MX2008014665A - Metodo y composiciones para tratar enfermedades hematologicas malignas. - Google Patents

Abstract

Se usa un compuesto de la fórmula (1), y/o sus sales, tautómeros o solvatos para tratar enfermedades hematológicas malignas. En una modalidad, se proporciona una sal de ácido orgánico del compuesto 1 para uso general en el tratamiento de neoplasmas, y en una modalidad adicional la sal es estabilizada con carbohidrato.

Description

MÉTODO Y COM POSICIONES PARA TRATAR ENFERM EDADES HEMATOLÓGICAS MALIGNAS Antecedentes de la invención Se ha demostrado que el ciclopropilPM EDAP N6 ("cpr- PMEDAP") es efectivo en la producción de un efecto antiproliferante e inductor de diferenciación en cultivos de células in vitro contra una variedad de l íneas de células tumorales (Naessens et al . , "Biochem. Pharmacol . 1999 Jul 1 5;58(2):31 1 -23). Sin embargo, cuando se emplearon el cpr-PMEDAP y otros compuestos de PMEDAP sustituidos en N6 en un modelo in vivo de enfermedad hematológica maligna de ratas endogámicas Sprague-Dawley (Valerianova et al . "Anticancer Res. 2001 May-Jun; 21 (3B):2057-64), los autores concluyeron que los "fosfonatos de nucleósido acíclicos sustituidos en la posición 6 del anillo de 2,6-diaminopurina no parecen ser fármacos prometedores para el tratamiento de enfermedades hematológicas malignas" debido a su "alto grado de toxicidad". Se han descrito diversos bis- y mono-ésteres amidato de aminoácido de cpr-PMEDAP (y su uso como agentes antiproliferantes). Ver WO 05/0661 89. WO 02/08241 describe un método para seleccionar profármacos análogos a nucleótido de metoxifosfonato que son útiles para tratar enfermedades hematológicas malignas con toxicidad reducida . Las enfermedades hematológicas malignas se definen ampliamente como trastornos proliferativos de células sangu íneas y/o sus progenitores, en donde estas células proliferan fuera de control. Anatómicamente, las enfermedades hematológicas malignas se dividen en dos grupos principales: linfomas - masas malignas de células linfoides, principalmente pero no exclusivamente en nodulos linfáticos y leucemias - neoplasmas derivados típicamente de células linfoides y mieioides y que afectan principalmente la médula ósea y la sangre periférica. Los linfomas pueden subdividirse en la enfermedad de Hodgkin y en linfoma No Hodgkin (N HL). El último grupo incluye varias entidades definidas que pueden distinguirse cl ínicamente (por ejemplo, linfoma agresivo, linfoma indolente), histológicamente (por ejemplo, linfoma folicular, linfoma de células de manto) o basado en el origen de la célula maligna (por ejemplo, linfocito B , linfocito T). Las leucemias y enfermedades malignas relacionadas incluyen leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfoblástica aguda (ALL) y leucemia linfocítica crónica (CLL). Otras enfermedades hematológicas malignas incluyen las discrasias de células de plasma, incluyendo el mieloma, y los síndromes mielodisplásicos. Aunque la introducción de agentes novedosos tales como el imatinib (Gleevec®), bortezomib (Velcade®) y rituximab ( Rituxin®) ha mejorado el resultado de muchas enfermedades hematológicas malignas, persiste una necesidad médicano cubierta de sustancias terapéuticas novedosas que sean eficaces. Por ejemplo, existe una necesidad médica no cubierta para pacientes que sufren de NHL refractarios al tratamiento o con recaída, dado que la incidencia de N HL ha aumentado sustancialmente en los Estados Unidos durante las últimas cinco décadas. Las leucemias tienen menores cantidades de pacientes. Sin embargo, persiste una necesidad médica no cubierta, por ejemplo, para el tratamiento de la leucemia mielógena aguda (AML) y de la leucemia linfocítica crónica (CLL), como lo ilustran las bajas tasas de supervivencia de 5 años. Existe la necesidad de agentes metabólicos multiespecíficos o ampliamente activos con una ventana terapéutica mejorada por encima de modalidades de tratamiento existentes, que puedan utilizarse ya sea como monoterapia independiente o en combinación con otros terapéuticos. La mayoría de los antimetabolitos interfieren con las enzimas involucradas en la síntesis de ADN , tal como las enzimas relacionadas con la biosíntesis de timidina o de purina, y/o están incorporados en ADN recientemente sintetizado. Los análogos de nucleobase, nucleósido y nucleótido son una clase importante de fármacos citotóxicos efectivos, y son ampliamente utilizados para el tratamiento de leucemias y linfomas. Algunos de estos agentes, 5-fluorouracilo, capecitabina y especialmente gemcitabina , también se utilizan para el tratamiento de tumores sólidos. Tres análogos de adenosina , fludarabina , cladribina y clofarabina se indican para CLL, leucemia de célula pilosa y ALL pediátrico, respectivamente. El análogo de purina, que es la pentostatina (2'-desoxicoformicina), un inhibidor de adenosindesaminasa , tiene actividad cl ínica contra las enfermedades malignas linfoides. La nelarabina es un profármaco del análogo de desoxiguanosina ara-G, que es resistente al catabolismo mediante fosforilasa de nucleósido de purina y ha demostrado actividad contra enfermedades malignas de células T; entre los análogos de pirimidina, ha sido evaluada la citarabina (ara-C); esta está activa en un número de enfermedades hematológicas malignas y es uno de los agentes utilizados en el tratamiento de leucemia mielógena aguda. Sin embargo, las terapias existentes tienen limitaciones en relación a seguridad, eficacia y facilidad de uso, por ejemplo. No es poco común que los tratamientos sean inicialmente exitosos, y que luego las enfermedades hematológicas malignas reaparezcan frecuentemente con el tiempo. Por lo tanto, persiste una necesidad de nucleósidos/nucleótidos novedosos con una ventana terapéutica mejorada y/o utilidad complementaria con respecto a los compuestos existentes en esta clase. Los solicitantes buscaron un compuesto adecuado para el tratamiento de enfermedades hematológicas malignas con PK y carga mejoradas, ventana . terapéutica mejorada y/o menor resistencia a fármacos. En particular se desea identificar un compuesto que se concentre en células sanguíneas, en particular PBMC. Se espera que concentrar el compuesto en estas células objetivo ampl íe la ventana terapéutica reduciendo la exposición de los otros tejidos del paciente al compuesto. La patente WO 05/0661 89 describe un compuesto que tiene la estructura 1 : La presente invención se refiere al compuesto 1 . También se refiere al diastereómero de este, en el cual el aminoácido bis sustituido sobre el átomo de fósforo en un aminoácido L, así como también dicho diastereómero está sustancialmente libre de aminoácido D. Hasta ahora, los compuestos de la formula 1 se han empleado como la base libre. Sin embargo, los solicitantes determinaron que la base libre no es comercialmente óptima para formulación en forma de dosis por ser higroscópica. Adecuadamente , los solicitantes buscaron una forma de compuesto 1 que pudiera facilitar el proceso de fabricación para formas de dosis terapéuticas. Breve descri pción de la invención Los solicitantes descubrieron que la naturaleza del éster de alquilo en el grupo carboxilo del éster de aminoácido de la clase de compuestos de bisamidato cpr-PMEDAP es instrumental para la distribución preferencial del compuesto en PBMC. Inesperadamente se descubrió que administrar el éster de bis(etilo) (es decir, el compuesto 1 ) daba como resultado una distribución altamente preferencial de cpr-PMEDAP en los PBMC en comparación con el plasma. La distribución fue mucho mayor a la obtenida con el por lo demás estrechamente relacionado éster de bis(isopropilo). Además, se determinó que las sales de ácido orgánico del compuesto 1 fueron menos higroscópicas que la base libre, facilitando así la fabricación de productos que contienen al compuesto 1 . Finalmente, se determinó que la estabilidad de estas sales (particularmente en formulaciones parenterales) se mejoró incluyendo un carbohidrato en las formulaciones. De acuerdo con esto, una modalidad de la presente invención es una sal de ácido orgánico del compuesto 1 y/o sus tautómeros y solvatos. Otra modalidad de la presente invención es una composición que incluye (a) una sal de ácido orgánico del compuesto 1 y/o sus tautómeros y solvatos y (b) un carbohidrato, mediante lo cual se mejora la capacidad de almacenamiento de la sal. Otra modalidad de la presente invención es un método para el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad hematológica maligna , que incluye administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto y/o sus sales, tautómeros y solvatos. Otra modalidad de la presente invención es una combinación que incluye el compuesto y/o sus sales, tautómeros y solvatos en un envase adecuado para utilizarse en la administración parenteral del compuesto. Otra modalidad de la presente invención es un método que incluye preparar una sal de ácido orgánico del compuesto y un carbohidrato en una solución acuosa estéril , y almacenar dicha solución durante un periodo mayor que aproximadamente una hora. Otra modalidad de la presente invención es una composición empacada que incluye una solución acuosa estéril de un carbohidrato y una sal de ácido orgánico del compuesto junto con una descripción (por ejemplo, un inserto para el paciente) de que la solución opcionalmente se almacena durante un periodo superior a aproximadamente 1 hora. Los ácidos orgánicos adecuados para preparar las sales de la presente invención típicamente son compuestos que contienen al menos un grupo carboxilo, incluyendo aminoácidos (de origen natural o sintéticos), tales como ácido glutámico y ácido aspártico, y ácidos alquilo C1 -16 y arilo C6-16 y heteroaril C4-1 6 carboxílicos, tales como el acético, fumárico, succínico, málico , maleico, hidroximaleico, benzoico, hidroxibenzoico, fenilacético, cinámico, salicílico, y ácidos 2-fenoxibenzoicos, junto con cualquier derivado (excluyendo a los ésteres donde ningún carboxilo permanece libre) de estos que tenga la misma raíz (por ejemplo, "ácido acetoacético") que se describen en la tabla "Physical Constants of Organic Compounds" pp3-1 2 a 3-523 Merck I ndex 74a. Ed . 1 993. Los ácidos orgánicos dicarboxílicos son de particular interés. Emplear más de un ácido orgánico o una combinación de estos se encuentra dentro del alcance de la presente invención. Las sales se preparan de forma análoga al procedimiento mostrado en el ejemplo 1 , a continuación.

Típicamente, la proporción molar de ácido orgánico con respecto al compuesto 1 es de aproximadamente 1 : 1 . Sin embargo, la proporción puede ser tan grande como 1 mol de compuesto 1 con respecto al número de grupos ácidos en el caso de ácidos poliorgánicos, por ejemplo, una proporción de 2: 1 del compuesto 1 con respecto a sal para una sal de ácido dicarboxílico. Sin embargo, la proporción es variable, bajando hasta 1 : 1 o menor, dependiendo del enriquecimiento de la funcionalidad ácida y su grado de sustitución con funcionalidades ácidas. Las formulaciones adecuadas del compuesto 1 , ya sea para uso veterinario o humano, opcionalmente incluyen uno o más portadores aceptables. Los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de que sean compatibles con los otros ingredientes de la formulación y fisiológicamente inocuos para el paciente. Las formulaciones opcionalmente contienen excipientes tales como aquellos expuestos en el "Handbook of Pharmaceutical Excipients" ( 1 986). Los excipientes opcionalmente incluyen ácido ascórbico y otros antioxidantes, agentes quelantes tales como E DTA, carbohidratos tales como dextrina, manitol o dextrosa , reguladores de pH (por ejemplo , citrato), sales metálicas de alquilo, deslizante, agentes espesantes y otras sustancias que se encuentran convencionalmente en tabletas, cápsulas, soluciones u otras composiciones adecuadas o dirigidas para uso terapéutico. Típicamente, las formulaciones no contendrán excipientes convencionales de tableta , dado que generalmente se formulan para uso parenteral . Idealmente, las formulaciones serán estériles. Además, las preparaciones parenterales serán sustancialmente isotónicas. El pH de las formulaciones opcionalmente varía desde aproximadamente 5-10 hasta aproximadamente 6-9 , típicamente de aproximadamente 5-6. Las soluciones parenterales (estériles acuosas) de las sales de ácido orgánico del compuesto 1 incluyen opcionalmente una cantidad estabilizante de carbohidrato, típicamente un sacárido (mono, di o polisacáridos), glucósidos o alcohol de azúcar (alditoles). Los polisacáridos deben ser biodegradables con la inyección o infusión parenteral e incluyen dextrinas y almidones, típicamente de 3 a 10 unidades. Los carbohidratos representativos incluyen hexosas, aldosas, aldohexosas, aldotriosas (por ejemplo, gliceraldehído), aldotetrosas (por ejemplo, eritrosa), aldopentosas (por ejemplo, arabinosa), cetosas, cetohexosa (por ejemplo, fructosa), cetopentosas (por ejemplo , ribulosa), maltosa, lactosa, sacarosa , lactosa, ribosa, xilosa, lixosa, alosa , altrosa, glucosa, mañosa, gulosa , idosa, galactosa y talosa. De interés particular son los carbohidratos utilizados convencionalmente en formulaciones parenterales, por ejemplo manitol o dextrosa. El carácter óptico del carbohidrato no es crítico, pero es deseable que la configuración sea tal que el carbohidrato sea biodegradable con la administración parenteral . Por ejemplo, 5% de dextrosa (por peso de solución; pH de aproximadamente 4.2 , no regulado en pH) permite almacenamiento de compuesto 1 de succinato a 40° C durante 60 horas sin degradación significativa. Por otra parte, el almacenamiento en soluciones reguladas en pH a pH 2, 7 y 9 bajo las mismas condiciones llevan a una degradación sustancial del compuesto 1 : aproximadamente 100%, 1 8% y 76% por peso, respectivamente. La cantidad estabilizante de carbohidrato es variable y dependerá de las condiciones de almacenamiento esperadas y la vida de anaquel deseada, de la elección de regulador de pH , del pH , de la cantidad de compuesto 1 y otros factores que apreciarán los expertos en la técnica. Generalmente se utilizará aproximadamente de 0.5% a 5% por peso de solución . Típicamente, la cantidad óptima de carbohidrato se determinará mediante experimentación rutinaria, pero la cantidad generalmente no superará (junto con reguladores de pH , cloruro de sodio y similares) una cantidad que proporcione isotonicidad a la solución. Los concentrados hiperisotónicos son aceptables, sin embargo, si se espera diluir la composición parenteral antes o durante la infusión. La solución parenteral opcionalmente se regula en pH (típicamente con regulador de pH de citrato) a un pH de aproximadamente 4 a 6. La presencia del carbohidrato estabiliza las sales del compuesto 1 en solución acuosa para el almacenamiento (incluyendo el tiempo de administración ) de al menos aproximadamente 60 horas, hasta 1 semana, 1 mes o un año, o cualquier periodo intermedio, dependiendo de los factores antes mencionados para la concentración de carbohidrato, por ejemplo, la temperatura de almacenamiento y similares. Las composiciones terapéuticas opcionalmente se administran por rutas parenterales (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica , intratecal y epidural) dado que estas son las más convenientes para el tratamiento de enfermedades malignas. Las infusiones intravenosas son generalmente el método de administración preferido. Las formulaciones se presentan en dosis unitaria o envases de dosis múltiple, por ejemplo, ampolletas selladas, recipientes o bolsas flexibles de infusión. Los envases opcionalmente serán de vidrio o plástico rígido, pero típicamente se utilizarán envases semirígidos o flexibles, fabricados a partir de poliolefinas (polietileno) o cloruro de polivinilo plastificado. El envase típicamente es de una sola cámara. Estos envases tienen al menos un puerto integral estéril para facilitar la entrada estéril al envase de un dispositivo para tener acceso a los contenidos (generalmente jeringas o un dispositivo perforador de equipo intravenoso). El puerto proporciona acceso estéril para solución solubilizante (si se requiere) y egreso de soluciones parenterales. Un receptáculo superior (generalmente de poliolefina) se proporciona opcionalmente para el envase. La formulación se encuentra presente dentro del envase como solución o en forma seca. Si se almacena en una forma sustancialmente anhidra, por ejemplo, liofilizado, la formulación requerirá solamente de la adición de un portador l íquido estéril , como por ejemplo inyección de agua, inmediatamente antes de usarla. Las soluciones incluyen agentes para establecer tonicidad, tales como cloruro de sodio o azúcar, tal como manitol o dextrosa. Una ventaja inesperada del carbohidrato o azúcar es un aumento en la estabilidad de la sal del compuesto 1 en soluciones acuosas almacenadas. Los envases se llenan con solución estéril o se llenan y luego se esterilizan, por ejemplo mediante calor o agentes qu ímicos, de acuerdo con procesos conocidos. En general , se llena un envase flexible con una solución estéril de la formulación y luego se liofiliza opcionalmente. La tecnología adecuada para producir los productos de envase de la presente invención se encuentran en Avis et al . , Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications vols. 1 y 3 ( 1 984). Los envases parenterales contendrán una dosis diaria o subdosis unitaria diaria del compuesto 1 como se describe a continuación , o una fracción apropiada de ellos. El compuesto 1 , las sales de ácido orgánico del compuesto 1 , o soluciones acuosas de este, estabilizadas mediante carbohidrato, se emplean opcionalmente para tratar cualquier neoplasma, incluyendo no solamente enfermedades hematológicas malignas, sino también tumores sólidos de todos los tipos, por ejemplo , de cabeza y cuello, pulmón , riñon , hígado, hueso, cerebro y similares, particularmente de cáncer y displasia uterino y cervical , melanoma y cáncer de seno, colon , próstata, pulmón (de células pequeñas y de células no pequeñas) y páncreas. ' Las formulaciones de la presente invención se administran ya sea como monoterapia o en combinación con otros agentes para el tratamiento de enfermedades hematológicas malignas. La formulación de la presente invención opcionalmente se administra al paciente sustancialmente al mismo tiempo como otros agentes antineoplásicos, u otros agentes, se combina con la formulación de la presente invención, y luego se administra simultáneamente al paciente. Los agentes antineoplásicos típicos, útiles con el compuesto 1 (ya sea combinados con éste en cantidades terapéuticamente efectivas o administrado concurrentemente) incluyen cualquiera de los terapéuticos empleados concurrentemente en el tratamiento de enfermedades malignas, incluyendo a los utilizados para enfermedades hematológicas malignas que se mencionan en los antecedentes de la invención antes expuestos. Estos agentes acompañantes se administran (a) sustancialmente al mismo tiempo pero por vías de administración diferentes, (b) se combinan con la formulación de la presente invención y se administran concurrentemente, o (c) se administran durante periodos alternativos (por ejemplo, durante un periodo de descanso del tratamiento con el compuesto 1 ). En general , si se utiliza en combinación, la formulación de la presente invención se combina terapéuticamente con otro agente antineoplásico, elegido de una clase distinta, como por ejemplo un anticuerpo monoclonal. El tratamiento de NHL típicamente incluye ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, prednisona y rituximab. Si se utiliza en combinación, el compuesto 1 se administra en un curso terapéutico junto con , o en sustitución de, uno o más de los agentes antes mencionados. El compuesto 1 puede también administrarse en combinación con el rituximab. Para la terapia de CLL , se administra el compuesto 1 , ya sea como monoterapia o en combinación con otros agentes, tales como ciclofosfamida y/o rituximab. Otros agentes teraupéuticos adecuados para utilizarse con el compuesto 1 incluyen etoposida, melfalán, nitrosurea, busulfan , complejos de platino, alquiladores no clásicos tales como procarbazina, antimetabolitos tales como folato, purinas, análogos de adenosina, análogos de pirimidina, alciloides de vinca y similares. En base a las observaciones de toxicología de una sola dosis en perros, es razonable asumir que una dosis del compuesto 1 de entre 1 mg/kg/d ía y 3 mg/kg/d ía o mayor, hasta aproximadamente 1 0 mg/kg/día sería eficaz en perros (cuando se utilice una sal de ácido orgánico del compuesto 1 , la dosis se ajustaría para tomar en cuenta el peso adicional de la sal). Asumiendo que el perfil PK del compuesto en seres humanos sea similar al observado en perros, los hallazgos a la fecha sugieren una dosis eficaz en seres humanos del compuesto 1 (corregida para área de superficie por los factores de 0.54) de entre 0.54 mg/kg IV y 1 .62 mg/kg IV o mayor, administrada como una sola dosis con administraciones repetidas de aproximadamente 1 a 14 d ías, generalmente semanalmente o cada dos semanas, típicamente semanalmente para 2 dosis, dependiendo de la condición del paciente y tolerancia a la infusión, entre otros factores. Dado que debería esperarse una variación considerable en dosis adecuadas, debido a la naturaleza única de los cánceres individuales, la condición del paciente, la tolerancia del paciente y otros aspectos conocidos para el oncólogo común, el rango de dosis efectivas será mayor al modelo experimental central . Por esta razón , se espera que un rango de dosis de aproximadamente 0.5 a 5.4 mg/kg/d ía sea adecuado. Una sola dosis es adecuada, pero se prevé que los ciclos múltiples de dosis sean típicos, con un periodo de descanso de aproximadamente 1 0 a 30, generalmente de 23 días entre ciclos, nuevamente dependiendo de la condición del paciente y la tolerancia al terapéutico, como será evidente para alguien con conocimientos ordinarios en la materia. Toda la literatura y citas de pacientes antes mencionadas se incorporan aquí expresamente mediante referencia . La invención se ha descrito con suficiente detalle para permitir a una persona con conocimientos ordinarios en la materia preparar y utilizar la invención estipulada en las siguientes reivindicaciones. Los siguientes son ejemplos de la presente invención , y no deben ser interpretados como l ímites a la misma. Ejem plo 1 Una mezcla de cPrPMEDAP ( 1 .64 g , 5 mmol ), éster de Ala- etilo, HCI (4.62 g , 30 mmol) y TEA (8.36 mL, 60 mmol) se trató con 10 mL de piridina anhidra , y se calentó a 60° C para alcanzar una solución homogénea. Se agregó una solución de Aldritiol-2 (7.78 g, 35 mmol) y trifenilfosfina (9.1 8 g, 35 mmol ) en 1 0 mL de piridina anhidra . La mezcla resultante se calentó a 60° C durante la noche.

Después de enfriarla, la solución de color amarillo brillante se vertió dentro de bicarbonato de sodio acuoso saturado, y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con solución salina, luego se secó sobre sulfato de sodio. Después de retirar el solvente, el residuo crudo se purificó por medio de cromatografía instantánea, utilizando acetato de etilo al 100% , y luego cambiando a MeOH/DCM al 10 a 1 5% para diluir el producto deseado (1 .1 2 g , rendimiento 43%). Formación de sai succinato : El profármaco neutral (260 g) se disolvió en una solución de ácido succínico (583 g) en etanol (1 5 mL). Siguiendo a la adición de 50% v/v de n-heptano/etanol (20 mL), la sal deseada se aisló mediante filtración (2.26 g; M . P. 1 30° C).

Btructira quírrica FórrnJa molecular CZIHJSN H Peso molecular 526.53 Peso de la formula 644.61 Apariencia física Polvo Banco Punto de fusión 130<C Solubilidad ¾9m3TH(pH 42-4.7) Ejem plo 2 La Tabla 1 muestra la EC50 antiproliferación del compuesto 1 y sus metabolitos, cpr-PMEDAP (9-(2-fosfonilmetoxietil)-N6-ciclopropil-2,6-diaminopurina), PM EG (9-(2-fosfonilmetoxietil)guanina), y PM EDAP (9-(2-fosfonilmetoxietil)-2,6-diaminopurina). También se sometió a prueba una variedad de compuestos que se utilizan para el tratamiento de enfermedades hematológicas malignas, incluyendo una inhibidor de ADN polimerasa (ara-C), inhibidores de ADN polimerasa/ribonucleótido reductasa (cladribina, clofarabina, fludarabina , gemcitabina), e inhibidor de adenosina desaminasa (desoxicoformicina), un inhibidor de metilación de ADN (decitabina), un alquilador de ADN (doxorubicina) y un inhibidor de mitosis (vincristina). Todos los compuestos, con la excepción de la doxorubicina y la vincristina son análogos de nucleósidos; el ara-C, gemcitabina y decitabina son análogos de citosina y el resto son análogos de adenosina . El cpr-PMEDAP y el PM EG pueden considerarse análogos de adenosina y guanosina, respectivamente. Se probaron los compuestos utilizando linfoblastos humanos y caninos (estimulados con una fitohemaglutina mitógena de célula T (PHA) o un mitógeno de célula B de ombú (PWM )), dos l íneas de células linfoides derivadas de pacientes con leucemia linfocítica aguda (CEM y Molt- 4), dos l íneas de células mieloides derivadas de pacientes con leucemia mielógena aguda (KG-1 y HL-60), dos líneas celulares de linfoides B derivadas de linfoma de Burkitt (Daudi y Raji), una célula linfoide de linfoma no de Hodgkin (RL), una l ínea de células T de linfoma T cutáneo (PM-1 ), y una línea celular monocítica de linfoma histiocítico (U937). El compuesto 1 mostró actividad antiproliferante en una variedad de linfoblastos y líneas celulares de leucemia/linfoma. Su rango de EC50 es de entre 27 y 1 043 nM , similar al de la clofarabina (25-41 8 nM) y ara-C (23-1 820 nM), dos análogos de nucleósido comúnmente utilizados para el tratamiento de enfermedades hematológicas malignas. Entre otros nucleósidos, la gemcitabina fue la más potente (3.4 a 18 nM ) y la desoxicoformicina fue la más potente (> 200,000 nM ). Entre todos los compuestos, la vincristina (0.6 a 5.3 nM ) mostró la potencia más alta. No existió diferencia significativa entre la actividad del compuesto 1 en células humanas y su actividad en células caninas. Además, no se observó diferencia entre los blastos de PHA (predominantemente células T) y los blastos PWM (predominantemente células B) o entre líneas celulares linfoides T y B. Por esta razón, a diferencia de otro análogo de guanosina, la nelarabina , que solamente es efectivo contra los linfomas de células T, el compuesto 1 puede ser efectivo tanto en linfomas de células T como B . En la mayoría de los tipos celulares probados, el cpr-PMEDAP, que es el producto hidrolizado del compuesto 1 , fue significativamente menos potente que el compuesto 1 , lo que sugiere que el profármaco de fosforamidata mejoró la entrada del fármaco en las células, y que el grupo del profármaco se segmentó dentro de las células . El P EG , que es el producto desaminado del cpr-PMEDAP se mostró significativamente más potente que el producto dialquilado PM EDAP , consistente con la hipótesis de que la molécula activa para actividad antiproliferante del compuesto 1 es PM EGpp. Tabla 1 . E Csn antiproliferación (nM) en linfoblastos humanos, linfoblastos can inos y líneas celulares humanas obtenidas de pacientes con leucemia/linfoma. Blastocfe Blasto cfe Biastode Biastode CEM M0lt4 PvWI PHA FWM KG- K PHA(oáUas (linfoide (linfoide (células B (células T (cáulasB ieidda T humanas) ? ? humaras) carinas) aniñas) compuBstoi 135 42 30 14 156 27.3 1043 GS-8369 (cpr- 2348 N.D N.D N.D. 2217 1473 1109 FMEDAP) PMEG 1679 N.D N.D N.D 5195 1739 2928 PMEDAP 8953 N.D N.D N.D 19874 27896 7633 Ara-c 1820 N.D N.D N.D 143 23 56 (Cita ra tí na) Gerratabira 9.6 IM.D N.D N.D 21 8.5 5.7 Clofarabina 62 126 146 93 418 25 60 dacfibina 296 IM.D N.D N.D 1167 74 89 Hudarabina 1102 N.D N.D N.D ; 0,000 1550 4518 desfosfatada Desoó ootomicina 200,003 N.D N.D N.D ISLD 200,000 200,000 (pertostasina) Decitabina 204 IM.D N.D N.D 3004 580 83 Doxoxibicina 7.6 N.D N.D N.D N.D 1.2 28 vincristina 2.4 0.9 0.9 0.9* 2 0.4 3.2 RL Dauti Raji PM-1 HL-60 U937 (lir oide (linfoide (linfoide (linfoide (Midoidd (Mcnodtico E B) B) corrpuestoi 214 78 27 89* 125 394 GS-8369 (qx- 1608 N.D 1838 6725 4478 PMEDAP) PMEC 3918 ND 994 2724 4022 4009 P EDAP 21667 IM.D 14045 2489T 22732 24445 Ara-c 212 610 209 23 194 38 (Citaraüna) Cerrtitatína 8.6 18 6 3.4 16 31 Clofaratína 73 49.5 221 19.4 145 37 Clad-lbina 50* 4 525 12 40 20 Fludanabina 1768 N.D N.D MD 12857 300 desfQBfatacfe Desod cofarridra 200,000 IM.D N.D MD N.D 200,000 (pertetasina) Dedtatína 3831 N.D N.D ND 200,000 77 DCKOiio'idna 24 25 3.8 8.6 29.5 13 Vincristina 2 1.4 0.6 2.5 5.3 2.8 Los linfoblastos PHA se generaron mediante incubación de las células sanguíneas mononucleares (PBMC) con PHA mitógeno de células T ( 1 ) durante 3 d ías, seguida de incubación con 10 U/mL de interleucina-2 por 4 d ías más. Los linfoblastos de PWM se generaron mediante incubación de células B (purificadas a partir de PBMC, utilizando perlas magnéticas conjugadas en CD1 9) con PWM (20 µg/mL) durante 7 d ías. Los linfoblastos ( 1 50 ,000 células por receptáculo de microtitulación) y l íneas celulares de leucemia/linfoma (30,000 células por receptáculo) fueron incubados con diluciones en serie de 5 veces de los compuestos durante 3 días. Se llevó a cabo un estudio BrdU como sigue: Los linfoblastos se incubaron con diluciones en serie de 5 veces de compuestos en placas para microtitulación ( 1 50,000 células por receptáculo) durante 3 días. En el d ía 3, se marcaron las células con 10 µ? de BrdU durante 3 horas, y la cantidad de Brd U que se incorporó en el ADN celular se cuantificó por medio de un Estudio Inmunosorbente Ligado a Enzimas (ELISA). Alternativamente, las células se incubaron con 1 mg/mL de reactivo XTT (hidrato de ácido 3,3'-[1 [(fenilamino) carbonil]-3,4-tetrazolio]-bis(4-metoxi-6-nitro)bencenosulfónico de sodio) y PMS al 1 % (metosulfato de fenazina) durante 2 horas, y se cuantificó el cambio de color (la dehidrogenasa mitocondrial reduce el XTT de color amarillo a sal de formazano de color naranja). Los datos experimentales se utilizaron para generar curvas sigmoidales de respuesta a la dosis y se calcularon valores de concentración efectiva del 50% (EC50) utilizando el software Graph Pad Prism versión 4.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego California, Estados Unidos). Los estudios se repitieron de 2 a 20 veces, hasta que el error estándar de la media (SEM ) quedó por debajo del 50% del valor de la media . En la mayoría de los casos, los estudios se repitieron de 2 a 20 veces, hasta que el SEM quedó por debajo del 50% del valor de la media.

*Datos de las variables (SEM > 0.5 promedio de EC50), N . D; no se realizó. Ejemplo 3 Distribución de profármacos entre PBMC y Plasma en Perros Los perros se administraron en diversos profármacos de cpr- PMEDAP como 0.2 mg/kg en infusiones intravenosas de 30 minutos. Los profármacos 1 a 4 son monoamidatos (el fósforo también se sustituyó con fenoxi), mientras que los dos compuestos fueron bis(amidatos). Los compuestos A y B fueron enantiómeros sustancialmente aislados en el centro quiral del átomo de fósforo, mientra que el monoAlatBU fue el racemato en este sitio. El isómero L fue alanina. *La sangre se recolectó en EDTA de potasio y se separó mediante centrifugación. Las células sangu íneas mononucleares primarias (PBMC) se recolectaron utilizando tubos de CPT (citrato de sodio). *Para el análisis, las muestras de plasma se precipitaron mediante la adición de 1 00 µ? de acetonitrilo que contenían estándares internos ( D4AP y TDF) a 1 00 µ\- de plasma para análisis de profármaco. Después de la precipitación de proteína por centrifugación , se transfirieron 1 00 µ\- a otro tubo para secarse y luego reconstituirse en 100 µ? de agua con 0.2% de ácido fórmico. Se inyectó una alícuota de 20 µ? dentro de la columna para análisis LC/MS/MS . El análisis se realizó utilizando una columna Synergi Fusion-RP 80A de 4 µ?? , de 1 50x2.0 mm (Fenomenex) y un gradiente lineal de etapas múltiples de 0.5 a 99% de acetonitrilo en presencia de 0.2% de ácido fórmico a 0.25 mL/min. Los analitos se detectaron utilizando un espectrómetro de masa Sciex API-4000, mediante ionización de electrorocío en modo M RM positivo. Las muestras se analizaron por GS-327260, -8369, -0573 y -0438. *Las muestras de PBMC se lisaron en MeOH al 70% . Se utilizaron alicuotas separadas de células de cada punto de tiempo resuspendidas en 1 00% de suero para establecer las cantidades de células en cada muestra. Las muestras celulares se normalizaron 1 5x106 células por muestra. Se observaron grados variables de hemolisis. Un 70% de MeOH que contenía material celular extraído se dividió en dos formas para análisis directo y defosforilación y se secó por separado. *Después del secado, las muestras para análisis directo se volvieron a suspender en acetonitrilo al 20% que contenía estándares internos (TDF y D4AP) y se analizaron para GS-327260, -8369. Se inyectaron 20 µ? para análisis de LC/MS/MS utilizando una columna Synergi Hydro-RP (Phenomenex) 80A de 4 µ?p de 50x2.0 mm ( Fenomenex) y un gradiente lineal de etapas múltiples de 0 a 95% de acetonitrilo en presencia de ácido fórmico al 0.2% a 1 .0 mL/min . Los analitos se detectaron utilizando un espectrómetro de masa Sciex API-4000, mediante ionización por electrorocío en modo M RM positivo. *Después del secado, se trató a las mezclas para defosforilación con 1 U de fosfatasa intestinal de ternera (fosfotasa alcalina, Sigma) durante 2 h en un regulador de pH proporcionado por el fabricante. Las muestras se ajustaron entonces a acetonitrilo al 60% secado y resuspendido en acetonitrilo al 60% que contenía estándares internos (TDF y D4AP) y se analizron para detectar cpr-PMEDAP como se describe para el análisis de PBMC directo. Tabla: Comparación de exposición de plasma v PBMC a cpr- PMEDAP (CPM EDAP) después de la admini istración del Drofármaco a un perro Beaqle mediante infusión intravenosa de 30 minutos. Corrpuesto CPM EDAP en rJ asma PBMC CPMEMDAP Proporcióii PM BC Profarmaoo N° AUWnM h) AUCo-24(nM n respecto a plasma 1 McnoAlaiPr 538+181 9,179+050 17 2 MonoAlatBu 144+77 1,790+468 12 3 M cnoAlatBu(A) 78+34 1,453+1412 19 4 M cnoAlatBu(B) BL0Qa ND ND 5 BisAlaiPr 4,470+2,040 5,380+1,320 1.2 CPMEDAP BisAlaiEtn 59+38 7,550 ,450 130 a BLDQ =For debajo del lírr-te iríeric decLartifiacicn. Para CPMEDAP en plasma etB va lor füe de20 nM. bND Nosere lectarc>n nuestras de PBMC para la adninistracidn del oompuesto4.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES:
2. 2. La sal de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada además porque el ácido orgánico es ácido succínico.
3. 3. Una solución acuosa estéril que contiene la sal de acuerdo con la reivindicación 1, además de un carbohidrato.
4. 4. Un método que incluye administrar a un paciente que tiene un neoplasma una dosis terapéuticamente efectiva de la sal de acuerdo con la reivindicación 1.
5. 5. Una combinación que incluye (a) un envase adecuado para un producto farmacéutico parenteral y colocada en él (b) una dosis terapéuticamente efectiva del compuesto y/o sus sales, tautómeros y solvatos.
6. 6. La combinación de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque el compuesto se encuentra en una solución acuosa sustancialmente isotónica.
7. 7. La combinación de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque el compuesto es una sal con al menos un ácido orgánico.
8. 8. La combinación de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque el ácido orgánico es ácido succínico.
9. 9. La combinación de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque el envase incluye un puerto estéril . 1 0. La combinación de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque el envase es un frasco o una bolsa flexible. 1 1 . Un método para el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad hematológica maligna, que incluye administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto y/o sus sales, tautómeros y solvatos. 1 2. El método de acuerdo con la reivindicación caracterizado porque la enfermedad hematológica maligna mieloma múltiple o síndrome mielodisplásico. 1 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizado porque la enfermedad hematologica maligna es una leucemia o un linfoma. 1 4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizado porque se administra una sal de ácido orgánico del compuesto. 1 5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizado porque el compuesto se administra parenteralmente. 16. Una composición que incluye el compuesto y/o sus sales, tautómeros y solvatos, y al menos otro agente útil para el tratamiento de una enfermedad hematologica maligna. 1 7. Un método que incluye preparar una sal de ácido orgánico del compuesto y un carbohidrato en una solución acuosa estéril, y almacenar dicha solución durante un periodo mayor que aproximadamente una hora. 18. Una composición empacada que incluye una solución acuosa estéril de (a) un carbohidrato y (b) una sal de ácido orgánico del compuesto y/o sus tautómeros y solvatos, junto con la descripción de que la solución opcionalmente se almacena durante un periodo superior a aproximadamente 1 hora. 1 9. Un equipo que incluye (a) un envase adecuado para un producto farmacéutico parenteral y (b) una dosis terapéuticamente efectiva del compuesto y/o sus sales, taut meros y so va os; y (c) instrucciones para el uso del compuesto y el envase. 20. El uso de un compuesto que tiene la estructura y/o sus sales, tautómeros y solvatos en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad hematológica maligna. 21 . Un compuesto o un método como los que se describen aquí.