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MX2012005678A - Enhibidores de cinasas. - Google Patents

Enhibidores de cinasas.

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MX2012005678A
MX2012005678A MX2012005678A MX2012005678A MX2012005678A MX 2012005678 A MX2012005678 A MX 2012005678A MX 2012005678 A MX2012005678 A MX 2012005678A MX 2012005678 A MX2012005678 A MX 2012005678A MX 2012005678 A MX2012005678 A MX 2012005678A
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MX
Mexico
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unsubstituted
substituted
heteroaryl
alkyl
aryl
Prior art date
Application number
MX2012005678A
Other languages
English (en)
Inventor
John William Taunton Jr
Rebecca Maglathlin
Iana Serafimova
Rand Miller
Ville Paavilainen
Shyam Krishnan
Jesse Mcfarland
Michael S Cohen
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of MX2012005678A publication Critical patent/MX2012005678A/es

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Abstract

La presente invenci6n describe métodos para inhibir cinasas utilizando inhibidores de cinasas que tienen porciones de olefina.

Description

INHIBIDORES DE CINASAS Antecedentes de la Invención El genoma humano contiene al menos 500 genes que codifican las proteínas cinasas. En efecto, los genes de las proteínas cinasas constituyen aproximadamente un 2% de todos los genes humanos. Las proteínas cinasas modifican hasta el 30% de las proteínas humanas totales y regulan la mayor parte de las vías celulares, en particular las vías involucradas en la transducción de señales.
Debido a los profundos efectos sobre las células, las actividades de las proteínas cinasas están muy reguladas. En efecto, la actividad de las cinasas sin regular frecuentemente causa enfermedades relacionadas con el control del crecimiento celular, el movimiento celular y la muerte celular, en particular cáncer. En la actualidad, se están realizando una gran cantidad de investigaciones para encontrar fármacos capaces de inhibir cinasas específicas, para tratar una variedad de enfermedades. Algunos de esos fármacos ya están en uso clínico, incluyendo el Gleevec (imatinib) y el Iressa (gefitinib) . Para aumentar la potencia y la selectividad, se han desarrollado inhibidores electrofílieos irreversibles, los cuales forman un enlace covalente con una cisteína en el sitio activo de la cinasa. Varios de estos inhibidores de cinasa irreversibles son Ref.:230823 utilizados en la actualidad en ensayos clínicos (por ejemplo, neratinib, tovok) . No obstante, la inhibición de las proteínas a través de la unión irreversible de un inhibidor a una proteína, cuando se usan para tratar enfermedades, a veces produce toxicidad y/o problemas inmunogénicos . En consecuencia, inhibidores reversibles de las cinasas son necesarios para inhibir las cinasas y minimizar el riesgo de toxicidad. La presente invención se dirige a estas y otras necesidades de la técnica.
Breve Descripción de la Invención En un primer aspecto, se proporcionan inhibidores de cinasas. En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas tiene la estructura de la Fórmula I : (I) En la Fórmula I, R1 es alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir o heteroarilo sustituido o sin sustituir.
L1 es un enlace, -C(0)-, -C (O) N (L3R2) - , -C(0)0-, -S(0)n-, -O-, -N(L3R2)-, -P(O) (OL3R2)0-, -S02N (L3R2) - , -P (O) (NL3R2) N- , alquileno sustituido o sin sustituir, heteroalquileno sustituido o sin sustituir, cicloalquileno sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, arileno sustituido o sin sustituir o heteroarileno sustituido 0 sin sustituir. El símbolo n es 0, 1 ó 2.
L2 es un enlace, -C(0)-, -C (O) N (L3AR2A) - , -C(0)0-, -S(0)t-, -O-, -N (L3AR2A) - , -P(O) (OL3AR2A)0-, -S02N (L3AR2A) - , -P (0) (NL3ARA) N- , alquileno sustituido o sin sustituir, heteroalquileno sustituido o sin sustituir, cicloalquileno sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, arileno sustituido o sin sustituir o heteroarileno sustituido o sin sustituir. El símbolo t es 0, 1 ó 2.
L3 y L3A son, de manera independiente, un enlace, un alquileno sustituido o sin sustituir, heteroalquileno sustituido o sin sustituir, cicloalquileno sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, arileno sustituido o sin sustituir, o heteroarileno sustituido o sin sustituir. El símbolo w es 0, 1 ó 2.
R2 y R2A son, de manera independiente, hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir o heteroarilo sustituido o sin sustituir .
E es un grupo aceptor de electrones o junto con L2 forma un grupo aceptor de electrones.
En otro aspecto, se proporcionan métodos para inhibir las proteínas cinasas. Los métodos incluyen poner en contacto una proteína cinasa con una cantidad efectiva de un inhibidor de las cinasas provisto en la presente. El inhibidor de las cinasa puede tener la estructura de la Fórmula I o de la Fórmula II (o cualquiera de las modalidades descritas en la presente) .
En otro aspecto, se proporciona un método de tratar una enfermedad asociada con la actividad de las cinasas en un sujeto que necesita tal tratamiento. El método incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva de un inhibidor de las cinasas provisto en la presente. El inhibidor de las cinasas puede tener la estructura de la Fórmula I o de la Fórmula II (o cualquiera de las modalidades descritas en la presente) .
Breve Descripción de las Figuras Las Fig. 1A y Fig. IB proporcionan resultados de espectrometría de masas, luego de la incubación de DMSO o de los Compuestos 1-4 (Fig. 1A) y 5-8 (Fig. IB) con CTD de RSK2 humana, durante 1 hora a temperatura ambiente.
La Fig. 2 ilustra la recuperación de la actividad de cinasa de CTD de RSK2 , luego de la inhibición por una selección de los compuestos descritos en la presente y posterior diálisis. Leyenda: Compuesto 6: marcado; Compuesto 7: recuadro abierto; Compuesto 1: recuadro negro; Compuesto 9: rayas diagonales.
La Fig. 3 ilustra la disociación de cianoacrilato o cianoacrilamida (Compuestos 4-7) del CTD de RSK2 plegado, medido por marcación competitiva con fluorometilcetona Compuesto 9 (FMK, por sus siglas en inglés) . Panel izquierdo superior: curso temporal de la marcación con FMK del CTD de RSK2 vacío. Panel derecho superior: curso temporal de la disociación de los inhibidores covalentes reversibles, Compuestos 4-7. Panel inferior: presentación tabular del tiempo medio de disociación (min) para los compuestos indicados .
La Fig. 4 ilustra la formación e inversión de la formación del enlace covalente entre RSK2 y el Compuesto 7 mediante espectrometría UV/Visible. Panel superior: absorbancia normalizada (400 nm) atribuida al Compuesto 7 después de la reacción con a) RSK2 C436V; b) RSK2 WT; c) RSK2 T más proteinasa K; d) RSK2 WT más SDS y e) RSK2 WT más guanidina HCl . Panel medio: Espectros UV/Visible para el Compuesto 7, en amortiguador solamente, en presencia de RSK2 o con RSK2 más proteinasa K (3 horas de incubación) . Panel inferior: Espectros UV/Visible para el Compuesto 7, en amortiguador solamente, en presencia de RSK2 o con RSK2 más SDS (1 min de incubación) .
La Fig. 5A ilustra el análisis espectrométrico de masas de la incubación del Compuesto 7 con guanidina HC1 3 M. La Fig. 5B ilustra el análisis espectrométrico de masas de la incubación del Compuesto 7 incubado con CTD de RSK2 antes de la adición de guanidina HCl 3 M.
La Fig. 6 ilustra la inhibición de la autofosforilación de Ser386 de RSK2 por los Compuestos 5-7 y Compuesto 9 en células HEK-293. Leyenda: FMK 9 (Compuesto 9): recuadro abierto; Compuesto 7: recuadro negro; Compuesto 6: recuadro gris; Compuesto 5: rayas diagonales. Panel inferior: Análisis por Transferencia Western {Western blot analysis) con fosfo-Ser386 RSK2 y anticuerpos anti-HA, tal como se describe en la presente .
La Fig. 7 ilustra los modos de unión de los Compuestos 6, 12 ó 15 (paneles superior, medio e inferior, respectivamente) a Cys-436 de RSK2, sobre la base de las estructuras cristalográficas de rayos X obtenidas como se describen en la presente.
La Fig. 8 ilustra los modos de unión del Compuesto 40 (panel superior) a Cys-436 de RSK2 y del Compuesto 55 a Cys-345 de cSrc.
La Fig. 9 ilustra el espectro de 1H RM antes y después de la dilución de la mezcla de reacción.
La Fig. 10 ilustra el espectro de absorbancia de cianoacrilamida y la representación gráfica de los valores de absorbancia, antes y después de la dilución.
Descripción Detallada de la Invención I. Definiciones Las abreviaturas usadas en la presente tienen el significado convencional que se utiliza dentro de las artes químicas y biológicas. Las estructuras químicas y las Fórmulas expuestas en la presente se construyen de acuerdo con las reglas estándares, conocidas en las técnicas químicas, de valencia química.
Cuando los grupos sustituyentes se especifican por sus Fórmulas químicas convencionales, escritas de izquierda a derecha, éstas también abarcan los sustituyentes químicamente idénticos que pueden resultar de la escritura de derecha a izquierda. Así, por ejemplo, -CH20- es equivalente a -OCH2-.
El término "alquilo" por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena lineal (es decir, no ramificada) , una cadena ramificada o una combinación de estas, que puede estar completamente saturada, mono- o poliinsaturada y puede incluir radicales di- y multivalentes , que tienen el número de átomos de carbono designados (es decir, Ci-Ci0 de significa uno a diez carbonos) . Los ejemplos de radicales hidrocarbonados saturados incluyen, pero no están limitados por, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, (ciclohexil) metilo, los homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y los similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más enlaces dobles o triples. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no están limitados por, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2 - (butadienilo) , 2 , 4-pentadienilo, 3 - ( 1 , 4 -pentadienilo) , etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo y los homólogos e isómeros superiores. Un alcoxi es un alquilo unido al resto de la molécula por medio de una unión de oxígeno ( -0- ) .
El término "alquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de un alquilo, ejemplificado, pero sin estar limitado por, CH2CH2CH2CH2 - y además incluye los grupos que se describen a continuación como "heteroalquileno" . Normalmente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, prefiriéndose en la presente invención los grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, en general que tiene ocho o menos átomos de carbono .
El término "heteroalquilo" por sí mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena lineal o ramificada estable, un radical hidrocarbonado cíclico o combinaciones de los mismos, que consiste en al menos un átomo de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en 0, N, P, Si y S, en donde opcionalmente los átomos de nitrógeno y azufre se pueden oxidar y en donde, de manera opcional, el átomo de nitrógeno se puede cuaternizar. El o los heteroátomos 0, N, P, S y Si se pueden ubicar en cualquier posición del grupo heteroalquilo o en la posición en la que el grupo alquilo se une al resto de la molécula. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados por, -CH2-CH2-0-CH3 , -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3 , -CH2-CH2/ -S (O) -CH3, -CH2-CH2-S (0)2-CH3, -CH=CH-0-CH3 , -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-0CH3, -CH=CH-N(CH3) -CH3, 0-CH3, -0-CH2-CH3 y -CN. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tales como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3. De manera similar, el término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un radical divalente derivado de heteroalquilo, ejemplificado, pero no limitado por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2- . Para los grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar uno o ambos extremos terminales de la cadena (por ejemplo, alquilenoxi, alquilendioxi , alquilenamino, alquilendiamino y similares) . Aún más, para los grupos de unión de alquileno y heteroalquileno, la orientación del grupo de unión no está relacionada con la dirección con la que se escribe la Fórmula del grupo de unión. Por ejemplo, la Fórmula -C(0)2R'- representa -C(0)2R'- y -R'C(0)2-- Como se describió antes, los grupos heteroalquilo, como se usa en la presente, incluyen los grupos que se unen al resto de la molécula a través de un heteroátomo, tal como -C(0)R', -C(0)NR', -NR'R", -0', -SR , y/o -S02R' . Cuando se menciona "heteroalquilo", seguido de la mención de grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares, se entenderá que los términos heteroalquilo y -NR'R'' no son redundantes o mutuamente excluyentes . Más bien, los grupos heteroalquilo específicos se mencionan para añadir claridad. En consecuencia, el término "heteroalquilo" no se debe interpretar en la presente, como que excluye a los grupos heteroalquilo específicos, tales como -NR'R" o similares.
Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo" por ellos mismos o en combinación con otros términos, representan, a menos que se indique lo contrario, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. En forma adicional, para el heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la que el heterociclo se une al resto de la molécula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no están limitados por, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3 -ciclohexenilo, cicloheptilo y similares. Los ejemplos de heterocicloalquilo incluyen, pero no están limitados por, 1 -(1,2,5,6-tetrahidropiridilo) , 1-piperidinilo, 2 -piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3 -morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran- 3 -ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2 -piperazinilo, y similares. Un "cicloalquileno" y un "heterocicloalquileno" , solo o como parte de otro sustituyente , significan un radical divalente derivado de un cicloalquilo y heterocicloalquilo, respectivamente .
[0001] Los términos "halo" o "halógeno" por sí mismos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique lo contrario, un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. En forma adicional, los términos tales como "haloalquilo" se entiende que incluyen monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término "halo (Ci-C4) alquilo" significa que incluye, pero no está limitado por, fluorometilo , difluorometilo, trifluorometilo, 2 , 2 , 2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3 -bromopropilo y similares.
El término "acilo" significa -C(0)R, donde R es un alquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir o heteroarilo sustituido o sin sustituir .
El término "arilo" significa, salvo que se indique lo contrario, ' un sustituyente hidrocarbonado aromático, poliinsaturado, que puede ser un anillo simple o anillos múltiples (con preferencia de 1 a 3 anillos) que se fusionan entre sí (es decir, un arilo anular fusionado) o que están unidos covalentemente . Un arilo anular fusionado se refiere a múltiples anillos fusionados entre sí, donde al menos uno de los anillos fusionados es un anillo arilo. El término "heteroarilo" se refiere a grupos arilo (o anillos) que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de N, 0 y S, donde los átomos de nitrógeno y azufre opcionalmente se oxidan y los átomos de nitrógeno están opcionalmente cuaternizados . En consecuencia, el término "heteroarilo" incluye grupos heteroarilo anulares (es decir, múltiples anillos fusionados entre sí donde al menos uno de los anillos fusionados es un anillo heteroaromático) . Un heteroarileno anular fusionado 5,6 se refiere a dos anillos fusionados entre sí, donde un anillo tiene 5 miembros y el otro anillo tiene 6 miembros y donde al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Asimismo, un heteroarileno anular fusionado 6,6 se refiere a dos anillos fusionados entre sí, donde un anillo tiene 6 miembros y el otro anillo tiene 6 miembros, y donde al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Y un heteroarileno anular fusionado 6,5 se refiere a dos anillos fusionados entre sí, donde un anillo tiene 6 miembros y el otro anillo tiene 5 miembros, y donde al menos un anillo es un anillo heteroarilo. Un grupo heteroarilo se puede unir al resto de la molécula a través de un carbono o un heteroátomo.
Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3 -pirazolilo, 2-imidazolilo, 4 - imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4- isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-benzimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2 -quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo, y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas anulares arilo y heteroarilo anteriormente indicados se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables que se describen a continuación. Un "arileno" y un "heteroarileno" solo o como parte de otro sustituyente , significa un radical divalente derivado de un arilo y un heteroarilo, respectivamente.
Para abreviar, el término "arilo", cuando se usa en combinación con otros términos (por ejemplo, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluye a los anillos arilo y heteroarilo definidos anteriormente. En consecuencia, el término "arilalquilo" significa que incluye los radicales en los que un grupo arilo se une a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y los similares) , incluyendo los grupos alquilo en los que un átomo de carbono (por ejemplo, un grupo metileno) fue remplazado con, por ejemplo, un átomo de oxígeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3- (1-naftiloxi ) propilo y los similares) .
El término "oxo" , tal como se utiliza en la presente, significa un oxígeno unido por enlace doble a un átomo de carbono .
El término "alquilsulfonilo" , tal como se utiliza en la presente, significa un resto que tiene la Fórmula -S(02)-R', en donde R' es un grupo alquilo, tal como el definido anteriormente. R' puede tener un número de carbonos especificado (por ejemplo "alquilsulfonilo Ci-C4") .
Cada uno de los términos anteriores (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo" ) se entienden que incluyen las formas sustituidas y sin sustituir del radical indicado. Los sustituyentes preferidos para cada tipo de radical se proporcionan a continuación.
Los sustituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo los grupos a menudo denominados como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados de, pero sin estar limitados por: -OR' , =0, =NR' , =N-0R' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR'R"R"', -OC(0)R', -C(0)R'# -C02R' , -CONR'R", -OC(0)NR'R", -NR"C(0)R' , -NR' -C(0)NR"R" \ -NR"C(0)2R', -NR-C (NR' R"R' " ) =NR" " , -NR-C(NR'R") =NR'" , -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02 en una cantidad que varía de cero a (2m'+l), en donde m' es el número total de átomos de carbono en el radical. De preferencia, R' , R" , R" x y R" " , cada uno, se refiere independientemente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir (por ejemplo, arilo sustituido con 1-3 halógenos) , alquilo sustituido o sin sustituir, grupos alcoxi o tioalcoxi o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona, de manera independiente, como cada uno de los grupos R' , R" , R' " y R"" cuando más de uno de estos grupos se encuentra presente. Cuando R' y R" se unen al mismo átomo de nitrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de a 4-, 5-, 6- ó 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" significa que incluye, pero no está limitado por, 1-pirrolidinilo y 4 -morfolinilo . De la descripción anterior de los sustituyentes , el experto en la técnica entenderá que el término "alquilo" significa que incluye grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos diferentes a los grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (por ejemplo, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (O) CH2OCH3 , y los similares) .
De manera similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo varían y se seleccionan de, por ejemplo: halógeno, -0R' , -NR'R", -SR' , -halógeno, -SiR'R"R" -OC(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", -OC(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR' -C (0) R"R' " , -NR"C(0)2R', -NR-C (NR' R"R' " ) =NR" " , -NR-C (NR' R" ) =NR' " , -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R' , -CN y -N02, -R' , -N3, -CH(Ph)2, fluoro (Cj.-C4) alcoxi y fluoro (C3.-C4) alquilo, en un número que varía de cero al número total de valencias abiertas en el sistema anular aromático y donde R' , R" , R" y R"" de preferencia se seleccionan, de manera independiente, de hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir y heteroarilo sustituido o sin sustituir. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona, de manera independiente, como cada uno de los grupos R' , R" , R' " y R" " cuando más de uno de estos grupos está presente.
Dos de los sustituyentes en los átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo opcionalmente pueden formar un anillo de Fórmula -T-C (O) - (CRR' ) q-U- , donde T y U son , de manera independiente, -NR- , -O-, -CRR'- o un enlace simple, y q es un numeró entero de 0 a 3. Alternativamente, dos de los sustituyentes de los átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo se pueden, de manera opcional, remplazar con un sustituyente de la Fórmula -A- (CH2) r-B- , donde A y B son , de manera independiente, -CRR' - , -O-, -NR-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -S(0)2NR'- o un enlace simple, y r es un número entero de 1 a 4. Uno de los enlaces simples del nuevo anillo así formado opcionalmente se puede remplazar con un enlace doble. Alternativamente, dos de los sustituyentes de los átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo opcionalmente se pueden remplazar con un sustituyente de la Fórmula -(CRR')S-X' - (C ' R' ' ' ) d- , donde s y d son, de manera independiente, números enteros de 0 a 3 y X' es -O-, -NR'-, -S-, -S(0)-, -S(0)2- o -S(0)2NR'-. Los sustituyentes R, R' , R" y R'", de preferencia, se seleccionan de manera independiente, entre hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir y heteroarilo sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza en la presente, el término "heteroátomo" , "anillo de heteroátomos" o "heteroátomo anular" significa que incluye oxígeno (O) , nitrógeno (N) , azufre (S) , fósforo (P) y silicio (Si) .
Un "grupo sustituyente" , tal como se utiliza en la presente, significa un grupo seleccionado entre los siguientes restos: (A) -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -N02, oxo, halógeno, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir, heteroarilo sin sustituir, y (B) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado entre: (i) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3f -N02, halógeno, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir, heteroarilo sin sustituir, y (ii) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado entre: (a) oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -N02, halógeno, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir, heteroarilo sin sustituir, y (b) alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo o heteroarilo, sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado entre oxo, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -N02, halógeno, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir y heteroarilo sin sustituir.
Un "sustituyente de tamaño limitado" o un "grupo sustituyente de tamaño limitado" , tal como se usa en la presente, significa un grupo seleccionado entre todos los sustituyentes descritos para un "grupo sustituyente" , en donde cada alquilo sustituido o sin sustituir es un alquilo C1-C20 sustituido o sin sustituir, cada heteroalquilo sustituido o sin sustituir es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros sustituido o sin sustituir, cada cicloalquilo sustituido o sin sustituir es un cicloalquilo C4-C8 sustituido o sin sustituir y cada heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir es un heterocicloalquilo de 4 a 8 miembros sustituido o sin sustituir.
Un "sustituyente inferior" o un "grupo sustituyente inferior", tal como se usa en la presente, significa un grupo seleccionado entre todos los sustituyentes descritos anteriores para un "grupo sustituyente", en donde cada alquilo sustituido o sin sustituir es un alquilo Ci-C8 sustituido o sin sustituir, cada heteroalquilo sustituido o sin sustituir es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros sustituido o sin sustituir, cada cicloalquilo sustituido o no sin sustituir es un cicloalquilo C5-C7 sustituido o sin sustituir y cada heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir es un heterocicloalquilo de 5 a 7 miembros sustituido o sin sustituir.
El término "sales farmacéuticamente aceptables" incluye las sales de los compuestos activos que se preparan con ácidos o bases relativamente no tóxicas, dependiendo de los sustituyentes particulares que se encuentran en los compuestos descritos en la presente. Cuando los compuestos de la presente invención contienen grupos funcionales relativamente ácidos, se pueden obtener sales de adición de bases contactando la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, ya sea pura o en un solvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de sodio, potasio, calcio, amonio, amino orgánico o magnesio, o una sal similar. Cuando los compuestos de la presente invención contienen grupos funcionales relativamente básicos, se pueden obtener sales de adición de ácidos contactando la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, ya sea solo o en un solvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen a las derivadas de los ácidos inorgánicos, tales como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrogenocarbónico, fosfórico, monohidrogenofosfórico, dihidrogenofosfórico, sulfúrico, monohidrogenosulfúrico, yodhídrico o fosforoso y los similares, así como las sales derivadas de los ácidos orgánicos relativamente no tóxicos tales como los ácidos acético, propiónico, isobutírico, maleico, malónico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, ftálico, bencensulfónico, p-tolilsulfónico, cítrico, tartárico, oxálico, metansulfónico y los similares. También se incluyen las sales de aminoácidos tales como las de arginato y las similares y las sales de ácidos orgánicos, tales como las de los ácidos glucurónico o galacturónico y los similares (ver, por ejemplo, Berge y col., P armaceutical Salts" , Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Ciertos compuestos específicos de la presente invención contienen grupos funcionales básicos y ácidos que permiten que los compuestos se conviertan en sales de adición de ácidos y de bases.
En consecuencia, los compuestos de la presente invención pueden existir como sales, tales como las sales de ácidos farmacéuticamente aceptables. La presente invención incluye a tales sales. Los ejemplos de tales sales incluyen a los clorhidratos, bromhidratos , sulfatos, metansulfonatos , nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartratos (por ejemplo, (+) -tartratos, (-) -tartratos o mezclas de los mismos, incluyendo a las mezclas racémicas) , succinatos, benzoatos y las sales con aminoácidos tales como el ácido glutámico. Estas sales pueden ser preparadas por métodos conocidos por los expertos en la técnica.
De preferencia, las formas neutras de los compuestos se regeneran contactando la sal con una base o un ácido y aislando el compuesto original de manera convencional. La forma original del compuesto difiere de las diversas formas salinas en ciertas propiedades físicas, tales como la solubilidad en solventes polares.
Además de las formas salinas, la presente invención proporciona compuestos, que se encuentran en forma de profármacos. Los profármacos de los compuestos descritos en la presente son aquellos compuestos que experimentan fácilmente cambios químicos en condiciones fisiológicos, para proporcionar los compuestos de la presente invención. Asimismo, los profármacos se pueden convertir en los compuestos de la presente invención, mediante métodos químicos o bioquímicos, en un ambiente ex vivo. Por ejemplo, los profármacos se pueden convertir lentamente en los compuestos de la presente invención cuando se colocan en un reservorio de parche transdérmico con una enzima o un reactivo químico adecuado.
Ciertos compuestos de la presente invención pueden existir en formas no solvatadas así como en formas solvatadas, entre las que se incluyen las formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y están comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Ciertos compuestos de la presente invención pueden existir en múltiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas físicas son equivalentes para los usos contemplados en la presente invención y se encuentran incluidas dentro del alcance de la presente invención.
Ciertos compuestos de la presente invención poseen átomos de carbono asimétricos (centros ópticos) o enlaces dobles; los racematos, los diastereómeros , los tautómeros, los isómeros geométricos y los isómeros individuales se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invención. Los compuestos de la presente invención no incluyen a aquellos que son conocidos en la técnica como demasiado inestables para sintetizar y/o aislar.
Los compuestos de la presente invención también pueden contener proporciones no naturales de isótopos atómicos de uno o más de los átomos que constituyen tales compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden estar radiomarcados con isótopos radiactivos tales como, por ejemplo, tritio (3H) , yodo-125 (125I) o carbono- 14 (14C) . Todas las variaciones isotópicas de los compuestos de la presente invención, sean radiactivos o no, están comprendidos dentro del alcance de la presente invención.
Cuando un sustituyente de un compuesto provisto en la presente está "R-sustituido" (por ejemplo R7-sustituido) , significa que el sustituyente está sustituido con uno o más de los grupos denominados R (por ejemplo R7) según sea apropiado. En algunas modalidades, el sustituyente está sustituido con solo uno de los denominados grupos R.
Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejoría de una lesión, patología o afección, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como la supresión; remisión; disminución de los síntomas o hacer que la lesión, patología o afección sea más tolerable para el paciente; lentificar la tasa de degeneración o declinación; hacer que el punto final de degeneración sea menos debilitante y mejorar el bienestar físico o mental del paciente. El tratamiento o mejoría de los síntomas se puede basar en parámetros objetivos o subjetivos, incluyendo los resultados de un examen físico, exámenes neuropsiquiátricos , y/o una evaluación psiquiátrica. Por ejemplo, ciertos métodos presentados en la presente tratan con éxito el cáncer mediante la disminución de la incidencia del cáncer, inhibiendo su crecimiento y/o causando la remisión del cáncer.
Una "cantidad efectiva" es una cantidad de un inhibidor de cinasa suficiente como para contribuir al tratamiento, prevención o reducción de un síntoma o síntomas de una enfermedad, o para inhibir la actividad de una proteína cinasa respecto a su actividad en ausencia del inhibidor de cinasa. Cuando se menciona con referencia a un tratamiento de una enfermedad, una "cantidad efectiva" también se puede denominar como una "cantidad terapéuticamente efectiva" . Una "reducción" de uno o varios síntomas (y los equivalentes gramaticales de esta frase) significa disminuir la gravedad o frecuencia del síntoma o la eliminación de los síntomas. Una "cantidad profilácticamente efectiva" de un fármaco es una cantidad de un fármaco que, cuando se administra a un sujeto, tendrá el efecto profiláctico deseado como, por ejemplo, prevenir o retrasar el inicio (o reaparición) de una enfermedad o reducir la probabilidad del inicio (o reaparición) de una enfermedad o sus síntomas. El efecto profiláctico completo puede no aparecer necesariamente por la administración de una sola dosis y puede aparecer después de la administración de una serie de dosis. En consecuencia, una cantidad profilácticamente efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. Una "cantidad que disminuye la actividad", tal como se usa en la presente, refiere a una cantidad de antagonista requerida para disminuir la actividad de una enzima con respecto a la ausencia del antagonista. Una "cantidad que altera la función", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la cantidad de antagonista requerida como para alterar la función de un osteoclasto o de un leucocito con respecto a la ausencia del antagonista.
Los términos "cinasa" , "proteína cinasa" y los similares, se refieren a una enzima que transfiere un grupo fosfato desde una molécula dadora (por ejemplo ATP) a un sustrato. El proceso de transferir un grupo fosfato desde un dador a un sustrato se conoce convencionalmente como fosforilación. El término "sustrato" en el contexto de la fosforilación de proteínas se refiere a un compuesto (por ejemplo, un proteína) que acepta un grupo fosfato y de este modo se fosforila.
II. Inhibidores de Cinasas En un primer aspecto, se proporcionan inhibidores de cinasas. Los inhibidores de cinasas normalmente son inhibidores de cinasas reversibles. En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas tiene la estructura de la Fórmula I: (I) En la Fórmula I, R1 es alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir, o -L1A-R1A. R1A es alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir. L1-R1 y/o R1 es/son generalmente diseñados para ajustarse dentro de un sitio de unión al ATP de la cinasa y/o unirse a aminoácidos dentro del sitio de unión al ATP de cinasa (por ejemplo al sitio de unión al ATP del resto cinasa) .
L1 es un enlace, -C(0)-, -C (0) N (L3R2) - , -C(0)0-, -S(0)n-, -0-, -N (L3R2) - , -P(0) (OL3R2)0-, -S02N (L3R2) - , -P (0) (NL3R2) N- , alquileno sustituido o sin sustituir, heteroalquileno sustituido o sin sustituir, cicloalquileno sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, arileno sustituido o sin sustituir o heteroarileno sustituido o sin sustituir. El símbolo n es 0, 1 ó 2. En algunas modalidades, L1 es un enlace. L1A es un enlace, -C(0)-, -C(0)N(L3'R2') -, -C(0)0-, -S(0)n.-, -0-, -N(L3'R2')-, -P(0)(0 L3'R2')0-, -S02N(L3'R2') -, -P (0) (N L3'R2')N-, alquileno sustituido o sin sustituir, heteroalquileno sustituido o sin sustituir, cicloalquileno sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, arileno sustituido o sin sustituir o heteroarileno sustituido o sin sustituir. El símbolo n' es 0, 1 ó 2.
L2 es un enlace, -C(0)-, -C (O) N (L3AR2A) - , -C(0)0-, -S(0)t-, -O-, -N (LAR2A) - , -P(0) (OL3AR2A)0-, -S02N (L3AR2A) - , -P (0) (NL3AR2A) N- , alquileno sustituido o sin sustituir, heteroalquileno austituido o sin sustituir, cicloalquileno sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, arileno sustituido o sin sustituir o heteroarileno sustituido o sin sustituir. El símbolo t es 0, 1 ó 2.
L3, L3' y L3A son, de manera independiente, un enlace, alquileno sustituido o sin sustituir, heteroalquileno sustituido o sin sustituir, cicloalquileno sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, arileno sustituido o sin sustituir, o heteroarileno sustituido o sin sustituir. El símbolo w es 0, 1 ó 2.
R2, R2'y R2A son, de manera independiente, hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir o heteroarilo sustituido o sin sustituir .
E es un grupo aceptor de electrones o junto con L2 forma un grupo aceptor de electrones (por ejemplo -L2-E puede formar un grupo aceptor de electrones) . En algunas modalidades, E es un anillo A o R4, en donde R4 y el anillo A son como se definen a continuación. En consecuencia, E puede ser hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir o -L5A-R4A. E también puede ser hidrógeno, R23A-alquilo sustituido o sin sustituir, R23A-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R23A-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R23A-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R23A-arilo sustituido o sin sustituir o R23A-heteroarilo sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, E es un heteroarilo sustituido o sin sustituir (por ejemplo R23A-heteroarilo sustituido o sin sustituir) o heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir (por ejemplo R23A-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir) .
En algunas modalidades, donde -L2-E es un grupo aceptor de electrones, E puede ser simplemente hidrógeno. El término "grupo aceptor de electrones" se refiere a un sustituyente químico que modifica las fuerzas electrostáticas que actúan en la cercanía de un centro de reacción química, extrayendo carga negativa de ese centro de reacción química. En consecuencia, los grupos aceptores de electrones retiran electrones de un centro de reacción. Como resultado, el centro de reacción es fraccionalmente más positivo que si estuviera en ausencia del grupo aceptor de electrones. En algunas modalidades, el centro de reacción química es uno de los carbonos formadores de enlaces dobles carbono-carbono (olefina) . En algunas modalidades, el centro de reacción química es el carbono de la olefina unido a -L1-R1. El grupo aceptor de electrones actúa retirando la carga o los electrones de ese carbono olefínico, haciendo de esta manera que el carbono olefínico sea deficiente en electrones (con relación a la ausencia del grupo aceptor de electrones) . Así, el carbono olefínico deficiente en electrones se vuelve más reactivo para los grupos químicos ricos en electrones, tales como el sulfhidrilo de una cisteína del sitio activo de la cinasa .
E y -L2-E son normalmente sustituyentes que retiran suficientes electrones del carbono olefínico del centro de reacción como para unirse en forma reversible al sulfhidrilo de una cisteína del sitio activo de la cinasa (por ejemplo, una unión reversible y medible cuando la cinasa está completamente desnaturalizada o parcialmente desnaturalizada) . Los métodos para analizar la reversibilidad del enlace entre el carbono olefínico del centro de reacción y el sulfhidrilo de una cisteína del sitio activo de la cinasa (o de un tiol del compuesto proxi) se proporcionan en los Ensayos y Ejemplos que se proporcionan más abajo.
En algunas modalidades, -L2-E es como se establece en alguna de las Fórmulas expuestas. Por ejemplo, en la Fórmula II, -L2-E es -C(0)X(L4-R3)z(L5-R4) , en la Fórmula IIIc es -L2-NR3R4, en la Fórmula IIIc -L2-E es - NR3R4, etc. En consecuencia, -L2-E puede ser como se expone en las Fórmulas provistas en la presente y combinarse con las definiciones y modalidades de -iZ-R1 provistas en la presente. Asimismo, -L1-R1 puede ser como se establece en las Fórmulas provistas en la presente (por ejemplo Fórmula Illa a lile donde -iZ-R1 incluye un pirrolopirimidinilo) y combinarse con las definiciones de -L2-E provistas en la presente.
Algunos ejemplos no limitantes de grupos capaces de retirar electrones de un centro de reacción incluyen, pero no están limitados por, -N02, -N(R2) , -N(R3) + , -N(H3) + , -S03H, -S03R' , -S(02)R' (sulfona) , -S(0)R' (sulfóxido), -S(02)NH2 (sulfonamida) , -S02NHR' , -S02NR'2, -PO(OR')2, -P03H2, -PO(NR'2)2/ piridinilo (2-, 3-, 4-), pirazolilo, indazolilo, imidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, oxazolilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, isoxazolilo, benzisoxazolilo, triazolilo, benzotriazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, pirimidinilo, un heteroarilo de 5 o 6 miembros con un enlace doble C-N opcionalmente fusionado a un heteroarilo de 5 o 6 miembros, N-óxido de piridinilo, -C=N, -CX'3f -C(0)X', -COOH, -COOR' , -C(0)R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)NR'2, -C(0)H, -P(0) (OR' )0R" y X', donde X' es, de manera independiente, halógeno (por ejemplo cloro o flúor) y R, R' y R' ' son , de manera independiente, hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir, o sustituyentes similares (por ejemplo un grupo sustituyente , un grupo sustituyente de tamaño limitado o un grupo sustituyente inferior) . El término "grupo aceptor de electrones" se distingue de un "grupo dador de electrones" como es conocido en la técnica.
En consecuencia, en algunas modalidades, los inhibidores de cinasas provistos en la presente (por ejemplo, los compuestos de la Fórmula I anterior o las Fórmulas que se proporcionan a continuación) son inhibidores de cinasas reversibles y se pueden disociar de modo medible de la proteína cinasa, cuando la proteína cinasa no está desnaturalizada, parcialmente desnaturalizada o completamente desnaturalizada. En algunas modalidades, el inhibidor de cinasa reversible covalente se disocia de forma medible de la proteína cinasa solo cuando la proteína cinasa está completamente desnaturalizada o parcialmente desnaturalizada, pero no se disocia de forma medible de la proteína cinasa cuando la proteína cinasa está intacta, o se disocia al menos 10, lxlO2, lxlO3, lxlO4, 1x10s, 1x10s, lxlO7, lxlO8, lxlO9, lxlO10 veces más lento cuando la proteína cinasa está intacta con respecto a la disociación cuando la proteína cinasa es desnaturalizada de manera completa o parcial (denominada en la presente como un "inhibidor de cinasa desnaturalizado reversible covalente"). En algunas modalidades, la proteína cinasa está desnaturalizada o completamente desnaturalizada (es decir, no intacta) cuando se coloca en una solución desnaturalizante, tal como guanidina 6 , 1% de SDS, 50% de MeCN o un desnaturalizante de proteínas similar, durante segundos o durante minutos (por ejemplo, 30 a 120 segundos, tales como 60 segundos) . En algunas modalidades, los inhibidores de cinasas reversibles descritos en la presente, después de la unión covalente al resto de cisteína del sitio activo de la cinasa, son capaces de disociar de la cinasa en el trascurso de segundos o minutos, luego de la desnaturalización/desplegado de la cinasa con guanidina 6 N, 1% de SDS, 50% de MeCN o un desnaturalizante de proteínas similar.
En algunas modalidades de los inhibidores de cinasa provistos en la presente, si L1 es un enlace y R1 es (3- (4-amino-5-p-tolil-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il) propan-l-ol) -6-ilo, entonces -L2-E no es -C(0)NH2. En otras modalidades, en donde L1 es un enlace y R1 es un 4-amino pirrolopirimidinilo sustituido, entonces -L2-E no es -C(0)NH2. En ciertas modalidades, en donde L1 es un enlace y R1 es un pirrolopirimidinilo sustituido, entonces -L2-E no es -C(0)NH2. En ciertas modalidades, en donde L1 es un enlace y R1 es un pirrolopirimidinilo sustituido o sin sustituir, entonces L2-E no es -C(0)NH2. En otras modalidades, en donde R1 es un pirrolopirimidinilo sustituido o sin sustituir, entonces -L2-E no es -C(0)NH2.
En otras modalidades, -L2-E no es -C(0)NH2. En otras modalidades, -L2-E no es -C(0)0H, o -C(0)0R'', en donde R' ' es un alquilo C1-C10 sin sustituir (por ejemplo alquilo Ci-C5 sin sustituir, tal como metilo). En algunas modalidades, L2-E no es -C(0)N(CH3)2 o -C (0) NH (CH3) .
En algunas modalidades de la Fórmula I anterior o de las Fórmulas provistas a continuación, R1 y R1A son , de manera independiente, R7-alquilo sustituido o sin sustituir, R7-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R7-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R7-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R7-arilo sustituido o sin sustituir o R7-heteroarilo sustituido o sin sustituir.
R7 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -C00H, -CF3, R8-alquilo sustituido o sin sustituir, R8-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R8-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R8-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir , R8-arilo sustituido o sin sustituir , R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir , o -L6-R7A. L6 es -O-, -NH- , -C(0)-, -C(0)NH-, -S(0)m- o -S(0)mNH-, en donde m es 0, 1 ó 2.
R7A es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2 , -C00H, -CF3, R8 alquilo sustituido o sin sustituir, R8-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R8-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R8-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R8-arilo sustituido o sin sustituir, o R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R8 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R9- alquilo sustituido o sin sustituir, R9- heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R9- cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R9-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R9- arilo sustituido o sin sustituir, R9- heteroarilo sustituido o sin sustituir o -L9-R9A. En algunas modalidades, R8 es, de manera independiente, -OH o alquilo sin sustituir. L9 es -O-, -NH- , -C(0)-, -C(0)NH-, -S(0)m.- o -S(0)m.NH-, en donde m' es 0, 1 ó 2.
R9A es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R10-alquilo sustituido o sin sustituir, R10- heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R10-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R10-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R10- arilo sustituido o sin sustituir o R10- heteroarilo sustituido o sin sustituir. R9 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R10- alquilo sustituido o sin sustituir, R10- heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R10- cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R10-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R10- arilo sustituido o sin sustituir o R10- heteroarilo sustituido o sin sustituir. R10 es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
En algunas modalidades, R1 y R1A son, de manera independiente, R7-heteroarilo de anillos fusionados 6,5 sustituido o sin sustituir, R7- heteroarilo de anillos fusionados 5,6 sustituido o sin sustituir, R7- heteroarilo de anillos fusionados 5,5 sustituido o sin sustituir, R7-heteroarilo de anillos fusionados 6,6 sustituido o sin sustituir o R7-heteroarilo de 5 o 6 miembros sustituido o sin sustituir, que tiene por lo menos 2 (por ejemplo 2 a 4) nitrógenos anulares. En algunas modalidades, R1 y R1A son, de manera independiente, R7-fenilo sustituido, R7-piperidinilo sustituido, R7-heterocicloalquilo sustituido de 6 miembros, R7-heteroarilo de anillos fusionados 6,5 sustituido o sin sustituir, R7-heteroarilo de anillos fusionados 5,6 sustituido o sin sustituir. R7 puede ser halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, R8-alquilo sustituido o sin sustituir, R8-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R8-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R8-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R8-arilo sustituido o sin sustituir o R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir o-L6-R7A. R7A puede ser R8-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R8-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R8-arilo sustituido o sin sustituir o R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir. L6 puede ser -0-, -NH- , -C(0)-, -C(0)NH-, -S(0)m-o -S(0)raNH-. R8 puede ser -OH o R9-alquilo sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades relacionadas, R7 es, de manera independiente, R8-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R8-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R8-arilo sustituido o sin sustituir, R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir o -L6-R7A. En otras modalidades relacionadas, R7 es R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir o -L6-R7A. L6 puede ser -C(0)-. R7A puede ser R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir.
En algunas modalidades, R1 o R1A es un heteroarilo sustituido o sin sustituir, tal como un R7-heteroarilo sustituido o sin sustituir. El heteroarilo puede ser un pirrolopirimidinilo sustituido o sin sustituir, indolilo sustituido o sin sustituir, pirazolilo sustituido o sin sustituir, indazolilo sustituido o sin sustituir, imidazolilo sustituido o sin sustituir, tiazolilo sustituido o sin sustituir, benzotiazolilo sustituido o sin sustituir, oxazolilo sustituido o sin sustituir, bencimidazolilo sustituido o sin sustituir, benzoxazolilo sustituido o sin sustituir, isoxazolilo sustituido o sin sustituir, bencisoxazolilo sustituido o sin sustituir, triazolilo sustituido o sin sustituir, benzotriazolilo sustituido o sin sustituir, quinolinilo sustituido o sin sustituir, isoquinolinilo sustituido o sin sustituir, quinazolinilo sustituido o sin sustituir, pirimidinilo sustituido o sin sustituir, N-óxido de piridinilo sustituido o sin sustituir, furanilo sustituido o sin sustituir, tiofenilo sustituido o sin sustituir, benzofuranilo sustituido o sin sustituir, benzotiofenilo sustituido o sin sustituir, imidazo [1 , 2b] iridazinilo sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, R1 o R1A es un heteroarilo de anillos fusionados 6,5 sustituido o sin sustituir, un heteroarilo de anillos fusionados 5,6 sustituido o sin sustituir, un heteroarilo de anillos fusionados 5,5 sustituido o sin sustituir o un heteroarilo de anillos fusionados 6,6 sustituido o sin sustituir. En otras modalidades, R1 o R1A es un heteroarilo de 5 o 6 miembros sustituido o sin sustituir que tiene, por lo menos, 2 (por ejemplo 2 a 4) nitrógenos anulares. Como se discutió más arriba, cualquier sustituyente R1 puede ser R7-sustituido, incluyendo los sustituyentes enumerados en este párrafo.
R1 y/o -L1-R1 es/son, por lo general, diseñados para ser restos del sitio de las cinasas de unión al ATP. Se ha encontrado también que en los compuestos de la Fórmula I, en los cuales R1 y/o -L1-R1 está/están unidos al remanente del compuesto vía un carbono sp2 , la estabilidad del compuesto se encuentra mejorada. Un "resto del sitio de las cinasas de unión al ATP" tal como se utiliza en la presente, es un resto capaz de ajustarse dentro del sitio de unión al ATP de las cinasas y/o de unirse a los amino ácidos dentro del sitio de unión al ATP de las cinasas. Los sitios de las cinasas de unión al ATP son bien conocidos para una amplia variedad de cinasas y pueden ser fácilmente determinados a partir de la estructura primaria de los amino ácidos de una cinasa, utilizando técnicas de modelado por computadora comúnmente empleadas en el arte. En algunas modalidades, -iZ-R1 es un resto del sitio de las cinasas de unión a ATP y el carbono olefínico deficiente de electrones se une a un sulfhidrilo de la cisteína del sitio activo de la cinasa. Así, en algunas modalidades, los inhibidores de cinasas que se proporcionan en la presente, se unen a, por lo menos, dos puntos de la de la proteína cinasa: por lo menos un resto dentro del resto del sitio de unión al ATP y un sulfhidrilo de la cisteína del sitio activo de una cinasa. En algunas modalidades, -iZ-R1 no tiene la Fórmula: En otras modalidades, -iZ-R1 no es un fenilo sustituido con hidroxilo. En algunas modalidades, -I^-R1 incluye un grupo heteroarilo sustituido o sin sustituir o un heteroarileno sustituido o sin sustituir.
En algunas modalidades, L1-R1 y/o R1 es arilo sustituido o sin sustituir o heteroarilo sustituido o sin sustituir. En otras modalidades, L1 es un enlace y R1 es un arilo sustituido o sin sustituir o un heteroarilo sustituido o sin sustituir. En otras modalidades, L1 es un arileno sustituido o sin sustituir o un heteroarilo sustituido o sin sustituir y R1 o R1A es un arilo sustituido o sin sustituir o un heteroarilo sustituido o sin sustituir. Por ejemplo, L1 puede ser arileno sustituido o sin sustituir y R1 o R1A puede ser heteroarilo sustituido o sin sustituir. En modalidades relacionadas L1A es -C(0)-, -C(0)NH-, -C(0)0-, -S(0)-, -S02-. -S-, -0-, -NH- o -SO2NH- .
En algunas modalidades, L1 es un enlace y R1 es un R7-fenilo sustituido. En algunas modalidades relacionadas, R7 es -L6-R7A o R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir, en donde R7A es R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir. En algunas otras modalidades, L6 es un enlace o -C(0)-. En otra modalidad relacionada, el R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir es un R8-heteroarilo de anillos fusionados 6,5 sustituidos o sin sustituir o R8-de anillos fusionados 5,6 sustituidos o sin sustituir.
En otras modalidades, L1 es un enlace y R1 es un R7-fenilo sustituido, R7-piperidinilo sustituido, R7-piperazinilo sustituido, R7-pirrolidinilo sustituido, R7-piperidinilo sustituido, R7-azepanilo sustituido o R7-azetidinilo sustituido. En algunas modalidades relacionadas, R7 es -L6-R7A o R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir, en donde R7A es R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir. En algunas otras modalidades, L6 es un enlace o -C(0)-. En otra modalidad relacionada, el R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir es un R8-heteroarilo de anillos fusionados 6,5 sustituido o sin sustituir o un R8-de anillos fusionados 5,6 sustituidos o sin sustituir.
En alguna modalidad, L1 es un arileno sustituido o sin sustituir (por ejemplo fenileno) y R1 o R1* es un heteroarilo sustituido o sin sustituir (por ejemplo R7-sustituido) . En otras modalidades, L1 es un heteroarileno sustituido o sin sustituir.
En algunas modalidades de la Fórmula I de más arriba o de las Fórmulas proporcionadas más abajo, L1 es un enlace, -C(O)-, -C(0)N(L3R2) -, -C(0)0-, -S(0)n-, -0-, -S-, -N(L3R2)-, -P(0) (OL3R2)0-, -S02N(L3R2) -, -P (0) (NL3R2) N- , R^-alquileno sustituido o sin sustituir, Ri:L-heteroalquileno sustituido o sin sustituir, R1:L-cicloalquileno sustituido o sin sustituir, R1:L-heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, Ri:L-arileno sustituido o sin sustituir o Ri:L-heteroarileno sustituido o sin sustituir. L1A puede ser un enlace, -C(0)-, -C(0)N(L3'R2') -, -C(0)0-, -S(0)n,-, -0-, -N(L3'R2')-, -P(0) (0 L3'R2')0-, -S02N(L3'R2') -, -P (0) (N L3'R2')N-, Ru-alquileno sustituido o sin sustituir, R1:L-heteroalquileno sustituido o sin sustituir, R1:1-cicloalquileno sustituido o sin sustituir, R11- heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, R11-arileno sustituido o sin sustituir o Ri:L-heteroarileno sustituido o sin sustituir.
L1 y L1A pueden ser, de manera independiente, un enlace, R1:L-alquileno sustituido o sin sustituir, R11- heteroalquileno sustituido o sin sustituir, R11- cicloalquileno sustituido o sin sustituir, R11- heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, R1:L-arileno sustituido o sin sustituir o R11-heteroarileno sustituido o sin sustituir.
R11 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -C0OH, -CF3, R12-alquilo sustituido o sin sustituir, R12-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R12-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R12-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R12- arilo sustituido o sin sustituir o R12-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R12 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2/ -COOH, -CF3, R13-alquilo sustituido o sin sustituir, R13-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R13-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R13-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R13-arilo sustituido o sin sustituir o R13-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R13 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R14-alquilo sustituido o sin sustituir, R14- heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R14- cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R14-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R14-arilo sustituido o sin sustituir o R14-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R14 es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3( alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir .
L2 puede ser un enlace, -C (0) N (L3AR2A) - , -C(0)0-, -S(0)t-, -0-, -S-, -N(L3AR2A)-, -C(0) --P(O) (OL3R2) ) -, -S02N (L3R2) - , -P (O) (NL3R2) N- , R19- alquileno sustituido o sin sustituir, R19- heteroalquileno sustituido o sin sustituir e, R19-cicloalquileno sustituido o sin sustituir e, R19-heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, R19-arileno sustituido o sin sustituir o R19-heteroarileno sustituido o sin sustituir.
R19 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R20-alquilo sustituido o sin sustituir, R20-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R20-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R20-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R20-arilo sustituido o sin sustituir o R0-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R20 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R21-alquilo sustituido o sin sustituir, R21-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R21-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R21-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R21-arilo sustituido o sin sustituir o R21-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R21 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2 , -COOH, -CF3, R22-alquilo sustituido o sin sustituir, R22-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R22-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R22-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R22-arilo sustituido o sin sustituir o R22-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R22 es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilp sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir .
En algunas modalidades, L3, L3' y L3A son, de manera independiente, un enlace, R27-alquileno sustituido o sin sustituir, R27-heteroalquileno sustituido o sin sustituir, R27-cicloalquileno sustituido o sin sustituir, R27-heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, R27-arileno sustituido o sin sustituir o R27-heteroarileno sustituido o sin sustituir. R27 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R28-alquilo sustituido o sin sustituir, R28-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R28-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R8-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R28-arilo sustituido o sin sustituir o R28-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R28 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R29-alquilo sustituido o sin sustituir, R29-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R29-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R29-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R29-arilo sustituido o sin sustituir o R29-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R29 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R30-alquilo sustituido o sin sustituir, R30-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R30-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R30-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R30-arilo sustituido o sin sustituir o R30-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R30 es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
En algunas modalidades, R2, R2' y R2A son, de manera independiente, hidrógeno, R15-alquilo sustituido o sin sustituir, R15-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R15-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R15-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R15-arilo sustituido o sin sustituir o R15-heteroarilo sustituido o sin sustituir .
R15 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R16-alquilo sustituido o sin sustituir, R16-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R16-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R16-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R16-arilo sustituido o sin sustituir, R16-heteroarilo sustituido o sin sustituir o -L7-R15A. L7 es, de manera independiente, -0-, -C(0)-, -C(0)NH-, -S(0)y- o -S(0)yNH-, en donde y es 0, 1 ó 2. R15A es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -C00H, -CF3, R16-alquilo sustituido o sin sustituir, R16-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R16-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R16-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R16-arilo sustituido o sin sustituir, R16-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R16 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -C00H, -CF3, R17-alquilo sustituido o sin sustituir, R17-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R17-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R17-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R17-arilo sustituido o sin sustituir o R17-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R17 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R18-alquilo sustituido o sin sustituir, R18-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R18-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R18-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R18-arilo sustituido o sin sustituir o R18-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R18 es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir .
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula II: (II) Con respecto a la Fórmula II, es -C(0)- o -S(0)2-, X es 0 o N y z es 0 ó 1, siempre que, sin embargo, si X es 0, entonces z es 0. L1 y R1 se definen como se revela más arriba para la Fórmula I. En algunas modalidades, X es N. En otras modalidades, X es O.
R3 es hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir o heteroarilo sustituido o sin sustituir.
R4 es hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir o -L5A-R4A. R4A es hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido 0 sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir. R3 y R4 puede ser juntados con X para formar un heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir o un heteroarilo sustituido o sin sustituir. R3 y R4A pueden ser juntados con X para formar un heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir o un heteroarilo sustituido o sin sustituir.
L4 y L5 son, de manera independiente, un enlace, -C(0)- -C(0)N(L3AR2A) -, -C(0)0-, -S(0)t-, -0-, -N (L3AR2A) - , -P(0) (OL3AR2A)0-, -S02N(L3AR2A) -, -P (0) (NL3AR2A) N- , alquileno sustituido o sin sustituir, heteroalquileno sustituido o sin sustituir, cicloalquileno sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, arileno sustituido o sin sustituir o heteroarileno sustituido o sin sustituir. L3A, R2A, t son como se definen más arriba. L5A es un enlace, -C(0)-, -C (O) N (L3ARA' ) - , -C(0)0-, -S(0)t,-, -O-, -N(L3A'R2A')-, -P(0)(0 L3A'R2A')0-, -S02N (L3AR2A' ) - , -P(0) (NL3A'R2A')N-, alquileno sustituido o sin sustituir, heteroalquileno sustituido o sin sustituir, cicloalquileno sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, arileno sustituido o sin sustituir o heteroarileno sustituido o sin sustituir. El símbolo t' es 0, 1 ó 2.
R2A' es, de manera independiente, hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir o heteroarilo sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, R2A es, de manera independiente, hidrógeno, R15-alquilo sustituido o sin sustituir, R15-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R15-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R15-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R15-arilo sustituido o sin sustituir o R15-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R15 es como se define más arriba.
L3A' es, de manera independiente, un enlace, alquileno sustituido o sin sustituir, heteroalquileno sustituido o sin sustituir, cicloalquileno sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, arileno sustituido o sin sustituir o heteroarileno sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, L3A' es un enlace, R27-alquileno sustituido o sin sustituir, R27-heteroalquileno sustituido o sin sustituir, R27-cicloalquileno sustituido o sin sustituir, R27-heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, R27-arileno sustituido o sin sustituir o R27-heteroarileno sustituido o sin sustituir. R27 es como se define más arriba.
En algunas modalidades, L4 y L5 son, de manera independiente, un enlace, -C(0)-, -C (0) N (L3AR2A) - , -C(0)0-, -S(0)t-, -O-, -N (L3AR2A) - , -P(O) (OL3AR2A)0-, -S02N (L3AR2A) - , -P (O) (NL3AR2A)N- , R19-alquileno sustituido o sin sustituir, R19-heteroalquileno sustituido o sin sustituir, R19-cicloalquileno sustituido o sin sustituir, R1 -heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, R19-arileno sustituido o sin sustituir o R19-heteroarileno sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, L5A es un enlace, -C(0)-, -C (0) N (L3AR2A' ) - , -C(0)0-, -S(0)t.-, -O-, -N(L3A'R2A') -, -P(0) (0 L3A'R2A')0-, -S02N(L3A'R2A') -, -P (0) (NL3A'R2A' ) N- , R19-alquileno sustituido o sin sustituir, R19-heteroalquileno sustituido o sin sustituir, R19-cicloalquileno sustituido o sin sustituir, R19-heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, R19-arileno sustituido o sin sustituir o R19-heteroarileno sustituido o sin sustituir. R19 es como se define más arriba.
En algunas modalidades, por lo menos uno de L5-R4 o L4-R3 incluye un heteroarilo sustituido o sin sustituir o heteroarileno sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, uno de L5-R4 o L -R3 incluye un heteroarilo sustituido o sin sustituir o heteroarileno sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, uno de L5-R4 o L -R3 es un hidrógeno .
En algunas modalidades, si L1 es un enlace y R1 es (3-(4 -amino-5-?-tolil-7H-pirrólo [2 , 3 -d] pirimidin-7 - il ) propan-1-ol)-6-il, entonces por lo menos uno de R3 y R4 no son hidrógeno .
En algunas modalidades de la Fórmula I o de la Fórmula II, R1 o R1A es R7-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R7-arilo sustituido o sin sustituir o R-heteroarilo sustituido o sin sustituir, en donde R7 es como se describe más arriba.
En algunas modalidades, R3 es hidrógeno, R23-alquilo sustituido o sin sustituir, R3-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R23-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R23-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R23-arilo sustituido o sin sustituir o R23-heteroarilo sustituido o sin sustituir .
R23 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R24-alquilo sustituido o sin sustituir, R2 -heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R24-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R24-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R24-arilo sustituido o sin sustituir, R2 -heteroarilo sustituido o sin sustituir o -L8-R23A' . L8 es, de manera independiente, -O-, -C(0)-, -C(0)NH-, -S(0)p-o -S(0)pNH-, en donde p es 0, 1 ó 2. R23A' es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R24-alquilo sustituido o sin sustituir, R24-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R24-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R4-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R24-arilo sustituido o sin sustituir, R24-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R24 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R25-alquilo sustituido o sin sustituir, R25-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R25-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R25-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R25-arilo sustituido o sin sustituir o R25-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R25 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R26-alquilo sustituido o sin sustituir, R26-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R26-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R26-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R26-arilo sustituido o sin sustituir o R26-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R26 es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir .
En algunas modalidades, R3 y R4 se juntan con X para formar un heteroarilo sustituido o sin sustituir o un heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir (por ejemplo R23-heteroarilo sustituido o sin sustituir o R23-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir) . En algunas modalidades, R3 y R4 se juntan con X para formar un heterocicloalquilo de 4 a 8 miembros, sustituido o sin sustituir o un heteroarilo de 5 a 6 miembros sustituido o sin sustituir (por ejemplo, las especies R23-sustituidas del mismo) . En algunas modalidades, R3 y R4 se juntan con X para formar un heterocicloalquilo de 4 a 7 miembros, sustituido o sin sustituir o un heteroarilo de 5 a 6 miembros sustituido o sin sustituir (por ejemplo, las especies R23-sustituidas del mismo) . En algunas modalidades, R3 y R4 se juntan con X para formar un heterocicloalquilo de 5 a 7 miembros, sustituido o sin sustituir o un heteroarilo de 5 a 6 miembros, sustituido o sin sustituir (por ejemplo, las especies R23-sustituidas del mismo) . En algunas modalidades, R3 y R4 se juntan con X para formar un morfolino sustituido o sin sustituir, un tiomorfolino sustituido o sin sustituir (o un anillo oxidado del mismo) , piridinilo sustituido o sin sustituir, pirazinilo sustituido o sin sustituir, pirrolidinilo sustituido o sin sustituir, piperidinilo sustituido o sin sustituir, piperizinilo sustituido o sin sustituir, pirrolidinilo sustituido o sin sustituir, azepanilo sustituido o sin sustituir o azetidinilo sustituido o sin sustituir (por ejemplo los sustituyentes R23-sustituidos del mismo) .
En algunas modalidades relacionadas con la Fórmula II, R4 y R4A son hidrógeno, R23A-alquilo sustituido o sin sustituir, R23A-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R23A-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R23A-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R23A-arilo sustituido o sin sustituir o R23A-heteroarilo sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, R4 y R4A no son hidrógeno.
R3A es hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R24A-alquilo sustituido o sin sustituir, R24A-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R24A-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R24A-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R24A-arilo sustituido o sin sustituir, R24A-heteroarilo sustituido o sin sustituir o -L7A-R24B. L7A es, de manera independiente, -0-, -C(0)-, -C(0)NH-, -S(0)y.-o -S(0)y,NH-, en donde y' es 0, 1 ó 2. R24B es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R24A-alquilo sustituido o sin sustituir, R2 A-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R24A-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R24A-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R24A-arilo sustituido o sin sustituir, R2 A-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R4A es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R25A-alquilo sustituido o sin sustituir, R5A -heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R5A -cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R25A -heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R25A -arilo sustituido o sin sustituir o R5A -heteroarilo sustituido o sin sustituir. R25A es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R26A-alquilo sustituido o sin sustituir, R26A-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R26A-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R26 -heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R26A-arilo sustituido o sin sustituir o R26A-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R26A es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir .
En algunas modalidades, R4 o R4A es R23A-alquilo sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, R3 es piridinilo sustituido o sin sustituir (2-, 3-, 4-), pirazolilo sustituido o sin sustituir, indazolilo sustituido o sin sustituir, imidazolilo sustituido o sin sustituir, tiazolilo sustituido o sin sustituir, benzotiazolilo sustituido o sin sustituir, oxazolilo sustituido o sin sustituir, bencimidazolilo sustituido o sin sustituir, benzoxazolilo sustituido o sin sustituir, isoxazolilo sustituido o sin sustituir, bencisoxazolilo sustituido o sin sustituir, triazolilo sustituido o sin sustituir, benzotriazolilo sustituido o sin sustituir, quinolinilo sustituido o sin sustituir, isoquinolinilo sustituido o sin sustituir, quinazolinilo sustituido o sin sustituir, pirimidinilo sustituido o sin sustituir, N-óxido de piridinilo sustituido o sin sustituir o un heteroarilo sustituido o sin sustituir de 5 o 6 -miembros con al menos un nitrógeno anular (por ejemplo un doble enlace C-N) , opcionalmente fusionado a un heteroarilo de 5 ó 6 miembros. En algunas modalidades, en donde los sustituyentes en la frase anterior están sustituidos, el sustituyente es R15-sustituido.
Además, con respecto a los compuestos con la estructura de la Fórmula II, en algunas modalidades, L1, L4 y L5 son, de manera independiente, un enlace y R1 es R7-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R7-arilo sustituido o sin sustituir o R7-heteroarilo sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, R7 es, de manera independiente, -NH2, R8 alquilo sustituido o sin sustituir, R8-arilo sustituido o sin sustituir, R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir o -L6-R7A. L6 puede ser -C(0)-. R7A puede ser R8 alquilo sustituido o sin sustituir, R8-arilo sustituido o sin sustituir, R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R8 puede ser -OH o R9-alquilo sustituido o sin sustituir. R4 puede ser hidrógeno o R15-alquilo sustituido o sin sustituir y R3 puede ser hidrógeno o R23-alquilo sustituido o sin sustituir. R3 y R4 pueden ser, de manera opcional, ser juntados con X para formar un heterocicloalquilo de 4-7 miembros (por ejemplo de 5-7 miembros) (por ejemplo una especie R23 sustituida del mismo) .
En algunas modalidades, R7 es R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir o -L6-R7A. L4 puede ser -C(0)- y R7A es R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir. R7, R8, L6, RA son como se definen más arriba.
En algunas modalidades, en el compuesto que tiene la estructura de la Fórmula I o II, R1 es R7-fenilo sustituido. En algunas modalidades relacionadas, R7 es R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir o -L6-R7A. L6 puede ser -C(0)-, y R7A puede ser R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir. En otras modalidades de la Fórmula II, R3 y R4 son hidrógeno.
En algunas modalidades, R7 es R8-purinilo, sustituido o sin sustituir, R8-pirimidinilo sustituido o sin sustituir, R8-imidazolilo sustituido o sin sustituir, R8-sustituido o sin sustituir lH-pirrolo [2 , 3-b] piridinilo, R8-pirimidinilo sustituido o sin sustituir, R8-lH-indazolilo, sustituido o sin sustituir, R8- 7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidinilo sustituido o sin sustituir. R7 puede ser también R8- pirrolopirimidinilo sustituido o sin sustituir, R8-indolilo sustituido o sin sustituir, R8-pirazolilo sustituido o sin sustituir, R8-indazolilo sustituido o sin sustituir, R8- imidazolilo sustituido o sin sustituir, R8-tiazolilo sustituido o sin sustituir, R8-benzotiazolilo sustituido o sin sustituir, R8-oxazolilo sustituido o sin sustituir, R8-bencimidazolilo sustituido o sin sustituir, R8-benzoxazolilo sustituido o sin sustituir, R8-isoxazolilo sustituido o sin sustituir, R8-bencisoxazolilo sustituido o sin sustituir, R8-triazolilo sustituido o sin sustituir, R8-benzotriazolilo sustituido o sin sustituir, R8-quinolinilo sustituido o sin sustituir, R8-isoquinolinilo sustituido o sin sustituir, R8-quinazolinilo sustituido o sin sustituir, R8-pirimidinilo sustituido o sin sustituir, R8-N-óxido de piridinilo sustituido o sin sustituir, R8-furanilo sustituido o sin sustituir, R8-tiofenilo sustituido o sin sustituir, R8-benzofuranilo sustituido o sin sustituir, R8-benzotiofenilo sustituido o sin sustituir, R8- imidazo [1 , 2b] piridazinilo sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, R1 es R8-heteroarilo de anillos fusionados 6,5, sustituidos o sin sustituir, R8-heteroarilo de anillos fusionados 5,6, sustituidos o sin sustituir, R8- heteroarilo de anillo fusionados 5,5, sustituidos o sin sustituir o R8- heteroarilo de anillos fusionados 6,6, sustituidos o sin sustituir. En otras modalidades, R1 es un R8-heteroarilo de 5 ó 6 miembros, sustituido o sin sustituir, que tiene por lo menos 2 (por ejemplo 2 a 4) nitrógenos anulares.
En algunas modalidades, R7 es -L4-R7A y R7A es R8- 1H-pirrolo [2 , 3 -b] piridinilo, sustituido o sin sustituir.
En algunas modalidades, X es N y R1 es R7-heterocicloalquilo de 6 miembros sustituido. R7 puede ser R8-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R1 puede ser R7-piperidinilo sustituido. R7 puede ser R8-purinilo, sustituido o sin sustituir, R8-pirimidinilo sustituido o sin sustituir, R8- imidazolilo sustituido o sin sustituir, R8- 1H-pirrólo [2 , 3-b] iridinilo, sustituido o sin sustituir, R -pirimidinilo sustituido o sin sustituir, R8- lH-indazolilo, sustituido ó sin sustituir o R8- 7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidinilo, sustituido o sin sustituir . En algunas modalidades, R3 y R4 son hidrógeno.
En otras modalidades, R1 es R7-heteroarilo de anillos fusionados 6,5, sustituidos o sin sustituir, o R7-heteroarilo de anillos fusionados 5,6 sustituidos o sin sustituir. R7 puede ser -NH2, R8 alquilo sustituido o sin sustituir, R8-arilo sustituido o sin sustituir y R8 es, de manera independiente, -OH o alquilo sin sustituir. En otras modalidades, R1 es R7-indazolilo, sustituido o sin sustituir o R7-7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidinilo, sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, R3 y R4 son hidrógeno.
En algunas modalidades de los compuestos que tienen las estructuras de la Fórmula I o II, R1 es R7-indazol sustituido o sin sustituir o R7- 7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidinilo, sustituido o sin sustituir, R3 es alquilo sin sustituir y R4 es hidrógeno. En otras modalidades, R3 es fenilmetilo y R4 es hidrógeno. En algunas modalidades, R3 y R4 se juntan con N para formar un R23-pirrolidinilo, sustituido o sin sustituir.
En algunas modalidades los compuestos contemplados que tienen la estructura de la Fórmula I o II, X es 0, R1 es R7-heteroarilo de anillos fusionados 6,5, sustituidos o sin sustituir o R7-heteroarilo de anillos fusionados 5,6, sustituidos o sin sustituir. R7 puede ser -NH2, R8 alquilo, sustituido o sin sustituir o R8-arilo sustituido o sin sustituir. R8 puede ser -OH o alquilo sin sustituir y R3 puede ser alquilo sin sustituir. En ciertas otras modalidades, R1 es R7- 7H-pirrolo [2 , 3 -d] irimidina, sustituido o sin sustituir y R7 es -NH2, R3 alquilo sustituido o sin sustituir o R8-fenilo sustituido o sin sustituir.
En algunas modalidades, el sustituyente -C(0)X(L4-R3)Z(L5-R4) de la Fórmula II es un grupo aceptor de electrones. Por lo tanto, el -C (0) X (L4-R3) z (L5-R4) es capaz de retirar la carga negativa del resto de olefina al cual se encuentra unido. En algunas modalidades, el -C (0) X (L4-R3) z (L5-R4) es capaz de retirar suficientemente la carga negativa del resto de olefina al cual de encuentra unido, para permitir la formación de un aducto del tiol entre un carbón olefínico y el sulfhidrilo de la cisteína el sitio activo de la cinasa, tal como se discutió más arriba.
En algunas modalidades de la Fórmula I y de la Fórmula II, R1 es heteroarilo sustituido o sin sustituir. En otras modalidades, R1 es pirazolopirimidinilo, sustituido o sin sustituir (por ejemplo R7- pirazolopirimidinilo, sustituido o sin sustituir) . En otras modalidades, R1 es pirrolopirimidinilo, sustituido o sin sustituir (por ejemplo R7- pirrolopirimidinilo, sustituido o sin sustituir pirrolopirimidinilo) .
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: (Illa) .
En la Fórmula Illa, z es un entero desde 1 hasta 4. L1, L2 y R7 son como se definen más arriba. En algunas modalidades, L1 es un enlace.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: (nib) .
En la Fórmula Illb, z es un entero desde 1 hasta 4. L1, L2, R3 , R4 y R7 son como se definen más arriba. En algunas modalidades, L1 es un enlace.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: (IIIc) .
En la Fórmula IIIc, W es -C(0)- o -S(0)2-, z es un entero desde 1 hasta 4. L1, R3, R4 y R7 son como se definen más arriba. En algunas modalidades, L1 es un enlace.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: (Illd) .
En la Fórmula Illd, W es -C(0)- o -S(0)2-, z es un entero desde 1 hasta 4. L1, L2, R3, R4 y R7 son como se definen más arriba. En algunas modalidades, L1 es un enlace. En alguna modalidad, el inhibidor de cinasas es el compuesto 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: (Ule) .
En la Fórmula lile, W es -C(0)- o -S(0)2-, w es un entero desde 1 hasta 5 (por ejemplo 1) . L1, L2, R3, R4, R7 y R8 son como se definen más arriba.
En otra modalidad de la Fórmula I o de la Fórmula II, L1 es arileno, sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, L1 es fenileno, sustituido o sin sustituir.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: En la Fórmula IVa, R1 , L2 , E y R11 son como se definen más arriba. El símbolo q es un entero desde 1 hasta 4. En algunas modalidades R11 es hidrógeno. En algunas modalidades, R1 es heteroarilo, sustituido o sin sustituir. En otras modalidades, R1 es pirrolopirimidina , sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades de la Fórmula IVa, R1 es heteroarilo, sustituido o sin sustituir, q es 0 y L1 es fenileno sustituido o sin sustituir .
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: En la Fórmula IVb, R7 , L2 , E y R11 son como se definen más arriba. El símbolo q es un entero desde 0 hasta 4. En algunas modalidades, R es hidrógeno, símbolo z es un entero desde 1 hasta 4.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: (IVc) .
En la Fórmula IVc, R7 , L2 y E son como se definen más arriba. El símbolo z es un entero desde 1 hasta 4. En otras modalidades, E es -NR3R4 (tal como se definió más arriba) .
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: (IVd) .
En la Fórmula IVd, R7 , L2 , R3 y R4 son como se definen más arriba. El símbolo z es un entero desde 1 hasta 4. En otras modalidades, L2 es -C(0)-.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: ( IVe) .
En la Fórmula IVe, W es -C(0)- o -S(0)2-, R? , R3 y R4 son como se definen más arriba. El símbolo z es un entero desde 1 hasta 4. En algunas modalidades, R7 es, de manera independiente, - H2 o arilo sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, uno de R7 es -NH2, y otro R7 es arilo sustituido.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: (IVf ) .
En la Fórmula IVf, W es -C(0)- o -S(0)2-, R7 , R3 y R4 son como se definen más arriba. En ciertas otras modalidades, R3 y R4 son, de manera independiente, hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir o se juntan para formar un heteroalqui lo sustituido o sin sustituir. R7 puede ser fenilo sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas es el compuesto 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 ó 61.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: (Va) .
En la Fórmula (Va), R1 , L2 y E son como se definen más arriba. En algunas modalidades, E es -NR3R4 (tal como se definió más arriba) . L2 puede ser -C(O) - .
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: (Vb) En la Fórmula Vb, W es -C(0)- o -S(0)2-, R1, R3 y R4 son como se definen más arriba. En algunas modalidades, R1 es alquilo sustituido.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura: (Ve) .
En la Fórmula Ve, W es -C(0)- o -S(0)2- y R3 y R4 son como se definen más arriba. En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas es el compuesto 38 ó 39.
En algunas modalidades, R1 es indazolilo, sustituido o sin sustituir y el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula Vía siguiente, en donde R7 es como se define en la presente.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas tiene la (Vía) .
En la Fórmula Vía, L2 , E y R7 son como se definen más arriba. El símbolo z es un entero desde 1 hasta 4.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas tiene la Fórmula: (vib) .
En la Fórmula VIb, W es -C(0) - o -S(0)2-, 3 , R4 y R7 son como se definen más arriba. El símbolo z es un entero desde 1 hasta 4.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas tiene la Fórmula: (VIc) .
En la Fórmula VIc, W es -C(0)- o -S(0)2-, R3, R4 y R7 son como se definen más arriba. En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas es el compuesto 37, 40, 41 ó 42.
En otra modalidad de la Fórmula I, L1 es •heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, L2 es -C(0)-. En otras modalidades, R1 es heteroarilo, sustituido o sin sustituir, E es -NR3R4. En algunas modalidades, L1 es piperidinilo . En otras modalidades, R1 es purinilo.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas tiene la Fórmula: (VII) .
En la Fórmula (VII), W es -C(0)- o -S(0)2- y R3 y R4 son como se definen más arriba. En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas es el compuesto 36.
El inhibidor de cinasas puede ser un inhibidor de cinasas reversible (tal como se discute en la presente) . En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas es un inhibidor de cinasas reversible desnaturalizado (tal como se discute en la presente) . En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas es un inhibidor de cinasas reversible covalente (tal como se discute en la presente) . En otras modalidades, el inhibidor de cinasas es un inhibidor de cinasas reversible covalente desnaturalizado (tal como se discute en la presente) . Y en algunas modalidades, el inhibidor de cinasas es un inhibidor de cinasas reversible covalente desnaturalizado de tioles (tal como se discute en la presente) .
En algunas modalidades, los compuestos de las Fórmulas proporcionadas en la presente y las modalidades de las mismas, son estables a pH 7,5 (por ejemplo, en solución salina amortiguador fosfato a 37°C) . En algunas modalidades, en donde el compuesto de la Fórmula I o II y sus modalidades, son estables a pH 7,5, el compuesto tiene una vida media mayor a las 6 horas, 12 horas, 24 horas o 48 horas. En algunas modalidades, en donde los compuestos de las Fórmulas proporcionadas en la presente y sus modalidades, son estables a pH 7,5, el compuesto tiene una vida media mayor a las 12 horas. En algunas modalidades, en donde los compuestos de las Fórmulas proporcionadas en la presente, y sus modalidades, son estables a pH 7,5, el compuesto tiene una vida media mayor a las 24 horas. En algunas modalidades, en donde los compuestos de las Fórmulas proporcionadas en la presente y sus modalidades, son estables a pH 7,5, el compuesto tiene una vida media mayor a las 48 horas y sus modalidades, exhiben inhibición a las cinasas adentro de una célula. En algunas modalidades, la célula es procariota o eucariota. La célula puede ser una eucariota (por ejemplo, células de protozoos, células de hongos, células de plantas o una célula animal). En algunas modalidades, la célula es una célula de mamíferos tal como una célula humana, una célula vacuna, una célula porcina, una célula equina, una célula canina, una célula felina, una célula de ratón o una célula de rata. En algunas modalidades, la célula es una célula humana. La célula puede formar parte de un órgano o de un organismo. En algunas modalidades, la célula no forma parte de un órgano o de un organismo.
En algunas modalidades, cada grupo sustituido descrito arriba en los compuestos de las Fórmulas proporcionadas en la presente es sustituido con, por lo menos, un grupo sustituyente . Mas específicamente, en algunas modalidades, cada alquilo sustituido, heteroalquilo sustituido, cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo sustituido, arilo sustituido, heteroarilo sustituido, alquileno sustituido, heteroalquileno sustituido, cicloalquileno sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir, arileno sustituido o sin sustituir o heteroarileno sustituido o sin sustituir descrito más arriba en los compuestos de las Fórmulas proporcionadas en la presente, es sustituido con, por lo menos, un grupo sustituyente . En otras modalidades, por lo menos uno, o todos estos grupos están sustituidos con, por lo menos, grupo sustituyente limitado por el tamaño. Alternativamente, por lo menos uno, o todos estos grupos están sustituidos con, por lo menos, un grupo sustituyente inferior.
En otras modalidades de los compuestos de las Fórmulas proporcionadas en la presente, cada alquilo sustituido o sin sustituir es un alquilo Ci-C2o/ sustituido o sin sustituir, cada heteroalquilo sustituido o sin sustituir es un heteroalquilo de 2 a 20 miembros, sustituido o sin sustituir, cada cicloalquilo sustituido o sin sustituir es un cicloalquilo C4-Ce/ sustituido o sin sustituir, cada heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir es un heterocicloalquilo, 4 a 8 miembros, sustituido o sin sustituir, cada alquileno sustituido o sin sustituir es un alquileno Ci-C2o, sustituido o sin sustituir, cada heteroalquileno sustituido o sin sustituir es un heteroalquileno de 2 a 20 miembros, sustituido o sin sustituir, cada cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, es un cicloalquileno C4-C8 sustituido o sin sustituir y cada heterocicloalquileno sustituido o sin sustituir es un heterocicloalquileno de 4 a 8 miembros, sustituido o sin sustituir .
Alternativamente, cada alquilo sustituido o sin sustituir es un alquilo Ci-C8, sustituido o sin sustituir, cada heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, es un heteroalquilo de 2 a 8 miembros, sustituido o sin sustituir, cada cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, es un cicloalquilo C5-C7, sustituido o sin sustituir, cada heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, es un heterocicloalquilo de 5 a 7 miembros, sustituido o sin sustituir, cada alquileno, sustituido o sin sustituir, es un alquileno Ci-C8, sustituido o sin sustituir, cada heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, es un heteroalquileno de 2 a 8 miembros, sustituido o sin sustituir, cada cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, es un cicloalquileno C5-C6, sustituido o sin sustituir y cada heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, es un heterocicloalquileno de 5 a 7 miembros, sustituido o sin sustituir .
En algunas modalidades, los compuestos de las Fórmulas proporcionadas en la presente son uno o más de los compuestos que se establecen en la Tabla 1 y/o en las Tablas 2a-2e de más abajo. En otras modalidades, el compuesto es uno o más de los siguientes: ?? 75 76 77 En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula VIII: (VIII) En la Fórmula VIII y las otras Fórmulas proporcionadas en la presente, el anillo A es un heteroarilo sustituido o sin sustituir, tal como un R31-heteroarilo, sustituido o sin sustituir. R1 y L1 son como se definen más arriba.
R31 es R23A tal como se definió más arriba o es hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, - H2, -COOH, -CF3 R33-alquilo, sustituido o sin sustituir, R33-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R33-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R33-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R33-arilo, sustituido o sin sustituir o R33-heteroarilo, sustituido o sin sustituir.
R33 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -N¾, -COOH, -CF3, R34-alquilo, sustituido o sin sustituir, R34-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R34-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R34-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R34-arilo, sustituido o sin sustituir o R34-heteroarilo, sustituido o sin sustituir.
R34 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R35-alquilo, sustituido o sin sustituir, R35-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R35-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R3-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R35-arilo, sustituido o sin sustituir o R35-heteroarilo, sustituido o sin sustituir.
R35 es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula IX: (IX) En la Fórmula IX, el anillo A es un heteroarilo, sustituido o sin sustituir, tal como un R31-heteroarilo, sustituido o sin sustituir, tal como se estableció más arriba. R1 y L1 son como se definen más arriba.
En algunas modalidades de las Fórmulas VIII y IX de más arriba, el anillo A es R31-heteroarilo, sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades de las Fórmulas VIII y IX de más arriba, el anillo A es un R31-heteroarilo de 5 miembros, sustituido o sin sustituir o un R31-heteroarilo de 6 miembros, sustituido o sin sustituir.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula Xa: (Xa) En la Fórmula Xa, X1 es -C(R31R32)-, -N(R31)-, -S- o -O- cuando Xi no es el punto de unión. Cuando Xx es el punto de unión, entonces Xi es C(R31) o N. X2, X3, X4 y X5 son, de manera independiente, -C(R31)= o -N= cuando no son el punto de unión. Cuando X2, X3, X4 o X5 es el punto de unión, entonces el X , X3, X4 o X5 que es el punto de unión es C. Por lo menos uno de Xi, X2, X3, X4 y X5 no es carbono (es decir, no es -C(R31R32)-, C(R31) o -C(R31)= según sea adecuado). Por ejemplo, en algunas modalidades, por lo menos uno de ??, X2, X3, X4 y X5 es nitrógeno (es decir, -N(R31)- o -N= según sea adecuado) . Por lo general, por lo menos 2 de Xlf X2, X3, X4 y X5 es un carbono (por ejemplo -C(R31R32)-, C(R31) o -C(R31)=) .
R31 es como se define más arriba. R32 es hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2í -C00H, -CF3, R33-alquilo sustituido o sin sustituir, R33-heteroalquilo sustituido o sin sustituir, R33-cicloalquilo sustituido o sin sustituir, R33-heterocicloalquilo sustituido o sin sustituir, R33-arilo sustituido o sin sustituir o R33-heteroarilo sustituido o sin sustituir. R33 se define como se revela más arriba.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula Xb: (Xb - ) (Xb1 ' ) En la Fórmula Xb' es C(R31) o N. X2, X3, X4 y 5 son de manera independiente, -C(R31)= o -N=, siempre que, sin embargo, por lo menos uno de Xi, X2, X3, X4 y X5 sea N. Por lo general, al menos 2 de Xlf X2, X3, X4 y X5 es un carbono. En la Fórmula Xb", ¾ es C. ¾ es -C(R31R32)-, -N(R31)-, -S- o -O- . X3/ X4 y ¾ son, de manera independiente, -C(R31)= o -N= , siempre que, sin embargo, por lo menos uno de Xi, X3, X4 y X5 no sea carbono. L1, R1 y R31 se definen como se revela más arriba. Por lo general, por lo menos uno de Xl X3, X4 y X5 es carbono .
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula Xc : (Xc) En la Fórmula Xc, X3 y X5 son, de manera independiente y -C(R31)=. L1, R1 y R31 son como se definen más arriba.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula Xd: (Xd) En la Fórmula Xd, X3, X4 y X5 son, de manera independiente, -C(R31) = . L1, R1 y R31 se definen como se revela más arriba.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula Xe : (Xe) En la Fórmula Xe , X4 y X5 son, de manera independiente, -C(R31) = . X2 es C. L1, R1 y R31 son definidas como se revela más arriba.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula Xf : (Xf ) En la Fórmula Xf, X4 y X5 son, de manera independiente, -C(R31) = . L1 , R1 y R31 se definen como se revela más arriba.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula Xla: (Xla) En la Fórmula Xla, X6, X7, X8, Xg y Xio son, de manera independiente, -C(R31)=, -N= o +N O-, siempre que, sin embargo, por lo menos uno de X6, X7) X8, X9 y Xi0 sea N o +N O". L1, R1 y R31 se definen como se revela más arriba.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula Xlb: (Xlb) En la Fórmula Xlb, X6, X7, X9 y X10 son, de manera independiente, -C(R31) = . X8 es N o +N 0- . L1, R1 y R31 se definen como se revela más arriba.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas posee la estructura de la Fórmula XIc: (XIc) En la Fórmula XIc, X6, X8, X9 y Xi0 son, de manera independiente, -C(R31) = . X7 es N o +N O- . L1, R1 y R31 se definen como se revela más arriba.
En algunas modalidades de las Fórmulas VIII y IX de más arriba, el anillo A es R31- furilo, sustituido o sin sustituir, R31- tienilo, sustituido o sin sustituir, R31-pirrolilo sustituido o sin sustituir, R31- imidazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-pirazolilo sustituido o sin sustituir, R31-oxazolilo sustituido o sin sustituir, R31-isoxazolilo sustituido o sin sustituir, R31-tiazolilo sustituido o sin sustituir, R31- isotiazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-triazolilo sustituido o sin sustituir, R31-oxadiazolilo sustituido o sin sustituir, R31-piridilo sustituido o sin sustituir, R31- pirimidilo sustituido o sin sustituir, R31-piridazinilo, sustituido o sin sustituir, R31-pirrolinilo, sustituido o sin sustituir, R31- pirazinilo sustituido o sin sustituir, R31-tetrazolilo sustituido o sin sustituir, R31-furanilo sustituido o sin sustituir, R31-dihidrotieno-pirazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-tianaftenilo, sustituido o sin sustituir, R31-carbazolilo, sustituido o sin sustituir, R31- benzotienilo sustituido o sin sustituir, R31-benzofuranilo sustituido o sin sustituir, R31-indolilo sustituido o sin sustituir, R31-quinolinilo sustituido o sin sustituir, R31-benzotriazolilo sustituido o sin sustituir, R31-benzotiazolilo sustituido o sin sustituir, R31-sustituido o sin sustituir benzooxazolilo, R31-bencimidazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-isoquinolinilo, sustituido o sin sustituir, R31-isoindolilo, sustituido o sin sustituir, R31-acridinilo, sustituido o sin sustituir, R31- benzoisazolilo, sustituido o sin sustituir. R31 se define como se revela más arriba.
En algunas modalidades de las Fórmulas VIII, IX, Xa-Xf, y Xla-XIc de más arriba, R1 es R7-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R7-arilo, sustituido o sin sustituir, o R7-heteroarilo, sustituido o sin sustituir. L1 es un enlace .
En algunas modalidades, el compuesto de la Fórmula I es uno o más de los compuestos que se denotan en la Tabla 1, en las Tablas 2a-2e de más abajo o en los siguientes compuestos : Utilizando técnicas de síntesis química generalmente conocidas en el arte y las técnicas de síntesis establecidas en la sección correspondiente a los Ejemplos, una persona con conocimientos medios en la técnica sería capaz de sintetizar los compuestos de la Fórmula I. En otro aspecto, se proporciona un método para la elaboración de un inhibidor reversible de cinasas. El método incluye la etapa de modificar un inhibidor de cinasas conocido, reversible o no reversible, para incluir un sustituyente que tiene la Fórmula : W, L2, L4, L5, E, R3, R4, el anillo A, ??, X2, X3, X4, X5, 6, X7, X8, X9/ X10 y z son como se definen más arriba. El símbolo representa el punto de unión del sustituyente al remanente del compuesto o a un soporte sólido.
En otro aspecto, se proporciona un aducto de proteína que comprende una proteína unida a un inhibidor de cinasas proporcionado en la presente. En algunas modalidades, el aducto tiene la Fórmula: 25 90 , Los símbolos en las Fórmulas del aducto de proteína (por ejemplo W, E, R1, R3 , R\ R7, R11, anillo A, Xlt X2, X3, X4, X5, X6, X7, ?ß/ X9/ Xio etc.) son como se definieron anteriormente. El símbolo Q representa una proteína (por ejemplo, un péptido) . El azufre unido a Q normalmente forma parte de un aminoácido de cisteína. En algunas modalidades, la cisteína ligada a los compuestos inhibidores es Cys-481 de BTK, Cys-909 de JAK3 , o Cys-436 de RSK2.
III. Métodos de inhibición proteína cinasas En otro aspecto, se proporcionan métodos de inhibición de las proteínas cinasas. Los métodos incluyen poner en contacto una proteína cinasa con una cantidad efectiva de un inhibidor de cinasa provisto en la presente. El inhibidor de cinasas puede tener la estructura de las Fórmulas provistas en la presente (o cualquiera de sus modalidades descritas anteriormente). En algunas modalidades, los métodos de inhibición de una proteína cinasa se llevan a cabo dentro de una célula. En consecuencia, en ciertas modalidades, se proporcionan métodos de inhibir una proteína cinasa dentro de una célula. El método incluye poner en contacto una célula con una cantidad efectiva de un inhibidor de cinasa tal como los proporcionados en la presente. El inhibidor de cinasa puede tener la estructura de las Fórmulas provistas en la presente (o cualquiera de sus modalidades descritas anteriormente) . En algunas modalidades, la célula es una procariota o una eucariota. La célula puede ser una eucariota (por ejemplo una célula de protozoario, una célula fúngica, una célula vegetal o una célula animal) . En algunas modalidades, la célula es una célula de mamífero tal como una célula humana, una célula de vaca, una célula de cerdo, una célula de caballo, una célula de perro y una célula de gato, una célula de ratón o una célula de rata. En algunas modalidades, la célula es una célula humana. La célula puede formar parte de un órgano o un organismo. En ciertas modalidades, la célula no forma parte de un órgano o de un organismo .
El inhibidor de cinasas puede ser un inhibidor de cinasas reversible. Un inhibidor de cinasas reversible es un inhibidor de cinasas, tal como los que se describen en la presente (por ejemplo los compuestos de las Fórmulas provistos en la presente y sus modalidades) , que es capaz de disociarse de manera medible de la proteína cinasa, cuando la proteína cinasa está intacta (es decir, no desnaturalizada) o desnaturalizada (por ejemplo parcialmente desnaturalizada o completamente desnaturalizada) . Una cinasa "desnaturalizada" es una cinasa sin suficiente estructura terciaria o secundaria, como para retener la actividad de cinasa. Una cinasa "intacta" es una cinasa con suficiente estructura terciaria o secundaria como para retener la actividad de cinasa. En consecuencia, en algunas modalidades, el método de inhibir una proteína cinasa incluye poner en contacto una proteína cinasa con un inhibidor de cinasas reversible y permitir al inhibidor de cinasas reversible unirse de forma reversible a un resto de cisteína del sitio activo, inhibiendo de este modo la proteína cinasa.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas reversible se disocia de modo medible de la proteína cinasa únicamente cuando la proteína cinasa está desnaturalizada y no se disocia de modo medible de la proteína cinasa cuando la proteína cinasa está intacta (o se disocia al menos 1, lxlO2, lxlO3, lxlO4, lxlO5, lxlO6, lxlO7, lxlO8, lxlO9, lxlO10 veces más lento con respecto a la disociación cuando la proteína cinasa está desnaturalizada) . Un inhibidor de cinasas reversible que se disocia de manera medible (o que se disocia al menos 1, lxlO2, lxlO3, lxlO4, lxlO5, lxlO6, lxlO7, lxlO8, lxlO9, lxlO10 veces más lento con respecto a la disociación cuando la proteína cinasa está desnaturalizada) de la proteína cinasa únicamente cuando la proteína cinasa está desnaturalizada y que no se disocia de manera medible de la proteína cinasa cuando la proteína cinasa está intacta, se denomina en la presente como un "inhibidor de cinasas desnaturalizadas reversible" . Después de disociar de la cinasa, el inhibidor de cinasas desnaturalizadas reversible puede unirse a la misma u a otra cinasa.
En ciertas modalidades, el método de inhibición de la proteína cinasa incluye poner en contacto a la proteína cinasa con un inhibidor de cinasas, en donde el inhibidor de cinasas inhibe a la proteína cinasa con una constante de inhibición menor quelOO nM. Cuando el inhibidor de proteína cinasa es un inhibidor de proteína-' cinasa reversible, el método de inhibición de la proteína cinasa incluye poner en contacto la proteína cinasa con un inhibidor de cinasa reversible, en donde el inhibidor de cinasa reversible inhibe la proteína cinasa con una constante de inhibición menor que 100 nM.
Cuando una cinasa (también denominada en la presente como una proteína cinasa) es inhibida mediante un inhibidor de cinasas descrito en la presente, significa que la actividad de la cinasa (es decir, la fosforilación de una molécula del sustrato (por ejemplo, un sustrato de proteína) ) disminuye cuando se pone en contacto con el inhibidor de cinasas con respecto a la actividad de la cinasa en ausencia del inhibidor de cinasas. En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas disminuye la actividad de las cinasas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 5000, 10.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, o más veces. En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas inhibe la actividad de la cinasa con una constante de inhibición (K ) menor que 100 µ?, 10 µ?, 5 µ?, 1 µ?, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, 25 nM, 10 nM, 1 nM, 500 M, 250 pM, 100 pM, 75 M, 50 pM, 25 pM, 10 pM o 1 pM. En algunas modalidades, el inhibidor de cinasa inhibe la actividad de la cinasa con una IC50 menor que 100 µ?, 10 µ?, 5 µ?, 1 µ?, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, 25 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 100 pM, 75 pM, 50 ???*, 25 pM, 10 pM, o 1 M, cuando se mide en las condiciones expuestas en la sección correspondiente a los ej emplos .
Cuando un inhibidor de cinasa reversible provisto en la presente se une en forma reversible a un resto de cisteína del sitio activo, se forma un enlace reversible entre el resto de cisteína del sitio activo y el inhibidor de cinasa reversible. El enlace reversible es, por lo general, un enlace covalente. Un "inhibidor de cinasas reversible covalente" tal como se usa en la presente, se refiere a un inhibidor de cinasa reversible que forma un enlace covalente con la cinasa. Cuando el inhibidor de cinasa reversible covalente forma un enlace reversible con un resto de cisteína del sitio activo, el inhibidor de cinasa reversible covalente se denomina en la presente como un "inhibidor de cinasas reversible covalente de tiol" . En algunas modalidades, el inhibidor de cinasas reversible covalente se disocia de modo medible de la proteína cinasa únicamente cuando la proteína cinasa está desnaturalizada, pero no se disocia de modo medible (o se disocia al menos 1, lxlO2, lxlO3, lxlO4, lxlO5, lxlO6, lxlO7, lxlO8, lxlO9, lxlO10 veces más lento con respecto a la disociación cuando la proteína cinasa está completamente o parcialmente desnaturalizada) de la proteína cinasa, cuando la proteína cinasa está intacta (denominada en la presente como un "inhibidor de cinasas desnaturalizada reversible covalente"). En algunas modalidades, la proteína cinasa está desnaturalizada (es decir, no intacta) cuando se coloca en una solución desnaturalizante, tal como guanidina 6 N, SDS 1%, MeCN 50% o un desnaturalizante de proteína similar, durante segundos o minutos (por ejemplo, 30 a 120 segundos, tales como 60 segundos) . Un inhibidor de cinasa desnaturalizada reversible covalente que forma un enlace reversible con un resto de cisteína del sitio activo se denomina "inhibidor de cinasa desnaturalizada reversible covalente de tiol." En algunas modalidades, el inhibidor de cinasa reversible covalente de tiol forma un enlace entre los grupos sulfhidrilo de la cisteína y un átomo de carbono que forma parte del enlace doble carbono-carbono (es decir, de olefina) del compuesto de las Fórmulas provistas en la presente. En consecuencia, en algunas modalidades, los electrones del átomo de azufre del grupo sulfhidrilo de la cisteína del sitio activo ataca un átomo de carbono deficiente en electrones del enlace doble carbono-carbono (de olefina) . En algunas modalidades, el átomo de carbono deficiente en electrones del enlace doble carbono-carbono es distal al grupo ciano aceptor de electrones y al sustituyente -L2-E aceptor de electrones del inhibidor de cinasa de las Fórmulas provistas en la presente y sus modalidades (es decir, el carbono unido a -I^-R1) . De esta manera, se forma un aducto de tiol (por ejemplo, una reacción de ichael con cisteína) . En consecuencia, en algunas modalidades, la combinación de ciano y los grupos aceptores de electrones -L2-E unidos al resto olefínico aumenta la reactividad de la oléfina para formar un aducto de tiol con el resto de cisteína del sitio activo. En algunas modalidades, el aducto de tiol resultante es estable a desde aproximadamente pH 2 a aproximadamente pH 7 (por ejemplo aproximadamente pH 3) . En algunas modalidades, los inhibidores de cinasas reversibles descritos en la presente, después de la unión covalente al resto de cisteína del sitio activo de cinasa como se describe en la presente, son capaces de disociarse de las cinasas dentro de segundos o minutos después de la desnaturalización/desplegado de la cinasa con guanidina 6 N, SDS 1%, MeCN 50%, o un desnaturalizante de proteína similar.
En algunas modalidades, además de aumentar la reactividad de la olefina hacia el grupo sulfhidrilo de la cisteína del sitio activo, el ciano y los grupos aceptores de electrones -L2-E actúan para aumentar la reversibilidad de aducto de tiol que se forma. En consecuencia, en algunas modalidades, los inhibidores de cinasas reversibles expuestos en la presente son completamente reversibles. El término "completamente reversible" significa que el inhibidor de cinasas reversible exhibe una tasa de disociación medible en condiciones en que la cinasa no está desnaturalizada. En algunas modalidades, los inhibidores de cinasa provistos en la presente no son completamente reversibles (es decir, no exhiben una tasa de disociación medible en las condiciones en que la cinasa está intacta) . La disociación se puede medir mediante algunos medios apropiados, entre los que se incluyen la diálisis y la espectrometría de masa. Los métodos específicos para medir la disociación se exponen en la siguiente de Ejemplos de más abajo.
En algunas modalidades, el inhibidor de cinasa desnaturalizada reversible se une de modo reversible a componentes celulares diferentes a la proteína cinasa inhibida por el inhibidor de cinasa desnaturalizada reversible (o inhibe específicamente) . Los componentes celulares pueden ser GSH, proteínas o fragmentos de proteína que no son cinasas específicas (por ejemplo, una cinasa que no incluye una cisteína en el sitio activo o que no incluye una cisteína del sitio activo en proximidad suficiente a un sitio de unión al ATP) , fragmentos de proteína de las cinasas específicas (por ejemplo, una cinasa que ha sido digerida de manera que el número de puntos de enlace al inhibidor de cinasa desnaturalizada reversible ha disminuido de manera tal que el inhibidor de cinasa desnaturalizada reversible se disocie de la cinasa) . En consecuencia, en algunas modalidades, el inhibidor de cinasa desnaturalizada reversible se disocia de manera medible de la cinasa, cuando la cinasa está parcial o completamente digerida. La capacidad de un inhibidor de cinasa desnaturalizada reversible para disociarse de manera medible de componentes celulares diferentes de la proteína cinasa de longitud completa inhibida por el inhibidor de cinasa desnaturalizada reversible, puede proporcionar una disminución de la toxicidad, tal como una disminución de la toxicidad inmunogénica . En ciertas modalidades, el grupo -iZ-R1 del inhibidor de cinasa desnaturalizada reversible es un resto del sitio de unión al ATP de la cinasa y el carbono olefínico deficiente en electrones se une al sulfhidrilo de una cisteína del sitio activo de la cinasa. En consecuencia, en algunas modalidades, los inhibidores de cinasas provistos en la presente se unen, al menos, a dos puntos de la proteína cinasa: al menos un resto dentro de la porción del sitio de unión al ATP y un sulfhidrilo de una cisteína del sitio activo de la cinasa.
En algunas modalidades, las concentraciones fisiológicas de glutatión (por ejemplo 5 o 10 mM de GSH) tienen poco o ningún efecto medible sobre la capacidad de los inhibidores de cinasas reversibles (por ejemplo, los proporcionados en la presente para inhibir una proteína cinasa, por ejemplo, un inhibidor de cinasa desnaturalizada reversible únicamente se une de manera reversible a una GSH, permitiendo la unión aumentada a la cinasa blanco) . En algunas modalidades, la IC50 o Ki del inhibidor de cinasa reversible aumenta no más de 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,01% o 0,001% en presencia de concentraciones fisiológicas de glutatión (por ejemplo 5 o 10 mM de GSH) . En otras modalidades, la IC50 o Ki del inhibidor de cinasa reversible no aumenta de modo medible por la presencia de concentraciones fisiológicas de glutatión (por ejemplo 5 o 10 mM de GSH) . En algunas modalidades, las concentraciones fisiológicas de glutatión (por ejemplo 5 o 10 mM de GSH) tienen poco o ningún efecto medible sobre la capacidad de los inhibidores de cinasas reversibles provistos en la presente para inhibir una proteína cinasa cuando el inhibidor de cinasa reversible está presente en concentraciones bajas (por ejemplo menos de 100 nM, 75 nM, 50 nM, 25 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 100 pM, 75 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM o 1 pM) . En algunas modalidades, las concentraciones fisiológicas de glutatión (por ejemplo 5 o 10 mM GSH) tienen poco o ningún efecto medible sobre la capacidad de los inhibidores de cinasas reversibles provistos en la presente para inhibir una proteína cinasa cuando el inhibidor de cinasas reversible está presente a una concentración de menos de 10 nM, 5 nM, 4 nM 3 nM, 2 nM o 1 nM. En ciertas modalidades, las concentraciones fisiológicas de glutatión (por ejemplo 5 o 10 mM GSH) tienen poco o ningún efecto medible sobre la capacidad de los inhibidores de cinasa reversible provistos en la presente para inhibir una proteín .
En algunas modalidades, la concentraciones fisiológicas de adenosina trifosfato (por ejemplo 1 mM de ATP) tienen poco o ningún efecto medible sobre la capacidad de los inhibidores de cinasa reversible provistos en la presente para inhibir una proteína cinasa. En algunas modalidades, la IC50 o K¿ del inhibidor de cinasa reversible aumenta no más del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,01% o 0,001%, en presencia de concentraciones fisiológicas de adenosina trifosfato (por ejemplo 1 mM de ATP) . En otras modalidades, la IC50 o Ki del inhibidor de cinasa reversible no aumenta de modo medible por la presencia de concentraciones fisiológicas de adenosina trifosfato (por ejemplo 1 mM de ATP) .
En ciertas modalidades, los inhibidores de cinasa reversible provistos en la presente reaccionan de modo reversible con GSH. En ciertas modalidades, los inhibidores de cinasas reversibles provistos en la presente reaccionan de modo rápido y reversible con GSH. En consecuencia, en ciertas modalidades, los inhibidores de cinasas reversibles provistos en la presente reaccionan de manera reversible con GSH (por ejemplo de manera rápido y reversible) a la vez que también se unen de modo reversible a un resto de cisteína del sitio activo (por ejemplo a una concentración de menos de 10 nM, 5 nM, 4 nM 3 nM, 2 nM o 1 nM) . El GSH puede estar en concentración fisiológica (por ejemplo 5-10 mM) . Sin estar ligado por ninguna teoría mecanística particular, se considera que la capacidad de los inhibidores de cinasas reversibles provistos en la presente para reaccionar de modo rápido y reversible con el glutatión celular protege a la mayoría de las proteínas celulares no específicas, de las cualidades electrofílicas del inhibidor de cinasa reversible.
La proteína cinasa puede ser cualquier cinasa adecuada. En algunas modalidades, la proteína cinasa incluye un resto de cisteína en el sitio activo. Un sitio activo de la proteína cinasa es una porción de la proteína cinasa en la que se fosforila el sustrato de la proteína cinasa. El sitio activo de la cinasa active es normalmente una región o un fisura que contiene a los restos de aminoácidos que se unen a un sustrato (también denominados en la presente como restos de unión del sitio activo de cinasa) y restos de aminoácidos que participan en la reacción de fosforilación catalítica (también denominada en la presente como restos catalíticos del sitio activo de cinasa) . Los inhibidores de cinasa reversible provistos en la presente son capaces de inhibir la acción catalítica de las cinasas por el ajuste en el sitio activo de la cinasa alterando la capacidad de la cinasa para fosforilar el sustrato. Los sitios activos de muchas proteína cinasas son conocidos en la técnica a través de determinaciones estructurales (por ejemplo, por técnicas de cristalografía de rayos X o RMN tridimensional) .Cuando la estructura tridimensional no se ha determinado, la estructura de un sitio activo de una proteína cinasa se puede determinar por la secuencia de aminoácidos primaria, utilizando programas de modelado por software de computadora generalmente conocidos en la técnica.
Las proteína cinasas inhibidas mediante los inhibidores de cinasas provistos en la presente incluyen, pero no están limitados por, las proteína cinasas específicas de serina-treonina, las proteína cinasas específicas de tirosina, las cinasas del receptor de tirosina, cinasas asociadas al receptor de tirosina, proteína cinasas específicas de histidina y proteína cinasas específicas del ácido aspártico/glutámico, conocidas en la técnica. En algunas modalidades, la cinasa es una proteína de tirosina cinasa o una proteína serina/treonina proteína cinasas. Los ejemplos de cinasas incluyen SRC, YES, FGR, CHK2 , FGFR1-4, BTK, EGFR, HER2, HER4, HER3 , JAK3 , PLK1-3, MPS1, RON, MEK1/2, ERKl/2, VEGFR, KIT, KDR, ' PDGFR, FLT3 , CDK8 , ME 7 , R0R1 , RSK1-4, MSK1/2, MEKK1, NEK2 , MEK5, M Kl/2, MEK , TGFbR2 , ZAP70 , W K1-4, BMX, TEC, TXK, ITK, BLK, MK2/3, LIMK1, TNK1 , CDK11, p70S6Kb, EfB3 , ZAK, y NOK.
IV. Métodos de tratar enfermedades En otro aspecto, se proporciona un método de tratar una enfermedad asociada con la actividad de las cinasas en un sujeto que necesita tal tratamiento. El método incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva) de un compuesto que tiene la estructura de las Fórmulas provista en la presente (o una modalidad del mismo, tal como se describió anteriormente) .
En algunas modalidades, la enfermedad asociada con la actividad de cinasa es una enfermedad crónica. La enfermedad puede ser cáncer, epilepsia, infección por VIH, enfermedad autoinmune (por ejemplo artritis), enfermedad isquémica (por ejemplo, ataque cardíaco o infarto) , accidente cerebrovascular, enfermedad neurodegenerativa, metabólica o inflamación. En ciertas modalidades, la enfermedad es un cáncer, incluyendo, por ejemplo, leucemia, carcinomas y sarcomas, tales como cáncer del cerebro, de mama, del cuello uterino, de colon, de páncreas, de cabeza y de cuello, de hígado, de riñon, de pulmón, de pulmón de células no pequeñas, de próstata, melanoma, mesotelioma, ovario, sarcoma, estómago, útero y meduloblastoma . Los ejemplos adicionales incluyen, enfermedad de Hodgkin, Linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de ovario, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores cerebrales primarios, insulinoma pancreático maligno, carcinoide maligno, cáncer de vejiga urinario, lesiones cutáneas premalignas, cáncer testicular, linfornas, cáncer tiroideo, neuroblastoma, cáncer esofágico, cáncer del aparato genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer de endometrio, cáncer cortical adrenal, neoplasias del páncreas endocrino y exocrino. En algunas modalidades, la enfermedad es cáncer hepático, cáncer de colon, cáncer de mama, melanoma, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, o cáncer pulmonar de células no pequeñas. En algunas modalidades, la enfermedad es cáncer que ha metastizado. En algunas modalidades, la enfermedad es artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, escleroderma o polimiositis . En algunas modalidades, la enfermedad es diabetes, obesidad, o trastornos lipidíeos. En algunas modalidades, la enfermedad puede ser causada por un agente infeccioso tal como bacterias, parásitos o virus. En algunas modalidades, la enfermedad es aguda tal como el infarto de miocardio, accidente cerebrovascular o asma. En algunas modalidades, la enfermedad es la enfermedad de Parkinson o la esclerosis lateral amiotrófica.
V. Ensayos Usando técnicas conocidas en la materia y la orientación provista en la presente, los candidatos a inhibidores de cinasas se pueden ensayar fácilmente para determinar su capacidad para inhibir alguna proteína cinasa conocida. Por ejemplo, los candidatos a inhibidores de cinasas que presentan la estructura de las Fórmulas provistas en la presente, o sus modalidades, se pueden ensayar, primero, mediante técnicas de modelado por computadora, a fin de evaluar los potenciales contactos de unión entre los restos de unión del sitio activo de cinasa y/o los restos catalíticos del sitio activo de cinasa. Tales técnicas de modelado por computadora también se pueden denominar como técnicas in silico. Como se describió anteriormente, los restos de unión del sitio activo de cinasa y/o los restos catalíticos del sitio activo de cinasa son conocidos o se determinan fácilmente para cualquier cinasa para la que la estructura primaria de aminoácidos es conocida. En particular, las técnicas de modelado por computadora se pueden emplear para evaluar la capacidad de los candidatos a inhibidores de cinasa para reaccionar con un resto de cisteína del sitio activo de cinasa con el carbono olefínico deficiente en electrones para formar un aducto de tiol. Por ejemplo, cuando el inhibidor de cinasas carbono olefínico deficiente en electrones está dentro de 10 Á del sulfhidrilo de la cisteína del sitio activo de cinasa, se puede mejorar la potencia y/o la selectividad del inhibidor de cinasa (por ejemplo por 1000-10,000 veces).
Asimismo, las técnicas de modelado por computadora se pueden usar para evaluar la capacidad de los candidatos a inhibidores de cinasa para ajustarse en el sitio activo de las cinasas sin crear choques estéricos . Como se describió anteriormente, en algunas modalidades, -R1 o -L-R1 se ajustan dentro del sitio de unión al ATP de las cinasas y/o hacen contacto con los restos de aminoácidos dentro del sitio de unión al ATP de las cinasa. En consecuencia, se pueden usar técnicas de modelado por computadora para evaluar la capacidad de -R1 o -L-R1 para ajustarse dentro del sitio de unión al ATP de las cinasas y/o hacer contactos con los restos de aminoácidos dentro del sitio de unión al ATP de las cinasas. Los ensayos de modelado por computadora descritos anteriormente se pueden usar para evaluar la capacidad de inhibición de la cinasa por los candidatos a inhibidores de cinasa candidatos que tienen diferentes subestructuras químicas generales dentro de la estructura de las Fórmulas provistas en la presente o sus modalidades. De esta manera, se pueden evaluar nuevas clases de subestructuras químicas usando modelado por computadora, antes de realizar ensayos de actividad in vitro.
Se pueden usar ensayos in vitro para evaluar las propiedades inhibidoras de cinasa de los candidatos a inhibidores de cinasa que tienen la estructura de las Fórmulas provistas en la presente o sus modalidades. Los ensayos de cinasa in vitro son bien conocidos en la técnica. Las técnicas de alto rendimiento son conocidas y útiles para evaluar rápidamente grandes cantidades candidatos de inhibidores de cinasa, mediante ensayos de unión para gran cantidad de paneles de cinasa. Ver, por ejemplo, Karaman y col., Nat Biotechnol. 2008 ene; 26 (1) : 127-32.
Los compuestos que disminuyen la actividad catalítica de las cinasas también se pueden identificar y analizar utilizando proteína cinasas biológicamente activas, sean éstas recombinantes o naturales. Las proteínas cinasas se pueden encontrar en las células nativas, aislar in vitro o co-expresar o expresar en una célula. Ciertas proteína cinasas fosforilan de manera específica sustratos particulares. Cuando los sustratos específicos son conocidos, se puede evaluar la capacidad de un candidato a inhibidor de cinasas para reducir la fosforilación del sustrato específico. También se pueden emplear sustratos de cinasa generales o no específicos.
Los inhibidores de cinasas provistos en la presente también se pueden analizar in vitro para determinar su capacidad para inhibir una cinasa mutante que no contenga un sitio activo de cisteína. La capacidad de un inhibidor de cinasa para disminuir la actividad catalítica de una cinasa que tiene una cisteína en el sitio activo y que no tiene la capacidad (o que tiene una capacidad disminuida medible) para disminuir la actividad catalítica de una mutante de la cinasa la cual no contiene una cisteína en el sitio activo es indicativa de un inhibidor de cinasa que inhibe a la cinasa mediante la unión a la cisteína del sitio activo. Por ejemplo, la mutante C436V de RSK2 puede ser resistente a ciertos inhibidores de cinasa (IC50 > 10 uM) que muestran una actividad inhibitoria contra la RSK2 tipo salvaje. Este resultado avala la conclusión de que la inhibición de RSK2 requiere de la formación de un enlace covalente entre Cys436 y el inhibidor.
Como se describió anteriormente, E y -L2-E son, por lo general, sustituyentes que retiran suficientes electrones del carbono olefínico del centro de reacción como para unirse de modo reversible al sulfhidrilo de una cisteína del sitio activo de la cinasa (por ejemplo, cuando la cinasa está parcial o completamente desnaturalizada) . Los inhibidores de cinasa provistos en la presente también se pueden analizar in vitro para determinar su capacidad para unirse de modo reversible a la cisteína del sitio activo de una proteína cinasa midiendo la asociación y la disociación del inhibidor de cinasa a la proteína cinasa (por ejemplo, parcial o completamente desnaturalizada) o de un compuesto tiol (por ejemplo 2 -mercaptoetanol (BME) ) . La capacidad del carbono del centro de reacción de un inhibidor de cinasa provisto en la presente para unirse de modo reversible al sulfhidrilo de una cisteína del sitio activo de una cinasa se puede medir utilizando cualquier medio apropiado, incluyendo diálisis, espectrometría de masas, RMN y detección UV (para más detalles, ver sección de Ejemplos) . Por ejemplo, los inhibidores de cinasas se pueden ensayar para detectar la unión de un compuesto tiol tal como BME . La unión se puede evaluar utilizando la detección UV de los compuestos que normalmente se vuelven menos activos al UV después de la unión a un compuesto tiol o por la detección de la unión mediante RMN protónica. Normalmente, los ensayos se realizan mediante la titulación del compuesto tiol y del examen de un cambio en el parámetro de detección de unión del punto final (por ejemplo, la actividad UV o la RMN protónica) . La reversibilidad se evalúa por dilución. Los ejemplos específicos se proporcionan a continuación en la sección de Ejemplos (ver Ejemplo 82) .
Los inhibidores de cinasas provistos en la presente también se pueden analizar in vitro en cuanto a su estabilidad a pH 7,5. Se puede usar cualquier método apropiado para determinar la estabilidad de un inhibidor de cinasas expuesto en la presente a pH 7,5. Los métodos apropiados incluyen, por ejemplo, LC-MS (por ejemplo HPLC-MS) así como medir los cambios en la absorción al UV, cuando el inhibidor de cinasas incluye un grupo cromóforo. La absorción UV se puede medir utilizando técnicas de alto rendimiento (por ejemplo, placas multipocillo para el escaneado simultáneo de grandes cantidades de inhibidores de cinasas) . La estabilidad se puede evaluar utilizando solución salina fosfato a pH 7,5 a 37 °C. Se pueden seleccionar compuestos que tengan una vida media mayor a 6 horas, 12 horas, 24 horas o 48 horas.
También se pueden usar ensayos celulares para evaluar las propiedades inhibidoras de las cinasa de los candidatos a inhibidores de cinasas que presentan la estructura de las Fórmulas provistas en la presente o de sus modalidades. Los ensayos celulares incluyen las células de cualquier fuente apropiada, incluyendo las células vegetales y animales (tales como las células de mamíferos) . Los ensayos celulares también se pueden realizar en células humanas. Los ensayos celulares de inhibición de cinasas son bien conocidos en la técnica e incluyen a los métodos en que un inhibidor de cinasa se administra a la célula (por ejemplo, por electroporación, difusión pasiva, microinyección y similares) y se mide un punto final de actividad de la cinasa, tal como la cantidad de fosforilación de un sustrato celular, la cantidad de expresión de una proteína celular o algún otro cambio en el fenotipo celular conocido, afectado por la actividad catalítica de la cinasa ensayada particular. Por ejemplo, la fosforilación de un sustrato celular particular se puede evaluar usando un anticuerpo de detección específico o un sustrato celular fosforilado y luego por técnicas de Western blotting y de visualización, utilizando cualquier medio apropiado (por ejemplo, detección fluorescente de un anticuerpo marcado por fluorescencia) .
La medición de la reducción de la actividad catalítica de la proteína cinasa en presencia de uno de los inhibidores de cinasas descritos en la presente, con respecto a la actividad en ausencia del inhibidor, se puede llevar a cabo utilizando una variedad de métodos conocidos en la técnica, tales como los ensayos descritos en la siguiente sección de Ejemplos. Otros métodos para analizar la actividad de las cinasas son conocidos en la técnica. La selección de los métodos de ensayo apropiados se encuentra dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.
Una vez que los inhibidores de cinasas son identificados como que son capaces de reducir la actividad catalítica de las cinasas in vitro y/o en una célula, los compuestos también se pueden analizar respecto de su capacidad para inhibir- selectivamente la actividad de cinasas en modelos animales (por ejemplo, animales enteros u órganos de animales) . En consecuencia, los inhibidores de cinasas también se pueden analizar en modelos celulares o modelos animales, para determinar su capacidad para efectuar cambios detectables fenotípicos relacionados con una actividad de cinasa particular. Además de los cultivos celulares, los modelos animales se pueden usar para analizar inhibidores de cinasas en cuanto a su capacidad de tratar, por ejemplo, cáncer en un modelo animal .
VI. Formulaciones Farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto inhibidor de cinasa de la invención o un compuesto inhibidor de cinasa en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, un portador) .
Las composiciones farmacéuticas incluyen a los isómeros ópticos, los diastereómeros o las sales farmacéuticamente aceptables de los inhibidores descritos en la presente. Por ejemplo, en algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas incluyen un compuesto de la presente invención y citrato como sal farmacéuticamente aceptable. El inhibidor de cinasas incluido en la composición farmacéutica se puede unir covalentemente a un resto portador, tal como se describió anteriormente. De modo alternativo, el inhibidor de cinasas incluido en la composición farmacéutica no está ligado de manera covalente a un resto portador.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" tal como se usa en la presente, se refiere a excipientes farmacéuticos, por ejemplo, sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas, farmacéutica y fisiológicamente aceptables, adecuadas para la aplicación entérica o parenteral y que no reaccionan de manera perjudicial con el extracto. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agua, soluciones salinas (tales como una solución de Ringer) , los alcoholes, los aceites, las gelatinas y los carbohidratos, tales como la lactosa, la amilosa o el almidón, los ésteres de ácidos grasos, la hidroximetilcelulosa, y la polivinil pirrolidina. Tales preparaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares tales como los lubricantes, los conservantes, los estabilizantes, los agentes humectantes, los emulsionantes, las sales para influir en la presión osmótica, las soluciones amortiguador, las sustancias colorantes y/o aromáticas y similares, que no reaccionen perjudicialmente con los compuestos de la invención.
Los compuestos de la invención se pueden administrar solos o se pueden coadministrar al paciente. La coadministración significa que se incluye la administración simultánea o secuencial de los compuestos de modo individual o en combinación (más de un compuesto) . En consecuencia, las preparaciones también se pueden combinar, cuando se desea, con otras sustancias activas (por ejemplo, para reducir la degradación metabólica) .
?. Formulaciones Los inhibidores de cinasas de la presente invención se pueden preparar y administrar en una amplia variedad de formas de dosificación oral, parenteral y tópica. En consecuencia, los compuestos de la presente invención se pueden administrar por inyección (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intracutánea, subcutánea, intraduodenal o intraperitoneal) . Asimismo, los compuestos descritos en la presente se pueden administrar por inhalación, por ejemplo, intranasal. En forma adicional, los compuestos de la presente invención se pueden administrar de forma transdérmica . También se prevé que se puedan usar múltiples vías de administración (por ejemplo, intramuscular, oral, transdérmica) para administrar los compuestos de la invención. Por consiguiente, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un portador o un excipiente farmacéuticamente aceptable y uno o más compuestos de la invención.
Para preparar composiciones farmacéuticas de los compuestos de la presente invención, los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen a los polvos, los comprimidos, las pastillas, las cápsulas, los sellos, los supositorios y los gránulos dispersables . Un portador sólido puede ser una o más sustancias, las cuales también pueden actuar como diluyentes, agentes saborizantes , aglutinantes, conservantes, agentes de desintegración de comprimidos o un material de encapsulación.
En los polvos, el portador es un sólido finamente dividido, el cual está mezclado con el componente activo finamente divido. En comprimidos, el componente activo se mezcla con el portador, el cual posee las propiedades de unión necesarias, en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y el tamaño deseado.
Los polvos y los comprimidos con preferencia contienen de un 5% a un 70% de compuesto activo. Los portadores adecuados son el carbonato de magnesio, el estearato de magnesio, el talco, el azúcar, la lactosa, la pectina, la dextrina, el almidón, la gelatina, el tragacanto, la metilcelulosa , la carboximetilcelulosa sódica, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y los similares. Se pretende que el término "preparación" incluya la formulación del compuesto activo con un material de encapsulación, tal como un portador, proporcionando una cápsula en la que el componente activo, con o sin otros portadores, está rodeado por un portador, el cual así está con asociación con este. De manera similar, se incluyen los sellos y las pastillas. Los comprimidos, los polvos, las cápsulas, las pastillas, los sellos y las tabletas, se pueden usar como formas de dosis sólidas adecuadas para la administración oral.
Para preparar supositorios, una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao, primero se funde y el componente activo se dispersa homogéneamente en ésta, mediante agitación. La mezcla homogénea fundida luego se vierte en moldes de tamaño convenientes, se dejar enfriar y, de este manera, se solidifica .
Las preparaciones en formas líquidas incluyen a las soluciones, las suspensiones y las emulsiones, por ejemplo, agua o soluciones de agua/propilenglicol . Para la inyección parenteral, las preparaciones líquidas se pueden formular en solución de polietilenglicol acuoso.
Cuando se necesita o se desea la aplicación parenteral, las mezclas particularmente adecuadas para los compuestos de la invención son las soluciones estériles inyectables, de preferencia las soluciones oleosas o acuosas, así como las suspensiones, las emulsiones o los implantes, incluyendo los supositorios. En particular, los portadores para la administración parenteral incluyen a las soluciones acuosas de dextrosa, solución salina, agua pura, etanol, glicerol, propilenglicol , aceite de maní, aceite de sésamo, polímeros en bloque de polioxietileno y los similares. Las ampollas son dosis unitarias convenientes. Los compuestos de la invención también se pueden incorporar en liposomas o administrar por medio de bombas o parches transdérmicos . Las mezclas farmacéuticas adecuadas para usar en la presente invención incluyen las descritas, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences (17th Ed. , Mack Pub . Co . , Easton, PA) y WO 96/05309, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente como referencia .
Las soluciones acuosas adecuadas para su uso oral se pueden preparar disolviendo el componente activo en agua y añadiendo colorantes, saborizantes , estabilizantes y agentes espesantes adecuados, según sea deseado. Las suspensiones acuosas adecuadas para su uso oral se pueden preparar disolviendo el componente activo finamente dividido en agua, con un material viscoso, tal como las gomas naturales o sintéticas, las resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y otros agentes de suspensión bien conocidos.
También se incluyen preparaciones en forma sólida, las cuales están destinadas a convertirse, inmediatamente antes de usar, en preparaciones en forma líquida, para la administración oral. Tales formas líquidas incluyen a las soluciones, las suspensiones y las emulsiones. Estas preparaciones pueden contener, además del componente activo, colorantes, sabores, estabilizantes, amortiguador, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares.
De preferencia, la preparación farmacéutica se encuentra en una forma de dosificación unitaria. En dicha forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen las cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades discretas de la preparación, tales como comprimidos envasados, cápsulas y polvos en viales o ampollas. Asimismo, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, un comprimido, un sello o una pastilla de por sí, o puede ser una cantidad apropiada de alguno de estos en forma envasada .
La cantidad de componente activo en una preparación de dosis unitaria se puede variar o ajustar desde 0,1 mg a 10000 mg, por lo general de 1,0 mg a 1000 mg y más generalmente aún de 10 mg a 500 mg, de acuerdo con la aplicación particular y la potencia del componente activo. La composición puede, si se desea, también contener otros agentes terapéuticos compatibles .
Algunos compuestos pueden presentar una solubilidad limitada en agua y, en consecuencia, pueden requerir un tensioactivo u otro cosolvente apropiado en la composición. Tales cosolventes incluyen: Polisorbato 20, 60 y 80; Pluronic F-68, F-84 y F-103; ciclodextrina; y aceite de polioxil 35 ricino. Tales cosolventes se emplean, por lo general, en un nivel entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 2% en peso.
Una viscosidad mayor que la de las soluciones acuosas simples puede ser conveniente para disminuir la variabilidad de dispensación de las formulaciones, para disminuir la separación física de los componentes de una suspensión o emulsión de la formulación y/o para, de otra manera, mejorar la formulación. Tales agentes de aumento de viscosidad incluyen, por ejemplo, al alcohol polivinílico, la polivinilpirrolidona, la metil celulosa, la hidroxi propil metilcelulosa, la hidroxietil celulosa, la carboximetil celulosa, la hidroxi propil celulosa, el condroitinsulfato y sus sales, el ácido hialurónico y sus sales y las combinaciones de los anteriores. Tales agentes se emplean normalmente en un nivel entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 2% en peso.
Las composiciones de la presente invención pueden incluir, además, componentes para proporcionar una liberación sostenida y/o comodidad. Los componentes incluyen a los polímeros mucomiméticos aniónicos de alto peso molecular, a los polisacáridos gelificantes y a los sustratos de portador de fármacos finamente dividido. Estos componentes se describen en mayor detalle en las Patentes U.S. Nos. 4,911,920; 5,403,841; 5,212,162 y 4,861,760. Los contenidos completos de estas patentes se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los fines.
B. Dosificaciones efectivas Las composiciones farmacéuticas provistas por la presente invención incluyen a las composiciones en donde el ingrediente activo está contenido en una cantidad terapéuticamente efectiva, es decir, en una cantidad efectiva como para obtener su propósito deseado. La cantidad efectiva real para una aplicación particular dependerá, Ínter alia, de la afección tratada. Por ejemplo, cuando se administra en métodos para tratar el cáncer, tales composiciones contendrán una cantidad de ingrediente activo efectivo como para obtener el resultado deseado (por ejemplo, disminuir el número de células cancerosas en un sujeto) .
La dosis y la frecuencia (dosis única o múltiples dosis) con que se administran a un mamífero pueden variar de acuerdo con una variedad de factores, entre los que se incluyen una enfermedad que produce un aumento de la actividad de cinasa, si el mamífero sufre de otra enfermedad y la vía de administración; tamaño, edad, sexo, salud, peso corporal, índice de masa corporal y dieta del receptor; naturaleza y grado de los síntomas de la enfermedad tratada (por ejemplo, del cáncer) , tipo de tratamiento concurrente, complicaciones de la enfermedad tratada u otros problemas relacionados con la salud. Otros regímenes o agentes terapéuticos se pueden usar en conjunto con los métodos y los compuestos de la invención .
Para cualquier compuesto descrito en la presente, la cantidad terapéuticamente efectiva puede determinarse inicialmente a partir de los ensayos de cultivo celular. Las concentraciones blanco serán aquellas concentraciones de compuesto activo que son capaces de reducir el nivel de actividad catalítica de la cinasa medida, por ejemplo, utilizando los métodos descritos.
Las cantidades terapéuticamente efectivas para usar en los seres humanos se pueden determinar a partir de modelos animales. Por ejemplo, una dosis para seres humanos se puede formular para obtener una concentración que se ha encontrado que es efectiva en los animales. La dosis en los seres humanos se puede ajustar mediante control de la inhibición de la cinasa y ajustar la dosis hacia arriba o hacia abajo, tal como se describió anteriormente .
Las dosis pueden variar de acuerdo con los requerimientos del paciente y el compuesto empleado. Las dosis administradas a un paciente, en el contexto de la presente invención, deben ser suficientes como para lograr, con el tiempo, una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente. El tamaño de la dosis también será determinado por la existencia, naturaleza, y grado de cualquiera de los efectos secundarios adversos. En general, el tratamiento se inicia con dosis pequeñas, menores que la dosis óptima del compuesto. A partir de este momento, la dosis se aumenta mediante pequeños incrementos, hasta alcanzar un efecto óptimo de acuerdo con las circunstancias. En una modalidad de la invención, el intervalo de dosis es de 0,001% a 10% p/v. En otra modalidad, el intervalo de dosis es de 0,1% a 5% p/v.
Las cantidades e intervalos de dosis se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles efectivos del compuesto administrado, para la indicación clínica particular que se está tratando. Esto proporcionará un régimen terapéutico acorde con la gravedad del estado de enfermedad del individuo.
Utilizando las enseñanzas provistas en la presente, se puede planificar un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico efectivo qµe no provoque una toxicidad sustancial y que aun así sea completamente efectivo para tratar los síntomas clínicos demostrados por el paciente particular. Esta planificación debe involucrar la elección cuidadosa del compuesto activo, considerando factores tales como el potencial del compuesto, la biodisponibilidad relativa, el peso corporal del paciente, la presencia y la gravedad de los efectos secundarios adversos, el modo de administración preferido y el perfil de toxicidad del agente seleccionado.
C. Toxicidad La relación entre toxicidad y efecto terapéutico para un compuesto particular es su índice terapéutico, el cual puede ser expresado como la relación entre la LD50 (la cantidad del compuesto letal en un 50% de la población) y la ED50 (la cantidad del compuesto efectivo en un 50% de la población) . Se prefieren los compuestos que exhiben índices terapéuticos altos. Los datos del índice terapéutico obtenidos de los ensayos de cultivo celular y/o de los estudios en animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosis para usar en seres humanos. Las dosis de tales compuestos, con preferencia, se encuentran dentro de un intervalo de concentraciones plasmáticas que incluyen la ED50 con poca o con ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo, de acuerdo con la forma de dosis empleada y la vía de administración utilizada. Ver, por ejemplo Fingí y col., En: THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Cap .1 , p.l, 1975. La formulación exacta, vía de administración y la dosis pueden ser elegidas por el médico individual teniendo en cuenta la afección del paciente y el método particular en que se utiliza el compuesto.
D. Agentes y Modalidades Terapéuticos Adicionales En . algunas modalidades, los inhibidores de cinasas provistos en la presente se pueden usar en combinación con otros agentes terapéuticos u otras modalidades terapéuticas. En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional es un agente anticáncer. El agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico, un agente biológico, un agente para la terapia hormonal o un inhibidor de cinasas que no es un inhibidor de cinasas representado por las Fórmulas provistas en la presente (o por sus modalidades) . El agente terapéutico adicional puede ser, adicionalmente , un agente alquilante, una antraciclina, un anticuerpo monoclonal, una citoquina, un análogo nucleosídico, prednisona, un taxano, estrógeno, progesterona, antagonistas hormonales, un alcaloide de la vinca, un anti-metabolito o agentes similares.
En algunas modalidades, los inhibidores de cinasas provistos en la presente se pueden usar en combinación con otras modalidades terapéuticas, tales como en la terapia de radiación y la cirugía.
VII. Ejemplos Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitan la invención reivindicada.
Métodos de química general. Se registraron espectros de masa por ionización por electroaspersión de baja resolución (ESI+-MS) en un espectrómetro Waters Micromass ZQ 4000. Se realizó LC/MS (MS : ESI+) en un Waters AllianceHT LC/MS con un caudal de flujo de 0,2 mi min"1 (controlado a 210 nm, 260 nm, y/o 350 nm) usando una columna Xterra MS C18 (Waters) . Para las reacciones sensibles al aire y al agua, el material de vidrio fue secado en estufa o llama antes de usar y las reacciones se llevaron a cabo bajo argón. Se secó diclorometano, dimetilformamida, metanol, tetrahidrofurano, tolueno y diisopropilamina , utilizando un sistema de purificación de solventes fabricado por Glass Contour, Inc. (Laguna Beach, CA) . Todos los otros solventes eran de grado químico ACS (Fisher) y se usaron sin purificación posterior, a menos que se indique lo contrario. La cromatografía en capa fina analítica y preparativa se llevó a cabo en placas de vidrio con gel de sílice 60 F254 (EM Science) . La cromatografía flash se realizó con gel de sílice de malla 230-400 (Selecto Scientific) . Se llevó a cabo una cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa (HPLC) en un equipo Prostar 210 (Varían) , con un caudal de flujo de 10 mi min"1 (controlado a 210 nm y 260 nm) , utilizando una columna preparatoria COMBI-A C18 (Peeke Scientific) .
Procedimiento General para los Ensayos de JA 2 y JAK3 cinasas. La JAK2 (Humana, 808 restos -extremo) y JAK3 (Humana, 781 restos -extremo) se adquirieron de Millipore. La cinasa activa (3 nM) en 8 mM de HEPES, pH 7,0, 200 uM de EDTA, 10 mM de MgCl2, 0,2 mg/ml de BSA, 100 uM de ATP y 10 mM de GSH se preincubaron con inhibidores (ocho o diez concentraciones, por duplicado) durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Las reacciones de las cinasas se iniciaron mediante la adición de 0,3 µ??/µ? de ?-32?-??? (6000 Ci/mmol, NEN) y 100 uM de sustrato peptídico (JA 3-tide para JAK3 o PDK-tide para JAK2, Millipore) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La actividad de cinasa se determinó por medio de la siembra de 5 µ? de cada reacción en láminas de fosfocelulosa. Cada transferencia se lavó una vez con 1% de solución de AcOH, dos veces con 0,1% de solución de H3P04 y una vez con MeOH (5-10 minutos por lavado) . Las transferencias secas se expusieron durante 30 minutos a una placa de fósforo de depósito y se escanearon por un Typhoon Imager (GE Life Sciences) . Los datos se cuantificaron usando el programa SPOT (Knight, Z. et al. Nature Protocols, 2 (10), 2459-66) y se graficaron utilizando el programa de computación GraphPad Prism 4.0.
Procedimiento general para el ensayo de Btk cinasa. La Btk (humana, longitud completa) se adquirió (Invitrogen, número de catálogo PV3363) y se utilizó tal como se especifica en la bibliografía del producto. Btk (concentración final 2 nM) se preincubó con inhibidores (seis o diez concentraciones, por duplicado) durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Las reacciones de las cinasas se iniciaron por la adición de 0,16 uCi/µ? de ?-32?-??? (6000 Ci/mmol, NEN) y 0,2 mg/ml de sustrato (poli [Glu:Tyr] , 4:1 Glu:Tyr) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La actividad de las cinasa se determinó sembrando 6 µ? de cada reacción sobre las láminas de fosfocelulosa. Cada transferencia se lavó una vez con 1% de solución de AcOH, dos veces con 0,1% de solución H3P04 y una vez con MeOH (5-10 minutos por lavado) . Las transferencias secas se expusieron durante 30 minutos a una placa de fósforo de depósito y se escanearon por medio de un visualizador de imágenes Typhoon (GE Life Sciences) . Los datos se cuantificaron utilizando ImageQuant (v. 5.2, Molecular Dynamics) y se graficaron usando el programa de computación GraphPad Prism 4.0.
Ejemplo 1. 3- (4- (9H-purin-6-il) fenil) -2 -cianoacrilamida .
A una solución de 1 - 1et rahidropi ran- 1 - i 1 - 6 - ( -formi 1 f eni 1 ) pur ina (Donald, A. y col. J. Med. Chem . 2007 , 50, 2289-2292) (170 mg , 0,55 mmol) en 6 mi de THF, se le añadió 20 gotas de HC1 1 N acuoso. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de 18 horas, se formó un precipitado blanco y todo el material de partida se consumió según lo determinado por medio de TLC. La reacción se diluyó con EtOAc, se lavó con NaHC03 saturado y la fase orgánica se secó con Na2S04. La evaporación giratoria proporcionó 100 mg (81%) de 2 como un sólido amarillo claro, el cual se utilizó sin purificación adicional. Masa exacta: 224,07, M/z experimental: 225,3 (M+H)+.
Una suspensión de la 6 - (p - formi 1 f eni 1 ) - pur ina (10,9 mg , 0,049 mmol) desprotegida, 2 - c i anoace tamida (5,4 mg, 0,064 mmol) , y PF3 (13 mg , 0,049 mmol) en THF (0,5 mi) se calentó a 80°C en un vial sellado. La mezcla se agitó a 80°C durante 12 horas y se concentró in vacuo. El resto se sometió a cromatografía en sílice con 9:1 CH2Cl2:MeOH, proporcionando 9,6 mg (87%) de 3 - ( 4 - ( 9H-purin- 6 -il) f enil) -2-cianoacrilamida (mezcla de isómeros E/Z) como un sólido amarillo claro. Masa exacta: 290,09, M/z experimental: 291,3 (M+H)+.
Ejemplo 2. 4- (1- tosil-lH-pirrolo [2 , 3 -b] piridin-3 - il) benzaldehído .
Una suspensión de 3 -bromo - 1 - tos i 1 - lH-p i rrolo [ 2 , 3 -blpiridina (100 mg , 0,29 mmol) , ácido 4 - f ormi 1 f eni 1 borónico (66 mg , 0,44 mmol) y K2C03 (126 mg , 0,87 mmol) en 5:1 dioxano : agua (2 mi) se desgasificó en argón, durante 30 minutos, en un vial de microondas. Se añadió Pd(Pph3)4 (33 mg, 0,029 mmol) y el recipiente se purgó con argón. El vial se calentó a 150°C, durante 15 minutos, en un reactor de microondas, se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc y se lavó con agua. La fase orgánica se secó con Na2S04 y se concentró in vacuo. El resto se sometió a cromatografía en sílice con 1:1 hexanos : Et OAc , proporcionando 92 mg (86%) de 4-(l-tosil-lfí-pirrolo[2,3-jb]piridin-3-il)benzaldehído como un sólido amarillo.
Ejemplo 3. 4- (lH-pirrolo [2, 3 -b] iridin-3 - il) benzaldehído.
A una solución de 4- ( 1-tosil- lH-pirrolo [2,3-b] piridin-~3 - il ) benzaldehído (162 mg , 0,45 mmol) en 2:1 THF : MeOH (2 mi), se le añadió Cs2C03 (435 mg , 1,34 mmol) . La solución se tornó amarilla después de la adición de la base de carbonato y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. Después del consumo completo del material de partida, controlado por TLC, la solución anaranjada claro se concentró in vacuo, el resto se tomó en 10 mi de agua y la suspensión resultante se agitó vigorosamente durante 30 minutos. El precipitado amarillo se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío para proporcionar 74 mg de 4 - ( 1H- p i rrol o [ 2 , 3 - b] pi ri din - 3 -i 1 ) benzaldehído como un sólido amarillo brillante. Masa exacta: 222,08, M/z encontrada: 223,3 (M+H)+.
Ejemplo 4. 3- (4- (lH-pirrolo [2 , 3-b] piridin-3-il) fenil) cianoacrilamida.
A una suspensión de 4 - ( lH-pirrolo [2 , 3 -£>] piridin- 3 - il ) benzaldehído (8 mg , 0,036 mmol) in 1:1 THF : MeOH se añadió 2 - c ianoacet ami da (4 mg , 0,043 mmol) y PF3 (5 mg, 0,018 mmol) . La mezcla de reacción se calentó a 80°C durante 48 horas, y después del desarrollo significativo de producto, se controló por LCMS, la reacción se concentró y tomó en un volumen pequeño de THF. Se añadió EtOH y el precipitado amarillo resultante se filtró y secó in vacuo para proporcionar 1,2 mg de 3 - (4 - ( lH-pirrolo [2 , 3 -£»] pi ridin- 3 - il ) f eni 1 ) - 2 - cianoacr i lamida (mezcla de isómeros E/Z) como un sólido amarillo brillante. Masa exacta: 288,30, M/z encontrada: 289,3 (M+H)+.
Ejemplo 5. 3 - (lH-pirrolo [2 , 3 -b] piridin-3 -carbonil) benzaldehido .
Se combinaron 7-azaindol (182 mg, 1,5 mmol) y A1C13 (945 mg, 7,4 mmol) en CH2C12 seco (50 mi), en un balón secado a la llama, bajo argón. La mezcla amarilla heterogénea se dejó agitar a temperatura ambiente, durante una hora. En este momento se añadió, gota a gota, cloruro de 3-formil benzoílo (505 mg , 2,9 mmol) por medio de una jeringa bajo presión positiva de argón. La mezcla se volvió lentamente una solución amarilla translúcida. Después de dos horas adicionales de agitación a temperatura ambiente, se añadió lentamente MeOH (-20 mi) para inactivar el exceso de cloruro ácido. El solvente se extrajo in vacuo y el resto se sometió a cromatografía en sílice con 9:1 de EtOAc : MeOH para proporcionar 42 mg (11%) de 3 - ( lfí-pirrolo [ 2 , 3 -b] piridin- 3 - carbonil ) benzaldehido , como un sólido blanco. Masa exacta: 250,07, M/ z encontrada: 251,3 (M+H)+.
Ejemplo 6. 3 - (3 - (IH-pirrolo [2 , 3 -b] iridin-3 -carbonil) fenil) -2-cianoacrilamida.
A una solución de 3 - ( IH-pirrolo [2 , 3 -b] piridina-3 -carbonil ) benzaldehído (19,5 mg, 0,08 mmol) en THF (1 mi) se añadió 2 -cianoacetamida (15 mg, 0,17 mmol) y piperidina (10 µ?, 0,096 mmol) y la suspensión se agitó a 80°C durante tres horas con evolución de un precipitado blanco. El precipitado se recolectó por filtración para proporcionar 1,5 mg (6%) de 3 - (3 - ( IH-pirrolo [2 , 3 -i>] piridin- 3 - carbonil ) fenil )- 2 - cianoacri lamida (mezcla de isómeros E/Z) como un sólido blanco. Masa exacta: 316,10, M/z encontrada: 317,3 (M+H)+.
Ejemplo 7. 2-ciano-3- (lH-indazol-5-il) acrilamida.
A una solución de 5-formil-lH-indazol (102,5 mg, 0,7 mmol) en THF (2 mi) se le añadió 2 -cianoacetamida (75 mg, 0,9 mmol) y piperidina (20 µ?, 0,2 mmol) . La reacción se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente, seguido por la adición de una punta de espátula de cianoacetamida . La reacción se agitó durante otras tres horas y comenzaron a precipitar los sólidos amarillos. La reacción se filtró, los sólidos se lavaron con THF y se secó in vacuo para proporcionar 65 mg (44%) de 2 -ciano- 3 - ( 1H- indazol - 5 -il ) acrilamida (mezcla de isómeros E/Z) como un sólido amarillo. Masa exacta: 212,07, M/z encontrada: 213,4 (M+H) + .
Ejemplo 8. 3 - (lH-indazol-5-il) -2 - (pirrolidino-1-carbonil) acrilonitrilo .
A una solución de 6 -formil-lJí- indazol (115 mg, 0,8 mmol) en THF (2 mi) se le añadió 2-ciano-iV-isopropilacetamida (100 mg, 0,7 mmol) y DBU (130 µ?, 1,05 mmol) . La solución marrón resultante se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y se la controló mediante TLC. Se le añadió una punta de espátula adicional de 2 -ciano-N- isopropilacetamida y la reacción se agitó durante otras 18 horas, con un mínimo desarrollo de producto adicional. La reacción se concentró, se tomó en un volumen pequeño de EtOAc y se purificó por TLC preparativa para proporcionar 43 mg (20%) de 3- ( 1H- indazol-6-il) -2- (pirrolidina- 1-carbonil ) acrilonitrilo (mezcla de isómeros E/Z) como un sólido canela amorfo. Masa exacta: 266,12, M/z encontrada: 267,5 (M+H) + .
Ejemplo 9. 2-ciano-3- (lH-indazol-6-il) acrilamida.
A una solución de 6 - formil - 1H- indazol (102,5 mg, 0,7 mmol) en THF (2 mi) se le añadió 2 -cianoacetamida (78,2 mg, 0,7 mmol) y piperidina (50 yl, 0,5 mmol). La reacción se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente con producción de un precipitado blanco. La reacción se filtró y los sólidos se lavaron con THF y se secaron in vacuo para proporcionar 69 mg (46%) de 2-ciano-3- (1H- indazol -6-il) acrilamida (mezcla de isómeros E/Z) como un sólido blanco. Masa exacta: 212,07, M/z encontrada: 213,4 (M+H)+.
Ejemplo 10. 2-ciano-3- (lH-indazol-6-il) -N-metilacrilamida.
A una solución de 6 - formil - 1H- indazol (103,5 mg, 0,7 mmol) en THF (1 mi) se la añadió 2 -ciano-W-metilacetamida (70 mg, 0,7 mmol) y DBU (130 µ?, 1,05 mmol). Inmediatamente después de la adición de DBU, la suspensión amarilla se volvió una solución anaranjada transparente, seguida por el desarrollo rápido de un precipitado anaranjado. Después de una hora de agitar a temperatura ambiente, la reacción se concentró, se tomó en un volumen pequeño de 1:1 EtOAc:H20 y se sometió a sonicación para romper el resto. Los sólidos resultantes se filtraron, se lavaron con EtOAc y H20 y se secaron para proporcionar 21 mg (13%) de 2 -ciano-3 - (1H-indazol-6-il) -iV-metilacrilamida (mezcla de isómeros E/Z ) como un sólido canela. Masa exacta: 226,09, M/z encontrada: 227,4 (M+H)+.
Ejemplo 11. 2-ciano-3- (lH-indazol-6-il) -N-isopropilacrilamida .
A una solución de .6 - formil - 1H- indazol (101,5 mg, 0,7 mmol) en THF (1 mi) se le añadió 2-ciano-N-isopropilacetamida (99,9 mg, 0,8 mmol) y DBU (130 µ?, 1,05 mmol) . Después de 1 hora, se observó un consumo completo del material de partida, controlado por TLC. La reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con H20 y salmuera. Se añadieron lentamente hexanos a la capa orgánica restante hasta que se formó un precipitado claro, que se recolectó por filtración para proporcionar 48 mg (27%) de 2-ciano-3-( 1H- indazol - 6 - il ) -N- isopropilacrilamida (mezcla de isómeros E/Z) como un sólido blanco.
Ejemplo 12. (1- (9H-purin-6-il) iperidin-4-il)metanol .
Se disolvió 6-cloropurina (509 mg, 3,2 mmol) , 4-piperidino metanol (737 mg, 6,4 mmol) y Et3N (2,25 mi, 25,6 mmol) en n-BuOH (30 mi) y se calentó a 100°C en un recipiente sellado. La solución de color anaranjado claro se calentó durante la noche, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró para proporcionar un sólido canela. El resto se trituró con 3:1 hexanos:MeOH (10 mi) y se secó in vacuo para proporcionar 401 mg (57%) de (1- (9H-purin-6-il) iperidin-4-il) metanol como un sólido blanco brillante.
Ejemplo 13. 1- (9H-purin-6-il) piperidino-4-carbaldehído .
Se combinaron (1- (9fí-purin-6-il) piperidin-4 - il) metanol (250 mg, 1,1 mmol) y periodinano de Dess-Martin (700 mg, 1,65 mmol) en CH2C12 seco (30 mi) y la suspensión se agitó vigorosamente hasta que se volvió una solución heterogénea amarilla. Se añadió agua (20 µ?) en CH2C12 (20 mi) gota a gota a la reacción, que se volvió turbia después de la adición de ~1 equivalente molar de agua. Después de 30 minutos adicionales de agitación vigorosa, la mezcla de reacción se diluyó in EtOAc (-100 mi) y se lavó con 1:1 NaS20 :NaHC03 saturado, agua y salmuera. La fase acuosa se extrajo de nuevo con EtOAc, las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2S0 y se concentraron. El resto se sometió a cromatografía en sílice con 9:1 CH2Cl2:MeOH para proporcionar 124 mg (48%) de 1- (9H-purin-6-il)piperidino-4-carbaldehído como un sólido incoloro ceroso.
Ejemplo 14. 3- (1- (9H-purin-6-il) iperidin-4-il) -2-cianoacrilamida .
Se combinaron 1- (9H-purin-6-il)piperidino-4-carbaldehído (11,2 mg, 0,048 mmol) , 2 -cianoacetamida (6 mg, 0,071 mmol) y PPh3 (6 mg, 0,023 mmol) en THF (1 mi) y se calentó a 80°C en un vial sellado. Después de 18 horas de calentamiento, se formó un precipitado blanco, pero la TLC indicó la presencia de cantidades significativas de material de partida. Una punta de espátula de 2 -cianoacetamida se añadió a la reacción y se agitó durante 18 horas adicionales a 80°C. La reacción se enfrió y el precipitado se recolectó por filtración para proporcionar 6 mg (46%) de 3- (1- (9H-purin-6-il) piperidin-4-il) -2-cianoacrilamida (mezcla de isómeros E/Z) como un sólido blanco. Masa exacta: 297,13, M/z encontrada: 298,3 (M+H) + .
Ejemplo 15. 2 - (2 -oxo-2 -p- toliletil) isoindolino- 1, 3 -diona.
Se disolvió 2-bromo-l-p-toliletanona (20 g, 93,8 mmol) en 100 mi de DMF. Se añadió ftalamida potásica (19,9 g, 103,2 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se diluyó a un volumen total de 200 mi con CH3C1 y el producto precipitó de la solución. El producto precipitado se recolectó por filtración. El filtrado sobrante se concentró, se redisolvió en 100 mi de CH3C1 y luego se lavó con agua, bicarbonato de sodio saturado y salmuera. La fase acuosa se extrajo con CH2C12 + 10% de MeOH y la fase orgánica resultante se secó con Na2S0 y se concentró in vacuo. La cantidad total de 2- (2-oxo-2-p-toliletil) isoindolin- 1 , 3-diona obtenida fue 24,4 g (94% de rendimiento) .
Ejemplo 16. 2 -amino-4 -p- tolil - lH-pirrol-3 -carbonitrilo .
A una solución de malononitrilo (1,23 g, 18,6 mmol) en MeOH (22,5 ml)/48% p/v NaOH ac (3,5 ml)/H20 (7,5 mi) se le añadió 2- (2 -oxo-2 -p-toliletil ) isoindolin- 1 , 3-diona (4 g, 14,3 mmol) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, luego de lo cual el producto precipitó de la solución. El sólido se recolectó por filtración y se lavó con agua. Al filtrado sobrante se le añadió agua y la precipitación resultante se filtró y combinó con el producto. El producto sólido se secó al vacío, durante la noche, para proporcionar 2,3 g (82% de rendimiento) de 2-amino-4-p-tolil-lH-pirrol-3 -carbonitrilo .
Ejemplo 17. N-3-ciano-4-p-tolil-lH-pirrol-2-il-formimidato de metilo. una solución de 2 - amino- 4 -p- tol i 1 - ??-pirrol carbonitrilo (2,3 g, 11,6 mmol) en ortoformi ato de trietilo (10 mi) se le añadió anhídrido acético (110 µ?, 1,1 mmol) y la mezcla se sometió a reflujo durante 1 hora. Después de enfriar a temperatura ambiente, el solvente se extrajo in vacuo. Los 2,88 g (99% de rendimiento) de N- 3 - ciano- 4 -p- tol il - ??-pirrol - 2 -i 1 formimida o de metilo se secaron azeotrópicamente con tolueno y se llevaron directamente a la próxima etapa .
Ejemplo 18. N' - ( 3 - ciano - 4 - - toli 1 - ??-pirrol - 2 -il) formimidamida.
El N- 3 -c i ano- 4 -p-tolil-lH-pirrol-2-ilformimidato de metilo bruto (2,88 g, 11,5 mmol) se disolvió en NH3 7 N en MeOH (80 mi) y se agitó a temperatura ambiente en un balón tapado durante 4 horas. El solvente se extrajo in vacuo y el producto de N' - ( 3 - c iano - 4 -p-tol i 1 - 1H -pi rol - 2 - i 1 ) formimidamida bruto se secó en alto vacío, durante la noche, para proporcionar 2,27 g (88 % de rendimiento) del producto.
Ejemplo 19. 5 -p - tol i 1 - 7H -pirrolo [ 2 , 3 - d] pirimidin-4 - amina .
Se disolvió N' - (3-ciano-4-p-tolil-lH-pirrol-2-il) formimidamida (2,27 g, 10,2 mmol) en MeOH (30 mi) y se calentó a reflujo. Se añadió metóxido de sodio (1,5 m, 25% en peso en MeOH, 5,1 mmol) y la reacción se agitó a reflujo durante 3 horas después de lo cual el producto precipitó de la solución. Después de enfriar a temperatura ambiente, el sólido se aisló por filtración y se secó en alto vacío para proporcionar 2,3 g (100%) de 5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-4 -amina pura como un sólido canela.
Ejemplo 20. 7- (3- (ter-butildimetilsililoxi) ropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-4 -amina .
A una suspensión a 0°C de 5-p-tolil- 7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin-4-amina (5,01 g, 22,3 mmol) en DMF (120 mi) se le añadió NaH (0,98 g de 60% de dispersión oleosa, 24,6 mmol) y la mezcla resultante se dejó calentar a temperatura ambiente.
Después de agitar durante 30 min, se le añadió gota a gota, durante 10 min, yoduro de 3- ( t-butildimetilsililoxi) propilo (7,38 g, 24,6 mmol) . Después de agitar durante 4 horas adicionales, la reacción se inactivo por la adición de 100 mi agua y el producto precipitado se filtró y se secó en alto vacío para proporcionar 7,78 g (88% de rendimiento) de 7- (3- ( ter-butildimetilsililoxi) propil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] irimidin-4 -amina . Masa exacta 396,23; Experimental 397,5 [M+H] + .
Ejemplo 21. 6-bromo-7- (3- (ter-butildimetilsililoxi) propil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-4 -amina .
A una solución de 7- (3- (ter-butildimetilsililoxi) propil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-4-amina (1,22 g, 3 mmol) en DMF (20 mi) se le añadió N-bromosuccinimida (0,65 g, 3,6 mmol) y la mezcla se agitó durante 24 horas protegida de la luz. La reacción se diluyó con EtOAc (25 mi) y se lavó con agua y salmuera. Las fracciones orgánicas combinadas se secaron en Na2S04 anhidro, se filtraron, se concentraron y se purificaron por cromatografía en columna flash (40% acetato de etilo/hexanos para proporcionar 0,9 g (62% de rendimiento) de 6-bromo-7- (3 (ter-butildimetilsililoxi) propil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-4 -amina . Masa exacta: 474,15; encontrada 47 [M]+ y 477 [M+2]+.
Ejemplo 22. 7 - (3 - (ter-butildimetilsililoxi) propil) -5-p tolil-6-vinil-7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin-4 -amina.
A una solución de 6-bromo-7- (3- (ter-butildimetilsililoxi) propil) -5-p-tolil-7H- irrólo [2,3-d] pirimidin-4 -amina (1,0 g, 2,1 mmol) en tolueno (30 mi), se le añadió tributilvinilestaño (0,8 mi, 2,73 mmol). Se burbujeó gas argón a través de la solución durante 10 min. Se le añadió rápidamente tetrakis (trifenilfosfina) paladio (244 mg, 0,21 mmol) y el gas argón se burbujeó a través de la solución durante otros 10 min. La reacción luego se agitó a reflujo durante 3 h. La reacción se filtró a través de Celite y el filtrado se concentró. El producto se purificó por cromatografía en columna flash en 50% de EtOAc/hexanos , para proporcionar un resto amarillo claro que se liofilizó de benceno para proporcionar 757 mg (85% de rendimiento) de 7- (3- (ter-butildimetilsililoxi) ropil) -5-p-tolil-6-vinil-7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin-4 -amina , como un polvo amarillo claro. Masa exacta 422,25; encontrada 423,1 [M+H] + .
Ejemplo 23. 4-amino-7- (3- (ter-butildimetilsililoxi) ropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin- 6 -carbaldehído .
A una solución de 7- (3- (ter-butildimetilsililoxi) propil ) -5-p-tolil-6-vinil-7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin-4 -amina (760 mg, 1,8 mmol) en 3:1 THF:H20 (11,3 mi), bajo argón, se le añadió gota a gota tetróxido de osmio (1,75 mi, 0,18 mmol, 2,5% in t-BuOH) . La reacción se agitó a temperatura ambiente bajo argón durante 20 min. Se añadió gota a gota peryodato de sodio (860 mg, 3,6 mmol, disuelto en 2,4 mi de agua caliente) a la reacción durante un período de 30 min. La reacción se agitó durante 1,5 h a temperatura ambiente y luego se diluyó con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con tiosulfato de sodio acuoso saturado y la fase acuosa se extrajo de nuevo con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se secaron en sulfato de sodio, filtraron y concentraron. El resto se purificó por cromatografía en columna flash en 50% de EtOAc/hexanos para proporcionar 417 mg (55% de rendimiento) de un aceite amarillento que solidificó después del decantamiento . Masa exacta 424,23; Experimental 425,1 [M+H]+.
Ejemplo 24. 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin- 6 -il) -2 -cianoacrilato de metilo.
A una solución de 4 -amino-7- (3 - ( ter-butildimetilsililoxi) propil) - 5 -p-tolil-7H-pirrólo [2,3-d] pirimidino-6-carbaldehído (52 mg, 0,123 mmol) en THF seco (1,5 mi) se añadió DBU (22 µ?, 0,147 mmol) y 2 -cianoacetato de metilo (13 mg, 0,135 mmol) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora después de lo cual la conversión alcanzó 90%. La reacción se concentró y el resto se purificó por cromatografía de capa fina preparatoria en 50% de EtOAc/hexanos para proporcionar 51 mg (80% de rendimiento) del cianoacrilato protegido con TBS como una película amarilla. A una solución del cianoacrilato protegido con TBS (51 mg, 0,098 mmol) en THF (1,5 mi) se añadió HC1 acuoso 1 N (500 µ?) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se diluyó con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con bicarbonato de sodio acuoso saturado y salmuera, luego se secó con sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El resto amarillo se purificó por precipitación de metanol/hexanos (1:3) para proporcionar 12 mg (25% de rendimiento) de 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil ) - 5 -p-tolil-7H-pirrólo [2, 3-d] pirimidin- 6 - il ) -2-cianoacrilato de metilo (mezcla de isómeros E/Z) como un sólido amarillo. Masa exacta 391,16; encontrada 392,0 [M+H] + .
Ejemplo 25. 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2 , 3 -d] irimidin-6-il) -2 -cianoacrilato de ter-butilo.
A una solución de 4-amino-7- (3- ( ter-butildimetilsililoxi) propil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-carbaldehído (100 mg, 0,235 mmol) en THF seco (2 mi) se le añadió DBU (45 µ? , 0,306 mmol) y 2-cianoacetato de ter-butilo (34 µ?, 0,235 mmol) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se diluyó con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con solución acuosa de HCl 0,1 N y salmuera, luego se secó en sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El resto se purificó por cromatografía en columna flash en 50% de EtOAc/hexanos y luego por purificación HPLC (gradiente 30-100% de MeOH durante 35 min, 10 mi min"1 de caudal de flujo, tiempo de retención 9,34 min) , para proporcionar 21,3 mg (21% de rendimiento) de 3- (4-amino-7- ( 3 -hidroxipropil ) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] irimidin-6-il) -2 -cianoacrilato de ter-butilo (mezcla de isómeros E/Z) . Fórmula química: C2 H27N5O3 Masa exacta 433,21; encontrada 434,1 [M+H] + .
Ejemplo 26. 3- (4 -amino-7 - (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin-6-il) -2 -cianoacrilamida .
A una solución de 4 -amino- 7 - ( 3 - ( ter-butildimetilsililoxi) propil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-carbaldehído (120 mg, 0,283 mmol) in THF seco (2 mi) y isopropanol (1 mi) se le añadió piperidina (28 µ? , 0,283 mmol) y 2-cianoacetamida (23 mg, 0,283 mmol) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas, después de lo cual se le añadió otro equivalente de 2- cianoacetamida y piperidina. Después de 10 días, la reacción se diluyó con acetato de etilo, la fase orgánica se lavó con agua y luego se secó en sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El resto bruto se disolvió en 3 mi de THF seco y se añadieron 1,2 mi de HC1 1 N. La reacción se agitó durante 1,5 horas y luego se diluyó con acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con bicarbonato de sodio acuoso saturado seguido por salmuera y luego se secó en sulfato de sodio, filtró y concentró. El resto se purificó por cromatografía en columna flash en 3-5% de MeOH/DCM para proporcionar 38 mg (42% de rendimiento) de 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-6-il) -2-cianoacrilamida (mezcla de isómeros E/Z) como un polvo amarillo. Masa exacta: 376,16; encontrada 377,4 [M+H] + .
Ejemplo 27. 2 -Ciano-N-bencilacetamida .
A una solución agitada de di i sopropi 1 e t i 1 amina (506 µ?, 3 mmol) y bencilamina (327 µ?, 3 mmol) en DMF se le añadió ácido cianoacético (85 mg , 1 mmol) , EDC (625 mg, 3 mmol) , y HOBt (208 mg , 1,5 mmol) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción luego se diluyó con éter y la fase orgánica se lavó dos veces con 1N HCl y once con salmuera. La fase orgánica se secó en sulfato de sodio, se filtró y se concentró por evaporación giratoria. El resto transparente se liofilizó en benceno para proporcionar 24 mg (14% de rendimiento) de un polvo blancuzco que no necesitó de purificación posterior .
Ejemplo 28. 2 -Ciano-N- isopropilacetamida .
A cianoacetato de metilo agitado (2,0 g, 20 mmol) a 0°C, se le añadió isopropilamina (1,7 mi, 20 mmol) gota a gota, manteniendo la temperatura debajo de 10°C. La reacción se agitó a 0°C durante 1 h, después de lo cual se añadieron 2 mi de NaOH acuoso 15% y la reacción se agitó, a temperatura ambiente, durante 5 min. La mezcla se diluyó con acetato de etilo y se lavó con agua. La fase orgánica se secó en sulfato de sodio, se filtró y se concentró para proporcionar 1,06 g (42% de rendimiento) de un sólido blanco, el cual no necesitó purificación posterior. Ref : Basheer, A. y col. J. Org . Chem . (2007), 72: 5297-5312.
Ejemplo 29. 3 - (4 -amino-7 - (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrólo [2 , 3 -d] irimidin-6-il) -N-bencil-2 -cianoacrilamida.
A una solución de 4-amino-7- (3- ( er-butildimetilsililoxi) ropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] irimidin-6-carbaldehído (58 mg, 0,138 mmol) en THF seco (1 mi) se le añadió piperidina (29 µ? , 0,276 mmol) y iV-bencil cianoacetamida (24 mg, 0,138 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente, durante 2 días, después de lo cual la conversión alcanzó el 50% y se detuvo. La reacción se concentró y el resto se purificó por cromatografía en columna flash en 50% de EtOAc/hexanos , para proporcionar un polvo amarillo que se disolvió en THF (1 mi) y se agregó 100 µ? de HC1 1 N. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, se diluyó con acetato de etilo, y las fases se separaron. La fase orgánica se lavó con bicarbonato de sodio acuoso saturado, seguido por un lavado con salmuera y luego se secó en sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El aceite amarillo se purificó por cromatografía en columna flash, eluyendo con 100% de EtOAc a 5% de MeOH/EtOAc , para proporcionar un resto amarillo que se liofilizó del benceno, para proporcionar 9,8 mg (46% de rendimiento) de 3-(4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-6-il) -N-bencil-2-cianoacrilamida (mezcla de E/Z isómeros) como un polvo amarillo. Masa exacta: 466,21; encontrada: 467,5 [M+H]+.
Ejemplo 30. 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin- 6 -il) -2 -ciano-N-isopropilacrilamida .
A una solución de 4-amino-7- (3- ( ter-butildimetilsililoxi) propil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] irimidin- 6 -carbaldehído (100 mg, 0,236 mmol) , en THF seco (1,5 mi) , se le añadió piperidina (50 µ? , 0,476 mmol) y N-isopropil cianoacetamida (60 mg, 0,476 mmol) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 días, después de lo cual la conversión alcanzó un 50%. La reacción se concentró y el resto se purificó por cromatografía en columna flash, en 50% de EtOAc/hexanos , para proporcionar una espuma amarilla que se disolvió en THF (1 mi) y HCl 1 N (100 µ?) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas, se diluyó con acetato de etilo y las fases se separaron. La fase orgánica se lavó con bicarbonato de sodio acuoso saturado, seguido por salmuera y luego se secó en sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El aceite amarillo se purificó por cromatografía en columna flash, eluyendo con 100% de EtOAc a 5% MeOH/EtOAc, para proporcionar un aceite amarillo que se liofilizó en benceno, para proporcionar 26 mg (54% de rendimiento) de 3 - ( 4 - amino- 7 - ( 3 - hidroxiprop i 1 ) - 5 -p -tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-6-il) -2-ciano-N-isopropilacrilamida (mezcla de E/Z isómeros) como un polvo amarillo. Masa exacta: 418,21; encontrada: 419,5 [M+H] + .
Ejemplo 31. 6 -bromo - 5 - - to 1 i 1 - 7H -pi rrolo [ 2 , 3 -d] irimidin-4- amina .
Se disolvió 5 -p- to 1 i 1 - ??- i rrol o [ 2 , 3 - d] i imi din -4-amina (1,5 g, 6,7 mmol) en DMF caliente y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. La suspensión turbia se agitó bajo argón, se protegió de la luz y se le agregó NBS (1,4 g, 8,04 mmol) , en porciones, durante 20 minutos. Una hora después de la adición, la solución se volvió transparente y se comenzó a formar un precipitado. Después de 2 horas, la reacción se filtró y el sólido se lavó con DMF . Los filtrados combinados se concentraron y agitaron en agua, durante 10 minutos, para proporcionar una segunda cosecha de sólido. Los sólidos grises se combinaron para proporcionar 1,464 g (72% de rendimiento) .
Ejemplo 32. 5 -p - tol i 1 - 6 - ini 1 - 7H-pi rrolo [ 2 , 3 - d]pirimidin-4- amina .
A una solución agitada de 6 -bromo- 5 -p- tol i 1 - ??- pirrolo [2 , 3 - d] pirimidin-4 -amina (500 mg , 1,65 mmol) se le añadió tributilvinilestannano (579 µ?, 1,98 mmol) y la solución se desgasificó durante 5 minutos. Se añadió tetrakistrif enilf osf ina de paladio (134 mg , 0,116 mg) y la reacción se llevó a reflujo y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de Celite y el sólido se lavó 3 veces con tolueno caliente. El filtrado se concentró y el resto se recristalizó en EtOAc /hexanos para proporcionar 190 mg (46% de rendimiento) de un sólido gris .
Ejemplo 33. (E) -3 - (4 -amino- 5 -p- tolil -7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-il) -2-cianoacrilamida. 41%, dos etapas Una solución 2,5% (p/v) de tetróxido de osmio en tert-butanol (136 µ?, 0,013 mmol) se agregó, gota a gota, a una solución agitada de 5-p-tolil-6-vinil-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-4 -amina (190 mg, 0,68 mmol) en 3:1 THF/H20 (5,2 mi) . La suspensión se agitó a temperatura ambiente durantelO minutos, seguido del agregado, gota a gota, de NaI04 (262 mg, 1,224 mmol) suspendido en 1 mi de H20. La reacción fue entonces agitada, a temperatura ambiente, durante la noche. La reacción se diluyó con acetato de etilo y se templó con tiosulfato de sodio saturado acuoso. La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se concentraron para obtener un sólido amarillo el cual fue disuelto en isopropanol/THF 2:1 (3 mi). A esta solución se le agregó cianoacetamida (30 mg, 0,359 mmol) y piperidina (35 µ? , 0,359 mmol) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, durante la cual se formó un precipitado amarillo. Este fue filtrado, para obtener 46 mg (41% de rendimiento, dos etapas) de 2-ciano-3- (7-p-tolil-5H-pirrolo [3 , 2-d] pirimidin-6-il) acrilamida. Masa Exacta: 318,12; Encontrada: 319,00 [M+H] + .
Ejemplo 34. (E) -3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin- 6 - il) acrilonitrilo .
A un frasco secado por fuego, se le agregó tert-butil 7- (3- ( ert-butildimetilsililoxi) propil) -6-formil-5-p-tolil- 7H-pirrolo [2 , 3-d] irimidin-4-ilcarbamato (218 -mg, 0,416 mmol) , (trifenilfosforaniliden) acetonitrilo (500,9 mg, 1,664 mmol) y CH2Cl2 seco (10 mi) . La reacción se agitó bajo argón a temperatura ambiente durantel6 horas, luego de lo cual, la reacción se concentró y el resto bruto se purificó mediante cromatografía de columna flash en 25% EtOAc/hexanos , para obtener 196 mg (87% de rendimiento) de 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-6-il ) acrilonitrilo como una mezcla de isómeros. El 3-(4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-6-il) acrilonitrilo (80 mg, 0,139 mmol) se disolvió en 2 mi de CH2C12 y se enfrió hasta O'C, luego de lo cual se le agregó 2 mi de TFA. La reacción se agitó a O'C durante 1 hora, para luego dejarla alcanzar temperatura ambiente. Luego de 16 horas, la reacción se concentró y el resto bruto se disolvió en 3 mi de THF seco y se le agregó 1 mi de HC1 1 N. La reacción se agitó durante 15 horas, luego se diluyó con acetato de etilo, la capa orgánica se lavó con bicarbonato de sodio saturado acuoso seguido de salmuera y luego se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El resto se purificó mediante cromatografía de columna flash en MeOH/DCM 3%, para obtener 9,1 mg (19% de rendimiento) de (£)-3-(4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-il) acrilonitrilo y 24,6 mg (53% de rendimiento) de (Z) -3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-6-il) acrilonitrilo . Fórmula Química C19H19N50 Masa Exacta: 333,16; Encontrada 334,5 [M+H] + .
Ejemplo 35. 3- (1- (9H-purin-6-il)piperidin-4-il) -2-ciano-N-metilacrilamida.
Se combinaron 1- (9H-purin-6-il)piperidina-4-carbaldehido (17 mg, 0,086 mmol) , 2 -ciano-metilacetamida (11 mg, 0,112 mmol) y PPh3 (28 mg, 0,106 mmol) en THF (1 mL) y se calentó hasta 110°C en un vial sellado. Luego de 18 horas de calentamiento, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (2 mL) y se lavó con agua (1 mL) . La capa orgánica se concentró y se sometió a TLC preparativa (eluyendo con 9:1 CH2Cl2:MeOH) para obtener 6 mg (23%) de 3- (1- ( 9H-purin- 6 - il ) piperidin-4-il) -2-ciano-N-metilacrilamida como un sólido blanco. Masa Exacta: 311,15, M/z Encontrada: 312,05 (M+H) + Ejemplo 36. 2-ciano-3- (lH-indazol-5-il) -N,N-dimetilacrilamida .
A una solución de 6-formil-lH-indazol (101 mg, 0,7 mmol) en THF (1 mL) se le agregó 2-ciano-iV-dimetilacetamida (80 mg, 0,7 mmol) y DBU (67 µL, 0,7 mmol). La solución marrón resultante se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, seguida de 4 horas a 60°C. Se detectó material de partida, por lo que la reacción se agitó durante otras 18 horas con una evolución mínima de producto adicional . La reacción se concentró, se la tomó en un pequeño volumen de EtOAc y el precipitado blanco resultante se recolectó mediante filtración para obtener 30 mg de 2-ciano-3- (lH-indazol-5-il) -N, N-dimetilacrilamida (19%) como un sólido blanco. Masa Exacta: 240,10, M/z, Encontrada: 241,09 (M+H)+.
Ejemplo 37. 3 - (3 - (lH-pirrolo [2 , 3 -b] iridina-3 -carbonil) fenil) -2 -ciano-N-metilacrilamida A una solución de 3 -( lH-pirrolo [2 , 3 -b] iridina-3 -carbonil) benzaldehido (47 mg, 0,2 mmol) en THF (1 mL) se le agregó 2 -cianoacetamida (19 mg, 0,2 mmol) y DBU (20 µ??, 0,2 mmol) y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante cinco minutos. Algunas gotas de MeOH se le agregaron a la reacción para evitar que un precipitado gomoso se pegue a las paredes y la reacción se agitó durante la noche con evolución a un precipitado amarillento. El precipitado se recolectó mediante filtración, para obtener 8 mg (12%) de 3-(3-(lJí-pirrolo [2 , -b] piridina-3-carbonil) fenil) -2-ciano-N-metilacrilamida como un sólido blanco. Masa Exacta: 330,11, M/z, Encontrada: 331,05 (M+H)+.
Ejemplo 38. 3 - (3 - (lH-pirrolo [2 , 3 -b] piridina-3 -carbonil) fenil) -2 -ciano-N, N-dimetilacrilamida A una solución de 3- (lH-pirrolo [2, 3 -b] iridina-3 -carbonil) benzaldehido (47 mg, 0,2 mmol) en THF (1 mL) se le agregó 2 -cianoacetamida (19 mg, 0,2 mmol) y DBU (20 µ?^, 0,2 mmol) y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante varias horas, punto en el que la suspensión marrón se transforma en una solución clara amarillenta. El día siguiente, la reacción se concentró hasta un sólido ceroso marrón, se resuspendió en EtOAc:MeOH (2:1), y el precipitado resultante se recolectó mediante filtración para obtener 12 mg (17%) de 3- (3- (lH-pirrolo [2 , 3 -ib] piridina-3-carbonil) fenil) -2 -ciano-N, N-dimetilacrilamida como un sólido blanco. Masa Exacta: 344.13, M/z Encontrada: 345.09 (M+H)+.
Ejemplo 39. 3 - (3 , 4 , 5- trimetoxifenil) - lH-indazol-5-carbaldehido 3-iodo-5-formilindazol (210 mg, 0,735 mmol), ácido trimetoxifenil borónico (187 mg, 0,882 mmol) y K2C03 (309 mg, 2,21 mmol) se combinaron en 5:1 Dioxano:H20 (2 mL) y se desgasificaron con burbujeo de argón durante 20 minutos. Se le agregó Pd(PPh3)4 (123 mg, 0,106 mmol) y el recipiente de reacción se purgó con argón. La reacción se sometió a microondas a 150°C durante quince minutos. La mezcla bruta de reacción se diluyó con EtOAc (20 mL) , se lavó con HC1 1M (10 mL) , H20 (10 mL) y salmuera (10 mL) , se secó con Na2S04 y se concentró. El resto se purificó en sílica, eluyendo con Hex:EtOAc 3:2 y las fracciones impuras conteniendo el producto se concentraron a un sólido amarillo. Este sólido amarillo fue suspendido en EtOAc y los sólidos blancos se filtraron para obtener 140 mg (83%) de 3- (3,4,5-trimetoxifenil ) -lff-indazol-5-carbaldehido, como un sólido blanco .
Ejemplo 40. 2 -ciano-3 - (3 - (3 , 4 , 5 - trimetoxifenil) - 1H-indazol-5-il) acrilamida.
A una solución de 3 - (3 , 4 , 5-trimetoxifenil ) - 1H- indazol-5-carbaldehido (52,0 mg, 0,16 mmol) y 2 -cianoacetamida (13,2 mg, 0,16 mmol) en THF (1 mL) se le agregó DBU (16 µ?;, 0,16 mmol) . La solución incolora se transformó en amarillo brillante luego del agregado de DBU y lentamente viró a rojo brillante durante el transcurso de 15 minutos. Luego de cuatro horas, la mezcla de reacción fue tomada en EtOAc (10 mL) y se lavó con HCl 1M (10 mL) , NaHC03 (10 mL) y salmuera (10 mL) . La capa orgánica se concentró y se purificó mediante TLC preparativa, eluyendo con CH2Cl2:MeOH 9:1, para obtener 5,3 mg (9%) de 2 -ciano- 3 - ( 3 - ( 3 , 4 , 5 - trimetoxifenil ) - 1H-indazol - 5 - il ) acri lamida como un sólido brillante amarillo. Masa Exacta: 378,13, M/z, Encontrada: 379,03 (M+H) + .
Ejemplo 41. 2 -ciano-N-metil - 3 - ( 3 - ( 3 , 4 , 5 -trimetoxifenil) - lH-indazol- 5 - il) acrilamida.
A una solución de 3- (3 , 4, 5-trimetoxifenil) -1H-indazol-5-carbaldehido (30 mg, 0,100 mmol) y 2-ciano-N-meti lacetamida (9,6 mg, 0,100 mmol), en THF (1 mL) , se le agregó DBU (10 µ??, 0,10 mmol) . La solución incolora se transformó en amarillo brillante luego del agregado de DBU y lentamente viró a rojo brillante durante el transcurso de 15 minutos. Luego de cuatro horas, la mezcla de reacción fue tomada en EtOAc (10 mL) y se lavó con HC1 1M (10 mL) , NaHC03 (10 mL) y salmuera (10 mL) . La capa orgánica se concentró y se purificó mediante TLC preparativa, eluyendo con CH2Cl2:MeOH 9:1, para obtener 17 mg (43%) de 2 - ciano-N-metil - 3 -( 3 -( 3 , 4 , 5 - trimetoxifenil ) -lH-indazol-5-il) acrilamida como un sólido brillante amarillo. Masa Exacta: 392,15, M/z, Encontrada: 393,07 (M+H) + .
Ejemplo 42. 2-ciano-N,N-dimetil-3- (3- (3,4,5-trimetoxifenil) -lH-indazol-5-il) acrilamida.
A una solución de 3- (3,4, 5-trimetoxifenil) -lfí-indazol-5-carbaldehido (50 mg, 0,16 mmol) y 2-ciano-N-metilacetamida (17,6 mg, 0,16 mmol), en THF (1 rtiL) , se le agregó DBU (16 L, 0,16 mmol). La solución incolora se transformó en amarillo brillante luego del agregado de DBU y, lentamente, viró a rojo brillante durante el transcurso de 15 minutos. Luego de cuatro horas, la mezcla de reacción fue tomada en EtOAc (10 mL) y se lavó con HC1 1M (10 mL) , NaHC03 (10 mL) y salmuera (10 mL) . La capa orgánica se concentró y se purificó mediante TLC preparativa, eluyendo con CH2Cl2:MeOH 9:1, para obtener 17 mg (26%) de 2-ciano-N,N-dimetil-3- (3- (3,4, 5-trimetoxifenil) -lH-indazol-5-il) acrilamida como un sólido brillante amarillo. Masa Exacta: 406.16, M/z, Encontrada: 407, 05 (M+H) +.
Ejemplo 43. 4-Amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidine-6-carbaldehido A una solución de 4 -Di- tert-butiloxicarbonilamino-7 - ( 3 -tert-butildimetilsiloxipropil) -5-p-tolil-7íí-pirrolo [2,3-d] irimidina-6-carbaldehido (1,43 g, 2,28 mmol) en diclorometano (12 mL) se le agregó TFA (5 mL) . La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 12 horas, luego se concentró bajo presión reducida. El resto se redisolvió en THF (12 mL) y se le agregó HC1 1M aq. (4 mL) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas y luego se diluyó con EtOAc (50 mL) y NaHC03 saturado acuoso (50 mL) . Se separaron las fases y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (50 mL) . Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (50 mL) y luego se concentraron bajo presión reducida. El resto fue azeotropado con benceno (50 mL) y secado in vacuo para obtener 0,99 g del aldehido desprotegido (húmedo) , el cual fue utilizado sin purificación posterior.
Ejemplo 44. Azetidina (X = H) , y 3 -hidroxiazetidina (X = OH) cianoacetamidas .
Etilcianoacetato (1,0 equiv.), azetidina (X = H) o clorhidrato de 3-hidroxiazetidina (X = OH) (1,1 equiv.) y trietilamina (1,5 equiv.) en EtOH (6 mL) fueron calentados a 80 °C durante 6 horas. La mezcla de reacción se concentró y el resto se particionó entre EtOAc (25 mL) y DI agua (25 mL) .
La fase acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 30 mL) . Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2S04) y se concentraron, para obtener un resto, el cual se purificó mediante cromatografía en sílica gel (EtOAc/Hexanos 4:1 para X = H; EtOAc/MeOH 16:1 para X = OH) para obtener la cianoacetamida deseada. Etilcianoacetato (550 mg, 4,86 mmol) y clorhidrato de azetidina (500 mg) rindieron 196,5 mg (33% de rendimiento) de azetidina cianoacetamida. Etilcianoacetato (469,4 mg, 4,15 mmol) y clorhidrato de 3 -hidroxiazetidina (500 mg) rindieron 89 mg (15% de rendimiento) de azetidina cianoacetamida .
Ejemplo 45. Síntesis de Cianoacrilamidas .
Procedimiento general para la síntesis de derivados de cianoacrilamida : 4-Amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7fí-pirrólo [2 , 3-d] pirimidina-6-carbaldehido (1,0 equiv.), la cianoacetamida adecuada (1,2-1,5 equiv.) y DBU (1.5-2.0 equiv.) fueron agitadas en THF (2 mL) a temperatura ambiente durante 1-3 días. La mezcla de reacción fue entonces concentrada y se purificó mediante TLC preparativa para obtener la cianoacrilamida como una mezcla de isómeros (E) - y (Z) .
Ejemplo 45a. 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-6-il) -2-ciano-N, N-dimeti1acri1amida.
El compuesto preparado a partir de N, N-dimetilcianoacetamida. Ver Basheer, A.; Yamataka, H.; Ammal, S. C. ; Rappoport, Z. J". Org. Chem. 2007, 72, 5297-5312. De rendimiento: 33,8 mg (24%, E:Z = 1,7:1). ESI-MS: 405,2 (MH+) Ejemplo 45b. 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin- 6- il) -2-ciano-N- (l-hidroxi-2-metilpropan-2-il) acrilamida.
El compuesto preparado a partir de 2-ciano-N- (1-hidroxi - 2 -metilpropan- 2 - il ) acetamida . Ver Santilli, A. A.; Osdene, T. S. J". Org. Chem. 1964, 29, 2066-2068. De rendimiento: 17,2 mg (39%) , ESI-MS: 449,2 (MH+) Ejemplo 45c. 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-6-il) -2 -ciano-N, N-dietilacrilamida.
El compuesto preparado a partir N, N-dietilcianoacetamida . Ver Wang, K. ; Nguyen, K. ; Huang, Y. ; Dómling, A. J. Comb. Che . 2009, 11, 920-927. De rendimiento: 9,2 mg (8%), ESI-MS: 433,2 (MH+) Ejemplo 45d. 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-6-il) -2- (pirrolidina-1-carbonil) acrilonitrilo .
El compuesto preparado a partir de la N-(2-cianoacetil) pirrolidina . Ver Wang y col., Id. De rendimiento: 1,6 mg (3%), ESI-MS : 431,2 (MH+) Ejemplo 45e. 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2, 3-d] irimidin-6-il) -2 - (azetidina- 1 - carbonil) acrilonitrilo.
De rendimiento: 16,5 mg (32%), ESI-MS: 417,2 (MH+) .
Ejemplo 45f. 3 - (4 -amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p-tol 7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-6-il) -2- (3 -hidroxiazetidina- 1-carbonil) acrilonitrilo.
De rendimiento: 20,1 mg (38%), ESI-MS: 433,2 (MH+) .
Ejemplo 45g. (E) -3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-tolil -7H-pir ólo [2 , 3-d] pirimidin-6-il) -2- ( -metilpiperazina 1-carbonil) acrilonitrilo.
El compuesto preparado a partir la N- (2-cianoacetil) ' -metilpiperazina . Ver Proenca, F . ; Costa, M. Green Chem. 2008, 10, 995-998. Rendimiento: 15,7 mg (25%), ESI-MS: 460,2 (MH+) Ejemplo 46. 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-6-il) -2-ciano-N-ciclopropilacrilamida.
A una solución de 4 - tert-butiloxicarbonilamino-7- (3-tert-butildimetilsiloxipropil) - 5 -p-tolil- 7H-pirrólo [2,3-d] pirimidina-6-carbaldehido (101 mg, 0,1925 mmol) y N-ciclopropilcianoacetamida (47,8 mg, 2,0 equiv.) en THF (2,2 mL) que fue preenfriada hasta 0-5 °C, se le agregó DBU (58 pL, 2,0 equiv.) . La mezcla de reacción se permitió calentar hasta temperatura ambiente, se agitó durante 1 hora y entonces se mantuvo a-20 °C durante 12 horas. La mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía en sílica gel (Hexanos/EtOAc 2:1) para obtener 53,2 mg (E:Z = 2:1, 44% de rendimiento) del intermediario protegido cianoacrilamida como un aceite amarillo. Este aceite se disolvió en CH2C12 (3 mL) y se le agregó TFA (1,5 mL) . Luego de 16 horas a 20-25 °C, la mezcla de reacción se concentró y el resto se redisolvió en THF (6 mL) y se le agregó HC1 1M aq. (2 mL) . La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 8 horas, entonces se templó con NaHC03 satd. aq. (20 mL) y salmuera (30 mL) y se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL) . Los extractos combinados de EtOAc se secaron (MgS04) y se concentraron, y el aceite obtenido se purificó mediante TLC preparativa (Tolueno/IPA 3:1, placa de 0,5 cm, 2 eluciones) para obtener la cianoacrilamida (26 mg, 74% de rendimiento durante 2 etapas) como un aceite amarillo.
Ejemplo 47. 1- (4-clorofenil) -2- (3- (hidroximetil) fenilamino) etanona.
Un frasco de fondo redondo de 100 mL con un agitador magnético cargado con alcohol 3 -aminobencílico (1,58 g, 12,85 mmol) , carbonato de potasio (3,05 g, 22,1 mmol) y ?,?'-dimetilformamida (10 mL) . La suspensión fue agitada mientras se le agregó, de a porciones, 2 -bromo-4 ' -chloroacetofenona (2,85 g, 12,2 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La reacción se diluyó con agua (80 mL) y el precipitado resultante se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y se secó in vacuo, proporcionando el producto (2,89 g, 86% de rendimiento).
Ejemplo 48. 2-amino-4- (4 -chlorofenil) -1- (3- (hidroximetil) fenil) -lH-pirrol-3-carbonitrilo.
Un balón de fondo redondo de 250 mL equipado con un agitador magnético se cargó con 1- (4 -clorofenil) -2- (3- (hidroximetil) fenilamino) etanona (2,88 g, 10,4 mmol) , hidróxido de potasio (85%) (1,8 g, 27 mmol), malonitrilo (1,32 g, 20 mmol) , agua (5 mL) y metanol (50 mL) . La mezcla se sometió a reflujo durante 1,5 h, luego de lo cual se formó un precipitado. La mezcla se diluyó con agua (50 mL) y el precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y se secó in vacuo, proporcionando el producto (1,68 g, 50% de rendimiento) .
Ejemplo 49. (3- (4-amino-5- (4 -clorofenil) -7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin-7 -il) fenil) metanol .
Un balón de fondo redondo de 250 mL, equipado con un agitador magnético, se cargó con 2-amino-4- (4 -clorofenil ) -1-(3- (hidroximetil) fenil) -lH-pirrol-3-carbonitrilo (1,60 g, 4,9 mmol) , trietil ortoformato (5 mL) y monohidrato del ácido p-toluensulfónico (5 mg) . La solución se calentó hasta 100 °C durante 45 min. El ortoformato de trietilo en exceso se eliminó bajo presión reducida y el aceite resultante fue secado brevemente in vacuo. Al sólido resultante se le agregó amoníaco (7 M en metanol, 20 mL) y el frasco fue sellado herméticamente. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La solución se concentró bajo presión reducida y se redisolvió en metanol (10 mL) . La solución se calentó hasta 80 °C y metóxido de sodio (25% p/v en metanol, 1 mL) se le agregó, gota a gota. La mezcla se sometió a reflujo durante 2 h, se enfrió hasta temperatura ambiente y se templó mediante el agregado de agua. La solución se extrajo con acetato de etilo (3x 50 mL) . La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El aceite resultante se purificó por medio de cromatografía de Si-gel (eluído EtOAc/Hex 1:1 hasta EtOAc 100%) . Las fracciones conteniendo el producto intermediario se combinaron y se concentraron bajo presión reducida. El aceite marrón rojizo resultante se disolvió en metanol (50 mL) y ácido clorhídrico 1M (50 mL) se le agregó. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La solución se particionó entre acetato de etilo y agua y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica fue secada sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró bajo presión reducida hasta un rendimiento del producto como un sólido amarillo claro .
Ejemplo 50. 3 - (4 -amino-5- (4 -clorofenil) -7H-pirrolo [2 , 3 -d] irimidin-7 -il) benzaldehido .
Un vial de 20 mL equipado con un agitador magnético se cargó con ( 3 - (4 -amino- 5 - ( 4 - clorofenil ) - 7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin- 7 - il ) fenil ) metanol (145 mg, 0,4 mmol), trietil amina (0,4 mL, 2,8 mmol) y sulfóxido de dimetilo (2 mL) . A una solución de trióxido de azufre · piridina (200 mg , 1,3 mmol) en DMSO (1,2 mL) se le agregó al vial y la solución resultante se agitó durantel h a temperatura ambiente. Se agregó ácido clorhídrico (1 M, 10 mL) y la solución durante 10 minutos adicionales. El precipitado resultante se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y se secó in vacuo, proporcionando el producto como un sólido blanco (162 mg, >99% de rendimiento) .
Ejemplo 51. (E) -3- (3- (4-amino-5- (4-clorofenil) -7H-pirrólo [2 , 3-d] irimidin-7-il) fenil) -2-cianoacrilamida.
Un vial de 20 mL, . equipado con un agitador magnético, se cargó con 3 - (4 -amino-5- (4 -clorofenil) - 7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin-7-il) benzaldehido (13 mg, 0,04 mmol) , 2-cianoacetamida (4 mg, 0,05 mmol), 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7 -ene (5 mg, 0,03 mmol) y tetrahidrofurano (1 mL) . La mezcla de reacción se calentó hasta 50 °C durante 24 h. Se determinó la presencia de material de partida remanente mediante cromatografía en capa delgado, por lo que se agregó acetato de piperidina (5 mg, 0,03 mmol) y 2-propanol (0,5 mL) y la solución se calentó hasta 60 °C durante 24 h adicionales. La solución resultante se particionó entre NaHC03 diluido y EtOAc . La solución se extrajo con EtOAc y la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El resto resultante se purificó mediante cromatografía en Si-gel (eluido EtOAc/Hex 3:1 hasta EtOAcl00% ) para obtener el producto como un sólido blanco (2 mg, 13% de rendimiento) . Masa Exacta: 414,10. M/z Encontrada: 415,1 (M+H) + Ejemplo 52. (E) -3- (3- (4-amino-5- (4-clorofenil) -7H-pirrolo [2 , 3 -d] irimidin-7 -il) fenil) -2 -ciano-N, N-dimetilacrilamida .
Un vial de 20 mL equipado con un agitador magnético se cargó con 3- (4-amino-5- (4 -clorofenil ) -7H-pirrolo [2, 3-d] irimidin-7-il) benzaldehido (35 mg, 0,10 mmol) , ?,?' -dimetil-2-cianoacetamida (12 mg, 0,11 mmol), 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-en (5 mg, 0,03 mmol), y 2-propanol (1 mL) . La mezcla de reacción se calentó hasta 60 °C durante 24 h. De acuerdo a lo determinado mediante cromatografía en capa delgada, únicamente el material de partida se encontraba presente, por lo que la solución se calentó hasta 80 °C durante 24 h adicionales. La solución se concentró bajo presión reducida, el resto resultante se redisolvió in DMSO (0,8 mL) y el producto se purificó mediante RP-HPLC (gradiente: MeCN/agua 20-95% con 0,1% TFA durante 25 min, tiempo de retención ~ 6.8 min) . Las fracciones conteniendo producto se combinaron, el solvente se eliminó bajo presión reducida y el sólido resultante se purificó mediante cromatografía Si-gel (eluido con EtOAc) . El producto s recogió como un sólido blanco (6,1 mg, 14% de rendimiento) Masa Exacta: 442,13. M/z Encontrada: 443.0 (M+H)+.
Ejemplo 53. (E) -3- (3- (4-amino-5- (4 -clorofenil) -7H pirrólo [2 , 3 -d] pirimidin-7 -il) fenil) -2 - (azetidina- 1-carbonil) acrilonitrilo .
Un vial de 20 mL equipado con un agitador magnético se cargó con 3 - (4 -amino-5 - ( 4 -clorofenil ) - 7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin-7-il) benzaldehido (15 mg, 0,04 mmol) , 3-(azetidin-l-il) -3-oxopropanonitrilo (12 mg, 0,1 mmol), 1 , 8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno (5 mg, 0,03 mmol) y 2-propanol (1 mL) . La mezcla de reacción se calentó hasta 60 °C durante 24 h. La solución se concentró bajo presión reducida y el resto resultante se purificó mediante cromatografía en Si-gel (eluido EtOAc 100% hasta MeOH/EtOAc 10%) . El producto se recogió como un sólido blanco (16 mg, 82% de rendimiento). Masa Exacta: 454,13. M/z Encontrada: 455,0 (M+H)+.
Ejemplo 54. (E) -3- (3- (4-amino-5- (4-clorofenil) -7H- pirrólo [2 , 3-d] pirimidin-7 -il) fenil) -2- (pirrolidina-1-carbonil) acrilonitrilo .
Un vial de 20 mL con un agitador magnético se cargó con 3 - ( -amino- 5 - (4 -clorofenil ) - 7H-pirrolo [2 , 3 -d] i rimidin- 7 - i 1 ) benzaldehido (15 mg , 0.04 mmol) , 3-oxo- 3 - (pirrol idin- 1 - i 1 ) propanoni t ri lo (14 mg , 0,1 mmol), 1 , 8 -diazabiciclo [ 5. .0 ] undec - 7 - eno (5 mg , 0,03 mmol) y 2-propanol (1 mL) . La mezcla de reacción se calentó hasta 60 °C durante 24 h. La solución se concentró bajo presión reducida y el resto resultante se purificó mediante cromatografía Si-gel (eluido EtOAc 100% hasta MeOH/EtOAc 10%) . El producto se recogió como un sólido blanco (12 mg , 59% de rendimiento) . Masa Exacta: 468,15. M/z Encontrada: 469,1 (M+H) + .
Ejemplo 55. ( E ) - 3 - ( 3 - ( 4 - amino - 5 - ( 4 - c loro f eni 1 ) -7H-pirrolo[2,3-d] pirimidin-7 -il) fenil) - 2 - ( 3 -hidroxiazetidina- 1-carbonil) acrilonitrilo.
Un vial de 20 mL con un agitador magnético se cargó con 3 - ( 4 - amino - 5 - ( 4 - c lorofeni 1 ) - 7H - p i rrolo [ 2 , 3 -d] irimidin- 7- il ) benzaldehido (15 mg , 0,04 mmol), 3-( 3 -hidroxiazet idin- 1 - il )- 3 -oxopropanoni tri lo (14 mg , 0,1 mmol), 1 , 8 - diazabi c i c lo [ 5.4.0 ] undec - 7 - eno (5 mg , 0,03 mmol) y 2-propanol (1 mL) . La mezcla de reacción se calentó hasta 60 °C durante 24 h. La solución se concentró bajo presión reducida y el resto resultante se purificó mediante cromatografía Si-gel (eluido 100% EtOAc hasta MeOH/EtOAc 10%) . El producto se recolectó como un sólido blanco (13 mg , 64% de rendimiento) . Masa Exacta: 470,13. M/z Encontrada: 471,0 (M+H)+.
Ejemplo 56. (E ) - 3 - ( 3 - ( 4 - amino - 5 - ( 4 - clorof eni 1 ) -7H-pirrolo [2 , 3 -d] irimidin - 7 - i 1 ) fenil) -2- (4- metilpiperazina-1 - carbóni 1 ) acrilonitrilo .
Un vial de 20 mL con un agitador magnético se cargó con 3- (4-amino-5- (4-clorofenil) -7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-7-il) benzaldehido (16 mg, 0,05 mmol) , 3- (4-metilpiperazin-l-il ) -3 -oxopropanonitrilo (17 mg, 0,11 mmol), 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-ene (5 mg, 0,03 mmol) y 2-propanol (1 mL) . La mezcla de reacción se calentó hasta 60 °C durante 24 h. Únicamente el material de partida se encontraba presente, de acuerdo a lo determinado mediante cromatografía en capa delgada, por lo que la solución se calentó hasta 70 °C durante 24 h adicionales. La solución se concentró bajo presión reducida, el resto resultante se redisolvió en DMSO (0.8 mL) y el producto se purificó mediante RP-HPLC (gradiente: MeCN/agua 5-80% con TFA 0,1% durante 25 min) . El producto se recogió como un sólido blanco (3 mg, 13% de rendimiento). Masa Exacta: 497,17. M/z, Encontrada: 498,1 (M+H)+.
Ejemplo 57. 2- (3- (hidroximetil) fenilamino) -1- (4-fenoxifenil) etanona.
Un frasco de fondo redondo de 100 mL con un agitador magnético se cargó con alcohol 3-aminobencílico (1,3 g, 10,6 ramol) , carbonato de potasio (1,4 g, 10,1 mmol) y ?,?'-dimetilformamida (15 mL) . La suspensión se agitó mientras se agregó, en porciones, 2 -bromo-4 ' -cloroacetofenona (3,04 g, 10,4 mmol) . La mezcla se calentó hasta 50 °C y se agitó durante 2 h. La mezcla de reacción se particionó entre EtOAc y agua y luego se extrajo con EtOAc . Las capas orgánicas se combinaron, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El resto resultante se purificó mediante cromatografía Si-gel (eluido EtOAc/hexanos 1:3 hasta EtOAc/hexanos 1:1). El producto se recolectó como un sólido blanco (1,39 g, 40% de rendimiento) .
Ejemplo 58. 2 -amino-1- (3 - (hidroximetil) fenil) -4 - (4 -fenoxifenil) - ??-pirrol-3 -carbonitrilo .
Un balón de fondo redondo equipado con un agitador magnético se' cargó con 2- (3- (hidroximetil) fenilamino) -1- (4- fenoxifenil ) etanona (1,39 g, 4,17 mmol) , hidróxido de potasio (85%) (0,8 g, 12 mmol) disuelto en agua (3 mL) , malonitrilo (0,50 g, 7,6 mmol) y metanol (15 mL) . La mezcla se calentó hasta 80 °C durante 2 h. La mezcla de reacción se particionó entre EtOAc y agua y luego se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas se combinaron, se secaron en sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El resto resultante se purificó por cromatografía Si-gel, proporcionando el producto (0,91 g, 57% de rendimiento) . Masa exacta: 381,15. M/z encontrada: 382,1 (M+H)+.
Ejemplo 59. (3- (4-amino-5- (4 - fenoxifenil) -7H- pirrolo [2 , 3 -d] irimidin-7 -il) fenil) metanol .
Un balón de 100 mi equipado con una barra magnética se cargó con 2-amino-l- (3- (hidroximetil) fenil) -4- (4- fenoxifenil) -lH-pirrole-3-carbonitrilo 2-amino-4- (4- clorofenil) -1- (3- (hidroximetil) fenil) -lH-pirrol-3- carbonitrilo (0,91 g, 2,7 mmol), ortoformiato de trietilo (3 mi), y monohidrato de ácido p-toluensulfónico (10 mg) . La solución se calentó a 100°C durante 1,5 h. La mezcla de reacción se dividió entre EtOAc y agua. La fase orgánica se lavó con 5% de NaHC03 y luego se secó en sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida. El resto resultante se purificó por cromatografía Si-gel (elusión 20% a 40% de EtOAc/Hex) . El aceite resultante se concentró a presión reducida y se redisolvió en solución de amoníaco/metanol (7 M, 10 mi) y el matraz se tapó herméticamente y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se redisolvió en solución de amoníaco/metanol (7 M, 10 mi) , el matraz se tapó herméticamente y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas adicionales. La solución se concentró a presión reducida, se redisolvió en metanol (20 mi) y se agregó metóxido de sodio (25% p/v en metanol, 1 mi) . La mezcla se sometió a reflujo durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se inactivo por la adición de ácido clorhídrico (1 M, 10 mi) . La solución se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución de reacción se neutralizó por la adición de bicarbonato de sodio y luego se extrajo con acetato de etilo (3x 50 mi) . La fase orgánica se secó en sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida. El aceite resultante se purificó por cromatografía Si-gel (elución de 100% de EtOAc a 10% de MeOH/EtOAc) para obtener el producto como un sólido amarillo claro (0,38 g, 38% de rendimiento) .
Ejemplo 60. 3- (4-amino-5- (4 - fenoxifenil) -7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7 - il) benzaldehído .
Un vial de 20 mi equipado con una barra de agitación magnética se cargó con (3- (4-amino-5- (4-fenoxifenil) -7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-7-il) fenil ) metanol (207 mg, 0,51 mmol) , trietilamina (0,5 mi, 3,6 mmol) , y dimetil sulfóxido (2,5 mi) . Una solución de trióxido -de azufre piridina (245 mg, 1,6 mmol) en DMSO (1,5 mi) se añadió al vial y la solución resultante se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió ácido clorhídrico (1 M, 5 mi) y la solución se agitó durante unos 5 minutos adicionales. La solución resultante se dividió entre EtOAc y agua y la fase orgánica se lavó con ácido clorhídrico (1 M, 2x) , bicarbonato de sodio (5%, lx) , agua (3x) , y salmuera (lx) . La fase orgánica luego se secó en sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida. El resto resultante se purificó por cromatografía Si-gel (elución 100% de EtOAc a 10% de MeOH/EtOAc) , proporcionando el producto como un sólido blanco (141 mg, 68% de rendimiento). Masa exacta: 406,14. M/ encontrada: 407,1 (M+H)+.
Ejemplo 61. Métodos generales para la síntesis de (E) -3 (3- (4-amino-5- (4 - fenoxifenil) -7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-7-il) fenil) -2 -ciano-acrilamidas .
Ejemplo 61a. (E) -3- (3- (4-amino-5- (4 - Eenoxifenil) -7H pirrólo [2,3-d] pirimidin-7 -il) fenil) -2 -ciano-N,N-dimetilacrilamida .
Un vial de 20 mi equipado con una barra de agitación magnética se cargó con 3- (4-amino-5- (4-fenoxifenil) -7H-pirrolo [2 , 3-d] irimidin-7-il) benzaldehído (20 mg, 0,05 mmol) , una cianoacetamida adecuada (0,05 mmol), 1,8-diazabiciclo [5 , 4 , 0] undec-7-eno (5 mg, 0,03 mmol) y 2-propanol (1 mi) . La mezcla de reacción se calentó a 60 °C durante 18 h. La solución se concentró a presión reducida y el resto resultante se redisolvió en DMSO (0,8 mi) y el producto se purificó por RP-HPLC (gradiente: 20-95% MeCN/agua con 0,1% de TFA durante 25 min) . El producto es un sólido blanco (4,2 mg, 17% de rendimiento). Masa exacta: 500,20. M/z encontrada: 501,3 (M+H)+.
Ejemplo 61b. (E) -3- (3- (4-amino-5- (4-fenoxifenil) pirrólo [2 , 3 -d] pirimidin-7 -il) fenil) -2- (4 -metilpiperazine- carbonil) acrilonitrilo .
Empleando el procedimiento descrito anteriormente, se sintetizó el compuesto de título. El compuesto es un sólido blanco (9,2 mg, 34% de rendimiento). Masa exacta: 555,24. M/z encontrada: 556,1 (M+H)+.
Ejemplo 61c. (E) -3- (3- (4-amino-5- (4-fenoxifenil) -7H- pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il) fenil) -2- (3 -hidroxiazetidina-1- carbonil) acrilonitrilo .
Empleando el procedimiento descrito anteriormente, se sintetizó el compuesto del título. El producto es un sólido blanco (9,7 mg, 37% de rendimiento). Masa exacta: 528,19. encontrada: 529,2 (M+H) + .
Ejemplo 61d. (E) -3- (3- (4-amino-5- (4-fenoxifenil) pirrólo [2 , 3 -d] pirimidin-7 -il) fenil) -2 -cianoacrilamida.
Empleando el procedimiento descrito anteriormente, se sintetizó el compuesto del título. El compuesto es un sólido amarillo claro (6,8 mg, 29% de rendimiento). Masa exacta: 472,16. M/z encontrada: 473,0 (M+H) + .
Ejemplo 62. 2 -ciano-N- (2 -hidroxietil) acetamida .
Un balón de 100 mi equipado con una barra de agitación magnética se cargó con cianoacetato de metilo (4,94 g, 49,9 mmol) y etanolamina (3,01 g, 49,8 mmol) . La mezcla de reacción se agitó durante 2 h a temperatura ambiente, hasta el punto en que la solución se concentró a presión reducida y se secó in vacuo para producir el producto como un sólido blanco (6,91 g, >99% de rendimiento).
Ejemplo 63. (E) -3- (3- (4-amino-5- (4 - fenoxifenil) -7H-pirrólo [2 , 3 -d] pirimidin-7 -il) fenil) -2-ciano-N- (2-hidroxietil) acrilamida.
Un vial de 4 mi equipado con una barra de agitación magnética se cargó con 3- (4-amino-5- (4 - fenoxifenil ) -7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin-7-il) benzaldehído (9 mg, 0,02 mmol) , 2-ciano-N- (2-hidroxietil) acetamida (4 mg, 0,03 mmol), acetato de piperidinio (1 mg, 0,01 mmol) y 2 -propanol (0,5 mi) . La mezcla de reacción se calentó a 60 °C durante 24 h. La solución se concentró a presión reducida y el resto resultante se purificó por cromatografía Si-gel (elución 100% de EtOAc a 10% de MeOH/EtOAc) para producir el producto, el cual posteriormente se purificó por RP-HPLC (gradiente: 20-95% de MeCN/agua con 0,1% de TFA durante 25 min) para producir el producto como un sólido blanco (3,1 mg, 27% de rendimiento). Masa exacta: 516,19. M/z encontrada: 517,0 (M+H) + .
Ejemplo 64. Determinación de constantes inhibitorias. Métodos. CTD RSK2 y His6-ERK2 se expresaron y purificaron como se describió (Cohén y col., Science, 308: 1318) . La imitante C436V del CTD de RSK2 se generó por mutagénesis Quikchange (Stratagene) y fue indistinguible del CTD RSK2 WT en ensayos de actividad de cinasa, tales como los descritos previamente. CTD de RSK2 WT y C436V (10 µ?) se activaron con His6-ERK2 (10 µ?) en 20 mM de HEPES [pH 8,0], 10 mM de MgCl2, 2,5 mM de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) , 0,2 mg/ml de BSA y 200 µ? de ATP, durante 30 min a 22 "C. La CTD de RSK2 activada (5 nM) en 20 mM de HEPES [pH 8,0], 10 mM de MgC12, 2,5 mM de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), 0,25 mg/ml de BSA y 100 µ? de ATP se preincubaron con inhibidores (diez concentraciones, por duplicado) durante 30 min. Las reacciones de cinasa se iniciaron por la adición de 5 µCi de [?-32?]??? (6000 Ci/mmol, NEN) y 167 µ? de sustrato peptídico (RRQLFRGFSFVAK) (SEQ ID NO:l) y se realizaron durante 30 min a temperatura ambiente. La actividad de cinasa se determinó por la siembra de 5 µ? de cada reacción en láminas secas de nitrocelulosa que se han prelavado con NaCl 1 M en 0,1% H3P04. Las hojas de nitrocelulosa se lavaron una vez con 1% de solución de AcOH y dos veces con una solución de NaCl 1 M en 0,1% de H3PO4 (5-10 min por lavado). Las transferencias secas se expusieron durante 30 min a una placa de fósforo de depósito y se escanearon con un visualizador de imágenes Typhoon (GE Life Sciences) . Los datos se cuantificaron usando el programa SPOT ( night, Z. y col., Nature Protocole, 2: 2459-66) , y los valores de IC50 se determinaron usando el programa de computación GraphPad Prism 4.0.
Resultados. La Tabla 1 proporciona la mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC50 en µ?) para pirrólo [2 , 3 - d] pirimidinas e lee t rof í 1 icas 1-8, hacia el dominio de cinasa C-terminal (CTD) de RSK2 WT y RSK2 C436V C-terminal. Adi c ionalment e , los compuestos 4-6 se analizaron para determinar la inhibición de CTD RSK2 en presencia de 10 mM de glutatión reducido (GSH) . A pesar de la reacción de modo reversible con cianoacrilatos/cianoacrilamidas 4-6 (la reacción de GSH con los compuestos 4-6 se controló por espectroscopia UV/visible a 350-400 nm) y de estar presente en un millón de veces la concentración de CTD RSK2 , el glutatión no presentó efecto sobre la potencia inhibidora de 4-6. En forma compatible con la formación de un aducto covalente entre Cys436 y el beta-carbono electrof í lico de los restos de cianoacrilato y cianoacrilamida de 4-8, la mutación de cisteína-436 a valina (C436V) produjo una pérdida >1000 veces en la potencia inhibidora. Finalmente, los cianoacrilatos y las cianoacrilamidas 4-8 fueron signif cativamente más potentes que los compuestos 1-3, los cuales se basan en aceptores de Michael más convencionales (vinil cetona, éster acrilato, acrilonitrilo) . N/d, no determinado.
Tabla 1. Valor de IC50 para compuestos y especies de RSK2 seleccionados .
IO M) Ejemplo 65. Espectrometría de masas de la reacción del CTD de RSK2 con los compuestos 1-8.
Métodos. El CTD de RSK2 (RSK2 humano, 399-740) se expresó en E.coli como una proteína de fusión marcada con His6 y se purificó por cromatografía de afinidad Ni/NTA, seguido por la escisión de His6-marca y posterior purificación por cromatografía de exclusión por tamaño. El CTD de RSK2 (5 µ?) se incubó con los compuestos indicados (25 µ?, 5 equiv) durante 1 h, a temperatura ambiente, en amortiguador (20 mM de HEPES [pH 8,0], 100 mM de NaCl , 10 mM de gCl2) . La reacción se detuvo por la adición de un volumen igual de ácido fórmico al 0,4%, y las muestras se analizaron por cromatografía líquida (columna de proteína Microtrap C18 [Michrom Bioresources] , 5% de MeCN, 0,2% de ácido fórmico, 0,25 ml/min; se eluyó con 95% de MeCN, 0,2% de ácido fórmico) y espectrometría de masas ESI en línea (LCT Premier, Waters) . Las masas moleculares de los aductos de CTD de RSK2 y pirrólo [2 , 3-d] pirimidina electrofílica se determinaron con el programa de computación de deconvolución de MassLynx y se muestran en formato de histograma.
Resultados. Como se ilustra en las Fig. 1A y Fig. IB, a pesar de su potencia más alta como inhibidores de RSK2 , los cianoacrilatos y las cianoacrilamidas 4-8 NO modifican de manera irreversible el dominio de cinasa C-terminal de RSK2 (CTD, por sus siglas en inglés) , tal como se reveló por análisis de espectrometría de masas de alta resolución. Las pirrólo [2 , 3-d] pirimidinas 1-3 contienen "ojivas" electrofílicas convencionales y, tal como se esperaba, formaron aductos 1:1 irreversibles con RSK2. Esta conclusión se encuentra avalada por la formación de un nuevo pico en el espectro de masa correspondiente a la masa molecular del CTD de RSK2 , más la masa molecular del compuesto electrofílico (Fig. 1A) . Cabe mencionar que la modificación del CTD de RSK2 por acrilato 2 y acrilonitrilo 3 fue algo más lenta con respecto a la enona 1, debido a la menor electrofilicidad intrínseca de las ojivas de acrilato/acrilonitrilo.
En contraposición a los compuestos 1-3, los inhibidores de cianoacrilato y cianoacrilamida 4-8 no formaron aductos irreversibles con CTD de RSK2 , tal como se demuestra por la presencia de un solo pico en los espectros de masa correspondientes al CTD de RSK2 no modificado. A pesar de la carencia de modificación irreversible de RSK2 , los compuestos 4-8 son inhibidores de la actividad de cinasa RSK2 significativamente más potentes que los inhibidores irreversibles 1-3 (Tabla 1) . La mutante RSK2 Cys436Val (C436V) fue -1000 veces menos sensible a los compuestos 4-8 (Tabla 1) , lo que demuestra que la inhibición potente requiere de Cys436. En conjunto, estos datos sugieren que los compuestos 4-8, todos los cuales contienen un cianoacrilato o una cianoacrilamida electrófilo, inhiben la actividad de cinasa RSK2 por la formación de un enlace covalente reversible entre el beta-carbono electrof ílico del resto cianoacrilato/cianoacrilamida y la Cys436 de la RSK2. La evidencia adicional para un mecanismo de inhibición reversible covalente para esta clase de electrófilos (cianoacrilatos y cianoacrilamidas ) se proporciona a continuación .
Ejemplo 66. Recuperación de la actividad de CTD de RSK2 Métodos. A una solución de CTD RSK2 (50 nM, preactivados con 1 equivalente de ERK2) en un amortiguador conteniendo 20 mM de HEPES [pH 8,0], 10 mM de MgCl2, 2,5 mM de. tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) , 0,25 mg/ml de BSA y 100 µ? de ATP, se le agregó las pirrólo [2 , 3-d] irimidinas (1 µ?) indicadas. Luego de 60 min a temperatura ambiente, las reacciones se transfirieron a un cásete de diálisis (0,1-0,5 mi Slide-A-Lyzer, M CO 10 kDa, Pierce) y se dializó contra 2 litros de amortiguador (20 mM de Hepes [pH 8,0], 10 mM de MgCl2, 1 mM de DTT) a 4°C. El amortiguador de diálisis se intercambió luego de 2 horas, para luego se intercambiarse cada 24 horas, hasta el final del experimento. Las alícuotas se extrajeron de los casetes de diálisis cada 24 horas, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y, posteriormente, se analizaron por triplicado, para determinar la actividad de cinasa RS 2. La actividad de cinasa para cada muestra se normalizó al control de DMSO para este punto de tiempo y se expresó como la media ± SD.
Resultados. Como se ilustra en la Fig. 2, la actividad de cinasa de CTD de RSK2 se recupera de la inhibición con las pirrólo [2 , 3-d] pirimidinas 6 y 7 después de la diálisis, lo que indica que 6 y 7 son inhibidores reversibles. Los datos de la Fig. 2 muestran que, después de la diálisis intensiva a 4°C, la actividad de cinasa de RSK2 se recupera de una manera dependiente del tiempo de la inhibición por un exceso (20 equivalentes, 1,0 µ?) de cianoacrilamidas 6 (-60% de recuperación) y 7 (-25% de recuperación) . En consecuencia, las cianoacrilamidas 6 y 7 son inhibidores reversibles de RSK2 de disociación lenta, con vida media de disociación de ~3 días y >4 días, respectivamente, en estas condiciones (diálisis a 4°C) . Cabe mencionar que la disociación es más rápida a temperatura ambiente y procede a la finalización en presencia de un competidor irreversible (ver Fig. 3) . En contraste a la recuperación parcial de la actividad de cinasa observada con las cianoacrilamidas 6 y 7, el CTD de RSK2 permaneció completamente inhibido por la enona 1 y la fluorometilcetona 9 durante 4 días de diálisis, lo que además demuestra que estos compuestos son inhibidores irreversibles. Estos resultados son compatibles con los datos de LCMS, que muestran que la enona 1 (Fig. 1A) y la fluorometilcetona 9 (Fig. 3) reaccionan de modo irreversible con RSK2 , mientras que los cianoacrilatos y las cianoacrilamidas no forman aductos de RSK2 irreversibles. Se proporciona evidencia adicional de que las pirrólo [2 , 3 -d] pirimidinas sustituidas con cianoacrilato y cianoacrilamida forman complejos con RSK2 completamente reversibles, de disociación lenta en la Fig. 3.
Ejemplo 67. Cinéticas de disociación de los inhibidores covalentes reversibles.
Métodos. Se preincubaron CTD de RSK2 (5 µ?) en 20 mM de HEPES [ H 8,0], 10 m de MgCl2, 100 mM de NaCl , 2,5 mM de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) y 0,2 mg/ml de BSA con 10 µ? de inhibidor 1, 4-7 (o control de DMSO) durante 60 min a temperatura ambiente. Luego se añadió FMK 9 (100 µ?) , se extrajeron alícuotas en puntos de tiempo diferentes (0,5-1500 min) y se inactivaron inmediatamente mediante la mezcla con un volumen igual de ácido fórmico 0,4%. Las muestras se analizaron por LCMS con un espectrómetro de masas LCT Premier y programa de computación de deconvolución de MassLynx, tal como el que se describe en la Fig. 1. Los picos que corresponden a CTD de RSK2 vacío (en el caso del pre-tratamiento con 4-7; el pre-tratamiento con enona 1 produjo el cambio de masa esperado, el cual no cambió después de la adición de FMK) y los CTD de RSK2 modificado con FMK se integraron en cada punto de tiempo y el porcentaje de aducto de FMK se gráfico en función de tiempo (indicado como "% de Disociación" en el gráfico de la parte izquierda de la Fig. 3) . El gráfico de la parte derecha de la Fig. 3 muestra la cinética de marcación de FMK en ausencia de cualquier competidor. Los datos cinéticos (% de aducto de FMK versus tiempo) se ajustaron con una exponencial simple (PRISM 4.0) para obtener las vidas medias de disociación ilustradas en la tabla. Los experimentos de control mostraron que la RSK2 C436V no fue modificada por FMK 9 bajo estas condiciones.
Resultados. Como se ilustra en la Fig. 3, los cianoacrilatos/cianoacrilamidas 4-7 disocian con una vida media de horas a partir del CTD de RSK2 plegado, intacto, medida por medio de la marcación competitiva con la fluorometilcetona 9. Un gran exceso molar de la fluorometilcetona 9 (100 µ?, 20 equivalentes; "FMK" en la Fig. 3) modificó rápida e irreversiblemente el CTD de RSK2 (tu 2 < 2 min) , tal como reveló el análisis de LCMS del CTD de RSK2 (Fig. 3, gráfico izquierdo superior) . En contraste, cuando el CTD de RSK2 se trató primero con los cianoacrilatos/las cianoacrilamidas 4-7 (2,0 equivalente) , la modificación resultante del posterior tratamiento con FMK 9 (100 µ?, 20 equivalentes) fue mucho más lenta, y se produjo con una vida media (ti/2) de 42-245 min (Fig. 3, gráfico derecho superior) . Debido a que la modificación de apo-CTD de RSK2 por FMK 9 ocurre en menos de 2 min, la tasa de modificación de FMK observada de RSK2 pre unida a los compuestos 4-7, es aproximadamente igual a la tasa de disociación de cianoacrilato/cianoacrilamida preunido. La metil vinil cetona 1, un aceptor de Michael convencional, no disoció en estas condicione y no se observó la marcación de FMK, incluso luego de 24 horas (Fig. 3) . Estos datos son compatibles con los experimentos de diálisis de la Fig. 2 y revelan que los cianoacrilatos/cianoacrilamidas 4-7 se disocian de' manera lenta, aunque completa, del CTD de RSK2 funcional, intacto, con una vida media de disociación de 1-4 horas. Los datos además revelan que las "tasas de disociación" de los inhibidores de cianoacrilatos/cianoacrilamidas se pueden ajustar por medio de la modificación de los sustituyentes éster y amida. La N-isopropil cianoacrilamida presentó una tasa de disociación más lenta, compatible con una potente actividad inhibidora de RSK2 in vitro y en ensayos basados en células (ver Tabla 1 y Fig. 6) .
Ejemplo 68. Formación del enlace covalente entre Cys436 y el Compuesto 7.
Métodos. A una solución de la cianoacrilamida 7 (1,0 equiv. , 100-200 µ?) en solución salina regulada por fosfato (PBS) se le agregó T RSK2 CTD, C436V RSK2 CTD (1,5 equiv.) o amortiguador solo. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se obtuvo el espectro de absorbancia UV/Visible (Espectrofotómetro NanoDrop 1000) . Se agregó SDS (concentración final del 2%) , guanidina (concentración final 3 M, pH 8) o proteinasa K (0,02 equivalentes sobre la base de RSK2 CTD) y se registró el espectro de absorbancia UV/Visible después de 1 minuto a TA (SDS, HCl de guanidinio) o de 3 h a 37 'C (proteinasa K) . Los espectros de los experimentos de adición de proteinasa K y SDS se muestran en los paneles medio e inferior, respectivamente. En cada experimento, los valores de absorbancia a 400 nm se normalizaron al valor de la cianoacrilamida 7 en amortiguador solo y se representaron sobre el gráfico de barras. Los experimentos de control demostraron que ni el SDS, ni la guanidina, ni la proteinasa K afectaron el espectro de absorbancia de la cianoacrilamida 7 a 400 nm.
Resultados. Tal como se ilustra en la Fig. 4, el enlace covalente entre Cys436 y la cianoacrilamida 7 se revierte en segundos, luego de la desnaturalización o la digestión proteolítica de RSK2. Monitoreamos la formación y la inversión de la formación del enlace covalente entre RSK2 y la cianoacrilamida 7 mediante espectroscopia de absorción UV/visible. La cianoacrilamida 7 absorbe luz visible con un máximo a -400 nm (Fig. 4, paneles medio e inferior), como era de esperar para un resto de cianoacrilamida conjugado a un sistema heteroaromático . La adición de un exceso de RSK2 CTD (1,5 equiv.) a la cianoacrilamida 7 produjo la desaparición completa del pico a 400 nm, lo que indicó la alteración del cromóforo cianoacrilamida por el ataque nucleofílico de la Cys436. En cambio, la adición de RSK2 CTD portadora de la mutación C436V no tuvo efecto alguno sobre el espectro de absorbancia de la cianoacrilamida 7 (Fig. 4, gráfico de barras) . Este control también corrobora nuestra interpretación de que la pérdida del pico de 400 nm es el resultado de la formación de un enlace covalente entre Cys436 de RSK2 y el carbono beta electrofílico del resto cianoacrilamida del compuesto 7.
Utilizamos tres métodos independientes para alterar el estado plegado del dominio cinasa de RSK2 unido a la cianoacrilamida 7: (1) 0,02 equiv. de proteinasa K ("Prot K" ) , una proteinasa no específica que digiere proteínas plegadas para dar pequeños péptidos; (2) dodecil sulfato de sodio ("SDS") al 2%, un detergente desnaturalizante de proteínas bien caracterizado; y (3) guanidina HCl ( "Guan" ) 3 M, un caótropo que altera el plegamiento nativo tridimensional de la mayoría de las proteínas. Los tres desnaturalizantes de proteínas dieron lugar a la reaparición del pico de absorbancia a 400 nm, lo que indicó que el enlace covalente entre Cys436 y la cianoacrilamida 7 se había roto. La inversión de la formación del enlace covalente tuvo lugar en segundos, en forma concomitante con la desnaturalización de RSK2 (por el SDS y la guanidina HCl) o la digestión proteolítica (la digestión completa con 0,02 equiv. de proteinasa K tuvo lugar durante ~3 h) . Los espectros de absorbancia se muestran en los paneles medio e inferior para los experimentos con proteinasa K y SDS, respectivamente (los valores absolutos de absorbancia son diferentes en los dos experimentos porque se utilizaron diferentes concentraciones de la cianoacrilamida 7) . Los valores de absorbancia para las tres condiciones se normalizaron a la absorbancia de la cianoacrilamida 7 en amortiguador solo y se muestran en el gráfico de barras. La Fig. 5 muestra cromatogramas LCMS derivados de experimentos similares, lo que prueba que la adición de desnaturalizantes proteicos al complejo covalente formado entre la cianoacrilamida 7 y la RSK2 CTD produce la liberación cuantitativa de la cianoacrilamida 7.
Nuestros datos sugieren que no es probable que los inhibidores con estructura de cianoacrilamida formen aductos covalentes permanentes con proteínas celulares, pues una vez que la proteína se despliega y/o es digerida proteolíticamente (una pre-condición probable para determinar una reacción inmunitaria demorada) , el enlace covalente se torna cinética y termodinámicamente inestable y se disocia rápidamente. Hemos demostrado este comportamiento con un complejo de alta afinidad (nanomolar a picomolar) entre la cianoacrilamida 7 y RSK2 CTD, en el que el período de semi-disociación cambió de ~3 h en el estado plegado a menos de 1 minuto luego de la desnaturalización del dominio cinasa. En coherencia con estas observaciones, el glutatión, un péptido que contiene abundante proporción de cisteína, formó aductos covalentes con los compuestos 4-8 (lo que se demostró mediante espectroscopia UV/Visible) los cuales se disociaron rápidamente, tal como se demuestra por (1) la rápida recuperación del cromóforo cianoacrilato/cianoacrilamida con la dilución y (2) la potencia inhibitoria no perturbada de RSK2 en presencia de glutatión 10 mM (Tabla 1) . Por lo que sabemos, la dependencia de la velocidad de disociación del enlace covalente de un aducto tiol de proteína/electrófilo con el estado plegado de la proteína no ha sido descrita.
Ejemplo 69. Recuperación del Compuesto 7 después de la desnaturalización del complejo RSK2 CTD/Compuesto 7.
Métodos. Se incubó la cianoacrilamida 7 (250 µ?) en ausencia o en presencia de RSK2 CTD (300 µ?) , durante 10 minutos, en un volumen total de 50 µ?. Se agregó clorhidrato de guanidina (50 µ?, 6 M, pH 8) y el contenido se mezcló suavemente durante 1 minuto, tras lo cual se añadió acetonitrilo hasta una concentración final de 50%. La solución se filtró (tamaño de poro: 0,2 µp?) y se analizó mediante LCMS (inyección de 20 µ?, columna Waters XTerra MS C18, 5-70% MeCN/agua + 0,1% de ácido fórmico durante 20 min; Módulo de Separaciones Waters 2695 Alliance, espectrómetro de masas Waters Micromass ZQ) .
Resultados. Tal como se ilustra en la Fig. 5A y en la Fig. 5B, en coherencia con los datos espectroscópicos que se muestran en la Fig. 4, el análisis por LCMS reveló la recuperación cuantitativa de la cianoacrilamida 7 después de la desnaturalización del complejo RSK2 CTD/cianoacrilamida 7 con guanidina 3 M. El primer cromatograma (Fig. 5A) (?= 350 nm) muestra a la cianoacrilamida 7 disuelta en amortiguador con guanidina HC1 3 M. El segundo cromatograma (Fig. 5B) (? = 350 nm) muestra la recuperación de la cianoacrilamida 7 pura después del tratamiento del complejo RSK2 CTD/cianoacrilamida 7 con guanidina HC1 3 M. Se observaron en ambas muestras dos picos principales, correspondientes a los isómeros E y Z de la cianoacrilamida 7, respectivamente. Las áreas de los picos fueron similares en el control y en las muestras tratadas con RSK2 CTD, lo que indica una recuperación cuantitativa de la cianoacrilamida 7 después de la desnaturalización con guanidina. El análisis por EM de cada pico confirmó su identidad como E- o Z-cianoacrilamida 7 (PM calculado, 418,2; [M+H] observado, 419,1).
Ejemplo 70. Inhibición de la autofosforilación de Ser386 en RSK2.
Métodos. Se transíectaron células HEK-293 en un matraz de 75 cm2 (-80% de confluencia) con el vector de expresión pMT2 que codifica RSK2 , con etiqueta de HA usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Luego de 12 h, las células se tripsinizaron y se sembraron en placas de 6 pocilios a razón de 600.000 células por pocilio en DMEM con 10% de suero. Después de transcurridas 16 h más, se retiró el suero de las células durante 4 h y luego se las trató con las concentraciones de inhibidores indicadas, durante 2 h en DMEM exento de suero. Luego del tratamiento con inhibidor, las células fueron estimuladas durante 30 min con miristato acetato de forbol (PMA) (100 ng/ml) , luego se lavaron con 2 mi de PBS frío y se congelaron en la placa a -80 'C. Las células se descongelaron y se transfirieron por raspado a 80 µ? de amortiguador de lisis (Hepes 20 mM, pH 7,9, NaCl 450 mM, 25% de glicerol, MgCl2 3 mM, EDTA 0,5 mM) con inhibidores de proteasa (Complete, Roche) y fosfatasa (Cócteles 1 y 2, Sigma-Aldrich) . Los lisados se clarificaron por centrifugación y se normalizaron mediante cuantificación con el ensayo de Bradford. A los lisados se les añadió amortiguador de muestra de Laemmli y las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 10% y se analizaron mediante transferencia Western con fosfo-Ser386 RSK2 (dilución 1:500, mAb de conejo, Cell Signaling #9335) y anticuerpos anti-HA (dilución 1:1000, monoclonales 12CA5 de ratón, Roche) . Las imágenes se registraron en un sistema de imágenes LI-COR Odyssey (LI-COR Biosciences) , y las intensidades de banda se integraron utilizando un programa LI-COR. Para cada condición, se calculó la relación entre la señal de la fosfo-Ser386 y la señal de HA-RSK2 y se expresó como porcentaje respecto del valor control de DMSO (+ PMA) . Estos datos se presentan en el gráfico.
Resultados. Tal como se ilustra en la Fig. 6, el cianoacrilato 5 y las cianoacrilamidas 6 y 7 inhiben la autofosforilación de Ser386 en RSK2 en células de mamífero. Obsérvese que la N-isopropil cianoacrilamida 7 fue la más potente (IC50 < 30 nM) entre todos los inhibidores ensayados, mientras que la cianoacrilamida 6 tuvo una débil actividad (IC50 ~ 1000 nM) . Los datos muestran que los inhibidores con estructura de cianoacrilato y cianoacrilamida tienen permeabilidad celular y son suficientemente potentes como para competir con elevadas concentraciones int racelulares de ATP y glutatión.
Ejemplo 71. Determinación de la utilidad general de las definas activadas para inhibir proteínas terapéuticamente relevantes.
Métodos. Para los ensayos de cinasa de RSK2 , véase el Ejemplo 64 anterior. Se expresó T175A NEK2 humana de longitud completa (denominada "NEK2") y se purificó tal como se describió anteriormente (Knapp S. y col., J. Biol Chem., 2007, 282: 6833 -6842) . La mutante C22V de NEK2 se generó mediante mutagénesis Quikchange (Stratagene) y resultó indistinguible de NEK2 en los ensayos de actividad de cinasa. Las cinasas de NEK2 (60 nM) se pre - incubaron en Hepes 20 m , pH 7,6, MgCl2 10 mM , EDTA 1 mM , 0,2 mg/ml de BSA y ATP 100 µ? con inhibidores (8-10 concentraciones, por duplicado) durante 30 min, a temperatura ambiente. Las reacciones de cinasas se iniciaron por adición de 0,4 µ??/µ? de ?-32?-??? (6000 Ci/mmol, NEN) y 2,37 mg/ml de ß-caseína (Sigma) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Se pre-incubó PLK1 Humana (Millipore, número de catálogo 14 -777M) (7,2 nM) en Hepes 20 mM, pH 7,6, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM , 0,2 mg/ml de BSA y ATP 100 µ? con inhibidores (8-10 concentraciones, por duplicado) durante 30 min, a temperatura ambiente. Las reacciones de cinasas se iniciaron por adición de 0,4 µ??/µ? de ?-32?-??? (6000 Ci/mmol, NEN) y 0,5 mg/ml de a-caseína des fos fori lada (Sigma) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. La actividad de cinasa se determinó sembrando 5 µ? de cada reacción sobre hojas secas de nitrocelulosa pre-lavadas con NaCl 1M en H3P04 0,1%. Después de transferir cada reacción de cinasa, las hojas de nitrocelulosa se lavaron una vez con solución de AcOH 1%. La actividad de cinasas se determinó sembrando 5 µ? de cada reacción sobre hojas secas de nitrocelulosa que habían sido pre-lavadas con NaCl 1M en H3P04 0,1%. Las hojas de nitrocelulosa se lavaron una vez con solución de AcOH 1% y dos veces con una solución de NaCl 1 M en H3P04 0,1% (5-10 minutos por lavado) . Las manchas secas se expusieron durante 30 minutos a una pantalla de almacenamiento fosforescente y se escanearon con un equipo para obtención de imágenes Typhoon (GE Life Sciences) . Los datos se cuant i f icaron utilizando el programa SPOT (Knight, Z. y col., iVature Protocols, 2: 2459-66), y los valores de IC50 se determinaron empleando el software GraphPad Pr i sm 4.0.
Resultados. Para ensayar la utilidad general de las olefinas activadas ("aceptores de Michael") , incluyendo las c ianoacr i lamidas , como grupos localizadores de cisteína para la inhibición de proteínas terapéuticamente relevantes, sintetizamos un panel de c i anoacr i 1 amidas que estaban sustituidas con heterociclos que habitualmente se encuentran en las drogas inhibidoras de cinasas (por ej . , azaindoles, indazoles, piridinas, pirazoles, biarilos) . También sintetizamos acri loni t i los que eran o bien no sustituidos en el carbono portador del nitrilo (Tabla 2a, entradas 28 y 30) o estaban sustituidos con grupos atractores de electrones distintos de carboxamida en el carbono portador del nitrilo (Tabla 2a, entradas 19-21, 31, 32) . Estos compuestos novedosos fueron evaluados para determinar su capacidad para inhibir las siguientes cinasas in vitro: WT RSK2 , C436V RSK2 , WT NEK2 , C22V NEK2 y/o PLK1. Obsérvese que todas las versiones de tipo salvaje de estas cinasas tienen una cisteína en una localización similar en el sitio de unión al ATP, inmediatamente C-terminal al bucle "rico en glicina" .
A partir de estos datos, llegamos a las siguientes conclusiones: (1) cambiar la estructura del heterociclo afecta dramáticamente la potencia y la selectividad inhibitoria de las cinasas de las cianoacrilamidas y los acrilonitrilos . De este modo, aun estos "fragmentos" ( PM < 300) relativamente simples muestran marcadas relaciones estructura-actividad. (2) Los acrilonitrilos que están sustituidos con un segundo grupo atractor de electrones (por ej . , carboxamida) en el carbono portador del nitrilo son más potentes que los acrilonitrilos sencillos que contienen hidrógeno en el carbono portador del nitrilo (compárense las entradas 30 vs . 31y 22 en la Tabla 2a; las entradas 3 vs . 4-8 en la Tabla 1) . (3) Cuando se ensayaron, las mutantes Cys a Val de RSK2 y NEK2 resultaron 10-100 veces menos sensibles que las enzimas WT, lo cual resulta coherente con un mecanismo inhibitorio que implica la modificación covalente de Cys436 y Cys22 de RSK2 y NE 2 , respectivamente. Esta idea fue avalada adicionalmente por las estructuras co-cristalinas obtenidas por rayos X de RSK2 unidas a dos fragmentos de c ianoacri lamida diferentes, en la Tabla 2a. Las estructuras muestran de forma inequívoca que la Cys436 de RSK2 forma un enlace covalente con el carbono beta e 1 e ct rof í 1 i co del resto cianoacrilamida (véase la Fig. 7) .
Tabla 2a. Valores de IC50 (uM) .
Tabla 2b. Valores e IC50 de los compuestos (µ?) .
Tabla 2c. Valores de IC50 de los compuestos (µ?) .
Tabla 2d. Valores de IC50 de los compuestos (µ?) .
Tabla 2e. Valores de IC50 de los compuestos (µ?) .
Ejemplo 72. Cristalografía de rayos y modelos de unión en el sitio RSK2 CTD ATP.
Métodos. RSK2 CTD se expresó y se purificó tal como se describió anteriormente (véase la descripción para la Fig. 1A y la Fig. IB) y se concentró hasta 20 mg/ml en HEPES 20 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM. Luego se añadió la cianoacrilamida 6, 12 o 15 (1 µ? de una solución madre 10 mM en DMSO 100%) a 19 µ? de RSK2 CTD, para dar 19 mg/ml de proteína e inhibidor 0,5 mM en DMSO 5%. Luego se hicieron crecer los cristales de los complejos en gotas pendientes, mezclando 1 µ? de complejo proteína/inhibidor con 1 µ? de solución precipitante compuesta por HEPES 0,1M, pH 7,0, 10% de PEG3350, sulfato de amonio 50 mM a 20 °C. Típicamente, los cristales crecieron hasta sus máximas dimensiones en 1-2 días. Luego, los cristales se transfirieron a una solución crioprotectora (LV Cryo Oil, Mitegen LLC, Ithaca, NY) y se congelaron en una corriente de nitrógeno líquido a 100 °K. Los cristales pertenecían al grupo espacial ?4?2?2 con parámetros de celda unitaria a=47,5 Á, b=47,5 Á, c=291,5 Á. Todos los conjuntos de datos se recolectaron en la línea del haz 8.2.1 de la Fuente de Luz Avanzada en el Lawrence Berkeley National Laboratory. Los datos de difracción se integraron y llevaron a escala con el programa XDS (Kabsh, W. 1993) . La estructura del complejo RSK2 CTD/ inhibidor se resolvió por remplazo molecular usando datos para 2,4 Á (cianoacrilamida 6), 2,1 Á (cianoacrilamida 12) y 2,1 Á (cianoacrilamida 15) y la estructura 2qr8 del Banco de Datos de Proteínas como modelo de búsqueda en el programa MolRep (Vagin y col., 1997), seguido de varios ciclos de reconstrucción manual y refinación restringida con los programas COOT (Emsley P, Cowtan K. , Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004) y REFMAC5 (GN, Vagin AA, Dodson EJ. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1997) .
Las cianoacrilamidas , cuando se anexan a tres andamiajes diferentes de inhibidores de cinasas, se unen al bolsillo de unión del ATP de RSK2 CTD y forman un enlace covalente con Cys-436. Resolvimos estructuras co-cristalinas de RSK2 CTD unidas a tres inhibidores de tipo cianoacrilamida: la pirrolo-pirimidina 6 (Tabla 1), el azaindol 12 (Tabla 2) y el indazol 15 (Tabla 2) . Estos compuestos son potentes inhibidores de la actividad de cinasa de RSK2 y la mutación de Cys-436 a Val confiere una significativa resistencia (Tabla 1 y Tabla 2) . Las estructuras co-cristalinas de 6, 12 y 15 revelan interacciones no covalentes que se observan típicamente en estructuras co-cristalinas cinasa/ inhibidor ; por ej . , uniones puente de hidrógeno entre un heteroátomo del inhibidor y el esqueleto NH de RSK2 Met-496. Para cada uno de los inhibidores de tipo cianoacrilamida, se observa claramente un enlace covalente entre el tiol de Cys-436 y el carbono beta del grupo cianoacrilamida (Fig. 7, creada a partir de los archivos coordinados de estructuras con PyMol) . Además de los datos que se presentan en la Tabla 2, las estructuras co-cristalinas que se muestran en la Fig. 7 avalan la noción de que un acrilonitrilo, cuando está sustituido en el carbono portador del grupo nitrilo con un grupo atractor de electrones (por ej . , carboxamida) , es un resto "transportable" localizador de cisteína que puede anexarse a diversos andamiajes de unión a cinasas para obtener potentes inhibidores (afinidad nanomolar) que forman un enlace covalente reversible con una cisteína de sitio activo. La unión del Compuesto 40 de indazol a la Cys-436 de RSK2 se ilustra en el panel superior de la Fig. 8.
Ejemplo 73. Clonación, expresión de proteínas, purificación y cristalización de cSrc.
El dominio de cinasa de la cSrc de pollo (mutante S345C) se expresó y purificó según lo descrito (Blair y col., Nat . Chem. Biol., 2007) y se concentró hasta 3 mg/ml en Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, DTT lmM, 5% de Glicerol. Se incubó la proteína (3 mg/ml) durante 10 minutos sobre hielo, con inhibidor (200 µ?) y DIVISO 2%. Luego los cristales del complejo se hicieron crecer en gotas pendientes mezclando 1 µ? de complejo proteína/inhibidor con 1 µ? de solución precipitante compuesta por MES 100 mM, NaOAc 50 mM, 2% de PEG(4000), pH 6,5 a 20°C. Por lo general, los cristales crecieron como placas delgadas hasta las máximas dimensiones en 1-2 días. Luego, los cristales se transfirieron a una solución crioprotectora consistente en aguas madres suplementadas con 25% de glicerol y se congelaron en una corriente de nitrógeno líquido a 100 °K.
Recolección de datos y resolución de la estructura. Los cristales pertenecían al grupo espacial Pl con parámetros de celda unitaria a=42,0 Á; b=63,2 Á; c=73,l Á; a=100,9°; ß=90,8°; ?=90,0°. Todos los conjuntos de datos se recolectaron en la línea del haz 8.2.1 de la Fuente de Luz Avanzada en el Lawrence Berkeley National Laboratory. Los datos de difracción se integraron y se llevaron a escala con el programa XDS (Kabsh, W. 1993) . La estructura del complejo cSRC/inhibidor se resolvió por remplazo molecular usando datos para 2,3 Á y la estructura 3en4 como modelo de búsqueda en el programa MolRep, seguido de varios ciclos de reconstrucción manual y refinación restringida, con los programas COOT y REFMAC5. La unión de la pirrolopirimidina Compuesto 55 a la Cys-345 de cSrc se ilustra en el panel inferior de la Fig. 8.
Ejemplo 74. Procedimiento General para el Ensayo de Cinasa de cSrc Los dominios cinasa de cSrc de tipo salvaje y de la mutante S345C se expresaron y purificaron según lo descrito (Blair y col., Nat . Chem. Biol . , 2007). La cinasa de cSrc purificada (concentración final, 2 nM) se pre-incubó con inhibidores (seis o diez concentraciones, por duplicado) durante 30 minutos, a temperatura ambiente, en amortiguador de reacción de cinasas (HEPES 20 mM, pH 7,4, MgCl2 10 mM, EDTA 0,2 mM) con ATP 200 uM y 1 mg/ml de BSA. Las reacciones de cinasa se iniciaron por agregado de 0,05 µ??/µ? de ?-32?-??? (6000 Ci/mmol, NEN) y sustrato peptídico (LEIYGEFKK ) 0 , 1 mM (SEQ ID N0:2) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La actividad de cinasa se determinó sembrando 6 µ? de cada reacción sobre hojas de fosfocelulosa . Cada siembra se lavó una vez con solución 1% de AcOH, dos veces con solución 0,1% de H3PO4 y una vez con MeOH (5-10 minutos por lavado) . Las siembras secas fueron expuestas, durante 30 minutos, a una pantalla de almacenamiento fosforescente y se barrieron con un equipo para obtención de imágenes Typhoon (GE Life Sciences) . Los datos se cuantificaron utilizando ImageQuant (v. 5.2, Molecular Dynamics) y se graficaron empleando el programa GraphPad Prism 4.0.
Ejemplo 75. 2-ciano-lV- (l-hidroxi-2-metilpropan-2-il) -3- (3- (3,4, 5- trimetoxifenil) -lH-indazol-5-il) acrilamida A una solución de 3 - (3 , 4 , 5 -trimetoxifenil) -lH-indazol-5-carbaldehído (48mg, 0,16 mmol) y 2 -ciano-N- (l-hidroxi-2-metilpropan-2 - il ) acetamida (23 mg, 0,16 mmol) en THF (1 mi) se añadió DBU (16 µ?., 0,16 mmol) . Luego de una hora, la solución incolora lentamente se volvió naranja brillante. La mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante TLC preparativa, eluyendo con EtOAc, para obtener 44 mg (61%) de 2 -ciano-N- ( l-hidroxi-2 -metilpropan-2 - il ) -3 - ( 3 - (3,4,5-trimetoxifenil ) -lH-indazol-5-il) acrilamida, un sólido de color amarillo brillante. Masa Exacta: 450,19, M/z encontrada: 451,23 (M+H)+.
Ejemplo 76. 3- (piridin-3 -il) -??-indazol- 5-carbaldehído Se combinaron 3 - iodo- 5 - formi 1 indazol (206 mg , 0,735 mmol) , ácido piridin- 3 - i lborónico (106 mg , 0,882 mmol) y K2C03 (330 mg, 2,21 mmol) en Dioxano:H20 5:1 (2 mi) y se desgasificaron con burbujeo de argón durante 20 minutos. Se añadió Pd(PPh3)4 (91 mg , 0,074 mmol) y el recipiente de reacción se purgó con argón nuevamente. Luego la reacción se sometió a microondas, a 130°C, durante 45 minutos. La mezcla de reacción bruta se diluyó con EtOAc (20 mi) y se lavó dos veces con HCl 1M (20 mi) . Los lavados acuosos combinados se neutralizaron con NaOH 1M y se extrajeron con tres porciones de EtOAc (75 mi) , que se concentraron a presión reducida para obtener42 mg (26%) de 3-(piridin-3 - il ) - 1H- indazol - 5 - carbaldehído como un sólido amarillo.
Ejemplo 77. 2 - ciano - 3 - ( 3 - (piridin- 3 - i 1 ) - 1H- indazol - 5 -il) acrilamida A una solución de 3 - (piridin- 3 - il )- 1H- indazol - 5 -carbaldehidó (30 mg, 0,134 mmol) y 2-ciano-N-met ilacetamida (12 mg, 0,134 mmol) , en THF (1 mi) , se le añadió DBU (13 µ? , 0,134 mmol) . La suspensión incolora lentamente se tornó amarilla brillante y soluble por la adición del DBU. Cuando se habían disuelto todos los sólidos, la mezcla de reacción bruta se concentró y purifico por TLC preparativa, eluyendo con EtOAc : MeOH : TEA 95:5:1, para obtener 7 mg (18%) de 2 - ciano- 3 - (3- (piridin-3-il) - lff- indazol - 5-il) acrilamida, como un sólido amarillo brillante. Masa exacta: 289,10, M/z encontrada: 290,01 (M+H)+.
Ejemplo 78. (E) - 3 - ( 3 - ( 4 - amino- 5 - ( 4 - fenoxi f enil ) - 7H-pirrolo [2, 3-d]pirimidin-7-il) feni 1 ) - 2 - ciano -N- ( 1 - hldroxi - 2 -meti lpropan- 2 - il ) acri lamida Un vial de 4 mi provisto de una barra magnética agitadora, se cargó con 3 - ( 4 - amino- 5 - ( 4 - f enoxi f eni 1 ) - 7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin- 7 - il ) benzaldehído (5 mg, 0,01 mmol) , 2 - c i ano -N- ( 1 - hidroxi - 2 -me t i lpropan - 2 - il) acetamida (5 mg , 0,03 mmol), acetato de piperidinio (2 mg , 0,02 mmol) y 2-propanol (0,5 mi) . La mezcla de reacción se calentó a 60°C durante 24 h. La solución se concentró a presión reducida y el resto resultante se purificó por cromatografía con gel de sílice (elución con EtOAc 100% hasta 10% MeOH/EtOAc) para dar el producto, que se purificó adicionalmente mediante RP-HPLC (gradiente: 20-95% MeCN/agua con 0,1% de TFA durante 25 min.) , para obtener el producto como un sólido blanco (1,5 mg , 22% de rendimiento) . Masa Exacta: 544,22. M/z encontrada: 545,0 (M+H)+.
Ejemplo 79. 4 - Amino - 7 - ( 3 - hidroxipropil ) - 5 -p- tol i 1 - 7 H-pirrólo [2, 3-d] irimidin-6- carbaldehido A una solución de 4 -Di - ter-butiloxicarbonilamino-7- (3 - er-butildimetil-siloxipropil) - 5 -p- tol i 1 - 7H-pirrolo [2 , 3 - d] pirimidin- 6 - carbaldehído (1,43 g, 2,28 mmol) en diclorometano (12 mi), se le agregó TFA (5 mi) . La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 12 horas y luego se concentró a presión reducida. El resto se redisolvió en THF (12 mi) y se le añadió HCI acuoso 1M (4 mi) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas y luego se diluyó con EtOAc (50 mi) y NaHC03 acuoso saturado (50 mi) . Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (50 mi) . Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (50 mi) y luego se concentraron a presión reducida. El resto se destiló azeotrópicamente con benceno (50 mi) y se secó al vacío para dar 0,99 g del aldehido desprotegido (húmedo) , el cual se utilizó sin purificación adicional.
Ejemplo 80. Síntesis de Cianoacetamidas y Heteroaril Acetonitrilos Se sintetizaron 3 -morfol ino- 3 - oxopropanonitrilo , 2 - ciano-N- ( 2 - (dimeti lamino) et i 1 ) -íí-met i lacetamida (Wang , K. ; Nguyen, K. ; Huang, Y.; Dómling, A. J. Comb . Chem. 2009, 11, 920-927) y 2 - ciano-W- ( 1 , 3 -dihidroxi - 2 -met i lpropan- 2 - il ) - acetamida (Santilli, A. A.; Osdene, T. S. J. Org. Chem. 1964, 29, 2066-2068), tal como se describió anteriormente. 1. 4 -Cianometilpiridin- 1-óxido A una suspensión del clorhidrato de 4-cianomet ilpiridina (689,2 mg, 4,458 mmol) en cloroformo (12 mi) se le agregó NaHC03 (538 mg , 5,35 mmol, 1,4 equiv.) en H20 (2 mi), lo que produjo efervescencia. Una vez que cesó la evolución de gas, se añadió ácido raeta-cloroperbenzoico (1,25 g, 6,69 mmol, 1,6 equiv.) en una porción. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, luego se concentró con gel de sílice y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (IPA 12,5 a 25% en CH2C12) dando 129 mg (22% de rendimiento) del N-óxido como semi-sólido rojo. 2-Ciano-JV- (2 -hidroxietil) -N-metilacetamida (97% de rendimiento) A una solución de cianoacetato de metilo (6,27 g, 63,3 mmol) en etanol (12 mi) se añadió 2 - (metilamino) etanol (5,6 mi, 69,6 mmol, 1,1 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a 70 °C durante 4 horas, luego se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. La cromatografía en gel de sílice del resto bruto (EtOAc) dio 8,76 g (97% de rendimiento) de 2-ciano-N- (2 -hidroxietil ) -lV-metilacetamida como un aceite de color ámbar. 3. N- ter-butil-2-cianoacetamida C|/VCI f-BuNH2, Na2C03 O CH2CI2, 0 °C?23 °C, 1 h rendimiento., 2 etapas) A una suspensión de ter-butilamina (3,7 mi, 35,4 mmol, 2,0 equiv.) y carbonato de sodio (3,75 g, 35,4 mmol, 2,0 equiv.) en CH2C12 (20 mi), enfriada a 0°C, se le añadió una solución de cloruro de cloroacetilo (1,4 mi, 17,7 mmol, 1,0 equiv.) en CH2C12 (10 mi) durante 5 minutos. Una vez completado el agregado, se permitió que la mezcla de reacción alcanzara la temperatura ambiente, se agitó durante 45 minutos y luego se filtró. La torta del filtro se lavó con CH2C12 (50 mi) . El filtrado y el lavado combinados se concentraron para dar el intermediario ter-butil-2-cloroacetamida como un sólido blanco, que se llevó a la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional. La ter-butil-2-cloroacetamida se disolvió en DMF (12 ral) y se añadieron 2,31 g (35,4 mmol, 2,0 equiv. ) de KCN finamente triturado. La mezcla de reacción se calentó a 70 °C durante 2 horas y luego se filtró. La torta del filtro se lavó con EtOAc (2 x 30 mi) . Los lavados y el filtrado combinados se concentraron para dar un aceite ámbar. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (40% de EtOAc en Hexanos) dio la ter-butil-2 -cianoacetamida como un semi-sólido con DMF como impureza. Este semi-sólido se disolvió en EtOAc (100 mi) y se lavó con agua (3 x 70 mi) . Los lavados acuosos combinados se extrajeron con EtOAc (100 mi) . Las soluciones en EtOAc combinadas se lavaron con salmuera (70 mi) , se secaron (MgS04) y se concentraron para dar la ter-butil-2 -cianoacetamida analíticamente pura (1,88 g, 76% de rendimiento, 2 etapas) como un sólido blancuzco. 4 . N-l-adamantil-2 -cianoacetamida A una suspensión de 1-adamantilamina (2,80 g, 18,5 mmol, 1,5 equiv.) y carbonato de sodio (2,62 g, 24,7 mmol, 2,0 equiv.) en CH2C12 (17 mi) a 20-25 °C se le agregó una solución de cloruro de cloroacetilo (1,24 mi, 12,3 mmol, 1,0 equiv.) en CH2C12 (5 mi), durante 5 minutos. Una vez completado el agregado, la mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos y se diluyó con CH2C12 (10 mi), para una agitación más eficiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se filtró. La torta del filtro se lavó con CH2C12 (20 mi) . El filtrado y el lavado combinados se concentraron para dar el intermediario 1 - adamant i 1 - 2 - cloroacetamida como un sólido blanco, que se llevó a la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional. La 1 -adamant il - 2 -cloroacetamida se disolvió en DMF (6 mi) y se añadieron 1,61 g (24,7 mmol, 2,0 equiv.) de KCN finamente triturado. La mezcla de reacción se calentó a 70°C durante 14 horas y luego se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 mi) y se lavó con agua (3 x 60 mi) . Los lavados acuosos combinados se extrajeron con EtOAc (70 mi) . Las soluciones en EtOAc combinadas se lavaron con salmuera (100 mi), se secaron (MgS04) y se concentraron para dar un resto. La purificación mediante cromatografía en gel de sílice (25% de EtOAc en Hexanos) dio 1 - adamantil - 2 -cloroacetamida (500 mg, 18% de rendimiento) y 1-adamantil-2 - c ianoacetamida (491 mg, 18% de rendimiento, 2 pasos) como sólidos blancos. 5. l-Ciano-W-isopropilmetansulfonamida 41 % de rendimiento A una solución de cloruro de 1-cianometansulfonilo (Sammes, M . P . ; Wilie, C. M . ; Hoggett, J . G . J. Chem. Soc. (C), 1971 , 2151-2155) (3,25 g, 23,3 mmol, 1,0 equiv.) en THF (20 mi) enfriada a 0-5°C se le añadió isopropilamina (5,0 mi, 58,2 mmol, 2,5 equiv.) durante 10 minutos. Se dejó luego que la mezcla de reacción alcanzara la temperatura ambiente. Después de 12 horas, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite. La torta del filtro se lavó con MeCN (50 mi) . El lavado se combinó con el filtrado y se concentró para dar un resto, que tras la purificación por cromatografía en gel de sílice (25% de EtOAc en Hexanos) , produjo 1,55 g (41% de rendimiento) de 1-ciano-N-isopropilmetansulfonamida como un aceite ámbar. 6. 2 - (2 -Cianoacetamido) -2 -metilpropanoato de alilo Una suspensión de ácido 2-amino-2-metilpropanoico (Aib, 2,05 g, 19,9 mmol) y ácido p-toluensulfónico monohidratado (5,11 g, '26,9 mmol, 1,35 equiv.) en alcohol alílico (30 mi) se calentó a 90°C durante 24 horas, luego se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró para eliminar el alcohol alílico y luego se diluyó con CH2C12 (100 mi) y carbonato de sodio acuoso saturado (100 mi) . Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con CH2C12 (100 mi) . Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (100 mi) , se secaron (Na2S04) y concentraron para dar el éster de Aib-alilo bruto (2,84 g, rendimiento cuantitativo) como un aceite marrón, el cual se llevó a la siguiente etapa sin ninguna purificación adicional.
A una solución de ácido cianoacético (500 mg, 5,88 mmol, 1,0 equiv.), N, N-diisopropiletilamina (3,1 mi, 17,6 mmol, 3,0 equiv.) y éster de Aib-alilo (1,26 g, 8,82 mmol, 1,5 equiv.) en CH2C12 (8 mi) enfriada a 0-5 °C se le agregó una solución de N, ' -diciclohexilcarbodiimida (1,82 g, 8,82 mmol, 1,5 equiv.) en CH2C12 (7 mi) durante 3 minutos. La mezcla de reacción se agitó a 0-5°C durante 40 minutos y se dejó luego alcanzar una temperatura ambiente. Después de 24 horas, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 mi) y se lavó con HCl 0,5 M (50 mi) y la fase orgánica se filtró a través de Celite para eliminar los sólidos precipitados. El filtrado se lavó con salmuera (50 mi), se secó (Na2S04) y se concentró para dar un sólido marrón, el cual se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (50% de EtOAc en Hexanos) , para dar 648 mg (53% de rendimiento) de 2 - ( 2 -cianoacetamido) - 2 -met ilpropanoato de alilo como un sólido blanco. 7. 2 -Ciano-W , N' -dimetilacetohidrazida (64% de rendimiento) A una solución de cianoacetato de metilo (5,48 g, 55,3 mmol, 1,0 equiv.) en 2 -propanol (12 mi) se le agregó N,N-dimetilhidrazina (8,4 mi, 110,6 mmol, 2,0 equiv.). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas, luego se concentró para dar un sólido rojo, el cual se dispersó en Et20 (50 mi) , se filtró y se secó para dar la hidrazida como un sólido rojo naranja (4,52 g, 64% de rendimiento) . La purificación adicional de una porción del sólido mediante cromatografía en gel de sílice (50% de EtOAc en Hexanos, luego EtOAc) dio 1,68 g de hidrazida, de pureza analítica, como un sólido blancuzco. 8. 2 -Ciano-N-metoxiacetamida A una suspensión de cianoacetato de metilo (1,21 g, 12,2 mmol, 1,0 equiv.) y clorhidrato de O-metilhidroxilamina (2,02 g, 24,2 mmol, 1,9 equiv.) en 2 -propanol (5 mi) se le agregó trietilamina (5,1 mi, 36,3 mmol, 3,0 equiv.) . La mezcla de reacción se calentó a 70 °C durante 3 horas y luego se filtró en caliente. La torta del filtro se lavó con 2-propanol (3 x 5 mi) . Los lavados combinados y el filtrado se concentraron y el resto obtenido se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (70% de EtOAc en Hexanos) para dar 2-ciano-N-metoxiacetamida (673 mg, 48% de rendimiento) como un sólido blanco. 9. 2 - (lff-pirazol-l-il) acetonitrilo (75% de rendimiento) A una suspensión de pirazol (1,04 g, 15,3 mmol, 1,0 equiv.) y carbonato de cesio (7,47 g, 22,9 mmol, 1,5 equiv.) en MeCN (21 mi) se le agregó cloroacetonitrilo (1,16 mi, 18,3 mmol, 1,2 equiv.) durante 3 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se filtró. La torta del filtro se lavó con MeCN (2 x 20 mi) . El filtrado y los lavados combinados se concentraron y el resto obtenido se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (25% de EtOAc en Hexanos) para dar 1,23 g (75% de rendimiento) de 2-(ltf-pirazol-l-il) acetonitrilo como aceite incoloro. 10. 2- ( 1JT- 1,2, 3 -triazol-l-il) acetonitrilo (52% de rendimiento) A una suspensión de 1H- 1 , 2 , 3 - triazol (261,4 mg, 3,79 mmol, 1,0 equiv.) y carbonato de potasio (785 mg, 5,68 mmol, 1,5 equiv.) en MeCN (8 mi) se le añadió una solución de bromoacetonitrilo (303 µ?, 4,54 mmol, 1,2 equiv. ) en MeCN (4 mi) durante 3 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se filtró. La torta del filtro se lavó con MeCN (30 mi) . El filtrado y los lavados combinados se concentraron y el resto obtenido se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (50% de EtOAc en Hexanos) para dar 211 mg (52% de rendimiento) de 2-(lff-1, 2, 3-triazol-l-il) acetonitrilo como un aceite incoloro. 11. Cianoacetamidas de azetidina (X H) y 3-hidroxiazetidina Se calentaron cianoacetato de etilo (1,0 equiv.), clorhidrato de azetidina (X = H) o de 3 -hidroxiazetidina (X = OH) (1,1 equiv.) y trietilamina (1,5 equiv.) en EtOH (6 mi) a 80 °C durante 6 horas. La mezcla de reacción se concentró y el resto se repartió entre EtOAc (25 mi) y agua desionizada (25 mi) . La fase acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 30 mi) . Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2S04) y se concentraron para dar un resto, el cual se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (EtOAc/Hexanos 4:1 para X = H; EtOAc/MeOH 16 : 1 para X = OH) para dar la cianoacetamida deseada .
El cianoacetato de etilo (550 mg, 4,86 mmol) y el clorhidrato de azetidina (500 mg) produjeron 196,5 mg (33% de rendimiento) de azetidina cianoacetamida .
El cianoacetato de etilo (469,4 mg, 4,15 mmol) y el clorhidrato de 3 -hidroxiazetidina (500 mg) produjeron 89 mg (15% de rendimiento) de azetidina cianoacetamida.
Ejemplo 81. Síntesis de Cianoacrilamidas o Heteroaril acrilonitrilos Procedimiento general para la síntesis de derivados de cianoacrilamida o heteroarilacrilonitrilo: Se agitaron 4- amino-7- ( 3-hidroxipropil ) - 5 -p-tolil-7H-pirrólo [2,3- d] irimidin-6-carbaldehído (1,0 equiv.), la cianoacetamida o el heteroaril acetonitrilo apropiado (1,2-1,5 equiv.) y DBU (1,5-2,0 equiv.) en THF o DMF (2 mi) a temperatura ambiente durante 1-3 días. Luego, la mezcla de reacción se concentró y se purificó mediante TLC o HPLC preparativa para dar la cianoacrilamida o el heteroaril acrilonitrilo como mezcla de isómeros (E) y (Z) . 3- (4-amino-7 - (3-hidroxipropil) -5-p- tolil-7íf- pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-6-il) -2- (morfolin-4- carbonil) acrilonitrilo Rendimiento: 12,1 mg (21% de rendimiento). ESI-MS: 447,7 (MH+ 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-il) -2- (piridin-4 -il) acrilonitrilo Rendimiento: 7,3 mg (25% de rendimiento). ESI-MS: 411,7 (MH*) 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-il) -N- tert-butil-2 -cianoacrilamida Rendimiento: 19,9 mg (38% de rendimiento). ESI-MS: 433,2 (MH+) 3- (4-amino-7- (3 -hidroxiprqpil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin- 6-il) -2-ciano-iV- (2- (dimetilamino) etil) -W-metilacrilamida Rendimiento: 9,8 mg (29%) . ESI-MS: 462,5 (MH+) . 3- (4 -amino-7 - (3-hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin- 6 -il) -2 -ciano-W- (2 -hidroxietil) -N-metilacri lamida Rendimiento: 2,3 mg (5%) . ESI- S: 435,6 (MH+) . 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2, 3-d] irimidin- 6-il) -2-ciano-N- (1, 3-dihidroxi-2-metilprqpan-2-yl) acrilamida Rendimiento: 12,3 mg (35% de rendimiento). ESI-MS: 464,5 ( H+) 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-il) -2- (1H-1,2,4- triazol-l-il) acrilonitrilo Rendimiento: 7,1 mg (27% de rendimiento). ESI-MS: 401,5 (MH+) . 2- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin- 6 -il) -1-ciano-lV-isopropiletenosulfonamida Rendimiento: 17,8 mg (49% de rendimiento). ESI-MS: 455,5 (MH+) . 3 - (4 -amino-7 - (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin- 6 -il) -N- (1 -adamantil) -2 -cianoacrilamida Rendimiento: 11,3 mg (27% de rendimiento) (MH+) . 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3-d] irimidin-6-yl) -2- (4-metiltiazol-2-il) acrilonitrilo Rendimiento: 12,7 mg (48% rendimiento). ESI-MS: 431,5 (MH+) 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7ff-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-il) -2 - (lií-pirazol- 1-il) acrilonitrilo Rendimiento: 6,6 mg (25% de rendimiento). ESI-MS: 400,3 (MH+) 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p- tolil-7ff-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-il) -2 - (lff-l, 2 , 3 -triazol-l-il) acrilonitrilo Rendimiento: 5,2 mg (21% rendimiento). ESI-MS: 401,5 (MH+) Alil-2- (3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7ff-pirrolo [2,3-ci]pirimidin-6-il) -2-cianoacrilamido) -2-metilpropanoato Rendimiento: 11,1 mg (19% de rendimiento). ESI-MS: 503,6 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2 d] pirimidin-6-il) -2- (piridin-3-il) acrilonitrilo Rendimiento: 21,3 mg (62% de rendimiento). ESI-MS: 411,3 (MH+) . 4- (2- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-il) -1-cianovinil) piridina 1-oxido Rendimiento: 3,3 mg (7% de rendimiento) . ESI-MS: 427,7 (MH+) 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3- d] pirimidin-6-il) -2 -ciano-N1 ,?' -dimetilacrilohidrazida Rendimiento: 6,1 mg (18% de rendimiento). ESI-MS: 420,5 (MH+) 3- (4-amino-7- (3-hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-il) -2 -ciano-N-methoxyacrilamida Rendimiento: 19 mg (49% de rendimiento). ESI-MS: 407,4 (M?) . 3- (4-amino-7- (3- droxiprqpil) - 5 -p- toli 1 - 7H-pirrolo [2 , 3 - d] irimidin- 6 -il) -2 -ciano-lW/ Jf-riimetilacrilamida Preparado a partir de N, N-dimetilcianoacetamida (Basheer, A. ; Yamataka, H.; Ammal, S. C; Rappoport, Z. J. Org. Chem. 2007, 72, 5297-5312).
Rendimiento: 33,8 mg (24%, E:Z = 1,7:1) . ESI-MS: 405,2 (MH+) 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3- d] pirimidin-6-il) -2 -ciano-iV- (l-hidroxi-2-metilpropan-2- il) acrilamida Preparada a partir de 2 -ciano-W- (l-hidroxi-2-metilpropan-2- il) acetamida (Santilli, A. A.; Osdene, T. S. J. Org. Chem. 1964, 29, 2066-2068).
Rendimiento: 17,2 mg (39%), ESI-MS: 449,2 (MH+) 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3- d] pirimidin-6-il) -2 -ciano--V,N-dietilacrilamida Preparado a partir de N, N-dietilcianoacetamida (Wang, K. ; Nguyen, K. ; Huang, Y.; Dómling, A. J. Comb. Chem. 2009, 11, 920-927) .
Rendimiento: 9,2 mg (8%), ESI-MS: 433,2 (MH+) 3- (4-amino-7- ( 3 - hidroxipropi 1 ) - 5 -p- tol i 1 - 7H-pirrolo[2,3-d] irimidin - 6-il) - 2 - (pirrolidina-1-carbonil) acrilonitrilo Preparado a partir de N- (2-cianoacetil) pirrolidina ( ang, K. ; Nguyen, K. ; Huang, Y.; Domling, A. J". Comb. Chem. 2009, 11, 920-927) .
Rendimiento: 1,6 mg (3%), ESI-MS: 431,2 (MH+) 3- ( 4 - amino - 7 - ( 3 - hidroxipropi 1 ) - 5 -p- tolil -7H-pirrolo[2,3-d] pirimidin- 6 -il) -2- (azetidina-1-carbonil) acrilonitrilo Rendimiento: 16,5 mg (32%), ESI-MS: 417,2 (MH+) 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidin-6-il) -2- (3 -hidroxiazetidina- 1- carbonil) acrilonitrilo Rendimiento: 20,1 mg (38%), ESI-MS: 433,2 (MH+) (E) -3- (4 -amino-7 - (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3- d] pirimidin-6-il) -2- (4-metilpiperazina-l- carbonil) acrilonitrilo Preparado a partir de N- (2-cianoacetil) -N' -metilpiperazina (Proenca, F.; Costa, M. Green Chem. 2008, 10, 995-998).
Rendimiento: 15,7 mg (25%), ESI-MS: 460,2 (MH+) 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3· d] irimidin- 6 -il) -2 -ciano-N-ciclopropilacrilamida A una solución de 4- ter-butiloxicarbonilamino-7- (3 - er-butildimetilsiloxipropil) -5-p-tolil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidina-6-carbaldehído (101 mg, 0,1925 mmol) y N-ciclopropilcianoacetamida3 (47,8 mg, 2,0 equiv.) en THF (2,2 mi) que fue preenfriada a 0-5 °C, se le añadió DBU (58 µ?? , 2,0 equiv.). La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente, se agitó durante 1 hora y luego se mantuvo a -20 °C durante 12 horas. La mezcla de reacción se concentró y se purificó por cromatografía en gel de sílice (2:1 de hexanos/EtOAc) para proporcionar 53,2 mg (E:Z = 2:1, 44% de rendimiento) del intermediario de cianoacrilamida protegida como un aceite amarillo. Este aceite se disolvió en CH2C12 (3 mi) y se añadió TFA (1,5 mi). Después de 16 horas a 20-25 °C, la mezcla de reacción se concentró y el resto se redisolvió en THF (6 mi) y se añadió HC1 acuoso 1 M (2 mi) . La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 8 horas, luego se inactivo con NaHC03 acuoso saturado (20 mi) y salmuera (30 mi) y se extrajo con EtOAc (3 x 50 mi) . Los extractos EtOAc combinados se secaron (MgS04) , se concentraron y el aceite proporcionado se purificó mediante TLC preparativa (3:1 Tolueno/IPA, placa de 0,5 cm, 2 eluciones) para proporcionar la cianoacrilamida (26 mg, 74% de rendimiento durante 2 etapas) como un aceite amarillo. ESI-MS: 417, 1 (MH+) . 1- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7H-pirrolo [2,3- d] irimidin-6-il) -2,2 -difluoroetanona A una solución de la correspondiente di-ter- butiloxicarbonilamino ter-butildimetilsililoxidifluorometil cetona (39,0 mg, 57,8 µp???) en CH2C12 (2 mi), se le añadió TFA (2 mi) . La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 17 horas, luego se concentró y el resto se redisolvió en THF (3 mi) . Se añadió HCl (1M, 1 mi) y la mezcla de reacción se agitó, a temperatura ambiente, durante 12 horas, luego se inactivo con bicarbonato de sodio acuoso saturado (5 mi) y se extrajo con EtOAc (3 x 10 mi) . Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2S04) y se concentraron para proporcionar un sólido blanco, el cual se suspendió en MeCN (10 mi) . La suspensión se filtró y el filtrado se concentró para proporcionar la difluorometilcetona (6,9 mg, 33% de rendimiento, 2 etapas) como un sólido blanco. ESI-MS: 361,3 (MH+) . 3- (4-amino-7- (3 -hidroxipropil) -5-p- tolil-7ff-pirrolo [2,3- d] pirimidin-6-il) -2 -ciano-iV-isopropilpropanamida A una solución de la correspondiente cianoacrilamida (31,7 mg, 75,8 µtt???) en MeOH (1,8 mi) se le añadió AcOH glacial (0,2 mi), seguido por cianoborohidruro de sodio (14,3 mg, 227 µp???, 3,0 equiv) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, luego se concentró y el resto se purificó por HPLC preparativa (0,1% de TFA en H20: 0,1% de TFA en MeCN, gradiente de 95:5 a 20:80 v/v, durante 20 minutos) para proporcionar la amida deseada (9,8 mg, 24% de rendimiento) como un aceite incoloro. ESI-MS: 421, 5 (MH+) .
Ejemplo 82. Ensayos para la adición de tiol reversible a las definas sustituidas con nitrilo electrofílicas .
Se preparó solución salina regulada con fosfato deuterada (PBS-d) , mediante disolución de NaCl (400 mg) , KCl (10 mg) , Na2DP04 (30,7 mg) y KD2P04 (9,7 mg) en 40 mi de D20. El pH de la solución se ajustó a 7,4 usando NaOD (solución en D20) y DCl en D20.
A una solución de cianoacrilato A (5,1 mg, 27,3 µp???) en 0,75 mi de DMSO-dí se le añadió una solución de 400 mM de 2-mercaptoetanol (BME) en PBS-d (0,25 mi). El análisis de la mezcla de reacción por 1H RMN indicó >95% de conversión al aducto de tiol B .
La proporción del cianoacrilato de partida a aducto puede determinarse fácilmente por la integración de los picos diagnósticos a 8,30 ppm para el cianoacrilato A y 4,52 ppm para el tioéter B.
Cianoacrilato A: XH RMN (400 MHz, 3:1 v/v DMS0-d6: PBS-d) : d 8,30 (s, 1H) , 7,91 (m, 2H) , 7,60-7,49 (m, 3H) , 3,78 (s, 3H) .
La adición de BME provoca la formación del aducto B (una mezcla de aproximadamente 61:39 de diastereómeros) con las siguientes resonancias: 1H RMN (400 MHz, 3:1 v/v DMS0-d6": PBS-d) : 7,41 (m, 1H) , 7,35-7,28 (m, 4H) , 4,52 (s, 1H) , 3,64 (s, 3H, diastereómero mayor) , 3,56 (s, 3H, diastereómero menor) , 3,46 (t, J = 6,3Hz, 2H, diastereómero mayor, se superpone con la señal para el exceso de BME) , 3,38 (t, J = 6,7Hz, 2H, diastereómero menor), 2,58-2,40 (m, 2H, se superpone con la señal para el exceso de BME) . Se encontró que la formación del aducto de tiol fue reversible, tal como se demuestra en el siguiente experimento: A una solución de cianoacrilato A (17,1 mg, 91,4 µt???) en 0,75 mi de DMSO-d6 se le añadió una solución de 400 mM de BME en PBS-d (0,25 mi) . El análisis de la mezcla de reacción por 1H RMN indicó una relación 85:15 del aducto de tiol B al cianoacrilato de partida A. La mezcla de reacción luego se diluyó 10 veces por la adición de 100 uL de la mezcla de reacción en 900 ]ih de 3:1 v/v de PBS DMS0-d6 : deuterado . El análisis de la solución por ""? RMN indicó una relación de 53:47 del aducto de tiol B al cianoacrilato de partida A; la relación de cianoacrilato A al aducto B se determinó por las integrales de los picos diagnósticos a 8,30 ppm para el cianoacrilato A y a 4,52 ppra para el tioéter B (Figura 9) .
Ejemplo 83. Ensayo de reversibilidad de tiol por espectroscopia UV/visible.
Las reacciones reversibles de electrófilos activos al UV con BME pueden ser caracterizadas espectrofotométricamente usando un espectrofotómetro UV-VIS Spectramax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale CA) , para el intervalo de 250-500 nm, a 20°C. Las reacciones de equilibrio se iniciaron por la mezcla de volúmenes iguales del W-isopropil cianoacrilamida ilustrado anteriormente (400 µ? de solución en PBS, pH 7,4) con una solución de 2 -mercaptoetanol (100 mM BME, solución en PBS, pH 7,4) .
Las soluciones C (200 µ? de cianoacrilamida en PBS a pH 7,4, control) y D (200 µ? cianoacrilamida más 50 mM de BME en PBS a H 7,4) se analizaron espectrofotométricamente (placa de 96 pocilios de parte inferior plana Costar, 100 µ? por pocilio para cada reacción, monitoreando el pico de absorbancia de cianoacrilamida a 400 nm. La desaparición de este pico (solución D, Fig. 2) indica la reacción con BME. La solución D luego se diluyó 10 veces por la mezcla de alícuotas de 10 µ? con 90 µ? de PBS (pH 7,4) o 50 mM de BME en PBS (pH 7,4) . La solución C también se diluyó 10 veces en PBS (pH 7,4) y se usó como referencia para la señal de absorbancia. La dilución de la solución D en PBS produce la recuperación rápida (dentro de segundos) de la absorbancia de cianoacrilamida a 400 nm, lo que indica la inversión rápida del aducto de BME-cianoacrilamida . Estos datos son compatibles con el ensayo de RMN descrito anteriormente. Para los electrófilos (por ejemplo, cianoacrilamidas) que absorben luz a longitudes de onda superiores a 300 nm, el ensayo espectrofotométrico es más conveniente que el de RMN y se implementa más fácilmente, en un formato de alto rendimiento (por ejemplo, placas de 96 pocilios) .
Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invención pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica y son abarcadas por las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, bases de datos, secuencias de Genbank, patentes, y solicitudes de patente mencionadas en la presente se incorporan en la presente por referencia.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (44)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para inhibir una proteína cinasa, caracterizado porque comprende poner en contacto la proteína cinasa con una cantidad efectiva de un inhibidor de cinasas reversible y permitir que el inhibidor de cinasas reversible se una de manera reversible a un resto de cisteína del sitio activo, inhibiendo así a la proteína cinasa, en donde el inhibidor de cinasas reversible tiene la estructura de la Fórmula I : en donde R1 es alquilo, sustituido o sin sustituir, heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, arilo, sustituido o sin sustituir o heteroarilo, sustituido o sin sustituir; L1 es un enlace, -C(O)-, -C (O) N (L3R2) - , -C(0)0-, -S(0)„-, -O-, -N (L3R2) - , -P(O) (OL3R2)0-, -S02N (L3R2) - , -P (O) (NL3R2) N- , alquileno, sustituido o sin sustituir, heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, arilo, arileno sustituido o sin sustituir o heteroarileno, sustituido o sin sustituir; L2 es un enlace, -C(0)-, -C (0) N (L3AR2A) - , -C(0)0-, -S(0)t-, -0-, -N (L3AR2A) - , -P(0) (OL3AR2A)0-, -S02N (L3AR2A) - , -P (O) (NL3AR2A) N- , alquileno, sustituido o sin sustituir, heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, arileno, sustituido o sin sustituir o heteroarileno, sustituido o sin sustituir; n y t son, de manera independiente, 0, 1 ó 2; L3 y L3A son, de manera independiente, un enlace, alquileno, sustituido o sin sustituir, heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, arileno, sustituido o sin sustituir o heteroarileno, sustituido o sin sustituir, en donde w es 0, 1 ó 2 ; R2 y R2A son, de manera independiente, hidrógeno, alquilo, sustituido o sin sustituir, heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, arilo, sustituido o sin sustituir o heteroarilo, sustituido o sin sustitui ; E es un grupo aceptor de electrones; en donde el inhibidor de cinasas reversible se disocia de manera medible de la proteína cinasa cuando la proteína cinasa no está desnaturalizada, parcialmente desnaturalizada o totalmente desnaturalizada; y en donde si L1 es un enlace y R1 es (3- (4-amino-5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin-7- il ) propan-l-ol) - 6- il , entonces -L2-E no es -C(0)NH2.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de cinasas reversible tiene la Fórmula: (II) en donde W es -C(O) - o -S(0)2-; z es 0 ó 1 ; X es O o N, en donde si X es 0, entonces z es 0; R3 y R4 son, de manera independiente, hidrógeno, alquilo, sustituido o sin sustituir, heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, arilo, sustituido o sin sustituir o heteroarilo, sustituido o sin sustituir, en donde R3 y R4 opcionalmente se juntan con X para formar un heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir o un heteroarilo, sustituido o sin sustituir; L1, L4 y L5 son, de manera independiente, un enlace, alquileno, sustituido o sin sustituir, heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, arileno, sustituido o sin sustituir o heteroarileno, sustituido o sin sustituir; y en donde si L1 es un enlace y R1 es (3- (4-amino-5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-7-il) propan-l-ol) -6-il , entonces por lo menos uno de R3 y R4 no son hidrógeno .
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de cinasas reversible tiene la Fórmula: (VIII) en donde el anillo A es un heteroarilo, sustituido o sin sustituir.
4. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el anillo A es un R31-heteroarilo cinco miembros, sustituido o sin sustituir, un R31-heteroari de seis miembros, sustituido o sin sustituir, R31 es hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R33-alquilo, sustituido o sin sustituir, R33-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R33-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R33-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R33-arilo, sustituido o sin sustituir o R33-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R33 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R34-alquilo, sustituido o sin sustituir, R34-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R34-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R34-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R34-arilo, sustituido o sin sustituir o R34-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R34 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R35-alquilo, sustituido o sin sustituir, R35-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R35-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R35-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R35-arilo, sustituido o sin sustituir o R35-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; y R35 es, de manera independiente halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3( alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
5. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el inhibidor de cinasas reversible ti la Fórmula : (IX) en donde el anillo A es un heteroarilo, sustituido o sin sustituir.
6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anillo A es R31-furilo, sustituido o sin sustituir, R31-tienilo, sustituido o sin sustituir, R31-pirrolilo, sustituido o sin sustituir, R31- imidazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-pirazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-oxazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-isoxazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-tiazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-isotiazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-triazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-oxadiazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-piridilo, sustituido o sin sustituir, R31-pirimidilo, sustituido o sin sustituir, R31-piridazinilo, sustituido o sin sustituir, R31-pirrolinilo, sustituido o sin sustituir, R31-pirazinilo, sustituido o sin sustituir, R31-tetrazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-furanilo, sustituido o sin sustituir, R31-dihidrotieno-pirazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-tianaftenilo, sustituido o sin sustituir, R31-carbazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-benzotienilo, sustituido o sin sustituir, R31-benzofuranilo, sustituido o sin sustituir, R31-indolilo, sustituido o sin sustituir, R31-quinolinilo, sustituido o sin sustituir, R31-benzotriazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-benzotiazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-benzooxazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-benzimidazolilo, sustituido o sin sustituir, R31-isoquinolinilo, sustituido o sin sustituir, R31-isoindolilo, sustituido o sin sustituir, R31-acridinilo, sustituido o sin sustituir, R31-benzoisazolilo, sustituido o sin sustituir, R31 es hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2 , -COOH, -CF3, R33-alquilo, sustituido o sin sustituir, R33-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R33-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R33-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R33-arilo, sustituido o sin sustituir o R33-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R33 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R34-alquilo, sustituido o sin sustituir, R3 -heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R34-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R34-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R34-arilo, sustituido o sin sustituir o R34-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R34 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R35-alquilo, sustituido o sin sustituir, R35-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R35-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R35-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R35-arilo, sustituido o sin sustituir o R35-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; y R35 es de manera independiente halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 es R7-alquilo, sustituido o sin sustituir, R7-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R7-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R7-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R7-arilo, sustituido o sin sustituir o R7-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R7 es de manera independiente hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R8-alquilo, sustituido o sin sustituir, R8-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R8-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R8-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R8-arilo, sustituido o sin sustituir, R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir o -LS-R7A; L6 es -0-, -C(0)-, -C(0)NH-, -S(0)m- o -S(0)mNH-; m es O, 1 ó 2; R7A es hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R8-alquilo, sustituido o sin sustituir, R8-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R8-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R8-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R8-arilo, sustituido o sin sustituir, R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R8 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R9-alquilo, sustituido o sin sustituir, R9-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R9-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R9-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R9-arilo, sustituido o sin sustituir o R9-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R9 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R10-alquilo, sustituido o sin sustituir, R10-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R10-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R10-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R10-arilo, sustituido o sin sustituir o R10-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; y R10 es, de manera independiente halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque L1 es un enlace, Ri:L-alquileno, sustituido o sin sustituir, R^-heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, R1:L-cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, R1]"-heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, Ri:L-arileno, sustituido o sin sustituir o R1:L-heteroarileno, sustituido o sin sustituir; R11 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2 , -COOH, -CF3, R12-alquilo, sustituido o sin sustituir, R12-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R12-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R12-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R12-arilo, sustituido o sin sustituir o R12-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R12 es, de manera independiente hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R13-alquilo, sustituido o sin sustituir, R13-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R13-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R13-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R13-arilo, sustituido o sin sustituir o R13-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R13 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R14-alquilo, sustituido o sin sustituir, R14-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R14-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R14-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R14-arilo, sustituido o sin sustituir o R14-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; y R14 es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R2 es hidrógeno, R15-alquilo, sustituido o sin sustituir, R15-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R15-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R15-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R15-arilo, sustituido o sin sustituir o R15-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R15 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R16-alquilo, sustituido o sin sustituir, R16-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R16-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R16-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R16-arilo, sustituido o sin sustituir, Rls-heteroarilo, sustituido o sin sustituir o -L7-R15A; L7 es -0-, -C(O)-, -C(0)NH-, -S(0)y- O-S(0)yNH-; y es 0, 1 ó 2; R15A es hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R16-alquilo, sustituido o sin sustituir, R16-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R16-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R16-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R16-arilo, sustituido o sin sustituir, R16-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R16 es de manera independiente hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R17-alquilo, sustituido o sin sustituir, R17-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R17-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R17-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R17-arilo, sustituido o sin sustituir o R17-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R17 es de manera independiente hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R18-alquilo, sustituido o sin sustituir, R18-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R18-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R18-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R18-arilo, sustituido o sin sustituir o R18-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; y R18 es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2/ -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
10. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque R4 es hidrógeno, R23A-alquilo, sustituido o sin sustituir, R23A-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R23A-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R23A-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R23A-arilo, sustituido o sin sustituir o R23A-heteroarilo, sustituido o sin sustituir. En algunas modalidades, R4 y R4A no son hidrógeno; R23A es hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -C00H, -CF3, R24A-alquilo, sustituido o sin sustituir, R24A-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R24A-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R24A-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R24A-arilo, sustituido o sin sustituir, R24A-heteroarilo, sustituido o sin sustituir o -L7A-R24B; L7A es de manera independiente -0-, -C(0)-, -C(0)NH-, -S(0)y.-o -S(0)y. H-; y' es 0, 1 ó 2 ; R24B es, de manera independiente hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -C00H, -CF3, R24A-alquilo, sustituido o sin sustituir, R24A-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R24A-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R4A-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R24A-arilo, sustituido o sin sustituir, R2 A-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R4A es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R25A-alquilo, sustituido o sin sustituir, R25A-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R25A-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R25A-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R25A-arilo, sustituido o sin sustituir o R25A-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R25A es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R26A-alquilo, sustituido o sin sustituir, R26A-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R26A-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R26A-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R26A-arilo, sustituido o sin sustituir o R26A-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R26A es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
11". El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque L2 es un enlace, R19-alquileno, sustituido o sin sustituir, R19-heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, R19-cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, R19-heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, R19-arileno, sustituido o sin sustituir o R19-heteroarileno, sustituido o sin sustituir; R19 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R20-alquilo, sustituido o sin sustituir, R20-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R20-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R20-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R20-arilo, sustituido o sin sustituir o R20-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R20 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R1-alquilo, sustituido o sin sustituir, R21-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R21-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R21-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R21-arilo, sustituido o sin sustituir o R21-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R21 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R22-alquilo, sustituido o sin sustituir, R22-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R22-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R2-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R22-arilo, sustituido o sin sustituir o R22-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; y R22 es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
12. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque L5 es un enlace, R19-alquileno, sustituido o sin sustituir, R19-heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, R19-cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, R19-heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, R19-arileno, sustituido o sin sustituir o R19-heteroarileno , sustituido o sin sustituir; R19 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2/ -COOH, -CF3, R20-alquilo, sustituido o sin sustituir, R20-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R20-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R20-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R20-arilo, sustituido o sin sustituir o R20-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R20 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R21-alquilo, sustituido o sin sustituir, R21-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R21-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R1-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R21-arilo, sustituido o sin sustituir o R1-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R21 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R22-alquilo, sustituido o sin sustituir, R22-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R22-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R22-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R22-arilo, sustituido o sin sustituir o R22-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; y R22 es, de manera independiente, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
13. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque R3 es hidrógeno, R23-alquilo, sustituido o sin sustituir, R23-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R23-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R23-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R23-arilo, sustituido o sin sustituir o R23-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R23 es de manera independiente hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R24-alquilo, sustituido o sin sustituir, R24-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R24-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R -heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R24-arilo, sustituido o sin sustituir, R24-heteroarilo, sustituido o sin sustituir o -L8-R23A'; L8 es -0-, -C(0)-, -C(0)NH-, -S(0)p- o -S(0)pNH-; p es 0, 1 ó 2; R23A' es, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R24-alquilo, sustituido o sin sustituir, R24-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R2 -cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R24-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R24-arilo, sustituido o sin sustituir, R24-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R24 es de manera independiente hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R25-alquilo, sustituido o sin sustituir, R25-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R25-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R5-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R25-arilo, sustituido o sin sustituir o R25-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R25 es de manera independiente hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R26-alquilo, sustituido o sin sustituir, R6-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R26-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R26-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R26-arilo, sustituido o sin sustituir o R6-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; y R26 es de manera independiente halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3, alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque L3 es un enlace, R27-alquileno, sustituido o sin sustituir, R2 -heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, R27-cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, R27-heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, R27-arileno, sustituido o sin sustituir o R27-heteroarileno, sustituido o sin sustituir; R27 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -C , -OH, -NH2, -COOH, -CF3, R28-alquilo, sustituido o sin sustituir, R28-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R28-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R28-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R28-arilo, sustituido o sin sustituir o R28-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R28 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, - H2, -COOH, -CF3, R29-alquilo, sustituido o sin sustituir, R29-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R29-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R9-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R29-arilo, sustituido o sin sustituir o R29-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R29 es, de manera independiente, hidrógeno, halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3/ R30-alquilo, sustituido o sin sustituir, R30-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R30-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R30-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R30-arilo, sustituido o sin sustituir o R30-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; y R30 es de manera independiente halógeno, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CF3( alquilo sin sustituir, heteroalquilo sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, heterocicloalquilo sin sustituir, arilo sin sustituir o heteroarilo sin sustituir.
15. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque R1 es R7-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R7-arilo, sustituido o sin sustituir o R7-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; L1, L4 y L5 son,, de manera independiente, un enlace; R7 es de manera independiente -NH2, R8-alquilo, sustituido o sin sustituir, R8-arilo, sustituido o sin sustituir, R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir o -L4-R7A; L4 es -C(0) - ; R7A es, de manera independiente, R8-alquilo, sustituido o sin sustituir, R8-arilo, sustituido o sin sustituir, R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R8 es, de manera independiente, -OH o R9-alquilo, sustituido o sin sustituir; R4 es hidrógeno o R15-alquilo, sustituido o sin sustituir; R3 es hidrógeno o R3-alquilo, sustituido o sin sustituir; o R3 y R4 opcionalmente se juntan con X para formar un heterocicloalquilo de 4-7 miembros.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque R8 es, de manera independiente, -OH o alquilo sin sustituir.
17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque X es N.
18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque X es 0.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque R4 es R15-alquilo, sustituido o sin sustituir.
20. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque R1 es R7-fenilo sustituido, R7-heterocicloalquilo de 6 miembros sustituido, R7-heteroarilo de anillos fusionados 6,5, sustituido o sin sustituir, o R7-heteroarilo de anillos fusionados 5,6, sustituido o sin sustituir; R7 es, de manera independiente, halógeno, -C , -OH, -NH2, -COOH, R8-alquilo, sustituido o sin sustituir, R8-heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, R8-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R8-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R8-arilo, sustituido o sin sustituir o R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir o -L6-R7A; R7A es, de manera independiente, R8-cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R8-heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, R8-arilo, sustituido o sin sustituir o R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir; L6 es -0-, -C(0)-, -C(0) H-, -S(0)m- o -S(0)n,NH-; R8 es, de manera independiente, -OH o R9-alquilo, sustituido o sin sustituir; y m es 0 , 1 ó 2.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque R7 es R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir o -L6-R7A; Ls es -C (O) - ; y R7A es R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir.
22. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el inhibidor de cinasas reversible inhibe a la proteína cinasa con una constante de inhibición menor que 100 nM.
23. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 22, caracterizado porque la proteína cinasa es Rsk, Nek, Mekkl, MSK1 o Plk.
24. Uso de un compuesto que tiene la estructura de la Fórmula (I) , para la manufactura de un medicamento para tratar una enfermedad asociada con la actividad de las cinasas en un sujeto que necesita del tratamiento , (I) en donde R1 es alquilo, sustituido o sin sustituir, heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, arilo, sustituido o sin sustituir o heteroarilo, sustituido o sin sustituir; L1 y L2 son, de manera independiente, un enlace, -C (0) N(L3R2) -, -C(0)0-, -S(0)n-, -O-, -S-, -N (L3R2) - , alquileno, sustituido o sin sustituir, heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, arileno, sustituido o sin sustituir o heteroarileno, sustituido o sin sustituir; L3 es, de manera independiente, un enlace, alquileno, sustituido o sin sustituir, heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, arileno, sustituido o sin sustituir o heteroarileno, sustituido o sin sustituir; R2 es de manera independiente hidrógeno, alquilo, sustituido o sin sustituir, heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, arilo, sustituido o sin sustituir o heteroarilo, sustituido o sin sustituir; E es un grupo aceptor de electrones; en donde si L1 es un enlace y R1 es (3- (4-amino-5-p-tolil-7H-pirrólo [2, 3-d] irimidin-7-il) propan-l-ol) -6-il, entonces por lo menos uno de R2 y R3 no es hidrógeno.
25. Uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde la enfermedad o el trastorno es un cáncer, una enfermedad o un trastorno autoinmune, una infección por VIH o una inflamación.
26. Un compuesto que tiene la Fórmula: (II) caracterizado porque W es -C(O) - o -S (O) 2- ; z es 0 ó 1; X es O o N, en donde si X es O, entonces z es 0; R1 es alquilo, sustituido o sin sustituir, heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, arilo, sustituido o sin sustituir o heteroarilo, sustituido o sin sustituir; R3 y R4 son, de manera independiente, hidrógeno, alquilo, sustituido o sin sustituir, heteroalquilo, sustituido o sin sustituir, cicloalquilo, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir, arilo, sustituido o sin sustituir o heteroarilo, sustituido o sin sustituir, en donde R3 y R4 opcionalmente se juntan con X para formar un heterocicloalquilo, sustituido o sin sustituir o un heteroarilo, sustituido o sin sustituir; L1, L4 y L5 son, de manera independiente, un enlace, alquileno, sustituido o sin sustituir, heteroalquileno, sustituido o sin sustituir, cicloalquileno, sustituido o sin sustituir, heterocicloalquileno, sustituido o sin sustituir, arileno, sustituido o sin sustituir o heteroarileno, sustituido o sin sustituir; y en donde si L1 es un enlace y R1 es (3- (4-amino-5-p-tolil-7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidin-7 - il ) propan- l-ol ) -6- il , entonces por lo menos uno de R3 y R4 no son hidrógeno.
27. El compuesto de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque X es N.
28. El compuesto de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque R1 es R7-fenilo sustituido; R7 es R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir o -L6-R7A, en donde L5 es -C(0)- y R7A es R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir .
29. El compuesto de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque R3 y R4 son hidrógeno.
30. El compuesto de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque R7 es R8-purinilo, sustituido o sin sustituir, R8-pirimidilo, sustituido o sin sustituir, R8-imidazolilo, sustituido o sin sustituir, R8- lH-pirrolo [2 , 3 -b] piridinilo, sustituido o sin sustituir, R8-pirimidilo, sustituido o sin sustituir, R8- lH-indazolilo, sustituido o sin sustituir, o R8- 7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidinilo, sustituido o sin sustituir.
31. El compuesto de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque R7 es -L4-R7A; y R7A es R8- lH-pirrolo [2 , 3 -b] iridinilo, sustituido o sin sustituir .
32. El compuesto de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque R1 es R7-heterocicloalquilo de 6 miembros sustituido; y R7 es R8-heteroarilo, sustituido o sin sustituir.
33. El compuesto de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque R1 es R7-piperidina sustituida; y R7 es R8-purinilo, sustituido o sin sustituir, R8-pirimidilo, sustituido o sin sustituir, R8-imidazolilo, sustituido o sin sustituir, R8- lH-pirrolo [2 , 3-b] piridinilo, sustituido o sin sustituir, R8-pirimidilo, sustituido o sin sustituir, R8- 1H-indazolilo, sustituido o sin sustituir o R8- 7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidinilo, sustituido o sin sustituir.
34. El compuesto de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque R3 y R4 son hidrógeno.
35. El compuesto de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque R1 es R7-heteroarilo de anillos fusionados 6,5, sustituido o sin sustituir, o R7-heteroarilo de anillos fusionados 5,6, sustituido o sin sustituir; R7 es, de manera independiente, -NH2, R8-alquilo, sustituido o sin sustituir, R8-arilo, sustituido o sin sustituir; y R8 es, de manera independiente, -OH o alquilo sin sustituir.
36. El compuesto de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque R1 es R7- indazolilo, sustituido o sin sustituir o R7- 7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidinilo, sustituido o sin sustituir.
37. El compuesto de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque R3 y R4 son hidrógeno.
38. El compuesto de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque R3 es alquilo sin sustituir; y R4 es hidrógeno.
39. El compuesto de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque R3 es fenilmetilo; y R4 es hidrógeno.
40. El compuesto de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque R3 y R4 se juntan con N para formar R23-pirrolidinilo sustituido o sin sustituir.
41. El compuesto de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque X es 0.
42. El compuesto de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque R1 es R7-heteroarilo de anillos fusionados 6,5, sustituido o sin sustituir, o R-heteroarilo de anillos fusionados 5,6, sustituido o sin sustituir; R7 es de manera independiente -NH2, R8-alquilo, sustituido o sin sustituir, R8-arilo, sustituido o sin sustituir; y R8 es de manera independiente -OH o alquilo sin sustituir; y R3 es alquilo sin sustituir.
43. El compuesto de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque R1 es R7-substituted 7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidinilo; y R7 es -NH2, R8-alquilo, sustituido o sin sustituir o R8-fenilo, sustituido o sin sustituir.
44. Un compuesto que tiene la Fórmula: (VIII) caracterizado porque el anillo A es un heteroarilo, sustituido o sin sustituir, ?? ?87 ?88 ??? 290 ??
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