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MX2007014470A - Metodo para el tratamiento de enfermedad de pompe usando derivados de 1-desoxinojirimicina. - Google Patents

Metodo para el tratamiento de enfermedad de pompe usando derivados de 1-desoxinojirimicina.

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Publication number
MX2007014470A
MX2007014470A MX2007014470A MX2007014470A MX2007014470A MX 2007014470 A MX2007014470 A MX 2007014470A MX 2007014470 A MX2007014470 A MX 2007014470A MX 2007014470 A MX2007014470 A MX 2007014470A MX 2007014470 A MX2007014470 A MX 2007014470A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
dnj
gaa
derivative
enzyme
compound
Prior art date
Application number
MX2007014470A
Other languages
English (en)
Inventor
Benjamin Mugrage
Original Assignee
Amicus Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amicus Therapeutics Inc filed Critical Amicus Therapeutics Inc
Publication of MX2007014470A publication Critical patent/MX2007014470A/es

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Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para incrementar la actividad de una enzima (-glucosidasa mutante o tipo silvestre in vitro e in vivo al poner en contacto la enzima con una chaperona farmacologica especifica la cual es un derivado de 1-desoxinojirimicina. La invencion proporciona tambien un metodo para el tratamiento de la enfermedad de Pompe mediante la administracion de un compuesto de chaperona de molecula pequena el cual es un derivado de 1-desoxinojirimicina. El derivado de 1-desoxinojirimicina es sustituido en la posicion N o Cl. Se proporciona tambien terapia de combinacion con gen o enzima (-glucosidasa de reemplazo.

Description

MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD DE POMPE USANDO DERIVADOS DE 1-DESOXINOJIRIMICINA Campo de la invención La presente invención proporciona un método para incrementar la actividad de una enzima a-glucosidasa y un método para tratar la enfermedad de Pompe que comprende administrar a un individuo una cantidad efectiva de 1-desoxinojirimicina (1-DNJ) y derivados de 1-DNJ, incluyendo por ejemplo, N-butil-1-desoxinojirimicina (NB-DNJ) . Se ha mostrado inesperadamente que estos compuestos incrementan la ácido a-glucosidasa, la enzima responsable de la patología de la enfermedad de Pompe .
Antecedentes de la invención Enfermedad de Pompe La enfermedad de Pompe es uno de varios trastornos de almacenamiento lisosómico. Los trastornos de almacenamiento lisosómico son un grupo de enfermedades recesivas autosómicas causadas por la acumulación de glicoesfingolípidos, glicógeno o mucopolisacáridos celulares, debido a enzimas hidrolíticas defectuosas. Ejemplos de trastornos lisosómicos incluyen pero no están limitados a enfermedad de Gaucher (Beutler et al., The Metabolic and Molecular Bases of Inheri ted Disease, 8a ed. 2001 Scriver et REF. : 188089 al., ed. Págs. 365-3668, McGraw-Hill, Nueva York), G -gangliosidosis (id. en pág. 3775-3810), fucosidosis ( The Metaboli c and Molecular Bases of Inheri ted Disease 1995, Scriver, C. R. , Beaudet, A. L. , Sly, W. S. Y Valle, D., ed. Pág. 2529-2561, McGraw-Hill, Nueva York) , mucopolisacaridosis (id. At 3421-3452) , enfermedad de Pompe (id. en pág. 3389-3420), enfermedad de Hurler-Scheie, (Weismann et al., Science . 1970; 169, 72-74), enfermedades de Niemann-Pick A y B, ( The Metaboli c and Molecular Bases of Inheri ted Disease 8a ed. 2001 . Scriver et al. Ed., pág. 3589-3610, McGraw-Hill, Nueva York) , y enfermedad de Fabry (id. en pág. 3733-3774) . La enfermedad de Pompe es causada por una deficiencia en la enzima ácido a-glucosidasa (Gaa) . Gaa metaboliza glicógeno, una forma de almacenamiento de azúcar usada para energía, en glucosa. Se cree que la acumulación de glicógeno lleva a miopatía muscular progresiva a lo largo del cuerpo lo cual afecta varios tejidos del cuerpo, particularmente el corazón, músculos esqueléticos, hígado y sistema nervioso. De acuerdo con el Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas y Apoplejía, se calcula que la enfermedad de Pompe ocurre en aproximadamente 1 de 40,000 nacimientos . Existen tres tipos reconocidos de enfermedad de Pompe infantil, juvenil y de inicio en la adultez. La infantil es la más severa, y se presenta con síntomas que incluyen una severa falta de tono muscular, debilidad, hígado y corazón agrandados y cardiomiopatía. La deglución puede volverse difícil y la lengua puede sobresalir y agrandarse. La mayoría de los niños mueren de complicaciones respiratorias o cardiacas antes de los dos años . La enfermedad de Pompe de inicio juvenil se presenta primero en la niñez temprana a tardía e incluye debilidad progresiva de los músculos respiratorios en el tronco, diafragma y extremidades inferiores, así como intolerancia al ejercicio. La mayoría de los pacientes de Pompe de inicio juvenil no viven más allá de la segunda o tercera década de vida. Los síntomas de inicio en la adultez incluyen debilidad muscular generalizada y desgaste de músculos respiratorios en el tronco, extremidades inferiores y diafragma. Algunos pacientes adultos están libres de síntomas principales o limitaciones motoras.
Tratamiento actual El tratamiento actual de la enfermedad de Pompe incluye tratamiento sintomático de los síntomas cardiacos y respiratorios . No hay algún tratamiento aprobado para el defecto genético subyacente. Recientemente, el uso de Gaa de reemplazo (Myozyme; Genzyme, Inc.) fue aprobado por la F.D. A. en los Estados Unidos. Sin embargo, evaluaciones clínicas usando terapia de reemplazo de enzimas para reemplazar Gaa defectuoso en pacientes de Pompe infantil sólo fue moderadamente exitoso para mejorar la función cardiaca y esquelética (Klinge et al., Neuropedia trics . 2005; 36(1): 6-11) . Gaa recombinante demostró ser más efectiva para resolver la cardiomiopatía que la miopatía de músculo esquelético (Raben et al., Mol . Ther. 2005; 11(1): 48-56), ampliamente debido a que la enzima recombinante no puede penetrar en tejido conectivo. Un método para tratar la enfermedad de Pompe usando Gaa recombinante se describe específicamente en U.S. 6,537,785 a Canfield. Una de las principales complicaciones con la terapia de reemplazo de enzima (ERT) es el logro y mantenimiento de cantidades terapéuticamente efectivas de enzima debido a una rápida degradación de la enzima infundida. Como resultado, la ERT requiere de numerosas infusiones de alta dosis y es costosa y consumidora de tiempo. La terapia ERT tiene varias salvedades adicionales, tales como dificultades con la generación, purificación y almacenamiento a gran escala de proteínas adecuadamente dobladas, obtención de proteína nativa glicosilada y la generación de una respuesta inmune anti-proteínas e insuficiencia de las proteínas para cruzar la barrera hemoencefálica en cantidades suficientes para afectar enfermedades que tengan una implicación significativa en el sistema nervioso central. Además, la enzima recombinante no puede cruzar barreras que rodean órganos tales como el riñon, ni puede penetrar tejido conectivo, y de esta manera no es efectiva para restablecer la función de numerosos tejidos afectados . La terapia génica usando vectores recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína funcional, o células humanas genéticamente modificadas que expresen una proteína funcional, también se está usando para tratar deficiencias proteínicas y otros trastornos que se benefician de reemplazo de proteínas. Aunque promisorio, este enfoque también está limitado por dificultades técnicas, tales como la incapacidad de los vectores para infectar o transducir células en división, la baja expresión del gen objetivo y la regulación de la expresión una vez que el gen es suministrado (por ejemplo, muchos vectores virales requieren que las células se dividan para eficacia) . Un tercer enfoque relativamente reciente para tratar deficiencias enzimáticas incluye el uso de inhibidores de molécula pequeña para reducir el substrato natural de proteínas enzimáticas deficientes, de esta manera reduciendo la patología observada. Este enfoque de "privación de substrato" ha sido descrito específicamente para el tratamiento de algunos trastornos de almacenamiento lisosómico incluyendo acumulación de glicolípidos (véanse patentes de E.U.A. 5,798,366, 6,291,657 y 6,660,749). Los inhibidores de molécula pequeña propuestos para usarse como terapia incluyen derivados de N-alquil-desoxinojirimicina (N-alquil-DNJ) , y se reporta que son específicos para inhibir las enzimas implicadas en la síntesis de glicolípidos, reduciendo de esta manera la cantidad de glicolípidos celulares que tienen que ser degradados por la enzima deficiente. Este enfoque también está limitado ya que los glicolípidos son necesarios para función biológica, y una privación excesiva puede causar efectos adversos. Específicamente, los glicolípidos se usan por el cerebro para enviar señales de los gangliósidos de una neurona a otra. Si hay muy pocos o muchos glicolípidos, la capacidad de la neurona para enviar señales es impedida. Un cuarto enfoque, una estrategia de chaperona específica, rescata proteínas mutadas de su degradación presuntamente en el retículo endoplásmico (ER) o en otros sistemas de degradación/desecho de proteínas celulares. Patentes y publicaciones anteriores describen una estrategia terapéutica para rescatar proteínas enzimáticas endógenas, incluyendo enzimas lisosómicas mal dobladas, de la degradación por la maquinaria de control de calidad del ER. En modalidades particulares, esta estrategia emplea chaperonas farmacológicas de molécula pequeña que se unen específicamente a una enzima lisosómica defectuosa asociada con un trastorno lisosómico particular. En ausencia de terapia, la proteína enzimática mutada es inestable en el ER (Ishii et al., Biochem , Biophys . Res . Comm . 1996; 220:812-815) , es retardada en su mutación hasta un producto final y es posteriormente degradada en el ER. La estrategia de chaperona incluye el uso de un compuesto que facilita el doblez e incrementa la estabilidad de una proteína mutada, para evitar una degradación indebida o anormal del sistema de control de calidad del ER. Estas chaperonas específicas se designan como chaperonas específicas de sitio activo o también se conocen como chaperonas farmacológicas específicas . La teoría original detrás de esta estrategia es la siguiente: ya que la proteína enzimática mutante se dobla inadecuadamente en el ER (Ishii et al., Biochem Biophys . Res . Comm . 1996; 220:812-815), la proteína enzimática es retardada en la vía de transporte normal (ER ? aparato de Golgi — endosoma —• lisosoma) y es rápidamente degradada. Por lo tanto, un compuesto que facilite el adecuado doblez de una proteína mutante servirá como una chaperona específico de sitio activo para que la proteína mutante promueva su escape suave del sistema de control de calidad del ER. Se sabía que algunos inhibidores enzimáticos ocupaban el centro catalítico, dando como resultado estabilización de la conformación enzimática in vi tro .
La estrategia de chaperona farmacológica específica ha sido demostrada para numerosas enzimas incluidas en trastornos de almacenamiento lisosómico como en las patentes de E.U.A. Nos.. 6,274,597, 6,583,158, 6,589,964, 6,599,919 y 6,916,829 a Fan et al., las cuales se incorporan en la presente a manera de referencia en su totalidad. Por ejemplo, un derivado de molécula pequeña de galactosa, 1-desoxigalactonojirimicina (DGJ) , un potente inhibidor competitivo de la enzima de Fabry mutante a-galactosidasa A (a-Gal A; Gla) , incrementó en forma efectiva la estabilidad in vi tro de la a-Gal A mutante humana (R301Q) a pH neutro, e incrementó la actividad de la enzima mutante en linfoblastos establecidos de pacientes de Fabry con mutaciones R301Q o Q279E. Más aún, la administración oral de DGJ a ratones transgénicos que sobre-expresaban una a-Gal A (R301Q) mutante elevó sustancialmente la actividad enzimática en los órganos principales (Fan et al., Na ture Med. 1999; 5: 112-115). Un rescate similar de glucocerebrosidasa (ácido ß-glucosidasa, Gba) de células de pacientes de Gaucher ha sido descrito usando otro iminoazúcar, isofagomina (IFG) y sus derivados, descritos en la patente de E.U.A. No. de serie 6,916,829, y usando otros compuestos específicos para glucocerebrosidasa (descritos en las solicitudes de patente de E.U.A. pendientes Nos. de serie 10/988,428 y 10/988,427, ambas presentadas el 12 de noviembre de 2004). La patente de E.U.A. 6,583,158 descrita arriba, describe varios compuestos de molécula pequeña que se esperaría funcionaran para rescatar Gaa para el tratamiento de la enfermedad de Pompe, incluyendo 1-desoxinoj irimicina (DNJ), a-homonoj irimicina y castanoespermina. La presente invención se basa en resultados inesperados obtenidos usando derivados de DNJ, tales como N-butil DNJ, los cuales se encontró que eran efectivos como chaperonas farmacológicas específicas para Gaa mutante.
Breve descripción de la invención La presente invención proporciona un método para inducir o estabilizar una conformación adecuada de una enzima a-glucosidasa (Gaa) en una célula al poner en contacto la enzima y un derivado de desoxinoj irimicina (DNJ), tal como 1-desoxinoj irimicina (1) o N-butil DNJ (5). De preferencia, la relación de actividad Gaa en presencia del derivado de DNJ sobre la actividad de Gaa sin el derivado de DNJ es de al menos 1.5 veces a la concentración del derivado de DNJ que proporciona la actividad Gaa máxima. En otra modalidad, el incremento de actividad Gaa es de al menos 5 veces. En una modalidad, el derivado de DNJ tiene la siguiente estructura: en donde Ri es H o un alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alcoxialquilo o aminoalquilo lineal o ramificado que contiene 1-12 átomos de carbono, un arilo, alquilarilo, heteroarilo o heteroariloalquilo que contiene 5-12 átomos de anillo, en donde Ri es sustituido opcionalmente con uno o más -OH, COOH, -Cl, -F, -CF3, -0CF3, -O-C (=0) N- (alquilo) 2 ; R2 es H; un alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquilarilo o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono o arilo que contiene 5-12 átomos de carbono, en donde R2 es sustituido opcionalmente con -OH, COOH, -CF3, -0CF3 o un anillo heterocíclico; y por lo menos uno de Rx y R2 no es H, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. De preferencia, el incremento de la actividad Gaa en presencia del derivado de DNJ sobre la actividad Gaa sin el derivado de DNJ es de al menos 1.5 a la concentración del derivado de DNJ que proporciona la actividad Gaa máxima en una célula, con la condición de que el derivado de DNJ no sea 1-desoxinoj irimicina o a-homonoj irimicina.
En otra modalidad, el derivado de DNJ tiene la siguiente estructura: en donde Ri es H o un alquilo, cicloalquilo, alcoxialquilo o aminoalquilo lineal o ramificado que contiene 1-12 átomos de carbono, sustituido opcionalmente con un -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -0-C(=0)N- (alquilo)2; R2 es H o un alquilo, cicloalquilo o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono y por lo menos uno de Ri y R2 no es H, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. De preferencia, la relación de actividad Gaa en presencia del derivado de DNJ sobre la actividad Gaa sin el derivado de DNJ es de al menos 1.5 a la concentración del derivado de DNJ que proporciona la actividad Gaa máxima en una célula, con la condición de que el derivado de DNJ no sea 1-desoxinoj irimicina o a-homonoj irimicina. La actividad Gaa máxima en una célula puede determinarse in vi tro o in vivo como se describe en los ejemplos, y para cualquier derivado de DNJ, se puede usar cualquiera de los ensayos ejemplificados para demostrar esta relación de actividad. En una modalidad especifica, Ri es un alquilo, cicloalquilo o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono sustituido opcionalmente con un -OH, -COOH, -CF3, OCF3 o -C(=0)N- (Me)2; y R2 es H. En otra modalidad, Rx es n-metilo, n-etilo, n-butilo, n-ciclopropilmetilo o n-nonilo. En otra modalidad más, en donde Ri es n-etilo o n-butilo sustituido con un -OH, -COOH, CF3, -OCF3; o -C(=0)N- (Me) 2. En una modalidad, Ri es En otra modalidad, Rx es H y R2 es un alquilo, alquenilo, arilo o éter de cadena recta o ramificada sustituido opcionalmente con -CF3 o un heterociclo. En una modalidad, R2 es un grupo n-nonilo. En modalidades adicionales del método reclamado, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en N-metil-DNJ, N-butil-DNJ, N-ciclopropilmetil-DNJ, N-(2-(N,N-dimetilamido) etiloxi-DNJ, N-4-t-butiloxicarbonil-piperidinilmetil-DNJ, N-2-R-tetrahidrofuranilmetil-DNJ, N-2-R-tetrahidrofuranilmetil-DNJ, N- (2- (2,2,2-trifluoroetoxi) etil-DNJ, N-2-metoxietil-DNJ, N-2-etoxietil- DNJ, N-4-trifluorometilbencil-DNJ, N-alf -ciano-4-trifluorometilbencil-DNJ, N-4-trifluorometoxibenil-DNJ, N-4-n-pentoxibencil-DNJ y N-4-n-butoxibencil-DNJ o Cl-nonil DNJ. En otra modalidad, el compuesto incrementa la actividad Gaa lisosómica a una concentración en o debajo del valor IC50 para la inhibición de Gaa intestinal. En una modalidad, la enzima Gaa es una a-glucosidasa mutante. En modalidades específicas, la a-glucosidasa mutante se selecciona del grupo que consiste en D645E, D645H; R224W; 2619R; R660H; T1064C; C2104T; D645N; L901Q; G219R; E262K, ; M408V; G309R; D645N; G448S; R672W; R672Q; P545L; C647W; G643R; M318T; E521K; W481R; L552P, G549R; R854X; V816I y T927I y combinaciones de los mismos. En otra modalidad, la Gaa es una Gaa funcional purificada o recombinante. En una modalidad más, el contacto ocurre in vivo o in vi tro . La invención proporciona también un método para el tratamiento de la enfermedad de Pompe al administrar una cantidad efectiva de un derivado de desoxinoj irimicina, tal como N-butil DNJ. En una modalidad, el derivado de DNJ tiene la siguiente estructura: en donde Ri es H o un alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alcoxialquilo o aminoalquilo lineal o ramificado que contiene 1-12 átomos de carbono, un arilo, alquilarilo, heteroarilo o heteroariloalquilo que contiene 5-12 átomos de anillo, en donde Ri es sustituido opcionalmente con uno o más -OH, COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C (=0) N- (alquilo) 2 ; R2 es H; un alquilo, cicloalquilo, alquenilo, o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono o arilo que contiene 5-12 átomos de carbono, en donde R2 es sustituido opcionalmente con -OH, -COOH, -CF3/ -0CF3 o un anillo heterocíclico; y en donde por lo menos uno de Ri y R2 no es H, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. De preferencia, la relación de la actividad Gaa en presencia del derivado de DNJ sobre la actividad Gaa sin el derivado de DNJ es de al menos 1.5 a la concentración del derivado de DNJ que proporciona la actividad Gaa máxima en una célula, con la condición de que el derivado de DNJ no sea 1-desoxinoj irimicina o a-homonoj irimicina. En otra modalidad, el derivado de DNJ tiene la siguiente estructura: en donde Ri es H o un alquilo, cicloalquilo, alcoxialquilo o aminoalquilo lineal o ramificado que contiene 1-12 átomos de carbono sustituido opcionalmente con uno o más -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -0CF3, -0-C(=0)N- (alquilo) 2; R2 es H; un alquilo, cicloalquilo o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono y por lo menos uno de Ri y R2 no es H, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. De preferencia, la relación de actividad Gaa en presencia del derivado de DNJ sobre actividad Gaa sin el derivado de DNJ es de al menos 1.5 a la concentración del derivado de DNJ que proporciona la actividad Gaa máxima en una célula, con la condición de que el derivado de DNJ no sea 1-desoxinoj irimicina o a-homonoj irimicina. En una modalidad, Ri es un alquilo, cicloalquilo o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono sustituidos opcionalmente con -OH, -COOH, CF3, 0CF3 o -C (=0) N- (Me) 2; y R2 es H. En una modalidad específica, Rx es n-metilo, n-etilo, n-butilo, n-ciclopropilmetilo o n-nonilo.
En otra modalidad, Ri es n-etilo o n-butilo sustituido con un -OH, -COOH, CF3, OCF3 o -C (=0) N- (Me) 2. En otra modalidad más, Ri es En otra modalidad, Rx es H y R2 es un alquilo, alquenilo, arilo o éter de cadena recta o ramificado sustituido opcionalmente con CF3 o un heterociclo. En otra modalidad más, R2 es un grupo n-nonilo. En una modalidad particular, el compuesto se selecciona del grupo que consiste en N-metil-DNJ, N-butil-DNJ, N-ciclopropilmetil-DNJ, N- (2- (N, N-dimetilamido) etiloxi-DNJ, N-4-t-butiloxicarbonil-piperidinilmetil-DNJ, N-2-R-tetrahidrofuranilmetil-DNJ, N-2-R-tetrahidrofuranilmetil-DNJ, N- (2- (2, 2, 2-trifluoroetoxi) etil-DNJ, N-2-metoxietil-DNJ, N-2-etoxietil-DNJ, N-4-trifluorometilbencil-DNJ, N-alfa-ciano-4-trifluorometilbencil-DNJ, N-4-trifluorometoxibenil-DNJ, N-4-n-pentoxibencil-DNJ y N-4-n-butoxibencil-DNJ o Cl-nonil DNJ. En otra modalidad, el compuesto incrementa Gaa lisosómica a una concentración en o debajo del valor IC50 para la inhibición de Gaa intestinal. En otra modalidad, la cantidad efectiva del derivado de 1-desoxinoj irimicina es de alrededor de 1 mg a 300 mg al día. En una modalidad alternativa, la cantidad efectiva es de aproximadamente 5 mg a alrededor de 150 mg al día. En otra modalidad más, la cantidad efectiva es de aproximadamente 5 a alrededor de 75 mg al día. En una modalidad, el derivado de desoxinoj irimicina se administra en una forma de dosis oral, tal como una tableta o una cápsula. En otra modalidad, el derivado de desoxinoj irimicina se administra en combinación con enzima de reemplazo de Gaa. En esta modalidad, el derivado de desoxinoj irimicina y la enzima de reemplazo de Gaa pueden administrarse en formulaciones separadas o como una sola formulación. Por ejemplo, en una de estas modalidades, el derivado de desoxinoj irimicina se administra en una forma de dosis oral y la enzima de reemplazo de Gaa se administra en una forma de dosis parenteral. En una modalidad alternativa, el derivado de desoxinoj irimicina se administra en combinación con terapia génica. En una modalidad de la invención, los tratamientos anteriores dan como resultado una disminución en la patología de la enfermedad de Pompe . En una modalidad específica, la patología se caracteriza por la presencia de al menos uno de: actividad de tejido esquelético Gaa reducida; cardiomiopatía; cardiomegalia; debilidad muscular progresiva; hipotonía; macroglosia; dificultad para tragar; succionar y/o alimentarse; insuficiencia respiratoria; hepatomegalia; laxidad de músculos faciales; arreflexia; intolerancia a ejercicio; dispnea ejercional; ortopnea; apnea del sueño; dolores de cabeza matutinos; somnolencia; lordosis y/o escoliosis; reflejos de tendón profundo reducidos; dolor de espalda inferior e insuficiencia para satisfacer metas motoras en desarrollo. La presente invención también proporciona un método para aliviar o reducir un síntoma de la enfermedad de Pompe al administrar una cantidad efectiva de un derivado de desoxinoj irimicina. En una modalidad, el síntoma es al menos uno de: actividad de tejido esquelético Gaa reducida; cardiomiopatía; cardiomegalia; debilidad muscular progresiva; hipotonía; macroglosia; dificultad para tragar; succionar y/o alimentarse; insuficiencia respiratoria; hepatomegalia; laxidad de músculos faciales; arreflexia; intolerancia a ejercicio; dispnea ejercional; ortopnea; apnea del sueñe-dolores de cabeza matutinos; somnolencia; lordosis y/o escoliosis; reflejos de tendón profundo reducidos; dolor de espalda inferior e insuficiencia para satisfacer metas motoras en desarrollo. En modalidades alternativas, el derivado de desoxinoj irimicina se administra en combinación con una proteína o gen de a-glucosidasa de reemplazo. La presente invención incluye además derivados de DNJ, composiciones que comprenden estos derivados de DNJ y composiciones farmacéuticas que comprenden estos derivados de DNJ. Los derivados de DNJ tienen fórmulas estructurales como las indicadas arriba, con la condición de que el derivado de DNJ no sean 1-desoxinoj irimicina o a-homonoj irimicina.
Breve descripción de las figuras El archivo de la patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. Copias de la patente o publicación de la solicitud de patente con dibujo (s) a color serán proporcionadas por la Oficina luego de su solicitud y del pago de la tarifa necesaria. Figura 1. La figura 1 ilustra los efectos de derivados de iminoazúcar 1-DNJ, NB-DNJ y N- (ciclopropil) metil DNJ en la actividad de ácido a-glucosidasa en la línea de células de la enfermedad de Pompe PM-11. Figuras 2A-2D . Las figuras 2A-2D muestran el incremento de Gaa en cerebro (2A) , hígado (2B) , músculos gemelos (2C) y lengua (2D) de ratones C57BL6 normales tratados con varias concentraciones de DNJ y NB-DNJ durante 2 semanas . Figuras 3A-3D. Las figuras 3A-3D muestran el incremento de Gaa en riñon (3A) , diafragma (3B) , corazón (3C) y soleo (3D) de ratones C57BL6 normales tratados con varias concentraciones de DNJ y NB-DNJ durante 2 semanas. Figuras 4A-4D. Las figuras 4A-4D muestran el incremento de Gaa en cerebro (4A) , hígado (4B) , músculos gemelos (4C) y lengua (4D) de ratones C57BL6 normales tratados con varias concentraciones de DNJ y NB-DNJ durante 4 semanas. Figuras 5A-5D. Las figuras 5A-5D muestran el incremento de Gaa en riñon (5A) , diafragma (5B) , corazón (5C) y soleo (5D) de ratones C57BL6 normales tratados con varias concentraciones de DNJ y NB-DNJ durante 4 semanas. Figuras 6A-6H. Las figuras 6A-6H ilustran la inmunocoloración de Gaa en fibroblastos tipo silvestre (6C) y Pompe PM8 (6A y 6F) . Esta figura ilustra también la coloración lisosómica para el marcador lisosómico LAMP-1 en fibroblastos tipo silvestre (6D) y PM8 de Pompe (6B y 6E) . También se muestra una transparencia de la coloración de Gaa y LAMP-1 para fibroblastos tipo silvestre (6H) y PM8 (6G) . Figuras 7A-7F. Las figuras 7A-7F ilustran la coloración inmunofluorescente para Gaa (7B y D) y LAMP-1 (7E) en fibroblastos de Pompe PM9. Transparencias de coloración de Gaa y LA P-1 también se ilustran (7A, 7C y 7F) .
Figura 8. La figura 8 ilustra la coloración doble de Gaa, LAMP-1 y Gaa/LAMP-1 en líneas de células de Pompe PM11 que han sido tratadas con DNJ o NB-DNJ.
Descripción detallada de la invención La presente invención describe un método para el rescate de Gaa mutante y el tratamiento de la enfermedad de Pompe, usando el iminoazúcar de molécula pequeña DNJ y derivados de DNJ que tienen sustituciones en el nitrógeno de anillo o carbono de anillo adyacente al nitrógeno como chaperonas farmacológicas específicas. Estas moléculas pueden unirse a proteínas mutadas Gaa que son inestables e inducirles a doblarse para crear una conformación molecular estable. Como resultado, Gaa progresa o trafica al lisosoma y tiene actividad hidrolítica contra glicógeno, de esta manera reduciendo la acumulación patológica en tejidos musculares asociada con esta enfermedad.
Definiciones Los términos usados en esta descripción tienen generalmente sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico en donde se usa cada término. Ciertos términos se describen abajo, o en cualquier otro lado de la descripción, para proporcionar una guía adicional al practicante en la descripción de las composiciones y métodos de la invención y cómo elaborarlos y usarlos. "Enfermedad de Pompe" , también conocida como deficiencia de ácido maltasa, enfermedad de almacenamiento de glicógenos tipo II (GSDII) y gicogenosis tipo II, es un trastorno de almacenamiento lisosómico genético caracterizado por mutaciones en el Gaa que metaboliza glicógenos. Según se usa en la presente, este término incluye los tipos infantil, juvenil y de inicio en adultez de la enfermedad. "Ácido a-glucosidasa (Gaa)" es una enzima lisosómica que hidroliza polímeros de D-glucosa alfa-1, 4- y alfa-1, 6-enlazados presentes en glicógeno, maltosa e isomaltosa. Los nombres alternativos son los siguientes: glucoamilasa; 1, 4-a-D-glucano glucohidrolasa; amiloglucosidasa; gama-amilasa y exo-1, 4 -a-glucosidasa, y gama-amilasa. El gen de Gaa ha sido mapeado al cromosoma 17q25.2-25.3 y tiene secuencias de nucleótidos y aminoácidos ilustradas en el Banco de Genes No. de Registro Y00839 (mostradas en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente) . Más de 70 mutaciones han sido asociadas con la enfermedad de Pompe. Las mutaciones que resultan en un doblez inadecuado o procesamiento inadecuado de la enzima Gaa incluyen T1064C (que cambia Leu en la posición 355 por Pro) y C2104T (que sustituye Arg 702 en Cys) (Montalvo et al., Mol . Genet Metab . 2004; 81 (3) : 203-8) . Además, Hermán et al. ( Human Muta tion 2004; 23: 47-56) describen una lista de mutaciones de Gaa que afectan la maduración y procesamiento de la enzima. Estas mutaciones incluyen Leu405Pro y Met519Thr. Se espera que el método de la presente invención sea útil para mutaciones que ocasionen un doblez inestable de a-glucosidasa en el ER. Según se usa en la presente, el término "chaperona farmacológica" o algunas veces "chaperona farmacológica específica" ("SPC") se refiere a una molécula que se une específicamente a Gaa y tiene uno o más de los siguientes efectos: (i) incrementar la formación de una conformación molecular estable de la proteína; (ii) incrementar la circulación adecuada de la proteína del ER a otra ubicación celular, de preferencia una ubicación celular nativa, es decir, evitando la degradación asociada con ER de la proteína; (iii) evitar la agregación de proteínas inestables conformacionalmente, es decir mal dobladas; (iv) restablecer y/o incrementar al menos parcialmente la función estabilidad y/o actividad tipo silvestre de la proteína y/o (v) mejorar el fenotipo o función de la célula que porta Gaa. Así, una chaperona farmacológica para Gaa es una molécula que se une a Gaa, dando como resultado un doblez, tráfico, no agregación y actividad adecuados de Gaa. Según se usa en la presente, este término no se refiere a chaperonas endógenas, tales como BiP, o a agentes no específicos que han demostrado actividad chaperona no específica contra varias proteínas, tales como glicerol, DMSO o agua deuterada, es decir, chaperonas químicas (véase Welch et al, Cell Stress and Chapreones 1996; 1 (2) : 109-115; Welch et al., Journal of Bioenergetics and Biomembranes 1997; 29 (5) : 491-502 ; patente de E.U.A. No. 5,800,360; patente de E.U.A. No. 6,270,954 y patente de E.U.A. No. 6,541,195). Incluye moléculas de unión específicas, por ejemplo, chaperonas específicas de sitio activo (ASSCs) , los cuales se unen en el sitio activo de la enzima, inhibidores o antagonistas y agonistas. Según se usa en la presente, el término "se une específicamente" se refiere a la interacción de una chaperona farmacológica con Gaa, específicamente, una interacción con residuos de aminoácido de Gaa que participan directamente en el contacto de la chaperona farmacológica. Una chaperona farmacológica se une específicamente a una proteína objetivo, por ejemplo, Gaa, para ejercer un efecto de chaperona en Gaa y no un grupo genérico de proteínas relacionadas o no relacionadas. Los residuos de aminoácido de Gaa que interactúan con cualquier chaperona farmacológica dada pueden o no estar dentro del "sitio activo" de la proteína. Como se describe abajo, el hexapéptido conservado WiDMNE en los residuos de aminoácido 512-520 se requieren para la actividad de la proteína Gaa (usando SEQ ID NO: 2 como una secuencia de referencia) . Además, Trp516 y Asp518 se requieren para actividad catalítica de Gaa (Hermans et al., J. Biol . . chem . 1991; 266:13507-12). La unión específica puede evaluarse a través de ensayos de unión de rutina o a través de estudios estructurales, es decir, co-cristalización, RMN y similares. En una modalidad no limitativa, la chaperona farmacológica es un inhibidor o antagonista de Gaa. En otra modalidad no limitativa, la chaperona farmacológica es un agonista de Gaa. En otra modalidad más, la chaperona farmacológica es un agonista/antagonista mixto. Según se usa en la presente, el término "antagonista" se refiere a cualquier molécula que se una a proteína y ya sea parcial o completamente bloquee, inhiba, reduzca o neutralice una actividad de Gaa. El término "agonista" se refiere a cualquier molécula que se una a una proteína e incrementa, mejora, restablece o imita al menos parcialmente una actividad de Gaa. Como se describe abajo, estas moléculas se conocen para Gaa. Según se usa en la presente, los términos "mejorar la estabilidad conformacional de Gaa" o "incrementar la estabilidad conformacional de Gaa" se refieren a incrementar la cantidad o proporción de Gaa que adopta una conformación funcional en una célula puesta en contacto con una chaperona farmacológica específica para Gaa, en relación a Gaa en una célula (de preferencia del mismo tipo o la misma célula, por ejemplo en un tiempo anterior) no puesto en contacto con la chaperona farmacológica específica para Gaa. En una modalidad, las células no expresan una Gaa mutante de conformación. En otra modalidad, las células sí expresan un polinucleótido Gaa mutante que codifica para un polipéptido, por ejemplo, un Gaa mutante conformacional. Según se usa en la presente, los términos "mejorar la circulación de Gaa" o "incrementar la circulación de Gaa" se refieren a incrementar la eficiencia del transporte de Gaa hacia el lisosoma en una célula puesta en contacto con el chaperona farmacológica específica para Gaa, en relación con la eficiencia del transporte de Gaa en una célula (de preferencia el mismo tipo de célula o la misma célula, por ejemplo, en un tiempo anterior) no puesto en contacto con la chaperona farmacológica específica para Gaa. Según se usa en la presente, los términos "mejorar la actividad de Gaa" o "incrementar la actividad de Gaa" se refieren a incrementar la actividad de Gaa, como se describe en la presente, en una célula puesta en contacto con una chaperona farmacológica específica para Gaa, en relación a la actividad de Gaa en una célula (de preferencia el mismo tipo de célula o la misma célula, por ejemplo, en un momento anterior) no puesta en contacto con la chaperona farmacológica específica para Gaa. Según se usa en la presente, los términos "mejorar el nivel de Gaa" o "incrementar el nivel de Gaa" se refiere a incrementar el nivel de Gaa en una célula puesta en contacto con una chaperona farmacológica específica para Gaa, en relación al nivel de Gaa en una célula (de preferencia el mismo tipo de célula o la misma célula, por ejemplo, en un momento anterior) no puesta en contacto con la chaperona farmacológica específica para Gaa. El término "estabilizar una conformación adecuada" se refiere a la capacidad de una chaperona farmacológica Gaa para inducir estabilizar una conformación de una proteína Gaa mutada que es funcionalmente idéntica a una conformación de la proteína Gaa tipo silvestre. El término "funcionalmente idéntico" significa que aunque pueden haber variaciones menores en la conformación (casi todas las proteínas exhiben cierta flexibilidad conformacional en su estado fisiológico) , la flexibilidad conformacional no da como resultado (1) agregación de proteínas, (2) eliminación a través de la vía de degradación asociada al retículo endoplásmico, (3) deterioro de la función de la proteína, por ejemplo, actividad Gaa, y/o (4) transporte inadecuado dentro de la célula, por ejemplo, ubicación hacia el lisosoma, o un mayor o menor grado que en el de la proteína tipo silvestre. El término "conformación molecular estable" se refiere a una conformación de una proteína, es decir, Gaa, inducida por una chaperona farmacológica, que proporciona al menos función tipo silvestre parcial en la célula. Por ejemplo, una conformación molecular estable de una Gaa mutante sería una en la que Gaa escapa del ER y se dirige al lisosoma como para una Gaa tipo silvestre, en lugar de doblarse erróneamente y ser degradada. Además, una conformación molecular estable de una Gaa mutada también puede poseer actividad Gaa completa o parcial, es decir, hidrólisis de a-1,4 y enlaces a-1,6 en glicógeno, maltosa e isomaltosa. Sin embargo, no es necesario que la conformación molecular estable tenga todos los atributos funcionales de la proteína tipo silvestre. El término "actividad tipo silvestre" se refiere a la función fisiológica normal de una Gaa en una célula. Por ejemplo, la actividad de Gaa incluye doblez y circulación del ER al lisosoma, con la capacidad concomitante para hidrolizar polímeros de D-glucosa a-1,4- y a-1, 6-enlazados presentes en glicógeno, maltosa e isomaltosa. El término "Gaa tipo silvestre" se refiere a las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO. 1) que codifican para Gaa, y de polipéptidos (SEQ ID NO: 2) codificadas por las secuencias de nucleótidos mencionadas arriba (Gaa humana Banco Genético No. de Registro Y00839, y a cualquier otra secuencia de nucleótidos que codifique para polipéptido Gaa (que tenga las mismas propiedades funcionales y afinidades de unión que las secuencias de polipéptidos mencionadas anteriormente) , tales como variantes alélicas en individuos normales, que tengan la capacidad de lograr una conformación funcional en el ER, logren una ubicación adecuada dentro de la célula y exhiban actividad tipo silvestre (por ejemplo, hidrólisis de glicógeno) . Según se usa en la presente el término "a-glucosidasa mutante" o "Gaa mutante" se refiere a un polipéptido de a-glucosidasa traducido de un gen que contiene una mutación genética que resulta en una secuencia de aminoácidos de a-glucosidasa alterada. En una modalidad, la mutación resulta en una proteína de a-glucosidasa que no logra una conformación nativa bajo las condiciones presentes normalmente en el ER, cuando se compara con la a-glucosidasa tipo silvestre o exhibe estabilidad o actividad reducida en comparación con a-glucosidasa tipo silvestre. Este tipo de mutación se conoce en la presente como "mutación conformacional", y la proteína que porte esta mutación es referida como un "mutante conformacional" . La falla en lograr esta conformación da como resultado que la proteína a-glucosidasa sea degradada o agregada, en lugar de ser transportada a través de una vía normal en el sistema de transporte de proteínas a su ubicación nativa en la célula o dentro del ambiente extracelular. En algunas modalidades, una mutación puede ocurrir en una parte no codificadora del gen que codifique para a-glucosidasa que dé como resultado una expresión menos eficiente de la proteína, por ejemplo, una mutación que afecte la eficiencia de transcripción, eficiencia de empalme, estabilidad de ARNm y similares. Al incrementar el nivel de expresión de tipo silvestre así como de variantes mutantes conformacionales de a-glucosidasa, la administración de una chaperona farmacológica de a-glucosidasa puede reducir un déficit dando como resultado y que resulte de esta ineficiente expresión de proteínas. Como alternativa, para mutantes de empalme o mutantes no de sentido que puedan acumularse en el ER, la capacidad de la chaperona para unirse y ayudar a los mutantes a salir del ER, sin restablecer la actividad de hidrolasa lisosómica, podría ser suficiente para disminuir ciertas patologías celulares en pacientes de Pompe, de esta manera mejorando los síntomas. Las mutaciones conformacionales ejemplares de Gaa incluyen las siguientes: D645E (Lin et al., Zhonghua Min Guo Xiao Er Ke Yi Xue Hui Za Zhi 1996 ; 37 (2) : 115-21) ; D645H (Lin et al, Biochem Biophys Res Commun . 1995 17 ; 208 (2) : 886-93) ; R224W, S619R y R660H (New et al. Pedia tr Neurol . 2003 ; 29 (4) : 284-7) ; T1064C y C2104T (Montalvo et al., Mol Genet Metab . 2004 ; 81 (3) : 203-8) ; D645N y L901Q (Cross et al., Neuromuscul Disord. 2004 ; 14 (6) : 371-4 ) ; G219R, E262K, M408V (Fernandez-Hojas et al., Neuromuscul Disord. 2002 ; 12 (2) : 159-66); G309R (Kroos et al., Clin Genet . 1998 ; 53 (5) : 379-82) ; D645N, G448S, R672W y R672Q y R672Q (Huie et al., Biochem Biophys Res Commun . 1998; 27 ; 244 (3 ) : 921-7) ; P545L (Hermans et al., Hum Mol . Genet . 1994 ; 3 (12) : 2213-8) ; C647W (Huie et al., Huie et al. Hum Mol Genet . 1994 ; 3 (7) : 1081-7) ; G643R (Hermans et al., Hum Muta t . 1993 ; 2 (4) : 268-73) ; M318T (Zhong et al., Am J Hum Genet . 1991; 49 (3) : 635-45) ; E521K (Hermans et al., Biochem Biophys Res Commun . 1991; 179 (2) : 919-26) ; W481R (Raben et al., Hum Muta t . 1999; 13 (1) : 83-4) ; y L552P y G549R (datos no publicados) . Los mutantes de empalme incluyen IVSIAS, T>G, -13 e IVS8+1G>A) . Los mutantes de Gaa adicionales han sido identificados y se conocen en la técnica. Los mutantes conformacionales son fácilmente identificables por alguien de capacidad ordinaria en la técnica. Las mutaciones que deterioran el doblez, y por consiguiente, la circulación de Gaa, pueden determinarse mediante ensayos de rutina bien conocidos en la técnica, tales como marcado metabólico de búsqueda de pulsos con y sin tratamiento de glicosidasa para determinar si la proteína entra en el aparato de Golgi, o inmunocoloración fluorescente para la coloración de Gaa dentro de la célula. Gaa tipo silvestre es secretada como un precursor de 110 kD que luego se convierte en el Gaa maduro de 76 kD por medio e intermedio de 95 kD. Esta funcionalidad puede probarse mediante cualquier medio conocido para establecer la funcionalidad de una proteína. Por ejemplo, ensayos usando substratos fluorescentes tales como 4-a-metilumbeliferil-D-glucopiranósido se pueden usar para determinar la actividad de Gaa. Estos ensayos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Hermans et al., arriba). Ciertas pruebas pueden evaluar los atributos de una proteína que puede o no corresponder a su actividad in vivo real, pero no obstante son sustitutos adecuados de funcionalidad de proteínas, y el comportamiento tipo silvestre en estas pruebas demuestra evidencia para soportar las técnicas de rescate o incremento de doblez de proteína de la invención. Una de estas actividades de acuerdo con la invención es el transporte adecuado de un Gaa funcional del retículo endoplásmico al lisosoma. In vi tro, por ejemplo, en una formulación, el compuesto de chaperona también puede asegurar que una proteína tipo silvestre mutada se pueda conservar en su forma nativa o adecuada. Este efecto puede manifestarse a su vez prácticamente a través de uno o más de (i) vida útil incrementada de la proteína, (es decir, para ERT) ; (ii) actividad más alta por unidad/cantidad de proteína o (iii) mayor eficacia in vivo . Se puede observar experimentalmente a través de un rendimiento incrementado del ER durante la expresión; mayor resistencia a desdoblamiento debido a incrementos en temperatura, o la presencia de agentes caotrópicos, y por medios similares.
Los términos "expresión endógena" y "expresado endógenamente" se refieren a la expresión fisiológica normal de Gaa en células en un individuo que no tenga o se sospeche que tenga una enfermedad o trastorno asociado con deficiencia de Gaa, sobre-expresión, u otro defecto, por ejemplo, enfermedad de Pompe, tal como una mutación en la secuencia de ácido nucleico o polipéptidos de Gaa que inhiba su expresión, actividad o estabilidad. Este término se refiere también a la expresión de Gaa en tipos de células en los cuales es normal que Gaa sea expresado y no incluye la expresión en células o tipos de células por ejemplo, tumores, en los cuales Gaa no sea expresado en individuos saludables . Según se usa en la presente, el término "eficiencia de transporte" se refiere a la capacidad de una proteína mutante para ser transportada fuera del retículo endoplásmico a su ubicación nativa dentro de la célula, membrana celular o dentro del ambiente extracelular. Un "inhibidor competitivo" de una enzima se puede referir a un compuesto que simule estructuralmente la estructura química y geometría molecular del substrato enzimático para unirse a la enzima aproximadamente en la misma ubicación que el substrato. Así, el inhibidor compite por el mismo sitio activo que la molécula de substrato, incrementando así la Km. La inhibición competitiva normalmente es reversible si suficientes moléculas de substrato están disponibles para desplazar el inhibidor, es decir, los inhibidores competitivos pueden unirse reversiblemente. Por lo tanto, la cantidad de inhibición de enzima depende de la concentración de inhibidor, concentración de substrato y de las afinidades relativas del inhibidor y substrato para el sitio activo. La inhibición competitiva no clásica ocurre cuando el inhibidor se une remotamente al sitio activo, creando un cambio de conformación en la enzima de tal forma que el substrato ya no pueda unirse a ésta. La inhibición competitiva no clásica, la unión del substrato en el sitio activo evita la unión del inhibidor en un sitio separado y viceversa. Esto incluye la inhibición alostérica. Un "inhibidor tipo mixto lineal" de una enzima es un tipo de inhibidor competitivo que permite que el substrato se una, pero reduce su afinidad, por lo que Km se incrementa y la Vmax se reduce . Un "inhibidor no competitivo" se refiere a un compuesto que forma fuertes enlaces con una enzima y podría no ser desplazado por la adición de substrato en exceso, es decir, los inhibidores no competitivos pueden ser irreversibles. Un inhibidor no competitivo puede unirse en, cerca o lejos del sitio activo de una enzima o proteína, y en relación con enzimas, no tiene efecto en la Km sino que reduce la Vmax. Una inhibición no competitiva se refiere a una situación en la cual el inhibidor se une sólo al complejo enzima-substrato (ES) . La enzima se vuelve inactiva cuando el inhibidor se une. Esto difiere de los inhibidores competitivos no clásicos que pueden unirse a la enzima en ausencia de substrato. El término "Vmax" se refiere a la velocidad inicial máxima de una reacción catalizada por enzimas, es decir, a niveles de substrato saturantes. El término "Km" es la concentración de substrato requerida para lograr Vmax. Un "incrementador" de enzimas es un compuesto que se une a Gaa e incrementa la velocidad de reacción enzimática. Los términos "dosis terapéuticamente efectiva" y "cantidad efectiva" se refieren a una cantidad suficiente para incrementar el procesamiento de proteínas en el ER (permitiendo una conformación funcional) , sin inhibir la proteína ya expresada en la ubicación celular adecuada (en el caso de un antagonista) , o sin inducir la internación de receptores mediada por ligandos de la proteína desde la ubicación celular adecuada (en el caso de un agonista) e incrementar la actividad de la proteína objetivo, dando como resultado entonces una respuesta terapéutica en el sujeto. Una respuesta terapéutica puede ser cualquier respuesta que un usuario (por ejemplo, un médico) reconozca como una respuesta efectiva a la terapia, incluyendo los síntomas descritos en la presente y conocidos en la técnica y cualquier marcador clínico sustituto. Así, una respuesta terapéutica generalmente será una reducción o inhibición de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno, por ejeraplo, enfermedad de Pompe, tales como aquellos conocidos en la técnica para la enfermedad o trastorno, por ejemplo, actividad Gaa reducida y debilidad de músculo progresiva. Se debe notar que una concentración del compuesto de chaperona que es inhibidor durante la producción, transportación o almacenamiento in vi tro de la proteína terapéutica purificada aún puede constituir una "cantidad efectiva" para los propósitos de esta invención debido a la dilución (y consecuente desplazamiento en unión debido al cambio en equilibrio) , biodisponibilidad y metabolismo de la chaperona luego de su administración in vivo . Un "respondedor" es un individuo diagnosticado con enfermedad de Pompe y tratado de acuerdo con el método actualmente reclamado que exhibe una mejora en, reducción o prevención de, uno o más síntomas clínicos, o mejora o reversión de uno o más marcadores clínicos que son indicadores de patología de enfermedad. Los síntomas o marcadores de la enfermedad de Pompe incluyen pero no están limitados a actividad de tejido esquelético Gaa reducida; cardiomiopatía; cardiomegalia; debilidad de músculo progresiva; hipotonía; raacroglosia; dificultad para tragar; succionar y alimentarse; insuficiencia respiratoria; hepatomegalia; laxidad de músculos faciales; arreflexia; intolerancia a ejercicio; dispnea ejercional; ortopnea; apnea del sueño; dolores de cabeza matutinos; somnolencia; lordosis y/o escoliosis; reflejos de tendón profundo reducidos; dolor de espalda inferior e insuficiencia para satisfacer metas motoras en desarrollo. El término "terapia de reemplazo de enzima" o "ERT" se refiere a la introducción de una enzima purificada y no nativa en un individuo que tenga deficiencia de esta enzima. La proteína administrada puede obtenerse de fuentes naturales o mediante expresión recombinante (como se describe en más detalle abajo) . El término se refiere también a la introducción de una enzima purificada en un individuo que de otra manera requiera o se beneficie de la administración de una enzima purificada, por ejemplo, que sufra de insuficiencia enzimática. La enzima introducida puede ser una enzima purificada y recombinante producida in vi tro, o proteína purificada a partir de tejido o fluido aislado, tal como, por ejeraplo, placenta o leche animal, o de plantas. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y que típicamente no producen reacciones desfavorables cuando se administran a un humano. De preferencia, según se usa en la presente, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del Gobierno Federal o Estatal o listada en la Farmacopea de E.U.A. u otra Farmacopea generalmente reconocida para usarse en animales y más particularmente en humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo para el cual se administre el compuesto. Estos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites. Soluciones salinas y solución de agua o acuosa y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se emplean de preferencia como vehículos, particularmente para soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martín, 18a edición u otras ediciones . El término "purificado" según se usa en la presente se refiere a un material, tal como un ácido nucleico o polipéptido de Gaa, que ha sido aislado bajo condiciones que reducen o eliminan materiales no relacionados, es decir, contaminantes. Por ejemplo, una proteína purificada está de preferencia sustancialmente libre de otras proteínas o ácidos nucleicos con los cuales está asociada en una célula. Según se usa en la presente, el término "sustancialmente libre" se usa operativamente, en el contexto de prueba analítica del material. De preferencia, el material purificado sustancialmente libre de contaminantes es al menos 50% puro; muy preferiblemente, al menos 90% puro y más preferiblemente aún por lo menos 99% puro. La pureza puede evaluarse mediante medios convencionales, por ejemplo, cromatografía, electroforesis en gel, inmunoensayo, análisis de composición, ensayo biológico y otros métodos conocidos en la técnica. Los términos "alrededor de" y "aproximadamente" generalmente significarán un grado aceptable de error para la cantidad medida dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Típicamente, los grados ejemplares de error están dentro de 20 por ciento (%) , de preferencia 10% y muy preferiblemente dentro de 5% de un valor o escala de valores dado. Como alternativa, y particularmente en sistemas biológicos, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" pueden significar valores que estén dentro de un orden de magnitud, de preferencia dentro de 5 veces y muy preferiblemente dentro de 2 veces de un valor dado. Las cantidades numéricas dadas en la presente son aproximadas a menos que se indique lo contrario, significando que el término "alrededor de" y "aproximadamente" puede inferirse cuando no se indique expresamente .
Definiciones químicas El término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo de C?-C20 lineal o ramificado que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene instauración, y el cual está unido al resto de la molécula por un solo enlace, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo (isopropilo), n-butilo, n-pentilo, 1,1-dimetiletilo (t-butilo). Los alquilos usados en la presente son de preferencia alquilos de C?-C8. El término "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático de C2-C20 que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono y el cual puede ser lineal o de cadena ramificada, por ejemplo, etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo (alilo) , iso-propenilo, 2-metil-l-propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo. El término "cicloalquilo" indica un sistema de anillo de hidrocarburo mono- o multicíclico insaturado y no aromático tal como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciciohexilo. Ejemplos de grupos cicloalquilo multicíclicos incluyen perhidronaftilo, adamantilo y grupos norbornilo grupos cíclicos puenteados o grupos espirobicíclicos, por ejemplo, espiro (4 , 4) non-2 -ilo. El término "cicloalquilalquilo" se refiere a un cicloalquilo como el definido arriba unido directamente a un grupo alquilo como el definido arriba, que da como resultado la creación de una estructura estable tal como ciclopropilmetilo, ciclobutiletilo, ciclopentiletilo . El término "éter alquílico" se refiere a un grupo alquilo o grupo cicloalquilo como el definido arriba que tiene por lo menos un oxígeno incorporado en la cadena alquilo, por ejemplo, éter etílico metílico, éter dietílico, tetrahidrofurano . El término "alquilamina" se refiere a un grupo alquilo o un grupo cicloalquilo como el definido arriba que tiene por lo menos un átomo de nitrógeno, por ejemplo, n-butilamina y tetrahidrooxazina. El término "arilo" se refiere a radicales aromáticos que tienen en la escala de aproximadamente 6 a alrededor de 14 átomos de carbono tales como fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo y bifenilo. El término "arilalquilo" se refiere a un grupo arilo como el definido arriba unido directamente a un grupo alquilo como el definido arriba, por ejemplo, -CH2C6H5 y -C2H C6H5. El término "heterocíclico" se refiere a un radical de anillo de 3 a 15 miembros estable que consiste en átomos de carbono y de 1 a 5 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, fósforo, oxígeno y azufre. Para los propósitos de esta invención, el radical anillo heterocíclico puede ser un sistema de anillo monocíclico, bicíclico o tricíclico, el cual puede incluir sistemas de anillo fusionados, puenteados o espiro, y el nitrógeno, fósforo, carbono, oxígeno o átomos de azufre en el radical de anillo heterocíclico puede ser opcionalmente oxidado a varios estados de oxidación. Además, el átomo de nitrógeno puede ser opcionalmente cuaternizado y el radical de anillo puede ser parcial o completamente saturado (es decir, heteroaromático o heteroaril aromático) . Ejemplos de estos radicales de anillo heterocíclicos incluyen, pero no están limitados a, azetidinilo, acridinilo, benzodioxolilo, benzodioxanilo, benzofuronilo, carbazolilo, cinolinilo, dioxolanilo, indalizinilo, naftiridinilo, perhidroazepinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piridilo, pteridinilo, purinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, tetrazolilo, imidazolilo, tetrahidroisoquinolilo, piperidinilo, piperazinilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 2-oxopirrolidinilo, 2-oxoazepinilo, azepinilo, pirrolilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, oxazolilo, oxazolinilo, oxasolidinilo, triazolilo, indanilo, isoxazolilo, isoxasolidinilo, morfolinilo, tiazolilo, tiazolinilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, quinuclidinilo, isotiazolidinilo, indolilo, isoindolilo, indolinilo, isoindolinilo, octahidroindolilo, octahidroisoindolilo, quinolilo, isoquinolilo, decahidroisoquinolilo, bencimidazolilo, tiadiazolilo, benzopiranilo, benzotiazolilo, benzooxazolilo, furilo, tetrahidrofurtilo, tetrahidropiranilo, tienilo, benzotienilo, tiamorfolinilo, sulfóxido de tiamorfolinilo, tiamorfolinilsulfona, dioxafosfolanilo, oxadiazolilo, cromanilo e isocromanilo. El radical de anillo heterocíclico puede ser unido a la estructura principal en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que resulte en la creación de una estructura estable. El término "heteroarilo" se refiere a un anillo heterocíclico en el que el anillo es aromático. El término "heteroarilalquilo" se refiere a un radical de anillo heteroarilo como el definido arriba unido directamente a un grupo alquilo. El radical heteroarilalquilo puede ser unido a la estructura principal en cualquier átomo de carbono del grupo alquilo que resulte en la creación de una estructura estable. El término "heterociclilo se refiere a un radical de anillo heterocílico como el definido arriba. El radical de anillo heterocíclico puede ser unido a la estructura principal en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado la creación de una estructura estable. El término "heterociclilalquilo" se refiere a un radical de anillo heterocíclico como el definido arriba unido directamente al grupo alquilo. El radical heterocicloalquilo puede ser unido a la estructura principal en el átomo de carbono en el grupo alquilo que resulte en la creación de una estructura estable. Los sustituyentes en el 'alquilo sustituido', 'alquenilo sustituido', 'alquinilo sustituido', 'cicloalquilo sustituido', 'cicloalquilalquilo sustituido', 'cicloalquenilo sustituido' , arilalquilo sustituido' , 'arilo sustituido' , 'anillo heterocíclico sustituido' , 'anilloheteroarilo sustituido' , 'heteroarilalquilo sustituido' o 'anillo heterociclilalquilo sustituido' , pueden ser los mismos o diferentes con uno o más seleccionados de los grupos de hidrógeno, hidroxi, halógeno, carboxilo, ciano, amino, nitro, oxo (=0), tio )=S) o grupos opcionalmente sustituidos seleccionados de alquilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, arilo, arilalquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, anillo heterocíclico, -C00Rx, -C(0)Rx, C(S)RX, -C(0)NR*Ry, -NRxC0NRyRz, -N(Rx)SORy, -N(Rx)S02Ry, - (=N-N(Rx)Ry), -NRxC(0)0Ry, -NRxRy, -NRxC(0)Ry-, -NRxC(S)Ry, NRxC(S)NRyRz, -S0NRxRy, -S02NRxRy-, -0RX, -0RxC (0) NRyRz , 0RxC(0)0Ry-, -0C(0)Rx, -0C(0)NRxRy, -RxNRyRz, -RxNRyRz, -RxRyRz, -RXCF3, -SRX, -S0Rx, -S02Rx, -0N02, en donde Rx, Ry y Rz en cada uno de los grupos anteriores puede ser un átomo de hidrógeno, grupo alquilo sustituido o no sustituido, haloalquilo, arilalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido o cicloalquilo no sustituido o anillo heterocíclico sustituido o no sustituido, heterociclilalquilo sustituido o no sustituido, heteroarilo no sustituido o sustituido o heteroarilalquilo sustituido o no sustituido.
El término "halógeno" se refiere a radicales de flúor, cloro, bromo y yodo.
DNJ y derivados de DNJ Se ha encontrado que los derivados de 1-desoxinoj irimicina (compuesto 1, DNJ; 1, 5-imino-1, 5-didesoxi-D-glucitol-CAS No. 19130-96-2) son útiles para tratar la enfermedad de Pompe. DNJ tiene la fórmula molecular C6H?3N04 y un peso molecular de 163.2. DNJ se describe en la patente de E.U.A. 4,806,650 a Schroder et al., y tiene la siguiente estructura: Los derivados de DNJ útiles en la presente invención pueden describirse por la fórmula: en donde Ri es H o un alquilo, alquenilo, éter alquílico o alquilamina lineal o ramificado que contiene 1-12 átomos de carbono, alquilarilo, heteroarilo o heteroarilalquilo que contiene 5-12 átomos de anillo, en donde Rx es sustituido opcionalmente con uno o más de -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -C(=0)N- (alquilo) 2 (es decir, -O-C (=0)N- (Me) 2) y R2 es H; un alquilo, cicloalquilo, alquenilo o éter alquílico lineal o ramificado, que contiene 1-9 átomos de carbono o arilo que contiene 5-12 átomos de carbono, en donde R2 es sustituido opcionalmente con -OH, -COOH, -CF3, -OCF3 o un anillo heterocíclico . Por lo menos uno de Ri y R2 no es H. Los derivados de DNJ preferidos incluyen derivados N-alquilo que tienen 1-12 átomos de carbono. De manera muy preferida, estos derivados son compuestos de cadena recta, ramificados o cíclicos que tienen 1-9 átomos de carbono. Los compuestos ejemplares incluyen, pero no están limitados a N-metil-DNJ (2) , N-etil-DNJ (3) , N-propil-DNJ (4) , N-buti-DNJ (5) , N-pentil-DNJ (6) , N-hexil-DNJ (7) , N-heptil-DNJ (8) , N-octil-DNJ (9) , N-nonil-DNJ, (10) , N-metilciclopropil-DNJ (11) y N-metilciclopentil-DNJ (12) .
Un derivado de alquil DNJ que se prefiere es N-metil-1-desoxinoj irimicina (compuesto 2, N-metil DNJ; N-metilmoranolina, 1, 5- (metilimino) -1, 5-didesoxi-D-glucitol) es un análogo de glucosa sintético que está disponible comercialmente de Toronto Research Chemicals, Número de Cat. M297000, CAS 69567-1-08. N-metil DNJ reduce la velocidad glicogenolítica al inhibir la a-1, 6-glucosidasa de la enzima de desramificación de glicógenos en el hígado, y posee una acción antihiperglucémica al bloquear a-1, 4-glucosidasa (Aral M et al., Circula tion . 1998Apr 7; 97 (13) : 1290-7) . Otro derivado de alquil DNJ que se prefiere es N- nonil-desoxinoj irimicina (Compuesto 10, N-nonil DNJ; 1,5- (nonilimino) -1, 5-didesoxi-D-glucitol) , un análogo de glucosa sintético que es útil para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher (una enfermedad de almacenamiento lisosómico caracterizada por acumulación de glicolípidos) . (Sawkar AR, et al., Proc Na ti Acad Sci USA 2002 ; 26 ; 99 (24) : 15428-33) . Los derivados de alquil DNJ que tienen un sustituyente tal como un -OH, -COOH u OCF3 también son compuestos que se prefieren. Los derivados de alquil DNJ sustituidos ejemplares incluyen, pero no están limitados: Un derivado de DNJ que se prefiere es N-2- hidroxietil-desoxinoj irimicina (compuesto 13, N-etoxi DNJ; 1,5- (2-hidroxietilimino) -1, 5-didesoxi-D-glucitol ; miglitol) , un análogo de glucosa sintético usado para tratar diabetes mellitus tipo 2. Drent et al. Diabetes Nutr Metab . 2002;15 (3) : 152-9; de Luis Román DA, Rev Clin Esp . 2004 Ene; 204 (1) :32-4. Otro derivado de DNJ que se prefiere es 5-N- carboxipentil desoxinoj irimicina (compuesto 14, 5-N-carboxipentil DNJ; 1, 5- (5-N-carboxipentilimino) -1, 5-didesoxi-D-glucitol) . Este análogo de glucosa sintético puede ser sintetizado por la ruta descrita por Bernotas RC, et al., Biochem J. 1990 Sep 1; 270 (2) : 539-40. Los derivados de DNJ adicionales son los derivados de éter alquílico tales como los compuestos: Otros compuestos preferidos incluyen derivados tales como los derivados de DNJ sustituidos con N-bencilo representados por las fórmulas: Otros compuestos preferidos incluyen derivados tales como los derivados de DNJ sustituidos con N-CH2-Ar representados por las fórmulas, en donde Ar es un heterociclo aromático: Además de los derivados de DNJ sustituidos con nitrógeno, derivados de DNJ que tienen un sustituyente anexo en el carbono C-l adyacente al nitrógeno de anillo también son compuestos preferidos de la presente invención. Estos compuestos incluyen pero no están limitados a: HO,,, Donde los análogos de hidrocarburo de cadena recta incluyen pero no están limitados a 1-12 átomos de carbono y R incluye pero no está limitado a: alquilo ramificado, cicloalquilo o alquilo sustituido opcionalmente con -OH, COOH, -CF3, -NHR, NHCOR' o un anillo aromático o heterocíclico, en donde R' es un grupo alquilo.
Donde HET es un grupo heterocíclico tal como tetrahidrofurano, piridina, furano, pirrol, imidazol, triazol, tetrazol, oxazol, tiazol y los análogos benzo anexos, etc., Ar es fenilo o fenilo sustituido. Los sustituyentes fenilo pueden consistir en G el cual es un grupo funcional (por ejemplo, CH3, Cl, F o CH2-0-CF3) y n es un entero entre 0 y 5.
Síntesis de los derivados de DNJ Los compuestos de la presente invención que tienen una sustitución en Rx pueden ser sintetizados de DNJ como se describe en: EP 49858, WO2005/063706, U.S. 4,639,436; WO 2004/037373; WO 95/22975; U.S. 5,399,567; US 5,310,745; Bols et al., Journal of Carbohidra te Chemistry 2004 23(4), 223-238, Sawker et al. Chemistry and Biology, 2005; 12, 1235-1244, Overkleef, Journal of Biological Chemistry, 2005; 273(41), 26522-26527; Tan et al., Journal of Biological Chemistry 1991, 266(22), 14504-14510; Romaniouk et al., Glycobiology, 2004; 14(4), 301-310; Lesur, Bioorganic and Medicinal Chemistry Leters 1997; 7(3), 355-360; Yoshikuni , Agrie Biol . Chem 1998; 52(1), 121), y mediante modificaciones conocidas de estos métodos. Los compuestos de la presente invención que tienen una sustitución en R2 pueden ser sintetizados de DNJ como se describe en: Anzeveno, et al., J. Org. Chem . 1989; 54(11), 2539; WO 00/56713; US 4,880,917; EP 0315017 y US 5,051,407 y por Boshagen et al., Angewan te Chemie, Int. Ed. Engl. 1981; 20(9), 806-807, y por métodos adicionales que han sido reportados y modificaciones conocidas de estos métodos se demuestran en WO00/56713, US 5,051,407 y EP 0315017. Otro enfoque para la síntesis de estas moléculas ha sido reportado por Davis en Angewante Chemie, Int. Ed. Engl. 2003; 42,3788-3792. Los compuestos de la presente invención también pueden ser sintetizados a partir de tetra-Obn gluconolactona.
Esta síntesis puede adaptarse a partir de las síntesis descritas en: Perrine et al., J. Org. Chem . 1967; 32, 664; Matos, Lopes & Sopes, Syn thesis 1999; 4, 571; Rao & Perlin; Can . J. Chem . 1981; 59, 333; Hoos, Naughton y Vasella, Helv. Chim . Acta , 1993; 76, 1802 y Baxter & Reitz, J. Org. Chem . 1994; 59, 3175. Un enfoque semi-sintético también se puede usar para formar los derivados de DNJ de la presente invención. Esta ruta enzimática usa Gl uconoba cter oxydans , y puede adaptarse a partir de los métodos descritos en: US 4,266,025; US 5,695,969; US 4,246,345; US 4,806,650; 0430307; y Kinast & Schedel; Angew Chem . In t . Ed. Engl., 20, 805 (1981) . Algunos compuestos útiles en la presente invención pueden comprarse, por ejemplo, los siguientes compuestos se compraron de Toronto Research Chemicals: 1-desoxinoj irimicina (Cat. No. D245000) , clorhidrato de 1-desoxinoj irimicina (Cat. No. D245005) , N-butil-1-desoxinoj irimicina (cat. No. B691000, CAS [21011-90-0] ) , Miglitol (cat. No. M344200, CAS [72432-03-2] ) , N-metil-1-desoxinoj irimicina (cat. No. 297000, CAS [69567-1-8] , N-5-carboxipentil-1-desoxinojirimicina (cat. No. C181200) , N- (5-adamantan- 1-il-metoxi) -pentil-1-desoxinoj irimicina (cat. No. A21000) ; a-homonoj irimicina se compró de TCI America (Cat. No. H1144, CAS 119557-99-2).
Un listado no limitativo de los compuestos que pueden usarse en la presente invención incluyen: DNJ, N-butil DNJ, N- (ciclopropil) metil DNJ, N-2- (tetrahidrofuran) metil DNJ, éter N-2-oxoetil DNJ trifluoroetílico / N- (2- (2,2,2-trifluoroetoxi) etil DNJ, carbamato de N-etiloxi DNJ dimetilo / N- (2- (N,N-dimetilamido)etiloxi) DNJ, N-metil-DNJ, 2-metoxietil DNJ, 2-etoxietil DNJ, 4-trifluorometil . -bencil DNJ, a-ciano-4-trifluorometil-bencil DNJ, 4-pentoxibencil DNJ, 4-butoxibencil DNJ, 4-t-BOC-piperidinilmetil DNJ, a-C6-n-nonil-DNJ y a-homo-DNJ. El incremento porcentual en relación a 1 mM de DNJ en el cual se observa un incremento máximo de la mitad, se da para estos compuestos en las tablas 1 y 2 abajo (ejemplo 2) . Compuestos adicionales contemplados para usarse en esta invención incluyen N-nonil DNJ (10) ; miglitol (13) ; N-5-carboxi-pentil-1-DNJ (14) ; metil-2-benzofuranil DNJ (30) ; metil-2-benzotiafenil DNJ (31) ; a-C6-n-butil-DNJ (33) ; metil-2-furanil DNJ (29) ; N-n-hexil DNJ (7) ; N-etil DNJ (3) ; N-n-propil DNJ (4); N-n-pentil DNJ (6); y ß-C6-bencil-DNJ (36); 2- (N- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-il) -N-meilamino) etil) -DNJ (28); y N-2- (N-metil-N-metilendioxifenilamino) etil-DNJ (37) .
Ensayos de actividad y ubicación La actividad, estabilidad y/o circulación incrementada de Gaa pueden determinarse al medir un incremento en polipéptido Gaa celular, al determinar un incremento en la circulación al lisosoma, por ejemplo, o al determinar una actividad o estabilidad de Gaa incrementada. Los métodos ejemplares no limitativos para evaluar cada uno de los anteriores se describen a continuación.
Determinación de la expresión intracelular de Gaa .
Los métodos para determinar los niveles de proteína LPL intracelular se conocen en la técnica. Estos métodos incluyen Western blotting, inmunoprecipitación seguida por Western blotting (IP Western) o inmunofluorescencia usando una proteína LPL marcada.
Determinación de la circulación de Gaa. Evaluar la circulación de proteínas a través de la vía biosintética puede lograrse, por ejemplo, usando experimentos de búsqueda de pulso con proteína receptora 35S-marcada, en conjunto con glicosidasas; o, preferiblemente, mediante inmunofluorescencia indirecta o directa para determinar la modificación de la proteína durante la circulación. Estos y otros métodos se describen por ejemplo en Current Protocols in Cell Biology 2001; John Wiley & Sons. Los experimentos de inmunofluorescencia ejemplares para detectar la circulación lisosómica de Gaa se describen en detalle en los ejemplos 3 y 4 abajo.
Otros métodos para detectar la circulación deteriorada de proteínas se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, para proteínas las cuales sean N- y/u O-glicosiladas en el aparato de Golgi, el marcado metabólico de búsqueda de pulso usando proteínas marcadas radiactivamente, combinado con el tratamiento de glicosidasa e inmunoprecipitación, se pueden usar para detectar si las proteínas están sufriendo glicosilación completa en el aparato de Golgi, o si están siendo retenidas en el ER en lugar de circular al aparato de Golgi para glicosilación adicional. Los métodos sensibles para detectar visualmente la ubicación celular también incluyen microscopía fluorescente incluyendo proteínas fluorescentes o anticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, las proteínas LPL de interés pueden marcarse con por ejemplo proteína fluorescente verde (GFP) , proteína fluorescente cian, proteína fluorescente amarilla y proteína fluorescente roja, seguidas por la microscopía de varios colores y de transcurrido de tiempo y microscopía electrónica para estudiar el destino de estas proteínas en células fijas y en células vivas. Para una revisión del uso de la formación de imágenes fluorescente en la circulación de proteínas, véase Watson et al., Adv Drug Deliv Rev 2005; 57(1) :43-61. Para una descripción del uso de microscopía confocal para la co-localización intracelular de proteínas, véase Miyashita et al., Methods Mol Biol . . 2004; 261:399-410. La espectroscopia por correlación de fluorescencia (FCS) es un método de detección ultrasensible y no invasivo capaz de la resolución de una sola molécula y en tiempo real (Vukojevic et al., Cel l Mol Life Sci 2005; 62(5): 535-50). SPFI (formación de imágenes por fluorescencia de una sola partícula) usa la alta sensibilidad de la fluorescencia para visualizar moléculas individuales que hayan sido marcadas selectivamente con partículas fluorescentes pequeñas (Cherry et al., Biochem Soc Trans 2003; 31(Pt 5):1028-31). Para una revisión de la formación de imágenes de células vivas, véase Harigchi, Cell Struct Funct 2002; 27 ( 5) : 333 -4 ) . La microscopía por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) también se usa para estudiar la estructura y ubicación de proteínas bajo condiciones fisiológicas (Periasamy, J Biomed Opt 2001; 6(3): 287-91) .
Determinación de un incremento en la actividad Gaa.
In vi tro, la actividad de Gaa puede determinarse como se describe abajo en el ejemplo 2. La actividad de Gaa puede determinarse in vivo después del tratamiento con chaperonas farmacológicas usando linfocitos mixtos como se describe en Okumiya et al., Mol Genet Metab . 2006 May; 88 (1) : 22-8. El método emplea glicógeno y 4-metilumbeliferil-alfa-d-glucopiranósido (4MU-alfaGlc) como substratos para medir la actividad de ácido a-glucosidasa lisosómica, e incorpora acarbosa para eliminar la interferencia de a-glucosidasas no relacionadas (predominantemente maltasa-glucoamilasa) .
Formulación, dosificación y administración En una modalidad, el compuesto de chaperona se administra como monoterapia, de preferencia en una forma de dosis oral (descrita más abajo) , aunque se contemplan otras formas de dosis. En esta modalidad, se contempla que el régimen de dosificación debe ser uno que proporcione un nivel constante y en estado fijo del compuesto en el plasma del paciente de Pompe. Esto se puede obtener ya sea mediante la administración diaria en dosis divididas, o formulaciones de liberación controlada, o administración menos frecuente de formas de dosis de liberación prolongada. Las formulaciones, dosificación y rutas de administración para el compuesto de chaperona se detallan abajo.
Formulaciones En una modalidad de la invención, el compuesto de chaperona se administra como una monoterapia, y puede estar en una forma adecuada para cualquier ruta de administración, incluyendo, por ejemplo, oralmente en forma de tabletas o cápsulas o líquido, en solución acuosa estéril para inyección, o en un polvo liofilizado en seco que será añadido a la formulación del Gaa de reemplazo (véase abajo) durante o inmediatamente después de su reconstitución para evitar la agregación enzimática in vi tro antes de la administración. Cuando el compuesto de chaperona es formulado para administración oral, las tabletas o cápsulas pueden prepararse mediante medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa) , rellenos (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio) ; lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice) ; desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o glicolato de almidón de sodio) o agentes humectantes (por ejemplo, larilsulfato de sodio) . Las tabletas pueden ser recubiertas mediante métodos conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tener la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de usarse. Estas preparaciones líquidas pueden prepararse mediante métodos convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, sorbitol, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas) , agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia) ; vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, esteres aceitosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) y conservadores (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico) . Las preparaciones también pueden contener sales reguladoras de pH, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes según sea adecuado. Las preparaciones para administración oral pueden formularse adecuadamente para dar la liberación controlada del compuesto de chaperona activo. ZAVESCA , un compuesto de chaperona contemplado para usarse en el método de la presente invención, está disponible comercialmente como cápsulas de gelatina dura, cada una conteniendo 100 mg de DNJ, glicolato de almidón de sodio, povidona (K30) y estearato de magnesio. La cubierta de la cápsula incluye gelatina y dióxido de titanio. Las formulaciones farmacéuticas del compuesto de chaperona adecuado para uso parenteral/inyectable generalmente incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) , o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida al grado de que exista capacidad de inyección. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos . El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol, y similares) , mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada puede conservarse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento de tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de agentes tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede ocasionarse por medio de varios agentes antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, alcohol bencílico, ácido sórbico y similares. En muchos casos, será razonable incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ocasionarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se preparan al incorporar el Gaa purificado y el compuesto de chaperona en la cantidad requerida en el solvente adecuado con varios de los demás ingredientes enumerados arriba, según se requiera, seguida por la esterilización en filtro o terminal. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar los diferentes ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos enumerados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución estérilmente filtrada previamente del mismo. La formulación puede contener un excipiente. Los excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden incluirse en la formulación son reguladores de pH tal como regulador de pH de citrato, regulador de pH de fosfato, regulador de pH de acetato y regulador de pH de bicarbonato, aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos; proteínas, tales como albúmina de suero, colágeno y gelatina; sales tales como EDTA o EGTA, y cloruro de sodio; liposomas; polivinilpirrolidona; azúcares, tales como dextrano, manitol, sorbitol y glicerol; propilenglicol y polietilenglicol (por ejemplo, PEG-4000, PEG-6000) ; glicerol; glicina u otros aminoácidos y lípidos. Los sistemas reguladores de pH para usarse con las formulaciones incluyen reguladores de pH de citrato; acetato; bicarbonato y fosfato. El regulador de pH de fosfato es una modalidad preferida. La formulación puede contener también un detergente no iónico. Los detergentes no iónicos preferidos incluyen Polisorbato 20, Polisorbato 80, Tritón X-100, Tritón X-114, Nonidet P-40, a-glucósido de octilo, ß-glucósido de octilo, Brij 35, Pluronic y Tween 20.
Administración La ruta de administración del compuesto de chaperona puede ser oral (de preferencia) o parenteral, incluyendo intravenosa, subcutánea, intraarterial, intraperitoneal, oftálmica, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intradérmica, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intrapulmonar, intranasal, transmucosal, transdérmica o mediante inhalación. La administración de las formulaciones parenterales descritas arriba del compuesto de chaperona puede ser mediante inyecciones periódicas de un bolo de la preparación, o se pueden administrar mediante administración intravenosa o intraperitoneal a partir de un depósito que sea externo (por ejemplo, una bolsa i.v.) o interno (por ejemplo, un implante bioerosionable) . Véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 4,407,957 y 5,798,113, cada una incorporada en la presente a manera de referencia. Los métodos de suministro intrapulmonar y aparato se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 5,654,007, 5,780,014 y 5,814,607, cada una incorporada en la presente a manera de referencia. Otros sistemas de suministro parenteral útiles incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, suministro de bomba, suministro de células encapsuladas, suministro liposómico, inyección suministrada por aguja, inyección sin aguja, nebulizador, aerosolizador, electroporación y parche transdérmico. Los dispositivos inyectores sin aguja se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,879,327; 5,520,639; 5,846,233 y 5,704,911, cuyas especificaciones se incorporan en la presente a manera de referencia. Cualquiera de las formulaciones descritas arriba puede administrarse usando estos métodos. Las inyecciones subcutáneas tienen las ventajas de permitir la auto-administración, mientras que también dan como resultado una vida media en plasma prolongada en comparación con la administración intravenosa. Además, una variedad de dispositivos diseñados para conveniencia del paciente, tales como plumas de inyección rellenables y dispositivos de inyección sin aguja, pueden usarse con las formulaciones de la presente invención como se describe en la presente.
Dosificación La cantidad de compuesto de chaperona efectiva para rescatar la Gaa mutante endógena (y/o estabilizar la Gaa purificada administrada -véase la sección de terapia de combinación abajo) se puede determinar sobre una base por caso por aquellos expertos en la técnica. La farmacocinética y farmacodinámica tales como vida media (t?/2) , concentración en plasma pico (Cmax) , tiempo para concentración en plasma pico (tmax) , exposición medida por área bajo la curva (AUC) , y distribución tisular de la proteína de reemplazo y el compuesto de chaperona, así como datos para la unión de Gaa a reemplazo/chaperona (constantes de afinidad, constantes de asociación y disociación y valencia) pueden obtenerse usando métodos ordinarios conocidos en la técnica para determinar cantidades compatibles requeridas para estabilizar la proteína de reemplazo, sin inhibir su actividad, y conferir así un efecto terapéutico. Los datos obtenidos de ensayos de cultivo de células o estudios con animales se pueden usar para formular una escala de dosis terapéutica para usarse en humanos y animales no humanos. La dosis de compuestos usada en los métodos terapéuticos de la presente invención se encentra de preferencia dentro de una escala de concentraciones circulantes que incluye la concentración ED50 (efectiva para 50% de la población probada) pero con poca o ninguna toxicidad. La dosificación particular usada en cualquier tratamiento puede variar dentro de esta escala, dependiendo de factores tales como la forma de dosis particular empleada, la ruta de administración utilizada, las condiciones del individuo (por ejemplo paciente) y así sucesivamente. Una dosis terapéuticamente efectiva puede calcularse inicialmente a partir de ensayos de cultivo de células y formularse en modelos de animales para lograr una escala de concentraciones circulantes que incluya la CI50. La concentración IC50 de un compuesto es la concentración que logra una inhibición media máxima de los síntomas (por ejemplo, determinada a partir de ensayos de cultivo de células) . Las dosis adecuadas para usarse en un individuo particular, por ejemplo en pacientes humanos, pueden entonces determinarse de manera más precisa usando esta información. Las medidas de compuestos en plasma pueden medirse de rutina en un individuo tal como un paciente mediante técnicas tales como cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía de gas. La toxicidad y eficacia terapéutica de la composición puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares, por ejemplo en ensayos de cultivo de células o usando animales experimentales para determinar la LD50 y la ED50. Los parámetros LD50 y ED50 son como se conoce en la técnica, y se refieren a las dosis de un compuesto que son letales para el 50% de una población y terapéuticamente efectivas en 50% de una población, respectivamente. La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es conocida como el índice terapéutico y se puede expresar como la relación: LD5o/ED5o. Los compuestos de chaperonas que exhiben grandes índices terapéuticos se prefieren. Como un régimen de dosificación ejemplar, N-butil-DNJ (ZAVESCA ) se administra para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher en dosis orales de 100 a 300 mg al día en dosis divididas (dos a tres veces al día) . Después de la administración de 100 mg, la tmax que varía de 2 a 2.5 horas en pacientes de Gaucher. La vida media de ZAVESCA es de aproximadamente 6 a 7 horas, lo cual predice que el estado fijo se logrará de 1.5 a 2 días luego de tres veces de dosificación diaria. No hay evidencia de que ZAVESCA se metabolice en humanos . Para actividad chaperona óptima de Gaa, se espera que dosis más bajas de los derivados de DNJ que aquellas requeridas para inhibir la síntesis de glicolípidos serán efectivas. Por ejemplo, dosis de entre 5 y 150 mg/día, particularmente entre 5-75 mg/día se prefieren para los derivados de DNJ que tienen actividad de incremento de Gaa más alta. Algunos derivados de DNJ pueden requerir de dosis ligeramente más altas debido a una actividad de incremento de Gaa reducida. Las concentraciones óptimas del compuesto de chaperona se determinarán de acuerdo con la cantidad requerida para estabilizar e inducir una conformación adecuada de la proteína recombinante in vivo, en tejido o circulación, sin evitar su actividad, biodisponibilidad del compuesto de chaperona en tejido o circulación, y el metabolismo del compuesto de chaperona en tejido o circulación. Por ejemplo, cuando el compuesto de chaperona es inhibidor de enzimas, la concentración del inhibidor de enzimas puede determinarse al calcular el valor IC50 de la chaperona específica para la enzima. Tomando en consideración la biodisponibilidad y metabolismo del compuesto, concentraciones alrededor del valor IC50 o ligeramente arriba del valor IC50 pueden ser entonces evaluadas con base en los efectos en la actividad enzimática, por ejemplo, la cantidad de inhibidor requerida para incrementar la cantidad de actividad enzimática o prolongar la actividad enzimática de la enzima administrada. Como un ejemplo, el valor IC50 del compuesto desoxigalactonojiromicina (DGJ) para la enzima a-Gal A es 0.04 µM, indicando que DGJ es un potente inhibidor. En consecuencia, se espera que la concentración intracelular de a-Gal A será mucho más baja que aquella del a-Gal A administrado.
Terapia de combinación con terapia de reemplazo de enzimas La terapia de reemplazo de enzimas incrementa la cantidad de proteína al introducir exógenamente enzima biológicamente funcional o tipo silvestre por medio de infusión. Esta terapia ha sido desarrollada para muchos trastornos genéticos incluyendo trastornos de almacenamiento lisosómico, enfermedad de Gaucher y enfermedad de Fabry, como las mencionadas arriba. La enzima tipo silvestre se purifica a partir de un sistema de expresión celular recombinante (por ejemplo, células de mamífero o células de insecto, véanse patentes de E.U.A. Nos. 5,580,757 a Desnick et al.; 6,395,884 y 6,458,574 a Selden et al.; 6,461,609 a Calhoun et al.; 6,210,666 a Miyamura et al.; 6,083,725 a Selden et al.; 6,451,600 a Rasmussen et al.; 5,236,838 a Rasmussen et al.; y 5,879,680 a Ginns et al.), placenta humana o leche animal (véase patente de E.U.A. No. 6,188,045 a Reuser et al.). Después de la infusión, la enzima exógena se espera que sea absorbida por tejidos a través de mecanismos no específicos o específicos de receptor. En general, la eficiencia de absorción no es alta, y el tiempo de circulación de la proteína exógena es corto (Ioannu et al., Am . J. Hum . Genet . 2001; 68:14-25). Además, la proteína exógena es inestable y sujeta a rápida degradación intracelular así como tiene el potencial de reacciones inmunológicas adversas con tratamientos subsecuentes . El reemplazo de enzimas para la enfermedad de Pompe ha sido descrito por varios grupos, Klinge et al., Neuropedia trics . 2005; 36(1):6-11; Klinge et al., Neuromuscul Disord. 2005; 15(1): 24-31; Van den Hout et al., J Inheri t Metab Dis . 2001; 24 (2) : 266-74 ; y Amalfitano et al., Genet Med. 2001; 3(2): 132-8, con éxito limitado. Gaa recombinante para administración en humanos se describe en Van den Hout et al., Lancet . 2000; 56:397-8. La presente invención incrementa la efectividad de la terapia de reemplazo de proteínas al incrementar la estabilidad de la proteína purificada in vivo en pacientes de Pompe que tienen una Gaa mutada caracterizada por doblez incorrecto, mediante la co-administración de un ASSC para la proteína e in vi tro en una formulación o composición. En una modalidad, la Gaa de reemplazo y el compuesto de chaperona se formulan en composiciones separadas. En esta modalidad, el compuesto de chaperona derivado de DNJ y la Gaa de reemplazo pueden administrarse de acuerdo con la misma ruta, por ejemplo, infusión intravenosa, o de preferencia, mediante rutas diferentes, por ejemplo, infusión intravenosa para la enzima de reemplazo y administración oral para el compuesto de chaperona como se describe en la sección anterior. La Gaa de reemplazo se administra mediante cualquiera de las rutas descritas arriba para la administración de la chaperona, pero de preferencia la administración es parenteral. Muy preferiblemente, la administración es intravenosamente en solución estéril para inyección. En otra modalidad, el compuesto de chaperona y Gaa de reemplazo se formulan en una sola composición. Esta composición incrementa la estabilidad de la enzima durante el almacenamiento y administración in vivo, reducciones y costos e incrementando la eficacia terapéutica. La formulación es de preferencia adecuada para administración parenteral, incluyendo intravenosa, subcutánea e intraperitoneal, sin embargo, las formulaciones adecuadas para otras rutas de administración tales como oral, intranasal o transdérmica también se contemplan.
Sincronización de administración . Cuando la Gaa de reemplazo y el compuesto de chaperona están en formulaciones separadas, la administración puede ser simultánea, o el compuesto de chaperona puede administrarse antes de, o después de la Gaa de reemplazo. Por ejemplo, cuando la enzima de reemplazo se administra intravenosamente, el compuesto de chaperona puede administrarse durante un periodo de 0 horas a 6 horas más tarde. Como alternativa, el compuesto de chaperona puede administrarse de 0 a 6 horas antes de la proteína. En una modalidad preferida, cuando el compuesto de chaperona y proteína de reemplazo se administran separadamente, y cuando el compuesto de chaperona tiene una corta vida media circulante (por ejemplo, molécula pequeña) , el compuesto de chaperona puede administrarse oralmente en forma continua, tal como diariamente, para de esta manera mantener un nivel constante en la circulación. Este nivel constante será uno que se haya determinado como no tóxico como el paciente, y que sea óptimo con respecto a la interacción con una proteína de reemplazo objetivo durante el momento de la administración para conferir un efecto no inhibidor y terapéutico. En otra modalidad, el compuesto de chaperona se administra durante el periodo de tiempo requerido para el cambio de la Gaa de reemplazo (la cual se extenderá por la administración del compuesto de chaperona) .
Dosis de Gaa de reemplazo . De acuerdo con los métodos actuales, la concentración de enzima de reemplazo está generalmente entre alrededor de 0.05-5.0 mg/kg de peso corporal, administrados típicamente por semana o bisemanalmente . La enzima puede administrarse a una dosis que varía de 0.1 µg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de preferencia de alrededor de 0.1 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg. Por ejemplo, para el tratamiento de la enfermedad de Fabry, la dosis de a-Gal A recombinante administrada es típicamente de entre 0.1-0.3 mg/kg y se administra semanalmente o bisemanalmente. Dosis regularmente repetidas de la proteína son necesarias durante la vida del paciente. Las inyecciones subcutáneas mantienen una exposición sistémica al fármaco de más largo plazo. La dosis subcutánea es de preferencia 0.1-5.0 mg del a-Gal A por peso corporal y por kilo de peso corporal bisemanalmente o semanalmente. La a-Gal A también se administra intravenosamente, por ejemplo, en una inyección de bolo intravenosa, en una inyección intravenosa de empuje lento o mediante inyección intravenosa continua. La infusión IV continua (por ejemplo, durante 2-6 horas) permite el mantenimiento de niveles específicos en la sangre. Se espera que la dosis efectiva de Gaa recombinante o purificada será más alta que aquella requerida en la enfermedad de Fabry o Gaucher, debido al hecho de que el tejido objetivo en Pompe, músculo esquelético, está protegido de una enzima administrada recombinantemente por tejido endotelial e intersticial. Gaa recombinante (Myozyme, Genzyme, Inc.) también está aprobada actualmente para el tratamiento de la enfermedad de Pompe. Pruebas adicionales están siendo llevadas a cabo en la Universidad de Duke en conjunto con Synpac, Inc., y en Europa. En un estudio europeo, pacientes con enfermedad de Pompe infantiles iniciaron a una dosis de 15 y 20 mg/kg por semana de Gaa humana recombinante de leche de conejo, mientras duraba el estudio, con base en el monitoreo de los niveles de actividad tisular muscular, la dosis se incrementó a 40 mg/kg en una infusión intravenosa una vez a la semana. El estudio se continuó durante 144 infusiones durante 36 semanas (Van den Hout et al., Pedia trics . 2004; 113: 448-57). En una prueba en varios pacientes de Pompe de inicio tardío, Gaa humana recombinante de leche de conejo se administró intravenosamente como una solución de 1 a 2 mg/ml en solución salina con 5% de glucosa y 0.1% de albúmina de suero humana, inicialmente en dosis semanales de 10 mg/kg, incrementándose hasta 20 mg/kg (Winkel et al., Ann Neurol . 2004; 55:495-502).
Terapia de combinación con terapia génica Aunque aún no aprobadas para tratamiento terapéutico en los Estados Unidos, las terapias génicas (tanto ex vivo como transferencia directa) para numerosos trastornos genéticos están bajo investigación. La presente invención contempla también el uso del compuesto de chaperona en combinación con terapia génica para reemplazar la Gaa defectuosa en la enfermedad de Pompe. Esta combinación incrementará la eficacia de la terapia génica al incrementar el nivel de expresión de la Gaa terapéutica in vivo, ya que, además de incrementar el doblez y procesamiento de enzimas mutadas, las chaperonas de molécula pequeña han demostrado incrementar el doblez y procesamiento de las contrapartes tipo silvestre o conformacionalmente estables (véase, por ejemplo U.S. 6,274,597 a Fan et al., ejemplo 3). Recientemente, Sun et al. (Mol . Ther . 2005; 11(1): 57-65) han empleado un vector de virus adeno-asociado (AAV) que codifica para Gaa humana (hGaa; seudotipificada como AAV8 (AAV2/8)) para su inyección intravenosa en un modelo de ratón inmunodeficiente de enfermedad de Pompe (ratones con gen Gaa suprimido/SCID) . Altos niveles de hGaa se mantuvieron en plasma durante 24 semanas después de la administración del vector AAV2/8. La deficiencia de Gaa en el corazón y músculo esquelético se corrigió con el vector AAV2/8 en ratones macho, en tanto que en ratones hembra tuvo una conexión sólo en el corazón. Cualquiera de los métodos para terapia génica que sean o vayan a hacerse disponibles en la técnica pueden usarse para suministrar genes terapéuticos. Los métodos ejemplares se describen abajo. Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, véanse Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 1991, 3:87-95; Tolstoshev, Ann . Rev. Pharma col . Toxicol . 1993, 32:573-596; Mulligan, Science . 1993, 260:926-932; y Morgan y Anderson, Ann Rev. Biochem . 1993, 62:191-217; May, TIBTECH 1993; 11:155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression , A Labora tory Manual , Stockton Press, NY; y en capítulos 12 y 13, Dracopoli et al., (eds.), 1994, Curren t Protocols in Human Genetics , John Wiley & Sons, NY; y Colosimo et al., Biotechniques 2000;29(2) :314-8, 320-2, 324. El gen de Gaa que se administrará para los métodos de la presente invención puede ser aislado y purificado usando técnicas ordinarias de biología molecular, microbiología y .ADN recombinante dentro de la capacidad en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican para la proteína objetivo pueden aislarse usando expresión de ADN recombinante como se describe en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning-. A Labora tory Manual , segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; DNA cloning: A Pra ctical Approach , volúmenes I y II (D.?. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Syn thesis (M. J. Gait ed. 1984) ; ?ucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Éhiggins eds. (1985)]; Transcription and Trasla tion [B. D. Hames & S. J.
Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Cul ture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobili zed Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. É Perbal, A Pra cti cal Guide To Molecular Cloning (1984) . El ácido nucleico que codifica para la proteína puede ser de longitud completa o truncada, siempre y cuando el gen codifique para una proteína biológicamente activa. El gen de Gaa identificado y aislado puede ser después insertado en un vector de clonación adecuado. Los vectores adecuados para terapia génica incluyen virus, tales como adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), vaccinia, virus del herpes, baculovirus y retrovirus, parvovirus, lentivirus, bacteriófagos, cósmidos, plásmidos, vectores fúngicos y otros vehículos de recombinación usados típicamente en la técnica que hayan sido descritos para su expresión en una variedad de huéspedes eucarióticos y procarióticos, y pueden usarse para terapia génica así como para expresión de proteína simple. En una modalidad preferida, el vector es un vector viral. Los vectores virales, especialmente vectores adenovirales pueden acomplejarse con un anfífilo catiónico, tal como un lípido catiónico, poli-L-lisina (PLL) y dietilaminoetildextrano (DELAE-dextran) , que proporcionan eficiencia incrementada de infección viral de células objetivo (véase, por ejemplo, PCT/US97/21496 presentada el 20 de noviembre de 1997, incorporada en la presente a manera de referencia) . Los vectores virales que se prefiere usar en la presente invención incluyen vectores derivados de vaccinia, virus del herpes, AAV y retrovirus. En particular, los virus del herpes, especialmente virus del herpes simple (HSV) , tales como aquellos descritos en la patente de E.U.A. No. 5,672,344, cuya descripción se incorpora en la presente a manera de referencia, son particularmente útiles para el suministro de un transgen a una célula neuronal. Los vectores AAV, tales como aquellos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5,139,941, 5,252,479 y 5,753,500 y publicación de PCT WO 97/09441, cuyas descripciones se incorporan en la presente, también son útiles toda vez que estos vectores se integran en los cromosomas del huésped, con un requerimiento mínimo para la administración repetida del vector. Para una revisión de vectores virales en terapia génica, véase McConnel et al., Hum Gene Ther . 2004; 15 (11) : 1022-33 ; Mccarty et al., Annu Rev Genet . 2004; 38:819-45; Mah et al., Clin . Pharmacokinet . 2002; 41 (12) : 901-11 ; Scott et al., Neuromuscul . Disord. 2002; 12 supl. l:S23-9. Además, véase la patente de E.U.A. No. 5,670,488. Beck et al., Curr Gene Ther. 2004; 4(4): 457-67, describe específicamente la terapia génica en células cardiovasculares . Las secuencias de codificación del gen que será suministrado son enlazadas operablemente a secuencias de control de expresión, por ejemplo, un promotor que dirija la expresión del gen. Según se usa en la presente, la frase "enlazado operablemente" se refiere a la relación funcional de un polinucleótido/gen con secuencias reguladoras y efectoras de nucleótidos, tales como promotores, potenciadores, sitios de detención de transcripción y traducción, y otras secuencias de señal. Por ejemplo, el enlace operativo de un ácido nucleico a un promotor se refiere a la relación física y funcional entre el polinucleótido y el promotor de tal manera que la transcripción de ADN sea iniciada a partir del promotor por una ARN polimerasa que reconozca específicamente y se una al promotor, y en donde el promotor dirige la transcripción de ARN desde el polinucleótido. En una modalidad específica, se usa un vector en el cual las secuencias de codificación y cualquier otra secuencia deseada son flanqueadas por regiones que promuevan la recombinación homologa en un sitio deseado en el genoma, proporcionando así la expresión de la construcción a partir de una molécula de ácido nucleico que tenga integrada en el genoma (Koller and Smithies, Proc . Na ti . Acad. Sci . USA . 1989, 86:8932-8935; Zijlstra et al., Na ture . 1989, 342:435-438; patente de E.U.A. No. 6,244,113 a Zarling et al.; y patente de E.U.A. No. 6,200,812 a Pati et al.).
Suministro génico El suministro del vector dentro de un paciente puede ser ya sea directo, en cuyo caso el paciente sea expuesto directamente al vector o un complejo del suministro, o indirecto, en cuyo caso las células son primero transformadas por el vector in vi tro, luego transplantadas en el paciente. Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapia génica ín vivo y ex vivo .
Transferencia directa. En una modalidad específica, el vector es administrado directamente in vivo, cuando entra en las células del organismo y media la expresión del gen. Esto se puede lograr mediante cualquiera de numerosos métodos conocidos en la técnica y descritos arriba, por ejemplo, al construirlo como parte de un vector de expresión adecuado y administrarlo de tal forma que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante infección usando un vector retroviral defectuoso o atenuado u otro vector viral (véase patente de E.U.A. No. 4,980,286), o mediante inyección directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont) ; o recubrimiento con lípidos o receptores de agente celular o de transfección, encapsulación en biopolímeros (por ejemplo, polisacárido de poli-ß-l-64-N-acetilglucosamina; véase patente de E.U.A. No. 5,635,493), encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas; al administrarlo en enlace con un péptido u otro ligando conocido que se sepa que entra en el núcleo o al administrarlo en relación con un ligando sujeto a endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol . . Chem . 1987, 62:4429-4432), etc. En otra modalidad, un complejo ácido nucleico-ligando puede formarse en el cual el ligando comprenda un péptido viral fusogénico para romper endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosómica, o péptidos de 12 meros catiónicos, por ejemplo, derivados de antenapedia, que se pueden usar para transferir ADN terapéutico en células (Mi et al., Mol . Therapy. 2000, 2:339-47). En otra modalidad más, el ácido nucleico puede ser dirigido in vivo para su absorción y expresión específica de células, al dirigir un receptor específico (véase, por ejemplo, publicaciones de PCT Nos. WO 92/06180, WO 92/22635, WO 92/20316 y WO 93/14188) . Recientemente, una técnica referida como magnetofección ha sido usada para transferir vectores a animales. Esta técnica asocia los vectores con nanopartículas superparamagnéticas para su suministro bajo la influencia de campos magnéticos. Esta aplicación reduce el tiempo de suministro e incrementa la eficacia del vector (Scherer et al., Gene Therapy. 2002; 9:102-9). La dirección adicional y metodologías de suministro se contemplan en la descripción de los vectores abaj o . En una modalidad específica, el ácido nucleico puede administrarse usando un vehículo lípido. Los vehículos lípidos pueden asociarse con ácidos nucleicos desnudos (por ejemplo, ADN plasmídico) para facilitar su paso a través de membranas celulares. Lípidos catiónicos, aniónicos o neutros pueden usarse para este propósito. Sin embargo, los lípidos catiónicos se prefieren toda vez que han demostrado asociarse mejor con ADN el cual, generalmente, tiene una carga negativa. Los lípidos catiónicos también han demostrado mediar el suministro intracelular de ADN plasmídico (Felgner and Ringold, Na ture . 1989; 337:387). La inyección intravenosa de complejos lípido catiónico-plásmido en ratones también ha demostrado resultar en la expresión del ADN en pulmón (Brigham et al., Am . J. Med. Sci . 1989; 298:278). Véase también Osaka et al., J. Pharm . Sci . 1996; 85(6) :612-618; San et al., Human Gene Therapy. 1993; 4:781-788; Sénior et al., Biochemica et Biophysica Acta . 1991; 1070:173-179); Kabanov and Kabanov, Bioconj uga te Chem . 1995; 6:7-20; Liu et al., Pharmaceut . Res . 1996; 13; Remy et al., Bioconj uga te Chem . 1994; 5:647-654; Behr, J-P., Bioconj uga te Chem . 1994; 5:382-389; Wyman et al., Biochem . 1997; 36:3008-3017; patente de E.U.A. No. 5,939,401 a Marshall et al; y patente de E.U.A. No. 6,331,524 a Scheule et al. Los lípidos catiónicos representativos incluyen también aquellos descritos, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. No. 5,283,185 y por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,767,099, cuyas descripciones se incorporan en la presente a manera de referencia. En una modalidad preferida, el lípido catiónico es colesterilcarbamato de N4-espermina (GL-67) descrito en la patente de E.U.A. No. 5,767,099. Los lípidos preferidos adicionales incluyen colesterilcarbamato de N4-espermidina (GL-53) y carbamato de 1- (N4 -espermina) -2, 3-dilaurilglicerol (GL-89) . De preferencia, para la administración in vivo de vectores virales, un tratamiento inmunosupresor adecuado se emplea en conjunto con el vector viral, por ejemplo, vector de adenovirus, para evitar la inmunodesactivación del vector viral y células transfectadas. Por ejemplo, citocinas inmunosupresoras, tales como interleucina-12 (IL-12) , interferón-? (IFN-?) , o anticuerpo anti-CD4 pueden administrarse para bloquear respuestas inmunes u humorales y celulares a los vectores virales. A este respecto, es adecuado emplear un vector viral que sea manipulado para expresar un número mínimo de antígenos.
Transferencia indirecta. Las células somáticas pueden manipularse ex vivo con una construcción que codifique para proteína tipo silvestre usando cualquiera de los métodos descritos arriba, y reimplantada en un individuo. Este método se describe generalmente en WO 93/09222 a Selden et al. Además, esta tecnología se usa en el Suministro a Base de Células propiedad de tecnología ImPACT, descrita en Payumo et al., Clin . Orthopaed and Rela ted Res . 2002; 403S: S228-S242. En este sistema de terapia génica, células somáticas (por ejemplo, fibroblastos, hepatocitos o células endoteliales) son retiradas del paciente, cultivadas in vi tro, transfectadas con los genes de interés terapéutico, caracterizadas y reintroducidas en el paciente. Ambas células primarias (derivadas de un individuo o tejido y manipuladas antes de su paso) , y células secundarias (pasadas in vi tro antes de su introducción in vivo) pueden usarse, así como líneas de células inmortalizadas conocidas en la técnica. Las células somáticas útiles para los métodos de la presente invención incluyen pero no están limitadas a células somáticas, tales como fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales, células endoteliales, células gliales, células neurales, elementos formados de la sangre, células de músculo, otras células somáticas que pueden ser cultivadas, y precursores de células somáticas. En una modalidad preferida, las células sin fibroblastos o células madre mesenquimáticas . Las construcciones de ácido nucleico, las cuales incluyen el gen exógeno y, opcionalmente, ácidos nucleicos que codifican para un marcador seleccionable, junto con secuencias adicionales necesarias para la expresión del gen exógeno en células primarias o secundarias receptoras, se usan para transfectar células primarias o secundarias en las cuales el producto codificado va a ser producido. Estas construcciones incluyen pero no están limitadas a vectores infecciosos, tales como vector retroviral, de herpes, adenovirus, asociado a adenovirus, de paperas y vectores de poliovirus, pueden usarse para este propósito. El suministro transdérmico es especialmente adecuado para la transferencia indirecta usando tipos de células de la epidermis incluyendo queratinocitos, melanocitos y células dendríticas (Pfutzner et al., Expert Opin . Investig. Drugs . 2000; 9:2069-83). Las células madre mesenquemáticas (MSCs) son células madre no productoras de sangre producidas en la médula ósea. Las MSCs pueden elaborarse para diferenciar y proliferarse en tejidos no hemáticos especializados. Las células madre transfectadas con retrovirus son buenos candidatos para la terapia gracias a su capacidad para la autorrenovación. Esta capacidad evita la administración repetitiva para la terapia génica. Otra ventaja es que si las células madre inyectadas alcanzan el órgano objetivo y luego se diferencian, pueden reemplazar las células dañadas o mal formadas en el órgano.
Estabilidad in vi tro Asegurar la estabilidad de una formulación farmacéutica durante su vida útil es un gran reto. Antes del desarrollo de un farmacéutico proteínico, las inestabilidades inherentes o latentes dentro de los ingredientes activos deben explorarse y resolverse. La inestabilidad de los terapéuticos de proteínas y péptidos es clasificada como inestabilidad química o inestabilidad física. Ejemplos de inestabilidad química son hidrólisis, oxidación y desamidación. Ejemplos de inestabilidad física son agregación, precipitación y absorción a superficies. Además, una proteína puede someterse a tensiones tales como pH, temperatura, tensión por esfuerzo cortante, tensión por congelación/descongelación y combinaciones de estas tensiones . Uno de los problemas de formulación más frecuentes es la agregación del producto, dando como resultado una pérdida en bioactividad. La adición de excipientes puede hacer más lento el proceso pero podría no evitarlo completamente. Pérdidas de actividad pueden o no detectarse mediante ensayos físicos y sólo son evidentes en bioensayos o ensayos de potencia con grandes (algunas veces 15-20%) coeficientes de variación, haciendo difícil determinar las pérdidas reales . Además de estabilizar la enzima de reemplazo que se administrará, la presencia de un compuesto de chaperona puede hacer posible que la formulación farmacéutica sea almacenada a un pH neutro de aproximadamente 7.0-7.5. Esto conferirá un beneficio para enzimas que normalmente deben ser almacenadas a un pH más bajo para conservar su estabilidad. Por ejemplo, enzimas lisosómicas, incluyendo Gaa, conservan una conformación estable a un pH bajo (por ejemplo, 5.0 o menos) . Sin embargo, el almacenamiento extendido de la enzima de reemplazo a un pH bajo puede acelerar la degradación de la enzima y/o formulación. La adición de un compuesto de chaperona estabilizante puede mitigar la necesidad de almacenar la proteína de reemplazo en ácido.
Ejemplos La presente invención se describe más por medio de los ejemplos, presentados abajo. El uso de estos ejemplos sólo es ilustrativo y de ninguna manera limita el alcance y significado de la invención o de cualquier término ejemplificado. Asimismo, la invención no está limitada a ninguna modalidad particularmente preferida descrita en la presente. De hecho, muchas modificaciones y variaciones de la invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica después de leer esta especificación y pueden hacerse sin alejarse de su espíritu y alcance. La invención por lo tanto deberá ser limitada sólo por los términos de las reivindicaciones anexas junto con el alcance completo de equivalentes a los cuales tienen derecho las reivindicaciones .
Ejemplo 1 Síntesis de DNJ y derivados Tetra-O-bencil-1-desoxinojirimicina [IMINOAZUCAR PREP-1 GENERAL] Una solución de DMSO (4.4 mL, 0.124 moles) en CH2C12 seco (75 mL) se pone bajo una atmósfera de argón y se enfría a -78 °C. Se añade lentamente una solución de anhídrido trifluoroacético (6.1 mL, 0.088 moles) en CH2C12 seco (50 mL) manteniendo la temperatura a -78 °C. Luego de completar la adición, la reacción se agita 30 minutos adicionales. Se añade por goteo una solución de 2, 3 , 4 , 6-tetra-O-bencilglucitol (5.4 g, 10 mmoles) en CH2C12. Se agita la reacción a -78 °C durante 90 minutos y luego se enfría rápidamente por la adición de trietilamina (11.2 mL, 0.08 moles) en CH2C12 (50 mL) . La reacción se calienta a 0°C y después se concentra usando un rotovap. El residuo se diluye con MeOH (75 mL) y una solución de NH3 2M en MeOH (10.0 mL, 20.0 mmoles) se añade seguida por ácido fórmico (0.77 mL, 20.0 mmoles), tamices moleculares de 3Á y finalmente NaCNBH3 (1.57 g, 25.0 mmoles) . La mezcla se agita durante la noche a temperatura ambiente . El solvente se evaporó usando un rotovap. El residuo se disuelve en EtOAc y se lava con 10% de Na2C03, se seca después sobre Na2S04. Después de la filtración, el solvente se evapora y el producto se purifica mediante cromatografía por vaporización (gradiente por etapas 20-40% de EtOAc en hexano) para dar 2 , 3 , 4 , 6-tetrabencil-l-desoxinorj irimicina .
Clorhidrato de 1-desoxinorjirimicina (compuesto 1) Una solución de 2 , 3 , 4 , 6-tetrabencil-l-desoxinorjirimicina (5.0 g, 9.5 mmoles) en EtOH (100 mL) se agita con HCl 5N en 2-PrOH (3.0 mL, 15.0 mmoles) y luego se evapora usando un rotovap. El residuo se disuelve en EtOH y se evapora de nuevo usando un rotovap. El residuo se disuelve en EtOH (150 mL) y luego se hidrogena (3.51 kg/cm2) durante 0.5 g Pd(OH)2 durante la noche a temperatura ambiente. El catalizador se remueve mediante filtración y la torta del filtro se lava con EtOH/H20 y luego finalmente con EtOH. El filtrado se evapora en un rotovap y luego se coevapora con EtOH para dar un sólido blanco. El sólido se tritura con EtOH y se filtra para dar un sólido blanco. La recristalización a partir de EtOH/H20 da el compuesto del título como un sólido blanco. MP 212-215°C, MH+, MH+ = 164.
Dimetilcarbamato de N- (2-hidroxietil) -1-desoxinojirimicina (compuesto 15) Dimetilcarbamato de N- (2-hidroxietil) -tetra-O-bencil-1-desoxinoj irimicina (0.63 g, 0.99 mmoles) se disuelve en 50 ml de metanol y se trata con 30 microlitros de ácido clorhídrico concentrado (1.6 mmoles) y 20% de hidróxido de paladio (0.2 g, 0.3 mmoles) como catalizador. La mezcla de reacción heterogénea se pone bajo una atmósfera de hidrógeno y se agita durante 15 h. El catalizador se remueve mediante filtración a través de Celite el cual se lava con metanol adicional. El filtrado se concentró usando un rotovap y el producto crudo se purificó usando cromatografía por vaporización en gel de sílice eluyendo con cloroformo:metanol (4:1). Las fracciones adecuadas se concentran usando un rotovap y luego se liofilizan a partir de agua para dar el derivado dimetilcarbamato de N- (2-hidroxietil) -1-desoxinoj irimicina (V, compuesto 14) (MS = 279.4, M + H).
N- (2- (2 , 2 , 2-Trifluoroetoxietil) -1-desoxinojirimicina (compuesto 19) El intermediario éter trif luoroetílico (IX) (0.40 g, 0.62 mmoles) se disuelve en 150 ml de metanol y se trata con 130 microlitros de ácido clorhídrico concentrado (1.6 mmoles) y 20% de hidróxido de paladio (0.2 g, 0.3 mmoles) . La mezcla de reacción heterogénea se pone bajo una atmósfera de hidrógeno y se presuriza a 2.81 kg/cm2 usando un agitador Parr. Después de 32 horas el catalizador se retira mediante filtración a través de Celite que se lava con metanol adicional. El filtrado se concentró usando un rotovap y el producto crudo se purifica usando cromatografía en gel por vaporización eluyendo con cloroformo : metanol (4:1) . Las fracciones adecuadas se concentran usando un rotovap y luego se liofilizan a partir de agua para dar N- (2- (2,2,2-trif luoroetoxietil )- 1 -desoxinoj irimicina como una espuma amarilla (MS = 290.2, M + H) .
N- (Metoxietil) DNJ (compuesto 20) Se usa la prep-1 de iminoazúcar general excepto que se usa 2 -metoxietilamina en lugar de NH3 para dar el compuesto del título, MS (ES+) : 222 [M+l] .
N- (Etoxietil) DNJ (compuesto 21) Se usa la prep-1 de iminoazúcar general excepto que se usa 2-etoxietilamina en lugar de NH3 para dar el compuesto del título. MS (ES+) : 258 [M+Na] .
N-R- (-) -Tetrahidro uranilmetil-1-desoxinojirimicina (compuesto 17) Tetrahidrofuranilmetil-tetra-O-bencil-1-desoxinoj irimicina se desbencila usando hidróxido de paladio en etanol bajo una atmósfera de hidrógeno a 4.22 kg/cm2 con calentamiento a 60°C. El producto crudo se purifica usando cromatografía en gel por vaporización eluyendo con una mezcla de cloroformo: metanol: hidróxido de amonio (80:20:2) para dar la base libre del compuesto del título como una espuma blanca. La base libre purificada se convierte después en la sal clorhidrato mediante tratamiento con 1.0 equivalente de ácido clorhídrico anhidro en 2-propanol. El solvente se remueve mediante evaporación usando un rotovap para dar la sal clorhidrato deseada como un sólido blanco (MS = 248.2, M + H) .
N-S- (+) -Tetrahidrofuranilmetil-1-desoxinojirimicina (compuesto 18) N-S- (+) -Tetrahidrofuranilmetil-tetra-O-bencil-1-desoxinoj irimicina es desbencilada usando hidróxido de paladio en metanol bajo una atmósfera de hidrógeno a 4.22 kg/cm2 con calentamiento a 60 °C. El producto crudo se purifica usando cromatografía en gel de sílice por vaporización eluyendo con una mezcla de cloroformo: metanol: hidróxido de amonio (80:20:2) para dar el compuesto del título como una espuma blanca (MS = 248.2, M + H) .
N-Etil-DNJ (compuesto 3) [IMINOAZUCAR PREP-2 GENERAL] Una mezcla de 1-DNJ (1.0 g, 6.1 mmoles), metanol (60 mL) , DI agua (3.0 mL) , acetaldehído (6.2 g, 141 mmoles) y negro Pd (50 mg) se agita rápidamente y se hidrogena a 20-22°C bajo 4.22 kg/cm2 de presión de H2 durante 20 horas. El catalizador se remueve mediante filtración a través de lecho de Celite-545. El filtrado se evaporó usando rotovap. El residuo no volátil se aplica a una columna de gel de sílice por vaporización y se eluye con una mezcla que comprende cloruro de metileno:metanol: 29% y NHOH concentrado (70:30:5). Las fracciones adecuadas se recolectan, se combinan, se evaporan usando un rotovap. El producto liofilizado da el producto aislado deseado. MP 168.3-169.6°C, m/z 192 (ES, [M + H] +) .
N-Propil-DNJ (compuesto 4) Una mezcla de 1-DNJ (1.0 g, 6.1 mmoles), metanol (60 mL) , agua DI (10.0 mL) , propionaldehído (8.1, 139 mmoles) y negro Pd (100 mg) se agita rápidamente y se trata usando condiciones similares a las descritas para la preparación de N-etil-DNJ. El compuesto del título se obtiene como un sólido blanco. MP: 56.6-57.2°C, m/z 206 (ES, [M + H] +) .
N-Pentil-DNJ (compuesto 6) Una mezcla de 1-DNJ (1.0 g, 6.1 mmoles), metanol (100 mL) , agua DI (10.0 mL) , valeraldehído (4.22 g, 49 mmoles) y negro Pd (100 mg) se agita rápidamente y se trata usando condiciones similares a las descritas para la preparación de N-etil-DNJ. El compuesto del título se obtiene como un sólido blanco. MP 70-71°C, m/z 234 (ES, [M + H] +) .
N-Hexil-DNJ (compuesto 7) Una mezcla de 1-DNJ (1.0 g, 6.1 mmoles), metanol (100 mL) , agua DI (3.0 mL) , hexanal (4.3 g, 42.9 mmoles) y negro de Pd (50 mg) se agita rápidamente y se trata usando condiciones similares a las descritas para la preparación de N-etil-DNJ. El compuesto del título se obtiene como un sólido blanco. MP 64.4-65.6°C, m/z 248 (ES, [M + H] +) .
N-Heptil-DNJ (compuesto 8) Una mezcla de 1-DNJ-HCl (1.0 g, 5.0 mmoles), metanol (100 mL) , heptaldehído (4.9 g, 42.9 mmoles) y negro de Pd (50 mg) se agita rápidamente y se trata usando condiciones similares a las descritas para la preparación de N-etil-DNJ. El compuesto del título se obtiene como un sólido blanco. MP 107-108°C, m/z 262 (ES, [M + H] +) .
N-Octil-DNJ (compuesto 9) Una mezcla de 1-DNJ-HCl (1.0 g, 5.0 mmoles), metanol (100 mL) , octil aldehido (4.9 g, 42.9 mmoles) y negro de Pd (50 mg) se agita rápidamente y se trata usando condiciones similares a las descritas para la preparación de N-etil-DNJ. El compuesto del título se obtiene como un sólido blanco. MP 193-195°C, m/z 276 (ES, [M + H] +) . 17- ( (Benzofuran-2-il)metil) desoxinorjirimicina (compuesto 30) Una suspensión de clorhidrato de desoxinorjirimicina (0.5 g, 2.5 mmoles) en EtOH (30 mL) se trata con benzofuran-2-carboxaldehído (0.55 g, 3.75 mmoles), HOAC (0.15 mL, 3.75 mmoles) y cianoborohidruro de sodio (0.23 g, 3.75 mmoles). La mezcla se agita durante 24-36 horas a temperatura ambiente . El solvente se evaporó usando rotovap y el residuo se disuelve en una mezcla de 9/1 de MeOH/NH4OH y se evapora sobre sílice. La purificación se logra usando cromatografía por vaporización con un gradiente de 0 a 20% (9/1 MeOH/NH4OH) en CHC13. Las fracciones adecuadas se combinan y el solvente se evapora para dar el compuesto del título como un sólido blanco pf 169-175°C. MH+ = 294.
N- ( (Benzotiofen-3-il)metil) desoxinorjirimicina (compuesto 31) El método descrito para el compuesto directamente anterior se usó excepto que se usó benzotiofen-3 -carboxaldehído en lugar de benzofuran-2 -carboxaldehído para dar el compuesto del título como un sólido blanco, pf 145- 149°C. MH+ = 310.
N- ( (Furan-2-il)metil)desoxinorjirimicina (ccmpuesto 29) Se usó el método descrito para el compuesto anterior, excepto que se usó furfural en lugar de benzofuran- 2 -carboxaldehído para dar el compuesto del título como un aceite incoloro. MH+ = 244.
N- ( (1 , 4-Benzodioxan-6-il)metil) desoxinorjirimicina (compuesto 28) TO Se usó el método descrito arriba excepto que se usó 1, 4 -benzodioxan-6-carboxaldehído en lugar de benzofuran-2-carboxaldehído para dar el compuesto del título como un sólido amorfo MH+ = 312.
N-Ciclopropilmetil-1-desoxinojirimicina (compuesto 11) [IMINOAZUCAR PREP-3 GENERAL] l-Desoxinoj irimicina (Toronto Research Chemicals, Cat. No. D245000, 3.0 g, 18.4 mmoles) disuelta en 300 ml de metanol anhidro se combina con ciclopropan carboxaldehído (Aldrich, 2.5 ml, 33.1 mmoles) . Se añaden tamices moleculares de 3 Angstroms (6.0 g) y la mezcla se agita durante 15 min. Se añade MP-cianoborohidruro (Argonaut Technologies, 19.2 g, 46.0 mmoles) seguido por ácido acético glacial (1.1 ml, 18.4 mmoles) . La mezcla de reacción se calienta a 45°C durante 48 horas. La solución se concentra usando un rotovap y el producto crudo se purifica usando cromatografía en gel de sílice por vaporización eluyendo primero con cloroformo luego con 5:1 de cloroformo :metanol/hidróxido de amonio (10/1), luego 3:1 de cloroformo :metanol/hidróxido de amonio (10/1) y finalmente 1:1 de cloroformo :metanol/hidróxido de amonio (10/1). Luego de la concentración de las fracciones adecuadas usando un rotovap, el compuesto del título se aisla como una espuma blanca (MS = 218.8, M + H). 4-Trifluorometil (bencil) -DNJ (compuesto 23) y alfa-ciano-4-trifluorometil (bencil) -DNJ (compuesto 24) Usando iminoazúcar prep-3 general, 1-deoxinoj irimicina (300 mg, 1.839 mmoles), 4-trifluorometilbenzaldehído (Aldrich, 576.2 mg, 3.309 mmoles), MP-cianoborohidruro (Argonaut Technologies, 1.92 g, 4.596 mmoles), ácido acético (110.4 mg, 1.839 mmoles) se combinan y se agitan como se describió en el procedimiento general . La purificación se logra usando cromatografía en gel de sílice por vaporización eluyendo primero con cloroformo, luego 10:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 8:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 6:1 de cloformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 4:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1) para dar 4-trifluorometil (bencil) -DNJ como un sólido blanco (MS = 322, M + H) y alfa-ciano-4-trifluorometil (bencil) -DNJ como un sólido blanco (MS = 347, M + H) . 4-Trifluorometoxi (bencil) -DNJ (compuesto 25) Usando iminoazúcar prep-3 general, 1-desoxinoj irimicina (300 mg, 1.839 mmoles), 4-trifluorometoxilbenzaldehído (Aldrich, 629.2 mg, 3.309 mmoles), MP-cianoborohidruro (Argonaut Technologies, 1.92 g, 4.596 mmoles), ácido acético (110.4 mg, 1.839 mmoles) se combinan y se agitan como se describió en el procedimiento general. La purificación se logra usando cromatografía en gel de sílice por vaporización, eluyendo primero con cloroformo, luego 10:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 8:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 6:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 4:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1) para dar el compuesto del título como un sólido blanco (MS = 338, M + H, MP 101-103°C) . 4-n-Butoxi (bencil) -DNJ (compuesto 27) Usando iminoazúcar prep-3 general, 1-desoxinoj irimicina (1.0 g, 6.1 mmoles), 4-butoxibenzaldehído (Aldrich, 2.0 g, 11.2 mmoles), MP-cianoborohidruro (Argonaut Technologies, 6.4 g, 15.3 mmoles), ácido acético (0.37 ml, 6.4 mmoles) se combinan y se agitan como se describió en el procedimiento general. La purificación se logra usando cromatografía en gel de sílice por vaporización, eluyendo primero con cloroformo, luego 10:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 8:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 6:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 4:1 de cloroformo ¡metanol/hidróxido de amonio (10:1) para dar el compuesto del título como un sólido blanco (MP 153-155°C) . 4-n-Pentoxi (bencil) -DNJ (compuesto 26) Usando iminoazúcar prep-3 general, 1-desoxinoji-rimicina (1.0 g, 6.1 mmoles), 4-butoxibenzaldehído (Alfa Aesar, 2.2 g, 11.2 mmoles), MP-cianoborohidruro (Argonaut Technologies, 6.4 g, 15.3 mmoles), ácido acético (0.37 ml,6.4 inmoles) se combinan y se agitan como se describió en el procedimiento general. La purificación se logra usando cromatografía en gel de sílice por vaporización, eluyendo primero con cloroformo, luego 10:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 8:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 6:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 4:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1) para dar el compuesto del título como un sólido blanco (MS = 340, M + H; MP 155-157°C.
N- (1- (ter-Butoxicarbonil) -4-piperidinilmetil) -1-desoxinojirimicina (compuesto 16) Usando iminoazúcar prep-3 general, 1-desoxinoj irimicina (500 mg, 3.064 mmoles), 1- (terbutoxicarbonil) -4 -piperidincarboxaldehído (CNH Technologies, 1.18 g, 5.516 mmoles), MP-cianoborohidruro (Argonaut Technologies, 3.19 g, 4.596 mmoles), ácido acético (184 mg, 3.064 mmoles) se combinan y se agitan como se describió en el procedimiento general. La purificación se logra usando cromatografía en gel de sílice por vaporización, eluyendo primero con cloroformo, luego 10:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1) para dar el compuesto del título como un sólido blanco (MS = 361, M + H, MP 46-50°C) .
N-Ciclopentilmetil-1-desoxinojirimicina (compuesto 12) Usando iminoazúcar prep-3 general, 1-desoxinoj irimicina (500 mg, 3.064 mmoles), ciclopentancarboxaldehído (Aldrich, 541 mg, 5.516 mmoles), MP-cianoborohidruro (Argonaut Technologies, 3.19 g, 7.661 mmoles), ácido acético (184 mg, 3.064 mmoles) se combinan y se agitan como se describió en el procedimiento general . La purificación se logra usando cromatografía en gel de sílice por vaporización, eluyendo primero con cloroformo, 8:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1), luego 4:1 de cloroformo:metanol/hidróxido de amonio (10:1) para dar N-ciclopentilmetil-1-desoxinoj irimicina como un aceite pardo viscoso (MS = 246, M + H) .
C-1-a-Nonil-l-desoxinojirimicina y C-l-ß-Nonil-1-desoxinojirimicina (compuesto 32) [IMINOAZUCAR PREP-4 GENERAL] Usando un procedimiento análogo al descrito por Boshagen, Geiger y Junge (Angewan te Chemie, Int. Ed. Engl., (9), 806-807 (1981). 1-a-Ciano-l-desoxinoj irimicina se preparó de acuerdo con el método de Marcuccio (WO00/56713) (1.0 g, 5.3 mmoles) y se suspende en hexametildisilazano (11 L) . La suspensión se trata con imidazol (156.3 mg, 2.5 mmoles) y se calienta a 60°C durante 5 horas bajo una atmósfera de argón. La mezcla se filtra para remover los sólidos y el filtrado se concentra a un rotovap a 55-60°C. El residuo se disuelve en THF seco (50 mL) y se añade una solución de bromuro de n-nonilmagnesio (ÍM en éter, 31.9 mmoles, 38 mL) a 15-20°C. La mezcla se calienta a la temperatura ambiente y se agita durante 5 horas. La mezcla se enfría en un baño de hielo y se agita con HCl ÍN (30 L) durante 3 horas. El pH de la mezcla se ajusta a 8.0 al añadir NaOH 2N. La capa orgánica se remueve y la fase acuosa se liofiliza. El residuo se disuelve en metanol (50 mL) y se filtra para remover los sólidos. El filtrado se evapora hasta la sequedad al vacío. El residuo obtenido después de la evaporación se somete a cromatografía sobre una columna de gel de sílice usando cloruro de metileno :metanol: 29% de NH4OH (85:15:1.5). Las fracciones adecuadas que contienen el isómero ß (Rf 0.5) se combinan y se evaporan usando un rotovap y luego se liofilizan para obtener C-1-ß-nonil-DNJ (MS = m/z 290) .
Cl-a-Butil-DNJ (compuesto 33) Usando iminoazúcar prep-4 general, 1-a-ciano-l-desoxinoj irimicina (2.0 g, 9.5 mmoles) se convierte en C-l-a-butil-DNJ. El producto se purifica mediante cromatografía en gel de sílice usando cloruro de metileno :metanol : 29% de NH4OH en la siguiente relación (85:15:1.5). Las fracciones adecuadas, que contienen isómero a (Rf 0.3), se combinan y evaporan para remover el solvente y se liofilizan para obtener el compuesto del título (MS = m/z 220) .
CI-a-Bencil-DNJ (compuesto 35) Tetra- (O-trimetilsilil) -1-a-ciano-l-desoxinoj irimicina (2.0 g, 9.448 mmoles) se prepara usando iminoazúcar prep-4 general. El compuesto protegido se disuelve en THF (20 mL) y bromuro de bencilmagnesio (2.0 M en THF, 20 mL) y se añade por goteo. La mezcla se agita y se calienta a 45 °C durante la noche. La mezcla se enfría a la temperatura ambiente, se añade HCl 2N (30 mL) , y la mezcla se agita durante 3 horas. El solvente se evapora usando un rotovap y el residuo se trata con una solución de 29% de NH4OH para neutralizar el ácido. La solución se lava con éter (2 x 20 mL) y la fase acuosa se separa y se liofiliza. El sólido se agita con cloruro de metileno:metanol : 29% de NH4OH (80:20:4), se filtra y el filtrado se evapora usando un rotovap. El residuo se cromatografía sobre una columna de gel de sílice usando cloruro de metileno :metanol : 29% de NH4OH (80:20:4). Las fracciones adecuadas que contienen isómero a (Rf 0.3) se combinan y evaporan usando un rotovap y luego se liofilizan para obtener el compuesto del título (MP = 73-74°C, MS = m/z 254) . hl-RMN, 300 MHz (D20) 2.28 (m, 2H) , 2.55 (ddd, ÍH, J = 2.8, 5.6,10Hz), 2.99 (m, 2H) , 3.06 (dd, ÍH, J = 2.8, 13.6Hz), 3.11 (m, ÍH) , 3.22 (dd, ÍH, J = 7.6, 11.2Hz), 3.56(dd, ÍH) , J = 3.2,11.6 Hz) y 7.2 (m, 5H) .
Ejemplo 2 Incremento de Gaa con DNJ y derivados de DNJ Los experimentos descritos a continuación indican que DNJ y derivado de DNJ N-butil-DNJ, inhibidores conocidos de enzimas responsables de la síntesis de glicolípidos, también se pueden unir a e incrementar la actividad de Gaa mutante sin inhibir la síntesis de glicolípidos.
Métodos Cultivo y siembra de células. Las líneas de células de fibroblasto PMll (P545L) , PM8 y PM12 (ambas defectuosas en empalme) se usan para los experimentos de incremento. Estas células son fibroblastos aislados de un paciente de Pompe.
Las células se sembraron a aproximadamente 5000 células por pocilio en 180 µL de medio en placas Costar de 96 pocilios de fondo transparente negro estériles y se incuban durante alrededor de 3-6 horas a 37 °C con 5% de C02. Los medios consistían en DMEM con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina .
Tratamiento con fármaco. Todos los compuestos de prueba se disuelven en 1:1 DMSO:H20 hasta una concentración de abastecimiento de 100 mM. Las diluciones en serie de las células usando otra placa Costar de fondo transparente negro estéril se llevaron a cabo como sigue: 1. 20 µL de 1:1 de DMS0:H20 y 180 µL de medio se añaden a las hileras 3-11, e hilera 1, columnas E-H para una concentración de 5% de DMSO, 5% de H20 en medio. 2. 20 µL de 100 mM de DNJ y 180 µL de medio se añaden a la hilera 1, columnas A-D para una concentración de 10 mM de DNJ. 3. 30 µL de cada solución de abastecimiento de 100 mM que será probada se añaden a un pocilio adecuado en la hilera 2 junto con 270 µL de medio para una concentración de 10 mM) . 4. La hilera 1 se mezcló arriba y abajo tres veces usando una pipeta de canales múltiples . 5. La hilera 2 se mezcló como arriba y 100 µL se transfirieron de la hilera 2 a la hilera 3. La hilera 3 se mezcló como se describió arriba, y 100 µL se transfirieron secuencialmente a cada una de las hileras 4 a 11 (la hilera 12 se deja en blanco) para generar diluciones de tres veces en serie. 4. 20 µL se transfirieron de la placa de dilución en serie de acuerdo con la tabla 1. 5. La placa se incubó a 37°C, 5% de C02 durante 6 días con el día 1 igual al día de dosificación.
Ensayo de actividad enzimática. Las células se lavaron dos veces con 200 µL de dPBS seguida por la adición de 70 µL de substrato (2.11 mM de 3 mM 4-MU-a-D-glu) en regulador de pH de fosfato de citrato (30 mM de citrato de sodio, 40 mM de fosfato de sodio dibásico, pH 4.0) y 2.5% de DMSO a las hileras 1-12. Después de la incubación a 37°C con 5% de C02 durante aproximadamente 3 horas, se añaden 70 µL de regulador de pH de paro (glicina 0.4 M, pH 10.8) a las hileras 1-12. La placa se leyó en un contador de placa fluorescente Victor2multilabel counter-Wallac y la fluorescencia a F460 nm se determinó b a una excitación de 355 nm y una emisión de 460 nm usando tiempo de lectura de 1 segundo por pocilio. La actividad enzimática por µg de proteína en el sobrenadante se calculó a partir de la cantidad de fluorescencia emitida, la cual es directamente proporcional a la cantidad de substrato hidrolizado, y por consiguiente, la cantidad de actividad Gaa en el lisado. La relación de incremento es la actividad Gaa en presencia del derivado DNJ dividida entre la actividad Gaa sin el compuesto.
Resultados DNJ, NB-DNJ y N- (ciclopropil)metil DNJ. Como se muestra en la figura 1, las células tratadas con DNJ (1) , N-butil-DNJ, (5) y N- (ciclopropil) metil DNJ (11), exhibieron incrementos dependientes de dosis en la actividad Gaa en comparación con las células de control no tratadas en la línea de células PMll. La concentración más alta de DNJ, 1 mM, incrementa la actividad Gaa aproximadamente 7.8 veces en comparación con la actividad Gaa en células no tratadas (datos no mostrados) . DNJ y NB-DNJ también incrementaron significativamente la actividad Gaa (más de 2 veces) en las líneas de células PM12 a una concentración de 50 µM. No se observaron incrementos en la actividad Gaa en la línea de células PM8 por DNJ (datos no mostrados) . El incremento de Gaa por DNJ y NB-DNJ depende de dosis, con un incremento cada vez más alto demostrado a una escala de 3.0-100 µM antes de una planicie (datos no mostrados) . Otros derivados de DNJ. Como se reporta en las tablas 1 y 2, abajo, los derivados de DNJ N-metil-DNJ, N- (2- (N,N-dimetilamido) etiloxi-DNJ (15), N-4-t-butiloxicarbonil-piperidinilmetil-DNJ (16) , N-2-R-tetrahidrofuranilmetil-DNJ (17), N-2-R-tetrahidrofuranilmetil-DNJ (18), N- (2- (2,2,2-trifluoroetoxi) etil-DNJ (19), N-2-metoxietil-DNJ (20), N-2-etoxietil-DNJ (21), N-4-trifluorometilbencil-DNJ (23), N-alfa-ciano-4-trifluorometilbencil-DNJ (24) , N-4-trifluorometoxibencil-DNJ (25) , N-4-n-pentoxibencil-DNJ (26) y N-4-n-butoxibencil-DNJ (27) también incrementaron significativamente la actividad Gaa en el PM-11. Actividad Gaa incrementada usando N-metil DNJ y N-carboxipentil DNJ fue dependiente de dosis de alrededor de 3-100 µM (datos no mostrados) . % Emax se refiere al incremento máximo porcentual de un compuesto experimental en relación al incremento en presencia de 1 mM de DNJ. Se calcula como la parte superior de la curva de regresión no lineal teórica analizada usando GraphPad Prism versión 3.02. El incremento se define como el promedio del control de fluorescencia múltiples normalizado a los conteos máximos promedio en presencia de 1 mM DNJ y a los conteos promedio mínimos en ausencia de compuesto. Los conteos de fluorescencia se restaron del fondo. El fondo se define por los conteos promedio en presencia o ausencia de células. EC50 (µM) se refiere a la concentración del compuesto que logra 50% de Emax. Sin limitarse a un mecanismo particular, se asume que DNJ y los derivados de DNJ se unen a Gaa mutante en el ER e inducen un doblez adecuado de la proteína mutada, permitiendo que la enzima salga del ER y circule al lisosoma en donde puede exhibir cierta cantidad de actividad enzimática.
Tabla 1 Derivados N-alquilo de 1-desoxinojirimicina Tabla 2 Derivados de 1-desoxinojirimicina con sustitución C Ejemplo 3 Actividad de Gaa in vivo luego de tratamiento con DNJ y derivados de DNJ Administración del fármaco. Este ejemplo proporciona información sobre los efectos de derivados de DNJ en ratones . Los compuestos de prueba del derivado DNJ se administraron a los ratones a 0, 1 mg/kg/día; 10 mg/kg/día; y 100 mg/kg/día; los órganos y plasma se tomaron 2 y 4 semanas después del inicio del estudio. Veinte ratones macho C57BL6 (25 g) por grupo fueron usados. El fármaco se administró en el agua de beber, por lo tanto el consumo de agua se monitoreó diariamente. En el grupo de control (0 mg/kg/día) , los ratones fueron dosificados diariamente en el agua para beber (sin fármaco) y se dividieron en dos grupos. Diez animales fueron sometidos a eutanasia después de 2 semanas de tratamiento, se tomó sangre de la aorta descendente o vena cava, y los tejidos se cosecharon y luego se necropsiaron. Después de 4 semanas de tratamiento, los 10 animales restantes fueron sometidos a eutanasia y sujetos a la misma evaluación. En el primer grupo de prueba, 20 ratones fueron dosificados diariamente en el agua para beber con un enfoque de administración de 1 mg/kg-día (suponiendo que un ratón de 25 g tuviera una velocidad de bebido diaria de 5 mL/día luego entonces el agua para beber debe tener una concentración de 0.025 mg/5 ml o 5 microgramos/ml) . En forma similar al control, 10 ratones fueron sometidos a eutanasia después de 2 semanas de tratamiento y evaluados . Después de 4 semanas de tratamiento, los 10 animales restantes serán autanizados y evaluados . Para los compuestos de prueba enfocados para 10 mg/kg-día, 20 ratones fueron dosificados diariamente en el agua para beber (calculando una concentración de compuesto de 50 microgramos/ml) y se dividieron en dos grupos para las pruebas como se describió para los grupos anteriores. Para el compuesto de prueba deseado para 100 mg/kg-día, 20 ratones fueron dosificados diariamente en el agua para beber (calculando una concentración de compuesto de 500 microgramos/ml) y se dividieron en dos grupos y fueron probados como se describió para los grupos arriba. Las muestras de sangre se extrajeron en heparina de litio y se centrifugaron para plasma. Después del sangrado, el corazón, hígado, músculo gastronemio, músculo soleo, lengua, riñon y cerebro fueron removidos y colocados en frascos. Los frascos se pusieron en hielo seco para congelación rápida. Los tejidos y plasma fueron después analizados para niveles tisulares de Gaa y glicógeno.
Preparación de tejidos. Porciones pequeñas de tejido fueron removidas y añadidas a 500 µl de regulador de pH de lisis (20 mM de citrato de sodio y 40 mM de fosfato ácido disódico, pH 4.0, incluyendo 0.1% de Tritón X-100) . Los tejidos fueron después homogeneizados usando microhomogeneizador durante un tiempo breve, seguidos por centrifugación a 10,000 rpt durante 10 minutos a 4°C. Los sobrenadantes fueron transferidos a un tubo nuevo y se usó para el ensayo de enzimas.
Ensayo de enzimas tisulares . A 2.5 µl de sobrenadante (en placas de 96 pocilios) se le añadieron 17.5 µl de regulador de pH de reacción (regulador de pH de fosfato-citrato, sin Tritón) , y 50 µl de substrato marcado con 4-metilumbeliferona (4 -MU) , a-glucopiranósido o controles negativos marcados, ß-glucopiranósido y a-galactopiranósido.
Las placas se incubaron a 37 °C durante 1 hora, seguidas por la adición de 70 µl de regulador de pH de paro (glicina 0.4 M-NaOH, pH 10.6). La actividad de Gaa se determinó al medir la absorbancia a 460 nm al excitar a 355 nm usando un tiempo de lectura de un segundo por pocilio (Victor2 multilabel counter-Wallac) . La actividad enzimática se normalizó a la cantidad en µl de lisado añadida, y la actividad enzimática por µl de lisado fue calculada. La relación de incremento es igual a la actividad con el compuesto sobre la actividad sin el compuesto.
Resultados Como se muestra por las figuras 2A-D y 3A-D, los niveles de Gaa se incrementaron después de tratamiento con DNJ y N-butil-DNJ en el cerebro, hígado, músculos gemelos, lengua (figura 2A-D) y también en el riñon, diafragma, corazón y músculo soleo (figura 3A-D) . Los resultados fueron significativos para una tendencia lineal. Para DNJ, los incrementos fueron dependientes de dosis en el cerebro, músculos gemelos, lengua, riñon, diafragma, corazón y soleo (significativos para la tendencia lineal) . Para N-butil-DNJ, los incrementos dependieron de dosis en el cerebro, hígado, músculos gemelos, lengua y riñon. Después de 4 semanas de tratamiento, los incrementos en la actividad Gaa se observaron después de tratamiento con DNJ en el cerebro, hígado, músculos gemelos y lengua (figura 4AD) , y también en el riñon, diafragma, corazón y soleo (figura 5A-D) . Los resultados para N-butil-DNJ fueron suministrados excepto para el diafragma, corazón y soleo, en donde los incrementos no se observaron. Los incrementos parecieron ser dependientes de dosis en el cerebro, músculos gemelos, lengua, riñon (DNJ solamente) , • diafragma (DNJ solamente) , corazón (DNJ solamente) y soleo (DNJ solamente) . Estos resultados confirman que las chaperonas farmacológicas específicas pueden incrementar la actividad de Gaa no mutada in vivo .
Ejemplo 4 Acumulación y localización de Gaa con y sin exposición a derivados de DNJ En este experimento, cuatro líneas de células derivadas de pacientes de Pompe quienes exhibieron muy poca a ninguna actividad Gaa residual se compararon con fibroblastos tipo silvestre para acumulación y localización de Gaa.
Métodos Lineas de células. Líneas de células PM8 , PM9, PMll y PM12 fueron evaluadas. PM8 porta un defecto de empalme que da como resultado cierta actividad Gaa residual (IVSIAS, T>G,-13); PM9 porta una mutación no de sentido en un alelo (R854X) y 3 mutaciones sin sentido en el otro (D645E, V816I y T927I) y esencialmente no tiene actividad Gaa residual (<1%) ; PMll contiene una mutación no sentido (P545L) y tiene cierta actividad Gaa residual. PM12 también tiene un defecto de empalme (IVS8+G>A/M519V) .
Inmunofluorescencia y microscopía. Las células cultivadas durante 5 días con o sin fueron cultivadas durante 5 días sobre portaobjetos de vidrio con NB-DNJ. Las células fueron fijadas con 3.7% de paraformaldehído durante 15 minutos, permeabilizadas con 0.5% de saponina durante 5 minutos, luego marcadas con una dilución 1:300 de Gaa antihumana de conejo (regalo de Barry Byrne) y/o anti-LAMPl monoclonal de ratón (BD Pharmingen, # de catálogo 555798) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios, IgG anti-conejo de cabra conjugada con AlexaFluor 488, e IgG anti-ratón de cabra conjugada con AlexaFluor 594 (Molecular Probes) fueron luego añadidas a una dilución 1:500 e incubadas durante una hora a temperatura ambiente. Cubiertas de portaobjetos se pusieron sobre los portaobjetos con 10 µl de Vectashield, se sellaron con barniz para uñas de secado rápido y se vieron con un microscopio confocal Nikon Cl .
Resultados PM8. A pesar de tener poca actividad Gaa residual, las células PM8 exhibieron coloración citosólica LAMP-1 y Gaa incrementadas, y tuvieron un patrón de coloración diferente, en comparación con fibroblastos tipo silvestre. Como se muestra en la figura 6, los fibroblastos tipo silvestre tratados con NB-DNJ exhibieron un patrón de coloración por puntos tanto para LAMP-1 como para Gaa (figura 6C-D) , que parecieron co-localizarse en los lisosomas. En contraste, en los fibroblastos PM8, la coloración fue persuasiva en el citoplasma tanto para LAMP-1 como para Gaa (figura 6A-B y 6E-F) . La superposición tanto de LAMP-1 y Gaa en fibroblastos tipo silvestre confluentes confirma la co-localización a los lisosomas (figura 6H) , en tanto que el exceso en fibroblastos PM8 confluentes confirman el exceso citosólico de LAMP-1 y Gaa (figura 6G) . Los resultados anteriores sugieren un defecto posible en la formación de lisosomas o la presencia de grandes agregados de estructuras de endosoma/lisosoma formadas anormalmente (agresomas) .
PM9. Fibroblastos PM9 exhibieron también un exceso de coloración de Gaa (figura 7B y 7D) y LAMP-1 (figura 7E) en el citosol (figura 7B) . Una transparencia muestra la formación de agregados de Gaa que simulan agresomas (figuras 7A, 7C y 7F, flechas e incrustación muestran agresomas) . Se anticipa que el tratamiento con derivados de DNJ reestablecerán la ubicación del Gaa a los lisosomas, y reducirá la formación de agresomas. Se anticipa que el tratamiento con derivados de DNJ reestablecerá la ubicación adecuada de Gaa a los liposomas y reducirá la presencia de agresomas citosólicos.
PMll. Los fibroblastos PMll exhiben actividad Gaa reducida. Cuando se tratan con NB-DNJ (50 µM) y DNJ (100 µM) , las células PMll exhiben un incremento en intensidad para marcado de Gaa en lisosomas como se evalúa por comarcado con el marcador lisosómico LAMP-1, indicando restablecimiento de circulación (figura 8) . Fibroblastos PMll no tratados exhiben cierta coloración Gaa, muy poca de la cual se co-localiza con LAMP-1. Además, para confirmar que el defecto en células PMll es la circulación de enzimas lisosómicas (Gaa) a los lisosomas, fibroblastos tipo silvestre y células PMll fueron teñidos para los marcadores de endosoma temprana y posterior EEA1 y M6PR, respectivamente. No hubo diferencia en los patrones de ubicación para los endosomas tempranos y tardíos entre fibroblastos tipo silvestre y fibroblastos PMll de Pompe (datos no mostrados) .
PM12. Incrementos significativos en la intensidad de coloración de Gaa también se observaron en fibroblastos PM12 tratados con ND-DNJ (datos no mostrados) .
Conclusión Este ejemplo demuestra que las chaperonas farmacológicas de la presente invención pueden restablecer el fenotipo de células que portan mutaciones en Gaa que no son (y además de) aquellas mutaciones que causan que Gaa se vuelva inestable y no pueda salir del ER durante la síntesis. Esto soporta una hipótesis en la que mejorar la circulación de Gaa mutante desde el ER hasta el lisosoma puede ser suficiente para reducir ciertos efectos patógenos de la enfermedad de Pompe en tejidos tales como músculo, y incluso sin restablecer la actividad Gaa hidrolasa en el lisosoma. Es claro que el cambio de glicógenos no es suficiente para mejorar el fenotipo del paciente en la enfermedad de Pompe. Así, una hipótesis de por qué mejoras en la circulación podrían mejorar la patología de Pompe es que la falta de actividad Gaa ocasiona una deficiencia de glucosa en células, lo cual puede desencadenar o perpetuar una respuesta autofágica (para usar glicógeno citoplásmico para una rápida liberación de glucosa) . Esta respuesta autofágica deteriora la circulación a través de las vías de circulación endosómicas, dando como resultado la mala circulación de proteínas de estabilización de membrana, y la degradación final de fibras musculares. La terapia con chaperonas puede rescatar la actividad Gaa, aliviar la deficiencia de glucosa y respuesta autofágica inducida por la deficiencia de glucosa, y finalmente restablecer la circulación de proteínas de estabilización de membrana para evitar daño muscular adicional .
Ejemplo 5 Efecto de los derivados de DNJ en Gaa intestinal : Contratamizado La chaperona farmacológica específica ideal, a concentraciones sub- inhibidoras, incrementará Gaa lisosómica sin inhibir Gaa intestinal. En consecuencia, la actividad de Gaa intestinal se evaluó en extractos crudos del intestino de ratón a un pH de 7.0. Además, un ensayo de inhibición de enzima Gaa intestinal se estableció para determinar si los compuestos tales como DNJ y NB-DNJ ejercían un efecto inhibitorio en Gaa intestinal.
Métodos Preparación de tejidos. Se prepararon extractos crudos a partir de intestinos de ratones C57BK6 como se describió arriba. Los sobrenadantes fueron transferidos a un tubo nuevo y usados para el ensayo de enzima.
Resultados DNJ fue un inhibidor más potente de Gaa intestinal con un valor IC50 de 1 µM, mientras que el NB-DNJ tuvo un valor inhibidor IC50 de 21 µM (datos no mostrados) .
Ejemplo 6 Tratamiento de pacientes de Pompe con derivados de DNJ En vista de los resultados anteriores, el tratamiento de pacientes de Pompe con los DNJ y derivados de DNJ de la presente invención reducirá la acumulación patológica de glicógeno en tejido muscular, de esta manera reduciendo el estado de enfermedad. En vista del hecho de que el tratamiento único actualmente aprobado para la enfermedad de Pompe, ERT, es inefectivo para reducir la acumulación de glicógenos en músculo esquelético toda vez que la enzima recombinante no puede penetrar en tejido muscular, este método resuelve una necesidad largamente sentida en la técnica.
Métodos Población de Pacientes. Pacientes con enfermedad de Pompe de inicio infantil, juvenil y/o en la adultez diagnosticados serán reclutados y evaluados en una prueba aleatorizada, de doble ceguera, de dosis múltiples, y de marca abierta para derivados DNJ administrada oralmente .
Para calificar, los pacientes deben tener al menos uno de los siguientes síntomas: a) cardiomiopatía, definida como un índice de masa ventricular izquierdo (LVMI) determinado por ecocardiografía transversal; b) un requerimiento para soporte ventilador invasivo o no invasivo, en donde la ventilación no invasiva se define como cualquier forma de soporte de ventilador aplicada sin el uso de un tubo endotraquial o c) severo retraso motor, definido como insuficiencia para llevar a cabo tareas motoras grandes logradas por 90% de personas de edad normal en la Prueba de Tamizado en Desarrollo de Denver (DDST-2; Hallioglo et al., Pedia tr Int . 2001; 43 (4) : 400-4) .
Administración de fármaco. Dos grupos de 10 sujetos recibirán ya sea 50 ó 100 mg de DNJ o un derivado de DNJ dos veces al día durante 24 semanas. Esto es debajo de la cantidad indicada para la privación del substrato de glicoesfingolípidos en enfermedad de Gaucher.
Puntos finales. La eficacia clínica será evaluada por una supervivencia libre de ventilador, índice de masa ventricular izquierdo, desarrollo de motor y función musculoesquelética, por ejemplo como la medida usando las pruebas Denver Developmental Screening Test y la Alberta Infant Motor Scale (Piper et al., Motor Assessmen t of the Developing infan t . Filadelfia, PA, W.B. Saunders Co., 1994), the Bayley Scales of Infant Development II (BSDII, Bayley et al., Bayley Scores of Infant Development , 2a ed. , San Antonio, TX: Harcourt Brace & Co. 1993) , así como análisis histológico y bioquímico de biopsias musculares, es decir, una determinación de niveles de glicógeno en pacientes tratados contra no tratados usando una coloración de ácido-Shiff (PAS) positiva periódica y ensayos de actividad enzimática, y la medición de la actividad Gaa en fibroblastos obtenidos de los pacientes. Las mediciones clínicas serán evaluadas dos veces a la semana, excepto para biopsias de músculo las cuales serán evaluadas a 4, 12 y 24 semanas .
Resultados El tratamiento con un derivado de DNJ será efectivo para el tratamiento de la enfermedad de Pompe al reducir algunos de los síntomas y reducir los niveles en tejido muscular de glicógenos. Por ejemplo, se espera que a las 12 semanas, los incrementos en la actividad Gaa en músculo se observe, y que la acumulación de glicógeno en músculo sea reducida. Además, se espera que LVMI se reduzca y que los síntomas respiratorios mejoren. Finalmente, el progreso de desarrollo motor y tono muscular, especialmente en pacientes jóvenes, es esperado.
Conclusión El método de la invención proporciona un beneficio inesperado en el tratamiento de la enfermedad de Pompe, para la cual el único tratamiento actual es ERT. La administración de una chaperona de molécula pequeña, de preferencia oralmente, es económica y permite el rescate de la enzima en tejidos impenetrables a ERT, es decir, el cerebro. Además, la terapia de combinación con el compuesto de chaperona y la proteína de reemplazo puede producir el número de infusiones y/o cantidad de enzima recombinante purificada requerida, reduciendo así costos y proporcionando un beneficio para los pacientes. Finalmente, la formulación de Gaa de reemplazo en combinación con un compuesto de chaperona de la invención puede estabilizar la enzima recombinante y prevenir la agregación y/o degradación, incrementando así la vida útil de la enzima. La presente invención no debe limitarse en alcance por las modalidades específicas descritas en la presente. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas en la presente se harán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y de las figuras acompañantes. Estas modificaciones deben destinarse para estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las patentes, solicitudes de patente, publicaciones, descripciones, números de registro y protocolos se citan a lo largo de esta solicitud, y sus descripciones se incorporan en la presente a manera de referencia en sus totalidades para todos los propósitos. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (38)

  1. REIVINDICACIONES
  2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para incrementar la actividad de una enzima a-glucosidasa en una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la enzima con una cantidad efectiva de un derivado de 1-desoxinoj irimicina de la fórmula: en donde Ri es H o un alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alcoxialquilo o aminoalquilo lineal o ramificado que contiene 1-12 átomos de carbono, un arilo, alquilarilo, heteroarilo o heteroariloalquilo que contiene 5-12 átomos de anillo, en donde Ri es sustituido opcionalmente con uno o más -OH, COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C (=0)N- (alquilo) 2; R2 es H; un alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquilarilo o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono o arilo que contiene 5-12 átomos de carbono, en donde R2 es sustituido opcionalmente con -OH, -COOH, -CF3, -OCF3 o un anillo heterocíclico; y por lo menos uno de R? y R2 no es H, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el derivado de DNJ no es 1-desoxinoj irimicina o a-homonoj irimicina. 2. Un método para incrementar la actividad de una enzima a-glucosidasa en una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la enzima con una cantidad efectiva de un derivado de 1-desoxinoj irimicina de la fórmula : en donde Rx es H o un alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alcoxialquilo o aminoalquilo lineal o ramificado que contiene 1-12 átomos de carbono sustituido opcionalmente con un -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C (=0) N- (alquilo) 2 ; R2 es H o alquilo, cicloalquilo o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono; y por lo menos uno de Ri y R2 no es H, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el derivado de DNJ no es 1-desoxinoj irimicina o a-homonoj irimicina.
  3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Rx es un alquilo, cicloalquilo o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono sustituido opcionalmente con un -OH, -COOH, -CF3, OCF3 o -C(=0)N-(Me)2; y R2 es H.
  4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque Ri es n-metilo, n-etilo, n-butilo, n-ciclopropilmetilo o n-nonilo.
  5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque Ri es n-etilo o n-butilo sustituido con un -OH, -COOH, CF3, -OCF3, o -C (=0) N- (Me) 2.
  6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque Rx es
  7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Ri es H y R2 es un alquilo, alquenilo, arilo o éter de cadena recta o ramificada sustituido opcionalmente con -CF3 o un heterociclo.
  8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque R2 es un grupo n-nonilo.
  9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste en N-metil-DNJ, N-butil-DNJ, N-ciclopropilmetil-DNJ, N- (2- (N,N-dimetilamido)etiloxi-DNJ, N-4-t-butiloxicarbonil-piperidinilmetil-DNJ, N-2-R-tetrahidrofuranilmetil-DNJ, N-2-R-tetrahidrofuranilmetil-DNJ, N- (2- (2, 2, 2-trifluoroetoxi) etil-DNJ, N-2-metoxietil-DNJ, N-2-etoxietil-DNJ, N-4-trifluorometilbencil-DNJ, N-alfa-ciano-4-trifluorometilbencil-DNJ, N-4-trifluorometoxibenil-DNJ, N-4-n-pentoxibencil-DNJ y N-4-n-butoxibencil-DNJ o Cl-nonil DNJ.
  10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el compuesto es N-butil-desoxinoj irimicina.
  11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el incremento en actividad Gaa en presencia del derivado de DNJ sobre la actividad Gaa sin el derivado de DNJ es de al menos 1.5 veces a la concentración del derivado de DNJ que proporciona la actividad Gaa máxima en una célula.
  12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el incremento en actividad Gaa en presencia del derivado de DNJ sobre la actividad Gaa sin el derivado de DNJ es de al menos 5 veces a la concentración del derivado de DNJ que proporciona la actividad Gaa máxima en una célula.
  13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto incrementa la actividad Gaa lisosómica a una concentración en o debajo del valor IC50 para la inhibición de Gaa intestinal.
  14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima a-glucosidasa es una a-glucosidasa mutante.
  15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la a-glucosidasa mutante se selecciona del grupo que consiste en D645E, D645H; R224W 2619R; R660H; T1064C; C2104T; D645N; L901Q; G219R; E262K, M408V; G309R; D645N; G448S; R672W; R672Q; P545L; C647W G643R; M318T; E521K; W481R; L552P, G549R; R854X; V816I y T927I y combinaciones de los mismos.
  16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima a-glucosidasa es una enzima a-glucosidasa funcional purificada o recombinante.
  17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el contacto ocurre in vivo .
  18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el contacto ocurre in vi tro .
  19. 19. Un método para tratar la enfermedad de Pompe en un individuo que lo requiera, caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un derivado de 1-desoxinoj irimicina que comprende un compuesto de la fórmula: en donde Ri es H o un alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alcoxialquilo o aminoalquilo lineal o ramificado que contiene 1-12 átomos de carbono, un arilo, alquilarilo, heteroarilo o heteroariloalquilo que contiene 5-12 átomos de anillo, en donde Rx es sustituido opcionalmente con uno o más -OH, COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C (=0) N- (alquilo) 2 ; R2 es H; un alquilo, cicloalquilo, alquenilo, o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono o arilo que contiene 5-12 átomos de carbono, en donde R2 es sustituido opcionalmente con -OH, -COOH, -CF3, -OCF3 o un anillo heterocíclico; y en donde por lo menos uno de Ri y R2 no es H; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el derivado de DNJ no es 1-desoxinoj irimicina o a-homonoj irimicina.
  20. 20. Un método para tratar la enfermedad de Pompe en un individuo que lo requiera, caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un derivado de 1-desoxinoj irimicina que comprende un compuesto de la fórmula : en donde Rx es H o un alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alcoxialquilo o aminoalquilo lineal o ramificado que contiene 1-12 átomos de carbono sustituido opcionalmente con un -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -0-C(=0)N- (alquilo)2; R2 es H o alquilo, cicloalquilo o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono; y por lo menos uno de Ri y R2 no es H, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el derivado de DNJ no es 1-desoxinoj irimicina o a-homonoj irimicina.
  21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque Ri es un alquilo, cicloalquilo o alcoxialquilo lineal o ramificado que contiene 1-9 átomos de carbono sustituido opcionalmente con un -OH, -COOH, -CF3, OCF3 o -C(=0)N- (Me)2; y R2 es H.
  22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque Ri es n-metilo, n-etilo, n-butilo, n-ciclopropilmetilo o n-nonilo.
  23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque Ri es n-etilo o n-butilo sustituido con un -OH, -COOH, CF3, -0CF3/ o -C(=0)N- (Me) 2.
  24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque Ri es
  25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque R es H y R2 es un alquilo, alquenilo, arilo o éter de cadena recta o ramificada sustituido opcionalmente con -CF3 o un heterociclo.
  26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque R2 es un grupo n-nonilo.
  27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste en N-metil-DNJ, N-butil-DNJ, N-ciclopropilmetil-DNJ, N- (2- (N,N-dimetilamido)etiloxi-DNJ, N-4-t-butiloxicarbonil-piperidinilmetil-DNJ, N-2-R-tetrahidrofuranilmetil-DNJ, N-2-R-tetrahidrofuranilmetil-DNJ, N- (2- (2, 2, 2-trifluoroetoxi) etil-DNJ, N-2-met?xietil-DNJ, N-2-etoxietil-DNJ, N-4 -trifluorometilbencil-DNJ, N-alfa-ciano-4-trifluorometilbencil-DNJ, N-4-trifluorometoxibenil-DNJ, N-4-n-pentoxibencil-DNJ y N-4-n-butoxibencil-DNJ o Cl-nonil DNJ.
  28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el compuesto es N-butil-desoxinoj irimicina .
  29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la relación de la actividad Gaa en presencia del derivado de DNJ sobre la actividad Gaa sin el derivado de DNJ es de al menos 1.5 veces .
  30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la relación de la actividad Gaa en presencia del derivado de DNJ sobre la actividad Gaa sin el derivado de DNJ es de al menos 5 veces .
  31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto incrementa la actividad Gaa lisosómica a una concentración en o debajo del valor IC50 para la inhibición de Gaa intestinal.
  32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la cantidad efectiva es de alrededor de 1 mg a aproximadamente 300 mg al día.
  33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la cantidad efectiva es de aproximadamente 5 mg a alrededor de 150 mg al día.
  34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la cantidad efectiva es de aproximadamente 5 a alrededor de 75 mg al día.
  35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el derivado de desoxinoj irimicina se administra en una forma de dosis oral.
  36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la forma de dosis oral es una tableta o una cápsula.
  37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el derivado de desoxinoj irimicina se administra en combinación con enzima de reemplazo de a-glucosidasa.
  38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la a-glucosidasa se administra en combinación con un gen de a-glucosidasa de reemplazo.
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