MX2007013825A - Composiciones de un conjugado peptidico y metodos para la prevencion y tratamiento de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades asociadas con depositos amiloides ?? en el cerebro de un paciente, tal como la enfermedad de Alzheimer; tales metodos abarcan administrar un fragmento de ??, que carece de un epitopo de linfocito T, capaz de inducir una respuesta inmune benefica en la forma de anticuerpos para ??; en otro aspecto, el fragmento inmunogenico de ?? es capaz de elevar los niveles de ?? en plasma; los fragmentos inmunogenicos comprende peptidos lineales o multivalentes de ??, composiciones farmaceuticas que comprenden el fragmento inmunogenico enlazado quimicamente a una molecula portadora que puede administrarse con un adyuvante.

Description

COMPOSICIONES DE UN CONJUGADO PEPTIDICO Y MÉTODOS PARA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para la prevención y el tratamiento de las enfermedades amiloidogénicas y, en particular, la enfermedad de Alzheimer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer (AD), está caracterizada por la disminución progresiva de la memoria y la declinación cognoscitiva. Sus lesiones patológicas características son depósitos amiloides (placas seniles), marañas neurofibrilares y pérdida neuronal en regiones específicas del cerebro. Los depósitos amiloides están compuestos de péptidos beta amiloides (Aß) de 40 a 43 residuos de aminoácidos, que son los productos proteolíticos de la proteína del precursor amiloide (APP). Las marañas neurofibrilares son los agregados filamentosos intracelulares de las proteínas tau hiperfosforiladas (Selkoe, Science. 275: 630-631 , 1997). La patogénesis de la AD no se ha entendido completamente, pero se espera que sea un evento con múltiples factores. Se cree que la acumulación y agregación de Aß en el tejido cerebral juega un papel principal en el proceso de la enfermedad, también conocido como la hipótesis de la cascada amiloide (Golde, Brain Pathol., 15: 84-87, 1995). De acuerdo con esta hipótesis, Aß, particularmente Aß42, es susceptible de formar varias formas de agregados, que varían de pequeños oligómeros a estructuras de profibrilas largas, alargadas. Estos agregados son neurotóxicos y son responsables de la patología sináptica asociada con la pérdida de la memoria y la declinación cognoscitiva en la etapa inicial de la enfermedad (Klein et al, Neurobiol. Aginq, 25: 569-580, 2004). Una publicación reciente sugiere que la reducción de Aß en un modelo de ratón transgénico triple, evita la deposición tau intracelular (Oddo et al, Proc. Neuron. 43:321-332, 2004). Este hallazgo sugiere que la deposición amiloide extracelular puede ser la causa de la formación posterior de marañas neurofibrilares, lo que puede, a su vez, conducir la pérdida neuronal. La inmunización de ratones transgénicos APP con el antígeno Aß puede reducir los depósitos de Aß en el cerebro y mitigar el progreso de la enfermedad. Esto se reportó primero por Shenk et al., Nature, 400: 173-177, 1999, y ahora se ha corroborado por un gran número de estudios que involucran diferentes modelos animales transgénicos, varias vacunas activas, así como una inmunización pasiva con anticuerpos monoclonales específicos de Aß (Bard et al., Nature Med, 6: 916-919, 2000; Janus et al, Nature, 408: 979-982, 2000; Morgan et al, Nature. 408: 982-985, 2000; DeMattos et al, Proc. Nati. Acad. Sci.. 98: 8850-8855, 2001 ; Bacskai et al, J. Neurosci.. 22: 7873-7878, 2002; Wilcock ef al, J. Neurosci.. 23: 3745-3751 , 2003). De manera consistente con estos datos animales, tres evaluaciones publicadas de tejidos de cerebro humano postmortem de pacientes que habían recibido previamente una inmunización activa con un preagregado de inmunógeno Aß (1-42) (AN1792, Betabloc), mostraron una eliminación regional de las placas seniles (Nicoll et al., Nature Med.. 9: 448-452, 2003; Ferrer et al, Brain Pathol.. 14: 11-20, 2004; Masliah eí al, Neurology, 64: 129-131 , 2005). Estos datos indican de manera colectiva que las vacunas que provocan efectivamente las respuestas del anticuerpo a los antigenos Aß, son eficaces contra las placas seniles patológicas encontradas en la AD. Sin embargo, el mecanismo de la vacuna o la eficacia del anticuerpo quedan por ser definidos. El programa de AD basado en la inmunoterapia más avanzado en el dominio público ha sido un ensayo de una vacuna de Fase II de inmunización activa utilizando AN1792 (Betabloc), una vacuna compuesta del preagregado Aß (1-42) coadministrado con el adyuvante, QS-21™ (Antigenics, New York, NY). En Enero del 2002, este estudio se terminó cuando cuatro pacientes mostraron síntomas consistentes con meningoencefalitis (Sénior, Lancet Neurol., 1 : 3, 2002). Finalmente, 18 de 298 pacientes tratados, desarrollaron signos de meningoencefalitis (Orgogozo eí al., Neuroloqy, 61 : 46-54, 2003). No hubo correlación entre la encefalitis y el título del anticuerpo, y se ha reportado que el mecanismo causal probable para este efecto fue la activación de los linfocitos T al autoinmunógeno, particularmente la porción media y carboxi terminal del péptido Aß42 (Monsonego eí al., J. Clin. Invest., 112: 415-422, 2003). En apoyo de esta conclusión, el examen postmortem de los tejidos cerebrales de dos receptores de la vacuna que desarrollaron encefalitis, reveló una infiltración meningeal sustancial de los linfocitos T CD4+ en un paciente (Nicoll eí al., Nature Med., 9: 448-452, 2003) y los linfocitos T CD4+, CD8+, CD3\ CD5+, CD7+ en el otro (Ferrer eí al., Brain Pathol., 14: 11-20, 2004). La evidencia actual sugiere que los niveles de Aß en plasma después de una inmunización pasiva o activa, reflejan el inicio de un colector periférico como un precursor a las disminuciones posteriores en el Aß cerebral. Un colector periférico se refiere a un cambio en el equilibrio en el almacenamiento de Aß en el cerebro y el plasma, lo que resulta en un flujo neto de Aß central a la perifepa (véase, por ejemplo, Deane eí al., J. Neurosci., 25: 11495-11503, 2005; DeMattos et al, Pro. Nati. Acad. Sci. USA. 98: 8931-8932, 2001 ). Otros estudios sugieren que este incremento en el Aß del plasma observado después de una inmunoterapia con anti-Aß es necesario para que se realicen las disminuciones posteriores en el Aß central (Cribbs eí al., 7a Conferencia Internacional sobre AD/PD, Sorrento, Italia, 2005). Así, cuando dos aminoácidos dentro de Aß son sustituidos (por ejemplo, tal como ocurre con las mutaciones Dutch y lowa), el péptido ya no es capaz de cruzar de los compartimientos centrales a los periféricos (Davis eí al., Neurobiol. Aging, en prensa, disponible en línea el 18 de Agosto del 2005). Cuando los ratones que expresan esta forma mutante de Aß y la mutación Swedish se inmunizan, no se encontraron elevaciones en el Aß del plasma, y no se notó una disminución posterior del Aß cerebral. En contraste, los ratones que expresan la secuencia Aß humana del tipo silvestre más la mutación Swedish, correspondieron a la inmunización activa con incrementos en el Aß del plasma y disminuciones posteriores en el Aß central (Cribbs eí al., 7a Conferencia Internacional sobre AD/PD, Sorrento, Italia, 2005). En consecuencia, se espera que cualquier inmunógeno de una vacuna activa capaz de generar una respuesta inmune que resulte en la elevación de los niveles de Aß en plasma, será útil para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y los trastornos relacionados, caracterizados por niveles elevados de Aß cerebral. Las Solicitantes han encontrado de manera sorprendente que un antígeno que elimina los epitopos de los linfocitos T, para evitar una autorrespuesta a los linfocitos T, es inmunogénico y eleva los niveles de Aß en plasma. Esto representa un medio potencial para producir una vacuna segura y efectiva para la AD. Las Solicitantes proporcionan en la presente, tal antígeno y una formulación para utilizarse como una vacuna para la AD.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un fragmento inmunogénico de Aß, que carece de un epitopo de linfocito T, capaz de inducir una respuesta inmune en la forma de anticuerpos para Aß. En un aspecto, esta composición comprende péptidos lineales de 8 aminoácidos (8-meros) de Aß. En aún otro aspecto, esta composición comprende 8-meros lineales multivalentes intercalados con al menos un separador o un péptido antigénico con múltiples ramificaciones, multivalente (MAP). La composición farmacéutica puede utilizarse como una vacuna para la AD y las enfermedades amiloides relacionadas. En otra modalidad de la invención, la composición farmacéutica es un agente que eleva el Aß en plasma, que comprende un fragmento inmunogénico de Aß, que carece de un epitopo de linfocito T, capaz de inducir una respuesta inmune en la forma de anticuerpos para Aß, que eleva los niveles de Aß en plasma. La composición farmacéutica puede utilizarse como una vacuna para la AD y las enfermedades amiloides relacionadas, caracterizadas por niveles de Aß cerebral. En aún otra modalidad de la invención, la composición farmacéutica está enlazada a una molécula portadora para formar un conjugado, en donde el portador ayuda a provocar una respuesta inmune que comprende anticuerpos para el fragmento Aß. En una modalidad preferida de la invención, el portador es el complejo de la proteína de la membrana externa de Neisseria meningitides (OMPC). En una modalidad adicional de la invención, la composición farmacéutica se administra con un adyuvante farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, el adyuvante es un adyuvante de aluminio (adyuvante de alumbre de Merck, MAA) o un adyuvante basado en saponina (ISCOMATRIX®, CSL Ltd., Parkville, Australia).

En aún otra modalidad, la invención proporciona métodos para prevenir o tratar una enfermedad asociada con los depósitos amiloides de Aß en el cerebro de un paciente. Tal enfermedad incluye la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, disminución cognoscitiva u otras formas de demencia senil. El método comprende administrar un fragmento inmunogénico de Aß, que carece de un epitopo de linfocito T, seleccionado del grupo que consiste de péptidos lineales de 8 aminoácidos (8-meros), péptidos lineales multivalentes dispersos con al menos un separador, y un péptido antigénico con múltiples ramificaciones, multivalente (MAP). En una modalidad preferida, el fragmento inmunogénico comprende un péptido lineal multivalente con un separador de polietilenglicol (PEG). En una modalidad más preferida, el fragmento inmunogénico comprende un MAP ramificado multivalente, conjugado Aß (3-10)/(21-28), Constructo No. 12, Figura 3A, conjugado a OMPC. Tales métodos abarcan la administración de una dosis efectiva de un fragmento inmunogénico de Aß, que carece de un epitopo de linfocito T, a pacientes en necesidad de tal tratamiento, que inducirá una respuesta inmune en la forma de anticuerpos para Aß. Tal respuesta del anticuerpo es capaz de elevar los niveles de Aß en plasma. En otro aspecto de esta modalidad, el fragmento inmunogénico a ser administrado está enlazado a una molécula portadora. En aún otro aspecto de esta modalidad, el fragmento inmunogénico se administra con un adyuvante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1 C representan la reactividad cruzada del suero extraído de un cobayo previamente inmunizado con un conjugado de Aß (3-10)-KLH (SEQ ID NO: 40) en el tejido de cerebro humano con AD. La Figura 1A muestra la inmunorreactividad del anticuerpo monoclonal anti-Aß 6F3D (que reconoce los aminoácidos 8-17 de Aß). El patrón de tinción revela la extensa patología amiloide en este cerebro humano. La Figura 1 B demuestra una falta de inmunorreactividad de este mismo cerebro al suero preinmune del cobayo inmunizado antes de la inmunización. La Figura 1C muestra la inmunorreactividad del suero de un cobayo inmunizado después de la inmunización. La Figura 2 muestra péptidos 8-méricos multivalentes representativos, que se seleccionaron basándose en la inmunogenicidad de los 8-meros separados en estudios con cobayos (Ejemplo 3). Estos conjugados se sintetizaron como se describió y se conjugaron a OMPC (ejemplo 1.J y 1.K). Las Figuras 3A-3B muestran los conjugados MAP ramificados multivalentes representativos, que se seleccionaron basándose en la inmunogenicidad de los 8-meros separados en estudios con cobayos (Ejemplo 3). La Figura 3A muestra los MAP divalentes representativos y la Figura 3B muestra los MAP de bromoacetilo-cisteína representativos. Estos conjugados se sintetizaron como se describió y se conjugaron a OMPC (Ejemplo 2).

La Figura 4 representa el título de anti-Aß40 del suero recolectado de monos rhesus después de 1 (PD1 ) o 2 (PD2) inyecciones con un péptido Aß (1-18) conjugado a OMPC, formulado en alumbre de Merck solo o en alumbre de Merck más IMX (ISCOMATRIX®, CSL, Ltd., Parkville, Australia), como un adyuvante. Las Figuras 5A-5B representan el incremento en los niveles de Aß en plasma después de la administración de un conjugado Aß. La Figura 5A muestra una elevación mayor de tres veces después de la administración de un constructo de MAP que comprende Aß (3-10)/(21-28) (Constructo No. 12, Figura 3A), conjugado a OMPC versus los constructos monoméricos, Aß (3-10) (SEQ ID NO: 69) y Aß (21-28) (SEQ ID NO: 73) (D, Constructo No. 12, Figura 3A; •, Aß (3-10) (SEQ ID NO 69), ? , Aß (21-28) (SEQ ID NO: 73). La Figura 5B muestra que los niveles de Aß en plasma son independientes de los niveles del título (D, Constructo No. 12, Figura 3A; •, Aß (3-10) (SEQ ID NO 69), A , Aß (21-28) (SEQ ID NO: 73).

Definiciones El término "8-mero", se refiere a un péptido de ocho aminoácidos que corresponde a un fragmento de Aß, un análogo de un péptido Aß natural o un mimético del péptido. Uno o más de los 8-meros puede combinarse con al menos un separador para formar un péptido lineal multivalente o para formar un MAP ramificado multivalente.

El término "conjugado Aß" significa un 8-mero o un fragmento inmunogénico de Aß que está enlazado de manera química o biológica a un portador, tal como hemocianina de lapa calada o el complejo de la proteína de la membrana externa de Nesseria meningitidies (OMPC). El término "péptido Aß" significa cualquiera de los péptidos Aß descritos en la presente, incluyendo, de manera no exclusiva, 8-meros lineales, péptidos lineales multivalentes con al menos un separador y péptidos antigénicos con múltiples ramificaciones, multivalentes (MAP). El término "epitopo" se refiere a un sitio en un antígeno en el cual los linfocitos B y/o T responden. Los epitopos de los linfocitos B pueden formarse de los aminoácidos contiguos o de los aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por un pliegue terciario de una proteína. Los epitopos formados de los aminoácidos contiguos se mantienen típicamente en exposición a solventes desnaturalizantes, mientras que los epitopos formados por el pliegue terciario se pierden típicamente en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Los epitopos de los linfocitos T consisten de péptidos que son capaces de formar complejos con las moléculas MHC hospederas. Los epitopos de los linfocitos T para las moléculas clase I de MHC humanas, que son responsables de la inducción de las respuestas de los linfocitos T CD8+, comprenden generalmente de 9 a 11 residuos de aminoácidos, mientras que los epitopos para las moléculas clase II de MHC humanas, que son responsables de las respuestas de los linfocitos T CD4+, comprenden típicamente 12 o más residuos de aminoácidos (Bjorkman eí al. Nature 329:506-512, 1987; Madden eí al. CeN 75:693-708; Batalla y Collins; Engelhard Annu Rev immunol., 12: 181-207-622. 1995; Madden, Annu Rev Immunol., 13:587-622. 1995). A diferencia de los linfocitos T, los linfocitos B son capaces de reconocer los péptidos tan pequeños como de 4 aminoácidos de longitud. Son los complejos del epitopo de linfocito T/MHC que son reconocidos por los receptores del linfocito T los que conducen a la activación de los linfocitos T. El término "fragmento inmunogénico de Aß" o "fragmento inmunogénico de Aß, que carece de una respuesta del linfocito T", como se utiliza en la presente, se refiere a un 8-mero o a un fragmento Aß que es capaz de inducir una respuesta inmune en la forma de anticuerpos para Aß, pero respuesta la cual no incluye una respuesta del linfocito T al autoantígeno Aß. El término respuesta "inmunológica" o "inmune" o "inmunogénica", se refiere al desarrollo de una respuesta humoral (mediada por el anticuerpo) y/o celular (mediada por los linfocitos T específicos del antígeno o sus productos de secreción), dirigida contra un antígeno en un individuo vertebrado. Tal respuesta puede ser una respuesta activa inducida por la administración de un inmunógeno o una respuesta pasiva inducida por la administración de un anticuerpo. El término "péptido multivalente" se refiere a péptidos que tienen más de un determinante antigénico.

El término "composiciones farmacéuticas" significa una composición química o biológica adecuada para la administración a un individuo mamífero. Como se utiliza en la presente, se refiere a una composición que comprende 8-meros, fragmentos inmunogénicos de Aß y conjugados de Aß descritos en la presente para ser administrados opcionalmente con o sin un adyuvante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA BNVENCBQN Como se describió previamente, los estudios preclínicos sugieren que la inmunización activa que resulta en una respuesta al anticuerpo policlonal anti-Aß proporciona eficacia contra los síntomas patológicos y cognoscitivos asociados con la AD en ratones transgénicos que sobreexpresan la proteína del precursor amiloide (Bard eí al., Nature Med.. 6: 916-919, 2000; Janus et al, Nature, 408: 979-982, 2000; Morgan et al., Nature, 408: 982-985, 2000; DeMattos eí al, Proc. Nati. Acad. Sci., 98: 8850-8855, 2001 ; Bacskai eí al, J. Neurosci.. 22: 7873-7878, 2002; Wilcoc, eí al, J, Neurosci., 23: 3745-3751 , 2003). Estos estudios preclínicos están apoyados por un solo ensayo clínico, en donde una forma agregada de Aß42 se utilizó como un inmunógeno activo. La evidencia preliminar de este estudio sugiere que se encontraron mejoras patológicas (Nicoll et al, Nature Med., 9: 448-452, 2003; Ferrer eí al, Brain Pathol., 14: 11-20, 2004; Masliah eí al, Neuroloqy, 64:129-131 , 2005) y cognoscitivas (Gilman eí al, Neuroloqy, 64 (9): 1553-1562, 2005), después del tratamiento. Mientras que estos hallazgos son alentadores y consistentes con los estudios preclínicos, el tratamiento probó ser inseguro y se terminó después de la aparición de meningoencefalitis en aproximadamente 6% de los pacientes tratados (Orgogozo eí al, Neurology, 61 : 46-54, 2003). Así, existe una necesidad por procedimientos de inmunización activa capaces de respuestas inmunes eficaces y desprovistos de problemas adversos de la seguridad. Se ha hecho progreso en el entendimiento de la naturaleza de los eventos adversos a este ensayo clínico preliminar. Varios investigadores ha reportado ahora la presencia de infiltrados meningeales positivos a CD4+ y CD8+ en la evaluación postmortem (Nicoll, eí al, Nature Med.. 9: 448-452, 2003; Ferrer eí al., Brain Pathol., 14: 11-20, 2004), lo que sugiere una respuesta de un linfocito T dirigida al autopéptido Aß42. Sin embargo, aunque aquellos con experiencia en la técnica reconocerían la necesidad de evitar una respuesta del linfocito T autodirigida, mientras se mantiene una respuesta al anticuerpo apreciable (mediada por los linfocitos B), los medios para producir un agente que tenga esta propiedad no se conocen. Esta dificultad esta combinada por una carencia de modelos animales predictivos u otros ensayos preclínicos con validez predictiva para estas actividades. Para este fin, los Solicitantes utilizaron en la presente la naturaleza diferente de los epitopos de los linfocitos T y B para diseñar los péptidos utilizados para la invención. Los constructos de la vacuna se diseñaron, restringiendo el tamaño del péptido lineal a ocho aminoácidos, y si es necesario, eliminando cualesquier residuos de anclaje C terminales potenciales del epitopo del linfocito T. En consecuencia, un aspecto de la presente invención fue la identificación de los fragmentos Aß que son inmunogénicos, pero carecen de un epitopo del linfocito T, para utilizarse como una vacuna para la AD. Antes de la presente solicitud, no se sabía definitivamente cuales fragmentos de aminoácidos del péptido Aß producirían una respuesta inmunogénica que también sería deficiente en un epitopo del linfocito T. Aquellos con experiencia en la técnica apreciarán que las enseñanzas previas en el campo no predicen, por ejemplo, que un 8-mero produciría una respuesta inmunogénica y no distinguen la utilidad de los fragmentos de diferentes regiones del péptido Aß. Véase, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 6,808,712 y 6,787,144. Un aspecto adicional de la invención incluye en la presente la identificación de los agentes que elevan el Aß en plasma, que comprenden un fragmento inmunogénico de Aß, que carece de un epitopo de linfocito T, que induce una respuesta inmune en la forma de anticuerpos a Aß, y que elevan los niveles de Aß en plasma. Tales agentes pueden utilizarse como una vacuna para la AD y para las enfermedades amiloides relacionadas caracterizadas por niveles elevados de Aß cerebral. Antes de la invención de las Solicitantes, no se sabía o era predecible cuales fragmentos inmunogénicos de Aß resultarían en niveles elevados de Aß en plasma. Sin desear apegarse a ninguna teoría, se cree que los agentes que elevan el Aß en plasma descritos en la presente, actúan para inducir una respuesta inmune en la forma de anticuerpos para Aß que, de acuerdo con la teoría del recolector periférico de la eliminación de Aß, producen niveles elevados de Aß en plasma, que conducen a disminuciones posteriores en el Aß cerebral. Además, aunque los 8-meros individuales o fragmentos inmunogénicos de Aß pueden ser capaces de inducir una respuesta inmune de manera que los niveles de Aß en plasma son elevados, las Solicitantes encontraron que un MAP ramificado multivalente, Aß (3-10)/(21-28) (Constructo No. 12, Figura 3A), conjugado a OMPC, fue particularmente efectivo para elevar los niveles de Aß en plasma con relación a aquéllos de sus constructos monoméricos constituyentes, Aß (3-10) (SEQ ID NO: 69) o Aß (21-28) (SEQ ID NO: 73).

Enfermedades amiloides La invención proporciona composiciones y métodos para el tratamiento profiláctico y terapéutico de la enfermedad caracterizada por la acumulación de depósitos amiloides. Los depósitos amiloides comprenden un péptido agregado a una masa insoluble. La naturaleza del péptido varía en diferentes enfermedades, pero en la mayoría de los casos, el agregado tiene una estructura de lámina plegada ß y se tiñe con tinte Rojo Congo. Las enfermedades caracterizadas por los depósitos amiloides incluyen la enfermedad de Alzheimer (AD), tanto de inicio tardío como temprano. En ambas enfermedades, el depósito amiloide comprende un péptido denominado beta amiloide (Aß), que se acumula en el cerebro de los individuos afectados. Así, el término "enfermedad amiloide", también se refiere a una enfermedad caracterizada por niveles elevados de Aß cerebral.

Agentes terapéuticos Los agentes terapéuticos para utilizarse en la presente invención inducen una respuesta inmune en la forma de anticuerpos para Aß. La inducción de una respuesta inmune puede ser activa como cuando un inmunógeno se administra para producir los anticuerpos o linfocitos T reactivos con Aß en un individuo, o pasiva, como cuando se administra un anticuerpo que se une por sí mismo al Aß en el individuo. El agente terapéutico a ser utilizado para prevenir o tratar las enfermedades amiloides, tales como AD, incluyen fragmentos peptídicos de Aß, que pueden ser cualquiera de las formas naturales (es decir, Aß39, Aß 0> Aß 2, Aß42 o Aß 3). Estas secuencias son conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, Hardy eí al., TINS 20: 155-158, 1997. Como se utiliza en la presente, el agente terapéutico es, en una modalidad preferida, un fragmento inmunogénico que carece de un epitopo de linfocito T, capaz de inducir una respuesta inmune en la forma de anticuerpos para Aß. El fragmento inmunogénico de Aß puede estar en la forma de un 8-mero, un conjugado Aß lineal multivalente, que tiene al menos un separador de PEG o un conjugado de Aß de MAP ramificado multivalente. El agente terapéutico puede administrarse en la forma de una composición farmacéutica. En otra modalidad, el agente terapéutico es un agente que eleva el Aß en plasma, capaz de inducir una respuesta inmune en la forma de anticuerpos para Aß y que eleva los niveles de Aß en plasma en un individuo. Tales agentes pueden comprender un fragmento peptídico natural o pueden incluir una o más sustituciones, adiciones o supresiones y pueden incluir aminoácidos sintéticos o no naturales. Los fragmentos y constructos pueden seleccionarse para la eficacia profiláctica y terapéutica en los ensayos descritos en la presente. Aunque en una modalidad preferida los agentes terapéuticos comprenden un fragmento peptídico de Aß, tales agentes también pueden incluir péptidos y otros compuestos que no necesariamente tienen una similitud de la secuencia de aminoácidos con Aß, pero que sin embargo, pueden servir como miméticos de Aß e inducir una respuesta inmune similar. Por ejemplo, los péptidos y proteínas que forman hojas con pliegues ß pueden seleccionarse para la adecuabilidad para la invención presente. De manera similar, las bibliotecas combinatorias y otros compuestos pueden seleccionase para adecuabilidad para la invención presente. Tales agentes terapéuticos identificados pueden enlazarse ya sea de manera química o biológica a un portador para facilitar su uso como un ¡nmunógeno. Tales portadores incluyen seroalbúminas, hemocianina de lapa calada (KLH), moléculas de inmunoglobulina, ovoalbúmina, proteína del toxoide tetánico o un toxoide de otras bacterias patogénicas, tales como difteria, E. coli, cólera o H. pylori, o un derivado de toxina atenuado. En una modalidad preferida de la invención, el portador es el complejo de la proteína de la membrana externa de Neisseria meningitides (OMPC). La invención presente también contempla el uso de tales agente terapéuticos en una composición farmacéutica que comprende un 8-mero o un fragmento inmunogénico de Aß, que puede enlazarse a un portador, para ser administrado opcionalmente con un adyuvante. Los adyuvantes adecuados incluyen sales de aluminio (alumbre), un lípido, tal como el monofosforil lípido A (MPL) 3 De-O-acilado o un adyuvante basado en saponina. En una modalidad preferida, el adyuvante es un adyuvante de aluminio (adyuvante de alumbre de Merck, MAA) o un adyuvante basado en saponina (ISCOMATRIX®, CSL Ltd, Parkville, Australia.

Regímenes de tratamiento Las dosis efectivas de las composiciones de la invención presente para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la AD y otras enfermedades amiloides variarán dependiendo de muchos factores, incluyendo, de manera no exclusiva, medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente, otras medicaciones administradas y si el tratamiento es terapéutico, es decir, después del inicio de los síntomas de la enfermedad, o profiláctico, es decir, para prevenir el inicio de los síntomas de la enfermedad. En una modalidad preferida, el paciente es un humano, y el agente terapéutico se administra mediante inyección.

La cantidad de inmunógeno o agente terapéutico a ser empleada, también dependerá de si un adyuvante se va a administrar de manera concomitante o secuencial, con las dosis más altas que se emplean en la ausencia de un adyuvante. La cantidad de un inmunógeno o agente terapéutico a ser administrado variarán, pero las cantidades que varían de 0.5-50 µg de péptido (basándose en el contenido del péptido Aß) por inyección, son consideradas para uso humano. Aquellos con experiencia en la técnica sabrán como formular composiciones que comprenden antígenos del tipo descrito en la presente. El régimen de administración consistiría de una inmunización primaria seguida por inyecciones de refuerzo a intervalos fijos. Los intervalos entre la inmunización primaria y la inmunización de refuerzo, los intervalos entre las inmunizaciones de refuerzo y el número de inmunizaciones de refuerzo, dependerá de los títulos del anticuerpo y la duración provocada por la vacuna. También dependerá de la eficacia funcional de las respuestas del anticuerpo, a saber, los niveles de los títulos de anticuerpo requeridos para evitar el desarrollo de la AD o para ejercer efectos terapéuticos en los pacientes con AD. Un régimen típico consistirá de un conjunto inicial de inyecciones a 1 , 2 y 6 meses. Otro régimen consistirá de inyecciones iniciales a 1 y 2 meses. Para cualquier régimen, se proporcionarán inyecciones de refuerzo cada seis meses o cada año, dependiendo de los títulos y duraciones del anticuerpo. Un régimen de administración también puede ser en una base conforme se necesite, como se determina por la verificación de las respuestas inmunes en el paciente.

Identificación de los epitopos de la vacuna para AD Con el fin de determinar cuales fragmentos de 8 aminoácidos ("8-meros") del péptido Aß fueron suficientes para producir una respuesta inmunogénica, las Solicitantes exploraron de manera sistemática toda la longitud de Aß 2 con pequeños péptidos sintéticos superpuestos (8 aminoácidos) derivados de la secuencia de Aß natural (SEQ ID NO. 1) como se muestra en el cuadro A (SEQ ID NOS: 2-37). El cuadro A representa los péptidos de 8 aminoácidos sintéticos (8-meros) (SEQ ID NOS: 2-36) derivados de Aß (1-42) (SEQ ID NO: 1 ), de los cuales se seleccionan los péptidos para realizar una exploración del péptido lineal para identificar los epitopos de Aß. Veintinueve péptidos de ocho aminoácidos superpuestos, que abarcan toda la longitud de Aß 2, se sintetizaron (cuadro B) para utilizarse como antígenos. Para mejorar la solubilidad, varios de los péptidos se modificaron por la adición de residuos triples de lisina (KKK) (SEQ ID NOS: 52, 53, 54, 56, 59, 60, 62, 64 y 65) o glutamina (EEE) (SEQ ID NOS: 50, 51 y 61 ), o el uso de un separador de polietilenglicol (PEG) (SEQ ID NOS: 55 y 63). Por esta razón, los péptidos que abarcan las secuencias de Aß que corresponden a los residuos (11-18) y (13-20), se hicieron en múltiples formas, la primera con un separador de ácido 6-aminohexanoico (Aha) más un grupo funcional para la reticulación química en el término N y la otra forma con Aha y el grupo funcional en el término C. Como un control, las Solicitantes incluyeron un péptido más largo, Aß (1-18). CUADRO A CUADRO B Exploración de Péptido Posición Aß Seq ID (Ac-DAEFRHDSGYEVHHQKLV-(Aha)-C-NH2) 1-18 37 (Ac-DAEFRHDS-(Aha)-C-NH2) 1-8 38 (Ac-AEFRHDSG-(Aha)-C-NH2) 2-9 39 (Ac-EFRHDSGY-(Aha)-C-¡MH2) 3-10 40 (Ac-FRHDSGYE-(Aha)-C-NH2) 4-11 41 (Ac-RHDSGYEV-(Aha)-C-NH2) 5-12 42 (Ac-HDSGYEVH-(Aha)-C-NH2) 6-13 43 (Ac-DSGYEVHH-(Aha)-C-NH2) 7-14 44 (Ac-SGYEVHHQ-(Aha)-C-NH2) 8-15 45 (Ac-GYEVHHQK-(Aha)-C-NH2) 9-16 46 (Ac-YEVHHQKL-(Aha)-C-NH2) 10-17 47 (Ac-EVHHQKLV-(Aha)-C-NH2) 11-18 48 (Ac-HHQKLVFF-(Aha)-C-NH2) 13-20 49 (Ac-EVHHQKLVEEE-(Aha)-C-NH2) 11-18 50 (Ac-HHQKLVFFEEE-(Aha-C-NH2) 13-20 51 (Ac-HHQKLVFFKKK-(Aha-C-NH2) 13-20 52 (Ac-QKLVFFAEKKK-(Aha-C-NH2) 15-22 53 (Ac-LVFFAEDVKKK-(Aha-C-NH2) 17-24 54 (Ac-LVFFAEDV-(PEG)-(Aha)-C-NH2) 17-24 55 (Ac-FFAEDVGSKKK-(Aha)-C-NH2) 19-26 56 (Ac-AEDVGSNK-(Aha)-C-NH2) 21-28 57 (Ac-DVGSNKGA-(Aha)-C-NH2) 23-30 58 (Ac-GSNKGAIIKKK-(A a)-C-NH) 25-32 59 (Ac-NKGAIIGLKKK-(Aha)-C-NH2) 27-34 60 (Ac-GAIIGLMVEEE-(Aho)-C-NH2) 29-36 61 (Ac-IIGL VGGKKK-(Aha)-C-NH2) 31-38 62 (Ac-GLMVGGW-(PEG)-(Aha)-C-NH2) 33-40 63 (Ac-GLMVGGWKKK-(Aha)-C-NH2) 33-40 64 (Ac-MVGGWIAKKK-(Aha)-C-NH2 ) 35-42 65 (PEG)= -NHCH2CH20(CH2CH2?)6CH2CH2NHCOCH2?CH2CO-(Aha)= ácido 6-amino exanoico Como se utiliza en la presente, los fragmentos inmunogénicos pueden ser péptidos de 8-meros (residuos de ocho aminoácidos) depvados de Aß natural, es decir, del tipo silvestre o sintético (SEQ ID NO:1 ) o cualquier mutación o variación del mismo. Tal mutación o variación puede producirse por medios sintéticos o recombinantes conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Un ejemplo de tal variante es el sustrato EV (EVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA) (SEQ ID NO: 66), un péptido que corresponde a Aß (1-42) en el cual, las posiciones 1 y 2 del Aß del tipo silvestre se han variado.

Conjugados Aß para uso en la formulación de la vacuna La selección de los conjugados Aß para utilizarse en la formulación de una vacuna, se basó en la inmunogenicidad de los 8-meros. Con el fin de determinar la inmunogenicidad del 8-mero en una especie con una secuencia idéntica a la secuencia Aß humana, los 29 péptidos (cuadro B), se conjugaron a KLH para formar un conjugado Aß y se probaron en cobayos (cuadro D). Como un inmunógeno de control, Aß (1-18)-KLH (SEQ ID NO: 37) se incluyó en este análisis. Los cobayos se inmunizaron como se describió en el Ejemplo 3.B con inmunógenos conjugados formulados en alumbre más 50 µg de ISCOMATRIX® (CSL, Ltd., Parkville, Australia). Con el fin de distinguir los fragmentos Aß 2 inmunogénicos de los no inmunogénicos, los cobayos se inmunizaron tres veces a intervalos de cuatro semanas. Tres semanas después de cada inmunización, se recolectaron muestras de sangre y se probaron mediante ELISA para los títulos del anticuerpo contra el péptido Aß 0. Estos títulos se muestran en el cuadro D como la postdosis 1 (PD1 ), postdosis 2 (PD2) y la postdosis 3 (PD3), respectivameníe.

Después de la primera inyección (PD1 ), algunas regiones peptídicas provocaron títulos de anticuerpo apreciables como ei 18-mero de control. En particular, los conjugados Aß que corresponden a los aminoácidos de Aß 1-8, 2-9, 3-10, 17-24, 21-28 y 33-40, todos produjeron íííulos en exceso de 1 :800. Después de la segunda inyección (PD2), 15 de los conjugados Aß provocaron títulos en el anticuerpo en exceso de 1 :1000. El análisis a la postdosis 3 (PD3), confirmó además que ciertas regiones de Aß son más inmunogénicas con relación a las otras. Once regiones demostraron íííulos mayores que 1 :6000. Estas incluyeron regiones que corresponden a los aminoácidos de Aß 1-8, 3-10, 7-14, 11-18, 13-20, 15-22, 19-26, 21-28, 23-30, 27-34 y 29-36. De estas regiones, cinco regiones fueron alíamenie inmunogénicas (>1 : 10000) incluyendo: las regiones 1-8, 15-22, 21-28, 23-30 y 29-36. Esíos dalos sugieren que ciertas regiones de 8-aminoácidos de Aß son alíamenie inmunogénicas, mienlras que otras regiones (por ejemplo, 5-12, 25-32, 31-38 y 35-42), son no inmunogénicas (títulos < 1 :300). Los resultados también demuestran que aunque los conjugados Aß fueron capaces de provocar una respuesta del anticuerpo específica del péptido Aß40, no iodos los fragmeníos de Aß fueron igualmenle inmunogénicos.

Inmunorreactividad de los conjugados del péptido Aß-KLH Con el fin de demostrar que el suero inmune generado de los cobayos después de la inmunización con los conjugados del péptido Aß-KLH es relevaníe para la AD humana, se realizó un esludio para evaluar la inmunorreaclividad del suero policlonal de un cobayo inmunizado con un conjugado de Aß (3-10)-KLH (SEQ ID NO: 40). La muesíra de suero recolecíada cuaíro semanas después de la segunda inyección del conjugado Aß (3-10)-KLH (SEQ ID NO: 40) de un cobayo, se probó para la reactividad con íejidos cerebrales humanos con AD medianíe inmunohistoquímica (Ejemplo 4). Como se describe en las Figuras 1A-1 C, la respuesta inmunogénica producida por el conjugado Aß (3-10)-KLH (SEQ ID NO: 40), produjo una respuesta al anticuerpo que se dirigió contra el tejido cerebral humano con AD. La Figura 1A demuestra la inmunorreactividad del anticuerpo anti-Aß monoclonal 6F3D (Vector Laboratories). Como se muestra, esle cerebro íenía depósitos exlensos de Aß de una manera esperada como íípica para la AD humana. La Figura 1 B demuesíra una falta de inmunorreacíividad del suero de un cobayo preinmunizado. La Figura 1C muesíra la inmunorreacíividad posiíiva del suero del mismo cobayo después de dos inyecciones del conjugado Aß (3-10)-KLH (SEQ ID NO: 40). De manera colectiva, estos datos demueslran que la inmunogenicidad encontrada mediante ELISA contiene una respuesta del aníicuerpo significativa dirigida contra el Aß humano encontrado en este tejido con AD. Estos resultados confirman y extienden el hallazgo inesperado de la inmunogenicidad diferencial impartida por los fragmentos particulares de Aß, para demostrar además que esta respuesta está dirigida de manera consiste a una aplicación terapéuíica.

Generación de los conjugados OMPC y múlíiples conjugados aníigénicos Basándose en la inmunogenicidad en cobayos, la ubicación relaliva del fragmento peptídico dentro de la secuencia de aminoácidos de Aß42, la solubilidad de los fragmentos Aß y la factibilidad de utilizar OMPC como una proteína portadora, las Solicilantes seleccionaron siete 8-meros (cuadro C) para la conjugación con OMPC. Estos fragmeníos peptídicos corresponden a las siguienles regiones de aminoácidos de Aß: 1-8, 2-9, 3-10, 7-14, 17- 24, 21-28 y 33-40.

CUADRO C Ají (1-8) Ac-DAEFRHDS-(Aha)-K(BrAc)NH2 SEQ ID N0.67 Aß (2-9) Ac-AEFRHDSG-(Aha)-K(BrAc)NH2 SEQ ID N0.68 Aß (3-10) Ac-EFRHDSGY-(Aha)-K(BrAc)NH2 SEQ ID N0.69 Aß (7-14) Ac-DSGYEVHH-(Aha)-K(BrAc)NH2 SEQ ID N0.70 Aj? (8-15) Ac-SGYEVHHQ-(Aha)-K(BrAc)NH2 SEQ ID N0.71 Aß (17-24) Ac-LVFFAEDV-(PEG)-(Aha)-K(BrAc)NH2 SEQ ID N0.72 Aß (21-28) Ac-AEDVGSNK-(Aha)-K(BrAc)NH2 SEQ ID N0.73 Aß (33-40) Ac-GLMVGGW-(PEG)-(Aha)-K-(BrAc)NH2 SEQ ID N0.74 A0-EV (1-18) Ac-EVEFRHDSGYEYHHQKLV-(Aha)-K(BrAc)NH2 SEQ ID N0.75 A0-EV (1-10) Ac-EVEFRHDSGY-(Aha)-K(BrAc)NH2 SEQ ID N0.76 AS-EV (1-8) Ac-EVEFRHDS-(Aha)-K(BrAc)NH2 SEQ ID N0.77 (PEG)= -NHCH2CH20(CH2CH20)6CH2CH2NHCOCH2OCH2CO- (Aha)= ácido 6-aminohexanoico La invención descrita en la presente incluye conjugados peptídicos multivalentes tales como aquéllos mostrados en las Figuras 2, 3A y 3B. Los conjugados de MAP ramificado multivalenle-OMPC (Figuras 3A y 3B), se generaron uíilizando un armazón basado en lisina, mientras que los conjugados de 8-meros lineales multivalenles-OMPC (Figura 2), se prepararon uíilizando un enlazaníe de PEG. Aquellos con experiencia en la íécnica apreciarán que un enlazante de PEG, en comparación con los enlazantes de aminoácidos convencionales que lambién pueden ulilizarse en la presente, ofrece la ventaja de una inmunogenicidad menor y mayor solubilidad del péptido. En una modalidad preferida de la invención, el fragmento inmunogénico es un MAP multivalente conjugado a OMPC. Deberá entenderse por aquellos con experiencia en la técnica, que tal conjugación no es una relación 1 :1 de péptido a portador. En su lugar, una pluralidad de péptidos se une de una manera esférica a cada molécula de OMPC. Se apreciará además por aquellos con experiencia en la técnica que el uso de constructos lineales multivalentes y MAP, mejorará la solubilidad, estabilidad de la formulación, inmunogenicidad y la diversidad de la respuesta policlonal.

Inmunoqenicidad de las vacunas del conjugado OMPC En un esfuerzo por evaluar la inmunogenicidad de un conjugado de péptido Aß-OMPC y evaluar además el beneficio de un adyuvante con esíe conslructo de la vacuna, las Solicitantes iniciaron un estudio en monos rhesus.

Los monos rhesus se vacunaron con un conjugado Aß (1-18)-OMPC (dosis basada en el contenido del péptido Aß), que se formuló en adyuvante de alumbre de Merck (MAA) o MAA e ISCOMATRIX® (CSL, Ltd., Parkville, Australia). Las mueslras de sangre se recolectaron y utilizaron para determinar los títulos del anticuerpo contra Aß40. El análisis interino de este estudio en curso, demostró que a una postdosis 1 (PD1 ), los monos que recibieron 5 µg de vacuna en alumbre fallaron en desarrollar algún título detecíable, mienlras que aquéllos que reciben 30 µg de vacuna en alumbre, desarrollaron bajos íítulos específicos para Aß40. Todos los monos que recibieron la formulación de alumbre más ISCOMATRIX®, desarrollaron títulos del anticuerpo significativos. A la postdosis 2 (PD2), ambas dosis del conjugado Aß en alumbre solo, produjeron niveles de íítulos similares, mientras que las cohortes que recibieron el alumbre más ISCOMATRIX®, desarrollaron títulos del anticuerpo 10 veces más altos con relación a las cohortes con el alumbre solo. Los resultados de este estudio confirman que el conjugado Aß-OMPC es inmunogénico en primales no humanos. Los daíos demueslran además que la eficacia de tal vacuna del conjugado se mejora de manera significativa mediante un adyuvante basado en saponina tal como ISCOMATRIX®.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de los conjugados Este ejemplo describe la preparación de los fragmentos peptídicos Aß utilizados posteriormente para los conjugados Aß, para inducir una respuesta inmune en la forma de anticuerpos para Aß.

A. Preparación de los péptidos Aß (8-meros) (SEQ ID NOS.: 37-65; cuadro B) Los péptidos pretendidos para la conjugación para las proteínas portadoras derivadas con maleimida, se sintetizaron con un residuo de cisteína en el íérmino carboxi. El separador, Aha (ácido 6-aminohexanoico), se incorporó eníre la secuencia pepíídica primaria y la cisíeína carboxi lerminal como un elemenío eslruclural para reducir al mínimo la accesibilidad estérica para la proteína portadora duranle la conjugación. Además, se introdujeron residuos solubilizantes representados por EEE, KKK o PEG en el término C en las secuencias 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. La unidad de PEG se introdujo como 0-(N-Fmoc-2-aminoetil)-0'-(2-carboxieíil)-undecaelilenglicol [FmoC-NHCH2CH2O(CH2CH2O)10 CH2CH2OCH2CH2C02H].

Iniciando con resina MBHA de Amida de Rink, los péplidos Aß se prepararon mediante síntesis en fase sólida en un sinteíizador peptídico automaíizado, utilizando los protocolos de química Fmoc como se proporciona por el fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Después del montaje, el péptido unido a la resina se desprotegió y escindió de la resina utilizando un cóctel de ácido trifluoroacélico al 94.5%, 1 ,2-eíanditiol al 2.5%, íriisopropilsilano al 1 % y H2O al 2.5%. Después de un íralamiento de dos horas, la reacción se filtró, se concentró y el aceite resultaníe se triluró con éter etílico. El producto sólido se filtró, se disolvió en ácido acético al 50%/H2O y se secó por congelación. La purificación del producío semipuro se logró medianíe RPHPLC ulilizando un gradiente de TFA al 0.1%/H2O/acetonitrilo en un soporte C-18. Las fracciones se evaluaron mediante HPLC analítica. Las fracciones puras (>98%) se reunieron y secaron por congelación. La identidad se confirmó mediante el análisis de los aminoácidos y análisis del espectro de masas.

B. Preparación de los conjugados del pépíido Aß-KLH (SEQ ID NOS.: 37-65; cuadro B) Para preparar los conjugados de KLH, los péptidos Aß (8-meros), 2 mg, que contienen una cisteína C terminal, se suspendieron en 1 ml de amortiguador de conjugación de maleimida comercial (fosfato de sodio 83 mM, EDTA 0.1 M, NaCI 0.9 M, azida de sodio al 0.02%, pH 7.2 (Pierce Bioíechnology, Rockford, IL). Una muesíra de 2 mg de KLH acíivado con maleimida comercial (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), se agregó al péplido y se dejó reaccionar a 25°C durante cuatro horas. El conjugado se separó del pépíido sin reaccionar y los reacíivos medianíe diálisis exhausíiva versus amortiguador de PBS utilizando una tubería de diálisis de 100,000 Da. La cantidad de péptido incorporada en el conjugado se estimó medianíe el análisis de los aminoácidos después de una hidrólisis acida de 70 horas. Las concenlraciones del pépíido se deíerminaron como de eníre 0.24 y 0.03 mg/ml.

O Síníesis de los pépíidos Aß bromoacefilados (SEQ ID NOS.: 67-77; cuadro C) Los péplidos bromoacelilados se prepararon mediante síntesis en fase sólida con t-Boc estándar, utilizando un protocolo de acoplamiento doble para la introducción de los aminoácidos en el sintetizador automatizado modelo 430A de Applied Biosystems. Iniciando con una resina de p-metilbenzhidrilamina, el aminoácido carboxi terminal t-Boc-Lys (Fmoc)-OH se introdujo seguido por los aminoácidos posteriores a la secuencia. Se introdujo el Aha como un separador para todas estas secuencias y una unidad de PEG en las secuencias 35 y 37 para ayudar a la solubilidad acuosa. La unidad de PEG se introdujo como 0-(N-Boc-2-aminoetil)-0'-(N-diglicolil-2-aminoelil)hexaeíilengliclol [BOC-NHCH2CH20(CH2CH20)6 CH2CH2NHCOCH2OCH2C02H]. El íérmino amino se coronó medianíe el acoplamiento del ácido acético. Después del montaje de la secuencia primaria, el grupo proleclor Fmoc en el grupo amino epsilon de la lisina carboxi torminal se eliminó mediante el tralamienío con piperidina. Posteriormente, el grupo amino Ne se hizo reaccionar con anhídrido bromoacético en cloruro de meíileno como el solvento duraníe 30 minutos. La desprotección y eliminación del péptido de este soporte de la resina se logró mediante el íratamiento con ácido fluorhídrico líquido y anisol al 10% como un depurador. Los pépíidos se purificaron medianíe HPLC preparaliva en columnas de sílice C-18 de fase inversa, uíilizando un gradieníe de TFA al 0.1 %/aceíonitrilo. La ideníidad y homogeneidad de los péptidos se confirmó mediante HPLC analítica y análisis del espectro de masas.

D. Síntesis del MAP divaleníe bromoaceíilado, Consírucío No. 8, Figura 3A La síntesis de los péptidos antigénicos con múlíiples ramificaciones bromoacetilados (MAP), es similar a aquélla descrita en el Ejemplo 1.C. Después del acoplamiento del Fmoc-Lys(ivDde)-OH [ivDde = 1 , (4,4-Dimeíil-2,6-dioxo-ciclohexiliden)-3-meíil-bulilo] carboxi terminal a resina MBHA, el grupo protector de Fmoc a-amino, se eliminó utilizando piperidina y la síntesis continuó con la inlroducción de l-Boc-Lys(Fmoc)-OH. Después de la desprolección del grupo l-Boc, la secuencia se exíendió como los siguienles aminoácidos protegidos con t-Boc: Aha, Y, G, S, D, H, R, F, E y el término amino se coronó mediante acoplamiento con ácido acético el en sintetizador ABl. El grupo protector de Fmoc de lisina de la cadena lateral, se eliminó con piperidina y el brazo Ne de la lisina se exlendió en el sinleíizador ABl con la iníroducción de los siguienles aminoácidos prolegidos: Aha, H, H, V, E, Y, G, S, D y el término amino se coronó mediante acoplamiento con ácido acéíico. La eliminación del grupo proíecíor ivDde fue mediante el tralamienío con hidrazina al 5% en dimelilformamida durante 5 minutos, proporcionando el grupo amino Ne no bloqueado en la lisina carboxi terminal, que se elaboró además con anhídrido bromoacético, como se describió en el Ejemplo 1.C. La escisión del péptido de la resina, su purificación posíerior y la caraclerización son como se describió en el Ejemplo 1.C.

E. Síníesis de los MAP bromoacetilados, Construcíos Nos. 11 v 12, Figura 3A Los construcíos de MAP Nos. 11 y 12 se prepararon como se describió en el Ejemplo 1.D.

F. Síníesis del MAP mulfivalenfe de cisíeína, Consírucío No. 9, Figura 3A Iniciando con la resina MBHA, se montaron los siguieníes aminoácidos prolegidos con í-Boc en el sintelizador aulomalizado ABl C, Lys(Fmoc), Aha, Y, G, S, D, H, R, F, E seguido por el acoplamiento con ácido acéíico. El grupo proíecíor Fmoc de amino Ne de la lisína se eliminó, y la síníesis coníinuó con la inlroducción de los siguieníes aminoácidos prolegidos con l-Boc: Aha, H, H, V, E, Y, G, S, D seguido por el acoplamiento con ácido acético. El péptido unido a la resina, se purificó y caracterizó como en el Ejemplo 1.C. Nota: En lugar de anisol al 10% como en el Ejemplo 1.C, se utilizó una mezcla 1 :1 de p-cresol: p-tiocresol como un depurador utilizando escisión con HF.

G. Síntesis de los MAP divalentes de cisteína. Consírucíos Nos. 10. 13 y 14. Figura 3A Los MAP divalentes, Constructos Nos. 10, 13 y 14, Figura 3A, se prepararon como se describió en el Ejemplo 6.F. La unidad de PEG se introdujo como 0-(N-Boc-2-aminoelil)-0'-(N-diglicolil-2-aminoelil)hexaeíilenglicol (l-Boc-NHCH2CH2O(CH2CH2O)6 CH2CH2NHCOCH2OCH2C02H).

H. Síníesis del MAP mulíivaleníe bromoaceíilado, Construcío No. 16. Figura 3B Ulilizando el siníelizador automatizado ABl, el Fmoc-Lys (í-Boc)-OH se acopló a la resina MBHA. Después de la eliminación del grupo prolecíor t-Boc en el grupo amino Ne de la lisina, la secuencia se extendió con la ¡nlroducción de los siguieníes aminoácidos proíegidos con l-Boc: Aha, Y, G, S, D, H, R, F, E, seguido por el acoplamiento con ácido acético. El grupo protector de Fmoc Ns en la lisina se eliminó mediante el tralamienlo manual con piperidina. La secuencia se elaboró además (en el sintetizador ABl) con la introducción de Fmoc-Lys (t-Boc)-OH seguido por los siguientes aminoácidos proíegidos con í-Boc: Aha, H, H, V, E, Y, G, S, D y el acoplamienlo del ácido acélico. El grupo proleclor de amino Na Fmoc se eliminó como se describió previamente y la síntesis continuó con la introducción de Fmoc-Lys(t-Boc)-OH, seguido por los aminoácidos protegidos con t-Boc: Aha, K, N, S, G, V, D, E, A y acoplamiento con ácido acético. El grupo protector Fmoc Na en la lisina se eliminó, y la síntesis continuó con la introducción de Fmoc-Lys(t-Boc)-OH, seguido por los siguienies aminoácidos prolegidos con l-Boc: Aha, V, V, G, G, V, M, L, G y acoplamiento con ácido acético. Después de la eliminación del grupo protector de Fmoc Na de la lisina, el péptido unido a la resina se hizo reaccionar con anhídrido bromoacético como en el Ejemplo 1.C. El aislamiento y la caracterización del produelo final fue como en el Ejemplo 1.C.

I. Síntesis de MAP multivalentes, Consíructos Nos. 15 y 17, Figura 3B La síntesis de los conjugados de Aß de MAP, Constructos Nos. 15 y 17, Figura 3B, es como se describió en el Ejemplo 1.F y 1.H.

J. Síntesis del péptido lineal multivalente bromoaceíilado, Constructo No. 1 , Figura 2 Iniciando con la resina MBHA, la secuencia primaria se sinieíizó utilizando la química de t-Boc en el siníeíizador automatizado ABl como se describe en el Ejemplo 6.A. Las unidades de PEG dispersas se introdujeron manualmeníe como el ácido Fmoc-1-amino-4,7,10-lrioxa-13-íridecanamin succínico [Fmoc-NHCH2CH2CH20(CH2CH20)2CH2CH2CH2NHCOCH2 CH2C02H], uíilizando el reacíivo BOP como el agento de acoplamienío. Se utilizó piperidina para la desprolección del grupo Fmoc. La bromoacelilación del término amino fue como se describió en el Ejemplo 1.C. El aislamiento y la caracterización del producío deseado fue como en el Ejemplo 1.C.

K. Siníesis de los pépíidos Aß lineales mulíivaleníes, Consírucíos Nos. 2, 5, 6 y 7, Figura 2 La síntesis de los péptidos Aß lineales multivaleníes, Consírucíos Nos. 2, 5, 6 y 7, es como se describió en el Ejemplo 1.J.

EJEMPLO 2 Conjugación química de los péptidos Aß a OMPC Este ejemplo presenta la conjugación química de los péptidos derivados de Aß42 humano al Complejo de la Proteína de la Membrana Externa (OMPC) de Neisseria meningitidis, tipo B, purificado. La naturaleza química del acoplamiento es la reacción entre el péptido derivado con haloacetilo y la proleína derivada con tiol del complejo de la membrana. Los péptidos amiloides se sinteíizaron como se describió anleriormenle con la funcionalidad bromoacetilo en el término N para los péptidos del epitopo lineal divalente o en el término C, o se unieron a través del grupo amino epsilon de un residuo de lisina para las formas de MAP lineales y ramificadas monovaleníes. El grupo BrAc se separó del pépíido maduro medianíe un separador que consisto de ácido 6-aminohexanoico (Aha). Referirse a las secuencias descriías anteriormente. La conjugación se describirá para el péptido represenlativo, Aß (3-10). Todas las manipulaciones de las soluciones que contienen OMPC se realizaron en un medio de flujo laminar seguido por técnicas asépticas estándar.

A. Tiolación de OMPC El OMPC estéril purificado, obtenible de un procedimiento tal como aquél descrito en Fu, Patente de E.U.A. No. 5,494,808, ulilizado para la producción de PedvaxHIB® y vacunas de conjugado de neumococos, se liolaron en una porción de sus residuos de lisina accesibles a la superficie, utilizando el reactivo N-acelilhomocisíeinliolacíona (NAHT, Aldrich, St. Louis, MO). La OMPC en agua, 117 mg, se granuló mediante cenírifugación a 289,000 x g duranle 60 minuíos a 4°C, y el sobrenadaníe se descartó. El amortiguador de aclivación burbujeado con N2 (borato de sodio 0.11 M, pH 11 ), se agregó al lubo de la cenírífuga y la pelotilla se desalojó con una varilla de agitación de vidrio. La suspensión se transfirió a un homogeneizador de Dounce de vidrio y se resuspendió con 30 golpes. El íubo de la centrífuga se lavó y el lavado se homogeneizó con el dounce con 30 golpes. La pelotilla resuspendida y el lavado se combinaron en un recipiente limpio para proporcionar una concentración de OMPC de 10 mg/mL. DTT sólido y EDTA se disolvieron en amortiguador de acíivación burbujeado con N2 y se cargaron al recipieníe a una relación de 0.106 mg de DTT/mg de OMPC y 0.57 mg de EDTA/mg de OMPC. Después de un mezclado suave, se disolvió NAHT en agua burbujeada con N2 y se cargó a la reacción a la relación de 0.89 mg de NAHT/mg de OMPC. La reacción procedió durante tres horas a íemperaíura ambiente, protegida de la luz en una campana de N2. Tras la terminación, el OMPC se granuló como se describió anleriormeníe y se resuspendió a 6 mg/mL medianíe homogenización Dounce en un amortiguador de conjugación burbujeado con N2 (borato de sodio 25 mM, pH 8.5, NaCI 0.15 M), para lavar la pelotilla. Para la resuspensión final, el OMPC se granuló como en lo anterior, y se resuspendió a 10 mg/mL mediante homogenización Dounce en amortiguador de conjugación burbujeado con N2. Se reliró una alícuola para la deíerminación del tiol libre mediante el ensayo de Ellman y el producto a granel se almacenó en hielo en la oscuridad hasla el uso. El contenido del tiol medido era de entre 0.2 a 0.3 µmol/mL.

B. Conjugación del péptido Aß a OMPC En contenido de BrAc funcional del péptido se supone que es de 1 :1 en una base molar. Suficiente péptido se pesó para proporcionar un exceso molar de 1.6 molar de BrAc sobre el tiol total. La proteína OMPC total objetivo para cada conjugación fue de 15 mg. Los péptidos se resuspendieron en amortiguador de conjugación burbujeado con N2 a 2.6 mg/mL y se agregaron lentamenle a la solución liolada de OMPC. Las reacciones se protegieron de la luz y se incubaron a temperaíura ambieníe duraníe aproximadamenle 22 horas. Los grupos liol libres residuales de OMPC se enfriaron con un exceso molar de 5 veces de N-etilmaleimida durante 18 horas a temperalura ambiente. Un control únicamente con OMPC tiolado se llevó a cabo durante el protocolo de conjugación en paralelo. Tras la lerminación del enfriamiento, el conjugado y el control se transfirieron a unidades de diálisis de corte de peso molecular de 100,000 Da y se dializaron de manera exhaustiva contra al menos cinco cambios del amortiguador de conjugación. Tras la terminación de la diálisis, las muesíras se íransfirieron a íubos de cenírífuga de polipropileno de 15 ml y se cenlrifugaron a 2,280 x g duraníe cinco minulos a 4°C para eliminar cualquier maíerial agregado. Se reliraron alícuotas para el análisis y el granel se almacenó a 4°C.

C. Análisis de los conjugados del péptido Aß-OMPC La proteína total se determinó medianíe el ensayo de Lowry modificado, y las muesíras del conjugado y el conírol se analizaron medianíe análisis cuanliíaíivo de los aminoácidos (AAA). Las relaciones molares del pépíido a OMPC se deíerminaron de la cuanlificación del residuo único de S-carboximelilhomocisleína, que se liberó Iras la hidrólisis acida del enlace naciente péptido-OMPC. La conceníración específica de OMPC se deíerminó de los residuos esíables a la hidrólisis que esíaban ausenles de la secuencia peptídica y por lo tanto son únicos a la proteína de OMPC. Suponiendo 1 mol de pépíido por cada mol de SCMHC, la relación de SCMHC/OMPC fue por lo lanío equivalenle al contenido de péptido/OMPC. La carga de la masa del péptido podría calcularse de esta relación, utilizando el peso molecular del péptido y una masa promedio de OMPC de 40,000,000 Da. La naturaleza covalente de la conjugación se confirmó de manera cualiíaliva medianle análisis SDS-PAGE ulilizando geles de Tris- glicina al 4-20% (Invilrogen, Carlsbad, CA), en donde un desplazamienío hacia arriba en la movilidad se observó para las bandas de conjugado leñidas con Coomassie con relación al conírol. Las relaciones de carga molar calculadas (mol de pépíido/mol de OMPC) para todos los péptidos BrAc conjugados fueron: EJEMPLO 3 Inmunogenicidad de ios conjugados de Aß Esíe ejemplo describe la formulación y administración de los conjugados Aß capaces de inducir una respuesta inmune en la forma de anticuerpos para Aß.

A. Formulación de los conjugados de la vacuna Las vacunas del conjugado del pépíido Aß-KLH se formularon en ISCOMATRIX® (CSL Lid., Parkville, Ausíralia). Todas las vacunas del conjugado del péplido Aß-OMPC se formularon en alumbre, ya sea con o sin un segundo adyuvante, tal como el adyuvante basado en saponina, ISCOMATRIX® (CSL Ltd., Parkville, Australia). Todas las manipulaciones de la muestra se realizaron bajo condiciones estériles. Para las formulaciones con alumbre, los conjugados se diluyeron una vez en suero fisiológico a las concentraciones designadas del pépíido y se mezclaron con dos veces alumbre (Merck, Product No. 39943), lo que corresponde a 900 µg/mL de alumbre de Merck preparado en suero fisiológico estéril (solución estéril de cloruro de sodio 150 mM). Así, la concentración del objelivo en la vacuna es 450 µg/mL de alumbre de Merck o una vez alumbre de Merck. Las concentraciones del péptido objelivo (antígeno) para los estudios animales fueron como sigue: para ratones - 12.1 µg/mL (Dosis de 0.1 mL); para monos - 10 µg/mL o 60 µg/mL (Dosis de 0.5 mL) y para cobayos - 12.5 µg/mL (Dosis de 0.4 mL). La mezcla se incubó duranle dos horas a íemperalura ambiente. Para obtener la dosis de la inyección, los conjugados absorbidos en alumbre se diluyen con una vez alumbre para alcanzar la concentración objetivo del péptido. En donde se necesita un segundo adyuvante, es decir, ISCOMATRIX®, la concentración objetivo fue 10 µg/mL para los esíudios con ratones, 0, 100 ó 200 µg/mL para los esludios con monos y 125 µg/mL para cobayos. 1. Preparación de ISCOMATRIX® Utilizando una membrana de cásete (Caseto para Diálisis Slide- A-Lyzer, 10K MWCO, Pierce, Rockford, IL), el ISCOMATRIX® se dializa en soluciones de suero fisiológico estéril a 2-8°C. La solución del suero fisiológico estéril se cambia 2-3 veces durante la diálisis. Después de la terminación de la diálisis, el ISCOMATRIX® se esteriliza por filtración utilizando un filtro de jeringa (filtro de jeringa de 0.22 uM Millex-GV, Millipore, Billerica, MA). La concentración del ISCOMATRIX® estéril, dializado, se determina mediante RP-HPLC. El ISCOMATRIX® se almacena estéril a 2-8°C hasta el uso. 2. Preparación del conjugado del pépíido Aß-OMPC v el alumbre de Merck Las soluciones patrón del conjugado del péptido Aß-OMPC se diluyen en solución de suero fisiológico esléril 1X. La soluciones palrón del conjugado del pépíido AD-OMPC diluido se agregan entonces a alumbre de Merck 2X en solución de suero fisiológico estéril 1X y se mezcla duraníe una hora en una rueda giratoria a lemperaíura ambiento. La mezcla se deja sedimeníar en el banco durante 15 minutos a temperatura ambiente y a continuación se centrifuga a 1500 rpm duraníe diez minuíos. El sobrenadaníe se decanía suavemenle (el análisis UV del sobrenadanle se realiza para delerminar el % del conjugado del péplido Aß-OMPC unido al alumbre), y la pelotilla se resuspende en suero fisiológico estéril 1X. Se lomaron alícuolas de la mezcla en viales de vidrio con tubos de 3 mL y a continuación se almacenan a 2-8°C hasta la formulación final con ISCOMATRIX®. 3. Formulación de la vacuna del péptido Aß-OMPC/alumbre e ISCOMATRIX® Antes de la formulación final con ISCOMATRIX®, el tamaño de partícula del pépíido Aß-OMPC/alumbre en suero fisiológico, se deíermina medianíe dispersión de una luz estática para conformar la unión y verificar la estabilidad de la partícula. El ISCOMATRIX® estéril, dializado en suero fisiológico 1X se agrega al pépíido Aß-OMPC/alumbre en NaCI 150 mM estéril mientras se somete a vórtice. Los viales se tapan, se roscan y pliegan para sellar completameníe. La vacuna se almacena a 2-8°C antes de la inyección. Antes de la inyección, cada vacuna se somete a vórtice duranle 3-5 minuíos.

B. Inmunogenicidad de las vacunas del conjugado en cobayos Cobayos hembra de seis a diez semanas de edad se obtuvieron de Harían Inc., Indianápolis, IA y se mantuvieron en las instalaciones para animales de los Laboratorios de Investigación de Merck de acuerdo con los lineamieníos insíilucionales. Todos los experimentos con animales se aprobaron por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Insíilucionales de los Laboralorios de Invesligación de Merck (IACUC). Los antígenos se prepararon en suero fisiológico amortiguado con fosfato y se formularon en el adyuvante designado. Dos animales por grupo se inmunizaron con los conjugados del péptido Aß-KLH mostrados en el cuadro B, intramuscularmeníe con 400 µl de una vacuna del conjugado (8 µg por conlenido de pépíido o 50 µg por coníenido total) en la presencia de 40 µg de ISCOMATRIX®. Las inmunizaciones se realizaron tres veces en intervalos de cuatro semanas. Las muestras de suero se recolectaron antes de la primera inmunización (presangrados), y tres semanas después de cada inmunización y se almacenaron a 4°C antes de las determinación del título del anticuerpo. Los tííulos del aníicuerpo se deíerminaron mediante ELISA de acuerdo con el protocolo que sigue, utilizando Aß 0 como el antígeno objetivo. El análisis basado en ELISA es como sigue: Placas de novenía y seis pozos se recubrieron con 50 µl por pozo de Aß a una conceníración de 4 µg/ml en amortiguador de bicarbonaío 50 mM, pH 9.6, a 4°C duraníe la noche.

Las placas se lavaron con suero fisiológico amortiguado con fosfato (PBS) y se bloquearon con leche descremada al 3% en PBS que coníiene Tween 20 al 0.05% (leche-PBST). Las muesíras de prueba se diluyeron en series de 4 veces en PBST. Cien µl de la muesíra diluida se agregaron a cada pozo, y las placas se incubaron a 24°C duraníe dos horas y a coníinuación se lavaron seis veces con PBST. Cincuenía µl de los anlicuerpos secundarios conjugados con HRP a una dilución 1 :5000 en leche-PBST se agregaron por pozo y las placas se incubaron a 24°C duranle una hora. Las placas se lavaron fres veces y se agregaron 100 µl de 1 mg/ml de diclorhidrato de o-fenilendiamina en citrato de sodio 100 mM, pH 4.5 por pozo. Después de 30 minutos de incubación a 24°C, la reacción se detuvo agregando 100 µl de H2S04 1 N por pozo, y las placas se leyeron a 490 nm utilizando un lector de placa de ELISA. El título del anticuerpo se definió como el recíproco de la dilución más alta que proporciona un valor de OD490 nm por encima de la media más dos desviaciones estándar de los pozos del control del conjugado. Los resultados de este análisis, mostrados en el cuadro D, demuestran que después de la primera inyección (PD1 ), algunas regiones del pépíido provocaron títulos del anticuerpo apreciables como el control de 18-meros. En particular, los fragmentos del péplido Aß que corresponden a los aminoácidos de Aß 1-8, 2-9, 3-10, 17-24, 21-28 y 33-40 produjeron iodos títulos en exceso de 1 :800. Después de la segunda inyección (PD2), 15 de los conjugados de 8-meros provocaron títulos del anticuerpo en exceso de 1 :1000. El análisis de la postdosis 3 (PD3) confirmó además que ciertas regiones del péptido Aß fueron más inmunogénicas con relación a oirás. Once regiones demoslraron títulos mayores que 1 :6000. Estas incluyeron regiones que corresponden a los aminoácidos Aß 1-8, 3-10, 7-14, 11-18, 13-20, 15-22, 19-26, 21-28, 23-30, 27-34 y 29-36. De estas regiones, cinco regiones fueron altamente inmunogénicas (>1 :10000) incluyendo: las regiones 1-8, 15-22, 21-28, 23-30 y 29-36. Los resultados demuestran que los conjugados de 8-meros son capaces de provocar una respuesía del anlicuerpo específica Aß40. De manera inesperada, y contrario a las enseñanzas previas, no todos los fragmentos de Aß fueron igualmente inmunogénicos. De hecho, estos datos sugieren que ciertos 8-meros son altamente inmunogénicos, mientras que otras regiones de Aß (por ejemplo, 5-12, 25-32, 31-38 y 35-42) son no inmunogénicas (títulos < 1 :300).

C. Inmunogenicidad de las vacunas del conjugado en monos rhesus Un estudio se realizó en primates no humanos, es decir, monos rhesus, comparable al realizado con cobayos, para determinar si los conjugados del péptido Aß-OMPC y un adyuvaníe de alumbre e ISCOMATRIX® proporcionan una respuesla inmune. Los monos rhesus (Macaca mulatta), se manluvieron de acuerdo con los protocolos de cuidado de animales inslilucionales de los Laboratorios de Investigación de Merck y el Centro de Investigación New Iberia (La Universidad de Louisiana en Lafayetíe, New Iberia, LA).

Las Solicitantes utilizaron péptidos Aß conjugados a OMPC como los antígenos modelo, incluyendo los 8-meros mosírados en el cuadro C: Aß (1-8) (SEQ. ID NO: 67), Aß (3-10) (SEQ. ID NO: 69), Aß (7-14) (SEQ ID NO: 70), Aß (17-24) (SEQ ID NO. 72), Aß (21-28) (SEQ ID NO: 73) y Aß (33-40) (SEQ ID NO. 74); los pépíidos lineales divalenles mostrados en la Figura 2: Aß (3-10) (7-14) (Constructo No. 1 ), Aß (3-10) (21-28) (Consíructo No. 2), Aß (1-8) (21-28) (Constructo No. 5); y los MAP ramificados multivalenles moslrados en la Figura 3A: Aß (3-10) (7-14) (Consirucío No. 8), Aß (1-8) (21-28) (Constructo No. 11 ), Aß (3-10) (21-28) (Construcío No. 12). Los macacos rhesus (N = 3) se inmunizaron con 5 µg de cada una de las vacunas formuladas en el adyuvanle de alumbre de Merck (MAA) más 100 ug de ISCOMATRIX® cada cualro semanas. Las muestras de suero se recolectaron cuatro semanas después de cada inyección y se determinaron para las respuestas del anticuerpo específicas Aß medianíe ELISA. De manera consisleníe con los resullados de los esíudios con cobayo, se enconlró que todos los conjugados son inmunogénicos en monos. Los tííulos del anlicuerpo específicos para Aß fueron deíecíables después de una sola inyección y se reforzaron además después de las inyecciones posíeriores. Generalmenle, para los conjugados probados, los conjugados máximos se alcanzaron después de la segunda o íercera inmunización, en donde los íííulos medios geoméíricos variaron de 25,000 a 500,000. Esíos resulíados confirman el hallazgo de que los conjugados Aß descriíos en la presente son capaces de provocar una respuesta del anticuerpo específico para Aß.

D. Efecto del adyuvante en la inmunogenicidad de las vacunas del conjugado en monos rhesus Se realizó un estudio adicional en primates no humanos, es decir, monos rhesus, para determinar si un conjugado del pépíido Aß-OMPC y un adyuvante basado en saponina, tal como ISCOMATRIX®, puede proporcionar una respuesta inmune mejorada. Las solicitaníes ulilizaron un pépíido Aß (1-18) conjugado a OMPC como el aníígeno modelo. Los monos rhesus (Macaca mulatta) se mantuvieron de acuerdo con los protocolos de cuidado de animales instilucionales de los Laboratorios de Investigación de Merck y el Centro de Investigación de New Iberia (La Universidad de Louisiana en Lafayetíe, New Iberia, LA). A cinco grupos de monos, íres por grupo, se les proporcionaron los siguientes conjugados de Aß (1-18)-OMPC: (1 ) 5 µg de conjugado (basado en el contenido del péptido) en alumbre, (2) 5 µg de conjugado en alumbre + 100 µg ISCOMATRIX®, (3) 5 µg de conjugado en alumbre + 50 de mg de ISCOMATRIX®, (4), 30 µg de conjugado en alumbre, (2) 30 µg de conjugado en alumbre + 100 µg de ISCOMATRIX®. Las inmunizaciones se llevaron a cabo mediante inyecciones intramusculares en alícuotas de 0.5 ml a las semanas 0, 8 y 24 ulilizando jeringas de luberculina (Becton-Dickinson, Frankiin Lakes, NJ). Las muestras de suero se recolecíaron a iníervalos de cuaíro semanas iniciando desde la semana 0 (presangrado) y se probaron para los títulos del anticuerpo coníra Aß40 medianíe ELISA, realizado como se describió en el ejemplo aníerior.

Los análisis interinos de este estudio en curso demostraron que a la PD1 , los monos que reciben 5 meg de vacuna del conjugado en alumbre fallaron en desarrollar cualesquier íííulos deíecíables, mieníras que aquéllos que reciben 30 µg de la vacuna del conjugado en alumbre desarrollaron bajos títulos específicos para Aß 0. Todos los monos que recibieron la formulación de alumbre más ISCOMATRIX® desarrollaron tííulos del anlicuerpo significalivos. A PD2, ambas dosis de inmunógeno en alumbre solo produjeron niveles del título similares, mientras que las cohortes que reciben el alumbre más ISCOMATRIX® desarrollaron tííulos del anticuerpo 10 veces más altos con relación a la condición de alumbre solo. Los resultados de este estudio confirman que este conjugado del péptido Aß-OMPC es inmunogénico en primates no humanos. Los dalos demueslran además que la eficacia de tal vacuna del conjugado se mejora de manera significativa por un adyuvante basado en saponina, tal como ISCOMATRIX®.

EJEMPLO 4 Inmunorreactividad del suero policlonal de cobayo Con el fin de demostrar que el suero inmune generado de los cobayos anteriores (Ejemplo 3.B), después de la inmunización con los conjugados de 8-meros-KLH, es relevante para la AD humana, se realizó un estudio para evaluar la inmunorreacíividad del suero policlonal de un cobayo inmunizado con un inmunógeno Aß (3-10)-KLH. Cuaíro semanas después de una segunda inyección de este constructo, la sangre se recolectó de un cobayo representativo, de acuerdo con la siguiente metodología. La reactividad del suero policlonal se evaluó en secciones de cerebro con AD (BioChain Insliíute, Inc., Hayward, CA). Las secciones de cerebro humano se prepararon incubando a 60°C duraníe treinta minutos, seguido por dos lavados de cinco minutos con xileno a lemperaíura ambieníe. Las secciones de sumergieron posleriormente en EtOH al 100% dos veces, duranle cinco minutos cada una, seguido por una inmersión de cinco minutos en ddH20. Las secciones se sumergieron durante tres minutos en ácido fórmico al 99%, seguido por un breve lavado en ddH20 y una inmersión de cinco minutos en solución amortiguada con fosfato (PBS). Las secciones de incubaron entonces con un bloqueador de peroxidasa durante diez minutos, seguido por un lavado de cinco minulos con PBS. Las secciones se bloquearon mediante una exposición de diez minutos a suero de cabra al 10%, seguido por un lavado de cinco minutos con PBS. Las secciones se incubaron con suero de cobayo diluido a 4°C durante la noche o durante una hora a temperatura ambiente. Después de un lavado de cinco minutos con PBS, las secciones se incubaron durante diez minutos con IgG anti-cobayo de cabra biotinilada diluida o anticuerpo anti-ratón de caballo biotinilado (1 gota en 5 ml de PBS). Las secciones se lavaron durante cinco minutos en PBS y se incubaron posteriormente con una solución de ABC (equipo Vectorstain ABC; Vector Laboratories, Inc.) durante treinía minuíos. Las secciones se lavaron con PBS duraníe cinco minutos. A conlinuación, las secciones se liñeron con DAB (DakoCytomation) duraníe cinco minulos y se lavaron con ddH20. Las secciones se coníratiñeron entonces en hematoxilina durante treinta segundos y se deshidrataron en EtOH graduado y Xilenos (70% de EtOH durante cinco minutos, 80% de EtOH durante cinco minutos, 100% de EtOH durante cinco minutos y xilenos durante cinco minutos). Las secciones se cubrieron con una tira y se evaluaron medianíe microscopía con luz. La respuesla ¡nmunogénica producida por el conjugado Aß (3-10)-KLH produjo una respuesla del anlicuerpo que se dirigió contra el tejido cerebral humano con AD. Como se muestra en las Figuras 1A-1 C, esta sección de cerebro humano liene una exlensa deposición de Aß, de una manera típica a la esperada para la AD humana. Mientras que el suero de cobayo preinmunizado demuestra una falta de inmunorreactividad cuando se expone a este tejido, se nota una inmunorreactividad positiva del suero de este mismo cobayo después de dos inyecciones del constructo de Aß (3-0)-KLH. Estos datos demueslran que la inmunogenicidad enconlrada por ELISA, e ilusírada en el cuadro D, conliene una respuesla del anticuerpo significativa, dirigida contra el Aß humano, encontrado en este íejido con AD. Así, el resullado extiende el hallazgo inesperado de una inmunogenicidad diferencial por algunos fragmentos de Aß, para demostrar además que esta respuesta está dirigida de una manera consistente con una aplicación íerapéuíica.

EJEMPLO 5 Identificación de los fragmentos inmunogénicos que carecen de Bos epitopos de Binfocito T Para idenlificar los fragmentos inmunogénicos que carecen de un epiíopo de linfocito T para utilizarse en la invención presento, puede uíilizarse el siguiente ensayo de InmunoMancha Enlazado a Enzima (ELISpot) como un método para valorar las respueslas a los linfocilos T para un antígeno particular. Los fragmentos de inmunógeno que poseen los epitopos de linfociío T se ideníifican por la presencia de una mancha oscura en la superficie de una membrana blanca; cada mancha indica la presencia de un linfociío T que ha secretado interferón gamma (IFN-?) en respuesta al antígeno (es decir, el fragmenío inmunogénico). Aquellos con experiencia en la técnica de las vacunas y la inmunología están familiarizados con esíe ensayo, véase, por ejemplo, Larsson eí al., AIDS 3: 767-777, 1999 y Mwau et al, AIDS Research and Human Reíroviruses 18: 611-618, 2002. Una revisión rédenle puede enconlrarse en A.E. Kalyuzhny, Methods Mol Biol. 302: 15-31 , 2005. Las Solicitantes utilizaron monocitos de sangre periférica (PBMC) de macacos rhesus (Ceníro de Invesligación de New Iberia, La Universidad de Louisíana en Lafayelíe, New Iberia, LA) para la respuesía a los péplidos Aß 1-40 (American Peplide Co., Sunnyvale, CA) (secuencia de aminoácidos DAEFRHDSGYEVHHQKLVEFAEDVG SNKGAIIGLMVGGW) (SEQ ID NO: 78) y Aß 1-20 (Synpep, Dublín, CA) (secuencia de aminoácidos DAEFRHDSG YEVHHQKLVFF) (SEQ ID NO: 79). El IFN-? de anti-mono de ratón policlonal purificado (clona MD-1 , No. de Catálogo CT 525, U-CyTech biosciences, Utrecht, Países Bajos) se diluyó en suero salino amortiguado con fosfato (PBS) con penicilina al 1 % y sulfato de estreptomicina (Penicilina-Estreptomicina de GIBCO®, No. de Catálogo 15140-122, Invitrogen, Carlsbad, CA), a continuación se agregó a placas estériles HTS IP de 96 pozos (No. de Catálogo MSIPS4W10, Millipore, Billerica, MA), y se incubó por más de doce horas a 4°C. Las placas se lavaron y se agregó medio R10 [medio RPMI 1640 (GIBCO No. de Catálogo 11875-093), suero bovino fetal al 10% (HyClone SH30070.03, Logan, UT), 0.1 % de 2-Mercaptoetanol 50 mM (GIBCO No. de Catálogo 21985-023), 1 % de Amortiguador HEPES 1 M (GIBCO® 15630-080), 1 % de L-gluíamina 200mM (GIBCO® No. de Calálogo 25030-081 ), 1 % de solución de piruvato de sodio MEM 100mM (GIBCO® No. de Catálogo 11360-070), solución de penicilina-estreptomicina al 1% (GIBCO® No. de Catálogo 15140-122)], aníes de la incubación durante al menos dos horas a 37°C. Los PBMC se centrifugaron y resuspendieron en R10. Los PBMC se coníaron en un coníador Z2 Couller (Beckman Couller, Fullerton, CA). Cada pozo de la placa aspirada recibió 0.4 µg de Aß 1-40, Aß 1-20, PHA (filohemagluíinina, No. de Calálogo L-8902, Sigma, St. Louis, MO, control positivo) o DMSO diluido (Sigma, control negativo); 400000 PBMC se agregaron entonces a cada pozo. Las placas se incubaron durante 18-24 horas a 37°C en una incubadora húmeda con C02. Las placas se lavaron en PBS con FBS al 5% y Tween al 0.005%; aníicuerpos monoclonales de IFN-? anti-mono conjugados con biotina (U-CyTech biosciences, Utrecht, Países Bajos) se diluyeron en el mismo medio y se agregaron a cada placa; las placas se incubaron entonces a 4°C duranie 18-24 horas. La esírepíavidina-AP (No. de Calálogo 13043E, BD PharMingen, Frankiin Lakes, NJ) se diluyó en el mismo medio y se agregó a las placas lavadas; las placas se incubaron a lemperatura ambiente y en la oscuridad durante dos horas. Se agregó sustrato NBT/BCIP filtrado de 1-Paso (Pierce, Rockford, IL, No. de Catálogo 34042) y se realizó una incubación adicional a temperatura ambiente en la oscuridad duraníe diez minutos. Después de lavar, las placas se dejaron secar anles de formarse la imagen con una cámara CCD y las manchas denlro de cada pozo se coníaron auíomálicamente por la computadora. Las Solicitanles han eslablecido que las células que forman manchas por millón de PBMC (SFC/106 PBMC) deben exceder de 55 y deben exceder 4 veces el conírol negalivo a ser definido como un resullado posilivo; la falla en el cumplimiento de ambos de esíos criíerios define un resulíado negativo. Los macacos rhesus se vacunaron con un constructo MAP que comprende Aß (3-10)/(21-28) (Constructo No. 12, Figura 3A) conjugado a OMPC o con ambos de los dos construcíos monoméricos, Aß (3-10) (SEQ ID NO: 69) y Aß (21-28) (SEQ ID NO: 73) conjugados a OMPC. Cada macaco se probó duranle el régimen de vacunación a intervalos mensuales durante tres o cuatro meses; la señal más alta registrada alguna vez contra Aß 1-40 o Aß 1-20 es sólo de 18 SFC/106 PBMC, significalivameníe por debajo del criíerio de 55 SFC/106 PBMC. Así, todo resultó en una calificación negaliva, proporcionando fuerte evidencia de que las vacunas no provocan respuestas de los linfocitos T y, por lo tanto, no incluyen un epitopo de linfociío T.

EJEMPLO 6 Eievación del Aß en el plasma Los primates no humanos, macacos rhesus (N=3) se inmunizaron con 5 µg de conjugado MAP Aß (3-10)/(21-28) (Construcío No. 12, Figura 3A) o su conjugado constituyeníe monomérico, Aß (3-10) (SEQ ID NO: 69) y Aß (21-28) (SEQ ID NO: 73) enlazado a OMPC como el portador y formulado en MAA más 100 µg de ISCOMATRIX®. Los primaíes rhesus recibieron vacunaciones cada cuaíro semanas con los sangrados recoleclados y analizados cuaíro semanas después de cada inyección. Los títulos anti-Aß40 y los niveles lolales de Aß-?_ 0 se delerminaron. Los niveles de Aß?_ 0 en plasma se deíerminaron en eslos animales inmunizados ulilizando un ELISA 6E10/G210. Este ensayo mide el Aß-?. o utilizando un ELISA emparedado que comprende un anticuerpo de captura N terminal 6E10 (Aß 1-8) (Signet Laboratories, Dedham, MA) y un anticuerpo de neo-epitopo Aß40 C terminal (G210) (The Genetics Company, Inc., Zurich, Suiza) conjugado con fosfatasa alcalina. El anticuerpo, 6E10, se recubrió en placas a una concentración de 5 ug/ml. Las muestras de plasma diluidas (1 :3) se utilizaron a 50 µl/pozo por triplicado. Los estándares de Aß-?-40 se prepararon de 400 pM-3 pM en una malriz de plasma de rhesus inmunoempobrecida de 6E10. Esíe ensayo liene una relación de señal a ruido de aproximadameníe 5-20. El suslrato de CDP-star fosfatasa alcalina se obtuvo de Applied Biosystems, Foster City, CA. El SuperBIock, un amortiguador de bloqueo preformulado se obtuvo de Pierce Bioíechnology, Rockford, IL (Caí # 37515). Los conleos de las muesíras individuales, corridos por íriplicado, se convirtieron a las conceníraciones reales del analiío uíilizando un ajusto de ranura de tercer orden a los estándares. Las muestras QC se corrieron para evaluar la variabilidad placa a placa de la señal. Como se describe en la Figura 5A, los resultados de estos análisis demostraron un incremento mayor a 3 veces en el Aß o en plasma a PD3 después de la inmunización con el construclo de MAP Aß (3-10)/(21-28) (Conslrucío No.12, Figura 3A). Esíe incremento en el Aß40 en el plasma no se observó en los animales inmunizados con los consírucíos de la vacuna del conjugado monomérico de Aß/OMPC. De manera específica, la inmunización uíilizando Aß (3-10) (SEQ ID NO: 69) o Aß (21-28) (SEQ ID NO: 73) produjo una falta de, o una respuesta apreciablemente menor en esía medición. Fue noíable que estas diferencias fueran independientes de los niveles del título, como se describe en la Figura 5B. Colectivamente, estos datos demuestran que algunos constructos tienen una ventaja con relación a otros construclos inmunogénicos, con respecto a su capacidad para elevar los niveles de Aß en plasma. Aquellos con experiencia en la lécnica apreciarán que esla selectividad de los fragmentos inmunogénicos, es decir, la capacidad para elevar los niveles de Aß en plasma, no se había mostrado antes de la invención presente y no era predecible de la técnica anterior. Por lo tanto, la identificación de los inmunógenos, ya sea 8-meros o MAP, que carecen de un epitopo de linfocito T, que elevan el Aß en plasma después de la inmunización, proporciona un método para seleccionar los 8-meros o MAP para utilizarse en un conslruclo de la vacuna. Como resultado de la invención presente, aquellos con experiencia en la técnica son ahora capaces de caracterizar los constructos de la vacuna tanto de manera cuanlilaliva (es decir, inmunogenicidad) como cualiíaliva (es decir, la naluraleza de la respuesía del anlicuerpo policlonal - capacidad para elevar los niveles de Aß en plasma). Se apreciará además por aquellos con experiencia en la técnica que la invención presente no está limitada a fragmentos de Aß de 8 aminoácidos, sin que incluye cualquier antígeno capaz de producir una respuesta del anticuerpo policlonal en el organismo hospedero, que sea reactivo a Aß.

Claims (18)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una composición farmacéutica, que comprende un fragmento inmunogénico de Aß, que carece de un epitopo de linfociío T, capaz de inducir una respuesla inmune en la forma de anlicuerpos para el fragmento Aß. 2.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el fragmento inmunogénico es capaz de elevar los niveles de Aß en plasma. 3.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el fragmento inmunogénico se selecciona del grupo que consiste de un péptido lineal de 8 aminoácidos (8-mero) de Aß, un péptido lineal multivaleníe disperso con al menos un separador y un pépíido del aníígeno con múlliples ramificaciones mulíivalente (MAP). 4.- La composición farmacéulica de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque comprende adicionalmente una molécula portadora enlazada a la composición para formar un conjugado, en donde el portador fomenla una respuesla inmune que comprende anlicuerpos para el fragmento Aß. 5.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la molécula portadora se selecciona del grupo que consiste de seroalbúminas, hemocianina de lapa calada, moléculas de inmunoglobulina y complejo de la proteína de la membrana externa de Neisseria meningitidies (OMPC). 6.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la molécula portadora es OMPC. 7 '.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque comprende adicionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable. 8.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el adyuvante farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo de un hidróxido de aluminio y un adyuvante basado en saponina. 9.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el adyuvanle farmacéuticamente aceptable es un adyuvante basado en saponina. 10.- El uso de un fragmento inmunogénico de Aß, que carece de un epitopo de linfocito T, capaz de inducir una respuesta inmune en la forma de anticuerpos para el fragmento Aß, en la elaboración de un medicamento útil para prevenir o tratar una enfermedad asociada con los depósitos amiloides de Aß en el cerebro de un paciente. 11.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en donde el fragmento inmunogénico es capaz de elevar los niveles de Aß en plasma. 12.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde el fragmento inmunogénico se selecciona del grupo que consiste de un péptido lineal de 8 aminoácidos (8-mero) de Aß, un péptido lineal mullivalente disperso con al menos un separador y un péptido del antígeno con múltiples ramificaciones multivaleníe (MAP). 13.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde el fragmento inmunogénico esíá enlazado a una molécula portadora para formar un conjugado y en donde el portador fomenla una respuesla inmune que comprende anlicuerpos para el fragmenío Aß. 14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 13, en donde la molécula portadora se selecciona del grupo que consiste de seroalbúminas, hemocianina de lapa calada, moléculas de inmunoglobulina y complejo de la proteína de la membrana externa de Neisseria meningitidies (OMPC). 15.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde la molécula portadora es OMPC. 16.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 13, en donde el conjugado eslá adaptado para ser administrable con un adyuvante farmacéuticamente aceptable. 17.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde el adyuvaníe farmacéuíicamente aceptable se selecciona del grupo de un hidróxido de aluminio y un adyuvaníe basado en saponina. 18.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 17, en donde el adyuvaníe farmacéuticamenle acepíable es un adyuvaníe basado en saponina.