MXPA03008667A - Procedimientos y vectores para la amplificacion o expresion de secuencias de acido nucleico de interes en plantas. - Google Patents
Procedimientos y vectores para la amplificacion o expresion de secuencias de acido nucleico de interes en plantas.Info
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Abstract
Esta invencion describe procesos biologicamente inocuos para generar amplificacion o expresion, o ambas cosas de una o mas secuencias de acido nucleico de interes en una planta, tejido vegetal, celula vegetal o cultivo vegetal, caracterizado porque la celula vegetal se proporciona con por lo menos dos vectores precursores disenados para experimentar procesamiento mediante recombinacion especifica de sitio en la celula por lo que, debido al procesamiento, se dota a la celula vegetal con por lo menos un replicon los cuales proporcionan la amplificacion o expresion.
Description
PROCEDIMIENTOS Y VECTORES PARA LA AMPLIFICACIÓN O EXPRESIÓN DE SECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO DE INTERES EN PLANTAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con procedimientos y vectores para provocar la amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una célula vegetal .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El avance significativo en la biotecnología vegetal durante las últimas dos décadas ha ampliado las oportunidades de agricultura molecular a escala comercial en plantas. La producción de proteínas combinantes en plantas es una alternativa atractiva con respecto a los sistemas más tradicionales basados en bacterias y levaduras . Tiene una ventaja evidente con respecto a los sistemas existentes basados en producción de termentadores debido a su menor costo y facilidad de aumento de escala de la producción al simplemente incrementar la cosecha de la biomasa vegetal. En general, la agricultura molecular en plantas se puede obtener mediante la expresión estable o transitoria de una proteína recombinante de interés (Franken et al., 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 411-416; Fischer et al., 1999, Biotechnol. Appl. Biochem. , Pt 2 , 101-108; Herbers & Sonnewald, 1999, Curr. Opin. Biotechnol., 10, 163-168). Se pueden utilizar plantas transgénicas estables para producir tejidos vegetativos o semillas ricas en proteínas recombinantes . El tejido vegetativo se puede utilizar directamente para procesamiento mientras que las semillas son más adecuadas para almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, para alcanzar un alto nivel de expresión de proteínas en plantas no es una tarea común, especialmente para la elaboración de proteínas que comprometen el crecimiento de la planta. Requiere el desarrollo de sistemas de expresión regulados apropiadamente y por lo tanto que permitan la activación de la producción de proteína en la etapa correcta del desarrollo de la planta. Las tecnologías existentes para controlar la expresión de genes en plantas habitualmente se utilizan en promotores específicos de tejido e inducibles y prácticamente la totalidad de estos adolecen de una actividad de expresión basal incluso cuando no son inducidos, es decir, presentan actividad residual. Los promotores específicos de tejido (US05955361; WO09828431) presentan una herramienta poderosa pero su uso se limita a áreas de aplicaciones muy específicas, por ejemplo para la elaboración de plantas estériles (W09839462) o la expresión de genes de interés en semillas (WO.00068388; US05608152.) . Los promotores inducibles se pueden dividir en dos categorías de acuerdo con sus condiciones de inducción -aquellos inducidos ¦ por factores abióticos (temperatura, luz, sustancias químicas) y los que se pueden inducir por factores bióticos, por ejemplo ataque de patógenos o plagas. Los ejemplos de la primera categoría son los promotores inducibles por calor (US 05.187287.) e inducibles por frío (US05847102) , un sistema inducible por cobre (Met.t et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci . , 90, 4567-4571), sistemas inducibles por esferoides (Aoyama & Chua, 1997, Plant J. , 11, 605-612; McNellis efc al., 1998r> Plant J. , 14, 247-257; USQ6063985) , un sistema inducible por etanol (Caddick et al., 1997, Nature Blotech. , 16, 177-180 ; . WO09321334) y un sistema inducible por tetraciclina ( einmann et al., 1994, Plant J. , 5, 559-569) . Uno de los últimos desarrollos en el área de los sistemas inducibles químicamente para plantas es un promotor quimérico que puede ser activado por el glucocorticoide dexametasona y que puede ser inactivado por tetraciclina (Bohner et al., 1999, Plant J. , 19, 87-95). Para una revisión de los sistemas inducibles químicamente véase: Zuo & Chua, (2000, Currertt Opin. Biotechnol . , 11, 146-151). Otros ejemplos de promotores inducibles son promotores que controlan la expresión de genes relacionados con patogénesis (PR) en plantas . Estos promotores pueden ser inducidos por tratamiento de la planta con ácido salicílico, un componente importante de las vías de señalización de plantas en respuesta al ataque de patógenos u otros compuestos químicos (benzo-1, 2 , 3-tiadiazol o ácido isonicotínico) los cuales son capaces de activar la expresión del gen para PR (US05942662) . Existen informes de sistemas de expresión transgénica controlable utilizando ARN/ARN polimerasa viral proporcionados por infección viral (véase por ejemplo US6093554; US5919705) . En estos sistemas, una secuencia de ADN vegetal recombinante incluye las secuencias nucleotídicas del genoma viral reconocido por el ARN/ARN polimerasa viral. La eficacia de estos sistemas es limitada debido a su baja capacidad, de que las polimerasas virales proporcionan funciones en trans y su incapacidad para controlar procedimientos diferentes a la amplificación de ARN. Los sistemas que se describen en lo anterior son de interés significativo como oportunidades para obtener patrones deseados de expresión transgénica, pero no permiten un control estrecho sobre los patrones de expresión, pues los agentes inductores (cobre o sus análogos (brassinoesteroides en el caso de un sistema controlable por esteroides) pueden estar presentes en tejidos vegetales a concentraciones suficientes para provocar expresión residual. De manera adicional, el uso de antibióticos y esteroides como inductores químicos no es deseable para aplicaciones a gran escala. Cuando se utilizan promotores de genes PR o ARN/ARN polimerasas virales como medios de control para transgenes el requerimiento de un control estricto sobre la expresión del transgen tampoco se satisface, pues una infección fortuita por un patógeno o bien factores de estrés pueden activar la expresión. Los promotores específicos de tejido o de órgano se limitan a áreas muy estrechas de aplicaciones dado que confinan la expresión a un órgano o a una etapa específicos del desarrollo de la planta, pero no permiten que el transgen se active a voluntad. Una manera de obtener un alto nivel de producción de proteína es la expresión transitoria, en donde el transgen se puede suministrar y expresar en la. etapa deseada del desarrollo de la planta, aprovechar por completo los recursos de la planta y permitir un rendimiento elevado del producto deseado. La solución de expresión transitoria más adecuada para la producción a escala media a grande incluye la mediada por Agrrpjbacter-ium (Kapila et al., 1996, Plant Sci., 122, 101-108) y los sistemas ' mediados por vector viral vegetal (para una revisión véage : Porta & Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol., 5, 209-22.1; Yusibov et al., 1999, Curr. Top. Microbiol . Immunol . , 240 , 81-94) . Los sistemas de expresión basados en vector viral ofrecen un rendimiento significativamente mayor del producto transgénico en comparación con los transgenes nucleares de la planta. Pbr ejemplo, la concentración de la proteína transgenica puede alcanzar 5-10% del contenido total celular de la planta, cuando se expresa desde un vector viral (Kumagai et al., 2000, Gene, 245, 169-174; Shivprasad et al., 1999, Virology, 255 , 312-323) . Los ARN virus son los más adecuados debido a que ofrecen el mayor nivel de expresión en comparación con los ADN virus. Existen varias patentes publicadas que describen vectores virales adecuados para expresión sistémica de material transgénico en plantas (US5316931; US5589367; US5866785) . En general, estos vectores pueden expresar un gen extraño como una fusión de traducción con una protelna viral (US5491076; US5977438) , desde un promotor subgenomico adicional (US5466788; US5670353; US5866785) o desde ARN viral plicistrónico utilizando elementos I ES para traducción independiente de proteínas (solicitud de patente Alemana Número 10049587.7, Solicitud PCT PCT/EP01/11629) . La primera solución, fusión traduccional de una proteína recombinante con una proteína estructural viral (Hamamoto et al., 1993, BioTechnology, 11, 930-932; Gopinath et al., 2000, Virology, 267 , 159-173; JP6169789; US5977438) proporciona un rendimiento significativo. Sin embargo, el uso de tal solución está limitado, dado que la proteína recombinante no se puede separar fácilmente de la viral. Una de las versiones de esta solución utiliza la fusión traduccional vía una secuencia peptídica reconocida por una proteasa viral específica de sitio o por medio de un péptido catalítico (Dolja et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10208-10212; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; US5162601; US5766885; US5491076) .
Los procesos de expresión que utilizan vectores virales construidos sobre promotores subgenómicos heterólogos proporcionan el nivel más alto de producción de proteína hasta ahora (US5316931) . La mayor desventaja de tales vectores y de muchos otros es su capacidad limitada con respectó al tamaño del ADN que se va a amplificar.. Habitualmente, los constructos (plásmidos recombinantes) estables albergan insertos no mayores de 1 kb. En algunas áreas del genoma funcional de la planta esto puede no ser una. limitación grave pues G. della-Cioppa et al. (W0993651) describen el uso de vectores virales basados en TMV para expresar bibliotecas de ADNc vegetal con el propósito de suprimir la expresión de genes endógenos-. Los sistemas de amplificación de dos componentes, los cuales utilizan los virus auxiliares pueden ofrecer una capacidad ligeramente mejor (US5889191) . Sin embargo, para la mayor parte de las aplicaciones, incluyendo la producción de proteínas o compuestos de peso molecular bajo en plantas, estas limitaciones no se pueden corregir dentro de. los procedimientos existentes. Por ejemplo, con el fin de- producir plásticos biodegradables en plantas, deben expresarse hasta cuatro genes recombinantes (Hanley et al., 2000,. Trenda Plant Sel., 5, 45-46) y se requieren por lo menos siete genes, bacterianos para modulación de la vía de biosíntesis de mevalonato en plantas (Dewick, P., 1999,, Nat . Prod. Rep., 16, 97-130). Una preocupación grave adicional con los sistemas de expresión en plantas basados en virus de la . técnica anterior es su inocuidad biológica. Por una parte, la alta infectividad del virus recombinante es una característica muy deseada para facilitar la difusión del virus a través de la lanta y a las plantas vecinas con lo que se incrementa el rendimiento del producto de gen deseado.. Por otra parte, tal infectividad elevada compromete la contención del material recombinante dado que se puede producir con facilidad la dispersión a plantas no deseadas. En consecuencia, se desean sistemas- de expresión vegetal basados en virus que sean más seguros. Por lo tanto, un objetivo de la- invención es proporcionar un procedimiento de amplificación o expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés, en una célula vegetal el cual no tenga los inconvenientes mencionados antes y que notablemente no tenga las, limitaciones de tamaño de la secuencia de interés.. Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento nuevo que permita la amplificación o expresión de más de una secuencia de ácido nucleico de interés en una célula vegetal. Además, un objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento de amplificación o expresión de una o varias secuencias de ácido nucleico de interés en una célula vegetal el cual sea mejor en cuanto a factores ecológicos y de seguridad biológica.
En este documento se describe un sistema que carece de las limitantes anteriores: no tiene un límite detectable en cuanto al tamaño del - ADN · que se va a expresar, permite la expresión de genes múltiples en la misma célula y planta y posee parámetros de bioseguridad implícitos elevados..
DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN
Esta invención proporciona un procedimiento para provocar la amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico, de interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular caracterizado porque la célula vegetal se proporciona, con por lo menos un vector precursor diseñado para experimentar procesamiento . en la_ célula por lo que, debido al procesamiento, la célula vegetal es dotada con por lo menos un replicón, que proporciona la amplificación o expresión, o ambas, por lo que por lo menos un replicón est relacionado estructuralmente de manera preferible a cada uno de por lo menos uno de los vectores precursores debido a dicho procesamiento. La invención proporciona además un procedimiento para provocar amplificación o expresión, o ambas, de una o más secuencias de ácido nucleido de .interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal, o cultivo celular, caracterizado porque la célula vegetal se proporciona con por lo menos un vector precursor diseñado para experimentar procesamiento en la célula, por lo que, debido al procesamiento, se dota a la célula vegetal con por lo menos dos replicones los cuales: (a) están relacionados estructuralmente entre si debido al procesamiento; (b) son funcionalmente distintos entre si; y (c) proporcionan' la amplificación o expresión. Además, la invención proporciona un procedimiento para producir la amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado porque la célula vegetal se proporciona con por lo menos dos vectores precursores diseñados para experimentar procesamiento en la célula,, preferiblemente por recombinación especifica de sitio por lo que, debido l. procesamiento, se rota a la célula vegetal con por lo- menos un replicón el . cual proporciona la amplificación o expresión. Preferiblemente, por lo menos un replicón está relacionado estructuralmente con cada uno de por lo menos, dos vectores precursores debido al procesamiento. Esta invención describe adicionalmente un procedimiento para la producción de un producto bioquímico, un procedimiento para la determinación de la función del gen. y un procedimiento para evolución artificial ? dirigida por medio del cual cada uno de estos procedimient¿s comprende uno de los procedimientos anteriores de provocar amplificación o expresión. Además, se proporcionan vectores o vectores precursores y material viral para este procedimiento así como el material viral, los replicones y el material vegetal obtenidos o que se puedan obtener al realizar este procedimiento. El material viral comprende ácidos nucleicos capaces de replicarse en una célula vegetal . Comprende ADN o ARN infeccioso. El material viral puede estar desnudo o recubierto con una proteína de recubrimiento. Además se proporciona un equipo constituido por partes, que comprende: (i) células vegetales, semillas o plantas, y (ii) los vectores, vectores precursores, material viral o replicones anteriores. Se proporciona además un equipo de partes que comprende: (i) células vegetales, semillas o plantas y (ii) células de Agrobacterium que contienen los vectores, vectores precursores, material viral o replicones anteriores . El proceso de la invención provoca amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una célula vegetal. La amplificación se refiere a la producción de ADN o ARN (por ejemplo por tecnología antisentido) . La expresión se refiere a la formación de un polipéptido o proteína. En ambos casos, el objetivo final puede ser un producto bioquímico cuya producción pueda requerir la amplificación del ADN o ARN, o la expresión de un polipéptido o proteína . El procedimiento de la invención se puede llevar a cabo en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular. Se prefiere llevar a cabo el procedimiento en células vegetales. De manera más preferible, el procedimiento se lleva a cabo en una planta. De acuerdo con la invención, se proporciona una célula vegetal con un vector precursor el cual puede comprender transfección viral, suministro mediado por Agrobacterium, suministro no biológico o conversión de un ADN preprecursor replicón que se preintegra en el ADN nuclear de la planta para formar un vector precursor o vectores. Sin embargo, el hecho de proporcionar una célula vegetal con un vector precursor puede comprender además, adicionalmente a la transfección o transformación, acción celular, por ejemplo en el caso de vectores precursores basados en virus ARN, un ADN transformado o transfectado primario puede requerir transcripción con el fin de producir un vector precursor de ARN en la célula. En el caso de suministro mediado por Agrobacterium, el vector precursor debe ser cortado o transcrito del T-ADN suministrado por Agrobacterium. Un replicón es un ADN o una molécula de ARN capaz de replicación autónoma en una célula de la planta. Los ejemplos incluyen: plásmidos bacterianos y de levadura, plástidos y ADN mitocondrial , virus ADN y ARN, viroides, fagos. Un replicón debe tener un origen de replicación. El origen de replicación se puede reconocer por una ADN o ARN polimerasa en la célula vegetal hospedadora, en base en si el replicón es un replicón de ADN o de ARN, o por polimerasa heteróloga, por ejemplo de origen viral. En este caso, la célula vegetal debe proporcionarse con la polimerasa heteróloga, por ejemplo por uno de los replicones. La replicación autónoma de los replicones en la célula vegetal probablemente tenga el efecto de que se incremente su concentración, lo cual puede aumentar el nivel de expresión de las secuencias de interés y sustentar la difusión entre células y a través de ¦ la planta. Preferiblemente, los replicones tienen infectividad y capacidad de difusión aumentadas en comparación con los vectores precursores . Por lo menos uno o por lo menos dos replicones pueden retener capacidades virales adicionales, tales como un montaje de partícula viral, infectividad, supresión o eliminación de la expresión de genes, transcripción inversa, integración en el cromosoma del hospedador, movimiento de una célula a otra o movimiento a larga distancia. Uno de los replicones esencialmente puede ser un virus de tipo auxiliar que proporcione funciones trans necesarias para replicación de otro replicón o replicones. Además, uno de los replicones puede ser esencialmente un retrovirus de tipo silvestre o un retrotransposon que proporcione funciones trans necesarias para replicacion, transcripción inversa, integración en el cromosoma de un hospedador de otro replicón o replicones. Por lo menos uno o por lo menos dos replicones proporcionan, preferiblemente juntos, la amplificación o expresión de las secuencias de ácido nucleico de interés. Si una secuencia de interés se amplifica o se expresa desde uno de los replicones, se puede requerir otro replicón, por ejemplo para una función necesaria para la replicacion de los replicones o para difusión de por lo menos un replicón a las células vecinas si el procedimiento se realiza en cultivo celular o en una planta. En este caso, los replicones cooperan funcionalmente entre si. Si más de una secuencia de interés se va a amplificar o expresar, cada secuencia puede ser expresada preferiblemente desde un replicón, por lo que los replicones proporcionan (juntos) la amplificación o expresión. Además, en este caso, los replicones preferiblemente cooperan funcionalmente entre si. Como un ejemplo, una función para replicacion o difusión de los replicones se puede expresar desde uno de algunos de los replicones los cuales amplifican o expresan las secuencias de interés o desde un replicón adicional. Sin cooperación funcional, el nivel de amplificación o expresión sería mucho menor o estaría limitado a las células a las que se les proporciona uno o varios de los vectores precursores, si se desea la amplificación o la expresión en células vegetales o en una planta. Por lo menos uno o por lo menos dos replicones son funcionalmente distintos entre si en la medida en que proporcionan funciones diferentes para amplificación o expresión de una o varias de las secuencias de interés. Los ejemplos de tales funciones incluyen, además de la codificación de una o varias de las secuencias de ácido nucleico de interés, la expresión de productos necesarios para replicar los replicones, expresión de factores o productos (preferiblemente enzimas) que facilitan el procesamiento de uno de los vectores precursores para proporcionar los replicones, expresión de productos necesarios para el movimiento de una célula a otra o a larga distancia o de una planta a otra de dichos replicones (por ejemplo el movimiento de proteínas o proteína de recubrimiento), etc. Estos productos pueden funcionar en trans o en cis. La distinción funcional no incluye mutaciones aleatorias en los replicones que se pueden presentar en el desarrollo del procesamiento en la célula vegetal . Debido a dicho procesamiento, por lo menos los replicones están relacionados estructuralmente entre si de manera que comparten porciones de secuencia entre si. El tipo de relación depende del tipo de procesamiento (procedimiento de modificación) . Si se elabora en el procedimiento un replicón, el replicón se relaciona estructuralmente en por lo menos uno o a cada uno de por lo menos dos vectores precursores debido al procesamiento . Los vectores precursores de la invención experimentan procesamiento en la célula vegetal por uno de los siguientes procedimientos de modificación de ADN o ARN siguientes, los cuales dotan a la célula vegetal con el replicón o replicones de acuerdo con la invención. El procesamiento en la célula vegetal puede involucrar modificación de ADN tal como recombinación de ADN, inserción o corte, etc. De manera alternativa, puede involucrar modificación de ARN tal como empalme de ARN, ligación o recombinación, etc. Dentro de esta invención, el procesamiento no incluye trascripción. El vector precursor en si mismo puede ser una molécula de ADN o ARN capaz de replicación autónoma en una célula de la planta. Uno o varios de los vectores precursores de esta invención preferiblemente son de origen viral vegetal, de manera más preferible, de origen ARN o ADN viral. Los ejemplos de virus específicos se proporcionan en lo siguiente. Los vectores precursores pueden ser capaces de replicación autónoma en la célula vegetal como lo son los replicones. La célula vegetal se puede proporcionar con uno o más vectores precursores. Si se proporciona a la célula con únicamente un vector precursor, este precursor dota a la célula vegetal con por lo menos dos replicones. Si la célula se proporciona con dos o más vectores precursores, la célula preferiblemente está dotada con por lo menos uno de por lo menos dos replicones por un procesamiento que involucra interacción entre los vectores precursores, por ejemplo recombinación. Al proporcionar a la célula vegetal con dos o más vectores precursores aumenta en gran medida las posibilidades de generar uno o varios de los replicones de la invención. Pueden presentarse varias modificaciones diferentes de ADN o AR en la célula vegetal, en base en el diseño de los vectores precursores . El procedimiento de acuerdo con la invención se basa en el uso de una o varias células vegetales de tipo silvestre o de una o varias células vegetales que se someten a ingeniería genética de manera que proporcionan funciones necesarias para el procesamiento o que proporcionan, en trans, una o más funciones necesarias para infectividad, replicación del replicón, ensamble de la partícula viral, supresión de la expresión de un gen por el hospedador, integración en el cromosoma del hospedador, transcripción inversa, movimiento de una célula a otra o a larga distancia de los replicones resultantes . La ingeniería genética de la célula vegetal se realiza por expresión transitoria, transfección mediada por virus o por Agrobacterium, integración estable en los genomás de los núcleos u organelos o dentro de plásmidos replicantes de manera autónoma de la célula vegetal. Las células vegetales y las plantas para el procedimiento de esta invención preferiblemente son plantas superiores o células de las mismas.
Se prefieren particularmente plantas de cosecha. El procedimiento para generar amplificación o expresión de acuerdo con la invención presenta varias ventajas importantes con respecto a la técnica anterior. El tamaño de una o varias de las secuencias de ácido nucleico de interés que se van a amplificar o a expresar está mucho menos limitado en comparación con la técnica anterior, dado que las funciones necesarias para amplificación o expresión se comparten por al menos dos replicones, por lo que los replicones son más pequeños que lo que sería el vector de la técnica anterior. En consecuencia, la amplificación o expresión es m s eficaz. Además, el procedimiento de la invención permite la amplificación o expresión de más de una secuencia de ácido nucleico de interés. Se proporcionan ejemplos para la expresión de dos genes de interés. Sin embargo, es factible dentro de esta invención la expresión de tres, cuatro o incluso más secuencias de ácido nucleico de interés. Esto permite la expresión de una vía bioquímica completa o una cascada o bien de una proteína con subunidades múltiples . Cada secuencia de interés preferiblemente se puede expresar desde un replicón. Una o varias de las funciones adicionales para funcionamiento eficaz del procedimiento como las que se incluyen en lo anterior se pueden localizar en un replicón adicional. De manera alternativa, un replicón puede codificar más de una de estas funciones.
Una tercera ventaja importante de la invención es que existen varias posibilidades de mejoramiento de la seguridad biológica con respecto a los procedimientos de la técnica anterior. En modalidades en donde se utiliza más de un vector precursor, el procedimiento es funcional únicamente cuando todos los precursores se encuentran dentro de la célula vegetal. De manera alternativa, el procesamiento en la célula para generar por lo menos uno de por lo menos dos replicones puede depender de un componente adicional , por ej emplo una enzima la cual cataliza dicho procesamiento. Así, el sistema es funcional únicamente si el componente adicional es suministrado al interior de la célula o si se utiliza una célula transgénica que exprese dicho componente. En una modalidad, el replicón que expresa una secuencia de interés puede difundirse a través de la planta desde la célula infectada primaria, pero no es posible la difusión a otras plantas. Los ejemplos de secuencias de ácido nucleico de interés incluyen secuencias codificantes o partes de la misma o cualquier elemento genético. En la presente, un elemento genético es cualquier elemento de ADN o ARN que tenga una función genética distinta diferente a la codificación para una parte estructural de un gen. Los ejemplos incluyen: mej oradores transcripcionales, promotores, mej oradores traduccionales , sitios de recombinación, secuencias de terminación transcripcional, sitios de entrada de ribosoma interno (los IRES) y sitios de restricción. Un elemento genético preferido es el IRESmp75 tobamoviral utilizado como mejorador traduccional unido operablemente a una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica para una proteina de interés. En una modalidad preferida de la invención, se dota a la célula vegetal con por lo menos un (tipo de) replicón. El replicón preferiblemente se forma por recombinación específica de sitio entre por lo menos dos vectores precursores . La recombinación específica de sitio preferiblemente se lleva a cabo a nivel de ADN. Por lo tanto, un replicón puede ser ADN. De manera alternativa, un replicón puede formarse por ARN por transcripción después de recombinación específica de sitio. En esta modalidad, los vectores precursores preferiblemente no son capaces de replicación autónoma en la célula vegetal . Esta modalidad es preferida particularmente desde el punto de vista de seguridad biológica. En otra modalidad preferida de la invención, se proporciona una célula vegetal con ADNc de un vector precursor (figuras 2 y 4) . Después de la transcripción que produce el vector precursor, el procesamiento en la célula por empalme dota a la célula con un replicón basado en ARN viral a partir del cual se puede amplificar o expresar una secuencia de interés. Dado que el empalme es lento o no sucede en todas las moléculas vectoras precursoras en la célula, las moléculas precursoras no empalmadas permanecerán el la célula. Para el propósito de esta invención, los vectores precursores no empalmados restantes son replicones que también se proporcionan y que son capaces de replicación autónoma. En esta invención, se utilizan para la expresión de: (a) una o varias funciones necesarias para amplificación o expresión de la secuencia de interés, por ejemplo una función para difundir uno o varios de los replicones a células vecinas. En otra modalidad preferida se generan un conjunto de replicones del tipo ???, AB2,..., ABn o del tipo ???, B2A, BnA en una célula mediante recombinación específica de sitio de un vector (A) precursor primario con un conjunto de por lo menos dos vectores precursores secundarios (??, B2, ... , Bn) , en donde n es un número entero de >2. En la modalidad que se muestra en la figura 8 , los vectores precursores (vectores secundarios) que contienen una secuencia que se va a expresar o amplificar se recombinan con otro vector precursor (vector precursor primario) para formar replicones del tipo ???, AB2 y AB3, a partir de los cuales se pueden amplificar o expresar estas secuencias . Se necesitan por lo menos tres vectores precursores para dotar a la célula con por lo menos dos replicones. Preferiblemente las funciones para difusión de los replicones se expresan desde uno o más de los replicones. Para llevar a cabo los procedimientos de la invención, los vectores precursores pueden ser utilizados directamente para transformación o transfección de una planta o célula vegetal. Esto es válido particularmente para replicones basados en ADN viral. Para replicones basados en AR viral, los vectores de ADN utilizados para transformación o transfección requieren la transcripción para producir los vectores precursores dentro de la célula. Los procedimientos de la invención se pueden utilizar para generar grandes cantidades de una o más secuencias de ácido nucleico en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo de células de una manera ambientalmente inocua. De manera notable, el procedimiento se puede utilizar para generar grandes cantidades de por lo menos uno o por lo menos dos replicones. Los replicones se pueden purificar o enriquecer a partir del material vegetal . Los replicones pueden ser vectores o material viral que se puede utilizar, opcionalmente después de concentración o purificación, para transformar o transfectar una planta, tejido vegetal, células vegetales o cultivo celular, adicionales. En esta modalidad, el procedimiento de la invención puede ser un procedimiento biológicamente seguro para producir material viral infeccioso o vectores para transformar o transfectar plantas a gran escala de una manera similar a escala agrícola o de granja. Tales materiales virales infecciosos de los vectores puede ser material viral empacado o recubierto. El material de proteína necesario para empacar el material viral se puede expresar a partir de uno o varios replicones.
Los procedimientos de la invención se pueden utilizar para la producción de un producto bioquímico. El producto bioquímico preferiblemente es una proteína, de manera más preferible una proteína farmacéutica. La proteína farmacéutica puede ser un anticuerpo funcional. El procedimiento de la invención se puede utilizar adicionalmente para determinación de función de gen, de manera especial para la determinación rápida de función de gen o para análisis genómico funcional . Los procedimientos de la invención se pueden utilizar adicionalmente para evolución artificial o dirigida, específicamente para evolución artificial o dirigida de genes o para evolución artificial o dirigida de elementos genéticos .
DESCRIPCIÓN BEVE DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra el principio general de la generación de replicones a partir de vectores precursores in planta. La figura 2 muestra la estructura de un vector precursor basado en PVX, su generación por transcripción para proporcionar la forma completa del transcrito y su empalme. La expresión se puede presentar a través del transcrito (vector precursor y replicón) . La figura 3 muestra plásmidos recombinantes básicos y estrategia de clonación utilizada para clonación del ADNc del vector precursor basado en PVX. La figura 4 muestra el esquema general de expresión de dos genes (CP y GFP) utilizando un vector precursor (provector) empalmable basado en CrTMV. La figura 5 muestra la estrategia de clonación del plásmido recombinante intermediario pIC3342. La figura 6 muestra la estrategia de clonación de los plásmidos recombinantes intermediarios pIC3378 y pIC3382. La figura 7 muestra las etapas finales de clonación del plásmido pIC3393. La figura 8 muestra el esquema general de expresión de varios genes via vectores precursores basados en CrTMV (a-c y el vector mostrado en la parte superior) así como la generación de replicones (A-C) por recombinación específica de sitio en los sitios LoxP catalizados por la enzima Cre recombinasa . La figura 9 muestra el esquema de clonación del plásmido recombinante pIC3461 - un componente primario de un sistema de recombinación. La figura 10 muestra el esquema de clonación del plásmido recombinante pIC3441 - uno de los componentes secundarios de un sistema de recombinación. La figura 11 muestra el esquema de clonación del plásmido recombinante pIC3941 - uno de los componentes secundarios de un sistema de recombinación. La figura 12 muestra el esquema de clonación del plásmido recombinante pIC3521 - uno de los componentes secundarios de un sistema de recombinación. La figura 13 muestra el esquema principal de expresión transgenica vía un vector viral no contagioso. La figura 14 muestra la estructura del plásmido pIC1593 utilizado para introducir un gen para Cre recombinasa en el genoma de N-benthamiana. La figura 15 muestra el esquema general de expresión de varios genes vía vectores precursores basados en CrTMV (a-c y el vector mostrado en la parte superior) y la generación de replicones (A-C) mediante la utilización del sistema integrasa/att para recombinación específica de sitio. Los vectores precursores se clonan en vectores binarios con límites de T-ADN (LB y RB) . La figura 16 muestra el esquema de clonación del plásmido recombinante pICH4851 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación. La figura 17 muestra el esquema de clonación del plásmido recombinante pICH5151 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación. La figura 18 muestra el esquema de clonación del plásmido recombinante pICH5161 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación.
La figura 19 muestra el esquema de clonación del plásmido recombinante pICH5951 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación. La figura 20 muestra el sistema de clonación de los plásmidos recombinantes pICH6871 y pICH6891 - dos de los componentes secundarios del sistema de recombinación. La figura 21 muestra el esquema de clonación del plásmido recombinante pICH4371 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación. La figura 22 muestra el esquema de clonación del plásmido pICH4461 - uno de los componentes secundarios del sistema de recombinación. La figura 23 muestra el plásmido pICPlOlO el cual se utiliza como una fuente de integrasa en el sistema att-provector.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente invención se describe una solución para amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, la cual tiene todos los potenciales de los sistemas de vectores virales pero carece de sus desventajas tales como capacidad limitada. Además, proporciona mejores características de bioseguridad. Para la construcción de vectores basados en virus de acuerdo con los principios de la presente invención se pueden utilizar virus que pertenezcan a grupos taxonómicos diferentes. Esto es válido para virus que contengan ARN y ADN, los ejemplos de los cuales se proporcionan en lo siguiente (a través -de este documento, cada nombre de especie de tipo está precedida por el nombre del orden, familia y género al que pertenece) . Los nombres de los órdenes, familias y géneros están itálicas o cursivas, si han sido probadas por la ICTV. Los nombres taxonómicos entre comillas (y no en cursivas) indican que este taxón no tiene un nombre aprobado por ICTV internacional. Los nombre de las especies (vernáculos) se proporcionan con letra normal. Se indican los virus sin asignación formal a género o familia) :
ADN virus : Virus ADN de cadena sencilla o circulares: Familia; Caulomoviridae, Género: Badnavirus, Especie de tipo: virus de las manchas amarillas de commelina, Género: Caulimovirus, Especie de tipo: virus de mosaico de coliflor, Genero: "virus similares a SbCMV" , Especie de tipo: virus de manchas cloróticas de frijol de soya, Género: "virus similares a CsVMV" , Especie de tipo: virus de mosaico de la vena de Cassava, Género "virus similares a RTBV" , Especie de tipo: bacilliformvirus de arroz tungro, Género: virus similares al aclaramiento de la vena de Petunia, Especie de tipo: virus de aclaramiento de la vena de Petunia;
Virus ADN de cadena sencilla circulares: Familia: Geminiviridae, Género: Mastrevirus (Geminivirus subgrupo I) , Especie de tipo: virus de las estrías de maíz, Género: Curtovirus (Geminivirus del subgrupo II) , Especie de tipo: virus de la parte superior rolliza de la remolacha; Género: Beg-omovi us (Geminivirus del subgrupo III) , Especie de tipo: virus del mosaico del frijol dorado;
ARN virus Virus ARN de cadena sencilla: Familia: Bromoviridae, Género: Alfamovirus: Especie de tipo: virus de mosaico de alfalfa, Género: llarvirus, Especie de tipo: virus de estrías de tabaco, Género: Bromovirus, Especie de tipo: virus de mosaico de bromo, Género: Cucumovirus, Especie de tipo: virus del mosaico del pepino; Familia: Closteroviridae, Género: Closterovirus, Especie de tipo: virus del amarilleo de remolacha, Género: Crinivirus, Especie de tipo: virus del amarilleo infeccioso de lechuga, Familia: Comoviridae, Género: Comovirus, Especie de tipo: virus de mosaico de garbanzo, Género: Fábavirus, Especie de tipo: virus 1 de wilt de frijol amplio, Género: Nepovirus, Especie de tipo: virus de anillo de tabaco. Familia: Potyviridae, Género: Potyvirus, Especie de tipo: virus Y de papa, Género: Rymovirus, Especie de tipo: virus de mosaico de ryegrass, Género: Bymovirus, Especie de tipo: virus de mosaico amarillo de cebada; Familia: Seguiviridae, Género: Seguivirus, Especie de tipo: virus parsnip yellow fleck, Género: Waikavirus , Especie de tipo: virus esférico de arroz de tungro; Familia: Tombusviridae, Género: Carmovírus, Especie de tipo: virus de manchas de clavel, Género: Dianthovirus, Especie de tipo: virus de ringspt de clavel, Género: Machlomovirus, Especie de tipo: virus de manchas cloróticas de maíz; Género: Necrovirus, Especie de tipo: virus de necrosis de tabaco, Género: Tombusvirus, Especie de tipo: virus bushy stun de tomate, Géneros no asignados de virus ARN de cadena sencilla. Género: Capillo-virus, Especie de tipo: virus de ranuras de tallo de manzana; Género: Carlavirus, Especie de tipo: virus latente de clavel; Género: Enamovirus, Especie de tipo: virus de mosaico de enation de chícharo, Género: Furovirus, Especie de tipo: virus de mosaico de trigo que crece en el suelo, Género: Hordeivirus, Especie de tipo: virus de mosaico de estrías de cebada, Género: Idaeovirus, Especie de tipo: virus de arbustos enanos de raspberry; Género: Luteovirus, Especie de tipo: virus de enanismo amarillo de cebada; Género: Marafivirus, Especie de tipo: virus de rayado fino de maíz; Género: Potexvirus, Especie de tipo: virus X de papa; Género: Sobemovirus, Especie de tipo: virus de mosaico de frijol sureño, Género: Tenuivirus, Especie de tipo: virus de stripe de arroz, Género: Tobamovirus, Especie de tipo: virus de mosaico de tabaco, Género: Tobravirus, Especie de tipo: virus de rattle de tabaco, Género: Trichovirus, Especie de tipo: virus de manchas en las hojas cloróticas de manzana; Género: Tymovirus, Especie de tipo: virus de mosaico amarillo turnip, Género: Umbravirus, Especie de tipo: virus de mottle de zanahoria; Virus ARN de cadena sencilla negativos: Orden: Mononegavirales, Familia: Rhabdoviridae, Género: Cytorhabdovirus, Especie de tipo: virus de amarilleo necrótico de lechuga, Género: Nucleorhabdovirus, Especie de tipo: virus del enanismo amarillo de papa; Virus de ARN de cadena sencilla negativos: Familia: Bunyaviridae, Género: Tospovirus, Especie de tipo: virus de spotted wilt de tomate; Virus de ARN de cadena doble: Familia: Partitiviridae, Género; Alphacryptovirus, Especie de tipo: virus 1 críptico de trébol blanco, Género: Betacrypfcovírus, Especie de tipo: virus 2 críptico de trébol blanco, Familia: Reoviridae, Género: Fijivirus, Especie de tipo: virus de enfermedad de Fiji, Género: Phytoreovirus, Especie de tipo: virus de tumor de heridas, Género: Oryzavirus, Especie de tipo: virus de ragged stunt de arroz; Virus no Asignados: ADN de cadena sencilla de genoma: Especie: virus de copete racimoso de plátano, Especies: virus de decaimiento foliar de coco. Especies: virus de enanismo de trébol subterráneo, Genoma: ADN de cadena doble, Especies: virus de amarilleo de la vena de pepino; Genoma: ARN de cadena doble, Especies: virus de enamismo de tabaco, Genoma: AR de cadena sencilla, Especies: virus del ajo A, B, C y D, Especies: virus de moteado de vid, Especies: virus de mosaico de línea blanca de maiz, Especies: virus 2 latente de oliva, Especies, virus de melón ourmia, Especies: virus de manchas de zonas de Pelargonio; Satélites y Viroides: Satélites: Virus de satélite de ARN de cadena sencilla: Virus de satélite subgrupo 2, especies de tipo: satélite de necrosis de tabaco, ARN Satélite, Satélites de ARNm tipo B subgrupo 2, satélites de ARN lineal tipo subgrupo 3C, satélites de ARN circular tipo subgrupo 4D, Viroides, Tipo de especies: viroide de tubérculo espinado de papa. En la mayor parte, los vectores de origen virales de plantas son los que se utilizan como plásmidos capaces de replicacion autónoma en plantas (replicones) . Sin embargo, se conocen los principios necesarios para ingeniería de tales plásmidos utilizando elementos no virales. Por ejemplo, muchos orígenes de replicacion supuestos de células vegetales han sido descritos (Berlani et al./ 1988, Plant Mol. Biol . , 11, 161-162; Hernandes et al., 1988, Plant Mol. Biol., JLO, 413-422; Berlani et al., 1988, Plant Mol. Biol., 11, 173-182; Eckdahl et al., 1989, Plant Mol. Biol., 12^, 507-516). . Se ha demostrado que las secuencias de replicación de manera autónoma (elementos ARS) de genomas de plantas superiores tienen características estructurales y de secuencia en común con los elementos ARS de levadura y animales superiores (Eckdahl et al., 1989, Plant Mol. Biol., 12, 507-516). Los elementos ARS vegetales son capaces de conferir habilidad de replicación autónoma a plásmidos en Saccharomyces cerevisiae. Los estudios en secuencia de ADN nuclear de maíz capaces de promover replicación autónoma de plásmidos en levadura muestra que presentan dos familias de secuencias muy relacionadas dentro del genoma de maíz. Estas secuencias tienen un patrón de hibridación genómico característico. Típicamente existe solo una copia de una secuencia homologa de ARS en cada 12-15 kb del fragmento genómico (Berlani et al., 1988, Plant Mol. Biol., 11:161-162). Otra fuente de replicones de origen vegetal son los elementos separadores de ADN ribosómico de planta que pueden estimular la amplificación y expresión de genes heterologos en plantas (Borisjuk et al., 2000, Nature Biotech. , 18, 1303-1306) . Por lo tanto, un replicón o un vector precursor contemplado en esta invención no necesariamente se deriva de virus vegetales . Los virus de ADN de planta proporcionan una manera sencilla de someter a ingeniería replicones (vectores) que pueden ser útiles específicamente para transformación de ADN dirigido, pero los vectores pueden ser total o parcialmente de elementos de virus de ARN vegetal u otros virus que no sean vegetales también son posibles. Los replicones basados en virus vegetales evidentemente son ventajosos. Tales replicones, además de la replicación, pueden proporcionar funciones útiles adicionales, por ejemplo, para movimiento de una célula a otra y a larga distancia. Además, con frecuencia se pueden separar con mayor facilidad de la célula vegetal aposteriori mediante la utilización de métodos conocidos de erradicación de virus de plantas infectadas. En la figura 1 se muestra el principio general de la invención. En el ejemplo más sencillo, se suministra un tipo de vector precursor (pro-vector) (A) en la célula vegetal en donde, ante su procesamiento en la célula, proporciona por lo menos uno o por lo menos dos replicones estructuralmente relacionados y funcionalmente distintos (F y G) los cuales son capaces de proporcionar amplificación o expresión de las secuencias de interés. Se puede introducir en la célula vegetal más de un vector precursor [A(+C,D,E... ) ] . Opcionalmente, la célula vegetal puede ser transgénica y contener otro componente adicional (B) necesario para el procesamiento del vector precursor o la expresión, replicación o movimiento célula a - -
célula o sistémico. En una modalidad de la invención, se describe un sistema pro-vector (vector precursor) que se basa en el empalme del AR de pro-vector en el núcleo de la planta. Este sistema comprende una molécula de ADN del pro-vector que contiene partes de ADNc del genoma del virus de la planta, uno o varios de los genes de interés y sitios de empalme funcionales en la célula vegetal (véase, por ejemplo, las figuras 2 ó 4) . Después de transcripción en la célula vegetal transfectada, el producto primario de ARN (pro-vector o vector precursor) se puede procesar por empalme. Debido al diseño del pro-vector (vector precursor) , el gen de interés (por ejemplo GFP) sustituye uno de los genes virales (por ejemplo CP) en esta forma empalmada. Esto permite que el gen de interés (GFP) se exprese vía la trayectoria viral normal en vez de la proteína viral sustituida. Sin embargo, dado que el empalme no puede avanzar con una eficacia de 100%, una fracción del transcrito primario permanece sin empalmar y se exporta desde el núcleo tal cual, en forma empalmada. Como un resultado, aparecen en el citoplasma de la célula vegetal transfectada dos tipos de ARN de vector viral auto-replicantes (replicones) . Esto lleva a la expresión tanto de GFP como de CP a partir de los replicones generados utilizando un vector precursor. Debe mencionarse que, en el caso ejemplificado, el nivel de expresión de GFP probablemente sea mucho más alto que el de CP. Se ha demostrado para tobamovirus que la cantidad de proteína viral producida durante la infección depende de la distancia entre el gen que codifica para la proteína y la parte 3' terminal del virus. Dado que GFP se expresa desde la forma empalmada de ARN, el ARN subgenómico correspondiente es significativamente más corto que el ARN a partir del cual se expresa CP (figura 4; sGFP indica un GFP sintético o sometido a ingeniería) . Como una ej.emplificación de esta modalidad se construyen dos pro-vectores (vectores precursores) en base en dos virus vegetales bien conocidos: el virus X de papa (PVX) y el tobamovirus que infecta a cruciferas (CrTMV) . En ambos casos, el gen para CP del virus está franqueado con sitios de empalme donador (hacia el extremo 5 ' ) y aceptor (hacia el extremo 3 ' ) (SA y SD, respectivamente) . Se clona GFP hacia el extremo 3 ' del sitio aceptor para que se exprese únicamente el transcrito empalmado . Los papeles fisiológicos de CP en PVX y CrTMV son diferentes. En el caso de PVX, se requiere CP para el movimiento' célula a célula del virus. En CrTMV, CP participa principalmente en la difusión a larga distancia del virus (infección sistémica) y no es crucial para la infección de células vecinas. Estos ejemplos proporcionan dos patrones diferentes de expresión de gen indicador (GFP) . En el caso del sistema basado en PVX, la dispersión viral se frena en células transfectadas primarias hasta que se expresa la cantidad requerida de CP desde un replicón menos eficiente que se forma a partir de ARN no empalmado. Esto lleva a la superconducción de GFP sintetizado mucho más rápidamente en la misma célula. Finalmente, la cantidad necesaria de CP se acumula y ambos replicones penetran en células vecinas en donde se repite el proceso. Por el contrario, en el caso del pro- ector basado en CrTMV, la difusión viral no se limita al movimiento de una célula a otra. Ambas formas del vector actúan independientemente, lo que induce un crecimiento más rápido del área infectada. Aunque los ejemplos específicos que describen modificación de ARN como un mecanismo para generar replicones de acuerdo con la invención se basan en empalme de ARN, también se pueden utilizar otros mecanismos de modificación de ARN para el procedimiento de esta invención. Estos incluyen, por ejemplo, modificaciones como ligación de ARN o recombinación de ARN. La ligación de moléculas diferentes de ARN por enzimas tales como ARN ligasa permite producir una pluralidad de replicones de ARN diferentes dentro de una célula basada en la actividad enzimática interna de las células vegetales o basada en la expresión de las ligasas bien conocidas tales como la ligada de ARN T4 (Nishigaki et al., 1998, Mol. Divers . , 4, 187-190) o la ligasa de ARN mitocondrial de Lelshmania (Blanc et al., 1999, J". Biol. Chem. , 274, 24289-24269). La recombinación de ARN-ARN es un fenómeno bien estudiado. Se produce con facilidad en una planta hospedadora entre moléculas de ARN viral con cierto grado de homología (Allison et al., 1990, Proc. Nati. Cad. Sci. Ql_, 1820-1824; Rao et al., 1990, J. Gen. Virol., 71, 1403-1407; E.U.A. 5,877,401). En otra modalidad, los vectores precursores se procesan por recombinación de ADN específica de sitio lo que produce un replicón o replicones parcialmente diferentes o ensamblado de un replicón viral in vivo. En este caso, los rearreglos moleculares se llevan a cabo a nivel de ADN. Se mezclan varias moléculas (pro-vectores) por medio de recombinación para producir una o varias moléculas vectores (replicones) . El primer componente de ADN del sistema puede contener un promotor vegetal (actina 2 de Arabidopsis) fusionado a la parte principal del genoma de CrTMV - el gen de polimerasa más el gen de MP seguido por un sitio específico de recombinación. Los componentes secundarios son ADN plasmídicos que comprenden el mismo sitio de recombinación seguido por uno o varios genes de interés (cualquier gen indicador) o un gen CP viral . El 31 -UTR de CrTMV debe clonarse hacia, él extremo 31 del gen de interés . El último componente del sistema puede ser Cre-recombinasa o integrasa que exprese ADN. Estas enzimas promueven la reorganización de los componentes de pro-vector en moléculas de vector activas (replicones) . Debe resaltarse que ninguno de los componentes pro-vector es infeccioso solo, lo cual es importante en términos de la seguridad biológica del sistema.
Después de proporcionar una célula vegetal con todos los componentes del sistema de componentes múltiples descrito, la recombinación se lleva a cabo y se pueden formar uno o varios replicones (véase la figura 8, A, B y C) . Estas moléculas de ADN rearregladas se pueden transcribir (dado que presentan promotor de actina 2 de Arabidopsis) en el núcleo y se exportan al citoplasma. Finalmente, al igual que en el caso que involucra empalme de ARN, varios ARN vectores replicantes aparecen en el citoplasma de la célula transfectada . En esta modalidad se describe el sistema en donde la totalidad de estos vectores contienen un gen MP funcional y un gen colocado corriente abajo. Esto permite que cada ARN vector exprese un gen MP funcional y un gen colocado hacia el extremo 3 ' y que penetre dentro de células vecinas. Se debe establecer que son posibles también otras combinaciones y que se contemplan y considera que están dentro del ámbito de esta invención. En la invención se ejemplifican dos soluciones diferentes de suministro de recombinasa. La recombinasa se puede suministrar en la célula en un procedimiento de bombardeo conjunto o bien por expresión transitoria mediada por Agrojbacterium junto con otros componentes de ADM del sistema. Como otra solución, se ha obtenido una planta transgénica que exprese la Cre-recombinasa . Esto reduce el número de componentes que se deben proporcionar a la célula y, como un resultado, incrementa la eficacia total del sistema.
Adicionalmente, esto mejora adicionalmente la seguridad del proceso pues no puede llevarse a cabo fuera de la planta la cual ha sido manipulada genéticamente para sostener el procedimiento. Durante la clonación de los componentes del provector, se clona un sitio de recotribinación LoxP hacia el extremo 51 de uno o varios de los genes de interés . Un sitio LoxP contiene dos secuencias repetidas invertidas pequeñas separadas por varios nucleótidos y forma una estructura de vástago y bucle en el AR . El vástago contiene únicamente 4 pares de GC de manera que no es muy estable. Sin embargo, este vástago puede reducir la eficacia de traducción de un gen hacia el extremo 3'. Para resolver este problema, se puede clonar cualquier mej orador traduccional entre LoxP y el gen de interés. En los ejemplos con Cre recombinasa se utiliza un líder omega de T V Ul . Sin embargo se puede utilizar cualquier secuencia mej oradora de traducción (por ejemplo IRESmp75 para CrTMV o TMV Ul) así como los IRES de planta. Los elementos IRESmp75 preferiblemente se pueden utilizar como mejoradores traduccionales al igual que en los ejemplos con integrasa del fago PhiC31. En este caso, en un conjunto de provectores, los sitios de recombinación LoxP se sustituyen por sitios att (sitios de unión) del fago PhiC31 de Streptomyces (Thorpe & Smith, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci . , 95, 5505-5510; Groth et al., 2000, Proc. Nati. Acad. Sci., 97, 5995-6000) los cuales son las secuencias objetivo para la recombinación de la enzima integrasa. Se clonan en los provectores dos sitios att diferentes : mientras que se inserta attP en los vectores del tipo de polimerasa-MP-LoxP, se clona un sitio attB-recombinación dentro de los provectores lo cual presenta al gen de interés seguido por una secuencia 3 'NTR y un terminador nos. Similar al sistema Cre, los sitios de recombinación att limitan la eficacia de traducción de un gen, el cual se localiza hacia el extremo 3'. Por lo tanto, también en este sistema se clonan secuencias mejoradores traduccionales entre los sitios attB y los genes de interés . Se ha demostrado que las secuencias IRESmp75 tienen un efecto comparable o incluso mejor como mejoradores traduccionales en comparación con el líder omega de TMV Ul. Los sistemas adecuados de recombinasas/sitio de recombinación incluyen, por ejemplo, el sistema Cre-Lox de bacteriófago Pl (Austin et al., 1981, Cell, 25, 729-736), el sistema Flp-Frt de Saccharomyces cerevisiae (Broach et al., 1982, Cell, 29, 227-234) , el sistema R-Rs de Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al., 1985, J. Mol. Biol., 182, 191-203), la integrasa de el fago PhiC31 de Strepto yces (Thorpe & Smith, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci . , 95, 5505-5510; Groth et al., 2000, Proc. Nati. Acad. Sci., 97, 5995-6000) y las resolvasas . Además se contempla que otros métodos de rearreglo o de redistribución de ADN estén dentro del alcance de la presente invención. Se pueden utilizar otros sistemas de ADN para modificación de enzimas para generar replicones relacionados pero funcionalmente distintos dentro de un tipo silvestre de una célula vegetal sometida a ingeniería genética: endonucleasa de restricción, transposasa, recombinasa general o específica, etc . Se pueden utilizar métodos diferentes para proporcionar a una célula vegetal con vectores precursores. Se puede transformar un ADN en células vegetales por un vector Ti-plásmido transportado por Agrobacterium (US 5,591,616; US 4,940,838; US 5,464,763) o bombardeo de partículas o microproyectiles (US 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616B1) . También se pueden utilizar otros métodos de transformación de plantas como microinyección (WO 09209696; WO 09400583A1; EP 175966B1) , electroporación (EP00564595B1 ; EP00290395B1 ; WO 08706614A1) o transformación de protoplastos mediada por PEG, etc. La elección del método de transformación depende de la especie vegetal que se va a transformar. Por ejemplo, el bombardeo con microproyectiles se prefiere de manera general para la transformación de monocotiledóneas mientras que para dicotiledóneas en general se obtienen mejores resultados con la transformación mediada por Agrobacterium, se prefiere el suministro de vectores precursores mediado por Agrrojbacterium. La construcción de vectores virales vegetales para la expresión de genes no virales en plantas se ha descrito en diversos documentos (Dawson et al., 1989, virology, 172 , 285-293; Brisson et al., 1986, Methods in Enzymology, 118 , 659; MacFarlane & Popovich, 2000, Virology, 276, 29-35; Gopinath et al., 2000, Virology, 267 , 159-173; Voinnet et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 96, 14147-14152) y se puede llevar a cabo fácilmente por los expertos en la técnica. La presente invención tiene muchas ventajas en comparación con las estrategias existentes basadas en vector viral para expresar genes extraños en plantas . Lo que es más importante, el procedimiento se puede utilizar para la expresión de más de una secuencia de ácido nucleico de interés y por lo tanto se puede utilizar para la expresión de genes múltiples de una vía o cascada bioquímica. A este respecto, el procedimiento de la invención es el único método disponible que puede ser utilizado eficazmente para la expresión de genes con el fin de determinación de función de gen o con el fin de producción bioquímica. La invención también abre una amplia gama de oportunidades para cualquier clase de construcción de cascada biológica. En la figura 13 se presenta un ejemplo. Este sistema utiliza la recombinación de tres componentes de vector precursor en dos replicones. En primer lugar, el replicón A expresa MP y un gen de interés (en el ejemplo GFP) . Debido a la expresión de la proteína de movimiento (MP) , este vector es susceptible de moverse de una célula a otra en la hoja inoculada. Sin embargo, no puede dispersarse sistémicamente en la planta infectada y no se puede transmitir a otras plantas debido a la ausencia de la proteína de recubrimiento (CP) . En otras palabras, este replicón es infeccioso únicamente si es suministrado artificialmente dentro de la célula vegetal . El segundo replicón B expresa únicamente CP. Nótese que no es capaz de formar partículas virales dado que su ARN carece del origen del ensamblado de virus (colocado dentro del gen para MP) . Sin embargo, expresa CP en cantidades significativas. El procedimiento que se propone es inherentemente más inocuo en la medida en que es operable solo en presencia de todos los vectores precursores . Si están presentes ambos replicones descritos antes en la misma célula, se complementan entre si y ambos componentes son capaces de desplazarse a células vecinas. Sin embargo, solo el vector A puede ser recubierto con CP para formar partículas virales y por lo tanto únicamente se exportará este componente de la hoja infectada a toda la planta. Si tales partículas virales penetran a hojas no infectadas, suministran únicamente el componente infeccioso A, pero no el B. Esto lleva a una dispersión sistémica de infección en toda la planta pero el virus no puede infectar a otras plantas debido a que las partículas virales se pueden formar únicamente en hojas inoculadas primarias y estas partículas contienen únicamente un componente de replicón, el cual no es suficiente para infección sistémica de otra planta.
Este sistema representa un ejemplo único de expresión altamente eficaz de un transgen en una planta completa vía un vector viral no contagioso . Adicionalmente, el procedimiento de ensamblado de un replicón viral desde por lo menos dos precursores de replicón a través de recombinación de ADN específica de sitio garantiza un nivel superior de seguridad en comparación con un vector viral conveniente que es utilizado para infectar células vegetales. El procedimiento de ensamblado de replicón viral desde por lo menos dos componentes requiere que estén presentes en la misma célula vegetal la presencia de los dos componentes y la recombinasa específica de sitio. La recombinasa se puede suministrar en cis junto con uno de tales componentes. Preferiblemente, la recombinación se puede suministrar por separado. De manera más preferible, la planta hospedadora puede ser sometida a ingeniería para que exprese la recombinasa. En este último caso, el ensamblado del vector funcional a partir de los elementos de provector se limitará específicamente a la planta hospedadora sometida a ingeniería. La tecnología descrita permite una mayor eficacia de la expresión de genes en comparación- con los sistemas convencionales . Esto se obtiene al reducir el tamaño del replicón o. de los replicones que expresan el gen. En nuestro sistema, el tamaño se reduce significativamente en comparación con otros vectores virales dado que el vector precursor puede proporcionar que se exprese algunos genes virales necesarios para la función del sistema a partir de componentes adicionales o vectores (replicones) en trans . Como se mencionó antes, el tamaño del ARN viral afecta notablemente el nivel de expresión de uno o varios de los transgenes . Otra ventaja técnica del sistema es que los usuarios no necesitan clonar nada dentro de la copia de ADNc de longitud completa del virus. Esta dificultad y el proceso que consume tiempo se evitan debido a que uno puede utilizar un plásmido recombinante construido previamente (similar a pIC3461, figura 9) que contiene un promotor, un gen para replicasa viral y (opcionalmente) un gen para proteína de movimiento. Este plásmido recombinante no requiere modificación adicional para aplicación alguna. La única clonación que necesita realizar el usuario es fusionar un gen de interés con algunas de las secuencias adicionales pequeñas (sitio de recombinación 31 -UTR del virus y señal terminadora de transcripción, en donde el tamaño total es menor de 1 kb) en cualquier clase de plásmido con un número alto de copias. Esta ventaja es especialmente importante en el caso de genes cuyos productos son tóxicos para las bacterias y que requieren manejo especial durante la clonación, así como para procedimientos de alto rendimiento.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de provector basado en PVX susceptible de empalme
Se han construido dos provectores basados en 35-PVX. Se utiliza el plásmido PVX-201 como un plásmido recombinante básico para clonación (Chapman S et al. 1992, Plant J 1992 Jul;2 (4) :549-57) . Este plásmido contiene ADNc de longitud completa del genoma del virus X de papa (PVX) (Gene Bank Números de Acceso NC 001455; AF172259) fusionado al promotor 35S y al terminador nos. La región promotora subgenómica CP se duplica y se insertan algunos sitios de clonación entre las regiones duplicadas en PVX-201 (véase la figura 3) . En la primera etapa se obtiene un plásmido recombinante intermediario pIC2518. Este plásmido contiene en consecuencia: la parte C terminal de CP (62 pb) del sitio Xhol al terminador con un sitio HindIII introducido a la derecha después del codón de terminación, un gen mejorado GFP (sGFP) (codón de inicio incluido dentro del sitio Ncol) y la parte 3' terminal del virus PVX que incluye la parte C terminal de CP (62nt) , 3'UTR y la secuencia s poli (A) seguida por un sitio SacI .(figura 3) . Se sintetizan dos grupos de oligonucleótidos para clonar dos pares diferentes de sitios de empalme donador/aceptor :
D1+ AACGGTCGGTAACGGTCGGTAAA DI- TCGACTTTACCGACCGTTACCGACCGTT Al+ AGCTAACCTAGCAGGTTATATGCAGGTTATATGCAGGTC Al- TTGGATCGTCCAATATACGTCCAATATACGTCCAGGTAC
2. D2+ CGAAAGGTAAG D2- TCGACTTACCTTT A2+ AGCTAACCTATTGCAGGTTGC A2- CATGGCAACCTGCAATAGGTT
Después de reasociación (recocido) entre si, los oligonucleótidos correspondientes forman los siguientes fragmentos de ADN de cadena doble:
D1+/D1- fragmento Di 5 ' CGAACGGTCGGTAACGGTCGGTAAAG 3 ' 3' TTGCCAGCCATTGCCAGCCATTTCAGCT 5' A1+/A1- fragmento Al 5 'AGCTAACCTAGCAGGTTATATGCAGGTTATATGCAGGTC 3 ' 31 TTGGATCGTCCAATATACGTCCAATATACGTCCAGGTAC 51
D2+/D2- fragmento D2 51 CGAAAGGTAAG 31 3' TTTCCATTCAGCT 5"
A2+/A2- fragmento A2 51AGCTAACCTATTGCAGGTTGC 3 ' 3 ' TTGGATAACGTCCAACGGTAC 5 '
Los extremos 5 ' sobresalientes de los fragmentos son adhesivos a ADN restringido por Clal/Sall en el caso de DI y D2. Los fragmentos Al y A2 se pueden ligar a sitios HindlII-Ncol . El plásmido PVX-201 descrito antes (figura 3) se digiere con Clal y Salí. Después, el fragmento DI o D2 se liga n el vector digerido, lo que proporciona el plásmido recombinante plC3033 [en el caso de Di) de plC3053 (en el caso de D2) . El plásmido pIC2518 (figura 3) se digiere con HindIII y Ncol . La ligación del fragmento Al o A2 produce el plásmido recombinante pIC3041 (Al) o pIC3068 (A2), respectivamente. Se obtienen dos variantes de un plásmido provector PVX susceptible de empalme por clonación del fragmento Xhol-SacI a partir de pIC3041 en pIC3033 y al fragmento Xhol-Sacl a partir de pIC3068 en pIC3053. Los plásmidos resultantes se denominan pIC3242 (sitios de empalme Dl+Al) y pIC3258 (sitios de empalme D2+A2) (figura 2) .
EJEMPLO 2 Bombardeo con microproyectiles El bombardeo con microproyectiles se realiza son el equipo Biolistic PDS-1000/He Partióle Delivery Systems (Bio-Rad) . Se bombardean hojas separadas de N. benthamiana a 6205 kPa (900 psi) con una distancia de 15 mm desde un punto de lanzamiento de macroportadora a una pantalla de detención y una distancia de 60 mm desde la pantalla de detención al tejido objetivo. La distancia entre el disco de ruptura y el punto de lanzamiento en la macroportadora es de 12 mm. Las células se bombardean después de 4 horas de tratamiento osmótico previo. Se realiza como sigue el procedimiento de recubrimiento con oro de ADN (PEG/Mg) : se mezclan 25 µ? de suspensión de oro (60 mg/ml en glicerol 50%) con 10 µ? de ADN plasmídico (hasta 1 µg/µl) en un tubo Eppendorf y se suplementa subsecuentemente por 10 µ? de PEG 40% en MgCl2 1.0 M. La mezcla se somete a remolino durante 2 min y después se incuba durante 30 min a temperatura ambiente sin mezclar. Después de centrifugación (2000 rpm, 1 min) , el sedimento se lava dos veces con 1 mi de etanol 70%, una vez con 1 mi de etanol 99.5% y finalmente se dispersa en 30 µ? de etanol 99.5%. Se cargan alícuotas de 6 µ? de suspensión de ADN-oro en etanol sobre discos de macroportadora y se permite que se sequen hasta por 5-10 min.
Preparación del ADN plasmídico Los plásmidos se transforman en E. coli cepas DH10B y JM109, se hacen crecer preparaciones máximas en medio LB y el ADN se purifica utilizando el equipo Qiagen.
EJEMPLO 3 Inoculación mecánica de plantas con ADN plasmídico provector
Se inoculan con ADN plasmídico hojas desarrolladas completamente de cinco a siete semanas de edad de plantas de Nicotiana benthamiana mediante generación mecánica de heridas . Para este propósito, se mezclan 10-50 µ<a de ADN con amortiguador GKP 3x (glicina 50 mM, 2P0 30 mM, Celite 3%, bentonita 3%) y se raspa suavemente sobre el lado superior de las ho as .
EJEMPLO 4 Expresión de un gen indicador en hojas de plantas por provector basado en PVX convertido (empalmado)
Las hojas de N. Benthamiana desarrolladas completamente se bombardean con los plásmidos pIC3242 y pIC3258. Se espera que se sinteticen dos transcritos diferentes de ARN en la célula vegetal a partir de cada uno de estos plásmidos - la forma completa y la forma empalmada (véase la figura 2) .
La presencia del segundo transcrito se puede detectar por fluorescencia de GFP en una célula transfectada con el provector . Se ha observado fluorescencia GFP fuerte en numerosas células de hoja bombardeadas con pIC3242 (48 horas después del bombardeo) . No se detecta GFP en el caso de pIC3258 - de manera que este plásmido recombinante puede servir como un control negativo en este experimento. Esta diferencia se presenta debido a la diferencia en los sitios donadores/aceptores utilizados en los plasmidos recombinántes (véase el ejemplo 1) . En el caso de pIC3258, se utilizan secuencias de 9 nucleótidos que representan sitios de empalme de consenso de Arahidopsis thaliana. En el caso de pIC3242, los sitios donador y aceptor se diseñan como se describe en Nussaume et al., Mol .gen. genet, 1995, 249:91-101, en donde se sometieron a exámenes y pruebas para que fueran activos en plantas. De acuerdo con las diversas investigaciones (Fedorkin et al., J Gen Virol 2001; 82 (Pt 2): 449-58, Cruz et al., Plant Cell 1998; 10 (4) :495-510) , se requiere CP o PVX para el transporte viral de una célula a otra. En "el caso del plásmido recombinante pIC3242, el gen para CP debe estar empalmado fuera del ARN. Esto significa que la forma empalmada del transcrito (figura 3) no puede expresar CP y proporcionar un movimiento de una célula a otra del virus. Sin embargo, en varios experimentos con pIC3242, se detectaron no solo células únicas sino también loci de células múltiples (10-1000 células) que expresan GFP. Esto indica que el empalme del transcrito de provector no se produce con una eficacia de 100%. Una fracción del AR de longitud completa permanece sin empalmar y por lo tanto CP se puede expresar a partir de esta forma del transcrito, mientras que el gen para GFP permanece con expresión suprimida en este ARN (dado que no se detectó expresión de GFP en el caso de pIC3258) .
EJEMPLO 5 Generación de plantas transgénicas de N. ben thstmíansi que expresan recombinasa Cre
El fragmento terminador Orf-Nos del promotor-LoxP-Cre de actina 2 a partir de pIC1321 se subclona como un fragmento Notl romo-SacI en los sitios Smal y SacI del vector binario pBIN19, lo que resulta en el plásmido recombinante pIC1593 (figura 14) . Se introduce el plásmido pIC1593 en AgroJbacte ium cepa Agil por electroporación y las agrobacterias transformadas se utilizan para transformar ADN de N. bentha i na extraído de diez transformantes y se utiliza para determinar la presencia del transgen, por PCR. Todas las plantas dieron resultado positivo cuando se realiza PCR con cebadores para el marcador de transformación de canamicina o para el gen Cre.
EJEMPLO 6 Generación de vectores funcionales a partir de pro ectores utilizando recombinación específica de sitio
a) Descripción general del sistema
El sistema descrito consiste de dos tipos de núcleo de vectores basados en CrT V los cuales presentan sitios de recombinación LoxP (figura 8) : i) Tipo de vector: Polimerasa-MP-LoxP : El vector codifica el RdRp de CrTMV y la proteína de movimiento (MP) , lo que permite que el virus se mueva de una célula a otra, pero que no se mueva de manera sistémica. La transcripción viral es controlada por un promotor de Arabzdopsis-actina 2. ii) Tipo de vector: El gen LoxP de interés-3 'NTR-terminador nos (véase figura 8 a-c) : Esta clase de vectores codifican para un gen indicador (sGFP o GUS) y elementos reguladores (nos: terminador de nopalina sintasa; 3 'NTR: región no traducida, pseudonudos y estructura similar a ARNt de CrTMV) . La expresión de la proteina de recubrimiento (CP; véase figura 8b) permite que el vector se disperse sistémicamenté en la planta hospedadora. iii) Tipo de vector: polimerasa-MP-attP : véase i), con sitio de recombinación attP iv) Tipo de vector: attB-gen de interés-3 'NTR-terminador nos (véase figura 15 a-c) : véase ii) , con sitio de recombinación attB. Después de recombinación catalizada por la recombinasa Cre o integrasa (vía infección conjunta de un plasmido recombinante viral que codifica para Cre o para integrasa) se forman unidades funcionales (replicones los cuales son capaces de expresar un gen indicador de manera eficaz y son capaces de moverse de una célula a otra (figura 8 A-C, 15 A-C) o sistémicamenté (figura 8B) .
b) Construcción, de plasmido
A. Clonación del vector tipo polimerasa-MP-LoxP (figura
21
Se toma un fragmento de MP EcoRI-Xhol del plasmido pIC3312 (figura 5) y se clona en el pl smido pIC1212 el cual presenta dos sitios LoxP en orientaciones opuestas. El gen MP del plasmido pIC3342 contiene un codón terminador el cual se introduce 25 AA antes de la detención natural. En el producto resultante pIC3431, un fragmento que contiene parte del gen MP se localiza cercano a un sitio LoxP. Ambos elementos se aislan vía restricción EcoRI-SacI. Después de eliminar los extremos pegajosos del sitio de restricción SacI, el fragmento se clona en un vector que contiene parte del plásmido p!C3301, el cual contiene un único sitio de restricción Eco I en el gen para MP. Se elige Notl (romo) como segundo sitio de restricción. En el producto de ligación resultante (pIC3461) el gen para CP, la secuencia IRES, el gen para sGFP y la región 3' no traducida de pIC3301 se sustituyen por LoxP (figura 9) .
B . Clonación de los vectores de LoxP-gen indicador- 3 'NTR-terminador nos
a) Plásmido recombinante LoxP-sGFP-3 'NTR-nos (figura 8a)
El fragmento Xhol-Ncol, el cual presenta un sitio LoxP cercano a una secuencia lider O se toma del vector pIC2744. Con el fin de colocar las secuencias adyacentes a un gen indicador, el fragmento se clona en el plásmido pIC1721, el cual contiene los sitios de restricción apropiados cercanos a un gen para sGFP y una secuencia 3'NTR. La sustitución de una secuencia IRES por el fragmento proporciona el plásmido resultante pIC3421. Con el fin de agregar una secuencia terminadora nos, se corta el plásmido pIC3421 con Kpnl y Notl. El fragmento se introduce en la parte que contiene el vector del plásmido pIC3232 y se puede obtener el plásmido recombinante final pIC3441 (véanse las figuras 10 y 8a) .
b) Plásmido recombinante LoxP-CP-sGFP-3 'NTR-nos (figura 8b) - -
Se utilizan como vectores iniciales los plásmidos descritos antes, pIC3342 y pIC1212. El fragmento PstI-SacI de pIC3342 que contiene los genes para CP y sGFP se clona en pIC1212. Como un resultado, el sitio LoxP se localiza cercano a CP y sGFP en el producto pIC3451. Para agregar una secuencia de terminador nos, se utiliza una solución similar a la del caso a) : Se introduce un fragmento de pIC3451 tratado con EcoRI-Notl dentro de la parte que contiene el vector de pIC3232 lo que resulta en el pl smido pIC3491 (véase la figura 11) .
c) Plásmido recombinante LoxP-CP~GUS-3 'NT -nos (figura
8c)
El plásmido pIC751 es análogo a pIC1721 y presenta un gen indicador GUS en vez de sGFP. Al cortar con Ncol y Notl, el gen GUS y la región 31 no traducida se pueden clonar directamente en pIC3441 y por lo tanto se obtiene el plásmido recombinante final pIC3521 (figura 12) .
EJEMPLO 7 Expresión de un solo gen indicador en hojas de plantas por provector basado en CrTMV convertido (recombinado)
Hojas separadas de N. benthamiana se bombardean con partículas con una mezcla de tres plásmidos: pIC3441 (LoxP-GFP, figura 10) , pIC3461 (promotor de actina 2-CrTMV RdRp-MP-LoxP, figura 9) y plC2721 (recombinasa Cre bajo el control del promotor hbt) . Se detecta fluorescencia de GFP en varios loci multicelulares 38 horas después del bombardeo. Se observa durante los siguientes días un incremento fuerte de la fluorescencia y del tamaño del área infectada (las hojas bombardeadas se incuban a 25°C sobre filtro húmedo) . No se detecta fluorescencia de GFP en las hojas control bombardeadas con pIC3441 junto con pIC2721, sin pIC3461.
EJEMPLO 8 Expresión de varios genes en hojas de plantas mediante provector basado en CrTMV convertido (recombinado)
Se bombardean con partículas hojas separadas de N. benthamiana con una mezcla de varios plásmidos; a) pIC3441 (LoxP-GFP, figura 10) , pIC3461 (promotor de actina 2-CrTMV RdRp-MP-LoxP, figura 9) y pIC2721 (recombinasa Cre bajo el control del promotor hbt) , pIC3521 (LoxP-GUS, figura 12) . b) pIC3441 (LoxP-GFP, figura 10) , pIC3461 (promotor de actina 2-CrTMV RdRp-MP-LoxP, figura 9) y pIC2721 (recombinasa Cre bajo el control del promotor hbt) , pIC3491 (LoxP-CP, figura 11) . Ambos genes indicadores GFP y GUS se expresan fuertemente en hojas bombardeadas en el caso a) . La formación de partículas virales y el movimiento sistémico del virus se lleva a cabo en el caso b) .
EJEMPLO 9 Construcción de un provector basado en CrTMV susceptible de empalme
El provector susceptible de empalme basado en virus CrTMV tiene ciertas ventajas en comparación con el basado únicamente en PVX. En la figura 4 se describen sistemas que permiten crear un gen indicador que exprese el sistema con el virus, el cual es completamente funcional en la hoja infectada. Contrario a PVX, la proteína de recubrimiento de CrTMV no es necesaria para el movimiento viral entre células de manera que el empalme no influye sobre la dispersión viral en la hoja infectada.
A. Clonación del plásmido recombinante intermediario pIC3312
Se obtiene un fragmento de PCR utilizando ADNc clonado de CrTMV y los siguientes cebadores : MPERI+ (que corresponde a la región media de MP que incluye el sitio EcoRI - posición 5455 en el genoma de CrTMV) : GTGGTTGACGAATTCGTC MP- (Complementario a la parte C terminal de MP 17 aminoácidos hacia el extremo 5 ' del codón de terminación natural que introduce un terminador artificial con los sitios Clal y Xhol hacia el extremo 3!. Además, este cebador contiene una mutación, puntual de CP, ATG en ACG, la cual elimina el inicio natural del gen para CP sin cambio de aminoácido en MP) : GGTCTCGAGTTATCGATTATTCGGGTTTGTAATGTTGTAAGACGTTTTCTTCTTTC Se obtiene otro fragmento de PCR utilizando la misma plantilla y los siguientes cebadores : CP+ (que corresponde al inicio del gen para CP con sitios Xhol y PstI introducidos hacia el extremo 5 ' de ATG) :
TAACTCGAGACCTGCAGCATGTCTTACAACATTACAAACC-CGAATCAG CP- (Complementario a la parte C terminal de CP que introduce la sustitución del nucleótido para eliminar el sitio Ncol en el gen para CP. Además, este cebador introduce los sitios de restricción HindIII y Ncol hacia el extremo 31 del gen para CP) : CTACTCCATGGTCAAGCTTAAGTAGC-AGCAGCAGTAGTCCACGGCACC En primer lugar, el fragmento de PCR se digiere con las enzimas EcoRI y Xhol. En segundo lugar, los fragmentos digeridos con Xhol y Ncol se unen por ligación en el vector pIC1721 (figura 5) por los sitios EcoRI y Ncol lo que proporciona el plásmido pIC3151 (figura 5) . Después se digiere pIC3151 con pnl y EcoRV. El sitio Kpnl se vuelve romo con ADN polimerasa T4 y el plásmido cortado se autoliga para eliminar los sitios entre Kpnl y EcoRV. El plásmido resultante se denomina pIC3312 (véase la figura 5) .
B. Clonación del pro ector susceptible de empalme pIC3393 y construcción de control pIC3401
Los fragmentos de ADN de cadena doble descritos en el ejemplo 1 que contienen sitios de empalme donadores y aceptores se clonan en pIC3312 utilizando los sitios Clal y Xhol en el caso del donador y HindIII y Ncol en el caso de los sitios de empalme aceptores (véase la figura 6) . Los plásmidos que se obtienen se denominan pIC3378 (sitio donador) y pIC3382 (sitio aceptor) . Para obtener un plásmido recombinante de control negativo, se clona el fragmento pIC3401 Eco I-Notl de pIC3382 en pIC3301 (figura 7) . El plásmido final pIC3393 se obtiene en la clonación de dos fragmentos utilizando el fragmento EcoRI-PstI a partir de pIC3378 con el fragmento PstI-Notl a partir de pIC3382 y pIC3301 digerido con EcoRI y Notl como un vector (figura 7) .
EJEMPLO 10 Expresión del gen indicador en hojas de plantas por el provector susceptible de empalme basado en CrTMV convertido
Las hojas separadas de N. benthamiana se bombardean con partículas con plásmidos pIC3393 y pIC3401. La fluorescencia de GFP se detecta en varios loci multicelulares 48 horas después del bombardeo en el caso de pIC3393. No aparece fluorescencia GFP en hojas bombardeadas con el plásmido recombinante de control pIC3401.
EJEMPLO 11 Expresión de un gen de interés a partir de un vector viral ensamblado desde dos pro ectores basados en CrTMV mediante el sitio específico att/sistema de recombinación basada en integraea
a) Descripción general del sistema
El sistema descrito consiste de dos tipos de núcleo de vectores basados en CrTMV los cuales presentan los sitios de recombinación attB o attP (figura 15) :
i) Tipo de vector: Polimerasa-MP-attP : El vector codifica para el RdRp de CrTMV y la proteína de movimiento
(MP) , lo cual permite que el virus presente movimiento de una célula a otra, pero no sistémico. La transcripción viral es controlada por un promotor de Arajidopsis-actina 2. ii) Tipo de vector: attB-gen de interés-3 'NTR-terminador nos (véase la figura 15 a-b) : Esta clase de vectores codifican para un gen indicador (sGFP o GUS) y elementos reguladores (terminador nos:nopalina sintasa; 3 'NTR región no traducida, pseudonudos y estructura similar a ARNt de CrTMV) . iii) Tipo de vector: attB-gen de ubiquitina de interés-3 'NTR- erminador nos (véase la figura 15c) : Con el fin de obtener una proteína definida la cual se puede aislar de plantas se introduce una secuencia de señal de separación de ubiquitina entre el sitio de recombinación attB y el gen de interés que se localiza hacia el extremo 3' (por ejemplo GFP, interferona 2B, insulina o somatotropina) . Mediante la utilización de este sistema, se puede elegir cualquier aminoácido, excepto prolina, como el primer aminoácido de la proteína sintetizada. Después de la recombinación catalizada por la enzima integrasa (vía coinfección de un plásmido recombinante viral que codifica para integrasa) , se forman unidades funcionales (replicones) los cuales son capaces de expresar el gen de interés eficazmente y son capaces de movimiento de una célula a otra (figura 8 A-C) .
b) Construcción de plásmido A) Clonación del tipo de vector: polimerasa-MP-attP
(figura 16)
Se toma un fragmento de fragmento Kpnl-Xhol del plásmido pIC3461 (figura 16) . Después de quitar las partes pegajosas del sitio de restricción Xhol, el fragmento se clona en el vector binario pIC3994 el cual presenta dos sitios attB en orientaciones directas, limites de ADN-T izquierdo y derecho (LB y B) y un cásete de expresión de canamicina como un marcador de transformación vegetal. De una manera similar, el clon análogo del sistema Cre/Lox, el plásmido resultante pICH4851 presenta un gen MP con un codón terminador que se introduce 25 AA antes de la detención natural.
B . Clonación del tipo de vector: attB-gen de interés- 3 'NTR-terminador nos (figuras 17-20)
a) Plásmido recombinante attB-sGFP-31 NTR-nos Combinación de cebador A) attB X o(+) : ATCACTCGAGCTCGAAGCCGCGGTGCGGGT : Complementario a la parte 5 ' de attB y que presenta un sitio de restricción Xhol en la parte 5 ' terminal attB O(-) : GGTAATTGTTGTAAAAATACGATGGGTGAAGGTGGAGTACG : La parte 3' del cebador corresponde a la región 3' de la secuencia attB, la parte 5' contiene 20 nucleótidos que presentan complementariedad con la parte 5' del elemento O. La combinación de cebador A se utiliza en una plantilla que contiene attB para crear un producto de PCR que consiste de la secuencia completa de attB, 20 nucleótidos de la secuencia líder O y un sitio de restricción Xhol en el extremo 5 ' . Combinación de cebador B) attBQ(+) : CGTACTCCACCTCACCCATCGTATTTTTACAACAATTACC: La parte 3 ' del cebador corresponde a la región 51 de la secuencia O, la parte 5' contiene 20 nucleótidos que presentan complementariedad con la parte 5 ' del elemento attB O NCOI(-) : CATGCCATGGGTAATTGTAAATAGTAATTGTAATGTT Complementariedad con la parte 3 ' de O y que presenta un sitio de restricción Ncol en la parte 51 terminal . La combinación B de cebador se utiliza en una plantilla que contiene la secuencia O para crear un producto de PCR que contiene la secuencia completa del líder O, 20 nucleótidos de recombinación attB y un sitio de restricción Ncol en el extremo 3 ' . Después de obtener productos de PCR de la combinación de cebador A) y B) , los oligonucleótidos aislados se utilizan junto con las plantillas para una reacción de PCR mediante la utilización de los cebadores attB Xhol +) y O Ncol(-) . Como un producto PCR final, se puede sintetizar una función de la recombinación de attB y la secuencia líder O. Este fragmento contiene sitio de restricción Xhol y Ncol en sus partes terminales. Se aisla el producto de PCR, se digiere y se clona en los sitios Xhol y Ncol del plásmido pICH3441 con el fin de sustituir la fusión LoxP-O. El plásmido intermediario se trata con Kpnl y HindIII. Al insertar este fragmento en los sitios correspondientes del vector binario BV10, se puede obtener un vector attB-sGFP-3 'NTR-nos el cual es transformable en Agrobacterium (pICH5151, véase figura 17) . Se utiliza una solución similar para clonar un provector análogo con el gen indicador GUS . El fragmento de PCR descrito antes se clona en los sitios Xhol y Ncol del plásmido pICH3521 que contiene GUS lo que resulta en el plásmido pICH4061. Finalmente, se liga en el vector binario BV10 un fragmento Kpnl-Hindlll del plásmido, plásmido plCH4061, lo que resulta en el vector final pICH5161 el cual es capaz de transformación estable en Agrobacterium (pICH5161, véase la figura 18) .
C) Construcción del provector 31 que contiene attB-ubiquitina-interferón
Con el fin de clonar una fusión de una secuencia de ubiquitina e interferón 0C.2B en un provector attB-3 ' , se sintetizan ambas secuencias como una fusión y se clonan en pUC19 (obteniéndose el plásmido pUC5760) . El vector se digiere con Ncol y PstI y el fragmento resultante se liga en los sitios de restricción correspondientes del plásmido pICH5781. El plásmido resultante pICH5951 contiene un sitio de recombinación attB, la fusión de ubiquitina-interferón y la región 31 no traducida, un promotor nos y un cásete de expresión de canamicina. La totalidad de las secuencias están franqueadas por límites de ADN T (LB y RB, véase la figura 19) .
D) Para sustituir la . secuencia O por diferentes elementos IRES, los cuales pueden servir como mejoradores traduccionales , se toma un fragmento Clal/Apal del plásmido pIC1701 (que contiene IRESmp75 (Ul) ) o pICH1731 (que contiene IRESmp75 (cr) ) , respectivamente. Los fragmentos se clonan en el plásmido pICH5939 (similar al plásmido pICH5781, pero sin el sitio de restricción Ncol con secuencia ATG en el codón de inicio de transcripción) . En los vectores binarios finales (pICH6871, pIC6891) , el sitio de recombinación attB se localiza adyacente a una secuencia IRES de 75 pares de bases (6871; origen Ul, 6891; origen CrTMV) , un gen indicador sGFP y los elementos reguladores 3'NTR y nos.
E) Clonación del vector de tipo polimerasa-MP-LoxP en vectores binarios
Para clonar el provector LoxP que presenta polimerasa-MP en un vector binario, se liga junto un fragmento Kpnl/Xhol y Xhol/HindIII en el vector pICBVlO el cual se digiere con HindIII y Kpnl . El plásmido resultante pICH4371 puede ser transformado de manera estable en Agrobacterium (figura 21) .
F) Clonación del vector tipo LoxP-gen de interés-3 'NTR-terminador nos en un vector binario
Se utiliza una estrategia de clonación análoga similar a E) para clonar el provector del gen indicador LoxP en un vector binario. El plásmido pICH3441 se digiere con la enzima pnl y HindIII. El fragmento resultante se inserta en los lados correspondientes de pICBVIO lo que resulta en el plásmido binario pICH4461 (véase la figura 22) .
EJEMPLO 12 Suministro de plásmidos recombinantes vectores virales por infiltración de una suspensión de Agrobacterium tumefaciens en hojas de plantas de N. benthamiana y N. tabacum
Todos los provectores del sistema Cre/Lox y la integrasa/att se han clonado en vectores binarios los cuales se pueden transformar establemente en Agrobacteria. Por lo tanto están disponibles métodos de suministro de ADN alternativos en las técnicas descritas. Un método de administración muy sencillo es la infiltración de suspensiones de Agrobacteria en hojas intactas.
Esto, que se denomina agroinfiltración, fue desarrollado inicialmente para analizar la expresión de genes extraños y la supresión de la expresión de genes en plantas ( aplia et al., 1997, .Plant Science, 122, 101-108; Schób et al., 1997, Mol. Gen. Genet . , 256 , 581-588) . La agroinfiltración de plantas transgénicas de tabaco se realiza de acuerdo con un protocolo modificado descrito por Yang et al., 2000, The Plant Journal, 2_2 (6) , 543-551. Se transforma Agrobacterium tumefacíens cepa GV3101 con plásmidos recombinantes individuales (pICH4851, pICH5151, pICPlOlO, figura 23) que se hacen crecer en medio LB suplementado con rifampicina 50 mg/1, carbencilina 50 mg/1 y acetosiringona 100 µ?? a 28°C. Las células de Agrobacterium de un cultivo de 5 mi durante la noche se recolectan por centrifugación (10 min, 4500 g) y se resuspenden en amortiguador MES 10 mM, pH 5.5 suplementado con MgS04 10 mM y acetosiringona 100 µ?. Se ajusta la suspensión bacteriana a una D060o final de 0.8. En caso de suministro de varios plásmidos recombinantes se mezclan suspensiones y diferentes plásmidos recombinantes de Agrobacteria en volúmenes iguales antes de la infiltración. La agroinfiltración se lleva a cabo en hojas expandidas casi completamente que aún están unidas a la planta intacta. Se infiltra una suspensión bacteriana utilizando una jeringa de 5 mi. Al infiltrar 100 µ? de suspensión bacteriana en cada punto (típicamente 3-4 cm2 en el área infiltrada) , de 8 a 16 puntos separados por venas se pueden distribuir en una hoja de tabaco única. Después de infiltración, las plantas se hacen crecer adicionalmente bajo condiciones de invernadero a 22°C y 16 h de luz. Las hojas de N. ben.thamia.na y N. tabacum que se han infiltrado con los plásmidos recombinantes muestran sectores de expansión de expresión fuerte de GFP 8-12 días después de la infiltración. La expresión puede ser detectada bajo luz UV directamente en las hojas infiltradas. No se puede observar expresión de GFP en caso de controles (combinación de provector sin el clon de integrasa) .
EJEMPLO 13 Suministro de provectores virales por infiltración de una suspensión de Agrobacterium tumefaciens en hojas de planta de plantas transgénicas de tabaco que expresan la recombinasa Cre (pICH1754)
Las hojas de plantas transgénicas de tabaco (plásmido recombinante transformado; pICH1754, especie Nicotiana tabacum) infiltrada con el plásmido recombinante pICH4371 y pICH4461 mostró 16 días después de la infiltración sectores de crecimiento de expresión fuerte de GFP que se pueden observar sin microscopio bajo luz UV en plantas intactas. No es visible expresión de GFP sobre hojas de tipo silvestre infiltradas con la misma mezcla de suspensión de Agrobacteria. EJEMLO 14 Uso de' secuencias de IRES de origen viral (IRESmp75 a partir de CrTMV o Ul) como secuencias mej oradoras traduccionales
La presencia de un sitio de recombinación att o LoxP entre el promotor y el gen localizado hacia el extremo 3 ' limita la eficacia de la traducción. Por lo tanto, la mayor parte de los casos, es necesario utilizar elementos de mej oración traduccional para alcanzar una concentración apropiada de expresión de gen indicador en el sistema provector. La clonación de las secuencias IRES viral IRESmp75(Ul) o IRESmp75 (cr) respectivamente entre el sitio de recombinación attB y GFP incrementa claramente la expresión del gen indicador. Mientras que en plantas las cuales se han infiltrado con provectores que contienen GFP que no presentan un me orador traduccional muestran expresión de GFP casi no detectable después de 10 días, el uso de las secuencias de IRES lleva la expresión de GFP, la cual se puede detectar bajo luz UV sin utilizar un microscopio, después de 5 días. El nivel de expresión del gen de interés proporciona una actividad mej oradora traduccional basada en IRESmp75 que es comparable o incluso superior a la proporcionada por mej oradores traduccionales "omega".
Claims (1)
- REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento para generar amplificación o expresión, o ambos de una o más secuencias de ácido nucleico de 5 interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado porque la célula vegetal se proporciona con por lo menos un vector precursor diseñado para experimentar procesamiento en la célula, por lo que, debido al procesamiento, la célula vegetal es dotada con por lo menos un 10 replicón que proporciona la amplificación o la expresión. 2. ¦ Un procedimiento para provocar amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado porque la célula vegetal se proporciona 15 con por lo menos dos vectores precursores diseñados para experimentar procesamiento por recombinación específica de sitio en la célula, por lo que debido al procesamiento, se dota a la célula vegetal con por lo menos un replicón el cual proporciona la amplificación o expresión. '20 3. Un procedimiento para generar amplificación o expresión, de una o más secuencias de ácido nucleido de interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado porque la célula vegetal se proporciona con por lo menos un vector precursor diseñado para experimentar 25 procesamiento en la célula, por lo que, debido al procesamiento, se dota a la célula vegetal con por lo menos dos replicones los cuales: (a) están relacionados estructuralmente entre si debido al procesamiento; (b) son funcionalmente distintos entre si; y (c) proporcionan la amplificación o expresión, o ambas. 4. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 , en donde el hecho de proporcionar a la célula vegetal con un vector precursor se realiza por transfección viral, suministro mediado por Agrobacterium, suministro no biológico o por conversión de un ADN vector preprecursor que se ha integrado previamente en un ADN nuclear de la planta para formar un vector precursor o vectores precursores . 5. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el vector precursor es de origen de virus vegetal . 6. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el vector precursor es de origen de virus de ADN. 7. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el vector precursor es de origen de virus de ARN. 8. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el vector precursor es esencialmente de origen de retrotransposon. 9. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el procesamiento del vector precursor es por modificación de ADN. 10. El procedimiento como se describe en la reivindicación 9, en donde el procesamiento del vector precursor es por recombinación, inserción, corte o ligación de ADN. 11. El procedimiento como se describe en la reivindicación 10, en donde el - procedimiento comprende la producción de un conjunto de por lo menos dos replicones del tipo ???, AB2, ... , ABn o del tipo BXA, B2A, ... , BnA por recombinación específica de sitio de un vector (A) precursor primario con un conjunto de por lo menos dos vectores precursores secundarios (??, B2; ... , Bn) , en donde n es un número entero de >2. 13. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en donde el procesamiento del vector precursor es por modificación de ARN. 13. El procedimiento como se describe en la reivindicación 12, en donde el procesamiento del vector precursor es el empalme, ligación o recombinación de ARN. 14. El procedimiento como se describe en la reivindicación 13, en donde el procesamiento comprende empalme de un vector precursor en una mezcla de dos replicones que consisten del vector precursor y el producto del mismo. 15. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones l a 14, en donde se proporcionan condiciones que facilitan el procesamiento del vector precursor para proporcionar los replicones. 16. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la célula vegetal es de tipo silvestre . 17. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la célula vegetal es sometida a ingeniería genética de manera que proporciona las funciones necesarias para el procesamiento en la célula vegetal . 18. El procedimiento como se describe en la reivindicación 17, en donde la célula vegetal se somete a ingeniería genética de manera que proporciona, en trans, una o más funciones necesarias para la replicación del replicón, ensamblado de la partícula de virus, infectividad, supresión o eliminación de la expresión por el hospedador, transcripción inversa, integración al cromosoma del hospedador, movimiento entre células o a larga distancia de los replicones o para recombinación o empalme . 19. El procedimiento como se describe en las reivindicaciones 17 ó 18, en donde la ingeniería genética de la planta se realiza por expresión transitoria, transfección mediada por virus o por Agrobacteriu , integración estable en los genomas de núcleos u organelos o dentro de plásmidos de replicacion autónoma de la célula vegetal. 20. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el procesamiento comprende recombinación de por lo menos dos moléculas vectoras precursoras . 21. El procedimiento como se describe en la reivindicación 20, en donde la recombinación de por lo menos dos moléculas vectoras precursoras resulta en el ensamblado in vivo de un gen expresable dentro de un replicón, por lo que se combinan módulos de genes funcionales diferentes, tales como promotor, mej orador de transcripción, mej orador de traducción, terminador, partes codificantes de protelna de interés, péptidos de señal o de tránsito o de transporte de membrana, purificación o visualización de una etiqueta polipeptídica u otras proteínas de fusión, los diferentes módulos de genes funcionales originalmente se localizan sobre dos o más moléculas precursoras . 22. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que resulta en amplificación o expresión de dos o más secuencias de ácido nucleico de interés . 23. El procedimiento como se describe en la reivindicación 22, en donde el procedimiento resulta en amplificación o expresión de genes múltiples de una vía bioquímica o cascada. 24. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde uno o más de los replicones retienen capacidades virales adicionales tales como ensamblado de partícula viral, infectividad, supresión de eliminación de la expresión de genes, transcripción inversa, integración dentro del cromosoma hospedador, movimiento entre células o movimiento a larga distancia. 25. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde uno de los replicones es esencialmente un virus de tipo silvestre que proporciona en condiciones trans necesarias para replicación de otro replicón o replicones. 26. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 , en donde uno de los replicones es esencialmente un virus de tipo auxiliar que proporciona, en trans, funciones necesarias para replicación de otro replicón o replicones . 27. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde uno de los replicones es esencialmente un retrovirus de tipo silvestre o retrotransposón el cual proporciona, en trans, funciones necesarias para replicación, transcripción inversa, integración en el cromosoma del hospedador de otro replicón o replicones. 28. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 27, en donde por lo menos dos de los replicones cooperan funcionalmente entre si . 29. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 28, en donde por lo menos uno de los replicones proporciona además para una expresión de productos necesarios para replicacion de los replicones. 30. El procedimiento como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en donde por lo menos uno de los replicones proporciona además para expresión de productos necesarios para movimiento de una célula a otra, larga distancia o de planta a planta, supresión o eliminación de expresión de genes, transcripción inversa, integración al cromosoma del hospedador. 31. El procedimiento como se describe en la reivindicación 29 ó 30, en donde los productos funcionan en trans . 32. El procedimiento como se describe en la reivindicación 29 ó 30, en donde los productos funcionan en cis . 33. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 32, en donde uno de los replicones contiene un IRESmp75 como un mejorador traduccional unido operablemente a una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica para una proteína de interés. 34. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 33, en donde a una célula vegetal se le proporciona con por lo menos dos vectores percusores diseñados para experimentar procesamiento en la célula. 35. El procedimiento para la producción de un producto bioquímico, que comprende la amplificación o expresión, o ambos, de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34. 36. El procedimiento como se describe en la reivindicación 35, en donde el producto bioquímico es una proteina, específicamente una proteína farmacéutica o un anticuerpo funcional. 37. Un procedimiento para la determinación de función de gen, que comprende amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34. 38. Un procedimiento para evolución artificial o dirigida, que comprende amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones l a 34. 39. Un procedimiento de transformación genética, que comprende la amplificación de una o más secuencias de ácido nucleico . de interés, como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 34, seguido por integración de las secuencias en el genoma de célula vegetal utilizando un procedimiento de integración basado en retrovirus o en retrotransposón . 40. Los vectores o vectores precursores para llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 34. 41. Material viral para realizar el procedimiento de las reivindicaciones 1 a 3 . 42. Material viral o replicones obtenidos o que se pueden obtener al llevar a cabo el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34. 43. Material vegetal obtenido o que se puede obtener al llevar a cabo el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34. 44. Equipo de partes que comprende: (i) células vegetales, semillas o plantas, y (ii) vectores o vectores precursores, como se describe en la reivindicación 40 o material viral como se describe en la reivindicación 41. 45. Equipo de partes como se describe en la reivindicación 44 , en donde los vectores o vectores precursores están contenidos en una cepa de Agr oj acter um.
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