MX2013003349A - Captura directa, amplificacion y secuenciacion de objetivo adn usando cebadores inmovilizados. - Google Patents

Abstract

Ciertas modalidades proporcionan un método para capturar un fragmento genómico. El método puede comprender: obtener un sustrato que comprende una primera población de los oligonucleótidos unidos a la superficie y una segunda población de los oligonucleótidos unidos a la superficie; hibridizar un primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie a un oligonucleótido seleccionado que comprende una región que hibridiza el primer miembro y una región que contiene una secuencia genómica; extender el primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir un cebador seleccionado unido al soporte que comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia genómica; hibridizar el cebador seleccionado unido al soporte a un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia genómica; extender el cebador seleccionado unido al soporte para obtener un producto de extensión que contiene una secuencia que flanquea la secuencia genómica, por ejemplo, en un genoma; y amplificar el producto de extensión en el sustrato.

Description

CAPTURA DIRECTA. AMPLIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DE OBJETIVO ADN USANDO CEBADORES INMOVILIZADOS Referencias Cruzadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de patente Estadounidense serie No. 61/386,390, presentada el 24 de septiembre de 2010, y 61/485,062 presentada el 11 de mayo de 2011, cuyas solicitudes se incorporan en la presente en su totalidad.

Derechos Gubernamentales Esta invención se realizó con apoyo del gobierno bajo el contrato HG000205 otorgado por el Instituto Nacional de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Antecedentes de la Invención En muchos métodos de secuenciación , particularmente en los métodos de resecuenciación (es decir, métodos en los que se resecuencia un locus), primero se captura el objetivo y después se secuencia. Varias metodologías de captura de objetivos se han desarrollado e integrado con los sistemas de secuenciación de alto rendimiento. Específicamente, pueden aplicarse ensayos basados en hibridación usando cuentas o microarreglos y técnicas basadas en soluciones usando sondas moleculares de inversión u oligonucleótidos genómicos de circularización para capturar el ADN objetivo. Después el ADN capturado se prepara para la secuenciación. Frecuentemente se utilizan protocolos complicados de biología molecular para preparar la muestra enriquecida de ADN y en ciertos casos la producción de la genoteca de secuenciación implica muchas reacciones enzimáticas, etapas de purificación y selección por tamaño mediante electroforesis en gel. El proceso de preparación de la muestra para la secuenciación del ADN objetivo capturado puede requerir mucho trabajo y las manipulaciones posteriores de la muestra pueden causar un sesgo en el contenido de ADN y aumentar la tasa de errores en la secuenciación.

Breve resumen de la Invención En la presente se proporcionan métodos para capturar y amplificar un fragmento de ácido nucleico, por ejemplo, un fragmento genómico o un ADNc obtenido a partir de ARN. Se proporcionan además los kits para practicar el método. En ciertas modalidades, el método comprende: a) obtener un sustrato que comprende una primera población de oligonucleótidos unidos a una superficie y una segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie, donde los miembros de la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos unidos a la superficie no están dirigidos espacialmente sobre el sustrato; b) hibridar un primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie a un oligonucleótido de selección que comprende una región que se híbrida con el primer miembro y una región que contiene una secuencia genómica, c) extender el primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir un cebador de selección unido al soporte que comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia genómica; d) hibridar el cebador de selección unido al soporte a un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, un fragmento genómico o ADNc) que comprende la secuencia genómica; e) extender el cebador de selección unido al soporte para producir un producto de extensión que contiene una secuencia que flanquea la secuencia genómica, por ejemplo, en el genoma; f) amplificar el producto de extensión sobre el sustrato, por ejemplo, por una PCR de puente usando miembros no extendidos de la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos unidos a la superficie, para producir un producto PCR.

En ciertas modalidades, el método comprende: a) obtener un sustrato que comprende una primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie y una segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie, donde la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos unidos a la superficie no están dirigidas espacialmente sobre el sustrato; b) hibridar un primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie a un oligonucleótido de selección que comprende una región que se híbrida con el primer miembro y una región que contiene una secuencia genómica, c) extender el primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir un cebador de selección unido al soporte que comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia genómica; d) hibridar el cebador de selección unido al soporte a un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia genómica; e) extender el cebador de selección unido al soporte para producir un producto de extensión que contiene una secuencia que flanquea la secuencia genómica, por ejemplo, en un genoma; y f) amplificar el producto de extensión, por ejemplo, usando una PCR de puente sobre el sustrato para producir un producto PCR.

Dependiendo de cómo se implementa el método, puede ligarse un adaptador ya sea al fragmento genómico antes de la hibridación, o al producto de extensión después de la extensión del cebador de selección unido al soporte. El adaptador distal puede hibridar con un oligonucleótido unido a la superficie (el cual puede ser en sí mismo un producto de extensión producido por una extensión con molde de la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie), permitiendo de esta manera que se produzca el PCR de puente. El cebador de selección puede contener además un sitio de unión para un cebador de secuenciación que puede utilizarse para secuenciar el producto PCR.

El método descrito anteriormente, generalmente encuentra uso en métodos de resecuenciación en los que se dispone de la secuencia de un locus de referencia y ese mismo locus se resecuenciará en una pluralidad de muestras de prueba. En esta utilidad, se diseña el oligonucleótido de selección para que hibride con un oligonucleótido sobre el sustrato y una región que flanquea el locus que se va resecuenciar. El locus se captura sobre el sustrato y después se amplifica antes de la secuenciación. Por ejemplo, un locus único o múltiples loci diferentes (por ejemplo, hasta 10, 50, 100, 200 o 1,000 o más loci) pueden capturarse a partir de una muestra que se obtiene de un individuo o de múltiples individuos (por ejemplo, hasta 10, 50, 100, 200 o 1,000 o más individuos).

En ciertas modalidades, el método comprende: a) obtener un sustrato que comprende una primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie y una segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie, donde la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos unidos a la superficie se intercalan aleatoriamente sobre el sustrato y no están dirigidos espacialmente; b) hibridar un primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie a un oligonucleótido de selección que comprende una región que se híbrida con el primer miembro y una región que contiene una secuencia genómica; c) extender el primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir un cebador de selección unido al soporte que comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia genómica; d) hibridar el cebador de selección unido al soporte a un fragmento ligado a un adaptador (por ejemplo, un fragmento genómico ligado a un adaptador) que comprende la secuencia genómica; e) extender el cebador de selección unido al soporte para producir un producto que contiene una secuencia que flanquea la secuencia genómica (por ejemplo, en un genoma) y la secuencia del adaptador del fragmento genómico ligado al adaptador; y f) amplificar el producto usando una PCR de puente para producir un producto PCR.

En modalidades alternativas, el método puede comprender: a) obtener un sustrato que comprende una primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie y una segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie, donde la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos unidos a la superficie se intercalan aleatoriamente sobre el sustrato y no están dirigidos espacialmente; b) hibridar un primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie a un oligonucleótido de selección que comprende una región que se híbrida con el primer miembro y una región que contiene una secuencia genómica; c) extender el primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir un cebador de selección unido al soporte que comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia genómica; e) extender el cebador de selección unido al soporte para producir un producto que contiene una secuencia que flanquea la secuencia genómica; f) ligar un adaptador de doble cadena al producto para producir un producto modificado con el adaptador; y g) amplificar el producto modificado con el adaptador usando una PCR de puente para producir un producto PCR.

En casos particulares, el método puede comprender además: i. ligar los fragmentos genómicos a un adaptador que contiene un sitio para un cebador de secuenciación y una secuencia nucleotídica que es la misma que los oligonucleótidos unidos a la segunda superficie, ii. ibridar los fragmentos genómicos ligados al adaptador a un primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie, ii. extender el primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie al que se híbrida el fragmento ligado al adaptador; y iv. hibridar el extremo del producto de extensión que contiene el adaptador a un segundo polinucleótido unido al soporte, produciendo de esta manera un puente y facilitando la PCR de puente.

Breve Descripción de las Figuras Ciertos aspectos de la siguiente descripción detallada se entenderán mejor cuando se lea junto con los dibujos acompañantes. Se destaca que, de acuerdo con la práctica común, las diversas características de los dibujos no están a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características se amplían o reducen arbitrariamente para mayor claridad. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras: Figura 1. Una visión general de la modalidad del método en cuestión denominado "OS-Sec". (a) La OS-Sec es un método de resecuenciación dirigida que se integra perfectamente con la plataforma de NGS de lllumina. Para este método se necesitan los oligonucleótidos específicos para los objetivos, una genoteca de secuenciación y un kit de generación de grupos de lllumina. La captura de los objetivos, el procesamiento y la secuenciación se realizan en el sistema de NGS. Los datos procedentes de cada sonda cebadora son dirigidos y específicos de cadena. Aquí se muestra el perfil medio de la cobertura de 366-OS-Sec. (b) El procesamiento de OS-Sec implica tres etapas de hibridación, extensión mediada por la DNA polimerasa y desnaturalización del ADN. Etapa 1; Los oligonucleótidos específicos para los objetivos se usan para modificar los cebadores en las celdas de flujo a sondas cebadoras. En el sistema de secuenciación de lllumina se inmovilizan dos tipos de cebadores (denominados C y D) sobre una celda de flujo para extremos apareados. En OS-Sec un subconjunto de cebadores D se modifica a sondas cebadoras usando una genoteca compleja de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos tienen secuencias que se hibridan con los cebadores tipo D de la celda de flujo. Después los oligonucleótidos hibridados se utilizan como molde para la ADN polimerasa y se extienden los cebadores D. Después de la desnaturalización, las sondas cebadoras específicas para los objetivos se inmovilizan aleatoriamente sobre la celda de flujo. Etapa 2: Los objetivos genómicas en una genoteca de adaptadores únicos se capturan usando sondas cebadoras. La preparación de las muestras para la secuenciación con lllumina implica la adición de adaptadores de ADN específicos a los fragmentos de ADN genómico. Estos adaptadores incorporan sitios para los cebadores de secuenciación e inmovilizan los cebadores en las celdas de flujo. En OS-Sec, usamos un adaptador modificado para preparar genoteca de un adaptador único a partir de ADN genómico. Los objetivos en la genoteca con el adaptador único se capturan durante la hibridación a altas temperaturas con sus sondas cebadoras complementarias. Los fragmentos capturados de la genoteca del adaptador único se usan como molde para la ADN polimerasa y se extienden las sondas cebadoras. La desnaturalización libera el ADN molde de los objetivos inmovilizados. Etapa 3: Los objetivos inmovilizados se hacen compatibles con la secuenciación de lllumina. En la secuenciación de lllumina, se requiere de la amplificación en fase sólida de los fragmentos inmovilizados de la genoteca de secuenciación usando los cebadores C y D. En OS-Sec, durante la hibridación a altas temperaturas las colas del adaptador único de los objetivos inmovilizados hibridan con los cebadores tipo C sobre la superficie de la celda de flujo, lo que estabiliza una estructura de puente. Los extremos 3' de los objetivos inmovilizadas y de los cebadores C se extienden usando la ADN polimerasa. Después de la desnaturalización, se forman dos fragmentos de la genoteca de secuenciación, inmovilizados y complementarios que contienen los sitios completos de los cebadores C y D y son compatibles con la amplificación en fase sólida. Después de las tres etapas de OS-Sec, los objetivos inmovilizados son estructuralmente idénticas a una genoteca estándar de extremos apareados de lllumina y las mismas se amplifican y procesan usando kits y protocolos estándares de lllumina. Los principios de este método se pueden utilizar en otras plataformas de secuenciación . (c) Se muestra el perfil de cobertura a lo largo del gen KRAS del ensayo 366-OS-Sec. En el eje x se presentan las posiciones de las bases con relación al inicio del exón 1 y se indican los exones de KRAS. (d) Evaluación de la uniformidad de los rendimientos de las sondas cebadoras dentro de los oligonucleótidos sintetizados en columnas y en arreglos. La uniformidad de la captura se comparó entre los oligonucleótidos sintetizados en columnas (azul, n = 366) y los sintetizados en arreglos (rojo, n = 11,742). En el eje x, los oligonucleótidos están ordenados por los rendimientos de captura de secuencias, en el eje y está el rendimiento normalizado de las sondas cebadoras. Para calcular el rendimiento normalizado, el rendimiento de cada oligonucleótido se dividió por el rendimiento medio de todos los oligonucleótidos.

Figura 2: Preparación de la genoteca de secuenciación para OS-Sec. Se usó un esquema general de fragmentación del ADN genómico, reparación de extremos, adición de la cola de A, ligación del adaptador y PCR en la preparación de las genoteca de OS-Sec.

Figura 3. Estrategias de diseño para OS-Sec. (a) Las sondas cebadoras se colocaron a 10 bases a partir del exón o (b) dispuestas cada 500 bases dentro de los exones grandes.

Figura 4. Generación de oligonucleótidos de OS-Sec. La síntesis en columna rindió gran cantidad de oligonucleótidos maduros de 101-mer de OS-Sec que se usaron fácilmente en el ensayo. La síntesis en microarreglos se aplicó para generar mezclas con alto contenido de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos precursores se amplificaron usando cebadores que incorporaron secuencias adicionales a los oligonucleótidos. La escisión de uracilo se aplicó para separar el sitio cebador de la amplificación a partir de las cadenas codificantes de los oligonucleótidos en OS-sec.

Figura 5. Estructuras de los componentes de oligonucleótidos en OS-Sec. (a) Los oligonucleótidos maduros de 101-mer en OS-Sec contenían un sitio específico para el objetivo y las secuencias que codifican para el cebador de secuenciación 2 y el cebador 'D' de la celda de flujo, (b) Los oligonucleótidos sintetizados en microarreglos se amplificaron usando cebadores que incorporaron uracilo en el extremo 5' del oligonucleótido de OS-Sec y sitios activos adicionales para la secuenciación. (c) El adaptador para OS-Sec contenía una T adicional para la ligación de los extremos cohesivos a los fragmentos genómicos con cola de A. Adicionalmente, en el adaptador de ADNbc estaban presentes las secuencias de indexación, así como el sitio del cebador 'C en la celda de flujo.

Figura 6. Descripción de las distribuciones por tamaño del inserto encontradas en los datos de OS-Sec. La fragmentación del ADN genómico produce fragmentos entre 200 y 2kb. La preparación de la genoteca de secuenciación añade un adaptador común a los extremos de los fragmentos. La amplificación por PCR distorsiona más la distribución por tamaño de los fragmentos. Los sitios objetivos están distribuidos aleatoriamente dentro de los fragmentos de la genoteca con un único adaptador. Los fragmentos de la genoteca se inmovilizaron sobre la celda de flujo y la distancia entre la sonda cebadora y el adaptador definió el tamaño de un inserto de ADN genómico. La PCR de puente se aplica para amplificar el ADN objetivo inmovilizado (generalmente, la PCR en fase sólida amplifica preferencialmente fragmentos más cortos). Después de la amplificación y el procesamiento de los grupos, los fragmentos inmovilizados se secuencian usando dos sitios. La Lectura 1 de la secuencia nucleotídico se origina a partir del ADN genómico y la Lectura 2 se deriva a partir de las sondas cebadoras sintéticas. La Lectura 1 se usa para evaluar la secuencia de ADN genómico a partir de los datos de OS-Sec.

Figura 7. Reproducibilidad de OS-Sec. (a) Reproducibilidad técnica de OS-Sec. Se analizaron dos genoteca idénticas usando OS-Sec. Los rendimientos de la secuenciación de sondas cebadoras individuales se compararon entre réplicas técnicas, (b) Reproducibilidad biológica de OS-Sec. Se prepararon dos genoteca diferentes de ADN genómico usando adaptadores indizados. Las genoteca se analizaron en el mismo experimento de OS-Sec. En la figura, se comparan los rendimientos de la captura específica de sondas cebadoras entre dos réplicas biológicas independientes.

Figura 8A-B. Efecto del contenido de GC sobre el rendimiento. Para analizar el efecto del contenido de GC en la eficiencia de las sondas cebadoras, determinamos el contenido de GC de cada secuencia de sonda cebadora específica para un objetivo. Clasificamos las sondas cebadoras que fallaban (0 objetivos capturadas). Las proporciones de las sondas cebadoras fallidas se compararon entre diferentes categorías basadas en el contenido de GC en %. El eje X presenta los porcentajes de las categorías ordenadas de CG y el eje y reporta la proporción de sondas cebadoras fallidas dentro de cada categoría del contenido de GC.

Figura 9A-B. Comparación del flujo de trabajo de procesamiento de los métodos de creación de genoteca por OS-Sec y por secuenciación aleatoria.

Definiciones A menos que se defina de cualquier otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por aquellos expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Si bien los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden usarse en la práctica o en la prueba de la presente invención, se describen los materiales y métodos preferidos.

Todas las patentes y publicaciones, que incluyen todas las secuencias descritas dentro de tales patentes y publicaciones, a las que se hace referencia en la presente, se incorporan expresamente como referencia.

Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique de cualquier otra forma, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación de 5" a 3"; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación del grupo amino al grupo carboxi, respectivamente.

Los encabezamientos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de la invención. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación están más completamente definidos como referencia a la especificación como un todo.

A menos que se defina de cualquier otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por aquellos expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Singleton, y colaboradores, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994), y Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan a un experto el significado general de muchos de los términos usados en el presente documento. Sin embargo, ciertos términos se definen a continuación por la claridad y facilidad de referencia.

El término "muestra" como se usa en el presente documento se refiere a un material o mezcla de materiales, típicamente, aunque no necesariamente, en forma líquida, que contiene uno o más analitos de interés. Las muestras de ácidos nucleicos usados en el presente documento pueden ser complejas por el hecho que contienen múltiples moléculas diferentes que contienen secuencias. El ADN genómico fragmentado y el ADNc obtenido a partir del ARNm de un mamífero (por ejemplo, ratón o humano) son tipos de muestras complejas. Las muestras complejas pueden tener más de 104, 105, 106 o 107 moléculas diferentes de ácido nucleico. Un ADN objetivo puede proceder de cualquier fuente, tal como ADN genómico, ADNc (a partir de ARN) o construcciones artificiales de ADN. Cualquier muestra que contiene ácido nucleico, por ejemplo, ADN genómico obtenido a partir de células de cultivos de tejido, una muestra de tejido, o una muestra FPET, puede utilizarse en la presente invención.

Se pretende que el término "nucleótido" incluya aquellas porciones que contienen no sólo las bases conocidas de purina y pirimidina, sino además otras bases heterocíclicas que se han modificado. Tales modificaciones incluyen purinas o pirimidina metiladas, purinas o pirimidina aciladas, ribosas alquiladas u otros heterociclos. Adicionalmente, el término "nucleótido" incluye aquellas porciones que contienen hapteno o etiquetas fluorescentes y puede contener no sólo los azúcares convencionales ribosa y desoxirribosa, sino otros azúcares como tal. Los nucleósidos o nucleótidos modificados incluyen además modificaciones en la porción del azúcar, por ejemplo, donde uno o más de los grupos hidroxilo están sustituidos con átomos de halógeno o grupos alifáticos, están funcionalizado como éteres, aminas, o similares.

Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en la presente invención para describir un polímero de cualquier longitud, por ejemplo, mayor de aproximadamente 2 bases, mayor de aproximadamente 10 bases, mayor de aproximadamente 100 bases, mayor de aproximadamente 500 bases, mayor de 1000 bases, hasta aproximadamente 10,000 o más bases compuestas de nucleótidos, por ejemplo, desoxirribonucleótidos o ribonucleótido, y pueden producirse enzimáticamente o sintéticamente (por ejemplo, un APN como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,948,902 y las referencias citadas en la misma) que pueden hibridarse con ácidos nucleicos de origen natural de una manera específica de secuencia análoga a la de dos ácidos nucleicos de origen natural, por ejemplo, pueden participar en interacciones de apareamiento de bases de Watson-Crick. Los nucleótidos de origen natural incluyen guanina, citosina, adenina y timina (G, C, A y T, respectivamente).

El término "muestra de ácido nucleico", como se usa en la presente invención denota una muestra que contiene ácidos nucleicos.

El término "polinucleótido objetivo", como se usa en la presente invención, se refiere a un polinucleótido de interés en estudio. En ciertas modalidades, un polinucleótido objetivo contiene una o más secuencias que son de interés y están en estudio.

El término "oligonucleótido" como se usa en la presente invención denota un multímero de nucleótidos de simple cadena de aproximadamente 2 a 200 nucleótidos, hasta 500 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser sintéticos o pueden obtenerse enzimáticamente , y, en algunas modalidades, son de 30 a 150 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos püeden contener monómeros de ribonucleótido (es decir, pueden ser oligorribonucleótidos) o monómeros de desoxirribonucleótidos. Un oligonucleótido, por ejemplo, puede ser de 10 a 20, 11 a 30, 31 a 40, 41 a 50, 51 a 60, 61 a 70, 71 a 80, 80 a 100, 100 a 150 o 150 a 200 nucleótidos de longitud.

El término "hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria mediante el apareamiento de bases como se conoce en la técnica. Se considera que un ácido nucleico es "selectivamente hibridable" a una secuencia de ácido nucleico de referencia si las dos secuencias se hibridan específicamente entre sí bajo condiciones de hibridación y lavado de moderada a alta rigurosidad. Las condiciones de hibridación de moderada y alta rigurosidad son conocidas (ver, por ejemplo, Ausubel, y colaboradores, Short Protocols in Molecular Biology, 3ra ed., Wiley & Sons 1995 y Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera edición, 2001 Cold Spring Harbor, N.Y.). Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad incluye la hibridación a aproximadamente 42°C en 50% de formamida, SSC 5X, solución de Denhardt 5X, SDS 0.5% y 100 ug/ml del ADN portador desnaturalizado seguido de dos lavados en SSC 2X y SDS 0.5% a temperatura ambiente y dos veces más en SSC 0.1X y SDS 0.5% a 42°C.

Los términos "híbrido", o "hibridado", como se usan en la presente invención, describen dos polinucleótidos complementarios con apareamiento de bases, es decir, se hibridan juntos.

El término "amplificar" como se utiliza en la presente se refiere a generar una o más copias de un ácido nucleico objetivo, usando el ácido nucleico objetivo como molde.

Los términos "determinar", "medir", "evaluar", "estimar", "ensayar", y "analizar" se utilizan indistintamente en la presente invención para referirse a cualquier forma de medición, e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen las determinaciones cuantitativa y/o cualitativa. La evaluación puede ser relativa o absoluta. "Evaluar la presencia de" incluye determinar la cantidad presente de algo, así como determinar si está presente o ausente.

El término "usar" tiene su significado convencional, y, como tal, significa utilizar, por ejemplo, poner en servicio, un método o una composición para alcanzar un fin. Por ejemplo, si un programa se usa para crear un archivo, un programa se ejecuta para hacer un archivo, siendo el archivo usualmente la salida del programa. En otro ejemplo, si se usa un archivo de computadora, usualmente se accede a este, se lee, y la información almacenada en el archivo se utiliza para alcanzar un fin. Similarmente si se usa un identificador único, por ejemplo, un código de barras, usualmente el identificador único se lee para identificar, por ejemplo, un objeto o un archivo asociado con el identificador único.

Como se utiliza en la presente, el término "Tm" se refiere a la temperatura de fusión de un híbrido de oligonucleótidos a la cual la mitad de los híbridos permanecen hibridados y la mitad de los híbridos se disocian en simples cadenas. La Tm de un híbrido de oligonucleótidos puede determinarse o predecirse experimentalmente usando la siguiente fórmula Tm = 81.5 + 16.6 (log10[Na+]) + 0.41 (fracción G + C) - (60/N), donde N es la longitud de la cadena y [Na+] es menor de 1M. Ver Sambrook y Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y., ch. 10). Existen otras fórmulas para predecir el Tm de los híbridos de oligonucleótidos y una fórmula puede ser más o menos apropiada para una condición dada o un conjunto de condiciones.

El término "libre en solución," tal como se utiliza en la presente, describe una molécula, tal como un polinucleótido, que no está unido o atado a otra molécula.

El término "desnaturalización", como se usa en la presente, se refiere a la separación de un híbrido de ácido nucleico en dos simples cadenas.

El término "secuencia genómica", como se usa en la presente, se refiere a una secuencia presente en un genoma. Debido a que los ARN se transcriben a partir de un genoma, este término comprende secuencias que existen en el genoma nuclear de un organismo, así como secuencias que están presentes en una copia de ADNc de un ARN (por ejemplo, un ARNm) transcrito a partir de tal genoma.

El término "fragmento genómico", como se usa en la presente, se refiere a una región de un genoma, por ejemplo, un genoma de un animal o una planta, tales como el genoma de un ser humano, mono, rata, pez, insecto o planta. Un fragmento genómico puede o puede no estar ligado a un adaptador. Un fragmento genómico puede estar ligado a un adaptador (en cuyo caso tiene un adaptador ligado a uno o ambos extremos del fragmento, al menos en el extremo 5' de una molécula), o no ligado a un adaptador.

En ciertos casos, un oligonucleótido usado en el método descrito en la presente invención puede diseñarse usando una región genómica de referencia, es decir, una región genómica de la secuencia nucleotídico conocida, por ejemplo, una región cromosómica cuya secuencia existe en la base de datos Genbank del NCBI u otra base de datos, por ejemplo. Tal oligonucleótido puede utilizarse en un ensayo que usa una muestra que contiene un genoma de prueba, donde el genoma de prueba contiene un sitio de unión para el oligonucleótido.

El término "ligar", como se usa en la presente invención, se refiere a la unión catalizada enzimáticamente del terminal nucleotídico en el extremo 5' de una primera molécula de ADN al terminal nucleotídico en el extremo 3' de una segunda molécula de ADN.

El término "adaptador" se refiere a moléculas de doble cadena, así como de simple cadena.

Una "pluralidad" contiene al menos 2 miembros. En ciertos casos, una pluralidad puede tener al menos 10, al menos 100, al menos 10,000, al menos 100,000, al menos 106, al menos 107, al menos 1 O8 o al menos 109 o más miembros.

Si dos ácidos . nucleicos son "complementarios", cada base de uno de los ácidos nucleicos se aparea con el nucleótido correspondiente en el otro ácido nucleico. Los términos "complementario" y "perfectamente complementario" se usan como sinónimos en la presente invención.

Un "sitio de unión del cebador" se refiere a un sitio en un oligonucleótido o en una cadena complementaria del mismo al que se híbrida un cebador.

El término "separar", como se usa en la presente, se refiere a la separación física de dos elementos (por ejemplo, por tamaño o afinidad, etcétera) así como a la degradación de un elemento, dejando al otro intacto.

El término "secuenciar", como se usa en la presente, se refiere a un método por el cual se obtiene la identidad de al menos 10 nucleótidos consecutivos (por ejemplo, la identidad de al menos 20, al menos 50, al menos 100 o al menos 200 o más nucleótidos consecutivos) de un polinucleótido.

El término "no dirigido espacialmente", en el contexto de un sustrato que contiene poblaciones de oligonucleótidos unidos a una superficie que no están dirigidos espacialmente, se refiere a un sustrato que contiene una superficie conteniendo diferentes moléculas de oligonucleótidos que no están en ningún orden o posición particular de unos con relación a otros, es decir, en posiciones aleatorias o intercalados aleatoriamente unos con otros. Tal sustrato no necesita ser plano y en ciertos casos puede ser en forma de una cuenta. Los sustratos que contienen poblaciones de un único oligonucleótido dirigidas espacialmente u ópticamente (por ejemplo, microarreglos y cuentas codificadas, etcétera) se excluyen en esta definición. Un sustrato que comprende una primera población de oligonucleótidos unidos a una superficie y una segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie, donde la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos unidos a la superficie no están dirigidos espacialmente, se refiere a un sustrato que contiene al menos dos poblaciones de oligonucleótidos diferentes que están distribuidos aleatoriamente a través del sustrato. Un sustrato puede ser plano o en forma de cuentas, por ejemplo.

El término "ligado a un adaptador", como se usa en la presente, se refiere a un ácido nucleico que se ha ligado a un adaptador. El adaptador puede ligarse a un extremo 5' o a un extremo 3' de una molécula de ácido nucleico.

El término "extender", como se usa en la presente, se refiere a la extensión de un cebador por adición de nucleótidos usando una polimerasa. Si se extiende un cebador que está apareado a un ácido nucleico, el ácido nucleico actúa como molde para la reacción de extensión.

El término "PCR de puente" se refiere a una reacción en cadena de la polimerasa en fase sólida en la cual los cebadores que se extienden en la reacción están atados a un sustrato por sus extremos 5'. Durante la amplificación, los amplicones forman un puente entre los cebadores atados. La PCR de puente (la cual puede referirse además como "PCR de grupo") se usa en la plataforma Solexa de lllumina. La PCR de puente y la plataforma Solexa de lllumina generalmente se describen en una variedad de publicaciones, por ejemplo, Gudmundsson y colaboradores (Nat. Genet. 2009 41:1122-6), Out y colaboradores (Hum. Mutat. 2009 30:1703-12) y Turner (Nat. Methods 6:315-6 2009), patente Estadounidense No. 7,115,400, y las publicaciones de las solicitudes de publicación No. US20080160580 y US20080286795.

El término "secuencia de código de barras", como se usa en la presente, se refiere a una secuencia única de nucleótidos y se usa para identificar y/o rastrear la fuente de un polinucleótido en una reacción. Una secuencia de código de barras puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' de un oligonucleótido. Las secuencias de código de barras pueden variar ampliamente en tamaño y composición; las referencias siguientes proporcionan orientaciones para seleccionar conjuntos de secuencias de código de barras adecuadas para modalidades particulares: Brenner, patente Estadounidense No. 5,635,400; Brenner y colaboradores, Proc Nati. Acad. Sci., 97: 1665-1670 (2000); Shoemaker y colaboradores, Nature Genetics, 14: 450-456 (1996); Morris y colaboradores, publicación de la patente europea No. 0799897A1; Wallace, patente Estadounidense No. 5,981,179; y similares. En modalidades particulares, una secuencia de código de barras puede tener una longitud en un intervalo de 4 a 36 nucleótidos, o de 6 a 30 nucleótidos, o de 8 a 20 nucleótidos.

Otras definiciones de términos pueden aparecer a lo largo de la descripción.

Descripción Detallada de Modalidades Ejemplares Ciertas características del método en cuestión se describen con referencia a Figura 1, la cual ilustra una modalidad en la que los adaptadores se ligan a un fragmento antes de la hibridación del fragmento al sustrato. En modalidades alternativas, un adaptador puede añadirse más tarde en el protocolo. El método generalmente comprende obtener un sustrato que contiene al menos dos olígonucleótidos de secuencias diferente unidos a la superficie que están intercalados espacialmente uno con el otro. Tales sustratos se utilizan actualmente en la tecnología de secuenciación Solexa de lllumina y se describen en una variedad de referencias, por ejemplo, la patente Estadounidense No. 7,115,400 y las publicaciones No. US20080160580 y US20080286795, que se incorporan como referencia para tal descripción. Algunas de las modalidades que se exponen a continuación pueden describir el uso del método para aislar fragmentos de un genoma. Estas modalidades pueden adaptarse fácilmente a otros tipos de secuencias, por ejemplo, ADNc o ADN sintético.

En ciertas modalidades, un primer miembro de la primera población de olígonucleótidos unidos a la superficie se híbrida a un oligonucleótido de selección que contiene a) una región que se híbrida con el primer miembro y una región, un sitio cebador de secuenciación y b) una región que contiene una secuencia genómica objetivo. La cantidad de oligonucleótido de selección usada en esta etapa puede optimizarse de manera que un número suficiente de oligonucleótidos de la primera población permanezca sin hibridar con el oligonucleótido de selección y disponible para usarse en la etapa PCR de puente que ocurre más tarde en el protocolo. El primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie se extiende para producir un híbrido que contiene un cebador de selección unido al soporte que contiene una secuencia que es complementaria a la secuencia genómica objetivo. El oligonucleótido de selección se elimina por desnaturalización para dejar extendido el cebador de selección unido al soporte. El cebador de selección unido al soporte extendido se híbrida con el fragmento genómico ligado al adaptador (que puede obtenerse mediante la fragmentación de ADN genómico, químicamente, físicamente o usando una enzima y ligando después los adaptadores a los extremos de los fragmentos resultantes) que contiene la secuencia genómica objetivo, la secuencia que flanquea la secuencia genómica objetivo, y una secuencia adaptadora en el extremo 5' de una o ambas de las cadenas. El cebador de selección unido al soporte se extiende para producir un producto que contiene una secuencia que flanquea la secuencia genómica en el genoma y la secuencia del adaptador del fragmento genómico ligado al adaptador.

En algunas modalidades, el adaptador del fragmento genómico ligado al adaptador puede hibridarse con la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie. Sin embargo, en ciertos casos, antes de la amplificación, la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie puede hibridarse con un oligonucleótido modificador que contiene a) una región que se híbrida con el segundo miembro y una región que contiene la secuencia del adaptador. La cantidad de oligonucleótido modificador usada en esta etapa puede optimizarse de manera que se hibriden un número suficiente de moléculas del producto. El segundo miembro de la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie puede extenderse para producir un híbrido que contiene un cebador adaptador unido al soporte que contiene una secuencia que es complementaria a la secuencia del adaptador. El oligonucleótido modificador se elimina por desnaturalización para dejar el cebador adaptador unido al soporte. El producto puede amplificarse después por PCR de puente.

Como se ilustra en Figura 1b, el producto se amplifica por unos primeros oligonucleótidos unidos a la superficie no extendidos, así como un segundo oligonucleótido unidos a la superficie para producir un producto PCR. En ciertos casos, el fragmento genómico es un fragmento genómico ligado al adaptador que comprende un adaptador en el extremo 5'. En estos casos, los miembros de la segunda población de los oligonucleótidos unidos a la superficie se hibridan con el complemento del adaptador. En modalidades alternativas, un adaptador puede ligarse al producto de extensión, colocando de esta manera un adaptador que se híbrida con la segunda población de los oligonucleótidos unidos a la superficie en el extremo 3' del producto de extensión. En otras modalidades, la amplificación se realiza usando: a) los miembros no extendidos de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie; y b) los cebadores unidos al soporte que se obtienen al: i hibridar los miembros de la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie a un oligonucleótido que comprende una región que se híbrida con los miembros de la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie y una región que es complementaria a un adaptador; y ii extender los miembros de la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir cebadores unidos al soporte que hibridan con el extremo 5' del producto de extensión.

En algunas modalidades, el fragmento genómico es un fragmento genómico ligado al adaptador que comprende un adaptador en el extremo 5', donde la extensión produce un producto de extensión que comprende, en su extremo 3', una secuencia que es complementaría al adaptador, y donde los miembros de la segunda población de los oligonucleótidos unidos a la superficie se hibridan a la secuencia que es complementaria al adaptador durante la PCR de puente. En esta modalidad, el adaptador del extremo 5' comprende un sitio de unión para un cebador de secuenciación en el extremo que se liga al fragmento genómico.

En otras modalidades, el método comprende, entre las etapas e) y f), ligar un adaptador en el extremo 3' del producto de extensión, y donde los miembros de la segunda población de los oligonucleótidos unidos a la superficie se hibridan al adaptador durante la PCR de puente. En estas modalidades, el adaptador comprende un sitio de unión para un cebador de secuenciación en el extremo que se liga al fragmento genómico.

En algunas modalidades, la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie se obtiene al: i. hibridar los miembros de una segunda población inicial de oligonucleótidos unidos a la superficie a un oligonucleótido que comprende una región que se híbrida con los miembros de la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie y una región que es complementaria a una secuencia del fragmento genómico; y ii. extender los miembros de la segunda población inicial de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie.

En algunas modalidades, la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie puede obtenerse al ligar un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria a una secuencia de tal fragmento de ácido nucleico a una segunda población inicial de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir tal segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie. Esta ligación puede facilitarse por un oligonucleótido conector que forma un puente entre los dos oligonucleótidos que se ligan. En otras palabras, un oligonucleótido modificador puede introducirse por un proceso basado en la ligación donde se usa un oligonucleótido de puente para guiar la modificación del oligonucleótido original del soporte sólido para crear el cebador adaptador unido al soporte. Similarmente, el cebador adaptador unido al soporte puede crearse usando un oligonucleótido de puente similar para crear la extensión del cebador necesaria para la modificación del objetivo.

En algunos casos el oligonucleótido de selección comprende un sitio de unión para un cebador de secuenciación entre tal región que se híbrida con tal primer miembro y tal región que contiene tal secuencia genómica.

En algunas modalidades, el método puede comprender además la secuenciación de una primera cadena de los productos PCR para obtener al menos parte de la secuencia nucleotídico de la secuencia que flanquea la secuencia genómica. Este método puede comprender además la secuenciación de la segunda cadena de los productos PCR para obtener al menos parte de la secuencia nucleotídico de la secuencia que flanquea la secuencia genómica.

En modalidades particulares, el método puede comprender fragmentar un genoma de mamífero para producir un genoma fragmentado, opcíonalmente añadir adaptadores al genoma fragmentado, y aplicar el genoma fragmentado al sustrato. La fragmentación se realiza físicamente, químicamente o usando una enzima de restricción. La fragmentación se realiza mediante sonicación o cizallamiento, por ejemplo.

En casos particulares, la hibridación puede realizarse al preparar una pluralidad de genomas fragmentados a partir de una pluralidad de individuos diferentes, mezclar la pluralidad de genomas fragmentados para producir una mezcla, aplicar la mezcla de genomas fragmentados al sustrato, y obtener los productos PCR que comprenden una secuencia que flanquea la secuencia genómica en los diferentes individuos. Estas modalidades pueden comprender además secuenciar al menos la primera cadena de los productos PCR para obtener al menos parte de la secuencia nucleotídico de la secuencia que flanquea la secuencia genómica en los diferentes individuos. En casos particulares, antes de mezclar, se ligan diferentes adaptadores a los genomas fragmentados de los diferentes individuos, donde el adaptador comprende una secuencia de código de barras que permite identificar la fuente del fragmento genómico ligado al adaptador después de secuenciar los productos PCR.

En algunas modalidades, el método comprende: un ADN genómico fragmentado ligado al adaptador a partir de un primer sujeto usando un primer adaptador que comprende una primera secuencia de código de barras para producir un primer producto; un ADN genómico fragmentado ligado al adaptador de un segundo sujeto usando un segundo adaptador que comprende una segunda secuencia de código de barras para producir un segundo producto; combinar los productos primero y segundo para producir un molde mixto; y realizar el método de la reivindicación 1 usando el molde mixto para proporcionar el primer y segundo productos PCR que contienen cada uno la secuencia de código de barras. El molde mixto en algunos casos puede comprender ADN genómico fragmentado a partir de al menos 1,000 sujetos.

En algunas modalidades, el método puede implicar i. ligar los fragmentos genómicos a un adaptador que contiene un sitio para un cebador de secuenciación y una secuencia nucleotídico que es la misma que los segundos oligonucleótidos unidos a la superficie, ii. hibridar los fragmentos genómicos ligados al adaptador a un primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie, iii. extender el primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie al que se híbrida el fragmento ligado al adaptador, y iv. hibridar el extremo del producto de extensión que contiene el adaptador a un segundo polinucleótido unido al soporte, produciendo de esta manera un puente y facilitando la PCR de puente.

Se proporciona además un sistema. En ciertos casos el sistema puede comprender: a) un sustrato que comprende una primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie y una segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie, donde la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos unidos a la superficie no están dirigidos espacialmente sobre el sustrato; b) un oligonucleótido de selección que contiene una región que se híbrida con un primer miembro de la primera población y una región que contiene una secuencia genómica; c) un adaptador; y e) instrucciones para realizar el método de la reivindicación 1. Los productos PCR puede secuenciarse, por ejemplo, usando la plataforma Solexa de lllumina, u otro método de secuenciación en fase sólida, para obtener al menos parte de la secuencia nucleotídico de la secuencia que flanquea las secuencias genómicas objetivos.

En modalidades particulares, el método puede utilizar secuencias de código de barras que permiten identificar la fuente de la secuencia que flanquea la secuencia genómica objetivo. En estas modalidades, el adaptador del fragmento genómico ligado al adaptador puede contener una secuencia de código de barras que permite identificar la fuente del fragmento genómico ligado al adaptador después de secuenciar los productos PCR. En modalidades particulares, este método comprende ADN genómico fragmentado y ligado al adaptador, de un primer sujeto (sujeto que puede incluirse en una mezcla de primeros sujetos) usando un primer adaptador que comprende una primera secuencia de código de barras para producir un primer producto; ADN genómico fragmentado y ligado al adaptador de un segundo sujeto (sujeto que puede incluirse en una mezcla de segundos sujetos) usando un segundo adaptador que comprende una segunda secuencia de código de barras para producir un segundo producto; combinar el primer y segundo productos para producir un molde mixto; y realizar el método descrito anteriormente usando el molde mixto para proporcionar los productos primero y segundo PCR conteniendo cada uno la secuencia del código de barras. En el método anterior, los adaptadores usados tienen una porción con la misma secuencia y que se híbrida con un oligonucleótido unidos a la superficie, y una porción que tiene una secuencia diferente de nucleótidos que contiene la secuencia del código de barras.

Se proporciona un segundo método de amplificación de una secuencia seleccionada. El principio de este método es similar al del método descrito anteriormente, excepto que a) el fragmento genómico que se híbrida con el cebador de selección unido al soporte no está ligado a un adaptador; y b) los adaptadores son después de la extensión del cebador de selección unido al soporte. La ligación del adaptador, el producto puede utilizarse en una reacción PCR de puente, como se discutió anteriormente. Como en la modalidad alternativa descrita anteriormente, la amplificación se realiza usando: a) miembros no extendidos de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie; y b) cebadores unidos al soporte que se obtienen al: i. hibridar los miembros de la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie a un oligonucleótido que comprende una región que se híbrida con los miembros de la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie y una región que es complementaria a la secuencia del adaptador; y ii. extender los miembros de la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir los cebadores unidos al soporte. Como con el método descrito anteriormente, los productos de la PCR puede secuenciarse para obtener al menos parte de la secuencia nucleotídico de la secuencia que flanquea la secuencia genómica.

En una modalidad alternativa, los fragmentos genómicos pueden ligarse a un adaptador que no sólo contiene un sitio de unión para el cebador de secuenciación, sino además una secuencia que es la misma que la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie. Como se muestra, cuando la primera población extendida de oligonucleótidos unidos a la superficie (que usualmente se realiza a altas temperaturas, es decir, al menos 90°C) se híbrida a los fragmentos ligados al adaptador y se extienden, el producto de extensión contiene una secuencia que se híbrida con la segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie (que normalmente se realiza a una temperatura inferior, por ejemplo, menor de 60°C, por ejemplo, menor de 55°C), facilitando de esta manera la amplificación de los fragmentos genómicos usando los primeros y segundos oligonucleótidos unidos a la superficie. Este método se ilustra en Figura 14.

En modalidades particulares, los oligonucleótidos de la primera población están presentes en un exceso molar de al menos 5X, 10X, 20X, 50X, o 100X, 500X, 1.000X, 2000X, 10.000X, 50.000X relativo a la cantidad de oligonucleótido de selección aplicado al sustrato. En una modalidad, el exceso molar puede estar en el intervalo de un exceso molar de 5X a 50,000X, por ejemplo, un exceso molar de 100X a 5,000 X.

En ciertas modalidades, un sustrato puede ponerse en contacto con una pluralidad de oligonucleótidos de selección diferentes, cada uno que comprende una región que se híbrida con miembros de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie (región que tiene la misma secuencia nucleotídico en los diferentes oligonucleótidos de selección) y una región que contiene una secuencia genómica. La secuencia genómica de cada uno de los oligonucleótidos de selección es diferente, permitiendo de esta manera la captura amplificación y secuenciación de varias regiones genómicas sobre el sustrato.

Kits Además en el presente documento se proporcionan los kits para practicar el método en cuestión como se describe anteriormente. En ciertas modalidades, un kit en cuestión puede contener a) un sustrato que comprende una primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie y una segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie, donde la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos unidos a la superficie no están dirigidas espacialmente sobre el sustrato y b) un oligonucleótido de selección que contiene una región que se híbrida con un primer miembro de la primera población y una región que contiene una secuencia genómica. El kit puede contener además otros reactivos descritos anteriormente y a continuación que pueden utilizarse en el método, por ejemplo, adaptadores, ligasa, amortiguadores de hibridación, etcétera.

Además de los componentes mencionados anteriormente, el kit en cuestión típicamente incluye además instrucciones para usar los componentes del kit para practicar el método en cuestión. Las instrucciones para practicar el método en cuestión generalmente se registran en un medio de grabación adecuado. Por ejemplo, las instrucciones se pueden imprimir en un sustrato, tal como papel, plástico, etcétera. Como tal, las instrucciones se pueden presentar en los kits como un prospecto, en el etiquetado del envase del kit o componentes de este (es decir, asociados con el envase o cualquier envase interior) etcétera. En otras modalidades, las instrucciones se presentan como un archivo de almacenamiento de datos electrónicos presente en un medio de almacenamiento adecuado fácil de leer en la computadora, por ejemplo, CD-ROM, disquete, etcétera. Aún en otras modalidades, las instrucciones verdaderas no están presentes en el estuche, sino que se proporcionan los medios para la obtención de las instrucciones de una fuente remota, por ejemplo, a través de Internet. Un ejemplo de esta modalidad es un estuche que incluye una dirección web donde las instrucciones se pueden ver y/o de la cual se pueden descargar las instrucciones. Al igual que con las instrucciones, este medio de obtención de las instrucciones se registra en un sustrato adecuado. Otros componentes necesarios incluirán programas relacionados con informática y/o escrituras de computadoras para implementar la modificación de los programas anteriores ya instalados en un secuenciador.

Adicionalmente a las instrucciones, los kits pueden incluir además una o más mezclas de analitos control, por ejemplo, dos o más analitos control para usarlo al probar el kit.

Con el fin de ilustrar más aun la presente invención, se dan los siguientes ejemplos específicos con el entendimiento de que se ofrecen para ilustrar la presente invención y no deben interpretarse en modo alguno como limitantes de su alcance.

La descripción de la solicitud de patente provisional Estadounidense No. de serie 61/386,390, presentada el 24 de septiembre de 2010, y 61/485,062 presentada el 11 de mayo de 2011, incluyendo todas las figuras, ejemplos, descripciones detalladas y secuencias de oligonucleótidos, se incorporan en la presente en su totalidad.

Ejemplos A continuación se presenta un nuevo enfoque para realizar la secuenciación específica de ADN. El método se basa en modificar un campo de cebadores genéricos (es decir, un campo que contiene al menos dos cebadores que se distribuyen aleatoriamente) sobre un soporte de fase sólida para servir como un dispositivo de captura de ADN objetivo, permitiendo la secuenciación directa del ADN capturado y sin manipulación significativa de la muestra. El método permite la integración perfecta de experimentos de captura y secuenciación de ADN objetivo con una plataforma de fluidos relacionada. Este enfoque usa un campo de cebadores universales sobre un soporte en fase sólida para servir como un sustrato para la captura de ADN mientras mantiene su potencial de secuenciación. El método puede usar ADN natural, no procesado, como molde para la secuenciación. La secuenciación usando este método no depende necesariamente de las instalaciones de laboratorio. Además, se evitan muchos de los sesgos introducidos durante el procesamiento de la muestra y pueden analizarse muestras sustancialmente más pequeñas en un tiempo menor y con un costo reducido con respecto a otros métodos. El método puede usarse para analizar moldes de simple y doble cadena. La capacidad de analizar moldes de ADN de simple cadena puede ser importante para algunas aplicaciones de secuenciación que usan muestras fijadas con formalina y embebidas en parafina provenientes de los archivos de patología. Similarmente, al permitir la secuenciación de un molde de ADN de simple cadena, el método no requiere etapas complicadas de extracción de ácidos nucleicos ni de instrumentación cara para la fragmentación que están diseñadas para preservar la formación de doble cadena del ADN. Más bien, la muestra puede prepararse por lisis y fragmentación por calor, que es barato y eficaz. El ensayo de secuenciación con captura directa no se limita al ADN genómico humano, sino que pueden analizarse otros sustratos de ácidos nucleicos, tales como ADN DNA y ARN bacteriano y viral. Además se pueden capturar y secuenciar transcriptomas, y ARNmi y o codificante. Además de la captura y secuenciación de secuencias de nucleótidos, pueden estudiarse otras propiedades genéticas y epigenéticas, tales como la metilación del ADN, los grandes reordenamientos genómicos, y la expresión génica. El método puede utilizarse además para seleccionar ADN sintético a partir de una población.

Generalmente, la secuenciación se ha considerado como un proceso en el cual la muestra de ADN se modifica estructuralmente para facilitar el análisis en un sistema de secuenciación. El método descrito a continuación modifica el sistema de secuenciación y por lo tanto no hay necesidad de modificar y preparar la muestra de manera extensiva. Por funcionalización puede ensayarse directamente un campo de cebadores genéricos usando una genoteca de oligonucleótidos de ADN sintéticos de los genes objetivos de muestras no procesadas. Para reducir la captura no específica, los componentes específicos de ADN que proporcionan las secuencias que se utilizan en la formación de la estructura de puente se presentan en forma secuencial, y el propio campo de cebadores se modifica. La preparación de la genoteca de secuenciación para todos los tipos de secuenciadores se basa en adicionar secuencias adaptadoras de doble cadena específicas para el molde de ADN. Puesto que los oligonucleótidos capturados sirvieron como adaptadores inmovilizados sobre un soporte sólido, la preparación de la genoteca para el ensayo sólo requirió una adición de un único adaptador. Esto acorta sustancialmente el procesamiento de la muestra y no requiere amplificación clonal ni separación por tamaño basada en electroforesis en gel. En ciertos casos se puede añadir un segundo adaptador al molde capturado sobre un soporte sólido. Ciertas modalidades del método permiten el uso de ADN natural como molde de secuenciación.

Varios métodos actuales para realizar la resecuenciación de alto rendimiento implican la captura del ADN objetivo y la secuenciación como métodos separados. En cierto caso esto puede conducir a múltiples problemas, que incluyen i) gran cantidad de trabajo y manipulaciones del material de ADN que consumen mucho tiempo, ii) errores secundarios a los protocolos experimentales complejos, ¡ii) sesgo creado por el proceso de selección y amplificación molecular y iv) requisitos de grandes cantidades del material de inicio. Se piensa que el método descrito a continuación elimina la fuente de muchos de estos problemas ya que implica poca o ninguna manipulación previa de las muestras y es totalmente automatizable y altamente escalable.

Como prueba de concepto, se secuenciaron todos los exones de 10 genes relacionados con el cáncer en el genoma humano para mostrar que el ensayo es reproducible y puede usarse para capturar y secuenciar regiones específicas del genoma. Esta tecnología de ensayo se demostró con un Analizador de Genoma lllumina pero note que este enfoque es ampliamente aplicable a cualquier secuenciador que use un soporte de fase sólida.

Los métodos descritos a continuación, algunos cuyos principios se ilustran en Figura 1, pueden usarse para capturar de manera efectiva cualquier secuencia de ADN objetivo y permiten la secuenciación directa de los fragmentos genómicos capturados. La muestra de ADN genómico puede prepararse para la secuenciación mediante una simple etapa de fragmentación por calor y el ensayo completo puede automatizarse totalmente y realizarse sobre el soporte sólido. La captura y las reacciones posteriores pueden estar mediadas por un sistema de fluidos.

Una modalidad adicional proporciona un método que permite la preparación de fragmentos de ADN para la secuenciación sobre el soporte sólido mediante el uso de ADN fragmentado como molde y la adición de los adaptadores de secuenciación a los fragmentos de ADN capturados usando un sistema de fluidos. Como prueba de concepto para desarrollar estos enfoques se usó un secuenciador de ADN de última generación de lllumina. Se presentan los resultados de una captura integrada y preparación de la reacción de secuenciación usando la modificación del campo cebador y 366 sitios objetivo en el genoma humano. Con la excepción de la fragmentación por calor durante 25 minutos, todas las etapas pueden realizarse sobre el soporte en fase sólida de la celda de flujo de lllumina.

Los datos descritos a continuación demuestran la robustez del ensayo y la aplicabilidad de un campo cebador universal y un sistema de fluidos como un sustrato de captura. Se han identificado los parámetros únicos de la modificación de los campos de cebadores, lo que permite que el método funcione más robustamente. Además de genomas eucariotas complejos, el método puede aplicarse para capturar genomas microbianos y de otros organismos, ADN y ARN viral, transcriptomas de diferentes fuentes, así como ADN sintético. Además, se está introduciendo y validando el concepto de "programar" un campo cebador nativo inmovilizado sobre un soporte sólido de un sistema de fluidos y ejecutar aplicaciones específicas.

Materiales y Métodos Muestras de ADN genómico. El ADN genómico para NA18507 se obtuvo del Instituto Coriell. Las muestras frescas congeladas de tejido se obtuvieron de un paciente con cáncer colorrectal. El material del paciente se obtuvo con el consentimiento informado del Centro de Cáncer de Stanford y el estudio se aprobó por la junta de revisión institucional (IRB por sus siglas en inglés) de la Universidad de Medicina de Stanford.

Se prepararon secciones de tejido congeladas, se realizó la tinción de hematoxilina-eosina y la composición del tumor de cada muestra se determinó mediante el examen patológico. Las muestras que representan tejidos tumorales y normales se disecaron a partir de áreas donde la composición celular fue del 90% de tumor o puramente normal, respectivamente. El ADN genómico se extrajo usando el kit E.Z.N.A SQ DNA/RNA Protein Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA). Los protocolos estándar para la preparación del ADN, la hibridación en el arreglo y el escaneo se usaron para analizar las muestras usando arreglos 6.0 de SNP (Affymetrix, Santa Clara, CA). El análisis de los datos se realizó usando el programa Genotyping Consolé y el algoritmo V2 Birdseed (Affymetrix). Se analizaron trece conjuntos adicionales de datos de microarreglos conjuntamente con las muestras estudiadas con el fin de evaluar la calidad de las lecturas automáticas de SNP. Los datos del arreglo 6.0 de SNP se filtraron usando un valor umbral de P de 0.01.

Selección de los objetivos y diseño de oligonucleótidos de OS-Sec en silicio. Se usaron construcciones del CCDS con liberación 20090902, la construcción de genoma humano en el NCBI 37 - hg19 y la construcción de la base de datos de SNP con ID 131 como los conjuntos de datos de referencia de polimorfismo. Para la selección de los genes, se usó la base de datos de anotación GeneRanker para seleccionar 344 genes relacionados con el cáncer priorizados por importancia. Con el fin de encontrar secuencias de oligonucleótidos específicos para los objetivos, las definiciones de los exones de los genes candidatos se tomaron de CCDS. Para la mayoría de los exones dirigidos (menos de 500 bp), las secuencias específicas para los objetivos de 40-mer eran 10 bases por fuera del extremo 5' del límite del exón (Figura 3a). Ambas cadenas de los exones fueron dirigidas mediante sondas cebadoras individuales. En el ensayo 366-OS-Sec sólo se cubrieron los flancos de los exones. En el ensayo 11k-OS-Sec, los exones mayores de 500 pb se trataron disponiendo las secuencias específicas para los objetivos hasta cubrir toda la región del exón (Figura 3b). Para mejorar la especificidad sobre el objetivo de 11k-OS-Sec, usamos Repbase para identificar y eliminar secuencias de oligonucleótidos dirigidas a secuencias altamente repetitivas.

Síntesis de oligonucleótidos. Se aplicaron dos estrategias para la síntesis de oligonucleótidos. Para 366-OS-Sec, diseñamos 366 oligonucleótidos de 101-mer (Figura 5a) que después se sintetizaron en columna (Centro de Tecnología del Genoma de Stanford, Stanford, CA) (Figura 4a). Los oligonucleótidos se cuantificaron y se mezclaron en concentración equimolar. Para 11k-OS-Sec, se usó un enfoque de síntesis in-situ en el microarreglos (LC Sciences, Houston) para sintetizar los 11,742 oligonucleótidos precursores (Figura 5b). Las secuencias de oligonucleótidos específicas para los objetivos están en Tabla 2 a continuación. 5 15 Amplificación de oligonucleótidos sintetizados en microarreglos. Se usaron tres submezclas de 25 µ? de oligonucleótidos precursores de 80-mer (587, 638 y 415 nM) (Figura 5b). Se usó una estrategia PCR para amplificar los oligonucleótidos precursores, a concentración baja (Figura 4b). Las submezclas de oligonucleótidos sintetizadas en los arreglos se diluyeron a 10 fM/oligo y se usaron como molde para la amplificación por PCR. La PCR se realizó usando Taq ADN polimerasa (NEB), y dNTP (dATP 1 mM, dCTP 1 mM, cGTP 1 mM, dTTP 500 nM y dUTP 500 nM) en condiciones estándar de la reacción. Después de la desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, se realizaron 20 ciclos de amplificación (95°C, 30 segundos; 55°C, 30 segundos; 68°C, 30 segundos). El Cebador de amplificación 1 contenía uracilo en el extremo 3', mientras que el Cebador de amplificación 2 incorporó secuencias funcionales adicionales (Figura 5b). Los oligonucleótidos amplificados se purificaron para eliminar el exceso de cebador (Fermentas), después se procesaron usando la mezcla de escisión de ADN por Uracilo 0.1 U/µ? (Epicentre, Madison, Wl) en 37°C durante 45 minutos para remover el sitio del cebador universal de amplificación y escindir las cadenas codificantes maduras de 101-mer de los oligonucleótidos. Los oligonucleótidos requieren que extremos 5' sean funcionales y libres con el fin de tener una extensión precisa del sitio específico para el objetivo durante la inmovilización de la sonda cebadora. Después de la inactivación de las enzimas por choque térmico (65°C, 10 minutos), se purificaron las preparaciones de oligonucleótidos (Fermentas). Finalmente, cuantificamos las tres submezclas de oligonucleótidos y creamos una mezcla única con concentración equimolar de cada submezcla.

Preparación de las sondas cebadoras de OS-Sec mediante la modificación del campo cebador en la celda de flujo. En el sistema Analizador de Genoma llx de lllumina (lllumina, San Diego), el soporte en fase sólida (es decir la celda de flujo) tiene dos cebadores ('C y 'D'), los cuales están inmovilizados aleatoriamente sobre una capa de poliacrilamida a una densidad extremadamente alta. Para los experimentos de OS-Sec, un subconjunto de los cebadores 'D' se modificó de manera específica usando la Estación de Grupos de lllumina. Antes de la modificación del cebador de NGS, las mezclas de 133 nM de oligonucleótidos se desnaturalizaron por calor a 95°C por 5 minutos. Usamos el choque térmico (95°C durante 5 minutos) para liberar la cadena codificadora de los oligonucleótidos de OS-Sec. No se requirió de purificación adicional de la cadena ya que la segunda cadena está inactiva en la celda de flujo y se elimina con el lavado después de la hibridación. Los oligonucleótidos desnaturalizados se diluyeron con amortiguador de hibridación 4x (SSC 20x, Tween-20 0.2%). Los oligonucleótidos 100 nM resultantes se usaron en los experimentos de modificación en la celda de flujo. Se dispensaron 30 µ? de la mezcla de oligonucleótidos en cada carril de la celda de flujo. Durante una diferencia de temperatura (de 96°C a 40°C en 18 minutos) los oligonucleótidos se aparearon de manera específica al cebador 'D' inmovilizado. Después, se usó ADN polimerasa para extender el cebador 'D' usando como molde el oligonucleótido apareado. Después de la extensión, el molde original del oligonucleótido se desnaturalizó del cebador 'D' extendido y se lavó del soporte de fase sólida. Para las etapas de extensión, lavado y desnaturalización se usaron reactivos estándares de lllumina v4. La modificación del cebador 'D' causó la inmovilización de las sondas cebadoras.

Preparación de la genoteca de secuenciación . En Figura 2 esbozamos el esquema general de la fragmentación de ADN genómico, la reparación de extremos, la adición de la cola de A, la ligación del adaptador y PCR usados en la preparación de la genoteca de secuenciación de OS-Sec. Usamos 1 g de ADN genómico de NA18507 y una muestra congelada de cáncer colorrectal como material de inicio. El ADN genómico se fragmentó usando Covaris E210R (Covaris, Woburn, MA) para obtener un tamaño medio de los fragmentos de 500 pb (ciclo de trabajo 5%, intensidad 3, 200 ciclos por ráfaga y 80 segundos). Los extremos del ADN fragmentado aleatoriamente se repararon usando 0.25 U del fragmento mayor de Klenow (New England Biolabs, Ipswich, MA), 7.5 U de la ADN polimerasa T4 (NEB), 400 µ? de cada dNTP (NEB), 25 U de la polinucleótido quinasa T4 (NEB) y amortiguador del ADN ligasa T4 con ATP (NEB) en 50 µ? de volumen de reacción a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de la reparación de los extremos, se añadieron adeninas a los extremos 3' del molde de ADN usando 3.2 U de la ADN polimerasa Taq (NEB), 100 µ? de dATP (Invitrogen) y el amortiguador de Taq con 1.5 mM de MgCI2 en 80 ul de reacción a 72°C durante 15 minutos. Antes de la ligación del adaptador, las reacciones se purificaron usando el kit de purificación PCR (Fermentas) .

Se desarrolló un sistema de indización para OS-Sec. Los adaptadores de la genoteca de secuenciación contienen una secuencia de indización opcional de 6 bases, un sitio cebador de secuenciación 1 y una secuencia de 12-mer para la hibridación del cebador 'C (Tabla 2 anterior, Figura 5c). Se diseñaron dieciséis adaptadores de indización. Los oligonucleótidos adaptadores se sintetizaron en el Centro de Tecnología del Genoma de Stanford. Antes de la ligación, los oligonucleótidos adaptadores se aparearon durante la disminución de la temperatura. Para la resecuenciación dirigida de NA18507, usamos un adaptador sencillo así como un adaptador múltiple con la etiqueta 'AACCTG'. Para la indización de las muestras apareadas de tumor y de tejido normal, usamos un código de barras 'TGCTAA' para el tejido normal mientras que la muestra de tumor se etiquetó con 'AGGTCA'. Los adaptadores de doble cadena de ADN con T-voladizo se ligaron a los moldes con cola de A usando 2,000 U de ADN ligasa T4 (NEB) y amortiguador de ADN ligasa T4 a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la ligación del adaptador, las reacciones se purificaron usando un kit de purificación PCR (Fermentas) y las genoteca se amplificaron usando PCR. Se prepararon reacciones de 50 ul de 1 U de la ADN polimerasa Phusion Hot Start (Finnzymes, Finlandia), 1 µ? del cebador para la amplificación de la genoteca (Tabla Suplementaria 1), amortiguador Phusion HF y 200 µ? de cada dNTP (NEB). Las reacciones se desnaturalizaron a 98°C durante 30 segundos. Después de eso, se realizaron 22 ciclos PCR (98°C durante 10 segundos, 65°C durante 30 segundos y 72°C durante 30 segundos), seguido de 72°C durante 7 minutos y 4°C. Después de ello, las reacciones PCR se purificaron usando el kit de purificación PCR (Fermentas) y se cuantificaron . Las genoteca múltiples se mezclaron en concentraciones iguales.

Captura de objetivos usando sondas cebadoras. Los objetivos se capturaron sobre la celda de flujo usando las sondas cebadoras de OS-Sec (Figura 1b y secuencias de oligonucleótidos a continuación). Inyectamos 30 ul de las genoteca de secuenciación genómica (30 - 42 ng/ul) en la celda de flujo. El ADN objetivo se hibridó con las sondas cebadoras al incubar las genoteca de secuenciación en la celda de flujo a 65°C durante 20 horas. Durante la hibridación de la genoteca de ADN genómico y la subsecuente extensión, la celda de flujo se mantuvo a temperatura constante de 65°C. Se usó una Estación de Grupos de lllumína para llevar a cabo las etapas de hibridación de las sondas cebadoras y de extensión. Antes de la hibridación a las sondas cebadoras, se desnaturalizaron 22.5 µ? de las genoteca de secuenciación (40 - 56.6 ng /µ?) a 95°C durante 5 minutos. Después del choque térmico, las genoteca de ADN genómico se diluyeron a un volumen total de 30 µ? usando el amortiguador de hibridación 4x. Las concentraciones finales de ADN de las genoteca de secuenciación variaron de 30 a 41.7 ng/µ?. Debido a la alta concentración de las genoteca de secuenciación, el volumen de hibridación se mantuvo al mínimo. Por lo tanto, se desarrolló un programa Estación de Grupos personalizado para permitir una hibridación reproducible en poco volumen. Las siguientes etapas de extensión, lavado y desnaturalización se realizaron usando los reactivos de lllumina v4.

Procesamiento y secuenciación en la celda de flujo. Después de la captura de los objetivos, la temperatura de la celda de flujo se redujo a 40°C durante 30 minutos para permitir que las 12 bases en el extremo 3' de los fragmentos capturados de la genoteca de ADN genómico hibridaran con el cebador 'C (Figura 1b y secuencias de oligonucleótidos a continuación). En la formación de puentes, el fragmento de la genoteca y el cebador 'C se extendieron usando ADN polimerasa para finalizar y replicar el fragmento de ADN capturado. Después, se llevó a cabo PCR de puente para generar los grupos de secuenciación amplificados clonalmente. Las muestras se secuenciaron usando ciclos de secuenciación de extremos apareados de 40 por 40 (366-OS-Sec) o 60 por 60 (11 k-OS-Sec) en un Analizador de Genoma llx de lllumina usando los reactivos e instrucciones de secuenciación regulares versión 4 (lllumina). El análisis de imágenes y la lectura automática de nucleótidos se realizaron con los programas de computación SCS 2.8 y RTA 2.8 (Ilumina).

Análisis de secuencias y detección de variantes. Las lecturas de las secuencias se alinearon al genoma humano versión del genoma humano construcción NCBI 37 - hg19 usando el Alineador Burrows-Wheeler (BWA) 9. Después de la alineación, se definió que las lecturas sobre los objetivos (Lectura 1) serían las que estaban dentro de 1 kb del extremo 5' de la sonda cebadora. Las lecturas fuera del objetivo se definieron como las alineadas fuera de 1 kb del extremo 5' de la sonda cebadora o mapeadas en un cromosoma diferente de la ubicación de la sonda cebadora asociada. Para la de-multiplexación de los carriles indexados, se usó una escritura en perl para generar un índice de las etiquetas de 7 bases usando los archivos de lectura automática de nucleótidos. Este archivo de índice y otra escritura en perl se usaron para de-multiplexar tanto el archivo combinado de la lectura automática de nucleótidos (de forma que puedan generarse los archivos separados de fastq para un procesamiento posterior) como el archivo alineado.

Para eliminar cualquiera de las secuencias de las sondas cebadoras sintéticas para la lectura de variantes, se aplicó un filtrado por el tamaño del inserto de los pares correspondientes. El tamaño del inserto se determinó mediante la comparación de la alineación de las lecturas de las secuencias apareadas. Para la lectura automática de variantes, las secuencias extraídas requerían tener un tamaño del inserto superior a [40 + la longitud de la Lectura 1]. Después del filtrado por tamaño del inserto, la lectura automática de las variantes se realizó usando SAMtools y BCFtools. Se realizó un apilamiento de secuencias contra el genoma humano (hg19) usando mpileup de SAMtools con un umbral de calidad del mapeo de 50. Se usó la vista BCFtools para genotipo las posiciones de las bases y los datos se filtraron usando vcfutils.pl, una variante de filtro escrito en perl proporcionada en el paquete SAMtools. Las condiciones de varFilter vcfutils fueron: i) cobertura de 10 o mayor, ii) remoción del filtro de cadena sesgada (ya que la OS-Sec es un método de captura específico de cadenas), iii) forzar a la escritura a sacar tanto las posiciones de referencia como las que no sean de referencia. Las lecturas automáticas de las referencias y de las que no son referencias se usaron para las comparaciones con los datos del arreglo Affymetrix SNP 6.0. Las posiciones genotipo se filtraron para tener un valor de calidad similar al de Phred por encima de 50. Usamos BEDtools intersectBed para definir las regiones objetivo para cada sonda cebadora y las combinaciones donde las sondas se superponen en sus objetivos.

Comparación de variantes. Para la evaluación de la calidad de las variantes extraídas, las lecturas automáticas de las variantes de los datos de NA18507 se compararon con las lecturas automáticas de las variantes identificadas a partir de un análisis completo de la secuencia genómica3 y de datos de genotipo Hapmap (www.hapmap.org). Las comparaciones de los datos de OS-Sec y los datos del arreglo Affymetrix SNP 6.0 se realizaron mediante escrituras en perl. dbSNP131 se usó para la anotación de SNP.

Otras secuencias de oligonucleótidos 0) Oligonucleótidos; Oligonucleótidos de OS-Sec: 5' NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGAT CGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCGATCTCGTATGC CGTCTTCTGCTTG - 3' (oligonucleótido genérico de captura, N = secuencia única de 40-mer; SEC ID No.: 37).

Ad_top_FC_captura_cola_A: 5' CGAG ATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - 3' (SEC ID No.: 38).

Ad_bot_FC_captura_cola_A: 5" GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG - 3' (SEC ID No.: 39).

Cebador 'C de la celda de flujo: 5' - PS- TTTTTTTTTTAATGATACGGCGACCACCGAG AUCTACAC - 3' (U = 2-deoxiuridina) (SEC ID No.: 40).

Cebador 'D' de la celda de flujo: 5' - PS-TTTTTTTTTTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGoxoAT - 3', (Goxo = 8-oxoguanina) (SEC ID No.: 41).

Cebador de secuenciación 1: 5' - ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - 3' (SEC ID No.:42).

Cebador de secuenciación 2: 5' - CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT -3' (SEC ID No.:43). 1) Modificación de la celda de flujo Apareamiento: 3' GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAG AGCCGTAAGGACGACT TGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNN - 5' (oligonucleótido de OS-Sec) (SEC ID No.: 44).

FC - CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT - 3' (cebador 'D' de la celda de flujo) (SEC ID No.:45).

Extensión: 3' GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAG AGCCGTAAGGACGACT TGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNN - 5' (oligonucleótido de OS-Sec) (SEC ID No.:46).

FC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNN - 3" (sonda cebadora) (SEC ID No.:47).

Desnaturalización: FC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNN - 3' (sonda cebadora) (SEC ID No.:48). 2) Prep de la genoteca Fragmentación, reparación de extremos: 5" - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3' (ADN genómico). 3' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 5' (ADN genómico). Cola de A: 5' - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNA - 3' (ADN genómico después de la cola de A). 3' - ANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 5' (ADN genómico después de la cola de A).

Ligación del adaptador: Adaptador bicatenario de OS-Sec: 5' GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCG - 3' (Ad_bot_FC_captura_cola_A) (SEC ID No.:49). 3' TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC - 5' (Ad_top_FC_captura_cola_A) (SEC ID No.:50). genoteca de Ad bicatenario de OS-Sec (Esta es la estructura de la genoteca de OS-Sec con adaptador, N = secuencia aleatoria de ADN genómico definida por la fragmentación). 5' CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAA AGAGTGTAGATCTCG - 3' (SEC ID No.:51). 3' GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGANNN NNNNNNNNNNNNNNNNN N NTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTT TCTCACATCTAGAGC - 5' (SEC ID No.:52).

PCR de la genoteca: Amplificación de la genoteca del adaptador de OS-Sec (Ad_top_FC_captura_cola_A, se usa un cebador único PCR para amplificar la genoteca del adaptador). 5' CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - 3' (Ad_top_FC_captura_cola_A) (SEC ID No.:53). 3' GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGANNN NNNNNNNNNNNNNN N NN NNTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTT TCTCACATCTAGAGC - 5' (fragmento de la genoteca de OS-Sec) (SEC ID No.:54). 5' CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN NNN NN NNN NNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAA AGAGTGTAGATCTCG - 3' (fragmento de la genoteca de OS-Sec) (SEC ID No.:55). 3' TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTAGAGC - 5' (Ad_top_FC_captura_cola_A) (SEC ID No.:56). 5' CGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAA AGAGTGTAGATCTCG - 3' (fragmento de la genoteca de OS-Sec, amplificado) (SEC ID No.:57). 3' GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGANNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTT TCTCACATCTAGAGC - 5' (fragmento de la genoteca de OS-Sec, amplificado) (SEC ID No.:58). 3) Captura Apareamiento: Apareamiento de la genoteca del adaptador de OS-Sec (N = sitio específico de captura de 40 mer). 3' GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAG Ageno micdna (SEC ID No.:59).

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN adngenómicoTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTA GAGC - 5' (fragmento de genoteca de OS-Sec, amplificado) (SEC ID No.:60).

FC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNN NNN NNNNN NNNNNN NNNNNNNNNNNN - 3' (sonda cebadora) (SEC ID No.:61).

Extensión: Captura en OS-Sec: 3" GCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAadng enómico (SEC ID No.:62).

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN adngenómicoTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACATCTA GAGC - 5' (fragmento de genoteca de OS-Sec, amplificado) (SEC ID No.:63).

FC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN N N N N N N NNN NN NadngenómicoAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGG GAAAGAGTGTAGATCTCG - 3" (ADN capturado) (SEC ID No.:64).

Desnaturalización: Genoteca de OS-Sec: FC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNadngenómicoAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGG GAAAGAGTGTAGATCTCG - 3' (ADN capturado) (SEC ID No.:65). 4) Finalización del adaptador Hibridación en 40C: genoteca_OS-Sec (hay 12-mer de homología entre el adaptador de OS-Sec y el Oligo-C); FC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNadngenómicoAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGG GAAAGAGTGTAGATCTCG - 3" (ADN capturado) (SEC ID No.:66). 3' - CACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA - FC (Oligo'C) (SEC ID No.:67).

Extensión: FC CAAGCAGAAGACG.GCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNN N NN NadngenómicoAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGG GAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT - 3' (ADN finalizado) (SEC ID No.:68). 3' GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACT TGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNN N NadngenómicoTCTAGCCTTCTCGCAGC ACATCCC TTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA - FC (ADN finalizado) (SEC ID No.:69).

Desnaturalización: FC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNadngenómicoAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGG GAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT - 3" (ADN finalizado) (SEC ID No.:70). 3' GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAG AGCCGTAAGGACGACT TGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN N NN N N N NN N NN NadngenómicoTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCC TTTCTCACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA - FC (ADN finalizado) (SEC ID No.:71). 5) Generación de grupos Apareamiento: FC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNN N NNNadngenómicoAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGG GAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT - 3' (ADN finalizado) (SEC ID No.:72). 3' - CACATCTAGAGCCACCAGCGGCATAGTAA - FC (Oligo'C) (SEC ID No.:73).

FC - CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT - 3' (SEC ID No.:74).

(Oligo'D'): 3' GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACT TGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNN N NN NadngenómicoTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCC TTTCTCACATCTAG AGCCACCAGCGGCATAGTAA - FC (ADN finalizado) (SEC ID No.:75).

Extensión: FC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTG A ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNN N NN NadngenómicoAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGG GAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT - 3' (ADN finalizado) (SEC ID No.:76). 3' GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACT TGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNadngenómicoTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCC TTTCTCACATCTAG AGCCACCAGCGGCATAGTAA - FC (ADN finalizado) (SEC ID No.:77).

Desnaturalización: FC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNadngenómicoAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGG GAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT - 3' (ADN agrupado) (SEC ID No.:78). 3' GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACT TGGCGAGAAGGCTAGANN NNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNN N NN NadngenómicoTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCC TTTCTCACATCTAG AGCCACCAGCGGCATAGTAA - FC (ADN agrupado) (SEC ID No.:79). 6) Secuenciación FC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNN N NN NadngenómicoAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGG GAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT - 3' (ADN agrupado) (SEC ID No.:80). 3· . < TCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCCTTTCTCACA - 5' (Cebador de secuenciación 1) (SEC ID No.:81). 5' - CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - > (Cebador de secuenciación 2) (SEC ID No.:82). 3' GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTAGCCAGAGCCGTAAGGACGACT TGGCGAGAAGGCTAGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNadngenómicoTCTAGCCTTCTCGCAGCACATCCC TTTCTCACATCTAG AGCCACCAGCGGCATAGTAA - FC (ADN agrupado) (SEC ID No.:83).

Resultados Esta sección describe un nuevo enfoque para la resecuenciación dirigida denominada Secuenciación Selectiva de Oligonucleótidos (OS-Sec) que soluciona muchas de las limitaciones observadas en los enfoques de resecuenciación dirigida. Conceptualmente diferente de otros métodos, la OS-Sec es un enfoque integrado en el cual se llevan a cabo tanto la captura como la secuenciación de objetivos genómicas sobre el soporte de fase sólida de NGS, tal como la celda de flujo de lllumina (Figura 1a). Para la preparación de OS-Sec, se prepara una genoteca de secuenciación de un adaptador único a partir de ADN genómico y se sintetizan oligonucleótidos específicos para los objetivos que se usan para construir sondas cebadoras sobre la celda de flujo. Después, las sondas cebadoras inmovilizadas sobre la celda de flujo se usan para capturar objetivos moleculares únicas de una genoteca de ADN genómico de un adaptador único.

El procesamiento de OS-Sec implica tres etapas donde se modifica el sistema de secuenciación de lllumina para contener sondas cebadoras específica para el objetivo, los objetivos se capturan a partir de una genoteca de un adaptador único y se le da fin a los fragmentos inmovilizados para la secuenciación (Figura 1b), Para preparar el sustrato de captura, volvimos a re-diseñar molecularmente la celda de flujo de lllumina modificando un subconjunto del campo cebador existente para convertirlo en sondas cebadoras específicas para los objetivos. Para crear estas sondas cebadoras, hibridamos la secuencia universal del 3' de una mezcla compleja de oligonucleótidos a su complemento sobre la celda de flujo y extendimos el cebador inmovilizado usando una reacción de extensión con ADN polimerasa. El resultado es un conjunto de sondas cebadoras específicas para los objetivos, colocados aleatoriamente, que están fijadas a la superficie de la celda de flujo. Durante la incubación a una temperatura alta de 65°C, las sondas cebadoras hibridan específicamente con las secuencias objetivo complementarias dentro de la genoteca de ADN genómico de un adaptador único; luego de la hibridación, las sondas cebadoras funcionan después como cebadores para otra reacción de extensión de la ADN polimerasa. La etapa de extensión captura eficazmente la secuencia objetivo. Después de la extensión, se lleva a cabo una etapa de desnaturalización seguida de una hibridación a temperatura baja de 40°C para estabilizar el adaptador de la genoteca de secuenciación a su complemento en la celda de flujo, lo que crea una estructura de puente. Una tercera reacción de extensión de ADN polimerasa incorpora la secuencia adicional a los extremos 3', creando dos moléculas aptas para la amplificación en fase sólida. Después de las tres etapas específicas para OS-Sec, las moléculas capturadas se amplifican, se procesan y se secuencian en el puente, usando el protocolo de secuenciación estándar del sistema de NGS de lllumina. Anteriormente se dio una descripción detallada de las etapas de biología molecular en OS-Sec y en consecuencia se modifican los programas de la Estación de Grupos de lllumina para OS-Sec.

Como demostración de prueba de principio, se desarrollaron dos ensayos de captura. En primer lugar, se diseñaron 366 sondas cebadoras para OS-Sec de manera que flanqueen los exones de 10 genes relacionados con cáncer (366-OS-Sec) (Figura 3). Con este ensayo se pretendió poner a prueba el método de OS-Sec y no la cobertura definitiva de exones. Sintetizamos 366-OS-Sec oligonucleótidos usando métodos basados en columnas. En segundo lugar, para demostrar la escalabilidad , diseñamos y sintetizamos 11,742 sondas cebadoras para capturar los exones de 344 genes relacionados con cáncer (11 k-OS-Sec). En estas sondas cebadoras se evitaron las repeticiones y se dispusieron a lo largo de los exones de gran tamaño para mejorar la cobertura de los exones. Para la producción de alto rendimiento de 11k-OS-Sec, sintetizamos los oligonucleótidos en un microarreglos programable. Estos oligonucleótidos sintetizados en arreglos requieren de amplificación para el procesamiento y la obtención de suficiente material para OS-Sec (Figura 4). Después de procesados, los oligonucleótidos de OS-Sec contienen 40-mer específicos para el objetivo complementarios al extremo 5' de la región objetivo (Figura 5). Estos oligonucleótidos contienen además una secuencia necesaria para aparear el cebador de secuenciación de extremos apareados y para la hibridación con el campo cebador inmovilizado sobre la celda de flujo.

Para evaluar el rendimiento de captura de los ensayos 366-OS-Sec y 11k-OS-Sec, se preparó el ADN previamente secuenciado de un individuo Yoruba (NA18507). La secuenciación de extremos apareados se llevó a cabo en todos los ensayos dirigidos. La primera lectura de la secuencia nucleotídico (Lectura 1) se deriva a partir del ADN genómico objetivo mientras que la segunda lectura (Lectura 2) proviene de las sondas cebadoras sintéticas específicas para los objetivos (Fig. 1a). 366-OS-Sec se corrió sobre un carril único de una corrida GAIIx. Cada muestra de 11k-OS-Sec se corrió sobre el equivalente de 1.3 carriles, sobre la base de nuestro esquema de indización. Desarrollamos un esquema de indización usando adaptadores con una secuencia única de código de barras (Fig. 5c) para etiquetar las muestras. Los códigos de barras se derivaron a partir de las primeras siete bases de Lectura 1. En general, el 87.6% de las lecturas de 366-OS-Sec y el 91.3% de las lecturas de 11k-OS-Sec, que contienen los códigos de barras adecuados, se mapearon con la referencia del genoma humano (Tabla 1). En comparación, el 58% de las lecturas derivadas usando un método de selección de híbridos reportado previamente pudo mapearse con la referencia del genoma humano.

Tabla 1 M uestra NA18507 NA18507 Normal Tumor Número de sondas cebadoras 366 11 ,742 11 ,742 11 ,742 Lecturas totales 1 ,969,091 1 ,602,825 2,038,270 1 ,551 ,279 Lecturas mapeadas 1 ,725,215 1 ,463,782 1 ,897,967 1,415,388 (porcentaje de lecturas totales) (87.6%) (91.3%) (93.1%) (91.2%) Lecturas capturadas sobre el 1 ,499,052 1 ,365,305 1,747,192 1 ,316,563 objetivo3 (86.9%) (93.3%) (92.1%) (93.0%) (porcentaje de lecturas mapeadas) Lecturas capturadas sobre el exón 518,318 624,937 725,072 608,458 objetivo" (30.0%) (42.7%) (38.2%) (43.0%) (Porcentaje de lecturas mapeadas) Lecturas capturadas fuera del 226,163 98,477 150,775 98,825 objetivo (13.1%) (6.7%) (7.9%) (7.0%) (Porcentaje de lecturas mapeadas) Muestra NA18507 NA18507 Normal Tumor Número de sondas cebadoras 366 11,742 11,742 11,742 233 kb 7,296 kb 7,296 kb 7,296 kb Región sobre el objetivo3 Región capturada sobre el objetivo usada para la lectura 191 kb 1,541 kb 1,754 kb 1 ,476 kb automática de SNV a' c (82.0%) (21.1%) (24.0%) (20.2%) (porcentaje de regiones sobre el SNVs de OS-Sec leídos a partir de la región capturada sobre el 105 985 871 727 SNP de OS-Sec que se reportan 97%d 95.7%d - - SNP de OS-Sec que concuerdan - - 99.8%e 99.5%e con el genotipo del arreglo Muestra NA18507 NA18507 Normal Tumor Número de sondas cebadoras 366 11 ,742 11 ,742 11 ,742 Regiones de exones*3 31 kb 959 kb 959 kb 959 kb Regiones de exones capturadas13' f 26 kb 917 kb 901 kb 909 kb (Porcentaje de las regiones de (83.9%) (95.6%) (94.0%) (94.8%) exones) Cobertura promedio de veces 729 31 38 31 sobre los exones capturados*3' f aDentro de 1 kb a partir de las sondas cebadoras. bDentro de los exones. cTamaño del inserto filtrado=40 + longitud de Lectura 1. Cobertura en veces =10. Valor de calidad similar al de Phred >50. dBases variantes combinadas a partir de Bentley y colaboradores (2008) y dbSNP131. ePosiciones genotípicas usando arreglos Affymetrix SNP 6.0. 'Cobertura de veces=1.

Para evaluar la cobertura global de cada sonda cebadora, determinamos el número de lecturas provenientes de los datos de la Lectura 1 que cayeron dentro de 1 kb a partir del extremo 3' de la sonda cebadora. Las sondas cebadoras de OS-Sec son específicas de cadena y solamente capturan los extremos 5' de los objetivos de ADN (Figura 6). Como ejemplo, el perfil de cobertura media de todas las sondas cebadoras en 366-OS-Sec (Figura 1a) ilustra cómo se captura la secuencia hasta 1 kb corriente abajo a partir de la sonda cebadora. Generalmente, se detectó un sesgo hacia tamaños más pequeños del inserto, pues el 50% de las lecturas dirigidas de 366-OS-Sec mapearon dentro de 283 bases a partir de las sondas cebadoras. En ambos ensayos, se identificaron lecturas adicionales más allá del intervalo de 1 kb y tan distantes como 1.7 kb. Las lecturas de secuencias más allá de 1 kb representan el extremo de la cola de la distribución de la captura de cualquier sonda cebadora dada y fue menos de 0.15% de los datos globales de secuencias para ambos 366-OS-Sec y 11k-OS-Sec. Se observó además que las características de la distribución de la cobertura se correlacionan con el tamaño del fragmento introducido durante la creación de la genoteca y de las limitaciones de tamaño inherentes a la formación de puentes y de PCR en fase sólida (Figura 6). Además, la introducción de una concentración molar mayor de la genoteca de adaptador único, la secuenciación de carriles adicionales o el uso de lecturas más largas puede aumentar la cobertura a lo largo del objetivo.

Las lecturas sobre el objetivo se definieron como las secuencias de la Lectura 1 que mapean dentro de 1 kb de una sonda cebadora. Usando estos criterios de cobertura sobre el objetivo, el 86.9% de 40 lecturas de bases en 366-OS-Sec y el 93.3% de 53 lecturas de bases en 11k-OS-Sec estuvieron sobre el objetivo (Tabla 1). 11k-OS-Sec mostró una mejor especificidad dados los esfuerzos para refinar el diseño en silicio de las sondas cebadoras. Específicamente, para la selección de las sondas cebadoras en silicio de 11K-OS-Sec, se usó un filtro de enmascaramiento de repeticiones, lo que resultó en menos lecturas fuera del objetivo. En comparación, el 89% de 76 lecturas de bases y el 50% de 36 lecturas de bases mapearon en la proximidad de una sonda en un método publicado de selección de híbridos, lo que sugiere una especificidad sobre el objetivo, similar entre los métodos, y la inclinación al hecho de que avanzar hacia lecturas más largas puede mejorar la especificidad sobre el objetivo de OS-Sec. La especificidad sobre exones de OS-Sec también fue similar al método publicado de selección de híbridos. Usando 11K-OS-Sec, observamos que el 42.7% de las lecturas mapearon dentro de los exones (Tabla 1), mientras que una tecnología de selección de captura de híbridos reportó un 42% de lecturas mapeadas a los exones.

Como ejemplo de un perfil típico de cobertura génica, mostramos los datos de secuencias capturadas para el gen KRAS en Figura 1c. Los objetivos de los exones se secuencian a una alta cobertura de veces con relación a las regiones adyacentes fuera del objetivo. Como se ha señalado anteriormente, se diseñó 366-OS-Sec para flanquear los exones y no dispuestos a través de grandes regiones. La cobertura de veces promedio para los exones en Tabla 1, y los desgloses detallados de las clases de cobertura (es decir, 10X, 20X) en Tabla 2. En general, se cubrió el 83.9% de las bases de los exones en 366-OS-Sec con al menos una lectura, con una porción del resto sin haber sido intencionalmente dirigidas en este ensayo piloto. Similarmente, entre las tres muestras analizadas con 11k-OS-Sec, se cubrió del 94 al 95.6% de las bases de los exones con al menos una lectura. En comparación con 366-OS-Sec, el ensayo de 11k-OS-Sec mostró un aumento en la cobertura de las secuencias sobre los exones debido a una mejoría en el diseño de las sondas cebadoras sobre el diseño de 366-OS-Sec, específicamente, el diseño de 11k-OS-Sec dispuso las sondas cebadoras a lo largo de los exones mayores de 500 bases.

Se evaluó además la uniformidad de la selección del objetivo en el ensayo agrupando los datos de Lectura 1 por su sonda cebadora correspondiente y contando las lecturas que alinean con sus objetivos. En Figura 1d las sondas cebadoras de OS-Sec se ordenaron sobre la base de los rendimientos de captura observados y las distribuciones dentro de 366-OS-Sec y 11k-OS-Sec se presentan de manera superpuesta. En 366-OS-Sec, se observó que el 100% de las sondas cebadoras tuvieron un rendimiento mínimo de una lectura de secuencia y el rendimiento de 89.6% de las sondas cebadoras estaban dentro de un intervalo de 10 veces. Similarmente, para 11k-OS-Sec, el 95.7% de las sondas cebadoras tuvieron un rendimiento de captura mínimo de una lectura de secuencia y el 54% de las sondas cebadoras tuvieron un rendimiento dentro de un intervalo de 10 veces. Los oligonucleótidos de 366-OS-Sec se sintetizaron en columnas y se cuantificaron por separado antes de mezclarlos, lo que garantizó que cada secuencia específica para su objetivo estuviera en una concentración equimolar en la etapa de construcción de la sonda cebadora. La mayor variación en los rendimientos de las sondas cebadoras para 11k-OS-Sec se atribuye más probablemente al sesgo por la amplificación introducido durante la POR de los oligonucleótidos sintetizados en los microarreglos usados para la creación de las sondas cebadoras.

La reproducibilidad técnica de OS-Sec se evaluó mediante la comparación de los rendimientos de las secuencias de las sondas cebadoras individuales en el ensayo 11K-OS-Sec (Figura 7). Las genoteca multiplexadas (NA18507, normal y tumoral) se mezclaron y la captura y secuenciación se realizaron en dos carriles independientes de lllumina GAIIx. Los rendimientos de secuencias de cada sonda cebadora individual se compararon entre las réplicas técnicas y se calculó el coeficiente de correlación: R2 = 0.986. Para la evaluación de la reproducibilidad biológica, dos genoteca de secuenciación multiplexadas y diferentes se corrieron en el mismo carril. El coeficiente de correlación de las réplicas biológicas fue de R2 = 0.90. Es probable que la alta reproducibilidad de OS-Sec se relacione con la automatización inherente al usar el sistema de NGS, la capacidad para realizar las etapas de captura y secuenciación en un volumen único de reacción y no tener que aplicar PCR después de la captura.

Para evaluar el desempeño de la lectura de las variantes en los ensayos 366-OS-Sec y 11k-OS-Sec, se realizó un análisis de las secuencias específicas en NA18507, un individuo Yoruba que se había sometido a un análisis completo de secuenciación del genoma. Para la lectura automática de SNV con cualquiera de los ensayos de OS-Sec, sólo analizamos las posiciones sobre el objetivo con puntuaciones de calidad del genotipo mayor que 50 y un mínimo de cobertura de 10X (Tabla 1). Para los datos de 366-OS-Sec y 11k-OS-Sec, un total de 191 kb y 1,541 kb cumplieron estos criterios, respectivamente. A partir de estas posiciones objetivo de alta calidad, leímos 105 SNV de 336-OS-Sec y 985 SNV de 11k-OS-Sec (Tabla 1). Extrajimos los SNV publicados de NA18507 y colaboradores SNP reportados que tienen lugar en estas mismas regiones de alta calidad. En comparación, el 97% del 366-OS-Sec y el 95.7% del 11k-OS-Sec se habían reportado anteriormente (Tabla 1). Para 366-OS-Sec y 11k-OS-Sec la sensibilidad de la detección de las variantes fue de 0.97 y 0.95 respectivamente, sobre la base de los SNP reportados (Tabla 3). Tabla 3 El análisis de 11k-OS-Sec se aplicó además al ADN genómico derivado de un par correspondiente de tejido normal y de tumor de carcinoma colorrectal. Usando los mismos criterios de calidad y cobertura para el análisis de NA18507, se identificaron 871 SNV identificados a partir de la muestra normal y 727 a partir del tumor (Tabla 4). Para la comparación, las dos muestras se genotiparon con el arreglo Affymetrix SNP 6.0. De acuerdo con los análisis previos, la precisión del genotipo es alta usando arreglos Affymetrix SNP 6.0 y el algoritmo Birdseed, ya que la tasa media de éxito de las lecturas automáticas de SNP es de 99.47% y los SNP leídos tienen un 99.74% de concordancia con los genotipos HapMap a partir de otras plataformas. Al comparar los SNV de OS-Sec con los SNP de Affymetrix, se observó una alta concordancia de 99.8% para el tejido normal y de 99.5% para el tumor. Al filtrar las variantes del tejido normal y considerando nuevas variantes específicas del cáncer, donde la cobertura era mayor que 40, se identificó y validó una clara mutación patógena sin sentido de SMAD4 (S144*). Frecuentemente este gen está mutado en el cáncer colorrectal y un gen de cáncer de colon conductor.

Tabla 4 Se investigó la eficacia de la captura de las sondas cebadoras individuales dentro de los ensayos 366-OS-Sec y 11 k-OS-Sec, y se evaluó el rendimiento de cada sonda cebadora. Una característica única de OS-Sec es que las secuencias genómicas capturadas pueden acoplarse a sus sondas cebadoras correspondientes cuando se secuencian con extremos apareados. La Lectura 1 se origina a partir del extremo 3' del objetivo capturada y la Lectura 2 comienza en la secuencia sintética de la sonda cebadora de OS-Sec. Así, la Lectura 1 siempre representa la secuencia de ADN genómico capturada mientras que la Lectura 2 sirve funcionalmente como un código de barras molecular para una sonda cebadora definida. Esto permite la identificación de la sonda cebadora exacta de OS-Sec, que medió en la direccionalidad, y facilita la evaluación del desempeño de las sondas cebadoras individuales. Por ejemplo, observamos una fuerte relación entre el contenido de GC de la sonda cebadora y el rendimiento de secuencias objetivo (datos no mostrados). Un contenido de GC extremadamente bajo (menor del 20%) o alto (>70%) se asoció con fallos crecientes de una sonda cebadora para capturar su secuencia objetivo (Figura 8). Se cree que la capacidad de evaluar directamente el desempeño de la captura será una medida útil de control de calidad para las sondas cebadoras.

La tecnología de OS-Sec se desarrolló para la resecuenciación dirigida altamente escalable y eficiente. En una desviación de los métodos de captura tradicionales de enriquecimiento de objetivos antes de la secuenciación, la OS-Sec integra la captura y la secuenciación del ADN objetivo mediante la hibridación y selección en el soporte de fase sólida de un sistema de NGS. Este estudio de prueba de principio muestra que el ensayo de OS-Sec captura las regiones genómicas objetivos de manera eficaz y reproducible, con buena uniformidad y alta especificidad. El análisis de las variantes del genoma de referencia NA18507 demostró alta especificidad y baja tasa de hallazgos falsos para la determinación de SNV. La resecuenciación dirigida de muestras correspondientes de tejido normal y tumor colorrectal demostró la aplicabilidad de OS-Sec al análisis genético de alto flujo de genomas de cáncer.

La tecnología de OS-Sec permite crear ensayos personalizados de resecuenciación dirigida. El diseño y la producción de los oligonucleótidos de las sondas cebadoras son relativamente sencillos y las regiones objetivo pueden seleccionarse simplemente usando secuencias no repetitivas y equilibradas en el contenido de GC. Pueden usarse recursos de síntesis de microarreglos programables para generar genoteca de oligonucleótidos complejas y personalizadas en masa. Del mismo modo, pueden usarse métodos tradicionales de síntesis de oligonucleótidos para crear ensayos personalizados para conjuntos más pequeños de genes objetivos. Aunque nuestro mayor ensayo dirigido cubrió los exones y las secuencias adyacentes de 344 genes, creemos que OS-Sec puede escalar significativamente a mayores contenidos de objetivos. A partir de los datos de 366-OS-Sec estimamos que había un exceso de sondas cebadoras de más de 2,000 veces en comparación con los fragmentos objetivo en la mezcla de hibridación dentro de la celda de flujo. Durante la hibridación por 20 horas, estimamos que se capturó el 4.9% de todas los objetivos posibles dentro de la genoteca para la secuenciación. Probamos además que la concentración de oligonucleótidos se puede aumentar al menos 10-veces y la concentración de la genoteca de secuenciación puede aumentarse en 5 veces (datos no mostrados) sin comprometer la formación de grupos.

La preparación de la muestra para OS-Sec es sencilla: puede completarse en un día y se automatiza fácilmente (Figura 9). En cuanto al trabajo, el uso de OS-Sec se compara favorablemente con la ejecución de un experimento de secuenciación aleatoria. Debido a que los adaptadores residuales no se hibridan a la celda de flujo durante la captura, las genotecas de OS-Sec pueden usar fragmentos de ADN de diferentes tamaños sin necesidad de una rigurosa purificación por tamaño mediante métodos de separación física. Sólo se necesita la adición de un adaptador único a los extremos 5' de un fragmento de ADN genómico. El diseño de un adaptador único también se presta fácilmente para la indización con la introducción de un código de barras molecular. Esta característica permite la multiplexación directa de la muestra de los ensayos de secuenciación y tiene muchas aplicaciones potenciales. Por ejemplo, el análisis de los correspondientes tejidos normal y tumoral ocurre en la misma reacción de captura, lo que puede reducir los sesgos.

Dado el creciente interés en la "medicina personalizada" hay una clara necesidad de desarrollar métodos rápidos y simples de resecuenciación del genoma humano. Esto incluye el análisis de las variantes de la línea germinal y mutaciones somáticas que se encuentran en genomas de cáncer. Como un enfoque práctico y eficiente para la resecuenciación dirigida, la OS-Sec es particularmente útil para los estudios de traducción y diagnósticos clínicos, permitiendo el análisis por alto flujo de genes candidatos y la identificación de regiones objetivo sobre las que se puede accionar clínicamente.

Para el método descrito anteriormente, se usó un analizador de Genoma lllumina. Sin embargo, se prevé que este sistema será ampliamente aplicable a cualquier plataforma de secuenciación paralela.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un método para capturar y amplificar una secuencia seleccionada que comprende: a) obtener un sustrato que comprende una primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie y una segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie, donde los miembros de tales primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos unidos a la superficie no están dirigidas espacialmente sobre tal sustrato; b) hibridar un primer miembro de tal primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie a un oligonucleótido de selección que comprende una región que se híbrida con tal primer miembro y una región que contiene una secuencia genómica, c) extender tal primer miembro de tal primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir un cebador de selección unido al soporte que comprende una secuencia que es complementaria a tal secuencia genómica; d) hibridar tal cebador de selección unido al soporte a un fragmento de ácido nucleico que comprende tal secuencia genómica; e) extender tal cebador de selección unido al soporte para producir un producto de extensión que contiene una secuencia que flanquea tal secuencia genómica; f) amplificar tal producto de extensión sobre tal sustrato usando miembros no extendidos de tales primeros y segundos poblaciones de oligonucleótidos unidos a la superficie, para producir un producto PCR.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde tal fragmento de ácido nucleico es un fragmento genómico ligado al adaptador que comprende un adaptador en el extremo 5', donde tal extensión produce un producto de extensión que comprende, en su extremo 3', una secuencia que es complementaria a tal adaptador, y donde los miembros de tal segunda población de tales oligonucleótidos unidos a la superficie hibridan con tal secuencia que es complementaria a tal adaptador durante tal PCR de puente.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, donde tal adaptador en el extremo 5' comprende un sitio de unión para un cebador de secuenciación en el extremo que está ligado a tal fragmento genómico.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde tal método comprende, entre las etapas e) y f), ligar un adaptador en el extremo 3' de tal producto de extensión, y donde los miembros de tal segunda población de tales oligonucleótidos unidos a la superficie se hibridan con tal adaptador durante tal amplificación .

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, donde tal adaptador comprende un sitio de unión para un cebador de secuenciación en el extremo que está ligado a tal fragmento de ácido nucleico.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde tal segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie son realizadas por: i. hibridar los miembros de una segunda población inicial de oligonucleótidos unidos a la superficie a un oligonucleótido que comprende una región que se híbrida con los miembros de tal segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie y una región que es complementaria a una secuencia de tal fragmento de ácido nucleico; y ii. extender tales miembros de tal segunda población inicial de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir tal segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde tal oligonucleótido de selección comprende un sitio de unión para un cebador de secuenciación entre tal región que se híbrida con tal primer miembro y tal región que contiene tal secuencia genómica.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además secuenciar una primera cadena de tal producto PCR para obtener al menos parte de la secuencia nucleotídico de tal secuencia que flanquea tal secuencia genómica.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además secuenciar la segunda cadena de tal producto PCR para obtener al menos parte de la secuencia nucleotídico de tal secuencia que flanquea tal secuencia genómica.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde tal método comprende fragmentar un genoma de mamífero para producir un genoma fragmentado, opcionalmente añadir adaptadores a tal genoma fragmentado, y aplicar tal genoma fragmentado a tal sustrato.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, donde tal fragmentación se realiza físicamente, químicamente o usando una enzima de restricción.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde tal fragmentación se realiza mediante sonicación o cizallamiento.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 10, donde tal hibridación se lleva a cabo al preparar una pluralidad de genomas fragmentados a partir de una pluralidad de individuos diferentes, mezclar tal pluralidad de genomas fragmentados para producir una mezcla, aplicar tal mezcla de genomas fragmentados a tal sustrato, y obtener productos PCR que comprenden una secuencia que flanquea tal secuencia genómica de tales individuos diferentes.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende además secuenciar al menos la primera cadena de tales productos PCR para obtener al menos parte de la secuencia nucleotídico de tal secuencia que flanquea tal secuencia genómica de tales individuos diferentes.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 13, donde, antes de mezclar, se ligan adaptadores diferentes a tales genomas fragmentados de tales individuos diferentes, donde el tal adaptador comprende una secuencia de código de barras que permite identificar la fuente de tal fragmento genómico ligado al adaptador después que se secuencian tales productos PCR.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, donde tal método comprende: ADN genómico fragmentado ligado al adaptador a partir de un primer sujeto usando un primer adaptador que comprende una primera secuencia de código de barras para producir un primer producto; ADN genómico fragmentado ligado al adaptador a partir de un segundo individuo usando un segundo adaptador que comprende una segunda secuencia de código de barras para producir un segundo producto; combinar tales primer y segundo productos para producir un molde mixto; y realizar el método de acuerdo con la reivindicación 1 usando tal molde mezclado para proporcionar un primer y segundo producto PCR conteniendo cada uno tal secuencia de código de barras.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, donde tal molde mixto comprende el ADN genómico fragmentado de al menos 1,000 sujetos.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende: i. ligar los fragmentos de ácido nucleico a un adaptador que contiene un sitio para un cebador de secuenciación y una secuencia nucleotídica que es la misma que los segundos oligonucleótidos unidos a la superficie, ii. hibridar los fragmentos ligados al adaptador a un primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie, Mi. extender el primer miembro de la primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie a la cual se híbrida el fragmento ligado al adaptador; y iv. hibridar el extremo, que contiene el adaptador, del producto de extensión a un segundo polinucleótido unido al soporte, produciendo de esta manera un puente y facilitando PCR de puente.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde tal segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie se obtiene al ligar un oligonucleótido que comprende una región que es complementaria a una secuencia de tal fragmento de ácido nucleico a una segunda población inicial de oligonucleótidos unidos a la superficie para producir tal segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde tal amplificación es por PCR de puente.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde tal fragmento de ácido nucleico es un fragmento genómico o ADNc.

22. Un sistema que comprende: a) un sustrato que comprende una primera población de oligonucleótidos unidos a la superficie y una segunda población de oligonucleótidos unidos a la superficie, donde la primera y segunda poblaciones de oligonucleótidos unidos a la superficie no están dirigidas espacialmente sobre el sustrato; b) un oligonucleótido de selección que contiene una región que se híbrida con un primer miembro de la primera población y una región que contiene una secuencia genómica; c) un adaptador; y e) instrucciones para realizar el método de acuerdo con la reivindicación 1.