[go: up one dir, main page]

MX2007012569A - Neutralizadores de anticuerpos del factor estimulante de la colonia de macrofagos-granulocitos humanos. - Google Patents

Neutralizadores de anticuerpos del factor estimulante de la colonia de macrofagos-granulocitos humanos.

Info

Publication number
MX2007012569A
MX2007012569A MX2007012569A MX2007012569A MX2007012569A MX 2007012569 A MX2007012569 A MX 2007012569A MX 2007012569 A MX2007012569 A MX 2007012569A MX 2007012569 A MX2007012569 A MX 2007012569A MX 2007012569 A MX2007012569 A MX 2007012569A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
csf
seq
amino acid
fragment
acid sequence
Prior art date
Application number
MX2007012569A
Other languages
English (en)
Inventor
Tobias Raum
Julia Heepp
Eva Krinner
Silke Petsch
Steven Zeman
Andreas Wolf
Sandra Bruckmaier
Original Assignee
Micromet Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Micromet Ag filed Critical Micromet Ag
Publication of MX2007012569A publication Critical patent/MX2007012569A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/243—Colony Stimulating Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)

Abstract

La presente invencion se refiere a un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, que se enlaza especificamente a, y neutraliza el GM-CSF de primate.

Description

NEUTRALIZADORES DE ANTICUERPOS DEL FACTOR ESTIMULANTE DE LA COLONIA DE MACROFAGOS-GRANULOCITOS HUMANOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de los mismos que neutralizan la actividad del factor estimulante de la colonia de macrófagos-granulocitos humanos (GM-CSF) (por sus siglas en inglés) . La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden tales anticuerpos y fragmentos de los mismos así como a los usos de tales anticuerpos y fragmentos de los mismos para la preparación de medicamentos para el tratamiento de varias condiciones . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Originalmente descritos como un estímulo potente del crecimiento y la diferenciación de las células precursoras de los granulocitos y macrófagos in vi tro, el factor estimulante de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) es una glicoproteína de aproximadamente 23 kDa con una estructura de haz helicoidal alfa cuatro que se enlaza a un receptor heterodimérico compuesto de subunidades que pertenecen a la familia del receptor de citocina del tipo 1. El mismo estimula la maduración de i. a. macrófagos, neutrófilos, granulocitos, eosinófilos y células dendríticas que presentan antígenos, para incrementar su capacidad funcional en el combate de las infecciones. Los experimentos de ablación Ref. :1863S3 genética, es decir, los experimentos de silenciamiento o para hacer agónico el gen de interés - aquí GM-CSF - en los ratones, indicaron que el GM-CSF (por sus siglas en inglés) es esencial para el mantenimiento de la actividad funcional de algunas poblaciones de macrófagos tales como aquellas involucradas en la depuración del agente tensioactivo en los pulmones en la respuesta a ciertas clases de infección o de respuestas inmune. Aunque el GM-CSF tiene actividades estimuladoras potentes in vi tro sobre las células madre para los neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, y a un menor grado las células eritroides y megacariocíticas, los resultados obtenidos in vivo con un ratón agónico sugieren que el papel fisiológico principal de GM-CSF es mantener o estimular la actividad funcional de los macrófagos y granulocitos maduros y estimular la presentación de antígenos al sistema inmune. Esto último se hace por sus efectos directos sobre las células dendríticas y la producción de macrófagos, pero también por el incremento de la expresión del complejo de histocompatibilidad mayor de la clase II y los receptores de Fc de las células dendríticas y de macrófagos. El GM-CSF (por sus siglas en inglés) estimula las actividades funcionales de los neutrófilos, eosinófilos, y monocitos-macrófagos . Estos incluyen la mejora de la actividad quimiotáctica, la expresión incrementada de las moléculas de adhesión celular y la adhesión incrementada a las superficies, y la actividad fagocítica incrementada así como la inhibición y el retardo de la apoptosis de estas células. Los neutrófilos representan la primera línea de defensa contra los agresores. La muerte programada de los neutrófilos es retardada por los estímulos proinflamatorios que incluyen GM-CSF (por sus siglas en inglés) para asegurar una resolución apropiada de la inflamación en el tiempo y lugar. GM-CSF también estimula la capacidad de estas células para que tengan un papel de mediación en la citotoxicidad de las células dependientes de los anticuerpos y para exterminar los microorganismos intracelularmente y tiene un efecto de "preparación" sobre estas células para mejorar su respuesta a los estímulos subsiguientes para el choque de ionización oxidante (producción del anión de superóxido) , desgranulación y liberación de agentes antimicrobianos, y quimiotaxis. Además, el GM-CSF estimula la liberación de las citocinas secundarias y los mediadores de estas células incluyendo IL-1, G-CSF, M-CSF, y los leucotrienos de los neutrófilos, así como IL-1, TNF, IL-6, G-CSF, M-CSF, y las prostaglandinas de los macrófagos. Es claro de lo anterior que GM-CSF (por sus siglas en inglés) desempeña un papel clave en la activación y mantenimiento de las poblaciones celulares necesarias para detener la infección. Sin embargo, en algunos casos la activación de estas poblaciones de células puede ser indeseable. Por ejemplo, la activación de los linajes de las células anteriores cuando ningún patógeno está presente, conduce en estos casos a condiciones inflamatorias agudas y/o crónicas, las cuales, en casos extremos, pueden ser amenazantes de la vida. De manera semejante, la sobre-expresión de GM-CSF (por sus siglas en inglés) puede conducir a una activación inmune en exceso, conduciendo a inflamación. En tales casos, puede ser deseable neutralizar la actividad de GM-CSF de tal modo que los síntomas de estas condiciones inflamatorias sean eliminados o al menos mitigados. Los ejemplos de tal actividad neutralizante ya existen en el arte previo. Por ejemplo, se encontró que un anticuerpo de anti-GM-CSF neutralizante contribuyó a un incremento en la velocidad de apoptosis de los eosinófilos en las muestras de la sangre periférica (Kankaanranta et al. (2000) Journal of Allergy and Clinical Immunology 106, 77-83) . Una supervivencia de eosinófilos mejorada está correlacionada con el asma, un incremento en la apoptosis de los eosinófilos se podría esperar que mitigue los síntomas asmáticos. En las enfermedades inflamatorias crónicas tales como el asma, artritis reumatoide, y esclerosis múltiple, los niveles de GM-CSF son incrementados localmente y en algunos casos sistemáticamente, y han sido correlacionados con el proceso inflamatorio en estas enfermedades.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, un objeto de la invención es mejorar los modos de neutralización incrementada o indeseable de la actividad de GM-CSF conocidos previamente en el arte previo. En consecuencia, un aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo que se enlaza específicamente a, y neutraliza el GM-CSF del primate. El término " se enlaza específicamente" o las expresiones relacionadas tales como "la aglutinación específica", "se enlaza específicamente", "aglutinante específico", etc., cuando se utilicen aquí, se refieren a la capacidad del anticuerpo monoclonal humano o un fragmento del mismo, para discriminar entre el GM-CSF de primate y cualquier número de otros antígenos potenciales diferentes de GM-CSF del primate a tal grado que, desde un conjunto de una pluralidad de diferentes antígenos como socios de aglutinación potenciales, solamente el GM-CSF de primate sea unido, o sea unido significativamente. Dentro del significado de la invención, el GM-CSF de primate está unido "significativamente" cuando, de entre un grupo de una pluralidad de antígenos diferentes igualmente accesibles como socios de aglutinación potencial, el GM-CSF de primate está unido al menos 10 veces, preferentemente 50 veces, aún más preferentemente 100 veces o mayor, más frecuentemente (en un sentido cinético) que cualquier otro antígeno diferente que el GM-CSF (por sus siglas en inglés) del primate. Tales mediciones y métodos pueden ser efectuados sobre un aparato Biacore . Cuando se utilice aquí, "neutralización", "neutralizador", "neutralizante" y las variantes relacionadas gramáticamente de los mismos, se refieren a la atenuación parcial o completa del (de los) efecto (s) biológico (s) de GM-CSF. Tal atenuación parcial o completa del (de los) efecto (s) biológico (s) de GM-CSF resulta de la modificación, interrupción, y/o anulación de la transducción de la señal mediada por GM-CSF, como se manifiesta, por ejemplo, en la señalización intracelular, la proliferación celular o la liberación de las substancias solubles, la regulación ascendente o descendente de la activación del gen intracelular, que conduce por ejemplo a la expresión de los receptores superficiales para los ligandos diferentes de GM-CSF (por sus siglas en inglés) . Como lo entiende una persona con experiencia en el arte, existen modos múltiples de determinación de que si un agente, por ejemplo, un anticuerpo en cuestión o un fragmento del mismo, va a ser clasificado como un neutralizador. Como un ejemplo, esto puede ser efectuado por una prueba in vitro estándar efectuada generalmente como sigue: en un primer experimento de proliferación, una línea celular, el grado de proliferación de la cual se sabe que depende de la actividad de GM-CSF, es incubada en una serie de muestras con concentraciones variables de GM-CSF, después de lo cual la incubación del grado de proliferación de la línea celular es medido. A partir de esta medición, la concentración de GM-CSF que permite la proliferación máxima intermedia de las células es determinada. Un segundo experimento de proliferación es efectuado entonces en cada una de las series de las muestras el mismo número de células que se utilizan en el primer experimento de proliferación, la concentración determinada anteriormente de GM-CSF y, en este tiempo, las concentraciones variables de un anticuerpo o fragmento del mismo que se sospecha que es un neutralizador de GM-CSF. La proliferación celular es medida nuevamente para determinar la concentración del anticuerpo o fragmento del mismo, suficiente para efectuar la inhibición del crecimiento máximo intermedio. Si la gráfica resultante de la inhibición del crecimiento contra la concentración del anticuerpo (o un fragmento del mismo) es de forma sigmoidal, conduciendo a una proliferación celular reducida con una concentración creciente del anticuerpo (o un fragmento del mismo) , entonces algún grado de inhibición del crecimiento dependiente del anticuerpo ha sido efectuado, es decir, la actividad de GM-CSF ha sido neutralizada hasta algún grado. En tal caso, el anticuerpo o fragmento del mismo puede ser considerado un "neutralizador" en el sentido de la presente invención. Un ejemplo de una línea celular, el grado de proliferación del cual se sabe que depende de la actividad de GM-CSF (por sus siglas en inglés), es la línea celular TF-1, como se describe en Kitamura, T. et al . , (1989). J Cell. Physiol 140, 323-34. Como lo entiende una persona con experiencia en el arte, el grado de proliferación celular no es el único parámetro por el cual se puede establecer la capacidad neutralizante. Por ejemplo, la medición del nivel de las moléculas de señalización (por ejemplo las citocinas) , el nivel de secreción del cual depende el GM-CSF, puede ser utilizado para identificar a un neutralizador de GM-CSF sospechoso . Otros ejemplos de las líneas celulares que pueden ser utilizadas para determinar si un anticuerpo en cuestión o fragmento del mismo es un neutralizador por la actividad de GM-CSF del primate incluyen AML-193 (Lange, B. et a l . , (1987). Blood 70, 192-9); GF-D8 (Rambaldi, A. et al . , (1993). Blood 81, 1376-83); GM/SO (Oez, S. et al . , (1990). Experimental Hematology 18, 1108-11); M07E (Avanzi, G. C. et a l . , (1990). Journal of Cellular Physiology 145, 458-64); TALL-103 (Valtieri, M. et al . , (1987). Journal of Immunology 138, 4042-50); UT-7 (Komatsu, N. et al . (1991). Cáncer Research 51, 341-8) . El anticuerpo humano o fragmento del mismo, de acuerdo con la invención es monoclonal. Cuando se utilice aquí, el término "monoclonal" se va a entender que tiene el significado descrito típicamente para él, en el arte, especialmente un anticuerpo (o su fragmento correspondiente) que surge de un clon único de una célula productora de anticuerpos tal como la célula B, y el reconocimiento de un epítopo único sobre el antígeno unido. Es particularmente difícil preparar anticuerpos humanos que son monoclonales. En contraste con las fusiones de las células B del murino con líneas celulares inmortalizadas, las fusiones de las células B humanas con las líneas células inmortalizadas no son viables. Por consiguiente, el anticuerpo monoclonal humano de la invención es el resultado de superar obstáculos técnicos significativos que se sabe generalmente que existen en el campo de la tecnología de los anticuerpos. La naturaleza monoclonal de los anticuerpos la hace particularmente muy adecuada para su uso como un agente terapéutico, puesto que tal anticuerpo existirá como una especie molecular homogénea, única, que puede estar bien caracterizada y hecha reproduciblemente y purificada. Estos factores conducen a un producto cuya actividad biológica puede ser predicha con un nivel elevado de precisión, muy importante si tal molécula está dirigiéndose a obtener la aprobación reguladora para la administración terapéutica en los seres humanos. Es especialmente importante que el anticuerpo monoclonal (o el fragmento correspondiente) de acuerdo con la invención, sea un anticuerpo humano (o fragmento correspondiente) . En la contemplación de un agente de anticuerpos propuesto para administración terapéutica a los seres humanos, es altamente ventajoso que este anticuerpo sea de origen humano. Después de la administración a un paciente humano, un anticuerpo humano o fragmento del mismo, será más probable que no produzca una respuesta inmunogénica fuerte por el sistema inmune del paciente, es decir, no será reconocido que es un "extraño", es decir, una proteína no humana. Esto significa que los anticuerpos del animal hospedero, es decir, los anticuerpos del paciente serán generados contra los anticuerpos terapéuticos gue de otra manera podrían bloquear la actividad del anticuerpo terapéutico y/o acelerar la eliminación del anticuerpo terapéutico del cuerpo del paciente, previniendo así que ejerza su efecto terapéutico deseado. El término anticuerpo "humano" como se utiliza aquí, se va a entender que significa que el anticuerpo de la invención, o su fragmento, comprende (una) secuencia (s) de aminoácidos contenida (s) en el repertorio del anticuerpo de la línea germinal humana. Para los propósitos de definición de aquí, un anticuerpo, o su fragmento, puede ser considerado por lo tanto humano si el mismo consiste de tal: (a) secuencia (s) de aminoácidos de la línea germinal humana, es decir, si la(s) secuencia (s) de aminoácidos del anticuerpo en cuestión o fragmento de la misma, es (son) idéntica (s) a (una) (s)) secuencia (s) de aminoácidos de la línea germinal humana expresada. Un anticuerpo o fragmento del mismo también puede ser considerado como humano si el mismo consiste de: (a) la(s) secuencia(s) que se desvía(n) de su(s) secuencia(s) de la línea germinal humana más cercana en no más de lo que se podría haber esperado debido a la impresión de su hipermutación somática. Adicionalmente, los anticuerpos de muchos mamíferos no humanos, por ejemplo roedores tales como ratones y ratas comprenden las secuencias de aminoácidos de VH CDR3 que se puede esperar que existan en el repertorio de anticuerpos humanos expresados también. Cualquiera (cualesquiera) de tal (es) secuencia (s) de origen humano o no humano que se puede esperar que exista en el repertorio humano expresado también podrían ser considerados como "humanos" para el propósito de la presente invención. De acuerdo con una modalidad de la invención, el GM-CSF (por sus siglas en inglés) de primate es el GM-CSF humano ( Homo sapiens) o el GM-CSF no humano. Las variantes preferidas especialmente de GM-CSF de primate no humano incluyen el GM-CSF del mono gibón ( nomascus concolor, también conocido como el gibón de cresta negra occidental) y el GM-CSF de los monos de la familia de los macacos, por ejemplo el GM-CSF del mono resus (Ma ca ca mula t ta ) y el mono cinomolgus (Ma ca ca fasci cularis ) y el GM-CSF de mono cinomolgus (Maca ca fascicularis) . De acuerdo con esta modalidad de la invención, el anticuerpo monoclonal humano o el fragmento del mismo exhibe una reactividad cruzada entre tanto el ser humano como al menos una de las especies de los monos mencionados anteriormente. Esto es especialmente ventajoso para una molécula de anticuerpos que está propuesta para administración terapéutica en sujetos humanos, puesto que tal anticuerpo normalmente tendrá que proceder a través de una multitud de pruebas previo a la aprobación reguladora, de la cual ciertas pruebas iniciales involucran especies de animales no humanos. Para efectuar tales pruebas, generalmente es deseable utilizar como una especie no humana, una especie que lleva un alto grado de semejanza genética con los seres humanos, puesto que los resultados así obtenidos generalmente serán altamente predictivos de los resultados correspondientes que pueden ser esperados cuando se administra la misma molécula a los seres humanos. Sin embargo, tal potencia predictiva basada en las pruebas en animales depende menos parcialmente de la comparabilidad de la molécula, y es muy elevada cuando, debido a la reactividad de las especies cruzadas, la misma molécula terapéutica puede ser administrada a los modelos de seres humanos y animales. Como en esta modalidad de la invención, cuando una molécula de anticuerpo tiene una reacción cruzada con el mismo antígeno en los seres humanos que en otras especies relacionadas estrechamente, las pruebas pueden ser efectuadas utilizando la misma molécula de anticuerpos en los seres humanos que en estas especies relacionadas estrechamente, por ejemplo en una de las especies de los monos mencionadas anteriormente. Esto incrementa tanto la eficiencia de las pruebas por sí mismas como la potencia predictiva permitida para tales pruebas con respecto al comportamiento de tales anticuerpos en los seres humanos, la última especie de interés desde un punto de vista terapéutico. De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, el anticuerpo monoclonal humano puede ser un anticuerpo de IgG. Como se sabe bien en el arte, un IgG comprende no solamente las regiones de anticuerpos variables responsables de la aglutinación y del reconocimiento del antígeno altamente discriminativo, sino también las regiones constantes de las cadenas de polipéptidos de anticuerpos ligeros y pesados presentes normalmente en los anticuerpos producidos endógenamente, y, en algunos casos, aún la decoración en uno o más sitios con los carbohidratos. Tal glicosilación es generalmente una marca distintiva del formato de IgG, y las porciones de estas regiones constantes componen la así llamada región de Fc de un anticuerpo total que se sabe que produce varias funciones efectoras in vivo. Además, la región de Fc tiene un papel mediador en la aglutinación de IgG al receptor de Fc, prolongando por consiguiente la vida media in vivo así como facilitando la instalación del IgG en las localizaciones con una presencia incrementada del receptor de Fc - tejido inflamado, por ejemplo. Ventajosamente, el anticuerpo de IgG es un anticuerpo de IgGl o un anticuerpo de IgG4, formatos que son preferidos puesto que su mecanismo de acción in vivo es particularmente bien entendido y caracterizado. Este es especialmente el caso para los anticuerpos de IgGl. De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, el fragmento del anticuerpo monoclonal humano puede ser un scFv, un anticuerpo de un solo dominio, un Fv, un anticuerpo de VHH, un "diacuerpo", un diacuerpo en serie, un Fab, un Fab' o un F(ab)2. Estos formatos pueden ser divididos generalmente en dos subclases, especialmente aquellos que consisten de una cadena de un solo polipéptido, y aquellos que comprenden al menos dos cadenas de polipéptidos. Los miembros de la primera subclase incluyen un scFv (que comprende una región de VH y una región de VL unidas en una sola cadena del polipéptido por medio de un enlazador del polipéptido) , un anticuerpo de un solo dominio (que comprende una región variable de un solo anticuerpo) tal como el anticuerpo de VHH (que comprende una sola región de VH) . Los miembros de esta última subclase incluyen un Fv (que comprende una región de VH y una región de VL como cadenas de polipéptidos separados que no están asociados covalentemente entre sí); un diacuerpo (que comprende dos cadenas de polipéptidos asociadas no covalentemente, cada una de las cuales comprende dos regiones variables de anticuerpos normalmente un VH y un VL por cadena de polipéptido - las dos cadenas de polipéptidos están arregladas en una conformación de cabeza con cola de modo que resulte una molécula de anticuerpos bivalentes); un diacuerpo en serie (anticuerpos de Fv de una sola cadena, biespecíficos, que comprenden cuatro variables de inmunoglobulina enlazadas covalentemente - regiones de VH y VL - de dos diferentes especificidades, formando un homodímero que es dos veces tan grande como el diacuerpo descrito anteriormente); un Fab (que comprende como una cadena del polipéptido, una cadena ligera del anticuerpo completo que comprende por sí misma una región de VL y la región constante de la cadena ligera completa, y, como otra cadena del polipéptido, una parte de una cadena pesada del anticuerpo que comprende una región de VH completa y una parte de la región constante de la cadena pesada, y dos cadenas de polipéptidos que están conectadas intermolecularmente por medio de un enlace de disulfuro intercadena) ; un Fab' (como un Fab, anterior, excepto con enlaces de disulfuros reducidos comprendidos sobre la cadena pesada del anticuerpo); y un F(ab)2 (que comprende dos moléculas de Fab' , cada Fab' está enlazado a la otra molécula de Fab' respectivo por medio de los enlaces de disulfuro intercadena). En general, los fragmentos de un anticuerpo del tipo descrito anteriormente permiten una gran flexibilidad en la adaptación, por ejemplo, las propiedades farmacocinéticas de un anticuerpo deseado para administración terapéutica a las exigencias particulares a la mano. Por ejemplo, puede ser deseable el tamaño del anticuerpo administrado para incrementar el grado de penetración del tejido cuando se tratan los tejidos que se sabe que van a estar vascularizados pobremente (por ejemplo, las articulaciones). Bajo ciertas circunstancias, puede ser deseable incrementar la velocidad a la cual el anticuerpo terapéutico es eliminado del cuerpo, la velocidad generalmente puede ser acelerada por la reducción del tamaño del anticuerpo administrado. De acuerdo con una modalidad de la invención, el anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo puede estar presente en las formas monoespecífica monovalente, monoespecí fica multivalente, en particular en una forma monoespecí fica bivalente, o una forma multiespecífica multivalente, en particular en formas biespecíficas bivalentes. En general, un anticuerpo monoespecífico multivalente, en particular un anticuerpo monoespecífico bivalente tal como un IgG humano total como se describió anteriormente, puede ser llevado con la ventaja terapéutica de que la neutralización efectuada por tal anticuerpo es potenciada por los efectos de avidez, es decir, por la aglutinación del mismo anticuerpo a las moléculas múltiples del mismo antígeno, aquí el GM-CSF de primate. Varias formas monoespecíficas monovalentes de los fragmentos del anticuerpo de la invención han sido descritas anteriormente (por ejemplo, un scFv, un Fv, un VHH o un anticuerpo de un solo dominio). Las formas multiespecíficas multivalentes, en particular las formas biespecíficas bivalentes del anticuerpo de GM-CSF anti-primate, monoclonal, humano, de la invención, pueden incluir un IgG total en el cual un brazo de aglutinación se enlaza al GM-CSF (por sus siglas en inglés) del primate mientras que el otro brazo de aglutinación del cual se enlaza a otro antígeno diferente del GM-CSF del primate. Una forma multivalente multiespecífica adicional, en particular una forma biespecífica bivalente puede ser ventajosamente un anticuerpo biespecífico de una sola cadena, humana, es decir, una construcción del anticuerpo humano recombinante que comprende dos entidades de scFv como se describió anteriormente, conectado en una cadena de polipéptido contigua por un espaciador de polipéptido interpuesto corto como se sabe generalmente en el arte (véase por ejemplo WO 99/54440 para un anticuerpo de una sola cadena biespecífica de anti-CDl9 x anti-CD3). Aquí, una porción de scFv del anticuerpo de la cadena única biespecífica comprendido dentro del anticuerpo de la cadena única biespecifica se enlazara específicamente al GM-CSF de primate como se describió anteriormente, mientras que la otra porción de scFv respectiva de este anticuerpo de una sola cadena, biespecifica, se enlazara a otro antigeno que se determinó que va a ser de beneficio terapéutico. De acuerdo con una modalidad adicional del anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo puede ser derivado, por ejemplo, con un polímero orgánico, por ejemplo con una o mas moléculas del polietilenglicol ("PEG") y/o polivmilpirrolidona ("PVP") . Como se sabe en el arte, tal derivación puede ser ventajosa en la modulación de las propiedades farmacodmamicas de los anticuerpos o fragmentos del mismo. Se prefieren especialmente las moléculas de PEG (por sus siglas en ingles) derivadas de la PEG-maleimida, haciendo posible la conjugación con el anticuerpo o fragmento del mismo de una manera especifica para el sitio por medio del grupo sulfhídrilo de un aminoácido de cisteína. De estas, se prefiere especialmente la PEG-maleimida de 20 kD y/o de 40 kD, ya sea en la forma de cadena ramificada o recta. Puede ser especialmente ventajoso incrementar el peso molecular efectivo de los fragmentos del anticuerpo de GM-CSF de anti-primate, humanos mas pequeños, tales como los fragmentos de scFv por la unión de este ultimo a una o más moléculas de PEG, especialmente de PEG-maleimida . De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, el anticuerpo monoclonal humano o el fragmento del mismo se enlaza específicamente a un epítopo, en particular a un epítopo discontinuo del GM-CSF de primate humano o no humano que comprende los aminoácidos 23-27 (RRLLN) y/o los aminoácidos 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL) . La variabilidad en la posición 67 dentro del fragmento 65-77 de la secuencia de aminoácidos mostrado anteriormente refleja la heterogeneidad de esta porción del GM-CSF del primate entre, por una parte, el GM-CSF humano y del gibón (en el cual la posición 67 es R) y, por otra parte, los monos de la familia de los macacos, por ejemplo los monos cinomolgus y resus (en los cuales la posición 67 es Q) . Cuando se utilice aquí, la numeración del GM-CSF humano y no humano se refiere a aquel de la naturaleza GM-CSF, es decir, GM-CSF (por sus siglas en inglés) sin su secuencia de la señal de 17 aminoácidos (la longitud total de GM-CSF maduro en las especies de primates tanto humanos como no humanos descritas anteriormente es de 127 aminoácidos) . La secuencia de GM-CSF humano y GM-CSF de gibón es como sigue: APARSPSPST QPWEHV AIQ EA LLN Si? OTAAEMNETV EVISE FDLQ EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE La secuencia de GM-CSF en ciertos miembros de la familia de los monos macacos tales como por ejemplo el mono resus y el mono cinomolgus es como sigue: APARSPSPGT QP EHVNAIQ EARRLLNLSi? OTAAEMNKTV EWSEMFDLQ EPSCLQTRLE LYKQGLQGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFQSFKENL KDFLLVIPFD C EPVQE El epítopo mínimo, ventajosamente un epítopo discontinuo, unido por el anticuerpo monoclonal humano de la invención (o fragmentos del mismo) como se describió anteriormente está indicado en la secuencia de GM-SCF con negritas. Cuando se utilice aquí, el término "epítopo discontinuo" se va a entender como al menos dos fragmentos de la secuencia de aminoácidos no adyacentes dentro de una cadena de polipéptidos dada, aquí el GM-CSF humano maduro y de primate no humano, que son unidos de manera simultánea y específica (como se definió anteriormente) por un anticuerpo. De acuerdo con esta definición, tal aglutinación específica simultánea puede ser del polipéptido de GM-CSF de la forma lineal. Aquí, se puede imaginar al polipéptido de GM-CSF maduro formando un bucle extendido, en una región de la cual las dos secuencias indicadas en la hilera anterior con negritas, por ejemplo más o menos en paralelo y en proximidad uno del otro. En este estado los mismos son unidos de manera específica y simultánea por el fragmento del anticuerpo de la invención. De acuerdo con esta definición, la aglutinación específica simultánea de los dos fragmentos de la secuencia de GM-CSF maduros indicados anteriormente también puede tomar la forma del anticuerpo que se enlaza a un epítopo de conformación. Aquí, el GM-CSF maduro ya tiene formado su conformación terciaria como la misma existe normalmente in vivo (Sun, H. W., J. Bernhagen, et al. (1996). Proc. Nati Acad. Sci USA 93, 5191-6) . En esta conformación terciaria, la cadena de polipéptidos de GM-CSF maduro es plegado en tal manera para llevar los dos fragmentos de la secuencia indicadora anteriormente en proximidad espacial, por ejemplo sobre la superficie externa de una región particular de GM-CSF plegado, maduro, en donde los mismos son reconocidos entonces en virtud de su conformación tridimensional en el contexto de las secuencias del polipéptido circundante. En la modalidad preferida, el epítopo anterior (discontinuo) comprende además los aminoácidos 28-31 (LSRD) , con letras itálicas en las secuencias anteriores de GM-CSF de primate humano y no humano. En la modalidad preferida especialmente, cualquiera de los epítopos anteriores (discontinuos) comprende además los aminoácidos 32-33 (TA) y/o los aminoácidos 21-22 (EA) , cada uno de tales fragmentos está subrayado en cada una de las secuencias anteriores del GM-CSF del ser humano y de un primate no humano. De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, el anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo comprende en su región variable de cadena pesada un CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de aquellos descritos en cualquiera de las SEC ID NOS: 1-13 ó 56. Es preferido un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento del mismo que comprende una región variable de cadena pesada CDRl como se describe en la SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de la cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15 y una secuencia de CDR3 de la región variable de la cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 1; o una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15, y una secuencia de CDR3 de una región variable de cadena pesada como se describe en la SEC ID NO: 2; o que comprende una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 14; una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15, y una secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 3; o que comprende una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en la SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15, y una secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 4; o que comprende una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en la SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en la SEC ID NO: 15 y una secuencia de CDR3 de la región variable de la cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 5; o que comprende una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15 y una secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 6; o que comprende una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15 y una secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 7; o que comprende una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15 y una secuencia de CDR3 de la región variable de la cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 8; o que comprende una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15 y una secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada como se describe en la SEC ID NO: 9; o que comprende una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15, y una secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada como se describe en la SEC ID NO: 10; o que comprende una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15 y una secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 11; o que comprende una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15 y una secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 12; o una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 15 y una secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 13; o que comprende una secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 14, una secuencia de CDR2 de la región variable de la cadena pesada como se describe en la SEC ID NO: 15 y una secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada como se describe en la SEC ID NO: 56.
De manera todavía más preferida, cualquiera de las 14 combinaciones anteriores de las secuencias de CDRl, CDR2, y CDR3 existen en un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo que comprende además en su región variable de cadena ligera un CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 16, un CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID NO: 17, y un CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID NO: 18. De acuerdo con una modalidad adicional, el anticuerpo monoclonal humano de la invención o fragmento del mismo comprende en su región variable de cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19. Se prefiere un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 20; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 21; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 22; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 23; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 24; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo; la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 25; o un fragmento monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 26; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 27; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 28; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 29; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 30; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 31; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 32; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 33; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 52; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 19 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 53. De acuerdo con una modalidad adicional, el anticuerpo monoclonal humano de la invención o fragmento del mismo comprende en su región variable de cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54. Es preferido un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 20; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 21; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 22; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 23; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 24; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 25; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 26; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 27; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 28; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 29; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 30; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 31; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 32; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 33; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe SEC ID NO: 52; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en • SEC ID NO: 54 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 53. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo monoclonal humano de la invención o fragmento del mismo comprende en su región variable de cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55. Se prefiere un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 20; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 21; o un anticuerpo monoclonal humano fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 22; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 23; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 55; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 24; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 25; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 26; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 27; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 28; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 29; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 30; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 31; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 32; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 33; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 52; o un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 55 y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 53. Una modalidad preferida proporciona un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, que comprende en su cadena ligera, una región variable de una región CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 16, una región de CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 17, y un CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 18 y que comprende en su región variable de cadena pesada una región de CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 14, una región de CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 15 y un CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en cualquiera de las SEC ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 56. En una modalidad preferida adicional, el anticuerpo monoclonal humano comprende en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su secuencia de aminoácidos de cadena pesada como se describe en SEC ID NO: 35; o en su cadena ligera un secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 36; o en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 37; o en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena de aminoácidos una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 38; o en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 39; o en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 40; o en su secuencia de aminoácidos de cadena ligera como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 41; o en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 42; o en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 43; o en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 44; o en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 45; o en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 46; o en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 47; o en su cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 34 y en su cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 48. Las modalidades preferidas anteriores proporcionan moléculas de anticuerpo monoclonal humano y/o fragmentos de las mismas que son especialmente ventajosas como neutralizadores de la actividad del GM-CSF de primate, especialmente del ser humano. Los anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de los mismos de acuerdo con estas modalidades especialmente preferidas son altamente ventajosos por varias razones.
En primer lugar, las mismas reconocen de manera altamente específica el GM-CSF de primate, es decir, que forman una mezcla del GM-CSF del primate con otros factores estimulantes de la colonia del primate (por ejemplo G-CSF y M-CSF del primate), las moléculas de aglutinación de acuerdo con estas modalidades preferidas especialmente son altamente discriminadoras para el GM-CSF del primate, mientras que otros factores estimulantes de las colonias en el mismo medio no son reconocidos. Esto significa que un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, de acuerdo con estas modalidades, cuando se administra a los seres humanos, se esperará que se aglutine específicamente a, y neutralice solamente el objetivo deseado, mientras que otros objetivos indeseables no son ni neutralizados ni se unen a ellos. Por último, esto conduce a un alto grado de predicción con respecto al modo terapéutico de acción in vivo . En segundo lugar, los aglutinadores de acuerdo con estas modalidades preferidas especialmente se enlazan al GM-CSF del primate con una afinidad extremadamente elevada. Los valores de KD desde aproximadamente 4 x 10~9 M descendiendo hasta un valor tan bajo como aproximadamente 0.04 x 10~9 M, este último correspondiente a aproximadamente 40 pM han sido observados para las moléculas de esta clase. Puesto que la velocidad de encendido sin embargo de tales moléculas en el medio acuoso es ampliamente controlado por difusión y por lo tanto no puede ser mejorado más allá de lo que las condiciones de difusión local lo permitirán bajo condiciones fisiológicas, la KD inferior surge principalmente como resultado de la velocidad de apagado cinética, kapagad0, que para el aglutinante del anticuerpo de afinidad más elevada es de aproximadamente 10"5 s_1. Esto significa que una vez que el complejo entre un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de estas modalidades de la invención por una parte y el GM-CSF de primate por la otra parte sean formados, el mismo no se separa fácilmente, o al menos no rápidamente. Para la aglutinación de las moléculas propuestas como neutralizadores de la actividad biológica, estas características son altamente ventajosas puesto que el efecto neutralizante deseable normalmente durará solamente el tiempo que la molécula, la actividad biológica de la cual va a ser neutralizada (aquí el GM-CSF del primate) permanezca unida por la neutralización de la molécula aglutinante. Así, una molécula neutralizante que permanece unida a su objetivo propuesto durante un período de tiempo prolongado continuará realizando la neutralización durante un período prolongado correspondientemente . La afinidad de aglutinación elevada de los anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos de los mismos hacia el GM-CSF de primate tiene una ventaja adicional. Normalmente, los anticuerpos o fragmentos de los mismos serán eliminados de la corriente sanguínea de un paciente de un modo dependiente del tamaño, con las moléculas más pequeñas que son excretadas y eliminadas antes que unas más grandes. Puesto que el complejo de los dos polipéptidos - anticuerpo o fragmento del anticuerpo y el GM-CSF unido - es obviamente más grande que el anticuerpo solo, la kapagado baja anterior tiene el efecto de que el neutralizador terapéutico es excretado y eliminado del cuerpo del paciente más lentamente de lo que podría ser el caso, si el mismo no estuviera unido a GM-CSF. Por consiguiente, no solamente la actividad neutralizante sino también su duración in vivo son incrementadas . Finalmente, la actividad neutralizante determinada para los aglutinantes de acuerdo con estas modalidades preferidas especialmente es sorprendentemente elevada. Como se describirá con mayor detalle posteriormente aquí, la actividad neutralizante es medida in vi tro utilizando un ensayo de inhibición del crecimiento TF-1 (Kitamura, T. et al . , (1989). J. Cell Physiol 140, 323-34). Como una indicación del potencial neutralizante, los valores de IC50 fueron medidos, el IC50 representa la concentración del anticuerpo monoclonal humano o un fragmento del mismo, de acuerdo con cualquiera de estas modalidades de la invención requeridas para producir una inhibición máxima intermedia de la proliferación de las células TF-1. Para los anticuerpos monoclonales humanos o fragmentos del mismo, de acuerdo con cualquiera de estas modalidades de la invención, un valor de IC50 de aproximadamente 3 x 10"10 M, o de aproximadamente 0.3 nM fue determinado. Las moléculas de aglutinación de acuerdo con cualquiera de estas modalidades de la invención por lo tanto son neutralizadores altamente potentes de la actividad del GM-CSF de primate. En resumen, entonces, un anticuerpo monoclonal humano o el fragmento del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores de la invención exhibe un alto grado de discriminación para el antígeno deseado, se enlaza a este antígeno de manera extremadamente fuerte y durante un período prolongado y exhibe una actividad neutralizadora altamente potente durante el tiempo prolongado que el mismo permanece unido. Al mismo tiempo, la persistencia prolongada del complejo de aglutinante-antígeno hace lenta la eliminación de este aglutinante del cuerpo, por lo cual se alarga la duración del efecto terapéutico deseado in vivo . Un aspecto adicional de la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con un aminoácido como se describe en cualquiera de las SEC ID Nos: 1-48 y/o 52-56. La homología fue determinada por los programas de alineación de la secuencia estándares tales como Vector NTI (InforMax™, Maryland, EUA) . Tales programas comparan las secuencias alineadas sobre una base de aminoácido por aminoácido, y como puede ser ajustada para varios niveles de características estructurales para la comparación (por ejemplo, aminoácidos idénticos, substitución de aminoácidos conservadores etc.). Cuando el término es utilizado aquí, dos aminoácidos en cuestión se considera que son "substituciones conservadoras" entre sí, si los mismos pertenecen cada uno a la misma clase química, es decir, son ácidos, no polares, polares no cargados y básicos. A manera de ejemplo no limitativo, dos aminoácidos diferentes gue pertenecen a la clase de los aminoácidos no polares podrían ser considerados "substituciones conservadoras" entre sí, aún si estos dos aminoácidos no son idénticos, mientras que un aminoácido no polar por una parte y un aminoácido ácido por otra parte podrían no ser consideradas como "substituciones conservadoras" una con respecto a la otra. El panel 3.1 de "Molecular Biology of de Cell", 4 a Edición (2002), por Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts y Walters agrupa los aminoácidos en cuatro grupos principales: ácidos, no polares, polares no cargados y básicos. Tal agrupación puede ser utilizada para los propósitos de la determinación, para los propósitos de la presente invención, de que si un aminoácido particular es una substitución conservadora o no del otro aminoácido en cuestión.
Un aspecto adicional de la invención proporciona una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se describe en cualquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52 hasta 56 o una secuencia de nucleótidos que exhibe al menos 70 % de homología con la misma, en donde la homología puede ser determinada por la comparación de una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56 con una secuencia de nucleótidos en cuestión por la alineación de la secuencia (como se determinó anteriormente, para las secuencias de aminoácidos), en donde un nucleótido en la secuencia en cuestión se considera homólogo si es ya sea idéntico con respecto al nucleótido correspondiente en la secuencia del nucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente de cualquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56 o si una o más desviación (es) de los nucleótidos en la secuencia en cuestión a partir de uno o más nucleótido (s) correspondiente (s) en la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56 conduce a una tripleta de nucleótidos la cual, cuando es traducida, conduce a un aminoácido que es ya sea idéntico con (debido a la tripleta degenerada) o con una substitución conservadora del aminoácido correspondiente en la secuencia de aminoácidos correspondiente de cualquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56. Aquí, el término "substitución conservadora" se va a entender como se describió anteriormente. Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo o una molécula de polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se describe en cualquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56 o que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos que lleva al menos 70 % de homología con cualquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56, en donde "homología" se entiende como se explicó anteriormente. De acuerdo con esta invención, el término "composición farmacéutica" se refiere a una composición para administración a un paciente, preferentemente a un paciente humano. En la modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intraarterial, intratecal y/o intranasal o por inyección directa en el tejido. Se contempla en particular que la composición farmacéutica sea administrada a un paciente por medio de infusión o inyección. La administración de las composiciones adecuadas puede ser efectuada por diferentes formas, por ejemplo, por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además un portador farmacéutico aceptable. Los ejemplos de los portadores farmacéuticos adecuados son bien conocidos en el arte e incluyen soluciones salinas amortiguadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, liposomas, etc. Las composiciones que comprenden tales portadores pueden ser formuladas por los métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser administradas al sujeto en una dosis adecuada. El régimen de dosificación puede ser determinado por el médico que proporciona la atención y los factores clínicos. Como se sabe bien en las artes médicas, las dosificaciones para cualquier paciente depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de la superficie corporal, la edad, el compuesto particular que va a ser administrado, el sexo, y la ruta de administración, la salud general, y otros fármacos que son administrados concurrentemente. Las preparaciones para administración parenteral incluyen las soluciones acuosas o no acuosas, estériles, suspensiones, y emulsiones. Los ejemplos de los solventes no acuosos son el propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo una solución salina y un medio amortiguado. Los vehículos parenterales incluyen una solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer tratada con lactato, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen rellenadores de fluidos y nutrientes, rellenadores de electrólitos (tales como aquellos sobre la dextrosa de Ringer) y semejantes. Los conservadores y otros aditivos también pueden estar presentes tal como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y semejantes. Además, la composición farmacéutica de la presente invención podría comprender portadores proteináceos, por ejemplo, la albúmina del suero o inmunoglobulina, preferentemente de origen humano. Se contempla que la composición farmacéutica de la invención podría comprender, además, del anticuerpo monoclonal humano o un fragmento del mismo (como se describió en esta invención), agentes activos biológicamente, adicionales, dependiendo del uso propuesto de la composición farmacéutica. Tales agentes podrían ser fármacos que actúan sobre el sistema gastrointestinal, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que previenen la hiperuricemia, fármacos que inhiben las inmunoreacciones (por ejemplo corticosteroides), fármacos que regulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o sobre agentes tales como las citocinas conocidas en el arte. Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo como se describió aquí anteriormente o una molécula de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se describió en cualquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56 o que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos que lleva al menos 70 % de homología con cualquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56, en donde "homología" se va a entender como se explicó aquí anteriormente, en la manufactura de un medicamento, que comprende opcionalmente uno o más agentes antiinflamatorios, para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias. Las enfermedades inflamatorias son elegidas ventajosamente del grupo que consiste de la artritis reumatoide (RA) (por sus siglas en inglés) que incluye la RA que es resistente al tratamiento con los neutralizadores de TNF-alfa) , asma, esclerosis múltiple (MS) (por sus siglas en inglés) , enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) (por sus siglas en inglés), síndrome de tensión respiratoria aguda (ARDS) (por sus siglas en inglés), enfermedad de Crohn, fibrosis pulmonar idiopática (IPF) (por sus siglas en inglés), enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (por sus siglas en inglés), uveítis, degeneración macular, colitis, psoriasis, degeneración de Wallerian, síndrome de antifosfolípidos (APS) (por sus siglas en inglés) , síndrome coronario agudo, restinosis, ateroesclerosis, policondritis recidivante (RP) (por sus siglas en inglés), hepatitis aguda o crónica, implantes ortopédicos que han fallado, glomerulonefritis, lupus o enfermedades autoinmunes. Es de interés especial el uso del anticuerpo monoclonal humano para el tratamiento de RA (incluyendo RA el cual es distinto al tratamiento con los neutralizadores de TNF-alfa), asma, MS y/o la enfermedad de Crohn. Con respecto a RA, asma y/o MS, existen dos teorías populares con respecto a la patogénesis de la artritis reumatoide (RA) . La primera sostiene que las células T, por medio de la interacción con un antígeno - todavía no identificado -, es la célula principal responsable del inicio de la enfermedad así como de desencadenar el proceso inflamatorio crónico. Esta teoría está basada en la asociación conocida de RA con los antígenos de histocompatibilidad principal de la clase II, el uso de un gran número de células T de CD4+ y del gen receptor de la célula T asimétrica en el sinovio con RA. El GM-CSF (por sus siglas en inglés) ya se sabe que mejora el antígeno que presenta la función aunque el incremento de la expresión de MHC de la clase II superficial y GM-CSF son producidas por las células T, indicando un papel supuesto para el GM-CSF en el progreso de la enfermedad de acuerdo con la hipótesis basada en las células T. La segunda teoría sostiene que, aunque las células T pueden ser importantes en el inicio de la enfermedad, es auto-perpetuada por los macrófagos y los fibroblastos de una manera independiente de las células T. Esta teoría está basada en la ausencia relativa de los fenotipos de las células T activadas en RA crónico y la preponderancia de los fenotipos de los fibroblastos y macrófagos activados. GM-CSF es un estimulador potente de los macrófagos y promueve la proliferación de los monocitos y macrófagos. El GM-CSF se sabe que va a ser producido principalmente por las células "efectoras" (macrófagos) y las células del tejido conectivo (fibroblastos) son expresadas en abundancia en el sinovio o RA y el fluido sinovial, cuando se mide por los estudios de ELISA o de ARNm. De acuerdo con la "teoría del macrófago-fibroblasto" de RA, estos dos tipos de células parece que van a ser ampliamente responsables de crear un estado de auto-perpetuación de la inflamación crónica en el cual la participación de las células T puede ya no ser crítica. En este escenario, el macrófago activado secreta continuamente IL-1 y TNF que mantienen al fibroblasto sinovial en un estado activado. El fibroblasto, a su vez, secreta grandes cantidades de: (a) citocinas - IL6, IL8 y GM-CSF; b) prostaglandinas, y (c) enzimas de proteasa. El GM-CSF se realimenta para promover la maduración de los monocitos reclutados recientemente hasta los macrófagos. IL-8 e IL-6 contribuyen a la reclutación y/o la activación de todavía otras poblaciones de células, aunque las prostaglandinas y las proteasas actúan directamente para erosionar y destruir los tejidos conectivos cercanos tales como los huesos y los cartílagos . Con respecto a la enfermedad de Crohn, el factor estimulante de las colonias de granulocitos/macrófagos humanos, recombinantes (rGM-CSF) (por sus siglas en inglés) de la levadura todavía muestran eficacia en el tratamiento de la enfermedad de Crohn, moderada a severa (Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002) . Lancet 3 60, 1 478-80) . Varios artículos revisados han especulado entonces lo consiguiente acerca del efecto terapéutico de estas citocinas proinflamatorias potentes en esta enfermedad, que se cree que va a ser de una naturaleza inflamatoria. Las explicaciones posibles para el modo de acción de rGM-CSF incluyeron un componente de inmunodeficiencia en la enfermedad de Crohn, las células de Th 2 que se hacen asimétricas, y la expansión de las células dendríticas que promueven la diferenciación de las células T reguladoras (Wilk NJ, Viney JL (2002). Curr Opin Invest Drugs 3, 1291-6; Folwaczny C et al. (2003) . Eur J Gastroenterol Hepatol 15, 621-6) . Los inventores creen que un modo más simple de acción, el cual al mismo tiempo es más consistente con el papel conocido de GM-CSF en otras enfermedades proinflamatorias puede ser propuesto. El GM-CSF (por sus siglas en inglés) es uno de los adyuvantes más potentes conocidos, lo cual es porque la citocina es coadministrada en numerosos intentos de vacunación en curso. Al mismo tiempo, el GM-CSF es altamente inmunogénico (Ragnhammar P et al. (1994). Blood 84, 4078-87). Un estudio muy reciente (Rini B et al. (2005) Cytokine 29, 56-66) ha mostrado que el tratamiento subcutáneo diariamente con rGM-CSF (por sus siglas en inglés) de la levadura, como se efectúa en el ensayo de la enfermedad de Crohn (Dieckgraefe BK, Korzenik JR (2002). Lancet, 360, 1468-80), condujo dentro de tres meses al 87 % (13/15) de los pacientes con cáncer de la próstata, al desarrollo de anticuerpos contra la citocina. Sesenta por ciento de los pacientes (9/15) desarrollaron anticuerpos neutralizantes de GM-CSF (policlonal). La posibilidad de una respuesta neutralizante con respecto a GM-CSF no fue investigada en el ensayo de la enfermedad de Crohn, ni los niveles del suero de GM-CSF fueron determinados bajo terapia. Dentro del alcance de esta modalidad de la invención, se contempla que los pacientes con la enfermedad de Crohn tratados con rGM-CSF no respondieron directamente solo a la actividad estimuladora-inmune de la citocina sino también, al menos en parte, respondieron clínicamente a una respuesta del anticuerpo que neutraliza el GM-CSF tanto administrado así como el GM-CSF endógeno, el cual se sabe que va a ser sobreproducido en la enfermedad de Crohn (Agnholt J et al. (2004) Eur J Gastroenterol Hepatol 16, 649-55). Los anticuerpos de anti-GM-CSF neutralizantes, entonces, pueden tener una actividad terapéutica semejante en la enfermedad de Crohn como lo hace el rGM-CSF, y deben ser considerados como un método terapéutico alternativo, como se contempló aquí anteriormente. Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, como se describió anteriormente, o una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se describió en cualquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56 o que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos que lleva al menos 70 % de homología con respecto a cualquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56, en donde "homología" se va a entender como se explicó aquí anteriormente en la manufactura de un medicamento, que comprende adicionalmente uno o más agentes anticáncer adicionales, para el tratamiento de una enfermedad tumorígena u otra condición con apoptosis celular retardada, supervivencia o proliferación celular incrementada. Una enfermedad tumorígena preferida es un cáncer, del cual la leucemia, mieloma múltiple, carcinoma gástrico o carcinoma de la piel, son preferidas especialmente . Olver et al ((2002) Cáncer Chemother Pharmacol. 50, 171-8) aplicaron simultáneamente el antagonista E21R de GM-CSF en pacientes con tumores sólidos que se sabe que expresan receptores de GM-CSF, conduciendo a una reducción solamente temporal de los niveles del suero de PSA. Además, la aplicación de este agonista de GM-CSF en la leucemia mieloide aguda ("AML") (por sus siglas en inglés) no revela la actividad clínica (Jakupovic et al. (2004) Blood 103, 3230-2). Todavía adicionalmente, la aplicación de los anticuerpos monoclonales de anti-GM-CSF a los pacientes con AML no revelan un efecto antileucémico a pesar de niveles del suero suficientes y una actividad biológica del anticuerpo in vivo (Bouabdallah et al. (1998) Leuk Lymphoma 30, 539-49) . Los autores por consiguiente concluyeron así que el tratamiento con anticuerpos de anti-GM-CSF no es efectivo en los pacientes con AML. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención será descrita con mayor detalle en los siguientes ejemplos y figuras no limitativas, una revisión de las cuales se da enseguida. La figura 1 muestra la intensidad de la absorción (directamente proporcional a la resistencia de la aglutinación) para una variedad de moléculas de scFv de anti-rhGM-CSF obtenidas durante • cuatro o cinco rondas de producción en la exhibición del fago como se determinó por ELISA. La figura 2 muestra la intensidad de la fluorescencia promedio (inversamente proporcional a la fuerza de la neutralización) para una variedad de scFv de anti-rhGM-CSF y otras moléculas de prueba como se determina por un ensayo a base de citometría de flujo. La figura 3 muestra los resultados de un ensayo de inhibición de la proliferación de TF-1 efectuado utilizando la molécula 5-306 de scFv de anti-rhGM-CSF. La figura 4 muestra la intensidad de la absorción (directamente proporcional a la fuerza de la aglutinación) para una variedad de moléculas de scFv de anti-rhGM-CSF humanas, obtenidas durante cuatro o cinco rondas de producción en el ensayo del fago como se determinó por ELISA. La figura 5 muestra los resultados del ensayo de inhibición de la proliferación de TN-1 efectuado utilizando varios valores exitosos de scFv de anti-rhGM-CSF humanos, representativos . Las figuras 6A-6C muestran la especificidad de la aglutinación de los anticuerpos monoclonales humanos para GM-CSF (por sus siglas en inglés) y otros factores estimulantes de las colonias humanas.
Las figuras 7A-7I muestran las mediciones de la resonancia del plasmón superficial que caracterizan la aglutinación cinética de los anticuerpos de anti-GM-CSF monoclonales, humanos, y fragmentos de los mismos. La figura 8A muestra la alineación de la secuencia de un GM-CSF de primate no humano y de un GM-CSF humano. La figura 8B muestra un radiograma por puntos de los péptidos que muestra la aglutinación de un fragmento de un anti-GM-CSF monoclonal humano a un GM-CSF humano. Las figuras 9A-9B muestran los resultados cualitativos del ensayo de inhibición de la proliferación de TF-1 efectuado utilizando varios fragmentos de anticuerpos de scFv de anti-rhGM-CSF humanos, representativos. Las figuras 10A-10D muestran los resultados cuantitativos del ensayo de inhibición de la proliferación de TF-1 efectuado utilizando varios IgGs de anti-rhGM-CSF representativos y fragmentos de scFv correspondientes. La figura 11 muestra los resultados cuantitativos del ensayo de producción de IL8 efectuado utilizando varios fragmentos de anticuerpos de scFv de anti-rhGM-CSF humanos representativos . Las figuras 12A-12B muestran los resultados cuantitativos del ensayo de inhibición de la proliferación de TF-1 efectuado utilizando varios IgGs de anti-macGM-CSF humanos, representativos y los fragmentos de scFV correspondientes . La figura 13 muestra los resultados del estudio de aglutinación comparativo que muestra la selectividad de la aglutinación del IgG B del anticuerpo de anti-GM-CSF para el GM-CSF humano recombinante y el GM-CSF de varias especies diferentes de los primates. Las figuras 14A-14B muestran los resultados del ensayo que investiga la dependencia del potencial neutralizante del IgG B de anti-GM-CSF sobre la glicosilación de GM-CSF. Las figuras 15A-15B muestran los resultados del estudio del efecto del IgG B del anticuerpo de anti-GM-CSF sobre la supervivencia de los eosinófilos mediada por GM-SCF. Las figuras 16A-16B muestran los resultados del estudio del efecto del IgG B del anticuerpo de anti-GM-CSF sobre la activación del eosinófilo mediado por GM-CSF. Las figura 17A, figura 17B, figura 17C, figura 17D, figura 17E, figura 17F muestran los resultados del estudio de toxicología ex vivo utilizando el IgG B del anticuerpo de anti-GM-CSF, medido con base en la fagocitosis (figuras 17A-17C) y las ráfagas oxidantes (figuras 17D-17F) por los granulocitos . Las figura 18A, figura 18B, figura 18C, figura 18D, figura 18E, figura 18F muestran los resultados del estudio de toxicología ex vivo utilizando el IgG B del anticuerpo de anti-GM-CSF, medido con base en la fagocitosis (figuras 18A-18C) y las ráfagas oxidantes (figuras 18D-18F) por los monocitos . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ejemplos Ejemplo 1: Procuración del antigeno de GM-CSF humano recombinante ("rh") utilizado para la generación de los anticuerpos humanos neutralizantes y los fragmentos de los mismos . Ejemplo 1.1: Clonación, expresión y purificación del antígeno de rhGM-CSF El gen que codifica el antígeno de GM-CSF humano fue subclonado en el vector de pET22b(+) (Novagene, EUA) del vector de expresión pORF-hGM-CSF (Novagen, EUA) por medio de los sitios Ndel y Xhol de reconocimiento de la enzima de restricción introducida por PCR. El gen que codifica hGM-CSF en pET22b(+) fue fusionado a la secuencia delantera de pelB y es adecuada para la expresión en el periplasma de E. coli. La producción y purificación de las proteínas fue efectuada como se describe por el fabricante. En resumen, BL21DE3 de E. coli fue transformado con el plásmido de expresión y se hizo crecer a 37 °C en un medio selectivo a una densidad óptica de 0.5-0.8 a 600 nm. La producción de proteínas fue inducida por la adición de IPTG a 1 mM y la reducción de la temperatura a 25 °C. Una preparación periplásmica fue efectuada por el choque osmótico utilizando una solución de sucrosa al 20 % para destruir selectivamente la pared celular manteniendo una pared celular intacta. El hGM-CSF natural contiene dos puentes de disulfuro y la expresión en el periplasma oxidante de E. coll permite la formación de estos puentes de disulfuro funcionalmente importantes . El GM-CSF humano recombinante ("rhGM-CSF") fue purificado en un proceso de purificación de dos etapas por medio de cromatografía de afinidad en un metal inmovilizado (IMAC) (por sus siglas en ingles) y la filtración en un gel. Un sistema Acta® FPLC (Pharmacia) y el software de Unicorn® fueron utilizados para la cromatografía. Todas las substancias químicas fueron del grado de investigación y comprados de Sigma ( Deisenhofen) o de Merck (Darmstadt). El IMAC fue efectuado utilizando una columna Ni-NTA Superflow de Qiagen de acuerdo con el protocolo provisto por el fabricante. La columna fue equilibrada con el amortiguador A2 (fosfato de sodio 20 mM de pH 7.2, 0.4 M NaCl) y la preparación pepplásmica ("PPP") (10 ml) fue aplicada a la columna (2 ml ) a una velocidad de flujo de 2 ml/mm. La columna fue lavada con 5 volúmenes de la columna con el amortiguador B2 al 5 % (fosfato de sodio 20 mM de pH (7.2, NaCl 0.4 M, ímidazol 0.5 M) para eliminar la muestra no unida. La proteina unida fue eluída utilizando el amortiguador B2 al 100 % en 5 volúmenes de la columna. Las fracciones de la proteína eluída fueron agrupadas para purificación adicional. La cromatografía por filtración en un gel fue efectuada en una columna del grado de Prep Superdex 200 (Pharmacia) equilibrada con PBS (Gibco). Las muestras de la proteína eluída (velocidad de flujo de 1 ml/min) fueron sometidas a SDS-PAGE estándares y al ensayo de Western blot para detección. Previo a la purificación, la columna fue calibrada para la determinación del peso molecular (kit marcador del peso molecular, Sigma MW-GF-200) . Las concentraciones de la proteína fueron determinadas midiendo la OD 280 nm y calculadas utilizando el coeficiente de extinción molecular específico para la secuencia. Ejemplo 1.2: Biotinilación del antígeno de rhGM-CSF Para la selección de la biblioteca del fago el antígeno de rhGM-CSF producido en E. coli (véase anteriormente) fue biotinilado. La biotinilación fue efectuada en PBS que contiene 5 % de DMSO (Sigma) con un exceso cinco veces molar de EZ-Link Sulfo NHS-LC-LC-Biotina (Pierce) durante 1 hora a temperatura ambiente en un mezclador de la muestra (Dynal) . Para la separación del antígeno de rhGM-CSF biotinilado y de la biotina libre, se llevó a cabo la cromatografía de intercambio aniónico (Resource Q, Amersham Biosciences) de acuerdo con los protocolos estándares. La cromatografía condujo a que ambos métodos (designados A y B, descritos anteriormente) produzcan dos puntos de elución. En el caso A, el pico eluído primario fue fraccionado nuevamente por medio de una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico (algunas condiciones como anteriormente) en dos picos de elución. Después de esto, las fracciones obtenidas fueron diluidas en serie (diluciones 1:2; concentración de partida de 6 µg/ml determinada a partir de la altura del pico) recubierta a las placas de ELISA de 96 cavidades y se detectaron. La detección fue llevada a cabo utilizando: A) un anticuerpo M500-A de GM-CSF anti-humano (Sigma, 2.5 µg/ml en PBS/BSA al 1 %, detectado con el anticuerpo policlonal específico de Fab2 de anti-rata, de cabra, conjugado con peroxidasa de rábano picante (Dianova, 1 µg/ml de PBS/BSA al 1 %) y B) el anticuerpo maternal (1 µg/ml de PBS/BSA al 1 %) detectado con el anticuerpo policlonal de anti-rata, de cabra, conjugado con peroxidasa de rábano picante (Dianota, 1 µg/ml de PBS/BSA al 1 %) . La biotinilación exitosa fue demostrada por un experimento de ELISA semejante que fue llevado a cabo utilizando la estreptavidina conjugada con peróxido de rábano picante, (Dako, 1 µg/ml de PBS/BSA al 1 %) . La señal fue desarrollada por la adición de una solución del substrato de OPD (Sigma) y se detectó a una longitud de onda de 492 nm (longitud de referencia de 620 nm) . Para estimular el grado de biotinilación, el ensayo de ELISA mencionado anteriormente fue llevado a cabo utilizando las funciones de intercambio aniónico directamente o después de una etapa de incubación con las perlas magnéticas de estreptavidina en una cantidad de 6.7 x 10 exp7 (Dynabeads M-280-Streptavidin, Dynal) con una agitación suave durante 30 minutos. El sobrenadante resultante fue recubierto sobre las cavidades de las placas de ELISA de 96 cavidades y detectado como se describió anteriormente. Los resultados de ELISA mostraron que el segundo pico eluído contuvo el rhGM-CSF biotinilado y que aproximadamente 95 % del rhGM-CSF eluído fue conjugado. Las concentraciones fueron estimadas utilizando el material original como un estándar y se centrifugaron para que sean de aproximadamente 20 µg/ml. La bioactividad retenida del rhGM-CSF etiquetado con biotina fue confirmada en los ensayos de proliferación de TF-1 de acuerdo con los protocolos descritos posteriormente en la caracterización de los anticuerpos de una sola cadena (scFvs) (por sus siglas en inglés) . Ejemplo 1.3: Etiquetación con fluoresceína del antígeno de rhGM-CSF Para los estudios de aglutinación sobre las células de TF-1, el antígeno de GM-CSF humano recombinante en E. coli (véase el ejemplo 1.2 anterior) fue conjugado con el éster N-succinimidílico del ácido de fluoresceín-5 ( 6) -carboxamido caproico (Fluka, fluoresceína-NHS) . La etapa de conjugación fue efectuada en el amortiguador de borato (ácido bórico 0.05 M, NaCl 0.1 M, pH 8.5) que contiene 17.5 % de DMSO con un exceso cinco veces molar de fluoresceína-NHS durante 1 hora a temperatura ambiente en un mezclador de la muestra. Después de esto, la filtración en un gel (Sephadex G25, Amersham Biosciences) fue llevada a cabo para disociar el antígeno de rhGM-CSF etiquetado con fluoresceína de NHS-fluoresceína libre. La filtración con un gel condujo a dos picos medidos a una longitud de onda de 485 nm (longitud de onda de referencia de 535 nm) , mientras que el pico primario representa el rhGM-CSF etiquetado con FITC. El grado de etiquetación fue determinado por la definición de la relación de F/P del conjugado ([mg/ml/] = (A28o - 0.35 x A93 x 1.08; F/P = (A493/73.000) x ( 15.000/ ( [mg/ml] )) . La concentración determinada fue de 0.041 mg/ml con una relación de F/P de 1.2. Ejemplo 2 : Generación y selección de los anticuerpos de anti-GM-CSF humanos, neutralizantes y fragmentos de los mismos Ejemplo 2.1: clonación del VH maternal a partir del HB-9569 del hibridoma Como se utilizó en todos los ejemplos precedentes, una región V "maternal" denota que la región V en cuestión se origina a partir de una molécula de inmunoglobulina entera. Como se utilizó en todos los ejemplos precedentes, un "resultado exitoso" denota una molécula que se sabe que se enlaza a un antígeno de interés, pero que la aglutinación no fue evaluada cuantitativamente. Un "resultado exitoso" es una molécula en una etapa inicial de la caracterización para la cual la producción a escala pequeña podría ya haber sido efectuada. Tal molécula está en la etapa de validación de la caracterización. Como se utilizó en todos los ejemplos previos, una molécula "delantera" denota una molécula, las características de aglutinación y neutralización de la cual, han sido cuantificadas . La formación de una molécula "delantera" ya se ha llevado a cabo a una escala grande. En los siguientes ejemplos una forma posible de generar un neutralizador del anticuerpo monoclonal totalmente humano de GM-CSF humano y la generación de fragmentos de la misma es descrita. El objeto de este experimento es el aislamiento y la subclonación del gen que codifica el VH en el mAb maternal producido por la línea celular HB-9569 del hibridoma. El hibridoma HB-9569 fue obtenido del ATCC (EUA) . Las células del hibridoma fueron cultivadas en el medio de crecimiento completo del ATCC: medio RPMl 1640 con L-glutamina 2 nM ajustada para contener 1.5 g/1 del bicarbonato de sodio, 4.5 g/1 de glucosa, HEPES 10 mM, y piruvato de sodio 1.0 mM y suplementado con 2-mercaptoetanol 0.05 mM, 10 % de suero de bovino fetal a 37 °C con C02 al 5 %. Para la preparación del ARN total, 1 x 10 exp7 células fueron utilizadas y el ARN fue preparado como se describió en el manual del producto del kit Omni-Skript de Qiagen (Qiagen, Alemania). El ADNc fue sintetizado de acuerdo con los métodos estándares (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, segunda edición). Para el aislamiento del ADN de la región V de la cadena pesada, la RP-PCR fue llevada a cabo utilizando el conjunto de cebadores MHALT1R.V: GCC GAA TTC CAC CAT GGR ATG SAG CTG KGT MAT SCT CTT y el conjunto de preparación de rIgG2a/b: CAC ACC GCT GGA CAG GGC TCC AGA GTT CC de Race GSP. El siguiente programa de PCR fue utilizado para la amplificación: desnaturalización a 94 °C durante 15 segundos, recocido del cebador a 52 °C durante 50 segundos y extensión del cebador a 72 °C durante 90 segundos fueron efectuados durante 40 ciclos, seguido por una extensión final a 72 °C durante 10 minutos. Los fragmentos V del ADN de cadena pesada fueron aislados entonces de acuerdo con los protocolos estándares . El fragmento V del ADN de cadena pesada fue clonado en el script-CAM de PCR (Stratagene) como se describió por el fabricante. Las secuencias fueron identificadas por secuenciación.
Ejemplo 2.2: Selección de un VL humano El objeto de este experimento es la selección de un VL humano que puede formar un par con el VH maternal clonado como se describió anteriormente. Ejemplo 2.2.1: Aislamiento de ARN a partir de las células B positivas a IgD seleccionadas 100 ml de la sangre fueron tomados de los donadores humanos sanos. Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs) fueron aisladas por el gradiente de Ficoll de acuerdo con los métodos estándares. Para seleccionar las células positivas a IgD, 1 ml de las perlas de IgG de antiratón (kit de IgG del ratón de Pan de CELLection™; DYNAL) fueron recubiertas con 20 µg del anticuerpo de IgD antihumano de ratón (PharMingen). Aproximadamente 2.5 x 10 exp7 de PBMCs fueron agregados a las perlas y se incubaron a 4 °C durante 15 minutos. Después del lavado cuatro veces con 1 ml del medio de RMPI (BioChrom) , las células positivas a IgD fueron liberadas de las perlas por la adición de 8 µl del amortiguador de liberación (DNasa) y se transfirieron a un tubo fresco o nuevo. Por este método se podrían obtener 0.9 x 10 exp5 hasta 3.7 x 10 exp6 células positivas a IgD. El ARN total fue aislado de las células positivas a IgD utilizando el kit Midi RNeasy® (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc fue sintetizado de acuerdo con los métodos estándares (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, Segunda edición). Ejemplo 2.2.2: Amplificación por PCR de las regiones de la cadena ligera variable (regiones VL) Para el aislamiento del ADN de la región V de la cadena ligera, la RT-PCR fue llevada a cabo utilizando los conjuntos cebadores de V-kappa- (5' -huVKl-SacI-2001 (5'-GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC-3' ) , 5'-huVK2/4-SacI-2001 (5' -GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACY CAGTCTCC-3' ) , 5'-huVK3-SacI-2001 ( 5' -GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGWTGACR CAGTCTCC-3' ) , 5' -huVK5-SacI-2001 (5' -GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC-3 ' ) , 5' -huVK6-SacI-2001 ( 5' -GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC-3' ) , 3' -hu-Vk-Jl-Spel-BsiWI (5' -GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATTTCCACC TTGGTCC-3'), 3'-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI ( 5' -GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATATCCASC TTGGTCC-3'), 3' -hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI ( 5' -GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATATCCACT TTGGTCC-3'), 3'-hu-Vk-J5-Spel-BsiWI (5' -GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT AATCTCCAGT CGTGTCC-3' ) . El ARN de las células IgD positivas a B fue transcrito en el ADNc (como se describió anteriormente) y se utilizaron como un ADN modelo en las reacciones de PCR. Por la reacción de PCR, un cebador 5' fue combinado con un cebador 3' . El número de diferentes reacciones de PCR fue determinado por el número de posibles combinaciones de los cebadores 5' y 3' . El siguiente programa de PCR fue utilizado para la amplificación: desnaturalización a 94 °C durante 15 segundos, primer recocido a 52 °C durante 50 segundos y extensión del cebador a 72 °C durante 90 segundos que fueron efectuados durante 40 ciclos, seguido por la extensión final a 72 °C durante 10 minutos. Los fragmentos de V del ADN de la cadena ligera fueron aislados entonces de acuerdo con los protocolos estándares. Ejemplo 2.2.3: Construcción-clonación de la biblioteca del grupo de VL humano Una biblioteca de exhibición del fago fue construida generalmente con base en los procedimientos estándares, como se describe por ejemplo en "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scoutt & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Los cebadores elegidos por amplificación por PCR dieron origen a los sitios de reconocimiento de 5' -Sacl y de 3' -Spel por los fragmentos V de la cadena ligera. Dos reacciones de ligadura fueron establecidas, que consisten cada una de 400 ng de los fragmentos de cadena ligera kappa (digeridas con Sacl-Spel) y 1400 ng del plásmido pBluescript KS+ (digerido en Sacl-Spel; un fragmento grande). Los dos grupos de cadena ligera V del anticuerpo, resultantes, fueron transformados entonces cada uno en 300 µl de azul de XL1 de Escherichia coli electrocompetente, por electroporación (2.5 kV, cuba con huecos de 0.2 cm, 25 mF, 200 Ohm, pulsador de genes Biorad) , conduciendo a un tamaño de la biblioteca de 5.8 x 10 exp8 clones independientes. Los fragmentos del ADN kappa (cadena ligera) de diferentes amplificaciones de PCR fueron ponderadas para cada ligadura como sigue: cada cebador 5' define un cebador específico. Dentro de estos grupos los cebadores 3' definen los subgrupos. Los subgrupos fueron ponderados como 1:2:1:1 que corresponden a los cebadores 3' -hu-Vk-Jl-Spel-BsiWI : 3'-hu-Vk-J2/4-SpeI-BsiWI : 3' -hu-Vk-J3-SpeI-BsiWI : 3'-hu-Vk-J5-Spel-BsiWI. Los grupos fueron ponderados de acuerdo con su distribución de la línea germinal 1:1:1:0.2:0.2 que corresponden a los cebadores 5' -huVKl-Sac-2001 : 5' -huVK3-Sac-2001: 5'-huVK2/4-Sac-2001: 5' -huVK5-Sac-2001 : 5' -huVK6-Sac-2001. Después de la electroporación, el ensayo fue incubado en un caldo de SOC (Fluka) para la expresión del fenotipo. Los cultivos fueron incubados cada uno entonces en 500 ml del medio de selección de SB que contiene 50 µg/ml de carbenicilina y 2 % p/v de glucosa toda la noche. El siguiente día, las células fueron colectadas por centrifugación y la preparación del plásmido se llevó a cabo utilizando un kit de preparación del plásmido disponible comercialmente (Qiagen) . Ejemplo 2.2.4: Construcción de la biblioteca del anticuerpo -VL humano - VL maternal La PCR fue efectuada para amplificar el VH maternal del vector que contiene el VH maternal descrito anteriormente en el ejemplo 2.1. Para la amplificación, un protocolo de PCR de acuerdo con los procedimientos estándares fue seguido utilizando el cebador 5' de MVH8 (5' -GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT-3') y el cebador 3'- de 3' -MuVHBstEII (5' -TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3') . Después de la purificación del producto de amplificación de aproximadamente 350 bp a partir de un gel de agarosa analítico, el fragmento de ADN fue cortado con las enzimas de restricción BstEII y Xhol. El fagemido pComb3H5BHis (este vector es descrito en la disertación de la tesis del Dr . Ralf Lutterbüse) fue digerido de acuerdo con esto y el fragmento grande fue ligado con el fragmento mencionado anteriormente. Después de la transformación en azul XL1 de E. coli, un clon único fue cultivado en 100 ml del medio de SB (que contiene 50 µg/ml de carbenicilina) y el plásmido fue preparado de acuerdo con los protocolos estándares. La clonación exitosa fue confirmada por la secuenciación del inserto (Sequiserve, Munich) . Este vector pComb3H5BHis/VH maternal fue restringido con las enzimas de restricción Sacl y Spel. El fragmento del vector grande fue aislado. El ADN del plásmido que contiene la biblioteca de VK del ejemplo 2.2.3 fue restringido con las enzimas de restricción Sacl y Spel. La banda del fragmento de VK pequeña (aproximadamente 350 pb) fue aislada. 1200 ng del fragmento del vector fueron ligados con 400 ng de los fragmentos de VK y se transformaron en 300 µl del azul XL1 de E. coli electrocompetente por electroporación (2.5 kV, cuba con huecos de 0.2 cm, 200 Ohm) conduciendo a una biblioteca de scFv total de un tamaño de 2.8 x 10 exp8 de clones independientes. Después de la expresión del fenotipo y la adaptación lenta a la carbenicilina, la biblioteca del anticuerpo fue transferida hacia el medio de selección de SB-carbenicilina (50 µg/ml). La biblioteca del anticuerpo fue infectada entonces con una dosis infecciosa de 1 x 10 expl2 partículas del fago auxiliador VCSM13 conduciendo a la producción y secreción del fago M13 filamentoso, en donde cada partícula del fago contuvo el ADN de pComb3H5BHis de una sola hebra que codifica un fragmento de scFv humano intermedio y exhibió la proteína de scFv correspondiente como una fusión traduccional hasta la proteína III de recubrimiento del fago. Ejemplo 2.2.5: Selección de exhibición del fago de un VL humano Las partículas del fago que llevan el repertorio de scFv fueron colectadas del sobrenadante del cultivo por centrifugación y precipitación de PEG8000/NaCl . Luego, aproximadamente 1 x 10 expll hasta 1 x 10 expl2 partículas del fago de scFv fueron resuspendidas en 0.4 ml de PBS/0.1 % de BSA y se incubaron con el rhGM-CSF soluble, biotinilado, recombinante (producido en E. coli como se describió anteriormente en el ejemplo 1) durante 2 h con agitación suave en un volumen total de 0.5 ml (rondas 1-3 de concentración del antígeno: 100 nM; ronda 4: 10 nM; ronda 5: 1 nM) . Luego se agregaron 6.7 x 10 exp7 perlas magnéticas de estreptavidina (Dynabeads M-280-Streptavidin, Dynal) y se incubaron adicionalmente bajo agitación suave durante 30 minutos . El fago de scFv que no se enlaza específicamente al antígeno objetivo fue eliminado por etapas de lavado con PBS/0.1 % de BSA. Para este propósito, los complejos de las perlas de estreptavidina-antígeno biotinilado (con los aglutinantes de scFv potenciales) fueron colectados por un magneto y resuspendidos en 1 ml de la solución de lavado (una etapa de lavado) . Este procedimiento de lavado fue repetido hasta 4 veces en rondas adicionales. Después del lavado, las entidades aglutinantes fueron eluídas utilizando HCl-glicina, pH 2.2. Después de la neutralización con Tris 2 M, pH 12, el material eluído fue utilizado para la infección de un cultivo de azul de XLl de E. coli no infectado, fresco. Para eluir las entidades de aglutinación elevada restantes, esta etapa fue repetida utilizando HCl-glicina, pH 1.0. Este segundo material eluído fue neutralizado y utilizando nuevamente para la infección de un cultivo del azul de XLl de E. coli no infectado, fresco.
Ambos cultivos de E. coli infectados fueron mezclados entonces y las células que fueron transducidas efectivamente con una copia del fagemido, que codifica un fragmento de scFv humano, fueron seleccionadas nuevamente para verificar la resistencia a la carbenicilina e infectada subsiguientemente con el fago auxiliador de VCSM13 para empezar la segunda ronda de la exhibición del anticuerpo y en la selección in vitro . El ADN del plásmido que corresponde a las rondas 4 y 5 de producción fue aislado de los cultivos de E. coli. Para la producción de la proteína de scFv soluble, los fragmentos de VL-ADN fueron escindidas de los plásmidos (Sacl-Spel), y se clonaron por medio de los sitios de restricción en el pComb3H5BFlag/His del plásmido con el VH maternal que difiere del pComb3H5BHis inicial/VH maternal en que la construcción de la expresión (por ejemplo scFV) incluye una etiqueta de Flag (TGDYKDDDDK) entre el scFv y la etiqueta de His6 y las proteínas del fago adicional son delecionadas . Después de la ligadura de cada grupo (diferentes rondas de producción) del ADN del plásmido, fueron transformados en el azul de XLl de E. coli competentes por choque térmico en una cantidad de 100 µl y se colocaron en placas sobre carbenicilina LB-agar. Las colonias únicas fueron recibidas en 100 µl de LB carb (50 µg/ml). 10 µl de esta suspensión celular fueron incubadas típicamente en 5 ml del medio de SB suplementado con carbenicilina hasta una concentración de 50 µg/ml y MgCl2 hasta una concentración final de 20 mM durante aproximadamente 6 h a 37 °C bajo agitación. Luego el IPTG fue agregado a una concentración final de 1 mM y la incubación se continúa toda la noche sobre un agitador a 30 °C. Las células fueron centrifugadas hasta una pelotilla y esta pelotilla fue resuspendida típicamente en 0.5 ml de PBS. Por cuatro rondas de congelamiento a -70 °C y descongelamiento a 37 °C, la membrana externa de las bacterias fue destruida por choque osmótico y las proteínas periplásmicas solubles incluyendo los scFVs fueron liberadas en el sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y los desechos celulares por centrifugación adicional (5 minutos a 10,000 x g) , el sobrenadante (es decir, PPP) que contiene los scFvs, fue colectado y examinado adicionalmente . El antígeno de rhGM-CSF (Leukine Liquid, Immunex) fue inmovilizado sobre placas de ELISA toda la noche a 4 °C (50 µl de 1 µg del antígeno/ml de PBS por cavidad) . Después del lavado de las cavidades una vez con PBS y el bloqueo con PBS 3 % de BSA durante 1 h a temperatura ambiente, se agregaron 100 µl de PPPs que contienen scFvs a las cavidades y se incubaron típicamente durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS/0.05 % de Tween20, la detección de los fragmentos de scFv unidos al antígeno inmovilizado fue llevado a cabo utilizando una anti-flag M2 (1 µg/ml de PBS/1 % de BSA) y se detectaron con el anticuerpo policlonal específico para Fab2 de anti-ratón, de cabra, conjugado con peroxidasa de rábano picante (Dianova, 1 µg/ml de PBS/BSA al 1 %) . La señal fue revelada por la adición de la solución del substrato del ácido 2, 2 ' -azino-di [3-etil-benzodiazolin-6-sulfónico] ("ABTS") y se detectó a una longitud de onda de 405 nm de acuerdo con los protocolos estándares. A partir de 20 clones probados (10 obtenidos después de 4 rondas y 10 obtenidos después de 5 rondas de producción) , cinco lisados mostraron señales de ELISA fuertes en contraste con PBS como un control negativo sobre el antígeno recombinante. Los resultados de ELISA son mostrados en la figura 1, en la cual las diversas moléculas de scFv probadas están arregladas a lo largo del eje x y del eje y, mostraron la intensidad de absorción medida, con la absorción más elevada que indica una aglutinación más fuerte. El control negativo de PBS está indicado sobre el eje X en el lugar más alejado hacia la izquierda. Las moléculas de scFv que exhiben una aglutinación apropiada están denotadas en la parte de arriba de la columna de intensidad de absorción respectiva ya sea con un diamante o con un asterisco. El diamante y el asterisco en la figura 1 representan dos diferentes secuencias, es decir, el scFv cuya columna de intensidad de la absorción está indicada con un diamante fue de una secuencia, mientras que todos los scFv cuyas columnas de intensidad de la absorción están indicadas con asteriscos, comparten la misma secuencia común. Los cinco clones positivos a ELISA fueron sometidos a secuenciación de ADN. La secuenciación fue llevada a cabo en un aparato Sequiserve (Munich) . Un total de cuatro clones compartieron la secuencia de ADN correspondiente a scFv 5-306 mientras que la otra secuencia (4-301) fue identificada solamente una vez. La secuencia dominante correspondiente a scFv 5-306 así como la secuencia 4-301 fueron de origen humano y exhibieron una homología muy estrecha con respecto a la secuencia Vkl-012 de la línea germinal humana. Ejemplo 2.2.6: Caracterización de las construcciones de scFv de los valores exitosos derivados de la selección de huVL El objetivo de los siguientes experimentos fue la caracterización de los resultados exitosos de scFv generados por los métodos descritos anteriormente. Ejemplo 2.2.6.1: Expresión y purificación a escala pequeña de los resultados exitosos de scFv (derivados como se describió anteriormente) en E. coli Para obtener los PPPs las células se hicieron crecer en el medio de SB suplementado con MgCl2 20 mM y carbenicilina 50 µg/ml y se redisolvieron en 1 ml de PBS después de la colección. La membrana exterior de las bacterias fue destruida por choque térmico (cuatro rondas de congelamiento a -70 °C y descongelamiento a 37 °C) y las proteínas periplasmicas solubles incluyendo los scFvs fueron liberadas en el sobrenadante. Después de la eliminación de las células intactas y de los desechos celulares por centrifugación, los sobrenadantes que contienen los scFvs fueron colectados y examinados adicionalmente . Para purificación adicional, se agregaron 25 µl de NaH2P04 20 mM, NaCl 400 mM, ímidazol 250 mM, de pH 7.0 a un PPP respectivo. El PPP fue purificado por medio de columnas Ni-NTA Spin (Qiagen) como se recomendó en el manual. En resumen, una solución de PPP respectiva fue agregada a la columna pre-equilibrada para la aglutinación a la res a. Las columnas Spin fueron lavadas dos veces con NaH2P04 20 mM, NaCl 400 mM, ímidazol 20 mM, de pH 7.0. La proteina unida fue eluida dos veces en 200 µl de NaH2P04 20 mM, NaCl 400 mM, ímidazol 250 mM, de pH 7.0. Las protemas de scFv purificadas fueron analizadas con respecto a la intensidad de la aglutinación (velocidad de apagado emético) y las capacidades de neutralización (inhibición de la proliferación de TF-1 dependiente de GM-CSF) como se describe en los ejemplos subsiguientes. Aunque no existen características distintivas y de separación entre las diferentes conformaciones posibles del scFv, esta purificación del material sin refinar de PPP produce 80 % de la proteína de scFv 80 % puro como se juzga por el análisis de Western-Blot (datos no mostrados) . Ejemplo 2.2.6.2: Inhibición de rhGM-CSF etiquetado con FITC El objeto de este experimento es mostrar que los clones de scFv identificados, son capaces de inhibir la aglutinación de rhGM-CSF hacia el complejo del receptor de GM-CSF exhibido sobre la superficie de las células de TF-1. Las construcciones de scFv neutralizantes se podría esperar que compitan con el epítopo de aglutinación al receptor por la molécula de GM-CSF, haciendo imposible para el rhGM-CSF que se aglutine al complejo del receptor de GM-CSF. Hasta que grado es inhibida la aglutinación por rhGM-CSF a su receptor de la manera anterior, se podría esperar que se observe una reducción en la intensidad del teñido por fluorescencia de las células de TF-1 por el rhGM-CSF etiquetado por fluoresceína (rhGM-CSF-FITC) en un ensayo basado en citometría . Lo siguiente describe el funcionamiento de tal ensayo basado en la citometría de flujo. Una concentración final de 0.4 µg/ml del conjugado de rhGM-CSF-FITC en PBS fue incubado con 10 µg/ml del anticuerpo maternal o el extracto periplásmico no diluido del scFv que ha sido purificado con la columna NiNTA Spin. Las muestras de proteína se dejó que se equilibren a 25 °C durante 1 hora previo a la adición de la suspensión de las células TF-1. Las células TF-1 fueron cultivadas en un medio RPMl 1640 (Gibco, L-glutamina, Rojo de fenol libre) , 10 % de FCS inactivado con calor en la ausencia de rhGM-CSF toda la noche. Una concentración final de 2 x lOexpd células/ml y 150 µl de la suspensión celular fueron utilizadas por muestra. Las células fueron colectadas por centrifugación a 500 x g a 4 °C durante 3 minutos y se lavan dos veces con el amortiguador de FACS. Las células lavadas fueron resuspendidas en 100 µl de la muestra de proteína pre-equilibrada que contiene el rhGM-CSF-FITC y el anticuerpo maternal respectivo o scFv. Las muestras fueron incubadas a 4 °C durante 60 minutos. Después de dos lavados adicionales, las células fueron resuspendidas en 150 µl del amortiguador de FACS enfriado con hielo y subsiguientemente se analizaron por citometría de flujo. Los resultados son mostrados en la figura 2. Específicamente, la figura 2 muestra una gráfica en la cual varias moléculas de prueba están arregladas a lo largo del eje X, y en las cuales la intensidad de la fluorescencia promedio ("MFI") (por sus siglas en inglés) está indicado sobre el eje Y. como se puede observar en la figura 2, una pérdida clara de la intensidad de la fluorescencia de las células TF-1 fue observada con el anticuerpo maternal (segundo desde la izquierda a lo largo del eje X) . La aglutinación por competición con respecto al rhGM-CSF de la molécula de scFv designada 5-306 podría ser verificada por la pérdida en el teñido por fluorescencia de las células TF-1 mientras que la molécula 4-301 de scFv difícilmente mostró algún efecto. Puesto que estos resultados sugieren que la molécula de scFv designada 5-306 puede ser un neutralizador promisorio de GM-CSF el análisis adicional de la actividad neutralizante fue restringida al scFv 5-306. Ejemplo 2.2.6.3: Expresión y purificación a gran escala de scFv delantero La producción y purificación de la proteína a una gran escala fue efectuada como sigue. En resumen, el BL21DE3 de E. coli fue transformado con el plásmido de expresión y se hizo crecer a 37 °C en 1 1 del medio selectivo hasta una densidad óptica a 600 nm de 0.5-0.8. La producción de la proteína fue inducida por la adición de IPTG a 1 mM y los cultivos fueron incubados durante otras 16 h con agitación a una temperatura de 25 °C. Las células fueron colectadas por centrifugación a 5,000 x g durante 10 minutos y se resuspendió en 100 ml 1 x PBS. Las proteínas periplásmicas fueron extraídas por congelamiento consecutivo, óptimo, en etanol/hielo seco y descongelamiento en un baño de agua a 37 °C durante cuatro ciclos. Finalmente, el extracto fue centrifugado a 10, 000 x g durante 20 minutos. El scFv 5-306 fue aislado en un proceso de purificación de dos etapas de la filtración en un gel y la cromatografía de afinidad de un metal inmovilizado (IMAC) (por sus siglas en inglés) . Todos los elementos delanteros fueron purificados de acuerdo con este método. Se utilizaron el sistema FPLC de Akta® (Pharmacia) y el software de Unicorn® para la cromatografía. Todas las substancias químicas fueron de grado de investigación y se compraron de Sigma ( Deisenhofen) o de Merck (Darmstadt). El IMAC fue efectuado utilizando una columna de superflujo de Ni-NTA de Qiagen de acuerdo con el método provisto por el fabricante. La columna fue equilibrada con un amortiguador A2 (fosfato de sodio 20 mM de pH 7.2, NaCl de 0.4 M) y el PPP (100 ml ) fue aplicado a la columna (2 ml) a una velocidad de flujo de 2 ml/minuto. La columna fue lavada con 5 volúmenes de la columna del amortiguador de B2 al 5 % (fosfato de sodio 20 mM de pH 7.2, NaCl 0.4 M, imidazol 0.5 M) para remover la muestra no unida. La proteína unida fue eluída utilizando 100 % del amortiguador B2 en 5 volúmenes de la columna. Las fracciones de la proteína eluída fueron agrupadas para purificación adicional. La cromatografía de filtración en un gel fue efectuada sobre una columna del grado preparación Superdex 75 HiLoadTM 16/60 (Pharmacia) equilibrada con PBS (Gibco) . Las muestras de proteína eluídas (velocidad de flujo de 1 ml/min) fueron sometidas a SDS-PAGE estándar y ensayo de Western blot para detección. Previo a la purificación, la columna fue calibrada para la determinación del peso molecular (kit marcador del peso molecular, Sigma MW GF-200). La separación dependiente del tamaño sobre la columna grado Prep Superdex 75 condujo a un monómero claramente distinguible y a fracciones del pico del dímero asociativas de los scFv delanteros. Las concentraciones de proteína fueron determinadas midiendo la densidad óptica a 280 nm y fueron calculadas utilizando el coeficiente de extinción molecular específico para la secuencia de scFv delantero. Ejemplo 2.2.6.4: Inhibición de la proliferación dependiente de rhGM-CSF de las células TF-1 por un scFv delantero El objeto de este experimento es lograr la información cualitativa sobre la actividad neutralizante del scFv 5-306 semi-humano utilizando la línea celular TF-1 dependiente de hGM-CSF (DSMZ ACC 334) . Las células TF-1 fueron cultivadas en el medio RPMl 1640 (Gibco; L-glutamina, rojo de fenol libre), FCS inactivado con calor al 10 % en la presencia de 2.5 ng/ml de rhGM-CSF como se describió por el distribuidor (Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunscheweig, Alemania). Las células se hicieron crecer hasta una densidad celular de 0.5 x 10exp6 células/ml. Para el ensayo de proliferación, las células TF-1 fueron colectadas por centrifugación a 300 x g durante 4 minutos y se lavaron con 1 x PBS (Dulbecco's, Gibco) . Las células fueron resuspendidas a una concentración final de 1 x 10exp5 células/ml en RPMl 1640, FCS al 10 % y 90 µl de la suspensión celular por cavidad de la placa del cultivo de las células, de fondo plano, Microtest fueron utilizadas (0.9 x 10exp4 células/cavidad) . Una concentración final de 0.3 mg/ml de rhGM-CSF fue utilizada para estimular la proliferación de las células de TF-1, para la neutralización de la proliferación dependiente de hGM-CSF, se agregaron 10 µl de scFv purificado a 100 µl de TF-1 y la solución de rhGM-CSF en una serie de dilución que varía desde aproximadamente 100 µg/ml hasta 100 pg/ml. Las muestras fueron incubadas a 37 °C al 5 % de C02 durante 72 horas. Después de 72 horas el estado proliferativo de las células TF-1 fue determinado agregando WST-1 y verificando el cambio colorimétrico con un lector de ELISA a 450 nm. Los datos fueron ajustados para la inhibición máxima media de la proliferación (IC50) utilizando el ajuste de la curva de regresión no lineal del software Prism. Un efecto de inhibición de la proliferación claramente dependiente de la dosis de scFv 5-306 podría ser observado y fue comparable para las formas conformacionales monoméricas y diméricas. Por el ajuste para la inhibición máxima intermedia de la proliferación, un valor de IC50 de 7.3 nM fue determinado para la forma monomérica y de 3.5 nM para la forma dimérica. Los resultados son mostrados en la figura 3.
Ejemplo 2.3: Construcción de las bibliotecas de anticuerpos y la selección de exhibición del fago de VHs humano El objeto de los siguientes experimentos es la selección de un conjunto de regiones de VH humanas que podrían formar un par con la región de VL humana de scFv 5-306 seleccionada como se describió anteriormente . Ejemplo 2.3.1: Aislamiento del ARN de las células mononucleares de la sangre periférica (PMBCs) 100 ml de la sangre fueron tomados de cinco donadores humanos sanos. Las células mononucleares de la sangre periférica (PMBCs) (por sus siglas en inglés) fueron aisladas por un gradiente de Ficoll de acuerdo con los métodos estándares. El ARN total fue aislado de los PMBCs utilizando el kit Midi de RNeasy® (QUIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc fue sintetizado de acuerdo con los métodos estándares (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, segunda edición) . Ejemplo 2.3.2: Amplificación por PCR de las regiones de cadena pesada variables (región de VH) La biblioteca de VH fue construida y nombrada Lib 134-VH. Esta biblioteca de VH consiste del repertorio humano de FR1-CDR2-FR2-CDR2-FR3 de las regiones de VH amplificadas por PCR del grupo de PBMC descrito anteriormente, enlazado operativamente al CDR3 de VH del anticuerpo maternal seguido por una secuencia de la línea germinal de FR4 humana. Para el aislamiento de las regiones de VH del molde humano, la RT-PCR fue llevada a cabo utilizando un conjunto de un cebador específico para 5'-VH, ( 5' -huVHl, 3, 5-XhoI-2001 (5' -AGG TGC AGC TGC TCG AGT CTG G-3'), 5 ' huVH4-XhoI-2001 (5' CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3'), 5' -huVH4B-XhoI-2001 (5' -CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3')) y un conjunto de dos cebadores específicos para 3'-VH ( 3' -hu-VH-BstEII-2001 (5' -CTG AGG AGA CGG TGA CC-3'), 3' -hu-VH-J3-BstEII-2001 (5'-CTG AAG AGA CGG TGA CC-3')). Para la reacción de PCR, un cebador 5' fue combinado con un cebador 3' ; el número de diferentes reacciones de PCR fue determinado por el número de combinaciones posibles de los cebadores 5' y 3' . El ADNc de PBMC (como se describieron anteriormente de cuatro donadores solamente, fue utilizado como una fuente de genes de VH) . El siguiente programa de PCR fue utilizado para la amplificación: desnaturalización a 94 °C durante 15 segundos, recocido del cebador a 52 °C durante 50 segundos y extensión del cebador a 72 °C durante 60 segundos que fueron efectuados durante 40 ciclos, seguido por una extensión final a 72 °C durante 10 minutos. Los productos de la amplificación con un tamaño de aproximadamente 350 pb fueron aislados de acuerdo con los métodos estándares. Para el aislamiento de las regiones de VH-Lib 134, la RT-PCR fue llevada a cabo en dos etapas. En primer lugar, los fragmentos de VH de la cadena pesada humana (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3) fueron amplificados por PCR a partir de los fragmentos de VH del molde aislado utilizando el mismo conjunto de cebadores específicos de 5'-VH como se describieron anteriormente ( 5' -huVHl, 3, 5-XhoI-2001, 5'-huVH4-XhoI-2001, 5'-huVH4B-XhoI-2001) y un conjunto del cebador 3'-específico (3'-Lib 134-VH-1A-MH3 (5' -GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT YGC ACÁ GTA ATA CAC GGC-3'), 3'-Lib 134-VH-1B-MH3 (5' -GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT YGC ACÁ GTA ATA CAY RGC-3), 3'-Lib 134-VH-3A-MH3 (5' -GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT NYG ACÁ GTA ATA CAC RGC-3' ) , 3'-Lib 134-VH-3B-MH3 (5' -GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT NGC ACÁ GTA ATA CAÁ RGC-3'), 3'-Lib 134-VH-4-MH3 (5'-GTA ATC AAA GTA GAC TGC TAT CAG ACC CGA TCT SGC ACÁ GTA ATA CAC R GC-3' ) ) para las subfamilias 1, 3 y 4 de VH humanas que se igualan en la región muy terminal de FR3. Las siguientes combinaciones de cebadores fueron utilizadas : a) 5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1A-MH3 b) 5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1B-MH3 c) 5'-huVHl, 3, 5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3A-MH3 d) 5'-huVHl, 3, 5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3B-MH3 e) 5'-huVH4-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3 f) 5'-huVH4B-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3 Para la reacción de PCR, un cebador 5' fue combinado con el cebador 3' ; el número de diferentes reacciones de PCR fue determinado por el número de posibles combinaciones de los cebadores 5' y 3' . El siguiente programa de PCR fue utilizado para la amplificación: desnaturalización a 94 °C durante 15 segundos, primer recocido a 52 °C durante 50 segundos y extensión del cebador a 72 °C durante 90 segundos que se efectuaron durante 40 ciclos, seguido por la extensión final a 72 °C durante 10 minutos. Por medio de esta etapa de PCR y la secuencia del cebador 3' respectivo, los segmentos de VH humanos son prolongados para una parte del CDR3 del VH maternal, que a su vez es el sitio de cebadura o preparación para la segunda etapa del cebador 3' de PCR. Estos fragmentos del ADN de VH- ( FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3) fueron utilizados entonces como moldes en una segunda reacción de PCR utilizando nuevamente el cebador específico para 5'VH respectivo y un cebador 3' universal que se iguala con la terminación 3' universal del fragmento de ADN amplificado (3'-Lib 134-JH3-BstE2, 5' -AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC TTG GCC CCA GTA ATC AAA GTA GAC TGC-3') . El siguiente programa de PCR fue utilizado para la purificación : Desnaturalización a 94 °C durante 15 segundos, recocido del cebador a 52 °C durante 50 segundos y extensión del cebador a 72 °C durante 60 segundos que fueron efectuados durante 40 ciclos, seguido por la extensión final a 72 °C durante 10 minutos. Los fragmentos V del ADN fueron aislados de acuerdo con los protocolos estándares. Ejemplo 2.3.3: Construcción de la biblioteca - clonación del grupo de VH humano En una segunda ronda del método precedente, el VL humano de scFv 5-306 identificado en la primera selección previa, fue elegido, y subsiguientemente combinado con la biblioteca de los fragmentos de VH humano descritos en el ejemplo 2.3.2 con el objeto de generar un scFv humano. Una biblioteca de exhibición del fago fue construida generalmente con base en los procedimientos estándares, como se describe por ejemplo en "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed.
Barbas, Burton. Scout & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Los fragmentos del ADN de cadena pesada de las diferentes amplificaciones de PCR fueron ponderadas para cada ligadura como sigue: a:b:c:d:e:f = 3:1:3:1:1:1, en donde a-f tienen los siguientes significados : a) 5'-huVHl,3,5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1A-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2 b) 5'-huVHl,3, 5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-1B-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2 c) 5'-huVHl, 3, 5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3A-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2 d) 5' -huVHl,3, 5-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-3B-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2 e) 5'-huVH4-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2 f) 5' -huVH4B-XhoI-2001 x 3'-Lib 134-VH-4-MH3 x 3'-Lib 134-JH3-BstE2 Una reacción de ligadura fue establecida, la cual consiste de 400 ng del grupo de fragmentos de Lib 134-VH humanos (digeridos en XhoI-BstEII) y 1200 ng del plásmido pComb3H5BHis/5-306 VL (el ADN que codifica la reacción de VL del scFv 5-306 fue clonado por medio de los sitios de restricción Sacl y Spel en pComb3H5BHis de acuerdo con los procedimientos estándares). El grupo de VH humano del anticuerpo, resultante, fue transformado entonces en 300 µl del azul XLl de Escherichia coli electrocompetente por electroporación (2.5 kV, cuba con huecos de 0.2 m, 25 mF, 200 Ohm, pulsador de genes Biorad) conduciendo un tamaño de la biblioteca de 1.6 x 10exp8 clones independientes en total. Después de la electroporación, el ensayo fue incubado en el caldo de SOC (Fluka) para la expresión de fenotipo. Los cultivos fueron incubados entonces cada uno en 500 ml del medio de selección de SB que tiene 50 µg/ml de carbenicilina y 2 % v/v de glucosa toda la noche. El siguiente día, las células de los cultivos fueron colectadas por centrifugación y la preparación del plásmido se llevo a cabo utilizando un kit de preparación del plásmido disponible comercialmente (Qiagen) para preservar la biblioteca de ADN. 1.5 µg de este grupo de plásmidos que codifica el grupo de scFv respectivo fueron electroporados entonces en azul de XLl de E. coli (2.5 kV, cuba con huecos de 0.2 cm, 25 mF, 200 Ohm, pulsador de genes de Biorad) conduciendo a un tamaño de la biblioteca de 2.4 x 10exp9 de los clones independientes en total. Después de la expresión del fenotipo y la adaptación lenta a la carbenicilina, la biblioteca de anticuerpos fue transferida hacia el medio de selección de SB-carbenicilina (50 µg/ml). La biblioteca de anticuerpos fue infectada entonces con una dosis infecciosa de 1 x 10expl2 partículas del fago auxiliador VCSM13 conduciendo a la producción y secreción del fago M13 filamentoso, en donde cada partícula del fago contuvo el pComb3H5BHis-ADN de una sola hebra que codifica un fragmento de scFv humano y exhibió la proteína de scFv correspondiente como una fusión traduccional a la proteína III de recubrimiento del fago. Ejemplo 2.3.4: Selección de exhibición del fago de un VH humano La biblioteca de fagos resultante que lleva el repertorio de scFv clonado fue colectada del sobrenadante del cultivo por precipitación y centrifugación con PEG8000/NaCl . Aproximadamente 1 x lOexpll hasta 1 x 10expl2 de scFv de las partículas del fago fueron resuspendidas en 0.4 ml de PBS/BSA al 0.1 % y se incubaron con el rhGM-CSF soluble, biotinilado, recombinante (material de E. coli, como se describió en el ejemplo 1) durante 1 h bajo agitación suave en un volumen total de 0.5 ml . Luego se agregaron perlas magnéticas de estreptadivina en una cantidad de 6.7 x 10exp7 (Dynabeads M-280-Streptavidin, Dynal) y se incubaron adicionalmente bajo agitación suave durante 30 minutos. El fago de scFv que no se enlaza específicamente al antígeno objetivo fue eliminado por etapas de lavado con PBS-BSA al 0.1 %. Para este propósito, los complejos de las perlas de estreptavidina-antígeno biotinilado (con los aglutinantes de scFv potenciales) fueron colectados por medio de un magneto y resuspendidos en 1 ml de la solución de lavado (una etapa de lavado) . Este procedimiento de lavado fue repetido hasta cuatro veces. Después del lavado, las entidades de aglutinación fueron eluídas utilizando HC1-glicina de pH 2.2 y después se neutralizaron con Tris 2 M de pH 12, el eluído fue utilizado para infección de un cultivo de azul de XLl de E-coli no infectado, fresco. Para eluir las entidades de aglutinación superiores restantes, las perlas fueron resuspendidas directamente en 200 µl de un cultivo de azul de XLl de E. coli fresco (OD600 > 0.5) y se incubaron durante 10 minutos bajo agitación suave. Ambos cultivos fueron mezclados entonces y las células de transdujeron exitosamente con una copia del fagemido, que codifica un fragmento de scFv humano, y fueron seleccionados nuevamente para verificar la resistencia a la carbenicilina y subsiguientemente se infectaron con el fago auxiliador de VCM13 para empezar la siguiente ronda de exhibición del anticuerpo y la selección in vitro. Un total de 4 rondas de selecciones fueron llevadas a cabo para dos anticuerpos. Las concentraciones del antígeno fueron reducidas durante la selección hasta las concentraciones finales como sigue: 1. ronda 100 nM 2. ronda 10 nM 3. ronda 10 nM 4. ronda 10 nM El ADN del plásmido de los cultivos de E. coli fue aislado del material correspondiente a las rondas 3 y 4 de la producción . Para la producción de la proteína de scFv soluble, los fragmentos de VH-VL-ADN fueron escindidos de los plásmidos (Xhol-Spel), y se clonaron por medio de los mismos sitios de restricción en el plásmido pComb3H5BFlag/His (con/sin proteínas del fago adicionales requeridas para la infección del fago) . Después de la ligadura de cada grupo (diferentes rondas de producción) del ADN del plásmido, se transformaron en TG1 de E. coli competente por choque térmico en una cantidad de 100 µl y se colocaron en placas sobre agar de carbenicilina LB . Las colonias únicas fueron tomadas y son inoculadas en 120 µl de LB carb (50 µg/ml) de glucosa al 1 % en placas de 96 cavidades (Greiner) . Las cavidades fueron selladas con una membrana semipermeable (Greiner) y las placas fueron incubadas toda la noche a 37 °C en un incubador con agitación (placa maestra) . Luego 10 µl de los cultivos de la placa maestra fueron transferidos hacia una segunda placa de 96 cavidades (placa de trabajo) que contiene 90 µl de LB carb (50 µg/ml) al 0.1 % de glucosa por cavidad. Después de la incubación durante 4 h en un incubador de agitación a 37 °C, la producción de scFv fue inducida agregando 20 µl de LB carb 6 mM IPTG a cada cavidad. Después de otra etapa de incubación toda la noche a 30 °C con agitación, las células fueron lisadas en una incubación de 1 h a temperatura ambiente con 40 µl del amortiguador para la lisis (ácido bórico 400 mM, NaCl 320 mM, EDTA 4 mM de pH 8, 2.5 mg/ml de lisozima). Las células residuales y los desechos celulares fueron separados por centrifugación durante 12 minutos a 1, 900 x g (Hettich) . Los sobrenadantes que contienen las moléculas de scFv fueron probados entonces para verificar la aglutinación en los ensayos de ELISA. La detección de los fragmentos de scFv unidos al antígeno de rhGM-CSF inmovilizados (Leucina) se llevó a cabo utilizando un anti-flag M2 (1 µg/ml PBS/BSA al 1 %) detectado con el anticuerpo policlonal específico para Fab2 de anti-ratón, de cabra, conjugado con peroxidasa de rábano picante (Dianova, 1 µg/ml de PBS/BSA al 1 %) . La señal fue revelada agregando la solución del substrato de ABTS y detectada a una longitud de onda de 405 nm. De aproximadamente 100 clones probados después de la tercera ronda de selección, 12 clones mostraron una aglutinación fuerte a rhGM-CSF. De aproximadamente 160 clones probados después de la cuarta ronda, arriba del 80 % de los lisados mostraron señales de ELISA fuertes cuando se compara con PBS como un control negativo sobre el antígeno recombinante. Los resultados de los clones representativos son mostrados en la figura 4, en la cual estos clones representativos están arreglados a lo largo del eje x, y la intensidad de la absorbencia está indicada sobre el eje y. Como se puede observar de la figura 4, el control negativo de PBS (segundo de la derecha sobre el eje X) no mostró una aglutinación apreciable, mientras que los clones de scFv representativos, scFv A, scFv 3035, scFv 3039, scFv 3080 y scFv 5-306 mostraron diferentes grados de fuerza de aglutinación por ELISA. Todos los lisados fueron probados sin rhGM-CSF en experimentos paralelos para la aglutinación específica al agente de bloqueo. Ninguna señal detectable significativa pudo ser observada, indicando la especificidad de la aglutinación con respecto a rhGM-CSF. Las secuencias de ADN de más de 13 clones de scFv positivos por ELISA fueron determinadas. En total, seis secuencias diferentes fueron identificadas. Todas las secuencias fueron de origen humano y estuvieron relacionadas estrechamente con la secuencia VH-1 1-02 de la línea germinal humana . Ejemplo 2.3.5: Caracterización de las construcciones de scFv humanas que contienen las regiones de VL y VH humanas Ejemplo 2.3.5.1: Producción y purificación a gran escala de las construcciones delanteras de scFv producidas por el método descrito en el Ejemplo 3 Las porciones delanteras de scFv fueron aisladas y purificadas como se describió en el ejemplo 2.2.6.3. Ejemplo 2.3.5.2: Análisis de aglutinación cinética de las porciones delanteras de scFv por la resonancia del plasmón superficial (SPR) El objetivo del experimento es la caracterización en la profundidad de las porciones delanteras de scFv. Las características cinéticas de la aglutinación ( kd y ka) de las porciones delanteras de scFv fueron medidas por la inyección de 10 µl de la proteína purificada en series de diluciones que varían desde 10 µg/ml hasta 1 pg/ml del scFv purificado y la verificación de la disociación a 25 °C durante 100 segundos. La proteína fue amortiguada en HBS-EP (HEPES 0.01 M, pH 7.4, 0.15 M NaCl, EDTA 3 mM, agente tensioactivo P20 al 0.005 %). Los datos fueron ajustados utilizando el software BIAevaluation™ que determina la constante de la velocidad para las características cinéticas de asociación y disociación con una ecuación de aglutinación de Langmuir 1:1 (fórmulas 1 y 2), en donde A es la concentración del analito inyectado y B es la concentración del ligando. dB/dt= - (ka * [A] * [B] -kd* [AB] ) (1) dAB/dt= - (ka * [A] * [B] -kd* [AB] ) ( 2 ) Las curvas de aglutinación cinética fueron determinadas utilizando hasta 8 concentraciones de cada porción delantera de scFv analizada. El ajuste independiente de los datos de entrada condujo a constantes de la velocidad de asociación y disociación que fueron utilizados para calcular la constante de disociación en el equilibrio (KD, los resultados son mostrados en la tabla 1) . Tabla 1 2.3.5.3: Inhibición de la proliferación dependiente de rhGM-CSF de las células de TF-1 por las porciones delanteras de scFv Después de la confirmación de que la intensidad de la aglutinación específica fue preservada en las porciones delanteras de scFv, el objeto de este experimento fue evaluar la especificidad de la interacción de la porción delantera de scFv con el rhGM-CSF del antígeno. La inhibición de la función biológica del rhGM-CSF del antígeno por la aglutinación del scFv fue caracterizado en un experimento de la inhibición de la proliferación de TF-1. Los experimentos de inhibición de la proliferación de TF-1 fueron efectuados como se describió anteriormente. Las células fueron resuspendidas a una concentración final de 1 x 10exp5 células/ml en RPMl en 1640, 10 % de FCS y 90 µl de la suspensión celular por cavidad fueron utilizados (0.9 x 10exp4 células/cavidad). Una concentración final de 0.3 ng/ml de rhGM-CSF fue utilizada para estimular la proliferación de las células de TF-1. Para la neutralización de la proliferación dependiente de rhGM-CSF, el scFV purificado en 1 x PBS fue agregado en una serie de diluciones con las concentraciones finales de la proteína que varían desde 100 µg/ml hasta 10 pg/ml. 10 µl de la solución de la proteína dializada y filtrada en condiciones estériles (filtro de 0.22 µm) fueron agregados a 100 µl de TF-1 y la solución de rhGM-CSF. Las muestras fueron incubadas a 37 °C en C02 al 5 % durante 72 h. Después de 72 horas, el estado proliferativo de las células TF-1 fue determinado agregando WST-1 y verificando el cambio colorimétrico con un lector de ELISA a 450 nm (Figura 5) . Como se puede observar en la Figura 5, la actividad neutralizante de GM-CSF humano es demostrada claramente. El scFv A exhibió la actividad neutralizante más fuerte . Ejemplo 2.4: Optimización de las caracteristicas de aglutinación de los scFv seleccionados Se contempló que la actividad biológica de un agente neutralizante para un ligando monomérico puede ser mejorada o aún optimizada por el incremento de la fuerza de aglutinación entre el neutralizador y el ligando, en particular por el incremento de la velocidad de apagado del neutralizador. Esto puede ser logrado preferentemente por la mutación de la secuencia de la región de VH y VL respectiva de un modo aleatorio por: (i) la inserción de una o más mutaciones aleatoriamente de principio a fin de la secuencia total o por (ii) la inserción de mutaciones únicas o mutaciones contiguas múltiples (por ejemplo fragmentos de cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos) en las regiones de scFV que tienen una probabilidad elevada de interactuar con el antígeno. Los mutantes respectivos deben ser caracterizados entonces por cualquier incremento en la actividad o, previo a la caracterización, deben ser enriquecidos para las calidades preferentes (por ejemplo, una aglutinación más fuerte) por medio de los métodos de selección (es decir, la exhibición del fago) . Ejemplo 2.4.1: Incremento de la afinidad por la mutación del VH CDR3 en una o más posiciones Para mejorar las características de aglutinación de un fragmento del anticuerpo, por ejemplo una molécula de scFv, por mutaciones de un solo punto o por fragmentos cortos de aminoácidos, los residuos de aminoácidos deben ser ubicados como objetivo, los cuales tienen una probabilidad muy elevada de interacción con el antígeno respectivo. Con este método, no es necesario seleccionar más que solamente un número limitado de mutantes sin reducir la probabilidad de éxito. La cadena pesada de CDR3 de un anticuerpo o fragmento del mismo usualmente contribuye fuertemente a la aglutinación total de un antígeno por este anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Por lo tanto se contempló que una manera promisoria de incrementar la afinidad de la aglutinación de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser por la mutación de la secuencia de nucleótidos que codifica para VH CDR3. Una variedad de diferentes metodologías ya existen para efectuar tal mutagénesis aleatoria por objetivos, algunas de las cuales son descritas en los siguientes términos de cómo la afinidad de la aglutinación de las moléculas de scFv descritas anteriormente, puede ser incrementada : A) para ubicar el objetivo en CDR3 de VH, un sitio de restricción adecuado puede ser introducido en la secuencia de nucleótidos dentro del CDR3 de VH, preferentemente por la síntesis del gen de la región de VH completa como una secuencia de nucleótidos de CDR3 modificada manteniendo la secuencia de aminoácidos original (Entelechon, Alemania) . Por medio de la segmentación por la enzima de restricción respectiva y agregando la SI nucleasa/ADN polimerasa I de Klenow y de GTP seguido por un duplexo del oligómero mutante, la mutagénesis aleatoria ubicada como objetivo en una o más posiciones de los aminoácidos puede ser efectuada de acuerdo con Matteucci y Heyneker, Nucleic Acids Research 11: 3113 ff (1983). Los VHs mutagenizados son combinados subsiguientemente con el VL respectivo (por medio de un enlazador adecuado) en un vector de expresión de scFv adecuado y transformado en las células de E. coli. Las colonias únicas que expresan los scFvs variantes pueden ser tomadas entonces y seleccionados para scFvs mejorados como se describe para la selección y caracterización de los resultados exitosos de scFv y las porciones delanteras de los ejemplos previos. B) un método alternativo es la mutagénesis mediada por oligonucleótidos por el método del doble cebador como se describe por detalle en Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989) "A laboratory manual". En esencia, la región de VH es clonada en un vector a base de M13 y el plásmido de una sola hebra es aislado. Un cebador capaz de hibridizarse al molde del plásmido de una sola hebra que contiene una secuencia aleatoria es recocido y extendido. Después de la propagación del grupo de plásmidos respectivos en E. coli, los VHs mutados pueden ser colectados del grupo de plásmido y combinados con el VL original (por medio de un enlazador adecuado) en un vector de expresión de scFv adecuado y transformado en las células de E. coli. Las colonias únicas que expresan scFv variables son tomados y seleccionados para scFvs mejorados como se describe para la selección y caracterización de los resultados exitosos de scFv y las porciones delanteras en los ejemplos previos. C) Todavía otra alternativa es montar hasta seis o aún más aminoácidos contiguos. Para este fin, una variante de deleción de la secuencia de nucleótidos de VH puede ser construida teniendo un CDR3 y FR4 eliminado. Esta construcción es utilizada como un molde para la amplificación de PCR de una o dos etapas, en las cuales un cebador 5' adecuado (que se hibridiza hasta el extremo 5' de la secuencia VH y agregando un sitio de clonación adecuado) es combinado con un conjunto de cebadores (que se recocen en el extremo 3' de la región de FR3 como un molde y se agregan a una región de CD3 y FR4 (como un sitio de restricción adecuado) con respecto al fragmento de amplificación. Este conjunto de cebadores 3' comprende una secuencia de una o más tripletas para insertar los codones aleatorios dentro de la secuencia de CDR3. Este grupo de regiones de VH que contienen las regiones de CDR3 aleatorias pueden ser combinadas entonces subsiguientemente con el VL respectivo (por medio de un enlazador adecuado) en un vector de expresión de scFv y transformado en las células de E. coli. Las colonias únicas que expresan los scFvs variables son tomadas entonces y seleccionadas para los scFvs mejorados como se describe para la selección y caracterización de los valores exitosos de scFv y las porciones delanteras en los ejemplos previos. Los grupos respectivos de los scFvs mutados que tienen una diversidad más elevada (debido a que pueden ser seleccionados fácilmente) pueden ser clonados en un vector de exhibición del fago adecuado y los scFvs mejorados pueden ser seleccionados entonces por la exhibición del fago sobre el antígeno de interés preferentemente bajo condiciones de reducción de las concentraciones del antígeno para seleccionar las afinidades más elevadas. Las selecciones de exhibición del fago son llevadas a cabo de acuerdo con los protocolos estándares como se describe en otra parte aquí. Cualquiera de los métodos A a C anteriores pueden ser combinados o efectuados en ciclos repetidos para mejorar y optimizar adicionalmente los scFvs ya modificados. Ejemplo 2.4.2: Incremento de la afinidad por mutación de las regiones V aleatoriamente de principio a fin de la secuencia total En lugar de la mutación de sitios específicos del scFv que tienen una alta probabilidad de interactuar con el antígeno respectivo, un método más pragmático puede ser llevado a cabo introduciendo mutaciones por puntos de principio a fin de la secuencia de VH y/o VL completa y luego seleccionando los scFvs optimizados o seleccionando y filtrando los scFvs optimizados. A manera de ejemplo, la secuencia de VH y/o VL puede ser mutagenizada utilizando las cepas del mutador de E. coli (como se describe en Low et al. 260: 359 ff J. Mol Biol (1996)) o la incorporación errónea de los nucleótidos por las ADN polimerasas como se describen con detalle en Sambrook, Frisch, Manniatis (1989) "A laboratory manual". La clonación, expresión y selección de las variantes optimizadas de las células de scFV pueden ser llevadas a cabo por la exhibición del fago o por la tecnología de la exhibición del ribosoma utilizada frecuentemente (como se describe en EP 0 975 748 Al). Las versiones optimizadas son expresadas en los sistemas de E. coli/vector, adecuados, para seleccionar los candidatos de scFv mejorados. La metodología adecuada como se describió anteriormente bajo el ejemplo 2.4 fue aplicado para optimizar un scFv delantero representativo (scFv A), conduciendo a una clase de fragmentos de anticuerpos neutralizantes de anti-GM-CSF humanos, monoclonales, representados por las moléculas B-N de scFv. Las características de estas moléculas de scFv serán discernidas y descritas adicionalmente en los siguientes ejemplos. La generación de las moléculas de IgG monoclonales a partir de las moléculas de scFv seleccionadas se describe en el siguiente ejemplo. Ejemplo 3: Clonación y expresión eucariótica de los anticuerpos monoclonales de los scFvs seleccionados Aunque las bacterias ya se sabe que expresan los fragmentos de Fab funcionales, los mismos usualmente no son capaces de producir inmunoglobulinas funcionales completas. Para la producción de anticuerpos funcionales completos, las células de mamífero deben ser utilizadas y por lo tanto la región de VL de scFv 5-306 y las diferentes regiones de VH de las moléculas de scFv seleccionadas en los ejemplos previos fueron subclonadas en los vectores de expresión de mamífero (especialmente las regiones VH de scFv A y scFv B) . Ejemplo 3.1: Clonación de la cadena ligera humana basada en scFv 5-306 Para generar sitios de restricción terminal adecuados, el fragmento de ADN que codifica la región VL de scFv 5-306 fue reamplificada por PCR, conduciendo a los fragmentos Vkappa con un sitio Bsu361 en el extremo 5' y un sitio Xhol en el extremo 3' . Este fragmento fue subclonado entonces en el plásmido (BSPOLL por Bsu36l y Xhol utilizando un cebador 5' ( 5' -ACGTCACCTTAGGTGTCCACTCCGATATCCAGATGACCCAGTC TCCATCTTCCGTGTCTGC-3' ) y el cebador 3' (5'-CATGCACTCGAGCTTGGTCCCTCCGCCGAAAG-3' ) , agregando así una secuencia delantera del mamífero y una región constante Ckappa humana y verificada por secuenciación. Utilizando EcoRI y Salí, el ADN de 5-306 VL-Ckappa fue escindido de BSPOLL y subclonado en el vector de expresión eucariótica pEF-ADA derivado del vector de expresión pEF-DHFR (Mack et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci USA. 92, 7021-5) remplazando el ADNc que codifica la dihidrofolato reductasa de murino (DHFR) con aquellos que codifican la adenosina desaminasa de murino (ADA) . Ejemplo 3.2: Clonación de los dominios variables de cadena pesada, humanos A partir de diferentes regiones de VH humanas, seleccionadas en los ejemplos previos (especialmente las regiones VH de scFv A y scFv B) , la región variable fue reamplificada por PCR, generando los sitios de restricción Bsu36l en ambos extremos. Para todas las construcciones, la combinación de dos cebadores fue utilizada: el cebador 5' VH-Bsu361 ( 5 ' -ACGTCACCTTAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGT CCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGC-3' ) y el cebador 3' (5'-ACGTCACCTGAGGAGACGGTGACCATTGTCCCTTG-3' ) . Los fragmentos de ADN resultantes fueron entonces subclonados utilizando estos sitios de restricción en el vector de expresión eucariótica pEF-DHFR que ya contiene una secuencia delantera eucariótica y un fragmento de ADN que codifica la región constante de cadena pesada IgGl humana. Las regiones variables de cadena pesada fueron insertadas así entre el elemento delantero y la región constante de cadena pesada. Las secuencias correctas de las regiones variables fueron conformadas por secuenciación. Ejemplo 3.3: Conversión de los fragmentos de scFv en los IgGs humanos, totales El plásmido que codifica la cadena ligera (VL 5-306/Ckappa) y el plásmido que codifica una cadena pesada (región constante de VH/IgGl humana) fueron cotransfectados en las células de HEK de acuerdo con los protocolos estándares para la expresión transitoria de la proteína y las células fueron cultivadas para permitir la expresión y producción de inmunoglobulinas en el medio de cultivo. De esta manera, el IgG A, que se deriva de scFv A e IgG B, que se deriva del scFv B, fueron producidos. Después del período de producción respectivo, los sobrenadantes fueron colectados y las inmunoglobulinas humanas fueron aisladas por medio de la cromatografía de la proteína A de acuerdo con los protocolos estándares para la purificación de las inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas purificadas fueron utilizadas entonces para experimentos de caracterización adicionales . Ejemplo 3.4: Reconversión de las especificidades de IgGs en los fragmentos de scFv Las regiones VH de las construcciones de IgG (IgG A e IgG B, como se describieron anteriormente) fueron reclonadas en un vector de expresión de scFv adecuado de acuerdo con los protocolos estándares y fueron unidos operativamente por medio de un enlazador flexible a la región VL de extensión de la cadena ligera humana del ejemplo 3.1. Estas construcciones fueron producidas solublemente en el periplasma de E. coli como se describió anteriormente. La caracterización de estos scFvs (scFv O, derivado de IgG A, y scFv P, derivado de IgG B) es descrita en los siguientes ejemplos . Ejemplo 4: Evaluación de la especificidad de aglutinación de un anticuerpo de anti-GM-CSF monoclonal humano para el GM-CSF humano y de primate El objetivo de este experimento fue demostrar que un anticuerpo obtenido como se describió anteriormente se enlaza al GM-CSF. Por lo tanto, la aglutinación de tal anticuerpo a diferentes factores estimulantes de la colonia humana recombinante ("rh") (rhG-CSF y rhM-CSF, Strathmann) fue comparada con la misma aglutinación del anticuerpo a rhGM-CSF por ELISA. 50 µl del antígeno particular (1 µg/ml en PBS) fueron recubiertos sobre la placa de ELISA (Nunc, Maxisorp) durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado 3 veces con PBS/0.05 % de Tween 20, las cavidades fueron bloqueadas con 200 µl de PBS/3 % de polvo de leche seco, sin grasa, por cavidad durante 1.5 h a temperatura ambiente seguido por el lavado 3 veces con PBS/0.05 % de Tween 20. 50 µl/cavidad de una serie de anticuerpos humanos (por ejemplo IgG A e IgG B) , cada uno con cadenas ligeras idénticas de la secuencia de acuerdo con la SEC ID NO. 34 pero con diferentes cadenas pesadas de acuerdo con las SEC ID NOs: 35-38 fueron agregadas en una serie de diluciones que varían desde 1 µg/ml hasta 0.5 ng/ml (en PBS/0.05 % Tween 20/3 % de polvo de leche seco, sin grasa) y se incubaron durante 1 hora. Después de 3 lavados con PBS/0.05 % Tween 20, el anticuerpo único fue detectado utilizando 50 µl del anticuerpo de IgG anti-humano, de cabra, conjugado con peroxidasa de rábano picante (Dianova; diluido 1:1000 en PBS/0.05 % Tween 20/3 % polvo de leche seco sin grasa) . La señal fue revelada por la adición de 50 µl/cavidad de la solución de ABTS (Roche) y la absorción fue medida a 405 nm utilizando una longitud de onda de 400 nm como una referencia. Los anticuerpos de conejo disponibles comercialmente (Strathmann Biotech AG) específicos para rhM-CSF y rhG-CSF, respectivamente, fueron utilizados como controles positivos para la aglutinación de estos antígenos, la aglutinación es detectada con un anticuerpo de anti-conejo, de cabra, conjugado con fosfatasa alcalina. La señal fue revelada con 50 µl/cavidad de la solución de pNpp (Sigma) y la absorción fue medida a 405 nm utilizando una longitud de onda de 450 nm con una referencia. Los resultados son mostrados en las figuras 6A, 6B y 6C para dos anticuerpos humanos representativos. IgG A e IgG B. Como se puede observar en la figura 6A, incrementar la concentración del anticuerpo concentrado conduce a un incremento en la absorción, lo cual indica una buena aglutinación al rhGM-CSF para ambos de los anticuerpos de IgG A y B representativos. La figura 6B muestra los resultados de los dos anticuerpos representativos para rhM-CSF. Como se puede observar en esta figura, incrementar las concentraciones del anticuerpo de anti-rhM-CSF de conejo conduce a incrementar la absorción, es decir, incrementar la aglutinación de este anticuerpo de control (puntos rellenos), mientras que dos anticuerpos representativos descritos anteriormente (cuadrados rellenos y triángulos rellenos), están superpuestos como la absorbancia de la línea base continua que no se incrementa con el incremento de la concentración del anticuerpo de prueba. Un resultado totalmente análogo es observado tanto para el anticuerpo de control como para los IgGs A y B representativos en la figura 6C, que muestran los resultados de la aglutinación a rhG-CSF. Tomados conjuntamente, los datos mostrados en las figuras 6A, 6B y 6C indican que los dos anticuerpos de prueba de IgGs A y B representativos se enlazan específicamente a rhGM-CSF, pero no a otros factores estimulantes de la colonia tales como M-CSF y G-CSF. Tal especificidad de aglutinación del antígeno es importante para un agente terapéutico del anticuerpo promisorio. Ejemplo 5: Caracterización de los datos de aglutinación para los anticuerpos de anti-GM-CSF monoclonales humanos y los fragmentos de los mismos Se desea generar una evaluación cualitativa de varios elementos identificados como aglutinantes positivos de rhGM-CSF por ELISA como se describieron anteriormente en el ejemplo 2. El intervalo de calificación estuvo propuesto para reflejar los parámetros cinéticos (velocidad de apagado) y de equilibrio (afinidad) de varios aglutinantes de anticuerpos representativos así identificados. Para este fin, la resonancia del plasmón superficial (SPR) fue detectado sobre el aparato BIAcore™ 2000, Biacore AB (Uppsala, Suecia) con una velocidad de flujo de 5 µl/min y HBS-EP (0.01 M HEPES, pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, 0.005 % del agente tensioactivo P20) como el amortiguador para la corrida a 25 °C. El GM-CSF humano recombinante (Leukine, Berlex, referido aquí alternativamente más abajo como "el antígeno" o "rhGM-CSF") producido en levadura, fue inmovilizado en las células de flujo 2-4 sobre un chip sensor CM5. La superficie del sensor fue activada por la inyección de 80 µl de sodio-hidroxisuccinimida, 0. 1 M, N-etil-N' (3-dimetil aminopropil) -carbodiimida (NHS/EDC) 0.4 M. El antígeno fue unido por la inyección manual de 10 µg/ml de rhGM-CSF en sodio-acetato 0.01 M, pH 4.7. Diferentes densidades del antígeno fueron inmovilizadas sobre las células de flujo 2-4 ajustando la cantidad de los tipos de inyección manualmente . La célula de flujo 1 se dejó sin modificar mientras que la célula de flujo 2 fue recubierta con la densidad más elevada posible de rhGM-CSF (800 RU) . La célula de flujo 3 fue recubierta con 50 % de la cantidad del antígeno inmovilizado sobre la célula de flujo 2 y la célula de flujo 4 fue recubierta con la densidad más baja de rhGM-CSF (típicamente 10 %) . La superficie activada del chip sensor fue bloqueada por la inyección de 85 µl de la etanolamina 1 M y el chip se dejó que se equilibre toda la noche a una velocidad de flujo constante de 5 µl/min de HBS-EP. Ej emplo 5 . 1 : Determinación cualitativa de los parámetros de aglutinación cinética ( velocidad de apagado ) para los f ragmentos de scFv de los anticuerpos de anti-GM-CSF monoclonales humanos Los experimentos de Biacore fueron efectuados como se describe en el párrafo precedente . Previo al experimento , las soluciones de proteínas eluídas de la preparación periplásmica ("PPP") (por sus siglas en inglés) fueron dializadas contra PBS a 25 °C durante 2 h y se diluyen 1:1 en HBS-EP. Las características cinéticas de aglutinación de los miembros de la clase reivindicada fueron medidas por la inyección de 10 µl de la proteína periplásmica purificada a 25 °C sobre el chip sensor. La adsorción del fondo no específica de la proteína hasta la superficie del chip sensor no modificado (FC1) (por sus siglas en inglés) fue restada de la señal de la respuesta en las células de flujo inmovilizado de rhGM-CSF (FC2, FC3, FC4) . La señal de respuesta relativa (FC2-1, FC3-1, FC4-1) fue determinada y la velocidad de disociación específica fue verificada durante 100 segundos. Los resultados de estos experimentos son mostrados en la figura 7A para una serie de fragmentos de scFv representativos que han sido identificados previamente como aglutinantes de rhGM-CSF positivos en los experimentos de ELISA. Los fragmentos del anticuerpo de scFv representativo para los cuales los datos de Biacore son mostrados en la figura 7A son como sigue: scFv A, scFv B, scFv C, scFv D, scFv E, scFv F, scFv G, scFv H, scFv I, scFv J, scFv K, scFv L, scFv M, y scFv N. En general, en la interpretación de los resultados de Biacore, la amplitud del pico de aglutinación (RUmax) se correlaciona directamente con la concentración de la proteína en la muestra inyectada. La velocidad de apagado cinético (ka) es dependiente de la concentración y, debido a las concentraciones variables de la proteína en la PPP, no puede ser utilizada para la evaluación cualitativa de los miembros de la clase reivindicada. La velocidad de apagado cinética (kd) es independiente de la concentración de la proteína y una característica para la resistencia a la aglutinación de los miembros respectivos de la clase reivindicada. Todos los miembros identificados de la clase reivindicada muestran una aglutinación específica al rhGM-CSF inmovilizado. Los miembros de la clase reivindicada con la mejor velocidad de apagado aparente fueron identificados y después de la correlación adicional de los datos de SPR con los datos de inhibición, se sometieron a la determinación de la afinidad por medio de experimentos de aglutinación de equilibrio sobre el BIAcore. En el examen de la figura 7A, entonces, se observan distintos picos para cada uno de los fragmentos A-N del anticuerpo de scFv representativo, las porciones superiores de las cuales muestran cada una, una curvatura característica que puede ser extrapolada para obtener una velocidad de apagado para el fragmento de scFv en cuestión. Cualitativamente, entonces, se puede concluir que cada uno de los fragmentos de scFv representativos se enlaza bien en GM-CSF humano .
Ejemplo 5.2: Determinación cuantitativa de los parámetros de aglutinación de equilibrio (afinidad) para ciertos anticuerpos de anti-GM-CSF humanos y fragmentos de scFv de los mismos Habiéndose establecido, cualitativamente en el ejemplo 5.1 que un número de fragmentos de scFv de los anticuerpos de anti-GM-CSF que se han probado previamente que son positivos para la aglutinación de GM-CSF por ELISA, demostraron velocidades de apagado cinético razonables cuando se enlazan al GM-CSF humano, fue deseable entonces obtener una representación cualitativa de tal aglutinación para los anticuerpos y fragmentos de los mismos por el enfoque sobre las características de aglutinación en el equilibrio para el GM-CSF humano recombinante. Como se mostró anteriormente en el ejemplo 4, la aglutinación específica al antígeno - aquí rhGM-CSF - es una de las características y atributos específicos de la clase de los anticuerpos de anti-GM-CSF y los fragmentos de los mismos como se describieron aquí. Las características cinéticas de aglutinación (la velocidad de apagado, kd, y la velocidad de encendido ka) , de ciertos elementos representativos de la clase de los anticuerpos de anti-GM-CSF humanos y fragmentos de los mismos, fueron medidas por inyección de 10 µl de la proteína purificada (es decir, el anticuerpo o fragmento del mismo) en una serie de diluciones que varían desde 10 µg/ml hasta 1 pg/ml de la proteína purificada y la verificación de la disociación a 25 °C durante 100 segundos. La proteína purificada fue amortiguada en HBS-EP. Los datos fueron ajustados utilizando el software BIAevaluation™, determinando la constante de la velocidad para las características cinéticas de asociación y disociación con una ecuación de de aglutinación de Langmuir 1:1 (véanse las fórmulas 1 y 2 posteriormente) , en donde A es la concentración del analito de la proteína purificada inyectada y B[0] es Rmax: dB/dt = - (ka/ * [A] * [B] -kd* [AB] ) (fórmula 1 ) dAB/dt = - (ka/* [A] * [B] -kd* [AB] ) (fórmula 2) Las curvas de aglutinación cinética fueron determinadas con hasta 8 concentraciones de cada anticuerpo de anti-GM-CSF humano representativo o fragmento del mismo analizado. El ajuste independiente de los datos de entrada condujo a las constantes de la velocidad de disociación y asociación que fueron utilizadas para calcular la constante de disociación en el equilibrio (KD) . Los resultados obtenidos para cada anticuerpo de anti-GM-CSF humano, representativo, o fragmento del mismo, son mostrados en las figuras 7B-7I. Específicamente, la figura 7B muestra los datos de aglutinación obtenidos para el IgG B representativo; la figura 7C muestra los datos de la aglutinación obtenidos para el IgG A representativo; la figura 7D muestra los datos de aglutinación obtenidos para el scFv C representativo; la figura 7E muestra los datos de aglutinación obtenidos para el scFv I representativo; la figura 7F muestra los datos de aglutinación obtenidos para el scFv B representativo, la figura 7G muestra los datos de aglutinación obtenidos para el scFv A representativo; la figura 7H representa los datos de aglutinación obtenidos para el scFv E representativo; y la figura 71 muestra los datos de aglutinación obtenidos para el scFv D representativo. Los datos son resumidos posteriormente en la tabla 2. Tabla 2: Datos de aglutinación de afinidad, cuantitativos, para ciertos anticuerpos de anti-GM-CSF humanos, representativos, y fragmentos de los mismos.
Ejemplo 6: Requerimientos mínimos del epitopo para un cierto fragmento representativo de un anticuerpo anti-GM-CSF humano Fue deseable determinar el epítopo unido por los anticuerpos de anti-GM-CSF humanos y fragmentos de los mismos como se describe y reivindica aquí. Para este fin, un análisis por puntos o manchas de los péptidos ("pepspot") fue efectuado utilizando scFv A como un miembro representativo de esta clase de moléculas y el GM-CSF humano como el antígeno. En general, un experimento de pepspot es efectuado como sigue. La superposición de los péptidos 13mer derivados de la secuencia de aminoácidos de hGM-CSF (para la secuencia de GM-CSF de los seres humanos y de otros ciertos primates, véase aquí anteriormente también la figura 8A, así como las SEC ID NOs: 49-51) fueron enlazados covalentemente a una membrana de celulosa Whatman 50 por la terminación C mientras que la terminación N acetilada permaneció libre. Los péptidos 13mer individuales generados (por JPT Peptide Technologies GmbH) son mostrados posteriormente en la tabla 3. La longitud de la secuencia de la superposición de cualesquiera dos péptidos respectivos fue fijada para que sea de 11 aminoácidos. De acuerdo con el protocolo del fabricante, la membrana fue enjuagada con EtOH absoluto durante 1 minuto, seguido por el lavado de TBS y del bloqueo con TBS/3 % de BSA toda la noche. Como con cada incubación y lavado subsiguiente, el bloqueo fue llevado a cabo a temperatura ambiente. Después del lavado 3 veces con TBS/0.05 % de Tween 20 durante 10 minutos, la membrana se incuba durante 1 µl/ml scFv A en TBS/3 % de BSA durante 2.5 h seguido por el lavado, llevado a cabo como anteriormente. La detección del scFv fue 17 efectuada utilizando un anticuerpo de anti-Penta-His (Qiagen, 0.2 µg/ml en TBS/3 % de BSA) y seguido por el anticuerpo de IgG (Fe-gamma-específico) de antiratón, de cabra, conjugado con peroxidasa de rábano picante (Dianova, 1:10.000 en TBS/3% de BSA) la incubación con cada uno de estos anticuerpos respectivos es efectuado durante 1 h. Después del lavado 3 veces con TBS/0.05 % de Tween 20 durante 10 minutos, la señal fue revelada por quimioluminiscencia mejorada (solución me j orador a /pico luminol de SuperSignal West y solución de peróxido pico estable de SuperSignalWest; Pierce) , y la exposición a una película BioMax (Kodak) . Las señales de aglutinación fuerte de scFv A a los segmentos de GM-CSF humana fueron detectadas sobre un segmento de los puntos del péptido entre los puntos A y B así como sobre el punto C (véase la tabla 3 posterior, y la figura 8B) . Como se puede observar en la figura 8B, la aglutinación a otros puntos parece que va a ser de una fuerza inferior. El segmento de los puntos de extensión A y B corresponde a los residuos de aminoácidos 15-35. Todos los péptidos 13mer que componen esta región contienen un fragmento de aminoácidos mínimos de los aminoácidos 23-27 (RRLLN) . El punto C corresponde a los residuos de aminoácidos 65-72 ( GLRGSLTKLKGPL ) de GM-CSF humano. Estos descubrimientos implican que scFV probablemente reconozca un epítopo discontinuo. En la estructura secundaria del GM-CSF humano, los aminoácidos 15-35 están situados en la hélice A mientras que los residuos que corresponden al sitio C son parte una estructura de bucle localizada entre las hélices C y D. Un modelo tridimensional de plegado de la molécula revela la proximidad estérica estrecha de estos sitios de manera relacionada entre sí. La porción de la secuencia de aminoácidos mínima en los péptidos de los puntos A-B corresponde a los residuos 23-27 del GM-CSF humano (RRLLN) . Una fuerza creciente de la señal de los puntos A a B puede ser explicada por una mejor accesibilidad del epítopo de RRLLN en el péptido correspondiente al punto B que en el péptido correspondiente al péptido A. En el péptido A, el epítopo está localizado directamente en la terminación C que está enlazada a la membrana mientras que en el péptido B el mismo está localizado en la terminación N más accesible del péptido.
Tabla 3: Secuencias de superposición de los péptidos 13mer inmovilizados sobre la membrana de celulosa.
APARSPSPSTQPW 16. DTAAEMNETVEVI 31. LYKQGLRGSLTKL 46. TPETSSATQTITF ARSPSPSTQPWEH 17. AAEMNETVEVISE 32. KQGLRGSLTKLKG 47. BTSSATQTITFES SPSPSTQPWEHVN 18. EMNETVEVISEMF 48. SSATQTITFESFK SPSTQPWEHV AI 19. NETVEVISE FDL 34. RGSLTKLKGPLTM 49. ATQTITFESFKEN STQPWEHVNAIQE 20. TVEVISEMFDLQE 35. SLTKLKGPLTMMA 50. QTITPESFKENLK QPWEHVNAIQEAR 21. EVISE FDLQEPT 36. TKLKGPLTMMASH 51. ITFESFKENLKDF WEHVNAIQEARRL 22. ISEMFDLQEPTSL 37. LKGPLTMMASHYK 52. FESFKENL DFLL 8. HVNAIQE (A) 23. EMFDLQEPTSLQT 38. GPLTMMASHYKQH 53. SFKENLKDFLLVI 9. NAIQE _ LS 24. FDLQEPTSLQTRL 39. LTMMASHYKQHSP 54. KENLKDFLLVIPF 10. IQEAiglLSRD 25. LQEP SLQTRLEL 40. MASHYKQHSPPT 55. NLKDFLLVIPFDS 11. EA»JLSRDTA 26. EPTSLQTRLELYK 41. ASHYKQHSPPTPE 56. KDFLliVIPFDSWE 12. ÜÜ sRDTAAE (B) 27. TSLQTRLELYKQG 42. HYKQHSPPTPETS 57. FLLVIPFDSWEPV 13 . LLNLSRDTAAEM 28. LQTRLELYKQGLR 43. KQHSPPTPETSSA 58. LVIPFDS EPVQE 1 . NLSRDTAAEMNET 29. TRLELYKQGLRGS 44. HSPPTPETSSATQ 15. SRDTAAEMNETVE 30. LELYKQG RGSLT 45. PPTPETSSATQTI Ejemplo 7 : Potencia de neutralización de ciertos fragmentos del anticuerpo/anticuerpos de GM-CSF anti-humanos, humanos Ejemplo 7.1: Evaluación cualitativa del potencial de neutralización de ciertos anticuerpos de GM-CSF anti-humanos, humanos, representativos y fragmentos de los mismos. El objeto de este experimento es lograr información cualitativa sobre la actividad neutralizante de los anticuerpos neutralizantes de anti-GM-CSF humanos, representativos, y fragmentos de los mismos. Para este fin, la línea celular TF-1 dependiente de GM-CSF humano (DSMZ, ACC 334) fue utilizada. La velocidad de proliferación de esta línea celular depende de la presencia de GM-CSF humano, de modo que la medición del crecimiento celular después de la incubación de las células con GM-CSF humano con y sin un anticuerpo sospechoso de tener una actividad neutralizante de GM-CSF, puede ser utilizado para determinar si tal actividad de neutralización existe en efecto. Las células TF-1 fueron cultivadas en el medio RPMl 1640 (Gibco; L-glutamina, rojo de fenol libre), FCS inactivado con calor al 10 % en la presencia de 2.5 ng/ml de rhGM-CSF como se describió por el distribuidor (Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania). Las células se hicieron crecer hasta una densidad celular de 0.5 x lOexpd células/ml. Para el ensayo de proliferación, las células de TF-1 fueron colectadas por centrifugación a 300 x g durante 4 minutos y se lavaron con 1 x PBS (Dulbecco's, Gibco) . Las células fueron resuspendidas hasta una concentración final de 1 x 10exp5 células/ml en RPMl 1640, 10 % de FCS y 90 µl de la suspensión celular por cavidad de la placa de cultivo de las células de fondo plano, Microtest, fueron utilizadas (0.9 x 10exp4 células/cavidad). Una concentración final de 0.3 ng/ml de rhGM-CSF fue utilizada para estimular la proliferación de las células TF-1. Para la neutralización del PPP purificado por la proliferación dependiente de GM-CSF de los fragmentos representativos de un anticuerpo de anti-GM-CSF humano fueron dializados contra 1 x PBS a 25 °C durante 2 h. 10 µl de la solución de proteína filtrada estéril y dializada (filtro de 0.22 µm) fueron agregados a 100 µl de la solución que contiene TF-1 y rhGM-CSF. Después de la incubación durante 72 h a 37 °C a 5 % de C02, el estado proliferativo de las células TF-1 fue determinado con un ensayo colorimétrico basado en la segmentación de las sales de tetrazolio (WST-1, Roche) por la deshidrogenasa mitocondrial en las células viables. El tinte de formazan formado por las células activas metabólicamente fue cuantificado por la medición de su absorbancia con un lector de ELISA a 450 nm. La inhibición de la proliferación dependiente de GM-CSF humano de las células TF-1 por los fragmentos representativos probados de los fragmentos del anticuerpo de GM-CSF anti-humano, humano, fueron de concentración variable (figura 9) . Aunque dos de tales fragmentos no tienen un efecto neutralizante (scFv F y scFv L) ; cinco construcciones (scFv J, scFv K, scFv M, scFv N, y scFv H) mostraron la inhibición intermedia y siete construcciones (scFv B, scFv I, scFv E, scFv D, scFv G, scFv C, scFv A) mostraron una inhibición fuerte de la proliferación dependiente de GM-CSF de las células TF-1. La falta o el grado inferior del efecto neutralizante podrían ser debido a un nivel de expresión inferior del scFv representativo particular o a un complejo menos estable formado entre un scFv representativo particular y un rhGM-CSF durante el período de incubación de 72 h a 37 °C. Ejemplo 7.2: Evaluación cuantitativa del potencial de neutralización de ciertos anticuerpos de GM-CSF anti-humanos, humanos, y fragmentos de los mismos, como se mide por proliferación celular Las moléculas de scFv representativas, seleccionadas, que se mostró anteriormente que exhiben una inhibición fuerte de la proliferación de TF-1, fueron sometidas entonces a un análisis cuantitativo de la eficacia neutralizante. Para este fin, la misma línea celular TF-1 dependiente de GM-CSF humano (DSMZ ACC 334) fue utilizada. Las células de TF-1 fueron cultivadas y preparadas para el ensayo de proliferación como se describe con detalle en el ejemplo 7.1 anterior. Una concentración final de 0.3 ng/ml de rhGM-CSF fue utilizada para estimular la proliferación de las células TF-1. Para la neutralización de la proliferación dependiente de GM-CSF, 10 µl de las muestras purificadas de los anticuerpos monoclonales de GM-CSF anti-humanos, humanos, representativos o fragmentos de los mismos, fueron agregados a una solución que contiene 100 µl de TF-1 y rhGM-CSF en una serie de diluciones. Las concentraciones finales de la proteína variaron desde 10 µg/ml hasta 10 pg/ml. Las muestras fueron incubadas a 37 °C al 5 % de C02 durante 72 h. Después de 72 h el estado proliferativo de las células TF-1 fue determinando como se describió en el ejemplo 7.1 anterior. Los datos fueron ajustados para la inhibición intermedia máxima de la proliferación (IC50) utilizando el ajuste de la curva de regresión no lineal del software Prism. El efecto neutralizante de GM-CSF claro observado en el experimento de inhibición de la proliferación, cualitativa, descrita en el ejemplo 7.1 anterior podría ser conformado y cuantificado. Todos los fragmentos de scFv preparados de los anticuerpos neutralizantes monoclonales de GM-CSF anti-humanos, humanos, exhibieron una constante de inhibición máxima intermedia (IC50) en el intervalo nanomolar en este experimento de inhibición de la proliferación. Una evaluación clara de la eficacia neutralizante podría ser establecida, como se observa en la figura 10A. Los anticuerpos de IgG neutralizantes, monoclonales, de GM-CSF anti-humanos, humanos, exhiben una eficacia neutralizante significativamente más elevada que sus contrapartes de scFv. La constante de inhibición máxima intermedia de las moléculas de IgG generadas en este experimento estuvo en el intervalo sub-nanomolar. Como se puede observar en la figura 10B, la IC50 evaluada para IgG A fue de 0.9 nM y la IgG B tuvo una IC50 de 0.3 mM. Para verificar si los anticuerpos de scFv generados de IgGs A y B (scFvs O y P, respectivamente) corresponden cuantitativamente en su potencial de aglutinación a scFvs A y B, los ensayos de neutralización de TF-1 análogos fueron efectuados como se describió anteriormente excepto que se utilizan los scFv 0 y P como moléculas de prueba. Los resultados son mostrados en las figuras 10C y 10D para los scFv P y 0, respectivamente. Como se puede observar de la figura 10D, el scFv O tiene el mismo potencial neutralizante que scFv A, que muestra que la reconversión de IgG de regreso al formato scFv es posible sin la pérdida de actividad biológica. Ejemplo 7.3: Evaluación cuantitativa del potencial de neutralización de ciertos anticuerpos de anti-rhGM-CSF humanos, representativos y fragmentos de los mismos, como se mide por la producción de IL-8 reducida Este experimento fue efectuado para cuantificar la actividad de neutralización de los anticuerpos de GM-CSF anti-humanos, humanos, representativos y los fragmentos de los mismos por la medición de la producción de IL-8 dependiente de GM-CSF por las células U-937. El antígeno de GM-CSF utilizado en los experimentos precedentes fue rhGM-CSF. Las células U-937 monocíticas fueron cultivadas en un medio RPMl 1640 de Gibco (L-glutamina, rojo de fenol libre) suplementado con 10 % de CSF inactivado con calor como se describe por el distribuidor (Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunscheweig, Alemania). Las células se hicieron crecer hasta una densidad celular de 1 x 10exp6 células/ml.
Efectuando el ensayo de inhibición basado en la medición de la producción de IL-8, las células fueron colectadas por centrifugación a 300 x g durante 4 minutos y se resuspendieron a una concentración final de 1 x lOexpd células/ml en RPMl 1640, 10 % de FCS. 1.8 x 10exp5 células/cavidad (180 µl de la suspensión celular) fueron sembradas por cavidad de la placa de cultivo de las células, de fondo plano, Microtest. Una concentración final de 1 ng/ml de rhGM-CSF fue utilizado para estimular la producción de IL-8 por las células U-937. 20 µl del scFv purificado o IgG fueron agregados a 180 µl de las células U937 y la solución de rhGM-CSF en una serie de dilución que conduce a las concentraciones de la proteína final que varían desde 10 µg/ml hasta 10 pg/ml. Después de la incubación durante 18 h a 37 °C y C02 al 5 %, las células fueron centrifugadas depositándolas descendentemente sobre placas de cultivo durante 2 minutos a 600 x g. Los sobrenadantes del cultivo fueron colectados por transferencia por medio de una pipeta a una nueva placa y fueron analizados para determinar la concentración de IL-8 en el mismo utilizando el conjunto OptEIA IL-8 ELISA (Becton Dickenson and Company) . La detección por ELISA fue llevada a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, 50 µl del anticuerpo de captura diluidos en carbonato de sodio 0.1 M, pH 9.5, fueron recubiertos sobre una microplaca de prueba durante la noche a 4 °C. Después del lavado 3 veces con PBS/0.05 % Tween 20, las células fueron bloqueadas con 200 µl de PBS/10 % de FCS por cavidad durante 1 h a temperatura ambiente seguido por el lavado 3 veces con PBS/0.05 % de Tween 20. Luego se agregaron 50 µl de las muestras del sobrenadante del cultivo a las cavidades y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Para una última cuantificación de la concentración de IL-8, se llevó a cabo una dilución en serie del estándar de IL-8 provista por el fabricante a lo largo de todo el experimento. Después del lavado 5 veces con PBS/0.05 % de Tween 20, la detección se llevó a cabo utilizando 50 µl del Detector de Trabajo (detección de Ab + Av-RHP) provista en el conjunto de OptEIA Humano IL-8 ELISA. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, las cavidades fueron lavadas unas 7 veces adicionales. La señal fue desarrollada por la adición de la solución del substrato de OPD (Sigma) y fue detectada a una longitud de onda de 490 nm (utilizando una longitud de onda de 620 nm) . Una curva estándar de IL-8 fue graficada para la calibración y la concentración de IL-8 en las muestras del sobrenadante del cultivo fue calculada de acuerdo con esta curva de calibración. Los datos fueron ajustados para la inhibición intermedia máxima de la producción de IL-8 (IC50) utilizando el ajuste de la curva de regresión no lineal del software Prism. Todos los fragmentos representativos de los anticuerpos neutralizantes monoclonales de anti-rhGM-CSF humanos, probados, mostraron una inhibición clara de la producción de IL-8 dependiente de GM-CSF de las células de U-937, como puede ser observado claramente por la reducción en la concentración de IL-8 con la concentración creciente de scFv en la figura 11. La evaluación de la eficacia neutralizante observada en este experimento está de acuerdo con la evaluación obtenida probando las mismas moléculas para verificar su efecto neutralizante en el experimento de proliferación-inhibición de TF-1 descrito anteriormente. Se observará que los valores de IC50 determinados en este experimento son más elevados cuando se compara con aquellos obtenidos para las mismas moléculas en el experimento de proliferación de TF-1 previo. Esto se debe a la concentración de GM-CSF más elevada requerida para la estimulación de la producción de IL-8 por las células de U-937 que la requerida para la estimulación de TF-1. Ejemplo 7.4: Evaluación cuantitativa del potencial de neutralización de los anticuerpos de GM-CSF anti-humanos, humanos, y los fragmentos de los mismos sobre el GM-CSF del macaco, recombinante, como se mide por proliferación celular El objeto de este experimento fue mostrar la potencia neutralizante de los anticuerpos de GM-CSF antihumanos, humanos, y los fragmentos de los mismos, para GM-CSF de los primates no humanos de la familia de los macacos ("macGM-CSF") . Para mostrar el efecto neutralizante de las moléculas de scFv y de IgG sobre macGM-CSF, un experimento de proliferación-inhibición fue efectuado de acuerdo con el protocolo descrito en los ejemplos 7.1 y 7.2 utilizando macGM-CSF en lugar de hGM-CSF. Tanto hGM-CSF como macGM-CSF estimulan la proliferación de las células TF-1 con la misma eficacia máxima intermedia (EC50) . Una concentración final de 3 ng/ml de macGM-CSF fue utilizada para estimular la proliferación de las células TF-1 en el experimento que prueba las moléculas de scFv y 0.3 ng/ml de las células de rhGM-CSF en el experimento que prueba la IgG B como un anticuerpo de GM-CSF anti-humano, humano, representativo. Para neutralizar la proliferación de las células de TF-1, 10 µl del anticuerpo de GM-CSF anti-humano, humano, purificado, o fragmento del mismo, fueron agregados a 100 µl de TF-1 y la solución de macGM-CSF en una serie de diluciones. Las concentraciones de las proteínas finales variaron desde 10 µg/ml hasta 10 pg/ml. Las muestras fueron incubadas a 37 °C al 5 % de C02 durante 72 h. Después de 72 h el estado proliferativo de las células de TF-1 fue determinado como se describió en los ejemplos 7.1 y 7.2. Los datos fueron ajustados para la inhibición intermedia máxima de la proliferación (Ic50) utilizando el ajuste de la curva de regresión no lineal del software Prism. Como se muestra en la figura 12A, ciertos fragmentos de anticuerpos monoclonales de GM-CSF anti-humanos, humanos, también exhibieron un potencial de neutralización claro de macGM-CSF (scFv B, scFv E, scFv C, scFv I, scFv A) . Además, como se puede observar en la figura 12B, el incremento de las concentraciones de IgG B del anticuerpo monoclonal de GM-CSF anti-humano, humano, representativo, claramente condujo a una reducción en la proliferación de TF-1, demostrando este potencial de neutralización del anticuerpo. De manera interesante, el valor de Ic50 generado para IgG B en este experimento (0.3 nM) utilizando el mac GM-CSF para la inducción de la proliferación de las células de TF-1 es igual a uno generado en el experimento utilizando hGM-CSF, mostrando una reactividad cruzada clara de IgG B para GM-CSF en estas especies. Ejemplo 8 : Reactividad cruzada de IgG B con GM-CSF de varias especies La reactividad cruzada de IgG B, con GM-CSF de varias especies no humanas fue investigada para identificar las especies adecuadas para estos últimos estudios in vivo . En un primer conjunto de experimentos, la aglutinación de IgG B a GM-CSF recombinante disponible comercialmente del ser humano (Leukine®, Berlex) , del cerdo, del perro, de la rata (R&D Systems, Wiesbaden, Alemania) y de ratón (Strathmann Biotech, Hamburg, Alemania) fue probada en el experimento de ELISA. Específicamente, una placa de ELISA fue recubierta con 1 µg/ml de GM-CSF de las diversas especies mencionadas. El IgG B fue agregado en una serie de diluciones y se detectó utilizando un anticuerpo de IgGl anti-humano conjugado con peroxidasa de rábano picante. El ensayo de ELISA fue desarrollado por la adición de la solución del substrato de OPD o-fenilendiamina ("OPD", amarillo-anaranjado cuando se hace reaccionar con peroxidasa) (Roche, Alemania) y se midió a 490 nm. Como se observa en la figura 13, la IgG B mostró una aglutinación robusta al GM-CSF humano recombinante, mientras que el GM-CSF de las otras especies probadas no fue reconocido. El cerdo, el perro, la rata o el ratón por lo tanto pueden no ser especies adecuadas para la prueba in vivo . Sin embargo, como se observó anteriormente en el ejemplo 7.4, la IgG B muestra una reactividad cruzada marcada con el macGM-CSF (del mono cinomolgus, maca ca fasci cularis) implicando la adecuación de al menos una especie del mono de la familia del macaco para los estudios in vivo de IgG B. Ejemplo 9: Aglutinación por IgG B a las variantes glicosiladas de manera diferente de GM-CSF El objetivo de este experimento fue determinar la extensión a la cual la aglutinación de IgG B a GM-CSF depende de la última configuración de glicosilación. Para este fin, una serie de diluciones del medio acondicionado que contiene el hGM-CSF natural (glicosilación humana) , así como el hGM-CSF recombinante de E . coli (sin glicosilación) y la levadura (glicosilación de levadura), así como un GM-CSF de macaco recombinante, fueron probados para verificar su potencia para inducir la proliferación de TF-1. El GM-CSF glicosilado, humano, fue obtenido del sobrenadante del cultivo de las células de BEAS-2B tratadas con IL-lß (las células del pulmón humano obtenidas de ATCC CRL-9609) . Las células de BEAS-2B fueron propagadas en el medio de BEBM substituido con el kit BEGM Bullet (Cambrex, Verviers, Bélgica) , pero cultivado en RPMl 1640, 10 % de FCS en la presencia de 50 ng/ml de IL-lß (Strathmann Biotech, Hamburg, Alemania) para la inducción de la producción de GM-CSF. Después de la incubación de 48 horas a 37 °C, al 5 % de C02, el sobrenadante del cultivo fue analizado para aplicar su contenido de GM-CSF utilizando el conjunto de OptEIA Humano GM-CSF Elisa (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El hGM-CSF recombinante de E . coli fue producido internamente como se describe en el ejemplo 1.1 de WO 2005/105844. El hGM-CSF recombinante de la levadura fue obtenido comercialmente bajo el nombre registrado "Leukine" (Berlex, EUA) . El GM-CSF del macaco fue producido recombinantemente en las células HEK293. Una serie de diluciones del medio condicional que contiene el hGM-CSF natural, así como el hGM-CSF recombinante de E . coli y la levadura, y el GM-CSF del macaco, fueron probados primero para verificar su potencia para inducir la proliferación de TF-1. La totalidad de las tres variantes de glicosilación de GM-CSF humano y el GM-CSF de macaco exhibieron valores de EC50 muy semejantes para la activación de TF-1. Estos fueron 10 pg/ml para el hGM-CSF producido de E . coli , 15 pg/ml para hGM-CSF producido por levadura, 36 pg/ml para el hGM-CSF producido por las células del pulmón humano, y 11 pg/ml para el GM-CSF del macaco, respectivamente (figura 14A) . La actividad neutralizante de IgG B fue determinada entonces en la presencia de 0.3 ng/ml de hGM-CSF recombinante, o 0.2 ng/ml de hGM-CSF fisiológico. Después de 72 horas, el estado proliferativo de las células de TF-1 en la presencia de diferentes concentraciones de IgG B fue cuantificada por una reacción colorimétrica (figura 14B) . Tomados conjuntamente, los datos mostrados en las figura 14 muestran que el IgG B inhibió la proliferación dependiente de GM-CSF de las células TF-1 a concentraciones sub-nanomolares aparentemente de manera independiente de la configuración de glicosilación de GM-CSF humano. La configuración de glicosilación del GM-CSF humano por lo tanto substancialmente no tiene influencia en la capacidad de IgG B para neutralizar la actividad de GM-CSF. Ejemplo 10 : Efecto de IgG B en las actividades biológicas de GM-CSF sobre los eosinófilos Ejemplo 10.1: Efecto de IgG B sobre la supervivencia de los eosinófilos mediados por GM-CSF Una de las diversas actividades biológicas de GM-CSF es la prolongación de la supervivencia de los granulocitos eosinofílicos y neutrofílicos . A causa de que las enfermedades inflamatorias del pulmón están asociadas con la acumulación local de eosinófilos, que desempeñan un papel substancial en el mantenimiento de la inflamación, la eficacia de IgG B en la inhibición de la supervivencia de los eosinófilos mediada por GM-CSF fue probada. Los eosinófilos fueron aislados de la sangre periférica de los donadores sanos por el agotamiento de los eosinófilos de DC16+ a partir de la población de granulocitos obtenida por centrifugación del gradiente de densidad y la lisis de los eritrocitos. Los eosinófilos de la sangre periférica aislados recientemente fueron sembrados en una densidad de 5 x 104 células/cavidad en RPMl 1640/10 % de FCS y Pen/Strep en una placa de microprueba de fondo plano de 96 cavidades. El GM-CSF fue agregado en una serie de diluciones que varía desde 33 ng/ml hasta 10 pg/ml para verificar la supervivencia de los eosinófilos dependiente de la concentración. Para analizar el potencial de inhibición de IgG B sobre la supervivencia de los eosinófilos dependiente de GM-CSF, los anticuerpos fueron agregados en una serie de diluciones que varían desde 10 µg/ml hasta 0.1 ng/ml. Una concentración final de 0.1 ng/ml de GM-CSF fue utilizada para efectuar la supervivencia de los eosinófilos. Después de la incubación durante 72 h a 37 °C, al 5 % de C02, se agregó el reactivo de WST-1. La reacción colorimétrica resultante correspondiente a la porción de las células viables fue cuantificada por la medición de la absorbancia a 450 nm. Los datos fueron analizados y ajustados para la inhibición intermedia máxima de la supervivencia (IC50) utilizando el ajuste de la curva de regresión no lineal del paquete de software Prism. Como se observa en la figura 15A, una dosis efectiva intermedia máxima (EC50), de 0.02 ng/ml de rhGM-CSF fue determinada. Como se observa en la figura 15B, un efecto neutralizante potente de IgG B fue observado como en una inhibición intermedia máxima de la supervivencia de los eosinófilos a una concentración de anticuerpos de 0.13 nM. Estos datos indican que el IgG B es efectivo en la inhibición de la supervivencia de los eosinófilos dependientes de GM-CSF de una manera dependiente de la dosis. Ejemplo 10.2: Efecto de IgG B sobre la activación de los eosinófilos inducida por GM-CSF También fue deseable investigar el efecto de IgG B sobre la activación inducida por GM-CSF de los eosinófilos. La expresión de CD69 se encontró que va a ser regulada ascendentemente sobre los eosinófilos periféricos (CD16) aislados de la sangre humana después de la estimulación durante 20 h o 3 días con: (a) 0.1 ng/ml de GM-CSF o (b) 0.1 ng/ml de GM-CSF, IL-3 e IL-5, pero no con (c) 0.1 ng/ml de IL-3 e IL-5 solo (figura 16A) . Los eosinófilos cultivados en la presencia del medio solo no mostraron regulación ascendente de CD69. El CD69 puede ser tomado por lo tanto como un marcador para la activación de los eosinófilos por GM-CSF, y el nivel de expresión de CD69 fue verificado como una medida de la activación de los eosinófilos dependiente de GM-CSF. En ambos instantes del tiempo (20 h y 3 días) , el IgG B (10 µg/ml) casi previno completamente la activación dependiente de GM-CSF de los eosinófilos, como se observa por la falta de la expresión de CD69 en la citometría de flujo. Los eosinófilos fueron aislados como se describió anteriormente en el ejemplo 10.1 y se cultivaron a una densidad de 5 x 105 células/cavidad en RPMl 1640/10 % de FCS y Pen/Strep en una placa de microprueba de fondo plano de 48 cavidades. Las células fueron incubadas en el medio solo o en la presencia de 0.1 ng/ml de GM-CSF solo o junto con 0.1 ng/ml de IL-3 o IL-5. 10 µg/ml de IgGB fueron utilizados para la neutralización de GM-CSF. Después de una incubación de 1 ó 3 días, las células fueron analizadas para la expresión de CD69 por citometría de flujo. Detección de CD69 por citometría de flujo: La expresión de CD69 sobre los eosinófilos fue determinada sobre un instrumento FACS Calibur (Becton Dickinson) . 105 células fueron incubadas con 5 µl de un CD16 anti-humano, conjugado con FITC (clon 3G8, BD Biosciences) y un anticuerpo de CD69 anti-humano conjugado con PE (clon FN50, BD Biosciences) cada uno durante 1 h a 4 °C. Como un control negativo se utilizaron anticuerpos conjugados con FITC y PE, igualados en los isotipos, irrelevantes. Después de la inoculación, las células fueron lavadas dos veces con PBS, FCS al 1 %, NaN3 al 0.05 % y se resuspendieron en 250 µl de PBS, 1 % de FCS, 0.05 % de NaN3. Se agregó yoduro de propidio para etiquetar las células muertas hasta una concentración final de 1 µg/ml inmediatamente antes del análisis de FACS. La interpretación de los datos se hizo utilizando el software CellQuestPro (BD Biosciences) . Las células positivas al yoduro de propidio (es decir, muertas) fueron excluidas del análisis de la expresión de CD69. El IgG B también redujo el porcentaje de eosinófilos vivos y activados como se verifica por el teñido con yoduro de propidio de las células CD16"/CD69+ de 0.1 ng/ml de GM-CSF. El IgG B redujo el porcentaje de las células activadas desde el 35 % hasta el 8 % después de 1 día y desde 43 % hasta 3 % después de 3 días de cultivo. En la presencia de 0.1 ng/ml de GM-CSF, IL-3 e IL-5, el porcentaje de eosinófilos vivos y activados, fue reducido desde 32 % hasta 8 %, y desde 48 % hasta 11 % después de 1 y 3 días, respectivamente. Aún cuando la regulación ascendente de CD69 fue inhibida completamente por IgG B, los números más elevados de los eosinófilos en reposo ( CDl 6~/CD69+ ) sobrevivieron durante 3 días en la presencia de 0.1 ng/ml de GM-CSF, IL-3 e IL-5 cuando se compara con las células incubadas con el medio o GM-CSF solo (figura 16A, última columna) . Lo mismo fue observado para las células incubadas en la presencia de 0.1 ng/ml de IL-3 más IL-5. En los experimentos de encuentro de la dosificación, el IgG B fue agregado en series de dilución a los eosinófilos cultivados en la presencia de 0.1 ng/ml de GM-CSF (figura 16B) . Un efecto inhibidor de IgG B sobre la intensidad de la fluorescencia promedio dependiente de CD69 (MFI) fue observado a una concentración intermedia máxima de IgG B 0.22 nM. Tomados conjuntamente, estos datos indican que IgG B es un neutralizador efectivo de la actividad de GN-CSF en un contexto biológico altamente relevante para las enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias, por ejemplo el asma.
Ejemplo 11: Los estudios de la toxicología ex vivo preliminares utilizando IgG B Como se explicó anteriormente, la neutralización de la actividad de GM-CSF puede ser ventajosa terapéuticamente en un número de medios ambientes de enfermedad. Sin embargo, al mismo tiempo, el GM-CSF desempeña un papel importante en la función normal del sistema inmune en el combate de los patógenos exógenos, por ejemplo como en la fagocitosis por los granulocitos de los neutrófilos y los monocitos. Esta función natural de los neutrófilos y los monocitos deben permanecer sin afectar en la presencia de cantidades terapéuticas de IgG B. Por lo tanto, se investigaron dos aspectos del proceso fagocítico: 1) ingestión de bacterias (fagocitosis); y 2) actividad de ráfagas oxidantes (indicativo para el exterminio intracelular) . Estos estudios están detallados en los siguientes ejemplos. Ejemplo 11.1: Ingestión de bacterias (fagocitosis) La determinación de la actividad fagocítica de los granulocitos y monocitos en la sangre entera heparinizada fue efectuada utilizando el kit Phagotest por Orpegen (Heidelberg, Alemania) . Esta prueba está basada en la ingestión de E . coli etiquetado por fluorescencia, optimizado, por las células fagocíticas. Estas células pueden ser detectadas entonces por la fluorescencia verde en la citometría de flujo. 20 µl de la E . coli opsonizada, etiquetada por fluorescencia, fueron agregadas a 100 µl de la sangre entera heparinizada y se incubaron a 37 °C. La incubación a 0 °C fue efectuada como un control negativo. Después de 10 minutos, el proceso fagocítico fue detenido por el enfriamiento de las muestras sobre hielo y la adición de 100 µl de la solución de Apagado (Orpegen) . Esta solución permite la discriminación de la fijación e internalización de bacterias por el apagado de la fluorescencia de FITC de las bacterias unidas a la superficie mientras que la fluorescencia de las partículas internalizadas permaneció sin afectar. Después de tres etapas de lavado con 3 ml de la solución de lavado (Orpegen), los eritrocitos fueron lisados. Los leucocitos restantes fueron lavados una vez con 3 ml de la solución de Lavado (Orpegen) . Después de la adición de 200 µl de la solución de teñido de ADN, que permite la exclusión de las bacterias o células agregadas, las células fueron analizadas por citometría de flujo. El porcentaje de células que tienen la fagocitosis efectuada fue determinado por medio de la fluorescencia de FITC. Para determinar la influencia de IgG B sobre la fagocitosis, el IgG B fue agregado a tres muestras de sangre idénticas a una concentración de sangre final de 10 µg/ml. Estas tres muestras se dejó entonces que se incuben a 37 °C con IgG B para varias cantidades de tiempo previo a la adición de E . col i . E . col i fueron agregados a la primera muestra inmediatamente, mientras que E . coli fue agregado a la segunda y tercera muestras después de 24 y 48 horas, respectivamente . Resultados observados para los granulocitos: directamente después que la sangre fue tomada, arriba del 98 % de los granulocitos ingirieron bacterias ya sea en la presencia o ausencia de IgG B (figura 17A) . Después de incubación de las muestras de sangre con IgG B durante 24 h una reducción hasta aproximadamente 92 % fue determinada sin IgG B y hasta 90 % en la presencia de IgG B (figura 17B) . Después de 48 h, 81 % de los granulocitos fueron positivos a la fagocitosis en la ausencia y 89 % en la presencia de IgG B (figura 17C) . Resultados observados para monocitos: Sin importar si el IgG B está presente o no, 98 % de los monocitos fueron fagocitados directamente después que la sangre fue tomada (figura 18A) . Después de 24 horas de pre-incubación con IgG B 90 % de los monocitos fueron positivos (figura 18B) . Después de 24 h de pre-incubación sin IgG B existieron 92 % de monocitos. Después de 48 h se encontraron 81 % de los monocitos sin IgG B y 89 % con IgG B positivos a la fagocitosis (figura 18C) . Ejemplo 11.2: Ráfagas oxidantes La determinación de la actividad de ráfaga oxidante de los granulocitos y monocitos en la sangre entera heparinizada fue efectuada utilizando el kit Phagoburst por Orpegen (Heidelberg, Alemania) . Este ensayo permite la determinación del porcentaje de las células fagocíticas que producen los oxidantes reactivos por la oxidación de la dihidro-rodamina (DHR) 123 del substrato con respecto al R 123 fluorescente. Las células que exhiben la actividad de las ráfagas oxidantes pueden ser identificadas en la citometría de flujo. La sangre heparinizada fue incubada con diferentes estímulos para inducir la actividad de ráfagas oxidantes: 12-acetato 13—acetato de forbol ("PMA") como un estímulo elevado, el E . col i opsonizado, no etiquetado, como un estímulo intermedio y el N-formil-MetLeuPhe del péptido quimiotáctico (fMLP) como un estímulo bajo. 100 µl de la sangre entera fueron incubados con estos estímulos a 37 °C. Como un control negativo, la incubación fue efectuada sin estimulación. Después de 10 minutos, de incubación la solución del substrato de DHR 123 fue agregada e incubada durante otros 10 minutos. El DHR 123 es convertido al R 123 fluorescente por la oxidación de las células. Después de tres etapas de lavado con 3 ml de la solución de lavado (Orpegen), los eritrocitos fueron lisados. Los leucocitos restantes fueron lavados entonces con 3 ml de la solución de Lavado (Orpegen) . Después de la adición de 200 µl de la solución para el teñido de ADN, que permite la exclusión de las bacterias o células agregadas, las células fueron analizadas por citometría de flujo. Para determinar la influencia de IgG B sobre las ráfagas oxidantes, IgG B fue agregado a tres muestras de sangre idénticas hasta una concentración final de 10 µg/ml. Cada una de estas tres muestras fue dividida entonces en tres alícuotas y se dejaron incubar a 37 °C para varias cantidades de tiempo previo a la adición, para separar las alícuotas, de E . co l i , fMLP o PMA. La E . co l i , fMLP o PMA fueron agregadas a las tres alícuotas de la primera muestra independientemente, mientras que E . co l i , fMLP o PMA fueron agregados a las tres alícuotas de la segunda y tercera muestras después de 24 y 48 horas, respectivamente. Las muestras de sangre paralelas que carecen de IgG B fueron tratadas idénticamente como anteriormente como los controles. Los resultados son mostrados posteriormente en la tabla 4, en donde "+" en la segunda columna de la izquierda indica que IgG B está presente en la alícuota de la muestra probada, y "-" en la segunda columna desde la izquierda indica el control libre de IgG B.
Tabla 4: Efecto de IgG sobre el comportamiento de ráfaga oxidante de los granulocitos Se obtuvieron resultados semejantes utilizando los monocitos en lugar de los granulocitos. El experimento fue efectuado de manera análoga como se describió anteriormente y los resultados son mostrados posteriormente en la tabla 5, en donde "+" en la segunda columna de la izquierda indica que IgG B está presente en la alícuota de muestreo probada, y "-" en la segunda columna de la izquierda indica el control libre de IgG B. Tabla 5: Efecto de IgG B sobre el comportamiento de ráfagas oxidantes de los monocitos Por lo general, se puede concluir por lo tanto que la presencia de IgG B a las temperaturas fisiológicamente relevantes no afecta adversamente la fagocitosis o exterminio oxidante de las bacterias ya sea por los granulocitos o monocitos. En un contexto in vivo, estos resultados sugieren entonces, que la administración terapéutica de IgG B no se podría esperar que afecte adversamente las defensas inmunes normales del paciente. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, caracterizado porque se enlaza específicamente a, y neutraliza el GM-CSF de primate. 2. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primate es un ser humano o un primate no humano. 3. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el primate no humano es un mono cinomolgous, un mono resus o un gibón. 4. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo es un IgG. 5. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el IgG es un IgGl o IgG4. 6. El fragmento del anticuerpo monoclonal humano de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el fragmento es un scFv, un anticuerpo de un solo dominio, un Fv, un anticuerpo de VHH, un diacuerpo, un diacuerpo en serie, un Fab, un Fab' o un F(ab)2. 7. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, se enlaza específicamente a un epítopo, preferentemente un epítopo discontinuo, de GM-CSF de primate que comprende los aminoácidos 23-27 (RRLLN) y/o los aminoácidos 65-77 (GLR/QGSLTKLKGPL) . 8. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el epítopo discontinuo comprende además los aminoácidos 28-31 (LSRD) . 9. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el epítopo discontinuo comprende además los aminoácidos 32-33 (TA) y/o los aminoácidos 21-22 (EA) . 10. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende en su región variable de cadena pesada un CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste de aquellos descritos en cualesquiera de SEC ID NOs: 1-13 o 56. 11. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque cualesquiera de las secuencias de CDR3 de la región variable de cadena pesada existe junto con una región variable de cadena pesada con la secuencia de CDRl de la región variable de cadena pesada descrita en la SEC ID NO: 14 y la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada descrita en SEC ID NO: 15. 12. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque comprende en su región variable de cadena ligera un CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 16, un CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la SEC ID NO: 17, y un CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID NO: 18. 13. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque comprende además en su región variable de cadena ligera una secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEC ID NOs: 19, 54 ó 55. 14. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 10-13, caracterizado porque comprende en su región variable de cadena pesada una secuencia de aminoácidos como se describe en las SEC ID NOs: 20-33, 52 ó 53. 15. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende en su región variable de cadena ligera un CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 16, un CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 17 y un CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 18; y que comprende en su región variable de cadena pesada una región de CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID NO: 14, una región de CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en SEC ID NO: 15 y un CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en cualesquiera de las SEC ID NOs: 1-13 ó 56. 16. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 10-15, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera como se describe en la SEC ID NO: 34 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada como se describe en cualesquiera de las SEC ID NOs: 35-48. 17. El anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 10-16, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que lleva al menos 70 % de homología con respecto a la secuencia de aminoácidos respectiva como se describe en cualesquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56. 18. Una molécula de polinucleótidos, caracterizada porque tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se describe en cualesquiera de las SEC ID NOs: 1-48, y/o 52 a 56 o una secuencia de nucleótidos que exhibe al menos 70 % de homología con la misma, en donde la homología puede ser determinada comparando una molécula de polinucleótidos que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de cualesquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56 con una molécula de polinucleótidos que tiene una secuencia de nucleótidos en cuestión por la alineación de la secuencia, en donde un nucleótido en la secuencia en cuestión se considera homologa si es ya sea idéntica con respecto al nucleótido correspondiente en la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente de cualesquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56 o si una O más desviación (es) de nucleótidos de la secuencia en cuestión desde uno o más nucleótido ( s) correspondientes en la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de cualesquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56 conduce una tripleta de nucleótidos la cual, cuando es traducida, conduce a un aminoácido que es idéntico a (debido a una tripleta degenerada) o una substitución conservadora del aminoácido correspondiente en la secuencia de aminoácidos correspondiente de cualesquiera de las SEC ID NOs: 1-48 y/o 52-56. 19. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-17 o la molécula de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 18. 20. El uso de un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-17 o de la molécula de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 18 en la manufactura de un medicamento, que comprende opcionalmente uno o más agentes inflamatorios, para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias . 21. El uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde las enfermedades inflamatorias son elegidas del grupo que consiste de artritis reumatoide (incluyendo la artritis reumatoide que es resistente al tratamiento con neutralizadores de TNF-alfa) , asma, esclerosis múltiple, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, síndrome de tensión respiratoria aguda, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad inflamatoria del intestino, uveítis, degeneración macular, colitis, psoriasis, degeneración de Wallerian, síndrome de antifosfolípidos, síndrome coronario agudo, restinosis, ateroesclerosis, síndrome relapsante, hepatitis aguda o crónica, implantes ortopédicos que han fallado, glomerulonefritis, lupus o enfermedades autoinmunes. 22. El uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-17 o de la molécula de polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 18 en la manufactura de un medicamento, que comprende opcionalmente uno o más agentes anticáncer adicionales, para el tratamiento de una enfermedad tumorigénica u otra condición con apoptosis celular retardada, supervivencia o proliferación celular incrementada. 23. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde la enfermedad tumorígena es un cáncer. 24. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde el cáncer es la leucemia, mieloma múltiple, carcinoma gástrico o carcinoma de la piel.
MX2007012569A 2005-04-18 2006-04-18 Neutralizadores de anticuerpos del factor estimulante de la colonia de macrofagos-granulocitos humanos. MX2007012569A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05008410 2005-04-18
PCT/EP2006/003528 WO2006111353A2 (en) 2005-04-18 2006-04-18 Antibody neutralizers of human granulocyte macrophage colony stimulating factor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2007012569A true MX2007012569A (es) 2007-12-06

Family

ID=37115507

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2007012569A MX2007012569A (es) 2005-04-18 2006-04-18 Neutralizadores de anticuerpos del factor estimulante de la colonia de macrofagos-granulocitos humanos.

Country Status (28)

Country Link
US (3) US8017748B2 (es)
EP (2) EP1874819B1 (es)
JP (1) JP5085533B2 (es)
KR (2) KR20150091193A (es)
CN (2) CN103342751B (es)
AU (1) AU2006237159B2 (es)
BR (1) BRPI0608281B8 (es)
CA (1) CA2605402C (es)
CY (1) CY1116632T1 (es)
DK (1) DK1874819T3 (es)
EA (2) EA017420B9 (es)
ES (1) ES2545769T3 (es)
HR (1) HRP20150773T1 (es)
HU (1) HUE025134T2 (es)
IL (2) IL186486A0 (es)
ME (1) ME02191B (es)
MX (1) MX2007012569A (es)
NO (1) NO344249B1 (es)
NZ (1) NZ562093A (es)
PL (1) PL1874819T3 (es)
PT (1) PT1874819E (es)
RS (1) RS54127B1 (es)
RU (2) RU2458071C2 (es)
SG (1) SG161292A1 (es)
SI (1) SI1874819T1 (es)
UA (1) UA94403C2 (es)
WO (1) WO2006111353A2 (es)
ZA (1) ZA200708201B (es)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150091193A (ko) 2005-04-18 2015-08-07 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 인간 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자의 중화 항체
JP4736037B2 (ja) 2005-10-26 2011-07-27 株式会社イーベック ヒトｇｍ−ｃｓｆに結合するヒトのモノクローナル抗体並びにその抗原結合部分
RS55526B1 (sr) * 2006-02-08 2017-05-31 Morphotek Inc Antigenski gm-csf peptidi i antitela gm-csf
US20080171038A1 (en) * 2006-11-08 2008-07-17 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating idiopathic thrombocytopenia purpura using a gm-csf antagonist
US8398972B2 (en) 2006-11-21 2013-03-19 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating dementia using a GM-CSF antagonist
EP2121755A1 (en) * 2007-02-08 2009-11-25 Merck & Co., Inc. Antibodies specific for dkk-1
EP2160407A4 (en) * 2007-05-23 2011-07-27 Crc For Asthma And Airways Ltd NEUTRALIZING ANTIBODIES
TW200918553A (en) 2007-09-18 2009-05-01 Amgen Inc Human GM-CSF antigen binding proteins
BRPI0820530A2 (pt) * 2007-11-13 2015-06-16 Boehringer Ingelheim Int Anticorpos monoclonais que se ligam ao hgm-csf e composições medicinais compreendendo os mesmos
PT2708559T (pt) * 2008-04-11 2018-05-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de ligação ao antigénio capaz de se ligar repetidamente a duas ou mais moléculas de antigénio
EA201001691A1 (ru) 2008-04-28 2011-10-31 Калобайос Фармасьютикалз, Инк. Антитела к гранулоцитарно-макрофагальному колониестимулирующему фактору
EA024654B1 (ru) * 2008-04-29 2016-10-31 Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх Ингибиторы гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (gm-csf) и интерлейкина-17 (il-17) для терапии
RU2366422C1 (ru) * 2008-05-19 2009-09-10 Государственное учреждение Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН) Способ коррекции депрессии гранулоцитопоэза при цитостатическом воздействии
RU2712273C2 (ru) * 2008-12-22 2020-01-28 Де Юниверсити Оф Мельбурн Лечение остеоартрита
ES2978209T3 (es) 2008-12-22 2024-09-09 Univ Melbourne Tratamiento del dolor
JP2012530047A (ja) * 2009-05-05 2012-11-29 モルフォシス・アー・ゲー 多発性硬化症のための治療
EP3604330A1 (en) 2011-02-25 2020-02-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fcgammariib-specific fc antibody
US20140234298A1 (en) 2011-07-06 2014-08-21 Morphosys Ag Therapeutic combinations of anti-cd20 and anti-gm-csf antibodies and uses thereof
WO2013090989A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Csl Limited Method of treating inflammatory bowel disease
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
EP2914289B1 (en) 2012-10-31 2019-05-22 Takeda GmbH Lyophilized formulation comprising gm-csf neutralizing compound
AR093297A1 (es) * 2012-10-31 2015-05-27 Amgen Res Munich Gmbh Formulacion liquida que comprende un compuesto neutralizante de gm-csf
WO2014138862A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 John Schrader Human monoclonal antibodies that neutralize bioactivity of granulocyte macrophage colony-stimulating factor and methods and uses thereof
US10745475B2 (en) * 2013-08-30 2020-08-18 Takeda Gmbh Antibodies neutralizing GM-CSF for use in the treatment of rheumatoid arthritis or as analgesics
WO2015028666A1 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 Takeda Gmbh Neutralizing antibody or a fragment thereof specifically binding primate gm-csf for use in the treatment and/or prevention of psoriasis
US9765142B2 (en) 2013-10-11 2017-09-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services TEM8 antibodies and their use in treatment and detection of tumors
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
BR112016025126B1 (pt) * 2014-05-07 2024-02-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited Composição aquosa compreendendo anticorpo neutralizante de gmcsf, e uso da mesma
WO2016077789A1 (en) 2014-11-14 2016-05-19 The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
WO2016079276A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 Takeda Gmbh Use of an anti-gm-csf antagonist and an anti-ccr2 antagonist in the treatment of an infectious disease
WO2016079277A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 Takeda Gmbh Use of an anti-gm-csf antagonist in the treatment of an infectious disease
WO2016138160A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
GB201503139D0 (en) * 2015-02-25 2015-04-08 Univ Leicester Diagnostic and therapeutic target
ES2789348T3 (es) 2015-03-20 2020-10-26 Us Health Anticuerpos neutralizantes para GP120 y sus usos
EP3359570A1 (en) 2015-10-07 2018-08-15 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Il-7r-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
GB201519331D0 (en) * 2015-11-02 2015-12-16 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Treatment paradigm
CN115010805B (zh) 2015-11-03 2025-01-28 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) Hiv-1 gp41中和抗体及其用途
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
CN106872428A (zh) * 2017-02-07 2017-06-20 远见生物科技（上海）有限公司 一种用于检测中性粒细胞呼吸爆发功能的试剂盒
EP3580235B1 (en) 2017-02-10 2024-05-01 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
US10899831B2 (en) 2017-10-02 2021-01-26 Humanigen, Inc. Method of reducing the level of non-GM-CSF cytokines/chemokines in immunotherapy-related toxicity
US10927168B2 (en) 2017-10-02 2021-02-23 Humanicen, Inc. Method of reducing tumor relapse rate in immunotherapy by administration of lenzilumab
US11130805B2 (en) 2017-10-02 2021-09-28 Humanigen, Inc. Methods of treating CART-T cell therapy-induced neuroinflammation using a GM-CSF antagonist
US10870703B2 (en) 2017-10-02 2020-12-22 Humanigen, Inc. Methods of treating immunotherapy-related toxicity using a GM-CSF antagonist
WO2019082869A1 (ja) 2017-10-24 2019-05-02 アドバンスト・ソフトマテリアルズ株式会社 低包接率ポリロタキサンの製造方法
US11976109B2 (en) 2018-01-02 2024-05-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
CA3091437A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
CN112805301B (zh) * 2018-10-15 2023-07-21 安立玺荣生医(香港)有限公司 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的抗体及其用途
US11078264B2 (en) 2018-10-17 2021-08-03 University Of Connecticut Inhibiting granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) prevents preterm birth
EP3883609A2 (en) 2018-12-20 2021-09-29 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Ebola virus glycoprotein-specific monoclonal antibodies and uses thereof
US12269872B2 (en) 2019-05-03 2025-04-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to Plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
US20230085439A1 (en) 2019-05-21 2023-03-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Antibodies that bind human metapneumovirus fusion protein and their use
EP3994173A1 (en) 2019-07-02 2022-05-11 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Monoclonal antibodies that bind egfrviii and their use
WO2021204649A1 (en) 2020-04-06 2021-10-14 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Gm-csf antagonists for use in the treatment of severe pulmonary covid-19, cytokine release syndrome and/or acute respiratory distress syndrome
WO2022132904A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
US20240117011A1 (en) 2021-02-09 2024-04-11 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies targeting the spike protein of coronaviruses
EP4291306A1 (en) 2021-02-09 2023-12-20 University of Georgia Research Foundation, Inc. Human monoclonal antibodies against pneumococcal antigens
EP4402165A1 (en) 2021-09-17 2024-07-24 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Synthetic humanized llama nanobody library and use thereof to identify sars-cov-2 neutralizing antibodies
US20250145690A1 (en) 2022-02-10 2025-05-08 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that broadly target coronaviruses
EP4499228A1 (en) 2022-03-28 2025-02-05 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2024030829A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind to the underside of influenza viral neuraminidase
WO2024054822A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineered sars-cov-2 antibodies with increased neutralization breadth
WO2024064826A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
EP4638491A1 (en) 2022-12-19 2025-10-29 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Monoclonal antibodies for treating sars-cov-2 infection
WO2024138151A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Ebolavirus (sudan and zaire) antibodies from non-human primates and human vaccinees
WO2024243355A1 (en) 2023-05-24 2024-11-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that target the rh5 complex of blood-stage plasmodium falciparum
WO2025014896A1 (en) 2023-07-07 2025-01-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Humanized 40h3 antibody
WO2025024233A1 (en) 2023-07-21 2025-01-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific antibodies that broadly target coronaviruses
WO2025106427A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing and protective monoclonal antibodies against respiratory syncytial virus (rsv)
WO2025117384A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Broadly neutralizing influenza hemagglutinin stem-directed antibodies
WO2025137284A2 (en) 2023-12-21 2025-06-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Broadly neutralizing antibodies against sars-cov-2 and sars-cov variants

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8624899D0 (en) * 1986-10-17 1986-11-19 Sandoz Ltd Monoclonal antibodies
US5070013A (en) * 1988-05-31 1991-12-03 Schering Corporation Immunochemical assay for human granulocyte-macrophage colony stimulating factor
CA2060741A1 (en) 1991-02-11 1992-08-12 Robert S. Greenfield Gm-csf inhibiting oligopeptides
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
DE69834032T2 (de) 1997-04-23 2006-12-07 Universität Zürich Verfahren zur erkennung von nucleinsäuremolekülen codierend für (poly)peptide, welche mit zielmolekülen interagieren
GB9722131D0 (en) * 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
KR100508289B1 (ko) 1998-04-21 2005-08-17 마이크로메트 에이지 Ｃｄ１９×ｃｄ３ 특이 폴리펩티드 및 그의 용도
US7157091B1 (en) * 1999-06-18 2007-01-02 Ludwig Institute For Cancer Research MAGE-A1 peptides presented by HLA class II molecules
AU2001232267A1 (en) 2000-02-14 2001-08-20 Japan As Represented By Director General Of Agency Of National Institute Of Infectious Deseases Remedies for hepatitis c
US20050271663A1 (en) * 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
ES2365606T3 (es) * 2002-02-13 2011-10-07 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Anticuerpos contra gm-csf quiméricos.
EP1593690B1 (en) * 2004-05-05 2009-07-01 Micromet AG Preparation of ScFv antibody fragments
KR20150091193A (ko) * 2005-04-18 2015-08-07 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 인간 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자의 중화 항체
BRPI0610796B8 (pt) 2005-05-18 2021-05-25 Morphosys Ag anticorpo humano ou humanizado isolado, ou um fragmento fab ou scfv do mesmo, sequência de ácidos nucleicos, vetor, e, uso de um anticorpo
RS55526B1 (sr) 2006-02-08 2017-05-31 Morphotek Inc Antigenski gm-csf peptidi i antitela gm-csf

Also Published As

Publication number Publication date
US8017748B2 (en) 2011-09-13
SG161292A1 (en) 2010-05-27
US9067993B2 (en) 2015-06-30
US20160130338A1 (en) 2016-05-12
BRPI0608281B1 (pt) 2020-01-28
EP1874819B1 (en) 2015-05-27
RS54127B1 (sr) 2015-12-31
BRPI0608281A2 (pt) 2009-12-15
HK1190161A1 (zh) 2014-06-27
WO2006111353A2 (en) 2006-10-26
UA94403C2 (ru) 2011-05-10
IL220412A0 (en) 2012-07-31
PL1874819T3 (pl) 2015-10-30
IL220412A (en) 2017-04-30
JP2008536505A (ja) 2008-09-11
JP5085533B2 (ja) 2012-11-28
AU2006237159B2 (en) 2011-03-24
DK1874819T3 (en) 2015-08-31
RU2007138341A (ru) 2009-05-27
US20120009195A1 (en) 2012-01-12
CN101184777B (zh) 2013-07-17
EP1874819A2 (en) 2008-01-09
EA013162B1 (ru) 2010-02-26
ZA200708201B (en) 2008-07-30
KR20150091193A (ko) 2015-08-07
HK1112003A1 (en) 2008-08-22
CY1116632T1 (el) 2017-03-15
US10138297B2 (en) 2018-11-27
WO2006111353A3 (en) 2007-04-19
NO344249B1 (no) 2019-10-21
CN103342751A (zh) 2013-10-09
ME02191B (me) 2016-02-20
HRP20150773T1 (hr) 2015-08-28
EA200702008A1 (ru) 2008-06-30
CN101184777A (zh) 2008-05-21
NZ562093A (en) 2011-01-28
EP2468774A3 (en) 2013-01-02
RU2458071C2 (ru) 2012-08-10
EP2468774A2 (en) 2012-06-27
KR20080005962A (ko) 2008-01-15
EA017420B9 (ru) 2013-03-29
SI1874819T1 (sl) 2015-09-30
US20090297532A1 (en) 2009-12-03
HUE025134T2 (en) 2016-01-28
ES2545769T3 (es) 2015-09-15
KR101704809B1 (ko) 2017-02-08
BRPI0608281B8 (pt) 2021-05-25
CA2605402A1 (en) 2006-10-26
AU2006237159A1 (en) 2006-10-26
PT1874819E (pt) 2015-09-17
NO20075802L (no) 2008-01-10
CN103342751B (zh) 2015-12-23
EA200901500A1 (ru) 2010-10-29
RU2012115683A (ru) 2013-10-27
EA017420B1 (ru) 2012-12-28
IL186486A0 (en) 2008-01-20
CA2605402C (en) 2017-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9067993B2 (en) Antibody neutralizers of human granulocyte macrophage colony stimulating factor
US9279017B2 (en) Preparation of scFv antibody fragments
JP2020536118A (ja) Ｇｍ−ｃｓｆアンタゴニストを使用した免疫療法関連毒性の治療方法
CN118791606B (zh) 双特异性抗体及其应用
CN118791607B (zh) 双特异性抗体及其应用
KR20140047170A (ko) 인간 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자의 중화 항체
HK1112003B (en) Antibody neutralizers of human granulocyte macrophage colony stimulating factor
HK1171029A (en) Antibody neutralizers of human granulocyte macrophage colony stimulating factor
HK1190161B (en) Antibody neutralizers of human granulocyte macrophage colony stimulating factor
CN118791606A (zh) 双特异性抗体及其应用
CN118791607A (zh) 双特异性抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration
HC Change of company name or juridical status