MX2010011068A - Expresion de secuencias heterologas. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para la expresión de secuencias heterólogas. Las composiciones y métodos son particularmente útiles para expresar una gran cantidad de proteínas heterólogas y ácidos nucleicos de las aplicaciones industriales, terapéuticas y de diagnóstico.

Description

EXPRESIÓN DE SECUENCIAS HETEROLOGAS REMISIÓN A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la ventaja de la Solicitud Provisional de E.U. Núm. 61/123,562 presentada el 8 de abril de 2008, cuya solicitud se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La diversidad de la terapéutica humana, las vacunas, el diagnóstico, asi como muchos agentes industriales y los productos comercialmente valiosos pueden producirse recombinantemente utilizando una amplia gama de sistemas de expresión. Los sistemas de expresión génica son ampliamente clasificados en dos tipos: sistemas (constitutivos) inducibles y no inducibles. Los sistemas de expresión génica inducibles por lo común tienen la mínima producción protéica, por ejemplo, es insignificante o casi ninguna producción protéica, que se produce hasta que un agente inductor se proporcione. Por otra parte, los sistemas de expresión génica (constitutivos) no inducibles por lo común no necesitan tal inducción, y la producción protéica generalmente ocurre continuamente a partir de un sistema de expresión génica constituido.

En algunas situaciones, como ciertas configuraciones de investigación, los sistemas de expresión génica inducibles son más deseables porque esto permite el control de la producción protéica a niveles y puntos temporales fisiológicamente óptimos (p.ej, niveles que no son tóxicos al estado fisiológico de la célula) .

Un sistema de expresión génica inducible usado con frecuencia se basa en el reguión GAL en la levadura. La levadura puede utilizar galactosa como una fuente de carbono y usar los genes de GAL para importar galactosa y metabolizarlo dentro la célula. Los genes de GAL incluyen genes est ucturales GALl, GAL2, GAL7, y genes GALIO, que respectivamente codifican para la galactocinasa , la galactosa permeasa, a-D-galactosa-l-fosfato uridiltransferasa, y uridina difosfogalactosa-4 -epimerasa , y genes reguladores de GAL4 , GAL80, y GAL3. El GAL4 y los productos génicos de GAL80 o las proteínas son respectivamente positivos y los reguladores son negativos para la expresión de los genes GALl, GAL2 , GAL7 y GALIO.

En ausencia de galactosa, muy poca expresión de las proteínas estructurales (Gallp, Gal2p, Gal7p, y GallOp) es por lo común detectada. Gal4p activa la transcripción uniendo en dirección 5 ' la activación de secuencias (UAS), como aquellos del GAL genes estructurales. Sin embargo, la actividad de transcripción de Gal4p se inhibe por Gal80p. En ausencia de galactosa, Gal80p interactúa con Gal4p, previniendo Gal4p actividad transcripcional . En la presencia de galactosa, sin embargo, GaBp interactúa con Gal80p, aliviando la represión de Gal4p por Gal80p. Esto permite la expresión de genes en dirección 3' de Gal4p secuencias de unión, como el GAL1, GAL2, GAL7, y GALIO .

El sistema de expresión inducible por galactosa convencional tiene varios inconvenientes profundos aunque él proporcione la regulación apretada y apoye de alto nivel de la producción de proteínas heterólogas. La limitación más grave es que esto requiere que la suplementacion directa de galactosa active la expresión de la proteína heteróloga. En la práctica, una gran cantidad de galactosa se adiciona directamente al medio de cultivo para inducir la expresión de una secuencia determinada después de que la célula hospedera alcanza una densidad deseada. Sin embargo, galactosa es un bien tangible costoso. En muchos casos, es costado prohibitivo para utilizar galactosa para la producción en gran escala, sobre todo de productos con el margen de beneficio bajo. Así, allí permanece una necesidad considerable de un diseño alternativo de un sistema de expresión que es igualmente sólido, pero más rentable que el sistema, convencional. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas también.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos a la producción heteróloga de productos en el cultivo celular usando un sistema de expresión inducible por galactosa.

En un aspecto, la presente invención abarca un método para expresar una secuencia heteróloga en una célula hospedera, que comprende: cultivar la célula hospedera en un medio y bajo condiciones tal que la secuencia heteróloga se expresa, donde la secuencia heteróloga se liga funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa, y la expresión de la secuencia heteróloga es inducida sin complementar directamente galactosa al medio. En algunas modalidades, el medio comprende un azúcar no galactosa (p.ej, lactosa) y la expresión de la secuencia heteróloga es inducida por el azúcar no galactosa y a un nivel comparable al obtenido cultivando la célula hospedera en un medio complementado por galactosa, donde las cantidades de galactosa complementada y azúcar no galactosa son comparables como se cuantifica en moles. La secuencia heteróloga cuya expresión puede ser inducida incluye cualquier secuencia de ácido nucleico, como moléculas antisentido, siARN, miARN, EGS, aptómeros, y ribozimas. Las secuencias de ácido nucleico también pueden codificar para productos proteicos. Donde diseñado, las secuencias heterólogas pueden estar presentes en un vector de expresión individual o en múltiples vectores de expresión.

La presente invención también proporciona un método a producir un isoprenoide en una célula hospedera que comprende: cultivar una célula hospedera que expresa para una o más secuencias heterólogas que codifican para una o más enzimas en una vía de desoxixilulosa 5-fosfato (DXP) independiente de mevalonato o mevalonato (MEV) vía, donde uno o más las secuencias heterólogas se ligan funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa y la expresión de una o más secuencias heterólogas es inducida sin complementar directamente galactosa al medio. En algunas modalidades, la expresión de una o más secuencias heterólogas es inducida en la presencia de lactosa. Las secuencias heterólogas pueden estar presentes en un vector de expresión individual o en múltiples vectores de expresión. El isoprenoide producido puede ser combustible. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende además una secuencia exógena que codifica para una preniltransferasa o una isoprenoide sintasa. En algunas modalidades, los métodos comprenden el medio que comprende la lactosa y/o lactasa.

En aún otro aspecto de la presente invención es la célula hospedera usada en métodos de la presente invención. La célula hospedera puede comprender un transportador de galactosa, como el transportador de galactosa de GAL2. En otras modalidades, la célula hospedera puede comprender un transportador de lactosa. La célula hospedera también puede comprender una secuencia exógena que codifica para una enzima de lactasa. En algunas modalidades, la secuencia exógena codifica para lactasa secretable.

En algunas modalidades, la célula hospedera puede producir un isoprenoide vía la vía de desoxixilulosa 5-fosfato (DXP) , donde la secuencia heterologa codifica para una o más enzimas en la vía de desoxixilulosa 5-fosfato (DXP) independiente de mevalonato de la vía de mevalonato (MEV) , donde la secuencia heterologa codifica para una o más enzimas eñ la vía. En algunas modalidades, el isoprenoide producido es combustible.

En algunas modalidades, el elemento regulador inducible por galactosa es episómico. En otras modalidades, el elemento regulador inducible por galactosa está integrado en el genoma de la célula hospedera. El elemento regulador inducible por galactosa puede comprender un promotor inducible por galactosa seleccionado del grupo que comprende a un promotor de GAL7, GAL2, GAL1, ' GALIO, GAL3 , GCY1, y GAL80. La célula hospedera también puede comprender lactasa o fragmento biológicamente activo de lo mismo. La célula hospedera puede mostrar una capacidad reducida de catabolizar galactosa. En algunas modalidades, la célula hospedera carece de Proteina funcional GAL1, GAL7, y/o GALIO. En algunas modalidades, la célula hospedera expresa para la proteina Gal4. En algunas modalidades, la célula hospedera expresa para GAL4 bajo el control de un promotor constitutivo.

Incluso en otro aspecto, la célula hospedera es una célula procariótica . En otras modalidades, la célula hospedera es una célula eucariótica, como una célula de Saccharomyces cerevisiae. La célula 'hospedera puede modificarse para expresar una secuencia heteróloga ligada funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa cuando cultivado en un medio, donde la expresión de la secuencia heteróloga es inducida sin complementar directamente galactosa al medio. El medio puede comprender un compuesto no de galactosa, por ejemplo, lactosa, y la expresión de la secuencia heteróloga es inducida a un nivel comparable al obtenido cultivando la célula hospedera en un medio complementado con moles de galactosa comparable al compuesto no de galactosa. Adicionalmente a condición de que en la presente invención sea un cultivo celular que comprende las células hospederas sometidas.

La presente invención también proporciona un vector de expresión. El vector de expresión sometido por lo común comprende una primera secuencia heteróloga ligada funcionalmente a · un elemento regulador inducible por galactosa y una segunda secuencia heteróloga que codifica para lactasa o fragmento biológicamente activo de lo mismo, donde mediante introducción a una célula hospedera, el vector de expresión causa la expresión de la primera secuencia heterologa en la célula hospedera cuando la célula es cultivada en un medio que es complementado con la lactosa en una cantidad suficiente para inducir la expresión de la primera secuencia heterologa. La segunda ' secuencia heterologa puede codificar para lactasa o fragmento biológicamente activo que hidroliza la lactosa a glucosa y galactosa. El vector de expresión puede comprender además una secuencia heterologa que codifica para un fragmento enzimático o biológicamente activo de lo mismo de la vía DXP o la vía de MEV. El vector también puede comprender una secuencia heterologa que codifica para un transportador de lactosa o transportador de galactosa.

También se proporcionan aquí es un conjunto de vectores de expresión que comprenden al menos un primer vector de expresión y al menos un segundo vector de expresión, donde el primer vector de expresión comprende una primera secuencia heterologa ligada funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa, y un segundo vector de expresión comprende una segunda secuencia heterologa que codifica para' lactasa o fragmento biológicamente activo de lo mismo, donde mediante introducción a una célula hospedera, el conjunto de vectores de expresión causa la expresión de la primera secuencia heterologa en la célula hospedera cuando la célula es cultivada en un medio, donde el medio es complementado con la lactosa en una cantidad suficiente para inducir la expresión de la primera secuencia heteróloga. La segunda secuencia heteróloga que codifica para lactasa o fragmento biológicamente activo de lo mismo puede expresarse para hidrolizar la lactosa a glucosa y galactosa. El conjunto de vectores de expresión puede comprender además una secuencia heteróloga que codifica para un fragmento enzimático o biológicamente activo de lo mismo de la vía DXP o la via de MEV. El conjunto también puede comprender además una secuencia heteróloga que codifica para un transportador de lactosa de un transportador de galactosa. También proporcionado es un kit que comprende un vector de expresión de la presente invención o el conjunto de vectores de expresión y las instrucciones de uso del kit correspondiente.

INCORPORACIÓN POR REFERENCIA Todas las publicaciones, las patentes, y las solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan aquí como referencia al mismo grado como si cada publicación individual, patente, o solicitud de. patente son específicamente e individualmente indicadas para incorporarse por referencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las novedosas características de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones anexadas. Una mejor comprensión de las características y las ventajas de la presente invención se obtendrán por referencia a la descripción detallada que sigue que establece modalidades ilustrativas, en las cuales los principios de la invención se utilizan, y las figuras acompañantes de cual: La Figura 1 es una representación esquemática de la conversión de lactosa en ß-D-galactosa y D-glucosa como es catalizado por lactasa.

La Figura 2 muestra mapas de fragmentos de ADN de ERG20-PGAL-tHMGR (A), ERG13-PGAL-tHMGR (B) , IDIl-PGAL-tHMGR (C) , ERG10-PGAL-ERG12 (D) y ERG8-PGAL-ERG19 (E) .

Las Figuras 3 muestran un mapa del plásmido pAM404.

La Figura 4 muestra mapas de fragmentos de ADN de GAL74 al 1021-HPH-GAL1 1637 a 2587 (A) , GAL7125 a 598-HPH-/ GiAi iL 11 4 y GAi iL 1/ 26 un 598-THnP>THT-PQAL40C-/GiAi TL4/Í-rGiAIL111585 La Figura 5 muestra un mapa . del fragmento de ADN 5' locus -NatR-LAC12-PTDHi-PpG Í-LAC4-3 ' locus .

La Figura 6 muestra la producción de ß-farneseno por cepas hospederas Y435 y Y596 en el medio de cultivo que comprende galactosa o lactosa.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN Mientras las modalidades preferidas de la presente invención se han mostrado y han descrito aquí, será obvio para los expertos en la técnica que tales modalidades se proporcionan a manera de ejemplo solamente. Las diversas variaciones, cambios, y las substituciones se les ocurrirán a los expertos en la técnica sin apartarse de la invención. Hay que entender que diversas alternativas a las modalidades de la invención descrita aquí pueden emplearse en la práctica de la invención. Está conceptualizado que las reivindicaciones que siguen definan el alcance de la invención y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes estén asi abarcadas.

Métodos generales: La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, los métodos convencionales de la inmunología, bioquímica, química, biología molecular, microbiología, biología celular, genómica y ADN recombinante, que se incluyen dentro de la habilidad de la técnica. Ver Sambrook, Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); las series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (MJ. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and yLane, eds. (1988) ANTIBODIES , A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987) ) .

Definiciones A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que comúnmente se entiende para el experto de experiencia común en la técnica a la cual esta invención pertenece. Se hace referencia aquí a varios términos que deben definirse para tener los significados que siguen: El término "constructo" o "vector" se refiere a un ácido nucleico recombinante, generalmente ADN recombinante, que se ha generado para la expresión y/o la propagación de una secuencia (s) nucleotídicas específica, o debe usarse en la estructura de otras secuencias nucleotídicas recombinantes .

El término "exógeno" se refiere a lo que no es normalmente encontrado en y/o producido por una célula determinada en la naturaleza.

El término "endógeno" se refiere a lo que es normalmente encontrado en y/o producido por una célula determinada en la naturaleza.

El término "sistema de expresión inducible por galactosa" se refiere a la combinación de una maquinaria de inducción de galactosa y un elemento regulador 1 inducible por galactosa .

El término "maquinaria de inducción de galactosa" se refiere a la recolección de proteínas que induce la transcripción de una secuencia heterologa ligada funcionalmente un elemento regulador inducible por galactosa en la presencia.de galactosa. Un ejemplo de una maquinaria de inducción de galactosa es la recolección de proteínas de levadura GaBp, Gal4p, y Gal80p, u homólogos funcionales de lo mismo .

El término "cásete de expresión inducible por galactosa" , se refiere a una secuencia nucleotidica que comprende una secuencia heterologa ligada funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa. El cásete de expresión inducible por galactosa es inducido (es decir, su secuencia heterologa es transcrita en el ARNm) cuando galactosa se encuentra.

El término "promotor inducible por galactosa" se refiere a una secuencia promotora' que es ligada por el regulado por un activador transcripcional regulado por galactosa. Por ejemplo, el promotor inducible por galactosa se regula por Gal4p u homólogos funcionales de lo mismo.

El término "heterólogo" se refiere a lo que no es normalmente encontrado en la naturaleza. El término "la producción heterologa de la proteína" se refiere a la producción de una proteína por una célula que no produce normalmente la proteina, o a la producción de una proteína a un nivel en donde no es normalmente producido por una célula. El término "secuencia heteróloga" se refiere a una secuencia nucleotídica que no es normalmente encontrada en una célula determinada en la naturaleza. El término abarca un ácido nucleico donde al menos un de lo siguiente es verdad: (a) el ácido nucleico que es exógenamente introducido en una célula determinada (por lo tanto "secuencia exógena" aunque la secuencia pueda ser ajena o natural para la célula de receptor); (b) el ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que es naturalmente encontrada en una célula determinada (p.ej, el ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que es endógena a la célula) pero el ácido nucleico es o producido en un no natural (p.ej. Mayor que previsto o mayor que naturalmente encontrado) la cantidad en la célula, o la secuencia nucleotídica se diferencia de la secuencia nucleotídica endógena tal que la misma proteína codificada (que tiene el mismo o sustancialmente la misma secuencia aminoacídica) que encontrado endógenamente se produce en un no natural (p.ej, mayor que previsto o mayor que naturalmente encontrado) la cantidad en la célula; (c) el ácido nucleico comprende dos o más secuencias nucleotídicas o segmentos que no son encontrados en la misma relación entre sí en la naturaleza (p.ej, el ácido nucleico es recom inante) .

El término "célula hospedera" se refiere a cualquier célula que comprenda una maquinaria de inducción de galactosa, e incluya cualquier archae adecuado (arqueobacterias) , célula bacteriana, o eucariótica.

Los términos "inducir", "inducción" e "inducible", se refieren a la activación de transcripción o el alivio de la represión de .la transcripción de una secuencia nucleotidica . El término "inducible por galactosa" se refiere a la activación de transcripción o el alivio de la represión de la transcripción de una secuencia nucleotidica en la presencia de galactosa.

El término "expresión" se refiere al proceso por el cual un polinucleótido es transcrito en el ARNm y/o el proceso por el cual el ARNm transcrito (también referido como "transcrito") es traducido posteriormente a péptidos, polipéptidos, o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados son recolectadamente referidos como "producto génico." Si el polinucleótido se deriva del ADN genómico, la expresión puede incluir el empalme del ARNm en una célula eucariótica .

El término "ligado funcionalmente" o " funcionalmente unido" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes tan descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera intencionada. Por ejemplo, una secuencia promotora se liga funcionalmente a una secuencia codificadora si la. secuencia promotora promueve la transcripción de la secuencia codificadora.

El término "isoprenoide" se refiere a una molécula derivable del difosfato de isopentenilo ("IPP"), y esto puede comprender uno o más unidades IPP.

El término "lactasa" se refiere a una enzima que puede hidrolizar el ß - unión glucosidica en la lactosa para generar galactosa (p.ej, ß-D-galactosa) y glucosa (p.ej, D-glucosa) . "Lactasa" hidrólisis catalizada de lactosa es esquemáticamente representada en la Figura 1.

El término "lactosa" se refiere a un disacárido que tiene la fórmula molecular C12H22O11, y esto comprende un ß-D-galactosa molécula y una molécula de D-glucosa unida a través de un enlace glucosidico Dl-4. La estructura de "lactosa", y su hidrólisis a ß-D-galactosa y D-glucosa, se muestran en la Figura 1.

El término "vía de MEV" se refiere a una vía biosintética para la conversión de acetil-CoA en isopentenildifosfato isomerasa ("IPP"). Las enzimas de la vía de MEV incluyen una enzima que puede convertir dos moléculas de la acetil-coenzima A en acetoacetil-CoA, una enzima que puede el converso acetoacetil-CoA y acetil-coenzima A en el 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) , una enzima que puede convertir HMG-CoA en mevalonato, una enzima que puede convertir mevalonato en el mevalonato 5-fosfato, una enzima que puede convertir el mevalonato 5-fosfato en el mevalonato 5-pirofosfato, y una enzima que puede convertir el mevalonato 5-pirofosfato en IPP.

El término "secuencia nucleotídica" se refiere al orden de bases de ácido nucleico en una hebra de ADN o ARN .

El término "ligado funcionalmente" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes tan descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera intencionada. Por ejemplo, un promotor se liga funcionalmente a una secuencia codificadora de proteínas si el promotor afecta la transcripción en el ARNm de la secuencia codificadora de proteínas.

El término "prenildifosfato sintasa" se refiere a una enzima que puede convertir isopentenildifosfato isomerasa ("IPP") y/o pirofosfato de dimetilalilo ( "DMAPP" ) en un prenildifosfato . Los ejemplos de difosfatos de prenilo son farnesildifosfato ("FPP"), geranildifosfato ("GPP"), y geranilgeranildifosfato ("GGPP") .

El término "secuencia codificadora de proteínas" se refiere a una secuencia ' nucleotídica que codifica para una proteína.

El término "sustancialmente puro" se refiere a sustancialmente libres de uno o más otros compuestos, es decir, la composición contiene mayor que 80 % de volumen, mayor que 90 % de volumen, mayor que 95 % de volumen, mayor que 96 % de volumen, mayor que 97 % de volumen, mayor que 98 % de volumen, mayor que 99 % de volumen, mayor que 99.5 % de volumen, mayor que 99.6 % de volumen, mayor que 99.7 % de volumen, mayor que 99.8 % de volumen, o mayor que 99.9 % de volumen del compuesto; o menor que 20 % de volumen, menor que 10 % de volumen, menor que 5 % de volumen, menor que 3 % de volumen, menor que 1 % de volumen, menor que 0.5 % de volumen, menor que 0.1 % de volumen, o menor que 0.01 % de volumen de uno o más otros compuestos, basados en el volumen total de la composición.

El término "recombinante" se refiere a un ácido nucleico particular (ADN o ARN) es el producto de diversas combinaciones de clonación, restricción, y/o etapas de ligamiento dando como resultado un constructo que tiene una codificación estructural o secuencia no codificadora distinguible de ácidos nucleicos endógenos encontrados en sistemas naturales.

El término "elemento regulador" se refiere a secuencia de control transcripcional y secuencia de control traductorial, como promotores, potenciadores , señales de poliadenilación, terminadores, señales de la degradación protéica, y lo similar, que preven y/o regulan la expresión de un transcrito, una secuencia codificadora y/o la producción de un polipéptido codificado en una célula.

El término "péptido de señalización" se refiere a un segmento de la secuencia aminoacidica de una proteina que regula la secreción de la proteina de una célula.

El término "terpeno sintasa" se refiere a una enzima que puede convertir uno o más pirofosfatos de prenilo en un isoprenoide .

Un polinucleótido o polipéptido tienen un cierto porcentaje de "identidad de secuencia" con respecto a otro polinucleótido o polipéptido, lo que significa que, cuando es alineado, aquel porcentaje de bases o aminoácidos son iguales, y en la misma posición relativa, al comparar las dos secuencias. Para determinar la identidad de secuencia, las secuencias pueden ser alineadas usando métodos y programas informáticos extensamente disponibles para el público, incluyendo el BLAST (disponible sobre el la Red a ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), FASTA (disponible en Genetics Computing Group (GCG) envase, Madison, Wisconsin) , algoritmo de Smith-Waterman, Needleman y alineación de Wunsch, y otros métodos .

El término "transportador" se refiere a una proteina que regula la transferencia de un compuesto a través de una membrana celular o la membrana de un organelo celular.

Los términos "polipéptido", "péptido", "secuencia aminoacidica" y "proteina" se usan de modo indistinto aquí para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede ser interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero aminoacídico que se ha modificado, por ejemplo, por formación de enlace disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación, como la conjugación con un componente de mareaje. Como se utiliza aquí el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o a sintéticos, incluyendo entre otros glicina y tanto el D o L isómeros ópticos, como análogos aminoacídicos y peptidomiméticos .

Expresión inducible de Secuencias heterólogas La presente invención proporciona composiciones y métodos a expresar para secuencias heterólogas productos dando como resultado heterólogos en una célula hospedera. En un aspecto, la secuencia heteróloga se liga funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa, pero la expresión de que es inducida sin complementar directamente galactosa al medio de cultivo. La inducción ocurre mediante la adición de uno o más compuestos, por lo común lactosa, que puede ser dividida rota en galactosa, por lo cual galactosa resultante induce, la expresión de las secuencias heterólogas. En otras modalidades,, la expresión de la secuencia heteróloga es inducida mediante la expresión de lactasa que hidroliza el presente de lactosa en el medio para generar galactosa, que por su parte activa la expresión de la secuencia heteróloga de interés. La expresión de la secuencia heteróloga puede ser inducida a un nivel comparable al obtenido cultivando la célula hospedera en un medio complementado con cantidades comparables (como se cuantifica en moles) de galactosa. En términos particulares, la cantidad del producto heterólogo producido por un cultivo de célula hospedera en el medio complementado con la lactosa es comparable a esto producido en un medio complementado con mismos moles o comparables de galactosa .

En otra modalidad, el medio de cultivo comprende además. una enzima que hidroliza la lactosa en galactosa, como lactasa o un fragmento biológicamente activo de lo mismo. La enzima puede producirse por la célula hospedera que transporta la secuencia heteróloga para expresarse. Por ejemplo la célula hospedera puede producir lactasa endógena o producir lactasa de una secuencia de ácido nucleico heteróloga. Cuando se desee, lactasa producida es secretada en el medio de cultivo celular. En aún otra modalidad, lactasa puede producirse por otra célula que no transporta la secuencia heteróloga de interés, pero es usada para suministrar lactasa o fragmento biológicamente activo de lo mismo para generar galactosa, que por su parte activa la expresión de la secuencia heteróloga En todavía otras modalidades, la expresión de la secuencia heteróloga es inducida mediante la adición de lactasa exógena al medio que comprende las células hospederas y lactosa.

Cuando la lactosa se convierte en galactosa fuera de las células hospederas que comprenden la secuencia heteróloga (p.ej en el medio), galactosa generada de la lactosa puede ser importada en la célula hospedera por un transportador de galactosa. Esto puede llevarse a cabo por un transportador de "galactosa endógeno o un transportador de galactosa heterogéneo. Galactosa importada puede inducir luego una o más secuencias heterólogas ligadas funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa en la célula.

Incluso en otras modalidades, la lactosa complementada al medio puede ser transportada en la célula hospedera, donde es hidrolizado dentro la célula por lactasa endógena o lactasa expresada para por una secuencia heteróloga. La hidrólisis de lactosa dentro glucosa de producciones celular y galactosa, éste- se utiliza para activar la expresión de la secuencia heteróloga de interés que se liga funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa. El transportador de lactosa adecuado nuevamente puede ser endógeno o exógeno, P-ej, lactasa exógena que se expresa por una secuencia heteróloga.

Maquinaria de inducción de galactosa La célula hospedera de la presente invención comprende una maquinaria de inducción de galactosa. La maquinaria de inducción de galactosa puede ser endógena (p.ej, como en Saccharomyces cerevisiae) o heterólogo a la célula hospedera. La maquinaria de inducción de galactosa se refiere a la recolección de proteínas que induce la transcripción de una secuencia heteróloga ligada funcionalmente . un elemento regulador inducible por galactosa en la presencia de galactosa. Un ejemplo de una maquinaria de inducción de galactosa es la recolección de proteínas de levadura Gal3p, Gal4p, y Gal80p, u homólogos funcionales fragmentos biológicamente activos de lo mismo que incluyen de lo mismo. Las secuencias nucleotídicas adecuadas para usarlos en la presente invención en la generación de células hospederas que comprenden una maquinaria de inducción de galactosa heteróloga incluyen entre otras cosas las secuencias nucleotídicas del gen Gal4 de Saccharomyces cerevisiae (marcador de locus de GenBank YPL248C) , el gen Gal80 de Saccharomyces cerevisiae (marcador de locus de GenBank YML051W) , y el gen de GaB de Saccharomyces cerevisiae (marcador de locus de GenBank YDR009W) , y sus homólogos funcionales .

La célula hospedera de la presente invención comprende además un elemento regulador. inducible por galactosa. El elemento regulador puede ser transcripcional o secuencias de control traductorial, como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores, señales de la degradación protéica, y lo similar, que preven y/o regulan la expresión de un transcrito, una secuencia codificadora y/o la producción de un polipéptido codificado en una célula. El elemento regulador inducible por galactosa puede ser endógeno o heterologo. Por ejemplo, la célula hospedera puede comrpise un cásete de expresión inducible por galactosa heterologo individual, donde el cásete de expresión inducible por galactosa comprende un elemento regulador inducible por galactosa. Un cásete de expresión inducible por galactosa heterologo individual puede expresar para una o más secuencias heterólogas de la identidad de secuencia igual o diferente. En algunas modalidades, el cásete de expresión puede activar la. expresión de múltiples copias de las secuencias heterólogas iguales o diferentes. En algunas modalidades, el cásete de expresión inducible por galactosa heterologo individual puede expresar para 2, 3, 4, 5 o copias de las secuencias heterólogas iguales o diferentes. En modalidades, el vector de expresión puede comprender una primera secuencia heteróloga ligada funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa y una segunda secuencia heteróloga que codifica para lactasa o fragmento biológicamente activo de lo mismo. Cuando se desee, un cásete de expresión individual puede activar la expresión de secuencias heterólogas que codifican para 2, 3, 4, 5, o proteínas más diferentes de una vía bioquímica, como MEV o vía DXP. Por ejemplo, un cásete de expresión individual puede codificar para tanto la reductasa de HMGCoA como otra enzima, como la sintasa de difosfato de farnesil, ispopentyl d isomerasa. En otras modalidades, un cásete de expresión individual controla la expresión de cinasa de mevalonato y CoA acetoacetyl thiolase o descarboxilasa diphosphoemevalonate y cinasa phosphomevalonate . El cásete de expresión para la expresión de cualquier combinación de enzimas en una via determinada puede construirse según procedimientos recombinantes rutinarios.

La célula hospedera también puede comprender una pluralidad de casetes de expresión inducibles por galactosa heterólogos. Por ejemplo, la célula hospedera puede tener múltiples casetes de expresión que controlan la expresión de las secuencias heterólogas iguales o diferentes. Cuando se desee, cada uno de múltiples casetes de expresión puede ser diseñado para controlar la¦ expresión de la misma proteína, una diferente proteína. Alternativamente, un subconjunto de la pluralidad de galactosa heteróloga - los casetes de expresión inducible pueden ser utlized para activar la expresión de la misma proteína y otro subconjunto expresa para diferentes proteínas. Más aún, la célula hospedera puede comprender otras secuencias exógenas que modulan la expresión de la secuencia heteróloga de interés. Según la opción del producto heterologo que debe producirse, las otras secuencias exógenas pueden abarcar lactasa, sobre todo lactasa secretable a faciliate la hidrólisis de lactosa complementada al medio de cultivo celular. Otros ejemplos no limitantes incluyen secuencias exógenas que codifican para el transportador de lactosa, el transportador de galactosa y homólogos funcional. Estos y otros secuencias exógenas adecuadas pueden ser constitutivamente expresadas para o colocarse bajo el control de un elemento regulador inducible no de galactosa.

El elemento regulador inducible por galactosa sometido abarca un promotor inducible por galactosa. Los promotores inducibles son por lo común usados en vez de promotores constitutivos en la producción herelogous de proteínas porque el anterior permite el control de la producción protéica a fisiológicamente puntos temporales óptimos y/o niveles (p.ej, niveles que no son tóxicos al estado fisiológico de la célula) . Los promotores inducibles por galactosa se usan con frecuencia en la producción heteróloga de proteínas porque thye son dispuestos a la regulación con especificidad de objetivo y apretada, y proporcionan altos niveles de la expresión. Los promotores inducibles por galactosa adecuados para usarlos en la presente invención incluyen entre otras cosas a los promotores de los genes de Saccharomyces ceverisiae GAL7 (acceso de GenBank REGIÓN de NC_001134: 274427.. 275527), GAL2 (acceso de GenBank REGIÓN de NC_001144: 290213.. 291937), GAL1 (acceso de GenBank REGIÓN de NC 001134: — 279021.. . 280607), GALIO (acceso de GenBank REGIÓN de NC_001134: 276253.. 278352), GAL3 (acceso de GenBank REGIÓN de NC_001136: 463431.. 464993), GCY1 (acceso de GenBank REGIÓN de NC_001147: 551115.. 552053), y GAL80 (acceso de GenBank REGIÓN de NC 001145: 171594.. 172901), u homólogos funcionales de lo mismo. En ciertas modalidades, el promotor inducible por galactosa comprende la secuencia nucleotídica CG (G o C) ( n) (G o C) CG, donde N es cualquier nucleótido. Los promotores híbridos también pueden usarse, por ejemplo, como está descrito en US5739007, US5310660 o US5013652. En ciertas modalidades, el promotor inducible por galactosa es un promotor sintético (es decir, el promotor se sintetiza químicamente) .

En ciertas modalidades, el promotor inducible por galactosa prevé la transcripción de alto nivel de una secuencia heteróloga determinada. En otras modalidades, el promotor inducible por galactosa prevé la. transcripción baja de la secuencia heteróloga. Varios genes son inducidos en la presencia de galactosa (Ren et al., ubicación Por todo el genoma y función de proteínas de unión de ADN. Ciencia 290:2306-2309 (2000) ) . Los promotores para estos genes, como el UASGAL también pueden tener el diferencial activiation niveles. Por ejemplo, sin la teoría que se une con, varios UASGAL se han identificado en la levadura, y tienen diferentes afinidades relativas para Gal4p y así, activación diferencial (ver por ejemplo, Lohr et al., regulación Transcripcional en la familia de gen de GAL yesat: una red genética compleja. FASEB J 9:777-787 (1995) ) . Éstos y cualquier otro promotor variante son abarcados como elementos reguladores inducibles por galactosa para la bocacalle fina los niveles de expresión deseados al llevar a la práctica los métodos sometidos.

Medio de cultivo La expresión de una secuencia heteróloga por lo común implica cultivar una célula hospedera que comprende tal secuencia heteróloga en un medio de cultivo. Un medio de cultivo adecuado abarca cualquier medio que prevea el crecimiento o el mantenimiento de un cultivo de célula hospedera. Los parámetros generales que gobiernan la supervivencia celular procariótica y eucariótica están bien establecidos en la técnica. Los parámetros fisicoquímicos que pueden controlarse in vitro son, p.ej, el pH, C02, la temperatura, y osmolarity. Los requerimientos nutricionales de células se proporcionan generalmente en formulaciones de medios convencionales desarrolladas para proporcionar un ambiente óptimo. Los nutrientes pueden dividirse en varias categorías: los aminoácidos y sus derivados, carbohidratos, azúcares, ácidos grasos, se forman en complejos lípidos, derivados de ácido nucleico y vitaminas. Aparte de nutrientes para mantener el metabolismo celular, algunas células pueden requerir uno o más hormonas de al menos un de los grupos que siguen: esteroides, prostaglandinas , factores de crecimiento, hormonas pituitarias, y hormonas peptídicas para sobrevivir o proliferar (Sato, G.H., et al. en "Growth of Cells in Hormonally Defined Media", Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1982; Ham and Wallace (1979) Meth. Em., 58:44, Barnes and Sato (1980) Anal. Biochem. , 102:255, o Mather, J.P. y Roberts, P. E, (1998) " Introduction to Cell and Tissue Culture", Plenum Press, Nueva York.

Un medio de cultivo adecuado por lo común comprende una fuente disponible en el acto de energía (p.ej, un azúcar simple, como glucosa, galactosa, mañosa, fructosa, ribosa, o combinaciones de lo mismo) , una fuente de nitrógeno, y una fuente de fosfato. En ciertas modalidades, el medio de cultivo es un medio líquido. Los medios líquidos adecuados incluyen entre otras cosas: YPD (YEPD) , YPAD, Hartwell completo (HC) , y medios (subcutáneamente) completos sintéticos. En ciertas modalidades, el medio de cultivo es complementado con uno o más agentes adicionales (p.ej, un inductor además de galactosa cuando la producción del transportador de galactosa, transportador de lactosa, o lactasa en la célula está bajo el control de un promotor inducible) . En otras modalidades, el medio de cultivo es complementado tanto con la lactosa como con galactosa en diversas proporciones para producir un nivel de inducción deseado.

Cuando se desee, un "medio definido" puede emplearse para cultivar . las células hospederas. Un medio definido por lo común comprende requerimientos nutricionales y otros necesarios para la supervivencia y/o el crecimiento de las células en el cultivo tal que los componentes del medio se conocen. Tradicionalmente, el medio definido se ha formulado mediante la adición de nutricional y/o factores de crecimiento necesarios para crecimiento y/o supervivencia. Por lo común, el medio .definido proporciona al menos un componente de uno o más de lo siguiente categorías: a) todos los aminoácidos esenciales, y por lo general el conjunto básico de veinte aminoácidos más cystine; b) una fuente de energía, por lo general en la forma de un carbohidrato, como glucosa; vitaminas . de c) y/o otros compuestos orgánicos requeridos a bajas concentraciones; ácidos grasos libres de d) ; y los microelementos de e) , donde los microelementos se definen como compuestos inorgánicos o elementos de origen natural que se requieren por lo común a muy bajas concentraciones, por lo general en el intervalo micromolar.

El medio definido también puede ser opcionalmente complementado con uno o más componentes de cualquiera de las categorías que siguen: a) uno o más agentes mitogenic; sales de b) y amortiguadores como, por ejemplo, calcio, magnesio, y fosfato; nucleósidos de c) y bases tal como, por ejemplo, adenosina y timidina, hypoxanthine; y proteina de d) e hidroproductos de la lisis tisulares.

Cultivar la célula hospedera en un medio puede ocurrir en cualquier recipiente o en cualquier sustrato que mantenga la viabilidad celular y/o el crecimiento. Los recipientes adecuados incluyen entre otras cosas un depósito para un reactor o fermentador, o una parte de una centrifugadora que puede separar materiales más pesados de materiales más ligeros en etapas de procesamiento subsecuentes. En ciertas modalidades, el recipiente tiene una capacidad de al menos 1 litro. En algunas de estas modalidades, el recipiente tiene una capacidad de al menos 10 litros. En algunas de estas modalidades, el recipiente tiene una capacidad de al menos 100 litros. En algunas modalidades, el recipiente tiene una capacidad de 100 a 3 000 000 de litros, como al menos 1000 litros, al menos 5 000 litros, al menos 10 000 litros, recipiente al menos 25 000 litros, al menos 50 000 litros, al menos 75 000 litros, al menos 100 000 litros, al menos 250 000 litros, al menos 500 000 litros o al menos 1 000 000 de litros.

El medio de cultivo de la invención comprende uno o más compuestos que pueden ser divididos rotos en galactosa. En métodos de la presente invención, el medio por lo común comprende la lactosa. La lactosa puede ser hidrolizada en galactosa y glucosa y es un compuesto relativamente barato, por lo común de presupuesto considerablemente menor que galactosa, ya que la lactosa es el componente principal del suero, que es un desecho de muchos procesos de elaboración de producto lácteo comerciales. Considerando el precio bajo de lactosa, y la disponibilidad de enzimas que pueden hidrolizar la lactosa, la hidrólisis enzimática de lactosa presenta unos medios rentables para generar galactosa para la inducción de sistemas de expresión inducibles por galactosa para la producción en gran escala de proteínas.

En ciertas modalidades, la concentración de lactosa en el medio de cultivo es menor que lOg/L, menor que 5g/L, o menor que 2g/L. En ciertas modalidades, la lactosa se agrega al medio como un compuesto sustancialmente puro. En otras modalidades, la lactosa se agrega al medio como un componente de una mezcla de compuestos. En algunas modalidades, la lactosa se agrega al medio como un componente de suero. En otras modalidades, la lactosa se agrega al medio como un componente de la leche o un producto de leche. Incluso en otras modalidades, la lactosa es secretada en el medio de cultivo por la célula hospedera. En otras modalidades, la lactosa es secretada en el medio de cultivo por una célula además de la célula hospedera. En ciertas modalidades, la lactosa se genera en el medio de cultivo a través de la acción de ciertas enzimas que se encuentran en el medio de cultivo. En el cierto tales modalidades, las enzimas se agregan al medio de cultivo en la forma sustancialmente pura. En otras tales modalidades, las enzimas se agregan al medio de cultivo como componentes de una mezcla de enzimas. En otras tales modalidades, las enzimas, son secretadas por la célula hospedera. En todavía otras tales modalidades, las enzimas son secretadas por una célula además de la célula hospedera. Las enzimas pueden encontrarse en el medio de una combinación de los métodos ya mencionados, por ejemplo, adicionado en la forma sustancialmente pura y también secretado por una célula hospedera y/o una célula que no es la célula hospedera.

En algunas modalidades, el medio de cultivo de la invención también comprende una enzima que hidroliza la lactosa a galactosa y glucosa. La enzima puede ser lactasa. Lactasas adecuadas para usarlos en la presente invención incluyen entre otras cosas (Número de acceso de GenBank; organismo): LAC4 (REGIÓN de M84410: 43.. 3120; Kluyveromyces lactis), lacZ (X91197, Escherichia coli) , LacA (S37150; Aspergillus Niger), y otros miembros de Comisión Enzimática clase 3.1.1.23. Las variantes funcionales también pueden usarse. En ciertas modalidades, lactasa se agrega al medio como una enzima sustancialmente pura. Lactasa sustancialmente pura para usarlo en la invención puede obtenerse, por ejemplo, pulverizando comprimidos de lactosa comercialmente disponibles (p.ej, el suplemento Dairy Digestive disponible de Long's Drugstore) . En otras modalidades, lactasa se agrega al medio como un componente de una mezcla de enzimas y/o compuestos .

En ciertas modalidades, lactasa es secretada en el medio de cultivo por la célula hospedera o por una célula además de la célula hospedera. En ciertas modalidades, lactasa es liberada en el medio de cultivo en virtud de comprender un péptido de señalización de origen natural que regula el transporte de la enzima de una célula. Lactasas secretadas adecuadas que comprenden un péptido de señalización de origen natural incluyen entre otras cosas LacA (S37150; Aspergillus Niger) . En otras modalidades, lactasa es liberada en el medio de cultivo en virtud de ser fusionada a un péptido de señalización heterólogo que regula el transporte de la enzima de una célula. Los péptidos de señalización adecuados incluyen entre otras cosas los péptidos de señalización del factor dé apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae y la toxina de asesino de Kluyveromyces lactis. En ciertas modalidades, lactasa es liberada en el medio de cultivo a consecuencia de la lisis celular. La lisis celular puede ocurrir, por ejemplo, en un elevado cultivo celular de densidad o a consecuencia de la expresión en una célula de la invención de una proteina heteróloga (Compagno et al. (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol. 43 (5) : 822-825) .

Lactasa producida en la célula hospedera o en una célula además de la célula hospedera que es secretada puede ser endógenamente producida o heterólogamente producida. La producción de lactasa en la célula hospedera o en una célula además de la célula hospedera puede controlarse por un promotor. El promotor puede ser constitutivo o inducible. Los promotores inducibles adecuados incluyen entre otras cosas a los promotores de los genes de Saccharomyces cerevisiae ADH2, PH05, CUP1, MET25, MET3, CYC1, HIS3, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, TP1 y AOXl . En otras modalidades, el promotor es constitutivo. Los promotores constitutivos adecuados incluyen entre otras cosas genes de Saccharomyces cerevisiae PGK1, TDH1, TDH3, FBA1, ADH1, LEU2, ENO, TPIl y PYK1.

Lactasa, Transportadores de Lactosa, y Transportadores de galactasa En ciertas modalidades, la célula hospedera de la invención comprende lactasa, o fragmentos biológicamente activos de lo mismo, que puede hidrolizar la lactosa en galactosa y glucosa (Figura 1) . Lactasa puede ser endógena a la célula hospedera o heteróloga, por ejemplo, producido de una secuencia de ácido nucleico heteróloga. En algunas modalidades, lactasa es secretada de la célula hospedera en el medio. Lactasa secretable por lo común comprende un péptido de señalización que es escindido postraductorialmente . Alternativamente, lactasa endógena o heteróloga puede residir dentro de la célula e hidroliza la lactosa que es importada en la célula vía p.ej, un transportador de lactosa.

Lactasas adecuadas incluyen entre otras cosas (Número de acceso de GenBank; organismo): LAC4 (REGIÓN de M84410: 43.. 3120; Kluyveromyces lactis), lacZ (X91197; Escherichia coli), LacA (S37150; Aspergillus Niger) , y otros miembros de Comisión Enzimática cantidad 3.1.1.23. En ciertas modalidades, la secuencia aminoacidica de lactasa comprende SEQ ID NO: 3, o una variante de lo mismo. En ciertas modalidades, la secuencia nucleotidica que codifica para lactasa comprende SEQ ID NO: 4, o un homólogo de lo mismo.

La producción de lactasa en la célula hospedera puede controlarse por un promotor. En ciertas modalidades, el promotor es inducible. Los promotores inducibles adecuados incluyen entre otras cosas a los promotores de los genes de Saccharomyces cerevisiae ADH2, PH05, CÜP1, MET25, MET3, CYC1, HIS3, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3 , LEU2, TP1 y A0X1. En otras modalidades, el promotor es constitutivo. Los promotores constitutivos adecuados incluyen entre otras cosas genes de Saccharomyces cerevisiae PGK1, TDH1 , TDH3, FBA1, ADH1 , LEU2, ENO, TPI1 y PYK1.

En ciertas modalidades, la célula hospedera de la invención comprende un transportador de lactosa que puede importar la lactosa del medio de cultivo en el citosol de la célula. Por ejemplo, si la lactosa se encuentra en el medio y lactasa se encuentra en la célula hospedera, la célula hospedera comprende un transportador de lactosa. El transportador de lactosa puede ser endógeno o heterólogo. En algunas modalidades, una célula hospedera puede comprender tanto transportadores de lactosa endógenos como heterólogos . Los transportadores de lactosa adecuados incluyen entre otras cosas: LAC 12 (Número de acceso de GenBank REGIÓN de X06997: 1616.3379; Kluyveromyces lactis) y Lac Y (Marcador de Locus de GenBank B0343; Escherichia Cnel) . En ciertas modalidades, la secuencia aminoacídica del transportador de lactosa comprende SEQ ID NO: 1, o una variante de lo mismo. En ciertas modalidades, la secuencia nucleotidica que codifica para el transportador de lactosa comprende SEQ ID NO: 2, o un homólogo de lo mismo.

En ciertas modalidades, la' célula hospedera de la invención comprende un transportador de galactosa que puede importar galactosa del medio de cultivo en el citosol de la célula. Por ejemplo, una célula hospedera que expresa para un transportador de galactosa es cultivada en medios que comprende la lactosa y lactasa, que permite a galactosa ser importada en la célula hospedera. El transportador de galactosa puede ser endógeno o puede ser heterólogo, por ejemplo, expresado para de una secuencia nucleotidica heteróloga. La célula hospedera puede comprender tanto transportadores de galactosa endógenos como heterólogos . Los transportadores de galactosa adecuados incluyen entre otras cosas: GAL2 (Marcador de Locus de GenBank de YLR081; Saccharomyces cerevisiae) , MST4 (AY342321; Oryza sativa Rosal Grupo Japónica), ST4 (DQ087177; Olea europaea) , LAC1 2 (X06997; Kluyveromyces lactis), GAL2 (AAU43755; Saccharomyces mikatae) y HGT1 (KLU22525; Kluyveromyces lactis).

La producción del transportador de lactosa o galactosa tranporter en la célula hospedera puede controlarse por un promotor. En ciertas modalidades, el promotor es inducible. Los promotores inducibles adecuados incluyen entre otras cosas a los promotores de los genes de Saccharomyces cerevisiae ADH2, PH05, CUP1, MET25, MET3, CYC1, HIS3, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, TPl y AOX1. En otras modalidades, el promotor es constitutivo. Los promotores constitutivos adecuados incluyen entre otras cosas genes de Saccharomyces cerevisiae PGK1, TDHl, TDH3, FBA1, ADHl, LEU2, ENO, TPI1 y PYK1.

Productos heterólogos Las composiciones de la presente invención que incluye entre otras cosas vectores, células hospederas, medios de cultivo y elementos reguladores inducibles por galactosa, son adecuadas para la expresión de cualquier secuencia heterologa en una manera inducible. Para inducir la producción de cualquier de los productos heterólogos, un agente inductor por lo común un azúcar no galactosa se emplea. La cantidad de producto producido por células hospederas cultivadas en un medio complementado con la lactosa puede ser comparable a la cantidad del producto producido de un medio de cultivo complementado con una cantidad comparable de galactosa. En algunas modalidades, la cantidad del producto heterologo producido es aproximadamente igual a o mayor que la cantidad de producto producido de la misma célula hospedera que mediante adiciona ' la misma cantidad de galactosa directamente en el medio. En algunas modalidades, la cantidad de producto producido es al menos aproximadamente 1.2 veces, 1.5 veces, 2 veces, 2.5 veces, 3 veces, 4, periodos de tiempo, 5 veces o más que la cantidad del producto ¦ producido agregando la misma cantidad de galactosa al medio.

La secuencia heterologa para expresarse puede codificar para una proteina o péptido, como proteínas bioactivas o péptidos. Según la naturaleza de la proteina, esto puede utilizarse por una célula hospedera para la síntesis o la disgregación de lípidos, carbohidratos, y combinaciones de lo mismo. La · expresión de las secuencias heterólogas puede producir productos de ácido nucleico que incluyen entre otros oligonucleótidos, p.ej, ribonucleótidos, moléculas antisentido, moléculas de ARNi, ribozimas, secuencias dirigidas del modo externo (EGS) , aptómeros, y miAR .

Por ejemplo, las secuencias heterólogas para expresarse por las composiciones sometidas o vía los métodos sometidos abarcan varias clases de ARN catalíticos (ribozimas), incluyendo ribozimas derivadas del intrón (WO 88/04300; también ver, Cech, T., Annu. El Rev Biochem. , 59:543-568, (1990)), ribozimas cabeza de martillo (WO 89/05852 y EP 321021), axehead ribozimas (WO 91/04319 y WO 91/04324) y cualquier otra secuencia heterologa ejemplificada aquí. Las moléculas de EGS también pueden codificarse por secuencias heterólogas de la presente invención cuando ligado funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa. EGS por lo común se une con un sustrato objetivo para formar una estructura secundaria y terciaria que se asemeja al sitio de corte natural de tRNA precursor para la ARNasa eucariótica. Los métodos para diseñar moléculas EGS se describen, por ejemplo en Patentes Estadounidenses Núms . US5624824, .US5683873, US5728521, US5869248, US5877162, y US6057153, de los cuales todos se incorporan aquí en su totalidad.

Las secuencias heterólogas también pueden producir moléculas antisentido, siARN, miARN, y aptómeros. El diseño de secuencias heterólogas que producen siARN, moléculas antisentido, EGS, o miARN, generalmente requiere el conocimiento del ARNm la secuencia primaria de un objetivo celular. La información de secuencia de ARNm primaria del ratón completo y genoma humano, asi como las secuencias génicas de varios otros organismos que incluyen aviar, canino, felino, rattus, y otros es disponible en el acto al público en el servidor NCBI. Los métodos convencionales en el diseño de siARN se conocen en la técnica (Elbashir y ah, Métodos 26:199-213 (2002)) y las herramientas de diseño públicas también son disponibles en el acto, por ejemplo, del Instituto Whitehead de la Investigación Biomédica a MIT, http : //jura . wi .mit . edU/pubint/http : //iona . wi .mit . edu/siRNAext / y www.RNAinterference.org, asi como de sitios comerciales de Promega y Ambion. Las bases de datos de secuencias de miARN también son disponibles al público, tal como a http://www.microrna.org/ y http://microrna.sanger.ac.uk/. Los aptómeros pueden generarse por métodos conocidos en la técnica o secuencias obtenidas de una base de datos pública tal como http://aptamer.icmb.utexas.edu.

La secuencia heteróloga también puede codificar para un producto proteico, como una proteina o un péptido. La proteína puede ser endógena o exógena a la célula. La proteína puede ser una proteína intracelular (p.ej, una proteína citosólica), una proteína transmembranal, o una proteína secretada. La producción heteróloga de proteínas es extensamente empleada en investigación y configuraciones industriales, por ejemplo, para la producción de terapéutica, vacunas, diagnóstico, combustibles bio, y muchas otras solicitudes de interés. Examplary proteínas terapéuticas que 'pueden producirse empleando las composiciones y métodos sometidas incluyen entre otras cosas ciertas hormonas humanas de origen natural y recombinantes (p.ej, insulina, hormona del crecimiento, factor de crecimiento similar a insulina 1, hormona folículo-estimulante, y chorionic gonadotropin) , proteínas hematopoyéticas (p.ej, eritropoyetina, C-CSF, General-Motors-CSF, e IL-11) , thrombotic y proteínas hematostatic (p.ej. Activador de plasminógeno tisular y proteína activada C) , proteínas inmunológicas (p.ej, interleucina) , y otras enzimas (p.ej, desoxiribonuclease I) . Las vacunas ejemplificantes que pueden producirse por las composiciones y métodos sometidas incluyen entre otras cosas vacunas contra diversos virus de influenza (p.ej, tipos A, B y C y diversos serotipos para cada tipo, como el H5N2, H1N1, H3N2 para el tipo Unos virus de influenza), VIH, hepatitis virues (p.ej, hepatitis A, B, C o D) , enfermedad de Lyme, y papillomavirus humano (HPV) . Los ejemplos del diagnóstico protéico heterólogamente producido incluyen entre otras cosas la secretina, tiroides hormona estimulante (TSH) , antigenos de VIH, y antigenos de hepatitis C.

Las proteínas o los péptidos producidos por la secuencia heteróloga pueden incluir, entre otras cosas citocinas, quimocinas, linfocinas, ligandos, receptores, hormonas, enzimas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, y factores de crecimiento. Los ejemplos no limitantes de receptores incluyen el tipo de factor de necrosis tumoral I receptor, tipo de receptor de IL-I II, antagonista de receptor de IL-I, receptor de IL-4 y cualquiera químicamente o receptores solubles genéticamente modificados. Los ejemplos de enzimas incluyen lactasa, activó la proteína C, factor VII, colagenasa (p.ej, comercializado por Advance Biofactures Corporation bajo el nombre Santyl); agalsidasa-ß (p.ej, comercializado por Genzyme bajo el nombre Fabrazyme) ; dornasa-a (p.ej, comercializado por Genentech bajo el nombre Pulmozyme); alteplasa (p.ej, comercializado por Genentech bajo el nombre Activasa) ; la asparaginasa pegilada (p.ej, comercializado por Enzon bajo el nombre Oncaspar) ; asparaginasa (p.ej, comercializado por Merck bajo el nombre Elspar) ; e imiglucerasa (p.ej. Comercializado por Genzyme bajo el nombre Ceredase) . Los ejemplos de polipéptidos o proteínas específicos incluyen, entre otras cosas factor estimulante de colonias macrófagos de granulocito (General-Motors-CSF) , factor estimulante de colonias granulociticas (G-CSF) , factor estimulante de colonias macrófagos (M CSF) , factor estimulante de colonias (CSF) , beta de interferón (IFN-ß), gamma de interferón (IFN ?) , factor de inducción gamma de interferón I (IGIF) , beta de factor de crecimiento transformante (TGF-ß) , RANTES (citocina expresada y secretada por el linfocito T normal en función de su grado de activación) (regulado mediante activación, linfocito T normal expresado para y probablemente secretado) , proteínas inflamatorias de macrófagos (p.ej, ???-1-a y ???-1-ß) , alargamiento de Leishmania que inicia el factor (LEIF) , plaqueta factor de crecimiento derivado (PDGF) , factor de necrosis tumoral (factor de necrosis tumoral) , factores de crecimiento, p.ej. Factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento de fibroblasto, (FGF) , factor de crecimiento nervioso (NGF) , cerebro factor neurotrófico derivado (BDNF) , neurotrofina 2 (NT-2), neurotrofina 3 (NT-3) , neurotrofina 4 (NT-4), neurotrofina 5 (NT-5) , glial factor neurotrófico derivado de la línea celular (GDNF) , ciliary factor neurotrófico (CNTF) , factor de necrosis tumoral tipo II receptor, eritropoyetina (EPO) , insulina y glucoproteínas solubles p.ej, gpl20 y glucoproteínas gpl60. La glucoproteína gp!20 es un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) proteina de envoltura, y la glucoproteína gpl60 es un precursor conocido a la glucoproteína gpl20. Otros ejemplos incluyen la secretina, nesiritide (B-tipo humano péptido natriurético (hBNP) ) , GLP-I.

Otros productos heterólogos pueden incluir GPCRs, Rhodopsin incluyendo, entre otros,' de clase A como receptores, como Muscatinic (Musa) . tipo de Vertebrado de acetilcolina 1, Musa, tipo de Vertebrado de acetilcolina 2, Musa, tipo de Vertebrado de acetilcolina 3, Musa, tipo de Vertebrado de acetilcolina 4; Adrenoceptores (Tipo 1 de Adrenoceptores Alfa, tipo 2de Adrenoceptores Alfa, tipo 1 de Adrenoceptores Beta, tipo 2 de Adrenoceptores Beta, tipo 3 de Adrenoceptores Beta, tipo 1 de Dopamina de Vertebrado, tipo 2 de Dopamina de Vertebrado, tipo 3 de Dopamina de Vertebrado, tipo 4 de Dopamina de Vertebrado, tipo 1 de Histamina,- tipo 2 de Histamina, tipo 3 de Histamina, tipo 4 de Histamina, tipo 1 de Serotonina, tipo 2 de Serotonina, tipo 3 de Serotonina, tipo 4 de Serotonina, tipo 5 de Serotonina, tipo 6 de Serotonina, tipo 7 de Serotonina, tipo 8 de Serotonina, otros tipos de Serotonina, amina de Traza, tipo 1 de Angiotensina, tipo 2 de Angiotensina, Bombesina, Bradicinina, anafilatoxina de C5a, Fmet-leu-phe, APJ como, Interleucina 8 tipo A, Interleucina 8 tipo B, Interleucina 8 otros de tipo, tipo de Quimocina de C-C 1 a través de tipo 11 y otros tipos, Quimocina de C-X-C (tipos 2 a través de 6 y otros), Quimocina de C-X3-C, Colecistocinina CCK, tipo de CCK A, CCK tipo B, otros de CCK, Endotelina, Melanocortina (Melanocyte hormona estimulante, Hormona adrenocorticotrópica, hormona de Melanocortin) , antigeno de Duffy, péptido que libera la Prolactina (GPR10) , Neuropéptido Y (tipo 1 a través de 7), neuropéptido Y, Neuropéptido Y otro, Neurotensina, Opioide (tipo D, K, M, X), Somatostatina (tipo 1 a través de 5), Tachykinin (Sustancia P (NK1) , Sustancia K (NK2), Neuromedina K (NK3), Tachykinin como 1, Tachykinin como 2, Vasopresina / vasotocina (tipo 1 a través de 2), Vasotocina, Oxitocina / mesotocina, Conopressin, Galanin como, activado por la Proteinasa como, Orexin & FF de neuropéptidos , QRFP, Quimocina parecida a un receptor, Neuromedina U como (Neuromedina U, PRXamide) , proteina hormonal (Hormona folículo-estimulante, hormona de Lutropin-choriogonadotropic, Thyrotropin, tipo de Gonadotropin I, tipo de Gonadotropin II), (Rhod) opsin, Vertebrado de Rhodopsin (tipos 1-5), tipo de Vertebrado de Rhodopsin 5, Artrópodo de Rhodopsin, tipo de Artrópodo de Rhodopsin 1, tipo de Artrópodo de Rhodopsin 2, tipo de Artrópodo de Rhodopsin 3, Molusco de Rhodopsin, ¦ Rhodopsin, Olfativo (Olfativo II fam 1 a través de 13), Prostaglandina (prostaglandina subtipo de E2 EP1, Prostaglandina subtipo de E2/D2 EP2, prostaglandina subtipo de E2 EP3, Prostaglandina subtipo de E2 EP4, F2-alfa de Prostaglandina, Prostacyclin, Thromboxane, tipo de Adenosina 1 a través de 3, Purinoceptores, Purinoceptor P2RY1-4,6,11 GPR91, Purinoceptor P2RY5 , 8,9,10 GPR35, 92 , 174 , Purinoceptor P2RY12-14 GPR87 (UDP-glucosa) , Canabinoide, factor de activación de Plaqueta, Gonadotropin-liberando hormona, Gonadotropin-liberando tipo hormonal I, Gonadotropin-liberando tipo hormonal II, hormona de Adipokinetic como, Corazonin, Thyrotropin-liberando hormona & Secretagogue, Thyrotropin-liberando 'hormona, secretagogue de Hormona del crecimiento, secretagogue de Hormona del crecimiento como, E cdy sis-provocación de hormona (ETHR) , elatonin, Lysosphingolipid & LPA (EDG) , 1 fosfato de Sphingosine Edg-l, ácido dé Lysophosphatidic Edg-2, 1 fosfato de Sphingosine Edg-3, ácido de Lysophosphatidic Edg-4, 1 fosfato de Sphingosine Edg-5, 1 fosfato de Sphingosine Edg-6, ácido de Lysophosphatidic Edg-7, 1 fosfato de Sphingosine Edg-8, Edg Otro Leucotrieno receptor de B4, Leucotrieno receptor de B4 BLTl, Leucotrieno receptor de B4 BLT2, Huérfano/otro de Clase A, neurotransmisores Putativos, SREB, proto-oncogén de Mas & Mas-relacionado (MRGs), GPR45 como, leucotrieno de Cysteinyl, proteina G receptor de ácido de bilis copulado, receptor de Ácido graso libre (GP40, GP41, GP43) , Secretina de Clase B como, Calcitonina, Corticotropin que libera factor, péptido inhibitorio Gástrico, Glucagón, hormona que libera la hormona del crecimiento, Hormona paratiroidea, PACAP, Secretina, Vasoactive polipéptido intestinal, Latrophilin, tipo de Latrophilin 1, tipo de Latrophilin 2, tipo de Latrophilin 3, receptores de ETL, inhibidor de angiogénesis Cerebral y especifico (BAI), proteínas Parecidas a un Matusalén (de lunes a JUEVES), Cadherin EGF RETRASO (CELSR) , el receptor acoplado a proteína G Muy mayor, la Clase C glutamato de Metabotropic / feromona, Grupo de glutamato de Metabotropic I a través de III, el sensible el Calcio como, el sensible el calcio Extracelular, Feromona, el sensible el calcio como otro, receptores de feromona Putativos, GABA-B, subtipo de GABA-B 1, subtipo de GABA-B 2, GABA-B como, Huérfano GPRC5, Huérfano GPCR6, Bride of sevenless proteins (REFUERZO) , receptores de Sabor (T1R) , la Clase D feromona Fúngica, A- Factor de feromona Fúngico como (STE2, STE3), feromona Fúngica B como (BAR, BBR, RCB, PRA) , receptores de AMPc de 'Clase E, proteínas de albinismo Oculares, familia de Frizzled/Smoothened, Grupo chisporroteado un (Fz 1&2&4&5&7- 9) , Grupo chisporroteado B (Fz 3 & 6) , Grupo chisporroteado C (otro) , receptores de Vomeronasal, quimiorreceptores de Nemátodo, receptores de insecto odorante, y la Clase Z Archaeal/opsinas fúngico / bacteriano.

Los péptidos bioactivos también pueden producirse por las secuencias heterólogas de la presente invención. Los ejemplos incluyen: BOTOX, Myobloc, Neurobloc, Dysport (u otros serotipos de neurotoxinas de botulinum) , alglucosidase alfa, daptomicina, YH-16, choriogonadotropin alfa, filgrastima, cetrorelix, interleucina 2, aldesleucina, teceleucina, denileucina diftitox, interferón alfa-n3 (inyección) , interferón alfa-nl, DL-8234, interferón, Suntory (gamma-la) , interferón gamma, timosina alfa 1, tasonermina, DigiFab, ViperaTAb, EchiTAb, CroFab, nesiritide, abatacept, alefacept, Rebif, eptotermina alfa, teriparatide (osteoporosis ) , calcitonina inyectable (enfermedad ósea), calcitonina (nasal, osteoporosis), etanercept, hemoglobina glutamer 250 (bovino) , drotrecogin alfa,, colagenasa, carperitide, factor de crecimiento epidérmico humano . recombinante (gel tópico, curación de herida) , DWP-401, darbepoetina alfa, Omega de epoetina, epoetina beta, epoetina alfa, desirudin, lepirudin, bivalirudin, nonacog alfa, Mononine, eptacog alfa Factor (activado), recombinante VIII + VWF, Recombinate, Factor recombinante VIII, Factor VIII (recombinante), Alphanate, octocog alfa, Factor VIII, palifermin, Indikinase, tenecteplase , alteplase, pamiteplase, reteplase, nateplase, monteplase, follitropin alfa, rFSH, hpFSH, micafungin, pegfilgrastim, lenograstim, nartograstim, sermorelin, glucagón, exenatide, pramlintide, imiglucerasa, galsulfase, Leucotropin, molgramostim, triptorelin acetato, histrelin (implante subcutáneo, Hydron) , deslorelin, histrelin, nafarelina, liberación prolongada de l'euprolido de liberación lenta (ATRIGEL) , implante, de leuprolido (DUROS), goserelina, somatropin, Eutropin, programa ' KP-102, somatropin, somatropin, yo casermin (falla de crecimiento), enfuvirtide, Org-33408, insulina glargine, insulina glulisine, insulina (inhalada), insulina lispro, insulina detemir, insulina (bucal, RapidMist) , mecasermin rinfabate, anakinra, celmoleucina, 99mTc-apcitide inyección, myelopid, Betaseron, glatiramer acetato, Gepon, el sargramostim, oprelvekin, humano interferón alfa derivado del leucocito, Bilive, insulina insulina humana ( recombinante ) , recombinante, insulina aspart, mecasermin, Roferón A, alfa del interferón 2, Alfaferone, interferón alfacon-1, alfa de interferón, Avonex ' hormona luteinizante humana recombinante, domase alfa, trafermin, ziconotide, taltirelin, dibotermin alfa, atosiban, becaplermin, eptifibatide, Zemaira, CTC-111, Shanvac-B, vacuna de HPV ( quadrivalent ) , EL 002 DE NOVIEMBRE, octreotido, lanreotide, ancestim, beta de agalsidasa, agalsidasa alfa, laronidase, prezatide acetato de cobre (gel tópico) , rasburicase, ranibizumab, Actimmune, Intrón de PEG, Tricomin, inyección de deseñsibilización de alergia de ácaro de polvo de casa recombinante, hormona paratiroidea humana recombinante (PTH) 1-84 (se, osteoporosis ) , epoetina delta, antitrombina transgénica III, Granditropin, Vitrase, insulina recombinante, alfa del interferón (pastilla oral), GEMA 2 ES, vapreotide, idursulfase, omapatrilat, albúmina sérica recombinante, certolizumab pegol, glucarpidase, inhibidor de esterasa de Cl recombinante humano (angioedema) , lanoteplase, hormona del crecimiento humana recombinante, enfuvirtide (inyección sin aguja, Biojector 2000) , VGV-I, interferón (alfa) , lucinactant, aviptadil (enfermedad inhalada, pulmonar) , icatibant, ecallantide, omiganan, Aurograb, pexiganan acetato, ADI-PEG-20, LDI-200, degarelix, cintredekin besudotox, F ávido, MDX-1379, ISAtx-247, liraglutide, teriparatide (osteoporosis ) , tifacogin, AA-4500, loción de liposoma de T4N5, catumaxomab, DWP-413, TÉCNICA 123, Chrysalin, desmoteplase, amediplase, corifollitropin .alfa, TH-9507, teduglutide, Diamyd, DWP-412, hormona del crecimiento (inyección de liberación prolongada), G-CSF recombinante, insulina (inhalado, AIRE), insulina (inhalado, Technosphere) , insulina (inhalado, AERx) , RGN-303, DiaPep277, beta de interferón (infección viral de hepatitis C (HCV) ) , interferón alfa-n3 (oral), belatacept, parches de insulina transdérmicos , AMG-531, MBP-8298, Xerecept, opebacan, AIDSVAX, GV-1001, LymphoScan, ranpirnase, Lipoxysan, lusupultide, P52 (portador de beta-tricalciumfosfato, regeneración ósea), vacuna de melanoma, sipuleucel-T, CTP-37, Insegia, vitespen, trombina humana (sangrado congelado, quirúrgico) , trombina, TransMID, alfimeprase, Puricase, terlipressin (intravenoso, hepatorenal síndrome), EUR-1008M, FGF-I recombinante (enfermedad inyectable, vascular) , BDM-E, rotigaptide, ETC. 216, P-113, MBI-594AN, duramicina (inhalado, fibrosis quística) , SCV-07, OPI-45, Endostatin, Angiostatin, ABT-510, el Inhibidor de Arquero Birk Se concentra, XMP-629, 99mTc-Hynic-Annexin V, kahalalide F, CTCE-9908, teverelix (liberación prolongada), ozarelix, romidepsin, BAY-50-4798, interleucina 4, PRX-321, Pepscan, iboctadekin, rh lactoferrina, TRU-015, IL-21, ATN-161, cilengitide, Albuferon, Biphasix, IRX-2, interferón de Omega, PCK-3145, TAPA 232, pasireotide, huN901-DMl, cáncer ovárico vacuna inmunoterapéutica, SB-249553, Oncovax-CL, OncoVax-P, BLP-25, CerVax-16, vacuna de melanoma de péptido de multiepitopo (MERCADO-I, gp 100, tirocinasa) , nemifitide, rAAT (inhalado), rAAT (dermatológico), CGRP (inhalado, asma), pegsunercept, thymosin la beta 4, plitidepsin, GTP-200, ramoplanin, GRASPA, OBI-I, corriente alterna 100, calcitonina de salmón (oral, eligen) , calcitonina (oral, osteoporosis ) , examorelin, capromorelin, Cardeva, velafermin, 131I-TM-601, KK-220, TP-10, ularitide, depelestat, hematide, Chrysalin (tópico), rNAPc2, Factor recombinante VIII (Pegilado liposomal) , bFGF, variante staphylokinase recombinante Pegilada, V-10153, SonoLysis Prolisan, NeuroVax, CZEN-002, célula de islote neogenesis terapia, rGLP-1, BIM-51077, LY-548806, exenatide (liberación controlada, Medisorb) , AVENIDA 0010, GA-GCB, avorelin, AOD-9604, linaclotide acetato, CETi-I, Hemospan, VAL (inyectable), insulina de acción rápida (inyectable, Viadel) , insulina intranasal, insulina (inhalada), insulina (oral, eligen), leptin humano methionyl recombinante, pitrakinra inyección subcutánea, eczema) , pitrakinra (polvo seco inhalado, asma) , Multiganado bovino, RG-1068, M 093, NBI-6024, A 001, PI 0824, Org-39141, CpnlO (enfermedades autoinmunitarias / inflamación) , talactoferrin (tópico), REV 131 (oftálmico), REV 131 (enfermedad respiratoria) , insulina humana recombinante oral (diabetes) , RPI-78M, oprelvekin (oral), CYT-99007 CTLA4-Ig, DTY-001, valategrast, interferón alfa-n3 (tópico), IRX-3, RDP-58, Tauferon, sal de bilis lipasa estimulada, Merispase, fosfatasa alcalina, EP-2104R, Melanotan-II, bremelanotide, ATL-104, microplasmina humana recombinante,' HACHA 200, SE AX, ACV-I, Xen-2174, CJC-1008, dynocphin A, SI-6603, LABORATORIO GHRH, AER-002, BGC-728, vacuna de malaria (virosomes, PeviPRO) , ALTU-135, parvovirus B19 vacuna, la ' vacuna contra la gripe (neuraminidasa recombinante) , malaria/HBV vacuna, vacuna de ántrax, Vacc-5q, Vacc-4x, vacuna de VIH (oral) , vacuna de HPV, Hace encaje el Toxoide, YSPSL, CHS-13340, PTH (1-34) crema liposomal (Novasome) , Ostabolin-C, análogo de PTH (tópico, psoriasis), MBRI-93.02, vacuna de TB72F (tuberculosis), vacuna de MVA-Ag85A (tuberculosis), LEJOS 404, British Airways 210, plaga recombinante vacuna de F1V, AG-702, OxSODrol, rBetVl, vacuna que apunta con acción selectiva hacia el alérgeno Der-pl/Der-p2/Der-p7 (alergia de ácaro de polvo), antigeno de péptido de PR1 (leucemia), mutante ras vacuna, HPV-16 E7 vacuna de lipopéptido, labyrinthin vacuna (adenocarcinoma),, vacuna de C L, vacuna WTl-peptídica (cáncer), IDD-5, CDX-110, Pentrys, Norelin, CytoFab, P-9808, VT-111, icrocaptide, telbermin (dermatológico, úlcera de pie diabético), rupintrivir, reticulose, rGRF, PIA, la galactosidasa alfa A, AS 011, ALTU-140, CGX-1160, angiotensina vacuna terapéutica, D-4F, ETC. 642, APP-018, rhMBL, SCV-07 (oral, tuberculosis), DRF-7295, ABT-828, inmunotoxina ErbB2-especifica (contra el cáncer), DT388IL-3, TST-10088, 1762 PRO, Combotox, cholecystokinin-B/gastrin-receptor péptidos de unión, 11 Hn-hEGF, evento adverso 37, trastuzümab-DMl, el Antagonista G, IL-12 (recombinante) , de la tarde 02734, DIABLILLO 321, rhIGF-BP3, BLX-883, CUV-1647 (tópico) , L-19 radioimmunotherapeutics con base (cáncer), Re-188-P-2045, AMG-386, DC/I540/KLH vacuna (cáncer), VX-001, AVENIDA 9633, corriente alterna 9301, vacuna de NY-ESO-I (péptidos), NA17. Péptidos de A2, vacuna de melanoma (antigeno pulsado terapéutico), vacuna de cáncer de próstata, CBP-501, lactoferrina humana recombinante (resequedad ocular), FX-06, AP-214, WAP-8294A2 (inyectable), ACP-CADERA, SOL 11031, YY peptídico [3-36] (obesidad, intranasal), FGLL, atacicept, BR3-Fc, MIL MILLONES 003, British Airways 058, hormona paratiroidea humana 1-34 (nasal-, osteoporosis ) , F-18-CCR1, A 1001 (enfermedad/diabetes celiaca) , JPD-003, PTH (7-34) crema liposomal (Novasome) , duramicina (oftálmico, resequedad ocular), TAXI 2, CTCE-0214, eritropoyetina de GlycoPEGylated, EPO-Fc, CNTO-528, AMG-114, 013 hijos, Factor XIII, aminocandin, PN-951, 716155, SOL-E7001, TH-0318, BAY-73-7977, teverelix (liberación inmediata), EP-51216, hGH (liberación controlada, Biosfera), OGP-I, sifuvirtide, TV 4710, ALG-889, Org-41259, rhCCIO, F-991, thymopentin (enfermedades pulmonares) , r (m) proteina C-reactiva, insulina hepatoselectiva, subalina, L 19-IL-2 proteina de fusión, elafam, NMK-150, ALTU-139, EN 122004, rhTPO, agonista del receptor de trombopoyetina (trastornos trombocitopénicos ) , AL 108, AL 208, antagonistas de factor de crecimiento nerviosos (dolor), SLV-317, CGX-1007, INNO-105, teriparatide oral (eligen) , GEMA-OSL, corriente alterna 162352, PRX-302, vacuna de fusión de LFn-p24 (Therapore) , EP-1043, S pneumoniae vacuna pediátrica, vacuna de malaria, Grupo de Neisseria meningitidis B vacuna, grupo neonato B streptococcal vacuna, vacuna de ántrax, .vacuna de HCV (gpEl + gpE2 + MF-59), terapia de medios de otitis, vacuna de HCV (antigeno principal + ISCOMATRIX) , hPTH .(1-34) ( transdérmico, ViaDerm) , 768974, SYN-101, PGN-0052, aviscumine, BIM-23190, vacuna de tuberculosis, multiepitopo tyrosinase péptido, vacuna de cáncer, enkastim, APC-8024, soldado 5005, CUENTA-OOL, TTS-CD3, factor de necrosis tumoral apuntado con acción selectiva hacia del modo vascular (tumores sólidos) , desmopresina (liberación controlada bucal), onercept, y TP-9201.

En ciertas modalidades, la proteina heterólogamente producida son fragmentos enzimáticos o biológicamente activos de lo mismo. Las enzimas adecuadas incluyen entre otras cosas: oxidorreductasas , transferasas , hidrolasas, lyases, isomerasas, y ligasas. En ciertas modalidades, la proteina heterólogamente producida es una enzima de la Comisión Enzimática (EC) la clase 1, por ejemplo una enzima de cualquier del EC 1.1 a través de 1.21, o 1.97. La enzima también puede ser una enzima de la clase 2, 3, 4, 5 de EC, o 6. Por ejemplo, la enzima puede seleccionarse a partir de cualquier del EC 2.1 a través de 2.9, EC 3.1 a 3.13, EC 4.1 a 4.6, EC 4.99, EC 5.1 a 5.11, EC 5.99, o EC 6.1-6.6.

En ciertas modalidades la proteina heterólogamente producida es acetilasa, acilasa, aldolasa, amidasa, amilasa, ATPasa, carboxilasa, ciclasa, cicloisomerasa, deacetilasa, deacilasa, descarboxilasa, deciclasa, dehalogenasa, dehidratasa, deshidrogenasa, dehidroxilasa, demetilasa, depolimerasa, desaturasa, dioxigenasa, dismutasa, endonucleasa, epimerasa, epoxidasa, esterasa, exonucleasa, galactosidasa , glucosidasa, glucosidasa, glicosilasa, halogenasa, hidratasa, hidrogenasa, hidrolasa, hidroxilasa, hidroxitransferasa, isomerasa, ligasa, lipasa, lipooxigenasa, liasa, metilesterasa, · monooxigenasa, mutasa, nucleasa, nucleosidasa, nucleotidasa, oxidasa, oxidorreductasa, oxigenasa, peptidasa, peroxidasa, fosfatasa, fosfodiesterasa, fosfolipasa, polimerasa, polimerasa, proteasa, proteinasa, racemasa, reductasa, reductoisomerasa, rionucleasa, ribonucleasa, sintasa, sintetasa, tautomerasa, tioesterasa, tioglucosidasa, tiolesterasa, topoisomerasa, o tránshidrogenasa . Las cinasas adecuadas incluyen entre otras cosas: tirosina cinasa, cinasas de serina, treoninas cinasa, cinasas de aspartina, y cinasas de histidina. Las fosforilasas adecuadas incluyen entre otras cosas: fosforilasas de tirosina, fosforilasas de serina, y fosforilasas de treonina.

En ciertas modalidades, la proteina heterólogamente producida es unos fragmentos isomerasos o biológicamente activos de lo mismo. Isomerasas adecuadas incluyen entre otras cosas: isomerasa de difosfato de isopentenilo ("IPP") o fragmentos biológicamente activos de lo mismo.' En ciertas modalidades, la proteina heterólogamente producida es una sintasa o fragmentos biológicamente activos de lo mismo. Las sintasas . adecuadas incluyen entre otras cosas: prenildifosfatos sintasa y terpenos sintasa. Prenildifosfatos sintasa adecuadas, o preniltransferasas , por ejemplo, la preniltransferasa puede ser una sintasa difosfato electrónica-isoprenil, incluyendo, entre otros, sintasa de difosfato de geranilo (GPP) , farnesil I sintasa de difosfato (FPP), sintasa de difosfato de geranilgeranilo (GGPP) , sintasa de difosfato de hexaprenilo (HexPP) , sintasa de difosfato de heptaprenilo (HepPP) , sintasa de difosfato de octaprenilo (OPP) , solanesil sintasa de difosfato (SPP) , sintasa de difosfato de decaprenilo (DPP), chicle sintasa, y sintasa de gutapercha; y una sintasa de difosfato de Zisoprenyl,- incluyendo, entre otros, sintasa de difosfato de nonaprenilo (NPP) , sintasa de difosfato de undecaprenilo (UPP) , dehidrodoliquil sintasa de difosfato, sintasa de difosfato de eicosaprenilo, sintasa de caucho natural, y otras síntesis de difosfato de Zisoprenyl. En algunas modalidades, la preniltransferasa se codifica por una secuencia exógena .

Las secuencias nucleotídicas de diversas transferasas de prenilo de una variedad de especies se conocen, y pueden usarse o modificado para usarlo en la generación de secuencias heterólogas para producir las proteínas heterólogas ya mencionadas. Por ejemplo, las secuencias para lo siguiente son disponibles al público: ARNm de sintetasa de pirofosfato farnesil humano (Número de acceso de GenBank J05262; Homo sapiens); sintetasa de difosfato de farnesil (FPP) gen (Número de acceso de GenBank J05091; Saccharomyces cerevisiae) ; isopentenilo difosfato : dimethylallyl gen de isomerasa de difosfato (J05090; Saccharomyces cerevisiae) ; Wang y Ohnuma (2000) Biochim. Biophys. Acta 1529:33-48; Patente de EE.UU. No. 6 645 747; Arabidopsis thaliana farnesil sintetasa de pirofosfato 2 (FPS2) / sintetasa de FPP 2 / farnesil sintasa de difosfato 2 ARNm (At4gl7190) (Número de acceso de GenBank NM_202836) ; sintasa de difosfato de geranilgeranilo de Ginkgo biloba (ggpps) ARNm (Número de acceso de GenBank AY371321); Sintasa de pirofosfato de geranilgeranilo de Arabidopsis thaliana (GGPS1) / sintetasa de GGPP / farnesiltranstransferasa (At4g36810) ARNm (Número de acceso de GenBank N _119845) ; gen de Synechococcus elongatus para farnesil, geranilgeranilo, geranilfarnesil , hexaprenilo, sintasa de difosfato de heptaprenilo (SelF-HepPS) (Número de acceso de GenBank AB016095) .

En otras modalidades, la proteina producida es un terpeno sintasa, incluyendo entre otros:' sintasa de amorpha-4,11-diene, ß-caryophyllene sintasa, germacrene Una sintasa, sintasa 8-epicedrol, valencene sintasa, (+) - d-cadinene sintasa, germacrene C sintasa, (E) -ß-farneseno sintasa, casbene sintasa, vetispiradiene sintasa, 5-epi-aristolochene sintasa, aristolchene sintasa, a-humulene sintasa, (E, E)-ot-farneseno sintasa, (-)-p-pineno sintasa, sintasa de ?-terpineno, ciclasa de limoneno, sintasa de linalool, sintasa 1,8-cineole, (+)-sabineno sintasa, sintasa de E-a-bisaboleno, (+)-bornyl sintasa de difosfato, levopimaradiene sintasa, abietadiene sintasa, isopimaradiene sintasa, (E) - ?-bisabolene sintasa, taxadiene sintasa, copalyl sintasa de pirofosfato, kaurene sintasa, longifolene sintasa, ?-humulene sintasa, d-selinene sintasa, ß-phellandrene sintasa, sintasa de limoneno, myrcene sintasa, terpinoleno sintasa, (-) sintasa de canfeno, (+) - sintasa 3-carene, syn-copalyl sintasa de difosfato, a-terpineol sintasa, syn-pimara-7 , 15-diene sintasa, ent-sandaaracopimaradieno sintasa, stemer-13-ene sintasa, ?-ß-ocimeno, sintasa de S-linalool, sintasa de geraniol, sintasa de ?-terpineno, linalool synthasel, sintasa de ?-ß-ocimeno, epi-cedrol sintasa, -zingiberene sintasa, guaiadiene sintasa, cascarilladieno sintasa, sintasa de CEI-muuroladiene, aphidicolan-16b-ol sintasa, elizabethatriene sintasa, sandalol sintasa, patchoulol sintasa, zinzanol sintasa, cedrol sintasa, scareol sintasa, copalol sintasa, y sintasa manool.

En algunas modalidades, la proteina heterólogamente producida es una enzima, o fragmentos biológicamente activos de lo mismo, que funciona en una vía metabólica. La proteina heterólogamente producida puede ser una enzima que funciona en una vía catabólica. Los ejemplos adecuados de vías catabólicas incluyen · entre otras cosas vías de la respiración aeróbica, que incluyen la glucólisis, la descarboxilación oxidativa de piruvato, ciclo de ácido cítrico, y fosforilación oxidativa; y vías de respiración anaerobia (fermentación) . En otras modalidades, la proteína heterólogamente producida es una enzima que funciona en una vía anabólica. Los ejemplos adecuados de vías anabólicas incluyen entre otras cosas al dependiente de vía de mevalonato ("MEV") y la vía ("DXP") independiente de mevalonato para la producción de isopentenildifosfato isomerasa ("IPP"). IPP puede ser convertido adicionalmente a isoprenoides Por ejemplo, secuencias heterólogas que codifican para las enzimas de vía de MEV que desempeñan un papel en el control del flujo metabólico de la vía, como los implicados en etapas de limitando de velocidad, o implicado en la síntesis de productos intermedios metabólicos se pueden usar en la presente invención. Las enzimas de vía de MEV ejemplificantes de esta categoría incluyen entre otras cosas la redúctasa de HMG-CoA, la sintasa de HMG-CoA, y la cinasa de mevalonato.

Las enzimas, o fragmentos biológicamente activos de lo mismo, implicados en la vía DXP se han identificado y han aislado y se pueden usar. Estas enzimas incluyen la sintasa l-deoxixilulosa-5-fosfato (codificada por el gen "dxs"), reductoisomerasa de l-deoxixilulosa-5-fosfato (se codifica por el gen "dxr", también conocido el gen "ispC"), 2C-metil-D-eritritol cytidyltransferase enzima (codificó por el gen "ispD", también conocido ya que el gen "ygbP"), cinasa de A-diphosphocytidyl-2-C-methyleritritol (codificó por el gen "ispE", también conocido el gen "ychB"), 2C-metil-D-eritritol sintasa 2 , 4-cyclodifosfato (codificado por el gen "ispF", también conocido como el gen "ygbB"), la sintasa de CTP (codificó por el gen "pyrG", también conocido como el gen "ispF"), una enzima implicada en la formación del difosfato de dimetilalilo (codificó por el gen "lytB", también conocido como el gen "ispH"), una enzima implicada en la síntesis de l-hydroxy-2-metil-2- (E) - butenilo sintasa de 4 difosfatos (codificó por el "gcpE' gen, también conocido como el gen "ispG") .

El polipéptido/secuencias nucleotídicas ejemplificante' de la vía DXP incluye entre otras cosas la sintasa de D-I-desoxixilulosa 5-fosfato {Escherichia coli, ACCESO# AF035440), l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (Pseudomonas putida KT2440, ACCESO* NC_002947 locusjag PP0527), l-deoxixilulosa-5-fosfato sintasa {Salmonela entérica subsp. entérica serovariedad Paratyphi Un str. ATCC 9150, ACCESO* CP000026, locusjag SPA2301), 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (Rhodobacter sphaeroides 2.4.1, ACCESO* NC_007493 locusjag RSP_0254), l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa {Rhodopseudomonas palustris CGA009, ACCESO* NC 005296 locusjag RPA0952) , l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa {Xylella fastidiosa Temeculal, ACCESO* NC_004556 locusjag PD1293) , 1-desoxi-D-xilulosa sintasa de 5 fosfatos (Arabidopsis thaliana, ACCESO* NC_003076 locusjag AT5G11380) , 1-desoxi-D-xilulosa reductoisomerasa de 5 fosfatos (Escherichia coli, ACCESO* AB013300), 1-desoxi-D-xilulosa reductoisomerasa de 5 fosfatos (Arabidopsis thaliana, ACCESO* AF148852), 1-desoxi-D-xilulosa reductoisomerasa de 5 fosfatos (Pseudomonas putida KT2440, ACCESO* NC_002947 locusjag PP1597), 1-desoxi-D-xilulosa reductoisomerasá de 5 fosfatos (Streptomyces coelicolor A3 (2), ACCESO* AL939124 Locusjag C05694), 1-desoxi-D-xilulosa reductoisomerasá de 5 fosfatos (Rhodobacter sphaeroides 2.4.1, ACCESO* NCJI07493 locusjag RSP_2709) , 1-desoxi-D-xilulosa reductoisomerasá de 5 fosfatos (Pseudomonas fluorescens PfO-I, ACCESO* NC_007492 locusjag Pfl 1 107) , 4-diphosphoCytidyl-2C-metil-D-eritritol sintasa {Escherichia- coli, ACCESO* AF230736) , 4-diphosphocytidyl-2-metil-D-erithritol sintasa {Rhodobacter sphaeroides 2.4.1, ACCESO *, NC_007493 locusjag, RSP_2835), 4-Diphosphocytidyl-2C-metil-D-eritritol sintasa (Arabidopsis thaliana, ACCESO* NC_003071 locusjag AT2G02500) , 2-C-metil-D-eritritol cytidylyltransferase de 4 fosfatos {Pseudomonas putida KT2440, ACCESO* NC_002947 locusjag PP1614), cinasa de 4-diphosphocytidyl-C-metil-D-eritritol (ispE) gen {Escherichia coli, ACCESO* AF216300), 4-diphosphocytidyl-2C-metil-D-eritritol cinasa (ispE) {Rhodobacter sphaeroides 2 A.I, ACCESO* NCJI07493 locusjag RSP_1779) , 2C-metil-D-eritritol sintasa 2 , 4-cyclodifosfato {Escherichia coli, ACCESO* AF230738), La sintasa 2 , 4-cyclodifosfato de 2C-metil-D-eritritol (Rhodobacter sphaeroides 2.4.1, ACCESO* NC_007493 locusjag RSP_6071), 2-C-metil-D-eritritol sintasa 2,4-cyclodifosfato {Pseudomonas putida KT2440, ACCESO* NC_002947 locusjag PP1618) , l-hydroxy-2-metil-2- (E) - butenilo sintasa de 4 difosfatos {Escherichia coli, ACCESO* AY033515), 4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-yl sintasa de difosfato {Pseudomonas putida KT2440, ACCESO* NC_002947 locusjag PP0853), 4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-yl sintasa de difosfato {Rhodobacter sphaeroides 2.4.1, ACCESO* NC_007493 locusjag RSP_2982), IspH (LytB) {Escherichia coli, ACCESO* AY062212), 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl reductasa de difosfato {Pseudomonas putida KT2440, ACCESO* NC_002947 locusjag PP0606) , y cualquier otro gen de vía DXP descrito en la Solicitud estadounidense 20060121558, que se incorpora aquí por referencia.

Las secuencias nucleotidicas que codifican para enzimas implicadas en el ciclo de TCA inverso también son conocidas en la técnica y se pueden usar como secuencias heterólogas para producir productos heterólogos que son enzimas en el ciclo de TAC inverso. El polipéptido/secuencias nucleotidicas ejemplificante del Ciclo de TCA incluye la oxidorreductasa de ferrodoxina entre otras cosas 2-oxoglutarate {Hydrogenobacter thermophilus, ACCESO* AB046568, Bordetella bronchiseptica, ACCESO* Yl 0540), (Escherichia coli, ACCESO* U09868), reductasa de fumarato {Mannheimia haemolytica, ACCESO* DQ680277, Escherichia coli, ACCESO* AY692474), el piruvato: oxidorreductasa de ferrodoxina {Hydrogenobacter thermophilus, ACCESO* AB042412), deshidrogenasa de isocitrato {Chlorobium limicola, ACCESO* AB076021, Rattus norvegicus, ACCESO* NM_031551), sintasa de ATP-citrato {Chlorobium limicola, ACCESO* AB054670, Saccharomyces cerevisiae, ACCESO* X00782), phosphoenolpyruvate sintasa {Escherichia coli, ACCESO* X59381, M69116) , phospoenolpyruvate carboxilasa {Estreptococo thermophilus, ACCESO* AM167938, Lupinus luteus, ACCESO* AM235211), deshidrogenasa de malato {Chlorobaculum tepidum, ACCESO* X80838, Mus musculus, ACCESO* X07297, Klebsiella pneumoniae, ACCESO* AM051137), y/o fumarasa {Rhizopus oryzae, ACCESO* X78576, Solanum tuberosum, ACCESO* X91615) . Cualquier de éstos revierte ácidos nucleicos de ciclo de TCA poderse usar para generar una célula hospedera recombinante que produce el isoprenoide según los métodos de esta invención.

Una amplia selección de secuencias nucleotidicas que codifican para enzimas de vía de MEV está disponible en la técnica y las enzimas o los fragmentos biológicamente activos de lo mismo pueden emplearse fácilmente en construir las secuencias heterólogas sometidas. Lo siguiente es ejemplos no limitantes de secuencias nucleotidicas conocidas que codifican para productos de gen de vía de MEV, con Números de acceso de GenBank y organismo del origen siguiente cada enzima de vía de MEV, en paréntesis: acetoacetil-CoA thiolase: (REGIÓN de NCJD00913: 232413 L.2325315; £ . coli), (D49362; Paracoccus denitrificans) , y (L20428; Saccharomyces cerevisiae); HMGS : (NCJ) 01 145. complemento 19061.. 20536; Saccharomyces cerevisiae) , (X96617; Saccharomyces cerevisiae) , (X83882; Arabidopsis thaliana) , (AB037907; Kitasatospora griseola) , y (BT007302; Homo sapiens) (NC_002758, marcador de Locus SAV2546, GeneID 1122571; Staphylococcus aureus) ; HMGR: (NM_206548; Drosophila melanogaster) , (NC_002758, marcador de Locus SAV2545, GeneID 1122570; Staphylococcus aureus), (N _204485; Gallus gallus) , (AB015627; Streptomyces sp . KO-3988), (AF542543; Nicotiana attenuata), (AB037907; Kitasatospora griseola), (AX128213, proporcionando la secuencia que codifica para HMGR truncado; Saccharomyces cerevisiae), y (NC_001145: complemento (115734.. 118898; Saccharomyces cerevisiae)); MK: (L77688; Arabidopsis thaliana) , y (X55875; Saccharomyces cerevisiae) ; PMK : (AF429385; Hevea brasiliensis ) , (NM_006556; Homo sapiens), (NC_001145. complemento 712315.. 713670; Saccharomyces cerevisiae); MPD: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium) , y (U49260; Homo sapiens); e IDI: (NC_000913, 3031087.. 3031635; E. coli), y (AF082326; Haematococcus pluvialis).

Los productos de las. vías metabólicas pueden incluir hidrocarburos, y derivados allí de. Por ejemplo, saturado, insaturado, los cicloalcanos, y los hidrocarburos aromáticos pueden producirse por los métodos de la presente invención. Por ejemplo, los terpenos y los terpenoides, como isoprenoides, pueden producirse a consecuencia de la producción de proteínas heterólogas, como una enzima de la vía de MEV que se codifica por una secuencia heteróloga de la presente invención.

Los isoprenoides, incluyendo, entre otras cosas, cualquier C5 a través de C20 o isoprenoides de cantidad de carbono más elevados, pueden estar un producto heterólogo producido por los métodos descritos aquí. Lo siguiente describe, entre otras cosas, isoprenoides ejemplificantes, como cualquier C5 a través de C2o o isoprenoides de cantidad de carbono más elevados. Los ejemplos de compuestos C5 de la invención pueden derivarse de IPP o DMAPP. Estos compuestos también son conocidos como hemiterpenos porque ellos se derivan de una unidad de isopropeno individual (IPP o DMAPP). El isopropeno, cuya estructura es: se encuentra en muchos vegetales. El isopropeno es por lo común elaborado de IPP por la sintasa de isopropeno. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotídicas adecuadas incluyen entre otras cosas: (AB198190; Populus alba) y (AJ294819; Polulus alba x Polulus trémula) y puede ser la secuencia heteróloga de usado en la presente invención .

Los compuestos Ció, también conocidos como monoterpenos porque ellos se derivan de dos unidades de isopropeno, de la presente invención pueden derivarse del pirofosfato de geranilo (GPP) que se elabora por la condensación de IPP con DMAPP. En ciertas modalidades, las células hospederas de la presente invención comprenden una secuencia heteróloga que codifica para una enzima que convierte IPP y DMAPP en GPP. Una enzima conocida catalizar esta etapa es, por ejemplo, la sintasa de pirofosfato de geranilo. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas para la sintasa de pirofosfato de geranilo incluyen entre otras cosas: (AF513111; Abies grandis), (AF513112; Abies grandis), (AF513113; Abies grandis), (AY534686; Antirrino majus), (AY534687; Antirrino majus), (Yl 7376; Arabidopsis thaliana) , (AE016877, Locus API 1092; Bacillus cereus; ATCC 14579), (AJ243739; Cítrico sinensis) , (AY534745; Clarkia breweri) , (AY953508; Ipspini) , (DQ286930; Lycopersicon esculentum) , (AF182828; Mentha x piperita) , (AF182827; Mentha x piperita), (MPI249453; Mentha x piperita), (PZE431697, Locus CAD24425; Paracoccus zeaxanthinifaciens ) , (AY866498; Picrorhiza kurrooa) , (AY351862; Vitis vinifera) , y (AF203881, Locus AAF12843; Zymomonás mobilis) . GPP puede ser convertido posteriormente luego a una variedad de compuestos Cío. Los ejemplos ilustrativos de compuestos Cío incluyen entre otras cosas siguiente monoterpenos.

Por ejemplo, el monoterpeno puede ser carene, cuya estructura es Carene es por lo común elaborado de GPP por la sintasa carene. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas adecuadas incluyen entre otras cosas: (AF461460, REGIÓN 43.. 1926; Picea abies) y (AF527416, REGIÓN: 78.. 1871; la Salvia stenophylla) para el uso como secuencias heterólogas que codifican para la sintasa carene.

Otro monoterpeno, como el geraniol _ (también conocido como rhodnol), cuya estructura es: puede ser un producto producido por la presente invención. El geraniol es por lo común elaborado, de GPP por la sintasa de- geraniol. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas adecuadas incluyen entre otras cosas: (AJ457070; Cinnamomum tenuipilum) , (AY362553; Ocimum basilicum) , (DQ234300; cepa de Perilla frutescens 1864), (DQ234299; cepa de Perilla citriodora 1861), (DQ234298; cepa de Perilla citriodora 4935), y (DQ088667; Perilla citriodora) para codificar para la sintasa de geraniol que se puede usar una secuencia heterologa de la presente invención.

El monoterpeno, el linalool, cuya estructura es: son por lo común elaborados de GPP por la sintasa de linalool y pueden producirse por la presente invención. Los ejemplos ilustrativos de una secuencia nucleotidica adecuada incluyen, entre otras cosas: (AF497485; Arabidopsis thaliana), (AC002294, Locus AAB71482; Arabidopsis thaliana) , (AY059757; Arabidopsis thaliana), (NM_104793; Arabidopsis thaliana), (AF 154124; Artemisia annua) , (AF067603,- Clarkia breweri), (AF067602; Clarkia concinna) , (AF067601; Clarkia breweri), (U58314; Clarkia breweri), (AY840091; Lycopersicon esculentum) , (DQ263741; Lavandula angustifolía) , (AY083653; citrato de Mentha) , (AY693647; Ocimum basilicum) , (XM_463918; Oryza sativa), (AP004078, Locus BAD07605; Oryza sativa), (XM_463918, Locus XP_463918; Oryza sativa), (AY917193; Perilla citriodora) , (AF271259; Perilla frutescens), (AY473623; Picea abies), (DQ195274; Picea sitchensis), y (AF444798; Perilla frutescens var. crispa cultivar núm. 79) . Estas secuencias se pueden usar como secuencias heterólogas de la presente invención.

Otro monoterpeno, limoneno cuya estructura es v es por lo común elaborado de GPP por la sintasa de limoneno. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas adecuadas que se pueden usar como secuencias heterólogas de la presente invención incluyen entre otras cosas: (+) - sintasas de limoneno (AF514287, REGIÓN: 47.. 1867; Cítrico limón) y (AY055214, REGIÓN: 48.. 1889; Agastache rugosa) y (-) - sintasas de limoneno (DQ195275, REGIÓN: L.1905; Picea sitchensis), (AF006193, REGIÓN: 73.. 1986; Abies grandis), y (MHC4SLSP, REGIÓN: 29.. 1828; Mentha spicata) .

El monoterpeno, myrcene cuya estructura es: es por lo común elaborado de GPP por la sintasa myrcene y es otro producto que puede producirse por la presente invención,. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas adecuadas que se pueden usar como secuencias heterólogas de la presente invención incluyen entre otras cosas: (U87908; Abies grandis), (AY195609; Antirrino majus), (AY195608; Antirrino majus), (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10) , (NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN) , (N _113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN) , (AF271259; Perilla frutescens) , (AY473626; Picea abies) , (AF369919; Picea abies), y (AJ304839; Quercus ilex) .

Otro monoterpeno, -ocimeno y ß-ocimeno, cuyas estructuras son: respectivamente, son por lo común elaborados de GPP por la sintasa de ocimeno, una sintasa que puede codificarse por las secuencias heterologas de la presente invención. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas adecuadas que se pueden usar como secuencias heterologas incluyen entre otras cosas: (AY195607; Antirrino majus), (AY195609; Antirrino majus), (AY195608; Antirrino majus), (AK221024; Arabidopsis thaliana) , (NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN) , (NM_117775; Arabidopsis thaliana ATTPS03 ) , (NM_001036574 ; Arabidopsis thaliana ATTPS03) , (N _127982; Arabidopsis thaliana TPS10) , (ABl 10642; Cítrico unshiu Cit TSL4), y (AY575970; Loto corniculatus var . japonicus) .

Otro monoterpeno, -pineno cuya estructura es: es por lo común eJ ie GPP por la sintasa del -pineno, una sintasa que puede codificarse por las secuencias heterologas de la presente invención. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas adecuadas que se pueden usar como secuencias heterologas para codificar para la sintasa incluyen entre otras cosas: (+) sintasa de a-pineno (AF543530, REGIÓN: L.1887; Pinus taeda) , (-) sintasa de -pineno (AF543527, REGIÓN: 32.. 1921; Pinus taeda), y (+) / (-) sintasa de a-pineno (AGU87909, REGIÓN: 6111892; Abies grandis) .

Otro monoterpeno, ß-pineno cuya estructura es: es tyipically elaborado de GPP por la sintasa de ß-pineno, una sintasa que puede codificarse por las secuencias heterologas de la presente invención. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas adecuadas que se pueden usar como ' secuencias heterologas para codificar para la sintasa incluyen entre otras cosas: (-) sintasas de ß-pineno (AF276072, REGIÓN: L.1749; Artemisia annua) y (AF514288, REGIÓN: 26.. 1834; Cítrico limón).

Otro monoterpeno, sabineno, cuya estructura es: es por lo común elaborado de GPP por la sintasa sabineno, una sintasa que puede codificarse por las secuencias heterologas de la presente invención. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia nucleotidica adecuada que se puede usar como una secuencia heteróloga de incluye entre otras cosas AF051901, REGIÓN: 26.. 1798 de Salvia officinalis .

Otro monoterpeno ?-tepineno, cuya estructura es: es por lo común elaborado de GPP por una sintasa de ?-terpineno, una sintasa que puede codificarse por las secuencias heterologas de la presente invención. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas adecuadas que se pueden usar como secuencias heterologas incluyen entre otras cosas: (AF514286, REGIÓN: 30.. 1832 de Cítrico limón) y (AB1 10640, REGIÓN 1.. 1803 de Cítrico unshiu)..

Otro monoterpeno, terpinoleno, cuya estructura es: es por lo común elaborado de GPP por la sintasa terpinoleno, una sintasa que puede codificarse por las secuencias heterologas de la presente invención. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas adecuadas que se pueden usar como secuencias heterólogas incluyen entre otras cosas: (AY693650 de Oscimum basilicum) y (AY906866, REGIÓN: 10.. 1887 de Pseudotsuga menziesii) .

Los productos heterólogos de la presente invención también pueden ser compuestos CÍ5. Los . compuestos CÍ5 son generalmente derivan del pirofosfato farnesil (FPP) que se elabora por la condensación de dos moléculas de IPP con una molécula de DMAPP. Una enzima conocida catalizar esta etapa es, por ejemplo, farnesil la sintasa de pirofosfato. Estos compuestos Ci5 también son conocidos como sesquiterpenos porque ellos se derivan de tres unidades de isopropeno. En ciertas modalidades, las células hospederas de la presente invención comprenden una secuencia heteróloga que codifica para una enzima que convierte IPP y DMAPP en FPP.

Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas que codifican para el pirofosfato farnesil que puede ser secuencias heterólogas de la presente invención incluyen entre otras cosas: (AF461050; Tauro de Bos) , (AB003187, Micrococcus luteus), (AE009951, Locus AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberellafujikuroi) , (ABO 16094, Synechococcus elongatus) , (CP000009, Locus AA 60034; Gluconobacter oxydans 621er), (AF019892; Helianthus annuus), (HUMFAPS; Homo sapiens), (KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis), (LAU15777; Lupinus albus) , (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus) , (NCFPPSGEN; Neurospora crassa) , (PAFPS1; Parthenium argentatum) , (PAFPS2; Parthenium argentatum) , (RATFAPS; Rattus norvegicus), (YSCFPP; Saccharomyces cerevisiae) , (D89104; Schizosaccharomycespom.be), (CP000003, Locus AAT87386; Estreptococo pyogenes), (CP000017, Locus AAZ51849; Estreptococo pyogenes), (NC_008022, Locus YP_598856; Estreptococo pyogenes MGAS10270) , (NC_008023, Locus YP_600845; Estreptococo pyogenes MGAS2096) , (NC_008024, Locus YP_602832; Estreptococo pyogenes MGAS10750) , y (MZEFPS; Zea mays, (AB021747, Oryza sativa gen de FPPS1 para sintasa de difosfato farnesil), (AB028044, Rhodobacter sphaeroides) , (AB028046, Rhodobacter capsulatus), (AB028047, Rhodovulum sulfidophilum) , (AAU36376; Artemisia annua) , (AF1 12881 y AF136602, Artemisia annua), (AF384040, Mentha x piperita), (D00694, Escherichia coli K-12), (D13293, B. stearothermophilus), (D85317, Oryza sativa), (ATU80605; Arabidopsis thaliana) , (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana) , (X75789, A. el thaliana), (Y12072, G. arboreum) , (Z49786, H. brasiliensis) , (U80605, Arabidopsis thaliana farnesil precursor de sintasa de difosfato (FPS1) ARNm, completan cds), (X76026, K. lactis FPS gen para sintetasa de difosfato farnesil, gen de QCR8 para complejo de bel, subunidad VIII), (X82542, P. argentatum ARNm para sintasa de difosfato farnesil (FPS1), (X82543, P. el ARNm de argentatum para la sintasa de difosfato farnesil (FPS2), (BCO 10004, Homo sapiens, farnesil sintasa de difosfato (farnesil sintetasa de pirofosfato, dimetilaliltranstransferasa, geraniltranstransferasa) , GC de clon 15352 IMAGEN, 4132071, el ARNm, cds completo) (AF234168, Dictyostelium discoideum farnesil sintasa de difosfato (Dfps), (L46349, Arabidopsis thaliana farnesil sintasa de difosfato (FPS2) ARNm, cds completo), (L46350, Arabidopsis thaliana farnesil sintasa de difosfato (FPS2) gen, cds completo), (L46367, Arabidopsis thaliana farnesil sintasa de difosfato (FPS1) gen, productos alternativos, cds completo), (M89945, Rata farnesil gen de sintasa de difosfato, exones 1-8), (NM_002004, Homo sapiens farnesil sintasa de difosfato (farnesil sintetasa de pirofosfato, dimetilaliltranstransferasa, geraniltranstransferasa) (FDPS) , ARNm) , (U36376, Artemisia annua farnesil sintasa de difosfato (fpsl) ARNm, completan cds), (XM_001352, Homo sapiens farnesil sintasa de difosfato (farnesil sintetasa de pirofosfato, dimetilaliltranstransferasa - geraniltranstransferasa) (FDPS), ARNm), (XM_034497 , Homo sapiens farnesil . sintasa de difosfato (farnesil sintetasa de pirofosfato, dimetilaliltranstransferasa, geraniltranstransferasa) (FDPS) , ARNm), (XM_034498, Homo sapiens farnesil sintasa de difosfato (farnesil sintetasa de pirofosfato, dimetilaliltranstransferasa, geraniltranstransferasa) (FDPS), ARNm), (XM_034499, Homo sapiens farnesil sintasa de difosfato (farnesil sintetasa de pirofosfato, dimetilaliltranstransferasa, geraniltranstransferasa) (FDPS) , ARNm) , y (X _0345002, Homo sapiens farnesil sintasa de difosfato (farnesil sintetasa de pirofos.fato, dimetilaliltranstransferasa, geraniltranstransferasa) (FDPS) , ARNm) .

Alternativamente, FPP también puede elaborarse agregando IPP a GPP. Los ejemplos ilustrativos de la codificación de secuencias nucleotidicas para una enzima capaz de esta reacción incluyen entre otras cosas: (AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5) , (NM_202836; Arabidopsis thaliana), (D84432, Locus BAA12575; Bacillus subtilis), (U12678, Locus AAC28894; Bradyrhizobium japonicum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus ) , (NC_002940, Locus NP_873754; Haemophilus ducreyi 35000HP) , (L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae Rd K 20) , (J05262; Homo sapiens), (YP_395294; Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K) , (NC_005823, Locus YP_000273; serovariedad de Leptospira interrogans Copenhageni str. Fiocruz Ll-130) , (AB003187; Micrococcus luteus), (NC_002946, Locus YP_208768; FA de Neisseria gonorrhoeae 1090), (U00090, Locus AAB91752; Rhizobium sp. NGR234), (J05091; Saccharomyces cerevisae) , (CP000031, Locus AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS-3) , (AE008481, Locus AAK99890; Estreptococo pneumoniae R6), y (NC_004556, Locus NP 779706; Xylella fastidiosa Temeculal) .

FPP puede ser convertido, posteriormente luego a una variedad de compuestos C15. Un ejemplo ilustrativo de un compuesto Ci5 incluye entre otras cosas amorfadieno, cuya estructura es: y es un precursor a artemisinina, que se elabora por Artemisia anna . Amorfadieno es por lo común elaborado de FPP por la sintasa de amorfadieno, una sintasa que puede codificarse por las secuencias heterólogas de la presente invención. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia nucleotidica adecuada es SEQ ID NO. 37 de Número de Publicación de Patente Estadounidense 2004/0005678.

El a-Farneseno, cuya estructura es: es por lo común elaborado de FPP por la sintasa de a-farneseno, y puede producirse por los métodos descritos aqui. La sintasa que puede codificarse por secuencias heterólogas tal como, entre otras cosas DQ309034 del cultivar de Pyrus communis d'Anjou (pera; nombre génico AFS1) y AY1 82241 de Red eléctrica domestica (manzana; AFS1 génico) . Pechouus y Al-, Planta 219 (l):84-94 (2004).

El ß-Farneseno, cuya estructura es: es por lo común elaborado de FPP por la sintasa de ß-farneseno, y puede producirse por los métodos descritos aqui . La sintasa que puede codificarse por secuencias heterólogas tal como, entre otras cosas: número de acceso de GenBank AF024615 de Mentha x piperita (hierbabuena; Tspal 1 génico) , y AY835398 de Artemisia annua. Picaud et al., Phytochemistry 66 (9) : 961-967 (2005) y se pueden usar como secuencias heterólogas de la presente invención.

El farnesol, cuya estructura es: es por lo común elaborado de FPP por una hidroxilasa, como la sintasa de farnesol. El farnesol puede producirse a través del uso de secuencias heterólogas que pueden incluir entre otras cosas el número de acceso de GenBank AF529266 de Zea mays y YDR481C de Saccharomyces cerevisiae (Pho8 génico) . Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128: 149-158 (2006.

Nerolidol, cuya estructura es: también es conocido como peruviol, y es por lo común elaborado de FPP por una hidroxilasa, como la sintasa de nerolidol, que tal vez codificó por secuencias heterólogas de la presente invención. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia nucleotidica adecuada que se puede usar como una secuencia heteróloga incluye entre otras cosas AF529266 de Zea mays (maíz; gen tpsl) .

Patchoulól, cuya estructura es: es por lo común elaborado de FPP por la sintasa patchouliol. Patchoulól puede producirse en la presente invención usando secuencias heterólogas tal como, entre otras cosas REGIÓN de AY508730: 1. 1659 de Pogostemon cablin.

Valencene, cuya estructura es: es por lo común elaborado de FPP por la sintasa nootkatone. Los ejemplos ilustrativos de una secuencia nucleotidica adecuada que se puede usar para codificar para la sintasa incluyen entre otras cosas la REGIÓN de AF441124: \..\6A1 de Cítrico sinensis y REGIÓN AY917195: 1. 1653 de Perillafrutescens .

Los productos heterólogos también pueden incluir compuestos C2o, como los derivados del pirofosfato geranilgeraniol (GGPP) que se elabora por la condensación de tres moléculas de IPP con una molécula de DMAPP. Estos compuestos C2o también son conocidos como diterpenos porque éstos se derivan de cuatro unidades de isopropeno. En ciertas modalidades, las células hospederas de la presente invención comprenden una secuencia heteróloga que codifica para una enzima que convierte IPP y DMAPP en GGPP. Una enzima conocida catalizar esta etapa es, por ejemplo, la sintasa de pirofosfato de geranilgeranilo.

Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotidicas para la sintasa de pirofosfato de geranilgeranilo incluyen entre otras cosas: (ATHGERPYRS; Arabidopsis thaliana) , (BT005328; Arabidopsis thaliana), (N _119845; Arabidopsis thaliana), (NZ_AAJM01000380, Locus ZP_00743052 ; Bacillus thuringiensis serovariedad israelensis, ATCC 35646 sql563) , (CRGGPPS; Catharanthus roseus) , (NZ_AABF02000074 , Locus ZP_00144509; Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberellafuj ikuroi ) , (AY371321; Ginkgo biloba), (AB055496; Hevea brasiliensis ) , (ABO 17971; Homo sapiens), (MCI276129; Mucor circinelloides f. lusitanicus) , (AB016044; Mus musculus), (AABX01000298, Locus NCU01427; Neurospora crassa), (NCU20940; Neurospora crassa) , (NZ_AAKL01000008, Locus ZP_00943566; Ralstonia solanacearum UW551), (AB118238; Rattus norvegicus) , (SCU31632; Saccharomyces cerevisiae) , (AB016095; Synechococcus elongates), (SAGGPS; Sinapis alba), (SSOGDS; Sulfolobus acidocaldarius) , (NC_007759, Locus YP_461832; Syntrophus aciditrophicus SB) , y (NC_006840, Locus YP_204095; Vibrio fischeri ES1 14) .

Alternativamente, GGPP también puede elaborarse agregando IPP a FPP. Los ejemplos ilustrativos de secuencias nucleotídicas que codifican para una enzima capaz de esta reacción incluyen entre otras cosas: (NM_112315; Arabidopsis thaliana), (ERWCRTE; Pantoea agglomerans) , (D90087, Locus BAA14124; Pantoea ananatis) , (X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus) , (AF195122, Locus AAF24294; Rhodobacter sphaeroides ) , y (NC_004350, Locus NP_721015; Estreptococo mutans UA159) . GGPP puede convertirse posteriormente luego a una variedad de isoprenoides C¿0. Los ejemplos ilustrativos de compuestos C20 incluyen por ejemplo, geranilgeraniol . Geranvlgeraniol, cuya estructura es: puede elaborarse por P-ej, añadiendo a los constructos de expresión un gen de fosfatasa después del gen para una sintasa GGPP.

Abietadiene es otro diterpeno que puede producirse por los métodos descritos aquí. Abietadiene abarca los isómeros que siguen: y es por lo común elaborado por la sintasa abietadiene. La sintasa de Abietadience puede codificarse por una secuencia nucleotidica heteróloga adecuada incluyendo, entre otros: (U50768; Abies grandis) y (AY473621; Picea abies) .

Los C2o + compuestos también son dentro del alcance de la presente invención. Los ejemplos ilustrativos de tales compuestos incluyen sesterterpenos (compuesto de C25 elaborado de cinco unidades de isopropeno) , triterpenos (compuestos de C30 elaborados de seis unidades de isopropeno) , y tetraterpenos (compuesto de C40 elaborado de ocho unidades de isopropeno) . Estos compuestos se elaboran usando métodos similares descritos aquí y substituyendo o adicionando secuencias nucleotidicas para la sintasa (s) adecuada.

En algunas modalidades, la cantidad del producto heterólogamente producido es mayor que 10mg/L. Por ejemplo, en algunas modalidades, la cantidad de producto producido por una célula de la invención abarca desde sobre 10mg/L hasta aproximadamente 100mg/L, de aproximadamente 100mg/L hasta aproximadamente l,000mg/L, de aproximadamente l,000mg/L hasta aproximadamente l,500mg/L, de aproximadamente l,500mg/L hasta aproximadamente 2,000mg/L, de aproximadamente 2,000mg/L hasta aproximadamente 3,000mg/L, de aproximadamente 3,000mg/L hasta aproximadamente 4,000mg/L, de aproximadamente 4,000mg/L hasta aproximadamente 5,000mg/L, de' aproximadamente 5,000mg/L hasta aproximadamente 6,000mg/L, de aproximadamente 6,000mg/L hasta aproximadamente 7,000mg/L, de aproximadamente 7,000mg/L hasta aproximadamente 8,000mg/L, o de aproximadamente 8,000mg/L hasta aproximadamente 10,000mg/L. En ciertas modalidades, la cantidad del producto heterologamente producido es mayor que 10,000mg/L. En cierto tales modalidades, la cantidad de producto heterologamente producido abarca desde sobre 10,000mg/L hasta aproximadamente 20,000mg/L, de aproximadamente 20,000mg/L hasta aproximadamente 3O,O00mg/L, de aproximadamente 30,000mg/L hasta aproximadamente 40,000mg/L, o de aproximadamente 40,000mg/L hasta aproximadamente 50,000mg/L. En ciertas modalidades, la cantidad del producto heterologamente producido es mayor que 50,000mg/L. Los niveles de producción se expresan en un por volumen de unidad (p.ej, por litro) base de cultivo celular. El nivel de proteina o compuesto producido es fácilmente determinado usando métodos bien conocidos, P-ej, espectometria de masa y cromatografía de gas, espectrometría de masas de la cromatografía líquida, espectrometría de masas de la cromatografía de ión, cromatografía en capa fina, detección amperometric pulsada, y espectrometría de luz-ultravioleta-vis .

La proteína heterólogamente producida, o compuesto elaborado por tal proteína, puede ser recuperada de la célula hospedera o del medio de cultivo en el cual la célula hospedera se cultiva usando métodos de purificación convencionales conocidos en la técnica, incluyendo, p.ej, cromatografía líquida de alta eficiencia, cromatografía de gas, y otros métodos cromatográficos convencionales. En algunas modalidades, la proteína purificada o compuesto es puro, p.ej, al menos aproximadamente el 40 % puro, al menos aproximadamente el 50 % puro, al menos aproximadamente el 60 % puro, al menos aproximadamente el 70 % puro, al menos aproximadamente el 80 % puro, al menos aproximadamente el 90 % puro, al menos aproximadamente el 95 % puro, al menos aproximadamente el 98 %, o más del 98 % puro, donde el término "puro" se refiere a proteína o compuesto que está libre de productos laterales, macromoléculas, contaminantes, etc .

Los productos heterólogos de la presente invención pueden ser comercialmente e industrialmente útiles. Por ejemplo, los isoprenoides producidos se pueden usar como productos farmacéuticos, cosméticos, perfumes, pigmentos y colorantes, antibióticos, fungicidas, antisépticos, nutracéuticos (p.ej vitaminas), productos intermedios químicos finos, polímeros, feromonas, productos químicos industriales, y combustibles.

En una modalidad, el isoprenoide producido es una vitamina, como la Vitamina A, E, o K y otro isoprenoide nutrientes con base. La vitamina- K, una vitamina importante implicada en el sistema de coagulación de la sangre, que se utiliza como un agente hemostático. La vitamina K también es implicada en el osteo-metabolismo, puede aplicarse al tratamiento de la osteoporosis . Además, ubiquinona y la vitamina K son efectivas en la inhibición de percebes de agarrarse a objetivos, y tan elabore un aditivo adecuado para pintar productos para impedir a percebes adherir.

La presente invención también proporciona métodos a la producción de isoprenoides, como ubiquinona, que desempeña un papel in vivo como un componente esencial del sistema de transporte de electrones .. Ubiquinona es útil no sólo como un producto farmacéutico efectivo contra enfermedades cardíacas, pero también como un aditivo alimenticio beneficioso. La filoquinona y la menaquinona han sido aprobadas como productos farmacéuticos.

La presente invención también implica la producción de o carotenoides, como ß-caroteno, astaxantina, y criptoxantina, que se esperan que posea la actividad de prevención de cáncer y la actividad inmunopotenciadora . Los carotenoides producidos por estos métodos también pueden usarse como pigmentos. Los carotenoides representan una de las clases el más extensamente distribuidas y estructuralmente diversas de pigmentos naturales, produciendo colores de pigmento del amarillo ligero a la naranja al rojo intenso. Los ejemplos de tejidos de carotenogenic incluyen zanahorias, jitomates, pimientos rojos, y los pétalos de narcisos y caléndulas. Los carotenoides se sintetizan por todos los organismos fotosintéticos , asi como algunas bacterias y hongos . Estos pigmentos tienen funciones importantes en fotosíntesis, nutrición, y protección contra el daño fotooxidativo . Por ejemplo, los animales no tienen la capacidad de sintetizar carotenoides, pero deben obtener en cambio estos compuestos nutricionalmente importantes a través de sus fuentes alimenticias. Un isoprenoide específico, como ß-caroteno (la naranja amarilla) o astaxantina (naranja rojo) , puede servir para potenciar el color de flor o la composición nutracéutica . Por ejemplo, la cianidina modificada y los pigmentos de delfinidina antocianina pueden producirse y usado para producir tonos en el rojo a agrupaciones azules. Luteína y zeaxantina pueden producirse, y usarse combinados con flavonoles incoloros (Nielsen y Bloor, Scienia Hort. 71:257-266, 1997).

La presente invención también abarca la producción heteróloga de lípidos además de terpenoides. Para ejemplos, lípidos, como acilos grasos (incluyendo ácidos grasos), glicerolípidos, glicerofosfolipidos , esfingolipidos, lípidos de esterol, lipidos de prenol, sacarolípidos y policitidos. Producción de carbohidratos, como monosacáridos, disacáridos, y polisacáridos .

Células hospederas Cualquier célula hospedera ' se puede usar en la práctica de la presente invención. La célula hospedera comprende una maquinaria de inducción de galactosa. Los ejemplos ilustrativos de células hospederas adecuadas incluyen células procarióticas y eucarióticas, como células de archae, células bacterianas, y células fúngicas. En muchas modalidades, la célula hospedera puede cultivarse en el medio de cultivo liquido.

Algunos ejemplos no limitantes de células archae incluyen a los que pertenecen a los géneros: Aeropyrum, Archaeglobus, Halobacterium, Methanococcus , Methanobacterium, Pyrococcus, Sulfolobus, y Thermoplasma. Algunos ejemplos no limitantes de cepas archae incluyen Aeropyrum pernix, Archaeoglobus fulgidus, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii, Thermoplasma acidophilum, y Thermoplasma volcanium.

Algunos ejemplos no limitantes de células bacterianas incluyen a los que pertenecen a los géneros: Agrobacterium, Alicyclobacillus , Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacteria, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonela, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphlococcus, Strepromyces,. Synnecoccus, y Zymomonas .

Algunos ejemplos no limitantes de cepas bacterianas incluyen el Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines , Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium beigerinckii, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, ¦ Lactococcus lactis, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas púdica, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonela entérica, Salmonela typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, y Staphylococcus aureus .

Si una célula hospedera bacteriana se usa, una cepa ?s patógena, como el Bacillus de ejemplos no limitante subtilis, Escherichia coli, Lactibacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudita, Rhodobacter sphaeroides, Rodobacter capsulatus, y Rhodospirillum rubrum se puede usar.

Algunos ejemplos no limitantes de células eucarióticas incluyen células fúngicas. Algunos ejemplos no limitantes de células fúngicas incluyen a los que pertenecen a los géneros: . Aspergillus, Candida, Chrysosporium, Cryotococcus, Fusarium, Kluyveromyces , Neotyphodium, Neurospora, Penicillium, Pichia, Saccharomyces, y Trichoderma .

Algunos ejemplos no limitantes de cepas eucarióticas incluyen Aspergillus nidulans, Aspergillus Niger, Aspergillus oryzae, Candida albicans, Chrysosporium lucknowense, Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Fusarium sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Neurospora crassa, Pichia angusta, Pichia finlandica, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia methanolica, Pichia opuntiae, Pichia pastoris, Pichia pijperi, Pichia quercuum, Pichia salictaria, Pichia thermotolerans , Pichia trehalophila, Pichia stipitis, Pichia sp., Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens , Streptomyces aureus, Saccaromyces bayanus, Saccaromyces boulardi, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces griseochromogenes , Streptomyces griseus, .Streptomyces lividans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis , Streptomyces vinaceus, Saccharomyces sp. y Trichoderma reesei.

Si una célula hospedera eucariótica se usa, una cepa no patógena, como ejemplos no limitantes Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Pichia pastoris, Saccaromyces boulardi, y Saccaromyces cerevisiae, se pueden usar .

Además, ciertas cepas han sido designadas por la Administración de Alimentos y Fármacos como GRAS o Generalmente Consideradas Como Seguras y tal vez usadas en la presente invención. Algunos ejemplos no limitantes de estas cepas incluyen el Bacillus subtilis, Lactibacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, y Saccharomyces cerevisiae .

En ciertas modalidades, la célula hospedera puede tener una vía de catabolismo de galactosa defectuosa. Por ejemplo, las una- o más enzimas endógenas que regulan el catabolismo de galactosa son funcionalmente deshabilitó. Sin limitaciones teóricas, deshabilitar del catabolismo de galactosa puede permitir a más galactosa estar disponible para la inducción del promotor inducible por galactosa. La incapacidad funcional puede lograrse en cualquiera de una variedad de modos conocidos en la técnica, incluyendo suprimiendo todos o una parte de un gen tal que el producto génico no es elaborado o está truncado y es enzimáticamente inactivo; mutándose un gen tal que el producto génico no es elaborado o está truncado y es enzimáticamente no funcional; insertar un elemento genético móvil en un gen tal que el producto génico no es elaborado o está truncado y es enzimáticamente no funcional; y la supresión o mutarse uno o más elementos reguladores que controlan la expresión de un gen tal que el producto génico no es elaborado. Las enzimas adecuadas que cuando funcionalmente deshabilitó eliminan o reducen la capacidad de una célula de Saccharomyces cerevisiae de catabolizar galactosa incluyen GALIp (Locus de GenBank YBR020W) , GAL7p (Locus de GenBank YBRO 18C) , y GALlOp (Locus de GenBank YBRO 19C) , y otros homólogos funcionales. Ácidos nucleicos En muchas modalidades, la célula hospedera es una célula genéticamente modificada en la cual las moléculas de ácido nucleico heterólogas se han insertado, han suprimido, o modificado (es decir, se han mutado; p.ej, por inserción, eliminación, substitución, y/o inversión de nucleótidos) .

En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos heterólogos se insertan en unos vectores de expresión. La opción de vector de expresión dependerá de la opción de células hospederas. Varios vectores de expresión adecuados para la expresión en células eucarióticas que incluyen la levadura, aviar, y células de mamífero se conocen en la técnica, muchos de los cuales se encuentran comercialmente disponibles. Algunos ejemplos de vectores comunes incluyen entre otras cosas SÍ 13 y la serie de Sikorski pRS303-306, 313-316, 423-426.

En ciertas modalidades, una secuencia nucleotidica que comprende un cásete de expresión inducible por galactosa y una secuencia nucleotidica que codifica para un transportador de galactosa está presente en un vector de expresión individual. En otras modalidades, una secuencia nucleotidica que comprende un cásete de expresión inducible por galactosa y una secuencia nucleotidica que codifica para un transportador de galactosa está presente en dos vectores de expresión. En ciertas modalidades, una secuencia nucleotidica que comprende un cásete de expresión inducible por galactosa y una secuencia nucleotidica que codifica para un transportador de lactosa está presente en un vector de expresión individual. En otras modalidades, una secuencia nucleotidica que comprende un cásete de expresión inducible por galactosa y una secuencia nucleotidica que codifica para un transportador de lactosa está presente en dos vectores de expresión. En ciertas modalidades, una secuencia nucleotidica que comprende un cásete de expresión inducible por galactosa y una secuencia nucleotidica que codifica para lactasa está presente en un vector de expresión individual. En otras modalidades, una secuencia nucleotidica que comprende un cásete de expresión inducible por galactosa y una secuencia nucleotidica que codifica para lactasa está presente en dos vectores de expresión.

En ciertas modalidades, una secuencia nucleotidica que comprende un cásete de expresión inducible por galactosa, una secuencia nucleotidica que codifica para un transportador de galactosa, y una secuencia nucleotidica que codifica para lactasa está presente en un vector de expresión individual. En otras modalidades, una secuencia nucleotidica que comprende un cásete de expresión inducible por galactosa, una secuencia nucleotidica que codifica para un transportador de galactosa, y una secuencia nucleotidica que codifica para lactasa está presente en dos o más vectores de expresión. En ciertas modalidades, una secuencia nucleotidica que comprende un cásete de expresión inducible por galactosa, una secuencia nucleotidica que codifica para lactasa, y una secuencia nucleotidica que codifica para un transportador de lactosa está presente en un vector de expresión individual. En otras modalidades, una secuencia nucleotidica que comprende un cásete de expresión inducible por galactosa, una secuencia nucleotidica que codifica para lactasa, y una secuencia nucleotidica que codifica para un transportador de lactosa está presente en dos o más vectores de expresión.

En ciertas modalidades, la célula hospedera comprende un cásete de expresión inducible por galactosa heterólogo individual. En otras modalidades, la célula hospedera comprende una pluralidad de casetes de expresión inducibles por galactosa heterólogos. En ciertas modalidades, la célula comprende una secuencia nucleotidica individual que codifica para un transportador de galactosa. En otras modalidades, la célula hospedera comprende una pluralidad de secuencias nucleotidicas que codifican para uno o más transportadores de galactosa. En ciertas modalidades, la célula hospedera comprende una secuencia nucleotidica individual que codifica para un transportador de lactosa. En otras modalidades, la célula hospedera comprende una pluralidad de secuencias nucleotidicas que codifican para uno o más transportadores de lactosa. En ciertas modalidades, la célula hospedera comprende una secuencia nucleotidica individual que codifica para lactasa. En otras modalidades, la célula hospedera comprende una pluralidad de secuencia nucleotidica que codifica para uno o más lactasas. La pluralidad de secuencias nucleotidicas que codifican para uno o más proteínas puede estar en unos vectores de expresión en forma individual o múltiple. Las proteínas pueden ser el igual o diferente, y pueden proporcionarse adicionalmente en el vector de expresión igual o diferente como el uno o más cásete de expresión inducible por galactosa heterologo.

En algunas modalidades, los vectores de expresión son extra-chromosocmal vectores de expresión. En algunas modalidades los vectores de expresión son episómicos. Por ejemplo, la célula hospedera puede comprender uno o más casetes de expresión inducibles por galactosa heterólogos en un vector de expresión extracromosómico o en un vector episómico. En ciertas modalidades, la célula hospedera comprende uno o más copias de secuencias nucleotidicas que codifican para un transportador de galactosa en un vector de expresión extracromosómico o un vector episómico. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende uno o más copias de secuencias nucleotidicas que codifican para un transportador de lactosa en un vector de expresión extracromosómico. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende uno o más copias de secuencias nucleotidicas que codifican para lactasa en un vector de expresión extracromosómico o vector episómico. En algunas modalidades, el vector de expresión extracromosómico puede tener una pluralidad de proteínas codificadas por un vector de expresión individual. Por ejemplo, un vector de expresión extracromosómico individual o el vector episómico pueden comprender una secuencia nucleotídica que codifica para un transportador de lactosa y lactasa de codificación de secuencia nucleotídica. En algunas modalidades, un vector de expresión extracromosómico individual puede comprender múltiples copias de secuencias nucleotidicas que codifican para la misma proteína, por ejemplo un vector de expresión extracromosómico individual puede tener dos secuencias nucleotidicas que codifican para lactasa individual. En otras modalidades, el vector de expresión extracromosómico individual puede comprender uno o más casetes de expresión inducible de galactosa con uno o más otras secuencias nucleotídicas que codifican para lactasa, transportador de lactosa, o transportador de galactosa.

En otras modalidades, los vectores de expresión son vectores de integración cromosómica, donde las secuencias nucleotídicas heterólogas de los vectores de integración cromosómica se introducen en los cromosomas de las células hospederas, o en el genoma de la célula hospedera. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende casetes de expresión inducibles por galactosa uno o más heterólogos integrados en un cromosoma. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende uno o más copias de secuencias nucleotídicas que codifican para un transportador de galactosa integrado en un cromosoma. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende uno o más copias de secuencias nucleotídicas que codifican para un transportador de lactosa integrado en un cromosoma. En algunas modalidades, la célula hospedera comprende uno o más copias de secuencias nucleotídicas que codifican para lactasa integrada en un cromosoma. En algunas modalidades, el vector de integración cromosómica comprende secuencias por su parte o vector de expresión inducible por galactosa más heterólogo y uno o más otras secuencias de nucleótidos que codifican para uno o más lactasas, transportadores de lactosa, o transportadores de galactosa, que están integrados en un cromosoma.

En ciertas modalidades, una secuencia nucleotidica que codifica para galactosa o transportador de lactosa y una secuencia nucleotidica que codifica para lactasa se liga funcionalmente a los mismos elementos reguladores. En otras modalidades, una secuencia nucleotidica que codifica para galactosa o transportador de lactosa está bajo el control de un primer elemento regulador, y una secuencia nucleotidica que codifica para lactasa está bajo el control de un segundo elemento regulador. Los elementos reguladores pueden ser promotores. Por ejemplo, los promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Los promotores inducibles adecuados incluyen entre otras cosas a los promotores de los genes de Saccharomyces cerevisiae ADH2, PH05, CUP1, MET25, MET3, CYC1, HIS3, GAPDH, ADC1, TRPl, URA3, LEU2, TP1, y AOXl . En otras modalidades, el promotor es constitutivo. Los promotores constitutivos adecuados incluyen entre otras cosas genes de Saccharomyces cerevisiae PGK1, TDH1, TDH3, FBA1, ADH1, LEU2, ENO, TPI1, y PYK1. Para generar una célula hospedera genéticamente modificada, los uno o más ácidos nucleicos heterólogos se introducen establemente o transitoriamente en una célula, usando métodos establecidos, incluyendo entre otros la electroporación, la precipitación de fosfato de calcio, DEAE-dextrán transfección regulada, y transfección regulada por el liposoma. Para la transformación estable, un ácido nucleico incluirá adicionalmente generalmente un marcador selecciónatele (p.ej, una resistencia de neomicina, resistencia de ampicilina, resistencia de tetraciclina, resistencia de cloranfenicol, o marcador, de resistencia de kanamicina) . La transformación estable también puede seleccionarse para usando un gen de marcador nutricional que confiere prototrofia para un aminoácido esencial (p.ej, Saccharomyces cerevisiae genes de marcador nutricionales URA3, HIS3, LEU2, ET2, y L YS2, otro puede incluir el HISM o KANMX) . Enzimas variantes y homólogos de secuencia nucleotidica La secuencia codificadora de cualquier proteina conocida de la invención puede ser alterada de diversos modos conocidos en la técnica generar proteínas variantes que comprenden cambios con especificidades de objetivo de la secuencia aminoacídica, pero sustancialmente no alterar la función de la proteína. Los cambios de secuencia pueden ser substituciones, inserciones, o eliminación. También adecuado para el uso son homólogos de ácido nucleico que comprenden secuencias nucleotídicas que tienen al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o identidad de secuencia nucleotidica de al menos aproximadamente el 99 % a secuencias nucleotídicas de la invención.

Se entiende que los equivalentes o las variantes del polipéptido o proteina natural también se incluyen dentro del alcance de esta invención. Los términos "equivalente", "el homólogo funcional", y "el fragmento biológicamente activo de lo mismo se usan de modo indistinto y se refieren a variantes de una secuencia seleccionada por cualquier combinación de adiciones, eliminación, o substituciones al conservar al menos una propiedad funcional del fragmento relevante para el contexto en el cual esto se usa. Por ejemplo, un equivalente de una enzima proteica (p.ej, lactasa) puede tener la misma capacidad o comparable de catalizar una reacción química determinada comparando con una enzima proteica natural. Como es evidente a un experto en la técnica, el equivalente también puede asociarse con, o conjugado con, otras sustancias o agentes para facilitar, potenciar, o modular su función. La invención incluye polipéptidos modificados que contienen a conservador o no sustituciones conservadoras que no afectan considerablemente sus propiedades, como la actividad enzimática de los péptidos o sus estructuras terciarias. La modificación de polipéptidos es la práctica rutinaria en la técnica. Los residuos aminoacídicos que pueden ser de forma conservadora sustituidos el uno para el otro incluyen entre otras cosas: glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico / ácido glutámico; serina/treonina ; lisina/arginina; y fenilananina / tirosina. Estos polipéptidos también incluyen polipéptidos glucosilados y no glucosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones postraductoriales, tal como, por ejemplo, glucosilación con diferentes azúcares, acetilación, y fosforilación.

Uso de codón En algunas modalidades, una secuencia nucleotídica usada para generar una célula hospedera de la invención se modifica tal que la secuencia nucleotídica refleja la preferencia de codón de la célula. En ciertas modalidades, la secuencia nucleotídica se modificará para la preferencia de codón de levadura (ver, p.ej, Bennetzen y Hall. 1982. J. Biol. Chem. 257 (6): 3026-3031).

Kits · La presente invención también abarca kits que proporcionan reactivos a producir productos heterólogos la producción a través de inducible por galactosa de secuencias heterólogas sin la suplementación directa de galactosa al medio de cultivo celular. El kit proporciona reactivos tales que la cantidad de producto obtenido es comparable al obtenido cultivando la célula hospedera en un medio complementado con moles comparables de galactosa. Por ejemplo, la cantidad de producto producido por el medio complementado por la lactosa es comparable a esto producido de un medio complementado con la cantidad comparable de galactosa. En algunas modalidades, la cantidad de producto producido es aproximadamente igual a o mayor que la cantidad de producto obtenido de un medio directamente complementado con moles comparables de galactosa. En algunas modalidades, la cantidad de producto producido es al menos 1.2 veces, 1.5 veces, 2 veces (es decir el doble), 2.5 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más que la cantidad del producto obtenido de un medio complementado con moles comparables de galactosa.

Cada kit por lo común comprende reactivos que hacen la producción de productos heterólogos a través de un cásete regulador inducible por galactosa sin complementar directamente galactosa al medio de cultivo celular. En una modalidad, el kit puede comprender componentes para un sistema de expresión inducible por galactosa. Por ejemplo, el kit puede comprender elementos reguladores inducibles por galactosa que pueden ligarse funcionalmente a una secuencia heteróloga de opción. El kit puede comprender además reactivos, como reactivos que se clonan para unir la-secuencia heteróloga de opción al elemento regulador. En otras modalidades, el kit puede comprender además vectores de expresión inducibles por galactosa, donde una secuencia heteróloga de opción puede insertarse. Los vectores pueden ser episómicos, extracromosomal o para la integración cromosómica . En otras modalidades, los kits pueden comprender vectores para lactasa de expresión, transportadores de lactasa, y/o transportadores de galactosa. En otras modalidades, el chamaco puede comprender componentes para expresar para la maquinaria de inducción de galactosa. Los diferentes kits pueden formularse para diferentes tipos de célula hospedera. Por ejemplo, algunos kits pueden comprender reactivos para células hospederas con lactasa endógena, y asi, el kit puede no comprender lactasa de expresión de vector.

¦En algunas modalidades, los kits comprenden un conjunto de vectores de expresión que comprenden al menos un primer vector de expresión y al menos un segundo vector de expresión, donde . el primer vector de expresión comprende una primera secuencia heteróloga ligada funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa, y un segundo vector de expresión comprende una segunda secuencia heteróloga que codifica para lactasa o fragmento biológicamente activo de lo mismo.

En otras modalidades, los kits pueden comprender además células hospederas. En otras modalidades, los kits comprenden además medio de cultivo, compuestos para inducir la producción de productos heterólogos, y otro cultivo celular suministra.

Cada reactivo en un kit puede ser suministrado en una forma sólida o se disolvió/suspendió en un amortiguador líquido adecuado para el almacenamiento de inventario, y más tarde para intercambio o adición en el medio de reacción cuando la prueba se lleva a cabo. El envase individual adecuado es normalmente proporcionado. El kit puede proporcionar opcionalmente componentes adicionales que son útiles en el procedimiento. Estos componentes opcionales incluyen, entre otras cosas, amortiguadores, purificando reactivos, recolectando reactivos, medios para la detección, muestras control, controlan compuestos (como galactosa) , instrucciones, e información interpretativa.

Los kits de la presente invención por lo común comprenden instrucciones de uso de reactivos contenidos en esa parte. Las instrucciones pueden proporcionarse en la forma de insertos de producto, manual, registrado en cualquier medio legible que incluye el medio electrónico.

EJEMPLOS La práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique otra cosa, los métodos convencionales de la industria biosintética y lo similar, que se incluyen dentro de la habilidad de la técnica. Al grado tales métodos no son descritos completamente aquí, uno puede encontrar la referencia amplia a ellos en la literatura científica.

A continuación ejemplos, los esfuerzos se han elaborado para asegurar la exactitud con respecto a cantidades usadas (por ejemplo, cantidades, temperatura, etcétera) , pero la variación y la desviación pueden ser acomodadas, y tal ' como resultó después un error administrativo en las cantidades mencionó agui existe, el experto común en las técnicas a las cuales esta invención pertenece puede deducir la cantidad correcta en vista de la descripción restante aquí. A menos que no indicado otra cosa, la temperatura se describe en grados centígrados, y la presión es a o cerca de la presión atmosférica al nivel del mar. Todos los reactivos, a menos que se indique otra cosa, se obtienen comercialmente . Los siguientes ejemplos son conceptualizados con objetivos ilustrativos sólo y no limitan en ninguna forma el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Este ejemplo describe métodos para elaborar plásmidos para la integración con especificidad de objetivo de ácidos nucleicos heterólogos que comprenden promotores inducibles por galactosa ligados funcionalmente a secuencias codificadoras de proteínas en ubicaciones cromosómicas específicas de Saccharomyces cerevisiae.

El ADN genómico es aislado de cepas de Saccharomyces cerevisiae Y002 (antecedente de CEN.PK2 MATA ura3-52 a 1-289 Ieu2-3,112 his3ñl MAL2-8C SUC2) , Y007 (antecedente de S288C MATA trplA63), Y051 (antecedente de S288C MATA his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0 PGALi-HMGl158S a 3323 PGALi-upc2-l erg9 : PMET3-ERG9 : : HIS3 PGALI-ERG20 PGALi-HMGI 1586 a 3323) y EG123 (MATA ura3 trpl Ieu2 his4 canl) . Las cepas se cultivan durante la noche en el medio liquido que contiene el extracto de Levadura del 1 %, la Bacto-peptona del 2 %, y Dextrosa del 2 % (medio de YPD) . Las células son aisladas de 10ml de cultivos líquidos por centrifugación a 3 100 revoluciones por minuto, lavado de comprimidos celulares en 10ml de agua ultradestilada, y nueva centrifugación. El ADN genómico se extrae usando el kit de extracción de ADN de levadura Y-DER (Perfore Biotecnologías, Rockford, Illinois) según el protocolo sugerido del fabricante. El ADN genómico extraído es suspendido de nuevo en lOOuL d.e lOmM Tris-Cl, pH 8.5, y 0D26O/28O, las lecturas se obtienen en un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) para determinar la concentración de ADN genómico y la pureza.

La amplificación de ADN por la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se lleva a cabo en un Applied Biosystems 2720 Thermocycler (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA) usando el sistema de ADN polimerasa de Alta fidelidad Phusion (Finnzymes OY, Espoo, Finlandia) según el protocolo sugerido del fabricante. Mediante la finalización de una amplificación por PCR de un fragmento de ADN que debe insertarse en el vector de clonación de TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, California) , Unas protuberancias nucleotidicas se forma agregando luL de la Taq polimerasa Qiagen (Qiagen, Valencia, California) a la mezcla de reacción y realización adicional de 10 minutos, 72°C etapa de extensión de PCR, seguida enfriándose a 4°C. Mediante la finalización de la amplificación por PCR, 8uL de una solución de glicerol del 50 % se agrega a la mezcla de reacción, y la mezcla completa se carga en TBE del 1 % (0.89 M Tris, Ácido bórico de 0.89 m, sal de sodio de EDTA de 0.02 m) el gel de agarosa que contiene 0.5ug/mL del bromuro de etidio.

La electroforésis en gel de agarosa se lleva a cabo a 120 V, 400 mA durante 30 minutos, y las bandas de ADN son visualizadas usando la luz ultravioleta. Las bandas de ADN son extirpadas del gel con una hoja de afeitar estéril, y el ADN extirpado se purifica en gel usando el Kit de Recuperación de ADN de Gel de Zymoclean (Zymo Research, Orange, CA) según los protocolos sugeridos del fabricante. El ADN purificado se eluye en lOuL de agua ultradestilada, y las lecturas ??26?/28? se obtienen en un espectrofotómetro ND-1000 para determinar la concentración de ADN y su pureza.

Los ligamientos se llevan a cabo usando 100-500ug de producto de PCR purificado y Alta concentración Ligasa de ADN de T4 (New England Biolabs, Ipswich, MA) según el protocolo sugerido del fabricante. Para la propagación plásmida, los constructos ligados son transformados en Escherichia coli DH5 a células químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, California) según el protocolo sugerido del fabricante. Los transformantes positivos se seleccionan en medios sólidos que contienen Agar de Bacto del 1.5 %, Triptona del 1 %, Extracto de Levadura del 0.5 %, NaCl del 1 %, y 50ug/mL de un antibiótico adecuado. Los transformantes aislados se cultivan durante 16 horas en el medio de libra líquido que contiene 50ug/mL de carbenicilina o antibiótico de kanamicina a 37 °C, y el plásmido se aisla y purifica usando un kit de QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Valencia, California) según el protocolo sugerido del fabricante. Los constructos son verificados llevando a cabo digestiones de enzima de restricción de diagnóstico, resolviendo fragmentos de ADN en un gel de agarosa, y visualizando las bandas usando la luz ultravioleta. Los constructos selectos también son verificados por la secuenciación de ADN, que se lleva a cabo por Elim Biopharmaceuticals Inc. ¦ (Hayward, California) .

El plásmido pAM489 se genera insertando el inserto de ERG20-PGAL-tHMGR del vector pA 471 en el vector pAM466. El vector pAM471 se genera insertando el fragmento de ADN ERG20-PGAL~tHMGR, que comprende el marco de lectura abierto (ORF) del gen ERG20 de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de ERG20 1 a 1208; un del codón iniciador ATG es el nucleótido 1) (ERG20) , el locus genómico que contiene GAL1 divergente y. el promotor GALIO de Saccharomyces cerevisiae (posición de nucl.eótido de GAL1 1 a - 668) (P GAL) I Y ORF truncado del gen HMGl de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de HMGl 1586 a 3323) (tHMGR), en el Cero TOPO vector de clonación de Blunt II (Invitrogen, Carlsbad, California) . El vector pAM466 se genera insertando el fragmento de ADN TRPr856 a 548; que comprende un segmento del locus de TRP1 natural de Saccharomyces cerevisiae que se extiende de la posición nucleotidica 856 para colocar 548 y alberga un sitio de restricción de Xmal interno no natural entre bases 226 y 225, en el vector de clonación de TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, California) . Los fragmentos de ADN ERG20-PGAL-tHMGR y TRP1 "85610 +M8 se generan por la amplificación por PCR como detallado en la Tabla 1. La Figura 2A muestra un mapa del inserto de ERG20-PGAL—tHMGR, y SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia nucleotidica del fragmento de ADN. Para la estructura de pAM489, 400ng de pAM471 y lOOng de pAM466 son digeridos a la finalización usando la enzima de restricción de Xmal (New England Biolabs, Ipswich, MA) , los fragmentos de ADN correspondiente al inserto de ERG20-PGAL-tHMGR y el vector pAM466 linearizado se purifican en gel, y 4 equivalentes molares del inserto purificado se ligan con 1 equivalente molar del vector ' linearizado purificado, produciendo pAM489.

Tabla 1 - amplificaciones por PCR llevadas a cabo para generar pAM489 Serie PCR Plantilla Cebador 1 Cebador 2 Producto de PCR lOOng de ADN 61-67-CPK001-G 61-67-CPK002-G hRPl_856 a-226 genómico Y051 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 30) .31) 61-67-CPK003-G 61-67-CPK004-G RP1_225 a +548 (SEQ 1 NUMERO DE ID: (SEQ ID NO: lOOng de ADN 61 67 CPKO50 G 32) 33) genómico EG123 (SEQ ID NO: 62) 61-67-CPK025-G (SEQ ID NO: 54) ERG20 lOOng de ADN 61-67-CPK051-G 61-67-CPK052-G genómico YO02 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 64) 63) 61-67- 61-67-CPK031-G CPK053-G (SEQ (SEQ ID NO: 55) ID NO: 65) PGAL tHMGR lOOng cada uno 61-67-CPK001-G de TRP 1-856 (SEQ ID NO: 30) a-226 y TRP1 - 225 - a +548 productos de PCR purificados 2 61-67-CPK004-G (SEQ ID NO: 856c0+548 TRPT 33) lOOng cada 61-67-CPK025-G 61-67-CPK052-G (SEQ ID NO: ERG20-PGAL uno de ERG20 (SEQ ID NO: 64) y PGAL 54) productos de PCR purificados 3 lOOng cada uno 61-67-CPK025-G 61-67-CPK031-G eRG20-PGAL- de ERG20-PGAL (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: tH GR y tHMGR 54) 55) productos de PCR purificados El plásmido pAM491 se genera insertando el inserto de ERG13-PGAL-tHMGR del vector pAM472 en el vector pAM467. El vector pAM472 se genera insertando el fragmento de ADN ERG13- PGAL-tHMGR, que comprende el ORF del gen ERG13 de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de ERG13 1 a 1626) (ERG13), el locus genómico que contiene GAL1 divergente y promotor GALIO de Saccharomyces cerevisiae (posición de nucleótido de GAL1 1 a - 668) (PGAL) t V ORF truncado del gen H G1 de Saccharomyces cerevisiae (posición de nucleótido de HMG1 1586 a 3323) (tHMGR), en el Cero TOPO vector de clonación de Blunt II. El vector pAM467 se genera insertando el fragmento de ADN URA3723 a 701, que comprende un segmento del locus de URA3 natural de Saccharomyces cerevisiae que se extiende de la posición nucleotidica 723 para colocar 224 y alberga un sitio de restricción de Xmal interno no natural entre bases 224 y 223, en el vector de clonación de TOPO TA pCR2.1. Los fragmentos de ADN ERG13-PGAL-tHMGR y URA3723 a 100 se generan por la amplificación por PCR como detallado en la Tabla 2. La Figura 2B muestra un mapa del inserto de ERG13-PGAL-tHMGR, y SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia nucleotidica del fragmento de ADN. Para la estructura de pAM491, 400ng de pAM472 y lOOng de pAM467 son digeridos a la finalización usando la enzima de restricción de Xmal, los fragmentos de ADN correspondiente al inserto de ERG13-PGAL_tHMGR y el vector pAM467 linearizado se purifican en gel, y 4 equivalentes molares del inserto purificado se ligan con 1 equivalente molar del vector linearizado purificado, produciendo pAM491.

Tabla 2 - amplificaciones por PCR llevadas a cabo para generar pAM491 Serie PCR Plantilla Cebador 1 Cebador 2 Producto de PCR lOOng de ADN 61-67-CPK005-G 61-67-CPK006-G URA3_723 a- genómico Y007 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 35) 224 34) 1 61-67-CPK007-G 61-67-CPK008-G URA3.223 a 701 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 36) 37) 61-67-CPK032-G 61-67-CPK054-G ERG13 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 56) 66) lOOng de 61-67-CPK052-G 61-67-CPK055-G PGAL URA3.223 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: genómico Y002 64) 67) a 701 2 61-6 -CPK031-G 61-67-CPK053-G tHMGR lOOng cada {SEQ ID NO: (SEQ ID NO: uno de URA3- 55) 65) 723 a-224 y URA3 223 a 701 productos de PCR purificados lOOng cada 'uno de ERG13 y PGAL productos de PCR purificados 3 61-67-CPK005-G 61-67-CPK008-G 723 a poiURA3 lOOng cada (SEQ ID NO: (NÚMERO DE ERG13-PGAL uno de ERG13- 34) 61-67- SEQID: 37) 61- PGAL y tHMGR CPK032-G (SEQ 67-CPK052-G productos de ID NO: 56) (SEQ ID NO: PCR 64) purificados 61-67-CPK031- (SEQ ID NO: 61-67-CPK032-G eRG13-PGAL-tHMGR G 55) (SEQ ID NO: 56) El plásmido pAM493 se genera insertando el inserto IDI 1-PGAL-tHMGR del vector pAM473 en el vector pAM468. El vector pAM473 se genera insertando el fragmento de ADN IDI1-PGAL~ HMGR, que comprende el ORF del gen IDIl de Saccharomyces cerevisiae (posición de nucleótido de IDIl 1 a 1017) (IDIl), el locus genómico que contiene GAL1 divergente y promotor GALIO de Saccharomyces cerevisiae (posición de nucleótido de GAL1 1 a - 668) (PGAL) , y ORF truncado del gen HMG1 de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de H G1 1586 a 3323) (tHMGR) , en el Cero TOPO vector de clonación de Blunt II. El vector pAM468 se genera insertando el fragmento de ADN ADE1 "825 ,° 653, que comprende un segmento del locus de ADE1 natural de Saccharomyces cerevisiae que se extiende de la posición nucleotidica 225 para colocar 653 y alberga un sitio de restricción de Xmal interno no natural entre bases 226 y 225, en el vector de clonación de TOPO TA pCR2.1. Los fragmentos de ADN IDIl-PGAL-tH GR y ADE 1 ~82510 653 se generan por la amplificación por PCR como detallado en la Tabla 3. La Figura 2C muestra un mapa del inserto de IDIl-PGAL-tHMGR, y SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia nucleotidica del fragmento de ADN. Para la estructura de pAM493, 400ng de pAM473 y lOOng de pAM468 son digeridos a la finalización usando la enzima de restricción de Xmal, los fragmentos de ADN correspondiente al inserto de IDI1-PGAL-tHMGR y el. vector pAM468 linearizado se purifican en gel, y 4 equivalentes molares del inserto purificado se ligan con 1 equivalente molar del vector linearizado purificado, produciendo un vector pAM493.

Tabla 3 - amplificaciones por PCR llevadas a cabo para generar pAM493 Plantilla de Cebador 1 Cebador 2 Producto de PCR Serie PCR HOOng de ADN 61-67-CPK009-G 61-67-CPK010-G ADE1 825 a 226 genómico Y007 (SEQ ID NO: 38) (SEQ ID NO: 39) ADE1225 a 653 61-67-CPK011-G 61-67-CPK012-G (SEQ ID NO: 40) (SEQ ID NO: 41) lOOng de ADN 61-67-CPK047-G 61-67-CPK0G4-G IDI genómico YO02 (SEQ 1 NÚMERO DE ID: 61) (SEQ ID NO: 76) 61-67-CPK052-G 61-67-CPK065-G PGAL (SEQ ID NO: 64) (SEQ ID NO: 77) 2 61-67-CPK031-G 61-67-CPK053-G tHMGR (SEQ ID NO: 55) (SEQ ID NO: 65) lOOng cada uno de 61 67 CPK009 G 61 67 CPK012 G ADE1-825 a 653 ADE F825 tO - 226 (SEQ ID NO: 38) (SEQ ID NO: 41) y ADE1-225 t 0 653 productos de PCR purificados lOOng cada uno de 61-67-CPK047-G 61-67-CPK052-G IDI1 y PGAL (SEQ ID NO: 61) (SEQ ID NO: 64) productos de PCR purificados 3 IDI, 1-PGAL lOOng cada uno de 61-67-CPK031-G IDI1-PGAL y tHMGR (SEQ ID NO: 55) productos de PCR purificados 61-67-CPK047-G iDIl-PGAL-tHMGR (SEQ ID NO: 61) El plásmido pAM495 se genera insertando el inserto de ERG10-PGAL-ERG12 de pAM474 en el- vector pAM469. El vector pAM474 se genera insertando el fragmento de ADN ERG10-PGAL-ERG12, que comprende el ORF del gen de ERGIO de Saccharomyces cerevisiae (posición de nucleótido de ERGIO 1 a 1347) (ERGIO) , el locus genómico que contiene GAL1 divergente y promotor GALIO de Saccharomyces cerevisiae (posición de nucleótido de GAL1 1 a - 668) (PGAL)/ y el ORF del gen ERG12 de Saccharomyces cerevisiae (posición de nucleótido de ERG12 1 a 1482) (ERG12 ) , en el Cero TOPO vector de clonación de Blunt II. El vector pAM469 se genera insertando el fragmento de ADN HIS332 a 100HISMX-HIS3504 hasta 1103, que comprende dos segmentos de SU locus de Saccharomyces cerevisiae que se extienden de la posición nucleotídica 32 para colocar 1000 y de la posición nucleotídica 504 para colocar 1103, un marcador HISMX, y un sitio de restricción de Xmal no natural entre la secuencia HIS35 y el marcador HISMX, en el vector de clonación de TOPO TA pCR2.1. Los fragmentos de ADN ERG10-PGAL-ERG12 e HIS332 t0 1000-HISMX-HIS3504 hasta 1103 se generan por la amplificación por PCR como detallado en la Tabla 4. La Figura 2da muestra un mapa del inserto de ERG10-PGAL-ERG12, y SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia nucleotídica del fragmento de ADN. Para la estructura de pAM495, 400ng ( de pAM474 y lOOng de pAM469 son digeridos a la finalización usando la enzima de restricción de Xmal, los fragmentos de ADN correspondiente al inserto de ERG10-PGAL-ERG12 y el vector pAM469 linearizado se purifican en gel, y 4 equivalentes molares del inserto purificado se ligan con 1 equivalente molar del vector linearizado purificado, vector flexible pAM495 e HISMX-HIS3 (SEQ ID NO: 42) (SEQ ID NO: 47) .

Tabla 4 - Reacciones PCR llevadas a cabo para generar DA 495 Serie PCR Plantilla Cebador 1 Cebador 2 Producto de PCR 61-67-CPK013-G 61-67-CPK014alt-G HIS3-32 a- (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 43) 1000 42) 1 61-67-CPK017-G 61-67-CPK018-G HIS3504 a-1103 (SEQ ID NO: 46) (SEQ ID NO: . 47) lOOng de 61-67-CP 035-G 61-67-CPK056-G ERGIO ADN (SEQ ID NO: 57) (SEQ ID NO: genómico 68) Y007 61-67- 61-67-CPK058-G PGAL 61-67- CP 057-G (SEQ ID NO: 70) CPK040-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 69) 58) 61-67- ERG12 lOng de plásmido 61-67- CPK059-G pAM330 ADN ** CPK015alt-G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 71) 44) 2 61-67-CPK016-G HISMX lOOng cada uno de 61-67- (SEQ ID NO: 45) HIS354 a-1103 y CPK015alt-G PCR HISMX (SEQ ID NO: productos 44) purificados 61-67-CPK018-G HISMX-HIS3504 lOOng cada uno de PGAL (SEQ ID NO: 47) a-1103 ERGIO y productos de PCR purificados 3 61-67-CPK035-G 61-67-CPK058-G ERG1 O PGAL lOOng cada (SEQ ID NO: 57) (SEQ ID NO: uno de HIS3- 70) 32 a-1000 61-67- 61-67-CP 018-G HIS3 - 32 a e HISMX-HIS3504 (SEQ ID NO: CPK013-G 1000 a-103 42) (SEQ ID NO: 47) HISMX- productos de PCR purificados HIS3so4 a-1103 lOOng cada uno 61-67-CPK035-G (SEQ ID de ERGIO PGAL HIS3504 y ERG12 productos de PCR purificados 61-67- ERG10-PGALERG12 CPK040-G (SEQ ID NO: 58) ** El marcador HISMX en pAM330 originado de pFA6a-HISMX6-PGALl como descrito por van Dijken et al. ((2000) Microb enzimático. Technol. 26 (9-10) 706-714) .

El plásmido pAM497 se genera insertando el inserto de ERG8-PGAL-ERG19 de pAM475 en el vector pAM470. El vector pAM475 se genera insertando el fragmento de ADN ERG8-PGAL-ERG19, que comprende el ORF del gen ERG8 de Saccharomyces cerevisiae (posición de nucleótido de ERG8 1 a 1512) (ERG8), el locus genóraico que contiene GAL1 divergente y promotor GALIO de Saccharomyces cerevisiae (posición de nucleótido de GAL1 1 a - 668) (PGAL), Y el ORF del gen ERG19 de Saccharomyces cerevisiae (posición de nucleótido de ERG19 1 a 1341) (ERG19), en el Cero TOPO vector de clonación de Blunt II. El vector pAM470 se genera insertando el fragmento de ADN LEU2-loo a 4so_HISMX_LEU2io96 hasta i77o^ que comprende dos segmentos del locus LEU2 de Saccharomyces cerevisiae que se extienden de la posición nucleotidica 100 para colocar 450 y de la posición nucleotidica 1096 para colocar 1770, un marcador HISMX, y un sitio de restricción de Xmal no natural entre la secuencia de 17 0 LEU2109610 y el marcador HISMX, en el vector de clonación de TOPO TA pCR2.1. Los fragmentos de ADN ERG8-PGAL-ERG19 y LE02-iooto45o_fflsM ?_ LEU2Ío96 hasta 1770 se generan por la amplificación pCR como es detallado en la Tabla 5. Figura 2E para un mapa del inserto de ERG8-PGAL-ERG19, y SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia nucleotidica del fragmento de ADN. Para la estructura de pAM497, 400ng de pAM475 y lOOng de pAM470 son digeridos a la finalización usando la enzima de restricción de Xmal, los fragmentos de ADN correspondiente al inserto de ERG8-PGAL-ERG19 y el vector pAM470 linearizado se purifican, y 4 equivalentes molares del inserto purificado se ligan con 1 equivalente molar del vector linearizado purificado, vector flexible pAM497.

Tabla 5 - Reacciones de PCR llevadas a cabo para Serie PCR generar pAM497 Cebador 1 Cebador 2 Producto de Plantilla 61-67-CPK019-G PCR (SEQ ID NO: 48) 61-67-CPK020- 100 a 450LEU2 lOOng de ADN 61-67-CPK023-G G (SEQ ID NO: genómico Y007 (SEQ ID NO: 49) 52) 61-67-CPK024- 1096 a de longitud de 61 67 CPK021 G G (SEQ ID NO: 1770LEU2 plásmido (SEQ ID NO: 53) pAM330 ADN **¦ 50) 61 67 CPK022 HISMX 61-67-CPK041-G 61-67-CPK060-G G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 51) 59) 72) ERG8 lOOng de ADN 61-67-CPK061-G 61-67-CPK062-G genómico YO02 (SEQ ID NO: (SEQ ID N'O: 73) 74) PGAL 61-67-CPK046-G 61-67-CPK063-G ERG19 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 60) 75) 1 lOOng cada uno 61-67-CPK021-G 61-67-CPK024-G HISMX-LEU21096 de LEU21096 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: hasta 1770 hasta 1770 e 50) 53) HISMX productos de PCR purificados 2 lOOng cada uno 61-67-CPK041-G 61-67-CPK062-G ERG8-PGAL de ERG8 y PGAL (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: productos de 59) 74) PCR purificados 3 100 a 450 lOOng de LEU2 61-67-CPK019-G 61-67-CPK024-G e HISMX-LEU2 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 1096 a 1770 31) 36) productos de PCR purificados LEU2-100 a lOOng cada uno 61-67-CPK041-G 61-67-CPK046-G 450LEU HISMX de ERG8-PGAL y (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 6 a 109 ERG19 42) 43) productos de PCR purificados ERG8-PGAL ERG19 ** El marcador de Microb. enzimático HISMX en pAM330 originado de Technol. 26 (9-10) 706-714). PFA6a-HISMX6-PGALl como descrito por van Dijken et al. ((2000) Ejemplo 2 Este ejemplo describe métodos para elaborar plásmidos de expresión para la introducción de ácidos nucleicos heterólogos extracromosómicos que comprenden promotores inducibles por galactosa ligados funcionalmente a secuencias codificadoras de, proteínas en Saccharomyces cerevisiae.

El plásmido de expresión pAM353 se genera insertando una secuencia nucleotídica que codifica para una sintasa de ß-farneseno en el vector pRS425-Gall (Mumberg y. Al-. (1994) Ácidos Nucí. Res. 22 (25): 5767-5768). El inserto de secuencia nucleotidica se genera sintéticamente, usando como una plantilla la secuencia codificadora del gen de sintasa de ß-farneseno de Artemisia annua (número de acceso de GenBank AY835398) optimizado por el codón para la expresión en Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 10). La secuencia nucleotidica sintéticamente generada es flanqueada de 5' BamHI y 3 'sitios de restricción de Xhol, y podría ser así clonada en sitios de restricción compatibles de un vector de clonación, como un patrón pUC o vector de origen pACYC.- La secuencia nucleotidica sintéticamente generada es aislada digiriendo a la finalización el constructo de síntesis de ADN usando enzimas de restricción de Xhol y BamHI. La mezcla de reacción es resuelta por la electroforésis en gel, aproximadamente 1.7kb el fragmento de ADN que comprende la secuencia codificadora de sintasa de ß-farneseno es el gel extraído, y el fragmento de ADN aislado se liga en BamHI el sitio de restricción de Xhol del vector pRS425-Gall, plásmido de' expresión flexible pAM353.

El plásmido de expresión pAM404 se genera insertando una secuencia nucleotidica que codifica para la sintasa de ß-farneseno de Artemisia annua (número de acceso de GenBank AY835398), optimizado por el codón para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, en el vector pAM178 (SEQ ID NO: 11) . La secuencia nucleotidica que codifica para la sintasa de ß-farneseno es amplificada mediante PCR de pAM353 usando cebadores 52-84 BamHI pAM326 (SEQ ID NO: 108) y 52-84 Nhel pAM326 (SEQ ID NO: 109) . El producto de PCR resultante es diqerido a la finalización usando enzimas de restricción de y Nhel y BamHI, la mezcla de reacción es resuelta por la electroforésis en gel, aproximadamente 1.7kb el fragmento de ADN que comprende la secuencia codificadora de sintasa de ß-farneseno es el gel extraído, y el fragmento de ADN aislado se liga en BamHI el sitio de restricción de Nhel del vector pAMl78, plásmido de expresión flexible pAM404 (ver la Figura 3 para un mapa de plásmidos) .

Ejemplo 3 Este ejemplo describe métodos para elaborar vectores y fragmentos de ADN para la perturbación con especificidad de objetivo del locus cromosómico gal7/10/l de Saccharomyces cerevisiae .

El plásmido pAM584 se genera insertando el fragmento de ADN GAL7 t0 1021-HPH-GALlml de t0 2587 en el vector de clonación de TOPO ZERO Blunt II (Invitrogen, Carlsbad, California) . El fragmento de ADN GAL7 t0 1021-HPH-GAL11637 a 2587 comprende un segmento del ORF del gen GAL7 de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de GAL7 4 a (1021) (GAL74 t0 1021) , el cásete de resistencia de higromicina (HPH) , y un segmento de la 3' región no traducida (UTR) del gen GALl de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de GALl 1637 a 2587) . El fragmento de ADN se genera por la amplificación por PCR como detallado en la Tabla 6. La Figura 4A muestra un mapa y SEQ ID NO: 12 la secuencia nucleotidica de fragmento de ADN GAL74 t0 1021-HPH-GAL11 Tabla 6 - PCR Plantilla Reacciones de PCR llevadas a cabo para generar pAM584 Cebador 1 Cebador 2 Producto de PCR 1 91-014-CPK236-G 91-014-CPK237-G GAL74 a 1021 lOOng de ADN (SEQ ID NO: 83) (SEQ ID NO: 84) genómico Y002 91-014-CPK232-G 91-014-CPK233-G 1637 a lOng de (SEQ ID NO: 81) (SEQ ID NO: 82) 25s7GALL plásmido pAM547 ADN ** 2 91-014 CPK231 G 91-014 CP 238 G HPH lOOng cada (SEQ ID NO: 80) (SEQ ID NO: 85) uno de GAL74 a 1021 y HPH productos de PCR purificados 3 91-014-CPK231-G 9GAL74 GAL74t 1637 a 2587 (SEQ ID NO: 80) tl021236-G (SEQ 1021HPH ID NO: 83) lOOng de cada 91014 CPK233 G 9GAL7 4 GAL74 a 1021- HIEL y GAL74 a (SEQ ID NO: 82) CPK236 G (SEQ GAL HPH-11637 puGAL74 1021- ID NO: 83) a 2587 HPH a productos de PCR ** La secuencia plásmida el gen de Tefl pAM547 se generó sintéticamente y para la higromicina B la fosfotransferasa de Kluyveromyces lactis comprende el cásete HPH de Escherichia coli flanqueada que comprende el por la codificación promotora y terminadora de la secuencia El plásmido pAM610 se genera insertando el fragmento de ADN GAL7125 t0 598-HPH-GALl4 t0 "M9-GAL4-GAL1 158510 2088 en el vector de clonación de TOPO ZERO Blunt II (Invitrogen, Carlsbad, California) . El fragmento de ADN GAL712510 593-HPH-GAL14 a -M-GAL4-GAL11585 hasta 2088 comprende un segmento del ORF del gen GAL1 de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de GAL7 125 a 598) (GAL7125 a 598 ) , el cásete de resistencia de higromicina (HPH), un segmento de 5' UTR del gen GAL1 de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de GAL1 4 a - 549) (GAL13 a 549) , el ORF del gen GAL4 de Saccharomyces cerevisiae (GAL4), y un segmento de 3' UTR del gen GAL1 de Saccharomyces cerevisiae (GAL1 158510 208S) . El fragmento de ADN se genera por la amplificación por PCR como detallado en la Tabla 7. La Figura 4B muestra un mapa y SEQ ID NO: 13 la secuencia nucleotidica de fragmento de ADN GAL7125 10 598-HPH-GALl4 a 549-GAL4 -GAL1 15851 a 2088.

Tabla 7 - PCR amplificaciones llevadas a cabo para generar pAM610 Serie PCR Plantilla Cebador 1 Cebador 2 Producto de PCR 91-035-CPK277-G 91-035-CPK278-G GAL7125 a 598 (SEQ ID NO: 86) (SEQ ID NO: 87) 1 lOOng de Y002 91-093-CPK285 91-093-CPK286 GAL11585t02088 genómico (SEQ ID NO: 104) (SEQ ID NO: 105) ADN GAL11585 a 91-035-CPK282-G GAL14t °-549 2088G (SEQ ID (SEQ ID NO: 91) NO: 90) 91-035-GAL14 91-035-CPK284-G G7AL4 lOng de ADN a-549EQ ID (SEQ ID NO: 93) plásmido número: 92) pAM547 ** 2 91-035-CPK279-G 91-035-CPK280-G HPH 50ng cada uno (SEQ ID NO: 88) (SEQ ID NO: 89) de GAL7125 purificados a 598 HPH, GALGAL7125 a 598AL4, GAL GAL712 585 a 2088 de productos purifiedl585 91-035-CPK277- 91-093-CPK286 GAL712s a 598 G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: HPH-GGAL7125 86) 105) 549-GAL4GAL11585 a 549- GAL4GAL1158 ** Plásmido pAM547 para la higromicina Kluyveromyces se generó sintéticamente B la fosfotransferasa de Escherichia lactis y comprende el cásete HPH de coli flanqueado del promotor que conprende y terminador la secuencia codificadora del gen Tefl El fragmento de ADN GAL712610 598-HPH-PGAMoc-GAL4-GALl a ¿mv^ que comprencie un segmento del ORF del gen GAL1 de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de GAL7 126 a 598) (GAL7126 a 598 ) , el cásete de resistencia de higromicina (HPH) , el ORF del gen GAL4 de Saccharomyces cerevisiae bajo el control de una "" versión constitutiva operativa de su promotor de origen natural (Griggs & Johnston (1991) PNAS 88 ( 19 ): 8597-8601 ) ( PGai4oc-GAL4 ) , y un segmento de 3' UTR del gen Gall de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de GAL1 1585 a 2088) (GAL.l 158510 2088 ) , se genera por la amplificación por PCR como detallado en la Tabla 8. La Figura 4C muestra un mapa y SEQ ID NO: 14 la secuencia nucleotidica de fragmento de ADN GAL71 8-HPH-P, GAL40C-GAL4 -GAL11.

Tabla 8 - Serie PCR amplificaciones llevadas a cabo para generar fragmento de ADN GAL7126 a 595- HPH-PGAjAoc-GAL4-GAL 1 1585 a 298 8 Plantilla Cebador 1 Cebador 2 Producto de PCR 1 100? de ADN 91-093-CPK285 91-093-CPK286 GAL11585 a plásmido (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2088GAL7126 AM610 g p p 104) 91-093- 105) 91-093- a 598HPH CPK277 (SEQ CPK421-G (SEQ ID NO: 102) ID NO: 106) 100 ngGAL11585 a 91093 (SEQ ID NO: 91093 CPK284 G (SEQ ID NO: 208GAL7126 a 598HPH CPK422 G 107) 103) 2 PGAL40C- 50ng de 91-0PGAL40G77 91-093- GAL4 GAL11585 a (SEQ ID NO: CPK286 (SEQ 2988 200ng de 102) ID NO: 105) 89 GAL7126to HPH, y 241ng de PGAL4OGAL7126 producto de PCR purificado GAL7126 a 598-HPH- PGAL40C-GAL41-8s a GALL2088 ** El inserto de GAL41-85DNA 100-30-KB013-G plásmido pAM629 fue cosido conjuntamente usando a pares de cebador 100-30-KBOll-G (SEQ (SEQ ID NO 20) y 100-30-KB014-G de fragmentos de ADN que número ID 18) y 100-30-KB012-G (SEQ ID NO 21) fueron amplificados mediante PCR (SEQ ID NO 10225 de Y002 19) .

Ejemplo 4 Este ejemplo describe métodos para elaborar fragmentos de ADN para la integración con especificidad de objetivo en ubicaciones cromosómicas especificas de Saccharomyces cerevisiae de ácidos nucleicos que codifican para transportadores de lactosa y lactasas.

El fragmento de ADN 5' locus-NatR-LAC12-PTDHi-PpGKi-LAC4-3- locus, que comprende un segmento de 5' UTR del gen ERG9 (3' locus) , el gen de marcador seleccionable de resistencia nourseothricin de Streptomyces noursei (NatR) , el ORF del gen LAC12 de Kluyveromyces lactis (REGIÓN de X06997: 1616.. 3379) (LAC12) ligado funcionalmente al promotor del gen TDH1 de Saccharomyces cerevisiae (PTDHI), el ORF del gen LAC4 de Kluyveromyces lactis (REGIÓN de M84410: 43.. 3382) (LAC4) ligado funcionalmente al promotor del promotor PGK1 de Saccharomyces cerevisiae (PPGKI)/ y la región promotora MET3 (5' locus) del plásmido pA 625, se genera por la amplificación por PCR como detallado en la Tabla 9. La Figura 5 muestra un mapa y SEQ ID NO: 15 la secuencia nucleotidica de -fragmento de ADN 5' locus-NatR-LAC12-PTOm-PPGKI-LAC4-3 ' locus .

Tabla 9 - PCR amplificaciones llevadas a cabo para generar fragmento de ADN 5' locus-NatR-LAC12-PTDHI-PPGKI-LAC4-3' locus Serie PCR Plantilla Cebador Cebador 2 Producto de 1 PCR 6.25ng de ADN LAC4-1 (SEQ ID NO: 110) LAC4-2 (SEQ ID genómico de (SEQ ID NO: 113) Kluyveromyces NO: 112) LAC12-2 (SEQ lactis (ATCC LAC12-1 ID NO: 111) catalog# 8585D-5, Lot# 7495280) 1 LAC4 LAC12 6.25ng PPGK1-1 (SEQ ID PPGK1-2 (SEQ de ADN NO: 116) PTDH1-1 ID NO: 117) genómico (SEQ ID NO: 22) PTDH1-2 (SEQ Y002 ID NO: 23) PPGK1P TDH1 400 ug 5' locus 1 SE ID NÚMERO: de ADN 26) plásmido pAM625 a) .

(SEQ) 3' locus 1 (SEQ ID 5" locus 2 (SEQ 5 ' locus 31 NO: 24) ID NO: 27) (Q) locus 3' locus 2 (SEQ ID NO: 25) 400 ug de ADN NatR-1 NatR-2 (SEQ ID NatR plásmido (SEQ ID NO: 115) pAM 00 b) NO: 114) 2 0.15 p.m. de 5 locus 5' locus-NatR- a) El plásmido cada uno de 1 (SEQ LAC12-3 locus 2 pAM625 se LAC4, LAC12, ID NO: (SEQ ID NO: 25) generó PPGKi, PTDH1, 26) PPGK1-LAC4-3 ' insertando el 5' locus, 3' locus fragmento de locus, y NatR ADN ERG9-1 a- productos de 800-nl' a- PCR 683_ERG9i a purificados 811 (ver el Ejemplo- 683_ERG91e vector de clonación de TOPO ZERO Blunt II. b) El plásmido pAM700 comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la acetiltransferasa nourseothricin de Streptomyces noursei (acceso de GenBank REGIÓN de X73149: 179.. 748) flanqueado del promotor y terminador del gen de Tefl de Kluyveromyces lactTefl Ejemplo 5 Este ejemplo describe la generación de cepas de Saccharomyces cerevisiae útiles en la invención.

Cepas de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C (Y002) (MATA; ura3-52; trpl-289; Ieu2-3, 112; his3Al; 5 MAL2-8C; SUC2) y CEN.PK2-1D (Y003) (MATalpha; ura3-52; trpl-289; Ieu2-3, 112; his3Al; MAL2-8C; SUC2) (van Dijken et al. (2000) Microb enzimático. Technol. 26 ( 9-10) : 706-714 ) se preparan para la introducción de genes de vía de MEV inducibles sustituyendo al promotor ERG9 por Saccharomyces cerevisiae promotor de MET3, y el ADE1 ORF con el Candida glabrata gen de LEU2 (CgLEUT) . Esto se lleva a cabo amplificando mediante PCR la región KanMX-PMET3 del Vector pAM328 (SEQ ID NO: 16) usando cebadores 50-56-pwlOO-G (SEQ ID NO: 28) y 0 50-56- pwlOl-G (SEQ ID NO: 29), que incluyen 45 pares de bases de la homología al promotor ERG9 de origen natural, transformando lOug del producto de PCR resultante en cultivar exponencialmente Y002 y células Y003 usando 40 Polietilenglicol de % p/p 3350 ( Sigraa-Aldrich, San Louis, Misuri), 100 mm de Acetato de Litio ( Sigma-Aldrich, Santo. Louis, Misuri), y lOug de ADN de Esperma de Salmón (Invitrogen Corp., Carlsbad, California), e incubar las células a 30°C durante 30 minutos seguidos de calor que los sobresalta a 42°C durante 30 minutos (Schiestl y Gietz. (1989) Curr. Jineta. 16, 339-5 346). Los recombinantes positivos se identifican por su capacidad de crecer en el medio rico que contiene 0.5ug/mL de Geneticina (Invitrogen Corp., Carlsbad, California), y las colonias seleccionadas se confirman mediante el PCR de diagnóstico. Los clones consiguientes se les proporcionan la designación Y93 (ESTERA A) y Y94 (alfa OPACA). CgLEU2 de 3.5 kbs locus genómico es amplificado luego del ADN genómico de Candida glabrata (ATCC, Manassas, VA) usando cebadores 61-67-CPK066-G (SEQ ID NO: 78) y 61-67-CPK067-G (SEQ ID NO: 79), que contienen 50 pares de bases de flanquear la homología al ADE1 0 ORF, y lOug del producto de PCR resultante son transformados en cultivar exponencialmente Y93 y células Y94, recombinantes positivos ,son seleccionados para el crecimiento en ausencia de la suplementación de leucina, y seleccionados los clones se confirman mediante el PCR de diagnóstico. Los clones consiguientes se les proporcionan la designación Y176 (ESTERA A) y Y177 (alfa OPACA) .

La cepa Y188 es generada luego digiriendo 2ug de pAM491 y ADN plásmido pAM495 a la finalización 5 usando la enzima de restricción de Pmel (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts ) , e introduciendo los insertos de ADN purificados en cultivar exponencialmente células de Y176. Los recombinantes positivos son seleccionados para por el crecimiento en uracilo de medio carente e histidina, e integración en el locus genómico correcto se confirman mediante el PCR de diagnóstico.

La cepa Yl 89 es generada después digiriendo 2ug de pAM489 y ADN plásmido pAM497 a la finalización usando la enzima de restricción de Pmel, e introduciendo los insertos de AD purificados en cultivar exponencialmente Yl 77 células. Una cantidad de 0 recombinantes positivos son seleccionados por el crecimiento en el medio carente de triptófano e histidina, e integración en el locus genómico correcto se confirma mediante el PCR de diagnóstico.

Aproximadamente 1 X 107 células de cepas Y188 y Y189 se mezclan en una placa media YPD durante 6 horas a temperatura ambiente para permite para el apareamiento. El cultivo celular mixto es sembrado en placa a histidina de medio carente, uracilo, y triptófano para seleccionar para el crecimiento de células diploides. Y238 de cepa se genera transformando las células diploides usando 2ug del ADN plásmido pAM493 que tienen sido digerido a la finalización usando la enzima de restricción de Pmel, e introduciendo el inserto de ADN purificado en las células diploides exponencialmente crecientes. Los recombinantes positivos son seleccionados para por el crecimiento en un medio carente de adenina, y la integración en el locus genómico correcto se confirman mediante el PCR de diagnóstico.

La cepa de Haploid Y211 (alfa OPACA) se genera esporulando la cepa Y238 en Acetato de Potasio del 2 % y medio de líquido de Raffinóse del 0.02 %, aislando aproximadamente 200 tétradas genéticas usando un micromanipulador de serie de Singer Instruments SM300 (Singer Instrument LTD, Somerset, Reino Unido), identificando aislados genéticos independientes que contienen el complemento adecuado del material genético introducido por su capacidad de crecer en ausencia de adenina, histidina, uracilo, y triptófano, y confirmando la integración de todo el ADN introducido por el PCR de diagnóstico.

La cepa Y381 se genera de la cepa Y211 eliminando - 69 nucleótidos del locus ERG9 de origen natural entre el promotor MET3 manipulado genéticamente . e inicio de la secuencia codificadora ERG9, asi haciendo la expresión de ERG9 más metionina represible, y sustituyendo el marcador de KanMX a este sitio con otro marcador seleccionable . Con este fin, exponencialmente crecer células de Y211 es transformado con lOOug del fragmento de ADN ERG91 10 a ^"^"^ETS-ERGg1 10. Fragmento de ADN ERG910 "^"^ETS-ERcg1 a 10 (SEQ ID NO: 17) comprende un segmento de 5' UTR del gen ERG9 de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de ERG9 1 a -800) (ERG9,-1 a -800), el marcador seleccionable de DsdA (DsdA) , la región promotora del gen MET3 de Saccharomyces cerevisiae (posiciones de nucleótido de MET3 2 a 687) ( PMET3 ) , y un segmento del ORF del gen ERG9 (posiciones de nucleótido de ERG9 1 a 811) (ERG91 10 8 n) . El fragmento de ADN se genera por la amplificación por PCR como detallado en la Tabla 10. Los transformantes de célula hospedera son seleccionados en medios definidos sintéticos que contienen glucosa del 2 % y D-serina, e integración en el locus genómico correcto se confirman mediante el PCR de diagnóstico.

Tabla 10 amplificaciones por PCR llevadas a cabo para generar fragmento de ADN ERGO a -800-DsdA-PMET3-ERG9 a 801 Serie PCR Plantilla Cebador 1 PrimERG91 Producto de PCR 91-044- 91-044-CPK321-G ERGO a-800 CPK320-G (SEQ (SEQ ID NO: 95) ID NO: 94) lOOng de ADN 91-044- 91-044-CPK325-G PMET3 genómico Y002 CPK324-G (SEQ (SEQ ID NO: 99) ID NO: 98) 1 (SEQ ID NO: 91-044- 91-044-CPK327-G ERG9 a 811 100) CPK326-G (SEQ ID NO: 101) 10ng de ADN 91-044- 91-044-CPK323-G DsdA plásmido CPK322-G (SEQ (SEQ ID NO: 97) pAM577 ** ID NO: 96) 2 lOOng cada 91-044- 91-044-CPK327-G ERG9 a 50.0DsdA- uno de ERG9-1 CPK320-G (SEQ (SEQ ID NO: PMET3-ERG9 a 8 a-800 DsdA, ID NO: 94) . 101) PMET3, y ERG91 a 811 productos de PCR purificados ** El plásmido pAM577 s00_generated sintéticamente y comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la desaminasa de D-serina de Saccharomyces cerevisiae.

La cepa Y435 se genera de la cepa Y381 haciendo la cepa incapaz de catabolizar galactosa, capaz de expresar para niveles más altos de GAL4p en la presencia de glucosa (es decir, capaz de hacer más eficazmente la expresión apagado promotores inducibles por galactosa en la presencia de glucosa, asi como asegurar que hay bastante factor de transcripción Gal4p para activar la expresión de todos los promotores inducibles por galactosa en la célula), y capaz de producir la sintasa de ß-farneseno en la presencia de galactosa. Con este fin, exponencialmente crecer células de Y381 es transformado primero con 850ng del gel fragmento de ADN purificado GAL7126 10 598-HPH-PGAL4oc-GAL4-GALl 15851 a 2088. Formantes de trans de célula hospedera son seleccionados en el agar YPD que contiene 200ug/mL de la higromicina B, las colonias individuales son escogidas, y la integración en el locus genómico correcto se confirma mediante el PCR de diagnóstico. Las colonias positivas son rayadas de nuevo en el agar YPD que contiene 200ug/uL de la higromicina B para obtener colonias individuales para la preparación de reserva. Una tal cepa de transformante positiva es transformada luego con el plásmido de expresión pAM404, cepa flexible Y435. Los transformantes de célula hospedera se seleccionan en medios definidos sintéticos, conteniendo glucosa del 2 % y todos los aminoácidos excepto leucina y metionina (SM-leu-met) . . Las colonias individuales se transfieren para cultivar viales que contienen 5ml de SM-leu-met liquido, y los cultivos se incuban agitando a 30°C hasta el crecimiento fase inmóvil alcanzada. Las células se almacenan a-80°C en cryo-viales en lml de partes alícuotas congeladas constituidas de 400uL del glicerol estéril del 50 % y 600uL del cultivo líquido.

La cepa Y596 se genera de la cepa Y435 haciendo la cepa capaz de producir lactasa y un transportador de lactosa. Con este fin, exponencialmente crecer células de Y435 es transformado con 4ug del gel fragmento de ADN purificado 5' locus-NatR-LAC12-PTDHi-PpGKÍ-LAC4-31 locus. Los recombinantes positivos se seleccionan para por el crecimiento en el medio YPD que comprende 200ug de nourseotricina, y la integración en el locus genómico correcto se confirma mediante el PCR de diagnóstico. Las colonias individuales se transfieren para cultivar viales que contienen 5ml de YPD liquido, y los cultivos se incuban agitando a 30°C hasta el crecimiento fase inmóvil alcanzada. Las células se almacenan a-80°C en cryo- viales en lml partes alícuotas congeladas constituidas de 400uL del glicerol estéril del 50 % y 600uL del cultivo líquido .

Ejemplo 6 Este ejemplo describe la producción de ß-farneseno en cepas hospederas de Saccharomyces cerevisiae cultivadas en la presencia de lactosa.

Los cultivos de semilla de cepas hospederas Y435 y Y596 son establecidos agregando partes alícuotas de reserva a un 125ml matraz que contiene 25ml de los medios de Producción de la Ave, y cultiva los cultivos durante la noche. Cada cultivo de semilla se utiliza inoculan a OD60o inicial de aproximadamente 0.05 cada uno de dos 20ml de matraces reflejados que contienen 40ml de los medios de Producción de la Ave que contienen glucosa del 2 % y 5.0g/L de galactosa, o 9.6g/L, 6.0g/L, o 2.4g/L de lactosa. Los cultivos son ' recubridos de 8ml del oleato de metilo, e incubados a 30°C en un rotoagitador a 200 revoluciones por minuto. El triplicado se obtiene las muestras cada 24 horas hasta 72 horas trasladándose 2uL a lOuL del revestimiento orgánico a un vial de cristal limpio que contiene 500uL de acetato etílico enriquecido con la beta - o trans-caryophyllene como un patrón interno.

Las muestras de acetato etílico se analizan en Agilent 6890N cromatógrafo de gas equipado con un detector de ionización de llama (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, California) . Los compuestos en un l L de la parte alícuota de cada muestra se separan usando una columna DB-IMS (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, California), gas de portador de helio, y el programa de temperaturas que sigue: 200°C se mantiene durante 1 minuto, temperatura cada vez mayor a 10°C/minute a una temperatura de 230°C, temperatura cada vez mayor a 40°C/minute a una temperatura de 300°C, y un asimiento a 300°C durante 1 minuto. Usando este protocolo, el ß-farneseno previamente había¦ mostrado tener un tiempo de retención de aproximadamente 2 minutos. Las titulaciones de farneseno se calculan al comparar las áreas pico generadas contra una curva de calibración cuantitativa del ß-farneseno purificado ( Sigma-Aldrich Chemical Company, San Louis, Misuri) en acetato etílico enriquecido con el trans-cariofileno .

La lactosa se analiza en un cromatógrafo líquido de alto desempeño de 1200 de Agilent usando un detector de índice refractivo (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, California) . Las muestras se preparan obteniendo un 500 L de la parte alícuota del caldo de fermentación depurado y diluyéndolo con un volumen igual de 30 mm de ácido sulfúrico. Los compuestos en un 10 L de la parte alícuota de cada muestra se separan usando una columna de aters IC-Pak con 15 mm de ácido sulfúrico como la fase móvil a una velocidad de flujo de 0.6ml de/minuto. Los niveles de lactosa · se cuantifican áreas pico al comparar generadas contra una curva de calibración cuantitativa del compuesto auténtico.

Como se muestra en la Figura 6A, el crecimiento de cultivo es similar para cada una de las dos cepas sin tener en cuenta si el medio de cultivo galactosa contenida o lactosa. Como se muestra en la Figura 6B, cepa Y596 producido más que 0.6g/L del ß-farneseno tanto en la presencia .de galactosa como en la presencia de lactosa mientras que cepa de control Y435 ß-farneseno producido sólo en la presencia de galactosa de inductor, pero no en la presencia de lactosa. Como se muestra en la Figura 6C, no más que 2.4g/L de la lactosa es necesario, para inducir la producción del ß-farneseno por la cepa Y596.

Mientras la invención se ha descrito con respecto a un número limitado de modalidades, las características específicas de una modalidad no deberían ser atribuidas a otras modalidades de la invención. Ninguna modalidad individual es representativa de todos los aspectos del tema reivindicado. En algunas modalidades, las composiciones o los métodos pueden incluir diversos compuestos o etapas no mencionadas aquí. En otras modalidades, las composiciones o. los métodos no incluyen, o están sustancialmente libres de, cualquier compuesto o etapas no enumeradas aquí. Las variaciones y las modificaciones de las modalidades descritas existen. Deberse observar que la solicitud de las composiciones de combustible a chorros descritas aquí no es limitado con motores a reacción; ellos pueden usarse en cualquier equipo que requiera un combustible a chorro. Aunque haya especificaciones para la mayor parte de combustibles a chorros, no todas las composiciones de combustible a chorros necesidad descrita aquí de cumplir con todos los requisitos en las especificaciones. Esto se observa que los métodos para la fabricación y usando las composiciones de combustible a chorros descritas aquí se describen en cuanto a varias etapas. Estas etapas pueden ser llevadas a la práctica en cualquier secuencia. Las una o más etapas pueden omitirse o combinado, pero todavía lograr sustancialmente los mismos resultados. Las reivindicaciones anexadas conceptualizan de cubrir todas tales variaciones y modificaciones como incluirse dentro el alcance de la invención.

Todas las publicaciones y las solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan aquí como referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente son específicamente e individualmente indicadas para incorporarse por referencia. Aunque la invención anterior se haya descrito en algunos detalles por via de ilustración y ejemplo con objetivos de la claridad de la comprensión, será fácilmente evidente a aquellos de la habilidad común en la técnica en vista de las enseñanzas de esta invención que los ciertos cambios y las modificaciones pueden elaborarse al mismo sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexadas.

Claims (71)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para expresar una secuencia heteróloga en una célula hospedera, que comprende: cultivar la célula hospedera en un medio y bajo condiciones tal que la secuencia heteróloga se expresa, donde la secuencia heteróloga se liga funcionalmente a un elemento regulador indúcible por galactosa, y la expresión de la secuencia heteróloga es inducida sin complementar directamente galactosa al medio. 2. El método según la reivindicación 1, donde la expresión de la secuencia heteróloga es inducida por un azúcar no galactosa y a un nivel comparable al obtenido cultivando la célula hospedera en un medio complementado por galactosa, donde las. cantidades de galactosa complementada y azúcar no galactosa son comparables como se cuantifica en moles . 3. Un método para expresar una secuencia heteróloga en una célula hospedera, que comprende: cultivar la célula hospedera en un medio y bajo condiciones tal que la secuencia heteróloga se expresa, donde la secuencia heteróloga se liga funcionalmente a un elemento regulador indúcible por galactosa, y la expresión de la secuencia heteróloga es inducida mediante adición de lactosa al medio. 4. El método según la reivindicación 3, donde la expresión de ' la secuencia heteróloga es inducida al complementar lactosa y a un nivel comparable al obtenido cultivando la célula hospedera en un medio complementado por galactosa, donde las cantidades de galactosa y lactosa complementadas son comparables como se cuantifica en moles. 5. El método según la reivindicación 3, donde la secuencia heterologa codifica para un producto proteico. 6. El método según la reivindicación 3, donde la secuencia heterologa produce un producto seleccionado del grupo que comprende: moléculas .antisentido, siARN, miARN, EGS, aptómeros, y ribozimas. 7. Un método para producir un isoprenoide en una célula hospedera que comprende: cultivar una célula hospedera que expresa para una o más secuencias heterólogas que codifican para una o más enzimas en una via de desoxixilulosa 5-fosfato independiente de mevalonato (DXP) o via de mevalonato (MEV) , donde una o más secuencias heterólogas se liga funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa y la expresión de una o más secuencias heterólogas es inducida sin complementar directamente galactosa al medio. 8. El método de las reivindicaciones 1 o 7, donde la expresión de una o más secuencias heterólogas es inducida en la presencia de lactosa. -9. El método de las reivindicaciones 1,3 o 7, donde el isoprenoide es un isoprenoide de Cs-C2o- 10. El método según la reivindicación 1, 3 o 7, donde el isoprenoide es un isoprenoide de C20+. 11. El método según la reivindicación 1, 3 o 7, donde la célula hospedera comprende además una secuencia exógena que codifica para una preniltransferasa y una isoprenoide sintasa . 12. El método según la reivindicación 7, donde el medio comprende la lactosa y lactasa. 13. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde la célula hospedera comprende un transportador de galactosa o fragmento biológicamente activo de lo mismo. 14. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde la célula hospedera comprende el transportador de galactosa GAL2 o el fragmento biológicamente activo de lo mismo . 15. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde la célula hospedera comprende un transportador de lactosa o fragmento biológicamente activo de lo mismo. 16. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde la célula hospedera comprende un transportador de galactosa que es GAL2. 17. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde el elemento regulador, inducible por galactosa es episómico . 18. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde el elemento regulador inducible por galactosa está integrado en el genoma de la célula hospedera. 19. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde el elemento regulador inducible por galactosa comprende un promotor inducible por galactosa seleccionado del grupo que comprende a un promotor de GAL7, GAL2, GALl, GALIO, GAL3, GCY1 y GAL80. 20. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde la célula hospedera comprende lactasa © fragmento biológicamente activo de lo mismo. 21. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde la célula hospedera comprende una secuencia exógena que codifica para una enzima de lactasa. 22. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde la célula hospedera comprende una secuencia exógena que codifica para lactasa secretable. 23. El método según la reivindicación 1, 3, 7, donde la célula hospedera muestra una capacidad reducida de catabolizar galactosa. 24. El método según la reivindicación 1, 3, 7, donde la célula hospedera carece de proteína funcional GALl, GAL7, y/o GALIO. 25. El método según la reivindicación 1, 3, 7, donde la célula hospedera expresa para la proteína GAL . 26. El método según la reivindicación 25, donde la célula hospedera expresa para la proteína GAL4 bajo el control de un promotor constitutivo. 27. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde la célula hospedera es una célula procariotica. 28. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde la célula hospedera es una célula eucariótica. 29. El método según la reivindicación 1, 3, o 7, donde la célula hospedera es Saccharomyces cerevisiae. 30. Una célula hospedera que se modifica para expresar cuando es cultivada en un medio de una secuencia heteróloga ligada funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa; donde la expresión de la secuencia heteróloga es inducida sin complementar directamente galactosa al medio. 31. La célula hospedera según la reivindicación 30, donde la expresión de la secuencia heteróloga es inducida por un azúcar no galactosa y a un nivel comparable al obtenido cultivando la célula hospedera en un medio complementado por galactosa, donde las cantidades de galactosa complementada y azúcar no galactosa son comparables como se cuantifica en moles . 32. Una célula hospedera que se modifica para expresar cuando es cultivada en un medio, una secuencia heteróloga ligada funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa; donde la expresión de la secuencia heteróloga es inducida en la presencia de lactosa. 33. La célula hospedera según la reivindicación 31, donde la expresión de la secuencia heteróloga es inducida al complementar lactosa y a un nivel comparable al obtenido cultivando la célula hospedera en un medio complementado por galactosa, donde las cantidades de galactosa y lactosa complementadas son comparables como se cuantifica en moles. 34. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32', donde la célula hospedera comprende un transportador de galactosa o fragmento biológicamente activo de lo mismo. 35. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera comprende un transportador dé galactosa GAL2 o fragmento biológicamente activo de lo mismo. 3,6. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera comprende un transportador de lactosa o fragmento biológicamente activo de lo mismo. 37. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde el elemento regulador inducible por galactosa está contenido en uno o más plásmidos extracromosómicos . 38. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde el elemento regulador inducible por galactosa está integrado en el genoma de la célula hospedera. 39. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde el elemento, regulador inducible por galactosa comprende un promotor inducible por galactosa seleccionado del grupo que comprende a un promotor del GAL 7, GAL2, GAL1, GALIO, GAL3, GCY1 y GAL80. 40. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera comprende una enzima de lactasa . 41. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera comprende una secuencia exógena que codifica para una enzima de lactasa o un fragmento biológicamente activo de lo mismo. 42. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera comprende una secuencia exógena que codifica para lactasa secretable. 43. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera muestra una capacidad reducida de catabolizar galactosa. 44. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera carece de proteina funcional GAL1, GAL7, y/o GALIO. 45. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera expresa para la proteina GAL4. 46. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera expresa para la proteina GAL4 bajo el control de un promotor constitutivo. 47. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera es una célula procariótica . 48. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera es una célula eucariótica. 49. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la célula hospedera es Saccharomyces cerevisiae. 50. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la secuencia heterologa codifica para un producto proteico. 51. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde la secuencia heterologa produce un producto seleccionado del grupo que comprende: moléculas antisentido, siARN, miARN, aptómeros y ribozimas. 52. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde esto produce un isoprenoide por la vía de desoxixilulosa 5-fosfato (DXP) , donde la secuencia heterologa codifica para una o más enzimas en la vía de desoxixilulosa 5-fosfato (DXP) independiente de mevalonato. 53. La célula hospedera según la reivindicación 30 o 32, donde esto produce un isoprenoide por la vía de mevalonato (MEV) , donde la secuencia heterologa codifica para una o más enzimas en la vía de MEV. 54. La célula hospedera según la reivindicación 53 o 54, donde el isoprenoide es un isoprenoide de Cs-C2o- 55. La célula hospe'dera según la reivindicación 52 o 53, donde el isoprenoide es un C2o + isoprenoide. 56. La célula hospedera según la reivindicación 52 o 53, donde el isoprenoide es un carotenoide. 57. Un vector de expresión que comprende una primera secuencia heteróloga ligada funcionalmente a un elemento regulador inducible por galactosa y una segunda secuencia heteróloga que codifica para lactasa o fragmento biológicamente activo de lo mismo, donde mediante introducción a una célula hospedera, el vector de expresión causa la expresión de la primera secuencia heteróloga en la célula hospedera cuando la célula es cultivada en un medio que es complementado con la lactosa en una cantidad suficiente para inducir la expresión de la primera secuencia heteróloga . 58. El vector de expresión según la reivindicación 57, donde la segunda secuencia heteróloga que codifica para lactas.a o fragmento biológicamente activo de lo mismo se expresa para hidrolizar la lactosa a glucosa y galactosa. 59. El vector de expresión según la reivindicación 57, que comprende además una secuencia heteróloga que codifica para un fragmento enzimático o biológicamente activo de lo mismo de la vía DXP. 60. El vector de expresión según la reivindicación 57, que comprende además una secuencia heteróloga que codifica para un fragmento enzimático o biológicamente activo de lo mismo de la vía de MEV. 61. El vector de expresión según la reivindicación 57, que comprende además una secuencia heteróloga que codifica para un transportador de lactosa. 62. El vector de expresión según la reivindicación 57, que comprende además una secuencia heteróloga que codifica para un transportador de galactosa o fragmento biológicamente activo de lo mismo. 63. Un conjunto de vectores de expresión que comprenden al menos un primer vector de expresión y al menos un segundo vector de expresión, donde el primer vector de expresión comprende una primera secuencia heteróloga ligada funcionalmente a un elemento regulador inducible' por galactosa, y un segundo vector de expresión comprende una segunda secuencia heteróloga que codifica para lactasa o fragmento biológicamente activo de lo mismo, donde mediante la introducción a una célula hospedera, el cásete de vectores de expresión causa la expresión de la primera secuencia heteróloga en la célula hospedera cuando la célula es cultivada en un medio, donde el medio es complementado con la lactosa en una cantidad suficiente para inducir la expresión de la primera secuencia heteróloga. 64. El conjunto de vectores de expresión según la reivindicación 63, donde la segunda secuencia heteróloga que codifica para lactasa o fragmento biológicamente activo de lo mismo se expresa para hidrolizar la lactosa a glucosa y galactosa . 65. El conjunto de vectores de expresión según la reivindicación 63, que comprende además una secuencia heteróloga que codifica para un fragmento enzimático o biológicamente activo de lo mismo en la vía DXP. 66. El conjunto de vectores de expresión según la reivindicación 63, que comprende además una secuencia heteróloga que codifica para un fragmento enzimático o biológicamente activo de lo mismo en la vía de MEV. 67. El conjunto de vectores de expresión según la reivindicación 63, que comprende además una secuencia heteróloga que codifica para un transportador de lactosa o fragmento biológicamente activo de lo mismo. 68. El conjunto de vectores de expresión según la reivindicación 63, que comprende además una secuencia heteróloga que codifica para un transportador de galactosa o fragmento biológicamente activo de lo mismo. 69. Un kit que comprende un vector de expresión según la reivindicación 57 e instrucciones de Uso del kit 70. Un kit que comprende un cásete de vectores de expresión según la reivindicación 63 e instrucciones de uso del kit. 71. Un cultivo celular que comprende una célula hospedera según la reivindicación 30 o 32.