MXPA02010351A - Antagonistas de integrina/adhesion. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a la fusion de vehiculos que extienden la vida media, preferentemente dominios FC, con secuencias peptidicas que actuan como antagonistas de las integrinas, las selectinas, las moleculas de adhesion celular o sus respectivos receptores. El enlace al vehiculo incrementa la vida media del peptido. Que de otro modo podria ser rapidamente degradado in vivo. El peptido puede ser un peptido existente o un peptido seleccionado por despliegue de fagos, despliegue de E. coli, despliegue de ribosomas, seleccion de ARN/peptidos, seleccion quimicopeptidica, u otros metodos.

Description

ANTAGONISTAS DE INTEGRINA/ADHESIÓN ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Existe una necesidad para agentes terapéuticos recombinantes o modificados que tengan actividad anti-integrina. Las proteínas recombinantes son una clase naciente de agentes terapéuticos. Tales agentes terapéuticos recombinantes han engendrado avances en la formulación de proteínas y en la modificación química. Tales modificaciones pueden proteger a las proteínas terapéuticas, principalmente mediante bloqueo de su exposición a enzimas proteolíticas. Las modificaciones a las proteínas pueden también incrementar la estabilidad de la proteína terapéutica, el tiempo de circulación, y la actividad biológica. Un artículo de revisión que describe la modificación de las proteínas, y las proteínas de fusión es Francis (1992), Focus on Growth Factors 3: 4-10 (Mediscript, Londres), que es incorporada por referencia en la presente. Una modificación útil es la combinación con el dominio "Fc" de un anticuerpo. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab", el cual se enlaza al antígeno, y un dominio constante conocido como "Fc", el cual se une a REF: 143010 tales funciones efectoras como la activación del complemento y el ataque por células fagocíticas. Un Fc tiene una vida media en suero prolongada, mientras que un Fab es de vida corta. Capón et al. (1989), Nature 337: 525-31. Cuando se construye conjuntamente con una proteína terapéutica, un dominio Fc puede proporcionar vida media más prolongada o incorporar funciones tales como enlace al receptor de Fc, enlace a la proteína A, fijación del complemento y quizás incluso transferencia placentaria. ^Ed. La Tabla 1 resume el uso de las fusiones de Fc conocidas en la técnica.

Tabla 1 - Fusión Fc con proteínas terapéuticas Forma de Fc Socio de fusión Implicaciones Referencia terapéuticas igGi Extremo N de Enfermedad de Patente de los CD30-L Hodgkin; linfoma Estados Unidos No. anaplástico; 5,480,981 leucemia de célula T Fc?2a murino IL-10 Anti-inflamatorio; Zheng et al. (1995), rechazo de J. Immunol. 154: transplante 5590-600 lgG1 Receptor de TNF Choque séptico Fisher et al. (1996), N. Engl. J. Med.. 334: 1697-1702; Van Zee, K. et al. (1996), J. Immunol. 156: 2221-30 IgG, IgA, IgM o IgE Receptor de TNF inflamación, Patente de los (excluyendo el desórdenes Estados Unidos No. primer dominio) autoinmunes 5,808,029, expedida el 15 de septiembre de 1998 igd Receptor de CD4 SIDA Capón et al. (1989), Nature 337: 525-31 lgG1 , lgG3 Extremo N de I L-2 Anti-cáncer, antiviral Harvill et al. (1995), Immunotech. 1 : 95- 105 lgG1 Extremo C de OPG osteoartritis; WO 97/23614, densidad ósea publicado el 3 de julio de 1997 igGl Extremo N de la anti-obesidad PCT/US 97/23183, leptina presentada el 11 de diciembre de 1997 Ig Humano C?1 CTLA-4 desórdenes Linsley (1991), L autoinmunes Exp. Med. 174: 561- 9 Un enfoque mucho más diferente para el desarrollo de agentes terapéuticos es la selección de biblioteca de péptidos. La interacción de un ligando proteico con su receptor frecuentemente tiene lugar en una interfaz relativamente grande. No obstante, como es demostrado para la hormona humana del crecimiento y su receptor, únicamente unos pocos residuos clave en la interfaz contribuyen a la mayor parte de la energía de enlace. Claxon et al. (1995), Science 267: 383-6. El gran volumen del ligando proteico muestra meramente los epítopes de enlace en la topología correcta o sirve funciones no relacionadas al enlace. De este modo, las moléculas únicamente de la longitud del "péptido" (2 a 40 aminoácidos) pueden enlazarse a la proteína receptora de un ligando proteico grande, dado. Tales péptidos pueden imitar la bioactividad del ligando de proteína grande ("agonistas peptídicos") o, a través del enlace competitivo, inhiben la bioactividad del ligando proteico grande ("antagonistas peptídicos"). Las bibliotecas de péptidos de representación visual de fago han emergido como un método poderoso en la identificación de tales antagonistas y antagonistas peptídicos. Ver, por ejemplo, Scott et al. (1990), Science 249: 386; Devlin et al. (1990), Science 249: 404; Patente de los Estados Unidos No. 5,223,409, expedida el 29 de junio de 1993; Patente de los Estados Unidos No. 5,733,731, expedida el 31 de marzo de 1998; Patente de los Estados Unidos No. 5,498,530, expedida el 12 de marzo de 1996; Patente de los Estados Unidos No. 5,432,018, expedida el 11 de julio de 1995; Patente de los Estados Unidos No. 5,338,665, expedida el 16 de agosto de 1994; Patente de los Estados Unidos No. 5,922,545, expedida el 13 de julio de 1999; O96/40987, publicada 19 de diciembre de 1996; y 098/15833, publicada el 16 de abril de 1998 (cada una de las cuales se incorpora por referencia en la presente) . En tales bibliotecas, las secuencias peptídicas aleatorias son desplegadas por fusión con proteínas de recubrimiento del fago filamentoso. Típicamente, los péptidos desplegados son eluidos por afinidad contra un dominio extracelular inmovilizado con anticuerpo, de un receptor. Los fagos retenidos pueden ser enriquecidos por rondas sucesivas de purificación de afinidad y repropagación. Los mejores péptidos de enlace pueden ser secuenciados para identificar los residuos clave dentro de una o más familiar estructuralmente relacionadas. Ver, por ejemplo, Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, en el cual fueron identificadas dos familias distintas. Las secuencias peptídicas pueden también sugerir cuáles residuos pueden ser reemplazados de manera segura por exploración de alanina o mediante mutagénesis en el nivel del ADN. Las bibliotecas de mutagénesis pueden ser creadas y seleccionadas para optimizar adicionalmente la secuencia de los mejores enlazadores. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol . Struct . 26: 401-24. Otros métodos compiten con el despliegue o representación visual del fago en investigación de péptidos. Una biblioteca peptídica puede ser fusionada al extremo carboxilo del represor lac y expresada en E. coli . Otro método basado en E. coli permite el despliegue sobre la membrana exterior de la célula mediante fusión con una lipoproteína asociada al peptidoglicano (PAL) . Posteriormente en la presente, éstos y otros métodos relacionados son colectivamente denominados como "despliegue o representación visual de E. coli " . Otro procedimiento biológico para seleccionar mezclas de péptidos solubles, utilizan levadura para la expresión y la secreción. Ver, Smith et al. (1993), Mol . Pharmacol . 43: 741-8. Posteriormente en la presente, el método de Smith et al . y los métodos relacionados son denominados como "selección basada en levadura". En otro método más, la traducción del ARN aleatorio es interrumpida antes de la liberación del ribosoma, dando como resultado una biblioteca de polipéptidos con su ARN asociado todavía enlazado. De aquí en adelante, éstos y otros métodos relacionados son colectivamente denominados como "despliegue de ribosoma" . Otros métodos emplean el enlace químico de los péptidos al AR?; ver, por ejemplo, Roberts & Szostak (1997), Proc. Nati.

Acad. Sci. EUA, 94: 12297-303. De aquí en adelante, éstos y otros métodos relacionados son colectivamente denominados como "selección de ARN-péptido" . Las bibliotecas peptídicas químicamente derivadas han sido desarrolladas, en las cuales los péptidos son inmovilizados sobre materiales no biológicos, estables, tales como varillas de polietileno o resinas permeables al solvente. Otra biblioteca de péptidos químicamente derivada utiliza la fotolitografía para explorar los polipéptidos inmovilizados sobre portaobjetos de vidrio. De aquí en adelante, éstos y otros métodos relacionados son colectivamente denominados como "selección químico-peptídica" . La selección químico-peptídica puede ser ventajosa ya que ésta permite el uso de D-aminoácidos y otros análogos no naturales, así como elementos no peptídicos. Los métodos biológicos y químicos son revisados en Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62. En el caso de los péptidos bioactivos conocidos, el diseño racional de los ligandos peptídicos con propiedades terapéuticas favorables puede ser completado. En tal procedimiento, se realizan cambios graduales a una secuencia peptídica y se determina el efecto de la sustitución sobre la bioactividad de una propiedad biofísica predíctiva del péptido (por ejemplo, estructura de la solución) . De aquí en adelante, estas técnicas son colectivamente denominadas como "diseño racional". En tal técnica, se elabora una serie de péptidos en los cuales se reemplaza un residuo simple a un solo tiempo, con alanina. Esta técnica es comúnmente denominada como una "caminata de alanina" o una "exploración de alanina". Cuando dos residuos (contiguos o espaciados) son reemplazados, éste es denominado como una "caminata de alanina doble". Las sustituciones de aminoácidos resultantes pueden ser utilizadas solas o en combinación para dar como resultado una nueva entidad peptídica con propiedades terapéuticas favorables. El análisis estructural de la interacción proteína-proteína puede también ser utilizado para sugerir los péptidos que imitan la actividad de enlace de los ligandos proteicos grandes. En tal análisis, la estructura cristalina puede sugerir la identidad y la orientación relativa de los residuos críticos del ligando proteico grande, a partir del cual puede ser diseñado un péptido. Ver, por ejemplo, Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70. De aquí en adelante, éstos y otros métodos relacionados son denominados como "análisis estructural de proteínas". Estos métodos analíticos pueden también ser utilizados para investigar la interacción entre una proteína receptora y los péptidos seleccionados por despliegue de fago, que puede sugerir la modificación adicional de los péptidos para incrementar la afinidad de enlace.

Conceptualmente, se pueden descubrir miméticos peptídicos de cualquier proteína utilizando el despliegue del fago y los otros métodos mencionados anteriormente. Estos métodos han sido utilizados para el trazado del mapa del epítope, para la identificación de los aminoácidos críticos en interacciones proteína-proteína, y como guías para el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos. Por ejemplo, Córtese et al. (1996), Curr. Opin. Biotech. 7: 616-21. Las bibliotecas de péptidos han sido utilizadas más frecuentemente en estudios inmunológicos, tales como el trazado del mapa del epítope. Kreeger (1996), The Scientist 10 (3) : 19-20. De interés particular aquí es el uso de las bibliotecas peptídicas y otras técnicas en el descubrimiento de péptidos que inhiben las integrinas, selectinas, moléculas de adhesión celular, o sus receptores respectivos. Un número de tales péptidos identificados en la técnica son resumidos en la Tabla 2. Para los péptidos aleatoriamente generada, las bibliotecas de péptidos fueron seleccionadas típicamente para el enlace a un receptor para un ligando de integrina (por ejemplo, a4ßl) . Para fines de esta solicitud, estas moléculas son colectivamente denominadas "Antagonistas de integrina/adhesión" . En la Tabla 2, la proteína listada en la columna lateral izquierda en esta tabla puede ser enlazada por el péptido asociado o mimetizada por el péptido asociado. La estructura y la actividad de los péptidos se describen en las publicaciones listadas, cada una de las cuales es incorporada por referencia en la presente en su totalidad. La columna intermedia describe la actividad farmacológica de los péptidos, y en algunos casos es seguida por un término corto a la mano en paréntesis.

Tabla 2 - Péptidos de antagonistas de integrina/adhesión Socio de enlace/ Actividad Referencia proteína de interés farmacológica Laminina Antagonista de integrina, Saiki, I. et al. (1989), Br. J. Cáncer 60: útil en el tratamiento del 722-8; Mu et al. (1999), BBRC 255. 75- crecimiento de tumores, 79; Nomizu et al. (1993), Cáncer metástasis tumoral Research 53: 3459-61.

Vinculina Procesos de adhesión Adey et al. (1997), Biochem. J. 324: celular -desarrollo celular, 523-8 diferenciación, sanado de heridas, metástasis tumorales ("enlace a la vinculina") Selectinas Adhesión de neutrófilos; Martens et al. (1995), J. Biol. Chem. enfermedades 270: 211290-36; solicitud de patente inflamatorias Europea EP-0,714,912, publicada el 5 ("antagonista de de junio de 1996 selectina") Integrinas Alojamiento tumoral; Solicitudes internacionales WO tratamiento para las 95/14714, publicada el 1 de junio de condiciones relacionadas 1995; WO 97/08203, publicada el 6 de a los eventos celulares marzo, 1997; WO 98/10795, publicada mediados por la integrina, el 19 de marzo, 1998; WO 99/24462, incluyendo agregación de publicada el 20 de mayo de 1999; Kraft plaquetas, trombosis, et al. (1999), J. Biol. Chem. 274: 1979- sanado de heridas, 1985 osteoporosis, reparación de tejidos, angiogénesis (por ejemplo, para el tratamiento del cáncer), e invasión tumoral ("enlace a la integrina") Equistatina Inhibición de la Gan (1988), J. Biol. Chem.. 263: 19827- agregación plaquetaria 32.

Los péptidos identificados por la selección de biblioteca de péptidos han sido considerados como "guía" en el desarrollo de agentes terapéuticos en vez de como agentes terapéuticos mismos. Como otras proteínas y péptidos, éstos podrían ser rápidamente removidos in vivo ya sea mediante filtración renal, mecanismos de despejo celular en el sistema reticuloendotelial, o degradación proteolítica. Francis (1992), Focus on Growth Factors 3: 4-11. Como resultado, la técnica utiliza actualmente los péptidos identificados para validar los objetivos farmacéuticos o como andamios para el diseño de compuestos orgánicos que pueden no haber sido tan fácilmente o tan rápidamente identificados a través de selección química de biblioteca. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los agentes terapéuticos que tienen actividad antagonista de integrina, que incl.uye la actividad de los péptidos conocidos pero con mejores características farmacéuticas (por ejemplo, vida media) . De acuerdo con la presente invención, tales compuestos comprenden: a. un péptido antagonista de la integrina/adhesión; y b. un vehículo, tal como un polímero (por ejemplo, PEG o dextrano) o un dominio Fc, el cual es preferido; en donde el vehículo está covalentemente enlazado al antagonista de la integrina/adhesión. El vehículo y el antagonista de la integrina/adhesión puede ser enlazado a través del extremo N o extremo C del antagonista de integrina/adhesión, como se describe más adelante. El vehículo preferido es un dominio Fc, y el dominio Fc preferido es un dominio Fc de IgG. Los antagonistas de la integrina/adhesión pueden ser generados mediante despliegue de fago, selección de ARN-péptido y las otras técnicas mencionadas en la presente. La presente invención también se refiere a un proceso mediante el cual la vida media in vivo de uno o más pépticos biológicamente activos es incrementada por la fusión con un vehículo. En esta invención, los compuestos farmacológicamente activos son preparados mediante un proceso que comprende : a. la selección de al menos un péptido antagonista de la integrina/adhesión; y b. la preparación de un agente farmacológico que comprende al menos un vehículo covalentemente enlazado a al menos una secuencia de aminoácidos del péptido seleccionado. El vehículo preferido es un dominio Fc . Los péptidos seleccionados en el paso (a) son preferentemente expresados en una biblioteca de despliegue de fago. El vehículo y el péptido pueden ser enlazados a través del extremo N o del extremo C del péptido o del vehículo, como se describe más adelante. Los dominios antagonistas preferidos comprenden las secuencias de aminoácidos descritas más adelante en las SEQ ID Nos. 7 a 21 y en las Tablas 3, 4 y 5. Los dominios antagonistas adicionales pueden ser generados mediante técnicas tales como el diseño racional, la selección basada en levadura, el diseño racional, el análisis estructural de proteínas, el despliegue de fagos, y la selección de ARN-péptido. Los derivados de los compuestos anteriores (descritos más adelante) son también abarcados por esta invención. Los compuestos de esta invención pueden ser preparados mediante métodos sintéticos estándares, técnicas de ADN recombinantes, o cualquier otros métodos de preparación de péptidos y proteínas de fusión. Los compuestos de esta invención que abarcan porciones no peptídicas pueden ser sintetizados mediante reacciones de química orgánica estándares, además de las reacciones de química de los péptidos estándares, cuando sea aplicable. El uso primario contemplado es como agentes terapéuticos o profilácticos. Los péptidos enlazados al vehículo pueden tener afinidad comparable a o incluso mayor que los ligandos naturales o péptidos conocidos. Además, los agentes terapéuticos basados en ligando, naturales, pueden inducir anticuerpos contra el ligando endógeno propio del paciente; los péptidos enlazados al vehículo evitan este escollo al tener poca o típicamente ninguna identidad secuencial con el ligando natural. Los compuestos de esta invención pueden ser utilizados para fines terapéuticos o profilácticos al formularlos con materiales portadores farmacéuticos apropiados, y administrando una cantidad efectiva a un paciente, tal como un humano (u otro mamífero) en necesidad del mismo. Otros aspectos relacionados son también incluidos en la presente invención. Numerosos aspectos y ventajas adicionales de la presente invención se volverán aparentes después de la consideración de las figuras y la descripción detallada de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1F muestran los dímeros Fc ejemplares que pueden ser derivados de un anticuerpo IgGl. "Fc" en la figura representa cualquiera de las variantes Fc dentro del significado del "dominio Fc" en la presente. "X1" y "X2" representan péptidos o combinaciones ligador-péptido como- se definen posteriormente en la presente. Los dímeros específicos son como sigue: Figura ÍA, Figura ID: Dímeros enlazados por puente disulfuro simple. Los anticuerpos IgGl tienen típicamente dos enlaces disulfuro en la región de bisagra entre los dominios constante y variable. El dominio Fc en las Figuras 2A y 2D pueden ser formados mediante el truncamiento entre los dos sitios del enlace disulfuro o mediante sustitución de un residuo cisteinilo con un residuo no reactivo (por ejemplo, alanilo) . En la Figura 2A, el dominio Fc está enlazado en el extremo amino de los péptidos; en 2D, en el extremo carboxilo. Figura IB, Figura ÍE: Dímeros enlazados con doble puent... disulfuro. Este dominio Fc puede ser formado mediante truncamiento del anticuerpo progenitor para retener los residuos de cisteinilo en las cadenas del dominio Fc o mediante expresión a partir de una construcción que incluye una secuencia que codifica para tal dominio Fc. En la Figura 2B, el dominio Fc está enlazado en el extremo amino de los péptidos; en 2E, en el extremo carboxilo. Figuras ÍC, Figura ÍF: Dímeros no covalentes.

Este domino Fc puede ser formado mediante eliminación de los residuos de cisteinilo ya sea mediante truncamiento o sustitución. Se puede desear eliminar los residuos de cistemilo para evitar las impurezas formadas por la reacción del residuo de cisteinilo con los residuos de cisteinilo de otras proteínas presentes en la célula huésped. El enlace no covalente de los dominio Fc es suficiente para mantener junto el dímero. Otros dímeros pueden ser formados mediante el uso de dominios Fc derivados de diferentes tipos de anticuerpos (por ejemplo, IgG2, IgM) . Las Figuras 2A - 2C muestran la estructura de los compuestos preferidos de la invención, que caracteriza las repeticiones en tándem de los péptidos farmacológicamente activos. La Figura 2A muestra una molécula de cadena simple y puede también representar la construcción de ADN para la molécula. La Figura 2B muestra un díméro en el cual la porción de enlazador-péptido está presente únicamente sobre una cadena del dímero. La Figura 2C muestra un dímero que tiene la porción peptídica sobre ambas cadenas. El dímero de la Figura 2C se formará espontáneamente en ciertas células huésped después de la expresión de una construcción de ADN que codifica para la cadena simple mostrada en la Figura 2A. En otras células huésped, las células podrían ser colocadas en condiciones que favorecen la formación de dímeros o los dímeros pueden ser formados in vi tro . Las Figuras 3A-3B muestran las secuencias ejemplares de ácido nucleico y aminoácidos (SEQ ID Nos. 1 y 2, respectivamente) del Fc de IgGl humana que puede ser utilizada en esta invención. Las Figuras 4A y 4B muestran los enlaces de Equistatin-Fc con alta afinidad al avß3 humano en el ensayo de enlace de fase sólida. Este ensayo es además descrito en el Ejemplo 1 posteriormente en la presente. Las Figuras 5A y 5B muestran la inhibición del fibrinógeno humano marcado con rutenio (fibrinógeno-ru) que se enlaza a GPIIb/IIIa con Equistatina-Fc. Estos experimentos son además descritos en el Ejemplo 1 posteriormente .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definición de los Términos Los términos utilizados a todo lo largo de esta especificación son definidos como sigue, a no ser que sean limitados de otro modo en casos específicos. El término "que comprende" significa que un compuesto puede incluir aminoácidos adicionales sobre uno o ambos de los extremos N o C de la secuencia dada. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deben interferir de manera significativamente con la actividad del compuesto. El término "vehículo" se refiere a una molécula que previene la degradación y/o incrementa la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad, o incrementa la actividad biológica de una proteína terapéutica. Los vehículos ejemplares incluyen un dominio Fc (el cual es preferido) así como un polímero lineal (por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polilisina, dextrano, etc.); un polímero de cadena ramificada (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,289,872 a Denkenwalter et al., expedida el 15 de septiembre de 1981; 5,229,490 a Tam, expedida el 20 de julio de 1993; W093/21259 por Frechet et al., publicada el 28 de octubre de 1993); un lípido; un grupo colesterol (tal como un esteroide) ; un carbohidrato u oligosacárido; o cualquier proteína natural o sintética, polipéptido o péptido que se enlace a un receptor silvestre. Los vehículos son además descritos posteriormente en la presente . El término "Fc nativo" se refiere a la molécula o a la secuencia que comprende la secuencia de un fragmento de enlace no antigénico que resulte de la digestión del anticuerpo completo, ya sea en forma monomérica o multimérica. La fuente de inmunoglobulina original del Fc nativo es preferentemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque son preferidas la IgGl e I G2. Los Fc ' s nativos están constituidos de polipéptidos monoméricos que pueden estar enlazados en formas diméricas o multiméricas por asociación covalente (por ejemplo, enlaces disulfuro) y no covalente. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre las subunidades monoméricas de las moléculas Fc nativas, están en el intervalo de 1 a 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o subclase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 , IgAl, IgGA2) . Un ejemplo de un Fc nativo es un dímero enlazado por puente disulfuro que resulta de la digestión con papaína de una IgG (ver Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). El término "Fc nativo" como se utiliza en la presente es genérico para las formas monoméricas, diméricas y multiméricas. El término "variante de Fc" se refiere a una molécula o secuencia que es modificada a partir de un Fc nativo pero que comprende todavía un sitio de enlace para el receptor silvestre, FcRn. Las solicitudes internacionales WO 97/34631 (publicada el 25 de septiembre de 1997) y WO 96/32478 describen variantes de Fc ejemplares, así como la interacción con el receptor silvestre, y son incorporadas por referencia en la presente. De este modo, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que es humanizada a partir de un Fc nativo no humano. Además, un Fc nativo comprende los sitios que pueden ser removidos debido a que éstos proporcionan características estructurales o actividad biológica que no son requeridas para las moléculas de fusión de la presente invención. De este modo, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios Fc nativos o residuos que afectan o que están involucrados en (1) la formación del enlace disulfuro, (2) la incompatibilidad con una célula huésped seleccionada, (3) la heterogeneidad N-terminal después de la expresión en una célula huésped seleccionada, (4) glucosilación, (5) interacción con el complemento, (6) enlace a un receptor Fc diferente de un receptor silvestre, o (7) citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Las variantes de Fc son descritas con detalle adicional más adelante en la presente. El término "dominio de Fc" abarca las moléculas variantes de Fc nativo y Fc, y las secuencias como se describen anteriormente. Como con las variantes de Fc y los Fc's nativos, el término "dominio de Fc" incluye las moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sea digeridas a partir del anticuerpo completo o producidas por otros medios. El término "multímero" como se aplica a los dominios Fc o a las moléculas que comprenden los dominios Fc se refiere a las moléculas que tienen dos o más cadenas polipeptídicas asociadas covalentemente, no covalentemente, o por interacciones covalentes y no covalentes. Las moléculas de IgG forman típicamente dímeros; IgM, pentámeros; IgD, dímeros; e IgA, monómeros, dímeros, trímeros, o tetrámeros. Los ultímeros pueden ser formados al explotar la secuencia y la actividad resultante de la fuente de Ig nativo del Fc o mediante derivatización (como se define más adelante) tal como un Fc nativo. El término "dímero" como se aplica a los dominios Fc o a las moléculas que comprenden dominios Fc, se refiere a las moléculas que contienen dos cadenas polipeptídicas asociadas covalentemente o no covalentemente. De este modo, los dímeros ejemplares dentro del alcance de esta invención son como se muestran en la Figura 1. Los términos "derivatización" y "derivado" o "derivatizado" comprenden los procesos y los compuestos resultantes respectivamente en los cuales (1) el compuesto tiene una porción cíclica; por ejemplo, la reticulación entre los residuos de cisteinilo dentro del compuesto; (2) el compuesto es reticulado o tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el compuesto tiene un residuo de cisteinilo y de este modo forma dímeros reticulados en cultivo o in vivo; (3) uno o más enlaces peptidilo es reemplazado por un enlace no peptidilo; (4) el extremo N es reemplazado por -NRR1, NRC(0)Rx, -NRCÍOJOR1, -NRSÍO^R1, -NHC (O) NHR, un grupo succinimida, o benciloxicarbonil-NH- sustituido o no sustituido, en donde R y R1 y los sustituyentes del anillo son como se definen posteriormente en la presente; (5) el extremo C es reemplazado por -C(0)R2 o -NR3R4 en donde R2, R3, y R4 son como se definen posteriormente; y (6) los compuestos en los cuales las porciones de aminoácidos individuales son modificadas a través del tratamiento con agentes capaces de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos terminales. Los derivados son además descritos posteriormente en la presente. El término "péptido" se refiere a las moléculas de 2 a 60 aminoácidos, con las moléculas de 3 a 20 aminoácidos que son las preferidas, y aquellas de 6 a 15 aminoácidos que son las más preferidas. Los péptidos ejemplares pueden ser aleatoriamente generados mediante cualquiera de los métodos citados anteriormente, llevado en una biblioteca de péptidos (por ejemplo, una biblioteca de despliegue de fago) , o derivados mediante digestión de proteínas. El término "aleatorizado" como se utiliza para referirse a las secuencias peptídicas, se refiere a las secuencias completamente aleatorias (por ejemplo, seleccionadas por métodos de despliegue de fagos) y secuencias en las cuales uno o más residuos de una molécula de origen natural son reemplazadas por un residuo de aminoácido que no aparece en esa posición en la molécula de origen natural. Los métodos ejemplares para la identificación de secuencias peptídicas incluyen el despliegue de fago, el despliegue de E. coli , la selección basada en levadura, despliegue de ribosoma, la selección de ARN-péptido, la selección química, el diseño racional, el análisis estructural de proteínas, y similares. El término "farmacológicamente activo" significa que una sustancia así descrita, es determinada como poseedora de actividad que afecta un parámetro médico (por ejemplo, la presión sanguínea, la cuenta de células sanguíneas, el nivel de colesterol) o el estado de enfermedad (por ejemplo, cáncer, desórdenes autoinmunes) . De este modo, los péptidos farmacológicamente activos comprenden los péptidos agonistas o miméticos y antagonistas, como se describe más adelante. El término "péptido antagonista" o "péptido inhibidor" se refiere a un péptido que bloquea o de alguna manera interfiere con la actividad biológica de la proteína asociada de interés, o tiene actividad biológica comparable a un antagonista o inhibidor conocido de la proteína asociada de interés. El término "antagonista de integrina/adhesión" comprende los péptidos que inhiben o que subregulan la actividad de las integrinas, selectinas, moléculas de adhesión de células, receptores de integrina, receptores de selectina, o receptores de moléculas de adhesión celular. Los antagonistas de integrina/adhesión ejemplares comprenden laminina, equistatina, los péptidos descritos en las SEQ ID Nos. 7 a 21 posteriormente en la presente, los péptidos en las Tablas 3, 4 y 5 más adelante, y aquellos descritos en las referencias en la Tabla 2. Aquellos de experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que cada una de estas referencias hace posible seleccionar diferentes péptidos que los efectivamente descritos en la presente al seguir los procedimientos descritos con las diferentes bibliotecas de péptidos . Adicionalmente, las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de esta invención son también abarcadas en la presente. Por "sales fisiológicamente aceptables" se entiende cualesquiera sales que sean conocidas o posteriormente descubiertas por ser farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos específicos son: acetato; trifluoroacetato; hidrohaluros, tales como clorhidrato y bromhidrato; sulfato; citrato; tartrato; glicolato; y oxalato.

Estructura de los compuestos En General . En las composiciones de interés preparadas de acuerdo con esta invención, el péptido puede ser enlazado al vehículo a través del extremo N o el extremo C del péptido. De este modo, las moléculas vehículo-péptido de esta invención pueden ser descritas por la siguiente fórmula I : I (X1)a-F1-(X2)b en donde : F1 es un vehículo (preferentemente un dominio Fc) ; X1 y X2 son cada uno independientemente seleccionados de -(L^c-P1, - (L1) c-P1- (L2) d-P2, - (L1) c-P1- (L2) d-P-(L3)e-P3, y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4 P1, P2, P3 y P4 son cada uno independientemente secuencias de péptidos antagonistas de la integrina/adhesión; L1, L2, L3 y L4 son cada uno independientemente ligadores; y a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que al menos uno de a y b sea 1. De este modo, el compuesto I comprende los compuestos preferidos de la fórmula II Xx-Fx y los multímeros de los mismos en donde F1 es un dominio Fc y está enlazado en el extremo C de X1; III Fx-X2 y los multímeros de los mismos en donde F1 es un dominio Fc y está enlazado en el extremo N de X2; IV F1-(L1)C-P1 y los multímeros de los mismos en donde F1 es un dominio Fc y está enlazado en el extremo N de -(L1)c-P1; y V F1-(L1)c-P1-(L2)d-P2 y los multímeros de los mismos en donde F1 es un dominio Fc y está enlazado en el extremo N de -L1-P1-L2-P2. Péptidos . Cualquier número de péptidos antagonistas de integrina/adhesión pueden ser utilizados en conjunto con la presente invención. Los péptidos de dirección al objetivo son también de interés, incluyendo los péptidos de alojamiento tumoral, los péptidos específicos de tipo celular y similares. Todas estas clases de péptidos pueden ser descubiertas mediante métodos descritos en las referencias citadas en esta especificación y otras referencias . El despliegue de fago, en particular, es útil en la generación de péptidos para el uso en la presente invención. Se ha establecido que la selección de afinidad a partir de las bibliotecas de péptidos aleatorios puede ser utilizada para identificar los ligandos peptídicos para cualquier sitio de cualquier producto génico. Dedman et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 23025-30. El despliegue de fago es particularmente bien adecuado para identificar péptidos que se enlazan a proteínas de interés tales como los receptores de la superficie celular o cualesquiera proteínas que tengan epítopes lineales. Wilson et al. (1998) , Can . J . Microbiol. 44: 313-29; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8. Tales proteínas son extensamente revisadas en Herz et al. (1997), J. Receptor & Signal Transduction Res. 17(5) : 671-776, que es incorporada por referencia en la presente. Tales proteínas de interés son preferidas para el uso en esta invención. Las proteínas particulares de interés como objetivos para la generación de péptidos en la presente invención son las integrínas, moléculas de adhesión, y los receptores para las integrinas o las moléculas de adhesión (por ejemplo, avß3 , aVßl) . Los péptidos particularmente de interés para el uso en la presente invención incluyen la laminina, la cual tiene la secuencia YIGSR (SEQ ID No. 7) equistatina, la cual tiene la secuencia ECESGPCCRNCKFLKEGTICKRARGDDMDDYCNGKTCDCPRNPHKGPAT (SEQ ID No. 8) RGD, NGR y derivados de los mismos que tienen las secuencias RX?ETX2WX3 (SEQ ID No. 9) RX!ETX2WX3 (SEQ ID No. 10) CX!X2RLDX3X4C (SEQ ID No. 11) CXXRGDC (SEQ ID No. 12) X?X X3RGDX XgX6 (SEQ ID No. 13) CX2CRGDCX3C (SEQ ID No. 14) (SEQ ID No. 15) (SEQ ID No. 16) en las cuales los sustituyentes Xlt X2, X3, X4, X5, X6, X7 Y X8 son como se definen en las solicitudes Internacionales WO 95/14714, publicada el 1 de junio de 1995 y WO 97/08203, publicada el 6 de marzo de 1997, las cuales son incorporadas por referencia en la presente, en su totalidad. También de interés particular para el uso en esta invención son los péptidos de enlace a la vinculina y los péptidos antagonistas de la selectina de las fórmulas RKXNXXWTWVGTXKXLTEE (SEQ ID No. 17) CXXXYTXLVAI QNKXE (SEQ ID No . 18 ) RKXXXXWXWVGTXKXLTXE (SEQ ID No . 19 ) AXNWXXXEPNNXXXED (SEQ ID No. 20) XKXKTXEAXNWXX (SEQ ID No. 21) en las cuales "X" se refiere a cualquier residuo de aminoácido de origen natural. Los péptidos ejemplares para esta invención aparecen en las Tablas 3, 4, 5 y 6 siguientes. Estos péptidos pueden ser preparados mediante los métodos descritos en la técnica. Se utilizan abreviaturas de aminoácidos de una sola letra. La X en estas secuencias (y a todo lo largo de esta especificación, a no ser que se especifique de otro modo en un caso particular) significa que cualquiera de los 20 residuos de aminoácidos de origen natural pueden estar presentes. Cualquiera de estos péptidos puede ser enlazado en tándem (por ejemplo, secuencialmente) , con o sin ligadores, con los péptidos de la misma secuencia o de diferentes secuencias. Cualquier péptido que contenga un residuo de cisteinilo puede ser reticulado con cualquier otro péptido que contenga Cys, uno o ambos de los cuales puede estar enlazado a un vehículo. Unos pocos ejemplos reticulados son proporcionados en la tabla. Cualquier péptido que tenga más de un residuo Cys puede formar un enlace disulfuro intrapeptídico. En la columna "SEQ ID No.", "NR" significa que no es requerido ningún listado de secuencias para la secuencia dada.

Tabla 3 - Secuencias del péptido antagonista de integrina Tabla 4 - Secuencias del péptido antagonista de selectina Tabla 5 - Péptidos de enlace a la vinculina Tabla 6 - Secuencias de péptidos relacionados a laminina Vehículos . Esta invención requiere la presencia de al menos un vehículo (F1, F2) enlazado a un péptido a través del extremo N, del extremo C o una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácidos. Pueden también ser utilizados vehículos múltiples; por ejemplo, los Fc's en cada extremo o un Fc en un extremo y un grupo PEG en el otro extremo o una cadena lateral . Un dominio Fc es el vehículo preferido. El dominio Fc puede ser fusionado al extremo N o C de los péptidos o en ambos extremos, N y C. Para los péptidos miméticos de TPO, las moléculas que tienen el dominio Fc fusionado al extremo N de la porción peptídica de la molécula, son más bioactivas que otra de tales fusiones, de modo que es preferida la fusión al extremo N. Como se anotó anteriormente, las variantes de Fc son vehículos adecuados dentro del alcance de esta invención. Un Fc nativo puede ser extensamente modificado para formar una variante de Fc de acuerdo con esta invención, con la condición de que el enlace al receptor silvestre sea mantenido; ver, por ejemplo WO 97/34631 y WO 96/32478. En tales variantes de Fc, se pueden remover uno o más sitios de un Fc nativo que proporcionan características estructurales o actividad funcional, no requeridas por las moléculas de fusión de esta invención. Se pueden remover estos sitios mediante, por ejemplo, sustitución o supresión de residuos, inserción de residuos dentro del sitio, o truncamiento de porciones que contienen el sitio. Los residuos insertados o sustituidos pueden también ser aminoácidos alterados, tales como los peptidomiméticos o D-aminoácidos. Las variantes de Fc pueden ser deseables por un número de razones, varias de las cuales son descritas más adelante. Las variantes Fc ejemplares incluyen moléculas y secuencias en las cuales : 1. Los sitios involucrados en la formación del enlace disulfuro son removidos. Tal eliminación puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína, presentes en la célula huésped utilizada para producir las moléculas de la invención. Para este propósito, el segmento que contiene cisteína en el extremo N puede ser truncado, o los residuos de cisteína pueden ser suprimidos o sustituidos con otros aminoácidos (por ejemplo, alanilo, serilo) . En particular, se puede truncar el segmento N-terminal de 20 aminoácidos SEQ ID No. 2 o suprimir o sustituir los residuos de cisteína en las posiciones 7 y 10 de la SEQ ID No. 2. Incluso cuando los residuos de cisteína son eliminados, los dominios Fc de cadena lateral pueden todavía formar un dominio Fc dimérico que es mantenido junto no covalentemente. Un Fc nativo es modificado para hacerlo más compatible con una célula huésped seleccionada. Por ejemplo, se puede remover la secuencia PA cerca del extremo N de un Fc nativo típico, el cual puede ser reconocido por una enzima digestiva en E. coli tal como la prolina-iminopeptidasa. Se puede también agregar un residuo de metionina N-terminal, especialmente cuando la molécula es expresada recombinantemente en una célula bacteriana tal como E. coli . El dominio Fc de la SEQ ID No. 2 (Figura 3) es una variante Fc tal.

Una porción del extremo N de un Fc nativo es removida para prevenir la heterogeneidad N-terminal cuando es expresada en una célula huésped seleccionada. Para este propósito, se pueden suprimir cualquiera de los primeros residuos de aminoácidos en el extremo N, particularmente aquellos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5. Son removidos uno o más sitios de glucosilación. Los residuos que son típicamente glucosilados (por ejemplo, asparagina) pueden conferir respuesta citolítica. Tales residuos pueden ser suprimidos o sustituidos con residuos no glucosilados (por ejemplo, alanina) . Sitios involucrados en la interacción con el complemento, tales como el sitio de enlace a Clq, son removidos. Por ejemplo, se puede suprimir o sustituir la secuencia EKK de la IgGl humana. El reclutamiento del complemento puede no ser ventajoso para las moléculas de esta invención, y puede ser así evitado con tal variante de Fc . Son removidos los sitios que afectan el enlace a los receptores de Fc diferentes de un receptor silvestre. Un Fc nativo puede tener sitios para la interacción con ciertas células sanguíneas blancas que no son requeridas para las moléculas de fusión de la presente invención y pueden así ser removidas. 7. El sitio ADCC es removido. Los sitios ADCC son conocidos en la técnica; ver, por ejemplo, Molec. Immunol . 29 (5) : 633-9 (1992) con respecto a los sitios ADCC en IgGl . Estos sitios, también, no son requeridos para las moléculas de fusión de la presente invención y así pues pueden ser removidos. 8. Cuando el Fc nativo es derivado de un anticuerpo no humano, el Fc puede ser humanizado. Típicamente, para humanizar un Fc nativo, se sustituirán los residuos seleccionados en el Fc nativo no humano con residuos que son normalmente encontrados en Fc nativo humano. Las técnicas para la humanización de anticuerpos son bien conocidas en la técnica. Las variantes de Fc preferidas incluyen las siguientes. En la SEQ ID No. 2 (Figura 3) la leucina en la posición 15 puede ser sustituida con glutamato; el glutamato en la posición 99, con alanina; y las lisinas en las posiciones 101 y 103, con alaninas. Además, uno o más residuos de tirosina pueden ser reemplazados por residuos de fenilalanina. Un vehículo alternativo podría ser una proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo o molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto peptidomimético) capaz de enlazarse a un receptor silvestre. Por ejemplo, se podría utilizar como un vehículo, un polipéptido como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5 ,739,277 , expedida el 4 de abril de 1998 a Presta et al. Podrían también ser seleccionados los péptidos mediante despliegue de fago para el enlace al receptor silvestre de FcRn. Tales compuestos de enlace al receptor silvestre son también incluidos dentro del significado de "vehículo" y están dentro del alcance de esta invención. Tales vehículos deben ser seleccionados para la vida media incrementada (por ejemplo, al evitar las secuencias reconocidas por las proteasas) y la inmunogenicidad disminuida (por ejemplo, al favorecer las secuencias no inmunogénicas, como se descubrió en la humanización de anticuerpos) . Como se anotó anteriormente, los vehículos poliméricos pueden también ser utilizados para F1 y F2. Los diversos medios para enlazar las porciones químicas útiles como vehículos, son actualmente disponibles, ver, por ejemplo, el Tratado de Cooperación en Materia de Patentes ("PCT") Publicación internacional No. WO 96/11953, titulada "Composiciones y Métodos de Proteína Químicamente Modificada N-Terminalmente" incorporada por referencia en la presente en su totalidad. Esta publicación del PCT describe, entre otras cosas, el enlace selectivo de los polímeros solubles en agua al extremo N de las proteínas. Un vehículo polimérico preferido es el polietilenglicol (PEG) . El grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular conveniente y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del PEG estará preferentemente en el intervalo de aproximadamente 2 kiloDalton ("kD") hasta aproximadamente 100 kDa, más preferentemente de aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 50 kDa, lo más preferentemente de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 10 kDa. Los grupos PEG serán en general enlazados a los compuestos de la invención mediante acilación o alquilación reductiva a través de un grupo reactivo sobre la porción PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, tiol o éster) a un grupo reactivo sobre el compuesto de la invención (por ejemplo, un grupo aldehido, amino o éster) . Una estrategia útil para la PEGilación de los péptidos sintéticos consiste de la combinación, a través de la formación de un enlace conjugado en solución, de un péptido y una porción PEG, poseyendo cada uno una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva una hacia la otra. Los péptidos pueden ser fácilmente preparados con síntesis en fase sólida convencional (ver, por ejemplo, figuras 5 y 6 y el texto anexo en la presente) . Los péptidos son "preactivados" con un grupo funcional apropiado en un sitio específico. Los precursores son purificados y completamente caracterizados antes de reaccionar con la porción PEG. La ligadura del péptido con PEG usualmente tiene lugar en fase acuosa y puede ser fácilmente monitorizada o mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) analítica, de fase inversa. Los péptidos PEGilados pueden ser fácilmente purificados mediante HPLC preparativa y caracterizados mediante HPLC analítica, análisis de aminoácidos y espectrometría de masa de desorción de láser. Los polímeros polisacáridos son otro tipo de polímeros solubles en agua que pueden ser utilizados para la modificación de proteína. Los dextranos son polímeros de polisacáridos comprendidos de subunidades individuales de glucosa predominantemente enlazada mediante enlace al-6. El dextrano mismo es disponible en muchos intervalos de peso molecular, y es fácilmente disponible en pesos moleculares de aproximadamente 1 kD hasta aproximadamente 70 kD. El dextrano es un polímero soluble en agua adecuado, para el uso en la presente invención, como un vehículo por sí mismo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo Fc) . Ver por ejemplo, WO 96/11953 y WO 96/05309. El uso del dextrano conjugado a las inmunoglobulinas terapéuticas o de diagnóstico ha sido reportado; ver, por ejemplo, Publicación de Patente Europea No. 0 315,456, la cual es incorporada por referencia en la presente. El dextrano de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD es preferido cuando se utiliza el dextrano como un vehículo de acuerdo con la presente invención.

Ligadores . Cualquier grupo "ligador" es opcional. Cuando está presente, la estructura química no es crítica, ya que éste sirve principalmente como un espaciador. El ligador está preferentemente constituido de aminoácidos ligados entre sí por enlaces peptídicos. De este modo, en las modalidades preferidas, el ligador está constituido de 1 a 20 aminoácidos enlazados por enlaces peptídicos, en donde los aminoácidos son seleccionados de los 20 aminoácidos de origen natural . Algunos de estos aminoácidos pueden estar glucosilados, como es bien comprendido por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad más preferida, los 1 a 20 aminoácidos son seleccionados de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Aún más preferentemente, un ligador está constituido de una mayor parte de aminoácidos que están estéricamente no impedidos, tales como glicina y alanina. De este modo, los ligadores preferidos son poliglicinas (particularmente (Gly)4, (Gly)5, poli (Gly-Ala) , y polialaninas . Otros ejemplos específicos de ligadores son.

(Gly) 3Lys (Gly) 4 (SEQ ID No . 3 ) ; (Gly) 3AsnGlySer (Gly) 2 (SEQ ID No . 4 ) ; (Gly) 3Cys (Gly) 4 (SEQ ID No . 5) ; GlyProAsnGlyGly (SEQ ID No . 6 ) .

Para explicar la nomenclatura anterior, por ejemplo, (Gly) 3Lys (Gly) - significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Las combinaciones de Gly y Ala son también preferidas. Los ligadores mostrados aquí son ejemplares; los ligadores dentro del alcance de esta invención pueden ser mucho más largos y pueden incluir otros residuos. Los ligadores no peptídicos son también posibles. Por ejemplo, los ligadores de alquilo tales como -NH- (CH2) 3-C (0) -, en donde s = 2-20, podrían ser utilizados. Estos ligadores de alquilo pueden además estar sustituidos por cualquier grupo no estéricamente impedidos tal como alquilo inferior (por ejemplo de 1 a 6 átomos de carbono) , acilo inferior, halógeno (por ejemplo cloro, bromo) , CN, NH2, fenilo, etc. Un ligador no peptídico no ejemplar es un ligador de PEG, VI En donde n es tal que el ligador tiene un peso molecular de 100 a 5000 kD, preferentemente de 100 a 500 kD. Los ligadores peptídicos pueden ser alterados para formar derivados de la misma manera como se describe anteriormente. Derivados . Los inventores también contemplan la derivatización de la porción peptídica y/o el vehículo de los compuestos. Tales derivados pueden mejorar la solubilidad, la absorción, la vida media biológica, y similares, de los compuestos. Las porciones pueden eliminar alternativamente o atenuar cualquier efecto colateral indeseable de los compuestos, y similares. Los derivados ejemplares incluyen compuestos en los cuales: 1. EL compuesto o alguna porción del mismo es cíclica. Por ejemplo, la porción peptídica puede ser modificada para contener dos o más residuos Cys (por ejemplo en el ligador) , que podrían ciclizarse mediante formación de enlace disulfuro. Para las citas a las referencias sobre la preparación de los derivados ciclizados, ver la Tabla 2. 2. El compuesto es reticulado o es hecho capaz de reticularse entre moléculas. Por ejemplo, la porción peptídica puede ser modificada para contener un residuo Cys y con esto ser capaz de formar un enlace disulfuro intermolecular con una molécula similar. El compuesto puede también ser reticulado a través de su extremo C, como en la molécula mostrada enseguida. VII Uno o más enlaces (uniones) peptidilo [-C(0)NR-] es reemplazado por un enlace no peptidilo. Los enlaces no peptidilos ejemplares son -CH2-carbamato, [-CH2OC(0)NR-] , fosfonato, -CH2-sulfonamida [-CH2-S(0)2NR-] , urea [-NHC (O)NH-] , -CH2-amina secundaria, y péptido alquilado [-C(0)NR6- en donde R6 es alquilo inferior] . El extremo N es derivatizado. Típicamente, el extremo N puede ser acilado o modificado a una amina sustituida. Los grupos derivados N-terminales, ejemplares incluyen -NRR1 (diferente de -NH2) , succinimida o benciloxicarbonil -NH- (CBZ-NH-) , en donde R y R1 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo inferior, y en donde el anillo de fenilo puede estar sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, cloro y bromo. El extremo C libre es derivatizado. Típicamente, el extremo C es esterificado o amidado. Por ejemplo, se pueden utilizar métodos descritos en la técnica para agregar (NH-CH2-CH2-NH2) 2 a los compuestos de esta invención que tienen cualquiera de la SEQ ID Nos. 504 a 508 en el extremo C. De igual modo, se pueden utilizar los métodos descritos en la técnica para agregar -NH2 a los compuestos de esta invención que tienen cualquiera de la SEQ ID Nos. 924 a 955, 963 a 972, 1005 a 1013, ó 1018 a 1023 en el extremo C. Los grupos derivados C-terminales, ejemplares incluyen, por ejemplo, -C(0)R2 en donde R2 es alcoxi inferior o -NR3R4 en donde R3 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono (preferentemente alquilo de 1 a 4 átomos de carbono) . 7. Un enlace disulfuro es reemplazado con otra porción de reticulación, preferentemente más estable (por ejemplo, un alquileno) . Ver por ejemplo Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39:3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep . Symp., 357-9. 8. Uno o más residuos de aminoácidos individuales son modificados. Diversos agentes de derivatización son conocidos por reaccionar específicamente con las cadenas laterales o residuos terminales seleccionados, como se describe con detalle más adelante.

Los residuos de lisinilo y los residuos amino-terminales se pueden hacer reaccionar con anhídridos de ácidos succínico o de otro ácido carboxílico, los cuales revierten la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para la derivatización de los residuos que contienen alfa-amino, incluyen los imidoésteres, tales como el picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencensulfónico; O-metilisourea; 2 , 4-pentanodiona; y la reacción catalizada por transaminasa, con glioxilato. Los residuos de arginilo pueden ser modificados mediante reacción con cualquiera o una combinación de varios reactivos convencionales, incluyendo fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1, 2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginilo requiere que la reacción sea realizada en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo epsilon-amino de la arginina. La modificación específica de los residuos de tirosilo ha sido estudiada extensamente, con interés particular en la introducción de marcadores espectrales dentro de los residuos de tirosilo por reacción con los compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar las especies de O-acetil-tirosilo y los derivados de 3 -nitro, respectivamente. Los grupos de cadena lateral carboxilo (aspartilo o glutamilo) pueden ser selectivamente modificados mediante reacción con carbodiimidas (R' -N=C=N-R' ) tal como 1-ciclohexil-3- (2-morfolinil- (4-etil) -carbodiimida o l-etil-3- (4-azonia-4, 4-dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo pueden ser convertidos a residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con los iones amonio. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo pueden ser desamidados a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos son desamidados bajo condiciones levemente acidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención. Los residuos de cisteinilo pueden ser reemplazados por residuos de aminoácidos u otras porciones ya sea para eliminar el enlace disulfuro o, de manera contraria, para estabilizar la reticulación. Ver por ejemplo Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39:3814-9. La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular los péptidos o sus derivados funcionales a una matriz de soporte insoluble en agua o a otros vehículos macromoleculares. Los agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, esteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo esteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1, 8 -octano. Los agentes de derivatización tales como el metil-3- [ (p-azidofenil) ditiojpropioimidato producen intermediarios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices insolubles en agua, reactivas tales como los carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; y 4,330,440 son empleados para la inmovilización de proteínas. Los grupos carbohidrato (oligosacáridos) pueden ser convenientemente enlazados a los sitios que se sabe son sitios de glucosilación en las proteínas. En general, los oligosacáridos O-enlazados son acoplados a los residuos de serina (Ser) o treonina (Thr) mientras que los oligosacáridos N-enlazados son acoplados a los residuos de asparagina (Asn) cuando éstos son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferentemente uno de los 19 aminoácidos de origen natural diferentes de la prolina. Las estructuras de los oligosacáridos N-enlazados y O-enlazados y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que es comúnmente encontrado sobre ambos es el ácido N-acetilneuramínico (denominado como ácido siálico) . El ácido siálico es usualmente el residuo terminal de los oligosacáridos N-enlazados y O-enlazados y, en virtud de su carga negativa, pueden conferir propiedades acidas al compuesto glucosilado. Tal o tales sitios pueden ser incorporados en el ligador de los compuestos de esta invención y son preferentemente glucosilados por una célula durante la producción recombinante de los compuestos polipeptídicos (por ejemplo, en células de mamífero tales como CHO, BHK, COS) . No obstante, tales sitios pueden además ser glucosilados mediante procedimientos sintéticos o semisintéticos conocidos en la técnica. Otras posibles modificaciones incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación y los grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, la oxidación del átomo de azufre en Cys, la metilación de los grupos alfa-amino de la lisina, la arginina y la histidina en sus cadenas laterales. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco) , pp. 79-86 (1983) . Los compuestos de la presente invención pueden ser cambiados al nivel del ADN también. La secuencia de ADN de cualquier porción del compuesto puede ser cambiada a los codones más compatibles con la célula huésped elegida. Para E. Coli, la cual es la célula huésped preferida, los codones optimizados son conocidos en la técnica. Los codones pueden ser sustituidos para eliminar los sitios de restricción o para incluir sitios de restricción silenciosos, los cuales pueden ayudar en el procesamiento del ADN en la célula huésped seleccionada. El vehículo, el ligador y la secuencia de ADN peptídico pueden ser modificadas para incluir cualquiera de los cambios secuenciales anteriores.

Métodos de Elaboración Los compuestos de esta invención pueden ser elaborados en gran medida en células huésped transformadas utilizado técnicas de ADN recombinantes. Para hacer esto así, una molécula de ADN recombinante que codifica para el péptido es preparada. Los métodos de preparación de tales moléculas de ADN son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias que codifican para los polipéptidos podrían ser extirpadas del ADN utilizando enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de ADN podría ser sintetizada utilizando técnicas de síntesis química, tales como el método del fosforamidato. También, podría ser utilizada una combinación de estas técnicas. La invención también insluye un vector capaz de expresar los péptidos en un huésped apropiado. El vector comprende la molécula de ADN que codifica para los péptidos operablemente enlazados a las secuencias de control de la expresión apropiadas. Los métodos para efectuar este enlace operativo, ya sea antes o después de que la molécula de ADN sea insertada en el vector, son bien conocidos. La secuencia del control de la expresión incluye promotores, activadores, aumentadores, operadores, sitios de enlace ribosomal, señales de inicio, señales de detención, señales de casquete, señales de poliadenilación, y otras señales involucradas con el control de la transcripción o de la traducción. El vector resultante que tiene la molécula de ADN sobre éste, es utilizado para transformar un huésped apropiado. Esta transformación puede ser realizada utilizando métodos bien conocidos en la materia. Cualquiera de un gran número de células huésped disponibles y bien conocidas pueden ser utilizadas en la práctica de esta invención. La selección de un huésped particular es dependiente de un número de factores reconocidos por la técnica. Éstos incluyen, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión elegido, la toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, la proporción o velocidad de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos, las características de expresión, la bioseguridad y los costos. Un balance de estos factores debe ser crucial con el entendimiento de que no todos los huéspedes pueden ser igualmente efectivos para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estos lineamientos generales, los huéspedes microbianos útiles incluyen bacterias (por ejemplo E. coli sp) , levaduras (tales como Saccharomyces sp) u otros hongos, células de insecto, de plantas, de mamífero (incluyendo humanos) en cultivo, u otros huéspedes conocidos en la técnica. Enseguida, el huésped transformado es cultivado y purificado. Las células huésped pueden ser cultivadas bajo condiciones convencionales de fermentación, de modo que los compuestos deseados son expresados . Tales condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Finalmente, los péptidos son purificados a partir del cultivo mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los compuestos pueden ser también elaborados mediante métodos sintéticos. Por ejemplo, pueden ser utilizadas técnicas de síntesis en fase sólida. Las técnicas adecuadas son bien adecuadas en la materia, e incluyen aquellas descritas en Merriefield (1973) , Chem. Polypeptides , pp 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merriefield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10:394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; Patente de los Estados Unidos No. 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2:105-253; y Erickson et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 257-527). La síntesis en fase sólida es la técnica preferida para la elaboración de los péptidos individuales, ya que este es el método de más bajo costo de elaboración de péptidos pequeños. Los compuestos que contienen péptidos derivatizados o que contienen grupos no peptídicos, pueden ser sintetizados por técnicas de química orgánica bien conocidas .

Usos de los Compuestos Los compuestos de esta invención tendrán usos como se describen para la laminina, la equistanina, antagonistas de integrina, antagonistas de la adhesión celular, y antagonistas de selectina, conocidos en la técnica. En particular, los compuestos de esta invención son útiles en el tratamiento de: • las condiciones tratadas benéficamente por inhibición de la agregación, incluyendo la inhibición de la agregación plaquetaria; • las condiciones benéficamente tratadas por inhibición de la angiogénesis (por ejemplo crecimiento tumoral, metástasis tumoral); • condiciones inflamatorias y autoinmunes (por ejemplo artritis reumatoide) ; • diversas formas de osteoporosis, tales como: osteoporosis primaria; osteoporosis postmenopáusica y relacionada a la edad ; - osteoporosis endrócrina (hipertiroidismo, hiperparatiroidismo, síndrome de Cushing y acromegalia) ; formas hereditarias y congénitas de osteoporosis (por ejemplo, osteogénesis imperfecta, homocistinuria, síndrome de Menkes y síndrome de Riley-Day) ; osteopororis debida a la inmovilización de las extremidades ; osteopororis secundaria a otros desórdenes, tales hemocromatosis, hiperprolactinemia, anorexia nerviosa, tirotoxicosis, diabetes mellitus, enfermedad celiaca, enfermedad inflamatoria del intestino, cirrosis biliar primaria, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, mieloma múltiple, enfermedades linfoproliferativas y mastocitosis sistémica; osteoporosis secundaria a la cirugía (por ejemplo gastrectomía, o a terapia con fármacos, tal como quimioterapia, terapia anticonvulsivante, terapia con inmunosupresores, y terapia con anticoagulantes ; y similares. Además de los usos terapéuticos, los compuestos de la presente invención son útiles en el diagnóstico de enfermedades caracterizadas por la disfunción de su proteína asociada de interés. En una modalidad, un método de detectar en una muestra biológica una proteína de interés (por ejemplo un receptor) que es capaz de ser activada que comprende los pasos de: (a) el poner en contacto la muestra con un compuesto de esta invención; y (b) detectar la activación de la proteína de interés por el compuesto. Las muestras biológicas incluyen especímenes tisulares, células intactas o extractos de las mismas. Los compuestos de esta invención pueden ser utilizados como parte de un equipo de diagnóstico para detectar la presencia de sus proteínas asociadas de interés, en una muestra biológica. Tales equipos emplean los compuestos de la invención que tienen un marcador acoplado para permitir la detección.

Composiciones Farmacéuticas En general . La presente invención también proporciona los métodos de utilizar las composiciones farmacéuticas de los compuestos de la invención. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser para la administración por inyección, o para la administración oral, pulmonar, nasal, transdérmica u otras formas de administración. En general, la invención abarca las composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de un compuesto de la invención, junto con los diluyentes, conservadores, solubilizantes, emulsificantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes de diversos contenidos de amortiguador (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) , pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizadores (por ejemplo Tween 80, polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio) , conservadores (por ejemplo Thimersol , alcohol bencílico), y sustancias de volumen (por ejemplo, lactosa, manitol) ; incorporación de material en preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en liposomas. El ácido hialurónico puede ser también utilizado, y éste puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Tales composiciones pueden influir el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo, y la velocidad de despejo in vivo de las presentes proteínas y derivados. Ver, por ejemplo Remington Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, que se incorpora por referencia en la presente. Las composiciones pueden ser preparadas en forma líquida, o pueden estar en forma de polvo seco, tal como la forma liofilizada. Las formulaciones de liberación sostenida implantables son también contempladas, como lo son las formulaciones transdérmicas. Forma de dosificación oral. Contempladas para el uso en la presente están las formas de dosis oral sólidas, las cuales son descritas en general en el Capítulo 89 de Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) , 18th Ed. , Mack Publishing Co. Easton PA 18042 la cual es incorporada por referencia en la presente. La forma de dosis sólida incluyen tabletas, cápsulas, pildoras, trociscos o pastillas, esferas o pellas. También, el encapsulamiento liposomal o proteinoide puede ser utilizado para formular las presentes composiciones (como por ejemplo, las microesferas proteinoides reportadas en la Patente de los Estados Unidos No. 4,925,673). El encapsulamiento liposomal puede ser utilizado y los liposomas pueden ser derivatizados con diversos polímeros (por ejemplo Patente de los Estados Unidos No. 5,013,556). Una descripción de las posibles formas de dosis sólida para la terapéutica se da en el Capítulo 10 de Marshall, K. , Modern Pharmaceutics (1979), editado por G. S Banker y C. T. Rhodes, incorporada por referencia en la presente. En general, la formulación incluirá el compuesto de la invención e ingredientes inertes, los cuales permiten la protección contra el ambiente estomacal, y liberan el material biológicamente activo en el intestino. También específicamente contempladas están las formas de dosis oral de los compuestos de la invención anteriormente mencionados. Si es necesario, los compuestos pueden ser químicamente modificados de modo que la administración oral sea eficaz. En general, la modificación química contemplada es el acoplamiento de al menos una porción a la molécula misma del compuesto, donde la porción permite (a) la inhibición de la proteólisis; y (b) la captación de la corriente sanguínea desde el estómago o el intestino. También se desea el incremento en la estabilidad total del compuesto y el incremento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Las porciones útiles como vehículos covalentemente enlazados en esta invención, pueden también ser utilizadas para este propósito. Los ejemplos de tales porciones incluyen: PEG, copolímero de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y poliprolina. Ver, por ejemplo Abuchowski y Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg y Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY. , pp 367-83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4:185-9. Otros polímeros que podrían ser utilizados son el poli-1, 3 -dioxolano y el poli-1, 3 , 6-tioxocano. Preferidas para el uso farmacéutico, como se indicó anteriormente, son las porciones PEG. Para las formas de dosis de administración oral, es también posible utilizar una sal de un aminoácido alifático modificado, tal como el N- (8- [2-hidroxibenzoil] amino) caprilato de sodio (SNAC) , como un portador para aumentar la absorción de los compuestos terapéuticos de esta invención. La eficacia clínica de una formulación de heparina utilizando SNAC ha sido demostrada en una prueba de Fase II conducida por Emisphere Technologies. Ver Patente de los Estados Unidos No. 5,792,451, "composiciones y métodos para la administración oral de fármacos". Los compuestos de esta invención pueden ser incluidos en la formulación como multiparticulados finos en la forma granulos o pellas de tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. La formulación del material para la administración en cápsula podría ser también como un polvo, "tampones" ligeramente comprimidos ("plugs") o incluso como tabletas. El producto terapéutico podría ser preparado mediante compresión. Pueden también ser incluidos agentes colorantes y saborizantes. Por ejemplo, la proteína (o derivado) puede ser formulada (tal como mediante encapsulamiento en liposoma o microesfera) y luego contenido adicionalmente dentro de un producto comestible, tal como una bebida refrigerada, que contiene colorantes y agentes y saborizantes. Se puede diluir o incrementar el volumen del compuesto de la invención con un material inerte. Estos diluyentes podrían incluir carbohidratos, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sucrosa, dextranos modificados y almidón. Ciertas sales inorgánicas pueden también ser utilizadas como rellenadores incluyendo trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes comercialmente disponibles son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress and Avicell. Los desintegradores pueden ser incluidos en la formulación del producto terapéutico en una forma de dosis sólida. Los materiales utilizados como desintegradores incluyen, pero no están limitados a, almidón que incluye el desintegrador comercial basado en almidón, Explotab. Glicolato de almidón de sodio, Amberlite, carboximetilcelulosa de sodio, ultramielopectina, alginato de sodio, gelatina, cascara de naranja, carboximetilcelulosa acida, esponja natural y bentonita pueden todos ser utilizados. Otra forma de desintegradores son las resinas de intercambio catiónico, insolubles. Pueden ser utilizadas gomas en polvo como desintegradores y como aglutinantes, y éstas pueden incluir gomas en polvo tales como agar, Karaya o tragacanto. El ácido algínico y su sal de sodio son también útiles como desintegradores. Los aglutinantes pueden ser utilizados para mantener el agente terapéutico junto, para formar una tableta dura, e incluyen materiales provenientes de productos naturales tales como acacia, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC) , etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC) . La polivinilpirrolidona (PVP) y la hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) podrían ser ambas utilizadas en soluciones alcohólicas para granular el producto terapéutico. Un agente antifricción puede ser incluido en la formulación del producto terapéutico para prevenir la adherencia durante el proceso de formulación. Pueden ser utilizados lubricantes como una capa entre el agente terapéutico y la pared del troquel, y éstos pueden incluir, pero no están limitados a: ácido esteárico incluyendo sus sales de magnesio y calcio, politetrafluoroetileno (PTFE) , parafina líquida, aceites vegetales y ceras. Lubricantes solubles pueden también ser utilizados tales como lauriisulfato de sodio, lauriisulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000. Los deslizantes que pueden mejorar las propiedades de flujo del fármaco durante la formulación y ayudan al reacomodo de la compresión, pueden también ser agradados. Los deslizantes pueden incluir almidón, talco, sílice pirogénica y silicoaluminato hidratado. Para ayudar a la disolución del compuesto de esta invención del ambiente acuoso, puede ser agregado un surfactante como un agente de humectación. Los surfactantes pueden incluir detergentes aniónicos tales como lauriisulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctil-sodio y sulfonato de dioctil-sodio. Los detergentes catiónicos pueden ser utilizados, y podrían incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que podrían ser incluidos en la formulación como surfactantes son lauromacrogol 400, estearato de polioxol 40, aceite de ricino polioxietilen-hidrogenado 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sucrosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos surfactantes podrían estar presentes en la formulación de la proteína o del derivado ya sea solos o como una mezcla en diferentes proporciones. Pueden también ser incluidos aditivos en la formulación para aumentar la captación del compuesto. Los aditivos que tienen potencialmente esta propiedad son por ejemplo los ácidos grados: ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. La formulación de liberación controlada puede ser deseable. El compuesto de esta invención podría ser incorporado en una matriz inerte que permite la liberación ya sea mediante mecanismos de difusión o de lixiviación, por ejemplo, las gomas. Las matrices de degeneración lenta pueden también ser incorporadas en la formulación, por ejemplo, alginatos, polisacáridos. Otra forma más de una liberación controlada de los compuestos de esta invención es mediante un método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), por ejemplo, el fármaco es encerrado en una membrana semipermeable que permite que el agua entre y empuje el fármaco hacia afuera a través de una pequeña abertura simple debido a los efectos osmóticos. Algunos recubrimientos entéricos también tienen un efecto de liberación retardada. Otros recubrimientos pueden ser utilizados para la formulación. Éstos incluyen una variedad de azúcares que podrían ser aplicados en un tambor de recubrimiento. El agente terapéutico podría ser también administrado en una tableta recubierta con película y los materiales utilizados en este caso son divididos en 2 grupos . Los primeros son los materiales no entéricos e incluyen metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, povidona y los polietilenglicoles. El segundo grupo consiste de los materiales entéricos que son comúnmente esteres de ácido ftálico. Puede ser utilizada una mezcla de materiales para proporcionar el recubrimiento de película óptimo. El recubrimiento de película puede ser llevado a cabo en un recubridor de tambor o en un lecho fluidizado o mediante recubrimiento por compresión. Formas de administración pulmonar. También contemplada en la presente está la administración pulmonar de la presente proteína (o derivados de la misma) . La proteína (o el derivado) es distribuida a los pulmones de un mamífero mientras que se inhala y viaja a través del revestimiento epitelial pulmonar hacia la corriente sanguínea. (Otros reportes de administración pulmonar incluyen Adjei et al Pharma. Res. (1990) 7:565-9; Adjei et al. (1990). Internatl. J. Pharmaceutics 63:135-44 (acetato de leuprólido) ; Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (supl.5): s.143-146 (endotelina-1) ; Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3:206-12 (al-antitripsina) ; Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84:1145-6 (al-proteinasa) ; Oswein et al. (Marzo 1990), "Aerosolization of Proteins", Proc. Symp, Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (hormona recombinante humana del crecimiento) ; Debs et al. (1988); J. Immunol . 140:3482-8 (interferón-? y factor a de necrosis tumoral) y Platz et al. Patente de los Estados Unidos No. 5,284,656 (factor de estimulación de colonias de colonias de granulocitos) . Contemplados para el uso en la práctica de esta invención, están una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de los productos terapéuticos, incluyendo, pero no limitados a nebulizadores, inhaladores de dosis medida, e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para aquellos expertos en la técnica. Algunos ejemplos específicos de dispositivos comercialmente disponibles, adecuados para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St . Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medida Ventolín, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; y el inhalador de polvo Spinhaler fabricado por Fisons Corp. Bedford, Massachusetts. Todos los dispositivos tales requieren el uso de formulaciones adecuadas para el surtimiento del compuesto de la invención. Típicamente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado, y puede involucrar el uso de un material propelente apropiado, además de los diluyentes adyuvantes y/o portadores útiles en terapia. El compuesto de la invención debe ser más ventajosamente preparado en forma particulada con un tamaño de partícula promedio menor de 10 µm (o mieras) , más preferentemente 0.5 a 5 µm, para la administración más efectiva al pulmón distal. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen carbohidratos, tales como trehalosa, manitol, xilitol, sucrosa, lactosa, y sorbitol. Otros ingredientes para el uso en la formulaciones pueden incluir DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Pueden ser utilizados surfactante naturales o sintéticos. Puede ser utilizado el PEG (incluso aparte de su uso en la derivatización de la proteína o del análogo) . Los dextranos, tales como el ciclodextrano, pueden ser utilizados. Las sales biliares y otros mejoradores relacionados pueden también ser utilizados. Pueden ser utilizados celulosa y derivados de celulosa. Pueden también ser utilizados aminoácidos, tales como el uso en una formulación amortiguadora. También, es contemplado el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, la inclusión de complejos u otros tipos de portadores. Las formulaciones adecuadas para el uso con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, comprenderá típicamente el compuesto de la invención disuelto en agua a una concentración de aproximadamente 0.1 a 25 mg de la proteína biológicamente activa por ml de solución. La formulación puede también incluir un amortiguador y un azúcar simple (por ejemplo para la estabilización de las proteínas y regulación de la presión osmótica) . La formulación nebulizadora puede también contener un surfactante, para reducir o prevenir la agregación inducida por la superficie, de la proteína, provocada por la atomización de la solución en la formación del aerosol. Las formulaciones para el uso con un dispositivo inhalador de dosis medida comprenderá en general un polvo finamente dividido que contiene el compuesto de la invención suspendido en un propelente con la ayuda de un surfactante. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como un clorofluorocarburo, un hidroclorofluorocarburo, un hidroclorofluorocarburo, o un hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol, y 1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Los surfactantes adecuados incluyen el trioleato de sorbitan y la lecitina de soya. El ácido oleico puede también ser útil como un surfactante. Las formulaciones para surtir desde un dispositivo inhalador de polvo, comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene el compuesto de la invención, y puede también incluir un agente de volumen, tal como lactosa, sorbitol, sucrosa, manitol, trehalosa o xilitol, en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo 50 a 90% en peso de la formulación. Formas de administración nasal. La administración nasal del compuesto de la invención es también contemplada. La administración nasal permite el paso de la proteína hacia la corriente sanguínea directamente después de la administración del producto terapéutico hacia la nariz, sin la necesidad para la deposición del producto en el pulmón. Las formulaciones para la administración nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano. Es también contemplada la administración vía el transporte a través de otras membranas mucosas . Formas de administración bucal . La administración bucal del compuesto de la invención es también contemplada. Las formulaciones de administración bucal son conocidas en la técnica para diversos péptidos. Dosificaciones . El régimen de dosificación involucrado en un método para el tratamiento de las condiciones anteriormente descritas, será determinado por el médico que atiende, considerando diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la edad, la condición, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. En general, el régimen diario debe estar en el intervalo de 0.1 a 1000 microgramos del compuesto de la invención por kilogramo de peso corporal, preferentemente 0.1-150 microgramos por kilogramo.

Modalidades preferidas específicas Los inventores contemplan las moléculas preferidas que tienen las diferentes secuencias peptídicas enlazadas a un vehículo. Por ejemplo, una molécula preferida puede incluir las secuencias F1-?-YIGSR-?-RGD (SEQ ID No. 95) YIGSR-?-RGD-?-F1 (SEQ ID No. 96) en donde "F1" es un dominio Fc como se describe previamente en la presente y "?" es un ligador como se describe previamente en la presente.

Todos los compuestos de esta invención pueden ser preparados mediante los métodos descritos en la solicitud del PCT no. WO 99/25044, presentado el 22 de Octubre de 1999, la cual es incorporada por referencia en la presente, en su totalidad. La invención será ahora adicionalmente descrita por los siguientes ejemplos de trabajo, los cuales son ilustrativos en vez de limitantes. Toda la información en los siguientes ejemplos de trabajo, incluyendo los procesos y los ensayos, pueden ser aplicados a otros compuestos dentro de esta invención.

Ejemplo 1 Preparación de las construcciones de Fc-péptido de eguistatina Un gen sintético que codifica para la equistatina fue fusionado vía un ligador de 5 glicinas al extremo C de la porción Fc de la molécula IgGl humana mediante PCR. Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para formar la plantilla de equistatina para una reacción de PCR en dos etapas (Jayaraman K, Puccini CJ. , Biotechniques 1992 Mar; 12 (3) : 392-398. Una estrategia de síntesis génica mediada por PCR que involucran el ensamble de los oligonucleótidos que representan únicamente una de las hebras) . 2304-46 GGG GGG CAT ATG GAA TFT GAA TCT GGT CCA TGC TGC AGA AAC TG (SEQ ID No. 97) 2304-47 TAA GTT CTT GAA GGA AGG TAC CAT CTG TAA GAG AGC TAG AGG TG (SEQ ID No. 98) 2304-48 ACG ACA TGG ACG ACT ACT GTA ACG GTA AGA CCT GTG ACT GCC CG (SEQ ID No. 99) 2304-49 AGA AAC CCA CAC AAG CGT CCA GCT ACT TAA TGG ATC CGC GGC CGC CCA GCT (SEQ ID No . 100) La plantilla de una sola hebra fue ensamblada utilizando los oligonucleótidos unidos en puente mostrados enseguida: 2304-52 TTC AAG AAC TTA CAG TTT CTG GAC (SEQ ID No. 101) 2304-53 CGT CCA TGT CGT CAC CTC TAG CTC (SEQ ID No. 102) 2304-54 GTC TGG GTT TCT CGG GCA GTC ACA (SEQ ID No. 103) Esta mezcla de plantillas fue sometida a PCR utilizando los siguientes cebadores oligonucleotídicos: 2305-26 CCG GGT AAA GGT GGA GGT GGT GGT GAA TGT GAA TCT GGT CCA TGC TGC (sentido; SEQ ID No. 104) 2304-51 AGC TGG GCG GCC GCG GAT CCA (antisentido: SEQ ID NO. 105) La porción Fe de la construcción fue obtenida mediante PCR utilizando Amgen Cepa #3728 (ver WO 00/24770, publicada el 4 de Mayo del 2000, Solicitud de Patente A-533) como la plantilla y los cebadores oligonucleotídicos 1216-52 AAC ATA AGT ACC TGT AGG ATC G (SEQ ID No. 106) 2305-27 GCA GCA TGG ACC AGA TTC ACA TTC ACC ACC ACC TCC ACC TTT ACC CGG A (SEQ ID No. 107) Los oligonucleótidos 2305-26 y 2305-27 son completamente complementarios, permitiendo que los dos genes sean fusionados entre sí en la estructura de lectura correcta mediante la combinación de los productos de PCR anteriores en una tercera reacción, utilizando los cebadores externos 1216-52 y 2304-51. El producto génico de PCR, final (el gen de fusión de longitud completa) fue digerido con las endonucleasas de restricción Ndel y BamHl, y luego ligado dentro del vector pAMG21 (descrito más adelante) y transformado dentro del E. coli cepa 2596 competente (GM221, descrita en la presente) mediante electroporación. Los clones fueron seleccionados para la habilidad de producir el producto proteico recombinante, y de poseer la fusión génica que tiene la secuencia nucleotídica correcta. Un clon simple de este tipo fue seleccionado y designado Amgen cepa #4592. Las secuencias de nucleótidos (SEQ ID No. 108) y de aminoácidos (SEQ ID No. 109) de la proteína de fusión 5 resultante se muestran enseguida.

I CATATGGACAAAACTC?CACATG CO^CTTGTCCAGCTCCGGAAC CCTGG 1 -+ + + +. + + 60 GTATACCTGTTTGAGTGTGTACAGGTGG??CAGGTCG?GGCCTTGAGGACCCCCCTGGC M D K T H T C P P C P A P E L L G G P -_ Q TCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGÍ-^^ 61 -+ + + + + + . ' 120 AGTCAGAAGGAG-?VGGGGGGT TTQSGTTCCTGTGGGAGTA^ S V P Xi F P P K P K D T Ii M I S R T P B GTCAC?ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT^ 121 -+ + + + + +• 180 cAGTOTACGCAca?:atf:ctGc»c^ V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y 5 GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGC 181 -+ + + ••• + + 240 V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S ACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCGGCACCAGGACTGGCTGAATGGO?G^ 241 -+ + + + + + 300 TGCATGGCACACCAGTCGCAGGAGTGGCAGGACGTGGTCCTGACCGACTTACCGTTC^ o T Y R V V S V Ii T V I. H Q D W t. N G K E - TAC?AGTGCAAGGTCTCCAACAAA8CCTCCC^ 301 -+ + + + + + 360 ATGTTCACGTTCCAGAGGTTGTTTCGGGAGGGTCGGGGGTAGCTCTTG^^ Y K C K V S N K A P A P I E K T I S K GCCAAAGGGCAGCCCCGAGLMU:CACAGGS<-^^ 361 _+ + + + + + 420 5 CGGTTTCCCGTCGGGGCTCTTGGTGTCCACATGTGGGACGGGsGTAGGGCCCTACTCGAC A K G Q P R E P Q V Y T I. P P S R D B L ACCAAGAAC{aGßTCACCCTGACCTGCCTGGTCAIAGXKrrTCT 421 -+ + + + * + 480 TGGTTCTrGGTCCAGTCGO?CTGGACGGA CAGTTTCCGAAGATAGGGTCGCTGTAGCGG T K N Q V S T C L V K G P Y P S D I A - GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG 481 -+ — -+ + +— — + +• 540 C?CCTO^CCTCTCGTTACCCGTCGGCC^CTTGTTGATGTTCTGGTGCGGAG«^^ V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA--AGC-A^^ 541 -+ +• + + +• + 600 CTGAGGCTGCCGAGGAAGAAGGAGATGTCGTTCGAGTGGCACCTGTTCTCGTCI^CCGTC D S D G S P P Y S K T V D K S R W Q C?GGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAsGCTC^ 601 -+ + + + + + 660 GTCCCCTTGOUSAAGAGTACGAGGCACTACGTACTrcGAGACGT Q ß N V P S C S V M H S ? H N H Y T Q AAGAGCCTCTrcCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGT^ 661 -+ + + + + + 720 TTCTCGGAGAGGGACAGAGGCCCATTTCCACCTCCACCACCACTTACACTTAGACC^ K S S L S P G K G G G G G E C E S G P End of Pe J | — gl linker-| | ßchistatin — > TGCTGCAGAAACTGTAAGTTCTTGAAGGAAGGtACCATCTGTAAGAGAGCTAGAGGTGAC 721 -.+--, — — — + — - — ~ — + — — + — — -+- -+ — 780 ACGACGTCTTTGACATTCAAGAACTTCCTTCCATGGTAGA^ C C R N C K P L K E G T I C K R A R G D GACATGGACGACTACTGTAACGGTAA--ytf:CIGTGAC 781 -+ + + + + + 840 CTGTACCTsCTOATGACATTGCC?TTCTGGACACT D M D D Y C N G K T C D C P R N P H K G BaaHI I CCAGCTACTTAATGGATCC 841 -+ + GGTCGATGAATTACCTAGG P A T * Expresión en E. coli. Los cultivos de las construcciones de fusión Fc-equistatina en E. coli GM221 fueron desarrolladas a 37°C en medio de Caldo Luria. La inducción de la expresión en producto génico proveniente del promotor luxPR fue lograda después de la adición del autoinductor sintético lactona de N- (3-oxohexanoil) -DL-homoserina al medio de cultivo, a una concentración final de 20 ng/ml. Los cultivos fueron incubados a 37°C por 3 horas adicionales. Después de 3 horas, los cultivos bacterianos fueron examinados mediante microscopía para la presencia de los cuerpos de inclusión y fueron luego recolectados mediante centrifugación. Los cuerpos de inclusión retráctiles fueron observados en los cultivos inducidos, indicando que la proteína de fusión fue más probablemente producida en la fracción insoluble en E. coli. Los botones celulares fueron lisados directamente mediante resuspensión en el amortiguador de muestra Laemli que contiene 10% de ß-mercaptoetanol y fueron analizados mediante SDS-PAGE. Una banda teñida con Coomassie, intensa del peso molecular apropiado fue observado sobre un gel de SDS-PAGE. PAMG21. El plásmido de expresión pAMG21 puede ser derivado del vector de expresión de Amgen, pCFM1656 (ATTC #69576) que a su vez es derivado del sistema vector de expresión de Amgen descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4,710,473. El plásmido pCFM1656 puede ser derivado del plásmido pCFM836 descrito (Patente No. 4,710,473) mediante: (a) la destrucción de los dos sitios de restricción Ndel endógenos mediante relleno del extremo con la enzima polimerasa T4, seguido por la ligadura del extremo romo; (b) el reemplazo de la secuencia de ADN entre los sitios de restricción únicos Aat I I y CLAI que contienen el promotor PL sintético con un fragmento similar obtenido a partir de pCFM636 (patente No. 4,710,473) que contiene el promotor PL (ver SEQ ID No. 110 siguiente) ; y c) sustituyendo la secuencia de ADN pequeña entre los sitios de restricción únicos CLAI y Kpnl con los oligonucleótidos que tienen la secuencia de la SEQ ID No. 111.

SEQ ID No. 110: Aat 11 5' CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAATAAATTCATAT- 3 ' TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTATTTAAGTATA- -AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA- - TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT - -TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3' -ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC 5 ' Clal SEQ ID NO. 111: 5 ' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3 ' 3 ' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5 ' Clal Kpnl El plásmido de expresión pAMG21 pueden ser derivado de pCFM1656 mediante la elaboración de una serie de cambios en las bases, dirigidos al sitio, mediante mutagénesis de oligo de traslape de PCR y sustituciones en la secuencia de ADN. Comenzando con el sitio Bglll (plásmido pb #180) inmediatamente 5' al promotor de replicación plasmídico PCOpB Y procediendo hacia los genes de replicación del plásmido, los cambios en los pares de bases son como se muestran en la Tabla 7 siguiente.

Tabla 7 - Cambios en los pares de bases que dan como resultado pAMG21 pAMG21 pb# pb en pCFM1656 Pb cambiado en pAMG21 # 204 T/A C/G # 428 A/T G/C # 509 G/C A/T # 617 -- Insertar dos pb G/C # 679 G/C T/A # 980 T/A C/G # 994 C/G A/T # 1004 A/T C/G # 1007 C/G T/A # 1028 A/T T/A # 1047 C/G T/A # 1178 G/C T/A # 1466 G/C T/A # 2028 G/C Supresión de pb # 2187 C/G T/A # 2480 A/T T/A # 2499-2502 AGTG GTCA TCAC CAGT # 2642 TCCGAGC Supresión de 7 pb AGGCTCG # 3435 G/C A/T # 3446 G/C A/T # 3643 A/T T/A La secuencia de ^N entre los sitios de restricción únicos AatII (posición #4364 en pCFM1656) y Sacll (posición #4585 en pCFM1656) está sustituida con la secuencia de ADN (SEQ ID No. 112) mostrada enseguida. (extremo pegajoso Aaül) 5 , GCGTAACGTATGCATGGTCTCC- (posición # 4358 en pAMG21) 3 • TGC?CGCATTGCATACGTACCAGAGG- -CCATGCGAGACWAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACOW GGCTCAGTCGAAAGACT- -GGTACGCTCTC?TCCCTTGACCWGCCGTAGTTTATTTTGCTTT^^ -GGGCCTTTCGprrTTATCTGTTGTTTGTCG^ -CCCGGAAAGOUUATAG?C?ACAAACAGCCACTTGCGAßA^^ -CGGGAGCGGATTTG?-ttGTTGCGA?GCJUlCs8^^ -^ccrcGCc AAACT sau?:GC tcGttGccGa -(-?TAAACTGCC?GGCATCA-UTTAAGa^^ -G ATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGACTGCCTATC ?? lI -T CTACAAACTCTTTTGTTTAIGTTTGCTAAATACA^ -AAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTATGTAAGTTTATACCTGCAGCA^^ -TTTTAAAGTATGGGCAATCJATTGCTCCTGTTAA-TTT^^ -AAAATTTCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATTTTA^ -GGlT-XrrTGTATTGAGTTTC?TTTGCCK_?^ -CCAAAC-AACATAACTCAAAGTAAACGCGTAACCAATTTACCTTTCACTGGCAC8 -TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGCTTTTTCCTTCGCATG^ -ATGTCGGATTATAAAAACGTTATAGGGTTCGCGAAAAAGGAAGCGTACGGGTGCGATTTC -Atxctttrrctcp rp ay-t A cGTTGr?TGAtp^^ -TAAGAAAAAGAGAAA^O?TTTAGCAACAAACTAAATAATAAACÍ^TATAAATAAAAA?- -GATAATTAT?W^CTAGAGÜVAGGAACAATT-^TGGTATGTTCATAO ^TATTAATAGTTGATCTCTTCCTTGTTAATGACCATACAAGTAT PGCGTAC_ATTT^ -AACT?TCT?T?TAGTTGTCTTTCpCrG3ülTGTGCAAAACr -T GATA-» AT?TauKMAAAGAGACTT?CACG ^^ -TAGCAGTATG^TAGGGA?ACTAA?CCCAGTGAT?AfiACCTGATG^ -ATCGTCATACTTATCCCTTTGACTTGGGTCACTATTC^^ -TTAÍ?TTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATACT -AATGTAAACCTCTAAA?AATAAATGTCGTA?C?AAAGTTTATATAAGGra -AATGATTGGAGTTAGa?TAATCTACTATAGGATCATATTTTATTAAATTAGCGTC?T^ -TTACT-WlCCTCA?TCTT?T M?TßATATC^^ -A?TATTGCCTCCATTTTTT?GGCTAATTATC^ -T ATAACßßAGG AAAAAATCCC?TTAAT?GGTCTTAACTTTAT^^ -AATGAGGATAAATGATCGCGAsrAAATAATA TCACAATGTACCATTTTAGTCATATCAG- -TTACTCCTATTTACTAGCGCTCATTTATTATAAGTGTTACATGGTAAAATCAGTATAGTC- -ATAAGCATTGATTAATATCATTATTGCTTCTACAGGCTTTAATTTTATC -TATTCGTAACTAATTATAGTAATAACG-WUaa^-rrCCGAAATTAAAATAATTAATAAGACA- -MgrGTCGTCGCgA TTMVlCITaag CCCATCTCTT AT^^ -TTOlCAGCAGCCGTAAATACAaAAAGTATGGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAG- -GCAAGTTTTGCGTGTTATATATCATTAAAACGGTAATAG-ACTGACATTTGATTCTAATAA- ^GTTCAAAACGCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAAC?AA-^TTACT -ATTGGATTTTTGTOWAURRATTATATC8TTGAAATACAATTGTTTAAC?TA^ -TAACCGAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTATTCATGGAC- -TAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGATTAATCGATTTGATT- -ATCCTAGCATGTCCAAATGCGTTCTTTTACCAAACAATATCAGCTAATTAGCTAAACTAA- -^RRAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTRAACGCGTTGGAATTCGA- M?TCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATA^ SacXX -GCTCACTAGTGTCGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAA-^ -CGAGTGATCACAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGA?TGAGCTCCTAGGCGCC^^ -GAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAGG-AAGCTOAGTTGGCTGCTGCCACCGCK^ -CTrcpCTTCTTCTTTCGGGCITrCCTrcGACTCAACC -ACTAßCATAACrcCTTGGGGCCTCTAAACGGsrCITGM -TGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATTTGCCC-AGAACTCCCC?AAAAACGACTT^ -AACCGCTCTTCACGCTCTTCACGC 3 ' (extremo pegajoso Sacll) -TTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTG 5 ' (posición # 5904 en pAMG21) Durante la ligadura de los extremos pegajosos de esta secuencia de ADN de sustitución, los sitios exteriores AatII y Sacll son destruidos. Existen sitios únicos AatII y Sacll en el ADN sustituido. GM221 (Amgen #2596) . La cepa huésped de Amgen #2596 es una cepa E. coli K-12 derivada de Amgen cepa #393. Esta ha sido modificada para contener el represor lambda sensible a la temperatura cI857s7 en la región temprana ebg y el represor lacIQ en la región tardía ebg (68 minutos) . La presencia de estos dos genes represores permite el uso de este huésped con una variedad de sistemas de expresión, no obstante estos dos represores son irrelevantes a la expresión a partir de IUXPR. El huésped no transformado no tiene resistencia a antibióticos. El sitio de enlace al ribosoma del gen cI857s7 ha sido modificado para incluir un RBS mejorado. Este ha sido insertado dentro del operón ebg entre la posición de los nucleótidos 1170 y 1411 como se numera en Genbank número de acceso M64441Gb_Ba con supresión de la secuencia de intervención ebg. La secuencia del inserto es mostrada en seguida con las letras minúsculas que representan la secuencias ebg que flanquean el inserto mostrado bajo la (SEQ ID No. 113) : ttattttcgtGCOXrCGC-VrCATTATCACCrc CarTTGCGGTG?TA^TTGA--«-ACATCG^^ C A TAAC-V^UVGAGCAGCTTGAGGACGCACGTCGCCtTAAA.^^ <^ATGCATTAA?TGCTTATAACaCCGCATTrcTT-^^ TCAATCKCAOAGA?TCTACGAGATGT?TGA^ ccc?rarttttctcATOTtcA0Gc^ CACC??CAG«pCCAAsCC?- rcTTTCCTa^^ AGatG?tpctGC?t»GCC?GAC tc-?ra8^ G'JX?ttTTTACAACC^TAAACCCACAGTACCaUVTGATCCCATGCAA TT?TCGCTMTau3TOGCCTGA?-3?-3?CsTT^^ La construcción fue distribuida hacia el cromosoma utilizando un fago recombinante llamado RBS #4 mejorado con Mmebg-cI857s7 dentro F'tet/393. Después de la recombinación y la resolución únicamente el inserto cromosómico descrito anteriormente permanece en la célula. Este fue renombrado F'tet/GMIOI. F'tet/GMIOl fue luego modificado mediante la distribución de una construcción lacIQ dentro del operón ebg entre la posición de los nucleótidos 2493 y 2937 como es numerado el número de acceso de Genbank M64441Gb_Ba con la supresión de la secuencia de intervención ebg. La secuencia del inserto es mostrada enseguida con las letras minúsculas que representan las secuencias ebg que flanquean el inserto (SEQ ID No. 114) mostrado enseguida: ggcggaaaccGACGTCCATCGMTGG CaUUUtC^^ ' GTTTCCttX:0T<a-n>3AACCAG0CCAGCCA^ A«rK3AATTACATTCCCA?CCGCOTO3^^ CTCC?GTCTCXKCCTOakCaCQCCGTO?-M?TTGTCGG^^ AGCQTOCTsQTGTCGATOCTABiUCGM e8CCTCg^^ AACQCCrrCAQ CX-n FGKICA-pAAC^ TA?TCTTCCQQCsTrATTTCTTOATQTCTCT^^ GOTACGCGACTOGOC<- K-UUX_ATCTQsTC^ La construcción fue distribuida hacia el cromosoma utilizando un fago recombinante llamado AGebg-LacIQ#5 dentro de F'tet/GMIOI. Después de la recombinación y la resolución únicamente el inserto cromosómico descrito anteriormente permanece en la célula. Este fue renombrado F'tet/GM221. El episoma de F'tet fue curado de la cepa utilizando naranja de acrilina a una concentración de 25 µg/ml en LB. La cepa curada fue identificada como sensible a la tetraciclina y fue almacenada como GM221. Purificación de Vitronectina. La vitronectina fue preparada a partir de plasma humano caducado como se describe por Yatohgo et al (1988) Struct. Funct . 13: 281-92, con modificaciones. Sangre humana normal recolectada en tubos con citrato fue centrifugada y coagulada toda la noche con la adición de cloruro de calcio. El coagulo fue centrifugado, filtrado a 0.45 µm, y aplicado a una columna Heparin Sepharose que fue equilibrada con NaP04 10 M, EDTA 5 mM, NaCl 0.13 M, pH 7.7. El flujo a través de la columna fue recolectado como un combinado simple, se agregó urea hasta una concentración final de 8 M, y se mezcló toda la noche. La muestra fue luego incubada con Heparin Separóse que había sido equilibrada con NaP04 10 mM, EDTA 5 mM, urea 8 M, pH 7.7 (amortiguador A) toda la noche. La Heparin Sepharose fue separada del líquido mediante centrifugación y se lavó una vez con amortiguador a, amortiguador A + NaCl 0.13 M, y amortiguador A + NaCl 0.013 M y BME 10 mM. La vitronectina fue eluida de la columna con el amortiguador A + NaCl 0.5 M. Las fracciones que contenían vitronectina fueron intercambiadas con amortiguador en PBS y almacenadas a -70°C. Rutenilación de la Vitronectina y el Fibrinógeno. La vitronectina humana purificada o el fibrinógeno humano purificado (Calbiochem) se dializó en borato 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8.0 Una solución de reserva del éster de N-hidroxisuccinimida de la tris-bipiridina de rutenio (II) (Origen TAG® Ester, Igen Inc. Gaithersburg, MD) se preparó en fresco mediante la adición de 50 µl de DMSO a 150 µg del éster TAG-NHS de Origen. Cincuenta microlitros del éster TAG-NHS de Origen se agregaron a una proporción de un quinto molar de la proteína de matriz. Después de una hora de incubación a 25°C, la reacción se apagó mediante la adición de 50 µl de glicina 2 M. El rutenio no incorporado y la glicina en exceso fueron removidos mediante diálisis en PBS, 0.05% de NaN3. Las concentraciones de proteína fueron determinadas utilizando Micro-BCA (Pierce, Rockford, IL) . La incorporación de Origen TAG fue evaluada a 455 nm (e = 13,7000 M"1 cm"1) . La vitronectina-Ru y el fibrinógeno-Ru fueron almacenados a -70°C hasta que fue necesario. Purificación del Receptor allbß3 de Fibrinógeno Plaquetario. Dos unidades de plaquetas caducadas se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y se centrifugaron a baja velocidad para eliminar las células sanguíneas rojas (RBCs) . Las plaquetas lavadas fueron lisadas en Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 140 mM, CaCl3 2 mM, pefabloc 1 mM, 3% de octilglucósido con agitación suave por dos horas a 4°C. El lisado fue centrifugado a 100,000 x g por 1 hora para concentrar el desecho celular insoluble. El sobrenadante resultante fue aplicado a una columna de lectina de lenteja (EY labs) y se lavó con el amortiguador de lisis que contenía 1% de octilgucósido (amortiguador de enlace) hasta que se alcanzó una línea base de UV estable. El allbß3 purificado fue eluido de la columna con el amortiguador de enlace que contenía 10% de dextrosa. El allbß3 purificado fue almacenado a -70°C hasta que fue necesario. Purificación de avß3 y avß5. Placentas congeladas fueron descongeladas toda la noche a 4°C, cortadas en secciones de 1 cm , y lavadas con Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, PMSF 1 mM, pH .75 (amortiguador A) . Las placentas fueron luego incubadas toda la noche en el amortiguador A con la adición de 3% (p/v) de octilglucósido. La proteína extraída fue separada del tejido completo mediante centrifugación. El extracto fue luego filtrado a 0.45 µm y se agregó NaN3 hasta una concentración final de 0.02%. la muestra fue luego cargada sobre una columna de afinidad anti-avß3 o anti-avß5, lavada con el amortiguador A más 1% (p/v) de octilglucósido y eluida con Gentle Elution Buffer® (Pierce) . Las fracciones que contenían avß3 y avß5 fueron intercambiadas en el amortiguador A más 1% de octilglucósido y se almacenaron a -70°C. avß3 y avß5 purificados fueron también adquiridos de Chemicon International Inc. Incorporación de avß3, avß5, o allbß3 sobre esferas paramagnéticas. Las esferas paramagnéticas avß3, avß5 o allbß3 fueron preparadas a partir de esferas Dynabeads® de 4.5 µ no recubiertas (Dynal® lake Success, NY) . La Dynabeads® no recubiertas fueron lavadas tres veces en solución salina amortiguada con fosfato, de pH 7.4 (PBS) y resuspendidas en Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM, y MnCl2 1 mM, pH 7.5 (Amortiguador A). El receptor avß3 purificado, avß5 (Chemicon) , o allbß3 fueron rápidamente diluidos en el amortiguador A y agregados a la Dynabeads® no recubiertas, a una proporción de 50 µg de proteína a 107 esferas. La suspensión de esferas fue incubada con agitación toda la noche a 4°C. Las esferas fueron lavadas tres veces en el amortiguador A, 0.1% del albúmina sérica bovina (BSA) y el amortiguador A resuspendido + 3% de BSA. Después de tres horas a 4°C las esferas fueron lavadas tres veces en amortiguador A, 1% de BSA, 0.05% de azida y almacenadas a -70°C hasta que fue necesario. Ensayo de Enlace en Fase Sólida. Todos los compuestos fueron disueltos y diluidos en serie en DMSO al 100% antes de una dilución final en el amortiguador de ensayo (Tris-HCl 50 mM, ph. 75., NaCl 100 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, MnCl2 1 mM, 1% de BSA, 0.05% de Tween-20) que contenía vitronectina-Ru o fibrinógeno-Ru y esferas paramagnéticas recubiertas con integrina, apropiadas. La mezcla de ensayo fue incubada a 25°C por dos horas con agitación, y subsecuentemente leída sobre un Origen Analyzer® (Igen Inc. Gaithersburg, MD.) El enlace no específico fue determinado utilizando vitronectina 1 µM, fibrinógeno 1 µM o EDTA 5 mM. Los datos fueron preparados utilizando un ajuste de cuatro parámetros mediante el algoritmo de Levenburg Marquardt (Xlfit® ID Business Solutions) . Donde los valores Ki fueron calculados utilizando la ecuación de Cheng y Prusoff (1973) Biochem. Pharmacology 22: 3099-3108.

Ejemplo 2 Preparación de fusiones laminina-Fc. Los siguientes péptidos relacionados a la laminina fueron fusionados al extremo N de la porción Fc de la molécula IgGl humana mediante PCR.

MYIGSRGGGGG (SEQ ID No. 115) MYIGSRYIGSRYIGSR (SEQ ID No. 116) MYIGSRYIGSRYIGSRYIGSRYIGSR (SEQ ID No. 117) MIPCNNKGAHSVGLMWWMLARGGGGG (SEQ ID No. 118) MYIGSRREDVEILDVPDSGRGGGGG (SEQ ID No. 119) MRGDRGDYIGSRRGDGGGGG (SEQ ID No. 120) Para estas fusiones, se utilizó una fusión de Fc-péptido no relacionada (THF gamma 2-FC) como la plantilla de PCR (Amgen cepa #4490, descrita en WO 00/24782, publicada el 4 de Mayo del 2000) . Los oligonucleótidos en sentido dados más adelante fueron cada uno utilizados en una reacción de PCR estándar con el oligonucleótido 1200-54 antisentido, para producir una fusión intraestructural del péptido deseado a Fc . 2453-79 GAA TAA CAT ATG TAC ATC GGT TCT CGT GGT GGA GGC GCT GGG GAC AAA (SEQ ID No . 121) 2554-70 GAA TAA CAT ATG TAC ATC GGT TCT CGT TAT ATT GGC TCC CGC TAC ATT GGT AGC CGT GAC AAA ACT CAC ACA TGT CCA CCT (SEQ ID No. 122) 2554-71 GAA TAA CAT ATG TAC ATC GGT TCT CGT TAT ATT GGC TCC CGC TAC ATT GGT AGC CGT TAT ATC GGC TCT CGC TAT ATT GGT AGC CGC GAC AAA ACT CAC ACA TGT CCA CCT (SEQ ID No. 123) 2719-06 GAA TAA CAT ATG ATC CCG TGC AAC AAC AAA GGT GCT CAC TCT GTT GGT CTG ATG TGG TGG ATG CTG GCT CGT GGT GGA GGC GGT GGG GAC AAA (SEQ ID No. 124) 2719-07 GAA TAA CAT ATG TAC ATC GGT TCT CGT CGT GAA GAC GTT GAA ATC CTG GAC GTT CCG GAC TCT GGT CGT GGT GGA GGC GGT GGG GAC AAA (SEQ ID No . 125) 2719-08 GAA TAA CAT ATG CGT GGT GAC CGT GGT GAC TAC ATC GGT TCT CGT CGT GGT GAC GGT GGA GGC GGT GGG GAC AAA (SEQ ID No. 126) 1200-54 GTT ATT GCT CAG CGG TGG CA (SEQ ID No. 127) Cada producto génico de PCR (gen de fusión de longitud completa) fue digerido con la endonucleasas de restricción NedI y BamHl, y luego ligado dentro del vector pAMG21 (descrito anteriormente) y transformado dentro de E. coli cepa 2596 competente (GM221, descrito en la presente) mediante electroporación. Los clones fueron seleccionados para la habilidad de producir el producto proteico recombinante y para poseer la fusión génica que tiene la secuencia nucleotídica correcta. La expresión y la purificación de cada proteína de fusión fue llevada a cabo como se describe anteriormente. Ensayo de Actividad de laminina: Apoptósis de células de fibrosacroma humano HT-1080. Las células HT-1080 provenientes de un fibrosarcoma humano son cultivadas en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 µg/ml de estreptomicina y 100 unidades/ml de penicilina. El cultivo es iniciado a una densidad de 5 x 104 células por placa. Los Fc-péptidos (Fc-YIGSR, Fc- (YIGSR) 2, YIGRS-Fc o (YIGSR) 2-Fc) a diversas concentraciones son agregados a cada placa, y después de 16 horas las células son cosechadas para la evaluación de la apoptosis con solución de cristal violeta a una absorbancia de 560 nm. El análisis de fragmentación de ADN es también llevado a cabo para evaluar el grado de apoptosis en un gel de agarosa al 1.5% y visualizado mediante tinción con bromuro de etidio.

Ejemplo 3 Preparación de Peptlcuerpos de Laminina Adicionales Dos péptidos de laminina adicionales, (YIGSR) 3 y (YIGSR) 5 de la Tabla 6 en la presente, fueron fusionados a la IgGl humana Esos péptidos de fusión fueron designados como laminina 3 ( (YIGRS) 3-Fc) y laminina 5 ( (YIGSR) 5-Fc) . Las fusiones péptido-Fc purificadas fueron examinadas para su efecto sobre el desarrollo de las células HT1080 como se describe en el Ejemplo 1. El péptido sintético (YIGSR) 3 dio una IC100 de 2.9 µM, mientras que la IC100 de (YIGSR) 3-Fc fue de 55 mM. Se observó un aumento de 50 veces después de que éste se fusionó a la IgGl humana. Ya que fue observada cierta proteólisis en la laminina 5, la IC100 de la laminina 5 no pudo ser evaluada de manera precisa. Toda la degradación ocurrió después del residuo de arginina (en la unión entre las repeticiones YIGSR) . Con el fin de eliminar la degradación, fueron diseñados y sintetizados varios péptidos diferentes. Algunos de ellos mostraron la inhibición del desarrollo de las células HT1080. Dos de los mejores péptidos fueron REDVEILDVYIGSRPDSGR (SEQ ID No. 136) y YIGSRREDVEILDVPDSGR (SEQ ID No. 137) .

Ejemplo 4 Evaluación del despejo plasmático El péptico sintético y los Fc-péptidos son yodados con 15I mediante el método Iodogen. El efecto inhibitorio de las moléculas yodadas sobre las células HT-1080 no es distinguible de aquellos de las moléculas no yodadas. Ratones C57BL/6 son inyectados intravenosamente y subcutáneamente con el péptido yodado/Fc-péptidos y la sangre es recolectada a diversos puntos de tiempo. La radioactividad sanguínea es medida con un contador ? y los perfiles farmacocinéticos de las moléculas inyectadas son evaluados . Ejemplo 5 Ensayo de metástasis pulmonar experimental Células de melanoma B16-BL6 altamente metastásicas e invasoras, son suspendidas en el medio MEM que contiene 0.1% de BASA (1.5 x 104 células/ml). Los ratones C57BL/6 son intravenosamente inoculados con 0.1 ml de la solución celular. Después de la inoculación del tumor, son inyectadas intravenosamente diversas concentraciones de los péptidos y de diversos Fc-péptidos. Los ratones son sacrificados dos a tres semanas después de la inoculación del tumor y se evalúan las colonias sobre la superficie pulmonar. Al haber sido descrita completamente ahora la invención, será aparente para una persona de experiencia ordinaria en la técnica que pueden ser realizados en ésta muchos cambios y modificaciones, sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención como se describe en la presente. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> AMGEN INC. <120> ANTAGONISTAS DE INTEGRINA/ADHESION <130> A-688A <140> PCT/US 01/13069 <141> 2001-04-23 <150> US 60/198,919 <151> 2000-04-21 <150> US 60/201,394 <151> 2000-05-03 <160> 135 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 684 <212> ADN <213> Homo sapiens <22ß> <221> CDS <222> (1) .. (684) <223> <400> 1 atg gac aaa act cae acá tgt cea ect tgt cea gct ceg gaa etc ctg 48 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 gg gga ceg tea gtc ttc etc ttc ccc cea aaa ccc aag gac acc etc 96 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 atg ate tec cgg acc ect gag gtc acá tgc gtg gtg gtg gac gtg age 144 Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 cae gaa gac ect gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 192 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 gtg cat aat gcc aag acá aag ceg cgg gag gag cag tac aac age acg 240 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 tac cgt gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg cae cag gac tgg ctg aat 288 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tec aac aaa gcc etc cea gcc ccc 336 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 ate gag aaa acc ate tec aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cea cag 384 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 gtg tac acc ctg ccc cea tec cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc 432 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg 480 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 145 150 155 160 gag tgg gag age aat ggg cag ceg gag aac aac tac aag acc acg ect 528 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 ccc gtg ctg gac tec gac ggc tec ttc ttc etc tac age aag etc acc 576 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tec gtg 624 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 atg cat gag gct ctg cae aac cae tac acg cag aag age etc tec ctg 672 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tet ceg ggt aaa 684 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 2 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tvr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ligador preferido <400> 3 Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ligador preferido <400> 4 Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ligador Preferido <400> 5 Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Secuecia Artificial <220> <223> Ligador preferido <400> 6 Gly Pro Asn Gly Gly 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido de Laminina <400> 7 Tyr He Gly Ser Arg 1 5 <210> 8 <211> 49 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido de Equistatina <400> 8 Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu 1 5 10 15 Gly Thr He Cys Lys Arg Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala 35 40 45 Thr <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido derivado de RGD, NGR <220> <221> Característica miscelánea <222> (2, 5 and) .. (7) <223> Xaa es cualquier aminoácido <400> 9 Arg Xaa Glu Thr Xaa Trp Xaa 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido derivado de RGD, NGR <220> <221> Característica miscelánea <222> (2, 5 and) .. (7) <223> Xaa es cualquier aminoácido <400> 10 Arg Xaa Glu Thr Xaa Trp Xaa 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido derivado de RGD, NGR <220> <221> Característica miscelánea <222> (2, 3, 7 and) .. (8) <223> Xaa es cualquier aainoacido <400> 11 Cys Xaa Xaa Axg Leu Asp Xaa Xaa Cys 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido derivado de RGD, NGR <220> <221> Caracte ís ica miscelánea <222> (2 y).. (3) <223> Xaa es cualquier aminoácido <400> 12 Cys Xaa Xaa Arg Gly Asp Cys 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> '<223> Péptido derivado de RGD, NGR <220> <221> Característica miscelánea <222> (1, 2, 3, 7, 8 y) .. (9) <223> Xaa es cualquier aminoácido <400> 13 Xaa Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido derivado de RGD, NGR <220> <221> Característica miscelánea <222> (2 ) .. (8) <223> Xaa es cualquier aminoácido <400> 14 Cys Xaa Cys Arg Gly Asp Cys Xaa Cys 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido derivado de RGD, NGR <220> <221> Característica miscelánea <222> (1, 2, 7 ) .. (8) <223> Xaa es cualquier aminoácido <220> <221> Característica miscelánea <222> (5).. (5) <223> Xaa se selecciona de glicina y leucina <220> <221> Característica miscelánea <222> (6) .. (6) <223> Xaa se seleccina de triptofan y leucina <400> 15 Xaa Xaa Asp Asp Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido derivado de RGD, NGR <220> <221> Característica miscelánea <222> (1, 2, 8, 9 ) .. (10) <223> Xaa es cualquier aminoácido <220> <221> Característica miscelánea , <222> (3).. (3) <223> Xaa se selecciona de triptofan y prolina <220> <221> Característica miscelánea <222> (6).. (6) <223> Xaa se selecciona de glicina y leucina <220> <221> Carcatepstica miscelánea <222> (7) .. (7) <223> Xaa se selecciona de triptofan y leucina <400> 16 Xaa Xaa Xaa Asp Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido de enlace a la vinculina/antagonista de selectina <220> <221> Característica miscelánea <222> (3, 5, 6, 13 ) .. (15) <223> Xaa es cualquier residuo de aminoácido que ocurre naturalmente <400> 17 Arg Lys Xaa Asn Xaa Xaa Trp Thr Trp Val Gly Thr Xaa Lys Xaa Leu 1 5 10 15 Thr Glu Glu <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido de enlace a la vinculina/antagonista de selectina <220> <221> Carácter is ia miscelánea <222> (2, 3, 4, 7 ) .. (15) <223> Xaa es cualquier residuo de aminoácido que ocurre naturalmente <400> 18 Cys Xaa Xaa Xaa Tyr Thr Xaa Leu Val Ala He Gln Asn Lys Xaa Glu 1 5 10 15 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido de enlace a la vinculina/antagoista de selectina <220> <221> Característica miscelánea <222> (3, 4, 5, 6, 8, 13, 15 ) .. (18) <223> Xaa es cualquier residuo de aminacido que ocurre naturalmente <400> 19 Arg Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Trp Val Gly Thr Xaa Lys Xaa Leu 1 5 10 15 Thr Xaa Glu <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido de enlace a la vinculina/atagoista de selectina <220> <221> Característica miscelánea <222> (2, 5, 6, 7, 12, 13 ) .. (14) <223> Xaa es cualquier residuo de aminoácido que ocurre naturalmente <400> 20 Ala Xaa Asn Trp Xaa Xaa Xaa Glu Pro Asn Asn Xaa Xaa Xaa Glu Asp 1 5 10 15 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido de enlace a la vinculina/antagonista de selectina <220> <221> Característica miscelánea <222> (1, 3, 6, 9, 12 ) .. (13) <223> Xaa es cualquier residuo de aminacido que ocurre naturalmente <400> 21 Xaa Lys Xaa Lys Thr Xaa Glu Ala Xaa Asn Trp Xaa Xaa 1 5 10 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 22 Cys Leu Cys Arg Gly Asp Cys He Cys 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 23 Cys Trp Asp Asp Gly Trp Leu Cys 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagnista de Integrina <400> 24 Cys Trp Asp Asp Leu Trp Trp Leu Cys 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 25 Cys Trp Asp Asp Gly Leu Met Cys 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 26 Cys Trp Asp Asp Gly Trp Met Cys 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 27 Cys Ser Trp Asp Asp Gly Trp Leu Cys 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 28 Cys Pro Asp Asp Leu Trp Trp Leu Cys 1 5 <210> 29 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 29 Asn Gly Arg 1 <210> 30 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 30 Gly Ser Leu 1 <210> 31 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 31 Arg Gly Asp 1 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 32 Cys Gly Arg Glu Cys Pro Arg Leu Cys Gln Ser Ser Cys 1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 33 Cys Asn Gly Arg Cys Val Ser Gly Cys Ala Gly Arg Cys 1 5 10 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 34 Cys Leu Ser Gly Ser Leu Ser Cys 1 5 <210> 35 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 35 Gly Ser Leu 1 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 36 Asn Gly Arg Ala His Ala 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 37 Cys Asn Gly Arg Cys 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 38 Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 39 Cys Gly Ser Leu Val Arg Cys 1 5 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido Aitagcnista de Integrina <220> <221> Característica miscelánea <222> (3 ) .. (4) <223> Xaa es cualquier residuo de aminoácido <400> 40 Asp Leu Xaa Xaa Leu 1 5 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido Antagonista de Integrina <400> 41 Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Thr Leu 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido Antagonista de Integrina <400> 42 Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr Tyr 1 5 10 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 43 Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Thr 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 44 Arg Thr Asp Leu Asp Ser Leu Arg 1 5 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 45 Gly Asp Leu Asp Leu Leu Lys Leu Arg Leu Thr Leu 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 46 Gly Asp Leu His Ser Leu Arg Gln Leu Leu Ser Arg 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 47 Arg Asp Asp Leu His Met Leu Arg Leu Gln Leu Trp 1 5 10 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 48 Ser Ser Asp Leu His Ala Leu Lys Lys Arg Tyr Gly 1 5 10 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 49 Arg Gly Asp Leu Lys Gln Leu Ser Glu Leu Thr Trp 1 5 10 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <220> <221> Característica miscelánea <222> (2 ) .. (3) <223> Xaa es cualquier residuo de aminoácido <400> 50 Cys Xaa Xaa Arg Gly Asp Cys 1 5 <210> 51 <211> 27 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 51 Ser Thr Gly Gly Phe Asp Asp Val Tyr Asp Trp Ala Arg Gly Val Ser 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Thr Thr Leu Val Ala Thr Arg 20 25 <210> 52 <211> 27 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido Antagonista de Integrina <400> 52 Ser Thr Gly Gly Phe Asp Asp Val Tyr Asp Trp Ala Arg Arg Val Ser 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Thr Thr Leu Val Ala Thr Arg 20 25 <210> 53 <211> 30 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 53 Ser Arg Gly Val Asn Phe Ser Glu Trp Leu Tyr Asp Met Ser Ala Ala 1 5 10 15 Met Lys Glu Ala Ser Asn Val Phe Pro Ser Arg Arg Ser Arg 20 25 30 <210> 54 <211> 30 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 54 Ser Ser Gln Asn Trp Asp Met Glu Ala Gly Val Glu Asp Leu Thr Ala 1 5 10 15 Ala Met Leu Gly Leu Leu Ser Thr He His Ser Ser Ser Arg 20 25 30 <210> 55 <211> 31 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 55 Ser Ser Pro Ser Leu Tyr Thr Gln Phe Leu Val Asn Tyr Glu Ser Ala 1 5 10 15 Ala Thr Arg He Gln Asp Leu Leu He Ala Ser Arg Pro Ser Arg 20 25 30 <210> 56 <211> 31 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 56 Ser Ser Thr Gly Trp Val Asp Leu Leu Gly Ala Leu Gln Arg Ala Ala 1 5 10 15 Asp Ala Thr Arg Thr Ser He Pro Pro Ser Leu Gln Asn Ser Arg 20 25 30 <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrinc <400> 57 Asp Val Tyr Thr Lys Lys Glu Leu He Glu Cys Ala Arg Arg "Val Ser 5 10 15 Glu Lys <210> 58 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> ' <223> Peptido Antagonista de Integrina <220> <221> Caracter stica miscelánea <222> (5)..(5) <223> Xaa es cualquier residuo de aminacido <400> 58 Arg Gly Asp Gly Xaa 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <220> <221> Caracterís ica miscelánea <222> (6).. (6) <223> Xaa es cualquier residuo de aminoácido <400> 59 Cys Arg Gly Asp Gly Xaa Cys 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido Antagonista de Integrina <400> 60 Cys Ala Arg Arg Leu Asp Ala Pro Cys 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 61 Cys Pro Ser Arg Leu Asp Ser Pro Cys 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 62 Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido Antagonista de Integrina <400> 63 Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Leu Cys 1 5 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Integrina <400> 64 Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Ser Ala Pro Pro Val 1 5 10 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de selectina <400> 65 Asp He Thr Trp Asp Gln Leu Trp Asp Leu Met Lys 1 5 10 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 66 Asp He Thr Trp Asp Glu Leu Trp Lys He Met Asn 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> pép.tido Antagonista de Selectina <400> 67 •* Asp Tyr Thr Trp Phe Glu Leu Trp Asp Met Met Gln 1 5 10 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido Antagonista de Selectina <400> 68 Gln He Thr Trp Ala Gln Leu Trp Asn Met Met Lys 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 69 Asp Met Thr Trp His Asp Leu Trp Thr Leu Met Ser 1 5 10 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 70 Asp Tyr Ser Trp His Asp Leu Trp Glu Met Met Ser 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Petido Antagonista de Selectina <400> 71 Glu He Thr Trp Asp Gln Leu Trp Glu Val Met Asn 1 5 10 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 72 His Val Ser Trp Glu Gln Leu Trp Asp He Met Asn 1 5 10 <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 73 His He Thr Trp Asp Gln Leu Trp Arg He Met Thr 1 5 10 <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 74 Arg Asn Met Ser Trp Leu Glu Leu Trp Glu His Met Lys 1 5 10 <210> 75 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 75 Ala Glu Trp Thr Trp Asp Gln Leu Trp His Val Met Asn Pro" Ala Glu 1 5 10 15 Ser Gln <210> 76 <211> 14 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido Antagonista de Selectina <400> 76 His Arg Ala Glu Trp Leu Ala Leu Trp Glu Gln Met Ser Pro 1 5 10 <210> 77 <211> 14 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 77 Lys Lys Glu Asp Trp Leu Ala Leu Trp Arg He Met Ser Val 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 78 He Thr Trp Asp Gln Leu Trp Asp Leu Met Lys 1 5 10 <210> 79 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 79 Asp He Thr Trp Asp Gln Leu Trp Asp Leu Met Lys 1 5 10 <210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 80 Asp He Thr Trp Asp Gln Leu Trp Asp Leu Met Lys 1 5 10 <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 81 Asp He Thr Trp Asp Gln Leu Trp Asp Leu Met Lys 1 5 10 <210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido Antagonista de Selectina <400> 82 Cys Gln Asn Arg Tyr Thr Asp Leu Val Ala He Gln Asn Lys Asn Glu 1 5 10 15 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Secuencia - Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 83 Ala Glu Asn Trp Ala Asp Asn Glu Pro Asn Asn Lys Arg Asn Asn Glu 1 5 10 15 Asp <210> 84 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <400> 84 Arg Lys Asn Asn Lys Thr Trp Thr Trp Val Gly Thr Lys Lys Ala Leu 1 5 10 15 Thr Asn Glu <210> 85 <211> 13 <212> PRT ' <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido Antagonista de Selectina <400> 85 Lys Lys Ala Leu Thr Asn Glu Ala Glu Asn Trp Ala Asp 1 5 10 <210> 86 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagoista de Selectina <220> <221> Característica miscelánea <222> (3 and) .. (15) <223> Xaa es cualquier residuo de aminoácido <400> 86 Cys Gln Xaa Arg Tyr Thr Asp Leu Val Ala He Gln Asn Lys Xaa Glu 1 5 10 15 <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido Antagonista de Selectina <220> <221> Característica miscelánea <222> (13 and) .. (15) <223> Xaa es cualquier residuo de aminacido <40Ó> 87 Ala Glu Asn Trp Ala Asp Gly Glu Pro Asn Asn Lys Xaa Asn Xaa Glu 1 5 10 15 Asp <210> 88 <211> 30 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido de enlace a la Vinculina <400> 88 Ser Ser Gln Asn Trp Asp Met Glu Ala Gly Val Glu Asp Leu Thr Ala 1 5 10 15 Ala Met Leu Gly Leu Leu Ser Thr He His Ser Ser Ser Arg 20 25 30 <210> 89 <211> 31 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido de enlace a la Vinculina <400> 89 Ser Ser Pro Ser Leu Tyr Thr Gln Phe Leu Val Asn Tyr Glu "Ser Ala 1 5 10 15 Ala Thr Arg He Gln Asp Leu Leu He Ala Ser Arg Pro Ser Arg 20 25 30 <210> 90 <211> 31 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido de enlace a la Vinculina <400> 90 Ser Ser Thr Gly Trp Val Asp Leu Leu Gly Ala Leu Gln Arg Ala Ala 1 5 10 15 Asp Ala Thr Arg Thr Ser He Pro Pro Ser Leu Gln Asn Ser Arg 20 - 25 30 <210> 91 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido de enlace a la Vinculina <400> 91 Asp Val Tyr Thr Lys Lys Glu Leu He Glu Cys Ala Arg Arg Val Ser 1 5 10 15 Glu Lys <210> 92 <211> 27 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido de enlace a la Vinculina <400> 92 Ser Thr Gly Gly Phe Asp Asp Val Tyr Asp Trp Ala Arg Gly Val Ser 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Thr Thr Leu Val Ala Thr Arg 20 25 <210> 93 <211> 27 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido de enlace a la Vinculina <400> 93 Ser Thr Gly Gly Phe Asp Asp Val Tyr Asp Trp Ala Arg Arg Val Ser 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Thr Thr Leu Val Ala Thr Arg 20 25 <210> 94 <211> 30 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido de enlace a la Vinculina <400> 94 Ser Arg Gly Val Asn Phe Ser Glu Trp Leu Tyr Asp Met Ser Ala Ala 1 5 10 15 Met Lys Glu Ala Ser Asn Val Phe Pro Ser Arg Arg Ser Arg 20 25 30 <210> 95 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido relacionado a la Laminina <400> 95 Arg Glu Asp Val Glu He Leu Asp Val Tyr He Gly Ser Arg Pro Asp 1 5 10 15 Ser Gly Arg <210> 96 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido relacionado a la Laminina <400> 96 Tyr He Gly Ser Arg Arg Glu Asp Val Glu He Leu Asp Val Pro Asp 1 5 10 15 Ser Gly Arg <210> 97 <211> 44 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> utilizado para formar la plantilla de Equistatina para PCR <400> 97 ggggggcata tggaatgtga atctggtcca tgctgcagaa actg - 44 <210> 98 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> ' *- <223> Utilizado para formar la plantilla de Equistatina para PCR <400> 98 taagttcttg aaggaaggta ccatctgtaa gagagctaga ggtg 44 <210> 99 <211> 44 <212> ADN 213> Secuencia Artificial <220> <223> Utilizado para formar la platilla de Equistatina para PCR <400> 99 acgacatgga cgactactgt aacggtaaga cctgtgactg cccg 44 <210> 100 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Utilizado para frmar la plantilla de Equistatina para PCR <400> 100 agaaacccac acaagggtcc agctacttaa tggatccgcg gccgcccagc t 51 <210> 101 <211> <212> ADN :213> Secuencia Artificial <220> <223> Utilizado para formar la plantilla de Equistatina para PCR <400> 101 ttcaagaact tacagtttct gcag 24 <210> 102 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Utilizado para formar la plantilla de Equistatina para PCR <400> 102 cgtccatgtc gtcacctcta gctc 24 <210> 103 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Utilizado para formar la plantilla de Equistatina para PCR <400> 103 gtgtgggttt ctcgggcagt caca 24 <210> 104 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de PCR <400> 104 ccgggtaaag gtggaggtgg tggtgaatgt gaatctggtc catgctgc 48 <210> 105 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de PCR <400> 105 ccgggtaaag gtggaggtgg tggtgaatgt gaatctggtc catgctgc 48 <210> 106 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de PCR <400> 106 aacataagta cctgtaggat cg " 22 <210> 107 <211> 49 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador de PCR <400> 107 gcagcatgga ccagattcac attcaccacc acctccacct ttacccgga 49 <210> 108 <211> 859 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Fc-peptido de Equistatina <220> <221> CDS <222> (4) .. (849) <223> <220> <221> Característica miscelánea <222> (1)..(1) <223> Sitio Ndel <220> <221> Característica miscelánea <222> (854).. (854) <223> Sitio Ba Hl <400> 108 cat atg gac aaa' act cae acá tgt cea ect tgt cea gct ceg gaa etc 48 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 1 5 10 15 ctg ggg gga ceg tea gtc ttc etc ttc ccc cea aaa ccc aag gac acc 96 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 etc atg ate tec cgg acc ect gag gtc acá tgc gtg gtg gtg gac gtg 144 Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 age cae gaa gac ect gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 192 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 gag gtg cat aat gcc aag acá aag ceg cgg gag gag cag tac aac age 240 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 65 70 75 acg tac cgt gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg cae cag gac tgg ctg 288 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 80 85 90 95 aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tec aac aaa gcc etc cea gcc 336 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 100 105 110 ccc ate gag aaa acc ate tec aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cea 384 Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 'Glu Pro 115 120 125 cag gtg tac acc ctg ccc cea tec cgg gat gag ctg acc aag aac cag 432 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 130 135 140 gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gcc 480 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala 145 150 155 gtg gag tgg gag age aat ggg cag ceg gag aac aac tac aag acc acg 528 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 160 165 170 175 ect ccc gtg ctg gac tec gac ggc tec ttc ttc etc tac age aag etc 576 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 180 185 190 acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tec 624 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 gtg atg cat gag gct ctg cae aac cae tac acg cag aag age etc tec 672 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 ctg tet ceg ggt aaa ggt gga ggt ggt ggt gaa tgt gaa tet ggt cea 720 Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Glu Cys Glu Ser Gly Pro 225 230 235 tgc tgc aga aac tgt aag ttc ttg aag gaa ggt acc ate tgt aag aga 768 Cys Cys Arg* Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu Gly Thr He Cys Lys Arg 240 245 250 255 gct aga ggt gac gac atg gac gac tac tgt aac ggt aag acc tgt gac 816 Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Lys Thr Cys Asp 260 265 270 tgc ceg aga aac cea cae aag ggt cea gct act taatggatcc 859 Cys Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala Thr 275 280 <210> 109 <211> 282 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Fc- péptido de Equistatina <220> <221> Característica miscelánea <222> ( 1 ) . . ( 1 ) <223> S i ti o Nde l <220> <221> Característica miscelánea <222> (854).. (854) <223> sitio BamHl <400> 109 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 ' 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu "Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Glu Cys Glu Ser Gly Pro Cys 225 230 235 240 Cys Arg Asn Cys Lys Phe Leu Lys Glu Gly Thr He Cys Lys Arg Ala 245 250 255 Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Lys Thr Cys Asp Cys 260 265 270 Pro Arg Asn Pro His Lys Gly Pro Ala Thr 275 280 <210> 110 <211> 140 <212> ADN Secuencia Artificial <220> <223> pAMG21 <220> <221> Característica miscelánea <222> (1)..(1) <223> Sitio AatlI <220> <221> Característica miscelánea <222> (140).. (140) <223> Sitio clal <400> 110 ctaattccgc tctcacctac caaacaatgc ccccctgcaa aaaataaatt cataaaaaaa 60 catacagata accatctgcg gtgataaatt atctctggcg gtgttgacat aaataccact 120 ggcggtgata ctgagcacat 140 <210> 111 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> pAMG21 <220> <221> Característica miscelánea <222> (1) .. (1) <223> Sitio Clal <220> <221> Característica miscelánea <222> (55) .. (55) <223> Sitio Kpnl <400> 111 cgatttgatt ctagaaggag gaataacata tggttaacgc gttggaatte ggtac 55 <210> 112 <211> 1546 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> pAMG21 <220> <221> Característica miscelánea <222> (1) .. (1) <223> Extremo pegajoso de Aatl <220> <221> Cara cte r í s t i c a mi s c e l á ne a <222> ( 1546 ) . . ( 1546 ) <223> Extremo pegajoso de Sac l <400> 112 gcgtaacgta tgcatggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa 60 cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct 120 ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga 180 gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc 240 ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actcttttgt ttatttttct aaatacattc 300 aaatatggac gtcgtactta acttttaaag tatgggcaat caattgctcc tgttaaaatt 360 gctttagaaa tactttggca gcggtttgtt gtattgagtt tcatttgcgc attggttaaa 420 tggaaagtga ccgtgcgctt actacagcct aatatttttg aaatatccca agagcttttt 480 ccttcgcatg cccacgctaa acattctttt tctcttttgg ttaaatcgtt gtttgattta 540 ttatttgcta tatttatttt tcgataatta tcaactagag aaggaacaat taatggtatg 600 ttcatacacg catgtaaaaa taaactatct atatagttgt ctttctctga atgtgcaaaa 660 ctaagcattc cgaagccatt attagcagta tgaataggga aactaaaccc agtgataaga 720 cctgatgatt tcgcttcttt aattacattt ggagattttt tatttacagc attgttttca 780 aatatattcc aattaatcgg tgaatgattg gagttagaat aatctactat aggatcatat 840 tttattaaat tagcgtcatc ataatattgc ctccattttt tagggtaatt atccagaatt 900 gaaatatcag atttaaccat agaatgagga taaatgatcg cgagtaaata atattcacaa 960 tgtaccattt tagtcatatc agataagcat tgattaatat cattattgct tctacaggct 1020 ttaattttat taattattct gtaagtgtcg tcggcattta tgtctttcat acccatctct 1080 ttatccttac ctattgtttg tcgcaagttt tgcgtgttat atatcattaa aacggtaata 1140 gattgacatt tgattctaat aaattggatt tttgtcacac tattatatcg cttgaaatac 1200 aattgtttaa cataagtacc tgtaggatcg tacaggttta cgcaagaaaa tggtttgtta 1260 tagtcgatta atcgatttga ttctagattt gttttaacta attaaaggag gaataacata 1320 tggttaacgc gttggaatte gagetcacta gtgtcgacct gcagggtacc atggaagcttí 1380 actcgaggat ccgcggaaag. aagaagaaga agaagaaage ccgaaaggaa gctgagttgg 1440 ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga 1500 ggggtttttt gctgaaagga ggaaccgctc ttcacgctct teaege 1546 <210> 113 <211> 872 <212> ADN <213> S e cuenc i a Art i f i ci al <220> <223> GM221 <400> 113 ttattttcgt gcggccgcac cattatcacc gccagaggta aactagtcaa cacgcacggt 60 gttagatatt tatcccttgc ggtgatagat tgagcacatc gatttgattc tagaaggagg 120 gataatatat gagcacaaaa aagaaaccat taacacaaga gcagcttgag gacgcacgtc 180 gccttaaagc aatttatgaa aaaaagaaaa atgaaettgg cttatcccag gaatctgtcg 240 cagacaagat ggggatgggg cagtcaggcg ttggtgcttt atttaatggc atcaatgcat 300 taaatgctta taacgccgca ttgettacaa aaattetcaa agttagcgtt gaagaattta 360 gcccttcaat cgccagagaa tetaegagat gtatgaagcg gttagtatgc agccgtcact 420' tagaagtgag tatgagtacc ctgttttttc tcatgttcag gcagggatgt tctcacctaa 480 gettagaace tttaccaaag gtgatgcgga gagatgggta agcacaacca aaaaagccag 540 tgattctgca ttctggcttg aggttgaagg taattccatg accgcaccaa caggctccaa 600 gccaagcttt cctgacggaa tgttaattct cgttgaccct gagcaggctg ttgagccagg .660 tgatttctgc atagecagac ttgggggtga tgagtttacc ttcaagaaac tgatcaggga 720 tagcggtcag gtgtttttac aaccactaaa cccacagtac ccaatgatcc catgcaatga 780 gagttgttcc gttgtgggga aagttatcgc tagtcagtgg cctgaagaga cgtttggetg 840 atagactagt ggatecacta gtgtttctgc cc 872 <210> 114 <211> 1197 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> GM221 <400> 114 ggcggaaacc gacgtccatc gaatggtgca aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc 60 cggaagagag tcaattcagg gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag 120 agtatgccgg tgtctcttat cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt 180 ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtegaagegg cgatggcgga gctgaattac attcccaacc 240 gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt cgctcctgat tggcgttgee acctccagtc 300 tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg 360 gtgecagcgt ggtggtgteg atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg 420 tgcacaatct tctcgcgcaa cgcgtcagtg ggctgatcat taactatccg ctggatgacc 480 aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct 540 ctgaccagac acccatcaac agtattattt tctcccatga agacggtacg cgactgggcg 600 tggagcatct ggtcgcattg ggtcaccagc aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt 660 ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggctggct ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc 720 ageegatage ggaacgggaa ggcgactgga gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc 780 aaatgctgaa tgagggcatc gttcccactg cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc 840 tgggcgcaat gcgcgccatt accgagtccg ggctgcgcgt tggtgcggat atctcggtag 900 tgggatacga cgataccgaa gacagetcat gttatatece gccgttaacc accatcaaac 960 aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc 1020 aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg 1080 cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac 1140 gacaggtttc ccgactggaa agcggacagt aaggtaccat aggatccagg cacagga 1197 <210> 115 <211> 11 <212> PRT ' <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido relacionado a la Laminina <400> 115 Met Tyr He Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 116 <211> 16 <212> PRT <213> S e cuen c i a Art i f i c i a l <220> <223> péptido relacionado a la Laminina <400> 116 Met Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg 1 5 10 15 <210> 117 <211> 26 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido relacionado a la Laminina <400> 117- Met Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg 1 5 10 15 Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg 20 25 <210> 118 <211> 26 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido relacionado a la Laminina <400> 118 Met He Pro Cys Asn Asn Lys Gly Ala His Ser Val Gly Leu Met Trp 1 5 10 15 Trp Met Leu Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 <210> 119 <211> 25 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido relacionado a la Laminina <400> 119 Met Tyr He Gly Ser Arg Arg Glu Asp Val Glu He Leu Asp Val Pro 1 5 10 15 Asp Ser Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 <210> 120 <211> 20 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido relacionado a la Laminina <400> 120 Met Arg Gly Asp Arg Gly Asp Tyr He Gly Ser Arg Arg Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly 20 <210> 121 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Codifica para el peptido relacionado a la Laminina , para la reacción de PCR para producir la fusión intraestructural a Fc <400> 121 gaataacata tgtacatcgg ttctcgtggt ggaggcggtg gggacaaa 48 <210> 122 <211> 81 <212> ADN 91- Secuencia Artificial <220> <223> Codifica paraeel pgptido relacionado a la Laminina, para la reacción de PCR para producir la fusión intraestructural a Fc <400> 122 gaataacata tgtacatcgg ttctcgttat attggctccc gctacattgg tagccgtgac 60 aaaactcaca catgtccacc t 81 <210> 123 <211> 111 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Codifica para el peptido relacioado a la Laminina, para la reacción de PCR para producir la fusión intraestructural a Fc <400> 123 gaataacata tgtacatcgg ttctcgttat attggctccc gctacattgg tagccgttat 60 atcggctctc gctatattgg tagccgcgac aaaactcaca catgtccacc t 111 <210> 124 <211> 93 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Codifica para el peptido relacionado a la Laminina, para la reacción de PCR para producir la fusión intraestructural a Fc <400> 124 gaataacata tgatcccgtg caacaacaaa ggtgctcact ctgttggtct gatgtggtgg 60 atgctggctc gtggtggagg cggtggggac aaa 93 <210> 125 <211> 90 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Codifica para el peptido relacionado a la Laminina, para la reacción de PCR para producir la fusión intraestructural a Fc <400> 125 gaataacata tgtacatcgg ttctcgtcgt gaagacgttg aaatcctgga cgttccggac 60 tctggtcgtg gtggaggcgg tggggacaaa 90 <210> 126 <211> 75 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Codifica para el peptido relacionado a la Laminina, para la reacción de PCR para producir la fusión intraestructural a Fc <400> 126 gaataacata tgcgtggtga ccgtggtgac tacatcggtt ctcgtcgtgg tgacggtgga 60 ggcggtgggg acaaa 75 <210> 127 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Codifica para el peptido relacionado a la Laminina, para la reacción de PCR para producir la fusión intraestrutural a Fc <400> 127 gttattgctc agcggtggca 20 <210> 128 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido relacionado a la Laminina <400> 128 Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 129 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido relacinado a la Laminina <400> 129 Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg 5 10 15 <210> 130 <211> 20 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido relacionado a la Laminina <400> 130 Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg Tyr 1 5 10 15 He Gly Ser Arg 20 <210> 131 <211> 25 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido relacionado a la Laminina <400> 131 Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg Tyr 1 5 10 15 He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg 20 25 <210> 132 <211> 20 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido relacinado a la Laminina <400> 132 He Pro Cys Asn Asn Lys Gly Ala His Ser Val Gly Leu Met Trp Trp 1 5 10 15 Met Leu Ala Arg 20 <210> 133 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido relacionado a la Laminina <400> 133 Tyr He Gly Ser Arg Arg Glu Asp Val Glu He Leu Asp Val Pro Asp 1 5 10 15 Ser Gly Arg <210> 134 <211> 14 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Peptido relacionado a la Laminina <400> 134 Arg Gly Asp Arg Gly Asp Tyr He Gly Ser Arg Arg Gly Asp 1 5 10 <210> 135 <211> 25 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Pepticb relacionad a la Laminina <400> 135 Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg Tyr 1 5 10 15 He Gly Ser Arg Tyr He Gly Ser Arg 20 25

Claims (1)

1. 95 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una composición de interés, caracterizada porque comprende a. un péptido antagonista de la integrina/adhesión; y b. un vehiculo. 2. Una composición de la fórmula y múltimeros de la misma, caracterizada porque: F1 es un vehiculo (preferentemente un dominio Fc) ; X1 y X2 son cada uno independientemente seleccionados de - (L1 ) c-P1 , - (L1) c-P1- (L2)d-P2, - (L1) c-P1- (L2)d-P2-(L3)e-P3, y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4 P1, P2, P3 y P4 son cada uno independientemente secuencias de péptidos antagonistas de la integrina/adhesión; L1, L2, L3 y L4 son cada uno independientemente ligadores; y a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que al menos uno de a y b sea 1. 96 3. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene la fórmula X^F1 o Fx-X2. . La composición de materia de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque tiene la fórmula 5. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque tiene la fórmula F1 - (h1 ) c - p1 - (h2 ) d- p2 . 6. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque F1 es un dominio Fc. 7. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque F1 es un dominio Fc de IgG. 8. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque F1 es un dominio Fc de IgGl. 9. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque F1 comprende la SEQ ID No. 2. 10. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque X1 u X2 comprenden 97 una o más secuencias seleccionadas de la SEQ ID No. 7 a 21. 11. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la composición de materia comprende una o más secuencias seleccionadas de las SEQ ID No. 22 a 94. 12. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la composición de materia comprende una o más secuencias seleccionadas de las SEQ ID No.7 y 9 a 16. 13. La composición de materia de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la composición de materia comprende una o más secuencias seleccionadas de las Tablas 3, 4, 5 y 6 (SEQ ID Nos. 22 a 94, 128 a 137). 14. Un ADN, caracterizado porque codifica para una composición de materia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13. 15. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN de conformidad con la reivindicación 14. 16. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 15. 17. La célula de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la célula es una célula de E. coli. 18. Un proceso para la preparación de un 98 compuesto farmacológicamente activo, caracterizado el proceso porque comprende : a) la selección de al menos un péptido antagonista de la integrina/adhesión aleatorizada; y b) la preparación de un agente farmacológico que comprende al menos un dominio Fc covalentemente enlazado al menos a una secuencia de aminoácidos del péptido o péptidos seleccionados . 19. El proceso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el péptido se selecciona en un proceso que comprende una o más técnicas seleccionadas de una selección basada en levadura, diseño racional, análisis estructural de proteínas, selección de una biblioteca de despliegue de fago, una biblioteca de despliegue de E. coli, una biblioteca ribosomal, una biblioteca química de péptidos. 20. El proceso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la preparación del agente farmacológico es llevada a cabo mediante: a) la preparación de una construcción génica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el péptido seleccionado y una secuencia de ácido nucleico que codifica para un dominio Fc; y b) la expresión de la construcción génica. 21. El proceso de conformidad con la 99 reivindicación 18, caracterizado porque la construcción génica es expresada en una célula de E. coli. 22. El proceso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el dominio Fc es un dominio Fc de IgG. 23. El proceso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el dominio Fc es un dominio Fc de IgGI . 24. El proceso de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el vehículo comprende la secuencia de la SEQ ID No. 2. 25. Una composición de materia, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID Nos. 132 a 137. 100 a zco - PA RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la fusión de vehículos que extienden la vida media, preferentemente dominios FC, con secuencias peptídicas que actúan como antagonistas de las integrinas, las selectinas, las moléculas de adhesión celular o sus respectivos receptores. El enlace al vehículo incrementa la vida media del péptido. Que de otro modo podría ser rápidamente degradado in vivo. El péptido puede ser un péptido existente o un péptido seleccionado por despliegue de fagos, despliegue de E. coli , despliegue de ribosomas, selección de ARN/péptidos, selección quimicopeptídica, u otros métodos.