MX2011013984A

MX2011013984A - Metodos y productos para el tratamiento de enfermedades.

Info

Publication number: MX2011013984A
Application number: MX2011013984A
Authority: MX
Inventors: David Bar-Or
Original assignee: Dmi Acquisition Corp
Priority date: 2009-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2012-06-01
Also published as: SG10201403388SA; IL217073A0; US20100323991A1; ZA201109449B; EP2445350A1; SG177302A1; US20160158250A1; AU2010264525B2; EP2445350A4; CA2765883A1; US20130005699A1; BRPI1010086A2; IL217073A; WO2010151531A1; AU2010264525A1

Abstract

La invención proporciona un método para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular en un animal. El método comprende administrar una cantidad de un compuesto de danazol efectiva para inhibir la hiperpermeabilidad vascular y una cantidad de un segundo fármaco efectiva para tratar la enfermedad o condición. La invención además proporciona un método para inhibir la hiperpermeabilidad vascular cuando es un efecto secundario causado por la administración de un fármaco a, u otro tratamiento de, un animal. El método comprende la administración de una cantidad de un compuesto de danazol efectiva para inhibir la hiperpermeabilidad vascular. La invención también proporciona un método para modular el citoesqueleto de células endoteliales en un animal que comprende administrar una cantidad de un compuesto de danazol y una cantidad de un segundo fármaco efectiva para modular el citoesqueleto. La presente invención también se relaciona a composiciones farmacéuticas y equipos que comprenden un compuesto de danazol y un segundo fármaco.

Description

MÉTODOS Y PRODUCTOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona al tratamiento de enfermedades y condiciones, mediadas por hiperpermeabilidad vascular. En particular, estas enfermedades y condiciones se tratan con una cantidad de un compuesto de danazol efectiva para inhibir la hiperpermeabilidad vascular y una cantidad de un segundo fármaco efectiva para tratar la enfermedad o condición. La presente invención también se relaciona a composiciones farmacéuticas y equipos que comprenden un compuesto de danazol y un segundo fármaco efectivo para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular.

La invención además se relaciona a un método para inhibir la hiperpermeabilidad vascular que es un efecto secundario causado por la administración de un fármaco, a, u otro tratamiento de, un animal. El método comprende la administración de una cantidad de un compuesto de danazol al animal efectiva para inhibir el efecto secundario de la hiperpermeabilidad vascular. La invención también se relaciona a una composición farmacéutica y equipo que comprende un fármaco que causa hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario y un compuesto de danazol.

La invención también se relaciona a la modulación del citoesqueleto de células endoteliales . En particular, el cite-esqueleto se modula utilizando una cantidad de un compuesto de danazol y una cantidad de un segundo fármaco efectiva para modular el citoesqueleto . La presente invención también se relaciona a composiciones farmacéuticas y equipos que comprenden un compuesto de danazol y un segundo fármaco efectivo para modular el citoesqueleto de células endoteliales .

ANTECEDENTES El endotelio vascular recubre el interior de todos los vasos sanguíneos. Este actúa como la interfase entre la sangre y los tejidos y órganos. El endotelio forma una barrera semipermeable que mantiene la integridad del compartimiento de fluido de sangre, pero permite al pasaje de agua, iones, moléculas pequeñas, macromoléculas y células de una manera regulada. La desrregulación de este proceso produce fuga vascular en los tejidos implícitos. La fuga de fluido en tejidos que causa edema puede tener consecuencias serias y amenazantes de la vida. Por consiguiente, sería altamente deseable tener métodos y productos para reducir edema y restaurar la barrera endotelial a fisiológica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona tales métodos. y productos. En una primera modalidad, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular en un animal. El método que comprende administrar al animal una cantidad de un compuesto de danazol efectiva para inhibir la hiperpermeabilidad vascular y una cantidad de un segundo fármaco efectiva para tratar la enfermedad o condición.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable, un primer fármaco y un segundo fármaco. El primer fármaco es un compuesto de danazol, y el segundo fármaco es un fármaco adecuado para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular.

La invención además proporciona un equipo que comprende un primer recipiente y un segundo recipiente. El primer recipiente comprende un compuesto de danazol, y el segundo recipiente comprende un fármaco adecuado para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular .

Además, la invención proporciona un método para inhibir la hiperpermeabilidad vascular en un animal que es un efecto secundario causado por un fármaco administrado al animal o mediante un tratamiento del animal. El método comprende administrar al animal una cantidad de un compuesto de danazol efectiva para inhibir la hiperpermeabilidad vascular .

La invención además proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable, un primer fármaco y un segundo fármaco. El primer fármaco es un compuesto de danazol, y el segundo fármaco es un fármaco que causa hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario.

La invención también proporciona un equipo que comprende un primer recipiente y un segundo recipiente. El primer recipiente comprende un compuesto de danazol, y el segundo recipiente comprende un fármaco que causa hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario.

La invención proporciona un método para modular el citoesqueleto de células endoteliales en un animal. El método comprende administrar al animal una cantidad de un compuesto de danazol y una cantidad de un segundo fármaco efectiva para modular el citoesqueleto.

La invención además proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable, un primer fármaco y un segundo fármaco. El primer fármaco es un compuesto de danazol y el segundo fármaco es un fármaco que modula el citoesqueleto de células endoteliales.

La invención también proporciona un equipo que comprende un primer recipiente y un segundo recipiente. El primer recipiente comprende un compuesto de danazol, y el segundo recipiente comprende un fármaco que modula el citoesqueleto de células endoteliales.

"Hiperpermeabilidad vascular" se utiliza en la presente para dar a entender la permeabilidad de un endotelio vascular que se incrementa como es comparado con los niveles básales. "Hiperpermeabilidad vascular" como se utiliza en la presente, incluye hiperpermeabilidad causada por paracelular e hiperpermeabilidad causada por transcitosis .

"Hiperpermeabilidad causada por paracelular" se utiliza en la presente para dar a entender la hiperpermeabilidad vascular causada por el transporte paracelular que se incrementa como es comparado con los niveles básales. Otras características de "hiperpermeabilidad causada por paracelular" se describen enseguida.

"Transporte paracelular" se utiliza en la presente para dar a entender el movimiento de iones, moléculas y fluidos a través de las uniones interendoteliales (IEJs) entre las células endoteliales de un endotelio.

"Hiperpermeabilidad causada por transcitosis" se utiliza en la presente para dar a entender la hiperpermeabilidad vascular causada por transcitosis que se incrementa como es comparado con los niveles básales.

"Transcitosis" se utiliza en la presente para dar a entender el transporte activo de macromoléculas y constituyentes de plasma de fase fluida acompañantes a través de las células endoteliales de un endotelio.

"Nivel basal" se utiliza en la presente para referirse al nivel encontrado en un tejido u órgano normal. "Inhibición", "inhibir" y términos similares se utilizan en la presente para dar a entender reducir, retardar o prevenir.

"Mediado" y términos similares se utilizan aquí para dar a entender causado por, que causa, que involucra o exacerbado por, hiperpermeabilidad vascular.

"Tratar", "tratando" o "tratamiento" se utiliza en la presente para dar a entender para reducir (completamente o parcialmente) los síntomas, duración o severidad de una enfermedad o condición, incluyendo la curación de la enfermedad, o para prevenir la enfermedad o condición.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los niveles OD medidos después de la incubación de células HUVEC con danazol como una medida de su habilidad para prevenir la proliferación inicial de células endoteliales .

La Figura 2 muestra fotografías de células HUVEC tomadas después de la incubación con danazol como una medida de su habilidad para prevenir la formación de tubo de células endoteliales. A= control; B = danazol 1 µ?, C = danazol 10 µ?, D = danazol 50 µ? y E = LY294002 50 µ?.

La Figura 3 muestra la fluorescencia medida después del tratamiento de células HUVEC con danazol como una medida de su habilidad para prevenir la invasión de célula endotelial.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES ACTUALMENTE PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN El endotelio es una compuerta clave que controla el intercambio de moléculas de la sangre al parénquima de tejido. Este grandemente controla la permeabilidad de un lecho vascular particular a las moléculas portadas por la sangre. La permeabilidad y selectividad de la barrera de célula endotelial es fuertemente dependiente de la estructura y tipo de endotelio que recubre la microvasculatura en diferentes lechos vasculares. Las células endoteliales que recubren los lechos microvasculares de diferentes órganos exhiben diferenciación estructural que puede ser agrupada en tres categorías morfológicas primarias: sinusoidal, fenestrada y continua.

Endotelio sinusoidal (también referido como "endotelio discontinuo") tiene espacios intracelulares grandes y nada de membrana de basamento, que permite el transporte mínimamente restringido de moléculas del lumen capilar en el tejido y viceversa. El endotelio sinusoidal se encuentra en el hígado, bazo y médula ósea.

Los endotelios fenestrados se caracterizan por la presencia de un número grande de aberturas transcelulares circulares llamadas fenestros o ventanas con un diámetro de 60 a 80 nm. Los endotelios fenestrados se encuentran en tejidos y órganos que requieren intercambio rápido de moléculas pequeñas, incluyendo el riñon (glomérulos, capilares peritubulares y vasa recta ascendente) , páncreas, glándulas adrenales, glándulas endocrinas e intestino. Los fenestros son cubiertos por diafragmas delgados, excepto para aquellos en glomérulos sanos, maduros. Ver Ichimura y colaboradores, J. Am. Soc. Nephrol., 19:1463-1471 (2008).

Los endotelios continuos no contienen fenestros o espacios grandes. En cambio, los endotelios continuos se caracterizan por una monocapa de célula endotelial no interrumpida. La mayoría de los endotelios en el cuerpo son endotelios continuos, y el endotelio continuo se encuentra en, o alrededor, del cerebro (barrera hematoencefálica) , diafragma, musculatura duodenal, grasa, corazón, algunas áreas de los ríñones (microvasculatura papilar, vasa recta descendente), vasos sanguíneos grandes, pulmones, mesenterio, nervios, retina (barrera retinal de sangre) , músculo esquelético, testículos y otros tejidos y órganos del cuerpo.

El transporte endotelial en el endotelio continuo puede ser a través de, en un sentido general como ocurre por las rutas paracelulares y transcelulares. La ruta paracelular es la ruta entre células endoteliales , a través de las uniones interendoteliales (IEJs). En el endotelio continuo no perturbado, agua, iones y moléculas pequeñas se transportan paracelularmente por difusión y convección. Una cantidad significante de agua (hasta 40%) también cruza la barrera de célula endotelial transcelularmente a través de canales de membrana que transportan agua llamados acuaporinas. Una variedad de estímulos puede interrumpir la organización de las IEJs, para de esta manera abrir espacios en la barrera endotelial. La formación de estos espacios intercelulares permite el pasaje de fluidos, iones, macromoléculas (por ejemplo, proteínas) y otros constituyentes de plasma entre las células endoteliales de una manera no restringida. Esta hiperpermeabilidad causada por paracelular produce edema y otros efectos adversos que pueden eventualmente dar por resultado el daño a tejidos y órganos.

La ruta transcelular es responsable para el transporte activo de macromoléculas, tales como albúmina y otras proteínas de plasma, a través de las células endoteliales, un proceso referido como "transcitosis". El transporte de macromoléculas ocurre en vesículas llamadas caveolas. Casi todos lo endotelios continuos tienen caveolas abundantes, excepto para los endotelios continuos localizados en el cerebro y testículos que tienen pocos caveolas. La transcitosis es un proceso de multietapas que involucra el brote de caveolas sucesivas y la fisión del plasmalemma y la translocación a través de la célula, seguido por la dosificación y fusión con el plasmalemma opuesto, donde las caveolas liberan sus contenidos mediante exocitosi.s en el intersticio. La transcitosis es selectiva y herméticamente regulada bajo condiciones fisiológicas normales.

Hay una realización creciente de la importancia fundamental de la ruta transcelular . La transcitosis de proteínas de plasma, especialmente albúmina que representa 65% de proteína de plasma, es de interés particular debido a su habilidad para regular el gradiente de presión oncótico transvascular . Como se puede apreciar, luego, la transcitosis incrementada de albúmina y otras proteínas de plasma arriba de los niveles básales incrementará la concentración de proteína de tejido de éstas, que, a su vez, causará que el agua se mueva a través de la barrera endotelial, para de esta manera producir el edema.

Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) también son transportadas a través de las células endoteliales mediante transcitosis. En hiperlipidemia, un incremento significante en transcitosis de LDL se ha detectado como el evento inicial en aterogénesis . Las LDL se acumulan en el espacio subendotelial, se atrapan dentro de la lámina basal expandida y la matriz extracelular . La acumulación de lipoproteína subendotelial en hiperlipidemia es seguido por una cascada de eventos que dan por resultado la formación de placa ateromatosa. Las lesiones ateroescleróticas avanzadas se reportan que son ocasionalmente acompañadas por la abertura de IEJs y el pasaje no controlado masivo de LDL y albúmina.

Las complicaciones vasculares son una marca de referencia de diabetes. Al nivel de vasos grandes, la enfermedad aparece para ser expresada como una aceleración de un proceso ateroesclerótico . Con respecto a la microangiopatia, las alteraciones en la microvasculatura de la retina, glomérulos renal y nervios causa el número más grande de complicaciones clínicas, pero un número continuamente incrementado de investigaciones muestran que la diabetes también afecta la microvasculatura de otros órganos, tal como el mesenterio, piel, músculo esquelético, corazón, cerebro y pulmón, causando complicaciones clínicas adicionales. En todos estos lechos vasculares, los cambios en la permeabilidad vascular aparecen para representar una marca de referencia de la disfunción endotelial diabética.

En el endotelio continuo, la hiperpermeabilidad capilar a macromoléculas de plasma en la fase temprana de la diabetes se explica por una intensificación de transporte vesicular transendotelial (es decir, mediante transcitosis incrementada) y no por la desestabilización de las IEJs. Además, las células endoteliales de diabéticos, incluyendo aquellas del cerebro, se han reportado que contienen un número incrementado de caveolas como es comparado con las normales, y las proteínas glicadas, particularmente albúmina glicada, son tomadas por las células endoteliales y transcitosadas a velocidades sustancialmente más grandes que sus formas nativas. Además, la transcitosis incrementada de macromoléculas es un proceso que continua más allá de la fase temprana de diabetes y aparece que es una causa de edema en tejidos diabéticos y órganos por toda la enfermedad si se deja sin tratar. Este edema, a su vez, conduce al daño de tejido y órgano. Incrementos similares en transporte transcelular de macromoléculas se ha reportado en hipertensión. La hiperpermeabilidad causada por paracelular también es un factor en la diabetes y las complicaciones vasculares de diabetes. Las IEJs de la ruta paracelular incluyen las uniones adherentes (AJs) y uniones herméticas (TJs) . La diabetes altera el contenido, fosforilación y localización de ciertas proteínas en ambas de las AJs y TJs, para de esta manera contribuir a la permeabilidad de barrera endotelial incrementada.

En soporte de la discusión anterior y para información adicional, ver Frank y colaboradores, Cell Tissue Res., 335:41-47 (2009), Simionescu y colaboradores, Cell Tissue Res., 335:27-40 (2009); van den Berg y colaboradores, J. Cyst. Fibros., 7 (6) :515-519 (2008); Viazzi y colaboradores, Hypertens. Res., 31:873-879 (2008); Antonetti y colaboradores, Chapter 14, pages 340-342, in Diabetic Retinopathy (edited by Elia J. Duh, Humana Press, 2008), Felinski y colaboradores, Current Eye Research, 30:949-957 (2005) , Pascariu y colaboradores, Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 52(l):65-76 (2004); Bouchard y colaboradores, Diabetologia, 45:1017-1025 (2002); Arshi y colaboradores, Laboratory Investigation, 80(8) :1 171-1184 (2000); Vinores y colaboradores, Documenta Ophthalmologica, 97:217-228 (1999); Oomen y colaboradores, European Journal of Clinical Investigation, 29:1035-1040 (1999); Vinores y colaboradores, Pathol. Res. Pract., 194:497-505 (1998); Antonetti y colaboradores, Diabetes, 47:1953-1959 (1998), Popov y colaboradores, Acta Diabetol, 34:285-293 (1997); Yamaji y colaboradores, . Circulation Research, 72:947-957 (1993); Vinores y colaboradores, Histochemical Journal, 25:648-663 (1993); Beals y colaboradores, Microvascular Research, 45:11-19 (1993); Caldwell y colaboradores, Investiga ti e Ophthalmol. Visual Sci, 33(5): 1610-1619 (1992).

El transporte endotelial en el endotelio fenestrado también ocurre mediante transcitosis y la ruta paracelular. Además, el transporte endotelial ocurre por medio de los fenestros. Los endotelios fenestrados muestran una permeabilidad notablemente alta al agua y pequeños solutos hidrofilicos debido a la presencia de los fenestros.

Los fenestros pueden o no pueden ser cubiertos por un diafragma. Las localizaciones del endotelio con fenestros diafragmados incluyen tejido endocrino (por ejemplo, isletas pancreáticas y corteza adrenal), mucosa gastroinestinal y capilares peritubulares renales. La permeabilidad de las proteínas de plasma del endotelio fenestrado con fenestros diafragmados no excede a aquel del endotelio continuo.

Las localizaciones del endotelio con fenestros no diafragmados incluyen los glomérulos de los ríñones. El endotelio fenestrado glomerular es cubierto por un glicocáliz que se extiende en los fenestros (formando los llamados "tapones seive") y por una capa de superficie de célula endotelial más sueltamente asociada de glicoproteinas . El análisis matemático de estudios de permeaselectividad funcional ha concluido que el glicocáliz de célula endotelial glomerular, incluyendo aquellos presentes en los fenestros, y su capa de superficie asociada tiene en cuenta la retención de hasta 95% de proteína de plasma dentro de la circulación.

La pérdida de fenestros en el endotelio glomerular se ha encontrado que está asociado con proteinuria en varias enfermedades, incluyendo nefropatía diabética, flomerulopatía de trasplante, pre-eclampsia, diabetes, falla renal, nefropatía de ciclosporina, nefritis de enfermedad del suero y nefritis Thy-1. El rearreglo de actina y,- en particular, la despolimerización de fibras de estrés se han encontrado que son importantes para la formación y mantenimiento de fenestros .

El soporte de la discusión anterior de los endotelios fenestrados y para información adicional, ver Satchell y colaboradores, Am. J. Physiol. Renal Physiol, 296: F947-F956 (2009); Haraldsson y colaboradores, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. , 18:331-335 (2009); Ichimura y colaboradores, J. Am. Soc . Nephrol., 19:1463-1471 (2008); Ballermann, Nephron Physiol., 106:19-25 (2007); Toyoda y colaboradores, Diabetes, 56:2155-2160 (2007); Stan, "Endothelial Structures Involved In Vascular Permeability", pages 679-688, Endothelial Biomedicine (ed. Aird, Cambridge University Press, Cambridge, 2007); Simionescu and Antohe, "Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium: Changes in Various Pathologies" , pages 42-69, The Vascular Endothelium I (eds. Moneada and Higgs, Springer-Verlag, Berlín, 2006) .

El transporte endotelial en el endotelio sinusoidal ocurre mediante transcitosis y a través de los espacios intercelulares (ranuras interendoteliales ) y espacios intracelulares (fenestros) . El tratamiento del endotelio sinusoidal con fármacos que interrumpen el filamento de actina puede inducir un incremento sustancial y rápido en el número de espacios, indicando la regulación de la porosidad del endotelio que se recubre por el citoesqueleto de actina. Otros fármacos que alteran el citoesqueleto se han reportado que cambian los diámetros de los fenestros. Por lo tanto, el citoesqueleto asociado con los fenestros probablemente controla la función importante de filtración endotelial en el endotelio sinusodial. En el hígado, la defenestración (pérdida de fenestro) , que causa una reducción en la permeabilidad del endotelio, se ha asociado con la patogénesis de varias enfermedades y condiciones, incluyendo envejecimiento, aterogénesis , ateroesclerosis, cirrosis, fibrosis, falla de hígado y cánceres de hígado primarios y metastáticos . En soporte de lo anterior y para información adicional, ver Yokpmori, Med. Mol. Morphol., 41:1-4 (2008); Stan, "Endothelial Structures Involved In Vascular Permeability" , pages 679-688, Endothelial Biomedicine (ed. Aird, Cambridge University Press, Cambridge, 2007); DeLeve, "The Hepatic Sinusoidal Endothelial Cell", pages 1226-1238, Endothelial Biomedicine (ed. Aird, Cambridge University Press, Cambridge, 2007); Pries and Kuebler, "Normal Endothelium", pages 1-40, The Vascular Endothelium I (eds. Moneada and Higgs, Springer- Verlag, Berlín, 2006) ; Simionescu and Antohe, "Functional Ultrastructure of the Vascular Endothelium: Changes in Various Pathologies", pages 42-69, The Vascular Endothelium I (eds. Moneada and Higgs, Springer-Verlag, Berlín, 2006) ; Braet and isse, Comparative Hepatology, 1:1-17 (2002); Kanai y colaboradores, Anat. Rec, 244:175-181 (1996); Kempka y colaboradores, Exp. Cell Res., 176:38-48 (1988); Kishimoto y colaboradores, Am. J. Anat., 178:241-249 (1987).

La invención proporciona un método para inhibir la hiperpermeabilidad vascular presente en cualquier tejido u órgano que contiene o es circundado por endotelio continuo. Como es mencionado en lo anterior, en endotelio continuo está presente en, o alrededor de, el cerebro (barrera hematoencefálica) , diafragma, musculatura duodenal, grasa, corazón, algunas áreas de los ríñones (microvasculatura papilar, vasa recta descendente) , vasos sanguíneos grandes, pulmones, mesenterio, nervios, retina (barrera retinal de sangre) , músculo esquelético) , piel, testículos, vena umbilical y otros tejidos y órganos del cuerpo. De preferencia, el endotelio continuo es aquel encontrado en o alrededor del cerebro, corazón, pulmones, nervios o retina.

La invención también proporciona un método para inhibir la hiperpermeabilidad vascular presente en cualquier tejido u órgano que contiene o es circundado por endotelio fenestrado. Como es mencionado en lo anterior, el endotelio fenestrado está presente en, o alrededor de, el riñon (glomérulos, capilares peritubulares y vasa recta ascendente), páncreas, glándulas adrenales, glándulas endocrinas e intestino. De preferencia, el endotelio fenestrado es aquel encontrado en los ríñones, especialmente aquel encontrado en los glomérulos de los ríñones.

Además, cualquier enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular se puede tratar por el método de la invención. Tales enfermedades y condiciones incluyen diabetes, hipertensión y ateroesclerosis.

En particular, las complicaciones vasculares de diabetes, incluyendo aquellos del cerebro, corazón, ríñones, pulmón, mesenterio, nervios, retina, músculo esquelético, piel y otros tejidos y órganos que contienen endotelio continuo o fenestrado, se pueden tratar mediante la presente invención. Estas complicaciones vasculares incluyen edema, acumulación de LDL en el espacio subendotelial, ateroesclerosis acelerada y lo siguiente: cerebro (envejecimiento acelerado de las paredes del vaso) , corazón (edema miocardiaco, fibrosis miocardiaca, disfunción diastólica, cardiomiopatía diabética) , riñon (nefropatía diabética), pulmón (retardo de desarrollo del- pulmón en el feto de madres diabéticas, alternaciones de varios parámetros fisiológicos pulmonares y susceptibilidad incrementada a infecciones) , mesenterio (hiperplasia vascular) , nervios (neuropatía diabética) , retina (edema macular y retinopatía diabética) y piel (enrojecimiento, descoloración, sequedad y ulceraciones) .

La retinopatía diabética es una causa principal de ceguera que afecta aproximadamente 25% de los 21 millones de Americanos estimados con diabetes. Aunque su incidencia y progresión se puede reducir mediante el control glicémico y de presión sanguínea intensivo, casi todos los pacientes con diabetes mellitus tipo 1 y arriba de 60% de aquellos con aquellos de diabetes mellitus tipo 2 eventualmente desarrollan retinopatía diabética. Hay dos etapas de retinopatía diabética. La primera, retinopatía no proliferativa, es la etapa más temprana de la enfermedad y se caracteriza por permeabilidad vascular incrementada, microaneurismas , edema y eventualmente cierres del vaso. La neovascularización no es un componente de la fase no proliferativa . La mayoría de la pérdida visual durante esta etapa es debido a la acumulación de fluido en la mácula, el área centro de la retina. Esta acumulación de fluido es llamada edema macular y puede causar visión disminuida temporaria o permanente. La segunda etapa de retinopatía diabética es llamada la retinopatía proliferativa y se caracteriza por la formación de nuevos vasos anormales. Desafortunadamente esta neovascularización anormal puede ser muy dañante debido a que causa sangrado en el ojo, tejido de cicatrización retinal, desuniones retínales diabéticas o glaucoma, cualquiera de las cuales pueden causar visión disminuida o ceguera. El edema macular también puede ocurrir en la fase proliferativa .

La neuropatía diabética es una complicación seria común de la diabetes. Hay cuatro tipos principales de neuropatía diabética: neuropatía periférica, neuropatía autonómica, neuropatía radiculoplexus y mononeuropatía . Los signos y síntomas de la neuropatía periférica, el tipo más común de neuropatía diabética incluye entumecimiento o habilidad reducida para sentir dolor o cambios en la temperatura (especialmente en los pies y dedos de los pies), una comezón o sensación de quemadura, dolor agudo, color cuando se camina, sensibilidad extrema al tacto más ligero, debilidad muscular, dificultad para caminar y problemas de los pies serios (tales como úlceras, infecciones, deformidades y dolor de hueso y articulaciones) . La neuropatía autonómica afecta el sistema nervioso autonómico que controla el corazón, vejiga, pulmones, estómago, intestinos, órganos sexuales y ojos, y problemas en cualquiera de estas áreas pueden ocurrir. La neuropatía radiculoplexus (también llamada amiotrofia diabética, neuropatía femoral o neuropatía próxima) usualmente afecta los nervios en las caderas, hombros o abdomen, usualmente en un lado del cuerpo. La mononeuropatía significa el daño a solamente un nervio, típicamente en un brazo, pierna o la cara. Las aplicaciones comunes de neuropatía diabética incluyen la pérdida de miembros (por ejemplo, dedo del pie, pies o piernas), articulaciones charcot, infecciones del tracto urinario, incontinencia urinaria, inconciencia por hipoglicemia (aun puede ser fatal), baja presión sanguínea, problemas digestivos (por ejemplo, constipación, diarrea, náusea y vómito) , disfunción sexual (por ejemplo, disfunción eréctil) y sudoración incrementada o disminuida. Como se puede observar, los síntomas pueden variar de leves a dolorosos, deshabilitantes y aun fatales.

La nefropatia diabética es la causa más común de enfermedad renal de etapa final en los Estados Unidos. Esta es una complicación vascular de la diabetes que afecta los capilares glomerulares del riñon y reducen la habilidad de filtración del riñon. La nefropatia es primero indicada por la aparición de hiperfiltración y luego microalbuminuria . La proteinuria pesada y la declinación progresiva en la función renal preceden en la enfermedad renal de etapa final. Típicamente, antes de cualquiera de los signos de nefropatia que aparezcan, la retinopatía usualmente se ha diagnosticado. El transplante renal usualmente se recomienda a pacientes con una enfermedad renal de etapa final debido a la diabetes. La proporción de supervivencia en 5 años para pacientes que reciban un transplante es aproximadamente 60% comparado con solamente 2% para aquellos en diálisis.

La hipertensión típicamente se desarrolla a través de muchos años, y este afecta casi a cualquiera eventualmente . La hipertensión no controlada incrementa el riesgo de problemas de salud serios, incluyendo ataque al corazón, falla de corazón congestivo, apoplejía, enfermedad de arteria periférica, falla del riñon, aneurismas, daño del ojo y problemas con memoria o entendimiento.

La ateroesclerosis también se desarrolla gradualmente. La ateroesclerisis puede afectar las arterias coronarias, la arteria carótida, las arterias periféricas o la microvasculatura, y complicaciones de ateroesclerosis incluyen enfermedad de arteria coronaria (que puede causar angina o ataque al corazón) , enfermedad microvascular coronaria, enfermedad de la arteria carótida (que puede causar un ataque isquémico o transiente o apoplejía), enfermedad de arteria periférica (que puede causar pérdida de sensibilidad al calor y al frío o aun muerte de tejido) y aneurismas .

-Enfermedades y condiciones adicionales que se pueden tratar de acuerdo con la invención incluyen la lesión de pulmón aguda, síndrome de angustia respiratoria aguda (ARDS) , degeneración macular relacionada con la edad, edema cerebral, edema coroidal, coroiditis, enfermedad microvascular coronaria, enfermedad microvascualr cerebral, enfermedad de Eals, edema causado por lesión (por ejemplo, trauma o quemaduras), edema asociado con hipertensión, fuga vascular glomerular, choque hemorrágico, Síndrome de Irvine Gass, isquemia, edema macular (por ejemplo, causada por oclusiones vasculares, cirugía post-intraocular (por ejemplo, cirugía de catarata) , uveitis o retinitis pigmentosa, además de aquellas causadas por diabetes, nefritis (por ejemplo, glomerulonefritis, nefritis de enfermedad de suero y nefritis THY-1) , nefropatías, edema necrótico, síndrome nefrótico, neuropatías, falla de órgano debido al edema de tejido (por ejemplo, en sepsis o debido a trauma) , pre-eclampsia, edema pulmonar, hipertensión pulmonar, falla renal, edema retinal, hemorragia retinal, oclusiones de vena retinal (por ejemplo, oclusiones de vena ramificada o central), . retinitis, retinopatias (por ejemplo, retinopatia ateroesclerótica, retinopatia hipertensiva, retinopatia de radiación, retinopatia de célula enferma y retinopatia de premadurez, además de la retinopatia diabética) , infarto cerebral silencioso, síndrome de respuesta inflamatoria sistémicos (SIRS) , glomerulopatía de transplante, uveítis, síndrome de fuga vascular, hemorragia vitrea y enfermedad de Von Hipple Lindau. Además, ciertos fármacos, incluyendo aquellos utilizados para tratar esclerosis múltiple, se conocen que causan hiperpermeabilidad vascular, y el danazol se puede utilizar para reducir este efecto secundario deseado cuando se utilizan estos fármacos. El angioedema hereditario y adquirido son expresamente excluidos de estas enfermedades y condiciones que se pueden tratar de acuerdo con la invención.

"Tratar", "tratando" o "tratamiento" se utilizan en la presente para dar a entender a reducir (completamente o parcialmente) los síntomas, duración o severidad de una enfermedad o condición, incluyendo la curación de la enfermedad, o para prevenir la enfermedad o condición.

La evidencia reciente indica que la hiperpermeabilidad causada por transcitosis es la primera etapa de un proceso que finalmente conduce al daño de órgano y tejido en muchas enfermedades y condiciones. Por consiguiente, la presente invención proporciona un medio de intervención temprana en estas enfermedades y condiciones que pueden reducir, retardar o aun potencialmente prevenir el daño de tejido y órgano observado en éstas. Por ejemplo, un animal se puede tratar inmediatamente en la diagnosis de una de las enfermedades o condiciones tratables de acuerdo con la invención (aquellas enfermedades y condiciones descritas en lo anterior) . Alternativamente, se prefiere el tratamiento de animales quienes tienen signos tempranos de, o una predisposición a desarrollar, tal enfermedad o condición antes de la existencia de los síntomas. Los signos tempranos de, y factores de riesgo para, diabetes, hipertensión y ateroesclerosis son bien conocidos y el tratamiento de un animal que exhibe estos signos tempranos o factores de riesgo se puede iniciar antes de la presencia de los síntomas de la enfermedad o condición (es decir, profilácticamente) .

Por ejemplo, el tratamiento de un paciente quien es diagnosticado con diabetes se puede iniciar inmediatamente en la diagnosis. En particular, los diabéticos de preferencia deben de ser tratados antes de cualquiera de los síntomas de una complicación vascular que está presente, aunque esto no es usualmente posible, puesto que la mayoría de los diabéticos muestran tales síntomas, cuando son diagnosticados (ver enseguida) . Alternativamente, los diabéticos deben ser tratados mientras que la retinopatia diabética no proliferativa es leve (es decir, niveles leves de microaneurismas y hemorragia intraretinal ) . Ver Diabetic Retinopathy, page 8 (Ed. Elia Duh, M-D-. Human Press, 2008) . Tal tratamiento temprano proporcionará la mejor oportunidad de prevenir el edema macular y la progesión de la retinopatia a retinopatia diabética proliferativa . También, la presencia de retinopatia diabética se considera un signo diferente de otras complicaciones microvasculares de diabetes que existen o se desarrollan (ver Id., pages 474-477), y el tratamiento temprano también puede prevenir o reducir estas complicaciones adicionales. Por supuesto, más enfermedades y condiciones avanzadas que son complicaciones vasculares de diabetes también se pueden tratar con resultados benéficos.

Sin embargo, como es mencionado en lo anterior, las complicaciones vasculares frecuentemente ya están presentes en el momento que la diabetes es diagnosticada. Por consiguiente, es preferible tratar profilácticamente un paciente que tiene signos tempranos de, o predisposición de desarrollar, diabetes. Estos- signos tempranos y factores de riesgo incluyen la glucosa en ayunas que es alta pero no bastante alta para ser clasificada como diabetes "prediabetes" ) , hiperinsulinemia, hipertensión, dislipidemia (alto colesterol, altos triglicéridos, alta lipoproteina de baja densidad, y/o bajo nivel de lipoproteina de alta densidad), obesidad (índice de masa corporal arriba de 25), inactividad, arriba de 45 años de edad, sueño inadecuado, historia familiar de diabetes, raza minoritaria, historia de diabetes gestacional e historia de síndrome de ovario policístico .

De manera similar, el tratamiento de un paciente quien es diagnosticado con hipertensión se puede iniciar inmediatamente en la diagnosis. La hipertensión típicamente no causa cualquiera de los síntomas, pero el tratamiento profiláctico se puede iniciar en un paciente que tiene una predisposición a desarrollar hipertensión. Los factores de riesgo para hipertensión incluyen edad, raza (la hipertensión es más común en negros) , historia familiar (corridas de hipertensión en familias) , sobrepeso u obesidad, falta de actividad, fumar tabaco, demasiada sal en la dieta, muy poco potasio en la dieta, muy poca vitamina D en la dieta, beber demasiado alcohol, altos niveles de estrés, ciertas condiciones crónicas (por ejemplo, alto colesterol, diabetes, enfermedad del riñon y apnea de sueño) y uso de ciertos fármacos (por ejemplo, anticonceptivos orales, anfetaminas, pildoras de dieta, y algunas medicaciones del resfriado y alergias) .

El tratamiento de un paciente quien es diagnosticado con ateroesclerosis se puede iniciar inmediatamente en la diagnosis. Sin embargo, es preferible trata profilácticamente un paciente quien tiene signos tempranos de, o una predisposición a desarrollar,' ateroesclerosis . Los signos tempranos y factores de riesgo para ateroesclerosis incluyen edad, una historia familiar de aneurisma o enfermedad de corazón temprana, hipertensión, alto colesterol, altos triglicéridos, resistencia a la insulina, diabetes, obesidad, la acción de fumar, falta de actividad física, dieta no sana y alto nivel de proteína C-reactiva.

La invención proporciona métodos, composiciones farmacéuticas y equipos para tatar un animal en necesidad del mismo. Un animal está "en necesidad de" tratamiento de acuerdo con la invención si el animal actualmente tiene una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular, exhibe signos tempranos de tal enfermedad o condición, tiene una predisposición a desarrollar tal enfermedad o condición, o está siendo tratado con un fármaco u otro tratamiento que causa hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario. De preferencia, el animal es un mamífero, tal como un conejo, cabra, perro, gato, caballo o humano. Más de preferencia, el animal es un humano.

Como se utiliza aquí, "un compuesto de danazol" significa danazol, profármacos de danazol y sales farmacéuticamente aceptables de danazol y sus profármacos.

Danazol ( 17a-pregna-2, 4-dien-20-ino [2 , 3-d] -isoxazol-17p-ol) es una hormona esteroide sintética conocida. Su estructura es : Métodos para hacer danazol son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 3,135,743, y la patente Británica No. 905,844. También, el danazol está disponible comercialmente de muchas fuentes, incluyendo Barr Pharmaceuticals, Inc., Lannett Co., Inc., sanofi-aventis Canadá, Sigma- Aldrich, and Parchem Trading Ltd.

"Profármaco" significa cualquier compuesto que libera un fármaco de origen activo (danazol en este caso) in vivo cuando tal profármaco se administra a un animal. Los profármacos de danazol incluyen danazol en donde el grupo hidroxilo se une a cualquier grupo que puede ser segmentado in vo para generar hidroxilo libre. Ejemplos de profármaco de danazol incluyen ésteres (por ejemplo, derivados de acetato, formiato y benzoato) de danazol.

Las sales farmacéuticamente aceptables de danazol y sus profármacos incluyen sales no tóxicas convencionales, tales como sales derivadas de ácidos inorgánicos (tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico y los similares) , ácidos orgánicos (tales como ácido acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, glutámico, aspártico, benzoico, salicílico, oxálico, ascórbico y los similares) o bases (tales como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión de metal farmacéuticamente aceptable o cationes orgánicos derivados de N, N-dibenciletilendiamina, D-glucosamina, o etilendiamina) . las sales se preparan de una manera convencional, por ejemplo, al neutralizar la forma de base libre de compuesto con un ácido. En particular, isoxazoles, tal como danazol, son sustancias débilmente básicas y forman sales de adición de ácido en la adición de ácidos fuertes y sales de amonio cuaternarias en la adición de ésteres de ácidos fuertes (por ejemplo, un éster de un ácido sulfónico inorgánico u orgánico fuerte, de preferencia un éster alquílico inferior, alquenílico inferior o aralquílico inferior, tal como yoduro de metilo, yoduro de etilo, bromuro de etilo, bromuro de propilo, bromuro de butilo, bromuro de alilo, sulfato de metilo, bencensulfonato de metilo, p-toluen-sulfonato de metilo, cloruro de bencilo y los similares). Ver la patente norteamericana No. 3,135,743.

Como es mencionado en lo anterior, un compuesto de danazol se puede utilizar para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular y para inhibir la ' hiperpermeabilidad vascular causada como un efecto secundario de un tratamiento o administración de un fármaco. Al hacerlo de esta manera, el compuesto de danazol se administra a un animal en necesidad del tratamiento.

Formas de dosificación efectivas, modos de administración y cantidades de dosificación para el compuesto de danazol se pueden determinar empíricamente utilizando la guía proporcionada en la presente. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que la cantidad de dosificación variará con la enfermedad o condición particular que es tratada, la severidad de la enfermedad o condición, la ruta(s) de administración, la duración del- tratamiento, la identidad de cualquiera de otros fármacos que son administrados al animal, la edad, tamaño y especie del animal. Y factores similares conocidos en las técnicas médicas y veterinarias. En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de danazol de la presente invención será aquella cantidad del compuesto de danazol que es la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Sin embargo, la dosificación diaria será determinada por un médico o veterinario asistente dentro del alcance de juicio médico. Si es deseado, la dosis diaria efectiva se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis, administrada separadamente en intervalos apropiados por todo el día. La administración del compuesto de danazol debe ser continua hasta que se logre una respuesta aceptable.

Los compuestos de danazol se han reportado previamente que inhiben la angiogénesis . Ver la solicitud de PCT WO 2007/009087. De manera sorprendente y muy inesperadamente, se ha encontrado que los compuestos de danazol se pueden utilizar en la práctica de la presente invención en dosis óptimas que son aproximadamente 100-1000 veces menores que aquellas previamente reportadas para inhibir la angiogénesis y sustancialmente menores que aquellas cantidades actualmente administradas a pacientes para el tratamiento de otras enfermedades y condiciones (típicamente 200-800 mg/día para un adulto humano) Usos de estas dosis inferiores de compuestos de danazol deben evitar cualquiera de los efectos secundarios significantes, quizás todos los efectos secundarios, que serán especialmente ventajosos para el tratamiento temprano o profiláctico de enfermedades y condiciones de acuerdo con la presente invención .

En- particular, una cantidad de dosificación efectiva de un compuesto de danazol para inhibir la hiperpermeabilidad vascular será de 0.1 ng/kg/día a 35 mg/kg/día, de preferencia de 40 ng/kg/día a 5.0 mg/kg/dia, mucho más de preferencia 100 ng/kg/dia a 1.5 mg/kg/dia. Una cantidad de dosificación efectiva puede ser aquella cantidad que dará por resultado una concentración en un fluido relevante (por ejemplo, sangre) de 0.0001 µ? a 5 µ , de preferencia de 0.1 µ? a 1.0 µ?, más de preferencia de 0.1 µ? a 0.5 µ?, mucho más de preferencia aproximadamente 0.1 µ?. Una cantidad de dosificación efectiva también será aquella cantidad que dará por resultado una concentración en el tejido u órgano que es tratado de aproximadamente 0.17% (peso/peso) o menos, de preferencia de 0.00034% a 0.17%, mucho más de preferencia 0.0034% a 0.017%. Cuando se da tópicamente o localmente, el compuesto de danazol de preferencia será administrado en una concentración de- 0.?001 µ? a 5 µ?, de preferencia de 0.1 µ? a 1.0 µ?, más de preferencia de 0.1 µ? a 0.5 µ?, mucho más de preferencia aproximadamente 0.1 µ , o una concentración de aproximadamente 0.17% (peso/peso) o menos, de preferencia de 0.00034% a 0.17%, mucho más de preferencia 0.0034% a 0.017%. Cuando se da oralmente a un humano adulto, la dosis de preferencia será de aproximadamente 1 ng/dia a aproximadamente 100 mg/dia, más de preferencia la dosis será de aproximadamente 1 mg/dia a aproximadamente 100 mg/dia, mucho más de preferencia la dosis será de aproximadamente 10 mg/dia a aproximadamente 90 mg/dia, de preferencia será en dos dosis iguales por día. Además, el danazol se espera que se acumule en las células y tejidos, de modo que una dosis inicial (carga) (por ejemplo 100 mg por día) puede ser reducida después de un periodo de tiempo (por ejemplo, 2-4 semanas) a una dosis de mantenimiento inferior (por ejemplo 1 mg por día) que se puede dar indefinidamente sin efectos secundarios significantes, quizás sin ninguno de los efectos secundarios .

El compuesto de danazol se administra en combinación con uno o más de segundos fármacos adecuados para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular. Por ejemplo, el compuesto de danazol se puede administrar antes de, en conjunción con (incluyendo simultáneamente con) , o después del segundo fármaco (s). El segundo fármaco (s) y el compuesto de danazol se pueden administrar en composiciones farmacéuticas separadas como parte de la misma composición farmacéutica. El segundo fármaco puede ser uno que también inhibe la hiperpermeabilidad vascular, uno que inhibe o trata otro proceso o síntoma de enfermedad de la enfermedad o condición, o uno que hace1 ambos.

Las formas de dosificación efectivas, modos de administración y cantidades de dosificación para los segundos fármacos son bien conocidas y se pueden determinar empíricamente. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que la cantidad de dosificación variará con la enfermedad o condición particular que es tratada, la severidad de la enfermedad o condición, la ruta(s) de administración, la duración del tratamiento, la identidad de cualquier de otros fármacos que son administrados al animal, la edad, tamaño y especie del animal, y factores similares conocidos en la técnicas médicas y veterinarias. En general, una dosis diaria adecuada de un segundo fármaco será aquella cantidad del compuesto que la dosis más baja para producir un efecto terapéutico. Sin embargo, la dosificación diaria será determinada por un médico veterinario asistente dentro del alcance del buen juicio médico. Si es deseado, la dosis diaria efectiva se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis, administradas separadamente en intervalos apropiados por todo el dia. La administración del segundo fármaco debe ser continua hasta que se logre una' respuesta aceptable.

En una modalidad, el segundo fármaco puede ser un compuesto que inhibe la hiperpermeabilidad vascular. Compuestos adecuados incluyen metilnaltrexona y naloxona (ver Singleton y colaboradores, Am J. Respir. Cell Mol. Biol, 37:222-231 (2007), derivados de fumagilol (ver la solicitud de PCT No. WO 2009/036108), antagonistas de angiopoyetina-2 (ver la solicitud de PCT No. WO 2007/033216), inhibidores de anhidrasa carbónica (ver la solicitud de PCT No. WO 2006/091459) , agentes neuroprotectores (por ejemplo, cannabidiol; ver Antonetti y colaboradores, "Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy," pages 333-352, in Diabetic Retinopathy (Elia J. Duh, ed., Humana Press, 2008)), A6 (inhibidor de uroquinasa; Angstrom Pharmaceuticals ) , y otros descritos enseguida.

En otra modalidad, el segundo fármaco puede ser un compuesto que inhibe el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) por ejemplo, al inhibir la función de VEGF, inhibir la función del receptor de VEGF, reducir la producción de VEGF, etc., puesto que VEGF es un inductor de permeabilidad vascular en muchas enfermedades y condiciones. Los compuestos adecuados incluyen cualquier molécula orgánica e inorgánica, incluyendo ácidos nucleicos modificados y no modificados, tales como ácidos nucleicos de antisentido, agentes RNAi tal como siRNA o shRNA, péptidos, peptidomiméticos, receptores, ligandos y anticuerpos. Los compuestos específicos adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, inhibidores de COX-2 (por ejemplo/ celecoxib) , inhibidores de receptor de Tie2, inhibidores de angiopoyetina, inhibidores de neuropilina, factor derivado de epitelio de pigmento, endostatina, angiostatina , análogos de somatastatina (por ejemplo, octreotide) , haptámeros inhibidores de VEGF (por ejemplo, pegaptanib (Macugen, Pfizer/Gilead/Eyetech) ) , anticuerpos . o fragmentos de los mismos (por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF, tal como bevacizumab (Avastin, Genentech, o fragmentos del mismo, tal como ranibizumab (Lucentis, Genentech) ) , cetuximab (Erbitux, Imclone, Bristol-Myers Squibb) , tirosina quinasa 1 similar a fms soluble (sFltl) polipéptidos o polinucleótidos, aflibercept o VEGF trap (Regeneron/Aventis) , CP-547,632 (clorhidrato de amida 3- ( -bromo-2 , 6-difluoro-benciloxi ) -5-[3- (4-pirrolidin-l-il-butil) -ureido] -isotiazol-4-carboxilico; Pfizer), AG13736, AG28262, SU5416, SU11248 y SU6668 (primero disponible de Sugen, ahora Pfizer), ZD-6474 y ZD-4190 (AstraZeneca) , CEP-7055 (Cephalon, Inc.), PKC 412 (Novartis), AEE788 (Novartis), AZD-2171, sorafenib (Nexavar®, BAY 43-9006, Bayer Pharmaceuticals y Onyx Pharmaceuticals ) , vatalanib (también conocido como PTK-787, ZK-222584; Novartis & Schering AG) , IM862 (glufanida disodio, Cytran Inc.), DC101 (anticuerpo monoclonal selectivo de VEGFR2; ImClone Systems, Inc.), angiozima (una ribozima sintética de Ribozyme y Chiron) , Sirna-027 (un inhibidor de VEGFR1 basado en siRNA, Sirna Therapeutics) , Neovastat (Aeterna Zentaris, Inc.), talidomida, dopamina, iressa, AV-951 (AVEO Pharmaceuticals) , y AGA-1470 (un análogo sintético de fumagilina, A.G. Scientific) . Ver solicitudes de PCT WO 2006/091459 y WO 2009/036108, Do y colaboradores, "Anti-VEGF Therapy as an Emerging Treatment for Diabetic Retinopathy, " pages 401-422, in Diabetic Retinopathy (Elia J. Duh, ed., Humana Press, 2008), and Bhattacharya y colaboradores, J. Mol. Signaling, 3:14 (2008). Se prefieren aquellos compuestos que se pueden administrar oralmente, incluyendo sunitinib (SU11248), sorafenib (BAY 43-9006), vandetanib (ZD6474), CEP7055, AV- 951, recentín (AZD2171) , talidomida y dopamina. También se prefiere pegaptanib, bevacizumab (Avastin) y ranibizumab (Lucentis) para inyección intra vitrea.

Otro inductor de PCT hiperpermeabilidad vascular en muchas enfermedades y condiciones es histamina. Por consiguiente, el compuesto danazol también se puede administrar en combinación con una antihistamina . Las antihistaminas son bien conocidas y de manera fácil comercialmente disponibles. Las antihistaminas incluyen loratadine (Claritin) , cetrizina (Zyrtec), fexofenadina ¦ (Allegra) y difenhidramina (Benadryl) .

Algunas de las enfermedades y condiciones que son mediadas por hiperpermeabilidad vascular también pueden involucrar angiogénesis en etapas avanzadas de las enfermedades y condiciones. Por consiguiente, en todavía otra modalidad de la invención, un fármaco que inhibe la angiogénesis se administra además del compuesto de danazol. Los fármacos adecuados para inhibir la angiogénesis incluyen aquellos compuestos que inhiben VEGF que son listados en lo anterior, puesto que VEGF también puede inducir angiogénesis bajo condiciones adecuadas. Los inhibidores de otros factores involucrados en angiogénesis (incluyendo hormona de crecimiento (GH) , factor de crecimiento similar a insulina (IGF), factor de crecimiento de fibroblasto, angiopoyetinas , eritropoyetina, factor de crecimiento de hepatocito, factor de necrosis tumoral, proteasa de serina extracelular y metaloproteasas de matriz, y factor de crecimiento placental) también se pueden utilizar. Tales inhibidores incluyen antagonistas de angiopoyetina-2 (ver la solicitud de PCT No. WO 2007/033216) . Tales inhibidores también incluyen análogos de somatostatina (por ejemplo, octreotide; inhibidores del eje GH-IGF) , antagonistas de Tie-2 (por ejemplo, muTek delta Fe), A6 (inhibidor de uroquinasa; Angstrom Pharmaceuticals ) , factor de crecimiento derivado de epitelio de pigmento, Serpina (inhibidor de protease de serina) , angiostatina, endostatina, trombospondina-1 , inhibidor' de tejido de metaloproteasas de matriz (ver Das y colaboradores, "Beyond VEGF - Other Factors Important in Retinal Neovascularization, " pages 375-398, in Diabetic Retinopathy (Elia J. Duh, ' ed. , Humana Press, 2008)). Compuestos antiiogénicos adecuados adicionales, también incluyen TNP-470, caplostatina y lodamin (todos derivados de fumigilol, SynDevRx, Inc.), taxol, herceptina (Genentech) , carboxiamidotriazol (CAI), IM862 (Cytran, . Inc.), trombospondinas y análogos de trombospondinas (por ejemplo, ABT-510; Abbott Laboratories), etaracizumab (Vitaxin, edlmmune) , E D 121974 (cilengitide, Merck & Co.), trilostano y derivados de trilostano descritos en la solicitud de PCT O 2007/009087, los péptidos que enlazan metal descritos en la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 20030130185 y los derivados de metilfenidato descritos en la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 20060189655, las descripciones de todas las tres de las cuales se incorporan en la presente por referencia.

En otra modalidad, el segundo fármaco puede ser un compuesto que inhibe la proteina quinasa C (P C). Inhibidores de PKC adecuados incluyen PKC412 (N-benzoil estaurosporina; Fementek Biotechnology, LC Laboartories y otros) , benfotiamina, y LY333531 ( ruboxistaurina o RBX) . Ver Sun y colaboradores, "Clinical Triáis in Protein Kinase C-ß Inhibition in Diabetic Retinopathy, " pages 423-434, in Diabetic Retinopathy (Elia J. Duh, ed. , Humana Press, 2008), Se prefiere benfotiamina (un derivado sintético soluble en lipido de vitamina Bl, disponible de muchas fuentes) y RBX (Eli Lilly) . RBX se puede administrar oralmente y se ha mostrado que inhibe la permeabilidad vascular y angiogénesis . · Algunas de las enfermedades y condiciones que son mediadas por hiperpermeabilidad vascular también involucran inflamación. Por consiguiente, en todavía otra modalidad de la invención, un fármaco anti-inflamatorio se administra además del compuesto de danazol. Los fármacos anti-inflamatorios adecuados incluyen esteroides antiinflamatorios y fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDs) . Los esteroides anti-inflamatorios adecuados incluyen corticoesteroides (por ejemplo, cortisona, prednisona, prednisolona, metilpredinisolona, dexametasona, betametasona, e hidrocortisona ) y triamcinolona acetonide. Esteroides antiinflamatorios son bien conocidos y de manera fácil comercialmente disponibles. Se prefiere triamcinolona acetonide intravitrea, disponible de Apothecon, Allergan y Alcon. Los NSAIDs adecuados también son bien conocidos y de manera fácil comercialmente disponibles. Tales NSAIDs incluyen inhibidores de COX-1, inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib (Celebrex) ) , ibuprofeno (por ejemplo, Advil y Motrin) , acetaminofen (por ejemplo, Tylenol), indometacina, naproxeno (por ejemplo, Aleve), glicina y salicilatos (por ejemplo, ácido acetilsalicilico o aspirina). Los NSAIDs adicionales incluyen ImSAIDs (peptides antiinflamatorios que alteran la activación y migración de células inflamatorias; disponibles de Immulon BioTherapeutics) . Los NSAIDs preferidos son glicina y aspirina .

SIP (esfingosina-1 fosfato) desempeña una función muy importante en la formación y mantenimiento de endotelio vascular. El agotamiento de SIP conduce a una fuga vascular y edema, y SIP puede revertir la disfunción endotelial y restaurar la función de barrera. Por consiguiente, el segundo fármaco utilizado en combinación con danazol puede ser un fármaco que incrementa los niveles de S1P. Tales fármacos incluyen S1P y agonistas de S1P. Los agonistas de S1P incluyen FTY720 (2-amino-2- (4-octilfenetil) propano-1 , 3-diol ; fingolimod; Novartis) , CYM-5442 (2- (4- (5- (3, -dietoxifenil ) -1, 2, 4-oxadiazol-3-il ) -2, 3-dihidro-lH-inden-l-il amino) etanol) y SEW2871 ( 5- [ 4-fenil-5- ( trifluorometil ) -2-tienil ] -3-[3- (trifluorometil) fenil ] -1 , 2 , 4 , -oxadizol ) .

Glicocáliz recubre la superficie luminal de los endotelios continuos y fenestrados y contribuye a la permeabilidad selectiva de estos endotelios al restringir el pasaje de albúmina. Las enzimas que degradan el glicocáliz (por ejemplo, heparanasa) son reguladas hacia arriba en ciertos estados de enfermedad proteinúricos (incluyendo diabetes temprana) , hipertensión y enfermedades del riñon diabéticas y no diabéticas (por ejemplo, nefritis, síndrome nefrótico y nefropatía) . Por consiguiente, el segundo fármaco utilizado en combinación con el compuesto de danazol puede ser un fármaco que inhibe las enzimas que degradan glicocáliz. Tales fármacos incluyen heparinas de bajo peso molecular (por ejemplo, sulfodexide (disponible de, por ejemplo, PharmGKB) .

.El fármaco utilizado en combinación con el compuesto de danazol también puede ser un fármaco que se utiliza para el tratamiento estándar de la enfermedad o condición. Por ejemplo, los tratamientos estándares para diabetes incluyen fármacos que disminuye el nivel de glucosa (típicamente medido en la sangre del paciente) . Muchos de tales fármacos de disminución de glucosa son bien conocidos y de manera fácil comercialmente disponibles. Tales fármacos incluyen insulina, análogos de insulina, biguanidas (por ejemplo, fenformina, metformina y buformina) , sulfonamidas (por ejemplo, glibenclamida, cloropropamida, tolbutamida, glibornurida, tolazamida, carbutamida, glipizida, gliquidona, gliclazida, metahexamida, glisoxepida, glimepirida y acetohexamida ) , inhibidores de alfa glicosidasa (por ejemplo, acarbosa, miglitol y voglibosa) , tiazolidindionas (por ejemplo, troglitazona, rosiglitazona y proglitazona) , inhibidores de dipeptidil peptidasa (por ejemplo, silagliptina y vildagliptina) y otros (por ejemplo, goma de guar, repaglinida, nateglinida, exenatida, pramlintida, benfluorex y liraglutida) .

El fármaco utilizado en combinación con el compuesto de danazol puede ser un antioxidante. Los antioxidantes adecuados son bien conocidos y de manera fácil comercialmente disponibles. Tales fármacos incluyen cisteína, glutationa, vitamina E, vitamina C, vitamina B2, luteína, licopeno, coe.nzima Q10, tumeric, resveratrol, y benfotiamina (ver lo anterior) . Otros antioxidantes adecuados incluyen aquellos péptidos y derivados de péptido divulgados en las patentes norteamericanas Nos. 7,529,304 y 7,632,803, las descripciones completas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia.

Un signo temprano y factor de riesgo para ateroesclerosis es alto colesterol, y alto colesterol es frecuentemente tratado con astatinas. Astatinas adecuadas son bien conocidas y de manera fácil comercialmente disponible. Ellas incluyen atorvastatina (Lipitor) , fluvastatina (Lescol), lovastatina (Mevacor) , pravastatina (Pravachol) , simvastatina, (Zocor) y rosuvastatin (Crestor) . Las estativas también pueden reducir el tamaño de placas, estabilizar las placas, reducir la inflamación, reducir los niveles de proteina C reactiva y disminuir la formación de coágulos sanguíneos.

La hipertensión frecuentemente se trata con una enzima que convierte angiotensina (ACE) o en antagonista de receptor de ACE para disminuir la presión sanguínea. Los inhibidores de ACE adecuados y antagonistas de receptor de ACE son bien conocidos y de manera fácil comercialmente disponibles. Los inhibidores de ACE adecuados incluyen Capoten (captopril), Prinivil y Zestril (lisinopril) , Vasotec (enalapril) , Lotensin (benazepril) , Altace (ramipril) , Accupril (quinapril), Monopril (fosinopril) , Mavik (trandolapril) , Aceon (perindopril ) , agonistas de S1P (por ejemplo, FTY720 (fingolimod) de Novartis), y Univasc (moexipril) . Se prefiere lisinopril o enalapril. Los antagonistas de receptor de ACE adecuados incluyen losartan, irbesartan, olmesartan, candesartan, valsarían y telmisartan. Aunque han existido reportes en el pasado e que estos fármacos pueden ser capaces de reducir y controlar las ¦ complicaciones de diabetes, incluyendo nefropatia diabética y retinopatia diabética, recientemente se ha reportado que no son efectivos para este propósito (ver Mehlsen y colaboradores, Acta Ophthalmol . , epub on March 19, 2010. PMID 20346089) .

La invención también proporciona un método para inhibir la hiperpermeabilidad vascular en un animal que es un efecto secundario causado por el tratamiento o fármaco administrado al animal. Los fármacos que causan hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario son bien conocidos e incluyen bapineuzumab ( yeth, Elan) , bloqueadores del canal de calcio (por ejemplo, Norvasc, Caduet, Lotrel, Exforge, Cardizem, Dilacor, Taztia, Tiazac, Lexxel, Plendil, DynaCirc, Cardene, Adalat, Procardia, Sular, Calan, Isoptin SR) , clopidogrel (por ejemplo, Plavix) , dutasterida (por ejemplo, Avodart), antagonistas de endotelina (por ejemplo, avosentan y bosentan) , estrógenos, fingolimod (Gilenia) , hormona de crecimiento humana, ibuprofen, interferonas (por ejemplo, Betaseron) , morfina, natalizumab (Tysabri) , agonistas de S1P (por ejemplo, altas dosis de FTY720 (fingolimod) de Novartis causan edema macular) y tiazolidindionas (por ejemplo, Actos y Avandia) . Los tratamientos que causan hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario incluyen la radiación.

Las formas de dosificaciones efectivas, modos de administración y cantidades de dosificación para fármacos que causan hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario son bien conocidas y/o se pueden determinar empíricamente. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que la cantidad de dosificación variará con la enfermedad o condición particular que es tratada, la severidad de la enfermedad o condición, la ruta(s) de administración, la dirección del tratamiento, la identidad de cualquier otro fármaco que son administrados al animal, la edad, tamaño y especie del animal, y factores similares conocidos en las técnicas médicas y veterinarias. En general, una dosis diaria adecuada de un fármaco que causa hiperpermeabilidad vascular será aquella cantidad del compuesto que la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Sin embargo, la dosificación diaria será determinada por un médico veterinario asistente dentro del alcance del buen juicio médico. Si es deseado, la dosis diaria efectiva se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis, administrada separadamente en intervalos apropiados por todo el día. La administración del fármaco debe ser continua hasta que se logre una respuesta aceptable.

Un compuesto de danazol se puede administrar en combinación con uno de estos tratamientos o fármacos para inhibir el efecto secundario de hiperpermeabilidad vascular. Por ejemplo, el compuesto de danazol se puede administrar antes de, en conjunción con (incluyendo simultáneamente con) , o después del fármaco (s) y/o el tratamiento ( s ) que causa el efecto secundario de hiperpermeabilidad vascular. El fármaco (s) que causa el efecto secundario de hiperpermeabilidad vascular y el compuesto de danazol se puede administrar en composiciones farmacéuticas separadas o como parte de la misma composición farmacéutica.

La invención también proporciona un método para modular el citoesqueleto de células endoteliales en un animal. En esta modalidad de la invención está basada en el descubrimiento de que el danazol inhibe la formación de fibra de esfuerzo de F-actina, causa la formación de anillos de actina corticales, aumenta y prolonga la formación de anillos de actina corticales mediante esfingosina-1 fosfato (S1P) , inhibe RhoA, incrementa la fosforilación de VE-cadherin, aparece para activar las GTPasas y estabilizantes de barrera y aparece para estabilizar microtúbulos . La modulación del citoesqueleto puede reducir la hiperpermeabilidad vascular e incrementar hiperpermeabilidad vascular (es decir, permeabilidad bajo los niveles básales) , para de esta manera regresar el endotelio a homeostasis. Por consiguiente, esas enfermedades y condiciones mediadas por hiperpermeabilidad vascular se pueden tratar (ver lo anterior) y esas enfermedades y condiciones mediadas por hiperpermeabilidad vascular también se pueden tratar. El último tipo de enfermedades y condiciones incluye envejecimiento de hígado, aterogénesis , ateroesclerosis , cirrosis, fibrosis del hígado, falla del hígado y cánceres de hígado primarios y metastáticos .

El método para modular el citoesqueleto de células endoteliales comprende administrar al animal una cantidad de un compuesto de danazol y de un segundo fármaco efectiva para modular el citoesqueleto. "Compuesto de danazol" y "animal" tiene el mismo significado como se expusiera en lo anterior.

Las formas de dosificación efectivas, modos de administración y cantidades de dosificación para un compuesto de danazol para modular el citoesqueleto se pueden determinar empíricamente utilizando la guía proporcionada en la presente. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que la cantidad de dosificación variará con la enfermedad o condición particular que es tratada, la severidad de la enfermedad o condición, la ruta(s) de administración, la duración del tratamiento, la identidad de cualquier otros fármacos que son administrados al animal, la edad, tamaño y especies del animal y factores similares conocidos en las técnicas médicas y veterinarias. En general, una dosis diaria de un compuesto de la presente invención será aquella cantidad el compuesto que es la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Sin embargo, la dosificación diaria será determinada por un médico veterinario .asistente dentro del alcance del buen juicio médico. Si es deseado, la dosis diaria efectiva se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis, administradas separadamente en intervalos apropiados por todo el día. La administración del compuesto debe ser continua hasta que se logre una respuesta aceptable.

En particular, una cantidad de dosificación efectiva de un compuesto de danazol para modular el citoesqueleto de las células 'endoteliales será de 0.1 ng/kg/dia a 35 mg/kg/dia, de preferencia de 40 ng/kg/dia a 5.0 mg/kg/dia, mucho más de preferencia de 100 ng/kg/dia a 1.5 mg/kg/dia. Una cantidad de dosificación efectiva también será aquella cantidad que dará por resultado una concentración en un fluido relevante (por ejemplo, sangre) de 0.0001 µ? a 5 µ?, de preferencia de 0.1 µ? a 1.0 µ , más de preferencia de 0.1 µ? a 0.5 µ?, mucho más de preferencia aproximadamente 0.1 µ?. Una cantidad de dosificación efectiva también será aquella cantidad que dará por resultado una concentración en el tejido u órgano que es tratado será de aproximadamente 0.17% (peso/peso) o menos, de preferencia de 0.00034% a 0.17%, más de preferencia 0.0034% a 0.017%. Cuando se da tópicamente o localmente, el compuesto de danazol de preferencia será administrado en una concentración de 0.0001 µ? a 5 µ?, de preferencia de 0.1 µ? a 1.0 µ?, más de preferencia de 0.1 µ? a 0.5 µ , mucho más de preferencia aproximadamente 0.1 µ?, o en una concentración de aproximadamente 0.17% (peso/peso) o menos, de preferencia de 0.00034% a 0.17%, mucho más de preferencia 0.0034% a 0.017%. Cuando se da oralmente a un humano adulto, la dosis de preferencia será de aproximadamente 1 ng/dia a aproximadamente 100 mg/dia, más de preferencia la dosis será de aproximadamente 1 mg/dia a aproximadamente 100 mg/dia, más de preferencia la dosis será de aproximadamente 10 mg/dia a aproximadamente 90 mg/dia, de preferencia dada en dos dosis iguales por día. Además, el danazol se espera que se acumule en las células y tejidos, de modo que una dosis inicial (carga) (por ejemplo 100 mg por día) se puede reducir después de un periodo de tiempo (por ejemplo, 2-4 semanas) a una dosis de mantenimiento inferior (por ejemplo 1 mg por día) que se puede dar indefinidamente sin efectos secundarios significantes, quizás en ninguno de los efectos secundarios.

El compuesto de danazol se administra en combinación con uno o más de segundos fármacos adecuados para modular el citoesqueleto de células endoteliales . Por ejemplo, el compuesto de danazol se puede administrar antes de, en conjunción con (incluyendo simultáneamente con) o después del segundo fármaco (s). El segundo fármaco (s) y el compuesto de danazol se puede administrar en composiciones farmacéuticas separadas o como parte de la misma composición farmacéutica .

Las formas de dosificaciones efectivas, modos de administración y cantidades de dosificación para los segundos fármacos son bien conocidas y/o se pueden determinar empíricamente. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que la cantidad de dosificación variará con la enfermedad o condición particular que es tratada, la severidad de la enfermedad o condición, la ruta(s) de administración, la duración del tratamiento, la identidad de cualquier otros fármacos que son administrados al animal, la edad, tamaño y especie del animal, y factores similares conocidos en las técnicas médicas y veterinarias. En general, una dosis diaria adecuada de un segundo fármaco será aquella cantidad del compuesto que es la dosis más baja efectiva para .producir un efecto terapéutico. Sin embargo, la dosificación diaria será determinada por un médico veterinario asistente dentro del alcance del buen juicio médico. Si es deseado, la dosis diaria efectiva se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis, administrada separadamente en intervalos apropiados por todo el día. La administración del segundo fármaco debe ser continua hasta que se logre una respuesta aceptable.

El segundo fármaco que es un compuesto que modula el citoesqueleto de células endoteliales. Tales fármacos incluyen inhibidores de Rho e inhibidores de Src quinasa. Los inhibidores de Rho incluyen estatinas (ver lo anterior) , de preferencia sinvastatina (disponible de, por ejemplo, Merck & Co.), C3 transferasa de exoenzima (disponible de Cytoskeleton, Inc., Denver, Colorado; producto CT04), ALSE-100 (Alseres Pharmaceuticals) . Los inhibidores de Src quinasa incluyen PP2 (Calbiochem/EMD Biosciences, San Diego, CA) , AP23846 (una purina 2, 6, 9-trisubstituida ; University of Texas), dasatinib (Sprycel, Bristol-Myers Squibb) y AZD0530 (Saracatinib; Astra Ceneca Oncology) . Otros fármacos adecuados incluyen aquellos que estabilizar microtúbulos, tales como taxanos (por ejemplo, paclitaxel (Bristol-Myers Squibb) , docetaxel (sanofi aventis) , abraxano (Abraxis Oncology) y carbazitaxel (sanofi aventis)).

Los compuestos de la presente invención (es decir, un compuesto de danazol, un segundo fármaco para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular, un fármaco que causa hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario, o un fármaco que modula el citoesqueleto de células endoteliales) se puede administrar a un paciente animal para terapia mediante cualquier ruta adecuada de administración, incluyendo oralmente, nasalmente, parenteralmente (por ejemplo, intravenosamente, intraperitonealmente, subcutáneamente o intramuscularmente) , transdérmicamente, intraocularmente y tópicamente (incluyendo bucalmente y sublingualmente) . En general se prefiere la administración oral para cualquier enfermedad o condición tratable de acuerdo con la invención. Las rutas preferidas de administración para el tratamiento de enfermedades y condiciones del ojo son oralmente, intraocularmente y tópicamente. Mucho más preferido es oralmente. Las rutas preferidas de administración para el tratamiento de enfermedades y condiciones del cerebro son oralmente y parenteralmente. Mucho más preferido es oralmente.

Mientras que es posible para un compuesto de la presente invención (es decir, un compuesto de danazol, un segundo fármaco para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular, un fármaco que causa hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario, o un fármaco que modula el citoesqueleto de células endoteliales ) que sea administrado solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición) . Las composiciones farmacéuticas de la invención comprende un compuesto o compuestos de la invención (es decir, compuesto de danazol, un segundo fármaco para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular, un fármaco que causa hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario, o un fármaco que modula el citoesqueleto de células endoteliales ) como un ingrediente activo en mezcla con uno más portadores farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, con uno .o más de otros compuestos, fármacos u otros materiales. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales al animal. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Sin considerar la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención se formulan en forma de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos para aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences .

Las formulaciones de la invención adecuados para administración oral puede estar en la forma de cápsulas, saquitos, pildoras, tabletas, polvos, gránulos o una solución o una suspensión en un liquido acuosa o no acuosa, o una emulsión de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (utilizando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y los similares, cada una que contiene una cantidad determinada de un compuesto o compuestos de la presente invención como un ingrediente activo. Un compuesto o compuestos de la presente invención como el ingrediente activo. Un compuesto o compuestos de la presente invención también se pueden administrar como bolo, electuario o pasta.

En formas de dosificación sólidas de la invención para administración oral (cápsulas, tabletas, pildoras, grageas, polvos, gránulos y los similares) , el ingrediente activo (es decir, un compuesto de danazol, un segundo fármaco para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular, o un fármaco que causa hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario) se mezcla con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera dé lo siguiente: (1) rellenadores o diluidores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; (2) aglutinantes, tal como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, tal como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tal como 'agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de solución, tal como parafina; (6) aceleradores de absorción, tal como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tal como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tal como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio, y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes de regulación. Las composiciones sólidas de un tipo similar se pueden emplear como rellenadores en cápsulas de gelatina rellenadas blandas y duras utilizando tales excipientes como lactosa o azúcares de leche, asi como polietilenglicoles de alto peso molecular y los similares.

Una tableta se puede hacer mediante compresión o moldeo opcionalmente con uno o más ingredientes adicionales. Las tabletas comprimidas se pueden preparar utilizando aglutinantes (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetil celulolsa) , lubricante, diluyente inerte, conservador, desintegrante (por ejemplo, almidón glicolato de sodio o carboximetil celulosa de sodio reticular) , agente tensoactivo o dispersante. Las tabletas moldeadas se pueden hacer al moldear en ' una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecida con un diluyente liquido inerte.

Las tabletas, y otras formas de dosificación sólidas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, tales como grageas, cápsulas, pildoras y gránulos, opcionalmente se pueden marcar o preparar con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Ellas también se pueden formular para proporcionar liberación lenta o controlada del ingrediente activo en la misma usando, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa en proporciones variantes para proporcionar el perfil de liberación deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas . Ellas se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro retenedor de bacteria. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser una composición que libera el ingrediente activo solamente, o preferencialmente, en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de una manera retardada. Ejemplos de composiciones de incrustación que se pueden utilizar incluyen sustancias poliméricas y ceras. El ingrediente activo también puede estar en forma microencapsulada .

Las formas de dosificación liquidas para administración oral de los compuestos de la invención incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del ingrediente activo, las formas de dosificación liquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en. la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros solventes, agente solubilizantes y emulsificantes, tal como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, de nuez molida, maíz, germen, olivo, ricino y ajojolí), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso de sorbitán, y mezclas de los mismos.

Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes y de suspensión, edulcorantes, saborizantes, colorantes, perfumantes y agentes conservadores.

Las suspensiones, además del ingrediente activo, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isostearílieos etoxilados, polioxietilen sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, gar-agar y tragacanto y mezclas de los mismos.

La invención también proporciona productos farmacéuticos adecuados para el tratamiento del ojo. Tales productos farmacéuticos incluyen composiciones farmacéuticas, dispositivos e implantes '(que pueden ser composiciones o dispositivos) .

Las formulaciones farmacéuticas (composiciones) para inyección intraocular de un compuesto o compuestos de la invención en la bola del ojo incluyen soluciones, emulsiones, suspensiones, partículas, cápsulas, microesferas , liposomas, matrices, etc. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,060,463, la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 2005/0101582, y la solicitud de PCT WO 2004/043480, las descripciones completas de las cuales se incorporan en la presente por referencia. Por ejemplo, una formulación farmacéutica para inyección intraocular puede comprender uno o más compuestos de la invención en combinación con una o más soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas, estériles, farmacéuticamente aceptables, que pueden contener antioxidantes, soluciones reguladoras, agentes de suspensión, agentes de espesamiento o agentes aumentadores de viscosidad (tal como polímero de ácido hialurónico) . Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, solución salina (de preferencia 0.9%), dextrosa en gua (de preferencia 5%), soluciones reguladoras, dimetilsulfóxido, alcoholes y polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y los similares) Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes humectantes y agentes emulsificantes y agentes dispersantes. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede originar por la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como polímeros y gelatina. Las formas de depósito inyectable se pueden hacer al incorporar el fármaco en microcápsulas o microesferas hechas de polímeros biodegradables tales como polilacturo-poliglicoluro . Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli (ortoesteres ) , poli (ácido glicólico) , poli (ácido láctico), policaprolactona y poli (anhídridos) . Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan al atrapar el fármaco en liposomas (compuestos de los ingredientes usuales, tal como dipalmitoil fosfatidilcolina ) o microemulsiones que son compatibles con el tejido del ojo. Dependiendo de la relación del fármaco al polímero o lípido, la naturaleza de los componentes de polímero o lípido particulares, el tipo de liposoma empleado, y si las microcápsulas o microesferas se recubren o no se recubren, la velocidad de liberación de fármaco de las microcápsulas, microesferas y liposomas se puede controlar.

Los compuestos de la invención también se pueden administrar quirúrgicamente como un implante ocular. Por ejemplo, un recipiente de depósito que tiene una pared difusible de alcohol polivinílico o acetato de polivinilo y que contiene un compuesto o compuestos de la invención se puede implantar dentro o sobre la esclera. Como otro ejemplo, un compuesto o compuestos de la invención se puede incorporar en una matriz polimérica hecha de un polímero, tal como policaprolactona, ácido poli (glicólico) , ácido poli (láctico) , poli (anhídrido) o un lípido, tal como ácido sebácido, y se puede implantar sobre la esclera o en el ojo. Es usualmente realizado con el animal que recibe un anestésico tópico o local y utilizando una pequeña incisión hecha detrás de la córnea. La matriz luego se inserta a través de la incisión y se sutura a la esclera.

Los compuestos de la invención también se pueden administrar tópicamente al ojo, y una modalidad preferida de la invención es una composición farmacéutica tópica adecuada para la aplicación al ojo. Las composiciones farmacéuticas tópicas adecuadas para la aplicación al ojo incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, gotas, geles, hidrogeles y ungüentos. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,407, 926 y las solicitudes de PCT WO 2004/058289, WO 01/30337 y WO 01/68053, las descripciones completas de todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia.

Las formulaciones tópicas adecuadas para la aplicación al ojo comprenden uno o más compuestos de la invención en una base acuosa o no acuosa. Las formulaciones tópicas también pueden incluir aumentadores de absorción, aumentadores de permeación, agentes de espesamiento, aumentadores de viscosidad, agentes para ajustar y/o mantener el pH, agentes para ajustar la presión osmótica, conservadores, surfactantes, soluciones reguladoras, sales (de preferencia cloruro de sodio) , agentes de suspensión, agentes dispersantes, agentes solubilizantes, estabilizadores y/o agentes de tonicidad. Las formulaciones tópicas adecuadas para la aplicación al ojo de preferencia comprenderán un aumentador de absorción o permeación para promover la absorción o permeación del compuesto o compuestos de la invención en el ojo y/o un agente de espesamiento o aumentadores de viscosidad que es incapaz de incrementar el tiempo de residencia de un compuesto o compuestos de la invención en el ojo. Ver las solicitudes de PCT WO 2004/058289, WO 01/30337 y WO 01/68053. Los aumentadores de absorción/permeación ejemplares incluyen metil sulfonil metano, solo o en combinación con dimetilsulfóxido, ácidos carboxilicos y surfactantes . Los agentes de espesamiento ejemplares y aumentadores de viscosidad incluyen dextranos, polietilenglicoles, polivinilpirrolidona, geles de polisacárido, Gelrite®, polímeros celulósicos (tales como hidroxipropil metilcelulosa ) , polímeros que contienen carboxilo (tales como polímeros o copolímeros de ácido acrílico) , alcohol polivinílico y ácido hialurónico o una sal del mismo.

Las formas de dosificación (por ejemplo, soluciones, suspensiones, dispersiones y gotas) adecuadas para el tratamiento del ojo se pueden preparar, por ejemplo, mediante disolución, dispersión o suspensión, etc., un compuesto o compuestos de la invención en un vehículo, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol y los similares, para formar una solución, dispersión o suspensión. Si es deseado, la formulación farmacéutica también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes reguladores del pH y los similares, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, trietanolamina sodio acetato, oleato de trietanolamina, etc.

Las soluciones y suspensiones acuosas adecuadas para el tratamiento del ojo pueden incluir, además de un compuesto o compuestos de la invención, conservadores, surfactantes, soluciones reguladoras, sales (de preferencia cloruro de sodio), agentes de tonicidad y agua. Si se utilizan suspensiones, los tamaños de partícula deben ser menores que 10 µ?t? para minimizar la irritación del ojo. Si se utilizan soluciones o suspensiones, la cantidad suministrada al ojo no deben de exceder 50 µ? para evitar el inundamiento excesivo del ojo.

Las suspensiones coloidales adecuadas para el tratamiento del ojo generalmente se forman de micropartículas (es decir, microesferas, nanoesferas, microcápsulas o nanocápsulas , donde la microesferas y nanoesferas son partículas generalmente monolíticas de la matriz polimérica en la cual la formulación es atrapada, adsorbida o de otra manera contenida, mientras que con las microcápsulas la formulación es realmente encapsulada) . El limite superior para el tamaño de estas microparticulas es aproximadamente 5 µ a aproximadamente 10 µ.

Los ungüentos oftálmicos para el tratamiento del ojo incluyen un compuesto o compuestos de la invención en una base apropiada, tal como aceite mineral, lanolina liquida, petrolato blanco, una combinación de dos o todos los tres de los anteriores, o gel de aceite mineral de polietileno. También opcionalmente se puede al incluir un conservador.

Los geles oftálmicos adecuados para el tratamiento del ojo incluyen un compuesto o compuestos de la invención suspendidos en una base hidrofilica, tal como Carpobol-940 o una combinación de etanol, agua y propilenglicol (por ejemplo, en una relación de 40:40:20). Un agente gelificante, tal como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o glicirrizinato amoniatado se utiliza. Opcionalmente se puede incluir un conservador y/o un agente de tonicidad.

Los hidrogeles adecuados para el tratamiento en el ojo se forman mediante la incorporación de un gel formador de gel, hinchable, tal como aquellos listados en lo anterior como agentes de espesamiento o aumentadores de viscosidad, excepto que una formulación referida . en la técnica como un "hidrogel" típicamente una viscosidad más alta que una formulación referida como solución o suspensión "espesada". En contraste a tales hidrogeles preformados con una solución también se pueden preparar para formar un hidrogel in situ después de la aplicación al ojo. Tales geles son líquidos a temperatura ambiente pero gelifican a temperaturas más altas (y así son llamados hidrogeles "termorreversibles") , tal como cuando, se colocan en contacto con fluidos corporales. Los polímeros biocompatibles que imparten esta propiedad incluyen polímeros de ácido acrílico y copolímeros, derivados de N-isopropilacrilamida y copolímeros de bloque ABA de óxido de etileno y óxido de propileno (convencionalmente referidos como "poloxámeros" y disponibles bajo el nombre comercial Pluronic® de BASF- Wayndotte) .

Las dispersiones preferidas son liposomales, caso en el cual la formulación se encierra dentro de liposomas (vesículas microscópicas compuestas de compartimientos acuosos alternantes y bicapas de lípidos) .

Las gotas para ojos se pueden formular con una base acuosa o no acuosa que también comprende uno o más agentes dispersantes, agentes solubilizantes o agentes de suspensión. Las gotas se pueden suministrar por medio de una botella con tapa de goteo para ojo simple o por medio de una botella de plástico adaptada para suministrar contenido líquido gota a gota por medio de una tapa especialmente conformada.

Los compuestos de la invención también se pueden aplicar tópicamente por medio del portador sólido impregnado con fármaco que se inserta en el ojo. La liberación del fármaco se efectúa generalmente mediante la disolución o bioerosión del polímero, osmosis o combinaciones de los mismos. Se pueden utilizar varios sistemas de suministro de tipo matriz. Tales sistemas incluyen lentes de contacto blandos hidrofílicos impregnados o empapados con el compuesto deseado de la invención, así como dispositivos biodegradables o solubles que no necesitan ser removidos después de la colocación en el ojo. Estos insertos oculares solubles pueden estar compuestos de cualquier sustancia degradable y puede ser tolerada por el ojo y que es compatible con el compuesto de la invención que va a ser administrado. Tales sustancias incluyen, pero no están limitadas a, poli (alcohol vinílico) , polímeros y copolímeros de poliacrilamida, etilacrilato y vinilpirrolidona, así como polipéptidos o polisacáridos reticulados, tal como quitina.

Las formas de dosificación para los otros tipos de administración tópica (es decir, no al ojo) o para administración transdérmica de compuestos de la invención incluyen polvos, rocíos, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches, gotas e inhalantes. El ingrediente activo se puede mezclar bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualquiera de las soluciones reguladoras, o propelentes que pueden ser requeridos. Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener, además del ingrediente activo, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco óxido dé zinc, o mezclas de los mismos. Los polvos y rocíos pueden contener, además del ingrediente activo, excipientes tal como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida o mezclas de estas sustancias. Los rocíos adicionalmente pueden contener propelentes usuales tales como clorofluorohidrocarbonos e hidrocarbonos no sustituidos volátiles, tal como butano y propano. Los parches transdérmicos tienen la ventaja agregada de proporcionar suministro controlados de los compuestos de la invención al cuerpo. Tales formas de dosificación se pueden hacer al disolver, dispersar o de otra manera incorporar uno o más compuestos de la invención en un medio apropiado, tal como un material de matriz elastomérica. Los aumentadores de absorción también se pueden utilizar para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad de tal flujo se puede controlar al ya sea proporcionar una membrana controladora de velocidad o al dispersar el compuesto en una matriz polimérica o gel. Un portador sólido impregnado con fármaco (por ejemplo, un aposito) también se puede utilizar para la administración tópica.

Las formulaciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para la administración mediante inhalación o insuflación o para administración nasal. Para la administración al tracto respiratorio superior (nasal) o inferior mediante inhalación, los compuestos de la invención se suministran convenientemente desde un insuflados, nebulizador o paquete presurizado u otro medio conveniente para suministrar un roció en aerosol. Los paquetes presurizados pueden comprender un propelente adecuado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono, u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad o dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad dosificada.

Alternativamente, para la administración mediante inhalación o insuflación, la composición puede tomar la forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla de polvo de uno o más compuestos de la invención y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón. La composición de polvo se puede presentar en forma de dosificación unitaria en, por ejemplo, cápsulas o cartuchos, o, por ejemplo, gelatina o paquetes de ampollas de las cuales el polvo se puede administrar con ayuda de un inhalador, insuflador o inhalador de dosis dosificada.

Para administración intranasal, los compuestos de la invención se pueden administrar por medio de gotas para la nariz o un roció liquido, tal como por medio de un atomizador de botella de plástico o inhalador de dosis dosificada. Los roclos líquidos convenientemente se suministran de paquetes presurizados . Típicos de atomizadores son el Mistometer ( introp) y.Medihaler (Riker) .

Las gotas para la nariz se pueden formular con una base acuosa o no acuosa que también comprende uno o más agentes dispersantes, agentes solubilizantes o agentes de suspensión. Las gotas se pueden suministrar por medio de una botella con tapa de goteo para ojos simple o por medio de una botella de plástico adaptada para suministrar los contenidos líquidos gota a gota por medio de una tapa especialmente conformada .

Las composiciones farmacéuticas de esta invención adecuadas para administraciones parenterales comprenden uno o más compuestos de la invención en combinación con una o más soluciones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles que pueden ser reconstituidos en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes del uso, que pueden contener antioxidantes, soluciones reguladoras, solutos que vuelven la formulación isotónica con la sangre del recipiente propuesto o agentes de suspensión o de espesamiento. También, se pueden utilizar stents recubiertos de fármaco.

Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y los similares) , y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de olivo y ésteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de la partícula requerida en el caso de dispersiones, y mediante el uso de surfactantes.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes dispersantes. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcar, cloruro de sodio, y los similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede originar mediante la inclusión de agente que retardan la absorción tal como monoesterato de aluminio y gelatina .

En algunos casos, con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, es deseable detener la absorción del fármaco de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede realizar mediante el uso de una suspensión liquida de material cristalino o amorfo que tiene pobre solubilidad en el agua. La velocidad de absorción del fármaco entonces depende de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño de cristal y forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un fármaco parenteralmente administrado se realiza al disolver o suspender el fármaco en un vehículo de aceite.

Las formas de depósito inyectables se hacen al formar matrices de microcápsulas del fármaco en polímero biodegradables tales como polilacturo-poliglicoluro . Dependiendo de la relación del fármaco al polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación de fármaco. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli (ortoésteres) y poli (anhídridos) . Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan al atrapar el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal. Los materiales inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro retenedor de bacterias.

Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o de dosis múltiple sellados, por ejemplo ampolletas y frasquitos, y se pueden almacenar en una condición liofilizada que requiere solamente la adición del portador liquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas se pueden preparar de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo descrito en lo anterior.

La invención también proporciona equipos. En una primera modalidad, el equipo comprende por lo menos dos recipientes. Un recipiente comprende un compuesto de danazol. Uno o más recipientes adicionales cada uno comprende uno o más fármacos adecuados para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular (incluyendo aquellos fármacos descritos en lo anterior) . Los recipientes adecuados incluyen frasquitos, botellas, paquetes de ampollas y jeringas. El equipo también contendrá instrucciones para la administración del compuesto de danazol y el uno o más fármacos adecuados para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular. Las instrucciones, por ejemplo, pueden ser impresas en el paquete que sostiene los dos o más recipientes, puede ser impresa en una etiqueta unida al equipo o a los recipientes, o puede ser impresa en una hoja de papel separada que se incluye en o con el equipo. El paquete que contiene los dos recipientes puede ser, por ejemplo, una caja o los dos o más recipientes se pueden mantener conjuntamente, por ejemplo, mediante envoltura de contracción de plástico. El equipo también puede contener otros materiales que son conocidos en la técnica y que pueden ser deseables desde un punto de vista comercial y del usuario .

En una segunda modalidad, el equipo comprende por lo menos dos recipientes. Un recipiente comprende un compuesto de danazol. Uno o más recipientes adicionales cada uno comprende uno o más fármacos que causan hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario (incluyendo aquellos fármacos descritos en lo anterior) . Los recipientes adecuados incluyen frasquitos, botellas, paquetes de ampollas y jeringas. El equipo también contendrá instrucciones para la administración del compuesto de danazol y el uno o más fármacos que causan hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario. Las instrucciones por ejemplo, pueden ser impresas en el paquete que sostiene los dos o más recipientes, puede ser impresa en una etiqueta unida al equipo de los recipientes, o puede ser impresa en una hoja de papel que se incluye en o con el equipo. El paquete que sostiene los dos o más recipientes puede ser, por ejemplo, una caja, o los dos o más recipientes se pueden mantener conjuntamente, por ejemplo, mediante envoltura de contracción de plástico. El equipo también puede contener otros materiales que son conocidos en la técnica y que pueden ser deseables desde un punto de vista comercial y del usuario .

En una tercera modalidad, el equipo comprende por lo menos dos recipientes. Un recipiente comprende un compuesto de danazol. Uno o más recipientes adicionales cada uno comprende uno o más fármacos que modulan el citoesqueleto de células endoteliales (incluyendo aquellos fármacos descritos en lo anterior) . Los recipientes adecuados incluyen frasquitos, botellas, paquetes de ampollas y jeringas. El equipo también contendrá instrucciones para la administración del compuesto de danazol y el uno o más fármacos que modulan el citoesqueleto. Las instrucciones por ejemplo, pueden ser impresas en el paquete que contiene los dos o más recipientes, puede ser impresa en una etiqueta unida al equipo de los recipientes, o puede ser impresa en una hoja de papel separada que se incluye en o con el equipo. El paquete que contiene los dos o más recipientes puede ser, por ejemplo, una caja, o los dos o más recipientes pueden ser mantenidos conjuntamente, por ejemplo, mediante envoltura de contracción de plástico. El equipo también puede contener otros materiales que son conocidos en la técnica y que pueden ser deseables desde un punto de vista comercial y del usuario .

Como se utiliza en · la presente, "uno" o "un" significa uno o más.

Objetivos adicionales, ventajas y características novedosas de la presente invención llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en la técnica en consideración de los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Efectos del Danazol sobre la Angiogénesis (Comparati o) A. Proliferación de Células HUVEC Protocolo Células endoteliales de vena umbilical humana primaria (HUVECs) y el medio de crecimiento EGM-2 se obtuvieron de Cambrex (Walkersville, MD) . Las células se sometieron a pasaje en el medio suplementado con suero de ternero fetal al 2% (FCS) en matraces de cultivo de tejido a 37 °C y C02 al 5%. El subcultivo se realizó utilizando tripsina cuando se obtuvo 60-80% de confluencia como es especificado por el proveedor.

Ampolletas criopreservadas de HUVECs del pasaje 2 se descongelaron y se colocaron en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades a 5,000 células/cm2. Una solución de extracto 50 mM de danazol se preparó en etanol y el FCS en el medio se incrementó a 5% para mantener el danazol en solución. Las células se trataron con el medio que contiene concentraciones finales de danazol que varían de 0.1 a 100 µ? por triplicado. Se realizaron incubaciones de 24, 48, y 72 horas y la proliferación celular se determinó utilizando un ensayo de Proliferación de Célula de una Solución Celltiter 96 AQueous de Promega (Madison, WI) . En breve, el medio se aspiró de cada cavidad y las células se lavaron con solución salina regulada de Hepes 200 µ? (HBSS) de Cambrex calentada a 37°C. 100 µ? de solución celltiter diluida (15 µ? de extracto + 85 µ? de EGM-2 que contiene FCS al 0.1%) se adicionaron a cada cavidad y se incubaron durante 4 horas adicionales. La densidad óptica se determinó mediante el lector de microplaca utilizando un filtro de 530 nm después de la sustracción de la preforma, y los datos se presentaron como OD ± desviación estándar. La concentración final de etanol en las cavidades fue menor que 0.2% y no tuvo efecto sobre la proliferación o viabilidad celular.

Todos los datos se presentan como experimento representativo hecho por triplicado. Las diferencias entre los subconjuntos se analizaron utilizando la prueba t del estudiante en Microsoft Excel. P <0.05 se consideró estadísticamente significante.

Resultados, Observaciones y Discusión: El cultivo de HUVECs primarias en la presencia de danazol disminuyó la OD obtenida del ensayo de proliferación celltiter Promega en un tiempo y el aspecto dependiente de dosis (Figura 1). El ensayo celltiter está basado en la reducción de la solución de ensayo por las enzimas deshidrogenasa a tinte formazan que directamente se correlaciona con el número de células.

El tratamiento de danazol en 24 horas se consideró que es efectivo solamente en muy · altas dosis. Disminuciones significantes (valor p <0.05) en el OD de ensayo se observaron en concentraciones de 10 µ? o más grandes de danazol. La OD detectada en las cavidades sin nada fue 0.414 ± 0.06 y el tratamiento con danazol 10 µ? disminuyó la OD a 0.288 ± 0.037 mientras que 100 µ? a 0.162 + 0.017 , igualando a por ciento de inhibiciones del 30% y 65% respectivamente.

En 48 horas, la inhibición observada fue significante aun a nivel de 1 µ?. La lectura nil obtenida después de 48 horas en el cultivo se incrementó al 0.629 ± 0.095 y se redujo a 0.378 ± 0.037 por 1 µ?, 0.241 ± 0.012 por 10 µ?, y 0.19 ± 0.033 por 100 µ? (o por ciento de inhibiciones de 40%, 61%, y 70% respectivamente) .

Después de 72 horas, todos los tratamientos de danazol probados exhibieron reducción significante en la proliferación de HUVEC. La OD obtenida en las cavidades nil fue 1.113 ± 0.054 y después del tratamiento con 0.1 µ? descendió a 0.798 ± 0.037, 1 µ? a 0.484 ± 0.022, 10 µ? a 0.229 ± 0.016, y 100 µ? a 0.156 ± 0.018 (inhibiciones de 28%, 57%, 80%, y 86% respectivamente) .

La examinación de la OD obtenida de todas las dosis de danazol de 100 µ? fue consistente en todos los puntos de tiempo indicando una detención completa de proliferación celular en esta concentración.

En resumen, el danazol exhibió fuerte inhibición de la proliferación de célula endotelial.

B. Formación de Tubo de HUVEC Protocolo Para investigar la formación de estructuras similares a capilares por HUVECs, el Sistema de Angiogénesis : Ensayo de Formación de Tubo de Célula Endotelial se adquirió de BD Biosciences (San José, CA) y se utilizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. En breve, 100,000 HUVECs se sembraron en tapones de matrigel rehidratados en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades en la presencia de FCS al 5% para inducir la formación de tubo. El danazol se adicionó a las concentraciones finales de 1 µ?, 10 µ?, o 50 µ? y LY294002 (control positivo) se adicionó en 50 µ . Después de 18 horas, las cavidades se fotografiaron utilizando una cámara digital Kodak DCS Pro SLR/N (Rochester, NY) montada en un microscopio invertido. Las cavidades tratadas con etanol se incluyeron para determinar si el vehículo tuvo algunos efectos sobre la diferenciación celular.

Resultados, Observaciones y Discusión: Para poner en claro si el danazol puede prevenir la formación de estructuras similares a tubo por HUVEC, se utilizaron placas de 96 cavidades que contienen tapones de matrigel. Las ' células endoteliales cuando se cultivaron en la presencia de sustancias angiogénicas y suministradas con una estructura de matriz extracelular se diferenciarán en estructuras que se asemejan sueltamente a vasos capilares. Las HUVECs cultivadas con danazol exhibieron menos estructuras organizadas con interconexiones delgadas y menos definidas que los controles (ver la Figura 2, en la cual A = control, B = 1 µ? danazol, C = 10 µ? danazol, D = 50 µ? danazol, y E = 50 µ? de LY294002) . El tratamiento con 50 µ? danazol condujo a colonias aisladas de HUVEC localizado en el tapón con muy pocas conexiones delgadas o espacios del lumen de vaso. El efecto del danazol fue muy similar al compuesto de control positivo LY294002. Para asegurar que el vehículo utilizado no tuvo efecto, las cavidades se trataron con etanol en concentraciones correspondientes a la dosis más alta de danazol utilizada y no se observó efecto en la formación de tubo (datos no mostrados) . Estos datos indican que el danazol es un inhibidor efectivo en la formación tuvo en 50 µ?. El danazol no tuvo efecto en la formación de tubo en 1 µ? o 10 µ .

C. Invasión de HUVEC Protocolo Cámaras de Invasión de Matrigel BioCoat se adquirieron de BD Biosciences (San José, CA) . Los insertos se rehidrataron a 37 °C con 500 µ? de HBSS durante 2 horas antes del uso en una incubadora humidificada . Las HUVECs tripsinizadas se lavaron dos veces con EG -2 caliente que contiene FCS al 0.1% y se adicionaron a la cámara superior del inserto de invasión en 100,000 células en un volumen total de 250 µ?. El danazol y los compuestos de control se adicionaron al depósito superior en concentraciones finales de 10 µ? y 100 µ?. 750 µ? de EGM-2 suplementado con FCS al 5% se adicionaron a la cámara del fondo para iniciar la invasión y las placas se incubaron durante 24 horas. Células no invasivas se remolieron de la cámara superior con torundas de algodón humedecidas y luego los insertos se lavaron dos veces con HBSS. Los insertos luego se sumergieron en calceina AM 10 µ? preparada en HBSS y se incubaron durante 4 horas. La fluorescencia se determinó en un lector de microplaca en 485 nm de excitación y 595 nm de emisión. LY294002 y el compuesto estructuralmente similar pero inactivo LY303511 sirvió como controles positivos y negativos respectivamente para este experimento.

Resultados Los resultados se presentan en la Figura 3. Todos los datos se presentan como el experimento representativo hecho por triplicado. Las diferencias entre los subconjuntos se analizaron utilizando la prueba t del estudiante en Microsoft Excel. P <0.05 sé consideró estadísticamente significante .

Insertos recubiertos de matrigel, porosos se utilizaron para determinar si el danazol interfiere con la invasión o migración de células endoteliales (Figura 3) . En el sistema utilizado para el estudio, un incremento significante de las células se detectó mediante el tinte fluorescente después de la adición de FCS a la cámara opuesta a las células endoteliales (5674 FU ± 77 a 7143 ± 516). Danazol en concentraciones de 10 µ? y 100 µ no tuvo efecto, mientras que LY294002 mostró casi atenuación completa de invasión celular (5814 ± 153). Estos datos indican que los factores presentes en el FCS inducen la producción de HUVECs de proteasas que digieren la matriz extracelular , seguido por la migración junto con un gradiente quimiotáctico . El danazol no tuvo efecto inhibidor aparente en la invasión y migración de HUVECs en este modelo.

D. Migración de HUVEC Protocolo Se realizaron ensayos para determinar el efecto de danazol sobre la migración de HUVECs en un ensayo de migración rayado. Las HUVECs del pasaje 8, número de lote 8750 (obtenida de Lonza) , se colocaron en placas de 6 cavidades (ICS BioExpress) en el medio de crecimiento endothelial-2 (EGM-2) medio completo (obtenido de Lonza) . Las placas se cultivaron en una incubadora a 37 °C con C02 al 5% durante 48-72 horas para lograr monocapas confluentes. Las monocapas luego se "rayaron" con una punta de pipeta de 1000 µ? y se lavaron dos veces con medio EGM-2 caliente. El medio de lavado final se aspiró y se reemplazó con medio EGM-2 fresco o medio EGM-2 fresco que contiene un intervalo de concentraciones de danazol (Sigma, # D8399) . Las fotografías de las monocapas dañadas se tomaron y las placas se incubaron en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5% durante otras 24 horas. Las cavidades se fotografiaron nuevamente. Los espacios se midieron en cada fotografía utilizando el software Adobe Photoshop, y las mediciones de espacio se presentan como el número de pixeles en el espacio.

Resultados : Los resultados de tres experimentos separados se presentan en la Tabla 1 enseguida. Como se puede observar de la Tabla 1, danazol en 50 µ?, 75 µ? y 100 µ?, se encontró que significantemente que inhibe la migración de HUVEC en este ensayo. El medio de cultivo EGM-2 utilizado en este ensayo contiene un cóctel de factores de crecimiento como es comparado con el FCS utilizado en el modelo de Matrigel descrito en la sección C anterior. Esta diferencia en los factores de crecimiento ' puede tener en cuenta la diferencia en los resultados obtenidos utilizando los dos modelos.

TABLA 1 Ejemplo 2: Efecto del Danazol en la Permeabilidad Vascular de Monocapas de HUVEC Protocolo Se realizaron ensayos para determinar el efecto de danazol sobre la permeabilidad de monocapas de HUVEC. HUVECs de pasajes 5-10, número de lote 7016 (obtenido de Lonza) , se sembraron en insertos de tamaño de poro de 1 miera localizados en las cavidades de una placa de 24 cavidades (inserto de cultivo de células Thincert de 24 cavidades Greiner BioOne, #662610, o ISC BioExpress, # T-3300-15) usando el medio de crecimiento endotelial-2 (EGM-2) (obtenido de Lonza). Las placas se cultivaron en una incubadora a 37 °C con C02 al 5% durante 48-72 horas para lograr confluencia y desarrollar monocapas herméticas. El medio luego se removió y se reemplazó con medio fresco o medio fresco que contiene un intervalo de concentración de danazol (Sigma, # D8399) . El factor de necrosis de tumor (TNFa; Pierce Biotechnology, # RTNFAI) e interleucina-?ß (IL-?ß; Sigma, # 1-9401) se adicionaron a las cavidades apropiadas en concentraciones finales de 10 ng/ml cada uno. TNFOÍ e IL-?ß inducen permeabilidad; ellos pueden causar hasta un incremento de diez veces en la permeabilidad. Finalmente, estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante (HRP) (Pierce Biotechnology, # N100, 1.25 mg/ml) se adicionó a cada cavidad en una dilución final de 1:250. HRP es una molécula grande que tiene un peso molecular de aproximadamente 44,000. Los volúmenes finales fueron 300 µ? en las cámaras superiores y 700 µ? en las cámaras de fondo de cada cavidad. Las placas se incubaron durante 24 horas adicionales en la incubadora a 37 °C con CO2 al 5%. Después de esta incubación, los insertos se removieron y se desecharon. La examinación visual de las células en los insertos indicó que todas las monocapas estuvieron intactas.

Para evaluar el flujo pasante de HRP, 15 µ? de las soluciones resultantes en las cámaras del fondo se transfirieron a placas ELISA de 96 cavidades (cada reacción se realizó por triplicado) . Enseguida, 100 µ? de solución de tetrametilbencidina (TMB) (Pierce) se adicionaron a cada cavidad, y el color se desarrolló durante 5 minutos a temperatura ambiente. El desarrollo de color se detuvo al adicionar 100 µ? de solución acidica 0.18 N. La OD se determinó para cada cavidad utilizando un lector de microplaca ajustado a 450 nm menos 530 nm. El por ciento de inhibición de permeabilidad se calculó contra los controles, y las medias para tres experimentos separados se presentan en la Tabla 2.

Como se puede observar de la Tabla 2, el danazol en concentraciones de 25.0 µ? . o más altas realmente incrementó la permeabilidad vascular. Una concentración de 10.0 µ? tuvo poco o nada de efecto en la permeabilidad vascular. El danazol en concentraciones de 0.1 µ? a 5.0 µ , con 0.1 µ? a 0.5 µ? que es óptimo, disminuyó la permeabilidad vascular. La curva de dosis-respuesta es muy interesante ya que hay un segundo pico de inhibición en concentraciones de 0.001 µ (o quizás aun más baja) a 0.005 µ . Asi, el danazol exhibe una curva de dosis respuesta muy sorprendente inesperada para la permeabilidad vascular.

Como se muestra en el Ejemplo 1, una concentración de 50 µ? a 100 µ seria requerida para obtener la inhibición de la proliferación de HUVEC, migración y formación de tubo después de 18-24 horas de incubación con danazol. Como se muestra en este Ejemplo 2, estas concentraciones óptimas para inhibir la angiogénesis notablemente incrementarían la permeabilidad vascular después de 24 horas (ver la Tabla 2) . A la inversa, las concentraciones óptimas para el uso para inhibir la permeabilidad vascular (0.1 µ? a 0.5 µ?) tienen efectos significantes sobre la angiogénesis en 24 horas.

TABLA 2 Ejemplo 3: Efecto del Danazol sobre la Permeabilidad Vascular Células endoteliales retínales humanas de pasaje 9 (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) se pasajearon en el medio EGM-2 (Lonza, Walkersville, D) hasta que se obtuvo 80% de confluencia. Las células luego se liberaron del matraz de pasaje utilizando Tripsina-EDTA, y las células en la suspensión resultante se contaron para determinar tanto la viabilidad como los números de células. La viabilidad de la suspensión de células fue más grande que 90% en este experimento.

Las células luego se sembraron sobre insertos (tamaño de poro de 1 miera) localizados en las cavidades de una placa de 24 cavidades (insertos de cultivo de células Thincert de 24 cavidades Greiner BioOne, #662610) en 300 µ? de medio completo EGM-2 (obtenido de Lonza) . Luego, 700 µ? de EGM-2 se colocó en la cámara del fondo, y las placas se cultivaron en una incubadora a 37 °C con C02 al 5% durante 48 horas para lograr monocapas confluentes. Las mediciones de resistencia eléctrica transendotelial (TER) se tomaron utilizando un electrodo STX 100 unido a un voltómetro EVOM2 (ambos de World Precisión Instruments) para todos los insertos para confirmar el establecimiento de una barrera semipermeable. Para realizar las mediciones, una sonda se colocó en cada cavidad con un electrodo en la cámara superior y una en la cámara inferior.

Luego, las células se trataron por duplicado como sigue. El medio EGM-2 se decantó cuidadosamente a los insertos y se reemplazó con el medio I DM que contiene suero de bovino fetal a 0.5% y suplementos de EGM-2, excepto para VEGF e hidrocortisona (todos de Lonza) . En algunas cavidades, el medio IMDM contuvo danazol (Sigma, # D8399) en una dilución en serie diez veces. Las placas se incubaron en una incubadora a 37 °C en C02 al 5% durante cuatro horas antes de que 30 µ? de una solución que contiene albúmina de suero humana marcada fluorescente al 4% sé adicionara a la cámara superior de cada cavidad. Las placas se incubaron en una incubadora a 37 °C con C02 al 5% durante 18 horas adicionales.

Después de esta incubación, los insertos se removieron y se desecharon, y 200 µ? del medio de cámara del fondo se transfirió a fluoro-placas negras de 96 cavidades (Falcon) por triplicado. La fluorescencia de cada cavidad luego se midió en una longitud de onda de 340 nm y una longitud de onda de emisión de 470 nm. Las unidades de fluorescencia media (FU) para cada inserto luego se calcularon, y se promediaron las lecturas por duplicado. Los resultados se presentan en la Tabla 3.

TABLA 3 Como se uede observar, la concentración más baja de danazol (0.01 . µ?) dio la inhibición más grande (aproximadamente 10%). Las cavidades de control que se corren sin células dieron arriba de 4000 FU en la cámara inferior, mostrando que las monocapas endoteliales retínales fueron selectivamente permeables.

Ejemplo 4: Efecto de Danazol sobre TER de Tres Monocapas de Células Endoteliales Diferentes Se realizaron ensayos para determinar el efecto de danazol en la resistencia eléctrica transendotelial (TER) de células endoteliales retínales humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) . Para hacer esto, 150,000 células endoteliales retínales humanas del pasaje 14 se sembraron sobre insertos (tamaño de poro de 1 miera) localizados en las cavidades de una placa de 24 cavidades (insertos de cultivo de células Thincert de 24 cavidades Greiner BioOne #662610) en 300 µ? del medio completo de EGM-2 (obtenido de Lonza) . Luego, las placas se cultivaron en una incubadora a 37 °C con C02 al 5% durante 24 horas. Después de la incubación, el medio de cultivo se decantó cuidadosamente y se reemplazó con ya sea EGM-2 fresco o EGM-2 fresco que contiene danazol a una concentración final de 1 µ?. Las placas se colocaron nuevamente en la incubadora y se cultivaron durante 144 horas adicionales. Los ensayos también se realizaron de la misma manera utilizando las células endoteliales de cerebro humano de pasaje 8 y células endoteliales de vena umbilical humana del pasaje 8.

Una medición TER inicial se tomó para cada inserto utilizando el voltómetro EVOM2 conectado a un electrodo STX100 (ambos de World Precisión Instruments). Las mediciones también se tomaron en 24, 48, 72 y 144 horas. Los resultados se presentan en las Tablas 4, 5 y 6 enseguida. Todos los datos se presentan como mediciones TER/cm2 del inserto con el TER de insertos de preforma sustraídos.

TABLA 4 Células Endoteliales Retínales Humanas TABLA 6 Células Endoteliales de Vena Umbilical Humana Como se puede observar, danazol aumentó mediciones de TER (permeabilidad de ion reducida) en las monocapas de célula endotelial retinal y de vena umbilical. El danazol no parece tener mucho efecto sobre la TER de las monocapas de célula endotelial de cerebro, TER es una medición de la resistencia eléctrica de monocapas celulares. Esta es una indicación de la integridad de barrera y se correlaciona con la permeabilidad iónica.

Ejemplo 5: Efecto de Danazol sobre la Fos orilación de Akt Se realizaron ensayos para determinar el efecto del danazol sobre la fosforilación de Akt en células endoteliales retínales humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) . Las células se cultivaron en un matraz de 25 cm2 cercano a confluencia en el medio EGM-2 (Lonza, Walkersville, MD) que contiene suero de ternero fetal al 2% (Lonza) . Las células luego se liberaron del matraz de pasaje utilizando Tripsina/EDTA. Las células en la suspensión resultante se contaron y se sembraron en una placa de 96 cavidades en 1 x 104 células/cavidad en el medio EGM-2. La placa se incubó a 37 °C con C02 al 5% durante 24 horas. Luego, 200 µ? de ya sea el medio EG -2 (control) o varias concentraciones de danazol se adicionaron, y .las placas se incubaron durante 2 horas adicionales. Después de esta incubación, las células se fijaron inmediatamente con formaldehido al 4%, se refrigeraron, y el grado de fosforilación de Akt se determinó utilizando la Activación Celular del Equipo ELISA de Señalización (Equipo CASE™ para AKT S473; ' SABiosciences, Frederick, MD) siguiendo los protocolos del fabricante. El Equipo CASE™ para AKT S473 cuantifica la cantidad de proteina Akt activada ( fosforilada) con relación a la proteina Akt total en ensayos en paralelo utilizando un formato de ELISA convencional con detección colorimétrica . El sitio de fosforilación de Akt es serina 473 y se reconoce por uno de los anticuerpos utilizados en uno de los dos ensayos en paralelo para proporcionar una medición de la proteina Akt activada. El otro anticuerpo utilizado en el otro ensayo en paralelo reconoce Akt para proporcionar una medición de la proteina Akt total. Ambos anticuerpos primarios se detectaron utilizando un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante. La adición de la Solución de Desarrollo del fabricante durante 10 minutos, seguido por la adición de la Solución de Detención del fabricante, produce el resultado que se puede medir colorimétricamente . , Los resultados se presentan en la Tabla 7 enseguida. Como se puede observar ahí, todas las concentraciones de danazol causaron un incremento en la fosforilación (activación) de Akt.

TABLA 7 Se cree que estos resultados proporcionan una explicación posible para la curva de dosis expuesta de permeabilidad vascular obtenida en el Ejemplo 2. Como se muestra en el Ejemplo 2, bajas dosis de danazol redujeron la permeabilidad, mientras que altas dosis incrementaron la permeabilidad. Se cree que un cierto nivel de fosforilación de Akt en S473 reduce la permeabilidad (las concentraciones 0.5-5.0 µ? en este experimento), mientras que la hiperfosforilación de Akt en S473 causa permeabilidad incrementada (las concentraciones de 10-50 µ en este experimento) .

Ejemplo 6: Efecto del Danazol y los Antagonistas del Receptor de Esteroide en TER de Monocapas de Célula Endotelial Retinal Se realizaron ensayos para determinar el efecto de danazol y antagonistas de receptor de esteroide en la resistencia eléctrica transendotelial (TER) de células endoteliales retínales humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, A) . Para hacer esto, insertos de cavidad de cultivo de tejido Greiner (insertos de cultivo de células Thincert de 24 cavidades Greiner BioOne, #662610) se recubrieron con 5 µ?/a?2 de fibronectina (Sigma) . Luego las células endoteliales retínales humanas del pasaje 12 se sembraron en la cámara superior de las cavidades en 120,000 células por inserto en un volumen de 300 µ? del medio EGM-2 (Lonza) . El volumen para la cámara inferior fue 700 µ? del medio EGM-2 (Lonza) . Las placas se cultivaron en una incubadora a 37 °C con C02 al 5% durante 48 horas para establecer las monocapas intactas. Al final de la incubación, las mediciones de TER se tomaron utilizando una sonda STX 2 unida al voltómetro EVOM2 (ambos de World Precisión Instruments) para todos los insertos para confirmar la integridad de la barrera endotelial. Todos los insertos exhibieron resistencia elevada como es comparado con los insertos sin las células.

Luego, el medio de cultivo se decantó cuidadosamente y se reemplazó con EGM-2 fresco, con y sin varios aditivos. Los aditivos fueron danazol, hidroxiflutamida (antagonista de receptor de andrógeno) , fluvestrant (antagonista de estrógeno) e inhibidor de PI3 quinasa LY 294002 (control). Las soluciones de extracto de todos los aditivos, excepto danazol, se hicieron en 10 mM en D SO. La solución de extracto de danazol fue 10 mM de etanol. El trabajo de diluciones de 200 µ? de todos los aditivos se hicieron en los mismos solventes. Luego, diluciones de 200 nM de cada aditivo, y de diluciones equivalentes de etanol y DMSO (controles) sé hicieron en el medio EGM-2, y el danazol y cada uno de los otros aditivos o el medio (control) se adicionaron a las cavidades en las combinaciones y concentraciones finales mostradas en la tabla enseguida. Las placas luego se colocaron nuevamente en la incubadora, y las mediciones de TER se tomaron como es descrito en lo anterior para cada inserto en 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos y 24 horas. La TER se calculó al sustraer la medición de fondo (inserto vacio) de la lectura de un inserto y al dividir entre el área de superficie del inserto (0.33 cm2) . Los resultados se presentan en la Tabla 8 enseguida.

TABLA 8 Como se puede observar de la Tabla fluvestrant incrementaron las mediciones de TER (redujeron la permeabilidad) mientras que hidroxiflutamida redujo las lecturas (incrementó la permeabilidad), comparado con el control (sin tratamiento) . El danazol previno la reducción causada por hidroxiflutamida . Esto podría se evidencia de que el danazol está ocupando el receptor de andrógeno en estas células. Danazol y fluvestrant mostraron resultados aditivos en puntos de tiempo.

Ejemplo 7 : Efecto del Danazol sobre la Formación de Fibra de Esfuerzo de Actina Las IEJs de la ruta paracelular incluyen AJs y TJs. El citoesqueleto de actina se enlaza a cada unión y controla la integridad de las uniones a través de la remodelación de actina. La reorganización del citoesqueleto de actina en fibras de esfuerzo da por resultado la aplicación de fuerzas mecánicas a las uniones que las jalan aparte, causan contracción celular y cambios en la morfología. El proceso de la polimerización de actina es muy dinámico, lo cual permite la organización rápida de estructuras de actina y la transición del fenotipo quiescente, caracterizado por el anillo de actina cortical grueso y la ausencia de fibras de esfuerzo, al fenotipo de célula activada con actina delgada o no cortical y fibras de esfuerzo abundantes. El citoesqueleto de actina también aparece para estar involucrado en la transcitosis , quizás al regular el movimiento de las caveolas .

Células endoteliales retínales humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) se sembraron en places de ensayo Falcon Optilux (BD Biosciences) en 1000 células por cavidad en un volumen total de 200 µ? del medio EGM-2 (Lonza) . Las placas se cultivaron en una incubadora a 37 °C con C02 al 5% durante 48 horas. Luego, el medio se removió y se reemplazó con 200 µ? del medio IMDM suplementado con suero bovino fetal al 0.1% (todos de Lonza), y las células se cultivaron bajo este factor de crecimiento y condiciones deficientes de suero de una hora para suprimir la polimerización de actina. Luego danazol (concentraciones finales de (0.1 µ o 10 µ?) o el inhibidor de PI3 quinasa LY294002 (concentración final de 10 µ?) (control positivo) se adicionaron. Inmediatamente después de la adición de estos compuestos, se adicionó TNFa (concentración final de 50 ng/ml) . Después de la incubación durante 30 minutos en una incubadora a 37 °C con C02 al 5%,' el medio se aspiró, y las células se fijaron con formaldehido al 3.6% en solución salina regulada de fosfato (PBS) durante diez minutos a temperatura ambiente. Todas las cavidades luego se lavaron dos veces con 100 µ? de PBS. Las células se permeabilizaron utilizando Tritón X-100 al 0.1% en PBS durante 5 minutos. Todas las cavidades luego se lavaron dos veces con 100 µ? de PBS, y 50 µ? de una dilución 1:40 de rodamina-faloidina (Invitrogen) en PBS se adicionó a las células para el manchado de F-actina y se dejaron sobre las células durante 20 minutos a temperatura ambiente. Todas las cavidades luego se lavaron dos veces con 100 µ? de PBS. Luego se adicionó 100 µ? de PBS a cada cavidad y las células se observaron y se fotografiaron utilizando un microscopio invertido con filtros de rodamina (ex530/em590) .

Los resultados mostraron que el danazol afectó la habilidad de las fibras de esfuerzo a desarrollarse. Cuando se trataron con danazol, las células exhibieron diferentes patrones de manchado, dependiente de la dosificación. En la dosis de danazol inferior (0.1 µ?) , el manchado difuso por todo el citoplasma se observó, posiblemente indicativo de un evento estabilizante o de un fenotipo de reposo. En la dosis de danazol superior (10.0 µ?) , las fibras de esfuerzo con múltiples puntos focales se detectaron. Estos descubrimientos se correlacionan con los estados previos (ver los ejemplos previos) que las dosis de danazol inferiores inhiben la permeabilidad y dosis de danazol superiores incrementan la permeabilidad. TNFa estimuló las células y condujo al desarrollo de fibra de esfuerzo fuerte con puntos focales intensamente manchados. Danazol y LY294002 disminuyó el número de células que exhiben desarrollo de fibra de esfuerzo con TNFa.

Ejemplo 8: Efecto de Danazol sobre la Formación de Fibra de Esfuerzo de Actina Células endoteliales retínales humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) se sembraron en places de ensayo Falcon Optilux (BD Biosciences) recubiertas con 1 µ?/a?2 de fibronectina en 3000 células por cavidad en un volumen total de 200 µ? del medio EGM-2 (Lonza) . Las placas se cultivaron en una incubadora a 37°C con C02 al 5% durante 48 horas. Luego, el medio se removió y se reemplazó con 200 µ? del medio Ultraculture suplementado con suero bovino fetal al 2.0% (todo de Lonza), y las células se cultivaron bajo este factor de crecimiento y condiciones deficientes de suero durante la noche para suprimir la polimerización de actina. Luego, el medio se removió y se reemplazó con el medio Ultraculture fresco suplementado con suero bovino fetal al 2.0% que contiene danazol (0.1 µ?, 1 µ? o 10 µ?) o el inhibidor de PI3 quinasa LY294002 (10 µ?) (control positivo) . Después de la incubación con estos compuestos durante 30 minutos en una incubadora a 27 °C con C02 al 5%, se adicionó factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (concentración final de 25 ng/ml) . Después de la incubación durante 30 minutos adicionales en una incubadora a 37°C con C02 al 5%, el medio se aspiró, y las células se fijaron utilizando formaldehido al 3.6% en solución salina regulada de fosfato (PBS) durante diez minutos a temperatura ambiente. Todas las cavidades luego se lavaron dos veces con 100 µ? de PBS. Las células se permeabilizaron utilizando Tritón X-100 al 0.1% en PBS durante 5 minutos. Todas las cavidades luego se lavaron dos veces con 100 µ? de PBS, y 50 µ? de una dilución de 1:40 de rodamina-faloidina (Invitrogen) en PBS se adicionó a las células para el manchado de F-actina y se dejó sobre las células durante 20 minutos a temperatura ambiente. Todas las cavidades luego se lavaron dos veces con 100 µ? de PBS. Para contramanchar los núcleos, 100 µ? de una solución DAPI 3 µ? (4, 6-diamidino-2-fenilindol, dilactato (Invitrogen)) se adicionó a cada cavidad. Después de 5 minutos, las células se lavaron dos veces con 100 µ? de PBS. Luego 100 µ? de PBS se adicionó a cada cavidad y las células se observaron y se otografiaron utilizando un microscopio invertido utilizando filtros de rodamina (ex530/em590 ) y DAPI (ex350/em460) .

Los resultados mostraron que el danazol afectó la habilidad de las fibras de esfuerzo a desarrollarse. Cuando se trataron' con danazol, las células exhibieron diferentes patrones de formación de fibra de esfuerzo, dependiente de la dosificación aplicada. En las dosis de danazol más baja (0.1 µ?) , se observó manchado de F-actina difuso por todo el citoplasma. En danazol 1.0 µ?, el manchado difuso persistió, pero las fibras de esfuerzo y puntos focales alrededor del perímetro de la mayoría de las células fueron visibles. En la dosis de danazol más alta (10.0 µ?) , no hubo por más tiempo algún manchado difuso, se observaron desarrollo de fibra de esfuerzo y puntos focales. El manchado observado con las dosis inferiores de danazol exhibieron un patrón de manchado perinuclear, indicativo de estabilización de microtúbulo similar a aquel observado con placlitaxel (un compuesto Taxol conocido que estabiliza y polimeriza los microtúbulos) . Con VEGF, hubo fuerte desarrollo de fibra de esfuerzo. El danazol cambió el patrón de VEGF de una manera dependiente de la dosis; (i) la dosis de danazol de 0.1 µ más baja hizo las fibras de esfuerzo menos pronunciadas y algo de manchado difuso apareció; (ii) la dosis de 1.0 µ? mostró menos fibras de esfuerzo gruesas, pero se observaron puntos focales en las superficies de contacto; y (iii) la dosis de danazol de 10.0 µ? más alta mostró fuerte desarrollo de fibra de esfuerzo con puntos focales. LY294002 previno el fuerte desarrollo de fibra de esfuerzo observado con VEGF y exhibió manchado difuso .

Ejemplo 9: Efecto del Danazol sobre la Fosforilación de Cadherina Endotelial Vascular (VE-Cadherina) Células endoteliales retínales humanas del pasaje 12 (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) se cultivaron a confluencia en places de cultivo de tejido de 10 cm2 recubiertas con fibronectina (1 \iq/cm2) utilizando el medio de cultivo EGM-2 (Lonza) en una incubadora a 37 °C con C02 al 5%. Cuando se logró la confluencia completa, el medio se reemplazó con el medio Ultraculture suplementado con suero bovino fetal al 0.5% y L-glutamina (todos de Lonza), y las células se cultivaron bajo este factor de crecimiento y condiciones deficientes de suero durante 24 horas. Luego, el medio se removió y se reemplazó con el medio ültraculture fresco suplementado con suero bovino fetal al 0.5% y danazol que contiene L-glutamina (0.1 µ?, 1 µ? o 10 µ?) o etanol (control de vehículo) . Después de la incubación durante 15 minutos en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5%, se adicionó factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (concentración final de 50 ng/ml), y las places se incubaron durante 15 minutos adicionales en una incubadora a 37 °C con C02 al 5%.

Las placas se trataron inmediatamente para lisar las células como sigue. PBS y la solución reguladora de lisis (PBS que contiene Tritón X-100 al 1% suplementado con soluciones inhibidoras de fosfatasa 1 y 2 (Sigma) , inhibidor de proteasa (Sigma) y ortovanadato de sodio en una concentración final de 2 mM) se enfriaron a 4°C. Las células se lavaron dos veces con 5 mi de PBS enfriado en hielo y luego se lisaron en 500 µ? de la solución reguladora de lisis enfriada en hielo. Los extractos de proteína resultantes se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1.7 mi, y los restos celulares se removieron al girar a 4°C en 10,000 rpm durante 10 minutos. Luego, 450 µ? de la solución aclarada se transfirió a los tubos que contiene 25 µ? de Protein Dynabeads ( I'nvitrogen) recubiertas con 10 µ? de anticuerpo polyclonal anti-VE cadherina C19 (Santa Cruz Biotechnology) (recubrimiento . realizado siguiendo el protocolo del fabricante) . Los extractos y las cuentas luego se incubaron durante la noche a 4°C en un agitador orbital para capturar la VE cadherina de los extractos. Las cuentas luego se lavaron cuatro veces con solución reguladora de lisis enfriada con hielo. Para liberar la proteina de las cuentas, ellas se calentaron durante 10 minutos a 75°C en tinte de carga de SDS que contiene tinte de reducción al 20% ( Invitrogen) .

Las proteínas liberadas se separaron en geles de poliacrilamida de 4-20% (Invitrogen) en 120 voltios durante 1 hora. Para determinar la fosforilación y la proteína total en los geles, el manchado de proteína Pro-Q diamante (Invitrogen) y SYPRO ruby (Invitrogen) se realizaron secuencialmente siguiendo el protocolo del fabricante. Los geles se fotografiaron y la densitometría se realizó utilizando una estación de formación de imagen Kodak. Los resultados se presentan en la Tabla 9 enseguida.

TABLA 9 VE-Cadherina Como se puede observar, el danazol causó un incremento en la fosforilación de VE-cadherina . VEGF causó un incremento aun más grande en la fosforilación de VE-cadherina (hiperfosforilación) que fue revertida por el danazol. VE-, cadherina es un componente de AJs, y la fosforilación de VE- cadherina puede tener una variedad de efecto dependiendo del residuo. En general, la fosforilación de tirosina de la VE- cadherina conduce a un desensamble de AJ e hiperpermeabilidad incrementada. La fosforilación de serina 665, sin embargo, causa una internalización rápida pero reversible de la VE- cadherina asociada con la función de barrera reducida.. Un circuito de retroalimentación aparece que existe en el cual la VE-cadherina internalizada induce un incremento en pl20 citoplásmico, una proteina de estructura que se forma en complejo con AJs. Esta regulación hacia arriba induce una disminución en RhoA activa en asociación con un incremento en las GTPasas, estabilizantes de barrera similares a Racl, Rap-1 y Cdc42. Se cree que el incremento en la fosforilación de VE-cadherina observada en este experimento después del tratamiento de danazol de baja dosis conduce a la activación de GTAasas estabilizantes de barrera. Además, el danazol puede prevenir los efectos de fosforilación desestabilizantes inducidos por VEGF.

Ejemplo 10: Efecto del Danazol y Antagonistas de Receptor Esteroide sobre la TER de Monocapas de Células Endoteliales Retínales Se realizaron ensayos para- determinar el efecto de danazol y los antagonistas de receptor esteroide sobre la resistencia eléctrica transendotelial (TER) de células endoteliales retínales humanas (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) . Para hacer esto, insertos de cavidad de cultivo de tejido Greiner (insertos de cultivo de células Thincert de 24 cavidades Greiner BioOne, #662610) se recubrieron con 5 g/cm2 de fibronectina . Luegos, células endoteliales retínales humanas del pasaje 13 se sembraron en la cámara superior de las cavidades en 120,000 células por inserto en un volumen de 300 µ? del medio EGM-2 (Lonza) . El volumen para la cámara inferior fue 700 µ? del medio EGM-2 (Lonza) . Las placas se cultivaron en incubadora a 37 °C con C02 al 5% durante 48 horas para establecer monocapas intactas. Al final de la incubación, las mediciones de TER se tomaron utilizando una sonda STX 2 unida al voltómetro EVOM2 (ambos de World Precisión Instruments) para todos los insertos para confirmar la integridad de la barrera endotelial. Todos los insertos exhibieron resistencia elevada como es comparado con los insertos sin células.

Luego, el medio de cultivo se decantó cuidadosamente ,y se reemplazó con EGM-2 fresco, con o sin varios aditivos. Los aditivos fueron danazol, hidroxiflutamida (antagonista de receptor de andrógeno) , fluvestrant (antagonista de estrógeno) , testosterona, estradiol e inhibidor de PI3 quinasa LY294002 (control). La solución de extracto de todos los aditivos, excepto danazol, se hicieron en 10 mM en DMSO. La solución de extracto de danasol fue 10 mM en etanol. El trabajo de diluciones de 200 µ? de todos los aditivos se hicieron en los mismos solventes. Luego diluciones de 200 nM de cada aditivo, y de .diluciones equivalentes de etanol y DMSO (controles) , se hicieron en el medio EGM-2 y el danazol y cada uno de los otros aditivos o el medio (control) se adicionaron a las cavidades en las combinaciones y concentraciones finales mostradas en la tabla enseguida. Las placas luego se colocaron nuevamente en la incubadora, y las mediciones de TER se tomaron como es descrito en lo anterior para cada inserto en 5 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 24 horas. TER se calculó al sustraer la medición de fondos (inserto vacio) de la lectura de un inserto y al dividir entre el área de superficie del inserto (0.33 cm2) . Los resultados se presentan en la Tabla 10 enseguida .

Como se puede observar de la Tabla 10, el danazol incrementó las mediciones de TER, hidroxiflutamida redujo las lecturas, testosterona redujo las lecturas muy ligeramente, y fluvestrant no tuvo efecto esencialmente, comparado con el control (sin tratamiento) . Danazol previno la reducción causada por hidroxiflutamida y la reducción muy ligera observada con testosterona. Como con los resultados en el Ejemplo 6, esto podría ser evidencia de que el danazol está ocupando el receptor de andrógeno en estas células.

TABLA 10 E emplo 11 : Efecto de Danazol sobre la Formación de Fibra de Esfuerzo de Acbina Células endoteliales microvasculares glomerulares renales humanas del pasaje 6 (ACBRI 128, Cell Systems Corporation (distribuidor exclusive para Applied Cell Biology Research Institute) , Kirkland, A) y células endoteliales retínales humanas del pasaje 12 (ACBRI 181, Cell Systems Corporation (distribuidor exclusivo para Applied Cell Biology Research Institute) , Kirkland, WA) se sembraron en platinas de vidrio de 16 cámaras recubiertas con 5 yg/cm2 de fibronectina en 2000 células" por cavidad en un volumen total de 200 µ? del medio EGM-2 (Lonza) . Las placas se cultivaron en una incubadora a 37 °C en C02 al 5% durante 48 horas con cambios del medio diario. Luego, los compuestos de prueba (danazol, TNFa y S1P) , diluidos en Solución de Sal Balanceada de Hanks (HBSS; Lonza), se adicionaron para dar las siguientes concentraciones finales: danazol (1 µ?) (Sigma) , TNFa (1 ng/ml) (Sigma), y S1P (1 µ?) (Sigma). Las platinas se incubaron con los compuestos de prueba durante 15 minutos, 30 minutos o 24 horas en una incubadora a 37 °C con C02 al 5%. Después de esta incubación, el medio se aspiró, y las células se fijaron utilizando formaldehido al 3.6% en solución salina regulada de fosfato (PBS) durante diez minutos a temperatura ambiente. Todas las cavidades luego se lavaron dos veces con 100 µ? de PBS. Las células se permeabilizaron utilizando Tritón X-100 al 0.1% en PBS durante 5 minutos. Todas las cavidades luego se lavaron dos veces con 100 µ? de PBS, y 50 µ? de una dilución 1:40 de rodamina-faloidina (Invitrogen) en PBS se adicionó a las células para el manchado de F-actina y dejó sobre las células durante 20 minutos a temperatura ambiente. Todas la.s cavidades luego se lavaron dos veces con 100 µ? de PBS. Luego 100 µ? de PBS se adicionó a cada cavidad y las células se observaron y se fotografiaron utilizando un microscopio invertido utilizando un filtro de rodamina (ex530/em590) .

Los resultados mostraron que el danazol afectó la habilidad de las fibras de esfuerzo para desarrollarse en las células endoteliales microvasculares glomerulares renales. Cuando se trataron con danazol sólo, las células exhibieron manchado perinuclear en 15 minutos, manchado difuso por todas las células con bordes rugosas en muchas de las células én 3 horas. Y el manchado similar a los controles no tratados en 24 horas. Con TNF solo, las fibras de esfuerzos se observaron en todos los tiempos, como en el número de células que exhiben fibras de esfuerzo y el espesor de las fibras que se incrementan con el tiempo. El danazol disminuyó la formación de fibra de esfuerzo y el espesor de todas las fibras en todos los tiempos, y los anillos de actina corticales y bordes rugosos fueron visibles comenzando en 3 horas. Las células tratadas con S1P mostraron anillos corticales de actina, con el desarrollo que comienza en 15 minutos y más fuerte en 3 horas. Las células estuvieron regresando a la morfología similar a los controles no tratados en 24 horas. El danazol se observó que aumenta los anillos corticales. También, el manchado difuso se observó, especialmente en 15 minutos y 24 horas.

Para las células endoteliales retínales tratadas con danazol solo, las células exhibieron manchado perinuclear en 15 minutos, manchado difuso por todas las células con bordes rugosos en muchas de las células en 3 horas, y manchado similar a los controles no tratados en 24 horas. Con TNFa solo, las fibras de esfuerzo se observaron en todos los tiempos, con el número de células que exhiben fibras de esfuerzo y el espesor de las fibras que se incrementan de 15 minutos a 3 horas y que es reducido después de 24 horas de incubación. El danazol disminuyó la formación de fibra de esfuerzo y/o el espesor de las fibras en todos los tiempos. El manchado difuso se observó en 15 minutos y 24 horas, y los anillos de actina corticales fueron visibles en 3 horas. Las células tratadas con S1P solo mostraron anillos corticales de actina, con el desarrollo que comienza en 15 minutos y más fuerte en 3 horas. Las células estuvieron regresando a la morfología similar a los controles no tratados en 24 horas. El d nazol se observó que aumentó los anillos corticales en 3 horas. También, el manchado difuso se observó, especialmente en 15 minutos y 24 horas.

S1P (esfingosina-l fosfato) desempeña una función muy importante en la formación y mantenimiento del endotelio vascular. S1P es una entrada de señalización constitutiva que facilita la organización y función de barrera del endotelio vascular a través de sus efectos en el citoesqueleto de actina. En particular, S1P está involucrado en la formación de fibras de actina5 corticales y la organización de las uniones adherentes. La supresión de S1P conduce a fuga vascular y edema, y SIP puede revertir la disfunción endotelial y restaurar la función de barrera.

En este experimento, danazol exhibió una habilidad para fortalecer los efectos protectores de SIP en las células endoteliales tanto retínales como glomerulares . El danazol también revertió la formación de fibras de esfuerzo inducidas por TNFOÍ en ambos de estos tipos de células endoteliales. El manchado perinuclear difuso se observa en células tratadas con danazol solo.

Ejemplo 12: Efecto del Danazol sobre ECIS Se realizaron ensayos para determinar el efecto del-danazol sobre la resistencia eléctrica transendotelial (TER) de células endoteliales microvasculares glomerulares renales humanas (ACBRI 128, Cell Systems Corporation (distribuidor exclusivo para Applied Cell Biology Research Institute) , Kirkland, WA) o células endoteliales retínales humanas (ACBRI 181, Cell Systems Corporation (distribuidor exclusivo para Applied Cell Biology Research Institute) , Kirkland, WA) . Resistencia eléctrica se midió utilizando el sistema de detección de impedancia de sustrato de célula eléctrico (ECIS) (ECISZ9, obtenido de Applied Biophysics) con placas de electrodo múltiple de 8 cavidades (8W10E) . Cada cavidad de las placas se recubrió con 5 pg/cm2 de fibronectina en HBSS .al adicionar la fibronectina en un volumen de 100 yl por cavidad y al incubar las placas durante 30 minutos en una incubadora a 37°C con C02 al 5%. La solución de fibronectina se removió, y 400 µ? del medio de cultivo EGM-2 (Lonza) se adicionó a cada cavidad. Las placas se conectaron al sistema ECISZG y se estabilizaron eléctricamente. El medio EGM-2 se aspiró y se reemplazó con 200 µ? del medio de cultivo EGM-2 que contiene 100,000 células por cavidad. Las placas se reconectaron al sistema ECISZ0 y se incubaron durante 24 horas en una incubadora a 37 °C con C02 al 5%. El medio EGM-2 se aspiró y se reemplazó con 400 µ? del medio de cultivo EGM-2 fresco por cavidad. Las placas se reconectaron al sistema ECISZe y se incubaron durante 6 horas en una incubadora a 37 °C con C02 de 5%. Las soluciones concentradas de los compuestos de prueba en HBSS se prepararon y se colocaron en la incubadora para equilibrarse. Los compuestos de prueba luego se adicionaron a las cavidades apropiadas en las siguientes concentraciones finales: danazol (1 µ?) (Sigma) y S1P (1 µ?) (Sigma) . ECIS (resistencia) se monitoreó durante 90 horas.

En las células endoteliales retínales, danazol 1.0 µ? solo mostró un incremento de ECIS como es comparado, con las células no tratadas iniciando aproximadamente 1.5-2.0 horas después del tratamiento y persistiendo durante 5 horas. SlP solo mostró un incremento de ECIS como es comparado con las células no tratadas que iniciaron dentro de los primeros 15 minutos después del tratamiento y persistió durante aproximadamente 3 horas. El danazol y S1P en combinación incrementaron la ECIS como es comparado con S1P solo y las células no tratadas, y esta ECIS incrementada persistió durante aproximadamente 90 horas. Asi, el danazol exhibió una habilidad para aumentar los efectos tempranos de S1P y para mantener una resistencia más alta por todo el experimtno cuando S1P estuvo presente.

Las células endoteliales glomerulares exhibieron un patrón diferente. El danazol solo no tuvo efectos sobre ECIS hasta aproximadamente 30 horas después del tratamiento. Danazol solo incrementó ECIS comparado con las células no tratadas de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 horas, con el incremento más grande que ocurre entre aproximadamente 60-90 horas. S1P solo también no tuvo efectos sobre ECIS hasta aproximadamente 30 horas después del tratamiento. S1P solo incrementó ECIS comprado con las células no tratadas de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 horas. La combinación del danazol y S1P no tuvo efectos sobre ECIS hasta aproximadamente 30 horas después del tratamiento. Esta combinación incrementó ECIS comparado con las células no tratadas, S1P solo y danazol solo. En particular, la combinación incrementó ECIS comparado con las células no tratadas de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 horas, incrementó ECIS comparado con S1P solo de aproximadamente 30 a 75 horas, e incrementó ECIS comparado con danazol solo de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 horas.

Ejemplo 13: Efecto de Danazol sobre ECIS Se realizaron ensayos para determinar el efecto de danazol sobre la resistencia eléctrica transendotelial (TER) de células endoteliales microvasculares glomerulares renales humanas (ACBRI 128, Cell Systems Corporation (distribuidor exclusivo para Applied Cell Biology Research Institute) , Kirkland, WA) . La resistencia eléctrica se midió utilizando el sistema de detección de impedancia de sustrato de célula eléctrico (ECIS) (ECISZG, obtenido de Applied Biophysics) con placas de electrodo múltiple de 8 cavidades (8W10E) . Cada cavidad de las placas se recubrió con 5 pg/cm2 de fibronectina en HBSS al adicionar la fibronectina en un volumen de 50 µ? por cavidad y al incubar las placas durante 30 minutos en una incubadora a 37 °C con C02 al 5%. La solución de fibronectina se removió, y 200 µ? del medio de cultivo EGM-2 (Lonza) se adicionó a cada cavidad. Las placas se conectaron al sistema ECISZ9 y se estabilizaron eléctricamente. El medio EGM-2 se aspire y se reemplazó con 200 µ? del medio de cultivo EGM-2 que contiene 40,000 células del pasaje 6 por cavidad. Las placas se reconectaron al sistema ECISZ9 y se incubaron durante 24 horas en una incubadora a 37 °C con CC^al 5%. El medio EGM-2 se aspiró y se reemplazó con 200 µ? del medio de cultivo EGM-2 fresco por cavidad. Las placas se reconectaron al sistema ECISZ9 y se incubaron durante 24 horas adicionales en una incubadora a 37 °C con C02 al 5%. El medio EGM-2 se aspiró y se reemplazó con 200 µ? del medio de cultivo EGM-2 fresco sin dexametasona por cavidad. Las placas se reconectaron al sistema ECISZ6 y se incubaron durante la noche en una incubadora a 37 °C con C02 al 5%. Finalmente el medio EGM-2 se aspire y se reemplazó con 200 µ? del medio de cultivo EGM-2 fresco sin dexametasona por cavidad. Las placas se reconectaron al sistema ECISZ9 y se incubaron 2 horas en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5%. Las soluciones concentradas de los compuestos de prueba en HBSS se prepararon y se colocaron en la incubadora para equilibrarse. Los compuestos de prueba luego se adicionaron a las cavidades apropiadas en las siguientes concentraciones finales: danazol (1 µ?) (Sigma) y dexametasona (1 µ?) (Sigma). ECIS (Resistencia) se monitoreó durante 90 horas.

El danazol solo incrementó ECIS comparado con las células no tratadas comenzando en aproximadamente 3 horas y persistiendo durante aproximadamente 90 horas. El incremento fue más grande de aproximadamente 12 a aproximadamente 15 horas. Cuando se compara con dexametasona, el danazol exhibió un patrón similar, pero el aumento de ECIS (TER) no fue tan grande.

Ejemplo 1 : Efecto del Danazol sobre RhoA La remodelación del citoesqueleto de célula endotelial es central para muchas funciones del endotelio. La familia Rho de proteínas de enlace de GTP pequeñas se identificaron como reguladores claves de la dinámica citoesquelética de F-actina. La familia Rho consiste de tres isoformas, RhoA, RhoB y RhoC. La activación de la actividad de RhoA conduce a la formación de fibra de esfuerzo prominente en células endoteliales . La estimulación de células endoteliales con trombina incrementa Rho GTP la fosforilación de miosina, consistente con la contractabilidad de célula incrementada. La inhibición de Rho bloquea esta respuesta y la pérdida de función de barrera, demostrando una función crítica para Rho en la permeabilidad vascular.

Este experimento se realizó utilizando un ensayo de activación Rho comercialmente disponible (GLISA) adquirido de Cytoskeleton, Denver, Colorado, siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, células endoteliales retínales humanas del pasaje 8 o 12 (ACBRI 181, Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA) se cultivaron en placas de cultivo de tejido de 6 cavidades recubiertas con fibronectina (1 g/cm2) utilizando el medio de cultivo EGM-2 (Lonza) durante 24 horas en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5% (30,000 células/cavidad en volumen total de 3 mi). Luego, el medio se aspiró y se reemplazó con el medio Ultraculture suplementado con suero bovino fetal al 0.1%, L-glutamina, piruvato de sodio, penicilina/estreptomicina e ITSS (insulina, transferrina sodio selenio) (todos de Lonza) para hacer deficiente el suero de las células y reducir el nivel de fondo de RhoA. Las células se cultivaron durante 24 horas en una incubadora a 37 °C con C02 al 5%. Los compuestos de prueba diluidos en HBSS se colocaron en una incubadora para equilibrarse antes de la adición de las células. Luego, 150 µ? de cada compuesto de prueba se adicionó a las cavidades de cultivo apropiadas, y las placas se incubaron en la incubadora durante 15 minutos adicionales. Luego, trombina se adicionó a las cavidades apropiadas. Después de 1 minuto, las células se lavaron una vez con 1.5 mi de solución salina regulada de fosfato y luego se lisaron con 100 µ? de solución reguladora de lisis GLISA suplementada con inhibidores de proteasa. Los extractos se rasparon, se transfirieron a tubos de microcentrifuga y se transfirieron al hielo para preservar la forma activa de RhoA. Todos los extractos luego se aclararon de los restos celulares al girar a 10,000 rpms durante 2 minutos a 4°C. Los sobrenadantes se transfirieron al nuevo tubo y se colocaron nuevamente sobre hielo. Alícuotas de cada extracto se removieron para el ensayo GLISA y para determinaciones de proteína. Todas las concentraciones de proteína estuvieron dentro del 10%, y los extractos se utilizaron en las concentraciones logradas (igual a 15 µg de proteína total por cavidad) . El ensayo GLISA se realizó utilizando los reactivos suministrados en el equipo.

Los resultados para las células endoteliales retínales del pasaje 12 se presentan en la Tabla 11 enseguida. Como es esperado, los niveles de Rho A activos inducidos por trombina fueron muy altos. Todos los compuestos de prueba inhibieron la activación inducida por trombina de Rho A.

Los resultados para las células endoteliales retínales del pasaje 8 se presentan en la Tabla 12 enseguida. Como es esperado, los niveles de Rho activos inducidos por trombina fueron muy altos. Todos los compuestos de prueba inhibieron la activación inducida por trombina de Rho A.

TABLA 11 * Obtenido de Sigma.

TABLA 12 Ejemplo 15: Modelo Animal de Hipezpermeabilidad Vascular Conejos blancos de Nueva Zelanda recibieron 0.215 mg/kg de danazol oralmente dos veces por día durante 7 días. Los conejos luego se inyectaron una vez intravitrealmente con el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) para producir fuga vascular en la retina. Luego, 24 horas después, se inyectó fluoresceina sódica, y la fluorescencia de los ojos se midió utilizando un Fluorotron (Ocumetrics) (cinco mediciones promediadas).' Un conejo de control individual (placebo) tuvo 250 unidades de fluorescencia en la retina, indicando fuga vascular ahí. Un conejo tratado con danazol individual dio 16 unidades de fluorescencia, que representa una reducción de 94% en la fuga vascular causada por el danazol.

Ejemplo 16: Composiciones Farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas de la invención incluirán danazol y un segundo fármaco en cápsulas de gelatina para administración oral en las siguientes cantidades expuestas en la Tabla 13: Tabla 13 Los ingredientes no medicinales incluirán almidón de maíz, monohidrato de lactosa, estearato de magnesio, talco y dióxido de titanio.

E emplo 17 : Composiciones Farmacéuticas de Liberación Sostenida Las composiciones farmacéuticas de liberación sostenida de la invención que permiten la administración oral una vez al día incluirán danazol y un segundo fármaco en cápsulas de gelatina en las cantidades expuestas en la Tabla 13 anterior. El danazol y el segundo fármaco serán incorporados en liposomas multilaminares compuestos de polietilenglicol-12 (PEG-12) gliciril dioleato o PEG-12 gliceril dimiristato. Los liposomas compuestos de estos lipidos son compatibles con cápsulas de gelatina blanda y dura. Para métodos para hacer estas formulaciones de liberación sostenida, ver la solicitud de PCT WO 2002/087543. Ejemplo 8: Composiciones Farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas de liberación sostenida de la invención que permiten la administración oral una vez al día incluirán danazol y un segundo fármaco en cápsulas en las cantidades expuestas en la Tabla 14: Tabla 14 Gránulos de danazol y el segundo fármaco serán preparados e incorporados en cápsulas de gelatina dura. Otros ingredientes en los gránulos incluirán PEG 6000, Poloxamer 188 y etolosa HS 90. Para métodos para hacer estas formulaciones de liberación sostenida, ver la publicación de solicitud de patente No. 2008/0249076.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular en un animal, el método caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad de un compuesto de danazol efectiva para inhibir la hiperpermeabilidad vascular y una cantidad de un segundo fármaco efectiva para tratar la enfermedad o condición.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad o condición es diabetes.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad o condición es aterosclerosis .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad o condición es hipertensión.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad o condición es una lesión de pulmón aguda, síndrome de angustia respiratoria aguda, degeneración macular relacionada con la edad, edema cerebral, edema coroidal, coroiditis, enfermedad microvascular coronaria, enfermedad microvascular cerebral, enfermedad de Eals, edema causado por lesión, edema causado por hipertensión, fuga vascular glomerular, choque hemorrágico, síndrome de Irvine Gass, isquemia, edema macular, nefritis, nefropatias, edema nefrótico, síndrome nefrótico, neuropatía, falla de órgano debido a edema, pre-eclampsia, edema pulmonar, hipertensión pulmonar, falla renal, edema retinal, hemorragia retinal, oclusión de vena retinal, retinitis, retinopatía, infarto cerebral silencioso, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, glomerulopatía de trasplante, uveítis, síndrome de fuga vascular, hemorragia vitrea o enfermedad de Von Hippie Lindau.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la enfermedad o condición es un edema macular .

7. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la enfermedad o condición es una neuropatía.

8. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la enfermedad o condición es una retinopatía .

• 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad o condición es una complicación vascular de diabetes.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la complicación vascular es edema, acumulación de lipoproteínas de baja densidad en el espacio subendotelial, aterosclerosis acelerada, envejecimiento acelerado de paredes del vaso en el cerebro, edema miocardiaco, fibrosis miocardiaca, disfunción diastólica, cardiomiopatia diabética, retardo de desarrollo de pulmón en los fetos de madres diabéticas, alteraciones de uno o más parámetros fisiológicos pulmonares, susceptibilidad incrementada a infecciones, hiperplasia vascular en el mesenterio, neuropatía diabética, edema macular, diabético, retinopatía diabética, nefropatía diabética o enrojecimiento, descoloración, sequedad y ulceraciones de la piel.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la complicación vascular es edema. ·

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque ¦ la complicación vascular es cardiomiopatía diabética.

13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la complicación vascular es neuropatía diabética.

14. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la complicación vascular es edema macular diabético.

15. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la complicación vascular es retinopatía diabética.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la retinopatía diabética es retinopatía diabética no proliferativa .

17. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la complicación vascular es nefropatia diabética.

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque el compuesto de danazol es danazol.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el compuesto de danazol se administra oralmente.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque el animal es un humano .

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque de 1 ng a 100 mg del compuesto de danazol se administra por día.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque de 1 mg a 100 mg del compuesto de danazol se administra por dia.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque de 10 mg a 90 mg del compuesto de danazol se administra por dia.

24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo fármaco es un fármaco efectivo para inhibir la hiperpermeabilidad vascular.

25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad o condición también involucra angiogénesis, y el segundo fármaco es uno que inhibe la angiogénesis.

26. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo fármaco es un fármaco efectivo para inhibir el factor de crecimiento endotelial vascular.

27. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo fármaco es una antihistamina .

28. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo fármaco es un fármaco que disminuye el nivel de glucosa.

29. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo fármaco es un inhibidor de enzima que convierte angiotensina (ACE) o un antagonista de receptor de ACE.

30. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo fármaco es un fármaco anti-inflamatorio .

31. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo fármaco es un antioxidante.

32. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo fármaco es una estatina.

33. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo fármaco es esfingosina-1 fosfato (S1P) o un agonista de S1P.

34. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo fármaco es un inhibidor de una enzima que degrada un glicocáliz.

35. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable, un primer fármaco y un segundo fármaco, en donde el primer fármaco es un compuesto de danazol y el segundo fármaco es un fármaco adecuado para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular.

36. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el segundo fármaco es uno que inhibe la hiperpermeabilidad vascular.

37. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el segundo fármaco es uno que inhibe el factor de crecimiento endotelial vascular.

38. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el segundo fármaco es una antihistamina .

39. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el segundo fármaco es un fármaco que disminuye el nivel de glucosa.

40. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el segundo fármaco es un inhibidor de enzima que convierte angiotensina (ACE) o un antagonista de receptor de ACE.

41. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el segundo fármaco es un fármaco antiinflamatorio.

42. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el segundo fármaco es un antioxidante.

43. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el segundo fármaco es una estatina.

44. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el segundo fármaco es esfingosina-1 fosfato (S1P) o un agonista de S1P.

45. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el segundo fármaco es un inhibidor de una enzima que degrada un glicocáliz.

46. Un equipo, caracterizado porque comprende un primer recipiente y un segundo recipiente, en donde el primer recipiente comprende un compuesto de danazol y el segundo recipiente comprende un fármaco adecuado para tratar una enfermedad o condición mediada por hiperpermeabilidad vascular .

47. El equipo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fármaco en el segundo recipiente es uno que inhibe la hiperpermeabilidad vascular

48. El equipo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fármaco en el segundo recipiente es uno que inhibe el factor de' crecimiento endotelial vascular .

49. El equipo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fármaco en el segundo recipiente es una antihistamina .

50. El equipo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fármaco en el segundo recipiente es un fármaco que disminuye el nivel de glucosa.

51. El equipo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fármaco en el segundo recipiente es un inhibidor de enzima que convierte angiotensina (ACE) o un antagonista de receptor de ACE.

52. El equipo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fármaco en el segundo recipiente es un fármaco antiinflamatorio.

53. El equipo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fármaco en el segundo recipiente es un antioxidante.

54. El equipo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fármaco en< el segundo recipiente es una estatina.

55. El equipo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fármaco en el segundo recipiente es esfingosina-1 fosfato (S1P) o un agonista de S1P.

56. El equipo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fármaco en el segundo recipiente es un inhibidor de una enzima que degrada un glicocáliz.

57. Un método para inhibir la hiperpermeabilidad vascular en un animal que es un efecto secundario causado por un fármaco administrado al animal o mediante un tratamiento del animal, el método caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad de un compuesto de danazol efectiva para inhibir la hiperpermeabilidad vascular.

58. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable, un primer fármaco y un segundo fármaco, en donde el primer fármaco es un compuesto de danazol y el segundo fármaco es un fármaco que causa hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario .

59. Un equipo, caracterizado porque comprende un primer recipiente y un segundo recipiente, en donde el primer recipiente comprende un compuesto de danazol y el segundo recipiente comprende un fármaco que causa hiperpermeabilidad vascular como un efecto secundario.

60. Un método para modular el citoesqueleto de una célula endotelial en un animal, caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad de un compuesto de danazol y una cantidad de un segundo fármaco efectiva para modular el citoesqueleto.

61. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable, un primer fármaco y un segundo fármaco, el donde el primer fármaco es un compuesto de danazol y el segundo fármaco es un fármaco que modula el citoesqueleto de una célula endotelial.

62. Un equipo, caracterizado porque comprende un primer recipiente y un segundo recipiente, en donde el primer recipiente comprende un compuesto de danazol y el segundo recipiente comprende un fármaco que modula el citoesqueleto de una célula endotelial.