[go: up one dir, main page]

MX2013004581A - Composiciones y metodos para la prevencion y tratamiento de cancer. - Google Patents

Composiciones y metodos para la prevencion y tratamiento de cancer.

Info

Publication number
MX2013004581A
MX2013004581A MX2013004581A MX2013004581A MX2013004581A MX 2013004581 A MX2013004581 A MX 2013004581A MX 2013004581 A MX2013004581 A MX 2013004581A MX 2013004581 A MX2013004581 A MX 2013004581A MX 2013004581 A MX2013004581 A MX 2013004581A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
nanoparticle
antigen
mhc
lymphocytes
complex
Prior art date
Application number
MX2013004581A
Other languages
English (en)
Other versions
MX350203B (es
Inventor
Pere Santamaria
Original Assignee
Uti Limited Partnership
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Uti Limited Partnership filed Critical Uti Limited Partnership
Publication of MX2013004581A publication Critical patent/MX2013004581A/es
Publication of MX350203B publication Critical patent/MX350203B/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La inmunoterapia convencional del cáncer resulta deficiente para expandir eficientemente los linfocitos T que se dirigen específicamente a células cancerosas en números suficientes para reducir significativamente el tamaño del tumor o el número de células cancerosas in vivo. Para superar esta limitación, se proporcionan en la presente nanopartículas recubiertas con moléculas MHC Clase I y/o Clase II que presentan antígenos tumor-específicos y moléculas co-estimuladoras y su uso para expandir linfocitos T antígeno-específicos anti-tumorigénicos a niveles no alcanzados en las técnicas inmunoterapéuticas actuales. Estos linfocitos T antígeno-específicos y anti-tumorigénicos incluyen linfocitos T citotóxicos, linfocitos T efectores, linfocitos T de memoria, y linfocitos T auxiliares que son necesario para iniciar y mantener una respuesta inmunitaria sustancial contra células metastáticas o no metastáticas cancerosas, pre-cancerosas, o neoplásicas in vivo. La presente invención describe un procedimiento sistémico para dirigirse a células cancerosas o pre-cancerosas que son células en circulación, como en linfomas, células metastáticas migratorias, y tumores sólidos.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se dirige a composiciones y métodos relacionados con la inmunoterapia y la medicina. En particular, esta invención se relaciona con la terapéutica para la prevención y tratamiento del cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La inmunología del cáncer es un campo emergente en el área de la terapéutica del cáncer que tiene la intención de utilizar las defensas inmunitárias del propio cuerpo para dirigirse y eliminar las células cancerosas. La idea de utilizar el sistema inmunitario del propio cuerpo para atacar las células cancerosas tiene muchas ventajas con respecto a las terapias tradicionales que son sitio específicas, tales como la radiación y la cirugía, o con respecto a los métodos quimioterapéuticos que están asociados con efectos secundarios perjudiciales y de alta toxicidad.
Este campo avanzó significativamente mediante la identificación y caracterización de muchos antígenos tumor-específicos diferentes. Estos antígenos tumor-específicos son específicos para las células cancerosas por sí mismas. Si se pudiera iniciar una respuesta inmunitaria que se dirija a estos antigenos tumor-específicos, el cuerpo podría ser capaz de depurar efectivamente las células cancerosas por sí mismo. Sin embargo, las estrategias para inducir una inmunidad tumor-específica en pacientes de esta forma han sido muy poco exitosas. Los estudios sugieren que existen diversos factores que contribuyen al fracaso de las estrategias inmunoterapéuticas contra el cáncer actuales. En primer lugar, estas estrategias fracasan en expandir suficientemente los linfocitos T citotóxicos en ciruclación. En segundo lugar, los pacientes con cáncer con frecuencia están inmunosuprimidos y fracasan en producir las moléculas co-estimuladoras necesarias para iniciar una respuesta inmunitaria. Por lo tanto, un objetivo principal de inmunoterapia del cáncer ha sido generar un gran número de linfocitos T tumor-específicos de alta avidez que puedan atacar eficientemente a las células cancerosas in vivo.
La presente invención utiliza una nanopartícula recubierta con complejos de antígeno de MHC/tumor-especificos y moléculas co-estimuladoras . Este complejo único puede inducir una expansión de linfocitos T CD8+ en circulación en una cantidad que supere la de las inmunoterapias contra el cáncer actuales.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La inmunoterapia convencional del cáncer resulta deficiente para expandir eficientemente los linfocitos T que se dirigen específicamente a células cancerosas en números suficientes para reducir significativamente el tamaño del tumor. Se contempla que las partículas nanodimensionadas recubierta con moléculas de MHC clase I y/o clase II que prestan antígenos tumor-específicos y moléculas co-estimuladoras capaces de activar linfocitos T que no han recibido tratamiento previo que conducen a una expansión masiva de linfocitos T antigeno específicos anti-tumorigénicos capaces de diferenciarse en linfocitos T citotóxicos, linfocitos T efectores, linfocitos T de memoria y linfocitos T auxiliares que son necesarios para iniciar y mantener una respuesta inmunitaria sustancial contra células cancerosas, precancerosas o neoplásicas in vivo. La presente invención describe un procedimiento sistémico para dirigirse a células cancerosas, precancerosas o neoplásicas que están en las células en circulación, como en linfomas, células metastásicas migratorias y tumores sólidos. Esto está en contraste absoluto con las terapias que son sitio-específicas tales como radiación, cirugía y biopsia.
Los aspectos y modalidades de esta tecnología incluyen un método novedoso para prevenir o tratar tumores y cáncer que comprende administrar a un sujeto un complejo de moléculas antigeno/MHC/co-estimuladoras acopladas funcionalmente a una nanoparticula en una cantidad suficiente para expandir los linfocitos T anti-tumorigénicos . Tradicionalmente, las inmunoterapias que se dirigen a tumores y cáncer han sido poco exitosas en la expansión de linfocitos T en números suficientes para tratar efectivamente a pacientes con células cancerosas y/o tumores. Los aspectos de la presente invención se relacionan con complejos novedosos que, inesperadamente, son capaces de expandir poblaciones de linfocitos T anti-tumorigénicos a niveles no alcanzados tradicionalmente con otras inmunoterapias.
Ciertas modalidades de la presente invención se relacionan con un método de inhibir el crecimiento de tumores y prevenir o tratar el cáncer, que comprende administrar a un sujeto un complejo de moléculas antigeno/MHC/co-estimuladoras acoplados funcionalmente a una nanoparticula a un sujeto en una cantidad suficiente para expandir linfocitos T anti- tumorigénicos, en donde el método comprende además administrar los complejos de antigenos/MHC/nanoparticulas en una cantidad suficiente para activar y/o expandir las células de memoria anti-tumorigénicas preexistentes. Se contempla que la administración de los complejos de antigenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanoparticulas a un paciente diferenciarán los linfocitos T que no han recibido tratamiento previo en diferentes tipos de poblaciones de linfocitos T antigeno-especifico anti-tumorigénicos . Como tales, una de estas poblaciones será linfocitos T de memoria antigeno-especificos anti-tumorigénicos. Se contempla además- que la posterior administración de los complejos de antigeno/MHC/nanoparticulas sin moléculas co-estimuladoras puede activar las células de memoria antigeno-especificas anti-tumorigénicas .
En un aspecto adicional, esta descripción proporciona un método para activar células de memoria antigeno-especifica anti-tumorigénico en un paciente que necesita del mismo al administrar una cantidad efectiva de un complejo de antigenos/MHC/moléculas co-estimuladoras acoplado funcionalmente a una nanoparticula .
Todavía una modalidad adicional, la invención incluye métodos para diagnosticar el cáncer que comprenden evaluar la expansión inducida por el tratamiento de las respuestas de los linfocitos T CD8+ o CD4+ anti-tumorigénico como una indicación de la inmunidad activa.
Otro aspecto se relaciona con un método para inhibir la metástasis de un cáncer en un paciente, el método comprende administrar a un sujeto un complejo de antigenos/MHC/moléculas co-estimuladoras acoplado funcionalmente a una nanoparticula a un sujeto en una cantidad suficiente para expandir la población de linfocitos T antigeno-especifico anti-tumorigénico en donde la población expandida es suficiente para tratar el cáncer, en donde el antigeno es especifico para el tumor en donde la administración proporciona la circulación sistémica del complejo en el paciente.
Las modalidades adicionales de la invención incluyen los métodos para expandir los linfocitos T antigeno-específicos anti-tumorigénicos que comprenden administrar a un sujeto o a las células in vitro un complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas en una cantidad suficiente para estimular la expansión de un linfocito T antígeno-específico anti-tumorigénico. En ciertos aspectos el linfocito T es un linfocito T CD8+ o un CD4+ o un linfocito NKT. En aspectos adicionales de la invención, el linfocito T es un linfocito T de memoria CD8+ o CD4+. Todavía en aspectos adicionales de la invención, el linfocito T es un linfocito T CD8+ citotóxico o un linfocitos T CD4+ auxiliar.
Ciertas modalidades de la presente invención se relacionan con los métodos para expandir y/o desarrollar selectivamente poblaciones de linfocitos T antígeno- específicos anti-tumorigénicos en un sujeto el método comprende administrar al sujeto un complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas en donde el complejo se administra en una cantidad y frecuencia suficientes para expandir las poblaciones. Por lo tanto, la presente invención puede iniciar y mantener una respuesta inmunitaria que reduzca o elimine el desarrollo de células cancerosas y precancerosas in vivo. Como tal, la presente invención puede expandir linfocitos T deseables, tales como linfocitos T que reconozcan los antigenos tumorales, para prevenir, tratar o mejorar enfermedades asociadas con el desarrollo de tumores.
La presente invención se dirige a destinar células en el cuerpo de una forma antigeno-especifica. Los antigenos tumor-especificos son bien conocidos en la técnica y se describen en diversas referencias, por ejemplo, por Dranoff, G. ("Targets of Protective Tumor Immunity." (2009) Cáncer Vaccines: Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174:74-80), y patentes de los Estados Unidos 7795224, 7812116, 7785801, que se incorporan en la presente como referencia. La tecnología no se limita a ciertos antígenos, y las técnicas para identificar los antígenos tumor-específicos son bien conocidas en este campo y se han descrito con anterioridad, por ejemplo, por Schlichtholz et al. ("The immune response to p53 in breast cáncer patients is directed against immunodominant epitopes unrelated te the mutational hot spot." Cáncer Res 1992; 52:6380-4), De Plaen E et al. ("Immunogenic (tum-) variants of mouse tumor P815: cloning of the gene of tum-antigen P91A and identification of the tum-mutation . " Proc Nati Acad Sci USA 1988; 85:2274-8), y Sahin U. et al. ("Human neoplasms elicit múltiple specific immune responses in the autologous host." Proc Nati Acad Sci USA 1995; 92: 11810-3) que se incorporan en la presente como referencia. De esta forma, sin estar vinculados por la teoría, esta tecnología inicia una respuesta inmunitaria contra cualesquiera células en el cuerpo que se caracterizan por tener un antígeno específico. Como tal, la presente invención no se limita a una secuencia de antígenos específicos, aunque se puede dirigir a cualquier secuencia de antígenos que se encuentre será única para una célula enferma en el cuerpo.
Las modalidades de la invención se dirigen a métodos para diagnosticar, prevenir o tratar el desarrollo de tumores que comprenden administrar un complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas a un sujeto en una cantidad suficiente para expandir los linfocitos T de antígeno-específieos anti-tumorigénicos . En general y en el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "un antígeno" incluye, de manera enunciativa todos o una porción de un péptido, ácido nucleico, carbohidrato, lípido u otra molécula o compuesto que pueda modular la actividad de los linfocitos T o las poblaciones de linfocitos T, cuando en el contexto de una molécula de MHC o similar a HC se acopla a un sustrato. En algunos aspectos de esta invención, la nanoparticula es bioabsorbible de tal forma que evite la acumulación a largo plazo de las nanoparticulas in vivo sin ninguna toxicidad acompañante que surja de la misma.
Las modalidades de la invención para utilizarse en los métodos descritos incluyen partículas que comprende una nanoparticula acoplada a un complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras . El complejo de antígenos/ HC/moléculas co-estimuladoras puede estar acoplado directamente a esta nanoparticula o vía un ligador. Una nanoparticula puede comprender diversas capas, que a su vez pueden comprender múltiples componentes (por ejemplo, un núcleo metálico con una cobertura o un forro de otras moléculas que se puede acoplar más fácilmente al complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras tal como estreptavidina o avidina u otras moléculas conocidas utilizadas para unir porciones a nanoparticulas) . En ciertos aspectos, una nanoparticula comprende uno o más de un material seleccionado del grupo que consiste, por ejemplo, de seleniuro de cadmio, titanio, dióxido de titanio, estaño, óxido de estaño, silicio, dióxido de silicio, hierro, óxido de hierro III, plata, níquel, oro, cobre, aluminio, acero, aleación de cobalto-cromo, aleación de titanio, brushita, fosfato tricálcico, alúmina, sílice, zirconia, diamante, poliestireno, silicona, caucho, policarbonato, poliuretano, polipropileno, polimetilmetacrilato, cloruro de polivinilo, poliésteres, poliéteres y polietileno, fosfato tricálcico, cromo, galio, así como polímeros biocompatibles , bioabsorbibles, tales como PGLA, PLLA, PGA, PDLLA, PCL, PDLGA, PLDLA, PLC (todos están disponibles de Zeus, 3737 Industrial Blvd, Orangeburg, SC, 29118 USA con el nombre AbsorvMR) , ácido hilaurínico, alginato, polihidroxialcanoatos y lo semejante. En aspectos adicionales, una nanoparticula biocompatible, bioabsorbible comprende uno o más de una nanopartícula metálica o magnetizable o superparamagnética . La nanopartículas bioabsorbible, biocompatible, además puede comprender uno o más de un recubrimiento biodegradable formado a partir de dextrano; poli (etilenglicol) ; poli (óxido de etileno) ; manitol; poli (hidroxalcanoato) s de la clase PHB- PHV; y otros poli ( sacáridos ) modificados tales como almidón, celulosa y quitosán.
Ciertos aspectos de la invención incluyen métodos y composiciones que comprenden composiciones antigénicas, las cuales a su vez comprenden uno o más segmentos, fragmentos o epítopes de polipéptidos , péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y otras moléculas que provocan o inducen una respuesta antigénica o inraunitaria, en general denominada como antigenos.
En ciertos aspectos el complejo de antígenos/MHC y la molécula co-estimuladora pueden estar reticulados (conjugado) con las nanopartículas descritas en la presente utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Un ejemplo no limitante de este método para conjugar una nanopartícula con un complejo de antígenos/MHC y una molécula co-estimuladora incluye (a) hacer reaccionar un complejo de antígenos/MHC y la molécula co-estimuladora con un agente de conjugación, formando con esto un complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras; y (b) hacer reaccionar una nanopartícula con el complejo del paso (a). Otro ejemplo de este método para conjugar una nanopartícula con un complejo de antígenos/MHC y la molécula co-estimuladora incluye (a) hacer reaccionar un complejo de antígenos/MHC y una molécula co-estimuladora con un agente de conjugación por separado, formando con esto un complejo de antígenos/MHC y un complejo de moléculas co-estimuladoras; y (b) hacer reaccionar una nanopartícula con los complejos del paso (a) de tal forma que el complejo de antígenos/MHC y la molécula co-estimuladora se separen unidos a la nanopartícula. En una modalidad, el método comprende concentrar el complejo del paso (a) antes de realizar el paso (b) . En otra modalidad, el agente de conjugación comprende un agente heterobifuncional . Todavía en otra modalidad, el agente de conjugación comprende DOTA-maleimida (4-maleimidobutiramidobencil-DOTA) , SMTP (4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a- ( 2-piridilditio) tolueno-) , sulfo-LC-SMPT ( sulfosuccinimidil-6- (a-metil-a- (2-piridiltio) toluamido) hexanoato, reactivo de Traut (2-Iminotiolano-HCl) o cualquier combinación de los mismos. Véanse, la publicación de patentes de los Estados Unidos Nos. 20070059775; las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,671,958; 4,659,839; 4,414,148; 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; 4,589,071; 7,186,814 y 5543391 la solicitud de patente Europea No. 188,256 para un análisis de los complejos de conjugación con microparticulas o ' nanopartículas, la descripción de las mismas se incorporan en la presente como referencia .
En ciertas modalidades el complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras se prepara al reticular primero la molécula co-estimuladora con una nanoparticula. En este caso, la descripción también proporciona el intermediario que comprende una nanoparticula y una molécula co-estimuladora acoplada a la nanoparticula.
Los tumores cancerosos, precancerosos , y/o las condiciones neoplásicas tratadas mediante los métodos y composiciones de esta descripción no se limitan a ninguna célula especifica o tipo de tumor o cáncer especifico aunque incluyen cualquiera de estos (por ejemplo, cáncer) en el cual está presente un antigeno tumor-especifico en las células, tales como las células cancerosas. En ciertos aspectos, un componente peptidico de un complejo de antigenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanoparticulas se deriva o se diseña a partir de un antigeno o un epitope antigénico, o un imitador de los mismos que se expresa o está presente en tumores células cancerosas, precancerosas o neoplásicas. Para una variedad de cánceres se han identificado diversas de estas proteínas o epitopes.
Todavía en aspectos adicionales de esta invención, el componente de MHC del complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas es un componente polipeptídico de MHC clásico o no clásico clase I o MHC clase II. El componente de MHC clase I puede comprender la totalidad o una porción de una molécula HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, en particular la totalidad o una porción de una molécula HLA-A, tal como una molécula de MHC clase I HLA-A*0201. El componente de MHC clase I no clásico puede comprender moléculas similares a CD1. Un componente de MHC clase II puede comprender la totalidad o una porción de un HLA-DR, HLA-DQ o HLA-DP. En ciertos aspectos, el complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras está acoplado covalente o no covalentemente o unido a un sustrato (complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanoparticulas ) .
Las moléculas co-estimuladoras son moléculas que producen una señal secundaria in vivo que sirve para activar los linfocitos T que no han recibido tratamiento previo en linfocitos T antígeno-específieos capaces de producir una respuesta inmunitaria a células que poseen el antígeno específico. En las técnicas son bien conocidas diversas moléculas co-estimuladoras, y la presente invención no se limita a una molécula específica co-estimuladora. Algunos ejemplos de moléculas co-estimuladoras son B7.1, 4-IBBL, CD40, IL-15/IL-15Ra CD28, CD80, CD86 y ICOS. En algunas modalidades, sólo una molécula co-estimuladora específica se acopla a una nanopartícula . En otra modalidad, una variedad de diferentes moléculas co-estimuladoras se acoplan a la misma nanopartícula. En ciertas modalidades la molécula co-estimuladora es una proteína tal como un anticuerpo que sea capaz de agonizar un receptor co-estimulador en un linfocito T. En este caso, el anticuerpo es capaz de inducir una señal co-estímuladora que sea necesaria para activar los linfocitos T e inducir una respuesta inmunitaria de una forma antígeno- específica .
El sustrato típicamente es una nanopartícula. Un aspecto decisivo de la presente invención es la nanopartícula de nanodimensionada . En una modalidad la nanopartícula está entre aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 100 nm de diámetro. De preferencia, la nanopartícula está entre aproximadamente 5 nm hasta aproximadamente 15 nm de diámetro. En otra modalidad el diámetro de la nanopartícula está entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 25 nm, o aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 50 nm, o aproximadamente 2 hasta aproximadamente 25 nm o aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 10 nm, o aproximadamente 10 nm hasta aproximadamente 20 nm o aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 30 nm. En una modalidad, la nanopartícula comprende un metal, tal como hierro u óxido de hierro. En otra modalidad, la nanopartícula comprende un polímero biocompatible, bioabsorbible . En ciertas modalidades, la nanopartícula experimenta biosorción in vivo de tal forma que se limite la acumulación de las nanopartículas in vivo. Los péptidos de la invención se pueden acoplar químicamente a un sustrato y en particular se pueden acoplar vía un químico o un ligador de peptídico. Las moléculas CDl son un ejemplo de una molécula de HC no clásico. Las moléculas de MHC no clásico se caracterizan como no polimórficas , conservadas entre las especies y que poseen bolsas de unión a ligandos estrechas, profundas, hidrofóbicas . Estas bolsas de unión tienen la capacidad de presentar glucolipidos y fosfolipidos para linfocitos T citoliticos (NKT) . Los linfocitos NKT representan una población única de linfocitos que co-expresa marcadores de células NK y un receptor semi-invariantes de linfocitos T (TCR) . Los mismos están implicados en la regulación de las respuestas in unitarias asociadas con una amplia gama de enfermedades .
En ciertos aspectos, el complejo de antigenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanoparticulas no es necesario que se administre con un adyuvante para inducir una respuesta inmune, por ejemplo, una respuesta a anticuerpos. En modalidades particulares, la composición de antigenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas se puede utilizar junto con otras técnicas terapéuticas que induzcan una respuesta a anticuerpos dirigida a células cancerosas .
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se podrá comprender mejor al hacer referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades especificas presentadas en la presente.
La figura 1 , representa una imagen TEM representativa. Las GNP (nanoparticulas de oro) recubiertas con pMHC (14 nm) están concentradas a altas densidades (~5Xl013/ml) y están monodispersas . Mag: 50,OOOX.
La figura 2, representa los efectos de la dosis de pMHC (GNP) y la valencia de pMHC sobre las propiedades agonistas de las GNP recubiertas con pMHC. La figura compara las cantidades de IFNy secretado por los linfocitos T 8.3-CD8+ cognados en respuesta a dos muestras de p HC-GNP diferentes (ambas que consisten de -2X1013 GNP de 14 nm de diámetro/ml) . Au-022410 y Au-21910 portan -250 y -120 pMHCs/PIB, respectivamente. Au-011810-C portan -120 de pMHCs/GNP control .
La figura 3, representa el efecto del tamaño sobre la actividad agonista. Au-022410 fueron GNP 14 nm recubiertas con una valencia de pMHC relativamente baja aunque preparada a una alta densidad; Au-032310 fueron GNP de 40 nm recubiertas con una valencia de pMHC alta aunque a una densidad baja. Au-022410 tuvo una actividad agonista superior que la de la muestra de Au-032310. Au-032310-C fueron NP recubiertas con TU /Kd (pMHC de control negativo) .
La figura 4, muestra el efecto de los PEG protectores sobre la función de los pMHC-GNP. Au-021910 consistió de ~2xl013 GNP de 14 nra de diámetro/ml protegidas por 2 kD tiol-PEG y recubiertas con -120 pMHCs/GNP. Au-011810 GNP (también ~2xl013 de 14 nm GNP/ml) estuvieron protegidas por 5 kD tiol-PEG y estuvieron recubiertas con -175 pMHCs/PIB. La muestra Au-021910 claramente tuvo una actividad agonista superior.
La figura 5 , representa la expansión in vivo de linfocitos T CD8+ auto-reguladores cognados mediante las IG 206-2i4-Kd-GNP recubiertas direccionalmente . El % promedio de los linfocitos T CD8+ en la sangre o los órganos linfoides (ganglios linfáticos pancreáticos o mesentéricos -PLN y MLN, respectivamente-) que unen los tetrámeros IGRP206-2i4~Kd (ratones n = 3) . Los pMHC-GNP control fueron GNP preparados de la misma forma aunque recubiertos con un complejo de pMHC de enfermedad irrelevante (TUM/Kd) .
La figura 6, representa la expansión masiva de los linfocitos T CD8+ cognados en ratones tratados con las NP recubiertas con pMHC. Panel superior: Perfil de un ratón sacrificado después de 4 dosis. Panel inferior: Perfil de dos ratones diferentes después de 10 inyecciones (sólo sangre; vivos al momento de esta presentación) .
La figura 7, muestra 30,000x y 40,000x de aumento de las nanoparticulas de pMHC conjugadas con Fe304 (IGRP/anti- CD28-SFPE-080411) en PBS. Las nanoparticulas de hierro (SFPE- 072611) tienen un tamaño de núcleo de 9.4nm. La concentración de pMHC es 380 µg/mL según se mide mediante Dot-ELISA. La concentración de anti-CD28 es 124 g/mL según se mide mediante Dot-ELISA. La concentración de Fe es de 700 mg/mL (3.5 X 1014 pMHC-FePs/mL) . La valencia de pMHC es 13 pMHCs/NP según se mide mediante Dot-ELISA. La valencia de anti-CD28 es 1.4 IgG/NP según se mide mediante dot-ELISA.
La figura 8, muestra 30,000x y 40,000x de aumento de las nanoparticulas de pMHC conjugadas con Fe30 (IGRP-IETcc-080411) en PBS. Las nanoparticulas de hierro (SFPE-072611) tienen un tamaño de núcleo de 9.4nm. La concentración de pMHC es 340 g/mL según se mide mediante Dot-ELISA. La concentración de Fe es 500 ug/mL (2.5 X 1014 pMHC-FeNPs/mL) . La valencia pMHC es 16 pMHCs/NP según se mide mediante Dot-ELISA.
Las figuras 9A, 9B y 9C, muestran un análisis en gel de agarosa y natural de las nanoparticulas de pMHC conjugadas con SFPE. En las figuras 9A y 9B se muestran los geles de agarosa antes de tinción con azul coomassie (figura 9A) y después de la tinción con azul coomassie (figura 9B) cargados en las lineas 1-5 con: 4 µg de pMHC (linea 1), 2 µg de pMHC (linea 2), 10 µ? de SFPE-080311 (linea 3), 20 µ? pMHC/anti-CD28-SFPE-080411 (linea 4) y 20 µ? de pMHC-SFPE- 080411 (linea 5) . La figura 9C representa un gel natural cargado con 4 de pMHC (linea 1), 2 pg de pMHC (línea 2), 4 µg de anti-CD28 (línea 3), 2 g de anti-CD28 (línea 4), 18 µ? de p HC-SFPE-080411 (línea 5), 18 µ? pMHC/anti-CD28-SFPE-0080411 (línea 6) y 10 µ? del SFPE-080311 (línea 7).
Las figuras 10A y 10B, muestran las respuestas a IFN-? y proliferativas de 8.3 células a las pMHC conjugadas con SFPE-NP. La figura 10A representa la respuesta a IFN-? (Interferón, panel izquierdo) y proliferativa (CPM, panel derecho) de pMHC-SFPE-080411. La figura 10B representa la respuesta a IFN-? (Interferón, panel izquierdo) y proliferativa (CPM, panel derecho) de pMHC/anti-CD28-SFPE-080411.
Las figuras 11A y 11B, muestran la proteina y secuencias de ADN de la estructura mB .1-hFcAA. Las secuencias de componentes individuales en la proteína de fusión se resaltan de la siguiente forma: la secuencia guía de proteínas HA está en una casilla blanca, la secuencia de proteínas mB7.1 está subrayada, la secuencia de proteínas del fragmento hFcAA está sombreada en gris, las secuencias de proteínas para biotinilación con BirA está encuadrada con líneas diagonales y el sitio de unión de FcR mutado (LL a AA) dentro de la región CH2 está marcado con asteriscos (A* A*).
La figura 12 , muestra las respuestas proliferativas de los linfocitos T CD4+ para la proteina de fusión mB7.1-hFc en presencia de una concentración sub-óptima del anti-CD3 (0.5 mg/mL) . Esta figura demuestra que la proteina de fusión mB7.1-hFc según se diseñó puede suministrar efectivamente una señal co-estimuladora de los linfocitos T TCR-estimulados .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se debe entender que esta invención no se limita a las modalidades particulares descritas, por supuesto, como tales, pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en la presente tiene el fin de describir sólo las modalidades particulares y no pretende ser limitante, debido a que el alcance de la presente invención se limitará únicamente por las reivindicaciones anexadas.
Se debe observar que en el sentido en el que se utiliza en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "uno", "una" y "el" incluyen referencias al plural a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. De esta forma, por ejemplo, la referencia a un "excipiente" incluye una pluralidad de excipientes.
I . Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien con experiencia normal en la técnica a la cual pertenece esta invención. En el sentido en el que se utilizan en la presente, los siguientes términos tienen los siguientes significados .
En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "que comprende" o "comprende" pretende dar a entender que las composiciones y métodos incluyen los elementos mencionados, aunque no excluyen otros. "Que consiste esencialmente de" cuando se utiliza para definir las composiciones y métodos, se debe entender que incluye otros elementos de cualquier significancia esencial para la combinación del propósito establecido. De esta forma, una composición que consiste esencialmente de los elementos según se definen en la presente podrían excluir otros materiales o pasos que no afecten materialmente las características básicas y novedosas de la invención reivindicada. "Que consiste de" debe entenderse que excluyen más que los elementos traza de otros ingredientes y los pasos sustanciales del método. Las modalidades definidas por cada uno de estos términos de transición quedan dentro del alcance de esta invención.
Por "biocompatible", se debe entender que los componentes del sistema de suministro no provocarán lesión a tejidos o lesión al sistema biológico humano. Para impartir una biocompatibilidad, los polímeros y excipientes que hayan tenido un historial de uso seguro en seres humanos o con el estado GRAS (en general aceptado como seguro) , de preferencia se utilizarán. Por biocompatibilidad, se debe entender que los ingredientes y excipientes utilizados en la composición por último serán "bioabsorbidos" o aclarados por el cuerpo sin efectos adversos para el cuerpo. Para que una composición que será biocompatible, y se considerará como no tóxica, ésta no debe provocar toxicidad a las células. Similarmente, el término "bioabsorbible" se refiere a nanopartículas preparadas a partir de materiales que experimenten bioabsorción in vivo durante un periodo de tiempo de tal forma que se evite la acumulación a largo plazo del material en el paciente. En una modalidad preferida, la nanopartícula biocompatible se bioabsorbe durante un período menor de 2 años, de preferencia menor de 1 año e incluso de mayor preferencia menor de 6 meses. La velocidad de bioabsorción se relaciona con el tamaño de la partícula, el material utilizado y otros factores bien reconocidos por el experto. Una mezcla de materiales bioabsorbibles, biocompatibles se puede utilizar para formar las nanopartículas utilizadas en esta invención. En una modalidad, el óxido de hierro (III) y un polímero biocompatible, bioabsorbible se pueden combinar. Por ejemplo, el óxido de hierro (III) y el PGLA se pueden combinar para formar una nanoparticula .
Un complejo de antigenos/ HC/moléculas co-estimuladoras/nanoparticulas se refiere a la presentación de un péptido, carbohidrato, lipido, u otro segmento antigénico, fragmento o epitope de una molécula antigénica o proteina sobre una superficie, tal como una nanoparticula. "Antigeno" en el sentido en el que se utiliza en la presente se refiere a la totalidad, porción, fragmento o segmento de una molécula que puede inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto o una expansión de los linfocitos T antigeno-especificos anti-tumorigénicos .
El término "molécula co-estimuladora" en el sentido en el que se utiliza en la presente se refiere a una molécula que puede producir una señal de co-estimulación que active un linfocito T que no ha recibido tratamiento previo. La activación total de los linfocitos T requiere al menos dos señales. La primera señal se proporciona por el antigeno mostrado por las células presentadoras de antigeno unidas al complejos del MHC. La segunda señal es la señal co- estimuladora. La señal es una señal agonista dirigida a los receptores co-estimuladores sobre los linfocitos T. La coestimulación de linfocito T es un componente decisivo para la proliferación, diferenciación y supervivencia de linfocitos T. La presente invención abarca moléculas capaces de producir una señal co-estimuladora . Como tal, la presente invención no se limita a una molécula co-estimuladora especifica. En algunos casos la molécula co-estimuladora es un anticuerpo capaz de convertir en agonista el receptor co-estimulador sobre el linfocito T.
El término "aproximadamente", cuando se utiliza antes una designación numérica, por ejemplo, temperatura, tiempo, cantidad y concentración, incluyendo variación, indica aproximaciones que pueden variar en ( +) o (-) 10%, 5% o 1%.
Por "exterminación" o "extermina" se debe entender que provoca muerte celular mediante apoptosis o necrosis. La apoptosis o necrosis puede estar mediada por cualquier trayectoria de muerte celular.
"Inmunocélulas" incluyen, por ejemplo, esplenocitos adultos, linfocitos T, linfocitos B y células de origen en la médula ósea, tales como las células defectuosas presentadoras de antigenos de un mamífero, que tienen actividad hacia el organismo del cual se deriva la inmunocélula.
Una "imitación" es un análogo de un ligando o péptido determinado, en donde el análogo es sustancialmente similar al ligando. "Sustancialmente similar" significa que el análogo tiene un perfil de unión similar al ligando excepto que la imitación tiene uno o más grupos funcionales o modificaciones que tomen en cuenta colectivamente menos de aproximadamente el 50%, menos de aproximadamente el 40%, menos de aproximadamente el 30%, menos de aproximadamente el 20%, menos de aproximadamente el 10% o menos de aproximadamente el 5% del peso molecular del ligando.
Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para alcanzar el fin pretendido, por ejemplo, la modulación de la actividad de linfocitos T o las poblaciones de linfocitos T. En el sentido en el que se describe en la presente en detalle, la cantidad efectiva, o dosificación y frecuencia de administración depende del fin y el antigeno y lo que se podrá determinar de acuerdo con la presente descripción .
Un "linfocito T antigeno-especifico anti- tumorigénico" o "linfocitos T anti-tumorigénico" es un linfocito T que está implicado en la respuesta inmunitaria dirigida al tratamiento de una enfermedad debida a células cancerosas, células precancerosas , células neoplásicas o para desarrollar tumores. Se contempla que administrar antigenos tumor-especificos covalentemente unidos a los complejos de MHC/moléculas co-estimuladoras/nanoparticulas a pacientes que padecen o están en riesgo de padecer de un tumor en desarrollo serán linfocitos T naturales diferenciados en linfocitos T capaces de experimentar una respuesta inmunitaria que se dirija a células cancerosas que posean el antigeno tumor-especificos . Estas células cancerosas no es necesario que estén en la forma de un tumor sólido, aunque pueden estar circulando en la sangre, como en las células linfáticas cancerosas o migrar a través del cuerpo, como en el caso de las células metastásicas . Las linfocitos T anti-tumorigénicos específicos expandidos mediante este método incluyen de manera enunciativa linfocitos T CD4+ y CD8+ de memoria anti-tumorigénicos, linfocitos T CD8+ citotóxicos anti-tumorigénicos y linfocitos T auxiliares CD4+ tumorigénicos .
Los términos "inhibir", "reducir" o "prevención" o cualquiera variación de estos términos cuando se utilizan en las reivindicaciones y/o la especificación incluyen cualquier disminución mensurable o la inhibición completa para alcanzar un resultado deseado. El término prevenir, según se relacione al cáncer, tiene la intención de una prevención de la progresión de un estado precanceroso a un estado canceroso.
El término "célula cancerosa" se refiere a una celda que exhibe una o más características o sellos de cáncer. Estos sellos de cáncer incluyen la autosuficiencia en señales de crecimiento, la insensibilidad a las señales inhibidoras del crecimiento (anti-crecimiento) , la evasión de la muerte celular programada (apoptosis) , potencial replicativo sin límite, angiogénesis sostenida e invasión de tejidos y metástasis. Cada uno de estos cambios fisiológicos —las capacidades novedosas obtenidas durante el desarrollo del tumor— representa la ruptura exitosa de un mecanismo de defensa anti-cáncer conectado permanentemente en células y tej idos .
El término neoplásico, se refiere a una masa anormal de tejido, como resultado de la neoplasia. La neoplasia es la proliferación anormal de células. El crecimiento de células neoplásicas excede y no está coordinado con el de los tejidos normales alrededor del mismo. El crecimiento persiste de la misma forma excesiva incluso después de la terminación de los estímulos. Los neoplasmas pueden ser benignos, precancerosos o cancerosos. En una modalidad, las composiciones y métodos descritos en la presente se dirigen a células precancerosas o cancerosas. "Precancerosas" en el sentido en el que se describe en la presente, es una forma temprana de cáncer gue se define por la ausencia de invasión de células tumorales en el tejido circundante. Precancerosas también se refiere a displasia, que es la forma más temprana de la lesión precancerosa reconocible en una biopsia por parte de un patólogo.
El uso de la palabra "uno" o "una" cuando se utiliza junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar "uno", aunque también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno", y "uno o más de uno".
El término anti-tumorigénico" se refiere a células que tienen un efecto protector contra el desarrollo de tumores, neoplasia de células y cáncer. Por ejemplo, "linfocitos T CD8+ anti-tumorigénicos" o "linfocitos T CD4+ anti-tumorigénicos" se refiere a células que tienen un efecto protector contra el desarrollo de tumores, neoplasma y cáncer. Los "linfocitos T CD8+ anti-tumorigénicos" también se refieren a células que tienen un efecto protector contra otras enfermedades tales como aquellas listadas bajo la subsección V. titulada: blancos terapéuticos.
Por "nanopartícula" en la presente se debe entender pequeñas partículas discretas que se pueden administrar a un sujeto. En ciertas modalidades, las nanopartículas tienen formas sustancialmente esféricas. El término "sustancialmente esférica", en el sentido en el que se utiliza en la presente, significa que la forma de las partículas no se desvía de una esfera en más de aproximadamente el 10%. A las partículas se pueden aplicar diversos complejos antigénicos o peptídicos de la invención. La nanopartícula nanodimensionales es decisiva para esta invención, y las partículas de esta invención varían de tamaño entre aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 100 nm de diámetro y, de preferencia, de aproximadamente 5 nm hasta aproximadamente 15 nm de diámetro. En algunas modalidades de esta invención la nanoparticula está entre aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 25 nm de diámetro, entre aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 50 nm de diámetro, o entre aproximadamente 5 nm hasta aproximadamente 10 nm de diámetro. Se pueden obtener partículas nanodimensionadas más pequeñas, por ejemplo, la fraccionación mediante la cual se permite que partículas mayores se asienten en una solución acuosa. La porción superior de la solución luego se recupera. Esta porción superior está enriquecida en partículas de tamaño más pequeño. El proceso se puede repetir hasta que se genere un tamaño promedio deseado.
Los términos "células metastásicas" se refiere a células cancerosas que hayan obtenido la capacidad para migrar de la lesión tumoral primaria u original hacia tejidos circundantes y/o hayan obtenido la capacidad para penetrar y las paredes de las células linfáticas o vasos sanguíneos y circular a través de la corriente sanguínea. El término "metástasis" en el sentido en el que se utiliza en la presente se refiere a la migración o diseminación de células cancerosas' desde una ubicación en el cuerpo hacia tejidos circundantes, el sistema linfático, o hacia los vasos sanguíneos. Cuando las células tumorales entran en metástasis, el nuevo tumor se denomina como un tumor metastásico .
El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para dar a entender "y/o" a menos que explícitamente se indique una referencia a solamente alternativas o las alternativas son mutuamente exclusivas, aunque la descripción soporte una definición que haga referencia a únicamente alternativas y "y/o".
En el sentido en el que se utiliza en la presente, los términos "agente inmunogénico" o "inmunógeno" o "antígeno" se utilizan indistintamente para describir una molécula con capacidad para inducir una respuesta inmunológica contra sí misma o la administración a un recipiente, ya sea sola, junto con un adyuvante, o presentada en un vehículo de muestreo.
En el sentido en el que se utiliza en la presente, una "amino-molécula" se refiere a cualquier aminoácido, derivado del aminoácido o imitación de aminoácido conocido en la técnica. En ciertas modalidades, los residuos de la molécula proteinácea son secuenciales, sin ninguna molécula que no sea amino que interrumpa la secuencia de los residuos de las amino-moléculas . En otras modalidades, la secuencia puede comprender una o más porciones de moléculas que no sean araino. En modalidades particulares, la secuencia de residuos de la molécula proteinácea puede estar interrumpida por una o más porciones de moléculas que no sean amino.
En el sentido en el que se utiliza la presente la frase "respuesta inmunitaria" o su equivalente "respuesta inmunológica" se refiere al desarrollo de una respuesta mediada por células (mediada por linfocitos T antigeno específicos o sus productos de secreción) dirigida contra un antígeno tumor-específico o un epítope relacionado de un antígeno tumor-específico. Se provoca una respuesta inmunitaria celular mediante la presentación de epitopes polipeptídicos en asociación con moléculas de MHC clase I o clase II, para activar los linfocitos T auxiliares CD4+ antígeno-específicos y/o los linfocitos T citotóxicos CD8+. La respuesta también puede implicar la activación de otros componentes .
Para los fines de esta especificación y las reivindicaciones anexas, los términos "epítope" y "determinante antigénico" se utilizan indistintamente para hacer referencia a un sitio sobre un antígeno al cual responden o reconocen los linfocitos B y/o T. Los epitopes de linfocitos B se pueden formar tanto de los aminoácidos contiguos o los aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por un plegamiento terciario de una proteína. Los epitopes formados a partir de aminoácidos contiguos típicamente se retienen sobre la exposición para desnaturalizar solventes, mientras que los epítopes formados mediante el plegamiento terciario típicamente se pierden en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epítope típicamente incluye al menos 3 y más usualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopes incluyen, por ejemplo, cristalografía mediante rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols (1996). Los linfocitos T reconocen los epítopes contiguos de aproximadamente nueve aminoácidos para las células CD8 o aproximadamente 13-15 aminoácidos para las células CD4. Los linfocitos T que reconocen el epítope se pueden identificar mediante análisis in vitro que miden la proliferación antígeno-dependiente, según se determina mediante la incorporación de 3H-timidina mediante los linfocitos T cebados en respuesta a un epítope (Burke et al., 1994), mediante el exterminio antígeno-dependiente (cytotoxic T lymphocyte assay, Tigges et al., 1996) o mediante la secreción de citoquinas. La presencia de una respuesta inmunologica mediada por células se puede determinar mediante análisis de proliferación (linfocitos T CD4+) o análisis CTL (linfocito T citotóxico) .
Opcionalmente, un antigeno o de preferencia un epitope de un antigeno, se puede conjugar químicamente, o expresar como, una proteina de fusión con otras proteínas, tales como las proteínas MHC y MHC relacionadas.
En el sentido en el que se utiliza la presente y en las reivindicaciones, los términos "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se utilizan indistintamente y hacen referencia a cualquiera de las diversas clases de proteínas relacionadas estructuralmente que funcionan como parte de la respuesta inmunitaria de un animal o recipiente, las proteínas incluyen IgG, IgD, igE, igA, Ig y las proteínas relacionadas.
Por consiguiente, el término "composición proteinácea" abarca las secuencias de amino-moléculas que comprenden al menos uno de los 20 aminoácidos comunes en las proteínas sintetizadas naturalmente, o al menos un aminoácido modificado o inusual.
En el sentido en el que¦ se utiliza en la presente, los términos "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente ya sea en referencia a un mamífero. En algunas modalidades, el paciente es un ser humano. En otras modalidades el paciente es un mamífero comúnmente utilizado en un laboratorio tal como un ratón, rata, simio, canino, felino, bovino, equino u ovina.
En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "tratamiento" o "tratar", significa cualquier tratamiento de una enfermedad o condición o un trastorno asociado, en un paciente, incluyendo: • inhibir la enfermedad o condición, es decir, detener o suprimir el desarrollo de los síntomas clínicos, tales como, caquexia en el cáncer; y/o • aliviar la enfermedad o condición es decir, provocar la regresión de los síntomas clínicos, por ejemplo, aumentando la supervivencia general y reduciendo la carga tumoral .
En algunos aspectos, el término tratar se refiere a una mejora en los efectos clínicos. El término "efecto clínico" se refiere a cualquier observación clínica o medición que se relacione con una reacción de un paciente a una terapia. Los ejemplos no limitantes de efectos clínicos incluyen respuesta al tumoral (TR) , supervivencia general (SG) , supervivencia libre de progresión (PFS) , supervivencia libre de la enfermedad, tiempo para la recurrencia del tumor (TTR) , tiempo para la progresión del tumor (TTP) , riesgo relativo (RR) , toxicidad o efecto secundario. "Supervivencia general" (OS) tiene la intención de una prolongación en la esperanza de vida en comparación con individuos o pacientes que no hayan recibido tratamiento previo o que estén sin tratar. "Supervivencia libre de progresión" (PFS) o "tiempo para la progresión de tumor" (TTP) indica el periodo de tiempo durante y después del tratamiento que el cáncer no creció. La supervivencia libre de progresión incluye la cantidad de tiempo de los pacientes que hayan experimentado una respuesta completa o una respuesta parcial, asi como la cantidad de tiempo que los pacientes hayan experimentado una enfermedad estable. "Recurrencia del tumor" en el sentido en el que se utiliza en la presente y como se define por el Instituto Nacional del Cáncer, es un cáncer que haya recurrido (regresado), por lo general después de un periodo de tiempo durante el cual el cáncer podría no ser detectado. El cáncer puede regresar al mismo lugar que el tumor original (primario) o a otro lugar en el cuerpo. También se denomina cáncer recurrente. "Tiempo para la recurrencia del tumor" (TTR) se define como el tiempo desde la fecha del diagnóstico del cáncer hasta la fecha de la primera recurrencia, muerte, o hasta el último contacto si el paciente estuvo libre de cualquier recurrencia de tumores en el tiempo del último contacto. Si un paciente no ha recurrido, entonces se censura el TTR en el momento de la muerte o en el último seguimiento. "Riesgo relativo" (RR) , en epidemiología estadística y matemáticas, se refiere al riesgo de un caso (o desarrollar una enfermedad) en relación a la exposición. Riesgo relativo es una proporción de la probabilidad del caso que se está presentando en el grupo expuesto contra un grupo no expuesto.
Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, mientras que indican modalidades específicas de la invención, se proporcionan sólo a manera de ilustración, debido a que diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención se harán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada .
Se contempla que las nanopartxculas recubiertas con complejos de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras (complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas ) expandirán las poblaciones de linfocitos T antígeno-específicos anti-tumorigénicos que se dirigen a células cancerosas. Se cree además que una de estas poblaciones tendrá linfocitos T de memoria antígeno- específicos anti-tumorigénicos. También se contempla que la posterior administración de los complejos de antígenos/MHC/nanopartículas sin moléculas co-estimuladoras se expandirá y/o activará la mezcla pre-existente de linfocitos T de memoria antígeno-específicos anti- tumorigénicos . Se contempla que esta tecnología expandirá los linfocitos T anti-tumorigénicos in vivo. En algunas modalidades entre aproximadamente 17% hasta aproximadamente 47% de todos los linfocitos T CD8+ en circulación son linfocitos T antígeno-específicos que resultan de la administración de nanopartículas recubiertas con los complejos de antígeno-MHC . Se contempla que la administración de nanopartículas recubiertas con complejos de antígenos/ HC/moléculas co-estimuladoras tumor-específicos a un paciente dará por resultado en una expansión de los linfocitos T CD8+ antígeno-especificos en circulación que son entre aproximadamente 5% hasta aproximadamente 90% de los linfocitos T totales en circulación, o entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 80%, o entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 50%, o entre aproximadamente 50% hasta aproximadamente 90%, o entre aproximadamente 20% hasta aproximadamente 50%, o entre aproximadamente 30% hasta aproximadamente 60%, o entre aproximadamente 35% hasta aproximadamente 65%, o entre aproximadamente 40% hasta aproximadamente 70%, o entre aproximadamente 45% hasta aproximadamente 75%, o entre aproximadamente 50% hasta aproximadamente 80%, o entre aproximadamente 25% hasta aproximadamente 55%.
II. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y ADMINISTRACIÓN La presente invención incluye los métodos para prevenir, mejorar, o tratar a pacientes que padecen de enfermedad asociada con células cancerosas, células neoplásicas, células metastásicas o que desarrollan tumores. Como tal, la invención contempla "vacunas" o modificadores del sistema inmunitario para utilizarse en diversas modalidades. Las composiciones propuestas que serán adecuadas para utilizarse como una vacuna se pueden preparar a partir de moléculas antigénicas tumor-específicas. La invención incluye composiciones y métodos para inducir o modificar una respuesta inmunitaria contra un antigeno tumor-especifico, por ejemplo, un polipéptido, un péptido, un carbohidrato, un lípido u otra molécula o fragmento molecular.
Un aspecto de la presente invención es un método para prevenir el crecimiento de células cancerosas en un paciente susceptible al crecimiento de célula cancerosa. Para ciertos tipos de cáncer, los antígenos tumor-específicos están bien caracterizados. En estos casos, un paciente en riesgo de desarrollar el cáncer se podría inmunizar con los complejos de antígeno/MHC/molécula co- estimuladora/nanopartículas que sean antígeno-específieos para el cáncer.
La administración de las composiciones de acuerdo con la invención típicamente serán vía cualquier ruta común. Esto incluye, de manera enunciativa, inyección parenteral, ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal o intravenosa. En ciertas modalidades, una composición de vacuna puede ser inhalada (por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6,651,655, que se incorpora específicamente como referencia en su totalidad) . Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales. Las formulaciones orales incluyen estos excipientes normalmente empleados como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y lo semejante. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen entre aproximadamente 10% hasta aproximadamente 95% del ingrediente activo, de preferencia entre aproximadamente 25% hasta aproximadamente 70%.
Típicamente, las composiciones de la invención se administran de una forma compatible con la formulación y frecuencia de la dosificación y en tal cantidad que será terapéuticamente efectiva e inmuno-modificante. La cantidad que será administrada depende del sujeto que será tratado.
Las cantidades precisas del ingrediente activo requeridas para ser administradas depende del juicio del médico. Sin embargo, las variaciones de dosificación adecuadas están en el orden de diez hasta varios cientos de nanogramos o microgramos del complejo de antigenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanoparticulas por administración. Los regímenes adecuados para una administración inicial y los refuerzos también son variables, aunque se tipifican mediante una administración inicial seguida por posteriores administraciones .
La forma de aplicación puede variar ampliamente. Son aplicables cualquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna. Se cree que estos incluyen la aplicación oral sobre una base fisiológicamente aceptable sólida o en una dispersión fisiológicamente aceptable, parenteralmente, mediante inyección y lo semejante. La dosificación del complejo del antígeno/MHC/co-estimuladoras nanopartículas dependerá de la vía de administración, la frecuencia de administración y variará de acuerdo con la talla y salud del sujeto.
En muchos casos, será conveniente tener múltiples administraciones de un complejo de péptidos/MHC/moléculas co- estimuladoras/nanopartículas, aproximadamente, a un máximo o al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. Las administraciones normalmente variarán de intervalos de 2 días hasta doce semanas, de manera más usual a intervalos de una a dos semanas. Los refuerzos periódicos a intervalos de 0.5-5 años, por lo general dos años, serán convenientes para mantener la condición del sistema inmunitario. El curso de la administración se puede seguir mediante análisis para respuestas inmunitarias y la actividad de linfocitos T para supervisar la terapia y tratamiento. Como tales, los métodos de la presente se pueden combinar con métodos conocidos para la supervisión de la terapia inmunitaria para proporcionar un curso de tratamiento al paciente hasta que alcance un punto final clínico deseado.
A. Terapia de combinación Las composiciones y métodos relacionados de la presente invención, en particular la administración de un complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas, también se puede utilizar en combinación con la administración de terapias tradicionales.
En un aspecto, se contempla que se utilice un complejo de antígenos/MHC/co-estimuladoras molécula/nanopartículas junto con un tratamiento con citoquinas. Alternativamente, la administración del complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas puede preceder o seguir al otro tratamiento a intervalos que varían de minutos hasta semanas. En las modalidades donde los otros agentes y/o los complejos de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas se administran por separado, en general se podría asegurar que un periodo significativo de tiempo no venza entre el tiempo de cada suministro, de tal forma que el agente y el complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas todavía podría ser capaz de ejercer un efecto combinado ventajosamente sobre el sujeto. En estos casos, se contempla que se puedan administrar ambas modalidades dentro de aproximadamente 12-24 horas entre si, y de mayor preferencia, dentro de aproximadamente 6-12 horas entre sí. En algunas situaciones, puede ser conveniente extender el periodo de tiempo para la administración significativamente, sin embargo, en un lapso de entre varios días (2, 3, 4, 5, 6 ó 7) o varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 8) entre las administraciones respectivas.
Se pueden emplear diversas combinaciones, por ejemplo la administración del complejo de antígenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas es "A" y el agente adicional es "B" : A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A/ B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A La administración de las composiciones del complejo de péptido-MHC-co-estimulantes de la presente invención a un paciente/sujeto seguirá los protocolos generales para la administración de estos compuestos, tomando en cuenta la toxicidad, en su caso. Se espera que los ciclos de tratamiento se puedan repetir según sea necesario. También se contempla que diversas terapias estándar, tales como hidratación, se pueden aplicar en combinación con la terapia descrita .
B. Composiciones farmacéuticas En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto. Diferentes aspectos de la presente invención implican administrar una cantidad efectiva de una composición del complejo de antigenos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanoparticulas a un sujeto adicionalmente . Adicionalmente, estas composiciones se pueden administrar en combinación con modificadores del sistema inmunitario. Estas composiciones en general se disolverán o dispersarán en un portador farmacéuticamente aceptable o medio acuoso.
Las frases "farmacéuticamente aceptables" o "farmacológicamente aceptable" se refieren a porciones moleculares y composiciones que no produzcan una reacción adversa alérgica u otra contraria cuando se administran a un animal, o ser humano. En el sentido en el que se utiliza la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera o la totalidad de solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos, agentes isotónicos y para retardar la absorción y lo semejante. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los ingredientes activos, se contempla su uso en composiciones inmunogénicas y terapéuticas.
Los compuestos activos de la presente invención se pueden formular para administración parenteral, por ejemplo, se pueden formular para inyección vía las rutas intravenosa, intramuscular, subcutánea, o incluso intraperitoneal . La preparación de una composición acuosa que contiene un complejo de antigenos/MHC/moléculas co- estimuladoras/nanopartículas que modifique la respuesta inmunitaria del sujeto será bien conocida por aquellos expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Típicamente, estas composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para utilizarse para preparar soluciones o suspensiones con la adición de un liquido antes de la inyección; y, las preparaciones también pueden estar emulsionadas.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; las formulaciones incluyen aceite de ajonjolí, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y los polvos estériles para la preparación extemporánea de las soluciones inyectables estériles o dispersiones. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida al grado en que se pueda inyectar fácilmente.
También debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos .
Las composiciones se pueden formular en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables, incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos aminos libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y lo semejante. Las sales formadas con los grupos carboxilo libre también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos y bases orgánicas tales como isopropilamina , trimetilamina , histidina, procaína y lo semejante.
El portador también puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y poli (etilenglicol) liquido y lo semejante) , las mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión, y mediante el uso de tensioactivos . La prevención de la acción de microorganismos se puede provocar mediante diversos agentes antibacterianos y antihongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y lo semejante. En muchos casos, también será conveniente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan al incorporar los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente adecuado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización. La esterilización de la solución se realizará de tal forma que no disminuya las propiedades antipatogénicas del péptido/MHC/molécula co-estimuladora/nanoparticula . En general, las dispersiones se preparan al incorporar los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básica y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son técnicas de deshidratación al vacio y liofilización, que proporcionan un polvo del ingrediente activo, más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución esterilizada con anterioridad del mismo. Uno de estos métodos de esterilización de la solución es la filtración estéril, sin embargo, esta invención implica que incluye cualquier método de esterilización que no disminuya significativamente las propiedades anti-patogénicas de los complejos de péptidos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas . Los métodos de esterilización que implican calor y presión intensos, tales como sometimiento autoclave, pueden comprometer la estructura terciaria del complejo, disminuyendo significativamente con esto las propiedades anti-patogénicas de los complejos de péptidos/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanopartículas .
Una cantidad efectiva de la composición terapéutica o profiláctica se determina con base en el objetivo pretendido. El término "dosis unitaria" o "dosificación" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para utilizarse en un sujeto, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de la composición calculada para producir las respuestas deseadas analizadas anteriormente junto con su administración, es decir, la ruta y régimen adecuados. La cantidad que será administrada, tanto de acuerdo con el número de tratamientos y la dosificación unitaria, depende del resultado y/o protección deseados. Las cantidades precisas de la composición también dependen del juicio del médico y son peculiares para cada individuo. Los factores que afectan la dosis incluyen el estado físico y clínico del sujeto, la vía de administración, el objetivo de tratamiento pretendido (el alivio de los síntomas contra la curación) y la potencia, estabilidad y toxicidad de la composición particular. Con la formulación, las soluciones se administrarán de una forma compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad que sea terapéutica o profilácticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente .
C. Administración in vltro o ex vivo En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término administración in vitro se refiere a la manipulación realizada sobre las células retiradas o fuera de un sujeto, incluyendo de manera enunciativa células en cultivo. El término administración ex vivo se refiere a células que se hayan manipulado in vitro y posteriormente se hayan administrado a un sujeto. El término administración in vivo incluye todas las manipulaciones realizadas dentro de un sujeto, incluyendo las administraciones.
En ciertos aspectos de la presente invención, las composiciones se pueden administrar ya sea in vitro, ex vivo, o in vivo. En ciertas modalidades in vitro, los linfocitos T autólogos se incuban con las composiciones de esta invención. Las células luego se pueden utilizar para análisis in vitro, o alternativamente para administración ex vivo.
III. COMPLEJOS DE ANTÍGENOS/MHC Y MOLÉCULAS CO- ESTIMULADORAS Los antigenos, entre los que se incluyen segmentos, fragmentos y otras moléculas derivas de una especie antigénica, incluyendo de manera enunciativa péptidos, carbohidratos, lipidos u otras moléculas presentadas por las moléculas de MHC clásica o no clásicas de la invención típicamente se complejan o se acoplan funcionalmente a una molécula de MHC o derivado de la misma. El reconocimiento de antígenos por parte de los linfocitos T es un complejo de mayor histocompatibilidad (MHC) restringido. Un linfocito T determinado reconocerá un antígeno sólo cuando esté unido a una molécula de MHC particular. En general, los linfocitos T se estimulan sólo en presencia de moléculas auto-MHC, y el antígeno es reconoce como los fragmentos del antígeno unido a las moléculas auto-MHC. La restricción MHC define la especificidad de los linfocitos T en los términos del antígeno reconocido y en los términos de la molécula de MHC que une sus fragmentos antigénicos. En aspectos particulares ciertos antígenos serán pareados con ciertas moléculas de MHC o polipéptidos derivados de los mismos.
El término "acoplado funcionalmente" o "recubierto" en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a una situación donde se combinan el polipéptido individual (por ejemplo, MHC) y los componentes antigénicos (por ejemplo, un péptido) para formar el complejo activo antes de la unión en el sitio blanco, por ejemplo, una inmunocélula . Esto incluye la situación donde los componentes del complejo polipeptídico individual se sintetizan o se expresan recombinantemente y posteriormente se aislan y combinan para formar un complejo, in vitro, antes de la administración a un sujeto; la situación donde un polipéptido quimérico o de fusión (es decir, cada componente proteinico discreto del complejo está contenido en una cadena polipeptidica individual) se sintetiza o se expresa recombinante como un complejo intacto. Típicamente, se agregan complejos polipeptídicos a las nanopartículas para proporcionar nanopartículas con complejos polipeptídicos adsorbidos o acoplados que tengan una proporción de número de moléculas: número de nanopartículas de aproximadamente, al menos aproximadamente o como máximo aproximadamente 0.1, 0.5, 1, 10, 100, 500, 1000 o más a: 1, más típicamente 0.1: 1 hasta 50:1. El contenido del polipéptidos de las nanopartículas se puede determinar utilizando técnicas estándar.
?. Componentes de las moléculas co-estimuladoras Las moléculas co-estimuladoras son moléculas que producen una señal secundaria in vivo que sirve para activar los linfocitos T naturales en los linfocitos T antígeno- específicos capaces de producir una respuesta inmunitaria para células que poseen el antígeno específico. La presente invención no se limita a ninguna molécula co-estimuladora específica. Las diversas moléculas co-estimuladoras son bien conocidas en la técnica. Algunos ejemplos no limitantes de moléculas co-estimuladoras son B7.1, 4-IBBL, CD40, IL-15/IL-15Ra, CD28, CD80, CD86 e ICOS. Sólo una molécula co-estimuladora especifica puede estar acoplada a una nanoparticula o una variedad de moléculas co-estimuladoras pueden estar acopladas a la misma nanoparticula. En ciertas modalidades la molécula co-estimuladora es una proteína tal como un anticuerpo que sea capaz de convertir en agonista un receptor co-estimulador sobre un linfocito T. En este caso, el anticuerpo es capaz de inducir una señal co-estimuladora que sea necesaria para activar los linfocitos T naturales e inducir una respuesta inmunitaria de una forma antígeno-específica .
La molécula co-estimuladora puede estar acoplada a la nanoparticula de la misma forma que el complejo de antígenos/MHC . En una modalidad de la presente invención, la molécula co-estimuladora y el complejo de antígenos/MHC se unen por separado a la nanoparticula. En otra modalidad de la invención, la molécula co-estimuladora y el complejo del antígeno/MHC primero se complejan conjuntamente y luego se complejan posteriormente a la nanoparticula. Típicamente, los complejos polipeptídicos se agregan a las nanopartículas para proporcionar nanopartículas con los complejos polipeptídicos adsorbido o acoplados que tengan una proporción de número de moléculas: número de nanoparticulas de aproximadamente, al menos aproximadamente o a como máximo aproximadamente 0.1, 0.5, 1, 10, 100, 500, 1000 o más: 1, más típicamente 0.1: 1 a 50: 1. El contenido de polipéptidos de las nanoparticulas se puede determinar utilizando técnicas estándar. La proporción de la molécula co-estimuladora al complejo de antígenos /MHC puede ser de aproximadamente 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 50 o más a l, de preferencia se obtiene una proporción de 1:1 del complejo: de moléculas co-estimuladoras de antígeno/MHC .
B . Moléculas de MHC Los antígenos intracelulares y extracelulares presentan desafíos bastante diferentes para el sistema inmunitario, tanto en los términos de reconocimiento como de respuesta adecuada. La presentación de antígenos a linfocitos T se media mediante dos clases distintas de molécula MHC clase I (MHC-I) y MHC clase II (MHC-II), que utilizan distintas trayectorias de procesamiento para antígenos. Los péptidos derivados de antígenos intracelulares se presentan a linfocitos T CD8+ mediante moléculas de MHC clase I, que se expresan virtualmente en todas las células, mientras que los péptidos intracelulares derivados de antígenos se presentan a linfocitos T CD4+ mediante moléculas MHC-II. Sin embargo, existen ciertas excepciones a esta dicotomía. Diversos estudios han mostrado que los péptidos generados a partir de una partícula sometida a endocitosis o proteínas solubles se presentan en moléculas de MHC-I en macrófagos, así como en células dendríticas. En ciertas modalidades de la invención, se identifica un péptido particular derivado de un antígeno tumor-específico y presentado en el complejo de péptido/ HC/molécula co-estimuladora/nanopartícula en el contexto de un polipéptido adecuado de MHC clase I o II. En ciertos aspectos, la constitución genética de un sujeto se puede evaluar para determinar cuál polipéptido MHC se utilizará para un paciente particular y un conjunto particular de péptidos.
También se contemplan molécula de MHC no clásico para utilizarse en los complejos del MHC de la invención. Las moléculas de MHC no clásico son no polimórficas , conservadas entre las especies, y poseen bolsas de unión a ligandos estrechas, profundas, hidrofóbicas . Estas bolsas de unión tienen la capacidad de presentar glucolipidos y fosfolípidos para linfocitos T citolíticos (NKT) . Los linfocitos NKT representan una población única de linfocitos que co-expresan marcadores de células NK y un receptor linfocitos T semi- invariantes (TCR) . Los mismos están implicados en la regulación de las respuestas inmunitarias asociadas con una amplia gama de enfermedades.
C . Componentes antigénicos Ciertos aspectos de la invención incluyen métodos y composiciones que se relacionen con composiciones antigénicas entre las que se incluyen segmentos, fragmentos o epitopes de polipéptidos , péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lipidos y otras moléculas que provocan o inducen una respuesta antigénica, en general denominada como antigenos. En particular, los antigenos, o segmentos antigénicos o fragmentos de estos antigenos, que conducen a la destrucción de una célula via una respuesta inmunitaria, se pueden identificar y utilizar para preparar un complejo de HC/nanoparticulas descrito en la presente. Estos antigenos se pueden presentar en y son específicos para células tumorales. Las modalidades de la invención incluyen composiciones y métodos para la modulación de una respuesta inmunitaria contra una célula particular o conjunto de células que lleven a cabo una función fisiológica particular. Los ejemplos de antigenos tumorales incluyen los antigenos descritos en la siguiente tabla. 1. Componentes peptidico y composiciones proteináceas Los polipéptidos y péptidos de la invención se pueden modificar mediante diversas supresiones, inserciones o sustituciones de aminoácidos. En modalidades particulares, los polipéptidos y/o péptidos modificados son capaces de modular una respuesta inmunitaria en un sujeto. En el sentido en el que se utiliza la presente, una "proteína" o "polipéptido" o "péptido" se refiere a una molécula que comprende al menos cinco residuos de aminoácidos. En algunas modalidades, se emplea una versión tipo silvestre de una proteina o péptido, sin embargo, en muchas modalidades de la invención, se emplea una proteina o polipéptido modificado para generar un complejo de péptido/MHC/molécula co-estimuladora/nanopartícula . Un complejo de péptido/MHC/moléculas co-estimuladoras/nanoparticulas se puede utilizar para generar una respuesta inmunitaria y/o modificar la población de linfocitos T del sistema inmunitario (es decir, re-educar al sistema inmunitario) . Los términos descritos anteriormente se pueden utilizar indistintamente en la presente. Una "proteina modificada" o "polipéptido modificado" o "péptido modificado" se refiere a una proteina o polipéptido cuya estructura química, en particular su secuencia de aminoácidos se altera con respecto a la proteína o polipéptido tipo silvestre. En algunas modalidades, una proteína o polipéptido o péptido modificado tiene al menos una actividad o función modificada (reconociendo que las proteínas o polipéptidos o péptidos puedan tener múltiples actividades o funciones) . Se contempla específicamente que una proteína o polipéptido o péptido modificado que se puede alterar con respecto a una actividad o función que todavía conserve una actividad o función tipo silvestre. En otros aspectos, tales como inmunogenicidad o capacidad para interactuar con otras células del sistema inmunitario cuando se trata en el contexto de un complejo de MHC/molécula co-estimuladora/nanoparticulas .
Los péptidos de la invención incluyen péptidos que se encuentra son específicos para células cancerosas o precancerosas en el cuerpo. Estos péptidos pueden estar asociados con moléculas de nanopartículas/MHC/moléculas co-estimuladoras específicas o múltiples péptidos pueden asociados con una nanopartícula común y una o más moléculas de MHC. La administración de las combinaciones de estos péptidos incluye la administración a una población de nanoparticulas que tengan múltiples péptidos unidos y/o administrar múltiples poblaciones de nanoparticulas cada una teniendo un péptido específico unido o una combinación de estas nanoparticulas que incluya las nanoparticulas con 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más péptidos unidos a 1, 2, 3, 4, 5, 6, o más nanoparticulas .
En ciertas modalidades, el tamaño de una proteína o polipéptido (tipo silvestre o modificado) , incluyendo cualquier complejo de una proteína o péptido de interés y, en particular una fusión de MHC/péptidos, puede comprender, de manera enunciativa 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 2728, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 8889, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 14001500, 1750, 2000, 2250, 2500 de amino-moléculas o mayor, incluyendo cualquier variación o valor derivable en el mismo, o derivado de los mismos. En ciertos aspectos, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos contiguos, incluyendo los derivados de los mismos y los fragmentos de un antigeno, tales como aquellas secuencias de aminoácidos descritas y a las que se hace referencia en la presente, se pueden utilizar como antigenos. Se contempla que los polipéptidos se pueden mutar mediante truncado, haciéndolos más cortos que su forma tipo silvestre correspondiente, aunque también se podrían alterar mediante fusión o conjugando de una secuencia de proteínas heterólogas con una función particular (por ejemplo, para la presentación como una complejo de proteínas, para una inmunogenicidad mejorada, etc.).
Las composiciones proteináceas se pueden preparar mediante cualquier técnica conocida por aquellos expertos en este campo, incluyendo (i) la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos a través de técnicas biológicas moleculares estándar, (ii) el aislamiento de compuestos proteináceos a partir de fuentes naturales o (iii) la síntesis química de materiales proteináceos. El nucleótido, así como las secuencias de proteínas, polipéptidos y péptido para diversos genes se han descrito con anterioridad, se pueden encontrar en las bases de datos computarizadas reconocidas. Una de esta base de datos es el National Center for Biotechnology Information' s GenBank y la base de datos GenPept (en la Red Mundial en ncbi.nlm.nih.gov/). La totalidad o parte de las regiones de codificación para estos genes se pueden amplificar y/o expresar utilizando las técnicas descritas en la presente o podrían ser conocidas por aquellos con experiencia normal en la técnica.
Las variantes de las secuencias de aminoácidos de epítopes antigénicos y otros polipéptidos de estas composiciones pueden ser variantes de sustitución, de inserción, o de supresión. Una modificación en un polipéptido de la invención puede afectar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, i 1, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 68, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 80, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 92, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 o más de los aminoácidos no contiguos o contiguos de un péptido o polipéptido, en comparación con el tipo silvestre. Se contempla un péptido o polipéptido que de por resultado en una respuesta inmunitaria para utilizarse en los métodos de la invención.
Las variantes de supresión típicamente carecen de uno o más residuos de la secuencia de aminoácidos natural o tipo silvestre. Los residuos individuales se pueden suprimir o un número de aminoácidos contiguos se pueden suprimir. Se puede introducir un codón de paro (mediante sustitución o inserción) en una secuencia de ácido nucleico codificante para generar una proteína truncada. Los mutantes de inserción típicamente implican la adición de material a un punto no terminal en el polipéptido. Esto puede incluir la inserción de uno o más residuos. También se pueden generar adiciones terminales, denominadas proteínas de fusión.
Las variantes de sustitución típicamente contienen el intercambio de un aminoácido por otro a uno o más sitios dentro de la proteína y se pueden diseñar para modular una o más propiedades del polipéptido, con o sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, se reemplaza un aminoácido con uno de forma y carga similar. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparragina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparragina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina a metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina. Alternativamente, las sustituciones pueden ser no conservadoras de tal forma que se afecte una función o actividad de un polipéptido o péptido, tal como la avidez o afinidad para un receptor o receptores celular. Los cambios no conservadores típicamente implican sustituir un residuo con uno que sea químicamente distinto, tal como un aminoácido polar o cargado por un aminoácido no polar o no cargado y viceversa .
Las proteínas de la invención pueden ser recomb'inantes, o se pueden sintetizar in vitro. Alternativamente, una proteína recombinante se puede aislar de bacterias u otra célula huésped.
El término "codón funcionalmente equivalente" en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a codones que codifican para el mismo aminoácido, tales como los seis codones para arginina o serina y también se refiere a codones que codifican biológicamente para aminoácidos equivalentes (véase la siguiente tabla 2).
TABLA 2 Tabla de codones También se debe entender que las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos N- o C-terminales adicionales, o las secuencias de ácido nucleico 5' o 3', respectivamente y todavía ser esencialmente como se establece en una de las secuencias descritas en la presente, siempre y cuando la secuencia cumpla con los criterios establecidos anteriormente, incluyendo el mantenimiento de la actividad de las proteínas biológicas (por ejemplo, inmunogenicidad) . La adición de secuencias terminales en particular se aplica a secuencias de ácido nucleico que por ejemplo pueden incluir diversas secuencias no codificantes, que flanquean las porciones 5' o 3' de la región codificante.
Se contempla que en las composiciones de la invención, existen entre aproximadamente 0.001 mg y aproximadamente 10 mg de proteína total por mi. De esta forma, la concentración de proteina en una composición puede ser de aproximadamente, al menos aproximadamente o a lo máximo de aproximadamente 0.001, 0.010 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 50, 100 µ?/ml o mg/ml o más (o cualquier variación que se pueda derivar de las mismas) . De esto, aproximadamente, al menos aproximadamente o a lo máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 5152, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,' 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% puede ser un complejo de péptido/MHC/molécula co-estimuladora/nanoparticula .
La presente invención contempla la administración de un complejo de péptido/MHC/molécula co- estimulante/nanoparticula para llevar a cabo un tratamiento o una terapia preventiva contra el desarrollo de una enfermedad o condición asociada con cáncer, células neoplásicas o desarrollo de tumores.
Además, la patente de los Estados Unidos No. 4,554,101 (Hopp) , que se incorporan en la presente como referencia, muestra la identificación y preparación de epítopes a partir de secuencias primarias de aminoácidos con base en la hidrofilicidad. A través de los métodos descritos en Hopp, alguien con experiencia en la técnica podría ser capaz de identificar epítopes potenciales dentro de una secuencia de aminoácidos y confirmar su inmunogenicidad. Muchas publicaciones científicas también han sido fieles a la predicción de una estructura secundaria y a la identificación de epítopes, a partir de análisis de secuencias de aminoácidos (Chou & Fasman, 1974a, ; 1978a, b; 1979) . Cualquiera de estos se puede utilizar, si se desea, para suplementar las enseñanzas de Hopp en la patente de los Estados Unidos No. 4,554,101. 2. Otros componentes antigenicos Se pueden utilizar moléculas distintas a péptidos como antígenos o fragmentos antigénicos en el complejo con moléculas de MHC, estas moléculas incluyen, de manera enunciativa carbohidratos, lípidos, pequeñas moléculas y lo semejante. Los carbohidratos son los componentes principales de la superficie externa de una variedad de células. Ciertos carbohidratos son característicos de diferentes etapas de diferenciación y con mucha frecuencia estos carbohidratos se reconocen por los anticuerpos específicos. La expresión de distintos carbohidratos puede estar restringida a tipos celulares específicos. Las respuestas de autoanticuerpos a antígenos endometriales y séricos se ha mostrado que es una característica común de la endometriosis . Se ha descrito una respuesta de auto-anticuerpos séricos en la endometriosis a un número de antígenos identificados con anterioridad, entre los que se incluyen la glucoproteína 2-Heremans Schmidt y la anhidrasa carbónica, que es específica para un epítope de carbohidratos (Yeaman et al, 2002) .
D. Sustratos/nanopartículas En cierto aspecto, los complejos de antígeno/MHC se acoplan funcionalmente a un sustrato. Un sustrato puede estar en la forma de una nanopartícula que comprende un material biocompatible, bioabsorbible . Un sustrato también puede estar en la forma de una nanopartícula tal como aquellas descritas con anterioridad en la Publicación de los Estados Unidos No. 2009/0155292 que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Las nanopartículas pueden tener una estructura de dimensión variable y diversamente conocida como una nanoesfera, una nanopartícula o una nanoesfera biocompatible biodegradable o una nanopartícula biocompatible biodegradable . Estas formulaciones de partículas que contienen un complejo de antígenos/MHC se pueden formar mediante acoplamiento covalente o no covalente del complejo a la nanopartícula .
Las nanoparticulas típicamente consisten de un núcleo sustancialmente esférico y opcionalmente una o más capas. El núcleo puede variar de tamaño y composición. Además del núcleo, la nanopartícula puede tener una o más capas para proporcionar funcionalidades adecuadas para las aplicaciones de interés. El espesor de las capas, si está presente, puede variar dependiendo de las necesidades de las aplicaciones específicas. Por ejemplo, las capas pueden impartir propiedades ópticas útiles.
Las capas también pueden impartir funcionalidades químicas o biológicas, denominadas en la presente como capas activas químicamente o activas biológicamente, y para estas funcionalidades la capa o capas típicamente pueden variar de espesor de aproximadamente 0.001 micrómetros (1 nanómetro) hasta aproximadamente 10 micrómetros o más (dependiendo del diámetro deseado de la nanopartícula) , estas capas típicamente se aplicarán sobre la superficie externa de la nanopartícula .
Las composiciones del núcleo y las capas pueden variar. Los materiales adecuados para las partículas o el núcleo incluyen, de manera enunciativa polímeros, cerámicas, cristales, minerales y lo semejante. Los ejemplos incluyen, de manera enunciativa, cristales estándar y especiales, sílice, poliestireno, poliéster, policarbonato, polímeros acrílicos, poliacrilamida, poliacrilonitrilo, poliamida, fluoropolímeros, silicona, celulosas, silicio, metales (por ejemplo, hierro, oro, plata) , minerales (por ejemplo, rubí) , nanoparticulas (por ejemplo, nanoparticulas de oro, partículas coloidales, óxidos metálicos, sulfuros metálicos seleniuro metálicos y materiales magnéticos tales como óxido de hierro) y compuestos de los mismos. El núcleo podría ser de composición homogénea, o un compuesto de dos o más clases de materiales dependiendo de las propiedades deseadas. En ciertos aspectos, se utilizarán nanoparticulas metálicas. Estas partículas o nanoparticulas metálicas se pueden formar a partir de Au, Pt, Pd, Cu, Ag, Co, Fe, Ni, Mn, Sm, Nd, Pr, Gd, Ti, Zr, Si, y In, precursores, sus aleaciones binarias, sus aleaciones ternarias y sus compuestos intermetálicos. Véase la patente de los Estados Unidos No. 6,712,997, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En ciertas modalidades, las composiciones del núcleo y las capas pueden variar con la condición de que las nanoparticulas sean biocompatibles y bioabsorbibles . El núcleo podría ser de composición homogénea, o un compuesto de dos o más clases de materiales dependiendo de las propiedades deseadas. En ciertos aspectos, se utilizará nanoesferas metálicas. Estas nanopartículas metálicas se pueden formar a partir de Fe, Ca, Ga y lo semejante.
Como se estableció con anterioridad la nanopartícula puede, además del núcleo, incluir una o más capas. La nanopartícula puede incluir una capa que consista de un azúcar biodegradable u otros polímeros. Los ejemplos de capas biodegradables incluyen de manera enunciativa dextrano; poli (etilenglicol) ; poli (óxido de etileno); manitol; poli (ásteres) con base en poliláctido (PLA) , poliglicólico (PGA) , policaprolactona (PCL) ; poli (hidroxalcanoato) s de la clase PHB-PHV; y otros poli ( sacáridos ) modificado tales como almidón, celulosa y quitosán. Adicionalmente, la nanopartícula puede incluir una capa con superficies adecuadas para unirse a funcionalidades químicas para la unión química o sitios de acoplamiento.
Las capas se pueden producir sobre las nanopartículas en una variedad de formas conocidas por aquellos expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen técnicas químicas de sol-gel tales como las descritas en (1979) ; Brinker y Scherer (1990) . Los procedimientos adicionales para producir capas sobre nanopartículas incluyen técnicas de química y encapsulación superficial, tales como las descritas en Parten and Brown (1998); Pekarek et al., (1994); Hanprasopwattana (1996); Davies (1998); y las referencias en la presente. También se pueden utilizar técnicas de deposición de vapor; Véase, por ejemplo, Goldman and Shinohara (2000); y patente de los Estados Unidos No. 6.387.498. Todavía otros procedimientos incluyen técnicas de auto-ensamble capa por capa tales como las descritas en Sukhorukov et al. (1998); Caruso et al. (1998); Caruso et al. (1999) ; la patente de los Estados Unidos No. 6,103,379 y las referencias citadas en la presente.
Las nanopartículas se pueden formar al poner en contacto una fase acuosa que contenga el complejo de antícfenos/ HC/moléculas co-estimuladoras y un polímero y una fase no acuosa seguida por la evaporación de la fase no acuosa para provocar la coalescencia de partículas a partir de la fase acuosa como se muestra en la patente de los Estados Unidos No. 4,589,330 o 4,818,542. Los polímeros preferidos para estas preparaciones son copolímeros o polímeros naturales o sintéticos seleccionados del grupo que consiste de gleatina, agar, almidón, arabinogalactano, albúmina, colágeno, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicólido-L (-) lactido poli (episilon-caprolactona, poli (epsilón-caprolactona-CO-ácido láctico), poli (epsilón- caprolactona-CO-ácido glicólico) , poli (ácido ß- hidroxibutírico) , poli (óxido de etileno) , polietileno, poli (alquil-2-cianoacrilato) , poli (metacrilato de hidroxietilo) , poliamidas , poli (aminoácidos) , poli(DL-aspartamide de 2-hidroxietilo) , poli(éster urea), poli(L-fenilalanina/etilenglicol/1 , 6-diisocianatohexano) y poli (metacrilato de metilo) . Los polímeros particularmente preferidos son poliésteres, tales como, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicólido-L (-) láctido poli (episilón-caprolactona, poli ( epsilón-caprolactona-CO-ácido láctico) y poli (epsilón-caprolactona-CO-ácido glicólico) . Los solventes útiles para disolver el polímero incluye: agua, hexafluoroisopropanol, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, hexano, benceno o sesquihidrato de hexafluoroacetona .
E . Acoplamiento de los comple os de antigeno-MHC y moléculas co-estimuladoras con la nanoparticula Para acoplar el sustrato o la nanoparticula a los complejos de antígeno-MHC y molécula co-estimuladoras, se pueden aplicar las siguientes técnicas.
La unión se puede generar al modificar químicamente el sustrato o la nanoparticula lo cual típicamente implica la generación de "grupos funcionales" sobre la superficie, los grupos funcionales, serán capaces de unirse a un complejo de antígenos-MHC, una molécula co-estimuladora y/o enlazar la superficie modificada opcional y químicamente del sustrato o nanoparticula con las denominadas "moléculas enlazantes" unidas covalente o no covalentemente seguida por hacer reaccionar el complejo de antigenos-MHC y la molécula co-estimuladora con las nanoparticulas obtenidas.
El término "molécula enlazante": significa una sustancia capaz de enlazarse con el sustrato o una nanoparticulas y también capaz de enlazarse a un complejo de antígenos- HC-moléculas co-estimuladoras .
El término "grupos funcionales" en el sentido en el que se utiliza en la presente no se restringe a grupos químicos reactivos que forman enlaces covalentes, sino que también incluye grupos químicos que conducen a una interacción iónica de enlaces de hidrógeno con el complejo de antígeno-MHC-molécula co-estimuladora . Además, se debe observar que no es posible una distinción estricta entre "grupos funcionales" generados en la superficie y moléculas enlazantes que portan los "grupos funcionales", ya que algunas veces la modificación de la superficie requiere la reacción de moléculas enlazantes más pequeñas tales como etilenglicol con la superficie de nanoparticulas.
Los grupos funcionales o las moléculas enlazantes que los portan se pueden seleccionar de grupos amino, grupo de ácido carbónico, tioles, tioéteres, disulfuros, guanidino, grupos hidroxilo, grupos amina, dioles vecinales, aldehidos, grupos alfa-haloacetilo, organilos de mercurio, grupos éster, haluro ácido, tioéster ácido, anhídrido ácido, isocianatos, isotiocianatos, haluros de ácido sulfónico, imidoésteres, diazoacetatos, sales de diazonio, 1, 2-dicetonas, ácidos fosfónicos, ésteres de ácido fosfórico, ácidos sulfónicos, azolidas, imidazoles, índoles, N-maleimidas, compuestos de carbonilo alfa-beta-insaturados, arilhalogenuros o sus derivados .
Los ejemplos no limitantes de otras moléculas enlajantes con mayores pesos moleculares son moléculas de ácido nucleico, polímeros, copolímeros, agentes de acoplamiento polimerizable, sílice, proteínas y moléculas similares a cadenas que tengan una superficie con la polaridad opuesta con respecto al sustrato o nanopartícula . Los ácidos nucleicos pueden proporcionar un enlace a moléculas de afinidad que contengan -por si mismas moléculas de ácido nucleico, aunque con una secuencia complementaria con respecto a la molécula enlazante.
Como ejemplos de agentes de acoplamiento polimerizables, se pueden citar diacetileno, estireno butadieno, vinilacetato, acrilato, acrilamida, compuestos de vinilo, estireno, óxido de silicona, óxido de boro, óxido fosforoso, boratos, pirrol, polipirrol y fosfatos.
La superficie del sustrato o nanopartícula se puede modificar químicamente, por ejemplo, mediante la unión de derivados de ácido fosfónicos que tengan grupos reactivos funcionales. Un ejemplo de estos derivados de ácido fosfónico o de éster de ácido fosfónico es el ácido imino-bis (metilenfosfon) carbónico que se puede sintetizar de acuerdo con la reacción "Mannich- oedritzer" . Esta reacción de unión se puede realizar con el sustrato o la nanoparticula según se obtenga directamente del proceso de preparación o después de una pre-tratamiento (por ejemplo con bromuro de trimetilsililo) . En el primer caso, el derivado de (éster) de ácido fosfónico por ejemplo puede desplazar los componentes del medio de reacción que todavía están unidos a la superficie. Este desplazamiento se puede mejorar a temperaturas mayores. Por otro lado, se cree que el bromuro de trimetilsililo desalquila los agentes complej antes a base de fósforo que contienen un grupo alquilo, creando con esto nuevos sitios de unión para el derivado del (éster) de ácido fosfónico. El derivado del (éster) de ácido fosfónico, o las moléculas enlazantes unidas al mismo, puede exhibir los mismos grupos funcionales como se proporcionó anteriormente. Un ejemplo adicional del tratamiento superficial del sustrato o r.anopartículas implica calentar un diol tal como etilenglicol . Se debe observar que este tratamiento puede ser redundante si la síntesis ya prosiguió en un diol. Bajo estas circunstancias, el producto de síntesis obtenido directamente probablemente mostrará los grupos funcionales necesarios. Sin embargo, este tratamiento se puede aplicar a un sustrato o nanopartícula que se produjeron en los agentes complejantes que contienen N- o P-. Si este sustrato o partícula se someten a un tratamiento posterior con etilenglicol, los ingredientes del medio de reacción (por ejemplo, el agente comple ante) que todavía se une a la superficie se pueden reraplazar por el diol y/o se pueden desalquilar.
También es posible reemplazar los agentes comple antes que contienen N unidos a la superficie de la partícula por derivados de amina primaria que tengan un segundo grupo funcional. La superficie del sustrato o nanopartículas también puede estar recubierta con sílice. La sílice permite una conjugación química relativamente simple de moléculas orgánicas ya que la sílice reacciona fácilmente con ligadores orgánicos, tales como trietoxisilano o clorosilano. La superficie de la nanopartícula también puede estar recubierta por homo o copolímeros. Los ejemplos de agentes de acoplamiento polimerizables son N- ( 3-aminopropil) - 3-mercaptobenzamidina, 3- (trimetoxisilil ) propilhidrazida y 3- trimetoxisilil) propilmaleimida . Otros ejemplos no limitantes de agentes de acoplamiento polimerizables se mencionan en la presente. Estos agentes de acoplamiento se pueden utilizar individualmente o en combinación, dependiendo del tipo de copo ímero que se generará como un recubrimiento.
Otra técnica de modificación superficial que se puede utilizar con sustratos o nanoparticulas que contengan compuestos de metales de transición oxidicos es la conversión de los compuestos de metales de transición oxidicos mediante gas de cloro o agentes para cloración orgánica con los oxicloruros correspondientes. Estos oxicloruros son capaces de reaccionar con nucleófilos, tales como grupos hidroxi o amino como los encontrados con frecuencia en las biomoléculas . Esta técnica permite generar una conjugación directa con proteínas, por ejemplo, vía el grupo amino de las cadenas laterales de lisina. La conjugación con proteínas después de la modificación superficial con oxicloruros también se puede llevar a cabo al utilizar un ligador bifuncional , tal como, hidrazida de ácido maleimidopropiónico.
Para las técnicas de enlazamiento no covalente, las moléculas tipo cadena que tienen una polaridad o carga opuesta a la del sustrato o la superficie de la nanoparticula son particularmente adecuadas. Los ejemplos de moléculas enlazantes que se pueden enlazar no covalentemente a una nanoparticula con núcleo/cubierta implican tensioactivos aniónicos, catiónicos o zwitteriónicos , proteínas ácidas o básicas, poliaminas, poliamidas, polisulfona o ácido policarboxilico. Las interacciones hidrofóbicas entre el sustrato o la nanoparticulas y el reactivo anfifilico, que tiene un grupo reactivo funcional pueden generar el enlace necesario. En particular, las moléculas tipo cadena con carácter anfifilico, tales como fosfolipidos o polisacáridos derivados, que se pueden reticular entre si, son útiles. La absorción de estas moléculas sobre la superficie se puede alcanzar mediante co-incubación . La unión entre una molécula de afinidad y un sustrato o nanoparticulas también se puede basar en enlaces no covalentes, auto-organizadores. Un ejemplo de los mismos implica sondas de simple detección con biotina como una molécula enlazante y moléculas acopladas con avidina o estrepdavxdina.
Los protocolos para las reacciones de acoplamiento de grupos funcionales con moléculas biológicas se pueden encontrar en la bibliografía, por ejemplo en "Bioconj ugate Techniques" (Greg T. Hermanson, Academic Press 1996) . La molécula biológica (por ejemplo, la molécula del MHC o derivado de la misma) se puede acoplar a la molécula enlazante, covalente o no covalentemente, en linea con los procedimientos estándar de la química orgánica tales como oxidación, halogenación, alquilación, acilación, adición, sustitución o amidación. Estos métodos para acoplar la molécula enlazante unida covalente o no covalentemente se pueden aplicar antes del acoplamiento de la molécula enlazante al sustrato o nanoparticula o después de esto. Además, es posible, por medio de incubación, llevar a cabo una unión directa de moléculas al sustrato o nanoparticulas pre--tratados correspondientemente (por ejemplo, mediante bromuro de trimetilsililo) , que exhibe una superficie modificada debido a este pre-tratamiento (por ejemplo, una carga mayor o superficie polar) .
F. Producción de proteínas La presente invención describe polipéptidos , péptidos y proteínas para utilizarse en las diversas modalidades de la presente invención. Por ejemplo, los péptidos específicos y sus complejos se analizan por sus capacidades para producir o modular una respuesta inmun ítaria . En modalidades específicas, la totalidad o parte de los péptidos o proteínas de la invención también se pueden sintetizar en solución o en un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Diversos sintetizadores automáticos están disponibles comercialmente y se pueden utilizar de acuerdo con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart and ifoung (1984); Tarn et al. (1983); Merrifield (1986); y Baraay and Merrifield (1979), cada uno incorporado en la presente como referencia. Alternativamente, se puede emplear tecnología de ADN recombinante en donde una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido de la invención se inserta en un vector de expresión, transformado o transfectado en una célula hospedera adecuada y cultivado bajo condiciones adecuadas para la expresión.
Uno modalidad de la invención incluye el uso de transferencia génica a células, incluyendo microorganismos, para la producción de proteínas. El gen para la proteína de interés se puede transferir en células hospederas adecuadas, seguido por el cultivo de las células bajo las condiciones adecuadas. Se puede emplear un ácido nucleico que codifica vi rtu lmente para cualquier polipéptido. La generación de vectores de expresión recombinante, y los elementos incluidos en los mismos, se conocen por un experto en la técnica y se analizarán brevemente en la presente. Los ejemplos de líneas de células hospederas de mamífero incluyen, de manera enunciativa células Vero y HeLa, distintas a las líneas de línfcoitos B y T, tales como CE , 721.221, H9, Jurkat, Raji, asi como las líneas celulares de ovario de hámster chino, W138- BHK, COS-7, 293, HepG2 , 3T3, RIN y células MDCK. Aa.i'i'.r:s , una cepa de célula hospedera se puede seleccionar para que module la expresión de las secuencias insertadas o que i'ítodifique y procese el producto génico de la forma deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, segmentación) de los productos prote inicos puede ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospederas tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento pos-traduccional y la modificación de proteínas. Las líneas celulares adecuadas o ' sistemas hospederos se pueden seleccionar para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. En algunos casos, las proteínas de la presente invención se pueden expresar y purificar a partir de células de Drosophila.
Se pueden utilizar varios sistemas de selección en re los que se incluyen, de manera enunciativa genes de timidina quinasa HSV, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y adenina fosforribosiltransferasa, en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También, se puede utilizar la resistencia a antimetabolitos como la base de selección: para dhfr, que confiere resistencia a trintetoprim y metotrexato; gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G418; e hygro, que confiere resistencia a Kigromicina .
S. Ácidos nucleicos La presente invención puede incluir polinucleotidos reccr,; inantes que codifican para las proteínas, polipéptidos, péptidos de la invención. En el sentido en el que se utiliza en esta solicitud, el término "polinucleótido" se refiere a una molécula de ácido nucleico que sea recombinante o que se haya aislado libre de ácido nucleico genómico total. Se incluyen dentro del término "polinucleótido" los oligonucleótidos (100 residuos de ácidos nucleicos o de menor longitud), vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus y lo semejante. Los polinucleotidos incluyen, en ciertos aspectos, secuencias reguladoras, sustancialmente aisladas lejos de sus genes que se presentan en la naturaleza o las secuencias codificantes de proteínas. Los polinucleotidos pueden ser ARN, ADN, análogos de los mismos o una combinación de los mismos.
Con respecto a esto, el término "gen", v-polinucleótido", o v,ácido nucleico" se utiliza para hacer referencia a un ácido nucleico que codifica para una protóína, polipéptido o péptido (incluyendo cualesquiera secuencias requeridas para una transcripción adecuada, una modificación pos-traduccional o localización) . Como se encenderá por aquellos expertos en la técnica, este término abarca las secuencias genómicas, los casetes de expresión, las ;:scuencias de ADNc y segmentos menores de ácido nucleico ma ipulado por ingeniería genética que expresan, o se pueden adaptar para expresar, proteínas, polipéptidos, dominios, pépt:.dos, proteínas de fusión y mutantes. Un ácido nucleico qu codifica para la totalidad o parte de un polipéptido puedr- contener una secuencia de ácido nucleico contigua que codifica para la totalidad o una porción de este polipéptido de ló- siguientes longitudes: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 6S0, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 9109-.?, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030,, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000 o más nucleótidos, nucleósidos c pares de bases. También se contempla que un polipéptido particular proveniente de una especie determinada se pueda codificar por los ácidos nucleicos que contienen variaciones r.a';u.:.:ales que tengan secuencias de ácido nucleico ligeramente diferentes aunque, no obstante, codifican para la misma o sust ancialmente similar a proteína, polipéptido o péptido.
En modalidades particulares, la invención se relaciona con segmentos de ácido nucleico aislados y vectores rece.".binantes que incorporan las secuencias de ácido nucleico que codifican para un antígeno tumor-específico y/o una molécula del MHG. El término "recombinante" se puede utilizar junto con un polipéptido o el nombre de un polipéptido especifico y esto en general se refiere a un polipéptido producido a partir de una molécula de ácido nucleico que se haya manipulado in vitro o que sea un producto de replicación de *s;s ca molécula.
Los segmentos de ácido nucleico utilizados en la presente invención, sin importar la longitud de la secuencia codificante misma, se pueden combinar con otras secuencias de ácido nucleico, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios para enzimas de restricción adicional, múltiples sitios de clonación, otros segmentos codificantes y lo semejante, de tal forma que su longitud toca.. pueda variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud se pueda emplear, con la longitud total de pref rencia que se limita por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ácido nucleico recombinante pretendido. En algunos casos, una secuencia de ácido nucleico p -id codificar para una secuencia de polipéptidos con secuencias codificantes heterólogas adicionales, por ejemplo pai'd permitir la purificación del polipéptido, transporte, secreción, modificación pos-traduccional o para beneficios terapéuticos tales como asignación o eficacia. Se puede agregar una marca u otro polipéptido heterólogo a las secuencias codificantes de un polipéptido modificado, en do'ide "heterólogo" se refiere a un polipéptido que no sea igual al polipéptido modificado.
Iv . BLANCOS TERAPÉUTICOS Un método de la presente invención incluye el trabamiento para una enfermedad o condición provocada por un neoplasma de células del cuerpo. Un polipéptido inmunogénico de la invención se puede administrar para inducir o modificar una respuesta inmunitaria en una persona que tenga, que se sospeche que tiene, o en riesgo de desarrollar cáncer, neoplasma de células o un tumor. Los métodos se pueden exrrpiear con respecto a individuos que se hayan probado positivos para una inmuno-reactividad antigénica o que se considere estén en riesgo de desarrollar esta condición o una co.'iá ción relacionada.
Las condiciones cancerosas o neoplásicas abarcadas por esta invención no se limitan por ningún tipo de célula específica o cáncer especifico aunque incluyen cualquier cáncer en el cual esté presente un antígeno tumor-específico ea las células cancerosas. Adicionalmente, la célula cancerosa o célula precancerosa debe estar ubicada de tal forma que sea tratable para una respuesta inmunitaria inducida por ' las composiciones y métodos de la presente invención. Algunos ejemplos de estos cánceres incluyen de manera enunciativa carcinoma adrenocortical; cáncer vesical; cáncer de mama; cáncer de mama ductal; cáncer de mama invasivo intraductal; cáncer de mama-ovario; linfoma de Burkitt; carcinoma cervical; adenoma colorrectal; cáncer colorrectal; cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, tipo 1; cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, tipo 2; cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, tipo 3; cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, tipo 6; cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, tipo 7; dermatofibrosarcoma protuberante; carcinoma endometrial; cá.'.cer de esófago; cáncer gástrico, fibrosarcoma, glioblastoma multiforme; tumores glómicos, múltiple; hepatoblastoma; cáncer hepatocelular ; carcinoma h atocelular; leucemia linfoblástica aguda; leucemia mieloide aguda; leucemia mieloide aguda con eosinofilia; leucemia aguda no linfocítica; leucemia mieloide crónica; Síndrome de Li-Fraumeni; liposarcoma, cáncer de pulmonar; cáncer de pulmón de células pequeñas; linfoma que no es de Hodgkin; síndrome II de la familia de cáncer Lynch; tumor de células germinales macho; leucemia de mastocitos; tiroides medular; meduloblastoma; melanoma, meningioma; múltiples neoplasias endocrinas; malignidad mieloide, predisposición a; mixosarcoma, neuroblastoma; osteosarcoma; cáncer de ovario; cáncer de ovario seroso; carcinoma ovárico; tumores del cordón sexual ovárico; cáncer de páncreas; tumores endocrinos pancreáticos; paraganglioma, nocromafina familiar; pi lomatricoma; tumor de la pituitaria invasivo; ad nocarcinoma prostético; cáncer prostético; carcinoma de células renales, retinoblastoma papilar, familiar o esporádico; síndrome de predisposición rabdoide; tumores r doides familiares; rabdomiosarcoma ; cáncer de pulmón de células pequeñas; sarcoma de tejido suave, carcinoma de células escamosas, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T de cabeza y cuello; síndrome de Turcot con glioblastoma; tilosis con cáncer de esófago; carcinoma de la cérvix ut-srina; cáncer colo-rectal; cáncer pulmonar; cáncer de próstata; cáncer cutáneo; osteocarcinoraa; tumores sólidos/malignidades; carcinoma de células mixoides y redondas; tumores avanzados localmente; carcinoma de tejido suave humano; metástasis de cáncer; carcinoma de células es carnosas; carcinoma de células escamosas esofágicas; carcinoma oral; linfoma de linfocitos T cutáneos; linfoma de Rcdgkin; linfoma que no es de Hodgkin; cáncer de la corteza ad 'renal; tumores para producción de ACTH; cánceres de células no pequeñas; cánceres gastrointestinales; cánceres urológicos; malignidades del tracto genital femenino; malignidades del tracto genital masculino; cáncer renal; cáncer cerebral; cánceres óseos; cánceres cutáneos; cáncer de la tiroides; retinoblastoma; efusión peritoneal; efusión pleural maligna; mesotelioma; tumores de Wilms; cáncer de la vesícula biliar; neoplasma trofoblástico; hemangiopericitoma; sa coma de Kaposi y cáncer hepático.
VI . EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar las diversas modalidades de la invención y no pretenden limitar la presente invención de ninguna forma. Un experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención está bien adecuada para llevar acabo los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionados, asi como aquellos objetivos, fines y ventajas inherentes en la presente. Los ejemplos de la presente, junto con los métodos descritos en la presente son representativos de las modalidades preferidas, son ilustrativos y no se destinan como limitaciones del alcance de la invención. Los cambios en la presente y otros que se abarcan dentro del espíritu de la in/ención se definen por el alcance de las reivindicaciones que se presentarán por aquellos expertos en la técnica.
Ejemplo 1 Síntesis y caracterización de la pMHC-NPs a base de oro. Las nanopartículas de oro (GNP) de tamaños específicos se pueden sintetizar de acuerdo con Levy, R. et al. (National and combinatorial design of peptide capping ligands for gold nanoparticles . " J Am Chem Soc 126, 10076-84 (2?0 ) ) . El tamaño, densidad, carga y monodispersidad de las preparaciones de GNP se miden utilizando espectrofotometrías , microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión de la. luz dinámica. Las muestras de GNP luego se concentran y conjugan con los pMHC (complejo de antígenos-MHC) utilizando d erentes procedimientos. Se desarrollaron métodos para cu le ificar la valencia de pMHC/GNP y para concentrar los ari'-igeno = MHC-GNP a altas densidades (~1014/ml) sin comprometer la monodispersión (figura 1). j&aplo 2 Capacidad de unión de pMHC de las GNP. Los pMHC se recubrieron sobre las GNP de diversos tamaños utilizando dos procedimientos: (i) unión aleatoria del pMHC con la GNP vía interacciones elestrostáticas y (ii) unión direccional a través de un ligador de tiol-PEG-NH2. En este caso, para prevenir la agregación se utilizó un tiol-PEG adicional como un estabilizante de la GNP. Se contempla que el primer procedimiento podría permitir densidades muy altas de ligandos mientras que compromete la direccionalidad de la unión de pMHC (es decir, únicamente una fracción de los pMHC podría estar disponible para el reconocimiento mediante los linfocitos T cognados) . El segundo procedimiento se dirige a generar pMHC-GNP que portan menos de los pMHC aunque unidos direccionalmente , via sus términos C. Se probaron ambos procedimientos en 14 a 40 nm de las GNP. Se confirmó que, para ambos procedimientos, la capacidad de unión de pMHC de las GNP es una función del área superficial. Por consiguiente, se unieron más pMHC cuando las nanopartículas fueron de un tamaño mayor. Sorprendentemente, se encontró que la unión mediada por PEG no sólo aseguró la direccionalidad de la unión, sino que también mejoró la capacidad de unión de las GNP individuales (contrario a la esperanza inicial) . La tabla 1 resume estos resultados.
Tabla I . Capacidad de unión de pMHC de la GNP Ejemplo 3 Actividad agonista contra contenido de pMHC. Se probaron los efectos de la valencia de pMHC, el tamaño dé GNP, la densidad de GNP y estrategia de recubrimiento sobre la actividad agonista de p HC-GNP in vitro. Se comparó la capacidad de diversas preparaciones de IGRP206-2i4~ d-GNP para activar los linfocitos T CD8+ que no han recibido tratamiento previo cognados ( IGRP206-2i4_especifico) (en la presente denominados como linfocitos T ? 8.3-CD8+) derivados de ratones NOD transgénicos con el receptor de linfocitos T 8.3 (TCR) . El primer conjunto de experimentos comparó los efectos de la valencia de IGRP2o6-2i4- d (pMHC) con respecto a una variación de densidades de la GNP. Las GNP recubiertas con un pMHC (no-cognado) (Tum-Kd) se utilizaron como controles negativos. Como se esperaba, las GNP GRP206~214-Kd- (pero no TUM-Kd) activaron estos linfocitos T (según se mide mediante la producción de IFNy) de una forma dependiente de la dosis de pMHC. La figura 2 muestra un experimento con 14 nm de GNP recubiertas con diferentes números de pMHC via el método ligador. Además, las GNP recubiertas con números mayores de ~2 veces de los pMHC tuvo una actividad agonista superior. De esta forma, la actividad agonista de la p HC-GNP es una función del contenido total de pMHC.
Ejeznplo 4 Actividad agonista contra tamaño y densidad de la GNP. Análisis adicionales indicaron que el contenido total de pMHC no es el único factor que afecta la actividad agonista de las pMHC-GNP y que el tamaño de la GNP también es importante. Esto se probó al comparar la actividad de dos muestras de pMHC-GNP de diferente tamaño (14 y 40 nm) y diferentes valencias de pMHC aunque un contenido similar de pMHC. En el experimento mostrado en la figura 3, se utilizaron 14 nm de las GNP que portan ~200 pMHC/GNP y 40 nm de las GNP que portan -5,000 pMHC/GNP. Las densidades de las GNP de estas dos muestras se ajustaron a 3xl013 y 1012 GNP/mL respectivamente, para ajustar el contenido total de pMHC a -450 ug/ml. De manera notable, las células 8.3-CD8+ respondieron significativamente mejor a los 14 nm del compuesto de pMHC/GNP que a los 40 nm sobre una gama de contenidos totales de pMHC, a pesar de que el último portó más de pMHC/GNP. Esto sugiere que la densidad de la GNP (más linfocitos T de las GNP/cognados) es la clave. Por ejemplo, 4X40 nm de las NP que portan 1000 pMHC/GNP (4000 pMHC) podrían ser menos convenientes que 40x10 nm NP que portan 100 pMHC/GNP (4000 pMHC) .
Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que las preparaciones óptimas de pMHC-GNP son aquellas comprendidas de las GNP pequeñas utilizadas a altas densidades. Las ventajas de aumentar la variante de pMHC por encima de un cierto nivel (es decir, 25 pMHC/GNP) son menos significativas .
Ejemplo 5 Actividad agonista contra la exposición de pMHC. Como se observó anteriormente, las muestras de pMHC-GNP se produjeron mediante el co-recubrimiento de las GNP con un ligador de tiol-PEG-NH2 de 3.4 kD (como aceptador de pMHC carboxiterminal) con un ligador de tiol-PEG que funciona como un estabilizante de GNP. Para determinar si la longitud del tiol-PEG estabilizante influye en sus propiedades antiagregación de GNP, se compararon la capacidad del tiol-PEG- NH2 para unirse a los pMHC y/o las propiedades agonistas de pMHC-GNP, pMHC-GNP preparados utilizando ligadores estabilizantes de diferentes tamaños (2 kD y 5 kD, más cortos y más largos que el aceptor de pMHC, respectivamente) . Arabos ligadores tuvieron propiedades similares de anti-agregación, y el ligador 5 kD no inhibió la unión de pMHC al tiol-PEG-NH2 de 3.4 kD más corto. Sin embargo, notablemente la pMHC-GNP protegido por el tiol-PEG más corto (2 kD) tuvo una actividad agonista superior que aquellos co-recubiertos con el tiol-PEG más largo (5 kD) (figura 4). Esto sugiere que los ligadores de tiol-PEG protectores largos protegieron las moléculas de pMHC unidas al ligador aceptor de la exposición a linfocitos .
Ejemplo 6 Expansión de las células CD8+ mediante pMHC-GNP in vivo: una función clave para la estrategia de recubrimiento.
Se probó la capacidad de diversas muestras diferentes de IGR?206-2i4- d-GNP para expandir las células CD8+ in vivo auto-reguladoras cognadas. Las pMHC-GNP se inyectaron mediante i.v. en ratones NOD de 10 semanas de edad. Cada uno recibió 2 inyecciones semanales durante 5 semanas. Los cambios en el tamaño de la población de linfocitos T cognados en sangre y órganos linfoides se evaluaron al teñir las suspensiones celulares con tetrámeros de pMHC marcados fluorescentemente. Primero se probaron dos muestras de 30 nm de pMHC/GNP (a ~l.8-2.2xl013 GNP/ml) que se habían recubierto a alta valencias de pMHC mediante adsorción directa (300-600 pMHC/PIB) (10 ul de GNP/inyección) . Ambas muestras exhibieron actividad agonista in vitro (no mostrada) . Sin embargo, ninguna fue capaz de inducir la expansión de células CD8+ auto-reguladoras cognadas en sangre u órganos linfoides (no mostrados) , probablemente debido a que los pMHC se desplazaron rápidamente del armazón de GNP in vivo.
Se probaron dos muestras de 14 nm de pMHC-GNP a densidades de NP similares aunque recubiertas a menores valencias (40-100 pMHC/GNP) vía ligadores de PEG. A diferencia del caso para las pMHC-GNP producidas mediante el método de adsorción, las inyecciones (10 µ?/dosis) de estas pMHC-GNP indujeron una expansión significativa de los linfocitos T cognados tanto en sangre como en órganos linfoides (figura 5). Estas expansiones fueron antigeno-especificas, debido a que las GNP conjugadas con los pMHC control no indujeron expansión, incluso a mayores dosificaciones (100 µ?/dosis) . De esta forma, las pMHC-GNP de diámetro pequeño (14 nm) recubiertas covalentemente con pMHC vía ligadores adecuados de PEG y utilizados a números suficientemente altos fueron capaces de expandir las células CD8÷ auto-reguladoras cognadas in vivo.
Ejemplo 7 Expansión masiva de los linfoci-bos T CD8+ cognados mediante la pMHC-GNP recubiertas a mayores valencias de pMHC .
Enseguida se determinó si las pMHC-NP tuvieron el potencial para inducir expansiones masivas de los linfocitos T cognados in vivo. Esto se realizó al tratar ratones con diversas inyecciones de 3xl012 10-14 nm de las NP que portan 25 ug de pMHC totales (-150 IGRP2062o6-2i4/ d moléculas por NP) . Como se muestra en la figura 6, los ratones tratados con 10 dosis (dos veces a la semana durante 10 semanas) exhibieron expansiones masivas de linfocitos T CD8+ IGRP206-214 (RP--V7 ) -reactivo sangre periférica en comparación con sus contrapartes sin tratar (de <0.4 hasta >17 o 47% de linfocitos T CD8+) (paneles inferiores) . Esta expansión ya se había observado en un ratón, que se sacrificó después de 4 dosis de pMHC-NP (paneles superiores) . Las células expandidas con pMHC-NP se unieron específicamente al cognado pero no a los tetrámeros de pMHC no cognados (RP-V7/Kd contra TUM/Kd, respectivamente) .
Ejemplo 8 Para incorporar el diseño óptimo de pMHC-GNP para desarrollar las NP "multiplexadas" con propiedades co- estimuladoras . Un ejemplo de una molécula co-estimuladora es IL-15/IL-15Ra . Por ejemplo, se requiere IL-15 para el mantenimiento de las respuestas a linfocitos T CD8+ de memoria (por ejemplo véase Kennedy, .M. K. et al. "Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in interleukin 15-deficient mice." J Exp Med 191, 771-80 (2000) and Becker, T. et al., "Interleukin 15 is required for proliferative renewal of virus-specific memory CD8 T cells." J. Exp. Med. 195, 1541-1548 (2002) que se incorporan en la presente como referencia) . La trans-presentación de IL-15 mediante la membrana IL-15Ra sobre la APC sostuvo la supervivencia de los linfocitos T CD8+ de memoria y mejoró su proliferación durante las respuestas de recuerdo antigénico (véase, por ejemplo, Sato, N. et al, "The IL-15/IL-15Ralpha on cell surfaces enables sustained IL-15 activity and contributes to the long survival of CD8 memory T cells." Proc Nati Acad Sci U S A 104, 588-93 (2007) and Mortier, E. et al. "Macrophage- and dendritic-cell-derived interleukin- 15 receptor alpha supports homeostasis of distinct CD8+ T cell subsets." Immunity 31, 811-22 (2009) que se incorporan en la presente como referencia) . Por consiguiente, se contempla que las pMHC-NP que muestran complejos de IL-15/IL-15Ra tendrán propiedades superiores para la expansión de linfocitos T que las NP recubiertas con pMHC solo. Por lo tanto, podría ser posible alcanzar efectos similares o mejores al disminuir significativamente las dosis de pMHC y NP totales. En una modalidad de la plataforma de pMHC-NP multiplexada, las NP podrían portar tanto pMHC como una fusión de IL-15/IL-15Ra-hFc recombinante a diferentes estequiometrías (variación: 1:25 hasta 25:1) .
En un ejemplo, un fragmento de mIL-16 ADNc que codifica para los residuos N49-S162 se fusionó con uno de mIL-15Ra ADNc que codifica para los residuos G33-A132 vía un ligador de GS flexible. Este IL-15/IL-15Ra ADNc luego se fusionó con ADNc que codifica para la porción Fe de IgG (hFc) humana. Se subclonó esta estructura en un vector de expresión celular de mosca, que se transfectó en células de Drosophila melanogaster SC2 junto con un gen de resistencia a puromicina para generar líneas celulares estables. Las proteínas recombinantes se purificaron a partir de sobrenadantes mediante cromatografía por afinidad de la proteína A. Se aplicó un diseño similar a otras moléculas co-estimuladoras (es decir, para generar dímeros de dímeros o trímeros fusionados a la porción Fe de IgG) .
Ejemplo 9 Preparación de la nanopartículas de oro conjugada con pMHC Preparación de la nanoparticula de oro conjugada con pMHC (pMHC-GNP, 12 y 30 nm) . Preparación de las GNP. Las GNP se prepararon al calentar agua D.D. (200 mL) en un matraz de bola en un baño con aceite de silicio hasta ebullición. Luego se agregó una solución de 1% de HAuCL (4 mL) en el agua hirviendo. La solución se agitó durante 10 minutos antes de agregar una solución de citrato de Na al 1%. Para 12 nm de las GNP, se agregaron 12 mL de solución de citrato de Na. Para 30 nm de las GNP, se agregaron 12 mL de una solución de citrato de Na. Inmediatamente apareció un color vino después de agregar la solución de citrato de Na. Para completar la reacción, la solución de GNP se agitó durante 30 minutos más. Esta es una modificación del método descrito por Levy, R. et al. ("Rational and combinatorial design of peptide capping ligands for gold nanoparticles." J Am Chem Soc 126, 10076-84 (2004)) que se incorpora en la presente como referencia.
Modificación superficial de las GNP. Las GNP se pegilaron mediante la adición de tiol-PEG-NH2 25 mM (M. W. 3,400) y tiol-PEG 50 mM (M. W. 2,000, PEG/GNP proporción 10,000:1) en la solución de GNP. La solución se agitó durante 5 horas a temperatura ambiente. Las GNP pegiladas luego se lavaron con 3 X 30 mL de agua D.D. esterilizada para eliminar el exceso de PEGs y se volvieron a suspender en 40 mL de tampón MES (C6Hi3N04S . xH20) de 100 mM, pH 5.5.
Conjugación de pMHC. Se agregaron los pMHC (IGRP206- 2i /Kd, 4 mg) en una solución de las GNP pegiladas, gota a gota con agitación leve a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante una hora antes de la adición de 20 mg de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) . La mezcla se agitó durante 4 horas adicionales. Los conjugados de pMHC-GNP luego se lavaron con 40 mL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS, PH 7.2-7.4) durante tres veces y se volvieron a suspender en 8 mL de PBS.
Ejemplo: 10 Preparación de las nanopartículas de oro conjugadas con pMHC Preparación de las pMHC conjugado con GNP (pMHC-GNP , 2-10 nm) . Preparar GNP (2-5 nm) . Las GNP de 2-5 nm se prepararon al disolver 250 mg (para 2 nm de las GNP) o 50 mg (para 4 nm de las GNP) dodecilamina en 10 mL de solución de DDAB (100 mM bromuro de didodecildimetilamonio (DDAB) en tolueno) . En segundo lugar, se disolvieron 100 mg de borohidruro de tetrabutilamonio (TBAB) en 4 mL de solución de DDAB. Las soluciones de dodecilamina y TBAB luego se mezclaron en un matraz de tres cuellos de 50 mL, con agitación bajo nitrógeno. Se volvieron a disolver 34 mg de AuCi3 en 4.5 mL de solución DDAB y se inyectaron rápidamente una mezcla de TBAB y solución de dodecilamina. La solución se tornó rojo intenso inmediatamente, indicando la formación de las GNP. La mezcla se agitó continuamente durante 30 minutos, y se agregaron en la mezcla 15 mi de etanol. La mezcla luego se sometió a centrifugación a 4,100 x g durante 12 minutos para precipitar las GNP.
Preparar GNP (6-10 nm) . Para preparar las GNP de 6- 10 nm de ácido decanoico (172 mg) primero se disolvieron en 10 niL de tolueno y luego se mezclaron con varias cantidades de solución de TBAB (4 y 1 mL para 6 y 10 nm de las GNP, respectivamente) en un matraz de tres cuellos de 50 mL, con agitación bajo nitrógeno. AuCl3 (34 mg disueltos en una solución madre de 4.5 mL de DDAB) luego se inyectó rápidamente en la mezcla de TBAB y solución de ácido decanoico. La solución se tornó rojo intenso inmediatamente. La mezcla se agitó continuamente durante 30 minutos, y se agregaron 15 mL de etanol en la mezcla. La mezcla luego se sometió a centrifugación a 4,100 x g durante 12 minutos para precipitar las GNP.
Modificación superficial de las GNP. Las GNP se volvieron a suspender en 20 mL de ácido mercaptopropanoico (MPA) 0.1 m en metanol, pH 10 y se agitaron durante una hora a temperatura ambiente, luego se agregaron 10 mL de acetato de etilo. La mezcla luego se sometió a centrifugación a 4,100 x g durante 15 minutos. Las GNP precipitadas luego se lavaron con 30 mL de agua D.D. esterilizada tres veces y se volvieron a suspender en 20 mL de tampón de MES (C6Hi3N04S . xH20) 100 mM, pH 5.5. A esta mezcla, se agregaron soluciones de polioxietileno bis (amina) 0.5 M (a una proporción de 10,000:1 PEG/GNP) y l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) 0.1 M (concentración EDC final 2 mM) . La mezcla luego se agitó durante 4 horas. Las GNP pegiladas se lavaron con 3 X 30 mL de agua D.D. esterilizada para eliminar el exceso de PEG y EDC.
Conjugación de pMHC. Las GNP pegiladas se volvieron a suspender en 20 mL de tampón MES (C6Hi3N04S . XH20) 100 mM, pH 5.5. pMHC (5 mg/mL, 10-30 mg totales) luego se agregaron a las GNP resuspendidas (proporción de 500:1 pMHC/GNP) , gota a gota y se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente antes de agregar l-etil-3- ( 3-dimetilaminopropil ) carbodiimida (EDC) 0.1 M (concentración final de EDC 2 mM) . La mezcla se agitó durante 4 horas más. Los conjugados de pMHC-GNP se lavaron tres veces con 40 mL de solución salina amortiguadora con fosfatos (PBS, PH 7.2-7.4) y luego se volvieron a suspender en 10-20 mL de PBS.
Ejemplo 11 Preparación, caracterización y análisis funcionales de nanoparticulas de óxido de hierro conjugadas con IGRP206- 2i Kd y un anticuerpo anti-CD28 agonista, para potenciar la activación de los linfocitos T CD8+ cognados que no recibieron tratamiento previo Las nanopartículas de óxido de hierro (Fe304 NP) se sintetizaron utilizando un método de descomposición térmica, y el tamaño de los NP se midió utilizando microscopía electrónica de transmisión (TE ) (9.4 nm) .
Las partículas sintetizadas luego se conjugaron con ligadores de dopamina-PEG con grupos funcionales de 3.4 KD diseñados tanto para estabilizar las nanopartículas como para que funcionen como aceptores de ligandos estimuladores de linfocitos. Estas nanopartículas pegiladas luego se conjugaron con un anticuerpo monoclonal anti-CD28 agonista (clon 37.51 mAb; un receptor para activación de linfocito para la molécula co-estimuladora B7.1) y/o múltiples copias de un complejo mayor de histocompatibilidad con péptido (pMHC) dirigido por una población significativa de linfocitos T CD8+ en ratones diabéticos non obesos (NOD) ( IGRP206-214/Kd) . La densidad de las nanopartículas se determinó al medir el contenido de hierro en las muestras. La valencia de pMHC y el anticuerpo en las preparaciones de nanopartículas conjugadas con mAb anti-pMHC/CD28 se determinó mediante un método dot-ELISA que emplea anticuerpos de HC e IgG-específieos como reactivos para detección para pMHC y mAb anti-CD28, respectivamente. Las figuras 7 y 8 muestran imágenes TEM representativas que muestran que tanto pMHC/mAb anti-CD28-( figura 7) como las preparaciones de nanoparticulas conjugadas con pMHC (figura 8) se monodispersaron y tuvieron contenidos similares de hierro (nanoparticulas y valencias pMHC - Los resultados de los análisis de electroforesis en gel de agarosa mostraron que las nanoparticulas sin conjugar control no contuvieron moléculas de proteínas, según se esperó (véase la falta de tinción con azul Coomassie en la línea 3 de la figura 9B) . Por el contrario, las preparaciones de nanoparticulas conjugadas con proteínas se tiñeron con azul Coomassie (líneas 4 y 5 de la figura 9B) y la tinción co-migró con la señal de hierro (líneas 4 y 5 de la figura 9A) . La electroforesis de estas preparaciones en geles de poliacrilamida al 5% indicaron adicionalmente que virtualmente todo el contenido de proteínas en ambas preparaciones estuvo sobre las nanoparticulas, con niveles no detectables de proteína no conjugada en la solución (figura 9C) . Como se esperaba, las nanoparticulas, a diferencia de los monómeros de pMHC sin conjugar control en solución, no migraron en el gel a causa de su tamaño.
Enseguida se compararon las capacidades de las nanoparticulas conjugadas con pMHC y pMHC/mAb anti-CD28 para estimular y activar los linfocitos T CD8+ que no han recibido tratamiento previo cognados derivados de un ratón NOD transgénico que expresa un transgén TCR IGRP206-2i4Kd-reactivo . Esto se realizó al medir las actividades proliferativas y para secreción de interferón-gamma de los linfocitos T CD8+ de estos ratones (paneles derecho e izquierdo en las figuras 10A y 10B, respectivamente) (2.5 x 105 células/mL) en respuesta a las preparaciones de nanoparticulas diluidas en serie. Como se muestra en la figura 10A, 10B, las nanoparticulas conjugadas con p HC/mAb anti-CD28 (figura 10B) tuvieron una actividad agonista significativamente superior que las nanoparticulas recubiertas con pMHC solo (figura 10A) . Las nanoparticulas conjugadas con pMHC/mAb anti-CD28 indujeron una proliferación máxima (figura 10B, panel derecha) y la secreción de interferón-gamma (figura 10B, panel izquierdo) a bajas densidades de nanoparticulas y estos valores fueron sustancialmente superiores que los valores máximos obtenidos para las nanoparticulas conjugadas con pMHC (figura 10A) a las mayores densidades probadas.
Ejemplo 12 Expresión, purificación y caracterización funcional de una proteina de fusión recombinante de ratón B7.1-hFc Idealmente, las nanoparticulas recubiertas con pMHC dirigidas a activar los linfocitos T naturales se podrían recubrir con una variación total ,de moléculas co-estimuladoras capaces de atraer los receptores cognados para transducción de señal sobre la superficie de los linfocito T (es decir, CD28 para B7.1, al igual que en el caso del mAb anti-CD28) . Esto podría ser particularmente útil para los receptores para los cuales no están disponibles los mAbs agonistas. Para probar la factibilidad de este procedimiento, se generó una estructura de ADN que codifica para una proteína de fusión B7.1 (mB7.1)-Fc de ratón (utilizando un GS flexible ligado separando las porciones B7.1 y hFc) para expresión en células de Drosophila S2 (utilizando el vector pMT/V5) o células de ovario de hámster chino (CHO) (utilizando un vector pcDNA3.3). La proteína de fusión incluye un fragmento mB7.1 (209 a. a., D37-K245), seguido por la región CH2 de IgGl (hlgGl) (227 a. a,) humano. La proteína de fusión se purificó a partir de los sobrenadantes de cultivo mediante cromatografía por afinidad en la proteína A-Sepharosa. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la proteína de fusión se muestran en las figuras 11A y 11B.
Para probar la actividad co-estimuladora de la fusión de mB7.1-hFc, se purificaron linfocitos T CD4+ naturales a partir de NOD tipo silvestre y se cultivaron en presencia de diluciones en serie de mB7.1-hFc en presencia de una concentración sub-óptima de un mAb anti-CD3 agonista inmovilizado sobre las placas. Los cultivos incubados sólo en presencia del mAb anti-CD3 inmovilizado o mAb anti-CD28 solo (controles negativos) no proliferaron (proporcionando niveles antecedentes de la incorporación de H3 timidina; datos no mostrados) . La adición del mAb anti-CD28 a cultivos en placas recubiertas con mAb anti-CD3 aumentaron dramáticamente los niveles de la incorporación de H3 timidina (control positivo). La adición de mB7.1-hFc a cultivos colocados en placa en presencia de concentraciones suboptimas de mAb anti-CD3 indujeron aumentos dependientes de la concentración en la actividad proliferativa de los linfocitos T CD4+ naturales, sin importar si se produjo la proteína de fusión en células S2 o CHO (figura 12) . Esto demuestra que la proteína de fusión según se diseñó puede suministrar efectivamente una señal co-estimuladora a los linfocitos T TCR-estimulados . Este diseño por lo tanto, servirá como una plantilla para la manipulación mediante ingeniería de las proteínas de fusión que codifican para otras moléculas co-estimuladoras que se conjugarán sobre las nanopartículas recubiertas con p HC para la activación y expansión de los linfocitos T antígeno- específicos in vivo.
De esta forma, se debe entender que aunque la presente invención se ha descrito específicamente por las modalidades preferidas y características opcionales, se puede recurrir a modificaciones, mejoras y variaciones de las invenciones incorporadas y descritas en la presente por parte de aquellos expertos en la técnica y que estas modificaciones, mejoras y variaciones se considera que quedan dentro del alcance de esta invención. Los materiales, métodos y ejemplos proporcionados en la presente son representativos de las modalidades preferidas, son ilustrativos, y no se pretende que sean limitaciones sobre el alcance de la invención.
La invención se ha descrito amplia y genéricamente en la presente. Cada una de las especies más estrechas y agrupamientos sub-genéricos que quedan dentro de la descripción genérica también forman parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa que elimine cualquier material del género sin importar que se haya o no eliminado material mencionado específicamente en la presente.
Además, cuando se describan características o aspectos de la invención en los términos de grupos Markush, aquellos expertos en la técnica reconocerán que la invención por lo tanto también se describe en los términos de cualquier miembro individual o sub-grupo de miembros del grupo Markush.
A todo lo largo de esta descripción, se hace referencia mediante una cita de identificación a diversas publicaciones, patentes y especificaciones de patente publicadas. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan expresamente con referencia en su totalidad, al mismo grado en que si cada una se hubiera incorporado como referencia individualmente. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluyendo las definiciones.

Claims (34)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :
1. Un método para tratar un tumor o cáncer en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto un complejo de antigenos/MHC/moléculas co-estimuladoras acopladas funcionalmente a una nanoparticula en una cantidad suficiente para expandir una población de linfocitos T antigeno-especificos de anti-tumorigénicos específicos para el tumor o cáncer, con lo cual tratar el tumor o cáncer.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la población expandida de linfocitos T anti-tumorigénicos son linfocitos T de memoria antigeno-especifico anti-tumorigénicos.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende administrar los complejos de antigenos/MHC/nanoparticulas sin moléculas co-estimuladoras .
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la nanoparticula está entre aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 100 nm de diámetro.
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la nanoparticula está entre aproximadamente 5 nm hasta aproximadamente 15 nm de diámetro.
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los linfocitos T antigeno-especificos anti-tumorigénicos son linfocitos T CD8+.
7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el tumor es un tumor canceroso.
8. Un método para expandir y/o desarrollar poblaciones de linfocitos T antigeno-especificos anti-tumorigénicos en un sujeto, el método caracterizado porque comprende administrar al sujeto un complejo de antígenos/MHC/molécula co-estimuladora/nanoparticulas en una cantidad y frecuencia suficiente para expandir y/o desarrollar las poblaciones.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque los linfocitos T antigeno-especificos anti-tumorigénicos que están expandidos son linfocitos T de memoria .
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque comprende administrar una cantidad efectiva de los complejos de antigenos/MHC/nanopartículas sin moléculas co-estimuladoras.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque la nanopartícula está entre aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm de diámetro.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la nanopartícula está entre aproximadamente 5 nm a aproximadamente 15 nm de diámetro.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque los linfocitos T antígeno-específico anti-tumorigénicos son linfocitos T CD8+.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque una pluralidad de epítopes antigénicos idénticos y no idénticos están contenidos en el complejo de antígenos/MHC/molécula co-estimuladora/nanopartículas .
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la pluralidad de epítopes antigénicos se derivan de un solo antígeno.
16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la pluralidad de epítopes antigénicos se derivan de una pluralidad de antígenos.
17. Un complejo de antígenos/MHC/molécula co- estimuladora/nanopartículas caracterizado porque comprende una molécula de antígeno/ HC/co-estimuladora, un núcleo biocompatible y un recubrimiento biodegradable sobre la superficie externa del núcleo.
18. El complejo de antigenos/MHC/molécula co-estimuladora/nanoparticulas de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el núcleo biocompatible comprende óxido de hierro (III).
19. El complejo de antigenos/MHC/molécula co-estimuladora/nanoparticulas de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el recubrimiento biodegradable es uno o más de dextrano, manitol, y poli (etilenglicol) .
20. El complejo de antigenos/MHC/molécula co-estimuladora/nanopartículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque la nanopartícula está unida covalentemente al grupo MHC del complejo de antígenos/MHC y además en donde la unión es opcionalmente vía un ligador.
21. El complejo de antigenos/MHC/molécula co- estimuladora/nanopartículas de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la nanopartícula está unida covalentemente al grupo co-estimulador y además porque la unión es opcionalmente via un ligador.
22. Un método para inhibir el crecimiento de un tumor o para tratar el cáncer en un paciente al administrar un complejo de antigenos/MHC/molécula co-estimuladora acoplado funcionalmente a una nanoparticula al paciente en una cantidad suficiente para expandir los linfocitos T antigeno-especificos anti-tumorigénicos, en donde la molécula de MHC del complejo comprende moléculas tanto de MHC de clase I como de MHC clase II.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque los linfocitos T antigeno-especificos anti-tumorigénicos son linfocitos T de memoria.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque comprende administrar los complejos de antigenos/MHC/nanoparticulas sin moléculas co-estimuladoras en una cantidad suficiente para expandir y/o activar los linfocitos T de memoria antigeno-especificos .
25. El método de conformidad con las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque la nanoparticula está entre aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm de diámetro.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la nanoparticula está entre aproximadamente 5 nm a aproximadamente 15 nm de diámetro.
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque los linfocitos T antigeno-especifico anti-tumorigénicos son CD8+.
28. Un complejo caracterizado porque comprende: (a) una nanopartícula; (b) un complejo de antígeno-MHC acoplado a la nanopartícula; (c) una molécula co-estimuladora acoplada a la nanopartícula .
29. La partícula de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el diámetro de la nanopartícula está entre aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm.
30. La partícula de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el diámetro de la nanopartícula está entre aproximadamente 5 nm a aproximadamente 15 nm.
31. Un complejo caracterizado porque comprende: (a) una nanopartícula; (b) una molécula co-estimuladora acoplada a la nanopartícula .
32. La partícula de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el diámetro de la nanopartícula está entre aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm.
33. La partícula de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el diámetro de la nanoparticula está entre aproximadamente 5 nm a aproximadamente 15 nm.
34. Un método para inhibir la metástasis de un cáncer en un paciente, el método caracterizado porque comprende administrar a un sujeto un complejo de antigenos/MHC/molécula co-estimuladoras acoplado funcionalmente a una < nanoparticula a un sujeto en una cantidad suficiente para expandir la población de linfocitos T antigeno-especifico anti-tumorogénico, en donde la población expandida es suficiente para tratar el cáncer en donde el antigeno es especifico para el tumor, en donde la administración proporciona una circulación sistémica del complejo en el paciente.
MX2013004581A 2010-11-12 2011-11-11 Composiciones para tratar cáncer y usos de las mismas. MX350203B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41333010P 2010-11-12 2010-11-12
PCT/EP2011/069931 WO2012062904A2 (en) 2010-11-12 2011-11-11 Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2013004581A true MX2013004581A (es) 2013-10-01
MX350203B MX350203B (es) 2017-08-30

Family

ID=44983530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2013004581A MX350203B (es) 2010-11-12 2011-11-11 Composiciones para tratar cáncer y usos de las mismas.

Country Status (14)

Country Link
US (3) US9511151B2 (es)
EP (1) EP2637700A2 (es)
JP (2) JP5991979B2 (es)
KR (1) KR20140037789A (es)
CN (2) CN103260648B (es)
AU (2) AU2011328077A1 (es)
BR (1) BR112013007064A2 (es)
CA (1) CA2817710C (es)
IL (1) IL225471B (es)
MX (1) MX350203B (es)
NZ (1) NZ608695A (es)
RU (2) RU2017119820A (es)
SG (2) SG10201509279QA (es)
WO (1) WO2012062904A2 (es)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140105980A1 (en) * 2012-10-11 2014-04-17 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
DK2131856T3 (da) * 2007-03-07 2014-12-15 Uti Limited Partnership Sammensætninger og fremgangsmåder til forebyggelsen og behandlingen af autoimmune tilstande
CA2813064C (en) * 2010-09-29 2021-06-01 Uti Limited Partnership Methods for treating autoimmune disease using biocompatible bioabsorbable nanospheres
US9511151B2 (en) * 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
US10988516B2 (en) 2012-03-26 2021-04-27 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating inflammation
WO2013184938A2 (en) * 2012-06-08 2013-12-12 Alkermes. Inc. Fusion polypeptides comprising mucin-domain polypeptide linkers
EP2711418B1 (en) * 2012-09-25 2017-08-23 Miltenyi Biotec GmbH Method for polyclonal stimulation of T cells by flexible nanomatrices
US10548957B2 (en) * 2012-09-28 2020-02-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Targeted expansion of Qa-1-peptide-specific regulatory CD8 T cells to ameliorate arthritis
US9603948B2 (en) 2012-10-11 2017-03-28 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
ES2902413T3 (es) 2013-06-24 2022-03-28 Neximmune Inc Composiciones y procedimientos de inmunoterapia
ES2612918T3 (es) 2013-07-10 2017-05-19 Miltenyi Biotec Gmbh Método para inducir la proliferación de células asesinas naturales por nanomatrices móviles
SG10201912301XA (en) 2013-11-04 2020-02-27 Uti Lp Methods and compositions for sustained immunotherapy
TWI689310B (zh) 2014-07-11 2020-04-01 巨生生醫股份有限公司 治療鐵缺乏症之方法
CN106317202A (zh) * 2014-09-05 2017-01-11 马恒标 大蒜中提取得到的抗肿瘤活性的多肽
SG10202104804PA (en) 2014-10-20 2021-06-29 Juno Therapeutics Inc Methods and compositions for dosing in adoptive cell therapy
IL286025B2 (en) 2014-12-24 2023-11-01 Neximmune Inc Nanoparticle preparations and immunotherapy methods
US12011480B2 (en) 2015-05-06 2024-06-18 Uti Limited Partnership Nanoparticle compositions for sustained therapy
KR102080107B1 (ko) * 2015-05-14 2020-02-21 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈 순환되는 종양세포를 바이오마커로 사용하여 암 치료요법의 효율을 모니터링 하는 방법
EP3303635B1 (en) 2015-06-01 2021-09-01 California Institute of Technology Compositions and methods for screening t cells with antigens for specific populations
WO2018094570A1 (zh) * 2016-11-22 2018-05-31 深圳华大基因研究院 多肽及其应用
CA3053539A1 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Juno Therapeutics, Inc. Compositions, articles of manufacture and methods related to dosing in cell therapy
US12258613B2 (en) 2017-03-08 2025-03-25 California Institute Of Technology Pairing antigen specificity of a T cell with T cell receptor sequences
RU2019135533A (ru) 2017-04-07 2021-05-07 Ютиай Лимитед Партнершип Анализ измерения эффективности рецепторно-лигандных взаимодействий в лекарственных нанолекарственных средствах
WO2018232318A1 (en) * 2017-06-16 2018-12-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Materials and methods for increasing immune responses
JP2020528747A (ja) * 2017-07-21 2020-10-01 バークレー ライツ，インコーポレイテッド 抗原提示合成表面、共有結合官能化表面、活性化ｔ細胞及びそれらの使用
WO2019089858A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy
WO2019089855A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Process for generating therapeutic compositions of engineered cells
CN111741746A (zh) 2017-11-29 2020-10-02 乌第有限合伙公司 治疗自身免疫性疾病的方法
US12161670B2 (en) 2017-12-08 2024-12-10 Juno Therapeutics, Inc. Phenotypic markers for cell therapy and related methods
CN108359013A (zh) * 2018-02-07 2018-08-03 上海交通大学 一种人工抗原递呈纳米制剂及其用于体内外扩增特异性t细胞的应用
WO2020061499A1 (en) * 2018-09-21 2020-03-26 Berkeley Lights, Inc. Functionalized well plate, methods of preparation and use thereof
CN114341175A (zh) * 2019-05-23 2022-04-12 乌第有限合伙公司 包含非经典mhc的纳米颗粒及其用途
US20220249389A1 (en) 2019-07-12 2022-08-11 Oregon Health & Science University Immunotherapeutic constructs and methods of their use
MX2019015508A (es) 2019-12-18 2021-06-21 Univ Guadalajara Nanopartículas para el tratamiento del cáncer.
AU2022241762A1 (en) 2021-03-24 2023-09-14 Mural Oncology, Inc. Upar antibodies and fusion proteins with the same
CN113403276A (zh) * 2021-06-23 2021-09-17 河北大学 抗体功能化的外泌体制剂及其制备方法和应用
WO2024130393A1 (en) * 2022-12-21 2024-06-27 Moskovchenko Svitlana Nanoparticle and method of synthesis thereof

Family Cites Families (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1000470A (en) 1908-02-11 1911-08-15 Frank C Widmann Ring-mold.
US1017295A (en) 1910-08-20 1912-02-13 Adolph F Hensler Journal-box.
US1048588A (en) 1911-05-05 1912-12-31 Adams & Westlake Co Pole-changer.
US1008080A (en) 1911-07-15 1911-11-07 Jacub Schwartzman Bed-spring.
US1012404A (en) 1911-07-29 1911-12-19 Frederick L S Means Protective caster.
US1044155A (en) 1912-04-11 1912-11-12 Diamond Match Co Splint-drying means for match-machines.
US4367110A (en) 1979-07-02 1983-01-04 Toppan Printing Co. Decorative laminate and a manufacturing method therefor
US4452901A (en) 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
GB2097032B (en) 1981-04-22 1984-09-19 Teron International Urban Dev A combined ceiling air and services distribution system mechanical chasse and structural roof member
US4478946A (en) 1981-07-02 1984-10-23 South African Inventions Development Corporation Carrier bound immunosorbent
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
DE3377484D1 (en) 1982-04-19 1988-09-01 Nissan Motor Method for controlling reduction ratio of continuously variable transmission with acceleration compensation
US4818542A (en) 1983-11-14 1989-04-04 The University Of Kentucky Research Foundation Porous microspheres for drug delivery and methods for making same
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
ATE66469T1 (de) 1985-01-14 1991-09-15 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
US5171582A (en) 1985-07-31 1992-12-15 Ghent William R Treatment of iodine deficiency diseases
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US5258499A (en) 1988-05-16 1993-11-02 Vestar, Inc. Liposome targeting using receptor specific ligands
US5260422A (en) 1988-06-23 1993-11-09 Anergen, Inc. MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US6106840A (en) 1988-06-23 2000-08-22 Anergen, Inc. MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US4859839A (en) 1988-07-08 1989-08-22 Counter Computer Corporation Point-of-sale terminal for laundry or dry cleaning establishments
US5543390A (en) 1990-11-01 1996-08-06 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
DE69232875T2 (de) 1991-04-23 2003-08-21 Anergen, Inc. MHC-Konjugate zur Verbesserung der Autoimmunität.
US5200189A (en) 1991-07-23 1993-04-06 Ecolab Inc. Peroxyacid antimicrobial composition
CA2130997A1 (en) 1992-02-27 1993-09-02 C. Garrison Fathman Early antigen for autoimmune diabetes
JP2631436B2 (ja) 1992-07-24 1997-07-16 徳厚 小島 排水立て管継手
US5972336A (en) 1992-11-03 1999-10-26 Oravax Merieux Co. Urease-based vaccine against helicobacter infection
AU2076895A (en) 1994-03-28 1995-10-17 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Liposomes
US6103379A (en) 1994-10-06 2000-08-15 Bar-Ilan University Process for the preparation of microspheres and microspheres made thereby
WO1996018105A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 The President And Fellows Of Harvard College Single chain t-cell receptor
DE19508058A1 (de) 1995-02-21 1996-08-22 Schering Ag Verfahren zur Herstellung von DTPA-Tetraestern der terminalen Carbonsäuren und deren Verwendung zur Herstellung pharmazeutischer Mittel
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840839A (en) 1996-02-09 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein
US6033864A (en) 1996-04-12 2000-03-07 The Regents Of The University Of California Diagnosis, prevention and treatment of ulcerative colitis, and clinical subtypes thereof, using microbial UC pANCA antigens
US20050003431A1 (en) 1996-08-16 2005-01-06 Wucherpfennig Kai W. Monovalent, multivalent, and multimeric MHC binding domain fusion proteins and conjugates, and uses therefor
DE69730038T2 (de) 1996-08-16 2004-11-25 The President And Fellows Of Harvard College, Cambridge Lösliche monovalente und multivalente mhc klasse ii fusionsproteine und deren verwendungen
AU741130B2 (en) 1997-09-16 2001-11-22 Oregon Health Sciences University Recombinant MHC molecules useful for manipulation of antigen-specific T-cells
BR9908082A (pt) 1998-02-19 2000-10-31 Harvard College Proteìna de fusão do complexo de histocompatibilidade principal classe ii, conjugado dos domìnios de ligação do complexo de histocompatibilidade principal multimérico, processos para detectar células t tendo uma especificidade do complexo definido de mhc / peptìdeo, para conferir a um indivìduo imunidade adotiva a um complexo definido de mhc / peptìdeo, para estimular ou ativar as células t reativas a um complexo definido de mhc / peptìdeo, para seletivamente matar células t reativas a um complexo definido de mhc / peptìdeo, para tolerizar um indivìduo humano a um complexo definido de mhc / peptìdeo, e, ácido nucleico isolado
EP1094828A4 (en) 1998-05-07 2005-01-26 Univ California USE OF TARGETED, NEGLIGATED TISSUE ANTIGENS TO MODULATE IMMUNE REACTIONS
DE19825371A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Bayer Ag Elektrochrome Anzeigevorrichtung mit isolierten Zuleitungen
IL125608A0 (en) 1998-07-30 1999-03-12 Yeda Res & Dev Tumor associated antigen peptides and use of same as anti-tumor vaccines
US7807377B2 (en) * 1998-10-20 2010-10-05 Salvatore Albani Method of isolating antigen-specific T cells employing artificial antigen presenting cells
US6150022A (en) 1998-12-07 2000-11-21 Flex Products, Inc. Bright metal flake based pigments
JP2000213425A (ja) 1999-01-20 2000-08-02 Hino Motors Ltd Ｅｇｒク―ラ
US7090973B1 (en) 1999-04-09 2006-08-15 Oscient Pharmaceuticals Corporation Nucleic acid sequences relating to Bacteroides fragilis for diagnostics and therapeutics
HUP0201222A3 (en) 1999-05-06 2004-07-28 Genetics Inst Llc Delaware All Use of soluble constimulatory molecules to enhance immune responses
CA2386377A1 (en) 1999-10-06 2001-04-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell targeting compositions and methods of using the same
US6585947B1 (en) 1999-10-22 2003-07-01 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Method for producing silicon nanoparticles
US6651655B1 (en) 2000-01-18 2003-11-25 Quadrant Technologies Limited Inhaled vaccines
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
KR100379250B1 (ko) 2000-12-04 2003-04-08 한국과학기술연구원 나노 단위 크기의 금속 입자가 함유된 고분자 복합 소재및 그 제조 방법
US7094555B2 (en) 2001-04-05 2006-08-22 Benaroya Research Institute At Virginia Mason Methods of MHC class II epitope mapping, detection of autoimmune T cells and antigens, and autoimmune treatment
DE10117858A1 (de) 2001-04-10 2002-10-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt MHC-Tetramere
EP1399740A2 (en) 2001-06-22 2004-03-24 The University of British Columbia Type 1 diabetes diagnostics and therapeutics
US20070129307A1 (en) 2001-06-22 2007-06-07 The University Of British Columbia Insulin epitopes for the treatment of type 1 diabetes
US20030124149A1 (en) 2001-07-06 2003-07-03 Shalaby Shalaby W. Bioactive absorbable microparticles as therapeutic vaccines
EP1990040A1 (en) 2001-07-10 2008-11-12 North Carolina State University Nanoparticle delivery vehicle
DE10144252A1 (de) 2001-08-31 2003-03-27 Fraunhofer Ges Forschung Nanopartikel mit daran immobilisiertem biologisch aktivem TNF
ATE403751T1 (de) 2001-11-09 2008-08-15 Nanosphere Inc Biokonjugat-nanopartikelsonden
DK1581119T3 (da) 2001-12-17 2013-05-13 Corixa Corp Sammensætninger og fremgangsmåder til terapi og diagnose af inflammatoriske tarmsygdomme
US6688494B2 (en) 2001-12-20 2004-02-10 Cima Nanotech, Inc. Process for the manufacture of metal nanoparticle
US7285289B2 (en) 2002-04-12 2007-10-23 Nagy Jon O Nanoparticle vaccines
US20040115216A1 (en) 2002-07-12 2004-06-17 The Johns Hopkins University Reagents and methods for engaging unique clonotypic lymphocyte receptors
DE10310261A1 (de) 2003-03-05 2004-09-23 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Identifizierung von Antigen-Epitopen
US20040197304A1 (en) 2003-04-01 2004-10-07 The Procter & Gamble Company And Alimentary Health, Ltd. Methods of determining efficacy of treatments of inflammatory diseases of the bowel
US6929675B1 (en) 2003-04-24 2005-08-16 Sandia Corporation Synthesis metal nanoparticle
US20050118102A1 (en) 2003-04-28 2005-06-02 Intematix Corporation Spin resonance heating and/or imaging in medical applications
DK1623017T3 (da) 2003-05-08 2011-01-10 Life Technologies Corp Frembringelse og isolering af antigenspecifikke T-celler
US8758767B2 (en) 2003-05-20 2014-06-24 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Antigens targeted by prevalent pathogennic T cells in type 1 diabetes and uses thereof
US7060121B2 (en) 2003-06-25 2006-06-13 Hsing Kuang Lin Method of producing gold nanoparticle
WO2005007673A2 (en) 2003-07-03 2005-01-27 Rush University Medical Center Immunogenic peptides
US9149440B2 (en) 2003-09-02 2015-10-06 University Of South Florida Nanoparticles for drug-delivery
GB0321937D0 (en) 2003-09-19 2003-10-22 Univ Liverpool Nanoparticle conjugates and method of production thereof
CA2540633C (en) 2003-10-09 2012-12-04 Emerson Electric Co. Valve assembly
DE102004023187A1 (de) 2004-05-11 2005-12-01 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
EP1768692B8 (en) 2004-07-01 2015-06-17 Yale University Targeted and high density drug loaded polymeric materials
JP5117191B2 (ja) 2004-10-01 2013-01-09 ミダテック リミテッド 抗原及びアジュバントを含むナノ粒子、並びに免疫原性構造
WO2006054806A1 (ja) 2004-11-22 2006-05-26 Locomogene, Inc. クローン病関連自己抗原
US7462446B2 (en) 2005-03-18 2008-12-09 University Of Washington Magnetic nanoparticle compositions and methods
US20070059775A1 (en) 2005-03-29 2007-03-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Synthesis and conjugation of iron oxide nanoparticles to antibodies for targeting specific cells using fluorescence and MR imaging techniques
US7562421B2 (en) 2005-04-03 2009-07-21 Magen Eco Energy A.C.S. Ltd. Connecting clasp
US7326399B2 (en) 2005-04-15 2008-02-05 Headwaters Technology Innovation, Llc Titanium dioxide nanoparticles and nanoparticle suspensions and methods of making the same
JPWO2007024026A1 (ja) 2005-08-25 2009-03-05 明石　満 Ｔ細胞認識エピトープペプチドを固定化又は内包化した生分解性ナノ粒子
CA2631714C (en) 2005-12-02 2014-09-16 Novartis Ag Nanoparticles for use in immunogenic compositions
WO2007084775A2 (en) 2006-01-20 2007-07-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for modulation of suppressor t cell activation
PT2476435T (pt) 2006-08-11 2018-03-05 Life Sciences Res Partners Vzw Péptidos imunogénicos e a sua utilização em distúrbios imunitários
US7816814B1 (en) 2006-08-18 2010-10-19 Hennessy Michael J Bi-directional power converters
JP2010530955A (ja) 2006-12-29 2010-09-16 ユニヴァーシティ オブ ワシントン 二重機能性非汚染表面および材料
US8889117B2 (en) 2007-02-15 2014-11-18 Yale University Modular nanoparticles for adaptable vaccines
US20150250871A1 (en) 2007-03-07 2015-09-10 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
US20140105980A1 (en) 2012-10-11 2014-04-17 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
DK2131856T3 (da) * 2007-03-07 2014-12-15 Uti Limited Partnership Sammensætninger og fremgangsmåder til forebyggelsen og behandlingen af autoimmune tilstande
US20100151031A1 (en) 2007-03-23 2010-06-17 Desimone Joseph M Discrete size and shape specific organic nanoparticles designed to elicit an immune response
EP2167537A2 (en) * 2007-07-03 2010-03-31 Dako Denmark A/S Compiled methods for analysing and sorting samples
WO2009013741A2 (en) 2007-07-22 2009-01-29 Camtek Ltd Method and system for controlling a manufacturing process
JP5085240B2 (ja) 2007-09-03 2012-11-28 日本電波工業株式会社 水晶デバイス及び水晶デバイスの製造方法
US9295736B2 (en) 2007-09-24 2016-03-29 Bar Ilan University Polymer nanoparticles coated by magnetic metal oxide and uses thereof
WO2009064273A1 (en) 2007-11-16 2009-05-22 Paul Appelbaum Apparatus and method for packaging articles in clear plastic packages
EP2231181B1 (en) 2007-12-17 2016-02-17 Marfl AB New vaccine for the treatment of mycobacterium related disorders
US8629098B2 (en) 2008-01-15 2014-01-14 Yale University Compositions and methods for adoptive and active immunotherapy
EP2240782A2 (en) 2008-02-04 2010-10-20 Ulive Enterprises Limited Nanoparticle conjugates
EP2262480B1 (en) 2008-03-04 2018-02-14 Liquidia Technologies, Inc. Immunomodulator particles
WO2009126835A2 (en) 2008-04-09 2009-10-15 University Of Washington Techtransfer Invention Licensing Magnetic nanoparticle and method for imaging t cells
US20090258355A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Brookhaven Science Associates, Llc Nanoscale Clusters and Methods of Making Same
CA2735006A1 (en) 2008-08-25 2010-03-11 Amplimmune, Inc. Pd-1 antagonists and methods of use thereof
US8323696B2 (en) 2008-08-29 2012-12-04 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Nanoparticles for immunotherapy
US20110318380A1 (en) 2008-10-01 2011-12-29 Dako Denmark A/S MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring
WO2010037397A1 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cmv immune monitoring
US8343497B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Targeting of antigen presenting cells with immunonanotherapeutics
CA2642141A1 (en) 2008-10-20 2010-04-20 Innovative Microelectronics Inc. Flange alignment pin
CA2743590A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Yeda Research And Development Co. Ltd. Diagnosis of multiple sclerosis
WO2010080032A2 (en) 2009-01-09 2010-07-15 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Bead-assisted viral transduction
CA2750098A1 (en) 2009-01-20 2010-07-29 Myelin Repair Foundation, Inc. Compositions and methods for induction of antigen-specific tolerance
US8383085B2 (en) 2009-05-29 2013-02-26 University Of Manitoba Methods of making iron-containing nanoparticles
US10464987B2 (en) 2009-10-06 2019-11-05 Abbvie Inc. Human single-chain T cell receptors
GB0922066D0 (en) 2009-12-17 2010-02-03 Univ Belfast Modulator
GB201003088D0 (en) 2010-02-24 2010-04-14 Univ Exeter Method for the preparation of a novel nanoparticle conjugate
ES2645509T3 (es) 2010-07-26 2017-12-05 Qu Biologics Inc Composiciones antiinflamatorias inmunogénicas
JP6108112B2 (ja) 2010-08-25 2017-04-05 ラオ ダヴルリ，ラマモハン 改良されたルフィナミド調製プロセス
KR20130107293A (ko) 2010-09-03 2013-10-01 오레곤 헬스 앤드 사이언스 유니버시티 공유 결합된 펩티드를 갖는 재조합 ｔ 세포 수용체 리간드
CA2813064C (en) 2010-09-29 2021-06-01 Uti Limited Partnership Methods for treating autoimmune disease using biocompatible bioabsorbable nanospheres
US9511151B2 (en) 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
WO2013034726A1 (en) 2011-09-07 2013-03-14 Midatech Limited Nanoparticle-peptide compositions
EP2758780A4 (en) 2011-09-22 2015-09-16 Marv Entpr Llc METHOD OF TREATING MULTIPLE SCLEROSIS
EP2591801A1 (en) 2011-11-14 2013-05-15 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Nanoparticle compositions for generation of regulatory T cells and treatment of autoimmune diseases and other chronic inflammatory conditions
US20130128138A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Shenzhen China Star Optoelectronics Technolog Co., LTD. Flat Panel Display Device, Stereoscopic Display Device, Plasma Display Device
JP2015500296A (ja) 2011-12-09 2015-01-05 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ 定義された動的形状を有する人工抗原提示細胞
US10988516B2 (en) 2012-03-26 2021-04-27 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating inflammation
US20150150996A1 (en) 2012-06-06 2015-06-04 Northwestern University Compositions and methods for antigen-specific tolerance
US9603948B2 (en) 2012-10-11 2017-03-28 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
RU2015129640A (ru) 2012-12-21 2017-01-26 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Связанные дисульфидом мультивалентные многофункциональные белки, содержащие молекулы гкгс класса 1
US9335768B2 (en) 2013-09-12 2016-05-10 Lam Research Corporation Cluster mass flow devices and multi-line mass flow devices incorporating the same
SG10201912301XA (en) 2013-11-04 2020-02-27 Uti Lp Methods and compositions for sustained immunotherapy
AU2015279738A1 (en) 2014-06-25 2016-12-22 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment with synthetic nanocarriers and immune checkpoint inhibitors
DK3233903T3 (da) 2014-12-19 2021-02-22 Eth Zuerich Kimære antigenreceptorer og anvendelsesfremgangsmåder
EP3067366A1 (en) 2015-03-13 2016-09-14 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin Combined T cell receptor gene therapy of cancer against MHC I and MHC II-restricted epitopes of the tumor antigen NY-ESO-1
BR112017020750A2 (pt) 2015-03-27 2018-06-26 Harvard College células t modificadas e métodos de produção e utilização das mesmas
US12011480B2 (en) 2015-05-06 2024-06-18 Uti Limited Partnership Nanoparticle compositions for sustained therapy
MA44907A (fr) 2015-09-11 2018-07-18 Agenus Inc Cellules hôtes génétiquement modifiées et leurs procédés d'utilisation
EP3538559B1 (en) 2016-11-09 2025-04-09 UTI Limited Partnership Recombinant pmhc class ii molecules
RU2019135533A (ru) 2017-04-07 2021-05-07 Ютиай Лимитед Партнершип Анализ измерения эффективности рецепторно-лигандных взаимодействий в лекарственных нанолекарственных средствах
CN111741746A (zh) 2017-11-29 2020-10-02 乌第有限合伙公司 治疗自身免疫性疾病的方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL225471B (en) 2018-04-30
CA2817710A1 (en) 2012-05-18
MX350203B (es) 2017-08-30
KR20140037789A (ko) 2014-03-27
SG10201509279QA (en) 2015-12-30
AU2016201498B2 (en) 2018-01-25
US9511151B2 (en) 2016-12-06
NZ608695A (en) 2014-12-24
CN105770906A (zh) 2016-07-20
US20190076545A1 (en) 2019-03-14
EP2637700A2 (en) 2013-09-18
AU2011328077A1 (en) 2013-04-11
US10172955B2 (en) 2019-01-08
RU2017119820A (ru) 2018-11-15
RU2013121571A (ru) 2014-11-20
IL225471A0 (en) 2013-06-27
CN103260648B (zh) 2016-04-13
JP5991979B2 (ja) 2016-09-14
US20120121649A1 (en) 2012-05-17
CA2817710C (en) 2020-11-10
JP2013543855A (ja) 2013-12-09
JP2017014255A (ja) 2017-01-19
AU2016201498A1 (en) 2016-03-24
US11000596B2 (en) 2021-05-11
WO2012062904A2 (en) 2012-05-18
CN103260648A (zh) 2013-08-21
SG189909A1 (en) 2013-06-28
BR112013007064A2 (pt) 2016-09-13
WO2012062904A3 (en) 2012-08-30
RU2623038C2 (ru) 2017-06-21
US20170274096A1 (en) 2017-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11000596B2 (en) Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
JP6899863B2 (ja) 多発性硬化症および関連障害を治療するための方法および組成物
AU2014343379B2 (en) Methods and compositions for sustained immunotherapy
US10905773B2 (en) Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders
JP2021520818A (ja) 癌の予防及び治療のための抗原性ペプチド
HK40009581A (en) Methods and compositions for treating multiple sclerosis and related disorders

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration