MX2009002014A

MX2009002014A - Proceso para la purificacion de proteinas que contienen fc.

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Publication number: MX2009002014A
Application number: MX2009002014A
Authority: MX
Inventors: Alex Eon-Duval; Alain Lamproye
Original assignee: Ares Trading Sa
Priority date: 2006-08-28
Filing date: 2007-08-27
Publication date: 2009-03-09
Also published as: KR20090057296A; CA2661748C; US8513393B2; EP2061803A1; HUE045898T2; PL2061803T5; AU2007291283A1; SI2061803T1; US20100190961A1; HK1131400A1; EA200970231A1; DK2061803T3; IL197220A; PT2061803T; JP2010501623A; AR062570A1; IL197220A0; PL2061803T3; EA017152B1; AU2007291283B2

Abstract

La invención se refiere a un proceso para reducir la concentración de las fracciones Fc libres en un fluido que comprende una proteína que contiene Fc que comprende un paso de cromatografía de intercambio de catión.

Description

PROCESO PARA LA PURIFICACION DE PROTEINAS QUE CONTIENEN FC CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuentra en el campo de la purificación de la proteína. Más específicamente, se relaciona con la purificación de una proteína que contiene Fe vía la cromatografía de intercambio de catión, en particular para la reducción de la cantidad de las fracciones de Fe libres en una preparación de la proteína que contiene Fe. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas han llegado a ser comercialmente importantes como drogas que son llamadas generalmente "biológicas." Uno de los desafíos más grandes es el desarrollo de los procesos del costo efectivo y eficiente para la purificación de proteínas en una escala comercial. Mientras muchos métodos están ahora disponibles para la producción a gran escala de proteínas, los productos crudos, tales como los supernacientes del cultivo de la célula contienen no sólo el producto deseado sino también impurezas, que son difíciles de separar del producto deseado. Aunque los supernacientes del cultivo de la célula de las células que expresan los productos de la proteína recombinante pueden contener menos impurezas si las células crecen en un medio libre de suero, las proteínas de la célula huésped (HCPs) permanecen todavía para ser eliminadas durante el proceso de REF. : 199900 purificación. Adicionalmente , las autoridades sanitarias solicitan altos estándares de pureza para las proteínas destinadas a la administración en seres humano. Una cantidad de sistemas cromatográficos son conocidos y son ampliamente utilizados para la purificación de la proteína . Los sistemas de cromatografía de intercambio de ión son usados para la separación de las proteínas, principalmente sobre la base de diferencias en la carga. Los intercambiadores de anión pueden ser clasificados como débiles o fuertes. El grupo de carga en un intercambiador de anión débil es una base débil, que llega a ser desprotonada y, por lo tanto, pierde su carga en un pH alto. DEAE-sefarosa es un ejemplo de un intercambiador de anión débil, donde el grupo amino puede ser cargado positivamente debajo de un pH~ 9 y pierde gradualmente su carga en valores más altos de pH. El dietilaminoetil (DEAE) o el dietil- (2-hidroxi-propil) aminoetil (QAE) tiene cloruro como contra-ión, por ejemplo. Un intercambiador de anión fuerte, por otro lado, contiene una base fuerte, que permanece positivamente cargada a través de la gama de pH usada normalmente para la cromatografía de intercambio de ión (pH 1-14) . La Q-sefarosa (Q significa el amonio cuaternario) es un ejemplo para un intercambiador fuerte de anión. Los intercambiadores de catión pueden ser clasificados también como débiles o fuertes . Un intercambiador fuerte de catión contiene un ácido fuerte (tal como un grupo de sulfopropil) que permanece cargado de pH 1 - 14; mientras que un intercambiador débil de catión contiene un ácido débil (tal como un grupo de carboximetilo) , que pierde gradualmente su carga mientras disminuye el pH por debajo de 4 o 5. El carboximetilo (CM) y sulfopropilo (SP) tiene sodio como contra- ión, por ejemplo. Una resina de cromatografía diferente se basa en una matriz insoluble de fosfato de calcio hidroxilada llamado hidroxiapatita . La cromatografía de hidroxiapatita es un método para purificar las proteínas que utiliza un fosfato insoluble de calcio hidroxilado (Ca5 (P04) 3AH) 2, que forma tanto la matriz como el ligando. Los grupos funcionales consisten en pares de iones de calcio cargados positivamente (los SITIOS C) y los clusters de los grupos de fosfato cargados negativamente (los SITIOS P) . Las interacciones entre la hidroxiapatita y las proteínas son complejas y de multi-modo. En un método de interacción, los grupos amino cargados positivamente sobre las proteínas asociadas con los SITIOS P cargados negativamente y los grupos carboxilo de proteínas interactúan por complej ación de coordinación a los SITIOS C (Shepard y colaboradores, 2000) . La hidroxiapatita cristalina fue el primer tipo de hidroxiapatita usada en cromatografía. La cromatografía hidroxiapatita cerámica (CHA) es un desarrollo adicional en la cromatografía de hidroxiapatita. La hidroxiapatita cerámica tiene alta durabilidad, buena capacidad de unión de proteína, y puede ser usada a tasas más altas de flujo y presión que la hidroxiapatita cristalina. (Vola y colaboradores, 1993) . La hidroxiapatita ha sido usada en la separación cromatográfica de las proteínas, los ácidos nucleicos, así como también en los anticuerpos. En la cromatografía de hidroxiapatita, la columna es normalmente equilibrada, y la muestra aplicada en una concentración baja de amortiguador de fosfato y las proteínas absorbidas son entonces eluidas en un gradiente de concentración de amortiguador de fosfato (Giovannini y colaboradores, 2000) . Aún una manera adicional de purificar las proteínas se basa en la afinidad de una proteína de interés a otra proteína que es inmovilizada a una resina de cromatografía. Los ejemplos para tales ligandos inmovilizados son la proteína A y la Proteína G de las proteínas de la pared de la célula bacteriana, teniendo especificidad para la porción Fe de ciertas inmunoglobulinas . Aunque ambas, la Proteína A y la Proteína G, tengan una fuerte afinidad para los anticuerpos de IgG, ellas tienen afinidades que varían a otras clases de inmunoglobulina y también los isotipos. La proteína A es una proteína de 43.000 Daltons que es producida por las bacterias del estafilococo dorado y tiene cuatro sitios de unión a las regiones de Fe de IgG. La proteína G es producida de Estreptococos de grupo G y tiene dos sitios de unión para la región de IgG Fe. Ambas proteínas han sido caracterizadas extensamente por su afinidad para varios tipos de inmunoglobulinas . Otro desarrollo es la Proteína A/G, una proteína genéticamente dirigida que combina las capacidades de unión de la Proteína A y G. La proteína L es una proteína bacteriana adicional, originándose en el peptoestreptococo, uniendo a las Inmunoglobulinas y a los fragmentos de las mismas que contienen cadenas de Ig livianas (Akerstrom y Bjork, 1989) . La cromatografía de afinidad de la proteína A, la Proteína G y la Proteína L son usadas extensamente para el aislamiento y la purificación de los anticuerpos. Desde que los sitios de unión para la Proteína A y la Proteína G residen en la región Fe de una inmunoglobulina, la cromatografía de afinidad de la Proteína A y la Proteína G permite también la purificación de las así llamadas proteínas de Fusión-Fc. La proteína L se une a la cadenas livianas Ig y así puede ser usada para la purificación de la cadena liviana que contiene anticuerpos. Los anticuerpos, o las inmunoglobulinas (Igs) consisten en cadenas ligeras y cadenas pesadas unidas juntas por las uniones de disulfuro. El primer dominio localizado en la terminal amino de cada cadena es variable en la secuencia aminoácida, proporcionando el vasto espectro de las especificidades de unión del anticuerpo. Estos dominios son conocidos como regiones (VL) livianas variables y pesadas variables (VH) . Los otros dominios de cada cadena son relativamente invariables en la secuencia aminoácida y son conocidas como regiones constantes pesadas (CH) y constantes livianas (CL) . Las clases mayores de anticuerpos son IgA, IgD, IgE, IgG y IgM; y estas clases pueden ser divididas aún más en subclases (isotipos) . Por ejemplo, la clase de IgG tiene cuatro subclases, a saber, IgGl , IgG2 , IgG3 , y IgG4. Las diferencias entre clases de anticuerpos son derivadas de las diferencias en la regiones constantes de la cadena pesada, que contienen entre 1 y 4 dominios constantes (CH1-CH4) , dependiendo de la clase de inmunoglobulina . Una región llamada de vinculación se localiza entre el dominio CH1 y CH2. La región de vinculación es especialmente sensible a la partición proteolítica; tal proteólisis rinde dos o tres fragmentos que dependen del sitio preciso de la partición. La parte de la región constante de la cadena pesada que contiene el dominio de CH2 y CH3 se llama también la parte de "Fe" de la inmunoglobulina. Los anticuerpos son así proteínas que contienen Fe. Otro tipo de proteínas que contienen Fe- son las proteínas llamadas de Fusión Fe.

Varios anticuerpos que se usan como proteínas terapéuticas son conocidos. Los ejemplos para anticuerpos recombinantes en el mercado son por ejemplo: Abciximab, Rituximab, Basiliximab, Daclizumab, Palivizumab, Infliximab, Trastuzumab, Alemtuzumab, Adalimumab, Cetuximab, Efalizumab, Ibritumomab, Bevacizumab, o Omalizumab. Las proteínas de fusión Fe son las proteínas quiméricas que consisten en la región de efector de una proteína, tal como la región Fab de un anticuerpo o la región de unión de un receptor, fusionada a la región de Fe de una inmunoglobulina que es con frecuencia una inmunoglobulina G (IgG) . Las proteínas de fusión Fe son usadas extensamente como terapéuticas ya que ofrecen ventajas conferidas por la región de Fe, taj como: - La posibilidad de purificación usando la cromatografía de afinidad de la proteína A o la proteína G con las afinidades que varían según el isotipo IgG. El IgGi, IgG2 y IgG humanos, se unen totalmente a la Proteína A y a todos los IgGs humanos inclusive al IgG3 que se une fuertemente a la Proteína G; - Un aumento de la vida media en el aparato circulatorio, ya que la región Fe se une al receptor salvaje FcRn el cual protege de la degradación lisosomal; - Dependiendo del uso médico de la proteína de Fusión Fe, las funciones del efector Fe pueden ser deseables. Tales funciones del efector incluyen la cito- toxicidad celular anticuerpo-dependiente (ADCC) por las interacciones con los receptores de Fe (FCYRS) y la cito-toxicidad complemento-dependiente (CDC) mediante la unión al componente complemento lq (Clq) . Los isoformos de IgG ejercen niveles diferentes de funciones de efector. Los IgGi y IgG3 humanos tienen efectos fuertes ADCC y CDC mientras que el IgG2 humano ejerce efectos ADCC y CDC débiles. El IgG4 humano exhibe un ADCC débil y ningún efecto CDC. La vida media del suero y las funciones del efector pueden ser moduladas mediante ingeniería de la región Fe para aumentar o reducir su unión a FcRn, FcyRs y Clq respectivamente, dependiendo del uso terapéutico destinado para la proteína de fusión Fe. En ADCC, la región de Fe de un anticuerpo se une a los receptores de Fe (FcyRs) en la superficie de células inmunes del efector tal como las asesinas naturales y los macrofagos, llevando a la fagocitosis o lisis de las células dirigidas. En CDC, los anticuerpos matan las células dirigidas provocando la cascada del complemento en la superficie de la célula. Los isoformos de IgG ejercen niveles diferentes de las funciones del efector aumentando en la orden de IgG4 < IgG2 < IgGi = IgG3. El Igd humano despliega ADCC altos y CDC, y es el más conveniente para el uso terapéutico contra células patógenas y del cáncer. Bajo ciertas circunstancias, por ejemplo cuando la reducción de la célula objetivo es indeseable, se puede requerir la anulación o disminución de las funciones del efector. Al contrario, en el caso de los anticuerpos destinados para el uso de oncología, aumentar las funciones del efector puede mejorar su actividad terapéutica (Cárter y colaboradores, 2006) . Modificar las funciones del efector pueden ser logrado por ingeniería de la región Fe tanto para mejorar o reducir la unión de FcyRs o los factores del complemento. La unión de IgG para el FCYRS activante (FCYRI, FcYRIIa, FcyRIIIa y FcYRIIIb) e inhibitorio (FcyRIIb) o el primer componente del complemento (Clq) depende de los residuos localizados en la región vinculante y el dominio CH2. Dos regiones del dominio CH2 son críticas para FcyRs y la unión del complemento Clq, y tienen las secuencias únicas en IgG2 y IgG . Por ejemplo la sustitución de los residuos IgG2 en las posiciones 233-236 en el IgGi humano redujo en forma importante a ADCC y CDC (Armour y colaboradores, 1999 y Shields y colaboradores, 2001) . Se han realizado numerosas mutaciones en el dominio CH2 de IgG y su efecto en ADCC y CDC fue probado in vitro (Shields y colaboradores, 2001, Idusogie y colaboradores, 2001 y 2000, Steurer y colaboradores, 1995) . En particular, una mutación a alanina en E333 fue informada para aumentar tanto ADCC como CDC (Idusogie y colaboradores, 2001 y 2000) . Aumentar la vida media del suero de un anticuerpo terapéutico es otra manera de mejorar su eficacia, permitiendo más altos niveles de circulación, menos frecuente administración y dosis reducidas. Esto puede ser logrado mejorando la unión de la región de Fe a FcR neonatal (FcRn) . FcRn, que se expresa en la superficie de las células endoteliales , une el IgG en una manera dependiente del pH- y lo protege de la degradación. Varias mutaciones localizadas en la interfase entre los dominios CH2 y CH3 han mostrado que aumentan la vida media de IgGi (Hinton y colaboradores, 2004 y Vaccaro y colaboradores, 2005) . La siguiente Tabla 1 resume las mutaciones conocidas de la región Fe de IgG (tomada del sitio web de Invivogen) .

Fe dirigido Isotipo Mutaciones Propiedades Beneficios AplicacioIgG potenciales nes higGiei IgGl T250Q/M428L Vida media de Localización humano plasma mejorada para Vacunación; Aumentada dirigir; eficacia uso aumentada; dosis terapéutico reducida o frecuencia de la adntinistración En una clase de proteínas de fusión Fe que tienen utilidad terapéutica, las regiones Fe se han fusionado a los dominios extracelulares de ciertos receptores que pertenecen a la superfamilia del receptor del factor de la necrosis del tumor (TNF-R) (Locksley y colaboradores, 2001, Bodmer y colaboradores, 2002, Bossen y colaboradores, 2006). Una marca de los miembros de la familia de TNFR es la presencia de las pseudo repeticiones ricas en cisteína en el dominio extracelular, tal como se describe, por ejemplo, por Naismith y Sprang, 1998. Los dos receptores de TNF, p55 (TNFR1) y TNFR p75 (TNFR2) son los ejemplos de tales miembros de la superfamilia de TNFR. Etanercept es una proteína de Fusión Fe que contiene la parte soluble del TNFR p75 (por ejemplo, en la patente WO91/03553, y WO 94/06476) . Bajo el nombre comercial Enbrel®, se vende para el tratamiento de la endometriosis , la infección del virus de Hepatitis C, la infección de HIV, artritis soriática, la soriasis, la artritis reumatoidea, el Asma, la espondilitis de Anquílosamiento, el ataque Cardiaco, el Injerto contra la enfermedad el huésped, la fibrosis Pulmonar, la enfermedad de Crohns . Lenercept es una proteína de fusión que contiene los componentes extracelulares del receptor humano de TNF p55 y la porción de Fe del IgG humano, y se piensa para el tratamiento potencial de asepsia severa y la esclerosis múltiple. 0X O es también un miembro de la superfamilia de TNFR. OX40-IgGl y las proteínas de fusión OX40-hIG4mut han sido preparadas para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias y autoinmunes tales como la Enfermedad de Crohn . Una proteína de Fusión Fe de la BAFF-R, llamada también BR3, designada BR3-Fc, es un receptor de seducción soluble de una serie de inhibidores de BAFF (el factor activante de la célula B de la familia TNF) , se desarrolla para el tratamiento potencial de las enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoidea (RA) y lupus eritematoso sistémica (SLE) . BCMA es otro receptor que pertenece a la superfamilia de TNFR. Una proteína de fusión de BCMA-Ig ha sido descrita para inhibir la enfermedad autoinmune (Melchers, 2006) . Otro receptor de la superfamilia TNF-R es TACI, el activador de la transmembrana e interactor CAML (von Bülow y Brarn, 1997; EEUU 5.969.102, Gross y colaboradores, 2000), que tiene un dominio extracelular que contiene dos seudo repeticiones ricas en cisteína. TACI se une a dos miembros de la familia del ligando (TNF) del factor de necrosis del tumor. Un ligando es designado BLyS, BAFF, neutroquina-a, TALL-1, zTNF4, o THANK ( oore y colaboradores, 1999). El otro ligando ha sido designado como APRIL, ligando- 1 de muerte TNRF-1 o ZTNF2 (Hahne y colaboradores, J. Exp.Med. 188: 1185 (1998) . Las proteínas de fusión que contienen formas solubles del receptor de TACI fundido a una región de IgG Fe son conocidas también y se designaron TACI Fe (WO 00/40716, WO 02/094852). TACI-Fe inhibe la unión de BLyS y APRIL a las células B (Xia y colaboradores, 2000) . Se desarrolla para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes, inclusive del lupus eritematoso sistémico (SLE) , la artritis reumatiodea (RA) y las malignidades hematológicas , así como para el tratamiento de la esclerosis múltiple (MS) . Además de esto, TACI-Fc se desarrolla en mielomas múltiples (M ) (Novak y colaboradores, 2004; oreau y colaboradores, 2004) y el linfoma de Hodgkin (NHL) , leucemia crónica de linfocito (CLL) y macroglobulemia de Waldenstrom (WM) . Dada la utilidad terapéutica de las proteínas de fusión Fe, en particular aquellas que contienen las porciones extracelulares de la superfamilia TNFR, existe una necesidad para cantidades importantes de proteínas altamente purificadas que es adecuada para la administración humana. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Uno de los problemas que pueden ser encontrados durante la producción de las proteínas que contienen Fe es la presencia de "fracciones libres de Fe", es decir, los fragmentos del polipéptido derivados de la proteína que contiene Fe, que ni son fundidos a las regiones del anticuerpo variable ni a otras proteínas específicas o dominios normalmente presentes en la proteína de Fusión Fe. La presente invención se dirige este problema. Se basa en el desarrollo de un proceso de purificación para un fluido, composición o preparación de una proteína que contiene Fe, por la cual la cantidad de las fracciones de Fe libres que pueden estar presentes como una impureza puede ser reducida.

Por lo tanto, la invención se refiere a un método para reducir la concentración de las fracciones libres de Fe en un fluido que comprende una proteína que contiene Fe, método que comprende someter dicho fluido a la cromatografía de cambio de catión. En un segundo aspecto, la invención se refiere al uso de la cromatografía de intercambio de catión para la reducción de Fe libre en una preparación de proteína que contiene FC .

En un tercer aspecto, la invención se refiere a una proteína que contiene Fe purificado, que comprende menos de 5% o menos de 2% o menos de 1% o menos de 0,5% o menos de 0,2% o menos de 0,1% de las fracciones de Fe libres . BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Fig. 1 muestra una SDS-PAGE manchada de plata no reducida de las fracciones diferentes que provienen de la cromatografía del intercambio de catión descrita en el Ejemplo 2. Senda 1: Los marcadores de peso molecular, Senda 2: TACI-Fc purificado, Senda 3: carga, Senda 4: lavado 2, Senda 5: eluato 2, Senda 6: lavado 3, Senda 7: eluato 3, Senda 8: lavado 1, Senda 9: eluato 1, Senda 10: Fe purificado libre ; La Fig. 2 muestra el perfil cromatográfico de la cromatografía del intercambio de catión descripto en el Ejemplo 2. BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La SEC ID N° : 1 es una secuencia de la huella dactilar de la cisteína (seudo repetición rica en cisteína) común a los miembros de la superfamilia de TNFR; La SEC ID N° : 2 es la secuencia de largo total del receptor humano de TACI (por ejemplo, descripto en WO 98/39361) ; La SEC ID N°: 3 es un ejemplo de una secuencia humana de Fe de la invención (por ejemplo, descripta en WO 02/094852) ; La SEC ID N° : 4 es una proteína preferida de Fusión Fe de la invención, que comprende las secuencias derivadas de la porción extracelular de TACI y una porción IgGi humano (por ejemplo, descripta en WO 02/094852) ; La SEC ID N° : 5 es un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la SEC ID N° : 2 ; La SEC ID N° : 6 es un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la SEC ID N° : 3 ,- La SEC ID N": 7 es un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la SEC ID N° : 4.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el hallazgo que la cromatografía de intercambio de catión puede reducir la cantidad o la extensión de las fracciones de Fe libres que pueden estar presentes en un fluido o la composición de una proteína que contiene Fe . La invención, por lo tanto, se refiere a un método para reducir la concentración de las fracciones de Fe libres en un fluido que comprende una proteína que contiene Fe, el método que comprende someter dicho fluido a la cromatografía de intercambio de catión. El fluido que comprende la proteína que contiene Fe puede ser cualquier composición o preparación, tal como por ejemplo, un fluido corporal derivado de un ser humano o animal, o un fluido derivado de una cultivo de célula, tal como por ejemplo un superpaciente de cultivo de célula. Puede ser también un fluido derivado de otro paso de purificación, tal como por ejemplo el eluato o flujo continuo de un paso de captura o cualquier otro paso conveniente de purificación tal como se encuentra explicado en más detalle abajo. El término "la proteína que contiene Fe", como se usa en el presente, se refiere a cualquier proteína que tiene por lo menos un dominio constante de inmunoglobulina escogido del CH1, vinculación, del dominio CH2 , CH3 y CH4 , o de cualquier combinación de los mismos, y preferiblemente una vinculación, dominio CH2 y CH3. El dominio constante de la inmunoglobulina puede ser derivado de cualquiera de IgG, de IgA, de IgE, de IgM, o de la combinación o isotipo de las mismas. Preferiblemente, es IgG, tal como por ejemplo IgGi , IgG2, IgG3 o IgG4. Más preferiblemente, es IgGi. Una proteína que contiene Fe, de acuerdo con la presente invención, así puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o una proteína de Fusión Fe, o variantes de la misma, tal como los fragmentos, muteínas o derivados funcionales de anticuerpos o proteínas de Fusión Fe. La proteína que contiene Fe de la invención puede ser un monómero, dímero o multímero. La proteína que contiene Fe puede ser también un seudo-dímero (llamado a veces "monómero"), que contiene una fracción Fe dimérica (por ejemplo, un dímero de dos constructos CH2-CH3 de vinculación puenteados de disulfuro) , de los que sólo uno es fusionado a una fracción adicional tal como un dominio variable de inmunoglobulina, un ligando que se une e inhibe opcionalmente el fragmento de un receptor, o de cualquier otra proteína. Un ejemplo para tal seudo-dímero es una proteína de Fusión Fe que tiene Interferón-ß fusionado a uno de dos constructos CH2-CH3 de vinculación IgG tal como, por ejemplo, el que se describe en la WO 2005/001025. La proteína que contiene Fe puede ser también un heterodímero, que contiene dos porciones diferentes de no- inmunoglobulina o dominios variables de inmunoglobulina, o un homodímero, que contiene dos copias de una sola porción de no-inmunoglobulina o el dominio variable de la inmunoglobulina.

Preferiblemente, la proteína que contiene Fe es un dímero. Se prefiere también que la proteína que contiene Fe de la invención sea un homodímero. De acuerdo con la presente invención, la fracción de Fe de la proteína que contiene Fe puede ser modificada también para modular las funciones del efector. Por ejemplo las mutaciones siguientes de Fe, según las posiciones del índice de EU (Kabat y colaboradores, 1991) , pueden ser introducidas si la fracción de Fe deriva de IgG].: T250Q/M428L M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F E233P/L234V/L235A/AG236 + A327G/A330S/P331S E333A; K322A. Mutaciones adicionales de Fe, por ejemplo, pueden ser las sustituciones en las posiciones del índice de EU seleccionadas de 330, 331, 234, o 235, o las combinaciones de las mismas. Una sustitución de aminoácido en la posición del índice de EU 297 localizado en el dominio CH2 puede ser introducido también en la fracción Fe en el contexto de la presente invención, eliminando un sitio potencial de fijación del carbohidrato unido a N. Además, el residuo de cisteína en la posición del índice de UE 220 pueden ser reemplazado también con un residuo de serina, eliminando el residuo de cisteina que forma normalmente las uniones de disulfuro con la región constante de la cadena liviana de inmunoglobulina.

De acuerdo con la presente invención, se prefiere que la fracción de Fe comprenda o consista de la SEC ID N° : 3 o esté codificada por un polinucleótido que comprenda o consista de la SEC ID N°: 6. En una modalidad preferida, la proteína que contiene Fe comprende una región variable de la inmunoglobulina, por ejemplo, uno o más dominios variables de cadena pesada y/o uno o más dominios variables de cadena liviana. Preferiblemente, el anticuerpo contiene uno o dos dominios variables de cadena pesada. Más preferiblemente, el anticuerpo contiene adicionalmente uno o dos constantes de cadena liviana y/o dominios variables. Es preferible que la proteína que contiene Fe sea un anticuerpo . El término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina o al fragmento de la misma, y abarca cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión de antígeno. El término incluye, pero no está limitado a, los anticuerpos generados policlonales , monoclonales , mono-específicos, poli-específicos, indeterminados, humanizados, humanos, quiméricos, de cadena única, sintéticos, recombinantes , híbridos, mutados, injertados, o in vitro. El anticuerpo puede ser escogido de cualquiera de los isotipos de anticuerpos conocidos, por ejemplo, IgA, IgG, IgD, IgE, IgM. El anticuerpo puede ser un monómerro, dímero, o multimero tal como un trímero, o pentámero. Los ejemplos de anticuerpos que pueden ser purificados de acuerdo con la presente invención son Abciximab, Rituximab, Basiliximab, Daclizumab, Palivizumab, Infliximab, Trastuzumab, Alemtuzumab, Adalimumab, Cetuximab, Efalizumab, Ibritumomab, Bevacizumab, o Omalizumab. Los ejemplos adicionales de anticuerpos que pueden estar sujetos a la cromatografía de intercambio de catión de acuerdo con la presente invención son los anticuerpos dirigidos contra: CD2 , CD3 , CD4 , CD8 , CDlla, CDllb, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80, CD86, CD147, CD164, receptor IL-2, receptor IL-4, receptor IL-6, receptor IL-12, subunidades de receptor IL-18 (IL-18R-alfa, TACI IL-18R-beta) , BCMA, BAFF-R, receptor de EGF, receptor de VEGF, integrin a4ß7, integrin VLA4 , integrinos B2 , receptores de TRAIL 1, 2, 3, y 4, ligando RA K, RANK, molécula epitelial de adhesión de célula (EpCAM) , molécula intercelular de adhesión-3 (ICA -3), CTLA4 , de Fe L, receptor II o III, HLA-DR 10 beta, antígeno de HLA-DR, o L-selectin. Los anticuerpos dirigidos contra TNF, Blys, o contra el Interferón-? Son los ejemplos adicionales de los anticuerpos donde reside el interés terapéutico.

Las proteínas de Fusión Fe son también proteínas que contienen Fe que están preferiblemente sometidas al método de la invención. El término "proteína de Fusión Fe" , como se utiliza en el presente documento, significa abarcar las proteínas, en particular las proteínas terapéuticas, que comprenden una fracción derivada de la inmunoglobulina, que será denominada en la presente como la "Fracción Fe" , y una fracción derivada de una segunda proteína no-inmunoglobulina, que será denominada en el presente como la "fracción terapéutica", sin tomar en consideración si se intenta o no el tratamiento de la enfermedad. Las proteínas terapéuticas de Fusión Fe, es decir, las proteínas de Fusión Fe que se intentan para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de un animal o preferiblemente para el tratamiento o la administración a los seres humanos, son especialmente convenientes para ser purificadas de acuerdo con la invención. Cualquier proteína de Fusión Fe puede ser purificada de acuerdo con la presente invención, tal como por ejemplo una proteína de fusión que contiene al Interferón-ß . Preferiblemente, el método de la invención es para purificar una proteína de Fusión Fe que comprende un fragmento de unión de ligando, tal como todo o parte de un dominio extracelular, de un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis del tumor (TNFR) . La fracción terapéutica de una proteína de Fusión Fe por ejemplo puede ser o es derivada de EPO, TPO, la Hormona del crecimiento, Interferón-Alfa, Interferón-Beta, Interferón-Gamma, La PDGF-BETA, VEGF, IL IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18, proteína de unión IL-18, TGF-BETA, TNF-ALFA, o TNF-BETA. La fracción terapéutica de una proteína de Fusión Fe puede ser derivada también de un receptor, por ejemplo un receptor de transmembrana, preferiblemente es o está derivada del dominio extracelular de un receptor, y en particular de un ligando que se une al fragmento de la parte extracelular o el dominio de un receptor dado. Los ejemplos para los receptores de interés terapéutico son CD2 , CD3 , CD4 , CD8, CDlla, CDllb, CD14 , CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80, CD86, CD147, CD164, Receptor IL-2, Receptor IL-4, Receptor IL-6, receptor IL-12, subunidades del receptor IL-18 (IL-18R-alfa, receptor de EGF IL-18R-beta) , receptor de VEGF, integrin alfa 4 10 beta 7, integrin VLA4 , integrinos B2, receptores de TRAIL 1, 2, 3, y 4, ligando RA K, RA K, molécula epitelial de adhesión de célula (EpCAM) , molécula intercelular de adhesión-3 (ICAM-3) , CTLA4 (que es un antígeno asociado del linfocito T citotóxico) , receptor Fe Gama I, receptor II o III, HLA-DR 10 beta, antígeno de HLA-DR, o L-selectin.

Es altamente preferible que la fracción terapéutica sea derivada de receptor que pertenece a la superfamilia de TNFR. La fracción terapéutica, por ejemplo, puede ser o es derivada del dominio extracelular de TNFR1 (p55) , TNFR2 (p75), OX40, Osteoprotegerin, CD27, CD30, CD40, RANK, DR3 , ligando de Fa, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3 , TAIL-R4, NGFR, AITR, BAFFR, BCMA, TACI. De acuerdo con la presente invención, la fracción terapéutica derivada de un miembro de la superfamilia de TNFR comprende preferiblemente, o consiste en todo o en parte, del dominio extracelular del miembro del TNFR, y más preferiblemente comprende un ligando que se une al fragmento de tal miembro TNFR. La siguiente Tabla 5 lista los miembros de la superfamilia de TNFR de la que una fracción terapéutica de acuerdo con la presente invención, puede ser derivada, y sus ligandos respectivos. Un "ligando que se une al fragmento" de un miembro de la familia de TNFR puede ser determinado fácilmente por la persona hábil en el arte, por ejemplo en un ensayo sencillo in vitro que mida la unión entre el fragmento de la proteína de un receptor dado y el ligando respectivo. Tal ensayo, por ejemplo, puede ser un ensayo sencillo in vitro RIA o ELISA sándwich donde una de las proteínas, por ejemplo, el fragmento del receptor, es inmovilizado a un portador (por ejemplo, una placa ELISA) y se incuba, siguiendo el bloqueo adecuado de los sitios de unión de la proteína en el portador, con la segunda proteína, por ejemplo el ligando. Después de la incubación, se detecta la unión de ligando, por ejemplo, por la manera del etiquetado radioactivo del ligando y la determinación de la radioactividad unida, después de un lavado apropiado en un contador de centelleo. La unión del ligando puede ser determinada también con un anticuerpo marcado, o con un primer anticuerpo ligando-específico y un segundo, anticuerpo marcado dirigido contra la parte constante del primer anticuerpo. La unión del ligando así puede ser determinada fácilmente, dependiendo de la etiqueta usada, por ejemplo en una reacción de color. Preferiblemente, el método de la presente invención es para purificar una proteína de Fusión Fe que comprende una fracción terapéutica derivada de un miembro de la superfamilia de TNFR escogida de aquellos listados en la Tabla 5. Tabla 5: La superfamilia de TNFR (según Locksley y colaboradores, 2001 y Bosten y colaboradores, 2006) Miembro de la superfamilia Ligando TNFR NGFR NGF EDAR EDA-Al XEDAR EDA-A2 Miembro de la superfamilia Ligando TNFR CD40 CD40L Fas FasL Ox40 0X4 OL AITR AITRL GITR GITRL CD30 CD30L CD40 CD40L HveA LIGHT, LT-alfa 4-1BB 4-1BBL TNFR2 TNF-alfa, LT-alfa, LT-alfa-beta LT-betaR LIGHT, LT-alfa, LT-alfa-beta DR3 TL1A CD27 CD27L TNFR1 TNF-alfa, LT-alfa, LT-alfa-beta LTBR LT-beta RA K RANKL TACI BlyS, APRIL BCMA BlyS, APRIL BAFF-R BAFF (= BlyS) TRAILR1 TRAIL TRAILR2 TRAIL TRAILR3 TRAIL Miembro de la superfamilia Ligando TNFR TRAILR4 TRAIL Fnl4 T EAK OPG RA KL, TRAIL DR4 TRAIL DR5 TRAIL DcRl TRAIL DcR2 TRAIL DcR3 FasL, LIGHT, TL1A En una modalidad preferida, la proteína de Fusión Fe comprende una fracción terapéutica escogida de un dominio extracelular de TNFR1, TNFR2 , o un TNF que se une al fragmento de la misma. En una modalidad aún más preferida, la proteína de Fusión Fe comprende una fracción terapéutica escogida de un dominio extracelular de BAFF-R, de BCMA, o de TACI, o un fragmento del mismo que une por lo menos uno de Blys o APRIL.

Un ensayo para probar la capacidad de la unión a Blys o APRIL se describe por ejemplo en Hymowitz y colaboradores, 2006. En aún otra modalidad más preferida, la fracción terapéutica de una proteína de Fusión Fe comprende la pseudo repetición rica en cisteína de la SEC ID N° : 1. Si se prefiere aún más que la fracción terapéutica que deriva de TACI. TACI es preferiblemente humana. La SEC ID N° : 2, que corresponde a la secuencia aminoácida del receptor TACI de largo total humano (también entrada SwissProt 014836) . Más preferiblemente, la fracción terapéutica comprende una porción soluble de TACI, preferiblemente derivada del dominio extracelular de TACI. Preferiblemente, la fracción terapéutica derivada de TACI comprende por lo menos los aminoácidos 33 a 67 de la SEC ID N° : 2 y/o los aminoácidos 70 a 104 de la SEC ID N° : 2. En una modalidad preferida, el dominio extracelular de TACI incluido en la fracción terapéutica, según la invención, comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 166 de la SEC ID N° : 2, o los aminoácidos 30 a 166 de la SEC ID N° : 2, o los aminoácidos 30 a 119 de la SEC ID N° : 2, o los aminoácidos 30 a 110 de la SEC ID N° : 2. Todas esas fracciones terapéuticas son preferidas para la preparación de la proteína de Fusión Fe para que sea purificada por el método de la invención y se combine con las fracciones de Fe descriptas en detalle anteriormente, y en particular con una Fracción de Fe que comprende o consiste de la SEC ID N° : 3. Una proteína de Fusión Fe sumamente preferida para ser purificada de acuerdo con la presente invención comprende o consiste en la SEC ID N° : 4 o se codifica por el polinucleótido de la SEC ID N°: 7.

Entonces, es altamente preferido que la proteína de Fusión Fe comprenda un polipéptido escogido de a. los aminoácidos 34 a 66 de la SEC ID N° : 2; b. los aminoácidos 71 a 104 de la SEC ID N° : 2; c. los aminoácidos 34 a 104 de la SEC ID N° : 2; d. los aminoácidos 30 a 110 de la SEC ID N° : 2 ; e . SEC ID N° : 3 ; f . SEC ID N° : 4 ; g. un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibridiza al complemento de la SEC ID N° : 5 o 6 o 7 bajo condiciones sumamente rigurosas; y h. una muteína de cualquiera de (c) , (d) , (e) , o que tiene por lo menos 80% o 85% o 90% o 95% de la identidad de la secuencia al polipéptido de (c) , (d) , (e) o (f) ; en donde el polipéptido se une a por lo menos uno de Blys o APRIL . De acuerdo con la presente invención, la proteína que contiene Fe esta sometida a la cromatografía de intercambio de catión para reducir, disminuir, o para eliminar las fracciones de Fe libres, preferiblemente por lo menos por 50, 40, 30, 20 o 10% de la concentración total de la proteína, o más preferiblemente menos del 10%. El término "fracciones Fe libres", "fracción Fe", o simplemente "Fe libre", como se usa en la presente, significa abarcar cualquier parte de la proteína que contiene Fe para ser purificada de acuerdo con la presente invención, que deriva del dominio o los dominios constantes de la inmunoglobulina sin comprender los dominios adicionales completos. Así, si la proteína que contiene Fe comprende dominios variables de la inmunoglobulina, Fe libre no contiene porciones significativas de los dominios variables. Si la proteína que contiene Fe es una proteína de Fusión Fe, Fe libre no contiene porciones significativas de la fracción terapéutica de la proteína de Fusión Fe. Fe libre por ejemplo puede contener dímeros de vinculación de IgG, los dominios CH2 y CH3 , que no están ligados ni se unen a las porciones significativas de una fracción terapéutica o a los dominios variables de la inmunoglobulina, tal como por ejemplo, la parte de Fe que es generada por la partición de papain. Los monómeros derivados de la fracción de Fe pueden también estar contenidos en la fracción libre de Fe. Se entiende que Fe libre puede contener todavía varios residuos de aminoácido de la fracción terapéutica o de los dominios variables de Ig, tal como por ejemplo uno a cincuenta o uno a veinte, o uno a diez, o uno a cinco aminoácidos, o a un solo aminoácido, perteneciendo a la fracción terapéutica o el dominio variable, todavía fusionados a la fracción de Fe. La cromatografía de intercambio de catión puede ser llevada a cabo en una resina de intercambio de catión adecuada, tal como los intercambiadores de catión débiles o fuertes explicados anteriormente en Antecedentes de la Invención. Preferiblemente, la cromatografía de intercambio de catión es llevada a cabo en una resina fuerte de intercambio de catión. Más preferiblemente, el material de intercambio de catión comprende un metacrilato reticulado modificado con los grupos S03. Una columna comercialmente disponible bajo el nombre Fractogel EMD S03" (de Merck) es un ejemplo de una resina de intercambio de catión que es especialmente conveniente en el contexto del método presente. Preferiblemente, el fluido o la composición que comprenden la proteína que contiene Fe se cargan a una resina de intercambio de catión a un pH de por lo menos una unidad por debajo del punto de iso-eléctrico (pl) de dicha proteína de Fusión Fe. En una modalidad preferida, la resina de intercambio de catión es lavada con un amortiguador que tiene una conductividad de 6 a 10 mS/cm y un pH de 5,5 a 7,5. El amortiguador por ejemplo puede tener una conductividad en 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, o 9,9 mS/cm. Más preferiblemente, la conductividad oscila de 8,2 a 8,6, más preferiblemente 8,4 mS/cm. El paso de lavado es llevado preferiblemente a cabo en un pH que oscila de 5,5 a 7,5, preferiblemente de 6,0 a 7,0. El pH del amortiguador por ejemplo puede estar en 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, o 7,5. En una modalidad aún más preferida, el paso de lavado es llevado a cabo en un amortiguador que comprende 60 a 140, preferiblemente 70 a 130, más preferiblemente 75 a 125 mM de fosfato de sodio. El amortiguador por ejemplo puede comprender 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, o 140 mM de fosfato de sodio. En una modalidad aún más preferida, la columna de intercambio de catión es eluida en un pH que oscila de 7,0 a 8,5, preferiblemente 7,25 o 7,3 o 7,35 o 7,4 o 7,45 o 7,5 o 7,55 o 7,6 o 7,65 o 7,7 o 7,75 o 7,8 o 7,85 o 7,9 o 7,95 o 8,0 o 8,05 o 8,1 o 8,15 o 8,2 o 8,25 o 8,3 o 8,35 o 8,4 o 8,45 O 8,5. La elusión puede ser llevada preferiblemente a cabo en una conductividad que oscila desde 15 a 22 mS/cm. Por ejemplo la conductividad puede ser escogida de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 mS/cm. Un amortiguador preferido para la elusión es un amortiguador de fosfato. De acuerdo con la presente invención, la cromatografía de intercambio de catión puede ser usada preferiblemente para la eliminación o la reducción de Fe libre en la gama de 5 a 15 veces. Así, puede lograrse una reducción de la concentración de Fe libre en la proteína que contiene fluido comprende fluido, preparación o composición a menos de 20% o menos de 15% o menos de 10% o menos de 5% o menos de 2% o menos de 1% o menos de 0,8% o menos de 0,5% o menos de 0,3% o menos de 0,2% o menos que 0,1% de la concentración total de la proteína. En una modalidad preferida, la cromatografía de intercambio de catión puede ser usada en un método de purificación que tiene uno o más pasos adicionales, preferiblemente escogido de la cromatografía de afinidad, la cromatografía de intercambio de anión y la cromatografía de hidroxiapatita . En una modalidad sumamente preferida, el método de la invención es usado como un segundo paso de un esquema de purificación de una proteína que contiene Fe que comprende los pasos siguientes: Someter un fluido que comprende dicha proteína que contiene Fe a la cromatografía de afinidad de la Proteína A o la Proteína G o Proteína L; a. Someter el eluato del paso (a) a la cromatografía de intercambio de catión; b. Someter el eluato del paso (b) a la cromatografía del intercambio del Anión; c. Someter el flujo continuo (c) a la cromatografía de Hidroxiapatita y reunir el eluato para obtener la proteína purificada que contiene Fe. De acuerdo con la presente invención, un fluido que comprende una proteína que contiene Fe se somete primero a la cromatografía de afinidad de la Proteína A o la Proteína G o la Proteína L o de la Proteína A/G. El fluido puede ser preferiblemente el material del cultivo de la célula, por ejemplo, las células solubilizadas , más preferiblemente el supernaciente del cultivo de la célula. El término "supernaciente de cultivo de la célula", como se usa en la presente, se refiere a un medio en el que las células son cultivadas y en la cuál las proteínas son secretadas siempre que contengan las señales celulares apropiadas, los así llamados péptidos de señal. Se prefiere que las células que expresan la proteína que contiene Fe sean cultivadas bajo condiciones de cultivo libres de suero. Así, preferiblemente, el supernaciente del cultivo de célula está desprovisto de los componentes derivados del suero animal . Más preferiblemente, el medio de cultivo de célula es un medio definido químicamente. La Proteína A, G, A/G o L usadas para la cromatografía de afinidad puede, por ejemplo, ser recombinante . Puede ser modificada también para mejorar sus propiedades (tal como por ejemplo en la resina llamada MabSelect Sure, comercialmente disponible de GE Healthcare) . En una modalidad preferida, el paso (a) es llevado a cabo en una resina que comprende agarosa reticulada modificada con una Proteína A recombinante . Una columna comercialmente disponible bajo el nombre Mabselect Xtra (de AG Healthcare) es un ejemplo de una resina de afinidad que es especialmente conveniente para el paso (a) del método presente. La cromatografía de afinidad de la Proteína A o G o la L se utiliza preferiblemente como un paso de captura, y así sirve para la purificación de la proteína que contiene Fe, en particular la eliminación de la proteínas de la célula huésped y de los agregados de proteína que contienen Fe, y para la concentración de la preparación de la proteína que contiene Fe. El término "agregados", como se usa en la presente, se utiliza para referirse a los agregados de la proteína, y abarca multímeros (tal como dímeros, tetrámeros o agregados de orden más alto) de la proteína que contiene Fe para ser purificada y puede resultar por ejemplo en agregados de peso molecular alto. La cromatografía de afinidad tiene la ventaja adicional de reducir los niveles del agregado por 2 a 4 veces. Al usar la cromatografía de afinidad Proteína A o G, los niveles de la proteína de la célula huésped pueden ser reducidos de 100 a 300 veces. En una modalidad preferida de la invención, la elusión en el paso (a) se lleva a cabo en un pH que oscila de 2,8 a 4,5, preferiblemente de 3,0 a 4,2, más preferiblemente en 3,5, 3,55, 3,6, 3,65, 3,7, 3,75, 3,8, 3,85, 3,9, 3,95, 4,0, 4,05, 4,1, o 4,15. La elusión en el paso (a) puede ser llevada también a cabo con un gradiente de pH, preferiblemente un gradiente de pH 4,5 a 2,8. En una modalidad aún más preferida, la elusión en el paso (a) es llevada a cabo en un amortiguador escogido de acetato de sodio o citrato de sodio. Las concentraciones convenientes de amortiguador, por ejemplo, son escogidas de 50 mM o 100 mM o 150 mM o 200 mM o 250 mM. De acuerdo con la presente invención, el eluato de la Proteína A o la cromatografía de la Proteína G o la Proteína A/G o la Proteína L está sujeta a la cromatografía de intercambio de catión, como se explica con todo detalle más arrib . Preferiblemente, el eluato de la cromatografía de intercambio de catión, es decir del paso (b) , es diluido o es dializado en un amortiguador apropiado de carga antes de cargarlo en la columna de intercambio de anión. La columna del intercambio de anión también es equilibrada preferiblemente con el amortiguador de la carga. Un pH preferido para el amortiguador de la carga es una unidad por debajo del pl . Los valores convenientes del pH oscilan de 6,0 a 8,5, preferiblemente de 7,0 a 8,0, por ejemplo 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95, o 8,0. Una conductividad preferida para el amortiguador de la carga está en la gama de 3,0 a 4,6 mS/cm. Un amortiguador apropiado de equilibrio/carga, por ejemplo, puede ser fosfato de sodio en una concentración que oscila de 5 a 35, preferiblemente de 20 a 30 mM. La concentración del amortiguador por ejemplo puede estar en 10, 15, 20, 25, 30 mM. En el marco de la presente invención, se recolecta el flujo continuo (llamado también retro-transmisión) de cromatografía de intercambio de anión, que comprende la proteína que contiene Fe de interés. El paso (c) del método de la invención reduce aún más los agregados 3 a 5 veces y las proteínas de la célula huésped 30 a 70 veces. De acuerdo con la presente invención, el flujo continuo de la cromatografía de intercambio de anión del paso (c) entonces se usa para la purificación adicional por la cromatografía de hidroxiapatita . Cualquier resina de hidroxiapatita puede ser usada para llevar a cabo el paso (d) del método según la invención. En una modalidad preferida, el paso (d) es llevado a cabo en una resina cerámica de hidroxiapatita, tal como una resina tipo I o tipo II de hidroxiapatita. La resina de hidroxiapatita puede tener las partículas de cualquier tamaño tal como 20, 40 o 80 µ?. En una modalidad sumamente preferida, la resina cerámica de hidroxiapatita comprende las partículas que tienen un tamaño de 40 µ?. Una resina de hidroxiapatita que es especialmente conveniente para el paso (d) del método presente es una columna comercialmente disponible bajo el de nombre de Hidroxiapatita de Cerámica CHT tipo I, 40 µ?. En una modalidad preferida, el flujo continuo del paso (c) es cargado directamente en la resina de hidroxiapatita, es decir sin la dilución o la diálisis previa en un amortiguador apropiado de carga. La carga es llevada preferiblemente a cabo en un pH de 6,5 a 7,5, tal como 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,1, 7,2, 7,3, o 7,4, y preferiblemente 7,0. En una modalidad aún más preferida, la elusión en el paso (d) es llevada a cabo en la presencia del fosfato de sodio que oscila desde 2 a 10 mM, oscilando preferiblemente de 2,75 a 5,25 mM, tal como por ejemplo en 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5. En una modalidad aún más preferida, la elusión en el paso (d) es llevada a cabo en un pH que oscila de 6,0 a 7,0, por ejemplo en 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9. En otra modalidad preferida, la elusión en el paso (d) es llevado a cabo en la presencia de cloruro de potasio que oscila desde 0,4 a 1 M, preferiblemente en 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 M, más preferiblemente en 0,6 M. De acuerdo con la presente invención, el eluato de la cromatografía de hidroxiapatita es recolectada, conteniendo la preparación finalmente purificada de la proteína que contiene Fe. Los materiales convenientes de la matriz, es decir, los materiales del portador para las resinas cromatográficas usadas en los pasos (a) a (c) , pueden ser usados con respecto a la presente invención, por ejemplo, pueden ser agarosa (sefarosa, superosa) dextran (sefadex) , polipropileno, celulosa de metacrilato, poliestireno/divinil benceno o lo similar. Los materiales de la resina pueden estar presentes en formas reticuladas, dependiendo del uso específico. El volumen de la resina, la longitud y el diámetro de la columna para ser usados, así como la capacidad dinámica y la tasa de flujo dependen de varios parámetros tales como el volumen del fluido para ser tratado, la concentración de la proteína en el fluido para estar sujeta al proceso de la invención, etc. La determinación de estos parámetros para cada paso se encuentra dentro de las habilidades promedio de la persona experta en la técnica. En una modalidad preferida del proceso presente de purificación, se llevan a cabo uno o más pasos de ultra-filtración. La ultra- filtración es útil para la eliminación de pequeñas moléculas orgánicas y sales en los eluatos que resulta de los pasos previos cromatograficos , para equilibrar la proteína que contiene Fe en el amortiguador a granel, o para concentrar la proteína que contiene Fe a la concentración deseada. Tal ultra-filtración, por ejemplo, puede ser realizada en membranas de ultra- filtración, con los tamaño de poro que permitan la eliminación de los componentes que tienen pesos moleculares debajo de 5, 10, 15, 20, 25, 30 o más kDa. Preferiblemente, la ultra- filtración es llevada a cabo entre los pasos (b) y (c) , y/o después del paso (d) . Más preferiblemente, se llevan a cabo dos pasos de ultra-filtración, uno entre los pasos (b) y (c) y uno después del paso (D) . Si la proteína purificada según el proceso de la invención es pensada para la administración a humanos, es ventajoso incluir uno o más pasos de eliminación del virus en el proceso. Preferiblemente, un paso de filtración de eliminación de virus se lleva a cabo después del paso (d) . Más Preferiblemente, el paso de filtración de eliminación de virus es un paso de nano- filtración donde el filtro tiene un tamaño nominal de poro de 20nm. El método de la presente invención, y en particular los pasos particulares (a) , (c) , (d) en combinación con la nano- filtración eliminan eficientemente la carga del virus a un LRV combinado (el valor de la reducción log) hasta aproximadamente 15 a 25. Para facilitar almacenamiento o transporte, por ejemplo el material puede ser congelado y puede ser descongelado antes y/o después de cualquier paso de purificación de la invención. De acuerdo con la presente invención, la proteína que contiene Fe recombinante puede ser producida en sistemas de expresión eucariótica, tal como la levadura, la célula de insecto, o de los mamíferos, teniendo como resultado las proteínas que contiene Fe glicosiladas . De acuerdo con la presente invención, es más preferido que se exprese la proteína que contiene Fe en las líneas de células mamíferas tales como las líneas de células de animal, o en las líneas de células humanas. Las células de hámster de ovario del hámster chino (CHO) o las líneas de célula de mieloma de ratón NSO son ejemplos de las líneas de célula que son especialmente convenientes para la expresión de la proteína que contiene Fe para ser purificado. La proteína que contiene Fe también puede ser producida preferiblemente en líneas humanas de célula, tales como, por ejemplo la línea humana de célula fibrosarcoma HT1080, la línea PERC6 célula retinoblastoma humana, o la línea de célula de riñon embriónica 293 humana, o una línea de célula permanente de amniocito descrita por ejemplo en EP 1 230 354 . Si la proteína que contiene Fe para ser purificada es expresada por las células mamíferas que la secretan, el material que empieza el proceso de purificación de la invención es el superpaciente del cultivo de célula, también llamada cosecha o cosecha cruda. Si las células son cultivadas en un medio que contiene suero animal, el supernaciente del cultivo de célula contiene también las proteínas del suero como las impurezas. Preferiblemente, la proteína que contiene Fe que expresa y secreta las células se cultiva bajo condiciones libres de suero. La proteína que contiene Fv puede ser producida también en un medio químicamente definido. En este caso, el material de inicio del proceso de purificación de la invención es el supernaciente del cultivo de célula libre de suero que contiene principalmente las proteínas de la célula huésped como las impurezas. Si los factores del crecimiento se añaden al medio del caldo de cultivo de la célula, tal como la insulina, por ejemplo, estas proteínas serán eliminadas durante el proceso de purificación también. Para crear la proteína soluble y secretada que contiene Fe, que se libera en el superpaciente del cultivo de célula, se usa el péptido de señal natural de la fracción terapéutica de la proteína que contiene Fe o preferiblemente un péptido de señal heterólogo, es decir un péptido de señal derivado de otra proteína secretada que es eficiente en el sistema particular de expresión usado, tal como por ejemplo el péptido bovino o humano de señal de Hormona del crecimiento, o el péptido de señal de inmunoglobulina . Como se mencionara anteriormente, una proteína preferida que contiene Fe para ser purificada de acuerdo con la presente invención es una proteína de fusión que tiene una fracción terapéutica derivada de TACI humano (SEC ID N° : 2), y en particular un fragmento derivado de su dominio extracelular (aminoácidos 1 a 165 de la SEC ID N° : 2). Un fragmento preferido comprende los aminoácidos 30 a 110 de la SEC ID N° : 2. En los siguientes, las fracciones terapéuticas derivadas del dominio extracelular de TACI se denominarán "TACI solubles "o "sTACI". Una Fracción de Fe preferida comprende la SEC ID N° : 3, teniendo como resultado una proteína de fusión Fe según la SEC ID N° : 4, llamada TACI-Fc. El término TACI-Fc, como se utiliza en la presente, también abarca las muteinas de TACI-Fc. El término "muteinas", como se usa en la presente, se refiere a los análogos de sTACI o TACI-Fc, en los cuales uno o más residuos de aminoácido de sTACI o TACI-Fc es reemplazado por residuos de aminoácidos diferentes, o se elimina, o uno o más residuos de aminoácido se añaden a la secuencia original de sTACI o TACI-Fc sin cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes como comparado con sTACI o TACI-Fc original. Estas luteínas se preparan por la síntesis conocida y/o por técnicas de mutagénesis de sitio dirigido, o por cualquier otra técnica conocida conveniente por lo tanto. Las muteínas de acuerdo con la presente invención incluyen las proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como el ADN o el R A, que hibridiza al complemento de un ADN o el RNA, que codifica un sTACI o TACI-Fc según cualquiera de la SEC ID N° : 2 o 4 bajo condiciones rigurosas. Un ejemplo para una secuencia de ADN que codifica un TACI-Fc es la SEC ID N° : 7. El término las "condiciones rigurosas" se refieren a las condiciones de hibridación y de lavado subsiguientes, que aquellas personas con habilidad ordinaria en el arte convencionalmente refieren como "rigurosas" . Vea Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6,3 y 6,4 (1987, 1992) . Sin limitación, los ejemplos de las condiciones rigurosas incluyen las condiciones de lavado de 12-20°C debajo de la Tm calculada del híbrido bajo el estudio en, por ejemplo, 2 x SSC y 0,5% de SDS durante 5 minutos, 2 x SSC y 0,1% SDS durante 15 minutos; 0,1 x SSC y 0,5% SDS a 37 °C durante 30-60 minutos y entonces, un 0,1 x SSC y 0,5% SDS a 68 °C durante 30-60 minutos. Aquellas personas de habilidad ordinaria en esta arte entienden que esas condiciones de rigor dependen también de la longitud de las secuencias de ADN, las sondas oligonucleótidas (tal como las bases 10-40) o las sondas de oligonucleotido mezcladas. Si las sondas mezcladas se usan, es preferible usar cloruro tetrametil amónico (TMAC) en vez de SSC. Vea Ausubel, supra. En otra modalidad, por lo tanto, cualquiera de tales muteínas tiene por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, o por lo menos 95% de identidad o de homología . La identidad refleja una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinucleótido, determinado comparando las secuencias. En general, la identidad se refiere a un nucleótido exacto al nucleótido o un aminoácido al correspondiente aminoácido de dos polinucleótidos o dos secuencias de polipéptido, respectivamente, sobre la longitud de las secuencias a ser comparadas . Para las secuencias donde no hay una correspondencia exacta, un "porcentaje de identidad" puede determinarse. En general, las dos secuencias para ser comparadas son alineadas para dar una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir los "espacios" en una o en ambas secuencias, para mejorar el grado de la alineación. Un% de identidad puede ser determinado sobre la longitud entera de cada una de las secuencias a ser comparadas (la así llamada alineación global) , lo cual es especialmente conveniente para las secuencias de la misma longitud o muy semejante, o sobre longitudes más cortas y definidas (la así llamada alineación local) , que es más adecuada para las secuencias de largo no igual . Los métodos para comparar la identidad y la homología de dos o más secuencias son bien conocidas en la técnica. Así por ejemplo, los programas disponibles en el Paquete del Análisis de la Secuencia de Wisconsin, versión 9,1 (Devereux J y colaboradores, 1984) , por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, pueden ser usados para determinar el% de identidad entre dos polinucleótidos y el% de identidad y el% de homología entre dos secuencias del polipéptido. BESTFIT usa el algoritmo de "homología local" de Smith y Waterman (1981) y encuentra la única mejor región de similitud entre dos secuencias. Otros programas para determinar la identidad y/o la similitud entre las secuencias son conocidos también en la técnica, por ejemplo la familia de BLAST de los programas (Altschul S F y colaboradores, 1990, de Altschul F S y colaboradores, 1997, accesible por la página de bienvenida del NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R, 1990) . Cualquiera de tales muteínas tiene, preferiblemente, una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicada de sTACI o TACI-Fc, tal como para tener una actividad de unión ligando substancialmente semejante como una proteína de la SEQ No: 2 o 4. Por ejemplo una actividad de TACI es su capacidad de unión a Blys o APRIL (Hymowitz y colaboradores, 2006) . Considerando que la muteína tiene una substancial actividad de unión APRIL o Blys, pueden considerarse que tiene una actividad substancialmente semejante a TACI. Por lo tanto, puede determinarse fácilmente, por una persona hábil en la técnica, si cualquier muteína dada tiene substancialmente la misma actividad que una proteína de la SEQ ID No. : 2 o 4 por medio de una experimentación rutinaria. Los cambios preferidos para las muteínas de acuerdo con la presente invención son lo que se conoce como sustituciones "conservadoras". Las sustituciones conservadoras de aminoácidos de sTACI o TACI-Fe, pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo que tiene propiedades físico-químicas suficientemente semejantes de que la sustitución entre miembros del grupo preservará la función biológica de la molécula (Grantham, 1974) . Es claro que las inserciones y las supresiones de aminoácidos pueden ser hechas también en las secuencias arriba definidas sin alterar su función, especialmente si las inserciones o las supresiones sólo implican unos pocos aminoácidos, por ejemplo, abajo de treinta, abajo de veinte, o preferiblemente abajo de diez, y no quitan o desplazan aminoácidos que son críticos a un conformación funcional, por ejemplo, residuos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas por tales supresiones y/o inserciones están dentro del alcance de la presente invención.

Preferiblemente, los grupos conservadores de aminoácido son aquellos definidos en la Tabla 2. Más preferiblemente, los grupos sinónimos de aminoácidos son aquellos definidos en la Tabla 3; y aún más preferiblemente los grupos sinónimos de aminoácidos son aquellos definidos en la Tabla 4. TABLA 2 Los Grupos preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu lie, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly lie Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie Phe Trp, Met, Tyr, lie, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys , Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys , Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Met Phe, lie, Val, Trp Trp TABLA 3 Los Grupos más Preferidos de Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, lie, Phe, Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, lie Gly Gly lie lie, Met, Phe, Phe Met, Tyr, lie, Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gln, Arg Gln Glu, Gln, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gln Met Met, Phe, lie, Val, Leu Trp Trp TABLA 4 Los Grupos más Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg Arg Leu Leu, lie, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly lie lie, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, lie, Leu Trp Met Un derivado funcional puede ser preparado de una proteína purificada de la Fusión-Fc de acuerdo con la presente invención. Los "derivados funcionales" usados como en el presente documento cubren derivados de la proteína que contienen Fe para ser purificados de acuerdo con la presente invención, o que pueden ser preparados de los grupos funcionales que ocurren como cadenas laterales en los residuos o en los grupos N- o C-terminal, por medios conocidos en la técnica, y son incluidos en la invención mientras que ellos permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir ellos no destruyen la actividad de la proteína la que es substancialmente semejante a la actividad de la proteína que contiene Fe inmodificada tal como fue definido más arriba, y no confiere propiedades tóxicas a las composiciones que lo contienen. Los derivados funcionales de una proteína que contiene Fe, por ejemplo, pueden ser conjugados a polímeros para mejorar las propiedades de la proteína, tal como la estabilidad, la vida media, bio-disponibilidad, la tolerancia por el cuerpo humano, o por inmuno-genecidad. Para lograr esta meta, la proteína que contiene Fe puede ser ligada por ejemplo al polietilenglicol (PEG) . La PEGilación puede ser llevada a cabo por métodos conocidos, descritos, por ejemplo, en la patente WO 92/13095. Los derivados funcionales pueden también, por ejemplo, incluir ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por la reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, los derivados de N-acilo de grupos libres de amino de los residuos de aminoácido formados con fracciones de acilo (por ejemplo, grupos alcanoil o grupos aroilo carbocíclico) o los derivados O-acilo de grupos libres de hidroxilo (por ejemplo aquellos residuos de serilo o treonilo) formado con fracciones de acilo. En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una proteína purificada por el proceso de purificación de acuerdo con la invención. En lo siguiente, tal proteína es llamada también "proteína purificada que contiene Fe" . Tal proteína purificada que contiene Fe preferiblemente es una proteína altamente purificada conteniendo Fe. La proteína sumamente purificada de la Fusión-Fc es determinada, por ejemplo, por la presencia de una sola banda en un gel manchado de plata y gel de PAGE SDS no-reducido después de cargar la proteína con una cantidad de 2 meg por senda. La proteína purificada de la Fusión-Fc puede ser definida también como eluyendo como un solo pico en HPLC. La preparación de la proteína que contiene Fe obtenida del proceso de purificación de la invención puede contener menos del 20 por ciento de impurezas, preferiblemente menos del 10 por ciento, 5 por ciento, 3 por ciento, 2 por ciento o 1 por ciento de impurezas, o puede ser purificado a homogeneidad, es decir estar libre de cualquier contaminante proteinoso perceptible, tal como se determinan por ejemplo, por manchado de plata SDS-PAGE o HPLC, como fue explicado más arriba . La proteína purificada que contiene Fe puede ser pensada para uso terapéutico, en particular para la administración a pacientes humanos. Si la proteína purificada que contiene Fe es administrada a pacientes, es administrado, preferiblemente, en forma sistémica, y preferiblemente subcutáneamente o intramuscularmente , o tópicamente, es decir localmente . La administración rectal o intratecal puede ser también conveniente, dependiendo del uso médico específico de la proteína purificada que contiene Fe. Para este fin, en una modalidad preferida de la presente invención, la proteína purificada que contiene Fe puede ser formulada en una composición farmacéutica, es decir junto con un portador farmacéuticamente aceptable, excipientes o lo similar . La definición "farmacéuticamente aceptable" significa que abarca cualquier portador, que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico para el huésped al que es administrado. Por ejemplo, para la administración parenteral, la(s) proteína (s) activa (s) puede (n) ser formulada (s) en una forma de dosis unitaria para inyectar en vehículos tales como salina, solución de dextrosa, albúmina de suero y solución de Ringer.

Los ingredientes activos de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención pueden ser administrados a un individuo en una variedad de maneras . Las rutas de la administración incluyen las rutas intradérmica, la transdérmica (por ejemplo, en formulaciones de liberación lenta) , intramuscular, intraperitoneal , intravenosa, subcutánea, oral, intracraneal, epidural, tópico, rectal, e intranasal. Cualquier otra ruta terapéuticamente eficaz de la administración puede ser usada, por ejemplo, la absorción a través de los tejidos epiteliales o endoteliales o por la terapia génica en donde una molécula de ADN que codifica al agente activo es administrada al paciente (por ejemplo, vía un vector) , que causa que el agente activo sea expresado y secretado in vivo. Además, la(s) proteína (s) de acuerdo con la invención puede (n) ser administrada (s) junto con otros componentes de agentes biológicamente activos, tales como surfactantes farmacéuticamente aceptables, excipientes, portadores, diluyentes y vehículos. Para la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular) , la proteína activa (s) puede (n) ser formulada (s) como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado conjuntamente con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable (por ejemplo. agua, salina, solución de dextrosa) y los aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o la estabilidad química (por ejemplo, conservantes y amortiguadores) . La formulación es esterilizada mediante técnicas utilizadas comúnmente. Las cantidades terapéuticamente efectivas de la(s) proteína (s) activa (s) será una función de muchas variables, inclusive el tipo de la proteína que contiene Fe, la afinidad de la proteína que contiene Fe para su ligando, la ruta de administración, la condición clínica del paciente. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es aquella que cuando es administrada, la proteína que contiene Fe tiene como resultado la inhibición de su ligando de la fracción terapéutica de la proteína de Fusión-Fe, como fue explicado más arriba y refiriéndonos especialmente a la Tabla 5 de más arriba. La dosis administrada, como dosis únicas o múltiples, a un individuo, variarán dependiendo de una variedad de factores, inclusive de las propiedades farmacocinéticas de la proteína de Fusión-Fc, la ruta de administración, las condiciones de paciente y sus características (el sexo, la edad, el peso, la salud, la estatura) , la extensión de los síntomas, los tratamientos concurrentes, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulación de las gamas establecidas de dosis están bien dentro de la capacidad de aquellas personas hábiles en la técnica, así como también los métodos in vitro e in vivo para determinar la inhibición del ligando natural de la fracción terapéutica en un individuo . La proteína purificada que contiene Fe puede ser usada en una cantidad de 0,001 a 100 mg/kg o 0,01 a 10 mg/kg del peso corporal, o de 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal o de 1 a 3 mg/kg de peso corporal o de 2 mg/kg de peso corporal . En modalidades aún más preferidas, la proteína purificada que contiene Fe es administrada a diario o cada dos días o tres veces a la semana o una vez a la semana. Las dosis diarias son, generalmente, dadas como dosis divididas o en forma de liberación prolongada, efectiva para obtener los resultados deseados. Las segundas o subsiguientes administraciones pueden ser realizadas en una dosis que sea la misma, menor que o mayor que la inicial o la dosis previa administrada al individuo. Una segunda o subsiguiente administración puede ser administrada durante o antes del comienzo de la enfermedad. La presente invención se relaciona además con el uso de la cromatografía del intercambio de catión para la reducción de la concentración de las fracciones de Fe libres en una composición que comprende una proteína que contiene Fe. En una modalidad preferida, la concentración de Fe libre es reducida a menos de 20 por ciento o a menos del 15 por ciento o a menos del 10 por ciento o a menos del 5 por ciento o a menos del 2 por ciento o a menos del 1 por ciento o a menos del 0,8 por ciento o a menos del 0,5 por ciento o a menos del 0,2 por ciento o a menos del 0,1 por ciento de la concentración total de la proteína de dicha composición. Ahora, habiendo descrito completamente esta invención, será apreciado por aquellas personas hábiles en la técnica que la misma puede ser realizada dentro de una gran variedad de parámetros equivalentes, concentraciones y condiciones sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención y sin una experimentación indebida. Mientras que esta invención ha sido descrita con respecto a modalidades específicas de la misma, será entendido que es capaz de modificaciones adicionales. Esta solicitud es pensada como para cubrir cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención, siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo tales salidas de la revelación presente como pudiesen surgir dentro de la práctica conocida o acostumbrada dentro de la técnica a la cual la invención pertenece y puede ser aplicada a las características esenciales aquí en el presente anteriormente establecidas como sigue dentro del alcance de las reivindicaciones del apéndice. Todas las referencias citadas en el presente documento, incluyendo los artículos de revistas o resúmenes, solicitudes de patentes de los Estados Unidos de Norte América o extranjeras publicadas o no publicadas, las patentes emitidas de los Estados Unidos de Norte América o extranjeras o cualesquiera otras referencias, están incorporados enteramente para referencia en el presente documento, inclusive todos los datos, las tablas, las figuras y el texto presentados en las referencias citadas. Adicionalmente , el contenido entero de las referencias citadas dentro de las referencias citadas en el presente documento también está incorporado enteramente para referencia. La referencia a pasos de método conocidos, los pasos de métodos convencionales, los métodos conocidos o los métodos convencionales no son de ninguna manera una admisión que algún aspecto, descripción o modalidad de la presente invención sea revelada, enseñada o sugerida en la técnica pertinente. La descripción que antecede de las modalidades específicas, así, revelarán completamente la naturaleza general de la invención, que otros pueden, aplicando los conocimientos dentro de la habilidad de la técnica (incluyendo el contenido de las referencias citadas en el presente documento) , modificar fácilmente y/o adaptar para varias aplicaciones tales modalidades específicas, sin una experimentación indebida, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones son pensadas como para estar dentro del significado de una gama de equivalentes de las modalidades reveladas, basado en la enseñanza y guía presentadas en el presente documento. Debe ser entendido que la fraseología o la terminología en el presente documento son para el propósito de descripción y no de limitación, tanto que la terminología o fraseología de la memoria descriptiva presente sean interpretadas por el artesano hábil a la luz de las enseñanzas y la guía presentadas en el presente documento, en combinación con el conocimiento de una persona de habilidad común en la técnica. EJEMPLOS: PURIFICACION DE TACI-Fc HUMANO RECOMBINANTE DEL SUPERNACIENTE DE LA CELULA CHO LIBRE DE SUERO Glosario usado en todos los Ejemplos BV: Volumen de cama CHO: Ovario de Hámster chino DSP: Proceso corriente descendente EDTA: Acido Tetraacético de etilendiamina ELISA: Ensayo de InmunoSorbente enlace de enzima HAC: Cromatografía de Hidroxiapatita HCP: Proteína de Célula huésped HPLC: Cromatografía Líquida de alto Desempeño id: diámetro interno K: Potasio KD: Kilo Dalton MES: Ácido 2 -Morfolinetanosulfónico Na: Sodio NaAc : Acetato de sodio N/D: No determinado PA-SE-HPLC: Cromatografía Líquida de Alto Desempeño de Exclusión Medida de la proteína A Ppm: Partes por millón RO: Osmosis inversa RT: Temperatura ambiente SDS-PAGE: Electroforesis de Gel de Poliacrilamida dodecil Sulfato de sodio SE-HPLC: Cromatografía Líquida de alto Desempeño de Exclusión de Medida T°C: Temperatura TMAC: Cloruro de tetra-metil Amonio UV: Ultravioleta WFI : Agua Para Inyección WRO: Osmosis de agua Inversa Ejemplo 1: Paso de Captura: Purificación de Afinidad en la Proteína A El material de inicio fue una cosecha clarificada de un clon de la célula CHO que expresa TACI-Fc al cultivarlo bajo condiciones libres de suero y almacenado congelado hasta el uso.

El paso de la captura en una columna MabSelect Xtra™ (GE Healthcare 17-5269-03) fue llevado a cabo de acuerdo con el protocolo siguiente en una columna que tiene una altura de cama de 17 cm. Todas las operaciones fueron realizadas a la temperatura ambiente, excepto la solución de carga, que fue mantenida a una temperatura por debajo de los 15°C. La señal UV a 280 nm fue registrada. Sani tización La columna fue sanitizada con, por lo menos, 3BV de 0,1M de ácido acético + un 20 por ciento de etanol en flujo inverso a 250cm/h. El flujo fue detenido durante 1 hora. Paso de lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 2BV de agua RO en flujo inverso a 250cm/h. Equilibrio La columna fue equilibrada con, por lo menos, 5BV de 25 mM fosfato de sodio + 150 mM de NaCl a un pH7,0 (hasta que los parámetros de conductividad y el pH estén dentro de la gama especificada: pH 7,0 ± 0,1, la conductividad a 18 ± 2 mS/cm) en flujo descendente a 450cm/h. Carga La columna fue cargada con una cosecha clarificada mantenida a una temperatura por debajo de los 15°C a una capacidad de hasta 15 mg total TACI-Fc determinada mediante el ensayo Biacore por mi de resina empacada a una tasa del flujo de 350cm/h. Paso de lavado Lavar la columna con, por lo menos, 2BV de amortiguador de equilibrio a 350cra/h, luego con, por lo menos, 4BV de amortiguador de equilibrio (hasta que la señal de UV regrese a la línea de base) a 450cm/h. Elusión El material fue eluido con diferentes amortiguadores de elusión como se muestra en la Tabla I a una tasa de flujo de 350 cm/h. La fracción de eluato fue recolectada desde el comienzo del aumento de la señal UV a 6,0 ± 0,5BV de elusión. El eluato fue incubado durante 1 hora a temperatura ambiente en un pH por debajo de 4,1 (ajustado mediante la adición de una solución ácido cítrico, si fuese necesario) y entonces el pH fue ajustado a 5,0 ± 0,1 mediante la adición de un 32 por ciento de solución de NaOH. Regeneración La columna fue regenerada con, por lo menos, 3BV de 50 mM de NaOH + 1M de NaCl en flujo inverso a 450cm/h, se detuvo el flujo durante 15 minutos, entonces se reinicia el flujo a 450 cm/h en, por lo menos, 3BV (hasta que la señal de UV vuelva a la línea de base) . Desde este paso, la columna fue operada en el modo flujo inverso. Paso de lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 2BV de agua RO a 450cm/h. Higienización La columna fue santitizada con, por lo menos, 3BV de amortiguador de higienización a 250cm/h, se detuvo el flujo y la columna incubó durante 60 minutos. Pasos del Lavado Final La columna fue lavada con, por lo menos, 1BV de agua RO a 250cm/h, luego con, por lo menos, 3BV de amortiguador de equilibrio a 250cm/h y finalmente con, por lo menos, 2BV de agua RO a 250cm/h. Finalmente, la columna fue almacenada después del enjuague con, por lo menos, 3BV de etanol al 20 por ciento a 250cm/h. Resultados Tabla I : Resultados usando diferentes amortiguadores de elusión Corrida Amortiguador de elusión Rendimien Agregado HCPs # toTACI-Fc (%) (ppm) (%) 1 50mM NaAcpH 3,7 47,7 30,3 5558 2 lOOmM NaAc pH 3,8 55,7 25, 2 n/d 3 200mM NaAc pH 3 , 8 58, 0 28, 2 n/d 4 lOOmM NaAc pH 3 , 7 68 30,0 n/d Corrida Amortiguador de elusión Rendimien Agregado HCPs # toTACI-Fc (%) (ppm) (%) 5 0,2M NaAc+150mM NaCl pH4 75, 1 3,8 n/d 6 lOOmM NaAc pH 3,7 84, 6 22 3491 7 250mM NaAc pH 3,7 82,8 18, 7 3318 8 lOOm Na citrato pH 3,7 79,2 8,8 4710 9 250iTiM Na citrato pH 3,7 71,9 23 2347 10 lOOmM Na citrato pH 3,75 82, 8 8,5 1576 11 lOOmM Na citrato pH 3,75 66, 6 9,0 664 12 ???p? NaAc pH 3,85 83, 3 15, 0 n/d 13 lOOmM Na citrato pH 3,75 81,0 9,1 3490 14 lOOmM Na citrato pH 3,65 75,1 14, 6 2580 14 ???p?? Na citrato pH 3,75 44 , 7 18,4 3783 16 lOOmM Na citrato pH 3,75 47, 1 15, 8 3217 17 ???p? Na citrato pH 3,75 50, 7 9,4 2349 18 ???p?? Na citrato pH 3,75 58, 0 10, 4 2550 19 lOOmM Na citrato pH 3,75 67, 1 28, 7 2372 20 ???p? Na citrato pH 3,75 65, 6 17, 5 2353 21 lOOmM Na citrato pH 3,75 75, 6 19, 4 1807 22 lOOmM Na citrato pH 3,75 57, 1 20,7 2465 23 lOOmM Na citrato pH 3,75 51, 9 18, 4 2030 24 ???p? Na citrato pH 3 , 75 58 11, 5 1746 Corrida Amortiguador de elusión Rendimien Agregado HCPs # toTACI-Fc (%) (ppm) (%) 25 lOOmM Na citrato pH 3,75 41,8 22, 9 3029 26 lOOmM Na citrato pH 3,9 39,4 6,0 2424 27 lOOmM Na citrato pH 3 , 9 31,0 8,8 2936 28 lOOmM Na Ac pH4,l 28, 3 25,0 3311 29 lOOmM Na citrato pH 3,9 46,4 9,1 n/d 30 lOOmM NaAc pH4,l 42,8 13, 4 n/d 31 lOOmM Na citrato pH 3,75 57, 5 26, 5 n/d 32 lOOmM NaAc pH4,2 38,1 10, 1 n/d 33 lOOmM Na citrato pH 3,9 43, 3 8,3 2011 34 lOOmM Na citrato pH 3,9 63, 6 6,6 1749 35 lOOmM Na citrato pH 3,9 65, 7 7,3 1689 36 lOOmM Na citrato pH 3,9 62, 7 7,4 1609 37 lOOmM Na citrato pH 3,9 61,6 7,4 1479 38 lOOmM Na citrato pH 3 , 9 60,6 7,4 1623 39 lOOmM Na citrato pH 3,9 64, 6 8,0 1497 Conclusiones El TACI-Fc 5 en la cosecha clarificada fue capturado directamente en una columna MabSelect Xtra a una capacidad dinámica de 15g total de TACI-Fc 5 por L de resina empacada a una tasa del flujo de 350 cm/h. Las condiciones de elusión, especialmente el pH, fue optimizado para llevar al máximo la recuperación del producto al proporcionar una reducción significativa en niveles agregados. Un amortiguador de elusión de pH 0,1 M de citrato de sodio pH 3,9 fueron escogidos dando aproximadamente de 5-10 por ciento de niveles agregados comenzando desde aproximadamente el 25-40 por ciento en la cosecha clarificada y sin ninguna turbulencia observada. Los niveles de HCP fueron, típicamente, 1500-2000ppm. Los niveles de HCP fueron medidos mediante ELISA usando un anticuerpo policlonal. El anticuerpo fue generado contra las proteínas de la célula huésped derivada del supernaciente del cultivo de células clarificado y concentrado de las células CHO no-transíectadas . Ejemplo 2: Cromatografía de Intercambio de Catión El eluato del paso de captura en la Proteína A, dializado en el amortiguador cargado convenientemente, fue usado como material de inicio para la cromatografía del intercambio de catión. Un Fractogel EMD S03" columna (Merck 1.16882.0010) que tiene una altura de cama de 10 cm fue usado en este paso. Una columna Fractogel S03" con una altura de cama de 15 cm también puede ser usada. En el último caso, la capacidad dinámica y la tasa de flujo puede necesitar adaptación, la cual está bien dentro del conocimiento rutinario de una persona hábil en la técnica. Todas las operaciones fueron realizadas a la temperatura ambiente y la tasa del flujo fue mantenida constante a 150 cm/h. La señal del UV a 280 nm fue registrada todo el tiempo.

Paso de lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 1BV de RO (osmosis inversa de agua) . Higienización Entonces, la columna fue saneada con por lo menos 3BV de NaOH 0,5 + 1,5M de NaCl en el modo de flujo ascendente. Enj uague La columna fue enjuagada con, por lo menos, 4BV de WRO en el modo de flujo descendente. Equilibrio La columna fue equilibrada con, por lo menos, 4BV de 100 mM de citrato de sodio pH5,0 (o hasta que sea alcanzado el objetivo de conductividad de 12+1 mS/cm y de pH 5,0 ± 0,1) . Carga La columna fue cargada con material post-captura a pH 5,0 (pH en 5,0±0,1, conductividad en 12±1 mS/cm) y en una capacidad de no más de 50 mg TACI-Fc, como fue determinado por el ensayo SE-HPLC por mi de resina empacada. Paso de lavado La columna entonces fue lavada con, por lo menos, 5BV de 100 mM de fosfato de sodio pH6 , 5. Elusión La columna fue eluida con diferentes amortiguadores y bajo condiciones diferentes como se informa en las tablas II - IV de más abajo. Regeneración e higienización La columna fue regenerada y fue saneada con 4BV de NaOH 0,5M + 1,5 de NaCl en el modo de flujo ascendente. Entonces, el flujo fue detenido durante 30 minutos. La regeneración y la sanitisación pueden ser llevados también a cabo usando 4 BV de NaOH 0,5M + 1,5M de NaCl en el modo de flujo ascendente, seguido por una pausa de 30 minutos. Enjuague La columna fue enjuagada con, por lo menos, 4BV de W O.

Almacenar La columna fue almacenada en, por lo menos, 3BV de etanol al 20 por ciento. Resultados Tabla II : Efecto del nivel del pH de elusión y nivel de la conductividad HCP en la carga: 189 ppm PH conductividad Recuperación de HCPs HCP (x) (1 mS/cm) TACI-Fe (ppm) Eliminación 6,5 15, 0 25% 118 1,6 7,3 22, 5 100% 50 3,8 8,0 15, 0 95% 34 5,5 7,3 22, 5 100% 56 3,4 7,3 33 , 0 98% 133 1,4 7,3 22, 5 96% 45 4,2 PH conductividad Recuperación de HCPs HCP (x) (1 mS/cm) TACI-Fe (ppm) Eliminación 7,3 22, 5 97% 53 3,6 7,3 12, 0 54% 79 2,4 6,3 22, 5 83% 47 4,1 8, 0 30,0 96% 108 1,8 8,2 22, 5 97% 46 4,2 6,5 30,0 91% 116 1,6 7,3 22, 5 93% 48 3,9 7,3 22, 5 95% 40 4,8 La tabla III muestra la recuperación de TACI-Fc y la remoción del HCP cuando se carga a una capacidad de 10 y 32 mg de TACI-Fc por Mi de resina y se eluye en un amortiguador de fosfato a una conductividad de entre 12 a 33 mS/cm. La recolección del pico fue hecha desde el principio del aumento UV por 10 + 0,5 BV. Tabla III: El efecto del pH de elusión óptimo y de la conductividad al cargar en niveles de HCP de capacidad de carga: 201 ppm Capacidad pH conductivida Recuperació HCPs Remoción de carga d (mS/cm) n de TACI - (ppm) de HCP (mg/ml) Fe (x) 10 8,0 15, 0 91% 67 3 , 0 20,7 93% 61 3,3 32 8, 0 20,7 88% 54 3,7 La tabla IV muestra el efecto de un paso del lavado con 50 o 100 o 150 mM de fosfato de sodio pH 6,5 en la recuperación de TACI-Fc y la remoción de HCP.

Tabla IV: El efecto de las condiciones del paso de lavado en el nivel de HCP en el desempeño de la columna en la carga: 190ppm y niveles agregados: 2,0 por ciento La Fig. 1 muestra un gel no-reducido de SDS-PAGE manchado en plata, de las muestras derivadas de los experimentos usando las condiciones de los tres pasos del lavado mostrado en la Tabla IV en la remoción del Fe libre. La Fig. 2 muestra los cromatogramas superpuestos de los experimentos del paso del lavado con fosfato de sodio en concentraciones diferentes. El paso del lavado fue optimizado a un pH 6,5 con concentraciones crecientes de fosfato de sodio (50 a 150mM) .

Como puede ser visto en la Fig. 1, una concentración de amortiguador de lavado de 150 mM (lavado 3, senda 6) dio como resultado pérdidas de TACI-Fc. Una concentración de amortiguador de lavado de 50 mM (lavado 1, senda 8) dio como resultado un pico de TACI-Fc puro, sin embargo, el eluato contenía trazas de Fe libre. Un paso del lavado con 100 mM de de fosfato de sodio a un pH 6,5 tuvieron como resultado un 98 por ciento de recuperación en el pico principal de elusión y sólo un 2 por ciento de pérdidas en el lavado (Fig. 2) . La remoción de HCP fue de 3,2 dobleces. El análisis de fracciones de lavado y eluato mediante SDS-PAGE muestra que el paso de lavado contenía Fe Libre con algún TACI-Fc intacto en concentraciones de amortiguador de 100 mM o más altas (Fig. 1, sendas 4 y 6) . Una concentración de 100 mM o más es necesario para quitar completamente el Fe Libre de la fracción de eluato (Fig. 1, sendas 5 y 7) . Conclusiones Un paso de intercambio de catión fue desarrollado como un segundo paso de purificación, después del paso de captura. El eluato de la captura estuvo en un pH bajo (5,0) y a baja conductividad y podría ser cargado directamente en el intercambiador de catión. Una resina Fractogel EMD S03- fue escogida con una capacidad de carga de 50 mg/ml . El Fe libre del producto de la degradación no bio-activa podría ser quitado eficientemente en un paso de lavado con 0 , 1M de fosfato de sodio a un pH 6,5. Las condiciones de elusión fueron optimizadas para mejor remoción de HCPs y para alta recuperación de TACI-Fc (179 mM de fosfato de sodio a un pH de 8,0, una conductividad 20,7 mS/cm) . Alternativamente, la elusión puede ser llevada a cabo en 10 BV de 20 mM de fosfato de sodio y 180 mM de NaCl a un pH 8,0 desde el comienzo del enjuague en una absorbancia a 280 nm. Ejemplo 3: Cromatografía de Intercambio de anión El material de inicio usado para este paso de purificación fue el eluato del paso de intercambio de catión en Fractogel S03" (Ver el Ejemplo 2) , dializado o diluido en un amortiguador cargado convenientemente. Este paso de cromatografía de intercambio de aniones fue llevado a cabo en una columna SOURCE 30Q (GE Healthcare 17-1275-01) con una altura de cama de 10 cm. Una columna SOURCE 30Q con una altura de cama de 15 cm puede también ser usada en este paso. En el último caso, la capacidad dinámica y la tasa del flujo pueden necesitar una adaptación, que está bien dentro del conocimiento rutinario de una persona hábil en la técnica. Todas las operaciones fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente y con la señal UV a 280 nm fueron registradas. Los pasos fueron llevados a cabo a una tasa de flujo de tanto 150 como 200cm/h. Enj uague Primero, la columna fue enjuagada con, por lo menos, 1 BV de agua RO a una tasa de flujo de 150cm/h. Higienización Entonces, la columna fue saneada con por lo menos 3 BV 0,5M de NaOH + 1,5M de NaCl . Paso del lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 3 BV, preferiblemente de 4 a 10 BV, 0,5M de fosfato de Na a un pH de 7,5 a una tasa de flujo de 200cm/h. Equilibrio La columna fue equilibrada con, por lo menos, 5 BV de 10, 15, 20, 25, o 30 mM de fosfato de sodio a un pH de 7,5. Opcionalmente , la columna puede ser pre-equilibrada con 3 BV de 0,5M de fosfato de sodio a un pH de 7,5. La carga, el lavado y la recolección concomitante de TACI-Fc por medio del flujo continuo La columna fue cargada con el material del intercambio post-catión diluido para obtener una concentración de fosfato de 10 a 30 mM, con un pH 7,5, en una capacidad de no más de 50 mg de TACI-Fc como fue determinado mediante el ensayo SE-HPLC por mi de resina empacada, reuniendo el flujo desde el inicio del aumento del UV hasta el fin del paso del lavado, que es llevado a cabo en 4±0,5 BV de amortiguador de equilibrio. Regenera ción/higienización La columna fue regenerada y fue saneada con por lo menos 3 BV de 0 , 5M de NaOH + 1,5M de NaCl en el modo del flujo inverso (hasta que la señal de UV regrese a la línea de base) a una tasa del flujo de 150cm/h. A fines de la regeneración, la bomba es detenida durante 30 minutos. Paso de lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 3, BV de agua RO a una tasa de flujo de 200cm/h. Almacenar La columna es almacenada en, por lo menos, 3 BV de etanol al 20 por ciento (V/V) a una tasa del flujo de 150cm/h. Resultados La Tabla V siguiente resume los resultados obtenidos con los procesos de purificación descriptos más arriba.

Tabla V: Efecto de la carga de la concentración de fosfato Carga Conc. Conc. Capacidad Recuperación Agregados HCPs PH de de de carga de TACI-Fc (ppm) fosfato TACI-Fc (mg/ml) cargado Cargado (nM) (mg/L) 7,5 30 773 39 94% 10, 4% 82, 8 7,5 25 639 39 90% 6, 9% 50,4 7,5 20 651 49 90% 5,6% 43, 9 7,5 15 437 46 88% 3,4% 45,0 7,5 10 283 N/D 82% 2,8% 26,3 Conclusiones El paso del intercambio de aniones en una columna SOURCE 30Q en el modo de flujo continuo fue optimizado para llevar al máximo la remoción de HCPs y agregados. Cargando el eluato de intercambio de cationes tanto diluido como diafiltrado en 20 mM de amortiguador de fosfato de sodio a un pH de 7,5 dio el mejor término medio entre la recuperación del producto (90%) y la reducción de HCPs (desde aproximadamente 2000ppm a 44ppm) y los agregados (desde aproximadamente un 25% a un 5,6%) . Fue usada una capacidad dinámica de 50 mg de TACI-Fc por mi de resina empacada a una tasa de flujo de 150-200cm/h.

Ejemplo 4: Cromatografía de Hidroxiapatita El material de inicio usado para este paso de purificación fue por flujo continuo de cromatografía de intercambio de aniones (ver el Ejemplo 3) . Se utilizó una columna de 40 µp? (Biorad 157-0040) de Tipo 1 de Hidroxiapatita de Cerámica CHT, con una altura de cama de 10 era. Todas las operaciones fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente. La tasa de flujo fue mantenida constante en 175 cm/h y fue registrada la señal UV en 280 nm. Todas las soluciones fueron filtradas estériles y el equipo se sanitizó con hidróxido de sodio antes del uso. La columna fue almacenada en una solución de 0,5M de NaOH cuando no estaba en uso.

Pasos del lavado inicial (Enjuague y pre-equilibrio) La columna fue lavada con, por lo menos, 1 BV de 20 mM de amortiguador de fosfato de sodio a un pH de 7 , 5 , y luego con, por lo menos, 3 BV de amortiguador de 0,5M de fosfato de sodio a un pH de 7,5 para bajar el pH. Equilibrio La columna fue equilibrada con, por lo menos, 5 BV de 20 mM de amortiguador de fosfato de sodio a un pH de 7 , 5 (o hasta que el objetivo de conductividad de 3,0+0,3 mS/cm y el pH 7,5 ± 0,1 fueran alcanzados). Carga La columna fue cargada con el flujo continuo en SOURCE 30Q con cloruro de calcio añadido a 0,1 mM de la concentración final de una solución de stock en 0 , 5M y el pH fue ajustado a 7,0 por la adición de un 85% de ácido orto-fosfórico, en una capacidad de MT 50 mg de TACI-Fc como se determinó mediante el ensayo por SE-HPLC por mi de resina empacada. Es también posible cargar el flujo continuo SOURCE 30Q sin cloruro de calcio, con el pH ajustado a 7,0, en la columna de hidroxiapatita . El paso del lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 4 BV de 3,4 o 5 mM de fosfato de sodio, 10 mM de MES, 0 , lmM de CaCl2 a un pH de 6,5. En estos pasos, es también posible usar el mismo amortiguador sin cloruro de calcio.

Elusión La columna fue eluida con 5, 4, 3 o 2 mM del fosfato de sodio (ver Tabla VI), 10 mM de MES, 0,1 mM de CaCl2, y amortiguador de KC1 0,6, 0,7, 0,8 o 0,9 M a un pH de 6,5, (ver Tabla VII) desde el principio del aumento de UV para BV diferente (ver Tablas VI y VII) . Es también posible usar el mismo amortiguador sin cloruro de calcio para el elusión. Enj uague La columna fue enjuagada con: - por lo menos IBV de 20 mM de amortiguador de fosfato de sodio pH 7,5; - al menos, 3BV de 0,5M de amortiguador de fosfato de sodio pH 7,5; y - con, por lo menos, IBV de 20 mM del amortiguador fosfato de sodio pH 7,5. Almacenar La columna fue almacenada en, por lo menos, 3BV de 0,5M de NaOH. Resultados La tabla VI muestra el efecto de la concentración de fosfato (de 2 a 5 mM) en el amortiguador de elusión en la remoción de los agregados y la recuperación del producto. Las fracciones del pico de Elusión fueron aunadas y analizadas mediante SE-HPLC para la concentración de TACI-Fc y los niveles de agregado.

Tabla VI : Efecto de la concentración de fosfato en el amortiguador de elusión Conc . de fosfato BV de Rendimiento Agregados (mM) elusion de TACI-Fc 5 12 73% 0,49% 13 74% 0, 52% 14 68% 0, 65% 15 77% 0, 67% 16 77% 0,70% 17 70% 0, 73% 18 76% 0,85% 4 12 68% 0, 34% 13 67% 0,29% 14 66% 0,36% 15 67% 0,39% 16 66% 0,38% 17 66% 0,32% 18 66% 0,40% Conc . de fosfato BV de Rendimiento Agregados (mM) elusion de TACI-Fe 3 12 70% 0,46% 13 76% 0,42% 14 73% 0,51% 15 71% 0, 52% 16 69% 0,55% 17 69% 0,50% 18 70% 0,53% 2 12 65% 0,19% 13 66% 0,00% 14 66% 0, 18% 15 68% 0, 14% 16 66% 0, 17% 17 71% 0, 19% 18 65% 0, 16% La tabla VII muestra el efecto de la concentración de KC1 en el amortiguador de elusión en la remoción de agregados y en la recuperación del producto. Dos concentraciones del fosfato del sodio fueron investigadas: 2 y 3 mM. Las fracciones del pico de Elusión fueron aunadas y fueron analizadas mediante SE-HPLC para la concentración de TACI-Fc y los niveles de agregado.

Tabla VII: Efecto de la concentración de cloruro de potasio en el amortiguador de elusión Conc . de Conc . de BV de Rendimiento agregados fosfato (mM) KC1 (M) elusión de TACI-Fe 3 0,6 10 102% 0,48% 11 109% 0,46% 12 106% 0, 43% 13 105% 0,42% 14 103% 0,43% 3 0,7 10 96% 0,42% 11 97% 0,40% 12 98% 0,41% 13 96% 0,40% 14 96% 0, 43% 3 0,8 10 106% 0, 58% 11 110% 0, 55% 12 112% 0,57% 13 101% 0,59% 14 110% 0, 57% 2 0,6 10 71% 0,29% 11 79% 0,28% 12 80% 0,29% 13 80% 0,29% 14 81% 0,26% Conc . de Conc . de BV de Rendimiento agregados fosfato (p??) KC1 (M) elusión de TACI-Fe 2 0,9 10 64% 0,27% 11 72% 0, 25% 12 73% 0,29% 13 70% 0,33% 14 66% 0, 24% Conclusiones : La cromatografía de Hidroxiapatita proporciona una manera segura y eficiente de reducir los niveles de agregado de TACI-Fc. Empezar desde el material purificado de la cromatografía del intercambio de aniones (ver el Ejemplo 3) con niveles acumulados de aproximadamente de 5-8%, la cromatografía de hidroxiapatita puede reducir estos niveles a por debajo de 0,8% con una recuperación de TACI-Fc del 85-90%. REFERENCIAS 1. Akerstrom and Bjork, J Biol Chem. 1989 Nov 25;264 (33) : 19740-6. 2. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990 3. Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997 4. Armour KL. et al., 1999. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol . 29 (8) : 2613-24 5. Bodmer et al., TIBS 27(1), 19-24 6. Boschetti, E.; Jungbauer, Sep. Sci. & Tech. 2 No . 15, Acad. Press (2000) 53 7. Boschetti et al., Genetic Engineering Vol. 20, No. 13, July, 2000 8. Bossen et al., JBC 281(2), 13964-13971 9. Bram and von Bülow, US 5,969,102 (1999) 10. Bram et al., WO 98/39361 11. Cárter PJ. , 2006. Potent antibody therapeutics by design. Nature Reviews Immunology. Advance online publication 12. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984 13. Feng et al., Bioprocessing 2005, 1-7 14. Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000) 15. Grantham et al., Science, Vol. 185, p . 862-864 (1974) 16. Gross et al., Nature 404(27), 995-999 17. Gross et al., WO 00/40716 18. Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J Biol Chem. 279 (8) : 6213-6 19. Hymowitz et al., JBC 280(8), 7218-7227 20. Idusogie EE . et al., 2000. Mapping of the Clq binding site on rituxan, a chiraeric antibody with a human IgGl Fc. J Immunol. 164 (8) : 4178-84 21. Idusogie EE. et al., 2001. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J Immunol . 166 (4) : 2571-5 22. Kabat, E. A. , Wu, T. T. , Perry, H. M.; Gottesman, K. S., and Foeller, C. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD 23. Kochanek et al., EP 1 230 354 24. Locksley et al . , Cell 104, 487-501, 2001 25. Melchers, Ann. Rheum. Dis 2003, 62, 25-27. 26. Moore et al., Science 285: 260-3 27. oreau et al . , Blood 103(8), 3148-3157 28. Naismith and Sprang, TIBS 23, 74-79, 1998 29. Novak et al . , Blood 103(2), 689-694 30. Parker et al . , WO 02/094852 31. Pearson, Methods Enzymol . 1990;183:63-98 32. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, and G. Belfrage, Nature (London) 258, 598-599 (1975) 33. Porath and B. Olin, Biochemistry 22, 1621-1630 (1983) 34. Puren et al . , Proc Nati Acad Sci U S A. 1999 Mar 2;96 (5) :2256-61 35. Shepard, J. of Chromatography 891:93- 98 (2000) 36. Shields RL. et al., 2001. High resolution mapping of the binding site on human IgGl for Fe gamma RI, Fe gamma RII, Fe gamma RUI, and FcRn and design of IgGl variants with improved binding to the Fe gamma R. J Biol Chem. 276(9) : 6591-604. 37. Smith et al., WO 91/03553 38. Smith et al., WO 94/06476 39. Stanker, J. Immunological ethods 76:157-169 (1985) (10 mM to 30 mM sodium phosphate elusion gradient) 40. Steurer W. et al., 1995. Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes graft tolerance. J Immunol . 155 (3 ) : 1165-74 41. Sun et al., WO 2005/044856 42. Tarditi, J. Chromatography 599:13-20 (1992) 43. Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fe región of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levéis. Nat Biotechnol. 23 (10) : 1283-8 44. Vigers et al., Nature . 1997 Mar 13 ; 386 (6621) : 190-4 45. Vedantham et al., WO 03/59935 46. Vola et al., BioTechniques 14:650-655 (1993) 47. von Bülow and Bram, Science 228 : 138 (1997) 48. Xia et al., J. Exp. Med. 2000, 137-143. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la soliciatent para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. El método para reducir la concentración de las fracciones de Fe libres en un fluido que comprende una proteína que contiene Fe, caracterizado porque comprende someter dicho fluido a la cromatografía de intercambio de catión.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el paso de: cargar dicho fluido en una resina de intercambio de catión en un pH de por lo menos una unidad debajo del punto isoeléctrico (pl) de dicha proteína que contiene Fe.

3. El método de conformidad con reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque comprende el paso de: Lavar la resina de intercambio de catión con un amortiguador que tiene una conductividad de 6 a 10 mS/cm y en un pH de 5,5 a 7,5.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el paso de lavado es llevado a cabo en una conductividad de 8,2 a 8,6 mS/cm.

5. El método de conformidad con las reivindicaciones 3 o 4, caracterizado porque el paso de lavado es llevado a cabo en un pH de 6,0 a 7,0.

6. El método de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque el paso de lavado es llevado a cabo en un amortiguador que comprende 75 a 125 mM de fosfato de sodio.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende el paso de: Eluir la proteína que contiene Fe en un pH que oscila desde 7,0 a 8,5.

8. El método de conformidad con con la reivindicación 7, caracterizado porque el paso de eluir es llevado a cabo en una conductividad de 15 a 22 mS/cm.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cromatografía de intercambio de catión es llevada a cabo en una resina de intercambio de catión fuerte.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la resina de intercambio de catión comprende los grupos S03".

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque la resina comprende una matriz de metacrilato reticulado.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende además un paso de purificación escogido de la cromatografía de afinidad, la cromatografía de intercambio de anión y la cromatografía de hidroxiapatita .

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proteína que contiene Fe comprende una región constante de Inmunoglobulina (Ig) .

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la región constante es una región constante humana .

15. El método de conformidad con la reivindicación 13 o 14, caracterizado porque la inmunoglobulina es un IgGl .

16. El método de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque la región constante comprende un dominio CH2 y un dominio CH3.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proteína que contiene Fe comprende una región variable de inmunoglobulina.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la proteína que contiene Fe es un anticuerpo.

19. El método de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la proteína que contiene Fe es una proteína de Fusión-Fc.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la proteína de fusión-Fe comprende una porción de unión de ligando de un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis de tumor (TNFR) .

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la porción de unión de ligando es escogida de un deminio extracelular de INFRl, TFR2, o un fragmento de unión INF del mismo.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la porción de unión de ligando es escogida de un dominio extracelular de BAFF-R, de BCMA, de TACI, o de un fragmento del mismo que une por lo menos uno de Blys o APRIL.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la proteína de Fusión-Fe comprende un polipéptido escogido de: a. los aminoácidos 34 a 66 de la SEC ID No.: 2; b. los aminoácidos 71 a 104 de la SEC ID No.: 2 ; c. los aminoácidos 34 a 104 de la SEC ID No. : 2; d. los aminoácidos 30 a 110 de la SEC ID No.: 2 ; e . SEC ID No . : 3 ; f . SEC ID No . : 4 ; g. un polipéptido codificado por un polinucleótido caracterizado porque hibridiza al complemento de la SEC ID No. : 5 o 6 o 7 bajo condiciones sumamente rigurosas; y h. una muteína de cualquiera de (c) , (d) , (e) , o (f) teniendo por lo menos 80% o 85% o 90% o 95% de la identidad de la secuencia al polipéptido de (c) , (d) , o (f) , en donde el polipéptido se une a por lo menos uno de Blys o APRIL.

24. El uso de la cromatografía de intercambio de catión para la reducción de la concentración de las fracciones de Fe libres en una composición que comprende una proteína que contiene Fe.

25. El uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde la concentración de Fe libre es reducida a menos de 5% o menos de 2% o menos de 1% o menos de 0,5% o menos de 0,2% o menos de 0,1% de la concentración total de la proteína de dicha composición.