicas incluyen pero no se limitan a: hormiga (negra), hormiga (roja), hormiga (carpintero), la mezcla de hormigas (roja, negra), hormiga (fuego) . Los ejemplos de los insectos que pican cuyas proteínas de veneno inducen reacciones alérgicas incluyen pero no se limitan a: abejas de miel, avispón amarillo, avispa, chaqueta amarilla, avispón de cara blanco y véspidos mixtos. Ejemplos de los insectos que inducen reacciones alérgicas inaladas incluyen pero no se limitan a: áfidos, mosca negra, mariposa, mosca cadis, cicada/langosta, grillo, cucaracha, una variedad de tábano, mosca de la fruta, abeja de miel (cuerpo completo) , mosca borriquera, mosca doméstica, saltamontes, efímera o mosca de mayo, gorgojo del fríjol mexicano, ácaros (polvo) , mosquito, polilla, mosca de los hongos, mosca gusano de tornillo, bichos de la siembra, arañas y pulgas de agua (ver ejemplo 4) . Todavía en otra modalidad preferida, los extractos de alimentos consisten o comprenden alternativamente de, productos de animales y plantas. Ejemplos de los productos animales incluyen pero no se limitan a res, pollo, venado, pato, huevo (pollo) , pescado, cabra, ganso, cordero, leche (vaca), leche (cabra), puerco, conejo, mariscos y pavo.

Ejemplos de los productos de plantas incluyen pero no se limitan a manzana, albaricoque, maranta, alcachofa, espárrago, aguacate, plátano, frijol, betabel, moras, familia de las coles, zanahoria, apio, cereza, chocolate, frutas cítricas, coco, café, pepino, dátil, berenjena, granos, uvas, verduras, ¦ gomas, lúpulos, lechuga, malta, mango, melón, hongos, nueces, okra, aceitunas, cebolla, papayas, chiviría, chícharo, cacahuate, pera, pimiento, piña, ciruela, papa, ciruela pasa, calabaza, rábano, ruibarbo, especies/condimentos, espinacas, calabacita, tapioca, té, tomate, sandía y levadura. Las alergias a los cacahuates y las nueces de árbol significan la mayoría de reacciones anafilácticas fatales o casi fatales (Sampson H., N. Engl. J. Med. 346 ( 17 ): 1294-1299 (2002)). Alrededor del 1.1% de los americanos o 3 millones de personas son alérgicas a los cacahuates, nueces de árbol o ambos (Sampson H . , N. Engl. J. Med. 346 ( 17 ): 1294-1299 (2002)). Alrededor del 6% de los Americanos tienen evidencias serológicas de sensibilidad a los cacahuates (esto es la presencia de anticuerpos IgE específicos para las proteínas del cacahuate) aunque la mayoría de estas personas no tendrán una presencia de alérgica cuando comen cacahuates (Sampson H., N. Engl. J. Med. 346 (17) : 1294-1299 (2002) and Helm, R. et al., J. Clin. Immunol. 109:136-142 (2002)). La alergia al cacahuate se desarrolla usualmente en una edad temprana, a menudo después de la exposición a la proteina del cacahuate en el útero durante la lactancia o temprano en la niñez con frecuencia un trastorno de por vida (Sampson H., N. Engl . J. Med. 346 (17) : 1294-1299 (2002); Li, X, et al., J. Allergy Clin. Immunol. 108:639-646 (2001); .and Helm, R. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 109:136-142 (2002)). Los niños que tienen alergia a los cacahuates tienden a tener reacciones alérgicas más severas cuando crecen (Sampson H., N. Engl. J. Med. 346(17) :1294-1299 (2002)). Se ha sugerido que la promoción de productos de cacahuate como una fuente nutricional para mujeres embarazadas y en lactancia, ha contribuido a una frecuencia creciente de alergia al cacahuate en los países occidentales (Sampson H., n. Engl. J. Med. 346 (17) : 1294-1299 (2002)). Los síntomas de alergia al cacahuate se pueden presentar entre minutos y unas cuantas horas después de la ingestión del alimento y en casos que amenazan la vida, los síntomas incluyen broncoespasmo severo. Actualmente la alergia del cacahuate consiste en enseñar a los pacientes y sus familias como evitar la ingestión accidental de los cacahuates, como reconocer los síntomas tempranos de la reacción alérgica, y como manejar las etapas tempranas de la reacción anafiláctica (Sampson H., N. Engl. J. Med. 3 6 ( 17 ): 1294-1299 (2002)). Las exposiciones inadvertidas resultan en una reacción alérgica cada 3 a 5 años en el paciente promedio en una alergia al cacahuate (Sarapson H., N. Engl. J. Med. 346 (1 ): 1294-1299 (2002)). Estas exposiciones inadvertidas pueden suceder como resultado de una contaminación con cacahuate del equipo usado en la fabricación de diversos productos, etiquetado inadecuado , de los alimentos, contaminación cruzada · de -alimentos durante el cocinado en restaurantes y exposiciones no anticipadas (por ejemplo la inhalación de polvo de cacahuate en aeronaves) (Sampson H., N. Engl. J. Med. 346 (17) : 1294-1299 (2002)). La terapia actual de una reacción aguda a los cacahuates incluye un tratamiento agresivo con epinefrina intramuscular; antagonistas del receptor Hl y H2 de la histamina oral, intramuscular o intravenoso, oxigeno; albuterol inhalado y corticosteriodes sistemático (Sampson H., N. Engl. J. Med. 3 6 ( 17 ): 1294-1299 (2002)). Además, un curso de 3 días de prednisona oral y antihistaminico se recomienda con frecuencia después de una reacción aguda a los cacahuates. Dada la severidad, frecuencia y persistencia frecuentemente de larga duración de la alergia a los cacahuates existe la necesidad de una terapia preventiva o curativa para la alergia a los cacahuates (Sampson H., N. Engl. J, Med. 346 ( 17 ): 1294-1299 (2002)). Dos principales proteínas alergénicas del cacahuate que se reconocen en más del 95% de los pacientes con alergia a los cacahuates son Ara h 1 y Ara h 2 (Bannon, G., et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 124:70-72 (2001) and Li, X. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 106:150-158 (2000), los contenidos completos de la cual se incorporan aquí como referencia) . Ara h 3 se reconoce por alrededor del 45% de los pacientes con alergia a los cacahuates (Li, X. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 106:150-158 (2000).).. En una modalidad especifica de la invención la composición comprende el antigeno Ara h 1, Ara h2, o Ara h3 o una mezcla antigénica del mismo mezclada con la partícula tipo virus (ver ejemplo 5) . En otra modalidad preferida los alérgenos epidérmicos de mamíferos, incluyen pero no se limitan a camello, pelo de gato, piel de gato, chinchilla, vaca, venado, perro, gerbo, cabra, conejillo de indias, hámster, cerdo, caballo, angora, mono, ratón, conejo, lana (borrego) . Todavía en otra modalidad preferida, las plumas incluyen pero no se limitan a canario, pollo, pato, ganso, periquito, paloma y pavo. En otra modalidad preferida otros inhalantes incluyen pero no se limitan a acacia, algas, semillas de ricino, semilla de algodón, borra de algodón, raíz de derris, esporas del helécho, polvos de humanos , fibras de cáñamo, heno, linaza, goma guar, yute, goma karaya, Kapok, piel, licopodium, raíz de orris, piretro, seda (cruda), henequén, hoja de tabaco, tragacanto y polvos de la madera. En otra modalidad preferida los alérgenos mamíferos típicamente definidos ya sea purificados de fuentes naturales o expresados recombinantemente se incluyen. Estos incluyen pero no se limitan a Fel d 1, Fel d 3 (cistatina) a partir de gatos y albúminas de gato, camellos, chinchilla, vaca, venado, perro, gerbo, cabra, conejillo de indias, hámster, cerdo, caballo, angora, mono, ratón, conejo y lana (borrego).

La selección de antígenos o determinantes antigénicos para composiciones y métodos de tratamiento para el cáncer, se conocerían por aquellos expertos en las artes médicas que tratan tales trastornos (ver Renkvist et al., Cáncer. Immunol. Immunother. 50:3-15 (2001) que se incorpora como referencia) , y antígenos o determinantes antigénicos tales se incluyen al alcance de la presente invención. Los ejemplos representativos de tales tipos de antígenos o determinantes antigénicos incluyen los siguientes Her2 (cáncer de mama) ; GD2 (neuroblastoma) ; EGF-R (glioblastoma maligno) ; CEA (cáncer medular de tiroides); CD52 (leucemia); proteína gplOO del melanoma humano, epítopos de la proteína gplOO de la melanoma humano tales como los aminoácidos 154-162 (secuencia: KTWGQYWQV, SEQ ID NO: 72), 209-217 (ITDQVPFSV, SEQ ID NO: 73), 280-288 (YLEPGPVTA, SEQ ID NO: 74), 457-466 (LLDGTATLRL, SEQ ID NO: 75) y 476-485 (VLYRYGSFSV, SEQ ID NO: 76); proteína del melanoma humano melan-A/MART-1 ; proteína del melanoma humano melan-A/MART-1 epítopos tales como los aminoácidos 26-35 (EAAGIGILTV) (SEQ ID NO: 98), 26-35AL (ELAGIGICTV, SEQ ID NO: 99), 27-35 (AAGIGILTV, SEQ ID NO: 77) Y 32-40 ( ILTVILGVL , SEQ ID NO: 78); proteínas relacionadas con la tirosinasa y tirosinasa (por ejemplo TRP-1 Y TRP-2); epítopos de la tirosinasa tales como los aminoácidos 1-9 (MLLAVLYCL , SEQ ID NO: 79) Y 368-376 (YMDGTMSQV, SEQ ID NO: 80) ; proteína NA17-a nt; epítopos de la, proteína NA17-A nt tales como los aminoácidos 38-64 (VLPDVFIRC, SEQ ID NO:81); proteína MAGE-3; epítopos de la proteína MAGE-3 tales como los aminoácidos 271-279 (FLWGPRALV, SEQ ID NO: 82); antígenos de otros tumores humanos, por ejemplos epítopos CEA tales como aminoácidos 571-579 ( YLSGANLNL, SEQ ID NO: 83); proteína p53; epítopos de la proteína p53 tales como los aminoácidos 65-73 (RMPEAAPPV, SEQ ID- NO: 84) 149-157 (STPPPGTRV, SEQ ID NO: 85) Y 264-272 (LLGRNSFEV, SEQ ID NO: 86); epítopos Her2/neu tales como los aminoácidos 369-377 (KIFGSLAFL, SEQ ID NO: 87) y 654-662 (IISAVVGIL, SEQ ID NO: 88); proteína HPV16; epítopos de la proteína HPV16 tales como los aminoácidos 86-93 (TLGIVCPI, SEQ ID NO: 89); así como fragmentos o mutantes de los cuales se pueden usar para tener respuestas inmunológicas . La selección de los antígenos o determinantes antigénicos para las composiciones y métodos de tratamiento para otras enfermedades o condiciones asociadas con los autoantígenos, también se conocerían por aquellos expertos en las artes médicas que tratan tales trastornos. Los ejemplos representativos de tales antígenos o determinantes antigénicos son por ejemplo las linfotoxinas (por ejemplo linfotoxina (LT a, Linfotoxina ß (LT ß) ) , y los receptores de linfotoxina, activador de receptor de lingando del factor KappaB (RANKL) , receptor asociado a osteoclastos (OSCAR) , factor de crecimiento endoterial vascular (VEGF) y factor de crecimientoi endotelial vascular (VEGF-R) , interleucina 17 y péptido beta amiloide (?ß?_42) # TNFa, MIF, MCP-1, SDF-1, Rank-L, M-CSF, angiotensinogeno, angiotensina I, angiotensina II, endoglina, eotaxina, grehelina, BLC, CCL21, IL-13, IL-17, IL-5, IL-8, IL-15, bradicinina, resistina, LHRH, GHRH, GIH, CRH, TRH y gastrina así como fragmentos para cada uno de los cuales se pueden usar para producir respuestas inmunológicas .

En una modalidad particular de la invención, el antígeno o determinante antigénico se selecciona del grupo que consiste de: a) un polipéptido recombinante de VIH, b) un polipéptido del virus de la influenza (por ejemplo un polipéptido M2 del virus de la influenza o un fragmento del mismo; c) un polipéptido recombinante de la hepatitis C; d) un polipéptido recombinante del virus de la hepatitis B; e) un polipéptido recombinante del toxsoplasma; f) un pqlipéptido recombinante de Plasmodium falciparum; g) un polipéptido recombinante de Plasmodium vivax; h) un polipéptido recombinante de Plasmodium ovale; i) un polipéptido recombinante de Plasmodium malaríae; j) un polipéptido recombinante de células de cáncer de mama; k) un polipéptido recombinante de células de cáncer de riñon; 1) un polipéptido recombinante de células de cáncer de próstata: m) un polipéptido recombinante de células de cáncer de piel; n) un polipéptido recombinante de células de cáncer de cerebro; o) un polipéptido recombinante de células de leucemia; p) formación de perfiles recombinantes ; q) un polipéptido recombinante de alergia al piquete de abeja; r) un polipéptido recombinante de alergia a las nueces; s) un polipéptido recombinante del polen; t) un polipéptido recombinante del polvo de casas; u) un polipéptido recombinante de alergia a los gatos y al pelo de gato; v) una proteina recombinante de alergia a los alimentos; w) una proteina recombinante del asma; x) un proteina recombinante de clamidia; y) antigenos extraídos de cualquiera de las fuentes de proteína mencionadas en (a-x) ; y (z) un fragmento de cualquiera de las proteínas establecidas en (a)-(x). En otra modalidad de la presente invención, el antígeno mezclado con la partícula tipo virus empacada con la substancia inmunoestimuladora, el ácido nucleico inmunoestimulador o el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar de la invención, es un epítopo de células T, ya sea un citotóxico o un epítopo de células Th . En otra modalidad de la presente invención, el antígeno mezclado con la partícula tipo virus empacada con la substancia inmunoestimuladora, el ácido nucleico inmunoestimulador o el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar de la invención es un epitopo de células B. En una modalidad adicional preferida, el antigeno es una combinación de al menos 2, preferiblemente epitopos diferentes en donde los al menos 2 epitopos se ligan directamente o por medio de una secuencias de enlaces. Estos epitopos se seleccionan preferiblemente del grupo que consisten de epitopos de células Th y citotóxicas. El antigeno de la presente invención y en particular el epitopo o epitopos indicados se pueden sintetizar o expresar recombinantemente y acoplar a la partícula de tipo virus o fusionarse a la partícula de tipo . virus usando técnicas de ADN recombinantes . Los procedimientos ejemplares que describen la colocación de antígenos a partículas del tipo virus se describen en WO 00/32227, en WO 01/85208 y en WO 02/056905, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia. La invención también proporciona un método de producción de una composición para mejorar una respuesta inmune en un animal que comprende un VLP y un oligonucleótido que contiene CpG sin metilar enlazado al VLP que comprende incubar con el VLP- oligonucleótido al agregar RNasa y purificar la composición. En una modalidad igualmente preferida el método comprende incubar el VLP con la RNasa agregando el oligonucleótido y purificando la composición. En una modalidad el VLP se produce en un sistema de expresión bacteriano. En otra modalidad la RNasa es la RNasa A. La invención proporciona además un método de producción de una composición para mejorar una respuesta inmune en un animal, que comprende un VLP enlazado a un oligonucleótido que contiene CpG sin metilar, que comprende desensamblar el VLP agregando el oligonucleótido y reensamblando el VLP. El método puede además comprender, retirar los ácidos nucleicos del VLP parcialmente desensamblados y/o purificar la composición después del ensamble. La invención también proporciona composiciones de vacuna que se puede usar para prevenir y/o atenuar enfermedades o condiciones. Las composiciones de vacuna de la invención comprenden o consisten alternativamente de una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición que mejora lo inmune de la invención junto con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. La vacuna también puede comprender un adyuvante. La invención proporciona además métodos de vacunación para prevenir y/o atenuar enfermedades o condiciones en los animales. En una modalidad la invención proporciona vacunas para la prevención de enfermedades infecciosas en un amplio rango de especies animales, particularmente especies de mamíferos tales como humanos, monos, vacas, perros, gatos, caballos, cerdos, etc. Las vacunas se pueden diseñar para tratar infecciones de etiología viral tales como VIH, influenza, herpes, hepatitis viral, Epstein Bar, polio, encefalitis viral, sarampión, viruela del pollo, etc. o infecciones de etiología bacteriana tales como neumonía, tuberculosis, sífilis, etc. o infecciones de etiología de parásitos tales como malaria, tripanosomiasis, leismaniasis , tricomoniasis , amibiasis, etc. En otra modalidad, la invención proporciona vacunas para la prevención del cáncer en un amplio rango de especies, particularmente especies de mamíferos tales como humanos, monos, vacas, perros, gatos, caballos, cerdos, etc. Las vacunas se pueden diseñar para tratar todos tipos de cánceres incluyendo pero no limitado a linfomas, carcinomas, sarcomas y melanomas . Como se entendería por alguien de experiencia ordinaria en la técnica cuando se administran las composiciones de la invención a un animal, pueden estar en una composición que contenga sales, soluciones amortiguadoras, adyuvantes u otras sustancias que sean deseables para mejorar la eficacia de la composición. Los ejemplos de los materiales adecuados para su uso en la preparación de composiciones farmacéuticas se suministran en diversa fuentes incluyendo REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990) ) . Se pueden usar diversos adyuvantes para incrementar la respuestas inmunológica dependiendo de la especie hospedadora incluyendo pero no limitando a Freund (completo e incompleto) , geles minerales tales como el hidróxido de aluminio substancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de .aceite, hemocianinas de una variedad de lapa, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tal como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Tales adyuvantes también son bien conocidos en el arte. Los adyuvantes adicionales que se pueden administrar con las composiciones de la invención incluyen pero no se limitan a un inmunomodulador de lipidos de monofosforilo, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sales de aluminio (Alum) , MF-59, OM-174, OM-197, OM-294 y tecnología de adyuvantes virosomales. Los adyuvantes también pueden comprender una mezcla de estas substancias. Las fracciones inmunológicamente activas de saponina que tienen una actividad adyuvante derivada de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina se conocen en el arte. Por ejemplo QS21 también conocido como QA21, es una fracción purificada por Hplc a partir del árbol de Quillaja Saponaria Molina y su método de su producción se describe (como QA21) en la patente de EUA No. 5, 057, 540. La saponina de Quillaja también se ha descrito como un adyuvante por Scout et al, Int. Archs . Allergy Appl . Immun, 1985, 77, 409. El lípido A de monofosforilo y sus derivados del mismo se conocen en el arte. Un derivado preferido es un lipido A de monofosforilo 3 des-o-acilado y se conoce de la patente Británica No. 2220211. Los adyuvantes preferidos se describen en WOOO/00462 la descripción de la cual se incluye aquí como referencia. . Las composiciones de la invención se dicen que son "farmacológicamente aceptables" si su administración se puede tolerar por un individuo receptor. Además las composiciones de la invención se administran en una "cantidad terapéuticamente efectiva" (esto es, una cantidad que produce un efecto fisiológico deseado) . Las composiciones de la presente invención se pueden administrar por diversos métodos conocidos en el arte. El modo particular seleccionado dependerá por supuesto de la composición en particular seleccionada, la severidad de la condición a tratarse y la dosis requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos de la invención hablando generalmente se pueden practicar usando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, lo que significa que cualquier modo que produzca niveles efectivos de.' los compuestos activos sin provocar efectos adversos clínicamente inaceptables. Tales modos de administración incluyen oral, rectal, parenteral, intrasistenal, intravaginal, intraperitoneal, tópico (como por polvos, ungüentos, gotas ó parches transdermales) , bucal o como un rocío nasal u oral. El término parenteral como se usa en la presente se refiere a modos de administración que incluyen inyección, infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal , intraesternal , subcutánea e interarticular. Las composiciones de la invención también se pueden inyectar directamente en un ganglio linfático. Los componentes de las composiciones para administración incluyen soluciones y suspensiones acuosas estériles (por ejemplo solución salina fisiológica) o soluciones no acuosas. Ejemplos de los solventes no acuosos son el propilenglicol , polietilenglicol , aceites vegetales como el aceite de olivo y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Los portadores o apositos de oclusión se pueden usar para incrementar la permeabilidad de la piel y mejorar la absorción del antígeno. Las combinaciones se pueden administrar concomitantemente por ejemplo, como una mezcla separadamente pero simultáneamente o concurrentemente o secuencialmente . Esto incluyen presentaciones en las cuales loa agentes combinados se administran juntos como una mezcla terapéutica, y- también procedimientos en los cuales los agentes combinados se administran separada pero simultáneamente por ejemplo, a través líneas intravenosas separadas dentro del mismo individuo. La administración en combinación incluye además la administración separada de uno de los compuestos o agentes dados primero seguido por el segundo. Los niveles de dosis dependen de modo de administración la naturaleza del sujeto y la calidad de formación de portador/adyuvante. Las cantidades típicas están en el rango de alrededor de 0.001 µg hasta alrededor de 20 mg por sujeto. Las cantidades preferidas son al menos alrededor de 1 µg hasta alrededor de 100 por sujeto. La administración múltiple para inmunizar al sujeto se prefiere y los protocolos son aquellos estándar en el arte adaptados al sujeto en cuestión. Las cantidades típicas del antígeno están en un intervalo comparable similar o idéntico al rango típicamente usado para la administración sin la adición de las VLP". Las composiciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosis unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en el arte de la farmacia. Los métodos incluyen la etapa de traer las composiciones de la invención en asociación con un portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general las composiciones se preparan al traer uniforme e íntimamente las composiciones de la invención en asociación con un portador liquido, un portador sólido finamente dividido ¦ o ambos y luego si es necesario formar el producto. Las composiciones adecuadas para administración oral se pueden presentar como unidades discretas tales como cápsulas, tabletas o grageas que contiene cada una, una cantidad predeterminada de las composiciones de la invención. Otras composiciones incluyen suspensiones en líquidos acuosos o líquidos no acuosos tales como un jarabe, un elíxir o una emulsión . Otros sistemas de suministro pueden incluir sistemas de suministro de liberación sostenida, liberación programada o liberación retrasada. Tales sistemas pueden evitar administraciones repetidas de las composiciones de la invención antes descritas incrementando la conveniencia para el sujeto y el médico. Estas disponibles muchos tipos sistemas de administración por liberación y se conocen para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Otras modalidades de la invención incluyen procesos para la producción de las composiciones de la invención y métodos de tratamiento médico para el cáncer y alergias usando las composiciones. Así la presente invención entre otras se refiere al hallazgo de que las partículas de tipo virus (VLP) se pueden cargar y cargar respectivamente con oligonucleótidos de ADN ricos en C y G no metilada (CpGs) . Si se mezclan tales CpG-'.. VLP con antígenos la inmunogenicidad de estos antígenos se mejora dramáticamente. Además las respuestas de células T contra los antígenos se dirigen especialmente a un tipo Thl. Sorprendentemente no se requiere ninguna ligadura covalente del antígeno al VLP sino que es suficiente mezclar simplemente las VLP con los adyuvantes para la coadministración. Además las VLP no mejoran las respuestas inmunes a menos carguen y empaquen respectivamente con CpGs . Los antígenos mezclados con las VLP empacados con CpG pueden por lo tanto ser vacunas ideales para una vacunación profiláctica o terapéutica contra alergias, tumores y otras auto-moléculas y enfermedades virales crónicas. En otro aspecto la presente invención proporciona un método de producción de una composición para mejorar una respuesta inmune en un animal, que comprende una partícula de tipo virus y una substancia inmunoestimuladora empacada dentro de la partícula de tipo virus. El método comprende (a) incubar la partícula de tipo virus con la substancia en un estimulador (b) agregar RNasa y (c) purificar la composición.

En una aspecto adicional la presente invención proporciona un método de producción de una composición para mejorar una respuesta inmune en un animal que comprende una partícula de tipo virus y una substancia inmunoestimuladora empacada dentro de la partícula de tipo virus, el método comprende (a) incubar la partícula de tipo virus con RNasa (b) agregar la substancia inmunoestimuladora y (c) purificar la composición. Todavía en un aspecto adicional la presente invención proporciona un método de producción de una composición para mejorar una respuesta inmune en un animal que comprende una partícula de tipo virus y una substancia inmunoestimuladora empacada dentro de la partícula de tipo virus, el método comprenden (a) desensamblar la partícula de tipo virus (b) agregar la sustancia inmunoestimuladora y (c) reemsamblar la partícula de tipo virus. En_ una modalidad alternativa, el método de producción de una composición para mejorar una respuesta inmune en un animal de conformidad con la invención, comprende además retirar los ácidos nucleicos de la partícula de tipo virus sin ensamblar. Todavía en una modalidad alternativa, el método de producción de una composición para mejorar una respuesta inmune en un animal de conformidad con la invención, comprende además purificar la composición después del reensamble (c) . Nuevamente en otro aspecto la presente invención proporciona un método de producción de una composición para mejorar una respuesta inmune en un animal que comprende una partícula de tipo virus y una substancia inmunoestimuladora empacada dentro de la partícula de tipo virus, el método comprende (a) incubar la partícula tipo virus con soluciones que comprenden iones de metales capaces de hidrolizar los ácidos nucleicos en la partícula de tipo virus (b) agregar una substancia inmunoestimuladora y (c) purificar la composición. Preferiblemente los iones de metal capaces de hidrolizar los ácidos nucleicos de la partícula de tipo virus de seleccionan del grupo que consisten de (a) iones zinc (Zn) (b) iones cobre (Cu), (c) iones fierro (Fe), (d) algunas mezclas de al menos un ión de (a) , (b) y/o (c) . En modalidades preferidas de los métodos de producción de una composición para mejorar una respuesta inmune en un animal de conformidad con la invención, indicada arriba, la subs.tancia inmunoestimuladora es una ácido nucleico inmunoestimulador seleccionado del grupo que consiste de o consiste de alternativamente esencialmente de: (a) ácido ribonucleicos preferiblemente poly-(I:C) o un derivado del mismo (b) ácidos desoxiribonucleicos preferiblemente oligonucleótidos libres de las porciones no metiladas CpG, y aun más preferiblemente oligonucleótidos que contienen CpG sin metilar (c) ácidos nucleicos quiméricos (d) algunas mezclas de un ácido nucleico de (a) , (b) y/o (c) . En otras modalidades preferidas de los métodos de producción de una composición para mejorar una respuesta inmune en un animal de conformidad con la invención indicada arriba, la partícula de tipo virus se produce en un sistema de expresión mamífero o bacteriano en una modalidad adicional preferida la RNasa es RNasaA. Los siguientes ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretenden que limiten el alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas. Será evidente para aquellos expertos en la técnica que se pueden hacer diversas modificaciones y variaciones en los métodos de la presente invención sin alejarse del espíritu y alcance de la invención. Así, se pretende que la presente invención cubra las modificaciones y variaciones de esta invención con tal de que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y sus equivalentes. Todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones referidas en ella se incorporan expresamente como referencia en su totalidad. EJEMPLO 1 Generación de las VLP. La secuencia del ADN del péptido p33 que contiene HBcAg a partir de LCMV se da en SEQ ID NO: 70, Las VLP de p33-HBcAg (p33-VLP) se generaron como sigue: clon de la hepatitis B pEco63 que contiene el genoma viral completo del virus de la hepatitis B se adquirió de ATCC. La generación del plásmido de expresión se ha descrito previamente (ver WO 03/024481) . Un clon de E. coli K802 seleccionado para una buena expresión se transfectó con el plásmido y se hicieron crecer las células y se volvieron a suspender en solución amortiguadora del lisis 5ml (10 mM Na2HP04, 30mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.25% T een-20, pH 7.0) . 200µ1 de solución lisozima (20 mg/ml) se agregaron. Después de la sonicación, se agregaron 4µ1 Benzonasa y lOmM MgCl2 y la suspensión estuvo en incubación por 30 minutos a temperatura ambiente, se centrifugó por 15 minutos a 15,000 rpm a 4°C y se conservó el sobrenadante. A continuación, se agregaron 20% (p/v) (0.2 g/ml lisato) del sulfato de amonio al sobrenadante. Después de la incubación por 30 minutos sobe hielo y la centrifugación por 15 minutos a 20, 000 rpm a 4°C, se descartó el sobrenadante y se volvió a suspender el peletizado en 2-3 mi PBS. Se cargaron 20ml de la solución PBS en una columna de filtración con gel Sephacryl S-400 (Amersham Pharmacia Biotechnology AG), se cargaron las fracciones sobre un gel SDS-Page y las fracciones con las cápsidas purificadas p33-HBcAg VLP se acumularon. Se cargaron las fracciones acumuladoras en una columna de hidroxiapatitas . Se recolectó el flujo de paso (que contiene las cápsidas p33-HBcAg VLP purificadas) se efectuó una microscopía de electrones según los protocolos estándar. Se muestra un ejemplo representativo en la figura 1 de Storni T., et al., (2002) J Immunol.; 168 ( 6 ) : 2880- 6. Se debe observar que las VLP que contiene el péptido p33 se usaron solamente por razones de conveniencia y que se puede usar similarmente las VLP de tipo silvestre en la presente invención. A lo largo de la descripción los términos ¦p33-HBcAg VLP, HBcAg-p33 VLP, p33-VLPs y HBc33 se usan de manera intercambiable. En particular las VLP usados en los ejemplos 1-4, 9, y 10, 18 son p33-HBcAg VLPs .

EJEMPLO 2 Oligonucleotidos que contienen CpG se puede empacar en VLP de HBcAg Las VLP recombinantes generados como se describe en el ejemplo 1 se hicieron correr en una electroforesis de gel de agarosa nativo al 1% y se tiñeron con bromuro de etidio o azul Coomassie para la detección del ARN/ADN o la proteina (figura 1) . Las VLP producidos de bacterias contienen altos niveles del ARN de hebra sencilla que se enlaza presumiblemente a las repeticiones de arginina que aparecen cerca de la terminación C de la proteina HBcAg y que se localizan geográficamente dentro de las VLP como de se muestra por cristolografia de rayos X. El ARN contaminante se puede digerir fácilmente y eliminarse asi al incubar las VLP con RNasa A. La enzima de RNasa A altamente activa tiene un peso molecular de alrededor de 14kDA y es presumiblemente los suficiente pequeña para entrar a las VLP para eliminar los ácidos ribonucleicos indeseables . Las VLP recombinantes se complementaron con '.: oligonucleotidos. ricos en CpG (ver SEQ ID NO: 69) antes de la digestión con RNasa A. Como se muestra en la figura 2 la presencia de los oligonucleotidos CpG conservó la estructura de las cápsidas como se muestra por una migración similar comparada con las VLP sin tratar p33. Los oligonucleotidos CpG que contienen VLP se purificaron a partir de oligonucleotidos sin enlazar por medio de diálisis (dilución de 4500 veces en PBS por 24 horas usando una membrana de diálisis 300 kDa M CO) (ver figura 3) . EJEMPLO 3 Oligonucleotidos que contienen CpG se pueden empacar en las VLP al eliminar el ARN con ARNasa y el empaque posterior de oligonucleotidos de las VLP. Las VLP (que contienen el ARN de hebra sencilla bacteriano y generado como se describe en el ejemplo 1) se incubaron primero con la RNasa A para eliminar el ARN y en una segunda etapa los oligonucleotidos CpG inmunoestimulantes (con porciones fosfodiéster normales pero con modificaciones de fosforotioato de la estructura de fosfato) se complementaron con las muestras (figura 4). Este experimento muestra claramente que los oligonucleotidos CpG no se requieren absolutamente de forma simultánea durante la reacción de degradación de ARN sino que se pueden agregar en un tiempo posterior. EJEMPLO 4 Las VLP que contiene los oligonucleotidos CpG inducen respuestas fuertes de IgG contra el veneno de abeja coadministrado La VLP generada como se describe en el ejemplo 1 se usó para este experimento. Se cebaron subcutáneamente ratones con 5µ? de veneno de abeja (ALK Abello) ya sea solo o mezclado con uno de los siguientes: 5C^g VLP solo, 50 g VLP cargado y empacado, respectivamente con oligonucleótidos CpG o 50 µg VLP mezclado con 20nmol CpG oligonucleótidos. Alternativamente, se cebaron ratones con 5µg de veneno de abeja mezclado con la VLP solamente, o VLP cargada y empacada respectivamente con oligonucleótidos CpG en conjunto con hidróxido de aluminio. 14 días después se reforzaron los ratones con las mismas preparaciones de vacuna y se sangraron el día 21. Las respuestas IgG especificas del veneno de abeja en sueros desde el día 21 se evaluaron por ELISA. Las VLP tratadas en RNasa A derivados del HBcAg que lleva dentro los oligonucleótidos CpG (que contienen porciones normales de fosfodiester) dializados a partir de oligonucleótidos sin enlazarse CpG fueron efectivos al mejorar las respuestas IgG contra los alérgenos del veneno de abeja (BV) . Como se muestra en la figura 5, la presencia de los CPPS libre o VLP cargadas y empacadas respectivamente con CPPS mejoró dramáticamente la respuesta IgG contra el veneno de abeja. El VLP sin CPPS no mejoró la respuesta inmune. La presencia de alumbre como un adyuvante incrementó además la repuesta IgG. Si se midieron las subclases IgG (figura 6) , fue evidente que las VLP empacadas con CpG giraron la respuesta de una dominancia IgGl hasta una dominancia IgG2, indicando que se usó una respuesta Thl . De manera interesante la presencia de alumbre mejoró el isotipo IgGl asociado con Th2. Asi, la adición de las VLP empacados con CpG al veneno de abeja en alumbre resultaron en concentraciones altas de IgG pero la respuesta todavía fue dominada por el IgGl. De manera importante, aunque los CPPS empacados en las VLP fueron similarmente efectivos como CpGs libres al mejorar las respuestas IgG contra el veneno de abeja en presencia y ausencia de alumbre no mostraron signos de activación inmune sistémica (figura 7). Específicamente, aunque la vacunación de los ratones en presencia de los CpGs libres indujo la esplenomegalia con bazos de hasta 4 veces aumentado los números totales de linfocitos, los CpGs empacados con VLP no resultaron en números crecientes de linfocitos. EJEMPLO 5 VLP Usadas Contra la Alergia del Cacahuate En los siguientes ejemplos 5 a 8 las VLP usadas como partículas de Qb ( SEQ ID NO: 1) empacado con G10-PO (SEQ ID NO: 122) . Ratonas C3H/Hej de 5 semanas de edad se sensibilizaron a los cacahuates por cebadura intragástrica c n 5 mg . de cacahuate entero recientemente molido y tostado junto con 10 µg de toxina del cólera al día 0. Se reforzaron los ratones una y 3 semanas después. Una semana después de la dosis de sensibilización final, los ratones reciben VLP mezclado con 10 mg de extracto curdo de cacahuate, VLP mezclado con 5 µg de Ara h 1, VLP mezclado con 5 µg de Ara h 2, VLP mezclado con 5 g de Ara h 3 o VLP mezclado con 5 µq de cada uno de Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3. Ratones nuevos, ratones que reciben solamente VLP, ratones que reciben 10 mg de extracto de cacahuate crudo solamente o ratones que reciben VLP mezclado con 5 µg de un antigeno irrelevante sirven como controles. Los niveles de IgE específicos del cacahuate se miden al usar ELISA. Los anticuerpos IgE específicos para Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3 se observan en los sueros acumulados de ratones sensibilizados con cacahuate. Las placas se recubren con Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3 (2 µg/ml) . Los niveles de las subclases IgG, específicamente IgGl y IgG2, también se miden por ELISA con objeto de determinar si se usa una respuesta TH1 o TH2. Se evalúan los síntomas anafilácticos por 30 a 40 minutos después de la segunda prueba inmunogénica al usar el siguiente sistema de calificación: 0-no hay síntomas; 1-enrojecimiento y comezón alrededor de la nariz y la cabeza; 2-hinchazón alrededor de los ojos y la boca, diarrea, pilar ere.ctí, actividad reducida y/o actividad disminuida con una tasa respiratoria aumentada; 3-resuello, respiración trabajosa y cianosis alrededor de la boca y la cola; 4-sin actividad después de aguijoneo o temblor y convulsión; 5-muerte.

Se recolectó la sangre 30 minutos después de la segunda prueba inmunológica con cebadura intragástrica . Se determinaron los niveles de histamina en plasma usando un kit de ensayo de inmunoenzimas ( ImmunoTECH Inc, Marseille, France) como se describe por el fabricante. Se retiraron los bazos de los ratones nuevos y sensibilizados con cacahuate después de una nueva prueba inmunogénica en la semana 5. Como una medida de su estado de activación, se determinó la capacidad de los esplenocitos para proliferar después de la estimulación in vitro con antigenos de cacahuate. Específicamente, se aislan las células del bazo y se suspenden en un medio de cultivo completo (RPMI-1640 más 10% FBS, 1% de penicilina estreptomicina y 1% de glutamina). Las células del bazo (1 x 106/pozo en 0.2 mL se incuban en cultivos por triplicado en placas de micropozo en presencia o ausencia de un extracto de cacahuate Ara h 1, Ara h 2 o Ara h 3 (10 o 50 µg/ml) . Se estimulan las células con Con A (2 µg/ml·) se usan como controles positivos. 6 días después, se pulsan los cultivos por 18 horas con 1 µCi por pozo de 3H-timidina. Se cosechan las . células y se cuenta la radioactividad incorporada en un contador de escintilación ß. También se cultivan las células de bazo en placas de 24 pozos (4 x 106/pozo/ml) en presencia o ausencia de un extracto de cacahuate crudo (50 µg ml) o Con A (2 µg/ml) . Se recolectan los sobrenadantes 72 horas después. Se determinan IL-4, IL-5, IL-13 y IFN-? por ELISA, según las instrucciones del fabricante con objeto de determinar si se usa una respuesta TH1 o TH2. EJEMPLO 6 Las VLP se usan contra la alergia de la ambrosia. Ratones C3H/Hej de 6 a 10 semanas de edad se sensibilizan a la ambrosia (RW) por inyección intraperitoneal de 80 µg RW en los días 0 y 4 (contenido de endotoxina >2.3 ng/mg RW; Greer Laboratorios, Lenoir, NC) . La solución de sensibilización consiste de 1 mg de RW en 1 mi de 0.9% NaCl (Baxter, Deerfield, IL) más 333 de alumbre Imyect (Pierce, Rockford, IL) . Una semana después de la dosis de sensibilización final, los ratones reciben VLP mezclado con 160 ug de RW o VLP mezclado con 80 ug de Amb a 1. Los ratones nuevos, ratones que reciben VLP solamente, ratones que reciben 160 ug de RW solamente, o ratones que reciben VLP mezclado con 80 ug de una antigeno irrelevante que sirven como controles. El día 25, 0.5 mi de sangre periférica de la vena de la cola se recolecta, se anestesian los ratones con cetaminá (90 µg/kg de peso corporal) y xilazina (10 mg/kg de peso corporal) y luego se les aplica la prueba inmunogénica por administración intratraqueal de RW (10 µg de RW en 0.1 mi de 0/9% NaCl) . 12 horas después de la aplicación de la prueba inmunogénica RW, 0.5 de sangre periférica de la vena de la cola se recolectan y se lavan los pulmones con una alícuota de 1 mi de PBS. Se centrifugan las muestras de 2,000 rpm por 5 minutos y se recolecta el fluido de lavado broncoalveolar . Se determinan los _ niveles de interleucina IL-4 y IL-5 usando kits de ensayo inmunoenzimáticos de 2 sitios (Endogen, Cambridge, MA) según las instrucciones del fabricante. Los límites inferiores de detección son 1 pg/ml para IL-4 y IL-5. Después de que se lavan los pulmones se retiran. Los pulmones se hacen infusión con 4% de paraformaldehido (en PBS) durante 30 minutos, se enjuagan con PBS y se sumergen en 0.5 M de sacarosa (en PBS) durante la noche a 4°C. Se inflan los pulmones y se colocan en parafina. Se tiñen las secciones de los tejidos con hematoxilina y eosina y se cuantifica el grado de inflamación por infiltración de eosinófilos por análisis de imágenes. Se aislan las células de los glóbulos blancos a partir de la sangre periférica por centrifugación por un gradiente discontinuo de Percoll con lisis hipotónica posterior de las células de glóbulos rojos restantes. Los eosinófilos se enriquecen a partir de células de glóbulos blancos por un proceso de selección negativo usando anticuerpo anti-CD90 y anti-CD45R para suprimir las poblaciones de células T y B usando el método de separación por perlas magnéticas MACS para el protocolo sugerido por el fabricante (Miltenyi Biotechnical , Aubrn, CA) . Las fracciones de eosinofilos se enriquecen rutinariamente hasta <98%. Los eosinofilos purificados de sangre periférica se vuelven a suspender en RPMI-1640 (Gibco-BRL) y 5% de suero de becerro fetal (GIBCO-BRL) a una densidad celular de 1 x 106 células/ml. Las células se estimulan con 10"7 de forbol 12 miristato 13 acetato (PMA) y 10"7 M A23187 (Sigma) en placas de 96 pozos a 37°C por 30 minutos, 1 h y 16 h o Amb a 1 (20 µg/ml) por 6 dias. Después de la estimulación, la capacidad de las VLP para invertir el perfil de secreción de citocinas dominante de TH2 inducido por Amb a 1 se analiza. Específicamente, la capacidad de los eosinofilos para producir ??G?-?, IL-4 y IL-5 se analiza por un intercalado ELISA. Los niveles de IgE específicos de ambrosía se miden al usar ELISA. Los anticuerpos IgE específicos para Amb a 1 se observan en sueros acumulados de ratones sensibilizados con ambrosía. Las placas se recubren con Amb a 1 (2 µg/ml) . Los niveles de las subclases IgG específicamente IgGl y IgG2 también se miden por ELISA con objeto de determinar si un TH1 o una respuesta TH2 se usada. EJEMPLO 7 VLP usadas contra alergias por hongos. Conejos Naive blancos de Nueva Zelandia de 7 días de edad se inmunizan con VLP mezclada con 10 µg de Alt a 1, un dimero estable al calor de 28 kd, que se extrae y se purifica del extracto de Alternaría alternata o con 10 µ? de Asp f 1 y/o 10 µg de Asp f 16, las proteínas que se extraen y purifican de aspergillus fumigatus . Los conejos nuevos, conejos que ¦ reciben solamente "VL'P y conejos que reciben 210 ng proteína/ml de . extracto liofilizado de Alternaría alternata o Aspergillus fumigatus, reconstituido en solución salina normal sirven como controles. Las IgE anti-Al ternaria y ant i-Aspergillus de conejos se mide por una anafilaxis cutánea pasiva homologa (PCA, por sus siglas en inglés) . Conejos Naive blancos de 3 meses de edad de Nueva Zelanda se inyectan int racutáneamente a lo largo de la espalda con 0.2 mi de diluciones de suero de conejos inmunizados de 3 meses de edad. Los sueros de los conejos no inmunizados y los conejos inmunizados con albúmina de suero de bovino se prueban como controles. Después de un periodo latente de 3 días los conejos receptores se inyectan intravenosamente con 2.1 mg de proteína de ' extracto de Alternaría o Aspergillus diluido en 5 mi de 2.5% de colorante azul de Evans (Fisher Scientific Company, Fair Lawn, NJ) . Para calibrar la respuesta de la prueba en la piel, se inyectan fosfato de histamina (0.2 mi de 0.275 mg/ml) y solución salina normal in t r acutáneament e 10 minutos antes de que se ve la mezcla de extracto y colorante. El tono azul de los sitios de inyección individuales se mide 1 hora después de la administración del colorante. Una respuesta positiva para .cualquiera dilución es un punto azul de 5mm o mayor de diámetro.

Los conejos inmunizados de 3 meses de edad asi como los conejos de control no inmunizados se anestesian con 1 a 3 mi de metohexital de sodio (Brevitol, Eli Lilly Co. , Indianápolis , IN), 10 mg/ml en solución salina normal que se da intravenosamente. Los conejos se incuban con un tubo endotraqueal de 3.5 mm (Portex Inc., Woburn MA) . Un globo de látex (Young Rubber Co . , Trenton, Nj ) , de 3 cm de longitud colocado a un catéter P-240 (Clay Adams , Parsippany, NJ) se coloca en el esófago. Se coloca un segmento de 4 cm de un tubo endotraqueal de 9 mm de diámetro en el reverso de la orofaringe que cubre el catéter del esófago y un tubo endotraqueal pequeño para evitar el daño por los dientes posteriores del conejo. La boca se. cierra y el animal se deja despierto por 2 horas. Después de la introducción de un volumen pequeño de aire en el globo, se ajusta la posición del globo al punto en donde la presión expiradora final es más negativa y el artefacto cardiaco menor. El catéter de globo esofagal se conecta a una transductor de presión diferencial Hewlett-Packard Modél 270 (Minneapolis , MN) y la diferencia de la presión del globo y del tubo endotraqueal se registra como una presión trans pulmonar. Las mediciones en la linea base se hacen después de que los animales se despiertan completamente. Estas mediciones incluyen la frecuencia respiratoria, relaciones de flujo inspirador y expirador, volumen tidal y presión transpulmonar. Después de que se hacen las mediciones en la linea base, se hace la prueba inmunogénica a los animales con aerosoles con solución salina normal, extracto de Alternaría alternata , o extracto de Aspergillus fumigatus diluido en 1:20 en peso/volumen en solución salina normal. 1 mi de solución salina normal, extracto de Alternaría , o extracto de Aspergillus se nebulizan durante 5 minutos directamente en el tubo endotraqueal usando un flujo de aire 4L/min (con aire comprimido) . Al final de la prueba inmunogénica de 5 minutos se hacen mediciones de la función pulmonar cada 30 minutos hasta 6 horas. Los niveles de Alt a 1, Asp f i o Asp f 16 específicos de . IgE se miden al usar ELISA. Los anticuerpos IgE específicos para Alt a 1, Asp f i o Asp f 16 se observan en sueros acumulados de ratón sensibilizados con Alternaría o Aspergillus . Se recubren las placas con Alt a 1, Asp f i o Asp f 16 (2 g/ml) . Los niveles de las subclases IgG específicamente IgGl y IgG2a también se miden por ELISA con objeto de determinar si se usa una respuesta THl o TH2. EJEMPLO 8 VLP usadas contra alergias por ácaros del polvo Ratones C57BL/6 de 6 semanas de edad se sensibilizan -a Dermatophogoldes pteronyssinus o Lepidoglyphus destructor por inyección subcutánea de 10 g D. pteronyssinus o L. destructor de extracto completo el día cero. El día 14 los ratones que se sensibilizan a D. pteronyssinus se inmunizan con VLP mezclado con 10 µg de D. pteronyssinus , VLP mezclado con 5 µg Der p 1, Der f 2, y/o Der 2, que se extrae y purifica del extracto completo de D. pteronyssinus . Los ratones Nalve, ratones que reciben VLP solamente, ratones que reciben 10 µg de D. pteronyssinus solamente o ratones que reciben VLP mezclado con 5 µg de un antígeno irrelevante sirven como controles. El día 14 los ratones que se sensibilizan al L. destructor se inmunizan con VLP mezclado con 10 µg de L. destructor, VLP mezclado con 5 µg Lep d 2, que se extrae y purifica, del extracto completo de L. destructor. Los ratones nuevos, ratones que reciben VLP solamente, ratones que reciben 10 iq de L. destructor solamente o ratones que reciben VLP mezclado con 5 µg del antígeno irrelevante sirven como controles.

El día 28, se recolectaron 0.5 mi de sangre periférica de la vena de la cola, se anestesian los ratones con cetamina (90 µ?/kg de peso corporal) y xilazina (10 mg/kg de peso corporal) y luego se les aplica la prueba inmunogénica intranasalmente con* 10 g de D. pteronyssinus o ' L. destructor. 72 horas después de la prueba inmunogénica D. pteronyssinus o L. destructor, 0.5 de sangre periférica de la vena de la cola se recolecta y se retiran los pulmones. Se hace infusión con los pulmones con paraformaldehido 4% (en PBS) por 30 minutos, se enjuagan con PBS y se sumergen en 0.5 M de sacarosa (en PBS) durante la noche en 4°C. Se inflan los pulmones y se colocan en parafina. Se tiñen las secciones de tejido con hematoxilina y eosina y se cuantifica el grado de infiltración de eosinófilos de inflamación por análisis de imagen. Las células de glóbulos blancos se aislan de la sangre periférica por centrifugación en un gradiente discontinuo de Percoll con una lisis hipotónica posterior de las células restantes de glóbulos rojos. Las células de glóbulos blancos se aislan de sangre periférica en un gradiente de Percoll discontinuo. Se enriquecen los eosinófilos de las poblaciones por un proceso de selección negativo usando anticuerpos anti-CD90 y anti-CD45R para suprimir las poblaciones de células B y células T usando el método de separación de perlas magnéticas MACS por el protocolo sugerido por el fabricante ( iltenyi Biotechnical, Auburn, CA) . Las fracciones de eosinófilos se enriquecen rutinariamente hasta <98%. Los eosinófilos de sangre periférica purificados se vuelven a suspender en RPMI.1640 (GINCO-BRL) y suero de becerro fetal al 5% (GIBCO-BRL) a una densidad, celular, de.1 x 106 células/ml. Las células se estimulan con 10"7 M forbol 10-miristato 13-acetato (PMA) y 10~7 M A-23187 (Sigma) en placas de 96 pozos a 37°C por 30 minutos, 1 h, y 16 h 5 µ9 Der p 1, Der f 2, Der 2, o Lep d 2 (20 µq/ l) por 6 días. Después de la estimulación, la capacidad de las VLP para invertir el perfil de secreción de citocinas dominantes de Th2 induce Der p 1, Der f 2, Der 2 o Lep d 2 se analiza. Específicamente, la capacidad de los eosinófilos para producir el IFN-?, IL-4 y IL-5 se analiza por un ELISA de intercalado . Los niveles de IgE específicos de D. pteronyssinus o L. destructor se miden al usar ELISA. Los anticuerpos IgE específicos para los Der p 1, Der f 2P Der 2 y Lep d 2 inducidos se observan en sueros acumulados de ratones sensibilizados con D. pteronyssinus o L. destructor. Se recubren las placas con Der p 1, Der f 2, Der 2 y Lep d 2. Los niveles de las subclases IgG específicamente IgGl e IgG2a, también se miden con ELISA con objeto de determinar si se usa una respuesta TH1 o TH2.

EJEMPLO 9 Desensibilización de los ratones contra una prueba inmunogénica con veneno de abejas. Empaque de las VLP con CpG e inmunización de ratones con VLP (CpG) mezclado con veneno de abeja. Las VLP que tienen la secuencia como, se muestra en SEQ ID NO: 70 se produjeron en E. coli y contienen cantidades de ARN que se pueden digerir y eliminar asi al incubarlos las VLP con RNasa. La enzima de la RNasa A altamente activa usada tiene un peso molecular de alrededor de 14 kDa. Las VLP de HBC producidos de forma recombinante concentrados a 0.8 mg/ml en una solución amortiguadora por PBS pH .2 se incubaron en ausencia o presencia de RNasa A (300 µg/ml·, Qiagen AG, Suiza) por 3 horas a 37°C. Después de la digestión con RNasa A, se complementaron las VLP con 130nmol/ml con oligonucleótidos de CpG (de la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 69) con una estructura de fosforotioato y se incubaron por 3 horas 3 37°C. Las preparaciones de VLP para inmunización de ratón se dializaron ampliamente (10000 veces diluidas) por 24 h contra PBS pH7.2 con una membrana de diálisis de 300kDa MWCO (Spectrum Medical Industries Inc., Houston, TX, USA) para eliminar la RNasa A y el exceso de oligonucleótidos CpG. Un grupo de 13 ratones CBA/J que se habían sensibilizado por inyecciones repetidas de 0.2 ug de veneno de abeja (Pharmalgen) y lmg Alum (Pierce) , mezclado con PBS el DIA 0, 9, 23 y 38. Los ratones recibieron un volumen total de 66ul s.c. (33 ul para cada lado) por día de inyección. Después de 4 veces de sensibilización se desensibilizaron los ratones con VLP(CpG) + veneno de abeja o con VLP(CpG) solamente en el día 65, 73 y 80. El primer grupo de 7 ratones recibió tres inyecciones de, cada una de 50ug VLP(CpG) + 5ug.de veneno deabeja en PBS. Se dio un volumen total de 200ul subcutáneo en 2 de las dosis a lOOul por cada lado. El segundo grupo de 6 ratones recibió la misma cantidad de VLP(CpG) pero ningún veneno de abeja después del mismo programa de inmunización como el primer grupo (d66, d73 y d80) . Finalmente el día 87 a todos los ratones se les aplicó la prueba inmunogénica con 30ug de veneno de abeja subcutáneo en un volumen total de 300ul PBS. A través de la descripción y las figuras los términos VLP(CpG) y VLP-CpG se usan intercambiablemente y significan VLP empacado con CpG . EJEMPLO 10 Evaluación de los cambios de temperatura en análisis de suero de ratones vacunados con prueba inmunogénica con veneno de abeja. Con objeto de evaluar el resultado protector de la .desensibilización con conjugados de VLP (CpG), se midió la temperatura corporal de los ratones en intervalos de 10 minutos durante una hora, después de la aplicación de la prueba inmunogénica con veneno de abeja (figura 8). La figura 8 muestra la temperatura del cuerpo alérgico en la caída en ratones vacunados con veneno de abeja + VLP(CpG). Se habían probado 2 conjuntos de ratones, grupo 1 (n=7) recibió VLP(CpG) mezclado con veneno de abeja como vacuna. Grupo 2 (n=6) recibió solamente VLP(CpG). Después de la aplicación de la prueba inmunogénica con una, dosis alta de veneno de abeja (30ug) , se evaluó la reacción alérgica en términos de los cambios en la temperatura corporal de los ratones. En el grupo 1 que recibe el veneno de abeja junto con VLP(CpG) no se observaron cambios importantes en la temperatura del cuerpo en ninguno de los ratones probados. En contraste, el grupo 2 que recibe solamente VLP(CpG) como una vacuna desensibilizadora mostró una caída pronunciada en la temperatura del cuerpo en 4 de 6 animales. Por lo tanto, estos ratones no se han protegido de reacciones alérgicas. NOTA: Los símbolos en la figura representan la media de de 6 (VLP(CpG)) o 7 (VLP(CpG) + veneno de abeja) ratones individuales que incluyen la desviación estándar (SD) . Para el análisis serológico se hicieron sangrar los ratones retroorbitalmente el día cero (pre-inmune) , día 58 (después de la sensibilización) y día 86 (después de la desensibilización) . Las pruebas ELISA se efectuaron como sigue: se recubrieron durante la noche las placas ELISA a 4°C con 5ug de veneno de abeja por una solución amortiguadora de recubrimiento de lml (0.1 M NaHCO, pH 9.6). Se bloquearon las placas con solución amortiguadora de bloqueo (2% de albúmina de suero de bovino (BSA) en PBS (pH 7.4) /0.05% Tween 20) por 2 horas a 37°C , se lavaron con PBS (pH 7.4) /0.05% Tween 20 y luego se incubaron por 2 horas a temperatura ambiente con sueros de ratón diluidos en serie en solución amortiguadora de bloqueo. Para la detección IgE los sueros inmunes se pre- . absorbieron en una columna de proteina G. Las placas se lavaron con PBS (pH 7.4) /O.05% Tween20 y luego se incubaron con anticuerpos IgE, IgGl o IgG2a de anti-ratón de cabra etiquetados con peroxidasa de raíz de rábano a 1 ug/ml (Jackson ImmunoResearach) durante lh a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS (pH 7.4) /0.05% Tween 20) y la solución del substrato se agregó (0.066M Na2HP04, 0.035M de ácido cítrico (pH 5.0) + 0.4 mg OPD (1.2 fenilenediamina diclorohidrato) + 0.01% H202) . Después de 10 minutos, se detuvo la reacción de color con 5% H2S04 y se leyó la absorbancia a 450 nm. Como un control, los sueros preinmunes de los mismos ratones también se probaron. Se presentaron las concentraciones de ELISA como una densidad óptica de (OD^onm) de 1:250 (IgE), 1:12500 (IgGl) o 1:500 (IgG2a) de sueros diluidos (figura 9) . La figura 9 muestra la detección de anticuerpos de suero específicos de IgE e IgG en ratones antes y después de la desensibilización. Se tomaron muestras de sangre de todos los ratones antes y después de la desensibilización y se probaron en ELISA para anticuerpos IgE específicos del veneno de abeja (panel A), anticuerpos IgGl (panel B) y anticuerpos IgG2a (panel C) respectivamente. Como se muestra en la figura 9A, una concentración aumentada de IgE se observa para VLP (CpG) + ratones vacunados con veneno de abeja después de la desensibilización. Los resultados se presentan como la densidad óptica (OD450nm) a una dilución en suero de 1:250. La media de 6 (VLP (CpG) ) o 7 (VLP (CpG) + veneno de abeja) de ratones individuales incluyendo la desviación estándar (SD) se muestra en la figura. La figura 9B revela un suero IgGl de veneno antiabeja aumentado después de la desensibilización solamente para ratones vacunados con VLP (CpG) + veneno de abeja. Lo mismo es verdad para la figura 9C en donde las concentraciones de suero IgG2a se han determinado. Como se espera para una desensibilización exitosa, el incremento en las concentraciones del anticuerpo IgG2a fue más pronunciado. Los resultados se muestran como medias de 2 (VLP (CpG)) o 3 (VLP (CpG) + veneno de abeja) en ratones que incluyen SD para 1:12500 (IgGl) o 1:500 (IgG2a) diluciones de suero, respectivamente. EJEMPLO 11 VLP que contienen oligonucleótidos CpG inducen respuestas de IgG. contra el extracto de polen de pasto co-administrado . Las VLP formadas por la proteina de recubrimiento de bacteriófago ARN Qb se usó para este experimento. Se usan sin tratar o después del empaque con los oligonucleótidos CpG-2006 (SEQ ID NO: 114) que tienen modificaciones de fosforotiorato de la estructura de fósforo. El empaque de CpG-2006 se logró al incubar 8 mi de solución Qb VLP (2.2 mg/ml) a 60°C durante la noche en presencia de 0.2 mi de una solución 100 mM de ZnS04. Este tratamiento conduce a la hidrólisis del ARN contenido en las VLP de Qb. Después de la diálisis contra 20 mM Hepes, pH 7.5 usando un tubo de diálisis (corte M CO 300000), se agregó CpG-2006 a una solución VLP 130 nmol/1 mi y se incubó durante 3 horas a 37°C bajo agitación a 650 rpm. La eliminación de CpG-2006 sin empacar se logró por un tratamiento posterior con 50 U/ml de benzonasa (Meck) por 3 horas a 37°C en presencia de 1 mM MgCl2 seguido por diálisis contra 20 mM Hepes, pH 7.5 como se describe arriba. El empaque de CpG-2006 se verificó por una electroforesis en gel de agarosa teñida con bromuro de etidio para visualización de los ácido nucleicos y posteriormente con azul de Coomassie para visualización de la proteina. Además de las VLP empacadas se analizaron en geles de TBE-urea y se estimaron las cantidades de los oligonucleótidos CpG empacados. Alrededor de 6.7 nmol de CpG-2006 se empacaron en 100 ug Qb VLPs . Se inmunizaron subcutáneamente ratonass en Balb/c con 1.9 B.U del extracto de polen de pasto (5-gras.mix Pangramin, Abello, preparado para centeno, perenne, pastos de huertos, fleo, pasto azul de Kentucky y polen de las praderas) mezclados con uno de los siguientes: 50 µ? Qb VLP solamente, 50 g Qb VLP cargado y empacado respectivamente con CpG-2006 o 3 mg de hidróxido de aluminio (Imject, Pierce). 14 días después se reforzaron los ratones con las mismas preparaciones de vacuna y se hicieron sangrar el día 21. Las respuestas IgG« en los sueros del día 21 se evaluaron por ELISA. Como se muestra en la figura 10, la presencia de las VLP cargadas y empacadas respectivamente con CpG-2006 mejoró la respuesta de IgG2b contra el extracto de polen. No se indujo ningún extracto de polen contra IgE en presencia de las VLP Qb cargadas y empacadas respectivamente con CpG-2006, cuando estaban en presencia de alumbre se observó una gran respuesta IgE. En contraste el alumbre cargó y empacó Qb-VLP respectivamente con CpG-2006 que no indujo los anticuerpos IgGl. Esto indica la ausencia de una respuesta desviada TH2. EJEMPLO 12 VLP que contienen oligonucleótidos CpG inducen las respuestas IgG contra el extracto de polen de pasto co-administrado en ratones alérgicos . Las VLP formadas por la proteina de recubrimiento de bacteriófago de ARN Qb se usaron para este experimento. Se usar.on después de empacar con los oligonucleótidos CpG-2006 (SEQ ID NO: 114) como se describe en EJEMPLO 11. Se sensibilizaron subcutáneamente los ratonas Balb/c con 1.9 B.U. con extracto de polen de pasto (ver ejemplo 11) mezclado con 3mg de hidróxido de aluminio (Imject, Pierce) . 14 dias después, se reforzaron los ratones con la misma preparación de vacuna. Se dejó sin tratar un grupo de ratones. Los grupos adicionales se sometieron a un tratamiento de de s en s ibi 1 i zaci ón en el dia 21, día 28 y día 35 por inyección de 1.9 B.U. del extracto de polen de pasto solamente o mezclado con uno de los siguientes: 50 µg Qb VLP solo, 50 µg Qb VLP cargado y empacado respectivamente con CpG- 2006 o 3 mg de Alum (Imject, Pierce) . Se desensibilizó un grupo adicional de ratones con 50 µg Qb VLP cargado y empacado respectivamente con Cpg- 2006. Las respuestas IgG de los sueros en los dias 14, 21, 28 , 35 y 42 se evaluaron por ELISA. Como se muestra en la figura 11 en presencia de polen y las VLP cargados y empacados respectivamente con CpG-2006 se indujo una respuesta fuerte con IgG2b contra el extracto de polen que estuvo ausente en los ratones sin tratar o con los ratones tratados con extracto de polen. La respuesta IgGl fue superior para los ratones desensibilizados con las VLP Qb cargados y " empacados respectivamente con CpG-2006, que para los ratones solamente tratados con extracto de polen. Los ratones sin tratar y los ratones tratados con Qb VLPs cargados y empacados respectivamente con CpG-2006 en ausencia de polen no indujeron los anticuerpos IgGl.

EJEMPLO 13 VLP que contiene noligonucleótidos CpG inducen las respuestas IgG contra el extracto de polen de árbol co-administrado en ratones alérgicos. Las VLP formadas por la proteína de recubrimiento de bacteriófago de ARN Qb se usaron para este experimento. Se usaron después de empacar con los oligonucleótidos CpG-2006 (SEQ ID NO: 114) como se describe en EJEMPLO 11. Se sensibilizaron subcutáneamente ratonas Balb/c con extracto de polen de árboles. Un grupo de ratones recibe 2 B.U. de la mezcla de extracto de polen de árbol (3 mezclas de árboles, Abello) que contiene extractos de polen de Alnus glutinosa, Betula verrucosa y Corylus avellana. Un segundo grupo recibe solamente el extracto de Alnus glutinosa , el grupo 3 recibe extracto de Betula verrucosa solamente y el grupo 4 recibe extracto de Corylus avellana solamente y el grupo 5 recibe solamente extracto de polen de cedro japonés {Cryptomeria japónica) . 14 días después se refuerzan los ratones con la misma preparación de vacunas. Se deja sin tratar un grupo de ratones. Los grupos adicionales se someten a un tratamiento de desensibilización el día 21, día 28 y día 35 por inyección de 2 B.U. por extracto de polen de árbol que se usó para la sensibilización. Este extracto correspondiente se usa solo o mezclado con uno de los siguientes: 50 µg Qb VLP solamente, 50 g Qb VLP cargado y empacado respectivamente con CpG-2006 o 3 mg de hidróxido de aluminio (Imject, Pierce) . Las respuestas IgG en suero de los días 14, 21, 28, 35 y 42 se evalúan por ELISA. EJEMPLO 14 VLP que contienen oligonucleótidos CpG inducen las respuestas IgG contra el extracto del alérgeno de gato co-administrados en ratones alérgicos . Las VLP formadas por la proteina de recubrimiento de bacteriófago de ARN Qb se usaron para este experimento. Se usaron después de empacar con los oligonucleótidos CpG-2006 (SEQ ID NO: 114) como se describe en EJEMPLO 11 Dos grupos de ratonas Balb/c se sensibilizaron subcutáneamente con un alérgeno de gato que corresponde a 0.5 µ9 y 5 ? de proteina Feldl . 14 días después se refuerzan los ratones con la misma preparación de vacunas. Se deja sin tratar un grupo de ratones. Los grupos adicionales se someten a un tratamiento de desensibilización en el día 21, 28 y día 35 por inyección del mismo alérgeno de gato que se usó para la sensibilización. Este extracto correspondiente se mezcla solo o con alguno de los siguiente: 50 µg Qb VLP solamente, 50 µg Qb VLP cargado y empacado respectivamente con CpG-2006 o 3 mg de hidróxido de aluminio (Imject, Pierce) . Las respuestas IgG en los sueros de los días 14, 21, 28, 35 y 42 se evalúan por ELISA. EJEMPLO 15 VLP que contienen GIO-PO inducen las respuestas IgG contra un extracto de alérgenos co-administrados . Las VLP formadas por la proteina de recubrimiento de bacteriófago de ARN Qb se usa para este experimento. Se usaron sin tratar o después de empacar con GIO-PO (SEQ ID NO: 122) Se logró el empaque de G10 por el siguiente método: Desensamble: 45 mg 0_ß VLP (como determina por el análisis Bradford) en PBS (20 mM fosfato, 150 m NaCl, pH 7.8) se reduce con 5 mM DTT durante 15 minutos a temperatura ambiente bajo condiciones de agitación. Una segunda incubación de 30 minutos a temperatura ambiente bajo condiciones de agitación seguida después de la adición de cloruro de magnesio hasta una concentración final de 700 mM conduce a la precipitación del ARN. La solución se centrifuga 10 minutos a 1000 g a 4°C con objeto de aislar el ARN precipitado en el peletizado. El dimero de proteina recubierto ?ß desensamblado en el sobrenadante se usa directamente para las etapas de purificación por cromatografía. Método de purificación de 2 etapas de la proteina de recubrimiento Q/3 desensamblada por cromatografía por intercambio de iones y cationes . El sobrenadante de la reacción de desensamble que contiene la proteína de recubrimiento desensamblada y el ARN restante se aplican sobre una SP-Sepharose FF. Durante la corrida que se efectúa a temperatura ambiente con una relación de flujo 5ml/min se observa la absorbancia a 260nm y 280nm. Se equilibró la columna con solución amortiguadora de fosfato de sodio 20mM pH , 150 mM .NaCl; la muestra se diluyó 1:10 para lograr una conductividad debajo de 10mS/cm. La etapa de elución (en fracción de 5ml) seguido de un gradiente de fosfato de sodio 20mM y cloruro de sodio 500mM con objeto de aislar el dimero de proteina de recubrimiento ?)ß puro de los contaminantes. Opcionalmente en una etapa posterior, el dimero de proteina de recubrimiento ?)ß aislado (la fracción eluida de la columna de intercambio de cationes) aplica sobre una Sepharose CL4B (Amersham pharmacia biotech) equilibrada con solución amortiguadora (fosfato de sodio 20 m, cloruro de sodio 250 mM; pH 7.2) . Se observa la absorbancia a 260 nm y 280 nm y se acumulan las fracciones que corresponden al dimero 0ß. Reensamble : El dimero de proteina de recubrimiento ?)ß purificado a una concentración de 1 mg/ml se usa para el reensamble de ?ß en presencia del oligodesoxinucleótido G10-PO. La concentración de oligodesoxinucleótido en la reacción de reensamble fue de 35 µ?. La concentración del dimero de proteina de recubrimiento en la solución de reensamble fue de 70µ . Se agregó urea a la solución para dar concentraciones finales de urea 1M. Alternativamente se agregó 2.5mM DTT además de la urea. Se agregó cloruro de sodio hasta una concentración total de 250mM. El oligodesoxinucleótido a empacarse durante la reacción de reensamble se agregó al final dando un volumen final de la reacción de reensamble de 25ml. Esta solución se diafiltró primero por- 100 minutos contra una solución amortiguadora que contiene fosfato de sodio 20mM, 250 mM NaCl, pH 7.2 usando una membrana Pellikon XL Biomax 5 con una M CO de 5 kDa a temperatura ambiente. Esto siguió por una segunda diafiltración sin o alternativamente después de la incubación con peróxido de hidrógeno 7 mM por una hora. En la segunda diafiltración, el fosfato de sodio 20mM, 150 mM NaCl, pH 7.2 usando una membrana Pellikon XL Biomax con un MWCO de 100 kDa o con una membrana de MWCO de 300 kDa se usó. Análisis de las VLP ?ß que se habían reensamblado en presencia de oligodesoxinucleótidos . A) Tamaño hidrodinámico de las cápsidas reensambladas : Las cápsidas ?,ß que se habían reensamblado en presencia de oligodesoxinucleótido G10-PO se analizaron por una dispersión de luz dinámica (DLS) y se compararon a las VLP Q3 intactos que se .habían purificado de E. coli. Las cápsidas reensambladas mostraron un tamaño hidrodinámico similar (que depende de la masa y la conformación) como los Qp VLP intactas . B) Formación del enlace bisulfuro en las cápsidas reensambladas : Las VLP ?)ß reensambladas se analizaron por SDS-PAGE no reductor y se compararon con las VLP ?)ß intactas que se habían purificado de E. coli. Las cápsidas reensambladas desplegaron un patrón similar de enlace de bisulfuro con la presencia de pentámeros y hexameros como las VLP Q£ intactas. C) Análisis del contenido de ácido nucleico de las VLP ?)ß que se habían reensamblado en presencia de oligodesoxinucleótido por electroforesis de agarosa y por desnaturalización de la electroforesis de poliacrilamida TBE-Urea: Las VLP ?)ß reensambladas se cargaron sobre un gel de agarosa al 1% y se tiñeron con bromuro de etidio y azul brillante Coomassie. Las VLP reensambladas ?)ß se trataron con la proteinasa K como se describe en el ejemplo 18. Luego se mezclaron las reacciones con una solución amortiguadora de muestra de TBE-Urea y se carga en un gel TBE-Urea y poliacrilamida al 15%. Como un estándar cualitativo así como cuantitativo, 10 pmol, 20 pmol y 40 pmol del oligodesoxinucleótido que se usa para la reacción de reensamble se carga sobre el mismo gel. Este gel se tiñe con SYBR®-Gold (Molecular Probes Cat. No. S-11494). El teñido SYBR®-Gold muestra que las cápsidas reensambladas f> que contienen el ácido nucleico que comigra con los oligodesoxinucleótidos que se usan en la reacción de reensamble. El gel de agarosa mostró la misma migración de la tinción de oligonucleótido y la tinción de proteínas. Al tomarse juntos, la comigración de ácido nucleico de las VLP ?)ß con la proteína y el aislamiento del oligodesoxinucleótido de las partículas purificadas por digestión con la proteinasa K demuestra el empaque del oligodesoxinucleótido. Se sensibilizaron subcutáneamente ratonas Balb/c con extracto de polen de pasto o extracto de pelo de gato como se describe en los EJEMPLOS 11 y 1 . Un grupo de cada grupo de ratones sensibilizados se dejó sin tratar. Los grupos adicionales se someten al tratamiento de desensibilización el día 21, día 28 y día 35 por inyección del mismo extracto de alérgenos que se usó para la sensibilización. El extracto correspondiente se usa solo o se mezcla con. uno de los siguientes: 50 µg Qb VLP solamente, 50 µg Qb VLP cargado y empacado respectivamente con G10-PO o 3 mg de hidróxido de aluminio (Imject, Pierce) . Las respuestas IgG en los sueros de los días 14, 21, 28, 35 y 42 se evalúan por ELISA. EJEMPLO 16 Clonación del gen de proteína de recubrimiento AP205 El ADNc de la proteína de recubrimiento AP205 (CP) (SE-Q ID NO: 90) se ensambla a partir de 2 fragmentos de ADNc generados del fago AP205 ARN al usar una técnica PCR de transcripción inversa y clonación en el plásmido comercial pCR 4-TOPO para formación de secuencias. Las técnicas de transcripción inversa son bien conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en el arte relevante. El primer fragmento contenido en el plásmido p205-246 contiene 269 nucleótidos en dirección ascendente de las secuencias CP y 74 nucleótidos . que codifican los primeros- 24 aminoácidos en la terminal N del CP. El segundo fragmento contenido en el plásmido p205-262 contiene 364 nucleótidos que codifican los aminoácidos 12-131 de CP y 162 nucleótidos adicionales en la dirección descendente de la secuencia CP. Ambos p205-246 y p205-262 fueron un obsequio generoso de J. Klovins. El plásmido 283-58 se diseño por un PCR de 2 etapas con objeto de fusionar ambos fragmentos CP de los plásmidos p205-246 y p205-262 en una secuencia CP de longitud completa. Un cebador ascendente pl.44 que contiene el sitio Ncol para clonación en el plásmido pQbl85 o pl.45, contiene el sitio Xbal para clonación en el plásmido pQblO y un cebador en dirección descendente pl.46 contiene el sitio de restricción Hindi se usaron (secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción subrayada) : pl .44 5'- C _ATG_GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3' (SEQ ID NO: 100) pl.455' -WCTAG?ATmC GCGC?CCCTCCCGG-3, (SEQ ID NO: 101) pl.465' -NNAAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3' (SEQ ID NO: 102) Dos sevadores adicionales pl.47 que se combinan en los pares bases en la terminación 5' de fragmento contendido en p205-262 y pl.48 se combinan en la terminación 3' del fragmento contenida en el plásmido p205-246 se usaron para amplificar los fragmentos en la primer PCR. Los cebadores pl.47 y pl.48 son complementarios uno del otro. pl.47: 5' H_¾CT(_¾CC-AACnO-OT (SEQ ID NO: 103) pl.48: 5'-CAGACTTGCTGAAAATGTAG^^ (SEQ ID NO: 104) En las primeras 2 reacciones por PCR se generaron 2 fragmentos . El primer fragmento se generó con los cebadores pl.45 y pl.48 y la plantilla p205-246. El segundo fragmento se generó con los cebadores pl.47 y pl.46 y la plantilla p205-262. Ambos fragmentos se usaron como plantillas para la segunda reacción por PCR, una extensión de traslape de empalme con la combinación del cebador pl.45 y pl.46 o pl.44 y pl.46. El producto de las 2 reacciones PCR de segunda etapa se digirieron con Xbal o Ncol respectivamente, y Hindi y se clonaron con los mismos sitios de restricción en pQblO o pQbl85 respectivamente, 2 vectores de expresión derivados de pGEM bajo el control del promotor de operon de triptofano de E. coli . Se obtuvieron 2 plásmidos, pAP283-58 (SEQ ID NO: 91) que contienen la codificación del gen para wt AP205 CP (SEQ ID NO: 90) en pQblO, y pAP281-32 (SEQ ID NO: 94) con la mutación Pro5? Thr (SEQ ID NO: 93), en pQbl85. La proteina de recubrimiento en sus secuencias se verificó por formación de secuencia de ADN. PAP283-58 contiene 49 nucleótidos en la dirección ascendente del codon ATG de CF, dirección descendente del sitio Xbal y contiene el sitio de enlace ribosomal de la proteina de recubrimiento de ARNm. EJEMPLO 17 Expresión y purificación del AP205 VLP recombinante. A. Expresión del AP205 VLP recombinante E. coli se transformó con el plásmido pAP283-58. 5ml del medio liquido de LB con 2(^g/ml de ampicilina se inocularon con una colonia sencilla y se incubaron a 37°C por 16-24 h sin agitación. El inoculo preparado se diluyó 1:100 en 100-300 mi de medio LB que contiene 20µ?/?t?1 de ampicilina y se incubó a 37°C durante la noche sin agitación. El segundo inoculo resultante se diluyó en 1:50 en medio 2Ty que contiene 0.2% de glucosa y fosfato para amortiguamiento y se incubó a 37°C durante la noche en un agitador. Las células se cosecharon por centrifugación y se congelaron a -80°C. B. Purificación de VLP recombinante Soluciones y soluciones amortiguadoras: Solución amortiguadora de lisis 50mM Tris-HCl pH 8.0 con 5mM EDTA, 0.1% tritonXlOO y PMSF a 5 microgramos por mi SAS Sulfato de amonio saturado en agua. NET amortiguadora. 20 mM Tris-HCl, pH 7.8 con 5mM EDTA y 150 mM NaCl. PEG 40%(p/v) polietilenglicol 6000 en NET Lisis : Se volvieron a suspender células congeladas en solución amortiguadora de lisis a 2 ml/g por células. La mezcla se sónico con 22 kH 5 veces por 15 segundos con intervalos de 1 min hasta enfriar la solución sobre hielo. Luego se centrifugó el lisado por 20 minutos a 12 000 rpm usando un rotor F34-6-38 (Ependorf ) . Las etapas de centrifugación abajo descritas se efectuaron todas- usando el mismo rotor excepto que se establezca de otra manera. Se almacenó el sobrenadante a 4°C mientras que se lavaron los desechos celulares 2 veces con solución amortiguadora de lisis. Después de la centrifugación, se acomodaron los sobrenadantes de lisado y las fracciones de lavado. La precipitación con sulfato de amonio se puede además usar para purificar AP205 VLP. En una primera etapa, una concentración de sulfato de amonio a la cual AP205 VLP no se precipita se escoge. Se descarta el peletizado resultante. En la .siguiente etapa, una concentración de sulfato de amonio a la cual AP205 VLP se precipita cuantitativamente se selecciona y AP205 VLP se aisla del peletizado de esta etapa de precipitación por centrifugación (14 000 rpm, por 20 minutos) . El peletizado obtenido se solubiliza es solución amortiguadora NET.

Cromatografía : La proteina cápsida de los sobrenadantes acumulados se cargó en una columna de Sefarosa 4B (2.8 X 70 cm) y se eluyó con solución amortiguadora NET a una fracción de 4ml/horas. Las fracciones 28-40 se recolectaron y se precipitaron con sulfato de amonio a una saturación de 60%. Las fracciones se analizaron por SDS.PAGE y manchado Western con un antisuero específico para AP205 previo a la precipitación. El peletizado aislado por centrifugación se volvió a solubilizar en una solución amortiguadora NET y se cargó en una columna de sefarosa 2B (2.3 X 65 cm) eluida a 3 ml/h/fracción . Se analizaron las fracciones por SDS-PAGE y se recolectaron las fracciones 44-50 se acumularon y precipitaron con sulfato de amonio a una saturación del 60%. El peletizado aislado por centrifugación se volvió a solubilizar en .solución amortiguadora NET y se purificó sobre una columna de Sefarosa 6B (2.5 X 47 cm) , se eluyó a 3 ml/horas/fracció . Se analizaron las fracciones por SDS-PAGE. Las fracciones 23-27 se recolectaron, la concentración de sal se ajustó a 0.5 M y se precipito a PEG 6000 agregado a partir de una reserva de 40% en agua y hasta una concentración final de 13.3%. El peletizado aislado por centrifugación se volvió a solubilizar en solución amortiguadora NET y se cargó sobre la misma columna de Sefarosa 2B como arriba se eluyó de la misma manera. Las fracciones 43-53 se recolectaron y se precipitaron con sulfato de amonio a una saturación de 60%. El peletizado aislado por centrifugación se volvió a solubilizar en agua y la solución de proteina obtenida se dializó ampliamente contra el agua. Se pudo aislar alrededor de 10 mg de proteina purificada por gramo de células. El examen de las partículas de tipo virus en el microscopio de electrones mostró que fueron idénticas a las partículas de fagos. EJEMPLO 18 Ácido nucleicos inmunoestimuladores se pueden empacar en las VLP de HBcAg Las VLP de HBcAg cuando se producen en E. coli al expresar la proteína de fusión del antígeno de núcleo de la hepatitis B p33-HBcAg (HBc33) (ver ejemplo 1) contienen ARN que se puede digerir y eliminar así al incubar las VLP con RNasa A. Se debe observar que las VLP que contienen el péptido p33 se usaron solamente por razones de conveniencia y que las VLP de tipo silvestre se pueden usar similarmente en la presente invención. Hidrólisis enzimática de ARN. Las VLP HBcAg-p33 producidos recombinantemente a una concentración de 1.0 mg/ml en 1 x PBS en solución amortiguadora (KC1 0.2 g/L, KH2P04 0.2g/L, NaCl 8g/L, Na2HP04 1.15 g/L) pH 7.4, se incubaron en presencia de 300 µg/ml RNasa A (Qiagen AG, Suiza) por 3 horas a 37°C en un termo mezclador a 650 rpm.

Empaque de los ácido nucleicos inmunoestimul adores : Después de la digestión con ARN con RNasa A HBcAg-p33, se complementaron las VLP con 130 nmol/ml oligonucleótidos B-CpG, NKCpG , G10-PO (Tabla 1) . Similarmente , el Cyl50-1 de hebra sencilla de 150mero y el dsCyCpG-253 de hebra doble de 253mero, que ambos contienen copias múltiples de las porciones CpG se agregaron a 130 nmol/ml o 1.2 nmol/ml respectivamente y se incubaron en un termomezclador por 3 horas a 37°C. El ADN CyCpG-253 de hebra doble se produjo por clonación de un multimero de hebra doble de CyCpG en el sitio EcoRV de pBluescript KS . El plásmido resultante producido en azul de XLl en E.coli y aislado usando el plásmido Qiagen Endofree en un Giga Kit, se digirió con las endonucleasas de restricción Xhol y Xbal y los productos de restricción resultantes se separaron por electroforesis de agarosa. Se aisló en inserto de 253 pares base por electro-elución y purificación con etanol. Se verificó la secuencia al formar las secuencias de ambas hebras. Tabla 1: Terminología y secuencias de los ácido nucleicos de los inmuno estimuladores usados en los ejemplos.

Las letras minúsculas indican desoxinucleótidos conectados por medio de enlaces de fosforotioato mientras que las letras mayúsculas indican desoxinucleótidos conectados por medio de enlaces fosforo diéster.

Tratamiento con DNAsa I: Las VLP empacadas con HBcAg-p33 se sometieron posteriormente a una digestión con DNasal (5 U/ml) durante a 3 horas a 37°C (DNasal, libre de RNasa Fluka AG, Suiza) y se dializaron ampliamente (en un volumen de 200 contra 2 X) por 24 horas contra ' PBS pH con' una membrana de diálisis 300 kDa M CO (Spectrum Medical Industries Inc., Houston, USA) para eliminar la RNasa A y el exceso de CpG oligonucleótidos . Tratamiento con benzonasa: Ya que algunos oligodesoxinucleotidos de hebra sencilla fueron parcialmente resistentes al tratamiento con DNasal, se usó el tratamiento con benzonasa para eliminar los oligonucleótidos libres de la preparación. 100-120 U/ml de benzonasa (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y 5 mM MgCl2 se agregaron y se incubaron por 3 horas a 37°C antes de la diálisis. Diálisis: Las preparaciones VLP empacadas con ácido nucleicos inmunoestimuladores usados en experimentos de inmunización con ratones se dializaron ampliamente (2 x contra un volumen de 200 veces) por 24 horas contra PBS pH 7.4 con una membrana de 300 kDa MWCO (Spectrum Medical Industries, Houston, US) , para eliminar las enzimas agregadas y los ácidos nucleicos libres. Analítica de empaque: liberación de ácidos nucleicos inmuno estimuladores empacados: A 50 µ? de solución cápsida de 1 µ? de proteinasa K (600 U/ml, Roche, Mannheim, Alemania), 3 µ? 10% de solución SDS y 6µ1 de solución amortiguadora de proteinasa 10 veces (0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, 0.1 M Tris pH 7.4), se agregaron y se incubaron posteriormente durante la noche a 37°C. Las VLP se hidrolizaron terminados bajo estas condiciones. Se inactivo la proteinasa K por calentamiento por 20 minutos a 65°C. Se agregó 1 µ? RNAsa A (Quiagen, 100 µq/ l, diluido 259 veces) hasta 25 µ? de cápsida. 2-30 de cápsida se mezclaron con un volumen de solución amortiguadora de carga 2 x (lxTBE, 42% p/v urea, 12% p/v Ficoll, 0.01% de azul de bromo fenol), calentado por 3 minutos a 95°C y se cargaron en' un gel de poliacrilamida de urea/TBE al 10% (para oligonucleótidos de alrededor de 20 nucleótidos de longitud) o 15% (para > que ácidos nucleicos 40 meros) (Invitrogen) . Se cargaron muestras alternativas sobre un gel de agarosa en 1% con un colorante de carga 6x (10 mM Tris pH 7.5, 50 mM EDTA, 10% v/v glicerol, 0.4% naranja G) . Los geles de TBE/urea se tiñeron con SYBRGold y los geles de agarosa se tiñeron con bromuro de etidio . La figura 12 muestra el empaque de los oligonucleótidos G10-PO- y HBc33. El contenido de los ARN en las VLP se redujo fuertemente después del tratamiento con RNasa A (Fig. 12A) aunque la mayoría de la cápsida migró como una substancia grasosa de migración lenta que se debe presumiblemente al retiro del ARN cargado negativamente (Fig.l2B). Después de la incubación con un exceso de oligonucleótidos , las cápsidas contenían una cantidad de ácido nucleico que las cápsidas tratadas con RNAsa y por lo tanto migraron a una velocidad similar como las cápsidas sin tratar. El tratamiento adicional con DNAsa I o benzonasa degradó los oligonucleótidos libre mientras que los oligonucleótidos empacados en las cápsidas no se degradaron lo que muestra claramente un empaque de los oligonucleótidos. El hallazgo de que los oligonucleótidos reestablecen la migración de las cápsidas, demuestra claramente el empaque de los oligonucleótidos . Se han obtenido resultados y cifras análogas para los otros oligonucleótidos utilizados e indicados dentro de este ejemplo. EJEMPLO 19 Reensamble desensamble y empaque de ?ß Desensamble y reensamble de VLP de Q/3 Desensamble : 10 mg VLP de ?)ß (también denominado de manera intercambiable de cápsidas QP) (como se determina por el análisis Bradford) en 20 mM HEPES, pH 7.4, NaCl a 150 mM se · precipitó con sulfato de amonio sólido a una saturación final de 60%. Se efectuó la precipitación durante la noche a 4°C y se sedimentaron las VLP precipitados por centrifugación por 60 minutos a 4°C (SS-34 rotor) . Se volvieron a suspender los peletizados en 1 mi de clorohidrato de guanidina 6 M (GuHCL) que contiene 100 mM DTT (concentración final) y se incubaron por 8 horas a 4°C. Purificación de la proteína de recubrimiento ?)ß por cromatografía de exclusión de tamaño: Se clarificó la solución durante 10 minutos a 14000 rpm (Eppendorf 5417 R, en un rotor de ángulo fijo F45-30-11 usado en todas las etapas siguiente) y se dializó contra una solución amortiguadora que contiene urea 7 M, 100 mM TrisHCl, pH 8.0, 10 mM DTT (2000 mi) durante la noche. Se intercambió la solución amortiguadora de diálisis una vez y la diálisis continuó por otras 2 horas. Se centrifugó la suspensión resultante a 14 000 rpm por 10 minutos a 4°C. Se descartó un sedimento despreciable y se mantuvo el sobrenadante como una fracción de carga que contiene la proteina de recubrimiento desensamblada y el AR . La proteina de concentración se determinó por un análisis Bradford y se aplicaron 5 mg de proteina total sobre una columna grado preparación HiLoad™ Superdex™ 75 (26/60, Amersham Biosciences) equilibrada con urea 7 M 100 mM TrisHCl y 10 mM DTT. Se efectuó la cromatografía de exclusión de tamaño con la solución amortiguadora de equilibrio (7 M urea, 100 mM TrisHCl pH 8.0, 10 mM DTT) a 12°C con una relación de flujo a 0.5 ml/min. Durante la absorbancia de elución a 254 nm y 280 nm se observó. Se aislaron 2 picos. Un pico de alto peso molecular antecedió a un pico de menor peso molecular aparente. Se recolectaron los picos en fracciones de 1.5 mi y se analizaron las alícuotas por SDS-PAGE seguida por tinción de Coomassie así como tinción SYBR®Gold. Esto mostró que el ARN puede separarse de la proteína de recubrimiento que se eluyó en el segundo pico. Purificación de la proteína de recubrimiento ?)ß por cromatografía de intercambio de iones: Alternativamente el sobrenadante clarificado se dializó contra una solución amortiguadora que contiene 7 M urea, 20 mM MES, 10 mM DTT, pH 6.0 (2000 mi) durante la noche. La solución amortiguadora de diálisis que intercambió 1 vez y la diálisis continuó por otras 2 horas. La suspensión resultante se centrifugó a 14000 por 10 minutos a 4°C. Se descartó un sedimento despreciable y se mantuvo el sobrenadante como la fracción de carga que contiene una proteína de recubrimiento sin ensamblar y el ARN. Se determinó la concentración de proteínas por un análisis Bradford y se diluyeron 10 mg de proteína total hasta un volumen final de 10 mi con solución amortiguadora A (ver a continuación) y se aplicó con una relación de flujo a 1 ml/min hasta una columna de 1 mi HiTrap™ SP HP (Amersham Biosciences, Cat . No. 17-1151-01) equilibrada con solución amortiguadora A: 7 M urea, 20 mM MES, 10 mM DTT, pH 6.0. El flujo de paso que contenía el ARN se recolectó como una fracción. Después de que se lavó ampliamente la columna con la solución amortiguadora A (30 CV) , la proteína de recubrimiento <2ß enlazado se eluyó en un gradiente lineal de 0%-100% de solución amortiguadora B (la duración del gradiente fue de 5 CV; solución amortiguadora A: ver arriba, solución amortiguadora B: 7 M urea, 20 mM MES, 10 mM DTT, 2 M NaCl, pH 6.0) . Durante la carga, el lavado y elución de la absorbancia a 254 nm y 280 nm se observó. Se recolectaron fracciones pico de 1 mi y se analizaron por SDS-PAGE seguido por tinción de Coomassie asi como tinción SYBROGold. Las fracciones que contienen la proteina de recubrimiento ?)ß pero no el ARN se identificaron y se ajustó el pH por adición de 100 µ? 1 M TrisHCl, pH 8.0. Las muestras que contienen la proteina de recubrimiento ?)ß pero no el ARN se acumularon y dializaron contra 0.87 M urea, 100 mM TrisHCl, 10 mM DTT (2000 mi) durante la noche y se intercambio la solución amortiguadora una vez que la diálisis continuó por otras 2 horas. La suspensión resultante se centrifugó a 14000 por 10 minutos a 4°C. Se descartó un sedimento despreciable y se mantuvo el sobrenadante como una proteina de recubrimiento sin ensamblar. Se determinó la concentración de proteina por análisis Bradford. ¦ Reensamble: La proteina de recubrimiento ?ß purificada con una concentración de 0.5 mg/ml se usó para el reensamble de las VLP en presencia de un oligodesoxinucleótido . Para la reacción de reensamble de oligodesoxinucleótido en un exceso de 10 veces sobre la cantidad teórica calculada de cápsidas ?ß-VLP (la concentración del monómero dividida por 180) . Después de que se mezcló la proteina de recubrimiento ?)ß con el oligodesoxinucleótido ha ser empacado durante la reacción de reensamble, esta solución (volumen de hasta 5 mi) se dializa primero por 2 horas contra solución amortiguadora 500 mi NET que contiene 10% de ß-mercaptoetanol a 4°C, luego se dializa en un modo continuo con un flujo de solución amortiguadora NET de 8 ml/h durante 72 horas a 4°C y finalmente por otras 72 h con el mismo modo continuo con una solución amortiguadora compuesta de 20 mM TrisHCl pH 8.0, 150 mM NaCl . La suspensión resultante se centrifugó a 14 000 por 10 minutos a 4°C. Se descartó un sedimento despreciable y el sobrenadante contenia el VLP ensamblado y empacado. Se determinó la concentración de proteínas por una análisis Bradford y si es necesario,' las VLP empacadas ' reensambladas se concentraron con un filtro centrifugo (Millipore, UFV4BCC25, 5 NMWL) hasta una concentración final de 3 mg/ml.

Purificación de las VLP reensambladas y empacadas: Se cargaron hasta 10 mg de proteína total sobre una columna Sepharosa™ (16/70, Amersham Biosciences) -equilibrada con 20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl . Se efectuó la cromatografía de exclusión de tamaño con una solución amortiguadora de equilibrio (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) a una temperatura ambiente con una relación de flujo 0.4 mi/ min. Durante la absorbancia de elución a 254 nm y 280 nm se observó. Se aislaron los picos. Un pico de alto peso molecular antecedió a un pico de aparente peso molecular menor. Se recolectaron fracciones de 0.5 mi y se identificaron por SDS-PAGE seguido por tinción de azul de Coomassie. La calibración de las columnas con las cápsidas 0ß altamente purificadas e intactas de E. coli, revelaron que el peso molecular aparente del primer pico principal fue consistente con las cápsidas ?)ß . Análisis de las VLP ?)ß que se habían reensamblado en presencia de los oligodesoxinucleótidos . A) Estructura global de las cápsidas: Las VLP de <2ß que se reensamblaron en presencia de uno de los siguientes desoxinucleótidos (CyOpA (SEQ ID NO: 127), Cy(CpG)20OpA (SEQ ID NO: 126), Cy(CpG)20 (SEQ ID NO: 125), CyCyCy (SEQ ID NO: 128), (CpG)20OpA) (SEQ ID NO: 124), ó en presencia de ARNt E. coli (Roche Molecular Biochemicals , Cat. No. 109541) se analizaron por microscopio de electrones (tinción negativa con acetato de uranilo pH 4.5) y se comparó con VLP Q intactos purificados de E. coli. Cuando un control negativo sirvió como una reacción de reensamble en donde se omitió el ácido nucleico. Las cápsidas reensambladas despliegan las mismas características y propiedades estructurales con las VLP ? intactas (figura 13) . B) Tamaño hidrodinámico de las cápsidas reensambladas : Las cápsidas ?ß que se habían vuelto ha reensamblar en presencia de los desoxioligonucleótidos se analizaron por una dispersión de luz dinámica (DLS) y se compararon con las VLP intactos ?)ß que se habían purificado de E. coli. Las cápsidas reensambladas mostraron el mismo tamaño hidrodinámico (el cual depende de la masa y la conformación) que las VLP intactos Q(5. C) Formación de enlaces bisulfuro en cápsidas reensambladas : Las VLP ?)ß reensambladas se analizaron por una electroforesis de gel de poliacrilamida nativo y se compararon con las VLP ?)ß intactas que se habían purificado de E. coli. Las cápsidas reensambladas desplegaron el mismo patrón de enlace con bisulfuro de las VLP Qp intactas. D) Análisis del contenido de ácido nucleico de las VLP 0ß que se habían vuelto a ensamblar con presencia de oligodesoxinucleótidos por electroforesis con gel de agarosa: Las VLP 0ß reensambladas con 5 µg se incubaron en un volumen total de reacción de 25µ ya sea con 0.35 unidades de Rnasa A (Qiange, Cat. No. 19101), 15 unidades de DNAsa I (Fluka, Cat. No. 31136) o sin ninguna adición adicional de enzimas por 3 horas a 37°C. Las VLP ?)ß intactas que se habían purificado de E. coli sirvieron como control y se incubaron bajo las mismas condiciones como se describen para las cápsidas que se habían vuelto a reensamblar en presencia de los oligodesoxinucleótidos. Luego se cargaron las reacciones sobre un gel de agarosa a 0.8% que se tiñó primero con bromuro de etidio (figura 14A) y posteriormente con azul Coomassie (figura 14B) . La tinción con bromuro de etidio muestra que ninguna de las enzimas agregadas puede digerir el contenido del ácido nucleico en las cápsidas ?ß reensambladas que el - contenido de ácido nucleico (esto es los oligodesoxinucleótidos ) se protege. Este resultado indica que los oligodesoxinucleótidos que se agregan se empacaron con las cápsidas recientemente formadas por la reacción de reensamble. En contraste, el contenido del ácido nucleico de las VLP <2ß intactas que se habían purificado con E. coli se degradó con la adición de RNAsa, lo que indica que el ácido nucleico en estos VLP consiste de ARN. Además, con la tinción de bromuro de etidio y la tinción de azul de Coomassie del gel de agarosa muestra que el ácido nucleico que contiene las VLP 0ß ( reensamblada y purificada de E. coli, respectivamente) están migrando alrededor del mismo tamaño lo cual indica que la reacción de reensamble conduce a las VLP de <2ß de tamaño comparable hasta las VLP ?)ß intactas que se habían purificado de E. coli. El gel muestra así que los oligodesoxinucleótidos protegidos con DNAsa I estuvieron presentes en la VLP <2ß reensamblada. Además, después de que se habían extraído los oligodesoxinucleótidos empacados por fenol/cloroformo se digirieron por DNAsa I, peor no por RNAsa. Los oligodesoxinucleótidos puede así empacarse exitosamente dentro de las VLP de <2ß después de un desensamble inicial de las VLP, purificación de la proteina de recubrimientos sin ensamblar a partir de ácido nucleicos y el reensamble posterior de las VLP en presencia de los oligodesoxinucleótidos . E) Análisis del contenido de ácido nucleico de las VLP ?)ß que se habían reensamblado en presencia de oligodesoxinucleótidos por una electroforesis TBE-Urea de poliacrilamida desnaturalizante : 40 µg de VLP reensamblado ?)ß (0.8 mg/ml) se incubaron en un volumen total de reacción de 60 µ? con 0.5 mg/ml de proteinasa K (grado PCR, Roche Molecular Biochemicals , Cat . No. 1964364) y una solución amortiguadora de reacción según las instrucciones del fabricante para 3 h a 37°C. Las VLP intactas <2ß que se habían purificado de E. coli sirvieron como controles y se incubaron por la proteinasa K bajo las mismas condiciones como se describen para las cápsidas que se hablan vuelto a reensamblar en presencia de oligodesoxinucleótidos. Las reacciones luego se mezclaron con solución amortiguadora de muestra de TBE-Urea, y se cargaron en un gel de TBE-Urea de poliacrilamida a 15% (Novex®, Invitrogen Cat. No. EC6885).. Como un estándar cualitativo asi como cuantitativo, 1 pmol, 5 pmol y 10 pmol de los oligodesoxinucleótidos que se usó para la reacción de reensamble se cargaron sobre el mismo gel. Este gel se cargó con ácido acético al 10%, metanol al 20%, equilibrado hasta un pH neutro y se tiñó con SYBROGold (Molecular Probes Cat. No. S-11494). La tinción con SYBR®Gold mostró que las cápsidas 0_ß reensambladas contenían ácido nucleico que migra con los oligodesoxinucleótidos que se usaron .en la reacción 'de reensamble. Observar que las VLP intactos 0_ß (que se habían purificado de E. coli) no contenían un ácido nucleico de tamaño similar. Al tomarse en conjunto el análisis del contenido del ácido nucleico de las VLP ?)ß que se habían vuelto a reensamblar en presencia de los oligodesoxinucleótidos, mostró que los oligodesoxinucleótidos se protegieron de la digestión con DNasa I, lo que significa que se empacaron) y que los oligodesoxinucleótidos agregados se pueden volver a aislar por medios adecuados (por ejemplo digestión de proteinasa K de las VLP 0_ß) . La figura 13 muestra micrográficas de electrones de las VLP <2ß que se volvieron a ensamblar en presencia de diferentes oligodesoxinucleótidos. Las VLP se habían vuelto a ensamblar en presencia de los oligodesoxinucleótidos adecuados o en presencia del ARNt pero no se habían purificado hasta una suspensión homogénea por cromatografía de exclusión de tamaño. Un control casi positivo sirvió para la preparación de las VLP 0_ß intactas que se habían purificado de E. coli: De manera importante al agregar cualquiera de los ácidos nucleicos indicados durante la reacción de reensamble, se pudieron formar las VLP del tamaño y conformación correctos, cuando se compararon con el control positivo. Esto implica que el proceso de reensamble general es independiente de la secuencias de los nucleótidos y la longitud de los oligodesoxinucleótidos usados. Observe que al agregar los ácidos nucleicos durante la reacción de reensamble se requiere para la formación de las VLP 0ß ya que no se habían formado partículas si se omitieran los ácidos nucleicos de la reacción de reensamble. La figura 14 muestra el análisis del contenido del ácido nucleico de las VLP ?)ß reensamblados por tratamiento con nucleasa y electroforosis con gel de agarosa: 5 µg de las VLP reensamblados y purificados con ?)ß y 5 µg de las VLP ?)ß que se habían purificado con E. coli respectivamente, se trataron como se indica. Después de este tratamiento, se mezclaron las muestras con el colorante de carga y se cargaron con un gel de agarosa al 0.8%. Después de la corrida se tiñó el gel primero de gel de etidio (?) y después la documentación del mismo gel se tiñó con azul de Coomassie (B) . Observar que el contenido del ácido nucleico de las VLP <2ß purificados y reensamblados fueron resistentes a la digestión de Rnasa A mientras que el contenido del ácido nucleico de las VLP ?)ß purificados de E. coli se digirieron con la incubación RNAsa A. Esto indica que el contenido de ácido nucleico de las cápsidas ?)ß reensambladas consiste de desoxinucleótidos de que por supuesto se protegen de la digestión con RNAsa A. Así se empacaron los oligodesoxinucleótidos en VLP ?)ß durante la reacción de reensamble. EJEMPLO 20 Desensamble, purificación y reemsamble de AP205 y empaque de los ácidos nucleicos inmunoestimuladores . A. Desensamble y reemsamble de AP205 VLP a partir de material que puede reensamblarse sin adición de oligonucleótido . Desensamble: 40 mg de un AP205 VLP (SEQ ID NO: 90 o 93) purificado liofilizado GuHCI se volvieron a solubilizar en 6 M 4 mi y se incubaron durante la noche a 4°C. La mezcla de desensamble se centrifugó a 8000 rpm (Eppendorf 5810 R, en un rotor de ángulo fijo F34-6-38, usado en todas las etapas siguientes) . Se volvió a solubilizar el peletizado en urea 7 M mientras que se dializó en sobrenadante 3 días contra una solución amortiguadora NET (20 mM Tris-HCl, pH 7.8 con 5mM EDTA y 150 mM NaCl) con tres cambios de solución amortiguadora. Alternativamente se efectúo la diálisis en un modo continuo durante 4 dias . La solución dializada se centrifugó a 8000 rpm por 20 minutos y se volvió a solubilizar el peletizado en urea 7M mientras que se peletizaba el sobrenadante con sulfato de amonio (saturación al 60%), y volvió a solubilizar en una solución amortiguadora de urea 7M que contiene 10 mM DTT. Todos los peletizados previos se volvieron a solubilizar en urea 7M se unieron y precipitaron con sulfato de amonio (saturación al 60%), y volvieron a solubilizar. la solución amortiguadora de urea 7M que contiene 10 mM DT . Los materiales que se volvieron a solubilizar en solución amortiguadora de urea 7 M que - contiene 10 mM DTT se unieron hasta que se cargaron en una columna Sephadex G75 equilibrada y eluida con una solución amortiguadora de urea 7 M que contiene 10 mM DTT a 2 ml/h. Eluyo un pico de la columna. Se recolectaron fracciones de 3 mi . Las fracciones pico que contienen una proteina de recubrimiento AP205 se acumularon y precipitaron con sulfato de amonio (saturación al 60%) . Se aisló el peletizado por centrifugación a 8000 rpm durante 20 minutos. Se volvió a solubilizar en urea 7 M, 10 mM DTT y se cargaron en una columna corta Sepharosa 4B (1.5 X 27 cm Sefarosa 4B, 2ml/h, 7 urea, 10 mM DTT solución amortiguadora de elución) . Principalmente un pico con un saliente pequeño que eluye de la columna. Las fracciones que contiene la proteina de recubrimiento AP205 se identificaron por SDS-PAGE, y se acumularon excluyendo las salientes. Esto produjo una muestra de 10.3 mi. La concentración de proteina se estimó por espectrofotométrica al medir una alícuota de proteína diluida 25 veces para la medición usando la fórmula siguiente: (1.55 X OD280 - 0.76 X OD260) X volumen. La concentración promedio fue de 1 nmol/ml de VLP (2.6 mg/ml) . La relación de absorbencia a 280 nm vs . 260 nm fue de 0.12/0.105.

Reensamble: se agregaron 1.1 mi beta-mercaptoetanol a la muestra y se prepararon las siguientes reacciones de reensamble . 1 mi de proteina de recubrimiento de AP205 sin ácidos nucleicos. - ~ 1 mi de proteina de recubrimiento de AP205 rRNA (approx. 200 OD260 unidades, lOnmol) 9 mi de proteina de recubrimiento de AP205 CyCpG (370 ul de 225 pmol/µ? solución esto es 83 nmol) . Estas mezclas se dializaron una hora contra 30 mi de solución amortiguadora NET que contiene 10% de mercaptoetanol . La mezcla que contiene ácidos nucleicos se dializó por separado. La diálisis se siguió en un modo continuo y un litro de solución amortiguadora NET se intercambio durante 3 días. Las mezclas de reacción se dializaron posteriormente con detalle contra el agua (5 cambios de solución amortiguadora) y se liofilizaron . Se volvieron a solubilizar en agua y se analizaron por EM. Todas las mezclas contenían cápsidas lo que muestra que el VLP AP205 en su reensamble es independiente de la presencia de ácidos nucleicos detectables cuando se mide por electroforesis de gel de agarosa usando tinción con bromuro de etidio y haciendo evidencia por un análisis EM. El procedimiento EM fue como sigue: se absorbió una suspensión de las proteínas en unas rejillas recubiertas con carbón-formvar y se tiñeron con ácido fosfotungstico al 2% (pH 6,8). Las rejillas se examinaron con un microscopio de electrones JE 100C (JEOL, Japan) a un voltaje de aceleración de 80 k.V. Se efectuaron los registros fotográficos (negativos) en una película de imágenes de electrones Kodak y se obtuvieron las micrográficas de electrones por impresión de los negativos en un papel Kodak Polymax. El VLP vuelto a ensamblar en presencia de CyCpG se purificó sobre una columna Sepharose 4B (1 X 50 cm) , se eluyó con una solución amortiguadora NET (1 ml/h) . Se analizaron las fracciones por un ensayo Ouchterlony y las fracciones que contienen VLP se acumularon. Esto resultó en una muestra de 8 mi, que se desaló contra agua por diálisis y se secó.. El rendimiento de la cápsida fue de 10 mg. El análisis del material resolubilizado en un gel de agarosa a 0.6% teñido con bromuro de etidio mostró que las cápsidas estaban vacías de ácidos nucleicos. Las muestras de la reacción de reensamble que contiene CyCpG que se toman después de la etapa de reensamble y antes de la diálisis detallada se analizaron en un gel de agarosa 0.6%. Una banda que migra a la misma altura de las VLP AP205 intactos y que tiñe con bromuro de etilio y tinción con azul de Coomassie se puede obtener lo que muestra que el VLP AP205 que contiene el oligodesoxinucleótido se había vuelto a ensamblar. Las etapas detalladas de diálisis que siguen el procedimiento de reensamble es probable que hayan conducido a la difusión del oligodesoxinucleótido fuera de las VLP. Significativamente, las VLP AP205 puede también volverse a ensamblar en ausencia de un oligodesoxinucleótido detectable cuando se mide por electroforesis de gel de agarosa usando tinción con bromuro de etidio. Los oligodesoxinucleótidos puede asi enlazarse exitosamente a AP205 VLP después de un desensamble inicial del VLP, la purificación de la proteina de recubrimiento sin ensamblar a partir de ácidos nucleicos y el reensamble posterior de las VLP en presencia de los oligonucleótidos . B. Reensamble de VLP de AP205 usando el material sin ensamblar que no vuelve a ensamblar en ausencia del oligonucleótido agregado. Desensamble: 100 mg de AP205 VLP purificado y seco recombinante se usaron para el desensamble como se describe arriba. Se efectuaron todas las etapas esencialmente como se describen bajo el desensamble en el parte A pero para el uso de la urea 8M para solubilizar los peletizados de las etapas de precipitación de sulfato de amonio y la omisión de la etapa de filtración con gel usando una columna CL-4B previo al reensamble. Las fracciones acumuladas de la columna Sephadex G-75 que contienen 21 mg de proteina cuando se determina por espectroscopia usando la fórmula descrita en la parte A. La relación de absorbancia a 280 nm a la absorbancia a 260 nm de la muestra fue de 0.16 a 0.125. La muestra se diluyó 50 veces para la medición.

Reensamble: La preparación de proteínas que resulta de la etapa de purificación con filtración de gel Sephadex G-75 se precipitó con sulfato de amonio a una saturación del 60% y el peletizado resultante se solubilizó en 2 mi 7 M -urea, 10 mM DTT . La muestra se diluyó con 8 mi de 2-mercaptoetanol al 10% en solución amortiguadora NET y se dializó por 1 hora contra 40 mi de 2 mercaptoetanol al 10% en solución amortiguadora NET. Se inició el reensamble al agregar 0.4 mi de una solución CyCpG (109 nmol/ml) a la muestra de proteína en la bolsa de diálisis. Se preparó la diálisis en un modo continuo y la solución amortiguadora NET se usó como una solución amortiguadora de elución. Se siguió la diálisis por 2 días y se tomó una muestra para el análisis E después de la terminación de esta etapa de diálisis (figura 44 B) . La solución de reensamble dializada se dializó posteriormente contra 50% v/v Glicerol en solución amortiguadora NET para lograr la concentración. Se efectuó un cambio de la solución amortiguadora después de un día de diálisis. Se siguió la diálisis por un total de tres días. La solución de reensamble dializada y concentrada se purifico por filtración de gel sobre una columna Sepharose 4-B (1X60 cm) a una relación de flujo de 1 ml/hora en solución amortiguadora NET. Se probaron las fracciones en un ensayo Ouchterlony y las fracciones que contienen cápsidas se secaron se volvieron a suspender en agua y se volvieron a cromatografiar en una columna 4-B equilibrada con 20 mM Hepes pH 7.6. Al usar una de las siguientes tres fórmulas: 1. (183* OD230nm -75.8*OD260nn>) * Volumen (mi) -2. ( (OD235nm -OD280nm/)2.51) x volumen -3. ( (OD228-5nm -OD23 -5nm) *0.37 ) x volumen se determinaron cantidades de proteínas de 6-26 mg de las VLP reensambladas . Las VLP reensambladas AP205 VLPs se analizaron por EM cornos se decribe arriba, electroforesis en gel de agarosa y SDC-PAGE bajo condiciones no reductoras . El análisis EM del material desensamblado muestra que el tratamiento del AP205 VLP con cloruro de guanidinio fragmenta esencialmente el ensamble de cápsida de VLP. El reemsamble de este material desensamblado con un oligonucleótido produce cápsidas (figura 15B) que se purifican y se enriqueció además por filtración de gel (Figura 15C) . Se obtuvieron dos tamaños de partículas, partículas de alrededor de 25 nm de diámetro y partículas más pequeñas son visibles en la micrográfica de electrones de la figura 44C. No se obtuvieron reensambles en ausencia de oligonucleótidos . La carga de las partículas reensambladas en la electroforesis de agarosa mostró que las partículas reensambladas, contenían ácido nucleico. La extracción del contenido de ácido nucleico por extracción con fenol y posterior carga en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio reveló que las partículas contenidas en el oligonucleótido usadas para el reemsanble (figura 45A) . La identidad del oligonucleótido empacado se controló por la carga de una muestra de este oligonucleótido lado a lado al material de ácido nucleico extraído de las partículas. El gel de agarosa en donde el AP205 VLP vuelto a ensamblarse habia cargado y teñido previamente con bromuro de etidio se tiñó posteriormente con azul de Coomassie, lo que revela una comigración del contenido de oligonucleótido con el contenido de proteína de las partículas (figura 16B) , lo que muestra que el oligonucleótido se había empacado en las partículas. La carga del AP205 VLP vuelto a ensamblar en un gel SDS-PAGE, que corre en ausencia de un agente reductor, demostró que las partículas reensambladas habían formado puentes de disulfuro como es el caso del AP205 VLP sin tratar. Adicionalmente, el patrón del puente de disulfuro es idéntico a las partículas sin tratar. Se detalla 15A una micrográfica de electrones de la proteína AP205 VLP sin ensamblar mientras que en la figura 15B muestra las partículas reensambladas antes de la purificación. La figura 15C muestra una micrográfica de electrones de las VLP AP205 purificados vueltos a ensamblar. La amplificación de la figura 15A-C es 200 000 X. La figura 16 A y B muestra las VLPs AP205 de reensamblados analisados por el electroforess de gel de agarosa. Las muestras cargadas en el gel de ambas figuras fueron de izquierda a derecha: AP205 VLP sin tratar, 3 muestras con una cantidad diferente de AP205 VLP reensam lada con CyCpG y purificadas y Qp VLP sin tratar. El gel en la figura 16 A se tiñó con bromuro de etidio mientras que el mismo gel se tiñó con bromuro de etilio mientras que el mismo gel se tiñó con azul, sie en la figura 16 B. EJEMPLO 21 Ácidos nucleicos inmunoestimuladores se pueden empacar en las VLP de ?ß. Acoplamiento de los péptidos p33 a VLP de 0_ß: Las partículas tipo virus producidas recombinantemente del bacteriófago de ARN Qb (QP VLPs) se usaron sin tratar o después del acoplamiento con los péptidos p33 que contienen un CGG en la terminal N o una extensión GGC en la terminal C (CGG-KAVYNFATM (SEQ ID NO: 115) y KAVYNFATM-GC (SEQ ID NO: 131)) . Las VLP Qp producidos recombinantemente se derivaron con un exceso 10 molar de SMPH (Pierce) por 0.5 h a 25°C, seguido por diálisis contra 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2 a 4°C para retirar el SMPH sin reaccionar. Se agregaron péptidos en un exceso molar 5 veces y se dejaron reaccionar por 2 horas en un termomezclador a 25°C en presencia de acetonitrilo al 30%. La figura 17 muestra el análisis SDS-PAGE que demuestra bandas de acoplamiento múltiples que consisten de uno, dos o tres péptidos acoplados al monómero <2ß (Arrows, figura 17) . Por cuestión de simplicidad, el producto de acoplamiento del péptido p33 y las VLP <2ß se denomina en particular a través de la sección de ejemplos Qbx33. Se debe observar que las VLP que contienen el péptido p33 se usaron solamente por razones de conveniencia y que las VLP de tipo silvestre pueden similarmente usarse en la presente invención. Las VLP ?ß cuando se producen en E.coli al expresar la proteina cápsida del bacteriófago ?)ß contiene ARN que se pueden digerir y eliminar asi al incubar las VLP con RNasa A.

Resistencia iónica baja y concentración <2ß baja permite la hidrólisis de ARN de las VLP ?)ß por RNasa A: Las VLP Qp a una concentración de 1.0 mg/ml en 20mM Hepes/150mM NaCl de solución amortiguadora (HBS) pH 7.4 se digirieron directamente por la adición de RNasa A (300 µg/ml, Qiagen AG, Suiza) o se diluyeron con 4 volúmenes de H20 hasta una concentración final de 0.2 x HBS y luego se incubaron con RNasa A (60 µg/ml, Qiagen AG, Suiza). Se dejo la incubación por 3 horas a 37°C en un termomezclador a 650 rpm. La electroforesis en gel de agarosa y la tinción con bromuro de etidio demostró que en lxHBS solamente se observó una reducción muy débil del contenido de ARN mientras que en 0.2 x HBS se hidrolizo la mayoría del ARN. De acuerdo, la migración de cápsida estuvo sin cambiar después de la adición de RNasa A en lx HBS, mientras que la migración fue más lenta después de la adición de RNasa en 0.2xHBS. Baja resistencia iónica incrementa el empaque de ácido nucleico en las VLP ?)ß. Después de la digestión con RNasa A en 0.2 xHBS, las VLP QP se concentraron hasta 1 mg/ml usando concentradores Millipore Microcon o Centriplus y alícuotas de dializaron contra 1 x HBS o 0.2 x HBS. Las VLP ?ß se complementaron con 130 nmol/ml CpG-oligonucleótido B-CpG y se incubaron en termomezclador por 3 horas a 37°C. Posteriormente, las VLP de ?)ß se sometieron a digestión con benzonasa (100 U/ml) por 3 horas a 37°C. Se analizaron las muestras en geles de agarosa al 1% después de teñir con bromuro de etidio o azul de Coomassie. Se demostró que en IxHBS solamente una cantidad muy baja de oligonucleótidos se puede empacar mientras que en 0.2 x HBS fue detectable una fuerte banda teñida con bromuro de etidio que se colocaliza con la tinción de azul, Coomassie de las cápsidas. Diferentes ácidos nucleicos inmunoestimuladores que puede empacar en las VLP ?)ß y Qbx33. Después de la digestión con RNasa A en 0.2 x HBS las VLP ?)ß o las VLP Qbx33 se concentraron hasta 1 mg/ml, usando concentradores Millipore Microcon o Centriplus y complementados con 130 nmol/ml CpG-oligonucleótidos , B-CpGpt glOgacga y el dsCyCpG-253 (Tabla 1) de 253 mero y se incubó en un termomezclador por 3 horas a 37°C. Posteriormente las VLP ?)ß o VLP Qbx33 se sometieron a digestión con DNAsa I (5 U/ml) o digestión con benzonasa (100 U/ml) por 3 a 37°C. Se analizaron las muestras en geles de agarosa al 1% después de teñir con bromuro de etidio o azul Coomassie. La figura 18 muestra que diferentes ácidos nucleicos B-CpGpt, glOgacga y los ADN ds 253 mer se puede empacar en Qbx33. Los ácidos nucleicos empacados fueron resistentes a la digestión con DNAse I y permanecieron empacados durante la diálisis (figura 18) . Al empacar B-CpGpt se confirmó por liberación del ácido nucleico por digestión de la proteinasa K seguido por electroforesis de agarosa y tinción con bromuro de etidio (figura 18C) . La figura 18 detalla en análisis del empaque B-CpGpt en las VLP Qbx33 sobre un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (A) y azul Coomassie (B) . Al cargar el gel están 50µg de las siguientes muestras l.Qbx33 VLP sin tratar 2.Qbx33 VLP tratado con RNasa A; 3.Qbx33 VLP tratado con RNasa A y empacado con B-CpGpt 4. Qbx33 VLP tratado con RNasa A' :empacado con ¦ B-CpGpt tratado con Dnasa I y dializado, un escalonamiento de ADN 5.1 kb MBI Fermentas. (C) detalla en análisis de la cantidad del oligo empacado extraído de VLP en una TBE/urea al 15% teñida con SYBR. Se cargan en el gel las siguientes muestras 1. BCpGpt con un contenido de oligo de 2 µg Qbx33 VLP después de la digestión con proteinasa K y tratamiento con RNasa A; 2. 20 pmol de control B-CpGpt; 3. 10 pmol B-CpGpt de control; 4. 5pmol B-CpGpt de control. La figura 18 D y E detalla en análisis del empaque gl0gacga-PO en las VLP Qbx33 en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (D) y azul Coomassie (E) . Se cargan en el gel 15 µg de las siguientes muestras: 1. Un escalonamiento de ADN MBI Fermentas 1 kb; 2. Qbx33 VLP sin tratar; 3. Qbx33 VLP tratado con RNasa A; 4. Qbx33 VLP tratado con RNasa A y empacado con glOgacga-PO; 5. Qbx33 VLP tratado con RNasa A, empacado con glOgacga-PO, tratado con benzonasa y dializado. La figura 18 E y F detalla en análisis de dsCyCpG-253 empacado con las VLP Qbx33 en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio (E) y azul Coomassie (F) . Se cargan en el gel 15 µg de las siguientes muestras: un escalonamiento de ADN 1. MBI Fermentas lkb; 2. Qbx33 VLP sin tratar, 3. Qbx33 VLP tratado con RNasa A; 4. Qbx33 VLP tratado con RNasa A, empacado con dsCyCpG-253 y tratado con Dnasel; 5. Qbx33 VLP tratado con RNasa A empacado con dsCyCpG-253, tratado con DNasal y dializado. EJEMPLO 22 Empaque de los ácidos nucleicos inmunoestimuladores en VLP. ' RNAsa A y ZnS04 Median la degradación del contenido de un ácido nucleico de un VLP Las VLP de <2ß se trataron con RNAsa como se describe en el ejemplo 21 bajo condiciones de baja resistencia iónica (20 mM Hepes pH 7.4 ó 4 mM Hepes, 30 mM NaCl, pH 7.4). Alternativamente, las VLP <2ß y VLP AP205 se trataron con ZnS04 bajo condiciones de baja resistencia iónica (20 mM Hepes pH 7. ó 4 mM Hepes, 30 mM NaCl, pH 7.4) similares a las que se describen en el ejemplo 11. AP205 VLP (1 mg/ml) en 20 mM Hepes pH 7.4 ó 20 mM Hepes, 1 mM Tris, pH 7.4) se trató por 48 horas con 2.5 mM ZnSC>4 a 50°C en un aparato Eppendorf Thermomixer a 550 rpm. Las muestras de Qp y AP205 VLP se centrifugaron a 14000 rpm y los sobrenadantes se dializaron en tuberías de diálisis 10.000 MWCO Spectra/Por® (Spectrum, Cat. nr.j 128 118) contra las primeras 2 1 20 mM Hepes, pH 7.4 por 2 horas a 4°C y después con intercambio de solución amortiguadora durante la noche. Se clarificaron las muestras después de diálisis similar a la descrita en el ejemplo 11 y las concentraciones de proteínas en 'los sobrenadantes de determinó por análisis Bradford. Empaque de ISS en RNasa A y ZnSOq tratado en las VLP Después de la hidrólisis y diálisis de ARN, se mezclaron los ?ß y AP205 VLP (1-1.5 mg/ml) con 130 µ? de oligonucleótidos CpG (NKCpG - cf. Tabla 1; G3-6, G8-8 - cf. Tabla 2; 1 mM de reserva de oligonucleótidos en 10 mM Tris pH 8) por mi de VLP. Se incubaron las muestras por 3 horas a 37°C en un termo agitador a 650 rpm. Posteriormente se trataron las muestras con 125 U Benzonasa/ml VLP (Merck KGaA, Darmstad, Alemania) en presencia de 2 mM MgCl2 y se incubaron por 3 horas a 37°C antes de la diálisis. Se dializaron las muestras en un tubo de diálisis 300.000 MWCO Spectra/Por® (Spectrum, Cat. Nr. 131 447) contra 20 mM Hepes, pH 7.4 por 2 horas a 4°C y después del intercambio de la solución amortiguadora durante la noche contra la misma solución amortiguadora. Después de que se centrifugaron las muestras de diálisis a 14000rpm y se determinó la concentración de proteina en los sobrenadantes por análisis Bradford. La electroforesis con gel de agarosa y la tinción posterior con bromuro de etidio y azul de Coomassie mostró que los oligonucleotidos se empacaron en los VPL. EJEMPLO 23 Empaque de los oligonucleotidos flanqueados por guanosina inmunoestimuladora en las VLP Qbx 33 VLP (VLP ?)ß acoplados al péptido 33, ver ejemplo 21) se trataron con RNAsa bajo condiciones bajas iónicas (20 mM Hepes pH 7.4) como se describe en el ejemplo 21 para hidrolizar el contenido de ARN del VLP Qbx33. Después de la diálisis contra 20 mM Hepes pH 7.4 Qbx33 se mezclaron las VLP con oligonucleotidos flanqueados con guanosina (tabla 2: G3-6, 67-7, G8-8, 69-9 ó g6 desde una reserva de oligonucleotidos 1 mM en 10 mM Tris pH 8) y se incubaron como se describe en ele ejemplo 22. Posteriormente se trataron las VLP Qbx33 con benzonasa y se dializaron en tubería 300.000 MWCO. Las muestras con los oligos 67-7, G8-8, 69-9 se dializaron ampliamente durante 3 días con intercambios de 4 soluciones amortiguadoras para retirar el oligo libre. Se confirmó el empaque en geles de agarosa en 1% y después de la digestión de la proteinasa k en geles de TBE/urea. Tabla 2: Secuencias de los ácidos nucleicos inmunoestimuladores usados en los ejemplos: Las letras minúsculas indican desoxinucleótidos conectados por medio de los enlaces tiofosforotiato mientras que las letras mayúsculas indican desoxinucleótidos conectados por medio de los enlaces tiofosfodiester .

EJEMPLO 24 ¦ · - Empaque del ácido ribonucleico en VLP. Degradación dependiente de ZnS04 del contenido de un ácido nucleico de un VLP. Las VLP ?)ß se trataron con ZnS04 bajo condiciones de baja resistencia iónica (20 mM Hepes pH 7.4 ó 4 mM Hepes NaCl, pH 7.4) similar como se describe en el ejemplo 11. Las VLP AP205 (1 mg/ml) en 20 mM Hepes pH 7.4 ó 20 mM Hepes, 1 mM Tris, pH 7.4 se trataron por 48 horas con 2.5 mM ZnS04 a 50°C en un aparato Eppendorf Thermomixer a 550 rpm. Se centrifugaron las muestras VLP ?ß y AP205 a 14000 y se dializaron contra 20 mM Hepes, pH 7.4 como en el ejemplo 22. Empaque de los poli (I:C) con VLP tratados con ZnS04 El poli ácido ribonucleico inmuno estimulador (I:C), (Cat. nr. 27-4732-01, poly (I) poli©; Pharmacia Biotech) se disolvió en PBS (Invitrogen cat. nr . 14040) o agua hasta una concentración de 4 mg/ml (9µ?) . El poli (I:C) se incubó por 10 minutos a 60°C y luego se enfrió a 37°C. Se agregó poli(I:C) incubado en un exceso molar de 10 veces al ?)ß tratado con 2nS04 ó VLP AP205 (1-1.5 mg/ml) y se incubaron las mezclas por 3 horas a 37°C en una termomezcladora 650 rpm. Posteriormente el exceso del poli (I:C) libre se hidroliza enzimáticamente por incubación con 125 U de benzonasa por mi de mezcla de VLP en presencia de 2 mM MgCl2 por 3 horas a 37°C en un termomezclador a 300 rpm. Con la hidrólisis de la benzonasa se centrifugaron las muestras a 1400.0 rpm y se dializaron los sobrenadantes en una tubería de diálisis 300.000 MWCO Spectra/Por® (Spectrum, Cat. nr. 131 447) contra 2 1 20 mM Hepes, pH 7.4 por 2 horas a 4°C, y después la solución amortiguadora de intercambio durante la noche contra la misma solución amortiguadora. Después de la diálisis las muestras se centrifugaron a 14000 rpm y se determinó la concentración de la proteina en los sobrenadantes por un análisis Bradford. El empaque se confirma en geles de agarosa en 1% y después de la digestión con la proteinasa K en geles TBE/urea . EJEMPLO 25 Empaque de oligonucleótidos flanqueados por guanosina inmunoestimuladora en las VLP HBcAg HBcAg VLP se tratan con RNasa A bajo condiciones de baja resistencia iónica (20 mM Hepes pH 7.4) como se describe en el ejemplo 21 para hidrolizar el contenido de ARN de las VLP. Después de la diálisis contra 20 mM Hepes, pH 7.4 se mezclan las VLP con oligonucleótidos flanqueados por guanosina (tabla 2; 67-7, G8-8, 69-9, G10-PO ó G6, 1 mM en 10 mM Tris pH 8) y se incuban como se describe en el ejemplo 22. Posteriormente, las VLP se tratan con benzonasa y se dializan en una tubería flexible 300.000 M CO. Se analiza el empacado de geles de agarosa en 1% en geles de TBE/urea después de la digestión de la proteinasa K. EJEMPLO 26 Empaque del ácido ribonucleico en HBcAg VLP. Las VLP HBcAg se tratan con ZnS04 bajo condiciones de baja resistencia iónica (20 mM Hepes pH 7. ó 4 mM NaCl, pH 7.4) similares a las que se describen en el ejemplo 11 y se dializan contra 20 mM Hepes, pH 7.4 como en el ejemplo 22. Se agrega poli (I:C) en un exceso molar de 10 veces a HBcAg VLP (1.5 mg/ml) y se incuba a 3 horas 37°C en un termomezclador a 650 rpm como se describe en el ejemplo 24. Posteriormente, el exceso de un poli (I:C) libre se hidroliza enzimáticamente por incubación con 125 U Benzonasa por mi de mezcla de VLP en presencia de 2 mM gCl2 por 3 horas a 37°C en un termomezclador a 300 rpm. Se clarifican las muestras después de la hidrólisis de benzonasa similar a la que se describe en el ejemplo 11 y se dializan como en el ejemplo 24. Después de la diálisis se centrifugan las muestras a 14000 rpm y se determina la concentración de los sobrenadantes por un análisis de Bradford. EJEMPLO 27 Desensamble, reensamble y empaque de ?)ß Desensamble y reensamble de las VLP ?)ß Desensamble : 45 mg 0_ß VLP (como se determina por el análisis Bradford) en PBC (20 mM fosfato, 150 mM NaCl, pH 7.5) se reduce con 10 mM DTT por 15 minutos a temperatura ambiente bajo condiciones de agitación. Una segunda incubación por 15 minutos a temperatura ambiente bajo condiciones de agitación seguida después de la adición de cloruro de magnesio hasta una concentración final de 700 mM conduce a la precipitación del ARN. Se centrifugó la solución por 10 minutos a 4000 rpm a 4°C (Eppendorf 5810 R, en un rotor de ángulo fijo A-4-62 usado en todas las etapas siguientes) con objeto de aislar el ARN precipitado en el peletizado. El dimero de la proteina de recubrimiento ?)ß sin ensamblar en el sobrenadante se usó directamente para las etapas de purificación por cromatografía. Método de purificación de 2 etapas de la proteina de recubrimiento ?)ß sin ensamblar por cromatografía de intercambio de iones, cationes y cromatografía de exclusión de tamaño. El sobrenadante de la reacción de desensamble que contiene la proteína de recubrimiento sin ensamblar y el ARN restante se aplicó en un SP-Sepharosa FF (16/20; 6ml; Amersham pharmacia biotech) . Durante la corrida que se efectuó a temperatura ambiente con una relación de flujo 5ml/min, se observó la absorbancia a 260 nm y 280 nm. Se equilibro la columna con solución amortiguadora de fosfato de sodio 20mM pH 7 la muestra se diluyó 1:10 para alcanzar una conductividad debajo de 9mS/cm (fue necesaria la dilución a esta conductividad y se hizo usando una solución amortiguadora del equilibrio 0.5x). La etapa de elución (fracciones de 5ml) seguida de un gradiente de fosfato de sodio 20mM y cloruro de sodio 500m con objeto de aislar el dimero de la proteína de recubrimiento 0ß pura de los contaminantes. Se regeneró la columna con 0.5 NaOH. En la segunda etapa el dimero de proteína de recubrimiento ?)ß aislada (la fracción eluida de la columna en intercambio de catión) se aplicó (en 2 corridas) sobre una columna de Sephacryl S-100 HR (26/60/ Amersham pharmacia biotech) equilibrado con solución amortiguadora (fosfato de sodio 20mM, cloruro de sodio 150mM; pH 6.5). La cromatografía se efectuó a temperatura ambiente con una relación de flujo 2.5ml/min. Se observó la absorbancia a 260nm y 280nm. Se recolectaron fracciones de 5ml . Se regeneró la columna con 0.5M NaOH . Reensamble : El dímero de proteína de recubrimiento <2ß purificado a una concentración de 2 mg/ml se usó para el reensamble de ?)ß VLP en presencia del oligodesoxinucleótido G8-8. La concentración de oligodesoxinucleótido en la reacción de reensamble fue de ??µ?. La concentración del dímero de la proteína de recubrimiento en la solución de reensamble fue de 40µ?. Se agregaron urea y DTT a la solución para dar concentraciones finales de 1M urea y 5mM DTT respectivamente. El oligodesoxinucleótido a empacarse durante la reacción de reensamble se agregó al final junto con H20 dando un volumen final de la reacción de reensamble 3ml . Esta solución se dializó primero por 72 horas contra 1500 mi de solución amortiguadora que contiene 20mM TrisHCl, 150 mM NaCl, pH 8.0 a 4°C. La mezcla de reensamble dializada se centrifugó a 14 000 rpm por 10 minutos a 4°C. Se descartó un sedimento despreciable mientras el sobrenadante contenía las VLP reensamblados y empacados. Se determinó la concentración de proteína por análisis Bradford. Las VLP reensamblados y empacados se concentraron con dispositivos de filtro centrifugó (Millipore, UFV4BCC25, 5K NM L) hasta una concentración final de proteína 3 mg/ml. Purificación de las VLP reensamblados y empacados : Hasta 10 mg de proteína total se cargaron en una columna de Sepharosa™ CL-4B (16/70, Amersham Biosciences) equilibrada con 20 m HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4. Se efectuó una cromatografía de exclusión de tamaño con solución amortiguadora de equilibrio (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4) a temperatura ambiente a una relación de flujo de 0.4 ml/min. Se observó la absorbancia a 254 nm y 280 nm. Se aislaron 2 picos. Un pico de alto peso molecular antecedió a un pico de menor peso molecular aparente. Se recolectaron las fracciones de 0.5 mi y las VLP Qb que contienen fracciones identificadas por SDS-PAGE seguido por tinción de azul de Coomassie. La calibración de la columna con cápsidas ?)ß intactas y altamente purificadas de E. coli revelaron que el peso molecular aparente del primer pico principal fue consistente con las cápsidas. <2ß. Análisis de las VLP ?)ß que se habían vuelto a ensamblar con oligodesoxinucleótidos : ?) Tamaño hidrodinámico de las cápsidas reensambladas : Las cápsidas ?ß que se habían reensamblado en presencia del oligodesoxinucleótido G8-8 se analizaron por dispersión de luz dinámica (DLS) y se compararon a las VLP ?)ß intactas que se habían purificado de E. colí. Las cápsidas reensambladas mostraron el mismo tamaño hidrodinámico (que depende de la masa y la conformación) como las VLP 0ß intactas. B) Formación de enlace bisulfuro en las cápsidas reensambladas : Las VLP <2ß reensambladas se analizaron por un SDS-PAGE no reductor y se compararon a la ?)ß VLP intacta que se había purificado de E. coli. Las cápsidas reensambladas desplegaron el mismo patrón de enlace a bisulfuro con presencia de pentámeros y hexameros como las VLP ?)ß intactas.

C) Análisis del contenido del ácido nucleico de las VLP ?)ß que se habían reensamblado en presencia de los oligodesoxinucleótidos al desnaturalizar la electroforesis de gel de poliacrilamida TBE-Urea: Los <2ß VLP (0.4 mg/ml) reensamblados que contienen los oligonucleótidos G8-8 se incubaron por 2 horas a 37°C con 125 U de benzonasa por mi de VLP ?)ß en presencia de 2 m MgCl2. Posteriormente las VLP <2ß tratados con benzonasa se trataron con proteinasa K (PCR-grade, Roche Molecular Biochemicals , Cat. No. 1964364) como se describe en el ejemplo 11. Luego se mezclaron las reacciones con una solución amortiguadora de muestra TBE urea y se cargaron en un gel de TBE-Urea y poliacrilamida al 15% (Novex®, Invitrogen Cat. No. EC6885) . Como un estándar cualitativo así como cuantitativo, 1 pmol, 5 pmol y 10 pmol del oligodesoxinucleótido que se usó para la reacción de reensamble se cargo sobre el mismo gel . Este gel se tiñó con SYBR®-Gold (Molecular Probes Cat . No. S-11494). La tinción de SYBR©-Gold mostró que las cápsidas reensambladas ? que contenían el ácido nucleico vuelven a migrar con los oligodesoxinucleótidos que se usaron en la reacción de reensamble. Al tomarse junto, la resistencia a la digestión con benzonasa del contenido de ácido nucleico de las VLP ?ß que se habían reensamblado en presencia de los oligodesoxinucleótidos y el aislamiento del oligodesoxinucleótido de partículas purificadas por digestión de proteinasa K, demuestra el empaque del oligodesoxinucleótido . EJEMPLO 28 Las VLP contienen G10-PO inducen las respuestas de tipo Thl contra extracto de polen de pasto co-administrado en presencia de alumbre Las VLP formados por la proteína de recubrimiento del bacteriófago de ADN ?)ß se usaron para este experimento. Se usaron sin tratar o después del empaque con G10-PO (SEQ ID NO: 122) como se describe en el ejemplo 15. Los ratonas Balb/c . se inmunizaron subcutáneamente con 1.9 B.U. del extracto de polen de pasto (5 gra-mix Pangramin, Abello, preparado de .centeno perenne, hierbas de huerto, fleo, pasto azul de Kentucky y polen de las praderas) mezclado en Alum (Imject, Pierce) en presencia de 50 µg Qb VLP solamente o 50 µ Qb VLP cargado y empacado respectivamente con G10-PO. Un grupo de control de ratones recibió el extracto de polen mezclado solamente con alumbre. 50 días después se reforzaron los ratones con las mismas preparaciones de vacuna y se hicieron sangrar el día 57. Las respuestas IgG en los sueros desde el día 57 se evaluaron por ELISA. El grupo de control mostró anticuerpos antipolen del isotipo IgGl pero ninguno del isotipo IgG2. La presencia de las VLP cargados con G10-PO indujo una respuesta IgG2 contra el extracto de polen. No se indujo ningún extracto de polen contra IgE en presencia de las VLP Qb cargados y empacados respectivamente con G10-PO mientras que estaban en presencia solamente de alumbre una respuesta IgE se observó. Esto indica que el G10-PO cargado en las VLP puede inducir una respuesta Thl y suprimir la producción IgE inducida por alumbre. Se hace constar que con relación a esta feckof el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una composición para mejorar una respuesta inmune en una animal caracterizada porque comprende (a) una partícula tipo virus (b) una substancia inmunoestimuladora en donde la substancia inmunoestimuladora (b) se enlaza a la partícula tipo virus (a) y (c) un antígeno en donde el antígeno se mezcla con la partícula tipo virus (a) . 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la substancia inmunoestimuladora es un receptor de tipo cuota que activa una substancia o una substancia inductora de la secreción de citocinas y en donde preferiblemente la substancia activadora del receptor tipo cuota se selecciona del grupo que consiste de: (a) ácidos nucleicos inmunoestimuladores (b) péptidoglicano • (c) lipopolisacáridos (d) ácidos lipoteicónico (e) compuestos de imidazoquinolina (f) flagelinas (g) lipoproteínas (h) moléculas orgánicas inmunoestimuladoras (i) oligonucleotidos que contienen CpG sin metilar (j) cualquiera de las mezclas de al menos una substancia de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) , (h) , y/o (i). 3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el ácido nucleico inmunoestimulador se selecciona del grupo que consiste de: (a) ácidos ribonucleicos y (b) ácidos desoxiribonucleicos y (c) ácidos nucleicos quiméricos y (d) algunas mezclas de al menos un ácido nucleico de (a) , (b) y/o (c); y en donde preferiblemente el ácido ribonucleico es poli-(I:C) o un derivado del mismo y en donde preferiblemente el ácido desoxiribonucleico se selecciona del grupo que consiste de oligonucleotidos que contienen CpG sin metilar y oligonucleotidos libres de porciones de CpG sin metilar. . La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la substancia inmunoestimuladora es un oligonucleótido que contiene CpG sin metilar. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar comprende la secuencia: 5' X1X2 GX3X4 3' en donde Xi, X2, X3, y X es cualquier nucleótido y en donde preferiblemente al menos 1 del nucleótido Xlr X2, X3, y X4 tiene una modificación en la estructura de fosfato. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 4 caracterizado porque el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar comprende, o consiste alternativamente esencialmente de, o consiste alternativamente de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de: (a) TCCATGACGATTCCTGAATAAT (SEQ ID NO: 116); (b) TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO: 118); (c) GGGGTCAACGTTGAGGGGG (SEQ ID NO: 120); (d) GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 122) y (e) "dsCyCpG-253" (SEQ ID NO: 130); y en donde preferiblemente el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar comprende, o consiste alternativamente esencialmente de, o consiste alternativamente de la secuencia GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 122) . 7. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la porción CpG del oligonucleótido que contiene el CpG sin metilar es parte de una secuencia palindrómica y en donde preferiblemente la secuencia •palindrómica es GACGATCGTC (SEQ ID NO: 105) . 8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la substancia inmunoestimuladora y preferiblemente el ácido nucleico inmunoestimulador y además preferiblemente el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar se empaca dentro de la partícula de tipo virus. 9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la substancia inmunoestimuladora es un ácido nucleico inmunoestimulador y en donde el ácido nucleico inmunoestimulador y preferiblemente el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar, comprende alrededor de 6 hasta alrededor de 300 nucleótidos, preferiblemente alrededor de 6 hasta alrededor de 100 nucleótidos y aun más preferiblemente alrededor de 6 hasta alrededor de 40 nucleótidos, y nuevamente aun más preferiblemente el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar comprende alrededor de 10 hasta alrededor de 30 nucleótidos . 10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la substancia inmunoestimuladora es un ácido nucleico inmunoestimulador, y en donde el ácido nucleico inmunoestimulador y preferiblemente el oligonucleótido que contiene CpG sin metilar (b) contiene una o más modificaciones de fosforotioato de la estructura de fosfato o en donde cada porción de fosfato de la e.structura de fosfato de oligonucleótido (b) es una modificación de fosforotioato . 11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la partícula de tipo virus (a) es una partícula de tipo virus recombinante y en donde preferiblemente la partícula de tipo virus (a) se selecciona del grupo que consiste de: (a) proteínas recombinantes del virus de la hepatitis B (b) proteínas recombinantes del virus de sarampión (c) proteínas recombinantes del virus de Sindbis (d) proteínas recombinantes del rotavirus (e) proteínas recombinantes del virus de la enfermedad de los pies y la boca (f) proteínas recombinantes del retrovirus (g) proteínas recombinantes del virus Norwalk (h) proteínas recombinantes del virus Alfa (i) proteínas recombinantes del virus del papiloma humano (j) proteínas recombinantes del virus del polioma (k) proteínas recombinantes de bacteriófagos (1) proteínas recombinantes de fagos de ARN (m) proteínas recombinantes del fago <2ß (n) proteínas recombinantes del fago GA (o) proteínas recombinantes del fago fr (p) proteínas recombinantes del fago AP 205 (q) proteínas recombinantes del Ty y • (r) fragmentos de algunas de las proteínas recombinantes de (a) a (q) ; y en donde además preferiblemente la partícula de tipo virus es la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B o la proteína VP1 del virus BK. 12. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la partícula del tipo virus comprende proteínas recombinantes o fragmentos de las mismas de un fago de ARN y en donde el fago de ARN se selecciona del grupo que consiste de: a) bacteriófago Qp; b) bacteriófago R17 c) bacteriófago fr d) bacteriófago GA e) bacteriófago SP f ) bacteriófago S2 g) bacteriófago Mil h) bacteriófago MX1 i ) bacteriófago NL95 K) bacteriófago f2 1) bacteriófago PP7 y m) bacteriófago AP205; y en donde preferiblemente la partícula de tipo virus comprende proteínas recombinantes o fragmentos de los mismos de un fago de ARN en donde el fago de ARN es ?)ß, fr o AP205. 13. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antígeno (c) se aisla de una fuente natural y en donde preferiblemente la fuente natural se selecciona del grupo que consiste de: (a) extracto de polen (b) extracto de polvo (c) extracto de ácaros del polvo (d) extracto fungal (e) extracto epidermal de mamífero (f ) extracto de plumas (g) extracto de insectos (h) extracto de alimento (i) extracto de cabello (j) extracto de saliva (k) extracto de suero 14. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno (c) se deriva del grupo que consiste de: (a) virus (b) bacterias (c) parásitos (d) priones (e) tumores (f) automoléculas (g) moléculas de hapteno no peptídicas (h) alérgenos y (i) hormonas. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antígeno es un antígeno de tumor y en donde preferiblemente el antígeno de tumor se selecciona del grupo que consiste de: (a) Her2 (b) GD2; (c) EGF-R; (d) CEA - (e) CD52 (f) Proteina de melanoma humano gplOO (g) Proteina de melanoma humano melan-A/MART-1 (h) Tirosinasa (i) Proteina NA17-A nt (j) Proteina MAGE-3 (k) Proteina p53 (1) Proteina HPV16 E7 (m) Un análogo de cualquiera de los antigenos de (a) a (1) y (n) Fragmentos antigénicos de cualquiera de los antigenos de tumor de la (a) a la (m) . 16. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antigeno es un alérgeno, y en donde preferiblemente el alérgeno se deriva del grupo que consiste de: (a) extracto de polen (b) extracto de polvo (c) extracto de ácaros del polvo (d) extracto fungal (e) extracto epidermal de mamífero (f) extracto de plumas (g) extracto de insectos (h) extracto de alimento (i) extracto de cabello (j) extracto de saliva (k) extracto de suero 17. La composición de conformidad con la reivindicación caracterizada porque el alérgeno se selecciona del grupo que consiste (a) árboles (b) pastos (c) polvo de casas (d) ácaro de polvo de casas (e) aspergilus (f) pelo animal (g) pluma animal (h) veneno de abeja (i) productos animales; y (j) productos de plantas . 18. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antígeno se selecciona del grupo que consiste de: (a) fosfolipasa A2 de veneno de abeja (b) polen de ambrosía Amb a 1 (c) polen de ambrosia Bet v I (d) veneno de avispón de cara blanca 5 Dol m V; (e) ácaro de polvo de casa Der p 1 (f) ácaro de polvo de casa Der f 2 (g) ácaro de polvo de casa Der 2 (h) ácaro de polvo Lep d (i) alérgeno de hongo Alt a 1 (j) al rgeno de hongo Asp fl (k) alérgeno de hongo Asp f 16; y (1) alérgenos de cacahuate. 19. Un método para mejorar una respuesta inmune en un animal, caracterizado porque comprende introducir en el animal una composición que comprende: (a) una partícula tipo virus (b) una substancia inmunoestimuladora en donde la substancia inmunoestimuladora (b) se enlaza a la partícula tipo virus (a) y (c) un antígeno en donde el antígeno se mezcla con la partícula tipo virus (a) . 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, . caracterizado porque se define además en cualesquiera de las reivindicaciones 2-18. 21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la respuesta inmune es una respuesta de células B mejorada, una respuesta de células T mejorada o una respuesta CTL, y en donde la respuesta de células T es una respuesta de células Th, y en donde además preferiblemente la respuesta de célula Th es una respuesta de células Th. 22. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el * animal es un mamífero, preferiblemente un humano y en donde preferiblemente la composición se introduce en el animal subcutáneamente, intramuscularmente , intravenosamente, intranasalmente o directamente en el ganglio linfático. 23. Una vacuna caracterizada porque comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 1 junto con un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, y en donde preferiblemente la vacuna comprende además un adyuvante. 24. Un método para inmunizar o tratar un animal, caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna de conformidad con la reivindicación 23, y en donde preferiblemente el animal es un mamífero y además preferiblemente un humano. - . 25.. El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 1 o el uso de una vacuna de conformidad con la reivindicación 23 en la fabricación de un farmacéutico para el tratamiento de un trastorno o enfermedad que comprende y se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de alergias, tumores, enfermedades crónicas y enfermedades crónicas virales. 26. Una composición caracterizada porque comprende: (a) una partícula tipo virus (b) una substancia inmunoestimuladora en donde la substancia inmunoestimuladora (b) se enlaza a la partícula tipo virus (a) y (c) un antígeno en donde el antígeno se mezcla con la partícula tipo virus (a), para su uso en un método para mejorar una respuesta inmune en un animal, que comprende introducir la composición en el animal, y en donde el método preferiblemente se define como en cualesquiera de las reivindicaciones 20-22. 27. El uso de una composición que comprende: (a) una partícula tipo virus (b) una substancia inmunoestimuladora en donde la substancia inmunoestimuladora (b) se enlaza a la partícula tipo virus (a) y (c) un antígeno en donde el antígeno se mezcla con la partícula tipo virus (a) , para la manufactura de una composición para mejorar una respuesta inmune en un animal, en donde la composición se va a introducir al animal. 28. El uso de conformidad con la reivindicación 20 como se define además en cualesquiera de las reivindicaciones 20-22. 29. Una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque es para uso en un método de inmunizar o tratar un animal que comprende administrar la cantidad al animal, y en donde preferibl'emente el animal es un mamífero y preferiblemente además un humano.