ES2612918T3 - Método para inducir la proliferación de células asesinas naturales por nanomatrices móviles - Google Patents
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Abstract
El uso de una nanomatriz para inducir in vitro la proliferación de células NK, comprendiendo la nanomatriz a) una matriz de cadenas poliméricas móviles, y b) unidos a dicha matriz de cadenas poliméricas móviles, uno o más agentes estimuladores que proporcionan señales de activación a las células NK; en el que la nanomatriz tiene un tamaño de 1 a 500 nm, y en el que dichas cadenas poliméricas móviles son de polisacáridos seleccionados del grupo que consiste en éteres de celulosa, almidón, goma arábiga, agarosa, dextrano, quitosano, ácido hialurónico, pectinas, xantano, goma guar y alginato.
Description
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DESCRIPCION
Metodo para inducir la proliferacion de celulas asesinas naturales por nanomatrices moviles Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general al campo de la inmunologfa, en particular a procesos para inducir la proliferacion de celulas asesinas naturales por nanomatrices.
Antecedentes de la invencion
Las celulas asesinas naturales (NK) son una parte importante del sistema inmune innato y estan implicadas en procesos contra enfermedades, tales como el cancer. Las celulas NK estan fenotfpicamente definidas por la expresion de CD56 y la ausencia de CD3 y de moleculas receptoras de las celulas T. Las celulas NK pueden destruir celulas diana sin necesidad de sensibilizacion previa, un efecto que se regula por el equilibrio de las senales estimuladoras e inhibitorias. Es importante destacar que las celulas NK, a diferencia de las celulas T, no inducen la enfermedad de injerto contra huesped (GvHD) en pacientes despues del trasplante alogenico clmico. Estas caractensticas hacen a las celulas NK candidatas altamente prometedoras para aplicaciones clmicas para combatir el cancer a traves de la inmunoterapia adoptiva.
El documento WO2004/056392 describe que los anticuerpos antirreceptores de celulas NK solubles tales como NKp30 y NKp46 pueden inducir una ligera proliferacion de celulas NK a partir de PBMC humanas frescas.
El documento US 5919700 describe un metodo para inducir la proliferacion de celulas NK suplementando medios de cultivo celular con IL-16. Pero la proliferacion inducida por IL-16 da como resultado un enriquecimiento de solo aproximadamente cinco veces de celulas asesinas naturales.
El documento US2003/0068306 A1 describe un metodo para la expansion de celulas NK a partir de celulas mononucleares de sangre periferica usando una combinacion de un medio de cultivo celular especial y citoquina IL-2 y anticuerpo OKT-3. Este metodo se basa en celulas T alimentadoras autologas que son activadas por IL-2 y el anticuerpo anti-CD3 OKT-3 y segregan asf factores solubles al medio de cultivo celular lo que induce la proliferacion en celulas Nk.
El documento US2004/0115198 A1 describe un metodo para expandir celulas efectoras que incluyen celulas NK por entrecruzamiento del receptor NKG2D con un anticuerpo monoclonal.
El documento US2004/0197903 A1 describe un metodo para inducir la proliferacion de celulas NK mediante cocultivo con celulas dendnticas tratadas con cultivos celulares. Se logra una expansion de 10 veces de celulas NK mediante IL- 12, TNF-alfa y GM-CSF secretadas por las celulas dendnticas.
La produccion a gran escala de celulas NK de grado clmico mediante la activacion a largo plazo en cultivos ex vivo es un medio para conseguir el objetivo de mejorar los disenos de ensayos clmicos aumentando la relacion de celulas efectoras a dianas in vivo y mediante la aplicacion de efectores NK citotoxicos superiores. Hasta ahora, para las celulas NK, el cocultivo con lmeas celulares y/o celulas alimentadoras es parte de la mayona de los protocolos de proliferacion (Suck and Koh, 2012, Hematol Oncol Stem Cell Ther 3: 135-142, Cho and Campana, 2009, Korean J Lab Med, 29: 89 - 96, EP 1306427A1, US8026097).
Los dendnmeros encapsulados con fosfonato nanometrico mostraron un ligero aumento en el numero de PBMC y la fenotipificacion de las celulas multiplicadas en cultivos con el dendnmero 3a-G1 revelo la prominencia de las celulas NK. Despues de cuatro semanas en cultivo, se consiguio una multiplicacion media del numero de celulas NK por un factor de 105 en medio suplementado con Il-2 y 3a-Gl, frente a una multiplicacion media solo por un factor de 7,5 en un medio suplementado solo con Il -2 (Griffe et al., 2007, Angew. Chem, 119: 2575 - 2578).
Aunque el uso de superficies de fase solida tales como perlas magneticas de tamano de micras son mas prominentes para la estimulacion y la expansion de celulas T, hay algunas divulgaciones acerca de la estimulacion de celulas NK y tambien de la expansion.
Bryceson y col. (2006, Blood, 107: 159-166) mostraron que las respuestas por las celulas NK en reposo, en ausencia de citoquinas exogenas, pueden ser inducidas por combinaciones de receptores activadores. Las respuestas medidas fueron flujo de Ca2 + _ desencadenado por mAbs entrecruzado en solucion, y secrecion de TNF-a e iFN-y inducida por mAbs unidos a la superficie de la fase solida y perlas de tamano celular (Dynabeads M-450, Dynal, Oslo, Noruega) y citotoxicidad frente a una celula diana FcR + _ en presencia de mAbs dirigidos a receptores de activacion de celulas NK. Se encontro que la combinacion de NKp46 (CD335) y CD2 era suficiente para activar las celulas NK en direccion a la
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liberacion de citoquinas y la citotoxicidad.
El kit de activacion/expansion de celulas NK de Miltenyi Biotec (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania, Pedido n° 130-094-483) esta disenado para activar y expandir celulas Nk humanas. El kit se compone de la superficie de fase solida y las partfculas antibiotina MACSiBead de tamano celular (3,5 pm de tamano) y anticuerpos biotinilados contra CD335 y CD2 humanas. Se utilizan partfculas de antibiotina MACSiBead cargadas con anticuerpos biotinilados para activar y expandir celulas NK en reposo purificadas a partir de sangre o PBMCs humanos.
Contrariamente a las celulas NK, los anticuerpos contra CD3 son un elemento central en muchos protocolos de proliferacion de celulas T policlonales. Inmovilizado en una superficie, el anti-CD3 genera una senal de activacion y de induccion de la proliferacion mediante entrecruzamiento del complejo receptor de celulas T en la superficie de celulas T. Al inmovilizar anti-CD3 y anti-CD28 para suministrar simultaneamente una senal y una senal coestimuladora, puede aumentarse la proliferacion (Baroja y colaboradores (1989), Cellular Immunology, 120: 205-217). En WO09429436A1 se utilizan superficies de fase solida, tales como placas de cultivo y perlas para inmovilizar los anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3. Regularmente, la inmovilizacion en perlas se realiza sobre DynaBeads®M-450 que tienen un tamano de 4,5 pm de diametro, aunque la US2012/0121649 describe un metodo de estimulacion y expansion de celulas T antitumorigenicas espedficas de antigeno que comprende administrar a un sujeto o in vitro un complejo antfgeno/MHC coestimulador de nanopartfculas que tiene un tamano de aproximadamente 1 a 100 nm, en una cantidad suficiente para estimular la expansion de una celula T antitumorigenica espedfica del antigeno.
En la solicitud copendiente No. EP12185939.1 se divulga que los agentes estimulantes de celulas T policlonales tales como anticuerpos, e.g. contra CD3 y CD28, unidos a nanomatrices, que se caracterizan por una superficie no solida, pueden ser utilizados para estimular celulas T ingenuas y con memoria in vitro, aunque su diametro sea menor de 1 pm, preferiblemente menor de 500 nm, mas preferiblemente menor que 200 nm. Contrariamente a lo anterior, se encontro que las perlas con superficies solidas del mismo tamano que las nanomatrices usadas en ellas no son capaces de estimular las celulas T en absoluto o a un nivel similar al de las nanomatrices lo cual esta en concordancia con la opinion bien establecida del experto en la tecnica. Debido a su pequeno tamano, las nanomatrices per se, sin anticuerpos unidos a ellas, no alteran la estructura, la funcion, el estado de actividad o la viabilidad de las celulas, es decir, no causan perturbacion en las celulas y no interfieren en los posteriores analisis, experimentos y aplicaciones terapeuticas de las celulas estimuladas. Ademas, preferiblemente, la nanomatriz es biodegradable y no toxica para las celulas vivas, es decir, la nanomatriz es una entidad biologicamente inerte con respecto a las alteraciones de la funcion celular. Por lo tanto la nanomatriz utilizada en el metodo de EP12185939.1 mejora la estimulacion in vitro de celulas T conservando la viabilidad de las celulas.
Ademas sorprendentemente, se encontro que los agentes estimulantes de celulas T policlonales tales como anticuerpos, e.g. contra CD3 y CD28, unidos a nanomatrices pueden conjugarse a nanomatrices separadas (en lugar de conjugarse con la misma nanomatriz), que pueden mezclarse a continuacion para un uso optimizado. En general, la relacion de nanomatrices a celulas es mayor que 100:1, preferiblemente mayor que 500:1, mas preferiblemente mayor que 1000:1. Esto da como resultado la posibilidad de ajuste fino de las nanomatrices usadas para la estimulacion de las celulas T diana, e.g. facilita el proceso de produccion y el control de calidad de las nanomatrices individuales y mejora la flexibilidad del reactivo, e.g. facilitando la optimizacion de las condiciones de activacion para subconjuntos de celulas T especializadas por titulacion de diversas concentraciones y relaciones CD3 y CD28.
Independientemente de EP12185939.1, era una opinion bien establecida en la comunidad cientffica que las partroulas menores de 1 pm no eran convenientes para estimular las celulas T eficazmente debido a que tales partroulas pequenas no proporcionan suficiente entrecruzamiento para activar celulas T (vease, por ejemplo, US8,012,750B2). Generalmente se cree que el requisito de partroulas de tamano celular es un requisito previo para lograr la activacion de otros tipos celulares tales como celulas NK y no hay indicacion en el estado de la tecnica de que estos requisitos sean diferentes. Especialmente las celulas T y las celulas NK son similares en sus moleculas de senalizacion y sus mecanismos efectores tales como la citotoxicidad mediada por Perforin/Granzyme y Fas/FasL, asf como la induccion de la liberacion de citoquinas.
Por ejemplo, la publicacion de Erin R Steenblock y Tarek M Fahmy (Molecular Therapy vol. 16 no. 4, 765-772 April 2008) utiliza nanopartroulas de superficie solida (130 nm) y muestra que estas nanopartroulas estimulan celulas T mas debiles que las micropartroulas (8 pm). Los autores afirmaron que estos hallazgos estan respaldados por los informes anteriores (Mescher, MF (1992) J Immunol 149: 2402-2405), demostrando que las partroulas de tamano micrometrico, que son de tamano cercano a las celulas T, proporcionan estimulacion optima de celulas T. El estudio de Mescher demostro la importancia cntica de una superficie de contacto superficial grande y continua para una activacion eficaz de CTL. Utilizando aloanrtgeno de clase I inmovilizado sobre microesferas de latex, se encontro que los tamanos de partroula de 4 a 5 micrometros proporcionan un esrtmulo optimo. Por debajo de 4 micras, las respuestas disminuyeron rapidamente con la disminucion del tamano de partroula, y un gran numero de partroulas pequenas no pudo compensar el tamano suboptimo.
Elodie Macho Fernandez et al (2011, International Journal of Pharmaceutics, vol. 423, n ° 1, paginas 45-54) describen el uso de nanopartroulas basadas en PLGA (PLGA es un polfmero amorfo) que comprende KRN7000, que es un activador
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de celulas iNKT (que no son celulas NK) para activar la proliferacion de celulas iNKT in vitro e in vivo. La activacion es indirecta ya que el KRN encapsulado en PLGA puede ser tornado y presentado por el APC esplenico y hepatico para activar in vitro, de una manera dependiente de CDLd, las celulas iNKT.
El documento WO2009/094273A2 describe la construccion de aAPCs polimericas con el proposito de estimular/expandir celulas T. Las partfculas portan uno o multiples elementos funcionales en su superficie para la activacion y expansion de celulas T. Las partfculas pueden ser micropartfculas o nanopartfculas, pero se indica que las aAPCs de micropartfculas son mas eficientes que las aAPC en nanopartfculas en la estimulacion de la activacion de celulas T. Entre las celulas T para estimular con la aAPC estan las celulas NKT pero no las celulas NK. Las unicas partfculas utilizadas en WO2009094273A2 consisten en el polfmero amorfo PLGA.
Reim y colaboradores (2009, Cancer Research, vol. 69, n° 20, paginas 8058-8066) describen el aislamiento de celulas NK y su expansion usando el Kit de Activacion/Expansion de Celulas NK de Miltenyi Biotec mencionado anteriormente que utiliza partfculas de 3,5 pm de tamano.
Tomados juntos, hasta ahora, para las celulas NK el cocultivo con lmeas celulares y/o celulas alimentadoras es parte de la mayona de los protocolos de proliferacion, que albergan el riesgo de contaminar las celulas. Ademas, los compuestos celulares son complejos y no son faciles de definir exactamente y, por tanto, pueden tener una influencia impredecible sobre el sistema de cultivo in vitro en comparacion con sistemas de estimulacion artificial exactamente definidos. Las perlas o microesferas utilizadas en el estado de la tecnica para la activacion de celulas NK a traves de anticuerpos estimuladores de celulas NK inmovilizados se usan raramente. En los pocos ejemplos existentes, las partfculas consisten en una partfcula de tamano de celula esferica solida con ligandos activadores unidos a la superficie. Las perlas de este tamano tienen varias desventajas con respecto a su potencial para interactuar con celulas NK, asf como su produccion, manipulacion y seguridad en procedimientos clmicos de terapias con celulas NK.
1. Debido a la superficie solida de la perla, el tamano del area de interaccion entre la perla y la celula es limitado.
2. Su preparacion es compleja y costosa en comparacion con anticuerpos solubles y es especialmente inconveniente generarlas en calidad cGMp, por ejemplo debido a su tamano, no es posible una filtracion esteril, la sedimentacion complica la manipulacion, es decir, el numero/volumen constante de partfculas durante el llenado y la carga de anticuerpos.
3. Son inconvenientes de usar para procesos in vitro para generar terapias de celulas NK para uso in vivo,
- puesto que tienen que ser anadidas a celulas en relaciones de celula/perla definidas a una densidad definida de celulas/perlas por area de superficie,
- la titulacion es imprecisa debido a la sedimentacion,
- la filtracion esteril no es posible
- debido a su tamano pueden afectar a la viabilidad la funcion celular y no pueden ser simplemente retiradas de las celulas por centrifugacion. Por lo tanto, se han desarrollado protocolos especiales para la separacion de granulos o partfculas biodegradables. Sin embargo, ambos metodos sufren imprecisiones con respecto al numero real de perlas residuales despues del proceso de eliminacion, dejando un cierto riesgo de efectos toxicos si se inyectan perlas estimuladoras de celulas NK en pacientes. Este problema es particularmente relevante debido al tamano de las partfculas, puesto que cada sola partfcula por sf misma puede haber retenido todavfa la capacidad para activar celulas NK in vivo.
Por lo tanto, existe la necesidad de un metodo in vitro mejorado para inducir la proliferacion de celulas NK.
Sumario de la invencion
Sorprendentemente, se encontro que los agentes estimuladores de las celulas NK tales como anticuerpos, e.g. frente a CD2 y CD335 (NKp46), unidos a nanomatrices, que se caracterizan por una estructura movil de matriz polimerica (superficie no solida), que pueden haber incluido dentro de la matriz compuestos funcionales adicionales, tales como nanocristales magneticos, pueden usarse para inducir proliferacion de celulas NK in vitro, aunque su diametro sea menor de 1 pm, preferiblemente menor de 500 nm, mas preferiblemente menor de 200 nm. Preferiblemente, las nanomatrices de la invencion inducen a las celulas NK a proliferar in vitro al menos 20 veces, mas preferiblemente al menos 50 veces, lo mas preferiblemente al menos 200 veces.
Inesperadamente, estas nanomatrices acopladas con agentes estimuladores de celulas NK pueden expandir celulas NK a una escala similar in vitro, ya que las perlas de tamano de celula del estado de la tecnica tambien se acoplan a
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agentes estimuladores de celulas NK tales como, por ejemplo las perlas del Kit de Activacion/Expansion de Celulas NK de Miltenyi Biotec (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania, Pedido n° 130-094-483).
Debido a su pequeno tamano, las nanomatrices per se, sin anticuerpos unidos a ellas, no alteran la estructura, la funcion, el estado de actividad o la viabilidad de las celulas, es decir, no causan perturbacion en las celulas y no interfieren con analisis, experimentos y aplicaciones terapeuticas posteriores de las celulas estimuladas. Ademas, preferiblemente, la nanomatriz es biodegradable y no toxica para las celulas vivas, es decir, la nanomatriz es una entidad biologicamente inerte con respecto a las alteraciones de la funcion celular. Por lo tanto, la nanomatriz usada en el metodo de la presente invencion mejora la expansion in vitro de celulas NK ahorrando la viabilidad de las celulas. Ademas, como es posible la filtracion esteril de las pequenas nanomatrices, es posible la expansion in vitro a largo plazo de celulas NK en condiciones que cumplan con rigurosas normas GMP y es una valiosa opcion para la aplicacion clmica de las celulas NK expandidas in vitro. Estas nanomatrices son adecuadas para su uso en sistemas de cultivo de celulas cerrados y esteriles tales como los descritos e.g. En WO2009/072003.
Ademas sorprendentemente, se encontro que los agentes estimuladores de celulas NK tales como anticuerpos, e.g. contra CD2 y CD335, unidos a nanomatrices pueden conjugarse a nanomatrices separadas (en lugar de conjugarse con la misma nanomatriz), que pueden mezclarse a continuacion para uso optimizado. En general, la relacion de nanomatrices a celulas es mayor que 100:1, preferiblemente mayor que 200:1, mas preferiblemente mayor que 500:1. Esto da como resultado la posibilidad de ajuste fino (titulacion) de las nanomatrices usadas para inducir la proliferacion de las celulas NK diana, por ejemplo facilitando el proceso de produccion y el control de calidad de las nanomatrices individuales y mejora la flexibilidad del reactivo, por ejemplo facilitando la optimizacion de las condiciones de activacion para subconjuntos de celulas NK especializadas mediante titulacion, por ejemplo a diversas concentraciones y relaciones de CD2 y CD335.
Las celulas NK son "educadas" o "licenciadas" durante su desarrollo por contacto de las moleculas del receptor de tipo inmunoglobulina de celulas asesinas (KIR) en su superficie con moleculas de Clase I del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) en celulas vecinas. Las combinaciones de moleculas KIR se distribuyen por clonacion en celulas NK individuales, dando como resultado un nivel heterogeneo y continuo de requisitos de senalizacion. Diferentes subconjuntos continuos (en contraste con los claramente distinguibles) pueden ser inducidos a la proliferacion por titulacion de las nanomatrices. Ademas, los subconjuntos de celulas NK se definen basandose en una expresion de marcador distinguible (por ejemplo CD16, CD62L, cD2, CD159a, CD27) que tienen diferentes requisitos de senalizacion para la activacion.
En comparacion con ello, se usan las perlas de Kit de Activacion/Expansion de Celulas NK de (Miltenyi Biotec GmgB, Bergisch Gladbach, Alemania, Pedido n° 130-094-483) en una proporcion perla:celula de 1:2 a 2:1 resultando en una menor flexibilidad para el ajuste fino.
En un primer aspecto, la presente invencion proporciona el uso de una nanomatriz para inducir la proliferacion in vitro de celulas NK, comprendiendo la nanomatriz
a) una matriz de cadenas polimericas moviles, y
b) unidos a dicha matriz de cadenas polimericas moviles uno o mas agentes estimulantes que proporcionan senales de activacion a las celulas NK;
en el que la nanomatriz tiene un tamano de 1 a 500 nm, y en el que dichas cadenas polimericas moviles son de polisacaridos seleccionados del grupo que consiste en eteres de celulosa, almidon, goma arabiga, agarosa, dextrano, quitosano, acido hialuronico, pectinas, xantano, goma guar y alginato.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para inducir la proliferacion de celulas NK in vitro, comprendiendo el metodo poner en contacto una poblacion de celulas NK con una nanomatriz, en el que la nanomatriz comprende una matriz de cadenas polimericas moviles y se ha unido a ella uno o mas agentes que proporcionan senales de activacion a las celulas NK; activando e induciendo asf las celulas NK para que proliferen, es decir, para expandirse; y en el que la nanomatriz tiene un tamano de 1 a 500 nm, preferiblemente de 10 a 200 nm, y en el que dichas cadenas polimericas moviles son de polisacaridos seleccionados del grupo que consiste en eteres de celulosa, almidon, goma arabiga, agarosa, dextrano, quitosano, acido hialuronico, pectinas, xantano, goma guar y alginato. Preferiblemente, la nanomatriz es biologicamente inerte con respecto a las alteraciones de la funcion celular. Ademas, preferiblemente, la nanomatriz es biodegradable.
Las celulas NK estimuladas y opcionalmente expandidas logradas con el metodo de la presente invencion pueden usarse en aplicaciones terapeuticas o no terapeuticas subsiguientes sin la necesidad de eliminar o retirar la nanomatriz debido a la propiedad de la nanomatriz de ser biologicamente inerte con respecto a las alteraciones de la funcion celular
Alternativamente, debido a que son solubles o coloidales las nanomatrices pueden diluirse facilmente mediante etapas
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de lavado repetidas hasta concentraciones eficaces por debajo del umbral de activacion de las celulas NK despues del proceso de estimulacion y proliferacion de celulas NK.
La nanomatriz es de 1 a 500 nm, preferiblemente de 10 a 200 nm de tamano. La nanomatriz es una matriz movil que consiste en un material polimerico pero no tiene una superficie de fase solida en contraste con perlas o microesferas. Los agentes tales como anticuerpos anti-CD2 y/o anti-CD335 que permiten la estimulacion de celulas NK se unen a las cadenas polimericas moviles de la matriz. Dentro de la matriz pueden incrustarse sustancias adicionales, tales como nanocristales magneticos, pigmentoss fluorescentes, etc., y anadir funciones adicionales a la nanomatriz sin alterar su estructura movil basica, caractensticas superficiales o parametros de interaccion celular de la nanomatriz.
Esta movilidad, es decir, la flexibilidad de las matrices polimericas en soluciones acuosas, incluso cuando estan unidas a superficies solidas, son bien conocidas en el campo. Por ejemplo, una estimacion cuantitativa de la flexibilidad o movilidad del dextrano y otros polfmeros usados para aplicaciones biologicas o medicas se da en Bertholon et al. Langmuir 2006, pp 45485 - 5490.
La movilidad introducida en la matriz de estimulacion por el polfmero usado esta bien descrita en multiples publicaciones para polisacaridos y nanocristales superparamagneticos embebidos, que se utilizan frecuentemente para tecnologfas de formacion de imagenes in vivo en situaciones clmicas. Estos reactivos son muy similares al tipo de reactivo que se uso aqu en varios de los ejemplos dados. Es bien sabido que a pesar del termino "partfcula" estos reactivos no son en realidad comparables a las partfculas de superficie solidas esfericas: "La mayona de las nanopartfculas coloidales (asf denominadas) usadas con fines medicos estan recubiertas con polfmeros o polielectrolitos y no pueden ser consideradas realmente como esferas ngidas (Di Marco y colaboradores, Int. J. Nanomed., 2007, p6l8, lmea 5 y siguientes) ".
Para ejemplificar directamente: esta caractenstica tfpica de los nanocristales superparamagneticos incrustados en polisacaridos se describe mejor por la discrepancia en los valores de tamano obtenidos por diferentes metodos utilizados para la determinacion del tamano. Normalmente, la microscopfa electronica de transmision utiliza muestras secas y, por tanto, determina principalmente el tamano de los nanocristales embebidos, que estan siempre en el intervalo de 10 nm. Sin embargo, en contraste, la dispersion laser dinamica que tambien toma en consideracion el tamano de la matriz circundante en solucion acuosa, determina diametros mucho mas grandes (por ejemplo 5-10 nm frente a 80-150 nm para AMI-25, un reactivo de contraste clmico, consistente en una matriz de dextrano y los cristales de oxido de hierro incrustados, lo que significa que el >99% del volumen total del complejo en solucion acuosa esta constituido por la matriz movil (Wang y colaboradores, Eur. Radiol. 2001: pagina 2323). Para las matrices que se usaron por ejemplo, en el Ejemplo 1, la medida del tamano revelo 30 nm (TEM) y 65 nm (DLS), de modo que aproximadamente 80-90% del complejo en solucion acuosa esta constituido por la matriz movil. Por lo tanto en este tipo de matrices moviles, el polfmero movil determina el comportamiento bioffsico durante la interaccion con las celulas, en lugar de una partfcula ngida o superficie solida cubierta, que podna ademas recubrirse con una delgada capa de polfmero utilizada para la union, de modo que la flexibilidad o movilidad bien conocida de las cadenas de polfmero en la matriz descrita sea la caractenstica determinante y la diferencia cntica con respecto a los anticuerpos unidos a superficie solida sobre microesferas usadas clasicamente para estimulacion.
En resumen, estos ejemplos indican el conocimiento comun actual sobre el comportamiento de matrices de polfmero flexibles moviles en solucion acuosa (requisito previo para todas las aplicaciones de cultivos celulares) y ponen de relieve el hecho de que tambien las propiedades bioffsicas de los coloides revestidos con polfmero, las matrices de polisacaridos que contienen oxido de hierro usadas en este estudio pero no limitadas a aquellas, estan determinadas principalmente por la caractenstica del material polimerico, independiente de las sustancias embebidas.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona un metodo in vitro para inducir la proliferacion de celulas NK, comprendiendo el metodo poner en contacto una poblacion de celulas NK con una nanomatriz, comprendiendo la nanomatriz
a) una matriz de cadenas polimericas moviles; y
b) unidos a dicha matriz de cadenas polimericas moviles, uno o mas agentes estimuladores que proporcionan senales de activacion a las celulas NK; activando e induciendo asf la proliferacion de las celulas NK, en las que la nanomatriz tiene un tamano de 1 a 500 nm, preferiblemente de 10 a 200 nm, y en la que dichas cadenas polimericas moviles son de polisacaridos seleccionados del grupo que consiste en eteres de celulosa, almidon, goma arabiga, y en donde la mayona (es decir, mas del 50%), preferiblemente mas del 80% y mas preferiblemente mas del 90% y mas preferiblemente mas del 99% del volumen total de la nanomatriz en solucion acuosa consiste en cadenas polimericas moviles.
Si se incrustan en la matriz sustancias adicionales, tales como nanocristales magneticos, pigmentos fluorescentes, etc., el complejo resultante consta principalmente de cadenas polimericas moviles, que representan mas del 50%, preferiblemente mas del 80% y mas preferiblemente mas de 90% y mas preferiblemente mas del 99% del volumen en
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solucion acuosa.
Descripcion detallada de la invencion
Era una opinion bien establecida en la comunidad cientffica el que las partfculas menores de 1 pm no son convenientes para estimular eficazmente las celulas, en particular las celulas T, sino tambien otras celulas, tales como las celulas NK, porque estas pequenas partfculas no proporcionan suficiente entrecruzamiento para activar las celulas. Por lo tanto, generalmente, las perlas o microesferas con superficies en fase solida usadas para estimular celulas, en su mayona celulas T, son siempre mayores de 1 pm de tamano en el estado de la tecnica, y regularmente son de tamano celular.
Ahora, de forma inesperada, los inventores descubrieron que las nanopartfculas que son menores de 1 pm, preferiblemente menores de 500 nm, mas preferiblemente menores de 200 pm, que tienen una matriz movil y que estan unidas a ellas, son convenientes para expandir las celulas NK. Es esencial para la presente invencion que la nanomatriz que es menor de 500 nm no tenga superficie de fase solida en contraste con perlas o microesferas del mismo tamano. La nanomatriz es como una malla o red que consiste en un material polimerico movil, preferiblemente dextrano. La nanomatriz es muy plastica, dando como resultado la capacidad de arrollarse a la membrana de la superficie celular de las celulas diana, es decir, las celulas NK que se activaran. Por lo tanto, la nanomatriz se une con sus agentes unidos a la matriz movil a los respectivos receptores (antfgenos) en la superficie celular, por lo que la movilidad o flexibilidad de la matriz permite una interaccion optima con los asociados de union. Hasta cierto punto, la forma de la nanomatriz se adapta a la superficie de la celula diana extendiendo de este modo la superficie de contacto entre la nanomatriz y la celula diana. Debido al tamano de la nanomatriz de 1 a 500 pm, preferiblemente de 10 a 200 nm, son demasiado pequenas para causar perturbacion en la celula, es decir, la nanomatriz es biologicamente inerte con respecto a las alteraciones de la funcion celular. Tales perturbaciones desencadenadas por el contacto directo entre celulas y granulos son problematicas si se utilizan perlas o microesferas de 1 pm o mas. Ademas, preferiblemente, la nanomatriz es biodegradable y no toxica para las celulas debido a la composicion que consiste en material polimerico biodegradable tal como un polfmero de dextrano. En consecuencia, la nanomatriz es una entidad por completo biologicamente inerte con respecto a las alteraciones de la funcion celular, pero biodegradable. Por lo tanto, no es necesario eliminar la nanomatriz despues de ponerse en contacto con las celulas NK para estimulacion y proliferacion. No se producen efectos perturbadores debido a la presencia de nanomatrices en composiciones de celulas NK activadas para analisis, experimentos y/o aplicaciones clmicas subsiguientes de estas celulas.
Ademas, debido a que son solubles o coloidales, las nanomatrices no unidas se pueden diluir facilmente mediante etapas de lavado repetidas a concentraciones eficaces por debajo del umbral de activacion de las celulas NK despues del proceso de expansion de las celulas NK.
La matriz movil de la nanomatriz tiene unida a ella uno o mas agentes estimuladores que proporcionan senales de activacion a las celulas NK, activando e induciendo asf la proliferacion de las celulas NK. Los agentes son moleculas que son capaces de unirse a una estructura de superficie celular e inducir la estimulacion de las celulas NK. Un ejemplo de agentes unidos a la matriz movil de la nanomatriz es el anticuerpo monoclonal anti-CD2 (mAb) en combinacion con un mAb anti-CD335. Otros ejemplos son anti-CD137, anti-CD 134, anti-CD16, anti-CD25, anti-CD52, anti-CD69, anti- CD84, anti-CD122, anti-CD244 (2B4), anti-CD314 (NKG2D) Anti-CD336, anti-CD337, anti-NKp80, ligandos Notch, por ejemplo Delta-like1/4, Jagged1/2 o receptores de citoquina ya sea solos o en diversas combinaciones con anti-CD2 o anti-CD335.
Preferiblemente, el agente estimulador unido a la nanomatriz es un anticuerpo monoclonal anti-CD2 (mAb) en combinacion con la protema coestimuladora anti-CD335 mAb. Los dos anticuerpos pueden acoplarse a la misma nanomatriz o separar nanomatrices.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para inducir la proliferacion de celulas NK, comprendiendo el metodo poner en contacto una poblacion de celulas NK con una nanomatriz, comprendiendo la nanomatriz
a) una matriz de cadenas polimericas moviles, y
b) unido a dicha matriz de cadenas polimericas uno o mas agentes que proporcionan senales de activacion a las celulas NK; activando e induciendo asf la proliferacion de las celulas NK;
y en el que la nanomatriz tiene un tamano de 1 a 500 nm, preferiblemente de 10 a 200 nm, y en el que dichas cadenas polimericas moviles son de polisacaridos seleccionados del grupo que consiste en eteres de celulosa, almidon, goma arabiga, agarosa, dextrano, quitosano, acido hialuronico, pectinas, xantano, goma guar y alginato.
La nanomatriz puede ser biologicamente inerte con respecto a la alteracion de la funcion celular.
Ademas, o alternativamente, la nanomatriz puede ser biodegradable.
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La nanomatriz puede ser de calidad cGMP para aplicaciones clmicas. La esterilidad puede conseguirse, por ejemplo por filtracion esteril usando filtros con un tamano de poro adecuado (200 nm) o por otros metodos bien conocidos por el experto en la tecnica. El procesamiento GMP de productos celulares se realiza frecuentemente en sistemas de cultivo de celulas cerrados. El uso de la nanomatriz en sistemas de cultivo GMP es ventajoso debido a:
- caractensticas de la nanomatriz para pasar un filtro esteril
- una baja densidad de partfculas o un comportamiento coloidal que evita una sedimentacion mas rapida de la matriz en comparacion con las celulas NK
- dosificacion de la nanomatriz en relacion con el volumen del cultivo en lugar del numero de celulas NK.
La caractenstica de la nanomatriz de ser capaz de pasar filtros esteriles permite la adicion a sistemas de cultivo de celulas cerradas que estan equipadas o son equipables con filtros esteriles, por ejemplo bolsas para cultivo celular (Miltenyi Biotec, Baxter, Cell-Genics), dispositivos G-Rex (fabricacion de Wilson Wolf), WAVE Bioreactors (GE Healthcare), Quantum Cell Expansion System (Terumo BCT), CliniMACS® Prodigy (Miltenyi Biotec, vease Apel y colaboradores. 2012, Chemie Ingenieur Technik 85: 103 - 110). La nanomatriz puede anadirse a sistemas de cultivo de celulas cerradas usando una jeringa para empujar la nanomatriz a traves del filtro o una bomba para tirar de la nanomatriz a traves del filtro de una bolsa o un vial (conectado a un adaptador de vial ventilado).
Otros agentes utilizados para inducir la proliferacion de celulas NK (perlas magneticas de tamano celular, lmeas celulares) no pueden pasar por un filtro esteril. El uso de estos reactivos requerina conectar agentes al sistema de cultivo de celulas cerrado usando un soldador de tubos esteril (por ejemplo, Terumo, GE, Genesis). No todos los soldadores de tubos estan disenados para funcionar dentro de una sala limpia de GMP. De este modo, la adicion de un agente al sistema de cultivo de celulas cerrado a traves de filtros esteriles proporciona una ventaja significativa.
Las partfculas magneticas de tamano de celulas ngidas utilizadas para inducir la proliferacion de celulas NK (kit de activacion y expansion de celulas Miltenyi Biotec NK) tienen una densidad mayor como linfocitos incluyendo celulas NK (1,07 g/l) y por lo tanto sedimentan mas rapidamente que la nanomatriz. Los sistemas de cultivo celular agitados tales como el WAVE Bioreactor (GE Healthcare) evitan la sedimentacion completa de las celulas mediante el movimiento del recipiente utilizado para el cultivo. El movimiento del recipiente aplica fuerzas diferentes a las celulas/partfculas de diferente tamano y densidad, dando como resultado un movimiento relativo. La induccion de la proliferacion se reduce dentro del biorreactor WAVE en comparacion con el cultivo estatico en matraces de cultivo celular.
El uso del kit de activacion y expansion de celulas NK (Miltenyi Biotec) que utiliza partfculas magneticas ngidas de tamano celular se ha optimizado para ser utilizado en una proporcion dada de perlas por celula (por ejemplo 1:2), requiriendo la determinacion del numero de NK dentro del recipiente de cultivo. Para una aplicacion clmica de celulas NK expandidas esto da como resultado un paso de muestreo adicional, posiblemente afectado por la esterilidad del producto. El uso de la nanomatriz de la presente invencion permite la dosificacion del agente inductor de proliferacion de celulas NK con base en el volumen del cultivo. El volumen de la celula NK que contiene la suspension de celulas puede determinarse mediante un sistema de balance o camara sin afectar a la barrera de esterilidad. La dosificacion del agente basandose en la determinacion de volumen permite un proceso de fabricacion de productos celulares completamente automatizado (por ejemplo, usando el sistema Clini-MACS Prodigy®) sin etapas de recuento manual de celulas.
El contacto puede ocurrir, por ejemplo in vitro en cualquier recipiente capaz de contener celulas, preferiblemente en un ambiente esteril. Tales recipientes pueden ser, por ejemplo frascos de cultivo, bolsas de cultivo, biorreactores o cualquier dispositivo que pueda usarse para cultivar celulas (por ejemplo, el sistema de procesamiento de muestras del documento W02009072003).
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para inducir la proliferacion de celulas NK en un sistema de cultivo de celulas cerrado, comprendiendo el metodo poner en contacto un cultivo de celulas que comprende una poblacion de celulas NK dentro de dicho sistema de cultivo de celulas cerrado con una dosificacion de nanomatriz, comprendiendo la nanomatriz
a) una matriz de cadenas polimericas moviles; y
b) unidos a dicha matriz de cadenas polimericas moviles uno o mas agentes estimulantes que proporcionan senales de activacion a las celulas NK;
en el que la nanomatriz tiene un tamano de 1 a 500 nm, y en el que dichas cadenas polimericas moviles son de polisacaridos seleccionados del grupo que consiste en eteres de celulosa, almidon, goma arabiga, agarosa, dextrano, quitosano, acido hialuronico, pectinas, xantano, goma guar y alginato, y en el que dicha dosificacion de nanomatriz se aplica esteril a dicho sistema de cultivo de celulas cerrado, y en el que dicha dosificacion depende del volumen del
cultivo celular en dicho sistema de cultivo de celulas cerrado.
Dicho volumen del cultivo celular puede determinarse mediante una balanza o un sistema de camara sin afectar a la barrera de esterilidad.
La determinacion y aplicacion de dicha dosificacion se puede realizar de forma automatica.
5 La nanomatriz utilizada en la presente invencion puede ser una nanomatriz en la que al menos un primer agente y un segundo agente estan unidos a la misma matriz movil. Las nanomatrices de este tipo se ponen en contacto con celulas NK, activando e induciendo asf la proliferacion de las celulas NK. La relacion del primer y del segundo agente unidos a la misma matriz flexible puede estar en el intervalo de las proporciones de 100:1 a 1:100, preferiblemente entre 10:1 y 1:10, mas preferiblemente entre 2:1 y 1:2.
10 Ademas sorprendentemente, se encontro que la nanomatriz usada en el presente metodo de la invencion tambien puede ser una nanomatriz en la que al menos un primer agente y un segundo agente estan unidos a matrices moviles separadas. Una mezcla de estas nanomatrices se pone en contacto con celulas NK, con lo que se activa e induce la proliferacion de las celulas NK. La relacion y/o concentracion de la matriz movil que tiene unido a la misma el primer agente y la matriz movil que tiene unido a la misma, el segundo agente, puede variar para producir resultados de 15 estimulacion optimos dependiendo del tipo de celulas NK utilizadas y/o agentes utilizados. Esto facilita la optimizacion de las condiciones de activacion para subconjuntos de celulas NK especializadas mediante la titulacion de diversas concentraciones y relaciones de la matriz movil que tiene unidas al mismo el primer agente y la matriz movil que tiene unido al segundo agente. Es ventajoso que generalmente la relacion de nanomatrices a celulas sea mayor que 100:1, preferiblemente mayor que 200:1, mas preferiblemente mas de 500:1. La gran cantidad de nanomatrices por celula 20 permite un ajuste fino de las nanomatrices marcadas separadas que sena imposible con relaciones menores de 1:10 a 10:1 comunmente usadas por la estimulacion de celulas usando perlas de tamano celular.
La nanomatriz utilizada en la presente invencion es una nanomatriz en la que la matriz movil consiste en un material polimerico preferiblemente biodegradable que no es toxico para las celulas, es decir, las cadenas polimericas moviles de la nanomatriz son de polisacaridos seleccionados del grupo que consiste en eteres de celulosa, almidon, goma
25 arabiga, agarosa, dextrano, quitosano, acido hialuronico, pectinas, xantano, goma guar y alginato. Preferiblemente, la
nanomatriz utilizada en la presente invencion es una nanomatriz en la que la matriz movil consiste en un polfmero de dextrano. El uso de material polimerico tal como dextrano para generar la matriz da como resultado una matriz movil y flexible. La movilidad (flexibilidad o plasticidad) de la matriz es superior en comparacion con las partfculas mas ngidas (que tienen una superficie en fase solida) o perlas del mismo tamano, es decir, nanoestructuras, para la proliferacion de 30 celulas. En la solicitud pendiente EP12185939 se describe que a pesar de sus nanomatrices de tamano pequeno (50200 nm de diametro) que comprenden una matriz de cadenas polimericas moviles (matriz flexible), de hecho tienen un
potencial unico para activar celulas T cuando se comparan con partfculas de tamano similar con una superficie solida.
La nanomatriz utilizada en la presente invencion puede ser una nanomatriz en la que la matriz movil es el unico o al menos el principal componente de la nanomatriz independientemente de los agentes que estan unidos a la misma.
35 Pero la nanomatriz utilizada en la presente invencion tambien puede ser una nanomatriz en la que la nanomatriz lleva nanocristales magneticos, paramagneticos, superparamagneticos o pigmentos fluorescentes incrustados en la matriz movil, preferiblemente incrustados en el polfmero de dextrano.
La nanomatriz utilizada en la presente invencion se puede usar en un metodo para proliferacion de celulas NK en las que la nanomatriz no se elimina en aplicaciones posteriores de las celulas NK proliferadas.
40 Alternativamente, la nanomatriz usada en la presente invencion tambien se puede usar en un metodo para proliferacion de celulas NK en las que la nanomatriz se elimina antes de las aplicaciones subsiguientes de las celulas NK proliferadas.
El metodo inventivo divulgado aqrn en el presente documento puede proporcionar una composicion que comprende i) la nanomatriz, comprendiendo la nanomatriz 45 a) una matriz de cadenas polimericas moviles; y
b) unidos a dicha matriz de cadenas polimericas moviles, uno o mas agentes que proporcionan senales de activacion a las celulas NK; activando e induciendo asf la proliferacion de las celulas NK; y en el que la nanomatriz tiene un tamano de 1 a 500 nm, preferiblemente de 10 a 200 nm, y en el que dichas cadenas polimericas moviles son de polisacaridos seleccionados del grupo que consiste en eteres de celulosa, almidon, goma arabiga, agarosa, dextrano, quitosano, 50 acido hialuronico, pectinas, xantano, goma guar y alginato,
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li) una poblacion de celulas NK que son activadas e inducidas a proliferar provocadas por el contacto entre dicha nanomatriz y celulas.
La nanomatriz puede ser biologicamente inerte con respecto a la alteracion de la funcion celular.
La nanomatriz puede ser biodegradable.
Los agentes se unen a las mismas o a nanomatrices separadas a alta densidad, preferiblemente con mas de 2|j mg por mg de nanomatriz, mas preferiblemente con mas de 50 jg por mg de nanomatriz.
Esta composicion puede ser conveniente para generar agentes terapeuticos de celulas NK para uso in vivo (composicion farmaceutica). La composicion tambien se puede usar en otros analisis y experimentos posteriores.
El metodo inventivo descrito en la presente invencion puede proporcionar una composicion o una composicion farmaceutica que comprende una poblacion de celulas NK estimuladas y expandidas. La composicion farmaceutica puede comprender una poblacion de celulas NK proliferadas producidas por el metodo de la presente invencion, en el que el metodo se lleva a cabo en un sistema de cultivo de celulas cerrado, tal como el sistema de procesamiento de muestras del documento WO2009072003.
Las nanomatrices pueden prepararse por diversos metodos conocidos en la tecnica, incluyendo evaporacion de disolvente, separacion de fases, secado por pulverizacion o extraccion con disolvente a baja temperatura. El proceso seleccionado debe ser simple, reproducible y escalable. Las nanomatrices resultantes deben ser de flujo libre y no agregadas con el fin de producir una suspension uniforme manipulable con jeringa. La nanomatriz tambien debe ser esteril. Esto se puede asegurar, e.g. por filtracion, una etapa de esterilizacion terminal y/o mediante un procesamiento aseptico. En el Ejemplo 1 se describe una preparacion de nanomatrices.
Definiciones
Los terminos "matriz de cadenas polimericas moviles" y "matriz movil" tal como se usan en el presente documento tienen un significado intercambiable. El termino "movil" se refiere a la caractenstica comun y bien descrita de biopolfmeros organicos tales como dextrano u otros en nanopartfculas (vease Bertholon y colaboradores, Langmuir 2006, pp45485-5490). Estos polfmeros estan constituidos por cadenas moviles (moviles), preferiblemente altamente moviles (moviles), por lo que la matriz se caracteriza por la ausencia de una superficie solida como punto de union para los agentes estimulantes tales como anticuerpos y que contrasta fuertemente con las perlas o microesferas utilizadas actualmente que tienen regularmente una superficie inflexible y ngida. Como resultado, la nanomatriz que comprende una matriz de cadenas polimericas moviles es flexible y ajustable a la forma de la superficie de las celulas. Ademas, como resultado, la nanomatriz es una nanomatriz en la que la mayona (es decir, mas del 50%), preferiblemente mas del 80% y mas preferiblemente mas del 90% y mas preferiblemente mas del 99% del volumen total de la nanomatriz en solucion acuosa consiste en cadenas polimericas moviles.
El contacto entre nanomatriz que se ha acoplado al mismo uno o mas agentes estimuladores y las celulas que se van a estimular se beneficia del hecho de que la nanomatriz no tiene una superficie fija, dura o ngida que permita que la nanomatriz se acople a las celulas. La matriz consiste en un material inerte polimerico, preferiblemente biodegradable o biocompatible que es no toxico para las celulas. La matriz esta compuesta de cadenas polimericas hidrofilas, que obtienen la maxima movilidad en solucion acuosa debido a la hidratacion de las cadenas. La matriz movil es el unico o al menos el principal componente de la nanomatriz independientemente de los agentes que estan unidos a ella.
La matriz movil es de polisacaridos seleccionados del grupo que consiste en eteres de celulosa, almidon, goma arabiga, agarosa, dextrano, quitosano, acido hialuronico, pectinas, xantano, goma guar o alginato. Preferiblemente, la matriz movil es un polfmero de dextrano.
La matriz movil define la propiedad de la nanomatriz de ser muy plastica, es decir, flexible, dando lugar a la capacidad de enroscarse a la membrana de la superficie celular de las celulas diana, es decir, las celulas NK que se activaran y proliferaran. Por lo tanto, la nanomatriz se une estrechamente con sus agentes unidos a la matriz movil a las celulas debido a que la movilidad de la matriz proporciona un acceso optimo de los ligandos o anticuerpos unidos a sus receptores o antfgenos de la superficie celular. Debido a esta propiedad, la nanomatriz tiene la capacidad de proporcionar suficiente entrecruzamiento para activar celulas NK independientemente del tamano pequeno de la estructura, es decir, menor de 1 jm, preferiblemente menor de 500 nm, mas preferiblemente menor de 200 nm. La adaptabilidad de la nanomatriz causada por la nanoestructura movil y flexible extiende el area de contacto entre la membrana de la superficie celular y la nanomatriz, dando lugar a uniones mas eficientes entre las moleculas de la superficie celular y los agentes unidos a la matriz movil.
En algunas realizaciones, la matriz movil puede incrustar nanocristales magneticos, paramagneticos o superparamagneticos u otras sustancias que anaden propiedades funcionales adicionales tales como pigmentos
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fluorescentes sin alterar la estructura movil basica y/o las caractensticas superficiales, es decir, la interaccion con celulas diana.
El termino "agente" que esta unido a la matriz movil de la nanomatriz tal como se usa en el presente documento se refiere a moleculas que son capaces de unirse a una estructura de superficie celular y contribuyen a una estimulacion y proliferacion de las celulas NK. Ejemplos de agentes adecuados para uso en la presente invencion incluyen agentes tales como compuestos sintetizados, acidos nucleicos y protemas, incluyendo anticuerpos policlonales o monoclonales, y fragmentos o derivados de los mismos, y protemas por bioingeniena, tales como protemas de fusion. En un ejemplo, los agentes son protemas mitogenicas. Las protemas mitogenicas son dos o mas protemas que son capaces de proporcionar el mmimo requerido de dos senales a las celulas NK con el fin de hacer que las celulas NK se activen. Por lo tanto, en el metodo de la presente invencion, al menos dos agentes estimuladores se unen a las matrices flexibles polimericas (las mismas matrices o matrices separadas) que proporcionan senales de activacion a las celulas NK, preferiblemente los al menos dos agentes se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos, fragmentos de los mismos o ligandos a CD2, CD7, CD8a, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD16, CD18, CD25, CD26, CD29, CD30, CD31, CD32c, CD38, CD39, CD43, CD44, CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RO, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e, CD50, CD52, CD53, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CD62L, CD63 CD69 CD81 CD82 CD84, CD85C, CD85E, CD85J, CD87, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD119, CD120a, CD120b, CD122, CD130, CD132, CD147, CD148CD, CD158a, CD158k, CD259a, CD159c, CD160, CD161, CD172g, CD178, CD183, CD185, CDw210b, CD212, CD217, CD218a, CD218b, CD220, CD221, CD221, CD222, CD223, CD225, CD226, CD229, CD230, CD232, CD244, CD247, CD257, CD261, CD262, CD263, CD264, CD270, CD274, CD277,
CD280, CD295, CD298, CD314, CD316, CD319, CD321, CD328, CD329, CD335, CD336, CD337, CD352, CD354,
CD355, CD357, CD360, CD361, CD363. Mas preferiblemente, los al menos dos agentes se seleccionan del grupo
constituido por anticuerpos, fragmentos de los mismos o ligandos a CD28, CD137 (4-1BBL), CD226 (DNAM-1), CD314
(NKG2D), CD159c (NKG2C), NKp30, NKp44, CD335 (NKp46), CD69, CD16, NKp80. Mas preferiblemente, los al menos dos agentes se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos, fragmentos de los mismos o ligandos a CD2 y CD335.
Otros agentes adecuados incluyen agentes capaces de suministrar una senal a las celulas NK a traves de receptores de citoquina tales como IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-gammaR, TNF-alfaR, IL-4R e IL-10R, incluyendo anticuerpos monoclonales (mAbs) a estos receptores, protemas de fusion con un extremo reactivo espedfico para estos receptores y los ligandos correspondientes a estos receptores o fracciones de los mismos. Otros agentes adecuados incluyen cualquier agente capaz de unirse a moleculas de adhesion celular sobre celulas NK tales como mAbs, protemas de fusion y los correspondientes ligandos o fracciones de las mismas a moleculas de adhesion en las siguientes categonas: cadherinas, ICAM, integrinas y selectinas. Ejemplos de moleculas de adhesion en las celulas NK son: CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-selectina) y CD29/CD49d (VLA-4). Otros agentes adecuados incluyen cualquier agente capaz de unirse a receptores de quimioquinas, incluyendo los de las categonas CC y C-X-C. Ejemplos de receptores de quimioquinas asociados con la funcion de las celulas NK incluyen CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCRS y CXCR3.
Un agente puede estar unido o acoplado a la matriz movil por una diversidad de metodos conocidos y disponibles en la tecnica. La union puede ser covalente o no covalente, electrostatica o hidrofoba y puede realizarse mediante una variedad de medios de fijacion, incluyendo, por ejemplo, medios qrnmicos, mecanicos, enzimaticos u otros medios mediante los cuales un agente es capaz de estimular las celulas. Por ejemplo, el anticuerpo frente a una estructura de superficie celular puede estar unido a la matriz, o la avidina o estreptavidina puede estar unida a la matriz para unirse a un agente biotinilado. El anticuerpo a la estructura de superficie celular puede estar unido a la matriz directa o indirectamente, por ejemplo a traves de un anticuerpo anti-isotipo. Otro ejemplo incluye el uso de protema A o protema G, u otras moleculas no espedficas de union a anticuerpo, unidas a matrices para unirse a un anticuerpo. Alternativamente, el agente puede estar unido a la matriz por medios qrnmicos, tales como entrecruzamiento a la matriz.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo" pretende incluir anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quimericos, haptenos y fragmentos de anticuerpo, y moleculas que son equivalentes de anticuerpos en cuanto que se unen espedficamente a un epftopo sobre el antfgeno. El termino anticuerpo incluye anticuerpos policlonales y monoclonales de cualquier isotipo (IgA, IgG, 25 IgE, IgD, IgM), o una porcion de union a antfgenos de los mismos, incluyendo, pero sin limitarse a, fragmentos F (ab) y Fv tales como sc Fv , anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados y una biblioteca de expresion de Fab.
El termino "biologicamente inerte" tal como se usa en el presente documento se refiere a las propiedades de la nanomatriz, que es no toxica para las celulas vivas y no induce fuertes alteraciones de la funcion celular a traves de la interaccion ffsica con la superficie celular, debido a su tamano pequeno, excepto la funcion espedfica de activacion de ligando/receptor de los ligandos o anticuerpos unidos. Las nanomatrices, ademas, pueden ser biodegradables, por ejemplo degradadas por actividad enzimatica o eliminadas por celulas fagodticas. El material biodegradable puede derivarse de materiales naturales o sinteticos que se degradan en fluidos biologicos, por ejemplo medios de cultivo celular y sangre. La degradacion puede ocurrir usando medios enzimaticos o puede ocurrir sin medios enzimaticos. El material biodegradable se degrada en dfas, semanas o pocos meses, lo que puede depender de las condiciones ambientales a las que esta expuesto. El material biodegradable debe ser no toxico y no antigenico para las celulas vivas
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y en humanos. Los productos de degradacion deben producir subproductos no toxicos. Un aspecto importante en el contexto de ser biologicamente inerte es el hecho de que la nanomatriz no induce una fuerte alteracion en la estructura, funcion, estado de actividad o viabilidad de las celulas marcadas, es decir, no causa perturbacion de las celulas y no interfiere con los experimented y las aplicaciones terapeuticas posteriores de las celulas estimuladas. La irritacion mecanica o qmmica de la celula se reduce debido a que las propiedades de la nanomatriz son muy pequenas, es decir, en un rango de nanoescala y tiene una matriz movil que se acopla mas bien a la superficie celular en lugar de alterar la forma de la superficie celular o ejercer una elevada fuerza de corte a las celulas, resultando, por ejemplo, en rotura de la membrana.
El termino "PBMC" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a celulas mononucleares de sangre periferica aisladas de preparaciones de sangre periferica humana, e.g. mediante el uso de un gradiente de densidad (por ejemplo Ficoll, PanColl). Las "PBMC" consisten en linfocitos y monocitos.
El termino "poblacion de celulas NK" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una suspension celular que contiene celulas asesinas naturales humanas. Las celulas NK son positivas para CD56 y negativas para CD3. En donantes sanos, las celulas NK son positivas para CD335 (NKp46). Una suspension de celulas que contiene celulas NK puede ser sangre periferica, una preparacion de capa pulida de sangre periferica, sangre de cordon o una recoleccion por aferesis o preparaciones de los mismos ("PBMC") o "celulas NK purificadas". Una "poblacion de celulas NK" puede contener varias subpoblaciones de celulas NK y celulas NK en un estado diferente de diferenciacion y/o activacion. Ademas, el termino "poblacion de celulas NK" tal como se usa en el presente documento no se limita a la poblacion humana de celulas nK sino que tambien puede ser de otras especies tales como raton, rata, res, perro, caballo, cerdo y oveja. Por lo tanto, el alcance del uso de la nanomatriz de la presente invencion no se limita a la especie humana. Para la estimulacion eficaz de celulas NK de otras especies distintas de las humanas, la nanomatriz de la presente invencion puede acoplarse con agentes que se unen a celulas NK de otras especies.
El termino "celulas NK purificadas" tal como se usa en el presente documento se refiere a poblaciones celulares con un contenido aumentado de celulas asesinas naturales. Las celulas NK pueden purificarse mediante diferentes metodos, incluyendo la clasificacion FACS®, el enriquecimiento mediante perlas magneticas (por ejemplo CD56 MicroBeads, Miltenyi Biotec), el agotamiento de las celulas magneticas de celulas no NK (por ejemplo, kit de aislamiento de celulas NK, Miltenyi Biotec) Por ejemplo, RosetteSep®, Stem Cell Technologies) o metodos de aislamiento de sangre completa (MACSxpress®, Miltenyi Biotec), asf como adhesion sobre superficies revestidas con anticuerpos.
El termino "subconjuntos de celulas NK" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a subpoblaciones de celulas NK que estan definidas por varios marcadores con poblaciones de celulas CD56 + CD3-NK que expresan estos marcadores con diferente densidad, por ejemplo CD56 atenuada/brillante, CD16 +/-, CD8 +/-, CD2 +/-, NKG2A +/-, NKG2C +/-, KIR +/-, CD161 +/-, CD25 +/-, CD69 +/-.
Realizaciones
En una realizacion de la presente invencion, una primera nanomatriz de 1 a 500 nm, preferiblemente de 10 a 200 nm, consta de una matriz movil de un polfmero de dextrano y ha unido a este un agente, por ejemplo anti-CD2 mAb. Una segunda nanomatriz de 1 a 500 nm, preferiblemente de 10 a 200 nm de tamano consta de una matriz movil de un polfmero de dextrano y tiene unido a este otro agente, por ejemplo anti-CD335 mAb. En este caso, la nanomatriz utilizada en la presente invencion es una nanomatriz en la que al menos un primer agente y un segundo agente se unen a matrices moviles separadas.
Una mezcla de estas nanomatrices se pone en contacto con celulas NK, con lo que se activa e induce la proliferacion de las celulas NK.
El ajuste fino de nanomatrices para la estimulacion de las celulas NK se realiza facilmente debido a la alta proporcion de nanomatrices a celulas (normalmente mayores de 100:1).
En otra realizacion de la presente invencion, una nanomatriz de 1 a 500 nm, preferiblemente de 10 a 200 nm de tamano consta de una matriz movil de un polfmero de dextrano y ha unido a este un agente, por ejemplo anti-CD2 mAb. En este caso, la nanomatriz utilizada en la presente invencion es una nanomatriz en la que al menos un primer agente esta unido a matrices flexibles. Esta nanomatriz se pone en contacto con celulas NK, activando e induciendo asf la proliferacion de las celulas NK.
Se pueden anadir un segundo o mas (multiples) agentes coestimulantes, por ejemplo anti-CD335 mAb, como agentes solubles para optimizar o apoyar la activacion inducida por la nanomatriz con el primer agente unido a ella.
En otra realizacion de la presente invencion, una nanomatriz de 1 a 500 nm, preferiblemente de 10 a 200 nm, consta de una matriz movil de un polfmero de dextrano y tiene unidos a ella dos agentes que proporcionan senales de activacion a la celula, e.g anti-CD2 mAb y anti-CD335 mAb. En este caso, la nanomatriz utilizada en la presente invencion es una
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nanomatriz en la que al menos un primer agente y un segundo agente estan unidos a la misma matriz movil. Las nanomatrices de este tipo se ponen en contacto con celulas NK, activando e induciendo as^ la proliferacion de las celulas NK.
En otra realizacion de la presente invencion, una nanomatriz de 1 a 500 nm, preferiblemente de 10 a 200 nm de tamano consta de una matriz movil de un polfmero de dextrano y tiene unidos a ella multiples agentes que proporcionan senales de activacion a la celula, por ejemplo anti-CD2mAb y mAb anti-CD335 u otras moleculas activadoras o coestimuladoras conocidas. En este caso, la nanomatriz utilizada en la presente invencion es una nanomatriz en la que al menos un primer agente y multiples otros agentes estan unidos a la misma matriz movil.
Las nanomatrices de este tipo se ponen en contacto con celulas NK, activando e induciendo asf la proliferacion de las celulas NK.
En otra realizacion de la presente invencion, una nanomatriz de 1 a 500 nm, preferiblemente de 10 a 200 nm para uso en la presente invencion, consiste en una matriz movil de un polfmero de dextrano y tiene unidos a este uno o mas agentes que proporcionar senales de activacion a las celulas, por ejemplo anti-CD2 mAb y/o anti-CD335 mAb. Ademas, la nanomatriz lleva nanocristales magneticos, paramagneticos o superparamagneticos, incrustados en el polfmero. La nanomatriz se pone en contacto con celulas NK, activando e induciendo asf la proliferacion de las celulas T. Opcionalmente, despues de estimular las celulas NK, la nanomatriz magnetica, paramagnetica o superparamagnetica no unida puede ser eliminada aplicando un gradiente de campo magnetico. Alternativamente, las celulas marcadas con las nanomatrices magneticas pueden separarse aplicando un gradiente de campo magnetico, en particular un campo magnetico de alto gradiente, y posterior expansion de las celulas NK purificadas.
Aunque no es necesario eliminar la nanomatriz despues de la activacion y proliferacion de la poblacion de celulas NK debido a su propiedad de ser biologicamente inerte con respecto a la alteracion de la funcion celular, se puede eliminar opcionalmente la nanomatriz con condiciones de lavado suaves, las cuales son suficientes para lavar las nanomatrices de las celulas o cultivo celular. Las nanomatrices se pueden diluir facilmente mediante etapas de lavado repetidas hasta concentraciones eficaces por debajo del umbral de activacion de las celulas NK. Esta etapa de eliminacion opcional es mucho mas facil de realizar con las nanomatrices que con perlas o microesferas bien conocidas en el estado de la tecnica debido a su pequeno tamano. Si la nanomatriz lleva nanocristales magneticos, paramagneticos o superparamagneticos, incrustados en el polfmero entonces puede realizarse opcionalmente la etapa de eliminacion aplicando un gradiente de campo magnetico a la mezcla celula/nanomatriz.
El metodo de la invencion se puede usar para expandir poblaciones de celulas NK seleccionadas para su uso en el tratamiento de una enfermedad infecciosa o cancer. La poblacion de celulas NK resultante puede transducirse geneticamente y utilizarse para inmunoterapia o puede usarse para el analisis in vitro de agentes infecciosos tales como VIH despues de la expansion de la poblacion de celulas nK a numeros suficientes, las celulas NK expandidas se vuelven a infundir en el individuo o paciente. De forma similar, se puede obtener una poblacion de linfocitos infiltrantes de tumores de un individuo afectado con cancer y las celulas NK estimuladas para que proliferen hasta numeros suficientes y ser restauradas al individuo. Ademas, los sobrenadantes de cultivos de celulas NK expandidas de acuerdo con el metodo de la invencion son una fuente rica de citoquinas y pueden usarse para sostener celulas NK in vivo o ex vivo. En otra realizacion de la presente invencion, se puede usar una nanomatriz como se describe en cualquier realizacion precedente en un sistema de cultivo de celulas cerrado, e.g. (Miltenyi Biotec, Baxter, CellGenics), dispositivos G-Rex (fabricacion de Wilson Wolf), WAVE Bioreactors (GE Healthcare), Quantum Cell Expansion System (Terumo BCT), el sistema de procesamiento de muestras de W02009072003 o bolsas de cultivo celular. Las nanomatrices tienen una conectividad optima a tal sistema de cultivo celular cerrado, pueden ser facilmente esterilizadas por filtracion e integradas en el sistema de cultivo de celulas cerrado. Facilitan los procesos del sistema de cultivo de celulas cerrado, es decir, la estimulacion de las celulas NK u otras celulas diana, porque no es necesaria la eliminacion de las nanomatrices despues del proceso de estimulacion (y expansion) como se describe en el presente documento. La nanomatriz puede anadirse en relacion con el volumen del cultivo en lugar del numero de celulas NK. El volumen de cultivo puede evaluarse mediante un equilibrio o un sistema de camaras (por ejemplo, en el sistema de procesamiento de muestras de W02009072003).
El uso del metodo de la presente invencion dentro de un sistema de cultivo de celulas cerrado tal como el sistema de procesamiento de muestras de W02009072003 da como resultado una manera segura y facil de producir una composicion farmaceutica de celulas NK estimuladas debido al riesgo reducido de, e.g. agentes contaminantes tales como otras celulas eucariotas, bacterias o virus (manejo mas seguro y mas rapido por el operador).
En otra realizacion de la presente invencion, se puede usar una nanomatriz como la descrita en cualquier realizacion anterior para inducir la proliferacion en subconjuntos espedficos de celulas NK que se caracterizan por su repertorio KIR unico. Las celulas NK son "educadas" en su interaccion de sus moleculas KIR con sus ligandos (es decir, moleculas HLA de clase I). Basandose en este proceso educativo, los subgrupos de celulas NK espedficos de KIR se vuelven mas citotoxicos y, por tanto, mas atractivos para su uso como terapeutico celular. En esta realizacion, los anticuerpos que se unen a moleculas de KIR se unen a la nanomatriz para imitar el proceso de educacion en celulas NK proliferantes.
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En otra realizacion de la presente invencion, el cultivo de celulas NK mediante el uso de la nanomatriz se realiza dentro de un campo magnetico. En esta realizacion, la nanomatriz consiste en nucleos superparamagneticos incrustados en la matriz movil. Cuando se aplican a un campo magnetico se inducen fuerzas magneticas en la nanomatriz y los ligandos que activan los receptores de celulas NK activadoras pueden concentrarse para mejorar la induccion de la proliferacion. El cultivo de celulas NK dentro de un campo magnetico puede realizarse en una columna que consiste en una matriz ferromagnetica (por ejemplo, de WO2009072003) o en una bolsa, matraz o camara en proximidad cercana a un iman permanente fuerte.
En otra realizacion de la presente invencion se induce la proliferacion de celulas NK para conseguir un aumento de al menos 50 veces en el numero de celulas. Alrededor de 4E8 celulas NK pueden enriquecerse a partir de un producto de aferesis tipico. La dosis de celulas diana para ensayos clmicos se define frecuentemente como 1-2E8 celulas NK por kg de peso corporal del paciente, es decir, 2E10 celulas NK expandidas para un paciente de 100 kg. La dosis de la celula diana se puede conseguir con una expansion de 50 veces (ejemplo 3). El grado de expansion se calcula como el numero de celulas NK despues del proceso de cultivo dividido por el numero de celulas NK que se ha utilizado para iniciar el cultivo.
Tfpicamente 30-80% de las celulas NK mueren dentro de los primeros 5 dfas del cultivo. Estas son celulas NK que estan diferenciadas terminalmente y funcionalmente agotadas (por ejemplo no son capaces de proliferar). En el caso de que el 80% de las celulas NK de entrada mueran en la fase de cultivo inicial, una expansion de 50 veces, como se ha definido anteriormente, se traduce en una expansion de 250 veces con respecto al numero de celulas mas bajo en el cultivo.
En otra realizacion de la presente invencion, se induce la proliferacion de celulas NK para conseguir un aumento de al menos 200 veces en el numero de celulas. Aproximadamente 1E7 de celulas NK pueden enriquecerse a partir de una donacion de 100 ml de sangre entera. La dosis de celulas diana para ensayos clmicos se define frecuentemente como 1-2E8 celulas NK por kg de peso corporal del paciente, por ejemplo 2E9 celulas NK expandidas para un paciente pediatrico de 20 kg. La dosis de la celula diana se puede conseguir con una expansion de 200 veces (ejemplo 3).
En otra realizacion de la presente invencion se induce la proliferacion de celulas NK para conseguir un aumento de al menos 500 veces en el numero de celulas y se usan donaciones semanales de sangre (100 ml) para cultivar celulas NK. Dentro de un tratamiento semanal de 8 semanas, se pueden administrar 4E10 celulas NK cultivadas a un paciente de cancer (ejemplo 2).
Antes de la estimulacion de celulas NK mediante la presente invencion, las celulas NK pueden ser identificadas directamente y/o separadas o aisladas de sangre, celulas de sangre mononucleares perifericas (PBMC), tejido corporal o celulas de fluidos tisulares. Las celulas se identifican normalmente y/o se separan de muestras de celulas de mairnferos tales como seres humanos, raton o rata, pero especialmente de humanos y preferiblemente de sujetos de ensayo y/o pacientes. La separacion se realiza por metodos de clasificacion bien conocidos en la tecnica. Esto incluye, por ejemplo, cromatograffa de afinidad o cualquier otra tecnica de separacion dependiente de anticuerpos conocida en la tecnica. Cualquier tecnica de separacion dependiente de ligando conocida en la tecnica puede usarse conjuntamente con tecnicas de separacion tanto positivas como negativas que dependen de las propiedades ffsicas de las celulas. Una tecnologfa de clasificacion especialmente potente es la clasificacion de celulas magneticas. Los metodos para separar las celulas magneticamente estan disponibles comercialmente, por ejemplo de Invitrogen, Stemcell Technologies, Cellpro, Advanced Magnetics o Miltenyi Biotec. Ademas de las mezclas de celulas NK con otras celulas, tales como monocitos, macrofagos, celulas dendnticas, celulas B u otras celulas que forman parte de muestras de celulas hematologicas, tales como sangre o leucaferesis, pueden usarse poblaciones de celulas NK altamente purificadas para ser puestas en contacto con presente invencion, incluyendo subpoblaciones de celulas NK, tales como celulas NK de CD56atenuado, celulas NK de CD56brillante, subpoblaciones positivas y negativas de CD27, subpoblaciones positivas y negativas de CD2, subpoblaciones positivas y negativas de CD16, subpoblaciones positivas y negativas de KIR. Las nanomatrices proporcionan suficiente actividad de entrecruzamiento para activar receptores de celulas NK, por lo tanto no se requiere entrecruzamiento adicional para la activacion, por ejemplo a traves de celulas que expresan el receptor Fc, tales como monocitos o celulas dendnticas.
Las poblaciones de celulas diana, tales como las poblaciones de celulas NK obtenidas mediante la presente descripcion, pueden administrarse solas o como una composicion farmaceutica en combinacion con diluyentes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citoquinas o poblaciones celulares. En resumen, las composiciones farmaceuticas de la presente descripcion pueden comprender una poblacion de celulas diana tal como se describe en el presente documento, en combinacion con uno o mas vehmulos, diluyentes o excipientes farmaceutica o fisiologicamente aceptables. Una composicion farmaceutica puede comprender
a) una poblacion de celulas NK, en la que dichas celulas NK se hacen proliferar hasta cantidades terapeuticamente eficaces de acuerdo con la presente invencion; y b) uno o mas vehmulos, diluyentes o excipientes farmaceutica o fisiologicamente aceptables. Dicha composicion puede contener trazas de nanomatrices que son biologicamente inertes con respecto a la alteracion de la funcion celular, pero pueden ser biodegradables, y que no son toxicas y no son antigenicas para los seres humanos. Las composiciones de la presente descripcion se formulan preferiblemente para
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administracion intravenosa.
Las composiciones farmaceuticas de la presente descripcion pueden administrarse de una manera apropiada a la enfermedad por tratar (o prevenir). La cantidad y frecuencia de administracion se determinara por factores tales como la condicion del paciente, y el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente, aunque pueden determinarse dosificaciones apropiadas mediante ensayos clmicos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparacion de nanomatrices
Las nanomatrices magneticas se produjeron mediante una modificacion del procedimiento de Molday y MacKenzie. Se disuelven 10 gramos de Dextran T40 (Pharmacia Uppsala, Suecia), 1,5 g de FeCl3.6H2O y 0.64 g de FeCl2.4H2O en 20 ml de H2O y se calienta a 40°C. Mientras se agita, se anaden lentamente 10 ml de NaOH 4N y la solucion se calienta a 70°C durante 5 min. La suspension de partfculas se neutraliza con acido acetico. Para retirar los agregados, la suspension se centrifuga durante 10 minutos a 2.000 g y se filtra a traves de un filtro de tamano de poro de 0,22 pm (Millex GV, Millipore, Molsheim, Francia). El dextrano sin unir se elimina lavando en un campo magnetico de alto gradiente (HGMF). El lavado con HGMF de nanomatrices magneticas se realiza en columnas de lana de acero realizadas como se describe a continuacion y colocadas en un campo magnetico de aprox. 0,6 Tesla (iman permanente MACS®, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania). Se aplican 10 mililitros de suspension de nanomatriz a una columna de 15 x 40 mm de 2 g de lana de acero. La columna cargada se lava con 30 ml de acetato de sodio 0,05 M. Despues de retirar la columna del campo magnetico externo, las nanomatrices magneticas se eluyen con acetato de sodio 0,05 M. Las nanomatrices forman una suspension marron. La concentracion relativa de partfculas se da como densidad optica a 450 nm. El tamano de las nanomatrices se determino por microscopfa electronica y dispersion de luz dinamica a 30 ±20 nm (e.m.) y 65 ±20 nm (DLS). Se determino que el contenido de dextrano y el contenido de magnetita de la matriz dentro de la solucion coloidal estaban en el intervalo de aproximadamente 3,5 mg/ml y 4,8 mg/ml, respectivamente, resultando aproximadamente en una relacion de 40:60 p/p. Con base en la densidad de la nanomatriz seca de 2,5 g/ml determinada por picnometro y las densidades conocidas de dextrano y magnetita de 1,6 g/ml y 5,2 g/ml, respectivamente, se puede calcular que el volumen de dextrano es aproximadamente el 70% para la nanomatriz seca. Las nanomatrices muestran un comportamiento superparamagnetico, determinado por las mediciones de susceptibilidad. El tamano de los microcristales de ferritas atrapados se determino a partir de mediciones magneticas a aproximadamente 10 nm.
Se conjugaron anticuerpos de CD2 (anticuerpos de clon LT2, isotipo IgG2b de raton) y CD335 (NKp46) (clon 9E2, isotipo IgGl de raton) (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania) con las mismas o separadas nanomatrices por qmmica de bioconjugacion estandar (Bioconjugate Techniques, 2nd Edition, de Greg T. Hermanson, publicado por Academic Press, Inc., 2008).
Ejemplo 2: Expansion de celulas NK de celulas mononucleares de sangre periferica usando nanomatrices en diversas concentraciones de CD2/CD335 frente a CD2/CD335 MACSi - Beads
Los reactivos actuales de la tecnica para la activacion de celulas NK altamente purificadas comprenden anticuerpos activadores contra CD2/CD335 inmovilizados sobre las superficies de partfculas de tamano de celula grande (2-10 pm) o cocultivo con lmeas celulares alimentadoras. Ambas tecnicas son propensas a errores y tecnicamente diffciles de realizar y estandarizar, especialmente bajo condiciones de produccion compatibles con GMP. En contraste, las nanomatrices pueden prepararse facilmente y usarse convenientemente para cultivo celular bajo condiciones GMP. Por lo tanto, se comparo el potencial para inducir la proliferacion de celulas Nk analizando el potencial de expansion de las nanomatrices recubiertas con CD2 y CD335 a diversas concentraciones con perlas de estimulacion celular comercialmente disponibles (MACSiBeads, 0 4,5 pm, Miltenyi Biotec GmbH). Se prepararon celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) a partir de preparaciones de capa leucocitaria a partir de sangre entera humana. Las PBMC se cultivaron en el medio CellGenix CellGro SCGM suplementado con 1000 unidades de Interleuquina-2 (IL-2) y suero AB humano al 5% de lotes de suero preseleccionados a 1E6 celulas/ml. Se anadieron perlas magneticas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (relacion 1:2 para MACSiBeads) o en volumenes de 1, 5, 25 o 50 pl de un conjugado de nanomatriz CD2/CD335 concentrada de 100 pg/ml (relacion 1: 1) por ml de medio. La expansion a dosis optimas (100 ng/ml) fue similar o mejor que el reactivo estandar (MACSi-Beads). La expansion a dosis optimas (100 ng/ml) fue similar o mejor que el reactivo estandar (MACSi-Beads). A dosis mas altas, la expansion se redujo debido a la sobreestimulacion de las celulas NK (muerte celular inducida por activacion).
El numero de celulas NK se incremento 3800 veces y 900 veces. El contenido de celulas NK aumento de <10% a 6090%. En conjunto, estos resultados muestran que las nanomatrices recubiertas con CD2/CD335 pueden inducir eficazmente la proliferacion de celulas NK dentro de PBMC a concentraciones de anticuerpo muy bajas y sin necesidad de entrecruzamiento adicional.
Ejemplo 3: Expansion de celulas NK a partir de celulas NK purificadas usando nanomatrices en diversas
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concentraciones de CD2/CD335 frente a MACSiBeads de CD2/CD335.
Se prepararon celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) a partir de preparaciones de capa leucodtica a partir de sangre entera humana. Las celulas NK se aislaron usando el kit de aislamiento de celulas NK (Miltenyi Biotec). Se cultivaron celulas NK aisladas en el medio CellGenix CellGro SCGM suplementado con 1000 unidades de Interleuquina- 2 (IL-2) y suero AB humano al 5% de lotes de suero preseleccionados a 1E6 celulas NK/mL. Se anadieron perlas magneticas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (relacion 1: 2 para MACSiBeads) o en volumenes de 1, 5, 25 o 50 |jl de un conjugado de nanomatriz CD2/CD335 concentrado de 100 jg/ml (relacion 1:1) por ml de medio. Las nanomatrices expanden eficientemente las celulas NK. La expansion a dosis optimas (100 ng/ml) fue similar o mejor que el reactivo estandar (MACSiBeads). A dosis mas altas, la expansion se redujo debido a la sobreestimulacion de las celulas NK (muerte celular inducida por la activacion).
El numero de celulas NK se incremento 400 veces, 35 veces y 50 veces. En conjunto, estos resultados muestran que las nanomatrices recubiertas con CD2/CD335 pueden inducir eficazmente la proliferacion de celulas NK, de celulas NK purificadas a concentraciones anticuerpos muy bajas y sin necesidad de entrecruzamiento adicional.
Ejemplo 4: Expansion de celulas NK a partir de celulas NK purificadas usando nanomatrices en diversas relaciones de CD2/CD335
Los anticuerpos CD2 (clon LT2) y CD335 (clon 9E2) se conjugaron a nanomatriz en relaciones de 1:2, 1:1 y 2:1. Las celulas NK purificadas se cultivaron a 1E6/mL en el medio CellGenix CellGro SCGM suplementado con 1000 unidades de IL-2 y 5% de suero AB humano preseleccionado y la nanomatriz. Las celulas NK se cultivaron con las diferentes variantes de la nanomatriz durante 14 dfas. Los cultivos se dividieron cuando se alcanzo una concentracion celular de celulas > 5E5. Las velocidades de expansion fueron 11/21, 18/14 y 13/11 para relaciones 1:1, 1:2 y 2:1 (CD2: CD335) a concentraciones de 100 y 250 ng/ml. Para tres donantes adicionales las tasas de expansion fueron 14/8, 11/8, 13/14 veces y 9/34, 12/18 10/10 veces y 32/25, 23/17, 21/20 veces respectivamente. Los valores de referencia para el uso de perlas de tamano celular (kit de activacion y expansion de celulas NK, Miltenyi Biotec) fueron 17/16 (a 100/250 ng/ml), 17/15 y 33/37 y 23/18 veces para los mismos donantes.
Ejemplo 5 Expansion de celulas NK de celulas mononucleares de sangre periferica usando combinaciones de nanomatrices conjugadas con anticuerpos CD2 y CD335 (nanomatrices separadas)
Los anticuerpos CD2 (clon LT2) y CD335 (clon 9E2) se conjugaron individualmente a nanomatrices (vease el ejemplo 1). Se prepararon celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) a partir de preparaciones de capa leucocitaria a partir de sangre entera humana. Se cultivaron PBMCs a 1E6/mL en medio CellGenGlG SCGM de Cell-Genix suplementado con 1000 unidades de IL-2 y 5% de suero AB humano preseleccionado y mezcla 1:1 de la nanomatriz cD2 y la nanomatriz CD335. Se cultivaron celulas NK durante 14 y 19 dfas. Los cultivos se dividieron cuando se alcanzo una concentracion celular de celulas > 5E6. Las tasas de expansion fueron 420/350/290 y 250 veces a 100/500/2500/5000 ng/mL despues de 14 dfas y 910/750/410 y 670 veces despues de 19 dfas. Las celulas NK en PBMC cultivadas con perlas de tamano celular (kit de activacion y expansion de celulas NK, Miltenyi Biotec) se expandieron 380 (d14) y 530 veces (d19). Si es similarmente eficaz a gran escala, se puede obtener una posible dosis de 2E10 celulas diana con un numero de celulas NK inicial de celulas NK <3E7, un numero de celulas que esta contenido en 100 a 300 ml de sangre entera (se supone una expansion de 750 veces).
Claims (12)
- 510152025303540Reivindicaciones1. El uso de una nanomatriz para inducir in vitro la proliferacion de celulas NK, comprendiendo la nanomatriza) una matriz de cadenas polimericas moviles, yb) unidos a dicha matriz de cadenas polimericas moviles, uno o mas agentes estimuladores que proporcionan senales de activacion a las celulas NK;en el que la nanomatriz tiene un tamano de 1 a 500 nm, y en el que dichas cadenas polimericas moviles son de polisacaridos seleccionados del grupo que consiste en eteres de celulosa, almidon, goma arabiga, agarosa, dextrano, quitosano, acido hialuronico, pectinas, xantano, goma guar y alginato.
- 2. Un metodo in vitro para inducir la proliferacion de celulas NK, comprendiendo el metodo el contacto de una poblacion de celulas NK con una nanomatriz, comprendiendo la nanomatriza) una matriz de cadenas polimericas moviles; yb) unidos a dicha matriz de cadenas polimericas moviles, uno o mas agentes estimuladores que proporcionan senales de activacion a las celulas NK;en el que la nanomatriz tiene un tamano de 1 a 500 nm, y en el que dichas cadenas polimericas moviles son de polisacaridos seleccionados del grupo que consiste en eteres de celulosa, almidon, goma arabiga, agarosa, dextrano, quitosano, acido hialuronico, pectinas, xantano, goma guar y alginato.
- 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que al menos un primer y un segundo agentes estimuladores estan unidos a la misma matriz de cadenas polimericas moviles.
- 4. El metodo segun la reivindicacion 2, en el que al menos un primer y un segundo agentes estimuladores estan unidos a matrices separadas de cadenas polimericas moviles.
- 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que la relacion de nanomatrices a celulas es mayor que 100:1 permitiendo el ajuste fino de la proliferacion de celulas nK.
- 6. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que un agente estimulador es un anticuerpo anti-CD2 o fragmento del mismo.
- 7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el segundo agente estimulador es un anticuerpo anti-CD335 o fragmento del mismo.
- 8. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que la matriz de cadenas polimericas moviles consiste en un polfmero de dextrano.
- 9. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que la nanomatriz lleva nanocristales magneticos, paramagneticos o superparamagneticos, incrustados en la matriz de cadenas polimericas moviles.
- 10. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que el agente estimulador esta unido a alta densidad con mas de 25 |jg por mg de nanomatriz.
- 11. Un metodo para inducir la proliferacion de celulas NK en un sistema de cultivo de celulas cerrado, comprendiendo el metodo poner en contacto un cultivo de celulas que comprende una poblacion de celulas NK dentro de dicho sistema de cultivo de celulas cerrado con una dosificacion de nanomatriz, comprendiendo la nanomatriza) una matriz de cadenas polimericas moviles; yb) unidos a dicha matriz de cadenas polimericas moviles, uno o mas agentes estimuladores que proporcionan senales de activacion a las celulas NK;en el que la nanomatriz tiene un tamano de 1 a 500 nm, y en el que dichas cadenas polimericas moviles son de polisacaridos seleccionados del grupo que consiste en eteres de celulosa, almidon, goma arabiga, agarosa, dextrano, quitosano, acido hialuronico, pectinas, xantano, goma guar y alginato y en el que dicha dosificacion de nanomatriz seaplica esteril a dicho sistema de cultivo de celulas cerrado, y en el que dicha dosificacion depende del volumen del cultivo celular en dicho sistema de cultivo de celulas cerrado.
- 12. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que dicho volumen del cultivo celular puede determinarse mediante una balanza o un sistema de camara sin afectar a la barrera de esterilidad.5 13. Un metodo de acuerdo con las reivindicaciones 11 y 12, en el que la determinacion y aplicacion de dichadosificacion se realizan automaticamente.
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