MX2007007503A - Uso de antibioticos de dicetoditiopiperazina para la preparacion de composiciones farmaceuticas anti-angiogenicas. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al uso de antibioticos de dicetoditiopiperazina, en particular caetocina y gliotoxina, para la preparacion de composiciones farmaceuticas para terapia anti-tumor.

Description

USO DE ANTIBIÓTICOS DE DICETODITIOPIPEPAZINA PARA LA PREPARACIÓN DE COMPOSICONES FARMACÉUTICAS ANTI-ANG OGENICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de antibióticos de dicetoditiopiperazina, en particular caetocina y gliotoxina, para la preparación de medicamentos con actividad anti-angiogénica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Caetocina (I) (I) (II) son ejemplos representativos de antibióticos de epipolitiodioxopiperazina, los cuales son metabolitos secundarios de hongos filamentosos que tienen actividad anti-microbiana y citotóxica producidos por hongos de la cepa Chaetomiun (C. Leigh, A. Taylor, Mycotoxins and other fungal metaboli tes rela ted food problems, ed. J.V. Rodricks, p. 228, Am. Chem. Soc, Washington, D.C., 1976; G.W. Kirby, DJ. Robins, The Biosyn thesis of Mycotoxins, ed. P.S. Stenyl, p. 301, Academic Press, New York, 1980). Para el aislamiento de caetocina a partir de cultivos de cepas de Chaetomium sp. , asignado a un C. thielavioideum, y a partir de una cepa de Farrowia sp . , véase también S. Udagawa et al . , The production of chaetoglobosins , sterigma tocysti , O-methylsterigma tocystin , and chaetocin by Chaetomi um spp . and rela ted fungi , Can. J. Microbiol. 1979, 25(2):170-7 y S. Sekita, et al . , Mycotoxin production by Chaetomium spp . and rela ted fungi , Can. J. Microbiol. 1981, 2 (8) : 766-72) . Los compuestos de esta clase se caracterizan por la presencia de un puente de disulfuro. Además de caetocina y caetomina, los ejemplos adicionales de epipolitiodioxopiperazinas son gliotoxina (III) (III) (P. Waring, J. Baever, Gliotoxin and rela ted epipoli thiodioxopiperazines, Gen Pharmacol. 27, 1311-1316, 1996), esporidesmina (Chem. Ber. 105(11): 3658-61, 1972), aranotina (N. Neuss et al . , Aranotin and rela ted metaboli tes . II. Isola tion , Characteriza tion and structures of two new metaboli tes, Tetrahedron Letters, 42, 4467-4471, 1968), verticilina (Chem. Ber. 105 (11) : 3658-61, 1972), melinacidina (F. Reusser, Mode of Action of Melinacidin, an Inhibitor of Nicotinic Acid Biosynthesis; J. Bacteriol. 96(4): 1285-1290, 1968) y orizaclorina (también conocida como antibiótico A-30641 o aspiroclorina: K. Sakata et al . , Structural revisión of aspirochlorine (=antibiotic A30641) , a novel epidi thiopiperazine-2 , 5-dione produced by aspergillus SPP, Tetrahedron Letters, 28(46), 5607-5610, 1987). Además un metabolito proveniente de Penicilium turba tum descrito por K. Michel et al . en J. Antibiot. 27, 57 (1974) tiene una estructura de epipolitio-dioxopiperazina. La estructura y la configuración absoluta de caetocina han sido descritas por H.P. Weber (Helv. Chim.

Acta, 53(5): 1061-73, 1970; Acta Crystallogr. B28, 2945 (1972) ) . Se ha reportado la actividad citotóxica de caetocina y un derivado dihidroxi de la misma, lla,lla'-dihidroxi caetocina (melinacidina IV) , siendo la CI50 de aproximadamente 0.03 µg/ml hacia células leucémicas HeLa (T. Saito et al , Chetracin A, a new epipoli thiodioxopiperazine having a tetrasulfide bridge from Chaetomium abuense and C. retardatum, Tetrahedron Letters, 26, (39), 4731-4734, 1985). El factor de crecimiento de célula del endotelio vascular (VEGF) juega un papel fundamental en procesos de angiogénesis fisiológica y fisiopatológicas . Están implicados mecanismos diferentes en la regulación del gen de VEGF; entre estos la tensión de oxígeno tisular es altamente relevante, como queda demostrado por el incremento reversible en los niveles de ARNm de VEGF bajo condiciones de hipoxia in vivo e in vi tro . La expresión incrementada del ARNm de VEGF es mediada principalmente por el factor 1 de transcripción inducible por hipoxia (Hif-1) , el cual se une a un sitio de reconocimiento en la región de promotor del gen de VEGF. Un gran número de datos experimentales muestra que Hif-1 es un regulador global de la homeostasis de oxígeno y que una actividad debilitada de Hif-1 promueve la supervivencia, proliferación, capacidad de invasión y de metástasis de células tumorales (G.L. Semenza, Nature Review Cáncer, 3, 2003, 721 -732) . Por lo tanto se ha planteado la hipótesis que las estrategias terapéuticas dirigidas a la inhibición de la actividad de Hif-1 pueden incrementar la supervivencia de pacientes con cáncer (Semenza GL. HIF-1 and tumor progression : pathophysiology and therapeutics, Trends Mol. Med. 2002 8:S62). HIF-1 es un heterodímero que consiste de las subunidades Hif-la y Hif-lß, las cuales se dimerizan y unen al ADN a través del dominio bHLH-PAS (Semenza GL et al . Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia -inducible factor 1 , J. Biol. Chem. 1996 271: 17771) . La expresión de la subunidad Hif-la está regulada estrictamente por el oxígeno tisular (Semenza GL et al . , Hypoxia-inducible factor 1 levéis vary exponentially over a physiologically relevant range of 02 tensión, Am. J. Physiol. 1996 271:C1172), mediante procedimientos de ubiquitinación y degradación proteosómica mediadas por la unión de la proteína VHL a Hif-la. Esta interacción ocurre únicamente cuando Hif-la ha sido hidroxilada en los residuos de prolina 402 y 564. El oxígeno es el substrato limitante para la prolil-hidroxilasa que modifica a Hif-la (Epstein AC et al . C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regúlate HIF by prolyl hydroxyla tion, Cell 2001 107:43). La expresión de Hif-la se incrementa en forma exponencial a medida que se reduce la concentración de 02 y determina los niveles globales de actividad de Hif-1. La función del dominio de trans-activación de Hif-la también está sujeta a regulación negativa controlada por la presión parcial de oxígeno. El dominio de transactivación N-terminal es regulado en forma negativa a través del reclutamiento de histona desacilasa por parte de VHL y el factor que inhibe a Hif-1 (FIH-I) , el cual se une tanto a VHL como a Hif-la (Semenza GL. et al . FIH-1 : a novel protein that interacts with HIF-lalpha and VHL to medía te repression of HIF-1 transcriptional activity, Genes Dev. 2001 15:2675) . La activación de Hif-1 ocurre a través de los coactivadores p300/CBP los cuales interactúan físicamente con la activación del dominio de Hif-1 para facilitar la transcripción de genes tales como VEGF (Arany Z. et al. An essential role for p300/cbp in the cellular-response to hypoxia , Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1996 93; 12969). Tanto p300 como CBP son co-activadores también para otros factores de transcripción, tales como Stat-3, NF-?B, p53. La interacción de p300/CBP con Hif-1 es esencial para la transcripción, y publicaciones recientes han demostrado la importancia de la interacción Hif-l/p300 para el crecimiento de tumor (Damert A. et al . Activa tor-protein-1 binding potentia tes the hypoxia-inducible factor-1-media ted hypoxia induced transcriptional activa tion of vascular-endothelial growth-f actor expression in c6 glioma cells, Biochem J. 1997 327:419). El dominio de transactivación C-terminal de Hif-la (C-TAD) se une a un dominio de p300 y CBP conocido como CHl. La unión de CBP y p300 a Hif-la es regulada en forma negativa a través de la hidroxilación dependiente de oxígeno de la asparagina 803 en el dominio de activación C-terminal por parte de FIH-1. Por lo tanto, la hipoxia induce tanto la estabilización hacia la degradación proteosómica como la actividad de transcripción de Hif-1. Los detalles estructurales de la interacción entre Hif-la TAD-C con el dominio CH1 de p300 o CBP han sido esclarecidos (Eck MJ. et al . Structural basis for recruitment of CBP/p300 by hypoxia-inducible factor-1 alpha , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002 99:5367, Wright PE et al . Structural basis for Hif-1 alpha/CBP recognition in the cellular hypoxic response, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2002 99:5271). Los detalles de la interacción entre p300/CBP y la proteína CITED2 (también conocida como pSd"-') , la cual es considerada un regulador negativo de la actividad de Hif-la, también han sido publicados (Freedman, S.J. et al , Nature Structural Biology, 2003, 10(7), 504- 12) . La activación de Hif-1 induce la transcripción de un número de genes implicados en la producción de factores angiogénicos, portadores de glucosa, enzimas glucolíticas, factores de supervivencia, migración e invasión, los cuales son particularmente importantes para el progreso de tumor. Se ha observado la expresión aberrante de la proteína Hif-la en más del 70% de tumores de humano y sus metástasis y se ha asociado a un incremento en la vascularización y progreso del tumor (Zhong, H. et al . , Overexpression of hypoxia-inducible factor la in common human cancers and their metastases, Cáncer Research, 1999, 59, 5830-5; Bos, R. et al . , Levéis of hypoxia-inducile-factors-la during breast carcinogenesis, J. Nat. Cáncer Inst. 2001, 93, 309-14; Talks, K.I. et al . , The expression and distribution of the hypoxia -inducible-factors HIF-la and HIF-2 in normal human tissues) . En la práctica clínica, la expresión aberrante de Hif-la ha sido asociada con el fracaso en la terapia y el incremento en la mortalidad en un número de patologías tumorales, tales como carcinoma de pulmón de células no pequeñas (Giatromanolaki, A. et al . , Rela tion of hypoxia inducible factor la and 2a in operable non-small cell lung cáncer to angiogenic/molecular profile of tumors and survival, Br. J. Cáncer 85, 881-890 (2001)), cáncer orofaríngeo de célula escamosa (Aebersold, D.M. et al . Expression of hypoxia-inducible factor la: a novel predictive and prognostic parameter in the radiotherapy of oropharyngeal cáncer, Cáncer Res. 61, 2911-2916 (2001)), cáncer cervical en etapa temprana (Birner, P. et al . Overexpression of hypoxia-inducible factor la is a marker for an unfavorable prognosis in early-stage invasive cervical cáncer, Cáncer Res. 60, 4693-4696 (2000)), cáncer de cabeza y cuello (Koukourakis, M.l. et al . , Hypoxia-inducible factor (HiflA and Hif2A) , angiogenesis, and chemoradiotherapy outcome of squamous cell head-and-neck cáncer, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 53, 1192-1202 (2002)), cáncer de ovario p53 mutado (Birner, P. et al . , Expression of hypoxia-inducible factor la in epithelial ovarían tumors : its impact on prognosis and on response to chemotherapy, Clin. Cáncer Res. 7, 1661-1668 (2001)), oligodendroglioma (Birner, P. et al . , Expression of hypoxia -inducible factor-l . in oligodendrogliomas: its impact on prognosis and on neoangiogenesis, Cáncer 92, 165-171 (2001) ) y cáncer esofágico BCL-2-positivo (Koukourakis, M.l. et al . , Hypoxia inducible factor (HIF-la and HIF-2a) expression in early esophageal cáncer and response to photodynamic therapy and radiotherapy, Cáncer Res. 61, 1830-1832 (2001) ) . En la literatura se han descrito diferentes estrategias para inhibir la actividad de Hif-1. Algunas de éstas sugieren el uso de oligonucleótidos de anti-sentido para Hif-la o de formas de Hif-la dominantes negativas. Entre las estrategias farmacológicas, se han descrito inhibidores de actividad de Hif-la que actúan a través de mecanismos indirectos, tales como: inhibidores de P13K-mTOR (Zundel, W. et al . Loss of PTEN facilitates HIF-1 -media ted gene expression, Genes Dev. 14, 391-396 (2000) ; Hudson, CC. et al . Regula tion of hypoxia-inducible factor 1 -alpha expression and function by the mammalian target of rapamycin, Mol. Cell. Biol. 22, 7004-7014 (2002)) e inhibidores de MEKK (Sodhi, A. et al . The Kaposi ' s sarcoma -associa ted herpes virus G protein-coupled receptor up-regula tes vascular endothelial growth factor expression and secretion through mitogen-activated protein kinase and p38 pa thways acting on hypoxia-inducible factor la, Cáncer Res. 60, 4873-4880 (2000)) los cuales actúan sobre la transducción de señales que controlan la actividad de Hif-la; inhibidores de la proteína chaperona HSP90 (Mabjeesh, N.J. et al . Geldanamycin induces degradation of hypoxia-inducible factor la protein via the proteosome pathway in prosta te cáncer cells, Cáncer Res. 62, 2478-2482 (2002)); inhibidores de tiorredoxina-reductasa, los cuales modifican el estado redox celular (Welsh, SJ. et al . The thioredoxin redox inhibi tors 1 -methylpropyl 2-imidazolyl disulfide and pleurotin inhibi t hypoxia- induced factor la and vascular endothelial growth factor forma tion, Mol. Cáncer Ther. 2, 235-243 (2003) ) ; moléculas que desestabilizan los microtúbulos, tales como 2-metoxiestradiol (Mabjeesh, NJ. et al . 2ME2 inhibi ts tumor growth and angiogenesis by disrupting microtubules and dysregula ting Hif, Cáncer Cell 3, 363-375 (2003)) y epotilonas (Escuin, D. et al . , Epothilone B inhibi ts Hif-la downstream of i ts microtubule stabilizing effects, Proceedings of the 95th Annual Meeting of the American Association for Cáncer Research, Abs. 5427). Recientemente, se ha reportado la inhibición de niveles de Hif-la tanto constitutivos como inducidos por hipoxia por PX-478 (N-óxido de Melfalan) en tumores de humanos transplantados a partir de ratones desnudos. El compuesto muestra actividad anti-tumoral marcada. Sin embargo, el mecanismo de acción de este compuesto aún no ha sido esclarecido completamente (S Welsh et al , Anti tumor activi ty and pharma cody nam i c properties of PX-478, an inhibitor of hypoxia -inducible factor la, Mol Cáncer Ther. 3:233-244, (2004)). Por último, recientemente se ha reportado que caetomina -un metabolito del hongo filamentoso Chaetomium sp con estructura de ditiodicetopiperazina- interfiere con la unión de Hif-la a p300. El compuesto actúa alterando la estructura del dominio de CHl de p300, evitando de esta manera su interacción con Hif-la. La administración de caetomina a ratones portadores de tumor inhibe la transcripción inducida por hipoxia en el tumor y el crecimiento de tumor (A.L. Kung et al . , Cáncer Cell, 6, 33-43, 2004) . Gliotoxina y caetocina se pueden conseguir comercialmente a partir de Sigma Aldrich y se pueden obtener de conformidad con los métodos descritos en las publicaciones antes mencionadas. La síntesis total de gliotoxina es reportada por T. Fukuyama, S. Nakatsuka e Y. Kishi en Total synthesis of gliotoxin, dehydrogliotoxin and hyalodendrin, Tetrahedron, 37(11), 2045-2078, 1981.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Actualmente se ha descubierto que los antibióticos con una estructura de dicetoditiopiperazina, en particular caetocina y gliotoxina, son capaces de inhibir la unión de Hif-la con p300 y de evitar la producción de VEGF en células mantenidas bajo condiciones de hipoxia. Por lo tanto, en una primera modalidad, la invención se refiere al uso de antibióticos de dicetoditiopiperazina que se seleccionan a partir de caetocina y gliotoxina para la preparación de medicamentos para el tratamiento de patologías en las cuales la inhibición de la unión de Hif-la con p300, en particular para la preparación de medicamentos anti-angiogénicos . Los objetivos de la invención son, por lo tanto, caetocina y gliotoxina como agentes anti-angiogénicos, anti-proliferativos y anti-metastásicos . En una modalidad adicional, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden antibióticos de dicetoditiopiperazina que se seleccionan a partir de los ingredientes activos caetocina y gliotoxina, en mezcla con vehículos y excipientes apropiados. La invención también se refiere a un método para inhibir la producción de VEGF en una célula, cuyo método comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de caetocina o gliotoxina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los antibióticos de dicetoditiopiperazina, en particular caetocina y gliotoxina, son capaces de inhibir la interacción entre Hif-la y p300, como se ha podido demostrar con una prueba de fluorescencia adaptada a partir de Freedman SJ et al . , Nature Structural Biology 2003, 10(7), 504-512. Por lo tanto, caetocina y gliotoxina son útiles para el control de angiogénesis y crecimiento de tumor. Las composiciones farmacéuticas de estos compuestos se pueden utilizar en forma conveniente para el tratamiento de un número de patologías en las cuales la angiogénesis está implicada como factor de patogénesis, por ejemplo formas diferentes de tumores sólidos, retinopatía diabética, artritis reumatoide, psoriasis, hemangioma, escleroderma, glaucoma neovascular. Los tumores sólidos que son particularmente sensibles a los compuestos que pueden inhibir la unión de Hif-la con el dominio CH1 de p300 comprenden carcinoma de pulmón, carcinoma mamario, carcinoma de próstata, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, melanoma, tumores del sistema nervioso central, cáncer orofaríngeo de célula escamosa, cervical, de ovario, esofágico, de riñon, de colon, tumor de cabeza y cuello y oligodendroglioma. Para los usos terapéuticos contemplados, dichos antibióticos de cetoditiopiperazina se pueden administrar a través de la vía de administración oral, parenteral, transdérmica, rectal, tópica o vía de administración equivalente, en dosis que serán determinadas por los expertos en el campo de conformidad con la fármaco-toxicología y propiedades farmacocinéticas del compuesto seleccionado y de conformidad con la patología, su gravedad y etapa de avance y con el peso, género y edad del paciente . Sin embargo, las dosis típicamente están comprendidas entre 0.1 y 100 mg/kg/día con respecto al peso del paciente. Caetocina y/o gliotoxina se pueden administrar opcionalmente en combinación con otros agentes quimioterapéuticos, por ejemplo en protocolos de quimioterapia con fármacos potencialmente sinergistas que tengan mecanismo de acción diferente. Los ejemplos de composiciones de la invención comprenden cápsulas, tabletas, soluciones inyectables u orales o suspensiones, supositorios, formas de liberación controlada y similares. Dichas composiciones se pueden preparar por medio de técnicas y excipientes convencionales, por ejemplo aquellos descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, XVII ed. Mack Pub., N. Y., E.U.A. La invención se ilustra con mayor detalle en los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 Inhibición de Biot-Hif-la/86'B<!6/GST-?300v323/423 La capacidad de caetocina para evitar la interacción entre Hif-la y p300 se evalúa utilizando el método de prueba de fluorescencia (DELFIA™) descrito por Freedman SJ a t al . , Nature Structural Biology 2003, 10 (7), 504-512, modificado en forma adecuada. El fragmento de Hif-la de humano modificado con biotina correspondiente a los aminoácidos C-terminales 786- 826 (Hif-la 786-826 modificado con biotina) es obtenido por AnaSpec Inc (San José, California, E.U.A.) y se utiliza sin purificaciones adicionales. Una construcción que expresa el fragmento GST-p300323"423 se transforma en la cepa BL21 (DE3) de E. coli . Dicha construcción se obtiene clonando en el vector de expresión pGEX-4T-l (Amersham n. 27-45-80-01) la secuencia de ADN que codifica para la región de p300 comprendida entre los aminoácidos 323-423; la secuencia de ADN se obtiene a través de PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) . La expresión de la proteína se induce con isopropil-1-tio-ß-D-galactopiranósido (IPTG) 1 mM. Las bacterias se lisan mediante aplicación de energía sónica en presencia de una solución reguladora apropiada (50 mM Tris. HCl pH 8.00, 100 mM NaCl, 0.1 mM ZnS04, 1 mM DTT, 0.1 mg/ml de lisozima y una tableta de inhibidor de proteasa de Roche) y la proteína de fusión GST contenida en la fracción soluble se purifica en una resina de Glutation-Sefarosa 4B (Amersham Biosciences; no. 27-4574 -01). La concentración final de proteína se determina con la prueba Biorad de conformidad con Bradford (Bradford M., Anal. Biochem., 72, 248, (1976)). La pureza de las muestras se evalúa a través de SDS-PAGE. Las muestras se almacenan a -80°C en glicerol al 50%. La prueba se efectúa de la siguiente manera, utilizando placas de 96 cavidades NUNC Maxisorp. Las placas C96 NUNC Maxisorp (Nunc, product No. 446612) se incuban durante la noche con estreptavidina (Sigma; product No. S 4762) a una concentración final de 1 µg/ml en solución reguladora de PBS (solución salina regulada con fosfatos 10 mM fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7.4). Cada cavidad se lava después tres veces con 300 µl de solución reguladora TBST (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween 20). A cada cavidad se agregan después 100 µl de una solución 10 nM de Hif-la786"826 modificado con biotina en TBSB (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 5% (p/v) BSA (Sigma, producto No. A 2153)) y se incuba 1 hora a 25 °C. En la última hilera de cada placa únicamente se agrega solución reguladora TBSB. Cada cavidad se lava después tres veces con 300 µl de solución reguladora TBST. La placa preparada de esta manera se utiliza para la prueba. Por separado, se prepara una placa (placa hija) que contiene en cada cavidad 10 µl de una solución 10 µM de cada compuesto de prueba en DMSO. A esta placa se agregan 100 µl de una solución 111 pM de GST-p300323"423 diluida en solución reguladora para incubación (TBSB adicionada con 0.1% (v/v) de Tween 20, 0.5 mM de DTT, 10 µM de ZnCl2) , mezclando las soluciones. 100 µl de la mezcla contenida en la placa hija se transfieren inmediatamente a la placa de prueba . Cada placa hija se prepara con caetocina a una concentración de 10 µM, segura para las dos últimas hileras de cavidades, en las cuales a cada cavidad se agregan 10 µl de DMSO. Estas dos hileras representan el control positivo (hilera 11, + Hif-1) y negativa (hilera 12, -Hif-1) . Después de incubar durante 1 hora a 25°C, cada cavidad se lava tres veces con 300 µl de solución reguladora TBST (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween 20). A cada cavidad se agregan después 60.8 ng de un anticuerpo anti-GST marcado con Europio (DELFIA Eu-Nl marcado; Perkin Elmer; producto no. AD 0251) disuelto en 100 µl de solución reguladora TBSB que contiene 10 µM de ZnCl2. Después de incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, cada cavidad se lava tres veces con 300 µl de solución reguladora TBST, después se agregan 100 µl de solución amplificadora de señal (Enhancement Solution, Perkin Elmer prodotto No. 1244-105) . Las placas se leen después con una lectora FUSIÓN alpha-FP-HT (Perkin Elmer) en modo de fluorescencia para resolución en tiempo. La actividad de caetocina se calcula de la siguiente manera. Se resta el valor promedio de fluorescencia de los controles negativos en la hilera 12 de la placa de prueba al valor de fluorescencia de todas las otras cavidades. El valor de fluorescencia resultante para cada cavidad de divide después entre el valor de fluorescencia promedio de los controles positivos en la hilera 11 (lo cual representa el valor de señal máximo, 100%), y se expresa como un valor en por ciento. El valor de inhibición es la diferencia entre 100 y el porcentaje de señal calculado para cada cavidad. Utilizando las placas hija en las cuales los compuestos están presentes a diez concentraciones diferentes comprendidas entre 90 µM y 0.178 µM en cada hilera, se puede calcular una curva de dosis-respuesta a partir de la cual se puede derivar la CI50 (concentración del compuesto necesaria para ocasionar el 50% de inhibición de la señal) . Las hileras 11 y 12 que contienen al vehículo únicamente representan los controles. En esta prueba, caetocina muestra inhibición de la interacción entre Biot-Hif-la786"826 y GST-p300323/423 con una CI50 de 12.5 µM.

EJEMPLO 2 Inhibición de producción de VEGF Los compuestos de la invención se evalúan utilizando una prueba celular en células Hep3B de hepatocarcinoma de humano genéticamente modificadas (Hep3B-VEGFLuciferasa) con el fin de expresar en forma estable un vector en el cual se coloca el marco de lectura abierto de luciferasa bajo el control del promotor del gen VEGF de rata. La inducción de Hif-1 con deferoxamina (la cual induce hipoxia) induce la transcripción de luciferasa a través de la activación del promotor de VEGF, el que a su vez conduce a un incremento de actividad de luciferasa que se puede medir con un estuche comercialmente disponible. Los compuestos que interfieren con el complejo HIF-la/p300 ocasionan inhibición de la activación de luciferasa dependiente de HIF, lo que da como resultado la reducción de actividad de luciferasa. Por lo tanto, esta prueba permite evaluar la actividad de los compuestos hacia el promotor de VEGF, el cual es esencial para la producción de VEGF y angiogénesis de tumor subsiguiente. La línea Hep-3B-VEGF-luciferasa se obtiene de conformidad con el siguiente procedimiento. Se siembran células Hep3B de hepatocarcinoma de humano (referencia ATCC No. HB-8064) en placas de 6 cavidades a una concentración de 2.5 x 105 células/cavidad en 2 ml de DMEM/10% de FCS y al siguiente día se transfectan con Fugene 6 (Roche Biochemicals®) . La mezcla de transfección en cada cavidad contiene 6 µl de Fugene 6 para reacción de transfección, 1 µg del plásmido reportero pxp2-VEGF-luciferasa (promotor de VEGF de rata, No. de acceso NCBI de GenBank U22373, Levy et al . , J. Biol. Chem. 270 (22), 13333-13340, 1995), y 10 ng de ADNpc 3.1 (+) plásmido (INVITROGEN) que hace que las células sean resistentes a neomicina. La transfección se efectúa de conformidad con las instrucciones del fabricante. La población celular apropiada (fenotípicamente resistente a neomicina) se selecciona a través de una estrategia de clonación basada en el procedimiento de "dilución límite" (Sambrook J. , Fritsch E.F. y Maniatis T. (1989) Molecular Cloning, A. Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratori) . La siguiente prueba de expresión/actividad de luciferasa "prueba de luciferasa" y la prueba para la cuantificación de VEGF secretado en el sobrenadante "prueba de ELISA para VEGF secretado") se efectúan con células seleccionadas transfectadas en forma estable. Se utiliza el siguiente protocolo experimental. Día 1. Las células Hep-3B-VEGF-luciferasa se siembran en placas NCBI de 96 cavidades para "blanco" (Greiner) a una densidad de 1 x 104 células/cavidad/125 µl de medio, después se deja que se adhieran durante la noche en un termostato (37°C/5% de C02) . Día 2. Se agregan 75 µl de "soluciones de trabajo 3.2 x" del compuesto (previamente preparado en medio de modo tal que la concentración de DMSO llegue a 1.6% v/v) a las células (volumen parcial/cavidad = 200 µl, concentración parcial del compuesto = 1.2 x, concentración parcial de DMSO = 0.6%). Después de 1 hora de incubación en termostato, se induce químicamente la hipoxia mediante adición de 40 µl/cavidad de una solución de reserva de 6x (600 µM) de deferoxamina (volumen final/cavidad = 240 µl, concentración final del compuesto = lx, concentración final de DMSO = 0.5%, concentración final de deferoxamina = 1 x « 100 µM) . Las placas se colocan después en un termostato durante 18-20 horas adicionales. Día 3. La "prueba de luciferasa" y la "prueba ELISA para VEGF secretado" se efectúan como se describe en lo que sigue.

Prueba ELISA para VEGF secretado La cuantificación de VEGF secretado se efectúa utilizando el estuche "DuoSet Elisa Development System human VEGF" (R&D Systems) . 100 µl/cavidad del sobrenadante proveniente de las placas de 96 cavidades "blanco" sembradas con las células del clon Hep3B/VEGF luciferasa se transfieren a placas de 96 cavidades transparentes (Maxisorp) y se analizan de conformidad con las instrucciones del fabricante del estuche. En la prueba ELISA para inhibición de VEGF secretado, caetocina y gliotoxina muestran CI50 de 0.1 µM y 0.2 µM respectivamente.

Prueba de luciferasa La cuantificación de expresión del gen reportero de luciferasa se efectúa con el Reactivo Bright Glo (Promega) . Después de desechar el sobrenadante y de lavar una vez con PBS, se agregan 40 µl/cavidad de reactivo Bright Glo a placas de 96 cavidades de "blanco", es decir, placas sin células Hep3B/VEGF-luciferasa de hepatocarcinoma de humano. Los niveles de expresión del gen reportero se determinan leyendo las placas con un luminómetro. En la prueba de luciferasa para la inhibición del promotor de VEGF, caetocina y gliotoxina muestran una CI50 (concentración del compuesto que ocasiona el 50% de inhibición de la señal de luciferasa) de 0.04 µM y 0.05 µM respectivamente .

Claims (4)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- El uso de caetocina para la preparación de composiciones farmacéuticas para la prevención o tratamiento de angiogénesis y tumores.

2.- El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los tumores son tumores sólidos.

3.- El uso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el tumor se selecciona a partir de carcinoma de pulmón, carcinoma mamario, carcinoma de próstata, neuroblastoma, glioblastoma multiforme, melanoma, cáncer del sistema nervioso central, cáncer orofaríngeo de célula escamosa, cáncer cervical, de ovario, esofágico, de riñon, de colon, de cabeza y cuello y oligodendroglioma.

4.- Un método para inhibir la producción de VEGF en una célula, cuyo método comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad efectiva de caetocina.