MXPA02009072A - Compuestos con actividad de 5-ht1a utiles para tratar trastornos de la retina exterior. - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones y metodos para tratar trastornos de la retina exterior con compuestos con actividad agonista de 5-HT1A.

Description

COMPUESTOS CON ACTIVIDAD PE S-HT^ ÚTILES PARA TRATAR TRASTORNOS DE LA RETINA EXTERIOR La presente invención se refiere a compuestos con actividad agonista de 5-HT-?A útiles para tratar trastornos de la retina exterior que resultan de condiciones o enfermedades degenerativas agudas o crónicas del ojo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es la causa principal de la ceguera en las personas de edad avanzada, con una incidencia de aproximadamente 20% en adultos de 65 años de edad, aumentando a 37% en individuos de 75 años o mayores. La AMD no exudativa está caracterizada por la acumulación de drusa y la atrofia de los fotorreceptores de bastones y conos en la retina exterior, el epitelio de pigmento retinal (RPE), la membrana de Bruch y la lámina coriocapilar; mientras que la AMD exudativa conduce a la neovascularización coloidal (Green y Enger, Ofthalmol, 100:1519-35, 1993; Green et al., Ofthalmol, 92:615-27, 1985; Green y Key, Trans Am Ophthalmol Soc, 75_180-254, 1977; Bressler et aL, Retina, 14:130-42, 1994; Schneider et al., Retina, 18:242-50, 1998; Green y Kuchle (1997). En: Yannuzzi, L.A., Flower, R.W., Slakter, J.S. (Eds.) Indocyanine green angiography. St. Louis: Mosby, p. 151-6). La retinitis pigmentosa (RP) representa un grupo de distrofias hereditarias caracterizadas por la degeneración de bastones con atrofia secundaria de los fotorreceptores de conos y el epitelio de pigmento subyacente. (Pruett, Trans Am Ophthalmol Soc, 81 :693-735, 1983; Heckenlively, Trans Am Ophthalmol Soc, 85:438-470, 1987; Pagon, Sur Ophthalmol, 33:137-177, 1988; Berson, Invest Ophthalmol Vis Sci, 34:1659-1676, 1993M Nickells y Zack, Ophthalmic Genet, 17:145-65, 1996). La patogénesis de las enfermedades degenerativas retínales, tal como AMD y RP es de facetas múltiples y puede ser provocada por factores ambientales en individuos normales y en aquellos que están predispuestos genéticamente. A la fecha, se ha correlacionado o clonado más de 100 genes que pueden estar asociados con varias degeneraciones retinales exteriores. La exposición a la luz es un factor ambiental que se ha identificado como factor contribuyente a la progresión de trastornos degenerativos retinales, tales como AMD (Young, Sur Ophthal, 32:252-269, 1988; Taylor, et al., Arch Ophthal, 110:99-104, 1992; Cruickshank, et al., Arch Ophthal, 111-514-518, 193). Se ha demostrado que el esfuerzo foto-oxidativo que conduce a daño por la luz a las células retinales es un modelo útil para estudiar las enfermedades degenerativas retinales por las siguientes razones: el daño es principalmente a los fotorreceptores y al epitelio de pigmento retinal (RPE) de la retina exterior, las mismas células que son afectadas en enfermedades heredodegenerativas (Noell et al., Invest Ophthal Vis Sci, 5, 450-472, 1966; Bressier et al., Sur Ophthal, 32, 375-413, 1988; Curcio et al., Invest Ophthal Vis Sci, 37, 1236-1249, 1996); la apoptosis es el mecanismo de muerte celular mediante el cual se pierden las células fotorreceptoras y de RPE y la AMD y la RP, a la vez que sigue un daño celular inducido foto-oxidativo (Ge-Zh¡ et al., Trans AM Ophthal Soc, 94,411-430, 1996; Abler et al., Res Commun Mol Pathol Pharmacol, 92, 177-189, 1996; Nickells y Zack, Ophthalmic Genet, 17:145-65, 1996); la luz ha estado implicada como factor de riesgo ambiental para la progresión de la AMD y la RP (Taylor, et al., Arch Ophthal, 110:99-104, 1992; Naash et al., Invest Ophthal Vis Sci, 37, 775-782, 1996); se ha demostrado también que las intervenciones terapéuticas que inhiben el daño foto-oxidativo son efectivas en modelos animales de enfermedad retinal heredodegenerativa (LaVail et al., Proc Nat Acad Sci, 89, 11249-11253, 1992; Fakforovich et al., Nature, 347, 83-86, 1990; Frasson et al., Nat. Med. 5, 1183-1187, 1990). Se han identificado varias y diferentes clases de compuestos en varios modelos animales que reducen al mínimo el daño foto-oxidativo retinal. Estas incluyen: antioxidantes, tales como ascorbato (Organisciak et al., Invest Ophthal Vis Sci, 26:1589-1598, 1985), dimetiltiourea (Organisciak et al., Invest Ophthal Vis Sci, 33:1599-1609, 1992; Lam et al., Arch Ophthal, 108:1751-1752, 1990), a-tocoferol (Kozaki et al., Nippon Ganka Gakkai Zasshi, 98:948-954, 1994) y ß-caroteno (Rapp et al., Cur Eye Res, 15:219-232, 1995); antagonistas de calcio, tales como flunarizina (Li et al., Exp Eye Res, 56:71-78, 1993; Edward et al., Arch Ophthal, 109. 554-622, 1992; Collier et al., Invest Ophthal Vis Sci, 36:S516); factores del crecimiento, tal como factor del crecimiento de fibroblasto básico, factor de nervio derivado del cerebro, factor neurotrófico ciliar e interleucina-1-ß (LaVail et al., Proc Nat Acad Sci, 89, 11249-11253, 1992); glucocorticoides, tales como metilprednisolona (Lam et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthal, 231 , 729-736, 1993) y dexametasona (Fu et al., Exp Eye Res 54, 583-594, 1992); quelatadores de hierro, tales como desferrioxamina (Li et al., Cur Eye Res, 2, 133-144, 1991); antagonistas de NMDA, tales como eliprodii y MK-801 (Collier et al., Investo Ophthal Vis Sci, 40: S159, 1999). Se han registrado o lanzando agonistas de 5-HTIA serotonérgicos (es decir, buspirona, ziprasidona, urapidil) para el tratamiento de ansiedad, hipertensión, esquizofrenia, psicosis o trastornos bipolares de depresión. Además, se ha demostrado que los agonistas de 5-HTIA son neuroprotectores en varios modelos animales y se están evaluando en la clínica para tratar la isquemia cerebral, trauma en la cabeza, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple y esclerosis lateral amitrófica. Se ha demostrado que los agonistas de 5-HTia, 8-OH-DPAT (8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)tetralin) e ipsapirona, evitan el daño neuronal excitotóxico inducido por NMDA en el núcleo basalis magnocelular de ratas (Oosterink et al., Eur J Pharmacol, 358:147-52, 1998), la dosificación con Bay-x-3702, redujo significativamente el daño isquémico en un modelo de hematoma subdérmico agudo de rata (Alessandri et al., Brain Res, 845:232-5, 1999), mientras que 8-OH-DPAT, Bay-x-3702, urapidil, gepirona y CM 57493 redujeron significativamente el volumen de infarto cortical en la rata (Bielenberg y Burkhardt, Stroke, 21(Suppl):IV161-3; Semkova et al., Eur J Pharmacol, 359-252-60, 1993; Peruche et al., J Neural Transm - Park Dis Dement Sect, 8:73-/3, 1994) y el ratón (Prehn et al., Eur J Pharmacol, 203:213-22, 1991 ; Prehn et al., Brain Res, 630:10-20, 1993) después de la oclusión de la arteria cerebral media. Además, se ha demostrado que el" tratamiento de ratas con SR 57746A, un potente agonista de 5-HT-IA, es neuroprotector después de isquemia global transitoria de 4 conductos, lesiones septohipocampales inducidas por sulfato de vincristina, neuropatía periférica inducida por acrilamida y aplastamiento del nervio ciático (Fournier et al., Nerosei, 55:629-41, 1993)) y ha demostrado que retarda la progresión de la degeneración de neuronas motoras en ratones de pmn (Fournier et al., Br J Pharmacol, 124:811-7, 1998) Se ha descrito esta clase de compuestos para el tratamiento de glaucoma (disminución y control de la IOP), véanse por ejemplo, WO 98/18458 (DeSantis, et al) y EP 0771563A2 (Mano, et al.), Osborne, et al. (Ophthalmologica, Vol. 210:308-314, 1996) enseñan que la 8-hidroxidipropilaminotetralina (8-OH-DPAT) (un agonista de 5HTIA) reduce la IOP en conejos. Wang, et al. (Current Eye Research, Vol. 16(8):769-775, agosto de 1997, e IVOS, Vol. 39(4), S488, marzo de 1998) exponen que 5-metilurapidilo, antagonista de a-iA y agonista de 5-HT?A disminuye la IOP en el mono, pero debido a su actividad receptora de aiA. También, se describen antagonistas de 5-HT-IA como útiles para el tratamiento del glaucoma (IOP elevada) (por ejemplo, WO 92/0338, McLees). Además, DeSai, et al. (WO 97/35579) y Macor, et al (U.S. 5,578,612) describen el uso de agonistas de 5-HT! y 5-HT?-s¡m¡?ar para el tratamiento de glaucoma (IOP elevada). Estos compuestos antimigraña son agonistas de 5-HTIB,D,E,F> por ejemplo, sumatriptan y naratriptan y compuestos relacionados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A y 1B muestran la conservación de la función de onda a y b en el ERG en ratas dosificadas sistémicamente con 8-OH-DPAT y expuestas a una lesión foto-oxidativa severa. La figura 2 muestra la protección de morfología retinal (fotorreceptores y RPE) en ratas dosificadas sistémicamente con 8-OH-DPAT y expuestas a una lesión foto-oxidativa severa. La figura 3 muestra la protección de ADN retinal, una medida del número de células retinales (A) y la protección completa de la morfología retinal (fotorreceptores) en ratas dosificadas sistémicamente con buspirona y expuestas a lesión foto-oxidativa severa (B). Las figuras 4A y 4B muestran la conservación de la función a y b en el ERG de ratas dosificadas sistémicamente con SR-57746A y expuestas a lesión foto-oxidativa severa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a agonistas de 5-HT?A los cuales se ha descubierto que son útiles en el tratamiento de trastornos de la retina exterior, particularmente: AMD; RP y otras formas de enfermedad retinal heredodegenerativa; desprendimiento retinal y lágrimas; pliegue macular; isquemia que afecta la retina exterior; retinopatía diabética; daño asociado con la terapia con láser (de rejilla, focal y panretinal) incluyendo terapia fotodinámica (PDT); trauma; retinopatía quirúrgica (traslocación retinal, cirugía subretinal o vitrectomía) o retinopatía ¡atrogénica inducida por la luz; y conservación de los transplantes retinales.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Se ha demostrado que los agonistas de 5-HT-IA serotonérgicos son potentes agentes neuroprotectores después de varias lesiones al sistema nervioso central. Inesperadamente, se ha demostrado que 8-OH-DPAT (8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)tetralina), buspirona y SR-57746A exhiben actividad neuroprotectora potente en la retina y evita la muerte celular apoptótica inducida por la luz a los fotorreceptores y las células del RPE. Se ha descubierto que el tratamiento con buspirona puede evitar completamente ia retinopatía inducida foto-oxidativa y reducir significativamente la pérdida de ADN retinal y el adelgazamiento de ONL. Las ventajas de seguridad de algunos de estos compuestos los hacen particularmente convenientes para terapias tanto agudas como crónicas. Cada agente tendría utilidad en el tratamiento de diversas enfermedades degenerativas de la retina exterior. En los paradigmas de daños por luz, los antioxidantes eran o bien inefectivos (a-tocoferol) o marginalmente efectivos en dosis altas (ascorbato, análogos de vitamina E). De manera similar, algunos antagonistas de calcio (flunarizina, nicardipina) fueron moderadamente efectivos, mientras que otros (nifedipina, nimodipina, verapimil) no tuvieron efecto en evitar los cambios funcionales o morfológicos inducidos por la luz. Sin embargo, se ha descubierto que los agonistas de 5-HT1A son 100 veces más potentes en estos paradigmas de daños por luz y son, por lo tanto, útiles para tratar trastornos de la retina exterior. La invención contempla el uso de cualquier agonista de 5-HT?A farmacéuticamente aceptable, que incluye sales farmacéuticamente aceptables, para tratar trastornos de la retina exterior (Compuestos). Farmacéuticamente aceptable, significa que los compuestos se pueden utilizar de manera segura para el tratamiento de enfermedades de la retina exterior. Como se utiliza en la presente, la retina exterior incluye el RPE, fotorreceptores, células Muller (hasta el punto en que sus procedimientos se extienden a la retina exterior), y la capa plexiforme externa. Los compuestos son formulados para suministro ocular sistémico o local. Los trastornos de la retina exterior abarcan condiciones degenerativas agudas y crónica ambientalmente inducidas (trauma, isquemia, tensión foto-oxidativa) de los fotorreceptores y células RPE en individuos normales o genéticamente predispuestos. Esto incluiría sin límite, AMD, RP y otras formas de enfermedad de retina heredodegenerativa, desprendimiento de retina, lágrimas, pliegue macular, isquemia que afecta la retina exterior, retinopatía diabética, daño asociado con terapia de láser (de rejilla, focal y panretinal) incluyendo terapia fotodinámica (PDT), térmica o crioterapia, trauma, quirúrgica (translocación retinal, cirugía subretinal o vitrectomía) o retinopatía ¡atrogénica inducida por luz y conservación de transplantes de retina. Los compuestos de la presente invención tienen potente afinidad para receptores de5-HT-?A con valores IC50 que están en la escala de hasta aproximadamente 500 nM (de preferencia menos de 100 nM). Estos compuestos también son agonistas totales, o bien, parciales con valores IC50 que están en la escala de hasta aproximadamente 1 µM (de preferencia menos de 500 nM). Los agonistas de 5-HT-IA representantes útiles de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a: tandospirona, urapidil, ziprasidona, clorhidrato de repinotan, clorhidrato de xaliproden, (SR-57746A), buspirona, flesinoxan, EMD-68843, DU-127090, gepirona, alnespirona, PNU-95666, AP-521 , flibanserina, MKC-242, lesopitron, clorhidrato de sarizotan, Org-13011 , Org-12966, E-5842, SUN-N4057, y 8-OH-DPAT. La unión al receptor y actividad agonista de acuerdo con esta invención se pueden determinar utilizando los siguientes métodos.

MÉTODO 1 Prueba de unión a receptor de 5-HTj^ Se realizaron estudios de unión a 5-HT1A con receptores clonados de humano expresados en células de ovario de hámster chino (CHO) utilizando (3H)8-OH DPAT como ligando. Las membranas de las células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan receptores de 5-HT?A clonados (fabricados para NEN de Biosignal, Inc., Montreal; Canadá) se homogeneizaron en aproximadamente 40 volúmenes de 50 mM de Tris pH 7.4. durante 5 segundos. Se realizaron diluciones de fármaco utilizando un robot Beckman Biomek 2000 (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Se llevaron a cabo incubaciones con preparación de membrana, compuestos de prueba, y 0.25 nM de [3H]8-OH-DPAT (NEN, Boston, MA) en el mismo regulador de pH a 27°C durante 1 hora. Las pruebas se terminaron mediante rápida filtración al vacío sobre filtros de fibra de vidrio Whatman GF/B presumergidos en polietilenimina al 0.3%. Se midió la radioactividad ligada utilizando espectrometría de escintilación líquida. Los datos se analizaron utilizando programas de ajuste de curva no lineal (Sharif et al., J Pharmac Pharmacol, 51 : 685-694, 1999). También se pueden efectuar estudios de unión a ligando utilizando preparaciones de membrana a partir de cerebro de ternera y rata (fuente local) y membrana de corteza humana. Se disecaron regiones específicas de cerebro, se homogeneizaron en 10 volúmenes de 0.32 M de sacarosa y se centrifugaron durante 10 minutos a 700 x g. El sobrenadante resultante se centrifugó a 43,500 x g durante 10 minutos y la pella se resuspendió en 50 mM de Tris-HCL (pH 7.7, 25°C) utilizando un tratamiento de politrón de 10 segundos. Las alícuotas se almacenaron a -140°C. Para remover serotonina endógena, las preparaciones se incubaron a 37°C durante 10 minutos antes del experimento. Las incubaciones de prueba se terminaron mediante filtración rápida sobre filtros Whatman GF/C utilizando un cosechador de células Brandell. Se calcularon valores de K¡ utilizando la ecuación de Cheng-Prusoff (De Vry et al., J Pharm Exper Ther, 284:1082-1094, 1998).

MÉTODO 2 La función de compuestos de la presente invención se puede determinar utilizando una variedad de métodos para evaluar la actividad funcional de agonistas de 5-HT-IA- Dicha prueba se realiza utilizando rebanadas hipocampales de ratas macho Sprague-Dawley, midiendo la inhibición de adenilato ciclasa estimada mediante forscolina (J Med Chem, 42:36 1999; J Neurochem, 56:1114, 1991 ; J Pharm exper Ther, 284:1082, 1998). Las membranas hipocampales de ratas se homogeneizaron en 25 volúmenes de 0.3 M de sacarosa que contiene 1mM de EGTA, 5 mM de EDTA, 5 mM de ditiotreitol, y 20 mM de Tris-HCl, pH 7.4 a 25°C. El homogenado se centrifugó durante 10 minutos a 1,000 x g. El sobrenadante posteriormente se centrifugó a 39,000 x g durante 10 minutos. La pella resultante se volvió a suspender en regulador de pH de homogeneización a una concentración de proteína de aproximadamente 1 mg/ml y las alícuotas se almacenaron a -140°C. Antes de utilizarse, las membranas se volvieron a homogeneizar en un homogeneizador Potter-Elvehjem. Cincuenta µl de la suspensión de membrana (50 µg de proteína) se añadieron a un regulador de pH de incubación que contiene 100 mM de NaCI, 2 mM de acetato de magnesio, 0.2 mM de ATP, 1 mM de PMAc, 0.01 mM de GTP, 0.01 mM de forscolina, 80 mM de Tris-HCl, 5 mM de fosfato de creatina, 0.8 U/µl de fosfocinasa de creatina, 0.1 mM de IBMX, 1-2 µCi a-[32P]ATP. Las incubaciones con los compuestos de prueba (10 minutos a 30°C) se iniciaron mediante adición de la solución de membrana a la mezcla de incubación (calentada previamente 5 minutos a 30°C). [32P]PMAc se midió de conformidad con el método de Salomón (Adv. Cyclic Nucleotide Res. 10:35-55, 1979). La proteína se midió utilizando la prueba de Bradford (Anal. Biochem 72:248-254, 1976). La actividad funcional también puede determinarse en receptores de humano recombinante de conformidad con el método de Schoeffter et al., (Neuropharm. 36:429-437, 1997). Las células HeLa transfectadas con receptores de 5-HT-IA de humano recombinantes crecieron para confluencia en placas de 24 pozos. Las células se enjuagaron con 1 ml de solución salina de Hepes-regulada (en mM) NaCI 130, KCl 5.4, CaCI2, 1.8, MgSO4 0.8, NaH2PO4 0.9, glucosa 25, Hepes 20, pH 7.4, y rojo fenol 5 mg/l. Las células se marcaron con 6 µCi/ml de [3H] adenina (23 Ci/mmoles, Amersham, Rahn AG, Zurich, Suiza) en 0.5 ml de solución salina a 37°C durante 2 horas. Las placas se enjuagaron posteriormente dos veces con 1 ml de solución salina regulada que contiene 1 mM de ?sobutilmetilxantina. Las células se incubaron durante 15 minutos en 1 ml de esta solución (37°C) en presencia o ausencia de 10 µM de forscolina y el compuesto de prueba. El regulador de pH entonces se removió y se añadió 1 ml de 5% de ácido tricloroacético (TCA) que contiene 0.1 mM de PMAc y 0.1 mM de ATP para extraer las muestras. Después de 30 minutos a 4°C, los extractos de TCA se sometieron a separación cromatográfica en Dowex AG 50W-X4 y columnas de alúmina (Salomón, Meth Enzymol 195: 22-28, 1991). La producción de AMP cíclico se calculó como la relación [3H]PMAc/([3H]PMAc+[3H]ATP). Los procedimientos anteriores descritos en los métodos 1 y 2 se utilizaron para generar los siguientes datos.

CUADRO 1 Unión de receptor a 5-HT-IA V datos de prueba funcional En general, para enfermedades degenerativas, los agonistas de 5-HT-IA de esta invención son administrados oralmente con dosificación diaria de estos compuestos en la escala entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 500 miligramos. La dosis diaria total preferida está en la escala entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 miligramos. La administración no oral, tal como intravitreal, ocular tópica, parche transdérmico, subdérmico, parenteral, intraocular, subconjuntival, o inyección retrobulbar o de subtenón, transescleral (incluyendo iontoforesis), o polímeros o ¡iposomas biodegradables de lenta liberación pueden requerir un ajuste de la dosis diaria total necesaria para proveer una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto. Los agonistas de 5-HT?A también se pueden suministrar en soluciones de irrigación ocular. Las concentraciones deben estar en la escala de aproximadamente 0.001 µM a aproximadamente 100 µM, de preferencia aproximadamente 0.01 µM a aproximadamente 5 µM. Los agonistas de 5-HT-IA se pueden incorporar en diferentes tipos de formulaciones oftálmicas para suministro al ojo (por ejemplo tópicamente, entre cámaras, o mediante un implante). Se pueden combinar con conservadores, agentes tensioactivos, incrementadores de viscosidad, agentes de gelificación, incrementadores de penetración, reguladores de pH oftalmológicamente aceptables, cloruro de sodio, y agua para formar suspensiones o soluciones estériles, acuosas o geles preformados o geles formados in situ. Las formulaciones de solución oftálmica se pueden preparar al disolver el compuesto en un regulador de pH acuoso isotónico fisiológicamente aceptable. Además, la solución oftálmica puede incluir un agente tensioactivo oftalmológicamente aceptable para ayudar a disolver el compuesto. Las soluciones oftálmicas pueden contener un incrementador de viscosidad, tal como, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidróxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, o similares, para mejorar la retención de ia formulación en la bolsa conjuntival. Con el fin de preparar formulaciones de ungüento oftálmico estériles, el ingrediente activo se combina con un conservador en un vehículo adecuado, tal como aceite mineral, lanolina líquida, o petrolato blanco. Las formulaciones de gel oftálmicas estériles se pueden preparar al suspender el ingrediente activo en una base hidrófila preparada a partir de la combinación de por ejemplo carbopol-940, o similares, de acuerdo con las formulaciones publicadas para preparaciones oftálmicas análogas; se pueden incoforar conservadores y agentes de tonicidad. Si se dosifica tópicamente, los agonistas de 5-HTIA de preferencia se formulan como suspensiones o soluciones oftálmicas tópicas, con un pH de aproximadamente 4 a 8. Los agonistas de 5-HT1A normalmente estarán contenidos en estas formulaciones en una cantidad .001 % a 5% en peso, pero de preferencia en una cantidad de .01% a 2% en peso. De esta forma, para presentación tópica, de 1 a 2 gotas de estas formulaciones se administrarían a la superficie del ojo 1 a 4 veces por día a discreción dei médico experto. Las siguientes formulaciones oftálmicas tópicas son útiles de acuerdo con la presente invención administradas 1-4 veces al día a discreción de un médico experto.

EJEMPLO 1 EJEMPLO 2 EJEMPLO 3 EJEMPLO 4 EJEMPLO 5 EJEMPLO 6 MÉTODO 3 Efectos neuroprotectores en el modelo de retinopatía foto-oxídativa inducida por rata Se evaluaron los efectos protectores de retina en estos agonistas de -HT-IA en el paradigma de retinopatía foto-oxidativa inducida.

Inducción de lesión fotoquímica Las lesiones fotoquímicas se indujeron en ratas adaptadas en oscuridad (24 horas) mediante exposición a (220 fc) de luz azul (paso de banda de amplitud media = 435-475 nm) durante 6 horas. Los animales se dejaron recuperar durante 5 días en oscuridad antes de evaluación de electrodiagnóstico de la función de la retina. Las ratas se alojaron por separado en jaulas de policarbonato transparente durante esta exposición de luz.

Evaluación de electrod ¡agnóstico El electrorretinograma (ERG) se registró a partir de ratas anestesiadas después de un período de adaptación en oscuridad de 24 horas. Las ratas se anestesiaron mediante inyección IP con cetamina-HCI (75 mg/Kg) y Xilasina (6 mg/Kg). Los ERG instantáneos registrados a partir de un electrodo de asa metálica de platino-iridio colocado en la córnea, se produjeron al visualizar un campo total. Se enumeraron respuestas eléctricas a una serie de destellos de luz que incrementan en intensidad para analizar características temporales de la relación de forma de onda e intensidad de voltaje-log de respuesta (Vlogl). Los cambios en la onda a de ERG están asociados con daño al fotorreceptor y epitelio del pigmento de retina, mientras que el daño a la retina interna se refleja en cambios en la onda b de ERG.

Evaluación de morfología retinal Se obtuvieron tejidos oculares a partir de ratas de control y dosificadas con fármaco o vehículo y se fijaron mediante inmersión en una mezcla de paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2%. Los globos oculares fijos se deshidrataron en una serie de etanol ascendente, incrustada en resina de plástico JB-4, y se analizaron secciones con 1 a 1.5 mieras de espesor utilizando un sistema de análisis de imagen por computadora cuantitativo unido al microscopio. Se midió el espesor de capa retinal (epitelio del pigmento retinal, RPE; espesor de la capa nuclear externa, ONL; espesor de la capa nuclear interna, INL; y longitud de segmentos interno y externo del fotorreceptor IS+OS).

Evaluación de cambios en ADN Se sometieron a eutanasia ratas albinas mediante inhalación de C02 y la retinas individuales se congelaron en tubos separados. Cada retina había sido tratada con sonido en 0.8 ml (2.0 M de NaCI, 50 mM de NaP04, pH 7.4, 2 mM de EDTA) para producir un homogenado uniforme, y se almacenaron congeladas. Alícuotas (0.1 ml) de cada muestra se diluyeron 10 veces con 2.0 M de NaCI, 50 mM de NaPO4, pH 7.4, 2 mM de EDTA que contiene 1.1 µg/ml de bisbencimidazol (Hoechst 33258). Se construyó una curva estándar utilizando ADN de timo de ternera de 0 a 25 µg/ml en el mismo regulador de pH. Alícuotas de 0.2 ml por triplicado de cada estándar y muestra de retina se colocaron en pipetas en una placa de 96 pozos para mediciones de fluorescencia en el Cytofluor II. La longitud de onda de excitación fue de 360 nm, y la longitud de onda de emisión fue de 460 nm.

Sujetos v dosificación Se asignaron aleatoriamente ratas Sprague Dawley macho para grupos experimentales de fármaco y vehículo. Las ratas de control se alojaron en su jaula de origen bajo exposición a luz cíclica normal. Todas las ratas se dosificaron 48, 24 y 0 horas antes de una exposición de luz azul de 6 horas. La dosificación fue de la siguiente manera: 1.) 8-OH-DPA T (8-hidroxi-2-.di-n-propilamino)tetralina): A las ratas que reciben vehículo (N = 10) u 8-OH-DPAT (0.5 mg/kg [N=5] o 1.0 mg/kg [N=10]), se les dio tres inyecciones subcutáneas (SC) antes de exposición a luz. Se utilizaron cinco ratas como control. Se evaluó la protección retinal al analizar la respuesta de ERG y medir los cambios en morfología de la retina. 2.) Buspirona: Para cuantificación de ADN, se dosificaron IP seis ratas por grupo de tratamiento con vehículo o buspirona (0.5 y 1 mg/kg) antes de exposición a luz. Se utilizaron retinas de siete ratas normales como controles. Para evaluar cambios en morfología retinal, las ratas fueron dosificadas (IP) ya sea con vehículo (N = 8) o buspirona (1.0 mg/kg [N=9]). Se utilizaron seis ratas como controles. Se evaluó la protección retinal al cuantificar cambios en ADN de retina y medir cambios en morfología de retina. 3.) SR-57746A Las ratas fueron dosificadas (IP) con vehículo (N= 5) o SR-57746A (I0.5 mg/kg [N=5] o 1 mg/kg [N=15]). Se utilizaron once ratas como controles. Se analizó él ERG después de un período de recuperación de 5 días para evaluar la protección de retina.

Resultados de evaluación de 8-OH-DPAT La exposición a luz azul durante 6 días dio como resultado una disminución importante de la amplitud de respuesta de ERG (ANOVA, p < 0.001 , prueba de t de Bonferroni, p < 0.05) en comparación con normales cuando se midieron después de un período de recuperación de 5 días (figuras 1A y B). La exposición a luz azul dio como resultado una reducción del 75% en las amplitudes máximas de la onda a y b en ratas dosificadas con vehículo en comparación con controles. Además, las respuestas de umbral fueron inferiores y se evocaron en intensidades de destellos de luz más brillantes. Las ratas dosificadas con 8-OH-DPAT mostraron protección dependiente de dosis de función de retina exterior e interior contra esta retinopatía foto-oxidativa inducida (figuras 1A y B). Las amplitudes de respuesta máximas de la onda a y b en ratas dosificadas con 8-OH-DPAT (0.5 mg/kg) no fueron diferentes a ratas dosificadas con vehículo y fueron aproximadamente 27% de amplitudes de control. Sin embargo, las amplitudes de respuesta máximas de las ondas a y b de ratas dosificadas con 8-OH-DPAT (1.0 mg/kg) fueron aproximadamente 53% y 61 % de normal, respectivamente, y significativamente mayor a respuestas medidas en ratas dosificadas con vehículo (figuras 1A y 1B). Consistente con estos cambios de ERG, el análisis morfométrico de estas retinas después de un período de recuperación de 3 semanas, demostró una pérdida importante (ANOVA, p < 0.01) de células fotorreceptoras, reducción de longitud del segmento interno + externo del fotorreceptor, y aplanamiento del RPE en animales dosificados con vehículo. No se detectaron cambios importantes en el espesor de la INL. El espesor de la ONL se redujo 73%, la longitud del segmento interno + externo se redujo 82%, y el espesor de RPE se redujo 59% en comparación con controles (figura 2). Las lesiones observadas en ratas dosificadas con 8-OH-DPAT (0.5 mg/kg) no fueron significativamente diferentes a lesiones medidas en ratas dosificadas con vehículo. Aunque los ERG se redujeron aproximadamente 63%, el espesor de la ONL se redujo en 53%, la longitud del segmento del fotorreceptor se redujo 60%, y el espesor del RPE se redujo 34%. Sin embargo, las lesiones fóticas observadas en ratas dosificadas con 8-OH-DPAT (1.0 mg/kg) fueron significativamente diferentes a ratas dosificadas con vehículo. Aunque las amplitudes de respuesta de ERG fueron mayores a 50% de normal, el espesor de la ONL fue 2.4 veces más grueso, la longitud del segmento del fotorreceptor fue 2.9 veces más larga, y el espesor de RPE fue 1.9 veces más grueso en comparación con ratas dosificadas con vehículo.

Resultados de evaluación de buspirona Como se ve en la figura 3A, los niveles de ADN de retina dosificados con vehículo se redujeron significativamente (ANOVA, P=0.017) en aproximadamente 30% de los niveles de control. No se midieron diferencias importantes entre grupos dosificados con vehículo o 0.1 mg/kg de buspirona. Se midió la protección retinal en ratas dosificadas con buspirona (1 mg/kg). Los niveles de ADN en retina fueron significativamente mayores que los medidos en ratas dosificadas con vehículo, pero no significativamente diferentes a los controles. La exposición a luz azul durante 6 horas dio como resultado una importante reducción en número de fotorreceptor (ANOVA, p < 0.03). El análisis morfométrico de estas retinas después de un período de recuperación de 4 semanas, demostró un adelgazamiento del 54% de la capa nuclear externa en ratas dosificadas con vehículo en comparación con controles (figura 3B). Sin embargo, no se midió diferencia importante en espesor de ONL entre ratas normales y ratas tratadas con buspirona. En ratas dosificadas con buspirona (1 mg/kg), el espesor de ONL fue de 28.3 µ en comparación con 30.4 µ en ratas normales.

Resultados de evaluación de SR-57746A Se midió protección importante de la función retinal en ratas expuestas a luz dosificadas con SR-57746A (0.5 y 1.0 mg/kg). Las amplitudes de respuesta máximas de las ondas a y b se redujeron en 50% en ratas dosificadas con vehículo en comparación con controles (figuras 4A y B). Las respuestas máximas fueron 82% de controles en ratas dosificadas con SR-57746A (0.5 mg/kg) y 70% de normal en ratas dosificadas con 1 mg/kg.

Conclusión Estos agonistas de 5-HT1A (8-OH-DPAT, buspirona, y SR-57746A) demostraron buena potencia y eficacia en su modelo oxidativo de enfermedad degenerativa retinal. Se obtuvo protección funcional y estructural en ratas dosificadas en 3 días consecutivos con una dosis tan baja como 1 mg/kg.

Claims (6)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un compuesto con actividad agonista de 5-HT-IA para preparar un medicamento para tratar trastornos de la retina exterior.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el compuesto se selecciona del grupo que consta de: tandospirona, urapidil, ziprasidona, clorhidrato de repinotan, clorhidrato de xaliproden, (SR-57746A), buspirona, flesinoxan, EMD-68843, DU-127090, gepirona, alnespirona, PNU-95666, AP-521 , flibanserina, MKC-242, lesopitron, clorhidrato de sarizotan, Org-13011 , Org-12966, E-5842, SUN-N4057, y 8-OH-DPAT.

3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el trastorno se selecciona del grupo que consta de: AMD; RP y otras formas de enfermedad retinal heredodegenerativa; desprendimiento retinal y lágrimas; pliegue macular; isquemia que afecta la retina exterior; retinopatía diabética; daño asociado con la terapia con láser (de rejilla, focal y panretinal) incluyendo terapia fotodinámica (PDT); trauma; retinopatía quirúrgica (traslocación retinal, cirugía subretinal o vitrectomía) o retinopatía iatrogénica inducida por la luz; y conservación de los transplantes retinales.

4.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el trastorno es AMD.

5.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consta de: tandospirona, urapidil, ziprasidona, clorhidrato de repinotan, clorhidrato de xaliproden, (SR-57746A), buspirona, flesinoxan, EMD-68843, DU-127090, gepirona, alnespirona, PNU-95666, AP-521 , flibanserina, MKC-242, lesopitron, clorhidrato de sarizotan, Org-13011 , Org-12966, E-5842, SUN-N4057, y 8-OH-DPAT.

6.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde el trastorno se selecciona del grupo que consta de AMD, RP y retinopatía diabética.