MXPA02004954A

MXPA02004954A - Proteina fluorescente de expresion en ratones transgenicos bajo el control del promotor de nestina.

Info

Publication number: MXPA02004954A
Application number: MXPA02004954A
Authority: MX
Inventors: N Enikolopov Grigori
Original assignee: Cold Spring Harbor Lab
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-11-14
Publication date: 2003-02-27
Also published as: CN1411470A; WO2001036482A8; JP2003514550A; US20020178460A1; EP1235857A1; AU1603701A; WO2001036482A1; CA2392051A1

Abstract

Se producen mamiferos transgenicos no-humanos que tiene, incorporado a su genoma, ADN que incluye una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamifero, ligada operativamente a un gen que codifica para una proteina marcador/informador. La secuencia reguladora puede incluir un promotor y una secuencia presente en el segundo intron del gen de nestina de mamifero. Preferiblemente, la proteina marcador/informador es una proteina fluorescente, por ejemplo una proteina fluorescente verde, modificada para fluorescencia potenciada. Se observan poblaciones de celulas impulsoras y progenitoras multipotentes, y en particular neurales, en los organos del mamifero no-transgenico o progenie del mismo. Las celulas impulsoras y progenitoras multipotentes se aislan directamente desde el mamifero transgenico no-humano, progenie o embrion del mismo, por ejemplo por FACS, sin pasos de cultivo.

Description

RATONES TRANSGENICOS QUE EXPRESAN PROTEINA FLUORESCENTE SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es una continuación-en-parte de la solicitud de la Patente estadounidense No. 09/444.335, registrada el 19 de noviembre de 1999, cuyas directrices completas se incorporan aquí como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se cree en general que las células del sistema nervioso central (SNC) se originan desde el neuroectodermo de la placa neural en la parte dorsal del embrión. Después del cierre del tubo neural, las células del neuroepitelio se diferencian para formar células neuronales y gliales. Una característica de las células impulsoras y progenitoras neurales es la expresión de nestina, una proteína de filamento intermedio. Las células impulsoras y progenitoras neurales se obtienen generalmente del cerebro desarrollado o adulto y se cultivan in vi tro como cultivos celulares, típicamente durante largos períodos de tiempo. Las colonias que expresan ciertos marcadores, por ejemplo nestina, pueden ser identificadas, aisladas y expandidas. Sin embargo, las células obtenidas por este procedimiento se someten a repetidos pasos de cultivo y ya no son las células recogidas originalmente. Se pueden perder las propiedades que caracterizan a las células originales. Por ejemplo, el cultivo in vi tro prolongado puede dar lugar a células progenitoras que, aunque aún no diferenciadas completamente en células neurales (neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, etc.) han perdido el verdadero carácter de células impulsoras neurales multipotentes. Además, la técnica antes señalada no permite el aislamiento de células progenitoras multipotentes tempranas que retienen especificidad regional y expresan marcadores específicos para una u otra región del sistema nervioso central, conservando al mismo tiempo su capacidad de generar células diferenciadas de diversos tipos. Por tanto, existe la necesidad de contar con métodos para aislar células impulsoras y progenitoras directamente de un animal o de un embrión, sin necesidad de un prolongado cultivo in vi tro .

COMPENDIO DE LA INVENCION La invención se refiere a un mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo que tiene integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero. El gen de nestina es expresado en células impulsoras y progenitoras multipotentes proliferantes y es regulado descendentemente una vez que las células impulsoras multipotentes y progenitoras se diferencian y pierden su carácter multipotente. Ligado operativamente a la secuencia reguladora del gen de nestina del mamífero, está un gen que codifica para una proteína fluorescente. En un modo de realización, las células impulsoras y progenitoras multipotentes son células impulsoras y progenitoras neurales. En otro modo de realización, la proteína fluorescente se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras multipotentes. Aún en otro modo de realización de la invención, el ADN incluye un promotor, un gen que codifica para una proteína fluorescente (por ejemplo, una proteína fluorescente verde) una secuencia del segundo intron de un gen de nestina de mamífero, donde el gen que codifica para la proteína fluorescente se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo. La invención se refiere además a un método para producir un mamífero transgénico no-humano que expresa para una proteína fluorescente en células impulsoras y progenitoras multipotentes. El método comprende introducir, en un óvulo fertilizado de un mamífero no-humano, ADN que comprende una sentencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína fluorescente que se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero no-humano. El óvulo fertilizado que tiene ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína fluorescente se introduce en un mamífero no-humano de la misma especie y se deja que éste produzca progenie. La progenie consiste en mamíferos transgénicos no-humanos. El método incluye además la selección de la progenie del mamífero transgénico no-humano, obtenida como se ha descrito antes, progenie de mamífero no-humano cuyas células impulsoras y progenitoras multipotentes expresan el gen fluorescente . Además la invención se refiere a un constructo o vector de expresión y también a la célula que lo comprende. El constructo de expresión incluye una secuencia de promotor, un gen que codifica para proteína fluorescente verde y secuencia reguladora presente en el segundo intrón del gen de nestina del mamífero. En un modo de realización preferido, el promotor es un promotor de un gen de nestina. La invención se refiere también a células que lo incluyen. La invención se refiere además a un método para medir una población de células impulsoras y progenitoras multipotentes en un órgano de un animal o región del mismo. El método comprende la medida de células que fluorescen desde el órgano, o región del mismo, de un mamífero transgénico no-humano que tiene integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína fluorescente, donde el gen que codifica para la proteína fluorescente se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano. Las células que fluorescen son células impulsoras y progenitoras multipotentes . También está relacionado con la invención un método para obtener células impulsoras y progenitoras multipotentes, primarias, no-cultivadas, que comprende aislar células que expresan una proteína marcador/informador (por ejemplo proteína fluorescente) de un mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo, que tiene integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de un mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para la proteína marcador/informador (por ejemplo proteína fluorescente) . El gen que codifica para la proteína marcador/informador se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo. En un modo de realización, las células impulsoras y progenitoras multipotentes son células impulsoras y progenitoras neurales. En otro modo de realización, la proteína marcador/informador se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras multipotentes. Aún en otro modo de realización, la proteína marcador/informador es una proteína fluorescente y las células fluorescentes se aislan por selección de células fluorescentes activadas. La invención se refiere también a células obtenidas o aisladas por estos métodos. Además, la invención se refiere a un método para evaluar la capacidad de compuestos para promover la diferenciación de células impulsoras y promotoras multipotentes. El método comprende: contacto de células impulsoras y progenitoras multipotentes capaces de diferenciación, que tienen integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína mercador/informador (por ejemplo proteína fluorescente) donde el gen que codifica para la proteína marcador/informador se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes, con un compuesto que se evalúa; determinación de la medida de proteína marcador/informador (por ejemplo fluorescencia) de las células vivas en presencia del compuesto; y comparación de la medida de proteína marcador/informador de células, en presencia del compuesto, con la medida de proteína marcador/informador de células vivas de control . Una reducción o ausencia de la medida del marcador/informador de células vivas en- presencia del compuesto comparada con la medida del marcador/informador de las células vivas de control es indicativo de la capacidad del compuesto para promover la diferenciación de células impulsoras y progenitoras multipotentes. Otro método de la presente invención es un método para evaluar la toxicidad de compuestos para células impulsoras y progenitoras multipotentes. La toxicidad de un compuesto se puede evaluar por su capacidad para matar células impulsoras y progenitoras multipotentes. El método comprende poner en contacto células impulsoras y progenitoras vivas, que llevan integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína marcador/informador (por ejemplo proteína fluorescente) , donde el gen que codifica para proteína marcador/informador es expresado en células impulsoras y progenitoras, con el compuesto que se va a evaluar. Se realiza una medida de la proteína marcador/informador de células vivas fluorescentes en presencia del compuesto y se compara con la medida de la proteína marcador/informador de células control . Una reducción o ausencia de medida de la proteína marcador/informador de células vivas en presencia del compuesto comparada con la medida de células control es indicativa de la toxicidad del compuesto para las células impulsoras y progenitoras multipotentes. Otro de los aspectos de la invención está dirigido a la evaluación de un compuesto en cuanto a su capacidad de promover diferenciación de células impulsoras y progenitoras vivas totipotentes en células impulsoras y progenitoras multipotentes. En el método, las células impulsoras y progenitoras totipotentes vivas que tienen integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero, ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína marcador/informador (por ejemplo un gen que codifica para una proteína fluorescente) , donde el gen marcador/informador que se expresa en las células se pone en contacto con el compuesto que se va a evaluar. Se determina la medida de la proteína marcador/informador (por ejemplo fluorescencia) de las células en presencia del compuesto y se compara con la medida de la proteína marcador/informador de células de control. Un aumento en la medida de la proteína marcador/informador de células en presencia del compuesto comparada con la medida de la proteína marcador/informador de células control es indicativo de la diferenciación de las células totipotentes en células impulsoras y progenitoras multipotentes. Asimismo, la presente invención se refiere a un método para evaluar la capacidad de un compuesto para promover diferenciación de células impulsoras y progenitoras multipotentes en células neurales. En este método, si las células que se investigan son células impulsoras y progenitoras multipotentes, una reducción en la medida de la proteína marcador/informador (por ejemplo fluorescencia) de células en la presencia del compuesto comparada con la medida de la proteína marcador/informador de células control es indicativa de la capacidad del compuesto para promover diferenciación de las células impulsoras y progenitoras multipotentes en células neurales.

La invención tiene numerosas ventajas. Por ejemplo, en la práctica de la invención, las células impulsoras y progenitoras multipotentes intactas así como las células impulsoras y progenitoras neurales intactas se obtienen directamente, sin un prolongado cultivo ín ví tro . Las células producidas retienen especificidad regional mientras que conservan su capacidad para generar células diferenciadas de diversos tipos. Además, las células producidas por el método de la invención se pueden utilizar para evaluar compuestos que promueven diferenciación y compuestos que son tóxicos para las células. Además, el método de la invención permite estudiar células impulsoras y progenitoras multipotentes en modelos animales. Por ejemplo, se puede hacer el seguimiento de células impulsoras y progenitoras neurales in vivo para seguir los efectos de compuestos administrados in vivo, con el fin de investigar la neurogénesis en el cerebro normal durante los estadios embrionario y post-embrionario, después de daño cerebral o después de experimentos de transplante. Se puede detectar la emigración de células durante el desarrollo normal de un órgano y después de transplante . La invención proporciona además métodos para evaluar la capacidad de compuestos para promover diferenciación de células impulsoras y progenitoras y células impulsoras y progenitoras neurales. Dado que se pueden aislar células intactas desde órganos específicos o regiones de ellos y dado que se conocen elementos reguladores que dirigen la expresidn de genes en el genoma de la célula, se pueden identificar los genes específicos de células, proteínas, antígenos de superficie, y otros marcadores específicos de células, potencialmente únicos" para subconjuntos celulares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A -IB constituyen un diagrama que muestra la preparación de un constructo de expresión de un modo de realización de la invención. La Figura 2 ilustra un constructo de expresión que incluye un promotor de nestina, una secuencia de gen que codifica para proteína de fluorescencia verde y una secuencia del segundo intron del gen de nestina. Las Figuras 3 A - 3C y 3G muestran los resultados de la selección de células fluorescentes activadas (FACS) de las células control . Las Figuras 3D-3F y 3H-3N muestran la FACS de células obtenidas de un mamífero transgénico no-humano.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La invención se refiere a un mamífero transgénico no-humano o progenie del mismo que tiene integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero. Ligado operativamente a la secuencia reguladora del gen de nestina del mamífero está un gen que codifica para una proteína marcador/informador, tal como, por ejemplo, una proteína fluorescente. La proteína marcador/informador es expresada en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo. Se puede utilizar cualquier mamífero no-humano adecuado para producir los mamíferos transgénicos no-humanos aquí descritos. Tal como aquí se emplea, el término "mamífero transgénico no-humano" incluye los recién nacidos, jóvenes, adultos en desarrollo y embriones de los mamíferos transgénicos no-humanos, así como los recién nacidos, jóventes, adultos en desarrollo o embriones de una progenie del mamífero transgénico no-humano. Entre los ejemplos de mamíferos transgénicos no-humanos se incluyen ratón, rata, perro, mono, así como cualquier otra especie de mamífero no-humano adecuado. Un mamífero preferido es el ratón. Por lo general, una célula impulsora se considera como una célula con capacidad de dividirse asimétricamente, produciendo una copia de sí misma y una célula hija más alineada. Frecuentemente, las células impulsoras se consideran como células indiferenciadas con capacidad de proliferar, presentar auto-mantenimiento, generar una progenie numerosa y generar nuevas células en respuesta a una lesión o enfermedad. Por lo general, una célula progenitora es una célula más alineada que se divide simétricamente y puede diferenciarse en morfotipos más maduros. Tal como aquí se emplea, la expresión "células impulsoras y progenitoras multipotentes" son células que expresan nestina. Generalmente, las células impulsoras y progenitoras multipotentes tienen especificidad regional y son capaces, al diferenciarse, de generar tipos de células características de un determinado órgano o tejido presente en el organismo del mamífero. Las células impulsoras y progenitoras neurales son un ejemplo de células impulsoras y progenitoras multipotentes. Al diferenciarse, las células impulsoras y progenitoras neurales dan lugar a células neurales, tales como células gliales y neuronas. Los precursores embrionarios o totipotentes de células impulsoras y progenitoras multipotentes se citan aquí como "células impulsoras y progenitoras totipotentes". Debido a su carácter totipotente, estas células son capaces de diferenciarse en células características de cualquier órgano o tejido del organismo del mamífero. Tal como aquí se emplea, las células impulsoras y progenitoras son precursores de células multipotentes, no poseen especificidad regional y se pueden distinguir de las células impulsoras y progenitoras multipotentes por el hecho de no expresar nestina. La nestina es una proteína de filamento intermedio; en particular se define como la clase sexta distinta de proteína de filamento intermedio. La nestina se expresa, por ejemplo, en células impulsoras y progenitoras neurales. Su espresión disminuye a medida que las células impulsoras y progenitoras se diferencian en tipos de células neurales. En los mamíferos sanos, las células diferenciadas del SNC, tales como las neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, no expresan por lo general nestina. Sin embargo, la expresión de nestina ha sido identificada en algunos tumores del SNC y después de lesión de la médula espinal del adulto o del nervio óptico. En el caso de lesión, se ha observado producción de nestina en astrocitos reactivos y en células cercanas al canal central de la médula espinal. Ha sido señalado (C.B. Johansson y col. Cell, 96: 25-34 (1999)) que, en mamíferos adultos, células que forran cavidades, tales como células epidimales, expresan nestina, en particular después de una lesión de la médula espinal. La expresión de nestina se ha observado también en células impulsoras y progenitoras multipotentes distintas a las células impulsoras y progenitoras neurales. Kobayashi M. y col., por ejemplo, han señalado en Pediatr. Res. 43(3) : 386-392 (1998) que la nestina se expresa en precursores de músculo; sin embargo, las células musculares maduras no expresan nestina (Zimmerman, L. y col. ?euron (EEUU) 12(1) : 11-24 (1994) . La expresión de nestina ha sido relacionada con el desarrollo de órganos tales como, por ejemplo, el hígado (?i i, T., y col. Hepatolbgy 29(2© 520-527 (1999), diente (Terling C, y col. Int. J. Dev. Biol. 39(6) 947-956 (1995), y corazón (Kachinsky, A.M. y col., J^ Histochem. Cytochem. 43 (8) 843-847 (1995) . Además, la expresión de nestina puede tener lugar en células impulsoras y progenitoras multipotentes del páncreas, tracto intestinal, y retina. Se pueden utilizar diversidad de genes de nestina o secuencias de ellos para las composiciones y métodos de la presente invención. Entre los ejemplos de genes de nestina de mamífero apropiados se incluyen gen de nestina de rata, gen de nestina humano, gen de nestina de ratón y genes de nestina específicos para cualquier otra especie de mamífero. En un modo de realización preferido de la invención, el gen de nestina de mamífero es gen de nestina de rata. Los genes de nestina de origen de mamífero han sido aislados y secuenciados. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de genes de nestina de rata y humanos y las secuencias de aminoácidos deducidas de las correspondientes proteínas nestina están descritas en la Patente estadounidense No. 5.338.839 registrada el 16 de agosto de 1994 para McKay y col., que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Los elementos reguladores del gen de nestina, por ejemplo de rata, están decritos en Zimmerman, L. y col. Neuron, 12: 11-24 (1994) ,por ejemplo, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Tal como aquí se emplea, "una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero" incluye una o más secuencias reguladoras del gen de nestina que, cuando están ligadas operativamente a un gen que codifica para una proteína, expresan la proteína en células impulsoras y progenitoras multipotentes. En un modo de realización de la presente invención, el mamífero transgénico no-humano o progenie del mismo tiene integrado en su genoma ADN que incluye una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero donde la secuencia reguladora es tal que la proteína marcador/informador se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes. En otro modo de realización de la invención, la secuencia reguladora es tal que la proteína marcador/informador se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras multipotentes (por ejemplo, sistema nervioso central) . Aún en otro modo de realización, la secuencia reguladora se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras neurales. En un modo de realización preferido, la secuencia reguladora incluye la secuencia entera del segundo intrón del gen de nestina de mamífero. También se pueden emplear sentencias más cortas del segundo intrón. Se conocen en la especialidad ejemplos de secuencias más cortas adecuadas que pueden emplearse. Por ejemplo, en European Journal of Neuroscience, 9: 452-462 (1997), incorporada aquí como referencia en su totalidad, Lothan y Lendhal han mostrado que ratones transgénicos generados con la mayor parte de los 717 pb conservados en la porción 3 ' del segundo intrón humano o con el intron humano completo, 1852 pb, daban un modelo de expresión tipo nestina muy similar y llegan a la conclusión de que los elementos de control importantes residen en el elemento de 714 pb. En Experimental Cell Research (Estados Unidos), 248(2): 509-519 (1999), incorporado aquí como referencia en su totalidad, Lothian y col. han mostrado que es suficiente la región de 374 pb en el segundo intron del gen de nestina humano y que se requiere una secuencia de 120 pb en esta región para la expresión del gen de nestina en células neurales del S?C embrionario. Opcionalmente, la secuencia reguladora puede incluir además elementos presentes en el primer intron del gen de nestina de mamífero. Se puede emplear la secuencia completa del primer intron o secuencias más cortas . Como se discute en el trabajo de Zimmerman y col. en ?euron, 12; 11-24 (1994) , incorporado aquí como referencia en su integridad, elementos independientes y específicos del tipo de células en los intrones primero y segundo del gen de nestina dirigen la expresión del gen informador al desarrollo de precursores musculares y neurales, respectivamente. La secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero, tal como aquí se ha definido, puede incluir cualquier promotor adecuado. En un modo de realización, el promotor puede ser un promotor de nestina. En un modo de realización preferido, el promotor de nestina se obtiene del mismo gen de nestina del mamífero que la secuencia reguladora. Los promotores adecuados incluyen también secuencias de promotor que son funcionales en células de mamífero, levaduras, bacterias y células de insectos. Entre los ejemplos de promotor adecuado se incluyen, sin que quede limitado a ellos, polihedrina, 3-fosfoglicerato quinasa, metalotioneina, LTR retroviral, promotores SV 40 y TK, y otros conocidos en la especialidad. En las composiciones y métodos de la presente invención, la secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero, tal como se ha definido antes, se liga operativamente a un gen que codifica para una proteína marcador/informador. El gen que codifica para la proteína marcador/informador se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo. En un modo de realización de la invención, la proteína marcador/informador se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras multipotentes. Tal como aquí se emplea, el témino "expresado selectivamente" significa que la proteína marcador/informador se expresa a un nivel detectable predominantemente en células impulsoras y progenitoras multipotentes. En otro modo de realización, la proteína marcador/informador se expresa a un nivel detectable en células impulsoras y progenitoras neurales. Aún en otro modo de realización, la proteína marcador/informador se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras neurales.

Las proteinas marcador/informador utilizadas en la composición y métodos de la presente invención son conocidas por los especialistas en esta técnica. Se prefieren las proteínas marcador/informador para las que hay métodos de ensayo convenientes y sencillos. Entre los ejemplos se incluyen, sin que quede limitado solo a ellos, proteínas luminiscentes, proteínas fluorescentes, enzimas, proteínas de superficies celulares y otras proteínas conocidas en la especialidad.

Una proteína marcador/informador preferida que se puede emplear es una proteína fluorescente. Entre los ejemplos de proteína fluorescente adecuada se incluyen, sin que quede limitado solo a éstas, proteína fluorescente verde (GFP) , proteína fluorescente verde modificada o potenciada (EGFP) , proteína fluorescente amarilla, FP cian, FP azul, FP roja y sus versiones potenciadas (Clontech) y cualquier otra proteína luminiscente o fluorescente que puede emitir luz. En un modo de realización preferido, la proteína marcador/informador es una proteína fluorescente tal como proteína fluorescente verde (GFP) . En otro, la GFP está modificada para potenciar la fluorescencia. La GFP así como los mutantes de GFP son conocidos por los especialistas en esta técnica. Por ejemplo, las proteínas que presentan fluorescencia verde están descritas en la Patente estadounidense No. 5.491.084 y Patente estadounidense No. 5.804.387, que se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Aún en otro modo de realización de la invención, la proteína fluorescente modificada para una fluorescencia modificada es EGFP (proteína fluorescente verde potenciada) y se puede obtener del plasmidio pEGFP-Nl suministrado por Clontech. Brevemente, el plasmidio incluye 190 cambios de base silenciosos, de preferencias de codon humano; hay una conversión del codon ATG para un mejor consenso de Kozak y sustituciones de amino ácidos: Phe64-Leu y Ser65-Thr. La invención se refiere también a un método de producción de un mamífero transgénico no-humano que expresa para una proteína fluorescente en células impulsoras y progenitoras multipotentes, que comprende introducir, en un óvulo fertilizado de un mamífero no-humano, ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina del mamífero, como se ha definido antes, ligado operativamente a un gen que codifica para una proteína fluorescente, tal como se ha descrito antes, que es expresada en células impulsoras y •4 A progenitoras multipotentes del mamífero no-humano. El óvulo fertilizado se introduce en un mamífero no-humano, preferiblemente de la misma especie, y se deja que produzca progenie que consiste en progenie de mamífero transgénico no-humano. El método comprende también la selección de la progenie del mamífero transgénico no-humano cuyas células impulsoras y progenitoras multipotentes expresan gen fluorescente. En un modo de realización de la invención, el método comprende la selección de la progenie del mamífero transgénico no-humano, aquellos de la progenie cuyas células impulsoras y progenitoras neurales expresan gen fluorescente. Los genes que expresan GFP o GFP modificada para fluorescencia potenciada, por ejemplo, EGFP, son los preferidos. Otro aspecto de la invención está relacionado con un mamífero transgénico no-humano que expresa una proteína fluorescente en células impulsoras y progenitoras producido por un método que comprende introducir, en un óvulo fertilizado de un mamífero no-humano, ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero, como se ha definido antes, ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína fluorescente, tal como se ha descrito antes, que se expresa en células impulsoras y progenitoras del mamífero no-humano; por introducción del óvulo fertilizado en un mamífero no-humano, preferiblemente de la misma especie, que se deja producir progenie que consiste en progenie de mamífero transgénico no-humano y por selección de la progenie de mamífero transgénico no-humano de aquella parte de progenie cuyas células impulsoras y progenitoras expresan gen fluorescente. En un modo de realización de la invención, la progenie de mamífero transgénico no-humano seleccionada consiste en aquellos de la progenie cuyas células impulsoras y progenitoras expresan gen fluorescente .

En un modo de realización preferido, el ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a una proteína fluorescente es un constructo de expresión o vector que comprende una secuencia de promotor, preferiblemente una secuencia de promotor de un gen de nestina de mamífero, un gen que codifica una proteína fluorescente verde y una secuencia reguladora presente en el segundo intron de gen de nestina. A continuación se describe además un ejemplo de tal constructo, métodos para producción así como métodos para introducir el constructo en el óvulo fertilizado del mamífero no-humano. Se puede aislar una célula o células que comprenden el constructo de expresión de la invención y se pueden emplear después. Por e emplo, estas células pueden ser estudiadas y caracterizadas in vi tro o pueden utilizarse en experimentos diseñados para hacer un seguimiento del desarrollo y/o la diferenciación celular. Las células que comprenden el constructo de la invención también se pueden transplantar a órganos de animales receptores. Las células de la invención se pueden emplear en otros métodos experimentales conocidos en la especialidad. La invención se refiere también a la evaluación de la presencia de células impulsoras y progenitoras multipotentes en el organismo, órganos o región de los mismos, del mamífero transgénico no-humano, en su progenie o en el embrión transgénico no-humano de la invención. En un modo de realización preferido, el mamífero transgénico no-humano empleado tiene integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora del gen de nestina de mamífero ligada operativamente a gen que codifica para una proteína fluorescente. Las poblaciones de células impulsoras y progenitoras multipotentes pueden evaluarse observando o midiendo la fluorescencia de un órgano o región del mismo del mamífero transgénico, progenie o embrión. La presencia de células fluorescentes se puede evaluar también en órganos sometidos a traumatismo, durante la regeneración del tejido u órgano, durante diversos tratamientos, antes y después de transplantes, y durante los diversos estadios del desarrollo en presencia o ausencia de diversos factores medioambientales o estímulos. Se pueden evaluar efectos in vivo de compuestos administrados a modelos animales y que afectan a células impulsoras y progenitoras multipotentes por utilización de los mamíferos no-humanos de la invención y por medida de la fluorescencia de un órgano o región del mismo y compararla con la fluorescencia del órgano o región del mismo en animales de control . Otro aspecto de la invención está relacionado también con un método para obtener o aislar células impulsoras y progenitoras multipotentes primarias, no cultivadas, (por ejemplo neurales) . Estas células se citan también aquí como intactas, frescas, o simplemente como células impulsoras y progenitoras multipotentes primarias. Estas células se obtienen de mamífero transgénico no-humano de la invención, desde una progenie del mismo o desde un embrión de mamífero transgénico no-humano, directamente, sin pasos de cultivo. La utilización de estos términos, sin embargo, no intentan omitir la posibilidad de estudios in vi tro de estas células frescas, intactas o primarias. Según esto, una vez obtenidas del mamífero transgénico no-humano o progenie del mismo, las células impulsoras, y progenitoras multipotentes primarias aisladas según el método de la presente invención se pueden cultivar además in vi tro utilizando técnicas conocidas por los expertos en esta especialidad. Un método de obtención de células impulsoras y progenitoras multipotentes que comprende aislar células que expresan la proteína marcador/informador definida antes de un mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo, que tiene integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora, de un gen de nestina de un mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína marcador/informador, donde el gen que codifica para la proteína marcador/regulador se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo. Otro método de obtención de células impulsoras y progenitoras multipotentes primarias vivas comprende el aislamiento de células fluorescentes desde un mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo, que tiene integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína fluorescente donde el gen que codifica para la proteína fluorescente es expresado en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo. Las células impulsoras y progenitoras multipotentes presentes en órganos o regiones de los mismos se pueden aislar por las composiciones y los métodos de la invención. En un modo de realización preferido, las células aisladas son células impulsoras y progenitoras neurales. Las células impulsoras y progenitoras multipotentes presentes en otros Órganos y que expresan nestina, por ejemplo células precursoras musculares, también pueden estar purificadas (por ejemplo altamente enriquecidas) . En un modo de realización preferido, las células que expresan una proteína fluorescente se pueden aislar utilizando selección de células fluorescentes activadas (FACS) . Con proteínas modificadas para una fluorescencia potenciada, la brillantez de las células que expresan transgen es muy alta y la FACS demuestra ser un procedimiento rápido y eficaz . Las técnicas de FACS t son conocidas por los especialistas. La utilización de FACS para seleccionar células está discutida, por ejemplo, en la Patente estadounidense No. 5.804.387. En un modo de realización preferido, la proteína fluorescente es una proteína fluorescente verde potenciada en cuanto a fluorescencia e identificada como EGFP. Se pueden aislar células que expresan EGFP, primarias, no-cultivadas, desde el organismo intacto, por FACS en menos de una hora, típicamente en 10 a 30 minutos . Se pueden emplear otros métodos para obtener o aislar células que tienen integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a una proteína marcador/informador .

Entre los ejemplos se incluyen, sin que quede limitado solo a ellos, la utilización del substrato ß-gal fluorescente (Herzberg) como está descrito por Nolan, G.P. y col. en Proc . Nati. Acad. Sci. EEUU_ 85(8): 2603-2607 (1988) o el método descrito por Stemple, D.L. y col. Cell 71(6): 973-85 (1992).

También se pueden emplear métodos basados en la expresión de un marcador de superficie celular específico para proteína nestina. En un modo de realización de la invención se puede emplear un marcador de superficie celular, tal como por ejemplo un receptor como proteína marcador/informador en lugar de GFP. Las células impulsoras y progenitoras multipotentes se pueden purificar entonces empleando técnicas de fluorescencia o anticuerpo marcado, tales como FACS o perlas magnéticas enlazadas a anticuerpos junto con separación magnética. Se pueden emplear también placas Petri con anticuerpos fijados a la superficie para adherir preferencialmente las células impulsoras y progenitoras multipotentes a la superficie de la placa Petri. Una vez aisladas, las células que expresan nestina se pueden además estudiar y caracterizar por técnicas conocidas por los especialistas. En un modo de realización de la invención, se separan ARN y proteínas de las células primarias aisladas. Se pueden identificar proteínas específicas para las células aisladas, por ejemplo, por dos electroforesis dimensionales o por enfoque isoeléctrico. En otro modo de realización de la invención, se identifican también los genes que caracterizan las células intactas aisladas como se ha descrito antes. Por ejemplo, esto se puede llevar a cabo por versiones de la tecnología de chip de genes. Entre los ejemplos de métodos de chip de genes conocidos por los especialistas se incluyen los métodos Affimetrix o Synteni. Un procedimiento para identificar tales genes incluye la preparación de un catálogo o biblioteca de, por ejemplo, genes ADNc, marcadores de secuencias expresados (EST) en las células aisladas y la comparación del catálogo con los genes expresados en células no-fluorescentes . Las células no-fluorescentes pueden ser células que están en un estadio de desarrollo más temprano (por ejemplo, células totipotentes) que las células que expresan nestina o pueden ser células que se han diferenciado más allá del estadio que expresa nestina. Análogamente, el catálogo puede compararse con genes expresados por células no-fluorescentes en órganos específicos o regiones de los mismos. En otro modo aún de realización de la invención, se identifican antígenos de superficie específicos para las células aisladas como se ha descrito antes. Las técnicas para identificar antígenos de superficie específicos de células de superficie son conocidas por los especialistas. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, inmunización de animales con las células aisladas y obtención de anticuerpos dirigidos contra antígenos específicos de células de los animales inmunizados . Aún en otro modo de realización de la invención, se trasplantan a animales células aisladas según la invención. En particular, las células aisladas se pueden trasplantar a órganos específicos o regiones de los mismos. Las técnicas para llevar a cabo el trasplante de células aisladas a un animal son conocidas por los especialistas. El animal puede ser de la misma especie que el mamífero transgénico no-humano de la invención. Alternativamente, el animal puede ser de especie diferente. Entre los ejemplos de animales se incluyen ratón, rata, mono y muchos otros. El mamífero transgénico no-humano o progenie del mismo descrito antes y las células aisladas según la invención se pueden emplear para identificar compuestos que afectan a la diferenciación de células impulsoras y progenitoras totipotentes y multipotentes. Tal como aquí se emplea, el término compuesto incluye, por ejemplo, formulaciones farmacéuticas tales como fármacos y otros compuestos biológicamente activos que pueden administrrarse en el tratamiento, diagnóstico o profilaxis de diversas indicaciones médicas o condiciones. Estos compuestos se citan en general aquí como "agentes terapéuticos". Los agentes terapéuticos preferidos incluyen factores de crecimiento y neutrofinas. Otros compuestos que pueden emplearse incluyen, sin que quede limitado solo a ellos, moléculas pequeñas (tales como moléculas orgánicas u organometálicas) , vitaminas, proteínas, péptidos, polipéptidos, virus, ácidos nucleicos, hormonas (tales como factores de crecimiento) , enzimas (por ejemplo, óxido nítrico sintasa) , y otros compuestos biológicos de origen de ADN natural o recombinante que pueden estar implicados en el desarrollo o diferenciación de células . Tal como aquí se describe, la presente invención se refiere además a métodos de identificación de si un compuesto (i) promueve diferenciación de células impulsoras y progenitoras multipotentes; (ii) si es tóxico para células impulsoras y progenitoras multipotentes; (iii) si promueve diferenciación de células impulsoras y progenitoras de totipotentes a multipotentes; y (iv) promueve diferenciación de células impulsoras y progenitoras multipotentes a células neurales Los métodos incluyen detección o medida de la expresión de una proteína marcador/informador . Los métodos de detección o medida de expresión de gen marcador/informador son conocidos por los especialistas. Se pueden emplear 5 métodos de luminiscencia, fluorescencia, actividad enzimátíca (por ejemplo ß-gal) , perlas magnéticas y otros métodos de purificación basados en anticuerpos, selección de células fluorescentes activadas, centrifugación diferencial y otros métodos de ensayo conocidos en la especialidad. Un gen 10 marcador/informador preferido es aquel que expresa una • proteína fluorescente, como se ha descrito antes. La fluorescencia se mide por técnicas y equipos conocidos por los especialistas. Las longitudes de onda de excitación y de emisión se seleccionan según la proteína marcador/informador 15 fluorescente utilizada y son ya conocidas por los especialistas. En un modo de realización se emplea GFP (longitud de onda de excitación de aproximadamente 395 nm y longitud de onda de emisión de aproximadamente 509 nm) . En otro modo de realización se emplea EGFP (longitud de onda de 20 excitación de aproximadamente 488 nm y longitud de onda de emisión de 507 nm) . Los compuestos analizados por selección o evaluados se pueden administrar o suministrar in vivo al mamífero transgénico no-humano de la invención. Los compuestos se 25 pueden estudiar también in vi tro. Tal como aquí se emplean, las expresiones "contacto de células impulsoras y progenitoras multipotentes vivas", "contacto de células impulsoras y progenitoras totipotentes vivas" y "contacto de células impulsoras y progenitoras neurales vivas" con un 30 compuesto incluye el tratamiento in vi tro de células así como la administración in vivo del compuesto. Se puede comparar la medida de la proteína marcador/informador de órganos o regiones de los mismos de animales que han recibido el compuesto in vivo con la medida de la proteína marcador/informador de los correspondientes órganos o regiones de los mismos en animales de control que no han recibido el compuesto. Otro método adecuado de evaluación de los efectos de compuestos administrados in vivo incluye la recolección y aislamiento de células de un mamífero transgénico no-humano sacrificado que haya recibido el compuesto y comparación de la medida de la proteína marcador/informador en las células aisladas con las células de control obtenidas de mamífero transgénico no-humano que no ha recibido el compuesto. Los compuestos administrados in vivo y sus efectos sobre las células se pueden evaluar, por ejemplo, por observación de cambios de fluorescencia del tejido o por FACS de células recogidas de mamíferos transgénicos no-humanos sacrificados. Los compuestos se pueden someter a análisis de selección (screening) in vitro empleando células aisladas de mamífero transgénico no-humano o células (por ejemplo células impulsoras y progenitoras totipotentes; células impulsoras y progenitoras multipotentes) transfectadas con un constructo que comprende una secuencia de promotor, un gen que codifica para una proteína marcador/informador y una secuencia reguladora presente en un segundo intrón de un gen de nestina de mamífero por los métodos antes descritos. Las células se pueden poner en contacto con el compuesto que se va a evaluar y medirse y compararse la proteína marcador/informador (por ejemplo proteína fluorescente) de las células en presencia del compuesto con la medida de la proteína marcador/informador de las células de control. Como saben los especialistas, la muestra de células en presencia del compuesto se hace corresponder con la muestra de células de control de manera que cualquier diferencia en la medida de la proteína marcadoir/informador (por ejemplo, fluorescencia) puede ser atribuida únicamente al efecto del compuesto. En un modo de realización de la invención, las células impulsoras y progenitoras que tienen integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína marcador/informador, se pone en contacto con el compuesto que se va a someter a análisis de selección. En ausencia de destrucción de células, la disminución de la medida de proteína marcador/informador (por ejemplo la fluorescencia)_ observada en las células expuestas al compuesto, comparando con la proteína marcador/informador de células de control es indicativa de la capacidad del compuesto para promover (potenciar, incrementar) la diferenciación de células impulsoras y progenitoras multipotentes en células que no expresan más el gen de nestina. La capacidad del compuesto para inhibir (reducir) la diferenciación queda indicada por una medida prolongada de la proteína marcador/informador . En el modo de realización en el que la proteína marcador/informador empleada es una proteina fluorescente, la diferenciación disminuida de células impulsoras y progenitoras multipotentes en presencia del compuesto queda indicada por una fluorescencia prolongada de las células en presencia del compuesto comparada con la fluorescencia de las células de control. En otras palabras, las células en presencia de un compuesto que inhibe la diferenciación fluorescerán durante un período de tiempo más largo que las células de control . En un modo de realización de la invención preferido, las células aisladas son células impulsoras y progenitoras neurales y un decrecimiento o aumento en la medida de proteína marcador/informador (por ejemplo fluorescencia) observada cuando estas células se exponen al compuesto, comparado con la medida de la proteína marcador/informador (por ejemplo fluorescencia) de las células control, es indicativo de la capacidad del compuesto para promover o retardar la diferenciación de células impulsoras y progenitoras neurales en neuronas y células gliales. En otro modo de realización, se pueden utilizar células en estadios de desarrollo que preceden a la expresión del gen de nestina (por ejemplo células totipotentes) para análisis de selección de compuestos que promueven su diferenciación en células que expresan gen de nestina, por ejemplo, células impulsoras y progenitoras multipotentes. Por ejemplo, la diferenciación de células totipotentes después de la exposición al compuesto se puede evaluar en cuanto a fluorescencia potenciada o presencia potenciada de otra proteína marcador/informador comparando con las células totipotentes de control que no se han puesto en contacto o no se han expuesto al compuesto. En un modo de realización preferido, las células impulsoras y progenitoras multipotentes incluyen células impulsoras y progenitoras neurales . Las células totipotentes se pueden aislar desde el mamífero transgénico no-humano, progenie del mismo o desde el embrión de mamífero transgénico no-humano de la invención. Entre los ejemplos de técnicas empleadas en el aislamiento de células totipotentes se incluyen: cultivo de células ES, disociación de blastocitos, selección FACS basada en promotor específico totipotente que guía la expresión de un marcador fluorocromo de superficie de células, específico, totipotente, seleccionado por anticuerpo, FACS, perla magnética, columnas de afinidad o anticuerpo fijado a placa Petri . Como es conocido en la especialidad, las células totipotentes de control se hacen corresponder con las células totipotentes que han sido puestas en contacto con el compuesto en todo menos en cuanto a la presencia del compuesto que se evalúa. Entre los ejemplos de compuestos que se pueden someter a análisis de selección para promover la diferenciación de células totipotentes se incluyen los descritos antes. En un modo de realización preferido, el compuesto que se va a evaluar se selecciona del grupo que consiste en un factor de crecimiento, una neurotrofina y un agente terapéutico. Los compuestos se pueden evaluar en cuanto a su toxicidad para células impulsoras y progenitoras multipotentes, por ejemplo, para células impulsoras y progenitoras neurales. Se ponen en contacto células vivas con el compuesto que se va a evaluar, se observa la medida de la proteína marcador/informador (por ejemplo fluorescencia) de estas células y se compara con la fluorescencia de las células de control. En si mismo, un decrecimiento de la medida (por ejemplo fluorescencia) de las células en presencia del compuesto puede ser indicativo tanto de la destrucción de células por el compuesto como de la diferenciación a tipos de células que no expresan ya nestina. Én un modo de realización preferido de la invención, se mide la destrucción de células por una técnica independiente, tal como la conocida por un especialista Por ejemplo, si se emplea fluorescencia como medida de la proteína marcador/informador, se utiliza una técnica no-fluorescente para medir la destrucción de células . Una disminución de la medida de proteína marcador/informador (por ejemplo fluorescencia) , conectada con una reducción en el número de células vivas en las células puestas en contacto con el compuesto que se evalúa en cuanto a toxicidad, cuando se compara con la fluorescencia y el número de células vivas de control (no puestas en contacto con el compuesto) es indicativa de la toxicidad de los compuestos para las células impulsoras y progenitoras multipotentes o, en un modo de realización preferido, para las células impulsoras y progenitoras neurales. La presente invención se ilustra además con los siguientes ejemplos que no han de entenderse como limitativos. Todas las referencias aquí citadas se incorporan como referencia en su totalidad.

EJEMPLOS Ejemplo 1 En las Figuras 1 A y IB se muestra la subclonación del promotor de nestina, la secuencia de poli adenilación de SV40 y el segundo intron de gen de nestina, que se realizó tal como se describe a continuación. Se separó la región de empalme/poliadenilación de SV40 de un plasmidio que llevaba promotor de nestina (Zimmernan, L. y col. Neuron, 12:11-24 (1994), poli A, y segundo intron del gen de nestina, por escisión con enzimas de restricción Xbal y BamHl, revelando una banda de 250 pares de bases de nucleótidos, y se ligó al vector pBSM13+ (comercialmente disponible de Stratagene y mostrado en la Figura ÍC) que también había sido escindido por Xbal y BamHl. La sede de Xbal de este plasmidio poli A-pBSM13+ se terminó en final romo o en bisel por tratamiento con ADN polimerasa Klenow y se clonó un ligando para Ascl (cuya secuencia es pAGGCGCGCCT) (SEQ. ID No. 1) en esta sede, reestableciendo sedes de Xbal sobre una u otra sede de la sede de restricción Ascl ahora presente. El segundo intron (nucleótidos de 1,8 kb) se digirió por corte del plasmidio promotor de nestina de rata/poli A/segundo intron con las enzimas de restricción BamHl y Smal, y entonces se ligó 3' al plasmidio poli-A-pBSM13+ que había sido escindido utilizando las enzimas de restricción BamHl y Smal. Con el fin de clonar la secuencia de promotor en el plasmidio poliA/segundo intron/pBSM13+, se terminó en final romo la sede de HindIII en el plasmidio poli A/2 ° intron/pBSM13+y se volvió a ligar, creando así la sede NHel. Se digirió entonces el promotor de nestina (nucleótidos de 5,8 kb) del plasmidio promotor de nestina de rata/poli A/segundo intron por digestión con las enzimas de restricción Spel-Sall, y se ligó al plasmidio poli A/segundo t intrón/pBSM13+ que había sido digerido con las enzimas de restricción NHel-SalI, fijando el 5' del promotor de nestina a la sede de poliadenilación. La sede de restricción Spel es compatible con la sede Nhel. De esta manera, se crea un plasmidio que lleva el promotor, y elementos del segundo intron del gen de nestina de rata con una secuencia de poliadenilación de SV40 colocada entre los dos. Se utilizó el plasmidio de pEGFP-Nl (Clontech) como fuente para GFP. El plasmidio codifica para una versión mudada de GFP que tiene fluoresceína potenciada. Con el fin de subclonar este gen en el plasmidio promotor de nestina de rata/poli A/segundo intron/pBSM13+, la sede de restricción Notl, que es 3' para el codon de parada traduccional de GFP, se digirió con la enzima de restricción Notl, terminada en final romo por ADN polimerasa Klenow, y el ligando Ascl (como antes) se ligó a la sede. Esto crea una sede de restricción en lugar de la sede Notl. La sede de restricción Xmal, que puede encontrarse en el poliligando que es 5 ' del gen de GFP, se terminó en final romo (como antes) y se volvió a ligar para destruir la sede Smal. Se digirió entonces la EGFP con las enzimas de restricción Salí y Ascl creando un fragmento de ADN de 780 pb, y se ligó al plasmidio promotor de nestina/EGFP/ SV40poliA/ segundo intron/pBSM13+ (que había sido digerido con Salí y Ascl) 3' al promotor de nestina y 5' a la sede de poli A. Se digirieron aproximadamente 10 µg del pasmidio con la enzima de restricción Smal . El plasmidio que contiene promotor de nestina/EGFP/SV40 poliA/segundo intron/pBSM13+, citado aquí también como "zGFP", se preparó por centrifugación con cloruro de cesio. En la Figura 2 se muestra el plasmidio completo de promotor de nestina-EGF-Nl-SV40poliA-2° intron de nestina-pBSM13+ (ZGFP) . Para hacerlo lineal se corta con Sma I para obtener un fragmento de 8,55 kb del promotor, GFP y segundo intron; la banda de 3,1 kb es columna vertebral de pBLUESCRIPT. El fragmento de ADN que contiene promotor de nestina-EGFP-poliA/segundo intrón se purificó con gel de agarosa.

Ejemplo 2 El fragmento específico, obtenido como se ha descrito en el anterior Ejemplo 1, se introdujo en pronúcleos de 500 oocitos de la cepa híbrida C57BL/6xBALB/cBy. Los oocitos inyectados se transfirieron a 12 hembras pseudo embarazadas .

Por este procedimiento se crearon un total de 86 crías F0.

Para la detección del trasgen, se realizó un análisis de PCR del ADN aislado de las colas. Las secuencias de los cebadores empleados en la PCR fueron CCTCTACAAATGTGTGATGGC (que corresponde a la región de la poliadenilación de SV40 (SEQ ID. No. 2) y GCGCACCATCTTCTTCAAGGACG (que corresponde a la secuencia de EGFP) (SEQ. ID. No. 3) . Se llevó a cabo una PCR en 30 µl que contenian DMS al 10%, MgCl2 2,5 mM, tampón IxPCR, 0,2nM de cada dNTP, 0,4 µM de cada cebador y 1 u amplitaq (Boeringer, Mannheim) . Se utilizaron 44 ciclos de PCR con una temperatura de templado de 55°C (30 s) y una temperatura prolongada hasta 65°C (1 minuto) . En estas condiciones, se detectó el fragmento esperado de 470 pb en 8 de los 86 ratones FQ- De estos ocho ratones transgénicos tres eran machos y cinco hembras .

Ejemplo 3 Con el fin de evaluar si la expresión de EGFP en estos ratones transgénicos positivos estaba controlada espacial y temporalmente por el promotor de nestina y 2° intron, los tres machos transgénicos positivos se aparearon con hembras C57BL/6 de 3-6 semanas. Se determinó el establecimiento de un tapón copulativo en el E0,5. Se trataron los embriones calculando su edad por el aspecto del tapón copulativo de la madre. Cuando hubo una maduración apropiada, se sacrificaron las madres empleando C02 seguido de dislocación cervical . Se sacaron los embriones y se colocaron en PBS a 0°C para lavarlos, seguido de paraformaldehido al 4% a 4°C durante toda la noche. Después del tratamiento con para-formaldehido, se utilizaron los embriones o bien para análisis del montaje completo o para colocarlos en sacarosa al 30% hasta 24 horas después de que el embrión se había sumergido por completo (típicamente dos días) . Las secciones en criostato se realizaron embebiendo los embriones en compuesto de O. C.T. (temperatura óptima de corte) (obtenido de V R) seguido de seccionado utilizando un criostato Leica Jung Frigocut 2800 E con una temperatura de caja de -20°C y una temperatura de objetivo de -17°C. Las secciones eran de 40-60 µm de grueso y se adhirieron a portaobjetos con sub-lecho de gelatina. Se analizaron los embriones ElO, 5, E13,5, y E16,5 en cuanto a fluorescencia. Se observaron las imágenes del montaje completo utilizando un microscopio le diseccionado Leica MPS30, bajo un objetivo 0,8 aumentos, con una lámpara de mercurio conectada y filtro de GFP. Se analizó el tejido seccionado utilizando un microscopio de axiofotios Zeiss con filtros de FITC y una cámara de punto luminoso CCD (Diagnostic Instruments); dado que los tejidos aparecían mucho más grandes que el campo de visión del microscopio, se tomaron secciones con una lente de 10 aumentos y se recompusieron, como un mosaico, en Adobe Photoshop. Los cerebros adultos se procesaron primero por perfusión de los ratones con para-formaldehido al 4%. Los cerebros se diseccionaron entonces desde el cráneo y se trataron luego con para-formaldehido al 4% durante 24 horas a 4°C. Después de la fijación, se sumergieron los cerebros en sacarosa al 30% hasta un día después de la inmersión (típicamente tres días) . Se realizaron secciones de criostato sagitales utilizando métodos como los establecidos antes, pero con una temperatura de la caja de -30°C y una temperatura del objetivo de -27°C.

Ejemplo 4 Se determinó la expresión de nestina para marcar células epiteliales neurales desde el inicio de la formación de la placa neural en el día embriónico 7,5. Para evaluar si la expresión de EGFP en estos ratones transgénicos positivos estaba controlada espacial y temporalmente por el promotor de nestina y segundo intron, se sometieron los tres ratones transgénicos macho a apareamiento con hembras C57BL/6 de 3-6 semanas de edad. Se determinó el establecimiento de un tapón copulativo el E 0,5. Los embriones se trataron calculando el tiempo por el aspecto del tapón copulativo de la madre. Al llegar a una maduración apropiada, se sacrificaron las madres por C02 seguido de dislocación cervical . Los embriones se separaron y se colocaron en PBS a 0°C para lavarlos, seguido de microscopía directa del montaje total. Se prepararon los embriones de esta manera para los días embriónicos (E) 9,5, 12,5, 14,5, 16,5 y 18,5. Se observaron las imágenes del montaje completo utilizando un microscopio de diseccionado Leica MPS30, con un objetivo de 0,8 aumentos, con una lámpara de mercurio conectada y filtro de GFP. Se observó la expresión de la GFP a través de la región entera del sistema nervioso central en estos estadios, incluyendo la retina, el cristalino, y la espina dorsal. La expresión comenzaba a disminuir después de E 12,5, lo que se correspondiía bien con el esquema evolutivo del sistema nervioso central. La diferenciación neural iniciada en este período, que da por resultado una notable disminución de la forma de células impulsoras y un incremento de la forma diferenciada. El esquema estaba representado más claramente por análisis de las secciones coronales del cerebro embrionario, que se preparó como antes. No se dejaron, sin embargo, los ratones en PBS sino que se fijaron con para-formaldehido al 4% a 4°C durante toda la noche. Después del tratamiento de para-formaldehido, los embriones se colocaron en sacarosa al 30% hasta 24 horas después de que el embrión estaba completamente sumergido (típicamente dos días) . Las secciones de criostato se llevaron a cabo embebiendo los embriones en compuesto (Sigma) de O. C.T. (temperatura óptima de corte) seguido de seccionado utilizando un criostato Leica Jung Frigocut 2800 E con una temperatura de caja de -20°C y una temperatura de objetivo de -17 °C. Las secciones fueron de 30 µm de grueso y se adhirieron a portaobjetos con sub-lecho de gelatina. Se analizaron los embrioes E12,5, E14,5, E15,5 y E18,5 en cuanto a fluorescencia. El tejido seccionado se analizó utilizando un microscopio de axiofotio scon filtros de FITC y conectado a una cámara de punto luminoso CCD (Diagnostic Instruments) ; dado que los tejidos aparecían mucho más grandes que el campo de visión del microscopio, la sección se tomó con lente de 10 aumentos y se recompuso en Adobe Photoshop. Se prepararon imágenes similares para el ratón adulto.

Los cerebros adultos se trataron primero por perfusión del ratón con para-formaldehido al 4%. Se diseccionaron entonces los cerebros desde el cráneo con y se trataron con más para-formaldehido al 4% durante 4 horas. Después de fijación, se sumergieron los cerebros en sacarosa al 30% hasta un día después de la sumersión (típicamente tres días) . Se llevaron a cabo secciones sagitales de criostato utilizando los métodos antes establecidos, pero con una temperatura de la caja de -30°C y una temperatura objetivo de -27°C. Los ratones adultos (6 semanas) mostraban expresión de GFP en la región del cerebro señalada antes como sedes de neoneurogénesis que previamente se habían identificado por incorporación de BrdU, como la circunvalación cerebral dentada (Kempermann y col., Proc. Nati . Acad. Sci. Vol. 94 (19) : 10409-10414 (1997), la zona subventricular (Morshead y col. Neuron, Vol, 13(5): 1071-1082 (1994), el bulbo olfatorio, y la corriente migratoria rostral (Subonen y col., Nature, Vol. 383(6601): 624-627 (1996).

Ejemplo 5 Con el fin de determinar si el gen para EGFP era espacial y temporalmente expresado en células impulsoras neuronales, se empleó inmunohistoquímica. El sistema nervioso central de un ratón deriva de una tira de ectodermo, rostral hasta la estría primitiva. Este tejido se vuelve placa neural, que aparece a los días 7,5 de la embriogénesis. La placa neural sufre un rápido crecimiento celular y al día nueve y diez de la embriogénesis, las células de los lados opuestos de la placa neural se funden para formar el tubo neural. La cavidad del tubo neural llega a ser eventualmente el ventrículo de la maduración, y el cerebro adulto el canal central de la médula espinal . Desde esta interfase de cavidad a tej ido es donde tienen lugar las principales divisiones y desarrollos del cerebro. Cuando las células emigran tangencialmente desde la superficie del ventrículo, su papel se hace más específico con más divisiones celulares simétricas. Se conocen varios antígenos que pueden determinar el estadio de desarrollo de los tipos de células principales en el cerebro (típicamente impulsoras neurales, neuronas, astroglia, y hematocitos) . En estos experimentos, se identificaron los diversos fenotipos diferentes del cerebro y se compararon en cuanto a la cantidad y lugar, por empleo de un método inmunohistológico. Para determinar si estas células marcadas por fluorescencia eran realmente representativas del tipo celular, es decir células positivas a nestina (nestina+) y células impulsoras neurales, se compararon las células de GFP frente a un marcador para neuronas diferenciadas (tubulina ß III) y un marcador para astrocitos diferenciados (GFAP) . Estas comparaciones permitieron el análisis de la co-localización de las células de nestina+/GFP+ del cerebro en ambos estadios, el embriogénico y el adulto. Los resultados indicaron un corrimiento manifiesto en los estadios de desarrollo, donde en embriogénesis temprana, las células que rodean inmediatamente los ventrículos eran GFP+, mientras que en las más distales al ventrículo, este modelo de expresión tenía una regulación descendente muy obvia de la expresión de GFP+ y un aumento de Tubulina ßlll en inmunohistoquímica. El promotor de nestina permitía suficientemente la expresión de GFP para aquellas regiones del cerebro que rodean el ventrículo. En el adulto, el modelo de expresión de la regulación de promotor de nestina de GFP disminuía mucho. El modelo de co-localización con los marcadores antes mencionados, tubulina ß III y GFAP se encontró entremezclado, pero sin co-localización amplia. En la región posterior del ventrículo lateral había un alto grado de co-localización regional, habiendo sin embargo muy poca co-localización celular con el marcador GFAP de astrocito. En las regiones anteriores del ventrículo lateral, donde las células comienzan a radiar desde el vetrículo a la corriente migratoria rostral, había un mayor grado de co-localización regional con el marcador neuronal tubulina-ßlll que con GFAP. Cuando las células migraban junto con la corriente migratoria rostral, de nuevo, había un alto grado de expresión de nestina-GFP; sin embargo, había de poca a ninguna colocalización de GFP tanto con los marcadores de GFAP como de tubulina. Estos resultados apoyan la hipótesis de que un gran número de nuevas células que se producen por el ventrículo lateral se hacen neuronas, así como la hipótesis de que ciertas formas de astrocitos sirven como células progenitoras que se dividen simétricamente. Además, estos resultados indican que el transgen de GFP-nestina no se co-localiza con marcadores de un fenotipo diferenciado.

Ejemplo 6 Se aparearon machos positivos transgénicos con ratones hembra C57B6. La aparición de un tapón copulativo era señal de que los embriones fertilizados de la hembra estaban en el día embriónico 0,5 del desarrollo. Al día 13,5 de la embriogénesis, las madres se sacrificaron y se sacaron los embriones . Se tomaron medidas de corona a grupa con el fin de comprobar que no había discrepancia entre el desarrollo de las carnadas transgénica positiva y negativa. No se pudo encontrar fenotipo de tamaño entre las crias . Los embriones se lavaron en PBS a 4°C y se utilizó una luz ultravioleta manual para determinar qué ratones eran transgénicos y cuales no lo eran. En este punto, el sistema nervioso central completo expresa altos niveles de GFP y se pueden determinar fácilmente transgénicos a través del método de luz UV. El tejido de cerebro se separó del feto y se colocó en solución salina con agente tampón de Hank (HBBS) (Gibco) a 4°C y un volumen total de 5 ml . Esta solución se mezcló entonces 1 : 1 con una solución de tripsina 2X que contenía tripsina (Gibco) al 25%, EDTA lmM (Gibco) , y Img/ml de colagenasa (Gibco) todo en HBBS. Se incubó esta solución durante 15 minutos a 37°C con agitación cada tres minutos. Para apagar la actividad de digestión enzimática, se añadió 0,1 mg/ml de ovomucoide (Sigma). El tejido se trituró entonces utilizando una jeringuilla de calibre 19 y luego otra de calibre 21. Las células se aglomeraron durantelO minutos a 500 rpm en una centrífuga Beckman de mesa a 4°C. Se volvieron a suspender luego las células en PBS enfriado con hielo a lxlO6 células/ml. De esta manera, se prepararon dos muestras de células primarias, una tomada del tejido de cerebro de ratones positivos a nestina/GFP y una tomada del tejido de ratones negativos a nestina /GFP. Ambas muestras derivan de los embriones de la misma madre (carnadas) . La selección de células activadas con fluorescencia (FACS) se llevó a cabo por FACS en Coulter Élite ESP. Las células se mantuvieron sobre hielo en PBS excepto mientras se realizaba la selección y recolección, durante la duración de estos experimentos . Las células se colocaron a través de una malla de nylon de 70 mieras para separar las aglomeraciones de células y luego se hicieron pasar por la máquina. El filtro utilizado para detección de GFP era un tubo fotomultiplicador 2 (PMT2) que tenía una longitud de onda de emisión entre 520 y 530 nm. Los resultados de la FACS se muestran en las Figuras 3 A-3N. Las células derivadas de los embriones negativos a nestina-GFP se analizaron primero con la máquina de FACS con el fin de establecer los niveles de fondo de la fluorescencia, así como para determinar el tamaño y forma de las células de esta población neuronal. Los resultados se * . muestran en las Figuras 3 A-3C que presentan la aparición de células de cerebro embrionarias no-transgénicas (células de control) cuando se hacen pasar por la máquina de FACS. La Figura 3 A presenta el tamaño (dispersión frontal o FS) y forma (dispersión lateral o LS) de las células de la población. La caja A muestra donde se encuentra el conjunto de células no-aglomeradas, sanas, determinado por la historia previa del trabajo con la FACS. Cada punto significa un punto de dato (una célula real) . Típicamente, los puntos en el fondo del eje de la dispersión frontal representan detritus celulares, mientras que los puntos del extremo derecha sobre el eje de dispersión lateral representan las aglomeraciones de células. La caja "A", que encierra el 69,9% de la población de las células, representa la acumulación de células analizadas en los siguientes paneles de datos. Las células que permanecen fuera de esta caja que pueden tener aglomeraciones, células muertas, o tener detritus de células no se incluyen. Los puntos de datos mostrados en la Figura 3B eran los de "tras la puerta" de la caja "A" en el panel del lado izquierdo. "Tras la puerta" significa que solo aquellas células que permanecen dentro de la caja "A" de la Figura 3 A están analizadas en la Figura 3 B. La Figura 3 B muestra el grado relativo de fluorescencia de GFP (eje vertical) frente a la dispersión frontal (FS) o tamaño de célula (eje horizontal) de células de la puerta A de la Figura 3 A. Colocando la caja "C" alrededor de esta población de células, se señalaba la fluorescencia de fondo. La puerta C se emplea entonces como señalador de la fluorescencia de fondo para el resto de los experimentos . Cualquier punto que se registre por encima de esta puerta C representa una célula que con una intensidad de fluorescencia más alta que el fondo, y por lo tanto, era positiva a GFP, ya que GFP era la única fuente de fluorescencia en los subsiguientes experimentos. (No hay fluorescencia de células de ratón no-transgénico fuera de la caja señalada como "C") . La Figura 3C muestra el número de células sobre el eje vertical en función de la intensidad de fluorescencia de GFP a escala logarítmica sobre el eje horizontal e indica que la población de células no-transgénicas derivadas del cerebro no muestran intensidad de GFP. Las Figuras 3D-3E muestran el análisis FACS de células de la camada transgénica. Típicamente, el ratón embarazado tenía unos nueve (9) embriones. Cuando estos embriones se sacaron para experimentación, se distinguieron los embriones que eran positivos al transgen de los que eran negativos utilizando una lámpara UV de mano. Los positivos tenían un modelo fluorescente característico en todo el sistema nervioso central . La Figura 3D es igual a la de control después de haber analizado un número de células similar (71.322) . (Este se muestra al lado en las Figuras 3G y Figura 3H que muestra que las poblaciones de las células positivas y negativas son idénticas en términos de dispersión frontal y lateral) . Las células de GFP nestina presentan un tamaño y forma equivalentes a las de su carnadas no-transgénicas . El 70,1% de todas las células se encontraban dentro de la puerta A en el tejido transgénico al compararlas con el 69,9% de células encontradas en la puerta A para las células no-transgénicas . La .Figura 3E muestra que las células positivas a GFP-nestina mostraban dos poblaciones obvias, una población tras la puerta C, por tanto una población de células que no expresan GFP (similar a la población del fondo) y otra, dentro de la puerta B, que muestra una fluorescencia 100 veces mayor que el fondo. De las 71.322 células analizadas, 41, 1% tenía una intensidad fluorescente más alta que las células de control, la segunda población, como queda denotada por la caja "B", incluía el 31,0% de las células. Las células de la caja B se seleccionaron (o en su lugar se aislaron) por la máguina de FACS . La Figura 3F presenta los dos picos y muestra una región de fluorescencia de GFP alta (marcada como puerta D) . Este dato demuestra que la unidad transcripcional 2a intrón -nestina nestina era activa en el 39,3% de células derivadas del cerebro de ratón del día embriónico 13 , 5 en este experimento. Además, dentro de este 39,3%, el 31% de las células eran 100 veces más fluorescentes que las células de fondo . En el siguiente experimento se utilizó además la máquina de FACS para purificar la población de alta fluorescencia. Las células de la caja B del experimento antes descrito se volvieron a seleccionar. Las células se seleccionaron por ambas puertas A y B para asegurar una población de células individuales, sanas, altamente fluorescentes. Los resultados se muestran en las Figuras 31-3K. Como resultado de la selección, las células de la puerta B del experimento anterior (31% de la población total) contenían ahora 93,1% de la población total que presentaba alta fluorescencia de GFP. Para determinar la pureza de células aisladas en dos rondas de selección de células, las células de la puerta B (Figura 3J) se aglomeraron y volvieron a suspender en un pequeño volumen de PBS. Esta población se analizó de nuevo por FACS, seleccionándose otra vez. Los resultados se muestran en las Figuras 3L-3N. Se analizaron 1.289 células y, de este grupo, el 99,9% de las células tenía alta fluorescencia de GFP. Esto demostraba que las células seleccionadas (puerta B, Figura 3J) representaban una población altamente purificada que expresa transgen de CFP a alto nivel .

Ejemplo 7 Se realizaron también experimentos basados en la formación de colonias de neurosferas con el fin de determinar si una célula de GFP de nestina es una célula impulsora o una célula progenitora. La formación de colonia de neurosferas es un ensayo común originalmente instrumentalizado por Reynolds y Weiis, Science, Vol. 255: 1701-1710 (1992), cuyo contenido completo se incorpora aquí como referencia, y se utiliza para determinar si una célula es realmente una célula impulsora neural. Por crecimiento de cultivos celulares primarios a partir de tejido de cerebro disociado enzimáticamente, se pueden identiificar células que crearían grandes colonias esféricas en cultivo al colocarlas en un medio libre de suero con EGF. Estas masas esféricas se podrían entonces cultivar en placa sobre portaobjetos de laminina con suero bovino fetal en el medio donde iniciaron la adherencia a la superficie con subsiguiente diferenciación de las células en tres fenotipos celulares neurales diferentes (neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos) dentro de los cinco a siete días. Estas células diferenciadas no sufren más mitosis, y no expresan más el marcador de células impulsoras nestina. El procedimiento empleado en estos experimentos era como sigue. Se recogieron las células de una cepa de ratón C57BL/6 transgénico adulto utilizando típicamente línea #3 de ratón. Se inyectaron al ratón (inyección intraperitoneal) 400 µl de hidrato de clorilo al 15% como sedante. Cuando perdió los reflejos, el ratón se perfundió con 10 ml de solución salina con tampón de Hanks enfriada con hielo (sin calcio o magnesio) para separar la sangre. Se diseccionó entonces el cerebro fuera del cráneo y colocó en HBSS+. La región del ventrículo se preparó por disección coronal separando el bulbo olfativo y el cerebelo. El bloque de tejido se cortó en dados utilizando un bisturí no. 10. El tejido se colocó entonces en medio DMEM/F12 con penicilina G/sodio a 100 u/ml y sulfato de estreptomicina a 100 µ/ml (Gibco) durante cinco minutos sobre hielo. Se dejó sedimentar el tejido y se separó todo el sobrenadante. Se añadieron entonces seis mililitros de tripsina 0,025% (Gibco) en presencia de verseno y se dejó digerir enzimáticamente el tejido durante diez minutos. Se valoraron entonces las células con una pipeta hasta que fueron células sueltas, como se determinó con un hemostato. Las células se aglomeraron entonces tres veces por adición de DMEM/F12 y se centrifugaron para separar la tripsina y se volvieron a suspender después en medio M12 libre de suero y se suplementaron con 20 ng/ml de EGF. Se cultivaron en placa entonces las células a una densidad de 20.000 células por mililitro de medio, o más bajo para densidad clonal. Se suplemento luego el medio con 100 ng de EGF cada tres días. Las neuroesferas aparecieron al cabo de cinco días y tuvieron 50-80 µm de diámetro durante dos semanas. Con un trabajo de rutina fue posible de esta manera conseguir un alto número de neuroesferas, todas las cuales eran altamente positivas en GFP. Al cultivar en placa estas esferas de fluorescencia sobre laminina en presencia de FBS, se obtuvo diferenciación en varios otros tipos de células tales como neuronas no-fluorescentes y astrocitos. Las células derivadas de GFP-nestina del ventrículo lateral eran capaces de formar neurosferas así como ser inducidas a dar fenotipos múltiples al ser inducidas a diferenciación, lo que indica que las células de GFP-nestina eran células impulsoras neurales.

Ejemplo 8 También se llevaron a cabo experimentos de trasplantes neuronales. En estos experimentos, las células de GPF+-nestina purificadas o aisladas desde un ratón transgénico se insertaron en el cerebro de un animal receptor (en estos estudios se emplearon ratas Sprague Dawley) . Se realizaron experimentos para evaluar si las células de GFP-nestina podían ser transplantadas al cerebro de la rata receptora y si estas células no solamente sobrevivían sino que también se incorporaban ellas mismas al esquema de desarrollo normal de la región a la que eran suministradas. El ratón embrionario se ^preparó por asfixia con C02 de la madre seguido de extirpación inmediata del embrión en HBSS enfriada con hielo. Se determinaron embriones positivos transgénicos con una lámpara de mercurio manual, y se separó toda la cabeza. El tejido se colocó entonces en medio DMEM/F12 con 100 u/ml de penicilina G/sodio y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina (Gibco) durante cinco minutos sobre hielo. Se dejó sedimentar el tejido y se separó todo el sobrenadante. Se añadieron entonces seis mililitros de tripsina 0,025% (Gibco) en presencia de verseno y se dejó digerir enzimáticamente el tejido durante 10 minutos. Se tritiaron entonces las células con una pipeta hasta que eran células aisladas, como se determina con un hemostato. Se aglomeraron luego tres veces por adición de DMEM/F12 y centrifugación para separar la tripsina. El ratón embrionario de día 14 (que era 60% GPF+ en el SNC en este período) se desorganizó. Las células se diluyeron a 20.000 células en 10 µl y se mantuvieron en hielo en HBSS hasta que la rata receptora estaba lista para transferencia celular. La rata adulta se preparó por anestesia de la rata utilizando una mezcla de cetamina y xilazina a 10 mg/kg y 10 mg/kg respectivamente, se diluyó en solución salina y se inyectó intraperitonealmente . Se comprobó el grado de sedación por reflejo de la pata a un pinchazo. Cuando quedó sedado, se rasuró la cabeza del animal utilizando una cuchilla eléctrica y se colocó en un bastidor estereotáctico. Se abrió entonces la boca de la rata y se insertaron incisores cruzando la barra dental. Se colocaron barras en las orejas a uno u otro lado en el canal de audición y se cerraron en su sitio. A continuación, se apretó la pinza de la nariz sobre el hocico del animal y se limpió la piel con betadine. Se hizo una incisión de linea media de 1,5 cm en el cuero cabelludo utilizando un bisturí no. 10 y utilizando fórceps y unas tijeras finas, y, comenzando desde la linea media y moviéndose hacia el lado, se separó el pericráneo para exponer el cráneo. Utilizando la intersección de las suturas coronal y sagital, se identificó la bregma para utilizarla como punto de referencia estereotáctico. Se cargaron entonces las 20.000 células en un Hamilton que se había conectado al soporte del bastidor estereotáctico. Se hizo mover la punta de la aguja hacia la bregma para registrar las coordenadas AP y ML (utilizando Parinox y arson 1982 para las coordenadas) y luego se movieron hasta las coordenadas estereotácticas por el ventrículo lateral . En este lugar se perforó un orificio utilizando buril de carburo número 1 fijado a una broca dental en el punto marcado. Se bajó entonces la aguja hasta la parte más arriba de la duramadre para registrar su coordenada vertical y se hizo descender ventralmente a aproximadamente 1 mm/min. Se inyectaron las células a aproximadamente 1 µl/min; se dejó la aguja durante 4 minutos y luego se separó a una velocidad de 1 mm/minuto. A continuación, se irrigó la piel en el punto en que se había sacado empleando solución salina y se cerró con sutura de etilón no absorbible del No. 2,0 empleando una aguja de corte inverso y cubierta de gel antiséptico. De esta manera pudieron inyectarse las células en el ventrículo con toda precisión; el método permitía también inyecciones dirigidas por ajuste de las coordenadas AP y ML. Se ha encontrado que, al cabo de un período de supervivencia de una semana, las células eran capaces de sobrevivir e incorporarse al cerebro. Aunque esta invención se ha presentado y descrito de forma particular con referencia a modos de realización preferidos de la misma, los especialistas entenderán que se pueden hacer diversos cambios en la forma y detalles en ella sin separarse del marco de la invención abarcado por las reivindicaciones adjuntas.

LISTA DE SECUENCIAS <110> Cold Spring Harbor Laboratory Enikolopov, Grigori N. Mignone , John <120> RATONES TRANSGENICOS QUE EXPRESAN PROTEI?A FLUORESCENTE <130> 1314.1062002 <150> Pat. EEUU 09/444.335 <151> 1999-11-19 <160> 3 <170> FastSEQ para versión Windows 4,0 <210> 1 <211> 10 <212> AD? <213> Secuencia artificial <220> <223> Ligando sintético <400> 1 aggcgcgcct <210> 2 <211> 21 <212> AD? <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador <400> 2 cctctacaaa tgtgtgatgg c <210> 3 <211> 23 <212> AD? <213> Secuencia artificial <220> Cebador <400> 3 gcgcaccatc ttcttcaagg acg

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo, que lleva integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína fluorescente donde el gen que codifica para la proteína fluorescente se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo.

2. El mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo según la reivindicación 1 donde el gen que codifica para proteína fluorescente es expresado en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano o progenie del mismo.

3. El mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismno según la reivindicación 1 donde el gen que codifica para proteína fluorescente es expresado selectivamente en células impulsoras y progenitoras neurales del mamífero transgénico no-humano o progenie del mismo.

4. El mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo, según la reivindicación 1 donde el mamífero es un ratón.

5. El mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo según la reivindicación 1 donde la secuencia reguladora del gen de nestina de mamífero se obtiene de un gen de nestina de rata.

El mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo según la reivindicación 1 donde la secuencia reguladora incluye una secuencia de segundo intrón del gen de nestina de mamífero.

7. El mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo según la reivindicación 1 donde la secuencia reguladora incluye un promotor.

8. El mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo según la reivindicación 7 donde tanto el promotor como la secuencia reguladora se obtienen del mismo gen de nestina del mamífero.

9. Un método para producir un mamífero transgénico no-humano que expresa para una proteína fluorescente en células impulsoras y progenitoras multipotentes, que comprende: (a) introducir en un óvulo fertilizado de un mamífero no-humano, ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína fluorescente que es expresada en células impulsoras y multipotentes del mamífero no-humano; (b) introducir el óvulo fertilizado de (a) en un mamífero no-humano de la misma especie; (c) dejar que el mamífero no humano tenga su progenie que está formada por mamíferos transgénicos no humanos; y (d) seleccionar la progenie del mamífero no-humano de (c) cuyas células impulsoras y progenitoras multipotentes expresan el gen fluorescente

10. El método según la reivindicación 9 donde el gen que codifica para una proteína fluorescente se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras multipotentes.

11. El método según la reivindicación 9 donde el gen que codifica para una proteína fluorescente se expresa en células impulsoras y progenitoras neurales.

12. El método según la reivindicación 9 donde el mamífero transgénico no-humano es ratón.

13. El método según la reivindicación 9 donde la secuencia reguladora del gen de nestina de mamífero se obtiene del gen de nestina de rata.

14. El método según la reivindicación 9 donde la secuencia reguladora comprende una secuencia de segundo intrón de gen de nestina del mamífero.

15. El método según la reivindicación 14 donde la secuencia incluye además un promotor.

16. El método según la reivindicación 15 donde tanto el promotor como la secuencia reguladora se obtienen del mismo gen de nestina del mamífero.

17. Un mamífero transgénico no-humano producido por el método de la reivindicación 9.

18. Un constructo de expresión que comprende una secuencia de promotor, un gen que codifica para proteína fluorescente verde y una secuencia reguladora presente en el segundo intrón de un gen de nestina de mamífero.

19. ' Una célula que comprende un constructo de expresión que incluye una secuencia de promotor, un gen que codifica para proteína fluorescente verde y una secuencia reguladora presente en el segundo intrón de un gen de nestina de mamífero.

20. Un método para medir una población de células impulsoras y progenitoras multipotentes en un órgano de un animal o región del mismo, que comprende: medir las células que fluorescen desde el órgano o región del mismo de un mamífero transgénico no-humano que tiene integrado en su genoma ADN que comprende : una secuencia reguladora ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína fluorescente, donde el gen que codifica para la proteína fluorescente se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano, donde las células que fluorescen son células impulsoras y progenitoras multipotentes.

21. El método según la reivindicación 20 donde el gen que codifica para la proteína fluorescente se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras multipotentes .

22. El método según la reivindicación 20 donde el gen que codifica para una proteína fluorescente se expresa en células impulsoras y progenitoras neurales.

23. El mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo según la reivindicación 20 donde la secuencia reguladora incluye una secuencia del segundo intrón del gen de nestina de mamífero.

24. El mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo según la reivindicación 20 donde la secuencia reguladora comprende además un promotor.

25. El mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo según la reivindicación 24 donde tanto el promotor como la secuencia reguladora se obtienen del mismo gen de nestina de mamífero.

26. Un método de obtención de células impulsoras y progenitoras multipotentes, primarias, no-cultivadas, que comprende aislar células que expresan para una proteína marcador/informador de un mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo, que tiene integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para la proteína marcador/informador donde el gen que codifica para la proteína marcador/regulador se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo.

27. Células obtenidas por el método de la reivindicación 26.

28. Un método de obtención de células impulsoras y progenitoras multipotentes, primarias, no-cultivadas, que comprende aislar células fluorescentes de un mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo que tiene integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína fluorescente donde el gen que codifica para la proteína fluorescente es expresado en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo. .

29. El método según la reivindicación 28 donde el gen que codifica para la proteína fluorescente se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras multipotentes del mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo.

30. El método según la reivindicación 28 donde el gen que codifica para la proteína fluorescente se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras neurales del mamífero transgénico no-humano, progenie o embrión del mismo .

31. El método según la reivindicación 28 donde la secuencia reguladora comprende una secuencia del segundo intrón del gen de nestina de mamífero.

32. El método según la reivindicación 28 donde la secuencia reguladora incluye además un promotor.

33. El método según la reivindicación 32 donde tanto la secuencia de promotor como la reguladora se obtienen del mismo gen de nestina del mamífero.

34. El método según la reivindicación 28 que comprende además identificar y/o aislar genes expresados en las citadas células fluorescentes aisladas.

35. El método según la reivindicación 28 que comprende además identificar y/o aislar proteínas expresadas en las citadas células fluorescentes aisladas.

36. El método según la reivindicación 28 que comprende además identificar y/o aislar antígenos de superficie específicos de célula expresados en las citadas células fluorescentes aisladas.

37. El método según la reivindicación 28 que comprende además transplantar las citadas células fluorescentes aisladas a un animal vivo o un embrión viable.

38. El método según la reivindicación 28 donde las células fluorescentes se aislan por selección de células fluorescentes activadas.

39. Células obtenidas por el método según la reivindicación 28.

40. Un método para evaluar la capacidad de un compuesto para promover diferenciación de células impulsoras y progenitoras multipotentes, que comprende: (a) contacto de células impulsoras y progenitoras multipotentes vivas, que tienen integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína marcador/informador donde el gen que codifica para la proteína marcador/informador se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes, con un compuesto que se va a valorar; (b) _ determinación de la medida de proteína marcador/informador de las células vivas de (a) en presencia del compuesto; y (c) comparación de la medida de la proteína marcador/informador de (b) con la medida de la proteína marcador/informador de células vivas de control; donde un decrecimiento o ausencia de medida de proteína marcador/informador de las células vivas en presencia del compuesto comparada con la medida de la proteína marcador/informador de las células vivas de control es indicativo de la capacidad de los compuestos para promover diferenciación de células impulsoras y progenitoras multipotentes .

41. El método según la reivindicación 40 donde la proteína marcador/informador es una proteína fluorescente y la medida de la proteína marcador/informador es fluorescencia .

42. El método según la reivindicación 41 donde el gen que codifica para la proteína fluorescente se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras multipotentes .

43. El método según la reivindicación 41 donde el gen que codifica para proteína fluorescente se expresa en células impulsoras y progenitoras neurales.

44. El método según la reivindicación 40 donde el compuesto es un agente terapéutico.

45. El método según la reivindicación 40 donde la diferenciación es a células impulsoras y progenitoras neurales .

46. Un método para evaluar la toxicidad de un compuesto para células impulsoras y progenitoras multipotentes, que comprende : (a) contacto de células impulsoras y progenitoras vivas, que tienen integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína marcador/informador, donde el gen que codifica para la proteína marcador/informador se expresa en células impulsoras y progenitoras multipotentes, con un compuesto que se va a valorar; (b) determinación de las células vivas que expresan la proteína marcador/informador en presencia del compuesto; y (c) comparación de las células vivas que expresan la proteína marcador/informador de (b) con las células de control vivas que expresan la proteína marcador/informador . donde el decrecimiento o ausencia de células vivas que expresan proteína marcador/informador en presencia del compuesto comparado con las células vivas de control que expresan la proteína marcador/informador es indicativo de la toxicidad del compuesto para las células impulsoras y progenitoras multipotentes.

47. El método según la reivindicación 46 donde la proteína marcador/ informador es una proteína fluorescente y las células que expresan proteína marcador/informador son células fluorescentes.

48. El método según la reivindicación 47 donde el gen que codifica para una proteína fluorescente se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras multipotentes .

49. El método según la reivindicación 47 donde el gen que codifica para proteína fluorescente se expresa en células impulsoras y progenitoras neurales.

50. Un método para evaluar la capacidad de un compuesto para promover diferenciación de células totipotentes en células impulsoras y progenitoras multipotentes, que comprende : (a) poner en contacto células impulsoras y progenitoras totipotentes vivas que tienen integrado en su genoma ADN que comprende una secuencia reguladora de un gen de nestina de mamífero ligada operativamente a un gen que codifica para una proteína marcador/informador, donde el gen que codifica para la proteína marcador/informador es expresado en células impulsoras y prpgenitoras multipotentes; (b) determinar la medida de una proteína marcador/informador de las células vivas de (a) en presencia del compuesto; y (c) comparar la medida de la proteína marcador/informador de (b) con la medida de proteína marcador/informador de las células de control; donde un incremento de medida de proteína marcador/informador en presencia del compuesto comparada con la medida de proteína de marcador/informador de las células de control es indicativo de la capacidad del compuesto para promover diferenciación de células totipotentes en células impulsoras y progenitoras multipotentes.

51. El método según la reivindicación 50 donde la proteína marcador/informador es una proteína fluorescente y la medida de proteína marcador/informador es fluorescencia.

52. El método de la reivindicación 51 donde el gen que codifica para una proteína fluorescente se expresa selectivamente en células impulsoras y progenitoras multipotentes .

53. El método según la reivindicación 51 donde el compuesto es un agente terapéutico.