MX2011005289A

MX2011005289A - Metodos y composiciones para union y cultivo celular sobre sustratos planares.

Info

Publication number: MX2011005289A
Application number: MX2011005289A
Authority: MX
Inventors: Benjamin Fryer; Ya Xiong Chen
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Priority date: 2008-11-20
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2011-06-01
Also published as: HK1162191A1; CA2744227C; US20180258387A1; AU2016206314A1; ES2584053T3; JP2012509086A; US9969973B2; JP5719305B2; KR20110089426A; CN102257132A; BRPI0921996A2; KR101687344B1; WO2010059778A1; RU2547925C2; RU2011124902A; AU2009316583B2; PL2366022T3; CN102257132B; CA2744227A1; EP2366022B1

Abstract

La presente invención está dirigida a métodos para el crecimiento, expansión y diferenciación de células madre pluripotentes en sustratos planares que carecen de una capa de adsorción y de una capa de células alimentadoras.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA UNIÓN Y CULTIVO CELULAR SOBRE SUSTRATOS PLANARES La presente invención reivindica la prioridad a la solicitud serie número 61/116,452, presentada el 20 de noviembre de 2008.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a métodos para el crecimiento, expansión y diferenciación de células madre pluripotentes sobre sustratos planares que carecen de una capa de adsorción y de una capa de células alimentadoras.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cultivo de células de mamíferos es uno de los muchos procesos en las ciencias de la vida y de la salud. Los recipientes para el cultivo y análisis de células de mamíferos que involucran células dependientes de anclaje, son frecuentemente hechos de vidrio o de un polímero, tal como, por ejemplo, poliestireno, el cual frecuentemente requiere tratamiento adicional de la superficie para permitir que las células se adhieran a la superficie del recipiente. Tales tratamientos pueden incluir la aplicación de una capa de adsorción en la superficie, por ejemplo, mediante técnicas de adsorción, injerto o polimerización de plasma. Alternativamente, el tratamiento de la superficie puede ser a través de la modificación química de la superficie del recipiente en sí, lo que puede lograrse, por ejemplo, mediante corona atmosférica, radiofrecuencia de plasma al vacío, descarga luminosa DC y tratamientos con plasma de microondas.

Los métodos actuales de cultivo de células madre pluripotentes, particularmente, células madre embrionarias (ES) requieren condiciones de cultivo complejas, tales como, por ejemplo, cultivar las células madre embrionarias sobre una superficie de sustrato sólido con una capa de células alimentadoras o sobre una superficie de sustrato sólido con un capa de adsorción de proteína de la matriz extracelular. Los sistemas de cultivo que emplean estos métodos frecuentemente usan las células alimentadoras o las proteínas de la matriz extracelular obtenidas a partir de una especie diferente a la de las células madre que se cultivan (material xenogénico). Los medios obtenidos por exposición a las células alimentadoras, es decir, los medios condicionados por células diferentes de las células ES indiferenciadas, se pueden usar para cultivar las células ES y los medios se pueden suplementar con suero de animales.

Por ejemplo, Reubinoff y oíros; (Nature Biotechnol. 8:399-404, 2000) y Thompson y otros; (Science 282:1145-1147, 1998) describen el cultivo de líneas celulares ES a partir de blastocistos humanos con el uso de una capa de células alimentadoras de fibroblastos de embrión de ratón.

En otro ejemplo, Xu y otros; (Nature Biotechnology 19: 971-974, 2001) describen el uso de MATRIGEL® y laminina para tratar superficies de sustratos sólidos antes del cultivo libre de células alimentadoras de células madre embrionarias humanas sin diferenciación. En otro ejemplo, Vallier y otros; (J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005) describen el uso de suero fetal bovino para tratar superficies de sustratos sólidos antes del cultivo libre de células alimentadoras de células madre embrionarias humanas sin diferenciación.

En otro ejemplo, la patente núm. WO2005014799 describe el medio acondicionado para el mantenimiento, proliferación y diferenciación de células de mamíferos. La patente núm. WO2005014799 indica que: "El medio de cultivo producido de conformidad con la presente invención se acondiciona por la actividad de secreción celular de las células murinas, particularmente, la de los hepatocitos transgénicos diferenciados e inmortalizados, denominados MMH (hepatocito Met murino)." En otro ejemplo, Wanatabe y otros; (Nature Biotechnol. 35:681-686, 2007) indican que "un inhibidor de ROCK permite la supervivencia de células madre embrionarias humanas disociadas" y demuestra una reducción en la apoptosis inducida por disociación, incrementa la eficiencia de la clonación (de aproximadamente 1 % a aproximadamente 27 %) y facilita la subclonación después de la transferencia de genes, con el uso de fibroblastos embrionarios de ratón como células alimentadoras, colágeno y MATRIGEL® como proteína de la matriz extracelular y Y-27632 o Fasudil para la inhibición de ROCK. Por otra parte, las células madre embrionarias humanas disociadas, tratadas con Y-27632 fueron protegidas de la apoptosis en cultivo en suspensión libre de suero.

En otro ejemplo, Peerani y otros; (EMBO Journal 26:4744-4755, 2007) indican que "la complejidad en la organización espacial de los cultivos de células madre embrionarias humanas (hESC) crea microambientes heterogéneos (nichos) que influyen en el destino de las hESC. Este estudio demuestra que la velocidad y la trayectoria de la diferenciación de las hESC pueden ser controlados por la manipulación de las propiedades del nicho de las hESC. El tamaño y la composición del nicho regulan el balance entre los factores que inducen e inhiben la diferenciación. De forma mecánica, un gradiente de señalización de Smadl espacial dependiente del tamaño del nicho se genera como resultado de las interacciones antagónicas entre las hESC y el endodermo extraembrionario derivado de las hESC (ExE). Estas interacciones son mediadas por la secreción localizada de la proteína morfogenética del hueso 2 (BMP2) por el ExE y su antagonista, el factor de diferenciación del crecimiento 3 (GDF3) por las EShCs. Los micropatrones de las hESC tratados con pequeñas interferencias (si) de RNA contra GDF3, BMP2 y Smadl , así como los tratamientos con un inhibidor asociado a Rho quinasa (ROCK) demostraron que el control independiente de la activación de Smadl puede rescatar la diferenciación dependiente del tamaño de la colonia de las hESC. Nuestros resultados ilustran, por primera vez, un papel para Smadl en la integración de la información espacial y en el control dependiente del tamaño del nicho de la autorrenovación y diferenciación de las hESC." En otro ejemplo, Koyanagi, M. y otros; (J Neurosci Res. 2008 Feb 1 ; 86(2): 270-80) indican que "la Rho-GTPasa se ha implicado en la apoptosis de muchos tipos celulares, que incluyen neuronas, pero el mecanismo por el cual actúa aún no se entiende completamente. A continuación se investigan los roles que juegan Rho y ROCK en la apoptosis durante el trasplante de células madre embrionarias derivadas de células precursoras neurales. Encontramos que la disociación de los precursores neurales activa a Rho e induce la apoptosis. El tratamiento con el inhibidor de Rho exoenzima C3 y/o el inhibidor de ROCK Y-27632 disminuye la cantidad de apoptosis inducida por disociación (anoiquis) en 20-30 %. La formación de ampollas en la membrana, que es un signo morfológico prematuro de apoptosis, el clivaje de caspasa-3 y la liberación de citocromo C de la mitocondria también se reducen mediante la inhibición de ROCK. Estos resultados sugieren que la disociación de las células precursoras neurales provoca una vía intrínseca de muerte celular que es al menos parcialmente, mediada a través de la vía Rho/ROCK. Por otra parte, en un modelo animal de trasplante, la inhibición de Rho y/o ROCK suprime la apoptosis aguda de las células trasplantadas. Después del trasplante, el factor alfa de necrosis tumoral y el pro-factor de crecimiento neural se expresan fuertemente alrededor del trasplante. La inhibición de ROCK también inhibe la apoptosis incrementada por estas citocinas inflamatorias. En conjunto, estos resultados indican que la inhibición de la señalización de Rho/ROCK puede mejorar la supervivencia de las células trasplantadas en la terapia de reemplazo celular." El uso de material xenogénico puede no ser adecuado para ciertas aplicaciones que usan células madre pluripotentes. Se pueden usar materiales alternativos. Por ejemplo, Stojkovic y otros. (Stem Cells 23:895- 902, 2005) describen el uso de suero humano para el tratamiento de superficies de sustratos sólidos antes del cultivo libre de células alimentadoras de células madre embrionarias humanas sin diferenciación.

Un sistema de cultivo alternativo emplea un medio libre de suero complementado con factores de crecimiento, capaz de promover la proliferación de células madre embrionarias.

Por ejemplo, Cheon y otros. (BioReprod DOMO.1095/biolreprod.105.046870; 19 octubre de 2005) describen un sistema de cultivo libre de células alimentadoras, libre de suero, en el que las células ES se mantienen en un medio de reemplazo con suero no acondicionado suplementado con diferentes factores de crecimiento capaces de activar la auto-renovación de las células ES.

En otro ejemplo, Levenstein y otros. (Stem Cells 24:568-574, 2006) describen métodos para el cultivo a largo plazo de células madre embrionarias humanas en ausencia de fibroblastos o medio acondicionado, por medio del uso de medios suplementados con factor de crecimiento fibroblástico básico (FCF).

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 20050148070 describe un método para cultivar células madre embrionarias humanas en medios definidos sin suero ni células alimentadoras de fibroblastos; el método comprende: cultivar las células madre en un medio de cultivo que contiene albúmina, aminoácidos, vitaminas, minerales, por lo menos una transferrina o sustituto de transferrina, por lo menos una insulina o sustituto de insulina; el medio de cultivo se encuentra esencialmente libre de suero fetal de mamíferos y contiene por lo menos aproximadamente 100 ng/ml de un FCF con la capacidad de activar un receptor de señalización de FCF, en donde el factor de crecimiento se suministra de una fuente aparte de únicamente una capa alimentadora de fibroblastos, el medio soporta la proliferación de células madre en un estado indiferenciado sin células alimentadoras ni un medio acondicionado.

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 20050233446 describe un medio definido útil para cultivar células madre, incluso células madre primordiales de primate indiferenciadas. En solución, el medio es sustancialmente isotónico en comparación con las células madre que se cultivan. En un medio de cultivo dado, el medio particular comprende un medio base y una cantidad de cada FCF básico, insulina y ácido ascórbico necesarios para sustentar sustancialmente el crecimiento indiferenciado de las células madre primordiales.

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 6800480 indica: "En una modalidad, se proporciona un medio de cultivo celular para el cultivo de células madre primordiales derivadas de primates en un estado sustancialmente indiferenciado, el cual incluye un medio básico de baja presión osmótica y bajo en endotoxinas que es eficaz para sustentar el crecimiento de las células madre primordiales derivadas de primates. El medio básico se combina con un suero nutriente eficaz para sustentar el crecimiento de las células madre primordiales derivadas de primates y un sustrato seleccionado del grupo que consiste de células alimentadoras y un componente de la matriz extracelular derivado de las células alimentadoras. El medio además incluye aminoácidos no esenciales, un antioxidante y un primer factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste de nucleósidos y una sal de piruvato." En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 20050244962 indica: "En un aspecto, la invención proporciona un método para cultivar células madre de embriones de primates. Se cultivan las células madre en un cultivo esencialmente libre de suero fetal de mamífero (preferentemente también esencialmente libre de cualquier suero animal) y en presencia del factor de crecimiento de fibroblastos que se suministra desde una fuente diferente de solo una capa alimentadora de fibroblastos. En una forma preferida, la capa alimentadora de fibroblastos, previamente requerida para mantener un cultivo de células madre, es innecesaria por la adición de suficiente factor de crecimiento fibroblástico." En otro ejemplo, la patente núm. WO2005065354 describe un medio de cultivo isotónico definido esencialmente libre de alimentador y libre de suero; el medio de cultivo comprende: a. un medio basal; b. una cantidad de factor de crecimiento de fibroblastos básico suficiente para sustentar el crecimiento de células madre de mamífero sustancialmente indiferenciadas; c. una cantidad de insulina suficiente para sustentar el crecimiento de células madre de mamífero sustancialmente indiferenciadas y d. una cantidad de ácido ascórbico suficiente para sustentar el crecimiento de células madre de mamífero sustancialmente indiferenciadas.

En otro ejemplo, la patente núm. WO2005086845 describe un método para el mantenimiento de una célula madre indiferenciada, dicho método comprende la exposición de una célula madre a un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento transformante beta (TGF ), a un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento fibroblástico (FCF) o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la célula en un estado indiferenciado durante un período de tiempo suficiente para lograr un resultado deseado.

Las células madre pluripotentes proporcionan un recurso potencial para la investigación y el tamizaje de fármacos. En la actualidad, el cultivo a gran escala de líneas celulares ES humanas es problemático y proporciona retos importantes. Una posible solución a estos retos es el pasaje y cultivo de las células madre embrionarias humanas como células individuales. Las células individuales son más sensibles a las técnicas estándar de cultivo de tejidos, como, por ejemplo, conteo, transfección y similares.

Por ejemplo, Nicolás y otros; proporcionan un método para producir y expandir las líneas de células madre embrionarias humanas a partir de células individuales que se aislaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia después de ingeniería genética por vectores de lentivirus (Stem Cells Dev. 16:109-1 18, 2007).

En otro ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2005158852 describe un método "para mejorar el crecimiento y la supervivencia de células madre embrionarias humanas individuales. El método incluye la etapa de obtener una célula hES individual indiferenciada; mezclar la célula individual indiferenciada con una matriz extracelular para rodear la célula e inocular la mezcla en células alimentadoras con un medio con nutrientes en un ambiente de crecimiento".

En otro ejemplo, Sidhu y otros; (Stem Cells Dev. 15:61-69, 2006) describen el primer reporte de tres clones de células ES humanas, hES 3.1 , 3.2 y 3.3, derivadas de la línea progenitora hES3 por clasificación de preparaciones de células individuales mediante citometría de flujo.

Sin embargo, el pasaje y cultivo de células madre embrionarias humanas como células individuales conduce a anomalías genéticas y a la pérdida de la pluripotencialidad. Las condiciones de cultivo son importantes en el mantenimiento de la pluripotencialidad y la estabilidad genética. Generalmente, el pasaje de líneas celulares ES humanas se lleva a cabo manualmente o con agentes enzimáticos tales como colagenasa, liberasa o dispasa.

Por ejemplo, Draper y otros; indican la presencia de "cambios cariotípicos que involucran la adición del cromosoma 17q en tres líneas de células madre embrionarias humanas independientes en cinco ocasiones independientes." (Nature Biotechnol. 22:53-54, 2004).

En otro ejemplo, Buzzard y otros; indican "sólo hemos detectado un evento de cambio de cariotipo... los métodos de cultivo usados pueden haber sido relevantes en nuestros resultados, ya que nuestros métodos son característicamente diferentes de aquellos usados por la mayoría de los otros grupos. Típicamente, separamos las células madre embrionarias humanas después de 7 días mediante una primera disección de la colonia con el borde de una pipeta rota... No se incorporó métodos enzimáticos ni químicos de disociación de células a este método. Suponemos que ésto puede explicar la relativa capacidad de recuperación citogenética de las células hES (ES humanas) en nuestras manos." (Nature Biotechnol. 22:381-382, 2004).

En otro ejemplo, Mitalipova y otros; indican: "métodos de pasaje en masa... pueden perpetuar las poblaciones de células aneuploides después del pasaje extendido en cultivo, pero se pueden usar por períodos más cortos (hasta por lo menos 15 pasajes) sin comprometer los cariotipos... es posible mantener un cariotipo normal en las células hES bajo condiciones de propagación manual a largo plazo seguido por el pasaje en masa limitado en experimentos que requieren mayores cantidades de células hES que los métodos de pasaje manual, solos, pueden proporcionar". (Nature Biotechnol. 23:19-20, 2005).

En otro ejemplo, Heng y otros; indican "los resultados demostraron que el segundo protocolo (tripsinización con pipeteo suave) es mucho menos perjudicial para la viabilidad celular que el primer protocolo (tratamiento de colagenasa con raspado). Esto a su vez, se tradujo en mayores índices de supervivencia a la congelación-descongelación." (Bioquímica Biotecnología Aplicada 47:33-37, 2007).

En otro ejemplo, Hasegawa y otros; indican "hemos establecido sublíneas de hESC tolerantes a la disociación completa. Estas células exhiben una alta eficiencia de re-plaqueo y alta eficiencia de clonación y mantienen su capacidad de diferenciarse en las tres capas germinales." (Stem Cells 24:2649-2660, 2006).

En otro ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 61/030,544 proporciona métodos y composiciones para unión celular a, cultivo en y separación de una superficie de sustratos sólidos con aproximadamente por lo menos 0.9 % de nitrógeno a aproximadamente por lo menos 11 % de nitrógeno y de aproximadamente por lo menos 12 % de oxígeno a aproximadamente por lo menos 30 % de oxígeno y sin una capa de adsorción ni células alimentadoras. En una modalidad de la presente invención las células se tratan con un compuesto capaz de inhibir la actividad de Rho quinasa.

Existe una gran necesidad de métodos y composiciones para el cultivo de células, que incluyen células madre pluripotentes en ausencia de células alimentadoras y una capa de adsorción, mientras se mantiene la pluripotencialidad de las células. La presente invención proporciona métodos para el crecimiento, expansión y diferenciación de células madre pluripotentes en sustratos planares que carecen de una capa de adsorción y de una capa de células alimentadoras, en donde las células no requieren tratamiento con un compuesto con la capacidad de inhibir la actividad de la Rho quinasa para unirlas al sustrato planar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad la presente invención proporciona métodos para la unión, cultivo y diferenciación de células madre pluripotentes con un sustrato planar que contiene hasta aproximadamente 12 % de N, de por lo menos aproximadamente 12 % de O a por lo menos aproximadamente 55 % de O, un ángulo de contacto de aproximadamente 18 grados a aproximadamente 32 grados y sin una capa de adsorción ni una capa de células alimentadoras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1 E muestran el efecto del inhibidor de la Rho quinasa H-1 152 sobre la unión de la línea H1 de células madre embrionarias humanas a sustratos planares. Figura 1A: representa la unión celular a membranas de ésteres de celulosa mezclados (membrana núm. 2 en la Tabla 1). Figura 1B: representa la unión celular a membranas de nailon (membrana núm. 4 en la Tabla 1 ). Figura 1 C: representa la unión celular a membranas de acetato de celulosa (membrana núm. 5 en la Tabla 1 ). Figura 1 D: representa la unión celular a membranas de policarbonato (membrana núm. 7 en la Tabla 1). Figura 1 E: representa la unión celular a membranas de tereftalato de polietileno (membrana núm. 12 en la Tabla 1).

Figuras 2A-2C: muestran el efecto del inhibidor de la Rho quinasa Y-26732 sobre la unión de la línea H9 de células madre embrionarias humanas a la membrana de ésteres de celulosa mezclados (membrana núm. 1 en la Tabla 1). Figura 2A: representa la unión celular en un pocilio control. Figura 2B: representa la unión celular para células tratadas con 10 µ? de Y-26732. Figura 2C: representa la unión celular para células tratadas con 20 µ? de Y-26732.

Figura 3: muestra las curvas de proliferación de la línea H1 de células madre embrionarias humanas sobre una superficie recubierta con MATRIGEL® (línea continua) y sobre membranas de ésteres de celulosa mezclados (membrana núm. 1 en la Tabla 1 ) (línea punteada).

Figuras 4A-4B: muestran los cromosomas con banda G de células representativas de las células madre embrionarias humanas de la línea H1. Figura 4A: representa los cromosomas de una célula cultivada en una superficie recubierta con MATRIGEL® durante 10 pasajes. Figura 4B: representa los cromosomas de una célula cultivada en membranas de ésteres de celulosa mezclados (membrana núm. 1 en la Tabla 1) durante 10 pasajes.

Figuras 5A-5C: muestran el efecto del inhibidor de la Rho quinasa Y26732 sobre células de la línea H9 de células madre embrionarias humanas en la unión a las membranas de policarbonato (membrana núm. 7 en la Tabla 1). Figura 5A: representa la unión celular en un pocilio control. Figura 5B: representa la unión celular después del tratamiento con 10 µ? de Y-26732. Figura 5C: representa la unión celular después del tratamiento con 20 µ? de Y-26732.

Las Figuras 6A-6F muestran el efecto del inhibidor de la Rho quinasa H-1152 sobre la unión de células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas a membranas de policarbonato (membrana núm. 7 en la Tabla 1). Figura 6A: representa la unión celular en un pocilio control. Figura 6B: representa la unión celular cuando se agrega 0.03 µ de H-1152 al medio. Figura 6C: representa la unión celular cuando se agrega 0.1 µ? de H-1152 al medio. Figura 6D: representa la unión celular cuando se agrega 0.3 µ? de H-1152 al medio. Figura 6E: representa la unión celular cuando se agrega 1 µ? de H-1152 al medio. Figura 6F: representa la unión celular cuando se agrega 3 µ? de H-1 52 al medio.

Las Figuras 7A-7B muestran la separación de las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas de membranas de policarbonato (membrana núm. 9 en la Tabla 1) después de eliminar el inhibidor de la Rho quinasa H-1 152 del medio de cultivo celular. Figura 7A: representa la unión de las células cuando se mantuvo 3 µ? de H-1 152 en el medio de cultivo. Figura 7B: representa la separación de las células cuando se eliminó el H- 152 del medio de cultivo.

Las Figuras 8A-8D muestran el efecto del tamaño de los poros de la membrana y del tratamiento con inhibidor de la Rho quinasa sobre la unión de la línea H1 de células madre embrionarias humanas a los sustratos planares que comprenden los siguientes: membrana de policarbonato núm. 10 en la Tabla 1 , figuras 8A y 8C y membrana de policarbonato núm. 11 en la Tabla 1 , figuras 8B y 8D). Figuras 8A y 8B): representan la unión de las células cuando se mantuvo 3 µ? de H-1 152 en el medio de cultivo. Figuras 8C y 8D: representan la separación de las células cuando se eliminó el H-1 52 del medio de cultivo.

La Figura 9 muestra el mantenimiento de la expresión de los marcadores relacionados con la pluripotencialidad en las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas cultivada en membranas de policarbonato (membrana núm. 8 en la Tabla 1) durante tres pasajes. La expresión de los genes indicada en la figura se determinó por PCR en tiempo real. Las barras sólidas representan los datos obtenidos de la línea H1 de células madre embrionarias humanas indiferenciadas. Las barras rayadas representan los datos obtenidos de las células cultivadas en las membranas de policarbonato.

La Figura 0 muestra la capacidad de las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas de formar cuerpos embrioides después de cultivo durante 12 pasajes en las membranas de policarbonato (membrana núm. 8 en la Tabla 1). La figura muestra los datos representativos de un experimento individual.

La Figura 11 muestra las micrografías electrónicas de escaneo de los sustratos planares de la presente invención.

Las Figuras 12A-12B muestran las micrografías electrónicas de escaneo del sustrato planar ULTRAWEB™.

La Figura 13 muestra el efecto del medio definido mTESR™ sobre la unión de las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas a varios sustratos planares.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para mayor claridad de la descripción y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, modalidades o aplicaciones de la presente invención.

Definiciones "Capa de adsorción", como se usa en la presente descripción, se refiere a una capa que se forma sobre una superficie de un sustrato sólido, por la fijación de moléculas a la superficie, ya sea por enlaces covalentes (también conocido como injerto) o no covalentes (también conocido como adsorción). Las moléculas que se usan en la fabricación de una capa de adsorción pueden, por ejemplo, ser moléculas proteínicas, las cuales pueden incluir, por ejemplo, proteínas de la matriz extracelular, aminoácidos y similares y moléculas no biológicas, tales como, por ejemplo, polietilenoimina.

"Linaje de células ß" se refiere a las células con expresión genética positiva para el factor de transcripción PDX-1 y por lo menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN3, NKX2.2, NKX6.1 , NEUROD, ISL1 , HNF-3 beta, MAFA, PAX4 o PAX6. Las células que expresan marcadores característicos del linaje de células ß incluyen células ß.

"Células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1 , Nodal, FGF8, braquiuria, proteína de homeosecuencia tipo mezcla, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 u OTX2. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo incluyen células precursoras de la línea primitiva, células de la línea primitiva, células mesendodérmicas y células endodérmicas definitivas.

"Células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: PDX1 , HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, NKX6.1 o HB9. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático incluyen células del endodermo pancreático, células del tubo intestinal primitivo y células del intestino posterior.

"Endodermo definitivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que portan las características de las células derivadas del epiblasto durante la gastrulación, las cuales forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo definitivo expresan los siguientes marcadores: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 y MIXL1.

"Célula endocrina pancreática" o "célula que expresa la hormona pancreática", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula con la capacidad de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipéptido pancreático.

"Endodermo extraembrionario", como se usa en la presente descripción, se refiere a una población de células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: SOX7, AFP o SPARC.

"Proteínas de la matriz extracelular" se refiere a las moléculas proteicas que normalmente se encuentran entre las células en el cuerpo o en la placenta. Las proteínas de la matriz extracelular pueden derivarse de los tejidos, fluidos corporales, tales como sangre o medios acondicionados por las células no recombinantes o por las células o bacterias recombinantes.

"Marcadores", como se usa en la presente descripción, son ácido nucleico o moléculas de polipéptidos que se expresan diferencialmente en la célula de interés. En este contexto, expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo. El nivel detectable del marcador de ácido nucleico o polipéptido es suficientemente más alto o más bajo en las células de interés en comparación con otras células, de modo que la célula de interés pueda identificarse y distinguirse de otras células por medio del uso de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

"Célula mesendodérmica", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa por lo menos uno de los siguientes marcadores: CD48, eomesodermina (EOMES), SOX-17, DKK4, HNF3 beta, GSC, FGF17 o GATA6.

"Célula que secreta hormona pancreática", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de secretar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipéptido pancreático.

La "célula de la línea preprimitiva", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa por lo menos uno de los siguientes marcadores: Nodal o FGF8.

"Célula de linea primitiva", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa por lo menos uno de los siguientes marcadores: braquiuria, proteína de homeosecuencia tipo mezcla o FGF4.

Las células madre son células indiferenciadas definidas por su capacidad a nivel de células únicas de autorrenovarse y diferenciarse para producir células progenitoras, que incluyen progenitoras que se autorrenuevan, progenitoras que no se renuevan y células diferenciadas de forma terminal. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos después de la inyección dentro de los blastocistos.

Las células madre se clasifican según su potencial de desarrollo como: (1) totipotencial, que significa ser capaz de originar todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotencial, que significa ser capaz de originar todos los tipos de células embrionarias; (3) multipotencial, que significa ser capaz de originar subconjuntos de linajes de células, pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular, (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir progenie que incluye HSC (autorrenovación), progenitores oligopotentes restringidos a glóbulos rojos y todos los tipos celulares y elementos (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) olígopotencial, que significa ser capaz de originar un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotenciales; y (5) unipotencial, que significa ser capaz de originar un único linaje celular (por ejemplo, células madre espermatogénicas).

La diferenciación es el proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada, adquiere las características de una célula especializada, tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula inducida a la diferenciación o diferenciada es una que toma una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometido", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha seguido la vía de la diferenciación hasta un punto en donde, bajo circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o subconjunto de tipos de células o revertir a un tipo de célula menos diferenciada. La desdiferenciación se refiere al proceso mediante el cual una célula revierte a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se usa en la presente descripción, el linaje de una célula define la herencia de una célula, es decir, de qué células proviene y qué células puede originar. El linaje de una célula posiciona a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico para el linaje se refiere a una característica específicamente asociada con el fenotipo de las células de un linaje de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida para linaje de interés.

"Superficie" como se usa en la presente descripción, se refiere a la capa más externa de las moléculas o de una matriz o recipiente de sustrato sólido destinado para usarse en el cultivo o análisis celular. La composición elemental, la rugosidad y la humectación de la superficie pueden analizarse por espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS), microscopía de fuerza atómica (AFM) y medición del ángulo de contacto, respectivamente.

Se usan varios términos para describir las células en cultivo. "Mantenimiento" se refiere generalmente a las células colocadas en un medio de crecimiento bajo condiciones que facilitan el crecimiento y/o la división celular que puede o no puede dar lugar a una población más grande de las células. "Pasaje" se refiere al proceso de remoción de las células a partir de un recipiente de cultivo y su colocación en un segundo recipiente de cultivo bajo condiciones que faciliten el crecimiento y/o la división celular.

Una población específica de células o una línea celular se refiere a o se caracteriza a veces por el número de veces que se separa. Por ejemplo, una población celular cultivada que se ha multiplicado diez veces se puede denominar como un cultivo P10. El cultivo primario, es decir, el primer cultivo después del aislamiento de células del tejido, se designa PO. Después del primer subcultivo, las células se describen como un cultivo secundario (S1 o pasaje 1). Después del segundo subcultivo, las células se convierten en un cultivo terciario (S2 o pasaje 2) y así sucesivamente. Los expertos en la materia entenderán que puede haber varias duplicaciones de las poblaciones durante el período de pasajes; por lo tanto, el número de duplicaciones de las poblaciones de un cultivo es mayor que el número de pasajes. La expansión celular (es decir, el número de duplicaciones de las poblaciones) durante el período entre pasajes depende de varios factores, que incluyen, pero no se limitan a, la densidad de siembra, el sustrato, el medio, las condiciones de crecimiento y el tiempo entre pasajes.

Sustratos planares de la presente invención Los sustratos planares adecuados para usar en la presente invención pueden estar comprendidos de cualquier material que tenga la capacidad de proporcionar un soporte al que se pueden unir las células pluripotentes. Por ejemplo, el sustrato planar puede estar comprendido de policarbonato. Alternativamente, el sustrato planar puede estar comprendido de tereftalato de polietileno (PETE). Alternativamente, el sustrato planar puede estar comprendido de nailon. Alternativamente, el sustrato planar puede estar comprendido de acetato de celulosa. Alternativamente, el sustrato planar puede estar comprendido de un éster mezclado de celulosa. Los ejemplos de los sustratos planares adecuados para usar en la presente invención se pueden encontrar en la Tabla 1.

En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para la unión, cultivo y diferenciación de células madre pluripotentes con un sustrato planar que contiene hasta aproximadamente 12 % de N, de por lo menos aproximadamente 12 % de O a por lo menos aproximadamente 55 % de O, un ángulo de contacto de aproximadamente 18 grados a aproximadamente 32 grados y sin una capa de adsorción ni una capa de células alimentadoras. El sustrato planar que contiene de por lo menos aproximadamente 8 % de N a por lo menos aproximadamente 12 % de N y de por lo menos aproximadamente 12 % de O a por lo menos aproximadamente 55 % de O puede ser una superficie fibrosa rugosa o, alternativamente, una superficie lisa.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para unir células madre pluripotentes a un sustrato planar que contiene hasta aproximadamente 12 % de N, de por lo menos aproximadamente 12 % de O a por lo menos aproximadamente 55 % de O, un ángulo de contacto de aproximadamente 18 grados a aproximadamente 32 grados y que carece de una capa de adsorción y de una capa de células alimentadoras; el método comprende las etapas de: a. obtener una suspensión de células madre pluripotentes y b. agregar la suspensión de células al sustrato planar y permitir que las células se unan.

En una modalidad las células madre pluripotentes se mantienen en cultivo después de adherirse a la superficie. En una modalidad las células madre pluripotentes se diferencian en el sustrato planar después de adherirse a la superficie.

En una modalidad la unión de las células madre pluripotentes a un sustrato planar que contiene hasta aproximadamente 12 % de N, de por lo menos aproximadamente 12 % de O a por lo menos aproximadamente 55 % de O, un ángulo de contacto de aproximadamente 18 grados a aproximadamente 32 grados y que carece de una capa de adsorción y de una capa de células alimentadoras se intensifica al tratar las células con un compuesto con la capacidad de inhibir la actividad de la Rho quinasa. El compuesto con la capacidad de inhibir la actividad de la Rho quinasa se puede eliminar de las células después de haberse adherido.

El compuesto con la capacidad de inhibir la actividad de la Rho quinasa se selecciona del grupo que consiste de: Y-27632, Fasudil, H-1 152 e Hidroxifasudil.

En una modalidad, el compuesto con la capacidad de inhibir la actividad de la Rho quinasa se puede usar a una concentración de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 100 µ?. En una modalidad, el al menos un compuesto capaz de inhibir la actividad Rho quinasa se usa a una concentración de aproximadamente 10 µ?.

Caracterización de los sustratos planares de la presente invención En una modalidad, la composición elemental de la superficie de los sustratos planares de la presente invención se puede analizar por espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS). La XPS, también denominada espectroscopia de electrones para análisis químico (ESCA), se usa como método para determinar qué elementos o átomos están presentes en la superficie de un sustrato sólido (todos los elementos en concentraciones mayores que 0.1 por ciento atómico se pueden detectar, excepto el hidrógeno y el helio) y para determinar el medio de unión de tales elementos o átomos.

En una modalidad la rugosidad de la superficie de los sustratos planares de la presente invención se puede analizar por microscopía de fuerza atómica (AFM). Los átomos o moléculas de la superficie con una resolución lateral que desciende hasta 0.1 nm (1 A) y una resolución vertical que desciende hasta 0.01 nm (0.1 A) se pueden capturar en imágenes por AFM.

En una modalidad la humectabilidad de la superficie de los sustratos planares de la presente invención se puede analizar por la medición del ángulo de contacto. Por ejemplo, la medición del ángulo de contacto por el método estático de la gota sésil proporciona información sobre la interacción entre la superficie de un sustrato sólido y un líquido. El ángulo de contacto describe la forma de una gota de líquido en reposo sobre la superficie del sustrato sólido y es el ángulo de contacto del líquido en la superficie del sustrato sólido, medido dentro del líquido en la línea de contacto donde el líquido, el sólido y el gas se encuentran. Una superficie con un ángulo de contacto con el agua mayor de 90° se denomina hidrofóbica y una superficie con un ángulo de contacto con el agua menor de 90° se denomina hidrofílica. En superficies extremadamente hidrofílicas, es decir, superficies que tienen una alta afinidad por el agua, una gota de agua se diseminó completamente (un ángulo de contacto efectivo de 0o).

En una modalidad la densidad de carga negativa de la superficie de los sustratos planares de la presente invención se puede analizar por la medición de la reactividad de la superficie con violeta cristal. El violeta cristal porta una carga positiva, la cual le permite enlazarse a las moléculas cargadas negativamente y a partes de las moléculas, por ejemplo, grupos funcionales cargados negativamente presentes en una superficie polimérica. Una superficie con una alta reactividad para el violeta cristal tiene una mayor densidad de cargas negativas que una superficie con una reactividad baja al violeta cristal, dado que las superficies tienen la misma aspereza y, por lo tanto el área.

Células madres pluripotentes Caracterización de las células madre pluripotentes Las células madre pluripotentes pueden expresar uno o más antígenos embrionarios específicos de etapa (SSEA) 3 y 4 y los marcadores detectables por medio del uso de los anticuerpos designados Tra-1-60 y Tra-1 -81 (Thomson y otros; Science 282: 1145, 1998). La diferenciación de las células madre pluripotentes in vitro produce la pérdida de la expresión de SSEA-4, Tra- 1-60 y Tra-1 -8 e incrementa la expresión de SSEA-1. Las células madre pluripotentes no diferenciadas tienen, típicamente, actividad de la fosfatasa alcalina, que se puede detectar por la fijación de las células con paraformaldehído al 4 % y después desarrollándoselas con el Vector rojo como sustrato, según lo describe el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calif.) Las células madre pluripotentes no diferenciadas también expresan típicamente Oct-4 y TERT, según se detectó por RT-PCR.

Otro fenotipo deseable de células madre pluripotentes propagadas es un potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejidos de endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencialidad de las células madre se puede confirmar, por ejemplo, por la inyección de células en ratones (SCID) inmunodeficientes combinados severos, al fijar los teratomas que se forman por medio del uso de 4 % de paraformaldehído y después examinándolos histológicamente para la evidencia de los tipos de células provenientes de las tres capas germinales. Alternativamente, la pluripotencialidad se puede determinar por la creación de cuerpos embrioides y el análisis los cuerpos embrioides para la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.

Las líneas de células madre pluripotentes propagadas se pueden cariotipar por medio del uso de una técnica estándar de bandas G y por la comparación con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable la obtención de células que tengan un "cariotipo normal", lo cual significa que las células son euploides, en donde todos los cromosomas humanos están presentes y no notablemente alterados.

Fuentes de las células madre pluripotentes Los tipos de células madre pluripotentes que se pueden usar incluyen las líneas establecidas de células pluripotentes derivadas del tejido formado después de la gestación, que incluye tejido preembrionario (tal como, por ejemplo, un blastocisto), tejido embrionario o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, típicamente, pero no necesariamente antes de aproximadamente 10 a 12 semanas de gestación. Ejemplos no limitantes son las líneas de células madre embrionarias humanas establecidas o células de germen embrionario humano, tales como, por ejemplo, las líneas H1, H7 y H9 de células madre embrionarias humanas (WiCell). También se contempla el uso de las composiciones de esta descripción durante el establecimiento inicial o la estabilización de estas células, en cuyo caso la fuente primaria de las células serían las células pluripotentes primarias tomadas directamente a partir de los tejidos fuente. También adecuadas son las células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivada, en ausencia de células alimentadoras.

También son adecuadas las líneas de células madre embrionarias humanas mutantes, tales como, por ejemplo, BG01v (BresaGen, Athens, GA). También son adecuados las células madre pluripotentes derivadas de células no pluripotentes, tales como, por ejemplo, una célula somática adulta.

En una modalidad, las células madre embrionarias humanas se preparan como se describen en Thomson y otros (patente de los Estados Unidos, núm. 5.843.780; Science 282:1 145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff., 1998; Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 92:7844, 1995).

Cultivo de células madre pluripotentes En una modalidad las células madre pluripotentes se cultivan en una capa de células alimentadoras o de proteínas de la matriz extracelular que soportan las células madre pluripotentes en varias formas, antes del cultivo de acuerdo con los métodos de la presente invención. Por ejemplo, las células madre pluripotentes se cultivan en una capa de células alimentadoras que soporta la proliferación de las células madre pluripotentes, sin sufrir diferenciación sustancial. El crecimiento de las células madre pluripotentes en una capa de células alimentadoras sin diferenciación se suplementa con (i) obtener un recipiente de cultivo que contiene una capa de células alimentadoras y (ii) un medio acondicionado mediante el cultivo previo con otro tipo celular o un medio no acondicionado, por ejemplo, libre de suero o incluso químicamente definido.

En otro ejemplo, las células madre pluripotentes se cultivan en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras, pero sin embargo soporta la proliferación de las células madre pluripotentes, sin sufrir diferenciación sustancial. El crecimiento de las células madre pluripotentes en un cultivo libre de células alimentadoras sin diferenciación se suplementa con (i) una capa de adsorción sobre una superficie de sustratos sólidos con una o más proteínas de la matriz extracelular y (ii) un medio acondicionado con el cultivo previo con otro tipo celular o un medio no acondicionado, por ejemplo, libre de suero o incluso químicamente definido.

En una modalidad alternativa las células madre pluripotentes se cultivan sobre una superficie planar que comprende un éster mezclado de celulosa en un medio acondicionado por el cultivo previo con otro tipo celular o un medio no acondicionado, por ejemplo, libre de suero o incluso químicamente definido.

Medio de cultivo: un ejemplo de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se puede encontrar en la patente de los Estados Unidos núm. 20020072117. Otro ejemplo de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se puede encontrar en la patente de los Estados Unidos núm. 6642048. Otro ejemplo de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se puede encontrar en la patente núm. WO2005014799. Otro ejemplo de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se puede encontrar en Xu y otros; (Stem Cells 22: 972-980, 2004). Otro ejemplo de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se puede encontrar en la patente de los Estados Unidos núm. 20070010011. Otros ejemplos de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se pueden encontrar en Cheon y otros; (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870; 19 de octubre de 2005). Otro ejemplo de medio de cultivo adecuado para su uso en la presente invención se puede encontrar en Levenstein y otros. (Stem Cells 24: 568-574, 2006). Otro ejemplo de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se puede encontrar en la patente de los Estados Unidos núm. 20050148070. Otro ejemplo de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se puede encontrar en la patente de los Estados Unidos núm. 20050233446. Otro ejemplo de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se puede encontrar en la patente de los Estados Unidos núm. 6800480. Otro ejemplo de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se puede encontrar en la patente de los Estados Unidos núm. 20050244962. Otro ejemplo de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se puede encontrar en la patente núm. WO2005065354. Otro ejemplo de los medios de cultivo celular adecuados para usar en la presente invención se puede encontrar en la patente núm. WO2005086845.

También se pueden hacer medios de cultivo adecuados a partir de los siguientes componentes, tales como, por ejemplo, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Gibco núm. 1 1965-092; medio Eagle modificado de Dulbecco Knockout (DMEM KO), Gibco núm. 10829-018 ; 50 % medio basal DMEM F12 de Ham, 200 mM de L-glutamina, Gibco núm. 15039-027; solución de aminoácidos no esenciales, Gibco 11 140-050; ß- mercaptoetanol, Sigma núm. M7522; factor de crecimiento fibroblástico básico recombinante humano (bFGF), Gibco núm. 13256-029.

Diferenciación de las células madre pluripotentes En una modalidad de la presente invención, las células madre pluripotentes se propagan en el cultivo, mientras mantienen su pluripotencialidad. Los cambios en la pluripotencialidad de las células con el tiempo se pueden determinar por la detección de cambios en los niveles de expresión de los marcadores asociados a la pluripotencialidad. Alternativamente, los cambios en la pluripotencialidad se pueden controlar por la detección de cambios en los niveles de expresión de los marcadores asociados a la diferenciación o los marcadores asociados con otro tipo de células.

En una modalidad alternativa, las células madre pluripotentes se propagan en el cultivo y después se tratan de manera tal que se promueva su diferenciación en otro tipo de células. El otro tipo de célula puede ser una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo. Alternativamente, el tipo de célula puede ser una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático. Alternativamente, el tipo de célula puede ser una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. Alternativamente, el tipo de célula puede ser una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß.

Las células madre pluripotentes tratadas de conformidad con los métodos de la presente invención pueden diferenciarse en una variedad de otros tipos de células por cualquier método apropiado en la materia.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes tratadas de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden diferenciarse en células neurales, células cardiacas, hepatocitos y similares.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes tratadas de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden diferenciarse en progenitores neuronales y cardiomiocitos de acuerdo con los métodos descritos en la patente núm. WO2007030870.

En otro ejemplo, las células madre pluripotentes tratadas de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden diferenciarse en hepatocitos de acuerdo con los métodos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6,458.589.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros; Nature Biotechnol. 23: 1534-1541 , 2005.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en Shinozaki y otros; Development 131 :1651-1662, 2004.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo, de acuerdo con los métodos descritos en McLean y otros; Stem Cells 25:29-38, 2007.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros; Nature Biotechnol. 24:1392-1401 , 2006.

Los marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo se seleccionan del grupo que consiste de SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1 , Nodal, FGF8, braquiuria, proteína de homeosecuencia tipo mezcla, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 y OTX2. Para el uso en la presente invención es apropiada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula precursora de la línea primitiva. En un aspecto alternativo una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula mesendodérmica. En un aspecto alternativo una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula del endodermo definitivo.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros; Nature Biotechnol. 24: 1392-1401 , 2006.

Los marcadores característicos del linaje de endodermo pancreático se seleccionan del grupo que consiste de PDX1 , HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HB9 y PR0X1. Para el uso en la presente invención es apropiada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático es una célula del endodermo pancreático.

Las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por cualquier método en la materia.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros; Nature Biotechnol. 24: 1392-1401 , 2006.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, por los métodos descritos en D'Amour y otros; Nature Biotechnol. 24: 1392-1401 , 2006.

Los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo que consiste de NGN3, NEUROD, ISL1 , PDX1 , NKX6.1 , PAX4, NGN3 y PTF-1 alfa. En una modalidad, una célula endocrina pancreática es capaz de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipéptido pancreático. Para el uso de la invención es adecuada una célula que expresa al menos uno de los marcadores características del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una célula pancreática que expresa hormonas. Alternativamente, la célula endocrina pancreática puede ser una célula pancreática secretora de hormonas.

En un aspecto de la presente invención, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß expresa PDX1 y por lo menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN3, NKX2.2, NKX6.1 , NEUROD, ISL1 , HNF3 beta, MAFA, PAX4 y PAX6. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß es una célula ß.

La presente invención se ilustra, pero no está limitada a, los siguientes ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1. Unión de células madre embrionarias humanas a los sustratos planares de la presente invención.

Se ha demostrado que el inhibidor de la Rho quinasa Y26732 aumenta la unión de células madre embrionarias humanas a las placas de superficie modificada (véase la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 61/030,544). El propósito de los estudios de la presente invención fue determinar la capacidad de las células madre embrionarias humanas de unirse a otras superficies planares. Las superficies planares analizadas en la presente invención se muestran en la Tabla 1.

Antes del análisis, las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se expandieron en placas de cultivo de tejidos, recubiertas con una dilución de 1:30 de MATRIGEL® reducido por factor de crecimiento. Las células se sembraron en placas de cultivo de 100 mm en 10 mi de medio acondicionado con MEF suplementado con 20 ng/ml de bFGF (MEF-CM/bFGF). Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con C02. El medio se cambió diariamente por MEF-CM/bFGF fresco. Una vez que las células alcanzaron aproximadamente 80 % de confluencia, se separaron mediante tratamiento con 1 mg/ml de LIBERASE durante 5 minutos a 37 °C. La digestión se detuvo al eliminar la enzima de la placa y lavar las células con MEF-CM/bFGF. Las células se recolectaron mediante raspado manual en 10 mi de MEF-CM/bFGF y se transfirieron a un tubo cónico de 50 mi. Las células se centrifugaron a 200x g (1000 rpm) en una centrifugadora de mesa para formar una microesfera. Después de eliminar el sobrenadante, las células se resuspendieron en 40 mi de MEF-CM/bFGF y se distribuyeron homogéneamente en 4 placas de cultivo de 100 mm recubiertas con una dilución de 1:30 de MATRIGEL® reducido por factor de crecimiento.

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se sembraron en varios sustratos planares que se exponen en la Tabla 1, a una densidad de 100,000 células/ cm2. Los sustratos planares carecían de una capa de adsorción y de una capa de células alimentadoras de fibroblastos. Las células se cultivaron en MEF-CM/bFGF, tal como se describió anteriormente. Se determinó el efecto del inhibidor de la Rho quinasa H-1 152 en la unión de las células a los sustratos planares. Se agregó 3 µ? de H- 152 al medio usado para sembrar las células. Se permitió que las células se unieran durante 24 horas. Después de este tiempo, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después las células se tiñeron con hematoxilina al 1 % y el número de células se determinó mediante microscopía de luz. Los pocilios que contenían vehículo se incluyeron como un control.

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se unieron a las siguientes membranas en forma independiente del inhibidor de la Rho quinasa: membrana de ésteres mezclados de celulosa (membrana núm. 2, Figura 1A); membrana de nailon (membrana núm. 4, Figura 1 B) y membrana de acetato de celulosa (membrana núm. 5, Figura 1 C). La unión de las células a estas membranas se mejoró con la adición de 3 µ? de H-1 152 (véase las Figuras 1A-1C).

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas requirieron la presencia de 3 µ? de H-1 152 para unirse a los siguiente sustratos planares: membrana de policarbonato (membrana núm. 7, Figura 1 D) y membrana de tereftalato de polietileno (membrana núm. 12, Figura 1 E). La eliminación de H-1 152 del medio de cultivo ocasionó el desprendimiento de las células H1 de ambos tipos de membranas. No se observó unión a estas membranas en ausencia de H-1152.

Ejemplo 2: Efecto del tratamiento con Rho Cinasa en la unión de células madre embrionarias humanas a sustratos planares que comprenden ésteres mezclados de celulosa (membrana núm. 1 ).

Se cultivó células de la linea H9 de células madre embrionarias humanas en placas recubiertas con MATRIGEL® antes de la manipulación experimental. Las células se sembraron en una membrana de ésteres mezclados de celulosa (membrana núm. 1) a una densidad de 150,000 células/ cm2 en un medio acondicionado con EF. El sustrato planar carecía de una capa de adsorción y de una capa de células alimentadoras de fibroblastos. Se examinó el efecto del tratamiento con inhibidor de la Rho quinasa sobre la unión al sustrato planar. Las células se trataron con 0, 10 ó 20 µ? de Y26732. Después de 24 horas, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 %, se lavaron con PBS, se secaron con aire y se tiñeron con tinción violeta cristal. El número de células se determinó mediante microscopía de luz. Los pocilios que contenían vehículo se incluyeron como control.

Se observó que las células se unieron al sustrato planar en ausencia de Y26732 (Figura 2A). La adición de Y26732 aumentó la unión de las células al sustrato planar, a 10 y 20 µ? (Figuras 2B y 2C). La eliminación de Y26732 del medio de cultivo por 24 horas no causó el desprendimiento de las células del sustrato planar.

Ejemplo 3: Efecto del cultivo en la membrana núm. 1 de sustrato planar sobre la velocidad de proliferación de las células madre embrionarias humanas.

Se comparó la velocidad de proliferación de las células de la linea de células madre embrionarias humanas cultivadas en placas recubiertas con MATRIGEL® y de las células cultivadas en la membrana núm. 1. Las células se sembraron a densidades iguales en ambos sustratos. Las células se liberaron de los sustratos mediante el tratamiento con TrypLE para crear una suspensión de una sola célula para determinar el número de células. Las muestras de las células se recolectaron en los tiempos indicados en la Figura 3. Se observó que las células proliferaron a velocidades comparables. El tiempo de duplicación es de aproximadamente 1.151 días y 1.138 días en MATRIGEL® y en la membrana núm. 1 , respectivamente.

Ejemplo 4: Las células madre embrionarias humanas conservan su pluripotencialidad para tres pasajes en sustratos planares que comprenden ésteres mezclados de celulosa (membrana núm. 1).

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se sembraron en un sustrato planar que comprendía membranas de ésteres mezclados de celulosa (membrana núm. 1) a una densidad de 75,000 células/cm2 en MEF-CM que contenía 20 ng/ml de bFGF. Las células se cultivaron durante 5 ó 6 días antes del pasaje hasta alcanzar aproximadamente de 75 a 90 % de confluencia, de conformidad con los métodos descritos anteriormente. El medio de cultivo se cambió diariamente. Después de cultivarlas para 3 pasajes, las células se recolectaron y se determinó la expresión de los marcadores relacionados con la pluripotencialidad por medio de citometría de flujo. Tal como se muestra en la Tabla 2, más del 95 % de las células conservó la expresión de los marcadores de superficie celular relacionados con la pluripotencialidad, que incluyen Tra1-60, Tra1-81 , SSEA-3 y SSEA-4, lo cual indica que las células aún eran pluripotentes.

Ejemplo 5: Las células madre embrionarias humanas conservan un cariotipo estable por diez pasajes en los sustratos planares que comprenden ésteres mezclados de celulosa (membrana núm. 1 ).

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se cultivaron ya sea en placas de cultivo recubiertas con MATRIGEL® o en membranas de ésteres mezclados de celulosa por 10 pasajes. Las células se cultivaron de conformidad con los métodos descritos anteriormente. El cariotipo se determinó por medio del análisis citogenético de veinte células en metafase con bandas G. Tal como se muestra en las Figuras 4A y 4B, los cromosomas con banda G de una célula representativa cultivada en placas de cultivo recubiertas con MATRIGEL® (Figura 4A) y los de otra célula cultivada en una membrana mezclada de celulosa (Figura 4B) demuestran un cariotipo masculino normal.

El cariotipo también se determinó mediante el examen de doscientos núcleos en interfase con hibridación in situ con fluorescencia (FISH), con el uso de una sonda del cromosoma 12p y una sonda de 17q para identificar poblaciones muy pequeñas de células con cambios en el número de copias de los cromosomas 12 y 17 que no se pueden detectar con citogenética de rutina. No se detectó células anormales con trisomía 12 y/o 17 en las células cultivadas en MATRIGEL® y en membranas de esteres mezclados de celulosa.

Ejemplo 6: Las células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse en células productoras de insulina en los sustratos planares que comprenden esteres mezclados de celulosa (membrana núm. 1).

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se sembraron en un sustrato planar que comprende ésteres mezclados de celulosa (membrana núm. 1) a una densidad de 150,000 células/ cm2 en medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF. Las células se diferenciaron en células productoras de insulina al tratarlas de conformidad con el protocolo de diferenciación descrito en la Tabla 3. Las células se cultivaron en medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF durante 3 a 4 días hasta alcanzar aproximadamente 75 a 90 % de confluencia. Las células se trataron en medio DMEM-F12 que contenía albúmina sérica bovina al 2 % libre de ácidos grasos (FAF-BSA), 100 ng/ml de activina A y 20 ng/ml de Wnt3A durante dos días, seguido del tratamiento con medio DMEM-F 2, albúmina sérica bovina al 2 % libre de ácidos grasos (FAF-BSA) y 100 ng/ml de activina A durante dos días más. Después, las células se trataron en medio DMEM-F12 que contenía BSA al 2 %, 20 ng/ml de FGF7 y 250 nM de Ciclopamina-KAAD durante tres días, seguido del tratamiento en medio DMEM-F12 que contenia suplemento B27 al 1 %, 20 ng/ml de FGF7, 250 nM de Ciclopamina-KAAD, 2 µ? de ácido retinoico (AR) y 100 ng/ml de Noggin durante 4 días. Las células se trataron en medio DMEM-F12 que contenía suplemento B27 al 1 %, .1 µ? de ALK5 inhibidor 2 (Axxora cat. núm. ALX-270-445-M001 ), 100 ng/ml de Noggin, 100 ng/ml de Netrin-4, 50 ng/ml de Exendin-4 y 1 µ? de DAPT durante 3 días. Las células se cultivaron en medio DMEM-F12, suplemento B27 al 1 % y 1 µ? de ALK5 inhibidor 2 durante 7 días y en medio DMEM-F 2 que contenía suplemento B27 al 1 % durante 7 días más.

Al final del protocolo de diferenciación, se recolectó muestras de RNA para determinar la expresión de los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. Se observó un número de CT para la insulina de aproximadamente 17. El valor de CT correspondiente para GAPDH fue aproximadamente 19; estos datos sugieren que las células expresaron altos niveles de insulina después del tratamiento.

Ejemplo 7: Las células madre embrionarias humanas se unen a sustratos planares que comprenden membranas de policarbonato de una forma dependiente de un inhibidor de la Rho quinasa.

Las células de la línea H9 de células madre embrionarias humanas se sembraron en un sustrato planar que comprendía policarbonato (membrana núm. 7) a una densidad de 150,000 células/cm2 en medio acondicionado con MEF. Se examinó el efecto del tratamiento con inhibidor de la Rho quinasa en la unión, se agregó el inhibidor de la Rho quinasa Y26732 al medio de cultivo a una concentración de 0, 10 ó 20 µ?. Después de 24 horas, las células sobre la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente, se lavaron con PBS, se secaron con aire y se tiñeron con tinción violeta cristal. El número de células se determinó mediante microscopía de luz. Los pocilios que contenían vehículo se incluyeron como control.

Las células no se unen a la membrana en las placas control (Figura 5A). La adición de Y26732 produjo la unión de las células a las membranas (Figuras 5B y 5C).

En un experimento separado, se determinó el efecto del inhibidor de la Rho quinasa H-1152 en la unión de las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas a la membrana núm. 7. Las células se sembraron en un sustrato planar que comprendía membranas de policarbonato (membrana núm. 7) a una densidad de 150,000 células/cm2 en MEF-CM que contenía 20 ng/ml de bFGF. Se agregó el inhibidor de la Rho quinasa H-1 152 al medio de cultivo a una concentración de 0, 0.03, 0.1 , 0.3, 1 y 3 µ?. Después de 24 horas, las células sobre la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4 %, se lavaron con PBS, se secaron con aire y se tiñeron con tinción violeta cristal.

El número de células se determinó mediante microscopía de luz. Los pocilios que contenían vehículo se incluyeron como control.

Las células no se adhieren a la membrana en la placa control (Figura 6A) y en las placas con 0.03 ó 0.1 µ? de H-1152 (Figuras 6B y 6C).

Sin embargo, se observó unión en los cultivos tratados con 0.3, 1 y 3 µ? de H-1 152 (Figuras 6D-6F).

Ejemplo 8: La eliminación del inhibidor de la Rho quinasa del medio de cultivo causa el desprendimiento de las células madre embrionarias humanas de sustratos planares que comprenden membranas de policarbonato.

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se sembraron en un sustrato planar que comprendía policarbonato (membrana núm. 9) a una densidad de 100,000 células/ cm2, en medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF y 3 µ? del inhibidor de la Rho quinasa H-1152. Las células se cultivaron durante 24 horas. Después de ese tiempo, el medio de cultivo se reemplazó con medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF y que carecía de H-1 152. Después de 24 horas, las células sobre la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4 %, se lavaron con PBS, se secaron con aire y se tiñeron con tinción violeta cristal. El número de células se determinó mediante microscopía de luz. Los pocilios que contenían H-1152 se incluyeron como control. La eliminación de H-1152 del medio de cultivo causó el desprendimiento de células del sustrato planar (Figuras 7A y 7B).

Ejemplo 9: La porosidad del sustrato planar afecta la adherencia de las células madre embrionarias humanas.

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se sembraron en el pasaje 42 en los siguientes sustratos planares: membrana núm. 10 (tamaño de los poros 0.4 µ??) y membrana núm. 1 1 (tamaño de los poros 3 pm). Las células se sembraron a una densidad de 100,000 células/cm2, en medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF. También se examinó el efecto de la inhibición de la Rho quinasa en la unión de las células a los sustratos planares. El medio de cultivo celular se suplemento con. 3 µ? de H-1 152. Después de 24 horas, el medio de cultivo se reemplazó con medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF y que carecía de H-1 152. Después de otras 24 horas de cultivo, las células sobre la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4 %, se lavaron con PBS, se secaron con aire y se tiñeron con tinción violeta cristal. Los pocilios que contenían 1 µ? H-1 1 52 se incluyeron como control. El número de células se determinó mediante microscopía de luz. Los pocilios que contenían vehículo se incluyeron como control.

Un número mayor de células se unió a la membrana núm. 10 (Figura 8A) en comparación con la membrana núm. 1 1 (Figura 8B). Se necesitó la presencia de 1 µ? de H-1152 en el medio de cultivo para mantener la unión de las células H1 a las membranas (Figuras 8A y 8B). La eliminación de H-1152 del medio de cultivo causó el desprendimiento de las células de la membrana núm. 10 y la membrana núm. 1 1 (Figuras 8C y 8D).

Ejemplo 10: Las células madre embrionarias humanas conservan su pluripotencialidad después de múltiples pasajes en los sustratos planares que comprenden membranas de policarbonato.

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se sembraron en un sustrato planar que comprendía membrana de policarbonato (membrana núm. 8). Las células se cultivaron en medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF, suplementado con 3 µ? de H-1152. El medio de cultivo celular se cambió diariamente. Las células se separaron por medio de la eliminación de H-1152 del medio y las células se eliminaron del sustrato planar girándolas suavemente. Las células se cultivaron para 3 pasajes y se recolectaron para efectuar la citometría de flujo y el análisis RT-PCR cuantitativa. Tal como se muestra en la Tabla 4, más del 95 % de las células expresó marcadores de superficie celular relacionados con la pluripotencialidad, que incluyen Tra1-60, Tra1-81 , SSEA-3 y SSEA-4, tal como lo determinó la citometría de flujo. La Figura 9 muestra los resultados de RT-PCR cuantitativa, que indican que múltiples genes expresados en la H1 cultivada en las membranas de policarbonato durante 3 pasajes se encuentran en niveles comparables a los de las células H1 indiferenciadas.

En un estudio separado las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se sembraron en un sustrato planar que comprendía membrana de policarbonato (membrana núm: 8). Las células se cultivaron en medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF, suplementado con 1 µ? de H-1 152. El medio de cultivo celular se cambió diariamente. Las células se separaron por medio de la eliminación de H-1 152 del medio y las células se eliminaron del sustrato planar girándolas suavemente. Las células se cultivaron para 9 pasajes y se recolectaron para efectuar la citometría de flujo. Tal como se muestra en la Tabla 5, más del 95 % de las células expresa marcadores de superficie celular relacionados con la pluripotencialidad, que incluyen Tra1-60, Tra1-81 , SSEA-3 y SSEA-4.

Un método alternativo de evaluar la pluripotencialidad es mediante la capacidad de las células de formar cuerpos embrioides. Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se sembraron en sustratos planares que comprenden membranas de policarbonato (membrana núm. 8). Las células se cultivaron en medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF, suplementado con 3 µ? de H-1152. El medio de cultivo celular se cambió diariamente. Las células se separaron por medio de la eliminación de H-1152 del medio y las células se eliminaron del sustrato planar girándolas suavemente. Las células se cultivaron para 12 pasajes.

Con el siguiente protocolo, se obtuvo la formación de cuerpos embrioides. Las células H1 se recolectaron y cultivaron en medio DMEM/F12 suplementado con suero fetal bovino al 20 % en placa Ultra Low Cluster (cat. de Corning núm.: 3471). Las células se alimentaron cada dos días cambiando 50 % del medio. Después de 14 días se formó cuerpos embrioides (Figura 10).

Ejemplo 11 : Las células madre embrionarias humanas son capaces de formar endodermo definitivo después de cultivarlas en los sustratos planares que comprenden membranas de policarbonato.

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se sembraron en un sustrato planar que comprendía policarbonato (membrana núm. 8). Las células se cultivaron ¡nicialmente en medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF, suplementado con 3 µ? de ?-1152. Las células se cultivaron después en medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF, suplementado con 1 µ? de H-1 152 por 10 pasajes antes de la manipulación experimental.

Las células se sembraron después en placas de cultivo de tejidos de 100 mm, recubiertas con una dilución de 1 :30 de MATRIGEL®. Las células se cultivaron en medio acondicionado con MEF que contenía 20 ng/ml de bFGF durante 3 días. Después, las células se trataron en DMEM/F12, se suplementaron con albúmina sérica bovina al 2 % libre de ácidos grasos, 100 ng/ml de activina A y 20 ng/ml de Wnt3A durante dos días y después se trataron con DMEM/F12, suplementado con albúmina sérica bovina al 2 % libre de ácidos grasos y 100 ng/ml de activina A durante dos días más. Después de ese tiempo, las células se liberaron con el tratamiento con TrypLE para formar una suspensión celular de célula única y la expresión de marcadores característicos del linaje definitivo del endodermo se determinó por medio de citometría de flujo.

Más de 90 % de las células es CD99 y CXCR4 (CD184) doble positivo y 12 % de las células es CD9 positivo CXCR4 negativo, tal como se muestra en la Tabla 6. Estos datos sugieren que las células conservan la capacidad de diferenciarse en endodermo definitivo.

Ejemplo 12. Propiedades físicas de los sustratos planares de la presente invención.

La química de la superficie se determinó sobre los sustratos planares de la presente invención. Las Tablas 7-10 representan el análisis de espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS) y el ángulo de contacto. Para la XPS, se usó una profundidad de análisis de aproximadamente 5-10 nm (50- 00 A). Típicamente, 95 % de la señal se origina a partir de esta profundidad.

Las membranas 1-3 contenían concentraciones similares de oxígeno, carbono (principalmente como C-O y C-(C,H), probablemente O-C-O) y nitrógeno (como NO3, NO2 y posiblemente C-N y P -NT). La membrana 3 también contenía concentraciones traza de Na+ y SOx y una concentración mayor de C-(C,H). La membrana 4 contenía C-(C,H), C-(O,N) y (O,N)-C=O y posiblemente una traza de sodio. La membrana 5 contenía, principalmente, C-O e incluso C-(C,H) y O-C-O y/o O-C=O. También se detectó concentraciones traza de Na+ y SOx. Las membranas 6-1 contenían C-(C,H), C-O o-C=O, C-N, CO3, p-p* y concentraciones traza de R4-N+, SOx y ya sea Na+ o Cr3+. La superficie de la membrana 6 también podía contener una concentración traza de cloro. Las concentraciones traza de cromo se detectaron únicamente sobre las membranas 10 y 11 , mientras que Na+ se detectó sobre las membranas 6 - 9. La superficie de la membrana 12 contenía C-(C,H), C-O, O-C=O y pi-pi* consecuente con PET. También se detectó las concentraciones traza de nitrógeno y sodio.

La Figura 1 1 muestra las micrografías electrónicas de escaneo de los sustratos planares de la presente invención. Se observó dos tipos de morfologías. Un tipo se caracterizó por una red abierta de fibras. El segundo tipo se caracterizó por una lámina lisa con agujeros circulares dispersos por toda la superficie.

La Tabla 10 muestra las mediciones del ángulo de contacto de las superficies de la presente invención. Las mediciones del ángulo de contacto de las superficies 1 a la 5 eran de aproximadamente 18° a aproximadamente 32°. Las células madre pluripotentes no requirieron la presencia de un inhibidor de la actividad de la Rho quinasa para adherirse a las superficies 1-5.

Las mediciones del ángulo de contacto de las superficies 6 a la 12 eran mayores que 32°. Las células madre pluripotentes sí requirieron la presencia de un inhibidor de la actividad de la Rho quinasa para adherirse a las superficies.

Ejemplo 13. Unión de las células madre pluripotentes a un sustrato planar que consiste de una poliamina.

El sustrato planar que consiste de poliamina se elaboró de conformidad con los métodos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6743273 y Schindler M. y otros; Biomaterials 26(28): 5624-5631 ; 2005. El sustrato planar está comercialmente disponible y se distribuye bajo la marca comercial ULTRAWEB™. Las superficies sintéticas ULTRAWEB™ están compuestas de nanofibras electrohiladas de poliamida orientadas aleatoriamente con un diámetro promedio de fibras de 280 nm. La distribución del tamaño de las fibras se encuentra entre 200 y 400 nm. La primera superficie ULTRAWEB™ analizada tenía una superficie ligeramente hidrofílica (catálogo núm. 3870XX1), mientras que la segunda superficie tenía una superficie (catálogo núm. 3871 XX1) ligeramente hidrofílica y se recubrió con un material de poliamina que proporcionó a las nanofibras grupos amina libres para una carga positiva neta. Ambas superficies son altamente efectivas en la absorción de proteínas por medio de interacciones hidrofóbicas. La resolución de 5 micrones y la micrografía electrónica de escaneo de 10.000X de magnificación se muestran en las Figuras 12A-12B. Sin embargo, las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas no pudieron adherirse a ninguna de las superficies UTRAWEB™ analizadas.

Ejemplo 14: El efecto del uso de medio definido sobre la unión de las células madre pluripotentes a los sustratos planares de la presente invención.

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas se sembraron en los siguientes sustratos planares: membrana 1 (éster mezclado de celulosa), membrana 4 (nailon), membrana 5 (acetato de celulosa) y nitrocelulosa. Las células se sembraron a una dilución de 1 :3 en el medio definido mTESR™ y se cultivaron durante 24 horas. Los cultivos paralelos en un medio acondicionado con MEF se incluyeron como controles. El cultivo de las células en mTESR™ no afectó la capacidad de las células de unirse a las superficies planares. Las células pudieron unirse a las membranas 1 , 4 y 5 y nitrocelulosa. La membrana que mostró la mayor adherencia de las células con el uso de mTESR™ fue la membrana 4, seguida de la membrana 5, que fue igual con nitrocelulosa, seguida de la membrana 1.

Tabla 1 : Caracterización de las membranas adecuadas para usar en la presente invención Tabla 2: Expresión de los marcadores de la superficie celular relacionados con la pluripotencialidad en la línea de células madre embrionarias humanas H1 después de la propagación en membranas de ésteres mezclados de celulosa durante 3 pasajes, tal como se determina mediante citometría de flujo.

Tabla 3: Protocolo para tratar células madre embrionarias humanas para inducir la diferenciación a células productoras de insulina.

Tiempo Tratamiento Medio DMEM-F12 Albúmina sérica bovina al 2 % libre de ácidos grasos (FAF-BSA) 2 días 100 nanogramos por mililitro de adivina 20 nanogramos por mililitro de Wnt3A Medio DMEM-F12 2 días Albúmina sérica bovina al 2 % libre de ácidos grasos (FAF-BSA) 100 nanogramos por mililitro de adivina Medio DMEM-F12 2 % BSA 3 días 20 nanogramos por mililitro de FGF7 250 nanomoles de ciclopamina-KAAD Medio DMEM-F12 Suplemento B27 al 1 % 20 nanogramos por mililitro de FGF7 4 días 250 nanomoles de ciclopamina-KAAD 2 micromoles de ácido retinoico (AR) 100 nanogramos por mililitro de Noggin Medio DMEM-F12 Suplemento B27 al 1 % 1 micromol de ALK5 inhibidor 2 3 días 100 nanogramos por mililitro de Noggin 100 nanogramos por mililitro de Netrin-4 50 nanogramos por mililitro de Exendin-4 1 micromol de DAPT Medio DMEM-F12 7 días Suplemento B27 al 1 % 1 micromol de ALK5 inhibidor 2 . . ..

Medio DMEM-F12 7 días Suplemento B27 al 1 % Tabla 4: Expresión de los marcadores de la superficie celular relacionados con la pluripotencialidad en la linea de células madre embrionarias humanas H1 después del cultivo en membranas de policarbonato durante 3 pasajes, tal como se determina mediante citometría de flujo.

Tabla 5: Expresión de los marcadores de la superficie celular relacionados con la pluripotencialidad en la línea de células madre embrionarias humanas H1 después de la propagación en membranas de policarbonato durante 9 pasajes, tal como se determina mediante citometría de flujo.

Marcadores de superficie Porcentaje de las células positivas Tra1-60 96.8 % Tra1-81 96.9 % SSEA-3 95.0 % SSEA-4 99.7 % Tabla 6: Expresión de los marcadores de la superficie celular relacionados con el endodermo definitivo en la linea de células madre embrionarias humanas H1. Las células se propagaron en membranas de policarbonato durante 10 pasajes y se trataron para la diferenciación del endodermo definitivo.

Tabla 7. Química de la superficie (concentración atómica en %).

Muestra c N O NA s Cr 1 39.3 8.8 51.9 - - - 2 38.2 9.6 52.1 - - - 3 41.3 8.5 49.1 0.7 0.5 - 4 75.9 11.9 12.2 ? - - 5 59.5 - 40.3 0.2 0.1 - 6* 82.0 3.5 14.2 0.2 0.1 - 7 79.1 0.8 19.6 0.3 0.2 - 8 82.2 3.1 14.3 0.2 0.2 - 9 77.2 1.1 21.5 0.1 0.1 - 10 76.2 2.9 20.0 - 0.6 0.3 11 80.4 0.6 18.5 - 0.2 0.3 12 70.2 0.2 29.5 0.1 ? - - Tabla 8: Concentraciones (en %) de los grupos funcionales de carbono 0-C-0 / C-(C,H) C-(O.N) o-c=o co3 pi-pi* % de % de % de % de % de Muestra B.E. átomos B.E. átomos B.E. átomos B.E. átomos B.E. átomos 1 284.8 2.3 287.0 29.7 288.4 7.3 - - - - 2 284.8 1.7 287.1 30.0 288.5 6.5 - - - - 3 284.8 7.6 287.0 27.1 288.4 6.6 - - - - 4 284.8 51.8 285.9 12.9 287.7 11.2 - - - - 5 284.8 14.9 286.3 28.8 288.5 15.8 - - - - 6 284.8 55.5 286.1 18.2 287.6 2.8 290.9 4.2 292.4 1.3 7 284.8 56.5 286.4 13.6 288.3 1.4 290.4 2.8 291.3 4.7 8 284.8 55.8 286.1 17.4 287.5 2.8 290.8 4.1 292.1 2.1 9 284.8 54.1 286.4 13.0 288.5 2.1 290.4 3.1 291.2 4.9 10 284.8 52.5 286.3 13.6 288.6 3.4 290.6 4.2 291.9 2.6 11 284.8 60.8 286.4 11.7 288.6 0.27 290.7 4.8 292.0 2.8 12 284.8 39.2 286.4 15.5 288.8 13.2 290.5 0.5? 291.6 1.9 Tabla 9: Concentraciones (en %) de los grupos funcionales de nitrógeno Tabla 10: Mediciones de los ángulos de contacto de las placas de la Las publicaciones citadas en este documento se incorporan como referencias en su totalidad. Aunque los diferentes aspectos de la invención se ilustraron anteriormente con referencia a los ejemplos y las realizaciones preferidas, se apreciará que el alcance de la invención no se define por la descripción anterior, sino por las siguientes reivindicaciones redactadas bajo los principios de la ley de patentes.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un método para unir células madre pluripotentes a un sustrato planar que contiene hasta aproximadamente 12 % de N, de por lo menos aproximadamente 12 % de O a por lo menos aproximadamente 55 % de O, un ángulo de contacto de aproximadamente 18 grados a aproximadamente 32 grados y que carece de una capa de adsorción y de una capa de células alimentadoras; el método comprende: a. obtener una suspensión de células madre pluripotentes y b. agregar la suspensión de células al sustrato planar y permitir que las células se unan.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células se mantienen en cultivo después de haberse adherido al sustrato.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las células se diferencian después de haberse adherido al sustrato.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la unión de las células madre pluripotentes al sustrato se intensifica mediante el tratamiento de la suspensión de células con un compuesto que tiene la capacidad de inhibir la actividad de la Rho quinasa.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el compuesto con la capacidad de inhibir la actividad de la Rho quinasa se elimina después de unir las células madre pluripotentes al sustrato.

6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el compuesto con la capacidad de inhibir la actividad de la Rho quinasa se selecciona del grupo que consiste de: Y-27632, Fasudil, H-1152 e Hidroxifasudil.