WO2004092371A1

WO2004092371A1 - グルタミン酸トランスポーターｇｌａｓｔ機能欠損マウス

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Publication number: WO2004092371A1
Application number: PCT/JP2004/005253
Authority: WO
Inventors: Kohichi Tanaka; Takayuki Harada
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-04-18
Filing date: 2004-04-13
Publication date: 2004-10-28
Anticipated expiration: 2005-10-18
Also published as: EP1619248A4; US7642399B2; EP1619248A1; CA2522597A1; JP4494340B2; EP1619248B1; JPWO2004092371A1; CA2522597C; US20070011758A1

Abstract

本発明は、内在性グルタミン酸トランスポーターGLAST遺伝子の機能を欠損させたGLASTノックアウトマウスであって、１）その眼圧が正常範囲にあり、かつ２）その網膜神経節細胞数が、野生型正常マウスに比べて減少している、GLASTノックアウトマウスを提供する。該ノックアウトマウスは、その眼の性状から正常眼圧緑内障モデルとして有用である。また、該ノックアウトマウスを使用することによって、正常眼圧緑内障の治療に有用な化合物をスクリーニングすることもできる。

Description

グルタミン酸トランスポーター G L A S T機能欠損マウス技術分野

本発明は、グルタミン酸トランスポーターの一種である GLASTの機能が欠損している GLASTノックアウトマウス及びその作製方法に関する。また、本発明は、該ノックアウトマウスの、正常眼圧緑内障モデルマウスとしての使用、及び該ノックアウトマウスを用いた、正常眼圧緑内障の予防及び/又は治療に有用な化合物のスクリ一ニング方法にも関する。背景技術

正常眼圧緑内障は、緑内障のなかの一つのタイプに属するが、その有病率の高さから、最近特に注目されている疾患である。一般に緑内障とは、眼圧（眼球内の水圧) が高くなるために視神経が圧迫されて萎縮し、そのために視機能が障害を受け、視野が狭くなる疾患であり、そのまま放置しておくと、最終的には失明にいたる危険性が高い。他方、正常眼圧緑内障は、眼圧が正常範囲（ヒトでは通常 1 0〜2 1 nmiHg) にあるにもかかわらず、眼圧が高い緑内障と同様の所見

(視神経の萎縮及び視野欠損）を呈する病態である。緑内障は、先進諸国では、糖尿病に次いで失明原因の第 2位にランクされており、日本人では 4 0歳以上の人の約 3 . 5 %に当たる約 2 ' 0 0万人が罹患しているが、近年の疫学調査では、その 7割が正常眼圧緑内障であると報告されている。正常眼圧緑内障は、ゆつくりと進行して自覚症状も少ないため、早期発見も難しく、また現在のところ、更に眼圧を下げること以外、決め手となる治療法がない。

近年、軽度かつ慢性的なグルタミン酸濃度の上昇によって誘発される網膜神経節細胞の変性脱落、すなわち神経細胞死が、緑内障や糖尿病性網膜症の原因の一つとして提唱されている（(Hamda, T.， et al. Proc Natl Acad Sci USA 95, 4663- 4666, 1998； Harada, C. et al., Neurosci. Lett. 292, 134-136, 2000)。

哺乳類の中枢神経系において、グルタミン酸は主要な興奮性神経伝達物質の 1 つであり、脳の高次機能に重要な役割を果たしているが、その反面、グルタミン酸の過剰な上昇が神経毒性を示し、各種の神経変性疾患や脳虚血後の遅延性神経細胞死を招くことが知られている。このグルタミン酸濃度を調節する機構の一つがグルタミン酸トランスポー夕一である。グルタミン酸トランスポ一夕一は、神経終末から一旦放出されたグルタミン酸を細胞内に取り込み、シナプス間隙のグル夕ミン酸濃度を低く保つことを主要な役割とする機能分子である。

現在、哺乳動物の脳内のグルタミン酸トランスポーターとしては、神経細胞に存在する型の EAACl, EAAT4及び EAAT5 (Kanai, Y. & Heidiger, M.A., Nature 360, 467-471, 1992； Fairman, W.A., et al" Nature, 375, 599-603, 1995； Arrizal, J.E., et al" Proc Natl Acad Sci USA 94, 4155-4160, 1997、並にグリァ細胞に存在する型の GLT1及び GLAST (別名 GluT-1)が知られており (Pines, D. et al., Nature 360, 464-467, 1992； Mukainaka et al., Biochimica et Biophysica Acta 1244, 233-237, 1995； Tanaka, , Neurosci. Res. 16, 149-153, 1993； Tanaka, K.， Neurosci. Lett. 159, 183-186, 1993； Storck, T" et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10955-10959， 1992)、これらのグルタミン酸トランスポー夕一の機能異常と各種の神経細胞変性疾患との関連が知られている。

この様な状況の中で、 GLASTノックァゥトマウス（Watase, K. et al, Eur. J. Neurosci. 10, 976-988, 1998；特開平 1 0— 3 3 0 8 7号）を用いた実験から、 GLASTが、網膜内のミューラー細胞に存在すること、そして GLASTノックァゥトマウスでは野生型と比較して、虚血負荷後の網膜損傷が著しく増悪することが明らかとなり、このことから、網膜のミューラー細胞に存在する GLASTが緑内障の発症に関与していることが示唆されている（Harada, T.， et al. Proc Natl Acad Sci USA 95, 4663-4666, 1998)) 。しかし、この GLASTノックアウトマウスでは、虚血負荷をかけない限り、網膜組織の損傷は観察されておらず、これを正常眼圧緑内障のモデルに用いることはできない。

既に、緑内障の治療薬の開発やその発症機序の解明のために、緑内障モデル動物として、遺伝的慢性緑内障モデルマウスや水負荷による高眼圧緑内障モデルゥサギなどが存在するが、正常眼圧緑内障のモデル動物は、これまで全く知られていない。また、正常眼圧緑内障と GLASTとの関係を指摘している報告はなく、正常眼圧緑内障の発症機序は依然として不明である。従って、正常眼圧緑内障モデル動物が得られれば、該疾患の治療に有効な治療薬の開発のために、その治療方法の確立のために、そしてまた該疾患の原因や発症機序の解明のために、極めて有益であると期待される。しかしながら、現在、正常眼圧緑内障モデル動物は知られておらず、従って、医学分野または医薬分野において、このようなモデル動物が切望されていた。発明の開示

本発明者は、従来から存在するダル夕ミン酸トランスポーター遺伝子 GLAST の機能が欠損した通常のノックアウトマウス (GLASTノックアウトマウス）を改良した結果、眼圧が正常範囲内にあるにもかかわらず、網膜神経節細胞が変性脱落し、その数が著しく減少した改良型 GLASTノックアウトマウスを得ることができた。そして、このノックアウトマウスは、正常眼圧緑内障のモデルマウスとして有用であることが判明した。

従って、本発明は、内在性 GLAST遺伝子の機能を欠損させた、正常眼圧緑内障のモデルとしての GLASTノックアウトマウス、特には、 1 ) その眼圧が正常範囲にあり、かつ 2 ) その網膜神経節の細胞数が、野生型マウスに比べて減少している、 GLASTノックアウトマウスを提供する。 . 本発明では、該 GLASTノックアウトマウスの眼圧は、通常 2 I mmH g以下、例えば 1 0〜2 I mmH gである。また、該 GLASTノックアウトマウスの網膜神経節の細胞数は、野生型マウスに比べて少なくとも 2 0 %減少している。本発明では、好ましくは、該 GLASTノックアウトマウスの遺伝的背景は、 C57KL/6系マウスの、例えば C57BL/6 J系マウスの遺伝的背景と同一又は実質的に同一である。

具体的には、本発明は、内在性 GLAST遺伝子領域内に、例えばその第 6ェキソンに、ネオマイシン耐性遺伝子が挿入されている GLASTノックアウトマウスを提供する。

本発明はまた、この様な GLASTノックアウトマウスの、正常眼圧緑内障のモデルマウスとしての使用をも提供する。

別の態様として、本発明は、内在性 GLAST遺伝子の機能を欠損させた GLAST ノックアウトマウスの作製方法を提供する。この作製方法は、下記 1〜6の過程を含んで成る：

1 ) 相同染色体上の 1つの内在性 GLAST遺伝子の機能を欠損させた任意のマウスの ES細胞を得ること、

2 ) 過程 1で得られた ES細胞を用いて、該細胞を含んで成るキメラマウスを得ること、

3 ) 過程 2で得られたキメラマウスを正常 C57BL/6系マウスと交配して、へテロ接合型ノックァゥトマウスを得ること、

4 ) 過程 3で得られたヘテロ接合型ノックァゥトマウスを正常 C57BL/6系マ. ウスと交配して、ヘテロ接合型ノックアウトマウスを得ること、

5 ) 過程 4に記載した交配を、少なくとも合計 5回繰り返して、その遺伝的背景を C57BL/6系マウスに近づけたヘテロ接合型ノックァゥ 1、マウスを得ること、及び

6 ) 過程 5で得られたヘテロ接合型ノックァゥトマウス同志を交配して、ホモ接合型又はへテロ接合型の GLASTノックァゥトマウスを得ること。

本発明の作製方法では、過程 5において、過程 4に記載した交配を少なくとも合計 9回繰り返すことが好ましい。

本発明の作製方法により作製された GLASTノックァゥトマウスもまた、本発明に含まれ、しかも、この様にして作製された GLASTノックアウトマウスもまた、正常眼圧緑内障のモデルマウスとして使用することができる。

更に別の態様として、本発明は、上記の本発明の GLASTノックアウトマウス、又は上記の本発明の作製方法により作製されたの GLASTノックァゥトマウスを、正常眼圧緑内障のモデルマウスとして用いる使用方法を提供する。

従って、本発明は、この様な GLASTノックアウトマウスを用いた、正常眼圧緑内障の予防及び Z又は治療に有用な化合物のスクリーニング方法を提供する。特には、このスクリーニング方法は、

1 ) 本発明の GLASTノックアウトマウスに試験化合物を投与すること、

2 ) 野生型マウスに試験化合物を投与すること、

3 ) 上記の各マウスにおいて、投与前、及び投与してから一定期間後に、生存する視神経細胞の数量又機能を評価すること、及び

4) ノックアウトマウスと野生型マウスの検査結果を比較して、試験化合物の有効性を評価すること

を含んで成る。

本発明のスクリーニング方法では、生存す'る視神経細胞数又は視神経細胞機能を評価するために、網膜神経節の神経細胞数の計数に加え、網膜電位や視覚誘発電位の測定 (Porciatti et al. , Vision Res. 39, 3071-3081, 1999)、 Visual CI iffテストなどの行動学的解析 (Ma, L. et al. , Neuron 36, 623-634, 2002)を併用して評価することが好ましい。図面の簡単な説明

図 1は、マウス GLAST遺伝子のゲノム構造の概略（制限酵素部位及びェキソン部分) を示す。図中、各記号が示す制限部位に関与する制限酵素は以下の通りである。 E : E c o R I、 B : B amH I。また、黒ボックスはェキソン (Exon) 1〜 10番を示す。

図 2は、実施例 1において、マウス GLAST遺伝子の機能を欠損させるために破壊しょうとする標的遗伝子領域 (上段) 、使用した夕ーゲティングベクター ( 中断）、及び破壊された GLAST遺伝子（下段）の構造を示す。図中、各記号が示す制限部位に関与する制限酵素は以下の通りである。 P ： Pvu I I、 RV： Ec oRV、 B : B amHI、 E : Ec oR I、 X : Xh o I。また、黒ボックスによりェキソン 6〜8番 (E6〜8) を示す。 n e oはネオマイシン耐性遗伝子を、 DT— Aはジフテリアトキシン Aフラグメント遗伝子を示す。

図 3は、ホモ接合型 GLASTノックァゥトマウス (GLAST-/-)及び野生型正常マウス (GLAST+/+)の網膜の病理切片像を示す。

図 4は、出生後、指示した週齢における、ホモ接合型 GLASTノックアウトマウス (GLAST-/-)、ヘテロ接合型 GLASTノックアウトマウス (GLAST+ )、及び野生型正常マウス (GLAST+/+)の網膜神経節の細胞数を示す。これらの細胞数は、網膜神経節の病理切片内の神経細胞数を、へマトキシリン /ェォシン染色後に計数した。縦軸は、 3〜22枚の切片から得られた切片 1枚あたりの平均細胞数を表す。横軸は、各マウスの出生後の週齢を表す。

図 5は、ホモ接合型 GLASTノックァゥトマウス (GLAST-/-)及び野生型正常マウス (GLAST+/+)の網膜神経節における、： Fluoi'o-Goldの逆行性ラベリングにより標識された神経細胞を示す蛍光像を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明において、マウスのグルタミン酸トランスポーター GLAST (Glutamate/Asparatate Transporter)とは、配列番号 1に示す塩基配列を有する DNA鎖によってコードされ、配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する蛋白質のことである (Tanaka, K" Neurosci. Lett. 159, 1803-186, 1993)) 。この蛋白質は、ラッ卜では GluT-1とも呼ばれており（Tanaka, , Neurosci. Res. 16, 149- 153, 1993； Storck, T" et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10955-10959, 1992) 、両者はいわゆるカウンターパートである。

マウス GLASTの遺伝子 (ゲノム) 構造は既に解明されており、その詳細は Hagiwara, T., et al., Genomics 33, 508-515, 1996に ci載されてレる。この退子構造の概略を表 1及び図 1に示す。

ただし、マウスの系統によっては、マウス GLASTは、上記のコード核酸配列及びアミノ酸配列、更にはそのゲノム配列が、その機能が維持される範囲内で変異していること、例えば塩基やアミノ酸残基の置換、欠失、付加、又は挿入を受けていることもあり、本発明では、その様な変異体、例えば上記のコード核酸配列において、例えば 1〜 1 0個、好ましくは 1〜 5個の塩基が置換、欠失、付加、又は挿入している変異体、あるいは上記アミノ酸配列において、例えば 1〜1 0個、好ましくは 1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入している変異体なども、マウス GLASTに含む。表 1 ：マウス GLAST遺伝子のェキソン一イントロン構成ェキソンィ卜ンキソン恭号サイス列 *与部位番号サイズ受容部位配列番号

表 1は、 GLAST遺伝子のェキソンとイントロンの接合部位の配列を示す。ェキソンの核酸配列は大文字で、ィントロンの核酸配列は小文字で示している。本発明において、グルタミン酸卜ランスポーター GLAST遗伝子の機能の欠損とは、相同染色体上の 1又は 2つの GLAST遺伝子座に存在する 1又は 2つの内在性 GLAST遺伝子領域において、その構造をコードする領域中、例えばェキソン中に、変異を導入することにより、あるいは GLAST遺伝子の発現に関与する領域中、例えば、プロモーター領域やイントロン領域中に、変異を導入することにより、機能的な GLASTが発現しないようにすること、あるいは GLAST遺伝子の発現が恒常的に抑制されていることを意味している。いずれの場合にしろ、内在性の 1又は 2つの GLAST遺伝子が生体内で実質的に機能していない状態を指す。従って、本発明において、 GLASTノックアウトマウスは、 2つの内在性 GLAST遺伝子の機能が欠損しているホモ接合型及び 1つの内在性 GLAST遺伝子の機能が欠損しているへテロ接合型を包含するが、該遺伝子の機能欠損の効果の点からホモ接合型マゥスが好ましい。

この様な遺伝子の機能の欠損を、公知のノックアウトマウスの作製方法、例えばジーン夕ーゲッティング法により達成することができる。また、上記の変異の導入は、 GLAST遺伝子領域内の塩基の置換、塩基の欠損、又はその領域内への塩基の挿入であってもよい。

本発明において、「遺伝的背景が同一又は実質的に同一」とは、比較するマウス間において、注目する遺伝子型（GLAST遺伝子型）以外の全ての遺伝子型が 9 9 %以上同一であることを意味する。具体的には、実施例において、 F1の GLASTへテ口接合型ノックァゥ卜マウスを 9世代以上正常 C57BL/6系マウスと戻し交配し、 129系統由来の遺伝子が全遺伝子の 1 %以下になったことを意味する。

1 . 本発明の GLASTノックアウトマウス

本発明は、相同染色体上の 1又は 2つの内在性 GLAST遺伝子の機能が欠損した、正常眼圧緑内障モデルマウスとしての GLASTノックァゥトマウスを提供し

、具体的には、 1 ) その眼圧が正常範囲にあり、かつ 2 ) その網膜神経節の細胞数が、野生型正常マウスに比べて減少している、 GLASTノックアウトマウスを提供する。特には、その遺伝的背景が C57BL/6系マウス、例えば C57BL/6 J系マウスと同一又は実質的に同一であるものが好ましい。

野生型正常マウスの眼圧は、通常、 1 0〜2 I mmH gであるが、本発明のノックァゥトマウスでもまた、その眼圧は正常範囲内にある。ただし、個体により、上記範囲を逸脱することもあるが、高眼圧といわれる範囲例えば 3 0 mmH g以上にまで達するものではない。マウスの眼圧は、例えば電子眼圧計を用いて

、測定することができる。

また、本発明のノックアウトマウスでは、その網膜神経節の神経細胞数が、正常マウスに比べて、少なくとも 2 0 %、より好ましくは少なくとも 5 0 %ほど減少している。網膜神経節の神経細胞数の減少は、慣用的な組織化学的な手法により、例えば切片を用いたへマトキシリン Zェォシン染色により、顕微鏡下に測定することができる。

更に、本発明のノックァゥトマウスでは、野生型正常マウスに比べて、光刺激による網膜の電位変化の一種である b波の低下も認められている。 b波は GLASTが存在するミューラー細胞を含む網膜内層の活動電位を反映するものであり、 GLASTによるグルタミン酸濃度調節機構が、視覚伝達においても重要な役割を持つことを示唆する（Harada, T.， et al. Proc Natl Acad Sci USA 95, 4663-4666, 1998) 。

この網膜神経節の神経細胞数の減少は、神経変性又は神経細胞死ととらえることができる。一般に、正常眼圧緑内障を含む緑内障では、視神経乳頭部の萎縮や網膜神経繊維の欠損が認められており、現在では眼圧依存性にせよ非依存性にせよ緑内障の最終病像は、網膜神経節細胞死であると考えられている。

従って、本発明の GLASTノックアウトマウスは、その眼の性状、すなわち眼圧が正常範囲にあること、及び網膜神経節の細胞数が少していることを考慮すると、正常眼圧緑内障のモデルマウスとして使用することができる。

2 . 本発明の GLASTノックアウトマウスの作製

第 2の態様として、本発明は、本発明の GLASTノックアウトマウスの作製方法を提供する。この方法は、下記過程 1〜6を含んで成る：

1 ) 相同染色体上の 1つの内在性 GLAST遺伝子の機能を欠損させた任意のマウス ES細胞を得ること、

3 ) 過程 2で得られたキメラマウスを、野生型 C57BL/6系マウスと交配して、ヘテロ接合型ノックァゥトマウスを得ること、.

4 ) 過程 3で得られたヘテロ接合型ノックァゥトマウスを野生型 C57BL/6系マウスと交配して、次世代のヘテロ接合型ノックァゥトマウスを得ること、

5 ) 過程 4に記載した交配を、少なくとも合計 5回繰り返して、その遺伝的背景を C57BL/6系マウスに近づけたヘテロ接合型ノックァゥトマウスを得ること、及び

6 ) 過程 5で得られたヘテロ接合型ノックアウトマウス同志を交配して、ホモ接合型又はへテロ接合型 GLASTノックァゥトマウスを得ること。

上記過程 5において、交配を少なくとも合計 9回繰り返すことが好ましい。正常眼圧緑内障モデルとして使用することができる本発明の GLASTノックァゥトマウスを作製するために、基本的には、公知のノックァゥトマウス作製方法、例えばジーンターゲティング法やジーントラップ法を用いることができる。基本的なノックァゥトマウスの作製方法は、 GLAST遺伝子の破壊を達成することができ、生存 ·繁殖の能力を消失していないマウスが得られるものである限り、特に制限はない。ノックアウトマウスの作製方法に関しては、例えば、村松正實、山本雅編集、『実験医学別冊新訂遺伝子工学ハンドブック改訂第 3版』（ 1 9 9 9年、羊土社発行）や八木健編集、『実験医学別冊ザ ·プロトコールシリーズジーンターゲティングの最新技術』（2 0 0 0年、羊土社発行）を参照することができ、適宜、この発明の実施に応用することができる。

従って、まず、慣用的な方法により、例えばジーン夕一ゲティング法に従って、上記過程 1〜4を行うことができる。これらの過程は、本発明者らの研究ダル —プによる特開平 10-33087及び Watase, K. et al, Eur. J. Neurosci. 10, 976-988, 1998にも開示されている。

従来、上記過程 4で得られたヘテロ接合型 GLASTノックァゥトマウスの雌雄を交配して得られたホモ接合型又はへテロ接合型 GLASTノックァゥトマウスが既に開示されているが、このタイプの GLASTノックアウトマウスでは、野生型正常マウスと比べて、網膜神経節の細胞数に実質的な変化は認められなかった。ただし、該 GLASTノックァゥ 1、の眼に対して生理食塩水を 150 cm H₂Oの圧力で 6 0分間注入することより、網膜を一過的な虚血状態にした後にのみ、網膜神経節の細胞数の減少が観察されていた（Harada, T.， et al。 Proc Natl Acad Sci USA 95， 4663-4666, 1998) 。

この様なことから、この様な従来の GLASTノックァゥ卜マウスを、正常眼圧緑内障のモデルとして用いることはできない。

本発明の作製方法に従つて、この様な従来の GLASTノックァゥトマウスを更に改良することにより、先に示した正常眼圧緑内障たる本発明の GLASTノックァゥトマウスを作製することができる。

以下に、標準的なノックァゥトマウス作製方法であるジーンタ一ゲティング法を例として、本発明のノックァゥトマウスの作製方法を説明する。

過程 1

( 1 ) 夕一ゲティングベクタ一の作製。

ジーンターゲティング法では、マウス ES細胞内の染色体上の GLAST遺伝子座を破壊するために、ターゲティングベクターを用いて、該遺伝子座に変異を導入する。

GLAST遺伝子の機能を欠損させるためには、 GLAST遺伝子のいずれかの部分に、例えば 1又は複数のェキソン部分に、塩基の欠失を生じさせ、点変異を導入し、又は他の遺伝子を挿入することができる。通常、内在性 GLAST遺伝子が破壊された ES細胞をより容易に選択するために、選択マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。

そのような遺伝子として、ポジティブ選別に用いるマーカー遺伝子、例えばネォマイシン（n e o ) 耐性遺伝子を用いうる。このネオマイシン耐性遺伝子は、ネオマイシン類似体である G 4 1 8を用いることにより目的遺伝子の選別を可能にする。また、目的遺伝子を選別除去するためにネガティブ選別に用いるマーカ一遺伝子を用いることもできる。このような遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ ( t k ) 遺伝子 (選別剤としてガンシク口ビル、 F I A U等を用い、それに対する感受性により非相同組換え体を選別除去する) 、ジフテリアトキシン Aフラグメント (D T - A) 遺伝子 (D T— Aにより発現されたジフテリア毒素により、非相同組換え体を選別除去する ) が用いられる。あるいは、ポジティブ /ネガティブ選別を行うために、これらの組み合わせを用いることもできる。例えば、ネオマイシン耐性遗伝子及びジフテリァトキシン Aフラグメント遗伝子 (Yagi, Nada, Watanabeet al., Analytical Biochemistry 214, 77-86, 1993)、あるいはネオマイシン耐性遗伝子及びチミジンキナーゼ遺伝子 (Mansour, Thomas, Capacchi, Nature 336， 348-352, 1988)を挿入することが好ましい。

該遺伝子配列中、変異を導入する部分、例えば上記マーカー遺伝子を挿入する部分は、該遺伝子の機能が欠損する部位であれば特に限定されないが、通常ェキソン部分である。

GLAST遺伝子のゲノム構造（制限酵素地図及び各ェキソン—イントロン連結点）が既に知られており (Hagiwara, T" et al" Genomics 33， 508-515, 1996) 、その構造の概略を図 1及び表 1に示す。マウス GLAST遺伝子は 1 0個のェキソンを含み、いずれかのェキソンに、該遺伝子の欠損が生じるようにマーカー遺伝子を挿入することが好ましい。

上記の通りに該遺伝子の機能を破壊するために、標的遺伝子との相同組換が可能であり、その結果、標的遺伝子に変異を導入することができるタ一ゲティングベクタ一（相同組換え用 D N A) を、 GLASTをコードする核酸配列（配列番号 1 ) 及び GLAST遺伝子のゲノム配列の情報 (Hagiwara, Τ·, et al" Genomics 33, 508-515, 1996) を基にして、常用の D NA組換え技術、例えば PCR法や部位特異的変異導入法により、作製することができる。

例えば、該遺伝子の全部又はその断片を含む D NA分子を、使用する ES細胞の基となった系統のマウスから慣用的な方法によって単離する。該 D NA分子は、 GLAST遺伝子の全長、若しくは全長とともに該遺伝子の 5 ' 上流域及び/又は 3 ' 下流域をさらに含む D NA分子であってもよい。

次に、得られた D NA分子から、該遺伝子中、変異を導入する部位に相当する部分に、所望の変異を導入した、例えば、上記のマーカー遺伝子を導入した改変 D NA分子を調製する。塩基配列の改変は、 P C Rにより増幅した D NA分子の連結や、部位特異的変異など慣用の組換え D NA技術によればよい。このようなターゲティングベクターを構築する際に、ターゲティングベクター構築用として市販されているプラスミドベクターを利用してもよい。

( 2 ) 夕一ゲティングベクタ一の ES細胞への導入、及び内在性 GLAST遺伝子との相同組換。

こうして得られたタ一ゲティングベクタ一を、マウス胚性幹細胞 (E S細胞) に導入し、 E S細胞中の GLAST遺伝子との間で相同組換えを行わせる。ターゲティングベクターの E S細胞への導入は、例えばエレクトロポレーシヨン法ゃリポフエクシヨン法等の、慣用の D N A導入法により行うことができる。ターゲティングベクターが導入された細胞内では、その染色体上の GLAST遺伝子と夕一ゲティングベクター上の対応部分との間で相同組換えが生じ、その内在性遺伝子内に、夕一ゲティングベクタ一中の改変された塩基配列、例えばマーカ一遺伝子が挿入される。その結果、 E S細胞は内在性 GLAST遺伝子の機能を欠損し、例えば同時にマーカー遺伝子を含むことになる。ターゲティングベクタ一導入後の細胞を、例えばマーカ一遺伝子の選別機能により、あるいは相同的組換えを確認するサザンブロッティング法、 P C R法等の常法によりスクリーニングすることにより、 GLAST遺伝子機能を欠損した E S細胞（以下、組換え E S細胞と称す ) を得ることができる。なお一般的には、この様な相同組換により相同染色体の一方のみの GLAST遺伝子が破壊された E S細胞が得られる。使用するマウス ES細胞としては、一般的には既に樹立されている 1 2 9系の ES細胞が用いられる。その他、 C57BL/6系や BDF1系（C57BL/6系と DBA72系との交配による F1 ) マウスを用いて、公知の方法 (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (Robertson, E.J. ed.), IRL press, Oxford, 1987)に従って樹立した ES細胞を用いることもできる。好ましくは、 1 2 9系の ES細胞が用いられる。

過程 2， 3

F 1世代のへテロ接合型 GLAST遺伝子ノックァゥトマウスの作製

次に、得られた組換え E S細胞を発生させてキメラマウスを得る。そのために、組換え E S細胞を、マイクロインジェクション法や凝集法により、胚盤胞期又は 8細胞期等の正常なマウス胚に注入し、その様にして得られたキメラ胚を、擬妊娠状態にある雌性マウスの子宮角に移植し、この移植マウスを通常通り飼育して、キメラマウス仔を出産させることができる。好ましくは、組換え E S細胞を、 C57BIV6系マウスの胚に注入することが好ましい。

このキメラマウスは、通常、その体細胞及び生殖細胞として、組換え E S細胞由来の細胞と正常細胞とを含んでなり、これを適当な系統の野生型マウス、好ましくは C57BL/6系マウス、例えば C57BL/6 J系マウスと交配することによりへテロ接合型の F 1産仔が得られる。通常、雄性キメラマウスと雌性野生型マゥスとを交配して、 F 1世代のへテロ接合型マウスを産出させる。交配に用いたキメラマウスの生殖細胞が、上記の組換え E S細胞、すなわち相同染色体の一方に存在する内在性 GLAST遺伝子が破壊されている E S細胞に由来していれば、該遺伝子の機能が欠損した所望のへテ口接合型 F 1マウスを得ることができる。

上記行程において、ヘテロ接合型 F 1マウスを髙効率に得るために、例えば、キメラ胚を作製する際に、組換え E S細胞の起源マウスとは異なる体毛色のマウスに由来する正常宿主胚細胞を組み合わせれば、体毛色を観察することにより、生体における組換え E S細胞の占める割合の高いキメラマウスやへテロ接合型 F 1マウスの選択が容易となる。

F 1世代において所期の遺伝子型が達成されているか否かは、その尾から抽出した D N Aに対して、サザンプロット法や P C R法により分析を行うことにより、確認することができる。

過程 4， 5， 6

( 1 ) 本発明の GLAST遺伝子ノックアウトマウスの獲得

本発明では、 GLAST遺伝子ノックアウトマウスの遺伝的背景を、できるだけ C57BL/6系マウスに近づけることが好ましい。そのために、上記の通りに作製した F 1ヘテロ接合型マウスを更に C57BL/6系マウス、例えば C57BL/6 J系マウスと交配し、生まれてきたへテロ接合型マウスを、再度 C57BL/6系野生型マウスと交配するという作業を繰り返す。この作業を、通常合計少なくとも 5回、好ましくは少なくとも 9回、より好ましくは少なくとも 1 5回行う。最後に、得られたへテロ接合型マウスの雌雄を交配して、 GLAST遺伝子の機能を欠損した、本発明のホモ接合型又はへテロ接合型ノックァゥトマウスを得ることができる。グルタミン酸トランスポ一ター遺伝子の機能欠損の効果の点からホモ接合型マウスが好ましい。

各世代において所期の遗伝子型が達成されているか否かは、上記と同様にサザンプロッテイング法、 P C R法、塩基配列決定等の常法によればよい。

この様に作製することができる本発明のノックァゥトマウスを、雄性 ·雌性の組合わせとして一旦得ておけば、それ以降は、必要に応じて適宜繁殖させることにより、容易に同じ遺伝子型のノックァゥトマウスを必要数得ることができる。 ( 2 ) 本発明の GLASTノックァゥトマウスの網膜及び眼圧の解析

最後に、上記の通りに作製したホモ接合型又はへテロ接合型 GLASTノックァゥトマウスにおいて、その眼圧が正常範囲にあること.，及び網膜神経節の神経細胞が減少していることを確認する。この様な眼の性状が確認できない場合には、過程 5に記載の交配を更に繰り返すことによって、上記性状を満たす本発明のノックアウトマウスを得ることができる。

本発明の GLASTノックアウトマウスの眼圧は、通常約 2 1 mmHg以下、例えば約 1 0〜2 l mmHgである。用いた ES細胞の起源であるマウスの系統、又はキメラ胚の作製に用いた正常胚の起源であるマウスの系統によって、この眼圧範囲は多少変動しうるが、それを考慮しもて 3 O mmHg以下でなければならない本発明の GLASTノックァゥトマウスでは、その網膜神経節の神経細胞数が、野生型マウスに比べて、少なくとも 2 0 %、より好ましくは少なくとも 5 0 %ほど減少している。

以下に、網膜神経節細胞数の計測方法と眼圧の測定方法の例を説明するが、これらの方法に限らず、公知の慣用的な方法を用いてよい。例えば、 Hai'ada, T., et al. Proc Natl Acad Sci USA 95:4663-4666， 1998や Harada, C. et al" Neurosci. Lett. 292， 134-136, 2000を参照されたい。

これらの測定では、上記の本発明のホモ接合型又はへテロ接合型ノックァゥトマウスに対する対照マウスとして、それらのマウスを得る際に同時に出生した野生型正常マウス、あるいは単に正常（野生型） C57BL/6系マウスを用いうる。必要に応じて、.上記の対照マウスの他に、上記の F 1ヘテロ接合型ノックァゥトマウス若しくはその雌雄を交配することにより得られるホモ接合型又はへテ口接合型 GLASTノックァゥ 1、マウス、又は戻し交配の途中で得られるヘテロ接合型ノックアウトマウスなどにおいても、上記の測定を行う。網膜神経節細胞数の計測：

マウスの網膜神経節細胞数を、通常の組織化学的な手法により、又は逆行性ラベリング法により測定することができる。

(a) 病理切片を用いた方法

1 ) 試験対象マウスを、麻酔により鎮静させ、 4 %パラホルムアルデヒド /PBS溶液にて灌流固定する。

2 ) 眼球を取り出して 4 °Cの同液中で更に 2時間固定する。

3 ) 眼球をパラフィンに包埋した後、切片、例えば厚さ 7 mの切片を作製する。

4 ) へマトキシリン/ェォシン染色を行い、顕微鏡下に、視神経を含む断面で神経節細胞数をカウントする。

(b) 逆行性ラベリングを用いた方法

1 ) 麻酔により鎮静したマウスの頭部を固定する。 2 ) 顕微鏡下で、エタノール噴霧した後、頭部をハサミで横切開し、頭蓋骨を露出させる。

3 ) 縫合線と血管を確認後、グラインダーで手術用の穴をあけ、そこからマイク口シリンジで上丘実質に、例えば蛍光色素 Fluoro-Gold (—般名 aminostilbamidine; Molecular Probes社）やカルポシァニン蛍光色素、例えば Dil ( 一般名 l,10-dioctadecyl-3,3,30,30-tetramethylmdocarbocyanine percnlorate; Molecular Probes社) ¾7主入する。

4 ) 皮膚をクリップで綴じた後、覚醒薬を腹腔内に注射して、回復を確認する。

5 ) 手術後 7日間通常通り飼育した後、処置マウスをエーテル麻酔にて死亡させ、眼球を取り出し、前眼部を除去する。

6 ) 網膜を含む後眼部を 4 %パラホルムアルデヒド溶液に入れ、 4でで 2 0 分間固定する。

7 ) 網膜を取り出して伸展標本を作成する。

8 ) 蛍光顕微鏡にて写真撮影後、蛍光ラベルされた網膜神経節細胞数をカウントする。

マウスの麻酔は、通常の動物実験に使用される麻酔剤であれば、マウスを死亡させない濃度範囲で、いずれのものを用いてもよい。例えばケ夕ミン (10 mg/ml) /メデトミジン (1 mg/ml)の 1 ： 1混合液 (0.15-0.2 ml/マウス) を用いてよく、この場合ァチパメゾール (5 mg/ml) (0.15-0.2 ml/マウス) により覚醒させることができる。

眼圧の測定：

1 ) 上記と同様に、通常の麻酔によりマウスを鎮静させる。

2 ) 鎮静したマウスの眼圧を、電子眼圧計（例えばトノペン XL、米国メドト口ニック 'ソ一ラン社製）を用いて測定する。

視覚機能又は視神経細胞の機能を評価するためには、網膜電図 (Electricretinograms, ERG)を測定してもよい。これは、光刺激により網膜から得られる電気的反応を測定するものであり、生体における視神経細胞の神経伝達の活動度を表す、よい指標である。詳しくは、「現代の眼科学改訂第 8版」（所敬、金井淳編集、金原出版発行）や「視能矯正学改訂第 2版」（丸尾敏夫編集、金原出版発行）、又は非特許文献 l (Hamda, T" et al. Proc Natl Acad Sci USA 95:4663-4666, 1998)を参照されたい。

以下に、その測定方法を簡単に説明する。

1 ) マウスを常法により麻酔した後、頭部ホルダーを用いてマウスの位置を固定する。

2 ) 0.5 %フヱ二レフリン及び 0.5 %トロピカミドを投与して、瞳孔を拡張させる。

3 ) 炭素繊維電極を角膜表面に接触させ、基準電極を前頭皮下に接触させる。 4 ) 3 0分間喑順応させる。

5 ) 光刺激装置 (SLS-3100, Nihon Koden, Japan)により、 0.6又は 1.2 Jの強度で、 10 秒間の閃光を与えて、網膜を刺激する。

6 ) 得られた電位を、増幅器 (MEB-5304， Nihon Koden)により、周波数の帯域を 50-1000 Hz及び 1-1000 Hz (各々振動電位 OP及び a波又は b波を測定する場合）に設定して、増幅する。

7 ) 2回の応答電位を、平均化して記録する。

8 ) データとして、 a波、 b波、及び各種振動電位を解析する。

3 . 正常眼圧緑内障の予防及び Z又は治療に有用な化合物のスクリ一ニング方法本発明のノックァゥトマウスは、正常眼圧緑内障を予防及び/又は治療するために有効な化合物、特には網膜神経節の神経細胞を含む、視神経細胞の死もしくは変性、又はその機能の低下を抑制するために有効な化合物、あるいは視神経細胞又はその機能を回復させるために有効な化合物をスクリーニングするために用いることができる。

従って、本発明は、正常眼圧緑内障の予防及びノ又は治療に有用な化合物のスクリーニング方法であって、

1 ) 本発明のホモ接合型又はへテロ接合型 GLASTノックァゥトマウスに試験化合物を投与すること、

2 ) 野生型正常マウスに試験化合物を投与すること、

3 ) 上記の各マウスにおいて、投与前、及び投与してから一定期間後、生存する視神経細胞の数量又機能を評価すること、及び

4 ) GLASTノックアウトマウスと野生型マウスの検査結果を比較して、試験化合物の有効性を評価すること

を含んで成るスクリーニング方法を提供する。

試験化合物が、正常眼圧緑内障の予防及び/又は治療にとって有効であるか否かは、緑内障に特徴的な徴候を改善できるか否かを検査することのよつて判定することができる。例えば、網膜神経節の神経細胞数を計数することにより、試験化合物の投与により、対照マウスに比べて、その数が少なくとも 1 0 %、好ましくは少なくとも 2 0 %、より好ましくは少なくとも 3 0 %回復していれば、その試験化合物は、医薬上有効であると判定してよい。また、網膜電位を測定することにより、試験化合物の投与により、対照値に比べて、例えば b波や振動電位の大きさが、少なくとも 1 0 %、好ましくは少なくとも 2 0 %、より好ましくは少なくとも 3 0 %回復していれば、その試験化合物は、医薬上有効であると判定してよい。

本発明のへテロ接合型ノックアウトマウスは、出生後、週齢と共に網膜神経節の細胞数が徐々に低下していくことが判明している（図 4 ) 。従って、上記スクリーニング方法の 1つの態様として、 1 ) 出生後直ぐに、 1群のへテロ接合型ノックアウトマウスには定期的に試験化合物を投与し、もう 1群のへテロ接合型ノックアウトマウスには試験化合物を投与せず、 2 ) 各週齢で、網膜神経節の細胞数を測定し、そして 3 ) 両者の比較から、網膜神経節の細胞数の経時的な低下を抑制する化合物を選別することもできる。

試験化合物としては、天然及び合成化合物の他、動植物の抽出物、発酵生成物、ペプチド、蛋白質、又は核酸分子など、任意の物質を用いることができる。所望の蛋白質を発現するための遺伝子べクタ一であってもよい。試験化合物の投与経路も、試験化合物の性質が許す限り、種々の方法を試みてよく、例えば点眼や経口投与によることもできる。投与期間や投与様式も、試験化合物の効果を最大限にする様に選択される。この様な試験化合物の種類や投与方法は、製薬分野又は医学分野における通常の方法に従ってもよい。

更に、本発明の GLASTノックアウトマウスを、他の種類のノックアウトマウス又は他の種類の疾患モデルマウスと交配して、新たな疾患モデルマウスを作製することもできる。この様な、本発明の GLASTノックアウトマウスの使用もまた本発明に含まれる。実施例

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。

実施例 1 ： GLAST(GluT-l)遺伝子機能欠損マウスの作成

( 1 ) マウス GLAST(GluT-l)遺伝子 DNAの相同組換え用 DNAの作成 1 2 9 S Vマウスの肝から抽出したゲノム D N A (野生型マウス GLAST(GluT- 1)遺伝子)を、制限酵素 S a u 3 A Iで部分消化して得たゲノムライブラリーラムダ F I X I Iについて、マウス GLAST(GluT-l)遗伝子の c D N Aの部分配列をプローブとして用いてハイブリダイゼ一ションを行い、 1 x 1 06個のコロニ一について検索した結果、 2 6個の陽性クローンを得た。これを制限酵素 E c o RV及び Xh o Iで不完全消化させて、第 6ェキソンから第 8ェキソンを含む、全長 9 k b pのゲノム DNAをサブクローニングした (図 2、上段) 。次いで、 GLAST(GluT- 1)遗伝子を破壞するために、第 6ェキソンの B amH I以降 1. 5 k b pを欠損させ、そこににネオマイシン耐性遺伝子を、さらに第 8ェキソンの下流にジフテリアトキシン Aフラグメント遺伝子を挿入した（図 2、中段) 。ゲノム DNAとの相同部分は、ネオマイシン耐性遺伝子の上流が 2. 5 k b、ネォマイシン耐性遗伝子とジフテリアトキシン Aフラグメント遗伝子との間が 5 k bとなるように構築した。得られた構築体を、 p B 1 u e s c r i p t SKに揷入し、 E S細胞への導入の際に制限酵素 N o t Iで切断して線状化することにより夕ーゲティングベクター (相同組換え用 DN A： p G 1 uT I Ne oDT) を得た（図 2、中断）。

(2) 相同組換え用 DNAの導入による E S細胞の GLAST(GluT-l)遺伝子の欠損

相同組換え用 DNA7 5 gをマウス E S細胞（E 1 4株） 3 x 1 0?個を含むエレクトロポレーション用緩衝液（137mM NaCl, 2.7mM KC1, lOmM Na₂HP0₄, 1.8mM KH2PO4) に懸濁させ、 Field Strength 210V/cm, Capacitance 500 Fの条件で、遺伝子導入を行った。導入後 24時間から 25 O ig/mlの G418 (Ge n e t i s i n, G I B CO BRL) で選択培養を行った。

G 18耐性コロニーを、遺伝子導入後 192時間後から、マイクロピぺットを用いて 60 1の T r i s— EDTA溶液（ 10 mM T r i s— H C 1 pH 8. 0と ImM EDTA pH8. 0とからなる溶液）を含む 96穴のマイクロプレート（FALCON 3077) に移し換え、数分間処理した後、ピぺッティングすることによって単一細胞にし、これらを 24穴のマイクロプレート (F ALCON 3047) に移し換え、培養を継続した。採取したコロニ一は、その長径がマイクロチップの内径の 1 Z 2以上に達したもので、この時の細胞数は、 1 10⁴〜10⁵個であった。エレクトロポレーシヨン後の生存細胞数は-. 6 . 0 x 10⁷個であった。 G418耐性コロニー数は、 2. 4x 102個で、生存細胞数の 1/2. 5 x 105であった。

24穴のマイクロプレート上の細胞が 3〜4日の培養でコンフルェントに達した段階で、細胞を 0. 25%トリプシンで、 37 °Cで 5分間処理後、順次、 35 mm (FALCON 3001) 又は 60 mm (FALCON 3002) の組織培養用シャーレ内で培養し、細胞の増殖を行った。なお、 ES細胞の培養は、すベてフィーダ一細胞上で行った。相同組換え体の確認をサザンブロットによって以下の通りに行った。

サザンブロット解析については、 G418耐性細胞からゲノム D N Aを抽出し、制限酵素 P V u I Iで消化後、第 5イントロンの Ap a I _E c o RV断片、 0. 5 k bをプローブとして用いて行った。破壊された対立遺伝子を含む相同組換え体（図 2、下段）及び非相同組換え体の確認は、それぞれ、 4. 2 kb及び 7 kbのバンドの検出によって行った。相同組換え体コロニー数は、 G418耐性コロニー 242個中 1個（2B7) であった。

(3) ES細胞及びその培養方法 ES細胞として、 1 29/S v J系マウス胚盤胞由来の E 14株を用いた。 E S細胞の培養には、ダルベッコゥ修正イーグル培養液（DMEM, 1 1 960 - 0 1 0 G I BCO) に 1 5%牛胎児血清（FCS) 、 0. ImMの 2—メルカブトエタノール、核酸混合液、非必須アミノ酸溶液及び 10³ un i t/m lの L I F (AMRAD) を添加した S CM培養液（Robertson, Teratocarcinomas and embryonicstem cells a practical approach 1987) を用レた。

. また、 ES細胞のフィーダ一細胞として用いるマウス胎児繊維芽細胞の培養には、 DMEMに 10 %F S Cを添加したものを用いた。マウス胎児繊維芽細胞の調製及び培養は、以下の通りに行った。胎齢 13〜14日の I CR系マウスの胎児を無菌的に採取し、カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS-) で洗浄後、ピンセットを用いて心臓、肝臓及び腸管を除き、眼科用のハサミを用いて細切した。次いで、得られた細切片を 0. 25%トリプシン及び 0. 04 %EDTAを含む P B S- (以下 TE溶液という) で、室温で 2 0分間処理して細胞浮遊液を得た。

細胞浮遊液を 1 500 r pm、 5分間の遠心後、上清を除去し、 10 % F C S 加 DMEMに懸濁させて 2分間静置した。そして、下部に沈んだ組織片を除いた細胞浮遊液を 100 x 20mmの組織培養用シャーレ (FALCON 3003 ) に移し、 3 7°C, 5%C〇₂， 95 %空気の条件で培養に供した。翌日、細胞浮遊液を P B S -で 1回洗浄し、培養を継続した。継代は、 3〜 4日間隔で行い、継代が三代目までの細胞をフィーダ一細胞として使用するためにマイトマイシン処理を施した。

コンフルェント状態にまで増殖したマウス胎児繊維芽細胞を 2 m g / 1のマィトマイシン C 75 a \で 3〜4時間処理し、 PBS-で 3回洗浄後、 TE溶液で室温で 3分間処理して細胞を剥離した。次いで、遠心後、細胞数を 5 x l 0⁵ / 1に調整し、 60 10 mmのゼラチンコートディッシュ（FALCON 3 002) に 3m lずつ分注した。以上のように作成したフィーダ一細胞は、 1週間以内に使用した。 ES細胞の継代は、室温で 5分間 TE溶液で処理後、ピぺッティングによって ES細胞を単一細胞に分散させ、 4 x 1 0⁵個の細胞をフィーダー細胞層上に播種することによって行つた。培養液は、 24時間間隔で交換し、継代間隔は、 56〜64時間とした。また ■、凍結保存する際には、 1 X 10⁶個の細胞を S CMに懸濁して凍結用チューブ (2m l , FALCON 4818) に移し、 0. 5 m 1の凍結用培地（ 20 % DMSO添加 DMEM) を滴下した後、 — 80 ^eCで一晩放置し、液体窒素中で保存した。

(4) GLAST(GluT-l)遺伝子欠損 E S細胞によるキメラマウスの作成

( a)GLAST(GluT-l)遺伝子欠損 E S細胞の胚盤胞への注入

ES細胞を、 C57BL/6 J系マウスの胚盤胞に注入した後、得られた宿主胚を偽妊娠マウスの子宮角に移植して産仔を得た。宿主胚の採取は、自然交配 4日目に、 He p e s— bu f f e r e d— Wh i t t e n's培地で、子宮を灌流することによって行った。注入に用いた ES細胞は、継代 2日目又は 3日目に TE 溶液で処理を行った後、ゼラチンコートディッシュに 30分間静置することによつて、フィーダ一細胞を除去し、顕微操作に供するまで、氷上に静置した。

ES細胞の注入用ピぺットは、外径 lmmの微小ガラス管（NAR I SH I G E) を微小電極作製器（NAR I SH I GE, PN— 3) を用いて細かく引き延ばし、研磨器（NAR I SH I GE) で、内径が約 20 / mとなるように先端を研磨し、さらにマイクロフォージ (D e Fo n bu r u n) で先端を鋭利に加ェした。胚保定用ピペットは、上述の方法で引き延ばしたガラス管をマイクロフォージを用いて、外径 50〜 100 mの部分で切断した後、さらに口径を 10 ~20 zmに加工して用いた。

注入用ピぺットと保定用ピぺットは、先端から約 5mmの部分を約 30度曲げて、マイクロマニピュレーター（LE I TZ) に接続した。顕微操作に用いたチヤンバーは、穴あきスライドグラスにカバーグラスを密蠟で接着させたものを用い、その上に約 20 1の 5 %FC S添加 He p e s -b u f f e r e d-Wh i t t e n' s培地のドロップを 2個置き、その上面をミネラルオイル（M 84 10, S i gma) で覆った。一方のドロップには、約 100個の ES細胞を入れ、他方には、拡張胚盤胞を 10~15個入れ、胚 1個あたり 10〜15個の E S細胞を注入した。顕微操作はすべて、倒立顕微鏡下で行った。操作胚は、 1〜2時間の培養後、偽妊娠 2日目の I CR系受容雌の子宮角に移植した。分娩予定日に至っても産仔を娩出しなかった受容雌については、帝王切開を施し、里親に哺育させた。自然交配 4日目に、子宮を灌流することによって採取した C57BL/6 J系マウスの胚盤胞 160個に E S細胞 2 B 7を注入した結果、 123個が生存し、成功率は 7 7%であった。 123個を偽妊娠 2日目の I CR系受容雌の子宮角に移植した結果、 103個に着床が認められ、 95匹の産仔が得られた。離乳に至った 83匹の産仔のうち、毛色でキメラマウスと判定できたのは 30匹で、このうち 26匹が、形態的に雄を示していた。これらのキメラマウスにおける ES細胞の寄与率は、 10〜 95 %の幅であり、寄与率が 60 %未満が 10例、 60 %以上 90 % 未満が 14例、 90 %以上が 2例であった。

(b)得られたキメラマウスを、 C57BL/6 J系マウスと交配し、娩出される産仔 (F 1ヘテロ型マウス）が GLAST(GluT-l)遺伝子欠損 E S細胞由来であるか否かを検定した。キメラマウスの生殖細胞が ES細胞に由来していれば、娩出される産仔の毛色は野生色を呈し、 C57BL/6 J系マウスの胚盤胞に由来していれば黒色を呈する。 ES細胞の寄与率の高い（70%以上） 9例（No. 1， 5, 1 3, 20, 33, 41, 54, 62， 81) のキメラマウスのうち、現在までに 8例（No. 1 , 5， 20, 33, 41 , 54, 62, 81) について、 ES細胞の生殖系列への伝達が確認された。

No. 5と C57BL/6 J系雌マウスとの交配では、 3回の分娩で合計 23匹の産仔が得られ、このうち、 23匹が野生色の毛色を示していた。また、 No. 3 3と C57BL/6 J系雌マウスとの交配で得られた 1 5匹の産仔のうち、 12匹が野生色の毛色を示した。これらの野生色マウスのうち 23例についてサザンブロットによる解析を行った結果、 1 1例で GLAST(GluT-l)遺伝子の欠損を確認した。

(5) C57BL/6 J系マウスとの戻し交配

GLAST遺伝子の欠損が確認された F 1ヘテロ型雄マウスを、 C57BL/6 J系野生型雌マウスと交配させ、産仔を得た。その遺伝型をサザンブロットにより解析し、 GLAST遺伝子の欠損が確認された次世代のヘテロ型雄マウスを選別した。再び、このへテロ型雄マウスを C57BL/6 J系雌マウスと交配をさせ、更に次の世代のへテロ型雄マウスを得た。この様にして、次々と同様の交配を合計 9回繰り返し、世代を更新した GLAST遺伝子欠損へテロ型マウスの雌雄を得た。最終的に、このへテロ型マウスの雌雄を交配することによって、 GLAST遺伝子欠損についてホモ型の GLASTノックァゥトマウス (GLAST-/-)、 GLAST遺伝子欠損についてヘテロ型の GLASTノックァゥトマウス (GLAST+/-)、及び野生型のマウス (GLAST+/+)を得た。これらのマウスを以下の測定に用いた。実施例 2 ：眼圧の測定

実施例 1で得られたホモ接合型 GLASTノックァゥトマウス及び野生型正常マウスにおいて、生後 1年の時点で、眼圧を測定した。各群 4匹ずつを麻酔により鎮静させた後に、その眼圧を電子眼圧計により測定した。その結果、以下に示す野生型正常マウス： 19±4 mmHg

ホモ型ノックアウトマウス： 15±3 mmHg (平均値土標準偏差）この結果から、ホモ型 GLASTノックアウトマウスの眼圧は、正常範囲にあることが確認された。実施例 3 ：網膜神経節細胞数の計測

種々の週齢で、実施例 1で得られたホモ接合型 GLASTノックァゥトマウス、ヘテロ接合型 GLASTノックアウトマウス、及び野生型正常マウスにおいて、網膜切片のへマトキシリンエオシン染色、及び Fluoro-Goldまたは Dilによる網膜神経細胞の逆行性ラベリングにより、各マウスの網膜神経節の細胞数を測定した。

切片の染色による観察：

1 ) 試験マウスを、ケ夕ミン (10 mg/ml)Zメデトミジン (1 mg/ml)の 1 ： 1混合液（0.15-0.2 ml/マウス）により鎮静させ、 4 %パラホルムアルデヒド溶液にて灌流固定し、 2 ) 眼球を取り出して 4 °Cの同液中で更に 2時間固定し、

3 ) 眼球をパラフィンに包埋した後、切片、例えば厚さ 7 mの切片を作製し、そして

4 ) へマトキシリン Zェォシン染色を行い、顕微鏡下に、網膜神経節領域の神経細胞を観察した。この顕微鏡像を図 3に示す。

5 ) 各マウス毎に、網膜神経節部分を含む切片中の神経細胞数を計測した。その結果を図 4に示す。

逆行性ラベリングによる観察：

1 ) ケ夕ミン (10 mg/ml)/メデトミジン (1 mg/ml)の 1 ： 1混合液（0.15-0.2 ml/マウス) により鎮静させた後、マウスの頭部を固定し、

2 ) 顕微鏡下で、エタノール噴霧した後、頭部をハサミで横切開し、頭蓋骨を露出させ、

3 ) 縫合線と血管を確認後、グラインダーで手術用の穴をあけ、そこからマイクロシリンジで上丘実質に Fluoro-Goldまたは Dilを注入し、

4 ) 皮膚をクリップで綴じた後、ァチパメゾール (5 mg/nil) (0.15-0.2 ml/マウス）を腹腔内に注射して、回復を確認した。

5 ) 手術後 7日間通常通り飼育した後、処置マウスをエーテル麻酔にて死亡させ、眼球を取り出し、前眼部を除去し、

6 ) 網膜を含む後眼部を 4 %パラホルムアルデヒド溶液に入れ、 4 °Cで 2 0分間固定し、

7 ) 網膜を取り出して進展標本を作成し、そして

8 ) 蛍光顕微鏡にて、蛍光ラベルされた網膜神経節細胞の像を、写真撮影した。この像を図 5に示す。

これらの結果（図 3〜5 ) から、ホモ型 GLASTノックアウトマウスでは、その網膜神経節の神経細胞数が、野生型マウス及びへテロ型ノックァゥトマウスに比べて、有意に低下していることが判明した。へマトキシリンエオシン染色の結果（図 3 ) 、矢印で示す網膜神経節細胞数が減少している。また中央に位置する内顆粒層における細胞数（アマクリン細胞、双極細胞など）の減少と、それに伴う内顆粒層のひ薄化が観察された。また、ホモ型 GLASTノックアウトマウスでは、生まれた時から細胞数が低下しているが、ヘテロ型ノックアウトマウスでも、経時的に細胞数が減少し、 5週齢以降では、野生型マウスに比べて有意に低下していることが判明した（図 4 ) 。産業上の利用可能性

本発明の、正常眼圧緑内障のモデルマウスとしての、内在性 GLAST遺伝子が欠損したホモ型又はへテロ型 GLASTノックァゥトマウスは、該疾患の治療に有効な治療薬の開発のために、その治療方法の確立のために、そしてまた該疾患の病態生理、例えば発症原因、発症メカニズム又は進行メカニズムの解明のために、極めて有益であると期待される。

Claims

請求の範囲

1 . 内在性 GLAST遺伝子の機能を欠損させた、正常眼圧緑内障のモデルとしての GLASTノックァゥトマウス。

2 . 内在性 GLAST遺伝子の機能を欠損させた GLASTノックアウトマウスであつて、

1 ) その眼圧が正常範囲にあり、かつ

2 ) その網膜神経節の細胞数が、野生型マウスに比べて減少している、

GLASTノックァゥ 1、マウス。

3 . その眼圧が 2 I mmH g以下である、請求項 2に記載の GLASTノックァゥ卜マウス。

4 . その網膜神経節の細胞数が、野生型マウスに比べて少なくとも 2 0 %減少している、請求項 2に記載の GLASTノックァゥトマウス。

5 . その遗伝的背景が、 C57BL/6系マウスの遗伝的背景と同一又は実質的に同一である、請求項 1又は 2に記載の GLASTノックアウトマウス。

6 . 内在性 GLAST遺伝子領域内にネオマイシン耐性遺伝子が挿入されている、請求項 1又は 2に記載の GLASTノックアウトマウス。

7 . 内在性 GLAST遺伝子の第 6ェキソンにネオマイシン耐性遺伝子が挿入されている、請求項 6に記載の GLASTノックァゥトマウス。

8 . 正常眼圧緑内障のモデルとしての、請求項 2に記載の GLASTノックァゥトマウスの使用。

9 . 内在性 GLAST遺伝子の機能を欠損させた GLASTノックァゥトマウスの作製方法であって、下記 1〜 6の過程を含んで成る、作製方法：

3 ) 過程 2で得られたキメラマウスを正常 C57BL/6系マウスと交配して、へテロ接合型ノックァゥ卜マウスを得ること、 4 ) 過程 3で得られたヘテロ接合型ノックァゥトマウスを正常 C57BL/6系マウスと交配して、ヘテロ接合型ノックァゥトマウスを得ること、

6 ) 過程 5で得られたヘテロ接合型ノックアウトマウス同志を交配して、ホモ接合型又はへテロ接合型の GLASTノックァゥトマウスを得ること。

1 0 . 過程 5において、過程 4に記載した交配を少なくとも合計 9回繰り返す、請求項 9に記載の作製方法。

1 1 . 請求項 9に記載の作製方法を用いて作製した、ホモ接合型又はへテロ接合型の GLASTノックァゥトマウス。

1 2 . 請求項 1、 2及び 1 1のいずれかに記載の GLASTノックアウトマウスを用いた、正常眼圧緑内障の予防及び/又は治療に有用な化合物のスクリ一ニング方法。

1 3 . 正常眼圧緑内障の予防及び/又は治療に有用な化合物のスクリーニング方法であって、

1 ) 請求項 1、 2及び 1 1のいずれかに記載の GLASTノックアウトマウスに試験化合物を投与すること、

2 ) 野生型マウスに試験化合物を投与すること、

4 ) GLASTノックァゥトマウスと野生型マウスの検査結果を比較して、試験化合物の有効性を評価すること

を含んで成る、スクリーニング方法。

1 4 . 生存する視神経細胞数又は視神経細胞機能を評価するために、網膜神経節の神経細胞数を計数し、及び/又は網膜電位を測定する、請求項 1 3に記載のスクリーニング方法。