KR101157078B1

KR101157078B1 - 아스퍼질러스 ｋｍｄ 901 균주, 이로부터 분리된 다이케토피페라진 화합물, 및 이를 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101157078B1
Application number: KR1020090102461A
Authority: KR
Inventors: 양현옥; 권학철; 최은주; 박진수; 김영주
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2009-10-27
Publication date: 2012-06-21
Anticipated expiration: 2029-10-27
Also published as: KR20110045763A

Abstract

해양퇴적토로부터 유래한 아스퍼질러스 속 곰팡이 균주 KMD 901 (Aspergillus sp. KMD 901), 이로부터 분리된 신규 화합물 디하이드로-디옥시아포아라노틴(Dehydro-deoxyapoaranotin), 아세틸아라노틴(Acetylaranotin), 및 아세틸아포아라노틴(Acetylapoaranotin), 및 이들의 암세포 성장 억제에 있어서의 용도가 제공된다. 상기 해양퇴적토로부터 분리된 곰팡이 및 이로부터 유래하는 이차 대사산물들은 항암제를 위한 후보물질로 유용하게 사용할 수 있다.

해양퇴적토, 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp. KMD 901), 항암, 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin), 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin), 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)

Description

아스퍼질러스 ＫＭＤ 901 균주, 이로부터 분리된 다이케토피페라진 화합물, 및 이를 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물 {Aspergillus sp. KMD 901 strain, diketopiperazines isolated therefrom, and a composition for the prevention of the treatment of cancer comprising the same}

해양퇴적토로부터 유래한 아스퍼질러스 속 곰팡이 균주 KMD 901 (Aspergillus sp. KMD 901), 이로부터 분리된 신규 화합물 디하이드로-디옥시아포아라노틴(Dehydro-deoxyapoaranotin), 아세틸아라노틴(Acetylaranotin), 및 아세틸아포아라노틴(Acetylapoaranotin), 및 이들의 암세포 성장 억제에 있어서의 용도에 관한 것이다. 상기 해양퇴적토로부터 분리된 곰팡이 및 이로부터 유래하는 이차 대사산물들은 항암제를 위한 후보물질로 유용하게 사용할 수 있다.

항암제 개발은 생명과학관련 기술개발연구의 가장 핵심을 차지하고 있으며, 암은 우리나라 뿐 아니라 미국, 일본 등에서도 사망원인 1-2 위를 다투고 있으며 특히 대형병원 사망률의 과반수이상을 차지하고 있다(생명과학동향, 생명공학 연구 소, 3: 55, 1995; 鶴尾降, 西條長壙, 암 화학적 요법, 서광서림, 351, 1991). 이러한 암을 정복하기 위한 노력의 일환으로 여러 가지 암의 조기 발견을 위한 진단법에 많은 발전이 있었으며, 암의 치료법에 있어서도 수술, 방사선 요법, 항암제의 개발, 생물학적 방법 등이 발달해 왔다. 그 중 항암제의 경우 다양한 종류의 암세포를 이용한 시도가 많았지만, 현재까지 진정한 의미의 치료제로서의 항암제는 없는 상태이고 단지 보조치료제 내지는 단기간의 생명연장을 돕는 정도의 약제밖에는 개발되지 못한 상태이다.

종래 주로 임상에서 사용되고 있는 항암제제들은 대부분 5-플루오로우라실, 시트라라빈 등과 같은 핵산의 합성 저해제들 또는 알킬화 약품, 미토마이신, 시스플라틴, 프로카바진 등과 같은 핵산과 반응하여 세포독성을 나타내는 물질로 분류할 수 있다. 그러나 이러한 항암제들은 다양한 부작용을 나타내기 때문에 많은 문제점들을 안고 있으며, 이러한 문제점을 해결한 새로운 암 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

최근 화학적 치료요법의 국제적인 동향을 살펴보면, 항암요법제 개발방법론에 있어서, 기존의 전통적인 접근방법으로써 DNA 생합성, DNA 결합체, 토포이소머라제, 방추사, 호르몬 등을 표적으로 그들의 억제제 혹은, 대체 가능한 화합물들을 찾는 것이었으나 최근에는 신호전달(EGF), 혈관생성억제(MMPI's), 세포주기(CDK's), 세포사멸(bcl2), 면역요법, 유전자치료, 모노클로널 항체 등으로 그 표적이 옮겨져 왔음을 알 수 있다.

또한, 새로운 항암제 개발방법으로는 천연 및 유기합성법을 주로 이용해 왔 다. 여러 암 세포주 및 동물 종양 모델을 이용한 효능 평가를 통해 계속 천연물로부터 항암 효과를 가진 성분을 분리하려는 시도가 계속되고 있었으며, 그 최근의 예로 탁솔과 캄포테신의 개발을 들 수 있다.

탁솔은 항방추사 활성을 통한 암세포독성을 나타내는 독특한 작용기전으로 유방암과 난소암에 강력한 효과를 나타낸다 (P.B. Schiff et al. J. Supramolec. Struct. 8: 328, 1978; E.K. Rowinsky et al. Cancer Res. 48: 4093, 1988; N. Kumar, J. Biol. Chem. 256: 10435, 1981; F.A. Holmes et al. J. Natl. Cancer Invest. 83: 1797, 1991). 또한 캄포테신은 토포이소머라제 I의 억제제로 실험적인 종양에서는 매우 강한 효과를 나타내었으나 임상에서 심한 방광염을 나타내었다 (M.E. Wall et al. J. Am. Chem. Soc. 88: 3888, 1966). 그러나 캄포테신을 선도물질로 하여 CPT-11, SN38과 같은 많은 유도체들이 개발되어 상기 부작용들을 해결하였다(T. Kunimoto et al. Cancer Res. 47: 5944, 1987; N. Kaneda et al. Cancer Res. 50: 1721, 1990; S. Negoro et al. J. Natl. Cancer Inst. 83:1164, 1991). CPT-11의 경우 현재 2상 임상 시험이 진행 중에 있으며 폐암(M. Fukuoka et al. J. Clin. Oncol. 110: 16, 1992), 백혈병 및 임파종(R. Ohno et al. J. Clin. Oncol. 8: 1907, 1990; M.R. Boyd et al. Agent Chemother. 31: 1238, 1987)에 효과가 좋은 것으로 알려져 있다. 하지만, 단일의 항암제가 모든 암에 대하여 항암활성을 나타내는 것은 아니고, 각각의 암에 대한 항암활성이 다른 바 새로운 항암제의 개발이 지속적으로 필요한 상황이다.

한편, 해양생물은 지구 전체 동물의 80% 에 달하는 수십만 종이 서식하는 것 으로 알려져 있어 육상에 전혀 존재하지 않는 새로운 생물이 서식하고 있어 미래 신약개발의 보고가 되고 있다. 특히 해양 미생물은 신약개발에 있어서 매우 중요한 요소 중 하나인 신규 화합물의 획득에 있어서 매우 효율성이 높은 생물자원으로서 인식되어 지고 있다.

대량 재배 또는 양식이 필수적인 식물 또는 동물자원과 달리, 미생물의 경우 상대적으로 신속하고 비용이 절감되는 대량배양법을 이용하여 목적하는 추출물 혹은 화합물을 수득할 수 있다. 살리노스포라아마이드 에이 (Salinosporamide A)(Feling, R. H. et al. Angew. Chem Intl. Ed. 42, 355-357, 2003)와 포르복사졸 에이 (Phorboxazole A) (Searie, P. A. & Molinski, T. F. J. Am. Chem. Soc. 117, 8126-8131, 1995)는 해양 미생물로부터 유래한 대표적인 약물로서, 살리노스포라아마이드 에이의 경우 해양퇴적토로부터 분리된 박테리아로부터 유래된 물질로 골수종 치료를 위해 임상 연구 중이며, 포르복사졸 에이의 경우 해면으로부터 분리된 박테리아로부터 분리된 화합물로 세포분열을 억제하는 기능을 가지고 있으며, 아주 낮은 농도로 세포주기를 저해하는 기능을 하고 있다.

아스퍼질러스(Aspergillus sp.)로부터 유래된 항암 또는 암세포독성 효능을 나타내는 대표적인 성분으로는, 푸미길린 (fumagillin) (Lu, J. et al. J. Med. Chem. 49(19), 5645-5648, 2006), 트로폴락톤 (Tropolactone) (Cueto, M. et al. Phytochemistry 67(16), 1826-1831, 2006), 아스테리퀴논 (Asterriquinone) (Kaji, A. et al. Anticancer Res. 17(5A), 3675-3679, 1997), 아스퍼질라진 (Aspergillazine) (Capon, R. J. et al. Org. Biomol. Chem. 3(1), 123-129, 2005), 아스피리돈 (Aspyridone) (Bergmann, S. et al. Nat. Chem. Biol. 3(4), 213-217, 2007), 및 트리프로스타틴(tryprostatin) (Zhao, S. et al. J. Med. Chem. 45(8), 1559-1562, 2002)등이 있다.

아스퍼질러스 (Aspergillus sp.) 속 곰팡이 균주는 1729년 이탈리아의 성직자이면서 생물학자인 Micheli, P. A 에 의해서 처음 분류 된 이래로 현재 약 180여종 이상이 보고되었다 (Lubertozzi, D. Biotechnol. adv. 27, 53-75, 2009). 식품 및 발효공업 등에 중요한 역할을 하는 많은 곰팡이들이 상기 아스퍼질러스 속에 포함되며, 아밀라아제 (Amylase)와 프로테아제 (protease) 활성이 강하므로 우리나라를 비롯한 동양 각국에서는 예부터 주류, 장류 등의 양조에 이용하였고, 또한 디아스타아제 (diastase), 글루코아밀라아제 (glucoamylase), 프로타아제 (protease) 등 의약이나 효소제 생산에도 이용된다 (Bennett, J.W. J. Biotechnol. 66(2-3):101-107, 1998).

아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.)에 속하는 대표적인 균주로서 아스퍼질러스 오리제;누룩곰팡이 (Aspergllus oryzae)는 오래 전부터 발효에 사용되어져 온 곰팡이로서 청주를 발효시키는데 (Machida, M. et al. DNA Research, 15, 173-183, 2008) 사용되며, 아스퍼질러스 소제 (A. sojae)는 간장의 제조에 사용되고(Chang, P. K. Appl. Microbiol. Biotechnol. 76, 977-984, 2007), 아스퍼질러스 니거 (A.niger)는 유기산 발효에 사용되고 (Withers, J. M. et. al. Biotechnol. Bioeng. 59(4):407-418, 1998), 아스퍼질러스 웬티이 (A. wentii)는 대두 (大豆)를 가공하는 데 사용되는 등 (Manabe, M. et. al. In Toxigenic Fungi. 4-14, 1984), 아스퍼질러스 곰팡이는 발효공업에는 빠질 수 없는 진균류라 하겠다.

한편, 아스퍼질러스 푸미가투스 (A.fumigatus), 아스퍼질러스 플라부스 (A. flavus), 아스퍼질러스 니거 (A.niger) 는 주로 폐의 실질에 손상을 입혀 공동 (Fungal gall; aspergilloma)을 형성하여 사람에게 아스퍼질러스증을 일으킬 수 있다 (Latgㅹ, J. P. Clin. Microbiol. Rev. 310-350, 1999).

한편, 아세틸아라노틴은 Neuss, N. et al. 에 의하여 처음으로 분리 보고가 되었으며 (Neuss, N. et al. Tetrahedron lett. 42, 4467-4471, 1968), 그 이후, 아스퍼질러스 테레스 (Aspergillus terreus) 균주로부터 분리되어져 식물성장 저해제로 많이 알려져 있다 (Kamata, S. et al. Agric. Biol. Chem. 47(11), 2637-2638, 1983). 또한, Murdock, K. C.에 의해 호흡기 바이러스인 콕사키 에이-21 (Coxsackie A-21)에 대한 항바이러스 효과 (Murdock, K. C. J. Med. Chem. 17, 827-835, 1974) 및 혈소판 응집 저해작용 (Ihara, Tetsuo et al. JP 02300129, 1990) 등이 보고되었으나, 암세포에 대한 성장 저해작용은 보고된 바 없다. 또한 본 발명의 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin)의 경우는 항생효과를 가지는 화합물로 그 화학적 특성에 대한 연구가 실행되었으며 (Nagarajan, R. J. Am. Chem. Soc. 95(22), 7212-7222, 1973), 혈소판 응집 억제 작용이 (Ihara, Tetsuo et al. JP 02300130, 1990) 보고되었으나, 암세포에 대한 작용은 전혀 보고 된 바 없다.

본 발명자들은 해양퇴적토로부터 분리된 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) 균주 (KMD 901), 및 이로부터 분리된 화합물이 다양한 종류의 암 세포 성장 억제에 효과가 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 일례는 해양퇴적토로부터 분리된 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) 균주 (수탁번호 KFCC 11450P)를 제공한다.

또 다른 예는 상기 아스퍼질러스속 균주로부터 분리된 화학식 3의 신규한 화합물 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)를 제공한다.

<화학식 3>

또 다른 예는 상기 아스퍼질러스속 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 유기용매 추출물, 및 상기 추출물의 알코올/물 분획물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다

또 다른 예는 아스퍼질러스속 균주로부터 분리된 화학식 1-3의 다이케토피페라진 화합물(아라노틴 유도체)을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

또 다른 예는 상기 아스퍼질러스속 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 유기용매 추출물, 상기 추출물의 알코올/물 분획물, 화학식 1-3의 다이케토피페라진(아라노틴 유도체) 화합물, 및 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제공한다.

또 다른 예는 상기 아스퍼질러스속 균주로부터 화학식 1 내지 3의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 해양퇴적토로부터 분리된 곰팡이 아스퍼질러스 속 (Asperigillus sp.) KMD 901 균주를 액체 배양 한 후 초산에틸을 이용하여 추출물을 조제하였고, 이로부터 신규화합물인 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)을 포함하여 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin) 및 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin) 등의 3종의 다이케토피퍼라진 (diketopiperazine)계열의 화합물을 분리하여 화합물의 구조를 동정하였고, 또한 상기 화합물들의 암세포 성장 저해 작용을 평가함으로써 본 발명을 완성하였다.

우선, 해양퇴적토로부터 분리된 신규한 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) 균주 (KMD 901)가 제공된다.

본 발명자들은 동해 울릉도 인근의 위도 130도 0분, 경도 37도 3.4분의 위치에서 수심 1,198 m에서 해양 퇴적물을 내경 5cm x 길이 1 m의 피스톤코어로 채취한 뒤 음지에서 건조하여 해양 퇴적물 시료를 조제하였다. 상기 건조물을 생리식염수에 현탁하여 1/10으로 희석한 후 차펙독스 (Czapek-Dox) 고체배지에 접종하고, 실온에서 배양하면서 생성된 단일 균주를 차펙독스 (Czapek-Dox) 고체배지에 다시 접종하여 순수한 균주를 분리 및 선별하였다. 이와 같이 분리된 KMD 901 균주는 차펙독스 (Czapek-Dox) 고체배지에서 솜털 모양의 콜로니와 중앙이 노란색을 띠며 (도 1 참조), 서열번호 1의 5.8S rRNA, 18S rRNA, 28S rRNA 유전자 염기서열을 가지며 이차대사산물로서 하기의 화학식 1 내지 3의 아라노틴 유도체를 분비하는 것 을 특징으로 한다. 상기 균주 KMD 901은 한국 미생물 보존 센터에 2009년 6월 23일자로 기탁하여, 수탁번호 KCCM 11047P를 부여받았다.

상기 KMD 901 균주의 5.8S rRNA, 18S rRNA, 및 28S rRNA 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 아스퍼질러스 버시컬러 (Aspergillus versicolor NRRL 227)와 98.8%의 상동성을 보였으나, 화학식 1 내지 3의 화합물과 같은 아라노틴 유도체의 분비 및 암세포 성장 저해 활성은 아스퍼질러스 버시컬러에서 전혀 보고된 바 없다.

상기 KMD 901 균주의 5.8S rRNA genes, 18S rRNA genes, 28S rRNA genes 염기서열은 다음과 같다 (서열번호 1):

또한, 상기 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) KMD 901 균주를 고체 배지에서 1차 배양한 이후 이로부터 생성된 콜로니를 액체 배지에 접종하여 대량 액체 배양하는 방법이 제공된다.

또한, 상기 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) KMD 901 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 유기용매 추출물, 및 상기 추출물의 알코올/물 분획물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

상기 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) KMD 901 균주의 이차대사산물 중 암세포 성장 저해 활성을 갖는 물질이 있음을 확인하였다 (시험예 <1> 내지 <3> 참조). 이러한 유용한 이차대사 산물은 배양 후 약 4일째부터 생산되는 것으로 나타났다. 따라서, 암의 예방 또는 치료용 조성물의 유효 성분으로 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) KMD 901 균주 뿐 아니라 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) KMD 901 균주의 배양물도 사용할 수 있다.

유용한 이차대사산물의 생산에 최적 조건을 제공하기 위하여, 배양 배지는 사카로오스 배지인 것이 좋다. 본 발명에 있어서, 사카로오스 배지는 물을 제외한 성분 총량을 기준으로 사카로오스 함량이 50 중량% 이상인 배지를 의미하는 것으로, 예컨대 차펙독스 (Czapek-Dox) 배지 (Saccharose 30 g, Sodium Nitrate 3.0 g, Dipotassium Phophate 1.0 g, Magnesium Sulfate 0.5 g, Potassium Chloride 0.5 g, 및 Ferrous Sulfate 0.01 g을 주성분으로 함유) 등일 수 있다. 상기 사카로오스 배지 형태는 고체배지와 액체배지 모두 가능하며, 바람직하게는, 액체배지일 수 있다.

배양 기간은 유효한 이차대사 산물의 생산이 활발한 약 4일 이상, 바람직하게는 4 내지 20일, 보다 바람직하게는 6 내지 15일로 하는 것이 좋다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 배양물은 상기 KMD 901 균주 콜로니 2-3개 당 사카로오스 액체 배지 20 내지 30 ㎖에서는 4 내지 10일, 바람직하게는 6 내지 8일 배양하여 얻어진 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 건조물과 농축물은 배양물을 통상적인 방법으로 건조 또는 농축하여 얻어진 것을 의미한다.

상기 유기용매 추출물은 KMD 901 균주의 배양물을 초산에틸, 탄소수 1 내지 4의 알코올 (바람직하게는, 부탄올), 염화메틸렌, 에테르, 클로로포름 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매로 추출하여 얻어진 추출물일 수 있다. 상기 추출은 초임계추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법, 또는 셀라이트 또는 폴리스틸렌 또는 폴리아미드 흡착수지를 이용하는 방법으로 대체 가능하나 이에 한정되지 않는다. 추출 시 용매를 배양액 분량의 1 내지 3 부피배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 약 2 부피배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 상온에서 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 감압건조는 회전진공농축기(Rotary Vacuum Evaporator)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 감압건조 시 온도는 20 ~ 40℃인 것이 바람직하고 30℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 추출물의 알코올/물 분획물은 상기 유기용매 추출물을 탄소수 1 내지 4의 알코올/물 혼합 용액을 이용하여 분획하여 얻어진 분획물일 수 있다. 탄소수 1 내지 4의 알코올/물 혼합 용액은 약 70 내지 90 %(v/v) 탄소수 1 내지 4의 알코올/ 물 혼합 용액, 바람직하게는 70 내지 90 %(v/v) 메탄올/물 혼합 용액일 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 분획물은 상기 70 내지 90 %(v/v) 탄소수 1 내지 4의 알코올/물 혼합 용액, 바람직하게는 70 내지 90 %(v/v) 메탄올/물 혼합 용액으로 분획하여 얻어진 분획물을 40 내지 60 %(v/v)의 탄소수 1 내지 4의 알코올/물 혼합 용액, 바람직하게는 40 내지 60 %(v/v)의 메탄올/물 혼합 용액으로 추가로 분획하여 얻어진 소분획물일 수 있다.

상기 분획물 및/또는 소분획물은 화학식 1 내지 3의 화합물을 비롯하여 유용한 이차대사산물을 함유하여 우수한 암세포 성장 저해 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 상기 KMD 901 균주로부터 분리된 화학식 1의 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin), 화학식 2의 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin), 및 신규한 화합물인 화학식 3의 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)이 제공된다. 이들 화합물은 모두 우수한 암세포 성장 저해 효과가 있는 것으로 나타났다. 따라서, 화학식 1 내지 3의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

상기 유효성분으로 사용되는 화학식 1의 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin), 화학식 2의 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin), 및 신규한 화합물인 화학식 3의 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)은 그 자체, 또는 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 염인 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 약학적으로 허용 가능한 모든 유기산일 수 있으며, 예컨대, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탄산, 아스파르트산 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 무기산은 약학적으로 허용 가능한 모든 무기산일 수 있으며, 예컨대, 염산, 브롬산, 황산, 인산 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 아스퍼질러스 KMD 901 균주, 및/또는 이로부터 분리된 상기 화합물은 다양한 암에 대하여 세포 독성을 나타내어 폭넓은 암 치료에 사용될 수 있다는 이점을 갖는다. 따라서, 상기 암의 예방 또는 치료용 조성물은 모든 종류의 암, 바람직하게는 모든 고형암, 예컨대 위암, 간암, 대장암, 폐암, 유방암, 전립선암에 대하여 우수한 예방, 치료, 개선 효과가 있다.

상기 화합물들의 암세포독성은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 분양받은 AGS (위암, ATCC 세포코드- CRL-1739^TM), HepG2 (간암, HB-8065^TM), HCT116 (대장암, CCL-247^TM), A549 (폐암, CCL-185^TM) 및 MCF-7 (유방암, HTB-22^TM) 암세포주를 사용하여 평가하였다. 그 결과, 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin)은 폐암 (A549)에 현저한 암세포 성장 저해 효과를 보였고, 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin)은 폐암 (A549), 유방암 (MCF-7), 위암 (AGS)에 현저한 암세포 성장 저해 효과를 보였으며, 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)은 폐암 (A549)에 암세포 성장 저해 효과가 있는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 조성물은 폐암, 유방암 또는 위암의 치료에 매우 바람직하게 이용될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 3종의 단일화합물이 대장암 세포에 대하여 자연세포사 (apoptosis)를 일으키는 것이 확인되었다.

상기 조성물 내의 아스퍼질러스속 KMD 901 균주, 상기 균주 배양물, 상기 배양물의 건조물, 농축물, 상기 배양물의 유기용매 추출물, 상기 추출물의 분획물, 또는 화학식 1 내지 3의 화합물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 바람직하게는 0.001 내지 50중량%인 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 배양물, 추출물 및 분획물의 경우 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

상기 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.　　

상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.　 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 한 가지 이상의 부형제 및/또는 윤활제 등을 포함할 수 있다.　경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.　 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.　

상기 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있 다.　보다 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물의 투여량은 유효성분인 기준으로 1일 약 1 내지 200 mg/kg으로 할 수 있으며, 예컨대, 유효성분이 상기 추출물, 배양물, 건조물 또는 농축물인 경우 1일 기준으로 10 내지 200 mg/kg, 유효성분이 화학식 1 내지 3의 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염인 경우 1일 기준 1 내지 10 mg/kg으로 하는 것이 좋다.　투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.　 본 발명의 조성물은 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다.　 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육, 피하주사 등에 의해 투여될 수 있다.　 본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 유효성분의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

또한, 상기 아스퍼질러스속 KMD 901 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 유기용매 추출물, 상기 추출물의 알코올/물 분획물, 화학식 1 내지 3의 다이케토피페라진 화합물(아라노틴 유도체), 및 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 암의 예방 및/또는 개선용 기능성 식품이 제공된다.

본 발명의 건강 기능 식품은 당뇨병 개선을 위한 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 건강 기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용될 수 있다.

이 때, 기능성 식품 중의 상기 아스퍼질러스속 KMD 901 균주 등의 함량은 목 적하는 식품의 종류, 기능, 효능 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 식품 중량의 약 0.00001 내지 100 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 10 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1 중량% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 예에서, KMD 901 균주로부터 상기 화학식 1 내지 3의 화합물들을 분리 정제하여 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:

1) 상기 아스퍼질러스 KMD 901 균주를 액체 배양한 배양액에 초산에틸, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 염화메틸렌, 에테르 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 가하여 추출하는 단계; 및

2) 상기 얻어진 추출물을 70 내지 90 %(v/v)의 탄소수 1 내지 4의 알코올/물 혼합 용액을 이용하여 컬럼크로마토그래피하여 분획물을 얻는 단계;

3) 상기 분획물을 40 내지 60 %(v/v)의 탄소수 1 내지 4의 알코올/물 혼합 용액으로 컬럼크로마토그래피하는 단계.

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 액체 배양은 사카로오스 액체 배지, 예컨대, 차펙독스 (Czapek-Dox) 액체배지 (Saccharose 30 g, Sodium Nitrate 3.0 g, Dipotassium Phophate 1.0 g, Magnesium Sulfate 0.5 g, Potassium Chloride 0.5 g 그리고 Ferrous Sulfate 0.01 g을 주성분으로 함)를 사용하여 균주 콜로니 2-3개 당 액체 배지 20 내지 30 ml의 비율로 접종하여 수행하는 것이 좋다.

상기 배양액의 유기용매 추출 시 용매를 배양액 분량의 1 내지 3 부피배 첨 가하여 추출하는 것이 바람직하며, 약 2 부피배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 상온에서 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니다. 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 감압건조는 회전진공농축기(Rotary Vacuum Evaporator)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 감압건조 시 온도는 20 ~ 40℃인 것이 바람직하고 30℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

단계 2) 또는 단계 3)의 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, RP-18, RP-8, RP-4, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 그룹으로부터 선택된 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피일 수 있다. 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있으며, 용매로 클로로포름(CHCl₃)-알코올 (예컨대, 메탄올), 초산에틸(ethyl acetate)-알코올 (예컨대, 메탄올), 염화메틸렌(dicloromethane)-알코올 (예컨대, 메탄올), 알코올 (예컨대, 메탄올)-물 또는 아세토니트릴-물을 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체예에서, 용리 조건은 물과 메탄올을 사용하였으며 20% 메탄올/물로 시작하여 20%씩 메탄올의 함량을 증가시켰으며, 100% 메탄올을 최종유출용매로 사용하였다. 이로부터 얻어진 분획물을 고속액체크로마토그래피법을 이용하여 주성분을 분석한 결과 80% 메탄올/물 분획물에서 3종의 화합물이 확인되었다. 상기 분획물에 추가적으로 50% 메탄올/물의 등용매 조건 및 분당 4 ml의 유속의 용리조 건으로, 10 mm x 250 mm의 RP-18 컬럼을 이용한 역상 액체 크로마토그래피법을 통해 정제하였으며 머무름 시간 10분에 상기 화학식 1으로 표시되는 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin)과 머무름 시간 12분에 상기 화학식 2로 표시되는 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin)과 머무름 시간 20분에 상기 화학식 3으로 표시되는 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)을 각각 수득하였다.

상기 분리한 화합물들은 MS 및 핵분광기를 이용하여 분석하여 화학구조를 동정하였으며, 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin)은 분자량 504이며 분자식이 C₂₂H₂₀N₂O₈S₂인 무정형 흰색 분말상이고, 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin)은 분자량 488이며 분자식이 C₂₂H₂₀N₂O₇S₂인 무정형 흰색 분말상이고, 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)은 분자량 428이며 분자식이 C₂₀H₁₆N₂O₅S₂인 무정형 연노랑 분말상의 물질인 것을 확인하였다.

상기한 바와 같아, 본 발명은 아스퍼질러스 (Aspergillus sp.) KMD 901 곰팡이의 액체 배양법을 개발하여 신규한 화합물인 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin) 외 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin), 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin)을 분리, 정제하였다. 이들 화합물들은 암세포에 대한 강한 세포독성 효과를 나타내었고 대장암세포에 있어서 3종의 단일화합물들은 세포자연사를 일으켰다. 또한, 이중 가장 강한 독성을 일으키는 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin)을 대상으로 한 in vivo 항암활성 측정에서 종양성장 억제 효과를 보였다. 그러므로 아스퍼질러스 (Aspergillus sp.) KMD 901 곰팡이의 액체 배 양액 추출물 혹은 상기 신규한 화합물인 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)을 포함한 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin) 및 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin) 혹은 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 한 약학적 조성물은 항암제 개발을 위한 후보물질로서 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) KMD 901 곰팡이 균주의 액체대량배양법을 통하여 생산된 배양 추출물 및 화합물 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin), 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin), 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)은 암 치료용 약학적 조성물의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시 예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기의 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시 예 1> 곰팡이 균주 탐색 및 선별

동해 울릉도 인근의 위도 130도 0분, 경도 37도 3.4분의 위치에서 수심 1,198 m에서 해양 퇴적물을 내경 5cm x 길이 1 m의 피스톤코어로 채취한 뒤, 음지 에서 건조하여 해양 퇴적물 시료를 준비하였다. 상기 준비된 시료를 생리식염수에 현탁하여 1/10(w/v)로 희석한 후, 차펙독스 (Czapek-Dox) 고체배지(30 g Saccharose, 3 g Sodium Nitrate, 1 g Dipotassium Phosphate, 0.5 g Magnesium Sulfate, 0.5 g Potassium Chloride, 0.01 g Ferrous Sulfate, 18 g Agar in 1L of DI water)에 100 ml의 양으로 접종한 후 25℃에서 7일간 정치배양하면서 단일 균주를 분리하여 20여 종의 균주를 확보하였다. 이와 같이 얻어진 20여종의 균주 시료 각각에 대하여 2배의 멸균수를 넣은 뒤, 1/10 (w/v)로 희석하여 상기 고체 배지에 100 ㎕의 양으로 접종하여 7일간 정치배양하여 균주를 정제하였다.

이 중 배양에 사용할 곰팡이 균주들을 고체배지 상에서 육안으로 형태적, 색상적 차이를 보이는 균주들을 각각 선택하여 고체배지에서 단일 종으로 순수 분리한 뒤, 차펙독스 (Czapek-Dox) 액체 배지 (물 1 리터당, 30 g Saccharose, 3 g Sodium Nitrate, 1 g Dipotassium Phosphate, 0.5 g Magnesium Sulfate, 0.5 g Potassium Chloride, 0.01 g Ferrous Sulfate 함유) 25 ml에 단일 콜로니 2개 내지 3개를 접종한 후 27℃ 진탕 배양기에서 5 ~ 7일간 배양하였다. 확보된 균주의 종 분석은 염색체 DNA를 분리하여 5.8S, 18S, 28S rRNA genes 염기서열을 분석하여 결정하였으며, 그 결과 KMD 901로 명명된 균주는 5.8S, 18S, 28S rRNA genes 염기서열이 서열번호 1과 같이 나타났으며, 아스퍼질러스 버시컬러 (Aspergillus versicolor NRRL 227)와 98.8%의 상동성을 보임을 확인하였다.

KMD 901균주의 경우 25 ㎖의 배양액을 초산에틸 유기용매 추출 후, 감압건조하여 분석크로마토그래피를 통한 분석을 하였을 때, 다른 균주들과 다른 새로운 물 질이 생산되고 있다는 것을 분석크로마토그래피 피크로 확인할 수 있었다. 또한, 이 소량의 추출물을 상대로 암세포에 대한 세포독성 실험결과 강한 암세포독성을 보여, 상기 KMD 901를 항암 미생물 균주로 선택하였다.

KMD 901 균주는 차펙독스 (Czapek-Dox) 고체배지(30 g Saccharose, 3 g Sodium Nitrate, 1 g Dipotassium Phosphate, 0.5 g Magnesium Sulfate, 0.5 g Potassium Chloride, 0.01 g Ferrous Sulfate, 18 g Agar in 1L of DI water )에서 솜털모양의 중앙지점이 노란색을 띄는 콜로니를 형성하는 것으로 나타났다 (도 1 참조). 상기 균주 KMD 901은 한국 미생물 보존 센터에 2009년 06월 23일자로 기탁하여, 수탁번호 KCCM 11047P를 부여받았다.

<실시 예 2> 아스퍼질러스 속 ( Aspergillus sp.) 균주 KMD 901의 액체대량배양

본 발명자들은 곰팡이 균주 KMD 901 (콜로니 2-3개)을 30 g Saccharose, 3 g Sodium Nitrate, 1 g Dipotassium Phosphate, 0.5 g Magnesium Sulfate, 0.5 g Potassium Chloride, 0.01 g Ferrous Sulfate 주성분으로 하는 차펙독스 (Czapek-Dox) 액체배지 25 ml에 접종한 후, 200 rpm 및 25℃ 진탕 배양기에서 7일간 배양하였다. 이 후 대량배양을 위해서 1리터 삼각플라스크에서 500 ml의 차펙독스 (Czapek-Dox) 액체배지에 상기 25 ml 배양액 중 10 ml을 접종하여 8일 동안 배양하였다.

또한, 지속적으로 고속액체 크로마토그래피법을 사용하여 액체배양액으로부터 이차 대사산물의 생산 여부를 분석하였다. 분석조건은 다음과 같이 하였다:

기기: Agilent 1100 LC/MS system;

용출속도: 1 mL/min;

용출액: 10% 아세토니트릴/물로부터 100% 아세토니트릴까지 30분 동안 아세토니트릴의 조성을 증가시킴;

컬럼: Phenomenex Luna 5u C18(2) 4.6 x 150 mm;

검출기: DAD 자외선 검출기(254 nm)

상기 조건에서의 고속액체 크로마토그래피의 분석결과를 도 2에 나타내었다. 상기 고속액체 크로마토그래피의 분석에 있어서, 추출물은 1 mg/mL의 농도로 10 μL를 주입하였고, 아세토니트릴:물 1:9 부피비에서 100% 아세토니트릴까지 30분동안 아세토니트릴의 함량을 증가시키는 유출용매 조건을 사용하였으며, C18 역상 컬럼 (4.6 mm x 150 mm, 입자크기 5μm)을 사용하였다.

배양 15일째까지의 분석 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 곰팡이 균주 KMD 901의 액체 배양액은 머무름 시간 17.9 분의 피크인 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin, 화학식 1)과 머무름 시간 18.6 분의 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin, 화학식 2), 머무름 시간 19.0 분의 피크인 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin, 화학식 3)을 포함하는 것으로 나타났다.

배양일 2일째부터 격일로 KMD 901의 액체배양액을 분석한 결과, 상기 화합물들은 배양 4일째부터 15일까지 생산되기 시작하는 것으로 나타났다.

<실시 예 3> 화합물들의 분리 정제 방법

상기 <실시 예 2>에서 획득한 8일간 배양한 배양액 25ml를 취한 후, 동량의 초산에틸을 가하여 얻어지는 유기용매층을 감압건조하여 초산에틸 추출물 제조하였다. 상기 얻어진 추출물을 회전진공농축기 (Rotary Vacuum Evaporator)를 사용하여 40℃에서 감압 건조하여 얻은 추출물을 역상 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 다섯 개의 분획으로 나누었다. 용리 조건은 용리액으로 물과 메탄올을 사용하여 20% 메탄올/물로 시작하여 20%(v/v) 씩 메탄올의 함량을 증가시키고, 100%(v/v) 메탄올을 최종유출용매로 사용한 것을 제외하고, <실시예 2>의 고속액체크로마토그래피법과 동일하게 하여, 역상 컬럼 크로마코그래피를 수행하였다. 이로부터 수득한 분획물의 주성분을 분석한 결과 80%(v/v) 메탄올/물 분획물에서 <실시예 2>에서의 3종의 주성분 피크가 확인되었다(도 5a 내지 5e 중 5d 참조). 상기 주성분 분석에 있어서, 각 분획물은 1 mg/mL의 농도로 10 μL를 주입하였고, 아세토니트릴:물 1:9 부피비에서 100% 아세토니트릴까지 30분동안 아세토니트릴의 함량을 증가시키는 유출용매 조건을 사용하였으며, C18 역상 컬럼 (4.6 mm x 150 mm, 입자크기 5μm)을 사용하였다.

상기 80% 메탄올/물 분획물을 50% 메탄올/물의 등용매 조건 및 분당 4 ml의 유속의 용리조건으로, 10 mm x 250 mm의 RP-18 컬럼을 이용한 역상 액체 크로마토그래피법을 통해 정제하였으며, 머무름 시간 10분에 화학식 1의 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin)과 머무름 시간 12분에 화학식 2의 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin)과 머무름 시간 20분에 화학식 3의 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)을 각각 수득하였다.

<실시 예 4> 화합물들의 동정

본 발명자들은 기기분석을 이용하여 <실시예 3>에서의 3종의 화합물의 화학구조를 상기 <화학식 1>, <화학식 2> 및 <화학식 3>과 같이 결정하였다. 화학구조를 하기와 같은 MS 자료 및 핵자기분광기 자료를 분석하여 규명하였다. 상기 수소와 탄소 핵자기분광기 스펙트럼은 각각 500 MHz와 125MHz에서 측정하였다.

<화학식 1>의 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin)은 디메틸설폭사이드-d ₆ (DMSO-d ₆)용매에서 측정되었으며, 상기 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin)의 구조에 대한 ¹H와 ¹³C NMR의 화학적 이동값은 다음과 같다;

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 1.90 (3H, s), 3.22 (1H, br ddd, J = 18.0, 1.5, 1.5 Hz), 3.84 (1H, br ddd, J = 18.0, 2.5, 1.5 Hz), 4.59 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz), 5.01 (1H, br ddt, J = 8.5, 2.0, 1.5 Hz), 5.42 (1H, ddd, J = 8.5, 2.5, 2.0 Hz), 6.45 (1H, dd, J = 8.0, 2.5 Hz), 6.82 (1H, br ddd, J = 2.5, 2.0, 1.5 Hz), ¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ: 21.2 (s), 34.1 (s), 62.9 (s), 69.9 (s), 76.4 (s), 105.4 (s), 114.0 (s), 139.2 (s), 141.6 (s), 162.3 (s), 169.7 (s).

<화학식 1>

<화학식 2>의 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin)의 구조에 대한 ¹H와 ¹³C NMR의 화학적 이동값은 다음과 같다;

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 2.03 (3H, s), 2.15 (3H, s), 2.88 (1H, br dd, J = 18.5, 1.5 Hz), 2.99 (1H, ddd, J = 18.0, 2.0, 2.0 Hz), 3.81 (1H, dm, J = 18.5 Hz), 4.02 (1H, br ddd, J = 18.0, 2.5, 1.5 Hz), 4.61 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz), 5.00 (1H, br dm, J = 13.2 Hz), 5.10 (1H, br dddd, J = 8.5, 2.0, 2.0, 1.5 Hz), 5.56 (1H, br dm, J = 13.2 Hz), 5.70 (1H, ddd, J = 8.5, 2.0, 2.0 Hz), 5.96-5.99 (2H, m^a), 6.05 (1H, br dm, J = 13.2 Hz), 6.31 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz), 6.61 (1H, br ddd, J = 2.5, 2.0, 2.0 Hz), ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 21.0 (s), 21.3 (s), 34.5 (s), 36.1 (s), 62.9 (s), 64.5 (s), 69.8 (s), 73.9 (s), 75.9 (s), 78.2 (s), 105.3 (s), 113.4 (s), 119.9 (s), 124.5 (s), 127.8 (s), 132.2 (s), 139.2 (s), 141.2 (s), 162.2 (s), 163.1 (s), 170.0 (s), 170.5 (s). ^a두 개의 프로톤 피크가 겹침.

<화학식 2>

<화학식 3>의 신규한 화합물 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)의 구조에 대한 ¹H와 ¹³C NMR의 화학적 이동값은 다음과 같다.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 1.95 (3H, s), 3.34 (1H, br ddd, J = 18.5, 1.5, 1.5 Hz), 3.54 (1H, d, J = 18.5 Hz), 3.91 (1H, br ddd, J = 18.5, 2.0, 1.5 Hz), 4.10 (1H, d, J = 18.5 Hz), 4.64 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz), 5.05 (1H, br ddt, J = 8.5, 2.0, 1.5 Hz), 5.53 (1H, ddd, J = 8.5, 2.0, 2.0 Hz), 6.48 (1H, dd, J = 8.0, 2.5 Hz), 6.86 (1H, br dt, J = 2.0, 2.0 Hz), 7.23 (1H, ddd, J = 7.5, 7.5, 1.0 Hz), 7.37 (1H, br dd, J = 7.5, 7.5 Hz), 7.45 (1H, br d, J = 7.5 Hz), 7.80 (1H, br d, J = 7.5 Hz), ¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ: 21.2 (s), 34.1 (s), 35.3 (s), 63.2 (s), 70.0 (s), 76.2 (s), 76.9 (s), 105.4 (s), 114.3 (s), 115.1 (s), 126.0 (s), 126.3 (s), 129.0 (s), 129.3 (s), 138.2 (s), 139.2 (s), 142.0 (s), 161.0 (s), 162.1 (s), 170.0 (s).

<화학식 3>

<시험예 1> 화합물들의 암세포에 대한 세포독성효과

상기 분리된 화합물들의 암세포에 대한 세포독성 평가를 시험관 내에서 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltrazdium bromide] 분석법을 이용하여 살아있는 암세포의 양을 측정하는 방법으로 수행하였다. 화합물의 암세포독성은 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 분양받은 AGS(위암, ATCC 세포코드- CRL-1739^TM), HepG2(간암, HB-8065^TM), HCT116(대장암, CCL-247^TM), A549(폐암, CCL-185^TM), 및 MCF-7 (유방암, HTB-22^TM) 암세포주를 사용하여 평가하였다.

96-웰 플레이트(well plate)에 위암(AGS), 간암(HepG2), 대장암(HCT-116), 폐암(A549) 및 유방암(MCF-7) 세포주를 각각 1 X 10⁴세포수만큼 가하고 아래의 배지를 가하여 총 100 마이크로리터가 되도록 하여 37℃에서 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 위의 암세포들은 각각 RPMI 1640 배지 (주성분 25 mM HEPES, L-Glutamine, Hyclone SH30255.01; 위암, 폐암, 유방암), DMEM/HIGH GLUCOSE (주성분 4.00 mM L-Glutamine, 4500 mg/L Glucose, Sodium pyruvate, Hyclone SH30243.01; 간암), MEM/EBSS (주성분 2.00 mM L-Glutamine, Earle's Balanced salts, Hyclone SH30024.01; 대장암) 배지에서 배양하였다. 그리고 나서, 기존의 배지를 제거한 후, 화합물과 기존의 위와 같은 배지로 혼합하여 교체하고 37℃에서 배양하였다. 24시간 후, MTT 용액을 10 마이크로리터씩 넣어 37℃에서 1시간 배양한 후 살아있는 세포 내에서 환원 효소에 의하여 형성된 포르마존 양을 450nm에서 흡광도를 측정하여, IC₅₀값을 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.

시험관 내에서 5개의 암세포주에 대한 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin), 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin) 및 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)의 세포독성 효과

	IC₅₀ (μM)
암세포주	HCT116	AGS	A549	MCF-7	HepG2
아세틸아라노틴 (1)	21.2±1.90	32±1.23	23±1.96	36±0.84	>80
아세틸아포아라노틴 (2)	13.8±1.59	12±0.22	2±1.08	10±0.43	48.4±2.16
디하이드로-디옥시아포아라노틴 (3)	52±1.47	29±0.92	23±0.48	31±0.63	56±1.28

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 상기 분리된 화합물들은 다양한 암세포 주에 대해 높은 세포독성 효과를 가짐을 알 수 있다.

<시험예 2> 화합물들의 대장암세포에 대한 세포자연사 효과

상기 분리된 3 종의 단일화합물들의 대장암세포에 대한 세포자연사멸 효과를 시험하기 위하여, 세포자연사멸에 영향을 미치는 단백질의 발현률을 측정하는 웨스턴 블로팅 (Western blotting) 방법을 수행하였다.

6-well plate에 MEM/EBSS (주성분 2.00 mM L-Glutamine, Earle's Balanced salts, Hyclone SH30024.01)배지에서 배양한 대장암세포를 상기 MEM/EBSS 배지 2mL에 5×10⁵세포만큼 가하고 37℃에서 24시간동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 24시간 후, 3종의 단일화합물을 대장암세포에 각각의 화합물이 저해하는 50% 농도를 중심으로 2 중량배 및 1/2 중량배 농도로 하여, 총 3개의 그룹으로 3종의 화합물을 24시간동안 처리하였다. 이 후, 대장암세포를 수거하여 단백질을 Bio-Rad사의 Protein assay 시약을 이용하여 추출하였다. 이 단백질들을 4-10% 그래디언트 (gradient) 아크릴아마이드 젤 (acrylamide gel) 에 30 ㎍을 진행시킨 뒤, PVDF membrane (Polyvinylidene fluoride membrane, Bio-Rad)에 이동시킨 뒤, 세포자살사에 영향을 끼치는 단백질 중의 하나인 폴리-에이티피 리보오스 폴리머라제 [Poly-ATP ribose polymerase (PARP)]의 발현률을 관찰하였다. 상기 웨스턴 블로팅 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 3종의 화합물들 모두가 농도의존적으로 암세포의 세포자살사에 영향을 끼치는 단백질의 하나인 파프 (PARP)의 발현률을 감소시키는 것으로 관찰되었다. 이로서 상기 화합물들이 세포증식에 있어서 영향을 주는 단백질인 파프 (PARP)가 감소시킴으로서 암세포 증식 감소 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

< 시험예 3> 아세틸아포아라노틴의 in vivo 항암 활성 측정

본 발명에 따른 세 종류의 화합물 중 가장 적은 농도로 세포독성을 일으키는 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin)의 in vivo 종양 성장 억제 활성을 평가하기 위하여 무게 18-22g 의 BALB/c 누드 마우스 ((주) 중앙실험동물)를 사용하였으며, 각 쥐에 HCT116(대장암세포) 세포주를 1×10⁶ 세포씩 오른쪽 어깨에 주사한 후 종양의 크기가 100mm³ 정도가 될 때 무작위로 4마리씩 음성 대조군, 실험군 1(아세틸아포아라노틴 5 mg/kg 투여군) 및 실험군 2(아세틸아포아라노틴 20 mg/kg 투여군)의 세 그룹으로 분류하였다. 이후 일주일에 2회씩 3주에 걸쳐 일정 농도의 시료를 정제수:Tween 80:에탄올을 95:2.5:2.5의 부피비로 혼합한 용액에 용해시킨 후 경구 투여 하였다. 시료를 투약할 때마다 종양의 크기를 측정하였다.

종양의 크기는 0.5×가로×(세로)²로 계산하였으며 세로는 종양의 짧은 직경, 가로는 긴 직경을 사용하였다. 측정결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 투약 직후부터 종양 크기 감소 효과가 관찰되며, 23일내에 음성 대조군에 비하여 실험군 1(아세틸아포아라노틴 5 mg/kg)에서 15.2%, 실험군 2(아세틸아포아라노틴 20 mg/kg)에서 16.1%의 종양 성장 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(*; P<0.2, **; P<0.10, ***; P<0.05).

즉, 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) 균주 KMD 901에서 분리한 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin)화합물은, 대조군과 비교할 때, 투여 직후 (약 2일째)부터 종양 성장을 안정적으로 억제하는 것으로 나타났다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) 균주 KMD 901, 및 이로부터 분리된 화합물 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin), 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin), 및 신규한 화합물 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)은 모두 암 예방 및/또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 해양퇴적토로부터 분리한 곰팡이 아스퍼질러스 (Aspergillus sp.) KMD 901 곰팡이 균주의 차펙독스 (Czapek-Dox) 고체배지에서의 형태를 나타내는 사진이고,

도 2는 상기 균주의 8일 동안 배양 후 고속액체 크로마토그래피를 통해 2차 대사물질의 생산을 피크로 관찰한 크로마토그래피이고,

도 3은 상기 3종의 화합물들이 농도별로 파프 (PARP)의 발현률의 감소에 미치는 영향을 웨스턴 블로팅 (Western blotting) 방법으로 평가한 사진이고,

도 4는 아세틸아포아라노틴의 HCT116 대장암세포의 크기 성장에 대한 효과를 측정한 그래프이고,

도 5a 내지 5e는 아스퍼질러스 (Aspergillus sp.) KMD 901 균주 배양액의 80%(v/v) 메탄올/물 분획물의 주성분 분석 결과를 보여주는 것으로, 5a는 20% 메탄올/물 분획물, 5b는 40% 메탄올/물 분획물, 5c는 60% 메탄올/물 분획물, 5d는 80% 메탄올/물 분획물, 및 5e는 100% 메탄올 분획물에 해당하는 결과이다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Aspergillus sp. KMD 901 strain, diketopiperazines isolated therefrom, and a composition for the prevention of the treatment of cancer comprising the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 567 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 5.8S, 18S, and 28S rRNA genes of Aspergillus KMD 901 strain <400> 1 tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtatccc tacctgatcc gaggtcaacc 60 tgaagaaaaa tggttggacg tcggctggcg cccggccggc cctaaatcga gcgggtgaca 120 aagccccata cgctcgagga ccggacacgg tgccgccgct gcctttcggg cccgtccccc 180 gggggggacg acgacccaac acacaagccg ggcttgatgg gcagcaatga cgctcggaca 240 ggcatgcccc ccggaatgcc agggggcgca atgtgcgttc aaagactcga tgattcactg 300 aattctgcaa ttcacattac ttatcgcagt tcgctgcgtt cttcatcgat gccggaacca 360 agagatccat tgttgaaagt tttgactgat tttatattca gactcagact gcatcactct 420 caggcatgaa gttcagtagt ccccggcggc tcgcccccga gagggctccc cgccgaagca 480 acagtgttag gtagtcacgg gtgggaggtt gggcgcccgg aggcagcccg cactcagtaa 540 tgatccttcc gcaggttcac ctacgga 567

Claims

수탁번호 KCCM 11047P의 아스퍼질러스(Aspergillus sp.) 균주.
화학식 3의 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin):

<화학식 3>
수탁번호 KFCC 11450P의 아스퍼질러스(Aspergillus sp.) 균주,

상기 균주의 배양물,

상기 배양물의 건조물,

상기 배양물의 농축물,

상기 배양물의 초산에틸, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 염화메틸렌, 에테르 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매 추출물, 및

상기 추출물을 탄소수 1 내지 4의 알코올과 물의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 이용하여 분획한 분획물

로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 배양물은 수탁번호 KFCC 11450P의 아스퍼질러스(Aspergillus sp.) 균주를 사카로오스 액체 배지에서 150 내지 250 rpm 및 22 내지 28℃에서 4일 내지 20일 동안 진탕 배양하여 얻어진 것인 암의 예방 또는 치료용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 분획물은 70 내지 90 %(v/v)의 탄소수 1 내지 4의 알코올/물 혼합 용액을 용매로 분획하여 얻어진 분획물인, 암의 예방 또는 치료용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 분획물은 70 내지 90 %(v/v) 메탄올/물 혼합 용액을 용매로 분획하여 얻어진 분획물인, 암의 예방 또는 치료용 조성물.
화학식 3의 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물:

<화학식 3>
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 위암, 간암, 대장암, 폐암, 유방암 또는 전립선암인, 암의 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
1) 수탁번호 KFCC 11450P의 아스퍼질러스(Aspergillus sp.) 균주를 액체 배양한 배양액에 초산에틸 초산에틸, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 염화메틸렌, 에테르 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 가하여 추출하는 단계; 및

2) 상기 얻어진 추출물을 70 내지 90 %(v/v)의 탄소수 1 내지 4의 알코올/물 혼합 용액을 이용하여 컬럼크로마토그래피하여 분획물을 얻는 단계;

3) 상기 분획물을 40 내지 60 %(v/v)의 탄소수 1 내지 4의 알코올/물 혼합 용액으로 컬럼크로마토그래피하는 단계

를 포함하는, 화학식 1의 아세틸아라노틴 (Acetylaranotin), 화학식 2의 아세틸아포아라노틴 (Acetylapoaranotin), 또는 화학식 3의 디하이드로-디옥시아포아라노틴 (Dehydro-deoxyapoaranotin)의 제조 방법:

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>