MXPA02002439A - Composicion para fertilizacion in vitro. - Google Patents

Abstract

Una composicion solida que contiene una sustancia activadora de la meiosis se puede preparar al adicionar proteina o un fosfoglicerido.

Description

COMPOSICIÓN PARA FERTILIZACIÓN IN VITRO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un producto sólido el cual se puede utilizar en conexión con la fertilización in vi tro .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se han encontrado varias sustancias activadoras de la meiosis (posteriormente designadas MAS) . Cuando las MAS se mantienen en un medio que contiene oocitos, los oocitos se vuelven más propensos a llegar hacer fertilizados. Sin embargo, un problema principal con el uso de las MAS es que, usualmente, estas tienen una solubilidad muy baja.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo de esta invención es desarrollar una composición que contiene MAS o un derivado de las mismas, el cual se puede disolver en un medio acuoso. Otro objetivo es desarrollar una composición que contiene MAS o un derivado de las mismas, el cual se puede REF 136420 disolver en un medio acuoso sin ninguna influencia física tal como calentamiento, agitación o tratamiento ultrasónico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La solubilidad de una MAS preferida, es decir, FF-MAS, en el agua es muy baja, es decir, aproximadamente 20 picogramos/ml (que corresponde a 2 x 10~5 µg/ml), y en etanol la solubilidad es sustancialmente mas alta, es decir, aproximadamente 4 mg/ml. De acuerdo con las investigaciones preliminares, la solubilidad más alta de la FF-MAS en una mezcla de etanol y agua (1:2.5) es aproximadamente 0.4 mg/ml. Otras diversas MAS tienen una solubilidad baja similar en el agua. Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que una composición sólida que contiene MAS y un aditivo tienen una buena solubilidad en el agua. Los aditivos son componentes los cuales, cuando se adicionan a las MAS, proporcionan una composición la cual puede ser utilizada para preparar una solución acuosa que contiene MAS. Ejemplos de aditivos son proteínas solubles en agua tales como albúmina de suero, por ejemplo, albúmina de suero humano (posteriormente designada HSA) , opcionalmente en forma recombinante, enzimas y fosfoglicéridos tales como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilnositol . Preferiblemente, las composiciones de esta invención tienen un contenido de agua abajo del 10%, preferiblemente abajo de 5%, más preferiblemente abajo de 1% (peso/peso) . Preferiblemente, las composiciones de esta invención tienen un contenido de solvente orgánico abajo de 10%, preferiblemente abajo de 5%, más preferiblemente abajo de 1% (peso/peso) . Preferiblemente, las composiciones de esta invención tienen un contenido de MAS abajo de 1%, preferiblemente abajo de 0.1%, más preferiblemente abajo de 0.05% (peso/peso). Preferentemente, las composiciones de esta invención tienen un contenido de un aditivo más alto que 99%, se prefiere mas alto que 99.9%. Las composiciones preferidas de esta invención son aquellas que pueden ser tratadas con un medio acuoso que no contiene o que solo contiene concentraciones bajas de solvente orgánico que da por resultado una solución que contiene MAS. Preferiblemente, estos medios acuosos contienen menos de 1%, preferiblemente menos de 0.5%, más preferiblemente menos de 0.1% de solvente orgánico (peso/peso) .

Anteriormente, los diversos intentos para preparar composiciones que cumplieran con este requerimiento han fallado. En la presente, el término MAS significa compuestos los cuales median la meiosis de oocitos. Más específicamente, las MASs son compuestos los cuales, en la prueba descrita en el Ejemplo 1 posterior, tienen un porcentaje de descomposición de vesículas germinales (posteriormente designada GVB) el cual es significantemente más alto que el control. Las MAS preferidas son aquellas que tienen un porcentaje de GVB de al menos 50%, preferiblemente al menos 80%. Los ejemplos de MASs preferidas son 4, 4-dimetil-5a-colesta-8, 14, 24-trien-3ß-ol (posteriormente designado FF-MAS); hemisuccinato de 4,4-dimetil-5a-colest-8, 14, 24-trien-3ß-ol; 5a-colest-8, 14-dien-3ß-ol, hemisuccinato de 5a-colest-8, 14-dien-3-ß-ol; (20S)-colest-5-en-3ß, 20-diol; N- (metionina) amida del ácido 3ß-hidroxi-4, 4-dimetil-5a-cola-8, 14-dien-24-óico; y colest-5-en-16ß-ol. Los ejemplos adicionales de MASs se mencionan en WO 96/00235, 96/27658, 97/00884, 98/28323, 98/54965 y 98/55498, más específicamente en la reivindicación de las mismas . Una manera para preparar las composiciones de esta invención es mezclar una solución de MAS en un solvente orgánico tal como etanol con una solución acuosa del aditivo y, después, esperar hasta que el solvente se evapore. La evaporación se puede acelerar al utilizar un flujo continuo de aire sobre el producto, vacio, o cualquier otro método factible para remover el solvente. El producto comercializado podria ser un sistema de suministro que tiene una o más depresiones o huecos. Posteriormente, estas depresiones y huecos son designados mutuamente huecos. Al menos uno de estos huecos contiene una composición de acuerdo con esta invención. Una manera conveniente para colocar la MAS sólida en el mismo es colocar primero una solución que contiene MAS y el aditivo en el hueco y posteriormente evaporar la solución. De esta manera, el residuo de la evaporación, es decir, la composición de acuerdo con esta invención, se coloca directamente en el hueco en el dispositivo (sistema de suministro) . Puesto que la composición de esta invención se debe utilizar para el tratamiento de oocitos, es importante que la composición de esta invención no contenga constituyentes los cuales influyan negativamente en los oocitos . Una manera de utilizar las composiciones de esta invención es disolver la composición en un medio acuoso tal como agua y luego, si se desea, adicionar otros constituyentes los cuales pueden tener una influencia favorable sobre la maduración de los oocitos. Otra manera de utilizar la composición es disolverla en medios normalmente utilizados para la maduración in vitro. La presente invención es ilustrada adicionalmente por los siguientes ejemplos, los cuales, sin embargo, no se deben construir para limitar el alcance de la protección. Las características descritas en la descripción anterior y en los siguientes ejemplos pueden, en cualquier combinación de las mismas, ser material para llevar a cabo la invención en diversas formas de la misma.

Ejemplo 1 Método utilizado para determinar si una composición es una MAS o no.

Los oocitos se obtuvieron de ratones hembra, maduros (C57BL/6J x DBA/2J Fl, Bomholtgaard, Dinamarca) que pesaban 13-16 gramos, que se mantuvieron bajo temperatura controlada (20-22°C), luz (luces de 06.00-18.00) y humedad relativa (50-70%) . Los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 0.2 ml de gonadotropinas (Gonal-F, Serono) que contenían 20 IU FSH y 48 horas después, los animales se sacrificaron mediante la dislocación cervical. Los ovarios se disecaron y los oocitos se aislaron en un medio Hx (ver posteriormente) , bajo un estereomicroscopio mediante la ruptura manual de los folículos utilizando un par de agujas de calibre 27. Los oocitos esféricos que exhibían una vesícula germinal intacta (posteriormente designada GV) se dividieron en oocitos encerrados en cúmulos (posteriormente designados CEO) y en oocitos desnudos (posteriormente designados NO) y se colocaron en un medio esencial a-minimo (a-MEM sin ribonucleósidos, Gibco BRL, Cat. No 22561) complementado con 3 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma Cat. No. A-7030) , 5 mg/ml de albúmina de suero humano (HSA, State Serum Institute, Dinamarca), piruvato 0.23mM (Sigma, Cat. No S-8636), glutamina 2 mM (Flow Cat. No. 16-801), 100 IU/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina (Flow, Cat No. 16-700) . Este medio se complementó con hipoxantina 3mM (Sigma Cat. No. H-9377) y se designó medio Hx. Los oocitos se enjuagaron tres veces en el medio Hx y los oocitos de tamaño uniforme se dividieron en grupos de CEO y NO. Los oocitos CEO y NO se cultivaron en multi-cajas de Petri de 4 pozos (Nuclon, Dinamarca) en las cuales cada pozo contuvo 0.4 ml de medio Hx y el compuesto a ser sometido a prueba en una concentración de 10 µM. Un pozo de control (es decir, 35-45 oocitos cultivados en un medio idéntico sin la adición del compuesto de prueba) se cultivó siempre simultáneamente con 3 pozos de prueba (35-45 oocitos por pozo complementados con el compuesto de prueba) . Los oocitos se cultivaron en una atmósfera humidificada de C02 al 5% en aire durante 24 horas a 37°C. Al final del periodo de cultivo, el número de oocitos con GV, GVB y cuerpos polares (posteriormente designados PB) , respectivamente, se contaron utilizando un estereomicroscopio (Wildt, Leica MZ 12) . El porcentaje de GVB, definido como el porcentaje de oocitos que se sometieron a la GVB por el número total de oocitos en ese pozo, se calculó como: % GVB = ( (número de GVB + número de PB) /número total de oocitos) X 100.

Ejemplo 2 Método utilizado para determinar si un compuesto puede ser utilizado como un aditivo en las composiciones de esta invención o no.

Un aditivo para las composiciones de FF-MAS se caracteriza por: Mejorar la solubilidad de la FF-MAS en etanol/agua (1:2.5 v/v). Asegurar una solución clara de FF-MAS después de la reconstitución de la composición en un medio MEM Alpha. Garantizar que el porcentaje de GVB sea al menos 50%, preferiblemente 80%, cuando se somete a prueba en oocitos obtenidos en ratones hembra, inmaduros. Preparar una solución etanólica saturada de FF-MAS. Mezclar con una solución acuosa del aditivo en la relación 1:2.5. Mediante la inspección visual, controlar que la FF-MAS excedente esté disponible en la solución. Hacer girar la solución durante 24 horas a temperatura ambiente. Filtrar la solución través de un filtro de 0.22µm, determinar el contenido de FF-MAS mediante la HPLC y calcular la solubilidad. Transferir 350µl a la caja de Petri de 4 pozos y evaporar a sequedad a temperatura ambiente. Adicionar 500µl del medio MEM ALPHA (Gibcobal) . Si se obtiene una solución clara dentro de media hora, la composición es sometida a prueba en los oocitos obtenidos de ratones hembra, inmaduros. El porcentaje de GVB obtenido es al menos 50%, preferiblemente 80%, véase el ejemplo 1.

Ejemplo 3 Composición que contiene Albúmina de Suero Humano (HSA) .

En este ejemplo, se prepararon 3 productos. Con referencia a la tabla posterior, la solución madre de la FF-MAS utilizada para el producto 1, 2 y 3 contuvo 50, 500 y 3330 µg/ml, respectivamente. Para cada uno de los productos, la solución madre de HSA contuvo HSA al 20%. La cantidad de las soluciones madre utilizada se establece en la tabla. Por ejemplo, para el producto 1, se mezclaron 1,400 µl de la solución madre de FF-MAS con 1000 µl de la solución madre de HSA. Después de mezclar estas soluciones madre, las soluciones se aclararon y no se observó precipitación en las mismas. Después de la mezcla, la cantidad de las mismas establecida en la tabla se transfirió a multi-cajas de Petri de 4 pozos (Nuclon, Dinamarca) . Por ejemplo, para el producto 1, se transfirieron 350 µl de la mezcla a la multi-caja de Petri. Finalmente, las soluciones se evaporaron a sequedad a temperatura ambiente. Después de la evaporación, algunos de los productos parecen como una pelicula clara, opalescente en las cajas de Petri, otros son invisibles para el ojo humano. La concentración más alta de la FF-MAS disuelta en este ejemplo es 0.95 mg/ml.

Antes del uso, se adicionan 500 µl del medio MEM ALPHA (Gibcobal) , y se obtiene una solución clara de FF-MAS y HSA dentro de media hora a temperatura ambiente.

Multi -caja de Multi -caja de Multi-caja de Petri de Petri de Petri de 4 pozos 4 pozos 4 pozos No.l No. 2 No. 3 Solución de FF-MAS en etanol. 400 µl - - 50 µg/ml Solución de FF-MAS en etanol, - 400 µl - 500 µg/ml Solución de FF-MAS en etanol, - - 450 µl 333 mg/ml Solución de HSA en agua, 1000 µl 1000 µl 1125 µl 20£ Cantidad transferida a la multi-caja 350 µl 350 µl 525 µl de Petp Relación entre FF-MAS y HSA 1 : 10.000 1 : 1,000 1:150 Apariencia de las soluciones Solucione s Incoloras, cl aras, sin antes de la evaporación precipitación: Ejemplo 4 Composiciones que contienen Albúmina de Suero Humano (HSA) .

De manera análoga a como se describe en el ejemplo anterior, se prepararon soluciones de FF-MAS en agua/etanol que contenían HSA en las concentraciones establecidas posteriormente al mezclar la muestra a temperatura ambiente. Después de la preparación, las soluciones fueron claras, y no se observó precipitación. Las soluciones se transfirieron a multi-cajas de Petri de 4 pozos (Nuclon, Dinamarca) . Finalmente, las soluciones se evaporaron a sequedad a temperatura ambiente. Antes del uso, se adicionan 500 µl del medio MEM ALPHA (Gibcobal) y dentro de media hora a temperatura ambiente, se obtiene una solución clara de FF-MAS y HSA. Las formulaciones se sometieron a prueba en oocitos obtenidos de ratones hembra inmaduros. El porcentaje de GVB para la formulación respectiva se establece en la tabla posterior.

Ejemplo 5 Composiciones que contienen Albúmina de Suero Humano (HSA) .

De manera análoga a como se describe en el ejemplo anterior, se prepararon soluciones de FF-MAS en agua/etanol que contenían HSA en las concentraciones establecidas posteriormente al mezclar la muestra a temperatura ambiente. Después de la preparación, las soluciones fueron claras y no se observó precipitación. Las soluciones se transfirieron a multi-cajas de Petri de 4 pozos (Nuclon, Dinamarca) . Finalmente, las soluciones se evaporaron a sequedad a temperatura ambiente. Antes del uso, se adicionaron 500 µl del medio MEM ALPHA (Gibcobal), y dentro de media hora a temperatura ambiente se obtuvo una solución clara de FF-MAS y HSA. La concentración de la FF-MAS después de la reconstitución se determinó mediante la HPLC, y los resultados se establecen posteriormente. Las formulaciones se sometieron a prueba en oocitos obtenidos en ratones hembra inmaduros. El porcentaje de GVB de las formulaciones respectivas se establece posteriormente.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere .

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un producto sólido, caracterizado porque contiene 4, 4-dimetil-5a-colesta-8, 14, 24-trien-3ß-ol y albúmina de suero humano, opcionalmente en forma recombinante.
2. 2. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el contenido de agua en la misma está abajo de 10%, preferiblemente abajo de 5%, mas preferiblemente abajo de 1% (peso/peso) .
3. 3. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el contenido de solvente orgánico en la misma está abajo de 10%, preferiblemente abajo del 5%, mas preferiblemente abajo de 1% (peso/peso) .
4. 4. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el contenido de , 4-dimetil-5a-colesta-8, 14 , 24-trien-3ß-ol en la misma está abajo de 50%, preferiblemente abajo de 20%, más preferiblemente abajo del 10%, mucho más preferiblemente abajo de 5% (peso/peso) .
5. 5. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque se puede utilizar para preparar una solución acuosa con las características mencionadas en cualquiera de las reivindicaciones siguientes.
6. 6. Una solución acuosa de 4, 4-dimetil-5a-colesta-8, 14, 24-trien-3ß-ol, caracterizada porque el contenido de 4, 4-dimetil-5a-colesta-8, 14, 24-trien-3ß-ol es al menos 0.001 µg/ml, preferiblemente al menos 0.01 µg/ml, más preferiblemente al menos 0.1 µg/ml, aun más preferiblemente al menos de 0.5 µg/ml.
7. 7. Una solución acuosa de 4 , 4-dimetil-5a-colesta- 8, 1 , 24-trien-3ß-ol de conformidad con la reivindicación anterior, caracterizada porque el contenido de 4,4-dimetil-5a-colesta-8, 14, 24-trien-3ß-ol no es mayor que 0.1 g/ml, preferiblemente no mayor que 0.01 g/ml
8. 8. Una solución acuosa de 4 , -dimetil-5a-colesta- 8, 1 , 24-trien-3ß-ol de conformidad con cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el contenido del solvente orgánico es menor que 0.1%, preferiblemente menor que 0.05%, más preferiblemente menor que 0.01%.
9. 9. Un dispositivo, caracterizado porque tiene un hueco que contiene un producto sólido o una solución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores .