MX2014006284A

MX2014006284A - Purificacion de proteinas usando amortiguador bis-tris.

Info

Publication number: MX2014006284A
Application number: MX2014006284A
Authority: MX
Inventors: Didier Duthe; Laure Landric-Burtin; Benoit Mothes
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2012-05-23
Publication date: 2014-10-24
Also published as: CN104039808A; BR112014012275A2; KR102048598B1; AR086525A1; RU2603347C2; AU2017245478A1; US20190135942A1; TWI643865B; JP2017095505A; US10131714B2; JP6437311B2; AU2017245478B2; SG11201402410RA; CA2855491A1; US20140323698A1; WO2013075740A1; MX364908B; JP2015500798A; IL232558B; TW201321402A

Abstract

La invención proporciona un proceso de cromatografía de dos etapas para la purificación a pequeña y gran escala de proteínas, específicamente anticuerpos monoclonales, usando sólo cuatro soluciones amortiguadoras preparadas a partir de una disolución madre.

Description

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS USANDO AMORTIGUADOR BIS TRIS Campo de la Invención La invención se refiere a un proceso de cromatografía de dos etapas para la purificación a pequeña y gran escala de proteínas, específicamente anticuerpos monoclonales, usando cuatro soluciones amortiguadoras.

Antecedentes de la Invención La purificación de anticuerpos puede ser uno de los aspectos más costosos de la bioproducción. Los anticuerpos monoclonales (mAb por sus siglas en inglés) se purifican generalmente usando un proceso de cromatografía de tres etapas, con tres resinas, usando un sistema amortiguador específico en cada etapa. Este proceso de purificación convencional engloba una etapa de captura, seguida de una etapa de intercambio iónico y finaliza con una etapa de pulido y habitualmente dura de 3 a 5 días laborables (incluyendo almacenamientos y fases abiertas). Al usarse mayores títulos de cultivo celular y mayores volúmenes de cultivo celular para la producción, el procesamiento aguas abajo se ve como un cuello de botella industrial. Esto es particularmente relevante para la producción de anticuerpos monoclonales, donde la atención se ha desviado desde el volumen del lote y hacia la capacidad de procesamiento aguas abajo. Además, los estudios de fase pre-clínica y clínica requieren que puedan producirse mayores cantidades de anticuerpos más rápidamente. Por lo tanto, existe una necesidad en la industria para una reducción en el número de etapas que se usan en la purificación de anticuerpos y en el tiempo que se tarda en obtener lotes.

Breve Descripción de la Invención Los inventores han encontrado un nuevo método para purificar anticuerpos, que comprende dicho método un número limitado de etapas mientras que aún permite la obtención de altos rendimientos de anticuerpos purificados con un grado excelente de pureza. Las proteínas purificadas son así adecuadas para aplicaciones médicas. De acuerdo con esto, el método puede usarse para purificar proteínas para ensayos clínicos y/o para comercializar una composición farmacéutica que comprende la proteína.

Brevemente, este método comprende sólo dos etapas cromatográficas: una cromatografía de afinidad y una cromatografía de resina multi-modal. Además, se ha encontrado que todos los amortiguadores usados durante estas dos etapas de cromatografía pueden prepararse empezando a partir de la misma solución madre. En otros términos, todos los amortiguadores pueden consistir de los mismos químicos, aunque las concentraciones de dichos químicos pueden variar de un amortiguador a otro. Estos amortiguadores comprenden ventajosamente Bis Tris, por ejemplo en combinación con NaCI, ácido acético y agua. Como no hay necesidad de ningún intercambio de amortiguador, el método es fácil de llevar a cabo y es muy adecuado para automatización y/o para realizarlo en modo continuo. Además, el hecho de que todos los amortiguadores puedan consistir de los mismos químicos permite una gran reducción del tiempo para preparar las columnas cromatográficas y también disminuye la necesidad de intervenciones manuales. El método de la invención permite además reducir o suprimir las fases abiertas (es decir, las etapas en las que el sistema de purificación se abre para llevar a cabo una operación manual como preparar la columna cromatográfica para un nuevo amortiguador, diluir la muestra, o ajustar su pH), reduciendo de esta manera el riesgo de contaminación. Por lo tanto, el método de la invención permite tanto la producción rápida de lotes como la reducción del tiempo de ocupación de los sistemas de purificación. Es así adecuado para el aumento de escala y la purificación de proteínas recombinantes a una escala industrial.

Se han puesto a punto e implementado dos protocolos específicos para tres anticuerpos diferentes. En el primer protocolo, el pH del eluyente de proteína cruda obtenido al final de la primera etapa cromatográfica se ajusta usando una solución Bis Tris (ver los Ejemplos 3, 4 y 5). Se ha mostrado que este protocolo es universal en la medida en que proporciona unos resultados excelentes y reproducibles independientemente del anticuerpo específico que se purifica (ver el Ejemplo 6). En un segundo protocolo, el eluyente de proteína cruda obtenido al final de la primera etapa cromatográfica se pasa directamente sobre la segunda columna de cromatografía, es decir, sin ser sometido a ningún tratamiento como ajuste de pH, intercambio de amortiguador o dilución (ver el Ejemplo 7). En este protocolo, las dos etapas cromatográficas pueden seguirse de un paso sobre un adsorbente de membrana. Este segundo protocolo tiene la ventaja de ser extremadamente rápido (aproximadamente 7 u 8 horas para 100 I de material de inicio). Además, puede automatizarse completamente, realizarse en modo continuo y no comprende ninguna fase abierta.

La invención proporciona así un método para purificar una proteína de una solución que comprende una primera etapa de cromatografía que comprende hacer pasar un amortiguador de equilibrio sobre una primera columna de cromatografía, pasando la solución sobre la primera columna de cromatografía, pasando el amortiguador de equilibrio sobre la primera columna de cromatografía, pasando el amortiguador de lavado y limpieza sobre la primera columna de cromatografía, pasando el amortiguador de equilibrio sobre la primera columna de cromatografía, eluir un eluyente de proteína cruda de la primera columna de cromatografía usando un primer amortiguador de elución, y opcionalmente ajustar el pH del eluyente de proteína cruda usando una solución Bis Tris; y una segunda etapa de cromatografía que comprende pasar el amortiguador de equilibrio sobre una segunda columna de cromatografía, pasando el eluyente de proteína cruda sobre la segunda columna de cromatografía, pasando el amortiguador de equilibrio sobre la segunda columna de cromatografía, y recuperar la proteína purificada de la segunda columna de cromatografía usando un segundo amortiguador de elución.

La invención también proporciona un método para purificar una proteína de una solución que comprende una primera etapa de cromatografía que comprende pasar el amortiguador de equilibrio sobre una primera columna de cromatografía, pasando la solución sobre la primera columna de cromatografía, pasando el amortiguador de equilibrio sobre la primera columna de cromatografía, eluir un eluyente de proteína cruda de la primera columna de cromatografía usando un primer amortiguador de elución y opcionalmente ajustar el pH del eluyente de proteína cruda usando una solución Bis Tris; y una segunda etapa de cromatografía que comprende pasar el amortiguador de equilibrio sobre una segunda columna de cromatografía, pasando el eluyente de proteína cruda sobre la segunda columna de cromatografía, pasando el amortiguador de equilibrio sobre la segunda columna de cromatografía, pasando el amortiguador de lavado y limpieza sobre la segunda columna de cromatografía, pasando el amortiguador de equilibrio sobre la segunda columna de cromatografía y recuperar la proteína purificada de la segunda columna de cromatografía usando un segundo amortiguador de elución .

En una modalidad de la invención, la solución Bis Tris es una solución 1 M Bis Tris. En otras modalidades, cada uno de los amortiguadores comprende Bis Tris y/o cada uno de los amortiguadores comprende diferentes concentraciones de los mismos químicos. En otra modalidad, cada amortiguador comprende Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua.

En una modalidad de la invención, la primera columna de cromatografía es una columna de Proteína A y la segunda columna de cromatografía es una columna de cromatografía de resina multi-modal. En otra modalidad de la invención, la primera columna de cromatografía es una columna de cromatografía de resina multi-modal y la segunda columna de cromatografía es una columna de Proteína A. En otras modalidades de la invención, el método para purificar una proteína de una solución no comprende ninguna etapa de cromatografía que comprenda pasar la solución sobre una columna de cromatografía de intercambio aniónico (AEX).

En una modalidad de la invención, la proteína que se está purificando es un anticuerpo. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En una modalidad de la invención, el método comprende además pasar el eluyente de proteína cruda sobre un adsorbente de membrana después de la etapa (b). En otras modalidades, el método comprende además una etapa de nanofiltración después de la etapa (b) y/o una etapa de ultrafiltración y diafiltración después de la etapa de nanofiltración.

En determinadas modalidades de la invención, el primer amortiguador de elución comprende 20 mM Bis Tris, y 20 mM NaCI, ajustado a pH 3.5 con ácido acético; el segundo amortiguador de elución comprende 20 mM Bis Tris, y 20 mM NaCI ajustado a pH 4.5 con ácido acético; el amortiguador de equilibrio comprende 20 mM Bis Tris, y 20 mM NaCI ajustado a pH 7.4 con ácido acético; y el amortiguador de lavado y limpieza comprende 20 mM Bis Tris, y 1M NaCI ajustado a pH 7.4 con ácido acético. En otras modalidades de la invención, el primer amortiguador de elución comprende 20 mM Bis Tris, y 20 mM NaCI, ajustado a pH 4.5 con ácido acético; el segundo amortiguador de elución comprende 20 mM Bis Tris, y 20 mM NaCI ajustado a pH 3.5 con ácido acético; el amortiguador de equilibrio comprende 20 mM Bis Tris, y 20 mM NaCI ajustado a pH 7.4 con ácido acético; y el amortiguador de lavado y limpieza comprende 20 mM Bis Tris, y 1M NaCI ajustado a pH 7.4 con ácido acético.

La invención proporciona un kit que comprende una columna de cromatografía de resina multi-modal y/o una columna de Proteína A; y al menos un amortiguador que comprende o consiste en Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua. En algunas modalidades, el kit se usa para purificar una proteína de una solución usando un método de la invención.

La invención también proporciona un kit que comprende una columna de cromatografía de resina multi-modal y/o una columna de Proteína A; e instrucciones para preparar al menos un amortiguador que comprende o consiste en Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua. En algunas modalidades, el kit se usa para purificar una proteína de una solución usando un método de la invención .

La invención proporciona además el uso de un amortiguador que comprende o consiste en Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua para purificar una proteína de una solución por al menos una etapa de cromatografía. En algunas modalidades, la etapa de cromatografía es una etapa de cromatografía de resina multi-modal y/o una etapa de cromatografía de Proteína A. También se proporciona el uso de un amortiguador que comprende o consiste en Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua para purificar una proteína de una solución por un método de la invención.

La invención proporciona además un método para preparar un amortiguador de equilibrio que comprende crear una solución de 100 I con una concentración final de 20 mM Bis Tris y 20 mM NaCI; ajustar el pH de la solución a 7.4 con ácido acético; y recoger 50 I de la solución. La invención también proporciona un método para preparar amortiguador de lavado y limpieza que comprende ajustar el pH de los 50 I restantes de la solución de la preparación del amortiguador de equilibrio a 4.5 con ácido acético; y recoger 25 I de la solución. La invención proporciona además un método para preparar un amortiguador de elución que comprende ajustar el pH de los 25 I restantes de la solución de la preparación del amortiguador de lavado y limpieza a 3.5 con ácido acético. La invención proporciona además un método para preparar un amortiguador de elución que comprende añadir eq. 1 M NaCI a 25 I de la solución restante de la preparación del amortiguador de elución. Los amortiguadores preparados por los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para purificar una proteína de una solución usando un método de la invención. Éstas y otras características y ventajas del método de purificación descrito se entenderán más completamente a partir de la siguiente descripción detallada tomada conjuntamente con las reivindicaciones adjuntas. Se indica que el alcance de las reivindicaciones se define por las recitaciones en ellas y no por la discusión específica de las características y ventajas mostrada en la descripción.

Descripción Breve de los Dibujos La siguiente descripción detallada de las modalidades del método de purificación descrito puede entenderse mejor cuando se lea conjuntamente con los dibujos siguientes.

Figura 1 muestra un esquema del protocolo usado para formular los amortiguadores del método de purificación descrito en los Ejemplos 3 a 6.

Figura 2 muestra un esquema del proceso de purificación de dos etapas.

Figura 3 muestra un esquema del uso del método de purificación de dos etapas para columnas de purificación a gran escala.

Figura 4 muestra un esquema de una purificación a gran escala "un lote un día".

Figura 5 muestra los resultados de una purificación a gran escala "un lote un día".

Figura 6 muestra un esquema del protocolo usado para formular los amortiguadores del método de purificación descrito en el Ejemplo 7.

Descripción Detallada de Aspectos v Modalidades Tomando como base la disponibilidad de resinas de modo mixto (también denominadas resinas multi-modales) los inventores han desarrollado un nuevo proceso de purificación usando sólo dos etapas de cromatografía. En otros términos, el método comprende sólo dos etapas que implican un paso sobre una columna de cromatografía.

La invención se refiere a un método para purificar una proteína de una solución que comprende o consiste en: (a) una primera etapa de cromatografía que comprende: pasar dicha solución sobre una primera columna de cromatografía; eluir un eluyente de proteína cruda de la primera columna de cromatografía usando un primer amortiguador de elución; y (b) una segunda etapa de cromatografía que comprende: pasar el eluyente de proteína cruda obtenido al final de la etapa (a) sobre una segunda columna de cromatografía; recuperar la proteína purificada de la segunda columna de cromatografía usando un segundo amortiguador de elución en donde cada uno de los amortiguadores comprende Bis Tris.

Más específicamente, cada una de las dos etapas de cromatografía anteriores puede comprender o consistir de: pasar el amortiguador de equilibrio sobre la columna de cromatografía; pasar la solución o el eluyente de proteína cruda sobre la columna de cromatografía (como se ha mencionado anteriormente); pasar el amortiguador de equilibrio sobre la columna de cromatografía; opcionalmente pasar el amortiguador de lavado y limpieza sobre la columna de cromatografía; opcionalmente pasar el amortiguador de equilibrio sobre la columna de cromatografía; eluir el eluyente de proteína cruda o recuperar la proteína purificada de la columna de cromatografía usando un amortiguador de elución (como se ha mencionado anteriormente), en donde cada uno de los amortiguadores comprende Bis Tris.

Como se ha indicado anteriormente, el método anterior de la invención sólo comprende dos etapas de cromatografía. Más específicamente, el método puede estar desprovisto de una etapa de cromatografía que comprende pasar la solución sobre una columna de cromatografía de intercambio aniónico (AEX), y/o de una etapa de cromatografía para pulido. Aunque el método de acuerdo con la invención sólo comprende dos etapas de cromatografía, permite obtener proteínas purificadas que son adecuadas para propósitos farmacéuticos y en particular para administración a humanos.

Además de la reducción del número de etapas en el proceso de purificación de tres a dos (y la reducción consecuente del tiempo global requerido para completar el proceso de purificación), el método descrito reduce el número de amortiguadores usado para la purificación de siete a cuatro. Además, los amortiguadores comprenden los mismos componentes (es decir, Bis Tris, NaCI, ácido acético y agua), lo que facilita en gran medida la preparación de los amortiguadores. El método de purificación descrito también simplifica la purificación de mAb, mejora el rendimiento global y reduce los materiales brutos, costos de productos y tiempo del proceso, además de permitir la purificación de una variedad de mAb.

A diferencia de los métodos de purificación de proteínas convencionales, como se ha indicado anteriormente, el método descrito en la presente descripción se usa cuatro amortiguadores: un amortiguador de equilibrio, un amortiguador de lavado y dos amortiguadores de elución. Los amortiguadores usados en el método descrito se preparan con la misma matriz de compuestos, a partir de una solución madre, lo que facilita en gran medida la preparación de los amortiguadores.

Tal y como se usa en la presente descripción, "amortiguadores de acuerdo con la invención" se refiere a amortiguadores que comprenden Bis Tris. Bis Tris es un compuesto muy conocido para el experto en la técnica, cuyo nombre IUPAC es 2-[bis(2-hidroxietil)amino]-2- (hidroximetil)propano-l ,3-diol, y cuyo Número CAS es 6976-37-0. Tales amortiguadores de acuerdo con la invención pueden corresponder a un amortiguador de equilibrio, a un amortiguador de lavado y limpieza y/o a un amortiguador de elución.

Más específicamente, tales amortiguadores de acuerdo con la invención pueden comprender o consistir de diferentes concentraciones de los mismos químicos (siendo uno de ellos Bis Tris). En una modalidad específica, los amortiguadores comprenden o consisten en Bis Tris, ácido acético y agua. En una modalidad más específica, los amortiguadores comprenden o consisten en Bis Tris, ácido acético, NaCI y agua. En otros términos, tales amortiguadores comprenden o consisten en diferentes concentraciones de Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua.

El amortiguador de elución puede, por ejemplo, comprender o consistir de 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) Bis Tris, y 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 3 y 4 (por ejemplo, 3.5) con ácido acético. Tal amortiguador de elución es particularmente adecuado para uso con una columna de cromatografía de afinidad como una columna de Proteína A.

El amortiguador de elución también puede comprender o consistir de 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) Bis Tris, y 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 4 y 5 (por ejemplo, 4.5) con ácido acético. Tal amortiguador de elución es particularmente adecuado para uso con una columna de cromatografía de resina multi-modal como por ejemplo Capto Adhere.

El amortiguador de elución también puede comprender o consistir de 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) Bis Tris, y 150 a 250 mM (por ejemplo, 200 mM) NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 8 y 9 con ácido acético. Tal amortiguador de elución es particularmente para uso con una columna de cromatografía de resina multi-modal como por ejemplo Capto MMC.

El amortiguador de equilibrio puede comprender o consistir de 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) Bis Tris, y 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 7 y 8 (por ejemplo, 7.4) con ácido acético.

El amortiguador de lavado y limpieza puede comprender o consistir de 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) Bis Tris, y 0.9 a 1.1 mM (por ejemplo, 1M) NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 7 y 8 (por ejemplo, 7.4) con ácido acético.

Más específicamente, un amortiguador de equilibrio para uso en el método descrito contiene 20 mM Bis Tris y 20 mM NaCI, ajustado a pH 7.4 con 2 mM ácido acético. Un amortiguador de lavado para uso en el método descrito contiene 20 mM Bis Tris y 1M NaCI, ajustado a pH 7.4 con 2 mM ácido acético. Un primer amortiguador de elución para uso en el método descrito contiene 20 mM Bis Tris y 20 mM NaCI, ajustado a pH 3.5 con 275 mM ácido acético. Un segundo amortiguador de elución para uso en el método descrito contiene 20 mM Bis Tris y 20 mM NaCI, ajustado a pH 4.5 con 35 mM ácido acético.

Las ventajas de las formulaciones amortiguadoras anteriores incluyen la capacidad de un producto mAb de pasar a través de dos columnas de cromatografía usadas en el método descrito con mayor compatibilidad, mientras se minimizan las interacciones no deseadas, se limitan las caídas en pH y conductividad y se estimula un rendimiento incrementado frente a los métodos de purificación tradicionales. Además de usar un número reducido de amortiguadores, otro aspecto del método descrito es el uso de un amortiguador Bis-Tris.

Los términos "polipéptido" o "proteína" tal y como se usan en la presente descripción se refieren a moléculas que tienen la secuencia de las proteínas nativas, esto es, proteínas producidas por células naturales y específicamente no recombinantes o células modificadas genéticamente o recombinantes y comprenden moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen deleciones de, adiciones a y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. En determinados aspectos, la proteína que se va a purificar es un anticuerpo.

El término "anticuerpo" tal y como se usa en la presente descripción se refiere a un anticuerpo intacto, o a un fragmento de unión de éste que compite con el anticuerpo intacto para la unión específica. Los fragmentos de unión incluyen, pero no están limitados a, F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, y anticuerpos de cadena única. El término "cadena pesada" incluye cualquier polipéptido de inmunoglobulina que tiene secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad para un antígeno.

El término "cadena pesada" tal y como se usa en la presente descripción contiene una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de ésta. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de región constante, CH1, CH2, y CH3. El dominio VH está en el extremo amino del polipéptido y el dominio CH3 está en el extremo carboxilo.

El término "cadena ligera" tal y como se usa en la presente descripción contiene una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de ésta. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. Como la cadena pesada, el dominio de región variable de la cadena ligera está en el extremo amino del polipéptido. El término "cadena ligera " tal y como se usa en la presente descripción incluye cualquier polipéptido de inmunoglobulina que tiene secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad para un antigeno.

Las unidades estructurales de anticuerpo naturales comprenden típicamente un tetrámero. Cada uno de tales tetrámeros está compuesto típicamente de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena ligera de longitud completa (que tiene típicamente un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena pesada de longitud completa (que tiene típicamente un peso molecular de aproximadamente 50 - 70 kDa). La parte amino terminal de cada cadena ligera y pesada incluye típicamente una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que típicamente es responsable del reconocimiento del antígeno. La parte carboxi terminal de cada cadena define típicamente una región constante responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican típicamente como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican típicamente como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. IgG tiene varias subclases, incluyendo, pero no limitadas a, lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4. IgM tiene subclases incluyendo, pero no limitadas a, lgM1 e lgM2. IgA se subdivide de manera similar en subclases incluyendo, pero no limitadas a, lgA1 e lgA2. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, típicamente, las regiones variables y constantes se unen mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más.

Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman típicamente el sitio de unión al antígeno. Las regiones variables presentan típicamente la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean típicamente por las regiones marco, que pueden permitir la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N-terminal al C-terminal, las regiones variables de la cadena ligera y pesada comprenden típicamente los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio está típicamente de acuerdo con las definiciones de Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., U.S.

Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es típicamente un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares diferentes de cadena pesada/cadena ligera y dos sitios de unión diferentes.

Un fragmento F(ab) se compone de una cadena ligera y el CH1 y las regiones variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula F(ab) no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un fragmento F(ab') contiene una cadena ligera y una cadena pesada que contiene más de la región constante, entre los dominios CH1 y CH2, de manera que puede formarse un enlace disulfuro intercadena entre dos cadenas pesadas para formar una molécula F(ab')2. La región Fv comprende las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, pero carece de regiones constantes. Los anticuerpos de cadena única son moléculas Fv en las que las regiones variables de la cadena pesada y ligera se han conectado por un conector flexible para formar una única cadena polipeptídica, que forma una región de unión al antígeno. Un anticuerpo bivalente distinto de un anticuerpo "multiespecífico" o "multifuncional", en determinadas modalidades, se entiende que comprende sitios de unión que tienen la misma especificidad antigénica.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) que pueden purificarse por el método descrito pueden producirse por varias técnicas, incluyendo metodología de anticuerpos monoclonales convencional, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas estándar muy conocida en la técnica. Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, pueden usarse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El anticuerpo monoclonal puede corresponder, por ejemplo, a un anticuerpo murino, quimérico, humanizado o completamente humano.

En una modalidad específica, el anticuerpo purificado por el método de la invención es un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo que se une específicamente a la forma protofibrilar de la proteína ß-amiloide humana (por ejemplo, un anticuerpo humanizado), un anticuerpo que se une específicamente al polisacárido de la superficie bacteriana poli-N-acetil glucosamina (PNAG) (por ejemplo, un anticuerpo completamente humano), y un anticuerpo que se une específicamente a la glicoproteína transmembrana CD38 (por ejemplo, un anticuerpo humanizado).

La expresión "recuperar la proteína" tal y como se usa en la presente descripción se refiere a recoger una proteína después de usar el método de purificación descrito. El método de purificación descrito puede conseguirse usando varias técnicas de cromatografía de proteínas estándar, como, pero no limitadas a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de resina multi-modal.

En determinadas modalidades del método descrito, la primera o segunda columna de cromatografía es una columna de Proteína A. La columna de Proteína A funciona mediante afinidad entre el ligando de la resina y la proteína, lo que resulta en una eliminación muy eficaz de las impurezas. Otra ventaja de usar una columna de Proteína A en el método descrito es que los mAb tienen una afinidad universal frente a la Proteína A. En una modalidad del método descrito, la columna de Proteína A es resina MabSelect Sure (GE Healthcare).

En modalidades adicionales del método descrito, la primera o segunda columna de cromatografía es una columna de cromatografía de resina multi-modal (modo mixto). La resina multi-modal interacciona con la proteína de interés mediante varios mecanismos con interacciones mAb:iónica, hidrofóbica y enlaces de hidrógeno. Más específicamente, en una columna de cromatografía de resina multi-modal, la interacción mAb:iónica es una interacción mAb:catiónica, a diferencia de interacciones mAb:aniónicas que ocurren en una columna de cromatografía de intercambio aniónico (AEX) clásica.

En una modalidad específica del método descrito, la resina multi-modal es resina Capto Adhere (GE Healthcare). Capto adhere es un intercambiador aniónico multimodal con una matriz con base de agarosa muy entrecruzada. Las características de Capto adhere se resumen a continuación (ver GE Healthcare Life Sciences, archivo de datos 28-9078-88 AC).

Matriz agarosa muy entrecruzada Grupo funcional intercambiador aniónico fuerte multimodal Capacidad iónica 0.09 a 0.12 mmoles Cl-/ml de medio total Tamaño de las 75 µ?t? (d50v) partículas Velocidad de Al menos 600 cm/h en una columna de 1 caudal m de diámetro con 20 - cm de altura de lecho a 20°C usando amortiguadores de proceso con la misma viscosidad que el agua a < 3 bares (0.3 MPa) estabilidad a corto plazo 2 a 14 largo plazo 3 a 12 Temperatura de +4°C a +30°C trabajo En otra modalidad específica del método descrito, la resina multi-modal es resina Capto MMC (GE Healthcare). Capto MMC es un intercambiador catiónico multimodal con una matriz con base de agarosa muy entrecruzada. Las características de Capto MMC se resumen a continuación (ver GE Healthcare Life Sciences, archivo de datos 11-0035-45 AA).

Matriz agarosa muy entrecruzada Grupo funcional intercambiador catiónico débil multimodal Capacidad iónica 0.07 - 0.09 mmoles H+/ml de medio total Tamaño de las 75 µ?t? (d50v) partículas Velocidad de al menos 600 cm/h en una columna de 1 m caudal de diámetro con 20 cm de altura de lecho a 20°C usando amortiguadores de proceso con la misma viscosidad que el agua a < 3 bares (0.3 MPa) Unión dinámica > 45 mg BSA/ml de medio a 30 mS/cm estabilidad a pH corto plazo 2 a 14 largo plazo 2 a 12 Temperatura de +4°C a +30°C trabajo El método de acuerdo con la invención puede o no puede comprender ajustar el pH del eluyente de proteína cruda usando una solución Bis Tris al final de la primera etapa cromatográfica.

En una primera modalidad, el pH del eluyente de proteína cruda usando una solución Bis Tris al final de la primera etapa crómate-gráfica, por ejemplo a un pH que comprende entre 6 y 7 (por ejemplo, 6.5). Tal solución Bis Tris puede ser una solución 1M Bis Tris. En tal método, la columna de cromatografía de resina multi-modal puede corresponder por ejemplo a una columna Capto Adhere. Un ejemplo específico de este método se describe en los Ejemplos 3 a 6.

En una segunda modalidad, el eluyente de proteína cruda obtenido al final de la primera etapa cromatográfica se pasa directamente sobre la segunda columna de cromatografía. Más específicamente, no se realiza ningún tratamiento (como ajuste de pH, intercambio de amortiguadores o dilución) entre las dos etapas. En tal método, la columna de cromatografía de resina multi-modal puede corresponder por ejemplo a una columna Capto MMC. Además, el eluyente de proteína cruda puede pasarse sobre un adsorbente de membrana después de la segunda etapa cromatográfica, como se describe más a continuación. Un ejemplo específico de este método se describe en el Ejemplo 7. En tal método, están totalmente ausentes los tratamientos inter-etapa que requieren intervención manual y abertura del sistema de purificación (por ejemplo, dilución en un recipiente de inactivación, filtración post inactividad y ajuste del pH en un recipiente con combinación de Proteína A).

El método descrito en la presente descripción puede usarse para recuperar proteínas purificadas. Tal y como se usa en la presente descripción, "purificada" se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la proteína in vitro, ex vivo, o in vivo. Para que una proteína sea útil en aplicaciones in vitro, ex vivo, o in vivo, debe carecer sustancialmente de contaminantes, otras proteínas y/o químicos que pueden interferir con el uso de esa proteína en tales aplicaciones o que al menos sea indeseable para la inclusión con la proteína de interés. Tales aplicaciones incluyen la preparación de composiciones terapéuticas, la administración de la proteína en una composición terapéutica y otros métodos descritos en la presente descripción. Preferiblemente, una proteína "purificada", como se hace referencia en la presente descripción, es una proteína que puede producirse por cualquier método (es decir, por purificación directa a partir de una fuente natural, de forma recombinante o sintética), y que se ha purificado de otros componentes proteicos de manera que la proteína comprende al menos aproximadamente 80% peso/peso de la proteína total en una composición dada, y más preferiblemente al menos aproximadamente 85%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 91%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 92%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 93%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 94%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 96%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 97%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 99% peso/peso de la proteína total en una composición dada.

Tal y como se usa en la presente descripción, "proteína cruda" se refiere a una proteína que puede producirse por cualquier método (es decir, por purificación directa a partir de una fuente natural, de forma recombinante o sintética), y que se ha purificado de otros componentes proteicos de manera que la proteína comprende menos de aproximadamente 80% peso/peso de la proteína total en una composición dada.

En una modalidad, el método descrito comprende además una tercera etapa, referida como "etapa (c)", en la que el eluyente de proteína cruda se pasa sobre un adsorbente de membrana después de la etapa (b). En particular, la etapa (c) puede realizarse cuando el eluyente de proteína cruda obtenido al final de la primera etapa cromatográfica se pasa directamente sobre la segunda columna de cromatografía. Un adsorbente de membrana es una forma de matriz o filtro de cromatografía que usa membranas con grandes poros en lugar de partículas microporosas. Estos poros cubren toda el área del filtro y facilitan una velocidad de caudal muy rápida de la muestra, así como la unión óptima de las moléculas objetivo en la estructura interna de la membrana. Las membranas pueden incorporarse en columnas de centrifugación, lo que permite una separación fácil y selectiva de las proteínas objetivo de soluciones complejas. Los beneficios de usar un adsorbente de membrana son que son tan eficaces como los procesos de cromatografía convencionales para unir contaminantes; permiten unas velocidades de caudal de procesamiento altas, no requieren empaquetamiento, validación o limpieza y son desechables pero pueden reusarse. Las membranas tolerantes a la sal permiten incluso más tipos de purificación. En determinadas modalidades, el adsorbente de membrana es un adsorbente de membrana de cromatografía de interacción tolerante a la sal (por ejemplo, un adsorbente de membrana Satorius STIC) o un adsorbente de membrana Q.

Cuando se purifican proteínas recombinantes para propósitos farmacéuticos, las etapas cromatográficas están seguidas típicamente por etapas de filtración. Por lo tanto, el método de la invención puede comprender además una etapa de nanofiltración después de la etapa (b) o (c). Una etapa de ultrafiltración o diafiltración puede realizarse además después de la etapa de nanofiltración. Tal y como se usa en la presente descripción, "ultrafiltración" o "UF" se refiere a una técnica de filtración que usa una membrana semi-permeable para eliminar física y selectivamente partículas y/o iones de una solución tomando como base el tamaño de las partículas y el tamaño de los poros de la membrana UF. Tal y como se usa en la presente descripción, "nanofiltración" se refiere a la filtración de una solución a través de un nanofiltro que se usa para eliminar, por ejemplo, partículas virales. Tal y como se usa en la presente descripción, "diafiltración" se refiere a una técnica que usa membranas de ultrafiltración para eliminar completamente, reemplazar o disminuir la concentración de sales o solventes de soluciones.

Finalmente, la proteína purificada puede formularse en una composición adecuada para almacenamiento, y/o en una composición farmacéutica adecuada para administración a animales y/o humanos.

Una de las numerosas ventajas del método descrito es que permite obtener buenos rendimientos de proteína altamente pura. La proteína purificada recuperada con el método de la invención puede por ejemplo presentar una pureza de al menos 95, 96, 97, 98 o 99%. Además, el método de la invención puede permitir recuperar la purificada con un rendimiento de al menos 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99%.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para preparar amortiguadores adecuados para uso en el método de la invención. De hecho, todos estos amortiguadores pueden prepararse fácil y rápidamente a partir de una única solución madre.

Tal método para preparar amortiguadores puede comprender o consistir de las etapas de: i) crear una solución (por ejemplo, una solución de 100 I) con una concentración final de 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) Bis Tris y de 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) NaCI; M) ajustar el pH de la solución a un valor que comprende entre 7 y 8 (por ejemplo, 7.4) con ácido acético; iii) recoger la mitad de la solución, obteniendo de esta manera un amortiguador de equilibrio; iv) ajustar el pH de la mitad restante de la solución de la etapa (iii) a un valor que comprende entre 4 y 5 (por ejemplo, 4.5) con ácido acético; v) recoger la mitad de la solución obtenida en la etapa (iv), obteniendo de esta manera un amortiguador de elución. vi) ajustar el pH de la mitad restante de la solución de la etapa (v) a un valor que comprende entre 3 y 4 (por ejemplo, 3.5) con ácido acético, obteniendo de esta manera un amortiguador de elución más; vii) recoger la mitad del amortiguador de equilibrio obtenido en la etapa (iii) y añadir NaCI para obtener una concentración final de NaCI que comprende entre 0.9 a 1.1 mM (por ejemplo, 1M), obteniendo de esta manera un amortiguador de lavado y limpieza.

Tal método se representa esquemáticamente en la Figura 1. Alternativamente, el método para preparar amortiguadores puede comprender o consistir de: i) crear una solución (por ejemplo, una solución de 100 I) con una concentración final de 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) Bis Tris y de 15 a 25 mM (por ejemplo, 20 mM) NaCI; ii) ajustar el pH de la solución a un valor que comprende entre 8 y 9 (por ejemplo, 8.2) con ácido acético; iii) recoger un cuarto (por ejemplo, 25 I) de la solución, obteniendo de esta manera un amortiguador de elución; iv) ajustar el pH de la solución restante de la etapa (iii) a un valor que comprende entre 7 y 8 (por ejemplo, 7.4) con ácido acético; v) recoger dos tercios de la solución obtenida en la etapa (iv), obteniendo de esta manera un amortiguador de equilibrio. vi) ajustar el pH de la solución restante de la etapa (v) a un valor que comprende entre 3 y 4 (por ejemplo, 3.5) con ácido acético, obteniendo de esta manera un amortiguador de elución más. vii) recoger la mitad del amortiguador de equilibrio obtenido en la etapa (v) y añadir NaCI para obtener una concentración final de NaCI comprendida entre 0.9 a 1.1 mM (por ejemplo, 1M), obteniendo de esta manera un amortiguador de lavado y limpieza.

Tal método se representa esquemáticamente en la Figura 6.

Uno de los métodos anteriores para preparar amortiguadores también puede corresponder a la primera etapa de todas del método de la invención, antes de llevar a cabo las dos etapas cromatográficas.

La invención se refiere además a un kit que comprende o consiste en: (a) una columna de cromatografía de resina multí-modal y/o una columna de cromatografía de afinidad como una columna de Proteína A; y (b) al menos un amortiguador de acuerdo con la invención (por ejemplo, que comprende o consiste en Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua), y/o instrucciones para preparar al menos un amortiguador de acuerdo con la invención (por ejemplo, que comprende o consiste en Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua).

La invención contempla además el uso de un amortiguador de acuerdo con la invención (por ejemplo, que comprende o consiste en Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua) para purificar una proteína de una solución por al menos una etapa de cromatografía. Más específicamente, al menos una etapa de cromatografía puede ser una etapa de cromatografía de resina multi-modal y/o una etapa de cromatografía de afinidad como una columna de Proteína A.

Ejemplos Los Ejemplos que siguen son ilustrativos de modalidades específicas del método descrito, y varios usos de éste. Se muestran sólo para propósitos explicativos, y no deben considerarse como que limitan el alcance de la invención de ninguna manera.

Ejemplo 1: Optimización de los Amortiguadores de Purificación 1.1. Un amortiguador Bis Tris puede usarse como un amortiguador de elución con una columna de Proteína A Cuando se realiza una etapa de cromatografía con una columna de Proteína A, el amortiguador de elución consiste típicamente en un amortiguador citrato o glicina. Tal etapa de cromatografía con una columna de Proteína A se realizó usando las condiciones clásicas siguientes Columna: MabSelect Sure de 80 mi Amortiguador de equilibrio: amortiguador PBS a pH 7.2 Amortiguador de elución: 100 mM citrato de sodio a pH 3.0 Carga: 1 I de solución que comprende 1.48 g/l de mAb anti-CD38.

Se obtuvieron 175 mi de eluyente de proteína cruda que comprende 7.92 g/l de mAb después de la etapa de cromatografía (1.386 g de mAb).

Los inventores investigaron si el amortiguador de citrato podía ser reemplazado con un amortiguador Bis Tris. Se usaron las condiciones siguientes: Columna: MabSelect Sure de 80 mi Amortiguador de equilibrio: amortiguador PBS a pH 7.2 Amortiguador de elución: 100 mM Bis Tris a pH 3.5 (pH ajustado con ácido acético) Carga: 1 I de solución que comprende 1.48 g/l de mAb anti-CD38.

Los inventores obtuvieron 200 mi de eluyente de proteína cruda que comprende 6.8 g/l de mAb 1.369 g de mAb).

Esto muestra que cuando se realiza una etapa de cromatografía con una columna de Proteína A, el uso de un amortiguador Bis Tris como un amortiguador de elución permite obtener resultados tan buenos como con el amortiguador citrato de sodio clásico. 1.2. Los amortiguadores Bis Tris pueden usarse ventajosamente como amortiguadores con una columna de cromatografía de resina multi-modal El eluyente de proteína cruda obtenido después del paso a través de una columna de cromatografía de Proteína A se pasó a través de una columna de cromatografía de resina multi-modal Capto adhere. Para este propósito, los inventores ensayaron en primer lugar las condiciones siguientes: - Columna: Capto adhere de 1 mi - Amortiguador de equilibrio: 100 mM citrato de sodio a pH 8.6 (80%) y 100 mM ácido cítrico a pH 2.2 (20%), siendo el pH final próximo a 5.3.

- Amortiguador de elución: Concentraciones variadas de los dos amortiguadores anteriores con el fin de identificar cuando tiene lugar una elución óptima.

- Amortiguador de lavado: Idéntico al amortiguador de equilibrio.

- Carga: 20 mi de un eluyente de proteína cruda que comprende 35 mg de mAb anti-CD38, que tiene un pH de 5.3.

Se encontró que el anticuerpo eluía durante la etapa de lavado, aparentemente porque el pH había caído. De hecho, el pH cayó momentáneamente de 5.3 a 4.0, antes de incrementarse de nuevo hasta un pH de 5.3. El hecho de que el pH cayera hasta 4.0 fue suficiente para que el anticuerpo eluyera durante la etapa de lavado.

Los inventores investigaron entonces si el uso de un amortiguador Bis Tris podría evitar posiblemente la elución no deseada durante la etapa de lavado. Ensayaron las condiciones siguientes: - Columna: Capto adhere de 1 mi Amortiguador de equilibrio: 20 m Bis Tris a pH 7.0 (pH ajustado con ácido acético) Amortiguador de elución: 20 mM Bis Tris a pH 6.0 (pH ajustado con ácido acético) - Amortiguador de lavado/regeneración: 20 mM Bis Tris a pH 4.0 (pH ajustado con ácido acético) Amortiguador de limpieza: NaOH 0.5N Carga. 18 mi de un eluyente de proteína cruda que comprende aproximadamente 30 mg de mAb anti-CD38. Este eluyente provino de la 2a. cromatografía descrita en el párrafo 1.1 anterior. El pH del eluyente se ajustó a un pH de 7.2 con una solución 1M Bis Tris antes de cargarlo en la columna Capto adhere.

Los inventores encontraron que estas condiciones permitían una elución correcta del anticuerpo. De hecho, el anticuerpo eluyó con el amortiguador de elución Bis Tris que tiene un pH de 6.0. Se observaron dos picos más pequeños y despreciables durante la regeneración a pH 4.0 y durante la limpieza con NaOH.

Se ensayó adicionalmente si podría ser beneficioso ajustar el pH de los amortiguadores Bis Tris con HCI en lugar de con ácido acético. Se usaron las condiciones siguientes: Columna: Capto adhere de 1 mi Amortiguador de equilibrio: 20 mM Bis Tris a pH 7.0 (pH ajustado con HCI 1N).

- Amortiguador de elución: gradiente con un amortiguador Bis Tris (20 mM, pH de 4, pH ajustado con HCI 1N).

Carga: 10 mi de un eluyente de proteína cruda que comprende aproximadamente 15 mg de mAb anti-CD38. Este eluyente provino de la 2a. cromatografía descrita en el párrafo 1.1 anterior. El pH del eluyente se ajustó a un pH de 7.2 con una solución 1 M Bis Tris antes de cargarlo en la columna Capto adhere.

Usando estas condiciones, el anticuerpo no eluyó durante la etapa de lavado. Este ensayo confirma por lo tanto que el uso de un amortiguador Bis Tris permite evitar la elución no deseada del anticuerpo durante la etapa de lavado. Sin embargo, el pH no cayó tan rápidamente durante la etapa de elución cuando el pH se ajustó con HCI en lugar de con ácido acético. La elución del anticuerpo fue así menos eficaz cuando se ajustó el pH con HCI en lugar de con ácido acético.

En conclusión, los inventores encontraron sorprendentemente que durante la etapa de cromatografía de resina multi-modal, el uso de amortiguadores de equilibrio y elución que comprenden Bis Tris permite evitar la elución no deseada del anticuerpo durante la etapa de lavado y limpieza. Además, encontraron que era ventajoso ajustar el pH del amortiguador Bis Tris con ácido acético. Como también se encontró que el amortiguador Bis Tris era adecuado para realizar la etapa de cromatografía con Proteína A, los inventores han encontrado un proceso de purificación en el que los amortiguadores pueden prepararse todos con la misma matriz de compuestos, lo que facilita en gran medida la preparación de los amortiguadores.

Se realizaron experimentos adicionales para determinar el pH óptimo para el amortiguador de equilibrio, el amortiguador de lavado y los dos amortiguadores de elución, que comprende todos Bis Tris así como ácido acético para propósitos de ajuste del pH. Los inventores encontraron además inesperadamente que NaCI podría añadirse ventajosamente a los amortiguadores. Estos experimentos adicionales dieron lugar a los amortiguadores y protocolos de purificación descritos en los Ejemplos 2 a 7.

Ejemplo 2: Formulación de los Amortiguadores de Purificación El método de purificación de dos etapas descrito en la presente descripción usa cuatro amortiguadores: un amortiguador de equilibrio, un amortiguador de lavado y limpieza, y dos amortiguadores de elución, todos preparados a partir de la misma solución madre. Un esquema del protocolo se muestra en la Figura 1 y es como sigue: se llevaron eq. 20 mM Bis Tris y eq. 20 mM NaCI hasta 100 I de agua para inyección (WFI) como la solución madre y el pH de la solución se ajustó a 7.4 usando ácido acético. Se recogieron 50 I de la solución resultante y se almacenaron como el amortiguador de equilibrio. Se tomaron 25 I del amortiguador de equilibrio y se añadieron eq. 1 M NaCI, disminuyendo de esta manera el pH a 3.5. Esta solución de 25 I resultante fue el amortiguador de lavado y limpieza. El pH de los 50 I restantes de la solución madre se ajustaron a 4.5 con ácido acético. Se recogieron 25L de esta solución como uno de los amortiguadores de elución. Se ajustó el pH de los 25 I restantes de la solución madre a 3.5 usando ácido acético, lo que resulta en el otro amortiguador de elución.

Ejemplo 3: Proceso de Purificación de Anticuerpos Monoclonales en Dos Etapas El proceso de purificación de anticuerpos monoclonales (mAb) en dos etapas se inicia con una primera etapa de cromatografía usando resina MabSelect Sure. Se pasan 2 volúmenes de columna (CV) de equilibrio sobre la columna. La solución de mAb se carga en la columna. Se pasan dos CV amortiguadoras de lavado sobre la columna, seguido de dos CV amortiguadoras de equilibrio. La solución de mAb crudo se eluye usando un CV del primer amortiguador de elución. Entre las dos etapas de cromatografía hay un tratamiento de pH bajo. Éste puede ser un ajuste de pH bajo usando 1 M ácido acético para alcanzar pH 3.5 ± 0.1 o un ajuste de pH usando 1 M Bis Tris para alcanzar pH 5 ± 0.1. La segunda cromatografía se lleva a cabo usando una columna de cromatografía Capto Adhere. Se pasan 2 CV de equilibrio sobre la columna. La solución de mAb crudo se carga en la columna, seguida de pasar 4 CV del amortiguador de equilibrio. La solución de mAb parcialmente purificado se eluye usando un CV del segundo amortiguador de elución. Después de la cromatografía, el mAb puede filtrarse con nanofiltración y ultrafiltración/diafiltración. La nanofiltración empieza con una etapa de pre-filtración usando prefiltros XOHC y VPD (Millipore) y concluye con nanofiltración usando un filtro Viresolve Pro (Millipore). La ultrafiltración se lleva a cabo con una concentración objetiva de 50 g/l, seguida de diafiltración usando 7 volúmenes amortiguadoras histidina (ver Figura 2 para un esquema del proceso).

Ejemplo 4: Purificación en Pequeños Lotes de mAb 13C3 Humanizado El protocolo descrito en el Ejemplo 2 se usó para la purificación en pequeños lotes de 53 g de mAb 13C3 humanizado. El mAb 13C3 se une a la forma protofibrilar de la proteína ß-amiloide humana como se describe en la Publicación Internacional No. WO 2009/065054.

La parte recogida principal de mAb se aclaró a través de un sistema de filtración de profundidad y se filtró usando un filtro de 0.22 pm antes de almacenarlo en una bolsa desechable de 50 I durante 96 horas a 2 - 8°C antes de la purificación. Se cargaron 43 I de la parte recogida principal en una columna de 3.1 I MabSelect Sure a una velocidad de caudal de 240 cm/hora. La primera etapa de cromatografía se realizó como se ha descrito anteriormente y se recogieron 6 I de solución de mAb. Los eluatos se diluyeron con 4 I de agua Milli-Q para crear una solución que tenía una concentración de ~5 g/l. El pH se re-ajustó a 6.5 con 1 I de 1 M Bis Tris. Se filtró un volumen total de 11.03 I a través de un filtro de profundidad de grado COHC y un filtro de 0.22 µp? illipak. Se recogieron 11.58 I y se almacenaron a 2 - 8°C. Para la segunda etapa de cromatografía, los eluatos de MabSelect sure se cargaron en una columna de 4 I Capto adhere a una velocidad de caudal de 240 cm/hora. Después de la etapa de carga, la cromatografía se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente y se recogieron en una bolsa de 10 I con un volumen final de 5.58 1. El producto final se filtró a través de un filtro de 0.22 m Millipak y se almacenó a 2 - 8°C.

Comparado con la purificación clásica de mAb, el método en dos etapas descrito en la presente descripción produce resultados similares con un rendimiento global >90% y una pureza >98%, en este caso, específicamente una pureza del 99.4% y una concentración final de 9.49 g/l.

Ejemplo 5: Purificación en Masa de Anticuerpos Monoclonales El método de purificación en dos etapas también puede aplicarse a la purificación a gran escala de anticuerpos monoclonales. Para la primera etapa de cromatografía, la parte recogida principal (216 I) del mAb 13C3 humanizado se dividió en 4 alícuotas y se cargó en la columna de 3.1 I MabSelect Sure a una velocidad de caudal de 240 cm/hora en 4 series de aproximadamente 54 I cada una. La cromatografía se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente y los eluatos de mAb se recogieron en una bolsa Mobuis de 100 I. Además, después de cada etapa de carga, la columna se equilibró con amortiguador de equilibrio. El pH de la solución de 19.7 I se midió y era 3.9. Los eluatos se diluyeron hasta una concentración de 5 g/l con 60 I de agua MilliQ. El pH se ajustó a 3.5 con 4.0 I de 1M ácido acético, lo que tardó -1 hora de duración. Después del mantenimiento del pH, se ajustó el pH de los eluatos a pH 6.5 para la etapa Capto Adhere con 7 I de solución 1M Bis Tris. El volumen final para esta etapa fue 91 I y el producto se almacenó a 4°C. Para la segunda etapa de cromatografía, los eluatos de MabSelect sure se dividieron y se cargaron en una columna de 3.5 I Capto Adhere a una velocidad de caudal de 240 cm/hora en 4 series. Después de cada etapa de carga, la columna se equilibró con amortiguador de equilibrio. Todas las eluciones se juntaron en la misma bolsa de 50 I Flexboy a través de un filtro de 0.22 µ?? y, después de cada etapa, se llevó a cabo la limpieza usando amortiguador de lavado. El volumen final fue 22.1 I y se almacenó a 2 - 8°C. Se llevó a cabo una etapa de filtración de profundidad con un filtro XOHC (Millipore). Debido a asuntos de compatibilidad entre el filtro XOHC y el pre-filtro VPF usado para la etapa que siguió, el pre-filtro VPF se añadió al filtro XOHC para llevar a cabo la filtración en el mismo soporte. Para minimizar la pérdida en el rendimiento, se instaló un nanofiltro Modus 1.3 en línea después de los dos filtros de profundidad. La solución se filtró a través de un filtro de 0.22 m2 de grado XOHC (2 x 0.11 m2), filtro de 0.22 m2 VPF (2 x 0.11 m2), y el Modus 1.3 (0.21 m2). Después del lavado de la filtración, el volumen total recuperado fue 25.9 I. No apareció ningún problema de presión, empezando la presión en 1.8 y finalizando aproximadamente 1.3 bares a 460 ml/minutos. La etapa final fue ultrafiltración y diafiltración de la solución. Los dos procesos se llevaron a cabo en un Millipore Cogent M con un soporte que incrementó la capacidad hasta 1.71 mz. El lote se cargó en el Cogent M con un volumen constante de 9.3 I para concentrar la solución hasta 50 g/l. La primera concentración se alcanzó después de 50 minutos a un flujo transversal de la bomba de 12 L/M/H. La diafiltración se hizo con 7 volúmenes de 10 mM Histidina pH 6.5 en 165 minutos a un flujo transversal de la bomba de 14 L/M/H. El producto se concentró lentamente durante 30 minutos a un flujo transversal de la bomba de 8 L/M/H. El flujo se ajustó para permanecer por debajo de ?? < 0.6Bares, empezando a 1.670 ml/minutos y finalizando a 520 ml/minutos. El volumen final de la solución recogida fue 2.6 I, que contiene 457 g de mAb, con una concentración final a 175.7 g/l (UV). Finalmente, el producto se filtró usando un filtro de 0.22 µ?p Sartopore 2 - 150 y se almacenó a 4°C.

Ejemplo 6: Purificación de diferentes anticuerpos monoclonales Además del anticuerpo 13C3 humanizado, el método de purificación en dos etapas descrito anteriormente se usó para purificar anticuerpos adicionales, concretamente un anticuerpo completamente humano que se une específicamente al polisacárido de la superficie bacteriana poli-N-acetil glucosamina (PNAG) y un anticuerpo monoclonal humanizado que se une específicamente a la glicoproteína transmembrana CD38.

La tabla siguiente muestra el rendimiento global y la pureza obtenidos después de la purificación de estos tres anticuerpos.

El rendimiento global corresponde al rendimiento antes de las etapas de nanofiltración, u Itrafiltración y diafiltración.

El mAb 13C3 humanizado purificado y el mAb anti-PNAG purificado se administraron a humanos en el marco de ensayos clínicos.

En conclusión, se ha confirmado con tres anticuerpos diferentes que el método de purificación en dos etapas permite obtener buenos rendimientos de los anticuerpos purificados con un grado de pureza excelente teniendo los anticuerpos purificados una calidad adecuada para administración al ser humano.

Ejemplo 7: Proceso de purificación "un lote un día" La purificación a gran escala también puede usar el uso de una columna de Proteína A unida a una columna multimodal, pasando el eluyente de proteína cruda obtenido al final de la primera etapa cromatográfica directamente sobre la segunda columna de cromatografía (ver la Figura 3). Algunos de los beneficios de usar el proceso para la purificación a gran escala son que no son necesarias más diluciones, ajustes de pH o almacenamiento. Además, este método permite una carga rápida de preparaciones de anticuerpo crudo. El método de purificación de anticuerpos a gran escala se usó para la purificación de un lote de 340 g de mAb durante un periodo de 7 horas, 30 minutos (ver la Figura 4). El método de purificación resultó en un rendimiento del 98% (332/340 g) y una pureza del 96.9% (ver la Figura 5). Además, la eliminación de contaminantes usando el método estuvo en un nivel similar al observado con los métodos de purificación convencionales.

Los métodos de purificación a gran escala descritos anteriormente pueden usarse para cumplir con los objetivos de preparaciones de anticuerpo mayores y más eficaces para uso, por ejemplo, en ensayos pre-clínicos y clínicos.

Más específicamente, este proceso que se denomina "Un lote un día" se aplicó a una purificación a gran escala del mAb 13C3 humanizado. El objetivo fue purificar un lote completo de 200 I sólo en un día, mediante 2 etapas de cromatografía sin etapa de almacenamiento, fase abierta, dilución/ajuste.

Los amortiguadores se prepararon como se muestra en la Figura 6.

Para la primera etapa de cromatografía, la parte recogida principal (179 I) se dividió en 4 alícuotas y se cargó en una columna de 3.1 I MabSelect Sure en 4 series. Todas las series se equilibraron con amortiguador B (20 mM NaCI, 20 mM Bis Tris pH7.4), se lavaron con amortiguador D (1M NaCI, 20 mM Bis Tris pH7.4), y se eluyeron con amortiguador C (20 mM NaCI, 20 mM Bis Tris pH 3.5). Cada elución se cargó directamente en una columna de 3.1 I Capto MMC. Antes de cada serie de carga, la columna se equilibró con amortiguador C (20 mM NaCI, 20 mM Bis Tris pH3.5), después de la carga, la columna se equilibró con amortiguador B (20 mM NaCI, 20 mM Bis Tris pH7.4) y el producto se eluyó con amortiguador A (200 mM NaCI, 20 mM Bis Tris pH8.2). El lote completo se purificó en un día laborable, de 7 am a 3 pm.

Después de estas dos etapas cromatográficas, todas las fracciones eluidas se pasaron a través de una membrana STIC antes de recogerse en bolsas de 50 I.

El volumen total cargado en la primera columna fue 179 I con una concentración de mAb de 1.61 g/l. El volumen total purificado fue 35.7 I con una titulación de mAb de 7.26 g/l. El rendimiento total fue 90%.

Habiendo descrito la invención con detalle y por referencia a modalidades específicas de ésta, será evidente que son posibles modificaciones y variaciones sin apartarse del alcance de la invención definido en las reivindicaciones adjuntas. Más específicamente, aunque algunos aspectos de la invención se identifican en la presente descripción como particularmente ventajosos, se contempla que la invención no está limitada necesariamente a estos aspectos particulares.

Cada referencia descrita y/o citada en la presente descripción se incorpora por referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para purificar una proteína de una solución que comprende: (a) una primera etapa de cromatografía que comprende: pasar dicha solución sobre una primera columna de cromatografía; eluir un eluyente de proteína cruda de la primera columna de cromatografía usando un primer amortiguador de elución; y (b) una segunda etapa de cromatografía que comprende: pasar el eluyente de proteína cruda obtenido al final de la etapa (a) sobre una segunda columna de cromatografía; recuperar la proteína purificada de la segunda columna de cromatografía usando un segundo amortiguador de elución en donde cada uno de los amortiguadores comprende Bis Tris.

2. El método de la reivindicación 1, en donde cada una de las dos etapas de cromatografía comprende: - pasar el amortiguador de equilibrio sobre la columna de cromatografía; pasar la solución o el eluyente de proteína cruda sobre la columna de cromatografía; pasar amortiguador de equilibrio sobre la columna de cromatografía; opcionalmente pasar el amortiguador de lavado y limpieza sobre la columna de cromatografía; opcionalmente pasar el amortiguador de equilibrio sobre la columna de cromatografía; eluir el eluyente de proteína cruda o recuperar la proteína purificada de la columna de cromatografía usando un amortiguador de elución, en donde cada uno de los amortiguadores comprende Bis Tris.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde cada uno de los amortiguadores consiste en concentraciones variables de los mismos químicos.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde cada uno de los amortiguadores consiste de Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el método para purificar una proteína de una solución sólo comprende dos etapas cromatográficas.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde una de las columnas de cromatografía es una columna de cromatografía de afinidad.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicha columna de cromatografía de afinidad es una columna de Proteína A.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde una de las columnas de cromatografía es una columna de cromatografía de resina multi-modal .

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la etapa (a) comprende además ajustar el pH del eluyente de proteína cruda usando una solución Bis Tris.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el pH se ajusta hasta un valor que comprende entre 6 y 7.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el eluyente de proteína cruda obtenido al final de la etapa (a) se pasa directamente sobre una segunda columna de cromatografía, sin ser sometido a ningún tratamiento como ajuste de pH, intercambio de amortiguadores o dilución.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho método comprende las etapas de: (a) una primera etapa de cromatografía que comprende: (i) pasar el amortiguador de equilibrio sobre una primera columna de cromatografía; (ii) pasar la solución sobre la primera columna de cromatografía; (iii) pasar el amortiguador de equilibrio sobre la primera columna de cromatografía; (iv) pasar el amortiguador de lavado y limpieza sobre la primera columna de cromatografía; (v) pasar el amortiguador de equilibrio sobre la primera columna de cromatografía; (vi) eluir un eluyente de proteína cruda de la primera columna de cromatografía usando un primer amortiguador de elución; y (vii) opcionalmente ajustar el pH del eluyente de proteína cruda usando una solución Bis Tris; y (b) una segunda etapa de cromatografía que comprende: (i) pasar el amortiguador de equilibrio sobre una segunda columna de cromatografía; (ii) pasar el eluyente de proteína cruda de la etapa (a) sobre la segunda columna de cromatografía; (Mi) pasar el amortiguador de equilibrio sobre la segunda columna de cromatografía; y (iv) recuperar la proteína purificada de la segunda columna de cromatografía usando un segundo amortiguador de elución.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la primera columna de cromatografía es una columna de cromatografía de afinidad.

14. El método de la reivindicación 13, en donde dicha columna de cromatografía de afinidad es una columna de Proteína A.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la segunda columna de cromatografía es una columna de cromatografía de resina multi-modal.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho método comprende las etapas de: (a) una primera etapa de cromatografía que comprende: (i) pasar el amortiguador de equilibrio sobre una primera columna de cromatografía; (ii) pasar la solución sobre la primera columna de cromatografía; (iii) pasar el amortiguador de equilibrio sobre la primera columna de cromatografía; (iv) eluir un eluyente de proteína cruda de la primera columna de cromatografía usando un primer amortiguador de elución; y (v) opcionalmente ajustar el pH del eluyente de proteína cruda usando una solución Bis Tris; y (b) una segunda etapa de cromatografía que comprende: (i) pasar el amortiguador de equilibrio sobre una segunda columna de cromatografía; (ii) pasar el eluyente de proteína cruda de la etapa (a) sobre la segunda columna de cromatografía; (iii) pasar el amortiguador de equilibrio sobre la segunda columna de cromatografía; (iv) pasar el amortiguador de lavado y limpieza sobre la segunda columna de cromatografía; (v) pasar el amortiguador de equilibrio sobre la segunda columna de cromatografía; y (vi) recuperar la proteína purificada de la segunda columna de cromatografía usando un segundo amortiguador de elución.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 16, en donde la primera columna de cromatografía es una columna de cromatografía de resina multi-modal.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, 16 y 17, en donde la segunda columna de cromatografía es una columna de cromatografía de afinidad.

19. El método de la reivindicación 18, en donde dicha columna de cromatografía de afinidad es una columna de Proteína A.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la proteína es un anticuerpo.

21. El método de la reivindicación 20, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

22. El método de la reivindicación 20 o 21, en donde dicho anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo que se une específicamente a la forma protofibrilar de la proteína ß-amiloide humana, un anticuerpo que se une específicamente al polisacárido de la superficie bacteriana poli-N-acetil glucosamina (PNAG), y un anticuerpo que se une específicamente a la glicoproteína transmembrana CD38.

23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que comprende además, después de la etapa (b), una etapa (c) de pasar el eluyente de proteína cruda sobre un adsorbente de membrana.

24. El método de la reivindicación 23, en donde dicho adsorbente de membrana es un adsorbente de membrana de cromatografía de interacción tolerante a la sal.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, que comprende además una etapa de nanofiltración después de la etapa (b) o (c).

26. El método de la reivindicación 25, que comprende además una etapa de ultrafiltracion y diafiltración después de la etapa de nanofiltración.

27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y 20 a 26, en donde el primer amortiguador de elución comprende 15 a 25 mM Bis Tris, y 15 a 25 mM NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 3 y 4 con ácido acético.

28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y 20 a 27, en donde el segundo amortiguador de elución comprende 15 a 25 mM Bis Tris, y 15 a 25 mM NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 4 y 5 con ácido acético.

29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y 20 a 27, en donde el segundo amortiguador de elución comprende 15 a 25 mM Bis Tris, y 150 a 250 mM NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 8 y 9 con ácido acético.

30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 16 a 26, en donde el primer amortiguador de elución comprende 15 a 25 mM Bis Tris, y 15 a 25 mM NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 4 y 5 con ácido acético.

31. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 16 a 26, en donde el primer amortiguador de elución comprende 15 a 25 mM Bis Tris, y 150 a 250 mM NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 8 y 9 con ácido acético.

32. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, 16 a 26, 30 y 31, en donde el segundo amortiguador de elución comprende 15 a 25 mM Bis Tris, y 15 a 25 mM NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 3 y 4 con ácido acético

33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 32, en donde el amortiguador de equilibrio comprende 15 a 25 mM Bis Tris, y 15 a 25 mM NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 7 y 8 con ácido acético.

34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 33, en donde el amortiguador de lavado y limpieza comprende 15 a 25 mM Bis Tris, y 0.9 a 1.1 mM NaCI, ajustado a un pH que comprende entre 7 y 8 con ácido acético.

35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en donde la proteína purificada se recupera con un rendimiento de al menos 85%.

36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, en donde la proteína purificada recuperada presenta una pureza de al menos 95%.

37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, que comprende además la etapa de formular la proteína purificada recuperada en una composición farmacéutica.

38. Un método para preparar amortiguadores adecuados para usarse en el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, que comprende las etapas de: i) crear una solución con una concentración final de 15 a 25 mM Bis Tris y de 15 a 25 mM NaCI; ii) ajustar el pH de la solución a un valor que comprende entre 7 y 8 con ácido acético; iii) recoger la mitad de la solución, obteniendo de esta manera un amortiguador de equilibrio; iv) ajustar el pH de la mitad restante de la solución de la etapa (iii) a un valor que comprende entre 4 y 5 con ácido acético; v) recoger la mitad de la solución obtenida en la etapa (iv), obteniendo de esta manera un amortiguador de elución. vi) ajustar el pH de la mitad restante de la solución de la etapa (v) a un valor que comprende entre 3 y 4 con ácido acético, obteniendo de esta manera un amortiguador de elución más. vii) recoger la mitad del amortiguador de equilibrio obtenido en la etapa (iii) y añadir NaCI para obtener una concentración final de NaCI comprendida entre 0.9 a 1.1 mM, obteniendo de esta manera un amortiguador de lavado y limpieza.

39. Un método para preparar amortiguadores adecuados para usarse en el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, que comprende las etapas de: i) crear una solución con una concentración final de 15 a 25 mM Bis Tris y de 15 a 25 mM NaCI; ii) ajustar el pH de la solución a un valor que comprende entre 8 y 9 con ácido acético; iii) recoger un cuarto de la solución, obteniendo de esta manera un amortiguador de elución; iv) ajustar el pH de la solución restante de la etapa (iii) a un valor que comprende entre 7 y 8 con ácido acético; v) recoger dos tercios de la solución obtenida en la etapa (iv), obteniendo de esta manera un amortiguador de equilibrio. vi) ajustar el pH de la solución restante de la etapa (v) a un valor que comprende entre 3 y 4 con ácido acético, obteniendo de esta manera un amortiguador de elución más. vii) recoger la mitad del amortiguador de equilibrio obtenido en la etapa (v) y añadir NaCI para obtener una concentración final de NaCI comprendida entre 0.9 a 1.1 mM (por ejemplo, 1M), obteniendo de esta manera un amortiguador de lavado y limpieza.

40. Un kit que comprende: (a) una columna de cromatografía de resina multi-modal y/o una columna de cromatografía de afinidad como una columna de Proteína A; y (b) y al menos un amortiguador que comprende o consiste en Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua.

41. Un kit que comprende: (a) una columna de cromatografía de resina multi-modal y/o una columna de cromatografía de afinidad como una columna de Proteína A; y (b) instrucciones para preparar al menos un amortiguador que comprende o consiste en Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua.

42. Uso de un amortiguador que comprende o consiste de Bis Tris, ácido acético, NaCI, y agua para purificar una proteína de una solución por al menos una etapa de cromatografía.

43. El uso de la reivindicación 42, en donde la etapa de cromatografía es una etapa de cromatografía de resina multi-modal y/o una columna de cromatografía de afinidad como una columna de Proteína A.