MXPA02007210A - Ensayo homogeneo de hibridacion doble o triple por medio de medidas multiples bajo condiciones variadas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona metodos de ensayo homogeneos para la hibridacion, deteccion y evaluacion de acido nucleico. El ensayo incluye la obtencion de senales de una muestra de prueba, tanto antes como durante la aplicacion de un voltaje a la muestra de prueba y correlacion de las-senales, siendo indicativa cada una de las cuales, de una afinidad de enlace de la substancia de ensayo y el objetivo entre ellos. El ensayo hace posible la determinacion de un grado de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo, conforme el voltaje puede ser calibrado como para desestabilizar de manera importante cualquier hibridacion excepto una hibridacion perfectamente complementaria. Las senales cuya magnitud esta correlacionada con la afinidad de enlace puede ser conductancia electrica y/o intensidad fluorescente. De preferencia, ambos pares de senales son medidos y comparados para mejorar la confiabilidad del ensayo. El ensayo puede detectar la hibridacion especifica entre substancias de ensayo de un solo hilo, y objetivos de hilo doble no desnaturalizados para formar triples, eliminando de este modo, la necesidad de desnaturalizar los objetivos. Los metodos de ensayo tambien pueden ser aplicados a complejos dobles de hibridacion.

Description

ENSAYO HOMOGÉNEO DE HIBRIDACIÓN DOBLE O TRIPLE POR MEDIO DE MEDIDAS MÚ LTIPLES BAJO CON DICION ES VARIADAS Campo de la I nvención La presente invención se refiere a métodos para secuenciar o ensayar ácidos nucleicos, y más particularmente, a métodos para ensayar en forma precisa complejos triples o dobles de hibridación de ácido nucleico.

Antecedentes del Invento Durante varios años ha quedado claro q ue las moléculas biológicas pueden ser aisladas y caracterizadas a través de la aplicación de un campo eléctrico a una muestra . La electroforesis es quizá, el ejemplo mejor conocido de una técnica de aislamiento y caracterización con base en la influencia de campos eléctricos en moléculas biológicas. En la electroforesis por gel , se forma una matriz o gel uniforme, por ejemplo, de poliacri lamida , a la cual se le aplica un campo eléctrico. Las mezclas aplicadas a un extremo del gel migrarán a través del gel , de acuerdo con su tamaño e interacción con el campo eléctrico. La movilidad depende de las características únicas de la substancia, tales como conformación , tamaño y carga. Las movilidades pueden ser influenciadas alterando los tamaños de poro del gel , tal como mediante la formación de una concentración o gradiente de pH , o alterando la composición del regulador (pH , SDS, DOC , glicina , sal).

Las electroforesis de gel de una y dos dimensiones, son probablemente los procedimientos de rutina en la mayoría de los laboratorios de investigación . Se pueden purificar substancias objetivo mediante el paso a través de y/o la extracción física del gel. Un proceso desarrollado más recientemente, en el cual se aplica un campo eléctrico a una muestra biológica , se describe en la Patente Norteamericana No. 5, 824,477 de Stanley. La patente de Stanley describe un proceso para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico predeterminada en una muestra. El proceso comprende: (a) un ácido nucleico de hilo doble de muestra promedio de un voltaje aplicado a la muestra en una solución por medio de un electrodo; (b) hibridar el ácido nucleico desnaturalizado con una substancia de ensayo de oligonucleótidos para la secuencia; (c) determinar si ha ocurrido la hibridación . La patente de Stanley describe la aplicación de un campo eléctrico a la muestra que será ensayada, con el propósito limitado de desnaturalizar la secuencia objetivo. Un tipo de ensayo de hibridación mejor conocido, se basa en el uso de agentes de marcación fluorescente. En su forma más básica , los ensayos a base de intensidad fluorescente han comprendido normalmente el contacto de un objetivo con una substancia de ensayo que contiene fluoroforo, que remueve cualquier substancia de ensayo no enlazada de la su bstancia de ensayo enlazada , y detectar la fluorescencia en la muestra lavada. Los ensayos homogéneos mejoran dichos ensayos básicos, ya que el formador no requiere un paso de lavado o la provisión de un soporte de fase no líqu ida. Algunos ensayos han empleado fluoroforos de intercalación para detectar la hibridación de ácido n ucleico, con base en la capacidad de tales fluoroforos para enlazar entre hilos de ácido n ucleico en un complejo de hibridación . Por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5, 824 ,557 de Burke et al . , describe un método y equipo para detectar y cuantificar moléculas de ácido nucleico. U na modalidad preferida depende de la intercalación de un tinte en una hélice de ácido nucleico de hilo doble o un ácido nucleico de un solo hilo. El tinte fluoresce después de la intercalación y la intensidad es una medida directa de la cantidad de ácido nucleico presente en la muestra . Aunque el método de Burke et al . , tiene el propósito de ser útil para medir la cantidad de ácido n ucleico en una muestra , el enlace no específico entre el intercalador y el ácido nucleico al momento en cuyo momento está basado el método, lo vuelve un método impráctico para detectar un en lace específico , particu larmente, bajo condiciones en donde no están presentes ácidos nucleicos dobles que no son el objetivo. La Patente Norteamericana No. 5, 814,447 de I shig uro et al . , describe un ensayo que tiene el propósito de mejorar los ensayos que dependen de una interacción no específica entre agentes de intercalación y ácidos nucleicos dobles, tal como el de Burke et al . , y un ensayo anterior descrito por I shiguro et al . , en la Descripción Pública de Patente Japonesa No. 237000/1 993. El desarrollo anterior comprend ía agregar un fl uorocromo de intercalado q ue ten ía la tendencia de exhibir intensidad incrementada de fluorescencia, cuando se intercalaba con una solución de muestra antes de que se amplificará mediante PCR una región específica de un ácido nucleico objetivo, y se med ía la intensidad de fluorescencia a partir de la solución de reacción en intervalos de tiempo determinados para detectar y cuantificar el ácido nucleico objetivo antes de la amplificación . La patente '447 intentó mejorar el desarrollo anterior, proporcionando un ensayo con una especificidad mejorada , caracterizada porque la muestra es un oligon ucleótido de un solo hilo marcado con un fluorocromo de intercalado, el cual era intercalado en una parte de enlace complementario entre un ácido nucleico objetivo y una muestra de oligonucleótido de un solo hilo. En la investigación actual para técnicas de ensayo más sensibles, precisas y rápidas, un grupo de investigación desarrolló un ensayo que comprende analizar los efectos de un campo eléctrico en la intensidad fluorescente de la hibridación de ácido nucleico doble. Se deben ver las Solicitudes de Patentes Norteamericanas Nos. 08/807, 901 y 08/870, 370, presentadas respectivamente el 27 de Febrero de 1 997 y el 6 de Junio de 1 997. Los investigadores indicaron que la intensidad fluorescente de un par básico doble mal emparejado, difiere de la de un par básico doble perfectamente emparejado. Por lo tanto, las solicitudes pretenden describir un método para detectar una secuencia de nucleótidos, en donde se aplica un campo eléctrico a un medio líquido antes de o en forma concurrente con un paso de detección , y se detecta un cambio en una intensidad de una emisión fluorescente, como una función del campo eléctrico, como una indicación de si la muestra está hibridada hasta u na secuencia de nucleótidos completamente complementaria o hasta una secuencia de nucleótidos complementaria de manera incompleta . No obstante los desarrollos anteriores, continúa la necesidad en el arte de un método simple, altamente sensible, efectivo y rápido para analizar la interacción entre ácidos nucleicos y/o análogos de ácido nucleico. Todas las referencias citadas en la presente invención , están i ncorporadas a la misma en sus totalidades como referencia . Sumario de la Invención La presente invención proporciona un método para ensayar la hi bridación específica de secuencias, en donde el método comprende: proporcionar un objetivo que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico; proporcionar una substancia de ensayo que comprende un ácido nucleico o secuencia análoga de ácido nucleico; agregar la substancia de ensayo y el objetivo a un medio de hibridación para proporcionar una muestra de prueba ; aplicar un primer estímulo a la muestra de prueba para proporcionar u na primer muestra de prueba estimulada; detectar una primera señal a partir de la primera muestra de prueba estimulada, en donde la primera señal está correlacionada con una afinidad de enlace entre la substancia de ensayo y el objetivo; cali brar la primera señal contra una señal de referencia exhibida por u na muestra de referencia q ue comprende al menos una substancia de ensayo de referencia combinada con el objetivo, en donde con relación al objetivo, cada una de las substancias de ensayo y cada una de al menos u na muestra de referencia es un elemento diferente seleccionado del grupo q ue consiste de u n emparejamiento perfecto, un par básico mal emparejados, dos pares básicos mal emparejados, tres pares básicos mal emparejados, una eliminación de un par básico, una eliminación de dos pares básicos, y una eliminación de tres pares básicos; y determinar a partir de dicha calibración una primera determi nación de un punto de emparejamiento entre la su bstancia de ensayo y el objetivo; apl icar un segundo estímulo a la primera muestra de prueba estimulada para proporcionar una segunda muestra de prueba estimulada; y detectar una segunda señal a partir de la segunda muestra de prueba estimu lada, en donde la segunda señal está correlacionada con la afinidad de enlace entre la substancia de ensayo y el objetivo; determinar a partir de la detección de la segunda señal , una segunda determinación de dicho punto de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo; y comparar la primera determinación y la segunda determinación . También se proporciona otro método para ensayar la hibridación , en donde el método comprende: proporcionar un objetivo que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico; proporcionar una substancia de ensayo que comprende un ácido n ucleico o una secuencia análoga de ácido nucleico; agregar la substancia de ensayo y el objetivo a un medio de hibridación para proporcionar una muestra de prueba ; medir de una primera señal de una primera condición de la muestra de prueba para proporcionar una determinación primaria con respecto a la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo, en donde la primera señal está correlacionada con la h i bridación entre la substancia de ensayo y el objetivo; medir una segunda señal de una segunda condición de la muestra de prueba para proporcionar una segunda determinación con respecto a la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo, en donde la segunda señal está correlacionada con la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo, siempre y cuando la primera condición y la seg unda condición sean iguales, se aplica un estímulo a la muestra de prueba después de medir la primera señal y antes de medir la segunda señal , en donde el estímulo afecta en forma sign ificativa la hibridación complementaria de manera imperfecta entre la substancia de ensayo y el objetivo y no afecta en forma significativa la hibridación perfectamente complementaria entre la substancia de ensayo y el objetivo; y comparar la determinación primaria y la determinación secundaria, para evaluar si cualquier inconsistencia entre estas garantiza la nueva elaboración de pruebas. Además, la presente invención proporciona aún otro método de ensayo de hibridación , que comprende: proporcionar un objetivo que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico; proporcionar una substancia de ensayo que comprende un ácido nucleico o una secuencia análoga de ácido nucleico; agregar la muestra y el objetivo al medio de hibridación para proporcionar una muestra de prueba; medir una intensidad fluorescente de electrificación previa de la muestra de prueba, para proporcionar una determi nación primaria con respecto a la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo, en donde la intensidad fluorescente de electrificación previa está correlacionada con la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo; aplicar un voltaje a la muestra de prueba ; medir una intensidad fluorescente de electrificación posterior de la muestra de prueba, durante o después de la aplicación de voltaje, para proporcionar una determinación secu ndaria con respecto a la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo, en donde la intensidad fluorescente de electrificación posterior está correlacionada con la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo; y comparar la determinación primaria y la determinación secundaria para evaluar si cualquier i nconsistencia entre ellas, amerita una nueva prueba. También se proporciona un método para ensayar una hibridación específica de secuencia , en donde el método comprende: proporcionar un objetivo que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico; proporcionar una substancia de ensayo que comprende un ácido nucleico o una secuencia análoga de ácido n ucleico; agregar la substancia de ensayo y el objetivo a un medio de hibridación para proporcionar la muestra de prueba; aplicar un voltaje eléctrico a la muestra de prueba; detectar una señal de la muestra de prueba durante o después de la aplicación del voltaje eléctrico, en donde la señal está correlacionada con una afinidad de enlace entre la substancia de ensayo y el objetivo; cali brar la señal contra una señal de referencia exhibida por una muestra de referencia que comprende al menos una substancia de ensayo de referencia combinada con el objetivo, en donde con relación al objetivo, cada substancia de ensayo y al menos una substancia de ensayo de referencia son un elemento diferente seleccionado del grupo que consiste de un emparejamiento perfecto, un par básico mal emparejado, dos pares básicos mal emparejados, tres pares básicos mal emparejados, una eliminación de un par básico, una eliminación de dos pares básicos, y una eliminación de tres pares básicos; y determinar a partir de dicha cali bración un punto de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo. Breve Descri pción de los Dibujos La presente invención será descrita en conjunto con los siguientes dibujos, en los cuales, los números de referencia similares designan elementos similares, y en donde: Las figuras 1 A y 1 B son gráficas de corriente como una función de tiempo y complementaridad ; Las figuras 1 C y 1 D son gráficas de corriente como una función de temperatura y complementaridad ; Las fig u ras 2A, 2B, 2C, 3A y 3B son g ráficas de corriente como una función de temperatura, complementaridad y factores ad icionales; La figura 4 es una gráfica de corriente como una función de tiempo y complementaridad ; y Las figuras 5A, 5B, 5C y 6 son espectros de intensidad fluorescente. Descripción Detal lada de la Invención La presente invención proporciona un método rápido, sensible, conveniente para el ambiente, y seguro para ensayar el enlace entre un objetivo y una substancia de ensayo, en donde el objetivo comprende una secuencia de ácido nucleico o una secuencia análoga de ácido nucleico, y la substancia de ensayo comprende una secuencia de ácido nucleico o una secuencia análoga de ácido nucleico. A diferencia de ciertos ensayos de la técnica anterior, la presente invención no detecta únicamente la presencia de hibridación , sino que también proporciona información cualitativa y cuantitativa con respecto a la naturaleza de hibridación entre una substancia de ensayo y un objetivo. Por lo tanto, la presente invención permite al practicante distinguir entre un emparejamiento perfecto, un par básico mal emparejado, dos pares básico mal emparejados, tres pares básicos mal emparejados, u na eliminación de un par básico, una eliminación de dos pares básicos, y una eliminación de tres pares básicos. Las modalidades de la presente invención comprenden calibrar la señal medida (por ejemplo, corriente eléctrica y/o intensidad fluorescente) de una primera mezcla de su bstancia de ensayo-objetivo contra el mismo tipo de señal exhibida por otras muestras combinadas con el mismo objetivo, en donde cada una de las otras substancia de ensayo difiere de la primera por al menos un par básico. En ciertas modalidades, se aplica un bajo voltaje a la muestra antes o de manera concurrente con la medición de la señal . Generalmente, se selecciona el voltaje de modo que sea lo suficiente para desestabilizar las partes de hibridación emparejadas de manera imperfecta au nq ue no tan alta, para desestabilizar las partes de hibridación perfectamente emparejadas. En ciertas modalidades preferidas, el voltaje es de aproxi madamente 1 V hasta aproximadamente 20V. Se puede generar una curva de calibración , en donde la magnitud de la señal medida (por ejemplo, corriente eléctrica y/o intensidad fluorescente) es una función de la afinidad de enlace entre el objetivo y la substancia de ensayo. Conforme la afinidad de en lace entre el objetivo y una pluralidad de pruebas diferentes varía con el número de pares básicos mal emparejados, la naturaleza del mal emparejamiento (A-G vs. A-C vs. T-G vs. T-C, etc. ), la ubicación del mal emparejamiento(s) dentro del complejo de hibridación , etc. , se puede utilizar el ensayo de la presente i nvención para secuenciar el objetivo. Por ejemplo, la señal med ida puede ser, conductancia eléctrica. En tales modalidades, la afinidad de enlace entre la muestra y el objetivo está directamente correlacionada con la magnitud de la señal . Esto es, la conductancia eléctrica incrementa junto con el punto de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo, preferentemente, en un rango incluso de 0 a 2 malos emparejamientos y/o eliminaciones, más preferentemente, en un rango i ncluso de 0 a 3 malos emparejamientos y/o eliminaciones. En otras modalidades, la señal medida puede ser la intensidad fluorescente de un fluoroforo inclu ido en la muestra de prueba . En tales modalidades, la afinidad de enlace entre la substancia de ensayo y el objetivo puede estar directa o inversamente correlacionada con la intensidad , dependiendo de si el fluoroforo señala una hibridación a través de la extinción de la señal o la amplificación de señal . De este modo, la intensidad fluorescente generada intercalando agentes, está directamente correlacionada con la afinidad de enlace substancia de ensayo-objetivo, mientras que la intensidad de modalidades que emplean fluoroforos que no son intercaladores enlazados en forma covalente a la substancia de ensayo, está inversamente correlacionada con la afinidad de enlace substancia de ensayo -objetivo. La intensidad fluorescente incrementa (o disminuye para los no intercaladores) j u nto con el punto de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo, en un rango preferentemente de incluso 0 a 2 malos emparejamientos y/o eliminaciones, más preferentemente en un rango incluso de 0 a 3 malos emparejamientos y/o eliminaciones. Au nque los inventores han descrito anteriormente las ventajas de ensayos de intensidad fluorescente para h i bridación (ver la Solicitud de Patente Norteamericana No. 09/468, 679, presentada el 21 de Diciembre de 1 999), la aplicación de un campo eléctrico a la muestra parece incrementar la resolución del ensayo, tal como se muestra en el Ejemplo 6 que se encuentra más adelante. Además, en las modalidades particularmente preferidas de la presente invención , el ensayo comprende medir al menos dos señales de la muestra. La primera señal es preferentemente una intensidad fluorescente, y la segunda señal es preferentemente seleccionada de varias medidas de conductancia eléctrica (o viceversa). En las modalidades preferidas de medida mú lti ple, la primera señal puede ser la misma o diferente a la segu nda señal . Cuando la primera y segunda señales medidas son las mismas, la segunda señal puede ser calibrada contra la primera señal y/o contra la misma señal(es) utilizada para calibrar la primera señal . Además, se aplica preferentemente un estímulo de alteración de condición a la muestra de prueba después de que la primera señal se mide y antes de que la seg unda señal se mida. El estímulo es preferentemente suficiente para afectar en forma significativa la hibridación complementaria de manera imperfecta entre de la substancia de ensayo y el objetivo e insuficiente para afectar en forma significativa la hi bridación perfectamente complementaria entre la substancia de ensayo y el objetivo. Por ejemplo, en una modalidad particularmente preferida de la presente invención , la primera señal medida es una intensidad fluorescente de electrificación previa (por ejemplo, intensidad medida antes de que se aplica un voltaje de alteración de condición a la muestra de prueba) y la segunda señal medida es una intensidad fluorescente de electrificación posterior (por ejemplo, la intensidad medida durante o después de que el voltaje de alteración de condición ha sido aplicado a la muestra de prueba).

Las medidas adicionales en las modalidades anteriores, incrementan la confiabilidad del ensayo y permiten que se realicen nuevamente de manera inmediata pruebas a resultados sospechosos.

Los resultados inconsistentes logrados por medio de al menos dos medidas, normalmente ameritan una nueva elaboración de pruebas. La presente invención permite cuantificar la afinidad de enlace entre la muestra y el objetivo. Tal información puede ser valiosa para una variedad de usos, incluyendo el diseño de fármacos antisentido con características de enlace optimizadas. A diferencia de los métodos de la técnica anterior, el ensayo de la presente invención es preferentemente homogéneo. El ensayo puede ser llevado a cabo sin separar el complejo substancia de ensayo-objetivo de la substancia de ensayo y objetivo libres antes de detectar la magnitud de la señal medida. El ensayo no requiere un paso de separación del gel, permitiendo de este modo, un mayor incremento en el rendimiento de la prueba. Los análisis cuantitativos son simples y precisos. De manera consecuente, el ensayo de enlace ahorra gran cantidad de tiempo y gastos, y puede ser fácilmente automatizado. Además, permite enlazar variables, tales como regulador, pH , concentración iónica, temperatura, tiempo de incubación, concentraciones relativas de secuencias de substancia de ensayo y objetivo, concentración de intercalador, longitud de secuencias objetivo, longitud de secuencias de substancias de ensayo, y posibles requerimientos de cofactores que serán fácilmente determinadas.

El ensayo puede ser llevado a cabo, por ejemplo, en una solución dentro de un depósito, sobre una su perficie impermeable o sobre un biochip. Además, el ensayo de la presente invención , se lleva a cabo preferentemente, sin proporcionar un agente de extinción de señal en el objetivo o en la substancia de ensayo. Las modalidades preferidas de la presente invención, detectan en forma específica la hibridación triple entre la substancia de ensayo y el objetivo de hilo doble, eliminado de este modo, la necesidad de desnaturalizar el objetivo. Aunque las muestras de APN han sido conocidas por formar triples con ciertas clases de objetivos (ver por ejemplo, la publicación de Egholm et al . , 365 Nature 566 ( 1 993), y Tomac et al . , 1 1 8 J .Am . Chem . Soc. 5544 ( 1 996)), los inventores se sorprendieron al tener la capacidad de ensayar en forma específica triples formados entre substancias de ensayo de ácido nucleico de un solo hilo (por ejemplo, ssADN y ARN ) y objetivos de ácido nucleico de hilo doble (por ejemplo, dsADN). La formación triple y/o estabilización , se aumenta a través de la presencia de un agente de intercalado en la muestra que está siendo probada. Las substancia de ensayo adecuadas para utilizarse en el ensayo de la presente invención , incluyen , por ejemplo, ssADN , ARN , APN y otros análogos de ácido nucleico que tienen estructuras no cargadas o parcialmente cargadas. Aunque se prefieren muestras antiparalelas en ciertas modalidades, las substancia de ensayo de APN también pueden ser paralelas. Se prefieren las secuencias de substancia de ensayo que tienen cualquier longitud de 8 a 20 pares básicos, ya que este es el rango dentro del cual se encuentran las secuencias de ADN únicas más pequeñas de procariotos y eucariotos. Las substancias de ensayo de 1 2 a 1 8 pares básicos son particularmente preferidas, ya que esta es la longitud de las secuencias únicas más pequeñas en el genoma humano. En las modalidades, las substancias de ensayo de 6 a 30 pares básicos son las más preferidas. Sin embargo, se puede utilizar una pl uralidad de substancias de ensayo más cortas para detectar una secuencia de nucleótidos que tenga una pluralidad de secuencias objetivo no únicas en la misma, que combinen para identificar únicamente la secuencia de nucleótidos. La longitud de la substancia de ensayo puede ser seleccionada para emparejarse con la longitud del objetivo. La presente invención no requiere el uso de substancia de ensayo radioactivas, las cuales son peligrosas, tediosas y tardadas para utilizarse, y necesitan ser constantemente regeneradas. Las substancias de ensayo de la presente invención son preferentemente seguras de usar y estables durante años. Por lo tanto, las substancia de ensayo pueden ser elaboradas o compradas en grandes cantidades y almacenadas. Es preferible que la substancia de ensayo y el objetivo no estén marcados, aunque en modalidades alternativas, existe un agente de intercalado enlazado en forma covalente a la substancia de ensayo. En tales modalidades, el agente de intercalado está preferentemente enlazado a la substancia de ensayo en cualquier extremo. En otras modalidades, el agente de intercalado no está enlazado en forma covalente a la substancia de ensayo, aunque puede autoinsertarse entre la substancia de ensayo y el objetivo durante el ensayo, en un enlace de sentido a la substancia de ensayo de un modo no covalente. Los agentes de intercalado preferidos para utilizarse en la presente invención , incluyen , por ejemplo, YOYO- 1 , TOTO- 1 , bromuro de etidio, homod ímero- 1 de etidío, homod ímero-2 de etidio y acridina . En general , el agente de intercalado es una parte q ue tiene la capacidad de intercalarse entre hilos de un complejo de ácido nucleico doble y/o triple. En modalidades preferidas, el agente de intercalado (o un componente del mismo) es esencialmente no fluorescente en la ausencia de ácidos nucleicos y fluorece cuando se intercala y excita mediante radiación de una longitud de onda adecuada, exhibiendo un aumento de fluorescencia de 1 00 dobleces a 1 0, 000 dobleces cuando se intercala con un complejo de ácido nucleico doble o triple. En modal idades alternativas, el agente de i ntercalado puede exhibir un cambio en longitud de onda fluorescente al intercalarse y excitarse mediante la radiación de una longitud de onda adecuada. La longitud de onda fluorescente exacta puede depender de la estructura del ácido nucleico que es intercalado, por ejemplo, ADN vs. ARN , doble vs. Triple, etc. La longitud de onda de excitación se selecciona (mediante experimentación de rutina y/o conocimiento convencional), para corresponder con este máximo de excitación para el fluoroforo que está siendo utilizado, y es preferentemente de 200 a 1 000 nm . Los agentes de intercalado son seleccionados preferentemente para tener una longitud de onda de emisión de 200 a 1 000 nm . En modalidades preferidas, se utiliza un láser de ion de argón para irradiar el fluoroforo con luz que tenga una longitud de onda dentro de un rango de 400 a 540 nm, y se detecta la emisión fluorescente en un rango de 500 a 750 nm. El ensayo de la presente invención se puede llevar a cabo en una amplia variedad de temperaturas, tales como por ejemplo, de 5°C a 85°C . Ciertos ensayos de la técnica anterior requieren temperaturas elevadas, agregando costo y retraso al ensayo. Por otra parte, la presente invención se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o más baja (por ejemplo, a una temperatura de bajo de 25°C). El ensayo de la presente invención es extremadamente sensible, por lo que se elimina la necesidad de llevar a cabo una amplificación PCR del objetivo. Por ejemplo, en al menos las modalidades de intensidad fluorescente, es posi ble ensayar una muestra de prueba que tenga un volu men de aproximadamente 20 microlitros, que contiene aproximadamente 1 0 femtomoles de objetivo y aproximadamente 1 0 femtomoles de su bstancia de ensayo. Las modalidades de la presente invención , son los suficientemente sensibles para ensayar objetivos a una concentración de 5 X 1 0~9 M , preferentemente a una concentración de no más de 5 x 1 0~1 0 M . Las modalidades de la presente invención son lo suficientemente sensibles para emplear substancia de ensayo a una concentración de 5 X 10"9 M , preferentemente a una concentración de no más de 5 x 1 0" 1 0 M . Las medidas de conductividad pueden distinguir muestras que tienen tan poco como aproximadamente 1 pmole de substancia de ensayo y 1 pmole de objetivo en 40 microlitros. Al disminuir el volumen de la muestra se podrá permitir el uso de cantidades de substancia de ensayo y objetivo incluso más pequeñas. No se quiere decir que los valores anteriores, no pretendan sugerir que el método no puede detectar concentraciones más altas.

Se tolera un amplio rango de concentraciones de intercalador en cada concentración de substancia de ensayo y objetivo probada. Por ejemplo, cuando una substancia de ensayo de 5 X 1 0" 1 0 M y un objetivo de 5 X 1 0~ 10 M son hibridados, la concentración óptima del YOYO-1 intercalador fluctúa de 25 nM a 2.5 n M . A una concentración de 5 X 1 0"8 M tanto de la substancia de ensayo como del objetivo, la concentración YOYO-1 preferida fluctúa de 1 000 n M a 1 00 nM . El ensayo es lo suficientemente sensible para d istinguir un complejo de substancia de ensayo-objetivo de un par básico mal emparejado de un complejo de substancia de ensayo-objetivo de dos pares básicos mal emparejados, y preferentemente un complejo de substancia de ensayo-objetivo de dos pares básicos mal emparejados, de un complejo de substancia de ensayo-objetivo de tres pares básicos mal emparejados. Por supuesto, el ensayo es lo suficientemente sensible para distinguir un complejo de substancia de ensayo-objetivo perfectamente emparejado de cualesquiera de los complejos mal emparejados anteriores. El medio de hibridación puede ser cualquier medio convencional conocido por ser adecuado para conservar nucleótidos. Por ejemplo, ver la publicación de Sambrook et al . , "Molecular Cloning : A Lab Manual ," Vol . 2 ( 1 989). Por ejemplo, el medio líquido puede comprender nucleótidos, agua, amortiguadores y concentraciones de sal estándar. La hi bridación entre los pares básicos complementarios ocurre bajo una ampl ia variedad de condiciones que tiene variaciones en temperatu ra , concentraciones de sal , fuerza electrostática y composición de regulador. Los ejemplos para aplicar estas condiciones y métodos son conocidos en la técnica. Se prefiere que los complejos de hibridación se formen a una temperatura de aproximadamente 1 5°C hasta aproximadamente 25°C du rante de aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 5 minutos. No se requieren tiempos de reacción más largos, aunque la incubación du rante varias horas no afectará en forma adversa los complejos de hibridación .

Es posible (aunque innecesario, particularmente para modalidades que contienen un agente de intercalado) facilitar la hibridación en la solución utilizando ciertos reactivos. Los ejemplos preferidos de estos reactivos incluyen proteínas de enlace de un solo hilo, tales como proteína Rec A, proteína T4, proteína del gen 32 , proteína de enlace de un solo hilo E. coli , proteínas de enlace de ranuras de ácido nucleico mayor o menor, iones divalentes, iones polivalentes, viologén y substancias de intercalado tales, como bromuro de etidio, actinomicina D, psoralen , y angelicina. Tales reactivos de facilitación pueden probar utilidad en condiciones de operación extremas, por ejemplo, bajo niveles anormales de pH o temperaturas extremadamente altas. El ensayo de la presente invención se puede utilizar para identificar, por ejemplo, regiones accesibles en secuencias de nucleótidos dobladas, para determinar el número de pares básicos mal emparejados en un complejo de hibridación , y para trazar mapas de genomas. En las modalidades en donde la intensidad fluorescente se detecta utilizando un agente de intercalado, la intensidad incrementa, incrementando la afinidad de enlace entre la substancia de ensayo y el objetivo. Las modalidades en donde se detecta intensidad fluorescente utilizando un fluoroforo sin intercalado, la intensidad disminuye conforme incrementa la afinidad de enlace entre la substancia de ensayo y el objetivo. Sin considerar si el fluoroforo intercala o no, el método de la presente invención no requiere la medida de la polarización de fluorescencia, a diferencia de los métodos de anisotropía fluorescente. La presente invención será i l ustrada con mayor detalle con referencia a los siguientes Ejemplos, aunque q ueda entendido que la misma no se deberá considerar limitada por estos ejemplos. EJEM PLOS Ejemplo 1 Se sintetizaron secuencias objetivo ssADN 50-mer de sentido y antisentido derivado de exón 1 0 del gen de fibrosis qu ística humana (Nature 380, 207 ( 1 996)) en un sintetizador de ADN (Expediente 8909, PerSeptive Biosystems) y se purifican mediante H PLC. Se desnaturalizaron cantidades equimolares de oligonucleótidos complementarios a una temperatura de 95°C durante 1 0 mi nutos y se dejaron endurecer gradualmente conforme la temperatura se enfrío a 21 °C durante 1 .5 horas. Se disolvieron los oligonucleótidos de ADN de hilo doble (dsADN ) en dd H2O a una concentración de 1 pmole/µl .

La secuencia para el hilo de sentido del ADN objetivo de tipo natural (SEQ I D NO: 1 ): 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'. La secuencia para el hilo antisentido del ADN objetivo de tipo natural (SEQ I D NO: 1 ) : 5'-TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAT CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3' . La temperatura de fusión prevista (Tm) de dsADN (SEQ I D NO: 1 ) es de 65.2°C.

La SEQ ID NO: 2 fue una secuencia objetivo de dsADN mutante 50-mer idéntica al ADN objetivo de tipo natural (SEQ ID NO: 1) excepto para una mutación de un par básico (subrayado) en la posición del aminoácido 507, en la cual la secuencia de tipo natural CAT se cambió a CGT. La secuencia para el hilo de sentido de SEQ ID NO:2: 5'-TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT CGT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3". La secuencia para el hilo de antisentido de SEQ ID NO:2: 5' -TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA CGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'. La temperatura de fusión prevista (Tm) de dsADN (SEQ ID NO:2) es de 66.0°C. La SEQ ID NO:3 fue una secuencia objetivo de dsADN mutante idéntica al ADN objetivo de tipo natural (SEQ ID NO:1) excepto para una mutación consecutiva de dos pares básicos (subrayada) en las posiciones de los aminoácidos 506 y 507 en las cuales la secuencia de tipo natural CAT se cambia a ACT. La secuencia para el hilo de sentido de SEQ ID NO:3: 5' -TGG CAC CAT TAA AGA AAA TAT ACT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3'. La secuencia para el hilo antisentido de SEQ ID NO:3: 5' -TAT ATT CAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA GTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3'.

La temperatura de fusión prevista (Tm) de dsADN (SEQ I D NO : 3) es de 65.2°C . Las substancias de ensayo de APN utilizados en los Ejemplos fueron sintetizadas, purificadas con H PLC y confirmadas mediante espectroscopia de masa por Commonwealth Biotechnologies, I nc. (Richmond , VA, USA). Las substancias de ensayo de APN se disolvieron primero en 0.1 % de TFA (ácido trifluoroacético) a una concentración de 1 0 mg/ml , y posteriormente, se dil uyeron a 1 mg/ml medíante la adición de ddH2O. Se prepararon soluciones de reserva de APN finales en dd H2O a una concentración de 1 pmole/µl . La muestra No. 1 fue una substancia de ensayo de APN antiparalela 1 5-mer diseñada para ser completamente complementaria con un segmento de 1 5 nucleótidos del hilo de sentido del ADN objetivo de tipo natural 50-mer (SEQ I D NO: 1 ), traslapando los aminoácidos de las posiciones 505 a 51 0 (Nature 380. 207 ( 1 996)). La muestra tuvo la siguiente estructura (SEQ I D NO :8): 5' -H-CAC CAA AGA TGA TAT-Lis-CONH2-3' La mezcla de reacción de hibridación (80µl) conten ía los siguientes: 2 pmoles de dsADN objetivo, 2 pmoles de muestra de APN , 0.5X TBE y 250 nM de YOYO-1 intercalador de ADN (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Se colocaron las muestras en una cubeta de cuarzo de 3 mm y se sometieron a electrificación DC de 1 ó 5 volts (V) durante 1 5 segundos. El ensayo amperométrico consistió de monitorear la corriente mientras que estaba siendo aplicado el voltaje a la solución. Se colocó una muestra de temperatura en cada solución para medir la temperatura en el momento de la evaluación amperométrica. A 1 volt, se observó una corriente pico durante los primeros 2 segundos de electrificación. La corriente disminuyó en forma marcada durante los siguientes 13 segundos. Los experimentos que aplican 5 volts, originaron corrientes que permanecieron relativamente estables durante todo el período de electrificación (15 segundos). Se llevó a cabo una serie de experimentos en donde los valores de conductancia se observaron cuando no estuvo presente ADN ó APN (control), o cuando la SEQ ID NO:1, de tipo natural, la SEQ ID NO:2 mutante o la SEQ ID NO:3 mutante se hicieron reaccionar con la Muestra No. 1 de APN antiparalelo. Las figuras 1A y 1B trazan los datos obtenidos de la conductancia en los experimentos individuales. La figura 1A muestra los resultados de la aplicación de una electrificación de 1V, y la figura 1B muestra la aplicación de 5V. Los triples híbridos ADN:APN de hilo doble que consisten de secuencias perfectamente complementarias (SEQ ID NO:1 + Substancia de ensayo No. 1) permitieron una máxima intercalación de YOYO-1, produciendo los valores de conductancia más altos (ilustrados en las figuras como valores de corriente negativa) durante los 15 segundos de aplicación de 1V. La conductancia pico normalizada para la hibridación triple de la muestra de APN antiparalelo con un dsADN 1 pb mal emparejado de (SEQ ID NO:2 + Substancia de ensayo No. 1) y con el dsADN de 2 pb mal emparejados (SEQ I D NO : 3 + Su bstancia de ensayo No. 1 ), fueron 79% y 96% respectivamente menores a la observada con el híbrido triple dsADN :APN perfectamente emparejado (SEQ I D NO: 1 + Substancia de ensayo No. 1 ) durante el primer segundo de aplicación de voltaje (figura 1 A). Se obtuvieron disminuciones de porcentajes similares en conductancia entre tripletes completamente complementarios y tripletes que contienen malos emparejamientos de pares básicos cuando fueron promediados los valores de conductancia en los 1 5 segundos de aplicación de voltaje. En la figura 1 A los híbridos de dsADN :APN de 1 pb y 2 pb mal emparejados dieron como resultado valores de conductancia promedio que fueron 65% y 91 % menores, respectivamente, a los del h íbrido de dsADN :APN perfectamente emparejado. Todos los experimentos expresados en la figura 1 A se llevaron a cabo a temperatura ambiente (23°C). Conforme se incrementó el grado de mal emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo de hilo doble, disminuyó el nivel de intercalado mediante el YOYO-1 disminuido y el nivel de conductancia. Estas relaciones también se observaron cuando los experimentos referidos fueron repetidos y se aplicó un voltaje superior (5V). Du rante la aplicación de 5V los valores de conductancia promedio normalizados para el triple de dsADN :APN de 1 pb mal emparejado (SEQ I D NO: 2 + Substancia de ensayo No. 1 ) y el triple de dsADN :APN de 2 pares básicos mal emparejados (SEQ I D NO : 3 + Substancia de ensayo No. 1 ) fueron 52% y 67% respectivamente inferiores a los observados para el triple de dsADN:APN perfectamente emparejado (SEQ ID NO:3 + Substancia de ensayo No. 1) (figura 1B). Los experimentos expresados en la figura 1B se llevaron a cabo a temperatura ambiente (23°C). Cuando se repitieron los experimentos con la temperatura incrementada a 50°C y 65°C, se observaron valores amperométricos similares. A una temperatura de 50°C, la aplicación de 1V durante 15 segundos al triple de dsADN:APN perfectamente emparejado (SEQ ID NO:1 + Substancia de ensayo No. 1) produjo una corriente promedio de -0.25 µAmp comparado con los valores de -0.15 µAmp (una reducción del 40%) y -006 µAmp (una reducción de 76%) para el triplete de dsADN:APN de 1 par básico mal emparejado (SEQ ID NO:2 + Substancia de ensayo No. 1) y el triple de dsADN:APN de 2 pares básicos mal emparejados (SEQ ID NO:3 + Substancia de ensayo No. 1), respectivamente (figura 1C). Una temperatura de 65°C, se notaron observaciones similares cuando se aplicó 1V de electricidad durante 15 segundos. Los híbridos de ácido nucleico perfectamente emparejados produjeron una corriente promedio de -0.37 µAmp comparados con -0.16 µAmp (una reducción del 57%) y -0.01 µAmp (una reducción del 97%) para híbridos de 1 par básico y 2 pares básicos mal emparejados, respectivamente (figura 1C). La aplicación de 5 volts a temperaturas altas produjo resultados análogos. Aunque los experimentos llevados a cabo a una temperatura de 50°C generaron corrientes promedio de -0.27 mAmp, -0.13 mAmp (una reducción del 52%), y -0.08 mAmp (una reducción del 70%), para híbridos perfectamente emparejados, 1 h íbrido con un par básico mal emparejado, e híbridos de 2 pares básicos mal emparejados, respectivamente, los experimentos llevados a cabo a una temperatura de 65°C dieron como resultado valores de corriente promedio de -0.31 mAmp, -0. 14 mAmp (una reducción del 55%), y -0. 1 0 mAmp (una reducción del 68%) para los mismos tres grupos respectivos (figura 1 D). Para todos los experimentos anteriores, el dsADN no fue desnaturalizado antes de la hibridación tri ple con la substancia de ensayo No. 1 de APN antiparalelo. Se llevaron a cabo experimentos similares a temperaturas variadas después de que las mezclas de hibridación habían sido calentadas a una temperatura de 65°C e inmediatamente se dejaron enfriar. Después del enfriamiento a temperatura ambiente (23°C), la aplicación de 1 V durante 1 5 segundos a la muestra perfectamente emparejada (SEQ I D NO: 1 + Substancia de ensayo No. 1 ) produjo una corriente promedio de -0. 1 8 µAmp. Por comparación , los valores de -0.06 µAmp (una reducción del 67%) y -0.05 µAmp (una reducción del 72%) para el h íbrido triple de dsADN :APN de 1 par básico mal emparejado (SEQ I D NO:2 + Substancia de ensayo No. 1 ) y el híbrido triple de dsADN :APN de 2 pares básicos mal emparejados (SEQ I D NO:3 + Substancia de ensayo No. 1 ), fueron respectivamente observados (datos no mostrados). Cuando las muestras fueron enfriadas de 65°C a 50°C, se notaron observaciones similares cuando se aplicó de manera subsecuente 1 V durante 1 5 segundos. La substancia de ensayo perfectamente emparejada (SEQ I D NO: 1 + Substancia de ensayo No. 1 ) prod ujo una corriente promedio de -0.23 µAmp comparada con -0. 1 1 µAmp (una reducción del 52%) y -0.01 µAmp (una reducción del 96%) observada para las substancia de ensayo de 1 pb y 2 pb mal emparejados, respectivamente (datos no 5 mostrados). Cuando se aplicaron 5V después del enfriamiento a 23°C ó 50°C , la corriente promedio generada en el h íbrido triple perfectamente emparejado (SEQ I D NO: 1 + Substancia de ensayo No. 1 ), el h íbrido triple de 1 par básico mal emparejado (SEQ I D NO :2 + Substancia de ensayo No. 1 ), y el híbrido triple de 2 pb de 10 mal emparejados (SEQ I D NO: 3 + Substancia de ensayo No. 1 ), fueron de -0. 1 5 mAmp, -0.09 mAmp (una reducción de 40%), y -0.07 mAmp (una reducción del 53%), respectivamente a una temperatura de 23°C , y menos -0.23 mAmp, -0.09 mAmp (una reducción del 61 %), y -0.09 mAmp (una reducción del 61 %), respectivamente a una 15 temperatura de 50°C (datos no mostrados). El tratamiento previo de las mezclas de hibridación a una temperatura de 65°C (el Tm de las secuencias dsADN 50-mer) seguido por el enfriamiento no afectó de manera importante la diferencia en la conductancia observada entre los triples dsADN :APN 20 perfectamente complementarios hacia aquellos q ue conten ían 1 pb ó 2 pb mal emparejados cuando se midieron directamente a una temperatura de 23°C ó 50°C (sin calentamiento previo a 65°C) cuando se utilizó u na substancia de ensayo antiparalela de APN . Claramente, la substancia de ensayo antiparalela de APN en la 25 presencia del intercalador de ADN , YOYO-1 pudo formar estructuras ^^-^ m am^u ^tiOM triples con los objetivos de dsADN . La aplicación de los niveles bajos de electricidad (tales como 1 V ó 5V) permitió q ue las secuencias triples perfectamente emparejadas dsADN :APN se pudieran distinguir de aquellas que conten ían mutaciones 1 pb ó 2 pb, sin desnaturalización previa de las secuencias. Eiemplo 2 La figura 2 demuestra que el ensayo amperométrico de la invención , también puede diferenciar entre los h íbridos triples dsADN :APN emparejados, y aquellos que contienen 1 pb ó 2 pb mal emparejados cuando la substancia de ensayo de APN utilizada se encuentra en orientación paralela con respecto a la secuencia de ADN objetivo. La substancia de ensayo No. 2 fue una substancia de ensayo de APN 1 5-mer idéntica en la secuencia a la substancia de ensayo No. 1 , pero se sintetizó para emparejar la orientación paralela del ADN objetivo, en vez de la orientación antiparalela convencional . La substancia de ensayo No. 2 tuvo la siguiente estructura (SEQ I D NO: 9): 5' -H-TAT AGT AGA AAC CAC-LÍs-CON H2-3' Los experimentos con las condiciones de ensayo idénticas a las descritas en el ejemplo 1 , se llevaron a cabo con la única diferencia de que la substancia de ensayo No. 2 fue utilizada en vez de la substancia de ensayo No. 1 . Cuando se aplicó 1 volt la corriente promedio para 1 pb mal emparejado del triple dsADN :APN (SEQ I D NO: 2 + substancia de ensayo No. 2), y un 2 pb consecutivo mal emparejado del triple dsADN :APN (SEQ I D NO: 3 + substancia de ensayo No. 2), fueron respectivamente del 25% y el 32% más bajos a una temperatura de 23°C, respectivamente 30% y 23% más bajos a una temperatura de 50°C, y respectivamente del 28% al 53% más bajo a una temperatura de 65°C que los observados con el triple dsADN :APN perfectamente emparejado (SEQ I D NO : 1 + substancia de ensayo No. 2) en las temperaturas de unión (figura 2A). Se obtuvieron resultados similares cuando se aplicaron 5V (en vez de 1 V) durante 1 5 segundos. Los híbridos dsADN :APN perfectamente emparejados a temperaturas de 23°C, 50°C y 65°C generaron corrientes promedio de -0.1 5 mAmp, -0.24 mAmp y -0. 1 7 mAmp, respectivamente (figura 2B). Los tri ples que son complementarios de manera incompleta con 1 pb mal emparejado, y un 2 pb mal emparejado, produjeron corrientes promedio que fueron temperaturas de 27°C menos (-0.1 1 mAmp) y 53% menos (-0.07 mAmp), respectivamente en temperaturas de 23°C , 21 % menos (-0.1 9 mAmp) y 46% menos (-0. 1 3 mAmp), respectivamente en temperaturas de 50°C, y no cambiaron (-0. 1 7 mAmp) y 1 8% menos (-0. 14 mAmp), respectivamente a una temperatura de 65°C , que las logradas por las muestras h íbridas perfectamente emparejadas (figura 2B). Los resultados il ustrados en las figuras 2A y 2B indicaron que cuando se utilizó la substancia de ensayo de APN paralela No. 2 , las diferencias en la conductividad obtenidas entre los triples dsADN :APN perfectamente emparejados, y aquellos que contienen 1 pb ó 2 pb mal emparejados, fueron menos dramáticas que las que se *~.."hir -^¡— lograron con la substancia de ensayo de APN antiparalela No. 1 (figura 1 ). Sin embargo, los experimentos que comprenden la substancia de ensayo paralela No. 2 y la aplicación de 5V después de que las muestras habían sido calentadas a una temperatura de 65°C y que se permitió que se enfriaran inmediatamente, mostraron mediciones amperométricas, las cuales demostraron diferencias de señalización aumentadas entre los triples dsADN :APN perfectamente emparejados, y los triples dsADN :APN con 1 pb ó 2 pb mal emparejados (figura 2). Los híbridos perfectamente emparejados (SEQ I D NO : 1 + substancia de ensayo No. 2), y los h íbridos con 1 pb mal emparejado (SEQ I D NO: 2 + substancia de ensayo No. 2) y los híbridos con 2 pb mal emparejados (SEQ I D NO : 3 + substancia de ensayo No. 2) produjeron valores de conductancia promedio de -0. 1 9 mAmps, -0.08 mAmps y -0.06 mAmps, respectivamente en una temperatura de 23°C, -0. 1 7 mAmps, -0.09 mAmps y -0.07 mAmps, respectivamente en una temperatura de 50°C, y -0.23 mAmps, -0.1 3 mAmps y -0.08 mAmps, respectivamente en una temperatura de 65°C . Esto traducido en reducciones en la conductividad del 58% y 68% a temperaturas de 23°C, el 47% y 59% a temperaturas de 50°C, y el 43% y 65% en temperaturas de 65°C para las muestras de 1 pb y 2 pb mal emparejados, respectivamente, cuando son comparados con los valores logrados por las muestras perfectamente complementarias (figura 2C).

Por lo tanto, ambas substancias de ensayo de APN antiparalelas y paralelas en el ensayo amperométrico, tienen la capacidad de diferenciar entre los objetivos dsADN perfectamente complementarios, y los objetivos dsADN q ue no son complementarios por completo que contienen mutaciones 1 pb ó 2 pb. Eiemplo 3 La substancia de ensayoa No. 3, fue una substancia de ensayo de ssADN 1 5-mer idéntica en la secuencia y orientación a la substancia de ensayo de APN antiparalela 1 5-mer No. 1 (SEQ I D NO: 8). La substancia de ensayo No. 3 tuvo la siguiente estructura: 5' -CAC CAA AGA TGA TAT-3' La especificidad del ensayo amperométrico fue investigada adicionalmente, haciendo reaccionar la substancia de ensayo No. 3 de ssADN con las secuencias dsADN objetivo 50-mer de tipo natural y mutantes, en ausencia de desnatu ralización previa. Las condiciones del ensayo fueron idénticas a las que se describieron en el ejemplo 1 . Mejorados por el intercalador de ADN , YOYO-1 , los triples dsADN : ssADN se formaron en temperaturas entre 30°C y 65°C . El tratamiento con 1 volt, el triple de ADN perfectamente emparejado, que consistía de la SEQ I D NO: 1 + substancia de ensayo No. 3, produjo los valores más altos de conductividad (figura 3A). En contraste, las combinaciones objetivo y las muestras no perfectamente complementarias que generan 1 pb mal emparejado (SEQ I D NO: 2 + substancia de ensayo No. 3), y un 2 pb mal emparejado (SEQ I D NO : 3 + substancia de ensayo No. 3), dieron como resultado valores de conductancia promed io que fueron del 14% y el 64% inferiores en temperatura de 23°C , del 30% y 70% inferiores en temperaturas de 50°C, y del 25% y 72% inferiores a temperaturas de 65°C, respectivamente, que los observados con las secuencias perfectamente complementarias en las temperaturas de unión (figura 3A). La aplicación de un voltaje más alto (5V), a estas muestras dio como resultado diferencias amperométricas mayores, observadas entre las muestras emparejadas y las mal emparejadas, que las obtenidas en temperaturas de 1 V, particularmente en temperaturas inferiores. Después del tratamiento con temperaturas de 5V durante 1 5 segundos, las corrientes promedio para el triple de ADN 1 pb mal emparejado y el triple de ADN 2 pb mal emparejado fueron del 54% y 78% más bajas, respectivamente, en temperaturas de 23°C, 68% y 70% más bajas respectivamente en una temperatura de 50°C, y 33% y 61 % más bajos respectivamente, en una temperatura de 65°C, que las observadas con el triple de ADN perfectamente emparejado en temperaturas de unión (figura 3B). En experimentos similares de electricidad , las mezclas de hibridación fueron calentadas a una temperatura de 65°C, y ya sea , que se mantuvieran a esta temperatura o se permitiera que se enfriaran inmediatamente a una temperatura de 50°C ó 23°C antes de la aplicación del voltaje de 1 V ó 5V. U n tratamiento con 1 V durante 1 5 segundos para las secuencias triples de ADN perfectamente emparejadas (SEQ I D NO: 1 + substancia de ensayo No. 3) produjo los valores de conductancia más altos en temperaturas de 23°C, 50°C y 65°C (figura 3A). Los triples de ADN q ue contienen 1 pb mal emparejado (SEQ I D NO : 2 + substancia de ensayo No. 3) o 2 pb mal emparejados (SEQ I D NO: 3 + su bstancia de ensayo No. 3) fueron menos conductivos por un 21 % y 63%, respectivamente, en temperaturas de 23°C, por 1 8% y 74% , respectivamente en una temperatura de 50°C, y por un 12% y 1 06%, respectivamente en una temperatu ra de 65°C (figura 3A). De un modo similar, cuando se aplicaron 5V durante 1 5 segundos a las muestras previamente calentadas, los valores de conductancia promedio para las triples de ADN 1 pb mal emparejado, y los triples de ADN 2 pb mal emparejados fueron reducidos por un 24% y 1 04% , respectivamente en una temperatura de 23°C, por un 42% y 44% , respectivamente en una temperatura de 50°C, y por un 38% y 1 02% , respectivamente, en una temperatura de 65°C, cuando se comparan con los valores de conductancia promedio generados por los triples de ADN perfectamente emparejados (figura 3B). La observación de que la su bstancia de ensayo de APN antiparalela (figura 1 ) y la substancia de ensayo de ssADN (figura 3) se comportaron de un modo similar en el ensayo amperométrico, sugirió que la estructura de la entidad de ácido nucleico utilizada como muestra , no era particularmente importante. La presencia del YOYO- 1 permitió que los objetivos de dsADN y la substancia de ensayo de ssADN formaran una conformación de hél ice triple con capacidad para generar diferentes cargas eléctricas dependiendo del ^¡^m nivel de la capacidad de complemento de la secuencia entre el objetivo y la muestra en la solución . Conforme aumentaba el grado de disparidad entre la muestra y el objetivo, se disminuyó el nivel de conductancia, probando la confiabilidad del ensayo amperométrico, cuando se utilizó una substancia de ensayo de ADN natural en ausencia de desnaturalización previa. Eiemplo 4 En los ensayos amperométricos i l ustrados en los ejemplos del 1 al 3, el intercalador de ADN , YOYO- 1 , fue agregado a la solución que contiene las mezclas de hibridación . La intercalación por medio del YOYO- 1 facilitó la formación de los triples dsADN :APN , y los triples dsADN :ssADN . En el ejemplo 4 , se evaluó la posibil idad de utilizar una porción del intercalador enlazada de manera covalente a una substancia de ensayo de ssADN en el ensayo amperométrico. La acridina es una alternativa del intercalador de dsADN , que también posee la capacidad para intercalar estructuras triples de ácido nucleico, estabilizando de este modo la formación de la hélice triple. Ver por ejemplo, Kukreti et al . , "Extensión del rango de secuencias disponibles de ADN para la formación de hélice triple: estabilización de triples mal emparejados por medio de oligon ucleótidos que contienen acridina" (Extensión of the range of ADN sequences available for triple helix formation : stabil ization of mismatched triplexes by acridine-containing oligonucleotides 25 Nucleic Acids Research páginas 4264-4270 ( 1 997)). U na substancia de ensayo de ssADN con un contenido de molécula de acridina (Glen Research , Sterling , VA, EUA) enlazada covalentemente al extremo 3' fue sintetizada en un sintetizador de ADN (Expediente 8909, PerSeptive Biosystems) y purificada mediante H PLC . La substancia de ensayo No. 4 fue una substancia de ensayo de ssADN 1 5-mer idéntica en secuencia y orientación a la substancia de ensayo No. 3. 1 5-mer (y de este modo , también idéntica en la secuencia y orientación a la substancia de ensayo No. 1 de APN antiparalelo 1 5-mer (SEQ I D NO: 8) pero con la adición de una porción de acridina en la posición 3'. La substancia de ensayo ten ía la siguiente estructura: 5' -CAC CAA AGA TGA TAT-acridina-3' La mezcla de reacción de hibridación (80 µl) conten ía lo sig u iente: 2 pmoles de dsADN objetivo, 2 pmoles de ssADN substancia de ensayo No. 4 y O. dX TBE. Las muestras fueron colocadas dentro de un cubeta de cuarzo de 3 mm y sometidas a electrificación por corriente directa de 5V durante 1 1 segundos a una temperatura de 23°C. La corriente y las temperaturas se monitorearon , tal y como se describió en el ejemplo 1 . Tal y como se muestra en la figura 4, la substancia de ensayo de ssADN No. 4, tuvo la capacidad para hibridar con el objetivo dsADN perfectamente emparejado de 50-mer (SEQ I D NO: 1 ) como un resultado de la intercalación estable de la porción de acridina enlazada de manera covalente, generando una corriente promedio de -0.53 mAmp. A modo de comparación , los triples de ADN menos estables que contenían 1 pb mal emparejado (SEQ I D NO: 2 + substancia de ensayo No. 4) o 2 pb mal emparejados (SEQ I D NO: 3 + substancia de ensayo No. 4) produjeron corriente promedio que fueron del 52% y 66% inferiores, respectivamente, que las logradas por el triple de ADN perfectamente emparejado, cuando se normalizó contra el control (substancia de ensayo No. 4 sin ADN objetivo) (figura 4). Por lo tanto, la acridina enlazada a una substancia de ensayo de ssADN fue igual de eficiente q ue el YOYO-1 no enlazado, para formar las hélices triples de ADN que generaron corrientes eléctricas diferentes dependiendo del nivel de la capacidad de complementación de la secuencia entre el objetivo y la muestra en el ensayo amperométrico. Eiemplo 5 Las secuencias de ssADN 1 5-mer antisentido objetivo derivadas del exón 1 0 de un gen de fibrosis qu ística humana , fueron sintetizadas, purificadas y recocidas, tal y como se describió en el ejemplo 1 . Los oligonucleótidos de DsADN fueron disueltos en ddH20 en una concentración de 1 pmole/µl . La SEQ I D NO : 4 fue una secuencia objetivo de dsADN 1 5-mer derivada de SEQ I D NO : 1 , diseñada para ser perfectamente complementaria con la substancia de ensayo No. 1 . La secuencia para el hilo sentido del objetivo del ADN objetivo de tipo natural (SEQ I D NO: 4): 5' -ATA TCA TCT TTG GTG-3' . La secuencia para el hilo antisentido del ADN objetivo silvestre (SEQ I D NO: 4) : 5' -CAC CAA AGA TGA TAT-3' . . . . .. »*?t*k, La temperatura de fusión prevista (Tm) del dsADN (SEQ I D NO: 4) es de 40.0°C. La SEQ I D NO: 5 fue una secuencia objetivo de dsADN 1 5-mer mutante idéntica a la ADN objetivo de tipo natural (SEQ I D NO: 4) excepto por u na mutación de un par básico (señalado), en el cual la secuencia TTT se cambió por TAT. La secuencia para el hilo sentido del objetivo del ADN objetivo mutante (SEQ I D NO: 5): 5' -ATA TCA TCT ATG GTG-3' La secuencia para el hilo antisentido del ADN objetivo mutante (SEQ I D NO : 5): 5' -CAC CAÍ AGA TGA TAT-3' La temperatura de fusión prevista (Tm) del dsADN (SEQ I D NO: 5) es de 40.0°C . La SEQ I D NO : 6 fue una secuencia objetivo de dsADN 1 5-mer mutante idéntica al ADN objetivo de tipo natural (SEQ I D NO : 4) excepto por una mutación consecutiva del par básico (señalado), en la cual la secuencia ATC fue cambiada por GGC. La secuencia para el hilo sentido del ADN objetivo mutante (SEQ I D NO: 6): 5' -ATA TCG GCT TTG GTG-3'. La secuencia para el hilo antisentido del ADN objetivo mutante (SEQ I D NO: 6): 5' -CAC CAA AGC CGA TAT-3' La temperatura de fusión prevista (Tm) del dsADN (SEQ I D NO: 6) es de 44.0°C. La SEQ I D NO: 7 fue una secuencia objetivo de dsADN 1 5-mer mutante idéntica al ADN objetivo de tipo natural (SEQ I D NO: 4) excepto por una mutación de tres pares básicos separada (señalada), en donde tres mutaciones de 1 pb fueron separadas por un par básico cada una. Las secuencias ATC, TCT y TGG fueron cambiadas por ACC, TAT y TAG , respectivamente. La secuencia para el hilo sentido del ADN objetivo mutante (SEQ I D NO : 7): 5' -ATA CCA TAT TTA GTG-3' . La secuencia para el hilo antisentido del ADN objetivo mutante (SEQ I D NO: 7): 5'-CAC J_AA AJ_A TGG TAT-3' . La temperatura de fusión prevista (Tm) del dsADN (SEQ I D NO: 7) es de 38.0°C. La mezcla de reacción de hi bridación (80 µl) contenía lo siguiente: 2 pmoles del dsADN objetivo, 2 pmoles de la substancia de ensayo No. 2 de APN paralelo, 0.5X TBE, y 250 nM del intercalador de ADN , YOYO-1 . Las mezclas de reacción fueron incu badas a una temperatura de 95°C por un período de 5 a 1 0 mi nutos para permitir la desnatu ralización , y luego se mantuvo en 65°C hasta que se realizó el ensayo. Las muestras fueron colocadas en cubiletes de cuarzo, irradiados con un rayo láser de ion de argón que ten ía una longitud de onda de 488 nm y se monitoreo la emisión fluorescente a una temperatura de 65°C. Se lograron mediciones consecutivas de temperatura por medio de una muestra de temperatura controlada por el programa (software) colocado directamente dentro de cada muestra. La intensidad fluorescente máxima ocurrió en una longitud de onda de 536 nm , indicadora de la intercalación del YOYO- 1 en los híbridos de APN :ADN . Como el segundo ensayo, siguiendo la 5 i rradiación láser inicial de cada muestra, las mismas muestras fueron sometidas a la electrificación de corriente di recta de 1 V durante 4 segundos. Durante la segunda electrificación final de las muestras fueron irradiadas una segunda vez con un láser de ion de argón , y se monitoreo la emisión fluorescente a una temperatura de 65°C. Las 10 intensidades fluorescentes fueron trazadas como una función de la longitud de onda para cada una de las muestras analizadas. Los h íbridos SsADN :APN consistentes de secuencias perfectamente complementarias (SEQ I D NO: 4 + substancia de ensayo No. 2), permitieron una intercalación máxima de YOYO-1 , 15 produciendo las intensidades fluorescentes más altas (figura 5A). Las intensidades fluorescentes para los h íbridos de ssADN :APN con 1 pb mal emparejado (SEQ I D NO. 5 + substancia de ensayo No. 2), y un híbrido de ssADN :APN con 2 pb mal emparejados consecutivos (SEQ I D NO: 6 + substancia de ensayo No. 2), y un h íbrido 20 ssADN :APN con 3 pb mal emparejados separados (SEQ I D NO : 7 + substancia de ensayo No. 2) todos fueron inferiores que los observados con el h íbrido de ssADN :APN perfectamente emparejados a una temperatura de 65°C (figura 5 y datos no mostrados). Conforme au mentó el grado de disparidad entre la 25 muestra y el objetivo, disminuyó el nivel de intercalación de YOYO-1 , •j— *^—»- *-- -^ -••- - y de ah í el nivel de la intensidad fluorescente también disminuyó. Solamente se observaron los niveles de fondo de fluorescencia cuando no estaba presente ADN o APN (YOYO-1 sólo) (figura 5A). Cuando los h íbridos de ssADN :APN perfectamente emparejados fueron sometidos a IV de electricidad durante 4 seg u ndos a una temperatura de 65°C, la intensidad fluorescente permaneció relativamente constante, disminuyendo solamente un 2% (figura 5A). En contraste, la aplicación de 1 V a los dobles complementarios de manera incompleta con un contenido de 1 pb mal emparejado (figura 5B), y 2 pb mal emparejados (figura 5C9 y 3 pb mal emparejados (datos no mostrados) produjeron intensidades fluorescentes que fueron del 1 8% , 39% y 71 % inferiores, respectivamente, que los logrados con las mismas muestras irradiadas en la ausencia de electricidad . El tratamiento con dos niveles de electricidad (tales como 1 V) disminuyó todavía adicional mente la estabilidad de los híbridos de ssADN :APN que contienen 1 pb mal emparejado. Conforme d isminuyó el grado de capacidad de complemento de la secuencia entre la su bstancia de ensayo y el objetivo, disminuyó dramáticamente el nivel de intensidad fluorescente en la presencia de electricidad , proporcionando un segundo ensayo altamente confiable y exacto para diferenciar entre las secuencias perfectamente emparejadas, y aquellos que contienen mutaciones de 1 pb, 2 pb ó 3 pb. Ejemplo 6 El ensayo de hibridación del ejemplo 5 se llevó a cabo después de la desnaturalización de las secuencias de dsADN objetivo y la formación medida del híbrido ssADN :APN en una temperatura superior al punto de fusión (Tm) de los objetivos dsADN . El ejemplo 6 demostrará la confiabilidad del ensayo de intensidad fluorescente en ausencia y presencia de electricidad aplicada para diferenciar entre los pares perfectos, y los pares básicos mal emparejados ,sin el requerimiento de una desnaturalización previa . La mezcla de reacción de hibridación (80 µl) conten ía lo siguiente: 4 pmoles de dsADN objetivo, 4 pmoles de APN antiparalelo substancia de ensayo No. 1 , 0.5X TBE y 250 nM del intercalador de ADN YOYO-1 . Las muestras fueron colocadas en un cubeta de cuarzo, irradiadas con un rayo láser de ion de argón que tiene una long itud de onda de 488 nm durante 80 mseg y se monitoreó la emisión fluorescente a una temperatura de 23°C. Se lograron mediciones consecutivas de temperatura por una sonda de temperatura controlada por el programa (software), colocada directamente dentro de cada muestra. La intensidad fluorescente máxima ocurrió en una longitud de onda de 536 nm , indicadora de la intercalación de YOYO-1 en los híbridos de APN :ADN . Como segundo ensayo, siguiendo la irradiación láser inicial de cada muestra, las mismas muestras fueron sometidas a electrificación por corriente directa de 20V durante 4 segundos. I n mediatamente después de 3 segundos de electrificación , las muestras fueron irradiadas por segunda vez con un láser de ion de argón por 80 mseg y se monitoreó la emisión fluorescente en una temperatura de 23°C. La intensidades fluorescentes fueron trazadas como una función de la longitud de onda de cada muestra analizada . Los triples de dsADN-APN se formaron a una temperatura de 5 23°C , mejorados por el intercalador YOYO-1 . La intensidad fluorescente más alta se logró cuando la secuencia objetivo dsADN 50-mer de tipo natural (SEQ I D NO: 1 ) fue hibridada con la substancia de ensayo de APN antiparalelo 1 5-mer No. 1 (figura 6). A modo de comparación , las intensidades fluorescentes de los triples 10 de dsADN :APN con 1 pb mal emparejado (SEQ I D NO : 2 + substancia de ensayo No. 1 ) y un triple de dsADN :APN de 2 pb mal emparejados consecutivos (SEQ I D NO: 3 + substancia de ensayo No. 1 ) fueron del 60% y el 91 % más bajos, respectivamente que los observados con los triples de dsADN :APN perfectamente 15 emparejados a una temperatura de 23°C (figu ra 6). Cuando no ha estado presente ADN ó APN en la mezcla de reacción con el contenido de YOYO- 1 , se observaron solamente los niveles del fondo de fluorescencia . La diferencia en las intensidades fluorescentes obtenidas por 20 los triples perfectamente complementarios de aq uellos que contienen 1 pb ó 2 pb mal emparejados fueron significativamente mayores que los logrados entre los dobles perfectamente emparejadas y los dobles emparejados complementarias de manera incompleta (comparar figura 5 y 6). Claramente, el ensayo de intensidad 25 fluorescente de la formación de triples poseyó habilidades ^.Alti&ÉÉi. discriminatorias mejoradas para detectar los pares básicos mal emparejados. Además, con la aplicación secundaria de electricidad , fue posible todavía una discriminación adicional , entre las secuencias de tipo natural y las mutadas. Un tratamiento de 20V durante 3 segundos a los triples de dsADN :APN perfectamente emparejados, produjo un espectro de intensidad fluorescente virtualmente idéntico al logrado por la misma muestra que no fue sometida a la electricidad (figura 6). Sin embargo, la aplicación de 20V durante 3 segundos a los triples complementarios de manera incompleta que conten ían 1 pb mal emparejado y 2 pb mal emparejados produjeron intensidades fluorescentes que fueron 23% y 71 % más bajas, respectivamente, que las obtenidas con la misma muestra irradiada en ausencia de electricidad (figura 6). El tratamiento con 20V de electricidad no afectó la estabilidad de los triples perfectamente complementarios, pero debilitó la estabilidad de los triples de dsADN :APN que contienen estos pares básicos mal emparejados en un nivel dependiente del grado de la capacidad de complementación de la secuencia entre la substancia de ensayo y el objetivo. Por lo tanto, la aplicación de electricidad al ensayo de intensidad fluorescente produjo un ensayo todavía más altamente confiable para distinguir entre las secuencias de tipo natural , y aq uellas que contienen mutaciones de 1 pb ó 2 pb, sin desnaturalización previa de las secuencias.

Aunque la presente invención ha sido descrita en detalle y con referencia a los ejemplos específicos de la misma , aquellos expertos en la técnica apreciarán que se le pueden hacer a la misma varios cambios y modificaciones si n salirse del espíritu y alcance de la invención .

LISTA DE SECUENCIAS <110> Picard, Pierre Da sis, Jasmine Erikson, Glen < 120 > ENSAYO HOMOGÉNEO DE HIBRIDACIÓN DOBLE O TRIPLE POR MEDIO DE MEDICIONES MÚLTIPLES BAJO CONDICIONES VARIADAS < 130 > E1047 /20031 <140> <141> <160> 9 <I7&-> Paze~ zZt. \er 2. <210> X <211> 50 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> < 223 > Descripción de la Secuencia Artificial derivada del exon 10 del gen de fibrosis quistica humana < 400 > 1 tggcaccatt aaagaaaata tcatctttgg tgtttcctat gatgaatatr 50 <210> 2 <211> 50 <212 > ADN <213 > SECUENCIA ARTIFICIAL <220> < 223 > Descripción de la Secuencia Artificial derivada del exón 10 del gen de fibrosis quística humana <400 > 2 tggcaccatt aaagaaaata tcgtctttgg tgtttcctat gatgaatata 50 10 <210> 3 <211> 50 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL c220> - J < 223 > Descripción de la Secuencia Artificial derivada del exón 10 del gen de fibrosis quísüca humana <400> 3 tggcaccatt aaagaaaata tactctttgg tgtttcctat gatgaatata 50 0 <210> 4 <211> 15 <212> ADN <213 > SECUENCIA ARTIFICIAL <22ü> 5 < 223 > Descripción de la Secuencia Artificial derivada del exon 10 del gen de fibrosis quistica humana <400> 4 atatcatctt tsgtg 15 <210> 5 <211> 15 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial derivada del exon 10 del gen de fibrosis quistica humana <400> 5 atatcaccta sg— 1? <210> 6 <211> 15 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> < 223 > Descripción de la Secuencia Artificial derivada del exon 10 del gen de fibrosis quistica humana <400> 6 <210> 7 <211> 15 <212> ADN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> < 223 > Descripción de la Secuencia Artificial derivada del exón 10 del gen de fibrosis quística humana <400> 7 ataccatatt tagtg 15 <210> 8 <211> 15 <212> APN <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial Substancia de Ensayo ssAPN <400> 8 caccaaagat gatat 15 <210> 9 <211> 15 <212> APN < 213 > Secuencia Artificial 220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial Substancia de Ensayo ssAPN <400> 9 tatagtagaa accac 5 10 15 20 25 ^áiMriilÉa^lilíMlákÉfiilB

Claims (1)

1. REIVI N DICACION ES 1 . U n método para ensayar una hibridación específica de la secuencia, comprendiendo el método: proporcionar un objetivo que comprende al menos una 5 secuencia de ácido nucleico; proporcionar una substancia de ensayo que comprende un ácido nucleico o una secuencia análoga de ácido nucleico; agregar la substancia de ensayo y el objetivo a un medio de hibridación para producir una muestra de prueba; 10 aplicar un primer estímulo a la muestra de prueba para producir una primera muestra de prueba estimulada ; detectar una primera señal de la primera muestra de prueba estimulada en donde la primera señal está correlacionada con una afinidad de enlace entre la substancia de ensayo y el objetivo; 15 calibrar la primera señal contra una señal de referencia exhi bida por una muestra de referencia que comprende al menos una substancia de ensayo de referencia combinada con el objetivo, y en donde cada u na de dichas muestras, en relación con el objetivo y al menos una substancia de ensayo de referencia es un miembro 20 diferente seleccionada del grupo consistente de un par perfecto, un par básico mal emparejado, dos pares básicos mal emparejados, tres pares básicos mal emparejados, una eliminación de un básico, una eliminación de dos básicos, y una eliminación de tres básicos; AtiU^l áá ?m im determinar a partir de dicha calibración una primera determinación de un grado de coincidencia entre la prueba y el objetivo; aplicar un segundo estímulo a la primera muestra de prueba estimulada para producir una segunda muestra de prueba estimulada; detectar una segunda señal de la segunda muestra de prueba estimulada , en donde la segunda señal está correlacionada con la afinidad de enlace entre la substancia de prueba y el objetivo; determinar a partir de la detección de la segunda señal , una segunda determinación del grado de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo, y comparar la primera determinación y la segunda determinación . 2. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , el cual comprende además la cuantificación de la afin idad de enlace. 3. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde el método es un ensayo homogéneo realizado sin desnaturalización previa del objetivo. 4. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde el método es un ensayo homogéneo realizado sin la amplificación PCR del objetivo. 5. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde la muestra de prueba comprende además un agente de intercalación y el objetivo es dsADN , y la muestra se hibridan específicamente con el objetivo para formar un triple. 6. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde la muestra es ssADN ó ARN . 7. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde la muestra tiene una estructura parcialmente cargada . 8. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde la muestra tiene una estructura no cargada. 9. El método tal y como se describe en la reivindicación 8, en donde la muestra comprende una secuencia de ssAPN . 1 0. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde la muestra es ssAPN preparado por síntesis antiparalela . 1 1 . El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde la substancia de ensayo y el objetivo son de longitud idéntica. 1 2. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde la substancia de ensayo es de un largo de 6 a 30 nucleótidos. 1 3. El método tal y como se descri be en la reivindicación 1 , llevado a cabo en una solución dentro de un depósito, o sobre una superficie impermeable. 14. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , realizado en un biochip. 1 5. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , el cual comprende además la variación de una condición de la primera muestra de prueba estimulada antes de la aplicación del segundo estímulo, en donde la variación es suficiente para afectar de manera importante la hibridación complementaria de manera imperfecta entre la substancia de prueba y el objetivo, e insuficiente para afectar de manera importante la hibridación perfectamente complementaria entre la substancia de ensayo y el objetivo. 1 6. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 5, en donde la variación comprende la aplicación de un voltaje eléctrico a la primera muestra de prueba estimulada , y la afinidad de enlace está directamente correlacionada con una diferencia entre la primera señal y la segunda señal . 1 7. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 6, en donde el voltaje eléctrico es de aproximadamente 1 volt a aproximadamente 20 volts. 1 8. El método tal y como se describe en la reivindicación 16, en donde el voltaje eléctrico es, ya sea corriente di recta, o corriente alterna. 1 9. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde la primera señal o la segunda señal es una conductancia eléctrica. 20. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 9, en donde la conductancia eléctrica indica un grado de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo. 21 . El método tal y como se describe en la reivindicación 20, en donde la conductancia eléctrica es comparada con una conductancia eléctrica de referencia del medio de hibridación antes de la adición de la substancia de ensayo y el objetivo. 22. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, en donde se mide un amperage inicial máximo logrado. 23. El método tal y como se describe en la reivindicación 22 , en donde se mide un índice de disminución del amperage proveniente del amperage pico inicial máximo. 24. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, en donde es medido el amperage por un tiempo de aplicación del voltaje eléctrico. 25. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, en donde el método es suficientemente sensible para distinguir un complejo de substancia de ensayo-objetivo mal emparejado por un par básico de un complejo de substancia de ensayo-objetivo mal emparejado por dos pares básicos. 26. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, en donde el método es lo suficientemente sensible para distinguir un complejo de substancia de ensayo-objetivo perfectamente complementario de un complejo de substancia de ensayo-objetivo con un par básico mal emparejado, y de un complejo de substancia de ensayo-objetivo con dos pares bádico mal emparejados. 27. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, en donde la muestra de prueba comprende además un agente de intercalación , el objetivo es dsADN , y la substancia de ensayo hi bridan específicamente con el objetivo para formar un triple. 28. El método tal y como se descri be en la reivindicación 20, en donde la substancia de ensayo es ssADN . 29. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, en donde la substancia de ensayo es APN . 30. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , el cual comprende además: proporcionar un fluoroforo de la muestra de prueba ; y calibrar la segunda señal contra u na segu nda señal de referencia , en donde: (a) el primer estímulo es voltaje eléctrico, la primera señal es conductancia eléctrica, el segundo estímulo es radiación de excitación , y la segunda señal es intensidad fluorescente; o (b) el primer estímulo es radiación de excitación , la primera señal es intensidad fluorescente, el segundo estímulo es voltaje eléctrico y la segunda señal es conductancia eléctrica. 31 . El método tal y como se describe en la reivindicación 30, en donde el fluoroforo está enlazado de manera covalente a la substancia de ensayo de modo que el fluoroforo no se intercala entre bases adyacentes, y disminuye la intensidad conforme aumenta el grado de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo. 32. El método tal y como se describe en la reivindicación 30, en donde el fluoroforo es un agente de intercalación , y aumenta la intensidad junto con el grado de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo. 33. El método tal y como se describe en la reivindicación 30, en donde el fluoroforo es un agente de intercalación enlazado de manera covalente a la substancia de ensayo. 34. El método tal y como se describe en la reivindicación 30, en donde el fluoroforo es un agente de intercalación agregado al medio de hibridación en una forma libre de la substancia de ensayo y libre del objetivo. 35. El método tal y como se describe en la reivindicación 30, en donde la muestra de prueba comprende además un agente de intercalación , el objetivo es dsADN y la substancia de ensayo hibridan específicamente con el objetivo para formar un triple. 36. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 5, el cual comprende además proporcionar un fluoroforo en la muestra de prueba, en donde la variación comprende la aplicación de un voltaje eléctrico a la primera muestra de prueba estimulada , el primer estímulo y el segundo estímulo son radiación de excitación , y la primera señal y la segunda señal son intensidad fluorescente. 37. El método tal y como se describe en la reivindicación 36, el cual comprende además la calibración de la seg unda señal contra la primera señal para determinar un grado de emparejamiento entre la muestra y el objetivo. 38. El método tal y como se describe en la reivindicación 36 , en donde el fluoroforo está enlazado de manera covalente a la substancia de ensayo de modo que el fluoroforo no se intercala entre las bases adyacentes, y la intensidad disminuye conforme aumenta el g rado de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo. 39. El método tal y como se describe en la reivindicación 36, en donde el fluoroforo es un agente de intercalación , y la i ntensidad aumenta j u nto con el grado de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo. 40. El método tal y como se describe en la reivindicación 36, en donde el fluoroforo es un agente de intercalación enlazado de manera covalente a la substancia de ensayo. 41 . El método tal y como se describe en la reivindicación 36, en donde el fluoroforo es un agente de intercalación agregado al medio de hibridación en una forma libre de la substancia de ensayo y libre del objetivo. 42. El método tal y como se describe en la reivindicación 36, en donde el fluoroforo es un agente de intercalación seleccionado del grupo consistente de YOYO-1 , TOTO-1 , bromuro de etidio, homodímero-1 de etidio, homodímero-2 de etidio y acridina . 43. El método tal y como se describe en la reivindicación 36 , en donde la muestra de prueba comprende además un agente de intercalación , el objetivo es dsADN , y la substancia de ensayo hibridan específicamente con el objetivo para formar un triple. 44. El método tal y como se describe en la reivindicación 36, en donde el método es un ensayo homogéneo realizado sin proporcionar un agente de extinción de la señal en el objetivo o en la substancia de ensayo. 45. El método tal y como se descri be en la reivindicación 36, en donde la radiación de excitación es emitida a partir de un láser de ion de argón en una longitud de onda de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1 000 nm . 46. El método tal y como se describe en la reivindicación 36, cond ucido en temperaturas dentro de un rango de 5 a 85°C. 47. El método tal y como se describe en la reivindicación 36, llevado a cabo en temperaturas inferiores a 25°C. 48. El método tal y como se describe en la reivindicación 36 , en donde la confiabilidad del método es independiente de la secuencia básica de la su bstancia de ensayo o el objetivo e i ndependiente del contenido de guanid ina y citosina de la substancia de ensayo o el objetivo. 49. El método tal y como se describe en la reivindicación 36, en donde la muestra de prueba tiene un volumen de aproximadamente 20 microlitros que contiene aproximadamente 1 0 femtomoles de objetivo y aproximadamente 1 0 femtomoles de su bstancia de ensayo. 50. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , en donde la muestra de prueba tiene un volumen de aproximadamente 40 microlitros con un contenido de aproximadamente 1 pmole de objetivo y aproximadamente 1 pmole de substancia de ensayo. 51 . El método tal y como se describe en la reivindicación 36, en donde u na concentración del objetivo en la muestra no es mayor de 5 x 1 0-1 0 M . 52. El método tal y como se describe en la reivindicación 51 , en donde la concentración de la substancia de ensayo en la muestra no es mayor de 5 x 1 0" 1 0 M . 53. El método tal y como se describe en la reivindicación 36, en donde el fluoroforo es un agente de intercalación y una longitud de onda en la cual dicho agente de intercalación cambia la fluorescencia a una segunda longitud de onda, al momento de la intercalación , y una diferencia entre la primera longitud de onda y la segunda longitud de onda indican si un complejo entre la substancia de ensayo y el objetivo es un doble o un triple y si el objetivo es ADN ó ARN . 54. U n método para ensayar la hibridación , comprendiendo dicho método: proporcionar un objetivo que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico; proporcionar una substancia de ensayo que comprende un ácido nucleico o una secuencia análoga de ácido nucleico; agregar la substancia de ensayo y el objetivo a un medio de hibridación para producir una muestra de prueba ; medir una primera señal de una pri mera cond ición de la muestra de prueba para producir u na determinación primaria con respecto a la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo en donde la primera señal está correlacionada con la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo; medir una segunda señal de una segunda condición de la muestra de prueba para proporcionar una determinación secundaria 5 con respecto a la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo, en donde la segunda señal está correlacionada con la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo, a condición de que cuando la primera condición y la seg unda condición son similares, se aplica un estímulo a la muestra de prueba después de 10 medir la primera señal y antes de medir la seg unda señal , en donde el estímulo afecta de manera importante la hibridación complementaria imperfecta entre la substancia de ensayo y el objetivo, y no afecta de manera importante la hibridación perfectamente complementaria entre la substancia de ensayo y el 15 objetivo; y comparar la determinación primaria y la determinación secundaria para evaluar si cualquier inconsistencia entre ellas amerita una nueva prueba. 55. El método tal y como se describe en la reivindicación 54, 20 en donde la primera señal es una emisión fl uorescente y la segunda señal es una conductancia eléctrica. 56. El método tal y como se describe en la reivindicación 54, el cual comprende además la aplicación de voltaje a la muestra de prueba antes o durante la medición de la primera señal . -"-—"-• •--"- • - T— . . -??^m?u 57. El método tal y como se describe en la reivindicación 54, el cual comprende una nueva prueba de la muestra de prueba cuando la determinación pri maria difiere de la determinación secundaria. 58. El método para ensayar la hibridación , comprendiendo dicho método: proporcionar un objetivo que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico; proporcionar una substancia de ensayo que comprende un ácido nucleico o una secuencia análoga de ácido nucleico; agregar la substancia de ensayo y el objetivo a un medio de hibridación para producir una muestra de prueba ; medir una intensidad fluorescente previa a la electrificación de la muestra de prueba para proporcionar una determinación primaria con respecto a la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo, en donde la intensidad fluorescente previa a la electrificación está correlacionada con la hibridación de la substancia de ensayo y el objetivo; aplicar un voltaje a la muestra de prueba; medir una intensidad fluorescente previa a la electrificación de la muestra de prueba durante o después de la aplicación de voltaje, para proporcionar una determinación secundaria con respecto a la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo, y en donde la intensidad fluorescente posterior a la electrificación está correlacionada con la hibridación entre la substancia de ensayo y el objetivo; y comparar la determinación primaria y la determinación secundaria para evaluar si cualquier inconsistencia entre ellas amerita una nueva prueba. 59. El método tal y como se describe en la reivindicación 58, 5 en donde el voltaje aplicado a la muestra de prueba es variado de modo que la intensidad previa a la electrificación y la intensidad posterior a la electrificación son relativamente constantes cuando se prueban complejos de substancia de ensayo -objetivo perfectamente complementarios, y la intensidad posterior a la electrificación difiere 10 de la intensidad previa a la electrificación cuando se prueban complejos de substancia de ensayo-objetivo complementarios de manera imperfecta, y una diferencia entre la intensidad previa a la electrificación y la intensidad posterior a la electrificación indica un grado de mal emparejamiento entre la substancia de ensayo y el 15 objetivo. 60. El método tal y como se describe en la reivindicación 1 , el cual comprende además, detectar si el objetivo contiene homózigos o alelos heterózigos. 61 . Un método para ensayar una hibridación específica de 20 una secuencia el cual comprende: proporcionar un objetivo que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico; proporcionar una substancia de ensayo que comprende un ácido nucleico o una secuencia análoga de ácido nucleico; - -»--»**'*-*- agregar la substancia de ensayo y la prueba a un medio de hibridación para producir una muestra de prueba; aplicar un voltaje eléctrico a la muestra de prueba ; detectar una señal de la muestra de prueba durante o después de la aplicación del voltaje eléctrico, en donde la señal está correlacionada con una afinidad de en lace entre la substancia de ensayo y el objetivo; calibrar la señal contra la señal de referencia exhibida por una muestra de referencia que comprende al menos una substancia de ensayo de referencia combinada con el objetivo, y en donde en relación con el objetivo, cada una de las substancias de ensayo y al menos una substancia de ensayo de referencia es un miembro diferente seleccionado del grupo consistente de un emparejamiento completo, una base mal emparejada , dos bases mal emparejadas, tres bases mal emparejadas, una eliminación de una base, una eliminación de dos bases, y una eliminación de tres bases; y determinar a partir de dicha calibración un grado de emparejamiento entre la substancia de ensayo y el objetivo.