MX2007007397A

MX2007007397A - Moleculas de acido nucleico codificando genes de desaturasa de acido graso a partir de plantas y metodos de uso.

Info

Publication number: MX2007007397A
Application number: MX2007007397A
Authority: MX
Inventors: Heiko Haertel; Jermaine Gibson; Peifeng Ren
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2004-12-20
Filing date: 2005-12-19
Publication date: 2007-08-15
Also published as: EP2180056A1; CN101120091A; EP1831380A2; CA2591230A1; JP2008523821A; ZA200704596B; US20090276921A1; BRPI0519724A2; AR052061A1; CN101942480A; AU2005323136A1; IL183892A0; WO2006073787A3; WO2006073787A2; EP2163638A1

Abstract

Esta invencion por lo general se refiere a secuencias de acido nucleico que codifican proteinas que se relacionan con la presencia de compuestos de almacenamiento de semilla en plantas. Mas especificamente, la presente invencion se refiere a secuencias de acido nucleico del tipo de FAD2 codificando proteinas reguladoras de metabolismo de lipidos y el uso de estas secuencias en plantas transgenicas. En particular, la invencion esta dirigida a metodos para manipular compuestos relacionados con el metabolismo de lipidos y para aumentar el nivel y alterar la composicion de acido graso en plantas y semilla. La invencion ademas se refiere a metodos para usar estos polipeptidos de planta novedosos para estimular el crecimiento de plantas y/o para aumentar la produccion y/o composicion de compuestos de almacenamiento de semilla.

Description

MOLÉCULAS DE ACIDO NUCLEICO CODIFICANDO GENES DE DESATURASA DE ÁCIDO GRASO A PARTIR DE PLANTAS Y MÉTODOS DE USO Esta solicitud reclama prioridad a la solicitud de E.U.A. provisional 60/637531 presentada el 20 de diciembre de 2004, incorpora a la presente por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN En la presente se describen invenciones en el campo de ingeniería genética de plantas, incluyendo moléculas de ácido nucleico aisladas codificando polipéptidos del tipo Desaturasa 2 de ácido graso (tipo FAD2) para mejorar los rasgos agronómicos, horticulturáles y de calidad. Esta invención se refiere por lo general a secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que están relacionadas con la presencia de compuestos de almacenamiento de semilla en plantas. Más específicamente, la presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico del tipo FAD2 codificando proteínas reguladoras de metabolismo de lípidos y el uso de estas secuencias en plantas transgénicas. En particular, la invención está dirigida a métodos para manipular compuestos relacionados con el metabolismo de lípidos y para aumentar el nivel de aceite y alterar la composición de ácido graso en plantas y semillas. La invención se refiere además a métodos de usar estos polipéptidos de plantas novedosos para estimular el crecimiento de la planta y/o aumentar la producción y/o composición de compuestos de almacenamiento de semilla.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El estudio y la manipulación genética de plantas tienen una historia larga que comenzó incluso antes de los estudios famosos de Gregor Mandel. En el perfeccionamiento de esta ciencia, los científicos han logrado la modificación de rasgos particulares en plantas que varían de tubérculos de papa teniendo contenido de almidón aumentado a plantas de semilla de aceite tales como cañóla y girasol teniendo contenido de ácido graso aumentado o alterado. Con el consumo y uso aumentados de aceites de planta, la modificación de contenido de aceite de semilla y niveles de aceite de semilla se ha extendido en aumento (por ejemplo, Tópfer y otros, 1995, Science 268:681-686). La manipulación de vías biosintéticas en plantas transgénicas provee un número de oportunidades para biólogos moleculares y bioquímicos de plantas para afectar el metabolismo de la planta dando auge a la producción de productos de valor superior específico. La producción o composición de aceite de semilla ha sido alterada en numerosas plantas de semilla de aóeite tradicionales tales como soya (patente de E.U.A. No. 5,965,650), cañóla (patente de E.U.A. No. 5,955,650), girasol (patente de E.U.A. No. 6,084,164) y colza (Tópfer y otros, 1995, Science 268:681-686), y plantas de semilla de aceite no tradicionales tal como tabaco (Cahoon y otros, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:11184-11188). Los aceites de semilla de plantas comprenden tanto lípidos neutrales como polares (ver tabla 1). Los lípidos neutrales contienen primariamente t riacilg licerol , que es el lípido de almacenamiento principal que se acumula en cuerpos de aceite en semillas. Los lípidos polares se encuentran principalmente en las varias membranas de las células de semilla, por ejemplo, el retículo endo-plásmico, membranas microsomales y la membrana celular. Los lípidos neutrales y polares contienen varios ácidos grasos comunes (ver tabla 2) y un rango de ácidos grasos menos comunes. La composición de ácido graso de lípidos de membrana se regula altamente y sólo un número de ácidos grasos se encuentra en lípidos de membrana. Por el otro lado, un número grande de ácidos grasos inusuales se puede incorporar en los lípidos de almacenamiento neutrales en semillas de muchas especies de plantas (Van de Loo F.J. y otros 1993, Inusual Fatty Acids in Lipid Metabolism in Plants, pp. 91-126, editor TS Moore Jr. CRC Press; Millar y otros 2000, Trends Plant Sci. 5:95-101). Se sintetizan lípidos de ácidos grasos y su síntesis se puede dividir en dos partes: la vía procariótica y la vía eucariótica (Browse y otros 1986, Biochemical J. 235:25-31; Ohlrogge & Browse 1995, Plant Cell 7:957-970). La vía procariótica se ubica en plásticos que son el sitio primario de la biosíntesis de ácido graso. La síntesis de ácido graso comienza con la conversión de acetil-CoA a malonil-CoA por acetil-CoA carboxilasa (ACCasa). Malonil-CoA se convierte a proteína portadora de malonil-acilo (ACP) por la malonil-CoA:ACP transacilasa. La enzima beta-ceto-acil-ACP-sintasa lll (KAS lll) cataliza urla reacción de condensación, en donde el grupo acilo de acetil-CoA se transfiere a malonil-ACP para formar 3-cetobutiril-ACP. En una serie posterior de reacciones de condensación, reducción y deshidratación, la cadena naciente de ácido graso en el cofactor ACP se alarga por la adición paso a paso (condensación) de dos átomos de carbono por malonil-ACP hasta que se forma una cadena de ácido graso saturado de 16 ó 18 átomos de carbono. La delta-9 acil-ACP desaturasa plastidial introduce la primera doble unión insaturada en el ácido graso. Las tioesterasas cortan los ácidos grasos del cofactor ACP y se exportan ácidos grasos libres al citoplasma en donde participan como esteres de acil-CoA grasos en la vía eucariótica. En esta vía, los ácidos grasos se esterifican por glicerol-3-fosfato aciltransferasa y acil-transferasa de ácido lisofosfatídico a las posiciones sn-1 y sn-2 de glicerol-3-fosfato, respectivamente, para dar ácido fosfatídico (PA). El PA es el precursor para otros lípidos polares y neutrales, los últimos siendo formados en la vía Kennedy (Voelker 1996, Genetic Engineering ed., Setlow 18:111-13; Shanklin & Cahoon 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641; Frentzen 1998, Lipids 100:161-166; Millar y otros 2000, Trends Plant Sci. 5:95-101).

Los l ípidos de almacenam iento en semillas se sintetizan de precursores derivados de carbohidrato. Las plantas tienen una vía glicol ítica completa en el citosol (Plaxton 1 996, Annu. Rev. Plant Physiol . Plant Mol. Biol. 47 : 165-214) y se ha mostrado que también existe una vía completa en los plásticos de cañóla (Kang & Rawsthorne 1994, Plant J . 6: 795-805) . Sacarosa es la fuente primaria de carbono y energía, transportada desde las hojas en las sem illas en desarrollo. Durante la fase de almacenamiento de las semillas, la sacarosa se convierte en el citosol para proveer los precursores metabólicos glucosa-6-fosfato y piruvato. Estos se transportan en los plásticos y se convierten en acetil-CoA que sirve como el precursor primario para la síntesis de ácidos grasos . Acetil-CoA en los plásticos por reacciones diferentes y la contribución exacta de cada reacción todavía se sigue debatiendo (Ohrlogge & Browse 1995, Plant Cell 7:957-970). Sin embargo, se acepta que una g ran parte del acetil-CoA se deriva de glucosa-6-fosfato y piruvato que se importan desde el citoplasma en los plásticos. Se produce sacarosa en los órganos originales (hojas, o en cualquier lugar que ocurra fotos íntesis) y se transporta a las semillas en desarrollo que también se denominan órganos sumideros. En las sem illas en desarrollo, sacarosa es el precursor para todos los compuestos de almacenamiento, es decir, almidón, lípidos y en parte las proteínas de almacenamiento de semilla. Por lo tanto, es claro que el metabolismo de carbohidrato, en donde sacarosa juega un papel central es muy importante para la acumulación de compuestos de almacenamiento de semilla. Los compuestos de almacenamiento tales como triaceilgliceroles (aceite de semilla) sirven como reservas de carbono y energía, que se usan durante germinación y crecimiento de la semilla joven. El aceite (vegetal) de semilla también es un componente esencial de la dieta humana y una comodidad valuable que provee existencias de alimentación para la industria química. Aunque el contenido y/o composición de lípido y ácido graso de aceite de semilla se puede modificar por los métodos tradicionales de cultivo de plantas, el advenimiento de tecnología de ADN recombinante ha permitido manipulación más fácil del contenido de aceite de semilla de una planta, y en algunos casos, ha permitido la alteración de aceites de semillas en maneras que no se podían lograr por cultivo solo (ver, por ejemplo, Tópfer y otros, 1995, Science 268:681-686). Por ejemplo, introducción de una secuencia de ácido nucleico de o12-h¡droxilasa en tabaco transgénic? resultó en la introducción de un ácido graso novedoso, ácido ricinoleico, en el aceite de semilla de tabaco (Van de Loo y otros 1995, Próc. Nati. Acad. Sci EUA 92:6743-6747). Las plantas de tabaco también han sido manipuladas para producir niveles bajos de ácido petroselínico por la introducción y expresión de una acil-ACP desaturasa de coriander (Cahoon y otros 1992, Proc. Nati. Acad. Sci EUA 89:11184-11188).

La modificación de contenido de aceite de semilla en plantas tiene ramificaciones médicas, nutricionales y económicas significativas. Con respecto a las ramificaciones médicas, los ácidos grasos de cadena larga (C 1 8 o más larga) encontrados en muchos aceites de sem illa han estado ligados a reducciones en hipercolesterolem ia y otros trastornos cl ínicos relacionados con enfermedad cardiaca coronaria (Brenner 1976, Adv. Exp. Med . Biol. 83: 85- 1 01 ) . Por lo tanto , el consumo de una planta teniendo niveles aumentados de estos tipos de ácidos grasos pueden reducir el riesgo de enfermedad del corazón. Los niveles mejorados de contenido de aceite de semilla tam bién aumentan la producción a escala grande de aceites de semilla y así reducir el costo de estos aceites . A fin de aumentar o alterar los niveles de compuestos tales como aceites de semilla en plantas, se deben identificar secuencias de ácido nucleico y proteínas regulando el metabolismo de lípido y ácido graso. Como se mencionó antes, varios ácidos nucleicos de desaturasa tales como ácido nucleico de ?6-desaturasa, ácido nucleico de ?12-desaturasa y ácido nucleico de acil-ACP desaturasa se han clonado y demostrado codificar enzimas requeridas para síntesis de ácido graso en varias especies de plantas (Miquel & Browse, en Seed Development and Germination , Galili y otros (eds. ), Marcel Dekker, Nueva York, pp. 169- 193, 1994; Ohlrogge & Browse 1995, Plant Cell 7: 957-970). Las secuencias de ácido nucleico de oleosina de dichas diferentes especies como cañóla, soya , zanahoria, pino y Arabidopsis thaliana también se han clonado y determinado para codificar proteínas asociadas con la membrana de monocapa de fosfolípido de cuerpos oleosos en estas plantas. Aunque se conocen varios compuestos que generalmente afectan el desarrollo de plantas y semillas, hay una necesidad clara por identificar específicamente los factores que sean más específicos para la regulación de desarrollo de acumulación del compuesto de almacenamiento y para identificar genes que tengan la capacidad de conferir producción de aceite alterada o aumentada a su planta huésped y a otras especies de plantas. Otro problema esencial para la presente invención fue proveer una manera más eficiente de silenciar desaturas de ácido graso. Otro problema esencial para la presente invención fue modificar específicamente el contenido de ácido graso de semillas de aceite. Otro problema esencial para la presente invención fue la disminución del contenido de ácido linólico de semillas de aceite. Esta invención describe secuencias de ácido nucleico de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitafissimum, Hordeum vulgare o Tritic?m aestivum. Estas secuencias de ácido nucleico se pueden usar para alterar o aumentar los niveles de compuestos de almacenamiento de semilla tales como proteínas, azúcares o aceites, en plantas, incluyendo plantas transgénicas, tales como cañóla, linaza, soya, girasol, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, arroz, pimienta, tapetes, algodón, palma de aceite, palma de coco, lino, castor y cacahuate, que son plantas de semilla de aceite conteniendo cantidades altas de compuestos lípidos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee secuencias de ácido nucleico y aminoácido aisladas novedosas asociadas con el metabolismo de compuestos de almacenamiento de semilla en plantas, en particular con secuencias que son del tipo FAD2. Otro tema de la presente invención es un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de a. X1X2X3X4X5X6X7LX8X9PX10YL, en donde X1 no es M y X3 nos es T y X6X7 no son FV, b. GX11X12X13X1 X15X1ßX17X18HX19X 0PX21X22X23X2 X25X 6X27X28ER, en donde X16 no es G y en donde X20 no es F y en donde X21X22 no son NA, c. H?29?30p?31?32?33?34?35?3ß?37?38ER en onde ?30 n0 es F y en donde X31X32 no son NA, d. L?39?40?41?42?43?44?45G?46?47?48?49?50?51?52??53?54p ep donde X41 no es Y y X45 no es Q y X48 no es S y X49 no es M y X50 no es I, e. TX55X56X57X58HX59X60X61X62X63X6<"X65X66X67Xe8X69X70X71T en donde X67 no es N, f. PX72X73X74X75X76X77X78X79X80X81X82X83X84X85X8ß, en donde ? 84 ? 85? 86 n o s o n w? v y en donde X tiene el significado de cualquier aminoácido si no se ha definido antes. Una alineación de secuencia para determinar las secuencias de péptido comunes a a f de la reivindicación 1 se genera de preferencia usando Align X (22 de agosto de 2003) del Vector NTI Suite 9.0. Los parámetros usados para la alineación múltiple son de preferencia los siguientes: penalidad por abertura de Gap: 1 0; penalidad por extensión de Gap: 0.05; rango de penalidad por separación de Gap: 8; % de identidad por retraso de alineación: 40. En una modalidad preferida, la presente invención reclama un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de a. AWYPYX87YX88NPX89GRLVHIX90VQLTLGWPLYLAX91 NX92 SGRPYPRFACH FDPYG PIYN DRER, b. FI SDVGV, c. ALX93KLX9 SX95FG FWWVVRVYGVP, d. I LGEYYQFDX96TPVAKAT, e . y en donde X tiene el significado de cualquier aminoácido. Una alineación de secuencia para determinar las secuencias de péptido com unes a a d de la reivindicación 2 se genera de preferencia usando Al ign X (22 de agosto de 2003) del Vector NTI Suite 9.0. Los parámetros usados para la alineación múltiple son de preferencia los sig uientes: penalidad por abertura de Gap: 10; penalidad por extensión de Gap: 0.05; rango de penalidad por separación de Gap: 8; % de identidad por retraso de alineación: 40. El polipéptido aislado de la presente invención puede incluir una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las secuencias de aminoácidos de la reivindicación 1. El polipéptido aislado de la presente invención puede incluir una, dos, tres o cuatro de las secuencias de aminoácidos de la reivindicación 2. X significa cualquir aminoácido si no está definido en ningún lugar en la reivindicación 1, en especial, G, A, V, L, I, F, Y, W, P, D, E, N, Q, S, T, C, M, K, R, H. X1 no es M. X1 es en una modalidad preferida un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de G, A, V, L, I, F, Y, W, P, D, E, N, Q, S, T, C, K, R y H, en una modalidad más preferida a partir del grupo que consiste de F, T y H y todavía en una modalidad más preferida, H. X3 no es T, X3 es en una modalidad preferida un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de G, A, V, L, I, F, Y, W, P, D, E, N, Q, S, C, M, K, R y H. En una modalidad más preferida a partir del grupo que consiste de L, A, V, F y todavía en una modalidad más preferida V o F. X6 no es F y X7 no es V. X6 y X7 son en una modalidad preferida independientemente uno del otro, un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de G, A, L, I, Y, W, P, D, E, N, Q, S, T, C, M, K y H, en una modalidad más preferida a partir del grupo que consiste de P, L y T y todavía en una modalidad más preferida, X6 es P o L y X7 es L o T y en otra modalidad preferida X6 es L y X7 es T. X15 no es G. X15 es en una modalidad preferida un espacio o un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de A, V, L, I, F, Y, W, P, D, E, N, Q, S, T, C, M, K, R y H, en una modalidad más preferida, X16 es R o un espacio, se prefiere más X16 es R. Espacio significa que no hay aminoácido en esta posición. X20 no es F. X20 es en una modalidad preferida, un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de G, A, V, L, !, Y, W, P, D, E, N, Q, S, T, C, M, K, R y H, en una modalidad más preferida N o D y todavía en una modalidad más preferida, D. X21 no es N y X22 no es A. X21 y X22 son en una modalidad preferida independientemente uno del otro un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de G, V, L, I, F, Y, W, P, D, E, Q, S, T, C, M, K, R y H. En una modalidad más preferida a partir del grupo que consiste de D, Y, H, S, G, I. Todavía en una modalidad más preferida, X21 es D, Y o H, más preferido Y y X22 es S o G, más preferido G. X30 no es F. X30 es en una modalidad preferida un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de G, A, V, L, I, Y, W, P, D, E, N, Q, S, T, C, M, K, R y H, en una modalidad más preferida, X30 es N o D y todavía en una modalidad más preferida X30 es D. •31 no es N y X no es A. X -31 y X 32 son en una modalidad preferida independientemente uno del otro un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de G, V, L, I, F, Y, W, P, D, E, Q, S, T, C, M, K, R y H, en una modalidad más preferida a partir del grupo que consiste de D, Y, H, S, G. Todavía en una modalidad más preferida X31 es D, Y o H, más preferido Y y X32 es S o G, más preferido G. X41 no es Y. X41 es en una modalidad preferida un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de G, A, V, L, I, F, W, P, D, E, N, Q, S, T, C, M, K, R y H, en una modalidad más preferida X41 es L. X45 no es Q. X45 es en una modalidad preferida un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de G, A, V, L, I, F, Y, W, P, D, E, N, S, T, C, M, K, R y H, en una modalidad más preferida a partir del grupo que consiste de M, K y F y todavía en una modalidad más preferida X45 es F. X48 nos es S y X49 no es M y X50 no es I. X48, X49 y X50 son independientemente uno del otro en una modalidad preferida, un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Q, W, L y V. Todavía en una modalidad más preferida, X48 es Q o W, más preferido X48 es W y X49, X50 son independientemente uno del otro L o V, más preferido X49, X50 son independientemente uno del otro V. X67 no es N. X67 es en una modalidad preferida un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de G, A, V, L, I, F, Y, W, P, D, E, Q, S, T, C, M, K, R y H. En una modalidad más preferida X67 es H o R y todavía en una modalidad más preferida X67 es H. X84 no es W y X85 no es Y y X86 no es V. X84, X85 y X8ß son en una modalidad preferida independientemente uno del otro un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de G, A, L, I, F, P, D, E, N, Q, S, T, C, M, K, R y H. X8 X85X8ß son en una modalidad preferida independientemente uno del otro seleccionados a partir del grupo que consiste de S, F, V, P, M, A, L, K y G y todavía en una modalidad más preferida X84X85X86 son VAK. Esta invención también provee una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una proteína conteniendo una secuencia de aminoácido mencionada antes como (de la reivindicación 1 o reivindicación 2) y un polipéptido aislado codificado por dicha secuencia de ácido nucleico (de la reivindicación 3). En otra modalidad de la presente invención, el polipéptido aislado mencionado antes (de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2) funciona como un modulador de un compuesto de almacenamiento de semilla en microorganismos o en plantas. En otra modalidad de la presente invención, el polipéptido aislado antes mencionado (de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2) se usa para aumentar el nivel de un ácido oleico en una planta transgénica en comparación con la variedad de tipo silvestre de la planta, por ejemplo, 1% en peso, 2.5% en peso, 5% en peso, 7.5% en peso, 10% en peso, 12.5% en peso, 15% en peso, 17.5% en peso, 20% en peso, 22.5% en peso, 25% en peso o más. En una modalidad preferida, el polipéptido aislado antes mencionado (de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2) tiene una secuencia de polipéptido como se describe en SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC lp NO: 24, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 34 o SEC ID NO: 36. En otra modalidad, el polipéptido aislado antes mencionado (de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2) se selecciona a partir del grupo que consiste de a. una secuencia de polipéptido como se describe en SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO:26, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 34 o SÉC ID NO: 36; b. una secuencia de polipéptido codificada por una secuencia de polinucleótido como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35; c. una secuencia de polipéptido teniendo al menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de a) o b) anterior. La presente invención provee además un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada a partir del grupo que consiste de: a. una secuencia de polinucleótido como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35; b. una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido como se describe en SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO:26, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 34 o SEC ID NO: 36; c. una secuencia de polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el ácido nucleico de a) o b) anterior; d. una secuencia de polinucleótido que es complementaria al ácido nucleico de a) o b) anterior; y e. una secuencia de polinucleótido que hibrida bajo condiciones severas al ácido nucleico de a) o b) anterior. La presente invención provee además un polipéptido aislado seleccionado a partir del grupo que consiste de a. una secuencia de polipéptido codificada por una secuencia de polinucleótido como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35; b. una secuencia de polipéptido como se describe en SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO:26, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 34 o SEC ID NO: 36; c. una secuencia de polipéptido teniendo al menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de a) o b) anterior. La presente invención también provee un ácido nucleico aislado de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitalissimum, Hordeum vulgare o Tricticum aestivum codificando una proteína de metabolismo de lípido (LMP), o una porción de la misma. Estas secuencias se pueden usar para modificar o aumentar lípidos y ácidos grasos, cofactores y enzimas en microorganismos y plantas, por ejemplo, por el aumento del nivel de ácido oleiCo por 1% en peso, 2.5% en peso, 5% en peso, 7.5% en peso, 10% en peso, 12.5% en peso, 15% en peso, 17.5% en peso, 20% en peso, 22.5% en peso, 25% en peso o más. Las plantas Arabidopsis son conocidas por producir cantidades considerables de ácidos grasos como ácido linoleico y linolénico (ver, por ejemplo, tabla 2) y para su similitud cercada en muchos aspectos (homología genética, etc.) a la planta de cosecha de aceite Brassica. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico que se originan de una plante como Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum u organismos relacionados son especialmente adecuados para modificar el metabolismo de l ípido y ácido g raso en un huésped , en especial en microorganismos y plantas. Además, los ácidos nucleicos de la planta Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum u orga ismos relacionados se pueden usar para identificar aquellas secuencias de ADN y enzimas en otras especies, que son útiles para modificar la biosíntesis de moléculas precursoras de ácidos grasos en los organismos respectivos . La presente invención además provee un ácido nucleico aislado que comprende un fragmento de al menos 1 5 nucleótidos de un ácido nucleico de una planta {Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum) que codifica una LMP , o una porción del mismo. La presente invención también provee pofipéptidos codificados por los ácidos nucleicos , y polipéptidos heterólogos que comprenden polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos, y a nticuerpos para aquellos polipéptidos. Adicionalmente, la presente invención se refiere a y provee el uso de ácidos nucleicos de LMP en la producción de plantas transgénicas teniendo un nivel o composición modificada de un compuesto de almacenamiento de sem illa. En respecto a una composición alterada , la presente invención se puede usar para , por ejemplo, aumentar el porcentaje de ácido oleico relativo a otros aceites de planta, por ejemplo, ácido linólico o ácido linoleico, por ejemplo, por 1% en peso, 2.5% en peso, 5% en peso, 7.5% en peso, 10% en peso, 12.5% en peso, 15% en peso, 17.5% en peso, 20% en peso, 22.5% en peso, 25% en peso o más. Un método dé producir una planta transgénica con un nivel o composición modificada de un compuesto de almacenamiento de semilla incluye los pasos de transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de LMP, y generar una planta con un nivel o composición modificada del compuesto de almacenamiento de semilla de la célula vegetal. En una modalidad preferida, la planta es una especie productora de aceite seleccionada a partir del grupo que consiste de cañóla, linaza, soya, girasol, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, arroz, pimiento, tapetes, algodón, palma ce aceite, palma de coco, lino, castor y cacahuate, por ejemplo. De acuerdo con la presente invención, las composiciones y métodos descritos en la presente se pueden usar para alterar la composición de una LMP en una planta transgénica y para aumentar o disminuir el nivel de una LMP en una planta transgénica que comprende aumentar o disminuir la expresión de un ácido nucleico de LMP en la planta. La expresión aumentada o disminuida del ácido nucleico de LMP se puede lograr a través de sobreexpresión transgénica, propuestas de cosupresión, propuestas anti-sentido y mutagénesis in vivo del ácido nucleico de LMP. La presente invención también se puede usar para aumentar o disminuir el nivel de un lípido en un aceite de semilla, por 1% en peso, 2.5% en peso, 5% en peso, 7.5% en peso, 10% en peso, 12.5% en peso, 15% en peso, 17.5% en peso, 20% en peso, 22.5% en peso, 25% en peso o más, para aumentar o disminuir el nivel de un ácido graso en un aceite de semilla, por ejemplo, por 1% en peso, 2.5% en peso, 5% en peso, 7.5% en peso, 10% en peso, 12.5% en peso, 15% en peso, 17.5% en peso, 20% en peso, 22.5% en peso, 25% en peso o más, o para aumentar o disminuir el nivel de un almidón en una semilla o planta, por ejemplo, por 1% en peso, 2.5% en peso, 5% en peso, 7.5% en peso, 10% en peso, 12.5% en peso, 15% en peso, 17.5% en peso, 20% en peso, 22.5% en peso, 25% en peso o más. Los microARNs (miARNs) han surgido como reguladores a base de ARN evolucionariamente conservados de expresión genética en plantas y animales. Los miARNs (-21 a 25 nt) surgen de precursores más grandes con una estructura de tallo con lazo que se transcriben de genes codificadores de no proteína. miARN busca un mARN específico para suprimir la expresión genética a niveles post-transcripcionales (es decir, degrada mARN) o de traducción (es decir, inhibe síntesis de proteína) (Bartel D 2004, Cell 116, 281-297). Se puede manipular precursor de miARN (pre-miARN) de tal manera que miARN endógeno codificado por pre-miARN se reemplaza por un miARN para encontrar un gen de interés, por ejemplo, gen reportero dsRed.

La presente invención provee además un método de producir una planta transgénica teniendo un nivel aumentado de ácido oleico en comparación con el del tipo silvestre que comprende, a. un primer paso de transformar una célula vegetal con una construcción de precursor de ARN, y b. un segundo paso de generar a partir de la célula vegetal la planta transgénica, en donde dicha construcción contiene una secuencia de micro ARN precursor en una célula vegetal ligada operativamente a una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de micro ARN precursora, en donde la secuencia de nucleótido que codifica dicha secuencia precursora de micro ARN se selecciona a partir del grupo que consiste de a. una secuencia de nucleótido como se ilustra en SEC ID NO: 47 b. una secuencia de polinucleótido teniendo al menos 70% de identidad de secuencia con el ácido nucleico de a) anterior; c. una secuencia de polinucleótido que es complementaria al ácido nucleico de a) anterior; y d. una secuencia de polinucleótido que hibrida bajo condiciones severas al ácido nucleico de a) anterior. Los genes de maíz que codifican desaturasas de ácido graso, se expresan en muchos tejidos incluyendo semillas. Una complementaria de 19 a 21 nt (por ejemplo, ACCAGACCCCGAACGCCGC como se describe en SEC ID NO: 40) a una región codificadora de desaturasa de maíz o 5' UTR y 3'UTR en mARN se puede usar para reemplazar Zm miR166 (5' tcggaccaggcttcattcccc 3') como se describe eh SEC ID NO: 37 y SEC ID NO: 38 en precursor Zm miR166. El tránsgen entonces se puede transformar en maíz. La expresión del gen Zm miR166 manipulado se puede controlar por un promotor específico de semilla de maíz (por ejemplo, promotor Zein de 10 KD específico de endoesperma o promotor específico de embrión Globl). Un micro ARN (por ejemplo, ACCAGACCCCGAACGCCGC como se describe en SEC ID NO: 40) se genera por lo general en semillas cuando se procesa el precursor Zm miR166 manipulado. Este miARN se puede unir específicamente a la región en un mARN de desaturasa de ácido graso de maíz complementario al miARN, lo que puede resultar en una reducción de esta expresión de desaturasa de maíz buscada a niveles transcripcionales o de traducción en semillas por maquinaria de silenciamiento genético. Como un resultado, la planta transgénica, de preferencia zea mays podría tener nivel y composición de ácido graso deseable como por ejemplo porcentajes de ácido linolénico bajo y/o ácido oleico medio o alto en semillas. La presente invención provee además un método para alterar, de preferencia para reducir lá expresión de desaturasa de ácido graso, en especial como se codifica por ortólogos FAD2, se prefiere además como se codifica por los ácidos nucleicos como se ilustra en el apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35 al producir una planta transgénica teniendo un nivel aumentado de ácido oleico en comparación con el tipo silvestre que comprende, a. un primer paso de transformar una célula vegetal con una construcción de precursor de ARN, y b. un segundo paso de generar a partir de la célula vegetal la planta transgénica, dicha construcción conteniendo un promotor que impulsa expresión en una célula vegetal ligada operativamente a una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de micro ARN precursora, en donde la secuencia de nucleótido que codifica dicha secuencia precursora de micro ARN se selecciona a partir del grupo que consiste de a. una secuencia de nucleótido como se ilustra en SEC ID NO: 47 b. una secuencia de polinucleótido teniendo al menos 70% de identidad de secuencia con el ácido nucleico de a) anterior; c. una secuencia de polinucleótido que es complementaria al ácido nucleico de a) anterior; y d. una secuencia de polinucleótido que hibrida bajo condiciones severas al ácido nucleico de a) anterior. En una modalidad preferida, la secuencia de nucleótido que codifica una secuencia precursora de micro ARN se ha manipulado en una manera que la secuencia de nucleótido que codifica para un micro ARN como se ilustra en SEC ID NO: 37 es reemplazada por una secuencia de nucleótido que codifica para un micro ARN como se ilustra en SEC ID NO: 40. El uso de precursores de micro ARN manipulados y micro ARN para modular la expresión de un gen es bien conocido y se describe, por ejemplo, en US 2004/0268441, que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad. Los precursores de micro ARN manipulados se pueden usar para modular la expresión de uno o de varios genes blanco, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o cinco de las secuencias de nucleótido como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35. El uso de precursores de micro ARN manipulados y micro ARN para modular la expresión de un gen se puede combinar con otros métodos de ingeniería genética bien conocidos al experto en la técnica. El promotor puede ser ubicuo o específico de tejido tal como específico de semilla y específico de endoesperma. El promotor es de preferencia un promotor específico de semilla. Este método se puede usar para aumentar eficientemente el nivel de ácido oleico en una semilla, por ejemplo, por 1% en peso, 2.5% en peso, 5% en peso, 7.5% en peso, 10% en peso, 12.5% en peso, 15% en peso, 17.5% en peso, 20% en peso, 22.5% en peso, 25% en peso o más. El uso de precursores de micro-ARN manipulados y micro-ARN para modular la expresión de un gen se puede aplicar a cada planta, en especial a las plantas descritas en la presente, en una modalidad preferida a plantas monocotiledóneas y en una modalidad más preferida a zea mays. Otro objeto de la presente invención es un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada a partir del grupo que consiste de: a. una secuencia de nucleótido como se ilustra en SEC ID NO: 47 b. una secuencia de polinucleótidp teniendo al menos 70% de secuencia de identidad con el ácido nucleico de a) anterior; c. una secuencia de polinucleótido que es complementaria al ácido nucleico de a) anterior; y d. una secuencia de polinucleótido que hibrida bajo condiciones severas al ácido nucleico de a) anterior. Esta secuencia de nucleótido se puede usar para modular la expresión de un gen de interés, en especial para desregular la expresión de un gen blanco, en especial de las secuencias de nucleótido antes mencionadas. Otro objeto de la presente invención es el precursor de micro ARN codificado por una secuencia de nucleótido seleccionada a partir del grupo que consiste de: a. una secuencia de nucleótido como se ilustra en SEC ID NO: 47 b. una secuencia de polinucleótido teniendo al menos 70% de secuencia de identidad con el ácido nucleico de a) anterior; c. una secuencia de polinucleótido que es complementaria al ácido nucleico de a) anterior; y d. una secuencia de polinucleótido que hibrida bajo condiciones severas al ácido nucleico de a) anterior. Otro objeto de la presente invención es el micro-ARN como se ilustra en SEC ID NO: 40. Más específicamente, la presente invención incluye y provee un método para aumentar contenido de aceite total en una semilla que comprende: tranformar una planta con una construcción de ácido nucleico que comprende como componentes ligados operativamente, secuencias promotoras y de ácido nucleico capaces de modular el nivel de mARN del tipo FAD2 o proteína del tipo FAD2, y hacer crecer la planta. Además, la presente invención incluye y provee un método para aumentar el nivel de ácido oleico en una semilla que comprende: transformar una planta con una construcción de ácido nucleico que comprende como componentes ligados operativamente, un promotor, una secuencia de ácido nucleico estructural capaz de aumentar el nivel de ácido oleico, y hacer crecer la planta. También se incluye en la presente una semilla producida por una planta transgénica transformada por una secuencia de ADN de LMP, en donde la semilla contiene la secuencia de ADN de LMP y en donde la planta es de cultivo verdadero para un nivel modificado de un compuesto de almacenamiento de semilla. La presente invención incluye además un aceite de semilla producido por la semilla antes mencionada. La presente invención además provee vectores que comprenden los ácidos nucleicos, células huésped conteniendo los vectores, y materiales de planta descendente prod ucidos al transformar una célula vegetal con los ácidos n ucleicos y/o vectores. De acuerdo con la presente invención, los compuestos, composiciones, y métodos descritos en la presente se pueden usar para aumentar o disminuir los porcentajes relativos de un lípido en un aceite de semilla, aumentar o disminuir el nivel de un lípido en un aceite de sem illa , o aumentar o disminuir el nivel de ácido graso en un aceite de semilla, o aumentar o disminuir el nivel de un almidón u otro carbohidrato en una semilla o planta , o aumentar o disminuir el nivel de proteínas en una semilla o planta , por ejemplo, por 1 % en peso, 2.5% en peso, 5% en peso, 7.5% en peso, 10% en peso, 12.5% en peso, 1 5% en peso, 1 7.5% en peso, 20% en peso, 22.5% en peso, 25% en peso o más. Las manipulaciones descritas en la presente también se pueden usar para mejorar la germinación de semilla y crecimiento de las semillas jóvenes y plantas y para realzar la producción de planta de compuestos de almacenamiento de semilla.

Se provee además un método de producir un nivel mayor o menor que el normal o típico de compuesto de almacenamiento en una planta transgénica que expresa un ácido nucleico de LMP de Arabidopsis thallana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum en la planta transgén ica , en donde la planta transgénica es Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare, Triticum aestivum, Helianthus anuus o Beta vulgaris o una especie diferente de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum. También se incluye en la presente composiciones y métodos de la modificación de la eficiencia de producción de un compuesto de almacenam iento de semilla . Como se usa en la presente, en donde la frase Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare, Triticum aestivum, Helianthus anuus o Beta vulgaris se usa , esto también significa Arabidopsis thaliana y/o Brassica napus y/o Glycine max y/o Oryza sativa y/o Zea mays y/o Linum usitatissimum y/o Hordeum vulgare y/o Triticum aestivum y/o Helianthus anuus y/o Beta vulgaris.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proveer ácidos nucleicos de LMP aislados novedosos y secuencias de aminoácidos de LM P aisladas de Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usifatissimum, Horde?m vulgare o Triticum aestivum así como fragmentos activos, análogos, y ortólogos de los mismos. Aquellos fragmentos activos, análogos, y ortólogos también pueden ser de especies de planta diferentes como un experto en la técnica lo apreciará que otras especies de planta también contrendrán aquellos o ácidos nucleicos relacionados. Otro objeto de la presente invención es proveer plantas transgén icas que tienen niveles modificados de compuestos de almacenam iento de semilla , y en particular, niveles modificados de un l ípido, un ácido graso o un azúcar.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención, incluyendo agonistas y/o fragmentos de los mismos, también tienen usos que incluyen modular el crecimiento de planta, y potencialmente producción de planta, de preferencia aumentar el crecimiento de planta bajo condiciones adversas (sequía, luz, frío, UV) al modular la eficiencia de uso de luz. Además, los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención mejorarán la germinación de semilla y latencia de semillas y, por tanto, mejorarán el crecimiento de plantas y/o producción de compuestos de almacenamiento de semilla. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden comprender además un promotor ligado operativamente o región promotora parcial. El promotor puede ser un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido. El promotor constitutivo puede ser, por ejemplo, el superpromotor (Ni y otros, Plant J. 7:661-676, 1995; US5955646). El promotor específico de tejido puede ser activo en tejido vegetativo o tejido reproductivo. El promotor específico de tejido activo en tejido reproductivo puede ser un promotor específico de semilla. El promotor específico de tejido activo en tejido vegetativo puede ser un promotor específico de raíz, específico de brote, específico de meristema o específico de hoja. La molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención todavía puede comprender además una secuencia no traducida de 5', secuencia no traducida de 3', intrones, o la combinación de los mismos.

La presente invención provee también un método para aumentar el número y/o tamaño de uno o más órganos de planta de una planta que expresa un ácido nucleico aislado de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum codificando una LMP, o una porción de la misma. Más específicamente, se puede manipular el tamaño de la semilla y/o número de semillas y/o peso. Otro objeto de la presente invención es proveer métodos para producir dichas plantas transgénicas antes mencionadas. Otro objeto de la presente invención es proveer semillas y aceites de semilla de dichas plantas transgénicas antes mencionadas. Estos y otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada de las modalidades descritas y las reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención se puede entender mejor a partir de la siguiente descripción detallada y los dibujos acompañantes y lista de secµencias que forman una parte de esta solicitud.

Las figuras 1A-D. SEC ID NO: 1-4. Secuencia de ácido nucleico, marco de lectura abierta del ácido nucleico y secuencias de aminoácidos del gen AtFAD-01 de Arabidopsis thaliana. Las figuras 2A-C. SEC ID NO: 5-8. Secuencia de ácido nucleico, marco de lectura abierta del ácido nucleico y secuencias de aminoácidos del gen GmFAD-01 de Glycine max. Las figuras 3A-C. SEC ID NO: 9-12. Secuencia de ácido nucleico, marco de lectura abierta del ácido nucleico y secuencia de aminoácidos del gen Gm-FAD-02 de Glycine max. Las figuras 4A-C. SEC ID NO: 13-16. Secuencia de ácido nucleico, marco de lectura abierta del ácido nucleico y secuencia de aminoácidos del gen GmFAD-03 dé Glycine max. Las figuras 5A-C. SEC ID NO: 17-20. Secuencia de ácido nucleico, marco de lectura abierta del ácido nucleico y secuencia de aminoácidos del gen ZmFAD-01 de Zea mays. Las figuras 6A-C. SEC ID NO: 21-24. Secuencia de ácido nucleico, marco de lectura abierta del ácido nucleico y secuencia de aminoácidos del gen OsFAD-01 de Oryza sativa. Las figuras 7A-C. SEC ID NO: 25-28. Secuencia de ácido nucleico, marco de lectura abierta del ácido nucleico y secuencia de aminoácidos del gen LuFAD-01 de Linum usitatissim?m. Las figuras 8A-C. SEC ID NO: 29-32. Secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos del gen HvFAD-01 de Hordeum vulgare.

Las figuras 9A-C. SEC ID NO: 33-36. Secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos del gen TaFAD-01 de Triticum aestivum. La figura 10. Datos de ácido graso de semilla T2 obtenidos con OsFAD-01 impulsado por el promotor USP y transformado en el mutante fad2 de Arabidopsis (los antecedentes genéticos de las líneas transformadas es Columbia-2, cada barra representa los datos de ácido graso obtenidos con 5 mg de semillas en volumen de una planta individual). La figura 11. Datos de ácido graso de semilla T2 obtenidos con HvFAD-01 impulsados por el promotor USP y transformados en el mutante fad2 de Arabidopsis (los antecedentes genéticos de las líneas transformadas es Columbia-2, cada barra representa los datos de ácido graso obtenidos con 5 mg de semillas en volumen de una planta individual). La figura 12. Diagrama que ilustra la homología elativa entre las secuencias de aminoácidos descritas de AtFAD-01, GmFAD-01, GmFAD-02, GmFAD-03, LuFAD-01, HvFAD-01, TaFAD-01, OsFAD-01 y ZmFAD-01. El diagrama fue generado usando Align X (22 de agosto de 2003) del Vector NTI Suite 9.0. Los parámetros usados para la alineación múltiple fueron los siguientes: penalidad por abertura de Gap: 10; penalidad por extensión de Gap: 0.05; rango de penalidad por separación de Gap: 8; % de identidad para retraso de alineación: 40.

La figura 13. Tabla que ilustra la similitud entré las secuencias de aminoácidos AtFAD-01, GmFAD-01, GmFAD-02, GmFAD-03, LuFAD-01, HvFAD-01, TaFAD-01, OsFAD-01 y ZmFAD-01. La tabla fue generada usando Align X (22 de agosto de 2003) del Vector NTI Suite 9.0. Para otros parámetros ver la leyenda de la figura 12. La figura 14. Diagrama que ilustra la homología relativa entre las secuencias de ácido nucleico descritas AtFAD-01, GmFAD-01, GmFAD-02, GmFAD-03, LuFAD-01, HvFAD-01, TaFAD-01, OsFAD-01 y ZmFAD-01. El diagrama fue generado usando Align X (22 de agosto de 2003) del Vector NTI Sµite 9.0. Los parámetros usados para la alineación múltiple fueron los siguientes: penalidad por abertura de Gap: 15; penalidad por extensión de Gap: 6.66; rango de penalidad por separación de Gap: 8; % de identidad por retraso de alineación: 40. La figura 15. Tabla que ilustra la similitud entre las secuencias de ácido nucleico AtFAD-01, GmFAD-01, GmFAD-02, GmFAD-03, LuFAD-01, HvFAD-01, TaFAD-01, OsFAD-01 y ZmFAD-01. La tabla fue generada usando Aligh X (22 de agosto de 2003) del Vector NTI Suite 9.0. Para otros parámetros ver la leyenda de la figura 14. La figura 16. Alineación de secuencia de secuencias de aminoácidos AtFAD-01, GmFAD-01, GmFAD-02, GmFAD-03, LuFAD-01, HvFAD-01, TaFAD-01, OsFAD-01 y ZmFAD-01. La alineación fue generada usando Align X (22 de agosto de 2003) del Vector NTI Suite 9.0. Los parámetros usados para la alineación múltiple fueron los siguientes: penalidad por abertura de Gap: 15; penalidad por extensión de Gap: 6.66; rango de penalidad por separación de Gap: 8; % de identidad por retraso de alineación: 40.

DEFINICIONES GENERALES Se debe entender que esta invención no esté limitada a la metodología particular, protocolos, líneas celulares, especies o género de plantas, construcciones, y reactivos descritos como tales. También se debe entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares sólo, y no debe limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada sólo por las reivindicaciones anexas. Cabe señalar que como se Usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un/uno/una", "y" y "el/la" incluyen referencia en plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un vector" es una referencia a uno o más vectores e incluye equivalentes de los mismos conocidos a aquellos expertos en la técnica, y así sucesivamente. El término "aproximadamente" se usa en la presente para decir, aproximadamente, casi, alrededor de, o en la región de. Cuando el término "aproximadamente" se usa en la presente para modificar un valor numérico arriba o debajo del valor mencionado por una discrepancia de 20 por ciento, preferiblemente 10 por ciento, más preferible 5 por ciento arriba o abajo (mayor o menor).

Como se usa en la presente, la palabra "o" significa cualquier un miembro de una lista particular y también incluye cualquier combinación de miembros de esa lista. Como se usa en la presente, el término "secuencia de aminoácidos" se refiere a una lista de abreviaciones, letras, caracteres o palabras representando residuos de aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la comisión IUPAC-IUB Biochemical Nomenclatura Comisión. Asimismo, los nucleótidos pueden ser referidos por sus códigos de una letra comúnmente aceptados. Las abreviaciones usadas en la presente son códigos de una letra convencionales para los aminoácidos: A, alanina; B, asparagina o ácido aspártico; C, cisteína; D, ácido aspártico; E, glutamato, ácido glutámico; F, fenilalanina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina, T, treonina; V, valina; W, triptofano; Y, tirosina; Z, glutamina o ácido glutámico (ver L. Stryer, Biochemistry, 1988, W. H. Freeman and Company, Nueva York). La letra "x" como se usa en la presente dentro de una secuencia de aminoácidos puede significar cualquier residuo de aminoácidos. El término "ácido nucleico" se refiere a desoxyribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros o híbridos de los mismos en forma de sentido o anti-sentido de una o doble cadena.

La frase "secuencia de ácido nucleico" como se usa en la presente se refiere a una lista consecutiva de abreviaciones, letras, caracteres o palabras, que representan nucleótidos. En una modalidad, un ácido nucleico puede ser una "sonda" que es un ácido nucleico relativamente corto, usualmente menos de 100 nucleótidos en longitud. A menudo una sonda de ácido nucleico es de alrededor de 50 nucleótidos en longitud a aproximadamente 10 nucleótidos en longitud. Una "región blanco" de un ácido nucleico es una poróión de un ácido nucleico que se identifica como de interés. Una "región codificadora" de un ácido nucleico es la porción del ácido nucleico, que se transcribe y traduce en una manera específica de secuencia para producirse en un polipéptido o proteína particular cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. La región codificadora se dice que codifica dicho polipéptido o proteína. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificados de modo conservador de la misma (por ejemplo, degenerar sustituciones de codon) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. El término "ácido nucleico" se usa de manera intercambiable en la presente con "gen", "cADN", "mARN", "oligonucleótido" y "polinucleótido". Como se usa en la presente, los términos "complementario" o "complementariedad" se usan en referencia a secuencias de nucleótido relacionadas por las reglas de emparejamiento entre bases. Por ejemplo, la secuencia 5'-AGT-3' es complementaria a la secuencia 5'-ACT-3'. La complementariedad puede ser "parcial" o "total". Complementariedad "parcial" es en donde una o más bases de ácido nucleico no se igualan de acuerdo con las reglas de emparejamiento entre bases. Complementariedad "total" o "completa" entre ácidos nucleicos es en donde cada y toda base de ácido nucleico se iguala con otra base bajo las reglas de emparejamiento entre bases. El grado de complementariedad entre cadenas de ácido nucleico tiene efectos significativos en la eficiencia y resistencia de hibridación entre cadenas de ácido nucleico. Un "complemento" de una secuencia de ácido nucleico como se usa en la presente se refiere a una secuencia de nucleótido cuyos ácidos nucleicos muestran complementariedad total a los ácidos nucleicos de la secuencia de ácido nucleico. El término "genoma" o "ADN genómico" se refiere a la información genética hereditaria de un organismo huésped. Dichos ADN genómico comprende el ADN del núcleo (también referido como ADN cromosómico) pero también el ADN de los plástidos (por ejemplo, cloroplastos) y otros orgánulos celulares (por ejemplo, mitocondria). Preferiblemente, los términos genoma o ADN genómico se refieren al ADN cromosómico del núcleo. El término "ADN cromosómico" o "secuencia de ADN cromosómico" se debe entender como el ADN genómico del núcleo celular independiente del estado del óiclo celular. Por lo tanto, el ADN cromosómico se puede organizar en cromosomas o cromatidos, se puede condensar o desenrollar. Una inserción en al ADN cromosómico se puede demostrar y analizar por varios métodos conocidos en la técnica como, por ejemplo, análisis de reacción en cadena de polimerasa (PCR), análisis de Southern blot, hibridación de fluorescencia in situ (FISH), y PCR in situ. El término "tipo silvestre", "natural" o de "origen natural" significa con respecto a un organismo, polipéptido, o secuencia de ácido nucleico, que dicho organismo ocurre de manera natural o está disponible en al menos un organismo que ocurre de manera natural que no está cambiado, mutado, o de lo contrario manipulado por el hombre. Los términos "secuencia de ácido nucleico heterólogo" o "ADN heterólogo" se usan de forma intercambiable para referir a una secuencia de nucleótido, que está ligada a o se manipula para ligarse a, una secuencia de ácido nucleico al que no se liga en naturaleza, o al que se liga en una ubicación diferente en naturaleza. El ADN heterólogo no es endógeno a la célula en donde se introduce, pero se ha obtenido de otra célula. Por lo general, aunque no necesariamente, dicho ADN heterólogo codifica ARN y proteínas que no se producen normalmente por la célula en donde se expresa. Una secuencia promotora reguladora de transcripción u otro elemento genético se considera como "heterólogo" en relación a otra secuencia (por ejemplo, codificando una secuencia marcadora o rasgo agronómicamente relevante) si dichas dos secuencias no se combinan o ligan operativamente de forma diferente su ambiente natural. Preferiblemente, dichas secuencias no se ligan operativamente en su ambiente natural (es decir, de genes diferentes). Muy preferible, dicha secuencia reguladora se junta covalentemente y adyacente a un ácido nucleico al que no está adyacente en su ambiente natural. El término "transgen" como se usa en la presente se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico, que se introduce en el genoma de una célula o que se ha manipulado por manipulaciones experimentales por el hombre. Preferiblemente, dicha secuencia resulta en un genoma que es diferente de un organismo que ocurre de manera natural (por ejemplo, dicha secuencia, si es endógena a dicho organismo, se introduce en una ubicación diferente de su ubicación natural, o su número de copia se aumenta o disminuye). Un transgen puede ser una "secuencia de ADN endógena", "una secuencia de ADN exógena" (por ejemplo, un gen extraño), o una "secuencia de ADN heteróloga". El término "secuencia de ADN endógena" se refiere a una secuencia de nucleótido, que se encuentra de manera natural en la célula en dónde se introduce siempre y cuando no contenga alguna modificación (por ejemplo, una mutación de punto, la presencia de un gen marcador que se puede seleccionar, etc.) relativo a la secuencia que ocurre de manera natural. El término "transgénico" o "recombinante" cuando se usa en referencia a una célula o un organismo (por ejemplo, con respecto a una planta de cebada o célula vegetal) se refiere a una célula u organismo que contiene un transgen, o cuyo genoma se ha alterado por la introducción de un transgen . Un organismo o tejido transgénico puede comprender una o más células transgénicas. Preferiblemente, el organismo o tejido consiste sustancialmente de células transgénicas (es decir, más de 80% , preferiblemente 90% , más preferible 95% , muy preferible 99% de las células en dicho organismo o tejido son transgénicas) . Un "polipéptido recombinante" es un polipéptido que no ocurre de manera natural que difiere en secuencia de un polipéptido que ocurre de manera natural por al menos un residuo de aminoácido. Los métodos preferidos para producir dicho polipéptido recombinante y/o ácido nucleico pueden comprender mutagénesis dirigida o no dirigida , revolver ADN u otros métodos de recombinación recursiva . El término "equivalente" cuando se hace referencia a una condición de hibridación como se refiere a una condición de hibridación de interés significa que la condición de hibridación y la condición de hibridación de interés resulta en hibridación de secuencias de ácido nucleico que tienen el mismo rango de porcentaje (%) de homolog ía . Por ejemplo, si una condición de hibridación de i nterés resulta en hibridación de una primera secuencia de ácido nucleico con otras secuencias de ácido nucleico que tienen de 80% a 90% de homolog ía a la primera secuencia de ácido nucleico, entonces otra condición de hibridación se dice que es equivalente a la condición de hibridación de interés si esta otra condición de hibridación resulta también en hibridación de la primera secuencia de ácido nucleico con las otras secuencias de ácido nucleico que tienen de 80% a 90% de homología a la primera secuencia de ácido nucleico. En una modalidad preferida para los propósitos de la invención, a menos que se defina lo contrario, el por ciento de identidad de secuencia entre dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido se determina usando el paquete de software del Vector NTI 7.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Una penalidad por abertura de gap de 15 y una penalidad por extensión de gap de 6.66 se usan de preferencia para determinar el por ciento de identidad de dos ácidos nucleicos. Una penalidad por abertura de gap de 10 y una penalidad por extensión de gap de 0.1 se usan de preferencia para determinar el por ciento de identidad de dos polipéptidos. Todos los otros parámetros se ajustan de preferencia en los ajustes implícitos. Para propósitos de una alineación múltiple (algoritmo Clustal W), en una modalidad preferida, la penalidad por abertura de gap es 10, y la penalidad por extensión de gap es 0.05 con matriz biosum62, se debe entender que para los propósitos de determinar la identidad de secuencia al comparar una secuencia de ADN con una secuencia de ARN, una secuencia de nucleótido de timidina es equivalente a un nucleótido de uracil. Cuando se usa en referencia a hibridación de ácido nucleico, la técnica conoce bien que se pueden emplear numerosas condiciones equivalentes para comprender condiciones de baja o alta severidad; factores tales como la longitud y naturaleza (ADN, ARN, composición base) de la sonda y naturaleza del blanco (ADN, ARN, composición base, presente en solución o inmovilizada , etc. ) y la concentración de las sales y otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, dextran sulfato, polietilen glicol) se consideran y la solución de hibridación se puede variar para generar condiciones de hibridación de baja o alta severidad diferente de, pero equivalente a, las condiciones listadas antes. Aquellos expertos en la técnica saben que si se prefieren severidades mayores para reducir o eliminar la unión no específica , se pueden preferir severidades menores para detectar un número mayor de secuencias de ácido nucleico teniendo homolog ías diferentes. El término "gen" se refiere a una región codificadora unida operativamente a secuencias reguladoras apropiadas capaces de regu lar la expresión del polipéptido en alguna manera. Un gen incluye reg iones reguladoras no traducidas de ADN (por ejemplo, promotores, realzadotes, represores, etc. ) precediendo (ascendente) y siguiendo (descendiente) la región codificadora (marco de lectura abierta, ORF) , así como, cuando sea aplicable, interviniendo secuencias (es decir, i ntrones) entre regiones codificadoras i ndividuales (es decir, exones). El término "gen estructural" como se usa en la presente debe significar una secuencia de AQN que se transcribe en mARN que después se traduce en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico. Como se usa en la presente, el término "región codificadora" cuando se usa en referencia a un gen estructural , se refiere a las secuencias de nucleótido que codifican los aminoácidos encontrados en el polipéptido naciente como un resultado de la traducción de una molécula de mARN. La región codificadora se une, en euóariotes, en el lado 5' por el triplete de nucleótido "ATG" que codifica la metionina iniciadora y en el lado 3' por uno de los tres tripletes que especifican codones de paro (es decir, TAA, TAG, TGA). Además de contener intrónes, las formas genómicas de un gen también pueden incluir secuencias ubicadas en el extremo 5' y 3' de las secuencias que están presentes en la transcripción de ARN. Estas secuencias son referidas como secuencias o regiones de "flanqueo" (estas secuencias de flanqueo están ubicadas en 5' o 3' a las secuencias no traducidas presentes en la transcripción de mARN. La región de flanqueo en 5' puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y realzadotes que controlan o influyen en la transcripción del gen. La región de flanqueo en 3' puede contener secuencias que dirigen la terminación o transcripción, corte post-transcripcional o poliadenilación. Los términos "polipéptido", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido", "producto genético", "producto de expresión" y "proteína" se usan de forma intercambiable en la presente para referir a un polímero u oligomero de residuos de aminoácidos consecutivos. El término "aislado" como se usa en la presente significa que un material ha sido quitado de su ambiente original. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que ocurre de manera natural presente en un animal viviente no es aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, es aislado. Dichos polinucleótidos pueden ser parte de un vector y/o dichos polinucleótidos ó polipéptidos podrían ser parte de una composición, y serían aislados en que dicho vector o composición no es parte de su ambiente original. El término "organismo genéticamente modificado" o "GMO" se refiere a cualquier organismo que comprenda AbN transgénico. Los organismos ejemplares incluyen plantas, animales y microorganismos. El término "célula" o "célula vegetal" como se usa en la presente se refiere a una sola célula. El término "células" se refiere a una población de células. La población puede ser una población pura que comprende un tipo celular. Asimismo, la población puede comprender más de un tipo celular. En la presente invención, no hay límite en el número de tipos celulares que una población celular pueda comprender. Las células pueden o no estar sincronizadas. Una célula vegetal dentro del significado de esta invención se puede aislar (por ejemplo, en cultivo de suspensión) o comprender en un tejido vegetal, órgano vegetal o planta en cualquier etapa de desarrollo. El término "órgano" con respecto a una planta (u "órgano vegetal") significa partes de una planta y puede incluir (pero no se debe limitar a) por ejemplo, raíces, frutos, brotes, tallo, hojas, borlillas, sépalos, pétalos, polen, semillas, etc.

El término "tejido" con respecto a una planta (o "tejido vegetal") significa arreglo de células vegetales múltiples incluyendo tejidos diferenciados o no de plantas. Los tejidos vegetales pueden constituir parte de un órgano vegetal (por ejemplo, la epidermis de una hoja de planta) pero también pueden constituir tejidos de tumor (por ejemplo, tejido cailus) y varios tipos de células en cultivo (por ejemplo, células individuales, protoplasmas, embriones, callo, cuerpos del tipo protocorm, etc.). El tejido vegetal puede ser in planta, en cultivo de órgano, cultivo de tejido o cultivo celular. El término "planta" como se usa en la presente se refiere a una pluralidad de células vegetales que se diferencian en gran parte en una estructura que está presente en cualquier etapa del desarrollo de una planta. Dichas estructuras incluyen uno o más órganos vegetales incluyendo, pero sin limitación a, fruto, brote, tallo, hoja, pétalo de flor, etc. El término "ADN cromosómico" o "secuencia de ADN cromosómico" se debe entender como el ADN cromosómico del núcleo celular desde el estado del ciclo celular. Por lo tanto, el ADN cromosómico se puede organizar en cromosomas o cromatidos, se puede condensar o desenrollar. Una inserción en el ADN cromosómico se puede demostrar y analizar por varios métodos conocidos en la técnica como, por ejemplo, análisis de PCR, análisis de Souther blot, hibridación de fluorescencia in situ (FISH), y PCR in situ.

El término "gen estructural" como se usa en la presente debe significar una secuencia de ADN que se transcribe en mARN que después se traduce en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico. El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un producto genético. Por ejemplo, en el caso de gen estructural, la expresión involucra transcripción del gen estructural en mARN y opcionalmente, la traducci.ón posterior de mARN en uno o más polipéptidos. El término "cassette de expresión" o "construcción de expresión" como se usa en la presente debe significar la combinación de cualquier secuencia de aminoácidos a expresarse en ligadura operable con una secuencia promotora y, opcionalmente, elementos adicionales (como, por ejemplo, secuencias terminadoras y/o de poliadenilación) que facilitan la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico. "Promotor", "elemento promotor" o "secuencia promotora" como se usa en la presente, se refiere a las secuencias de nucleótido en el extremo 5' de una secuencia de nucleótido que dirige la iniciación de transcripción (es decir, es capaz de controlar la transcripción de la secuencia de nucleótido en mARN). Un promotor típicamente, aunque no necesariamente, se ubica en 5' (es decir, ascendente) de una secuencia de nucleótido de interés (por ejemplo, próxima al sitio de inicio transcripcional de un gen estructural) cuya transcripción en mARN controla, y provee un sitio para unión específica por ARN polimerasa y otros factores de transcripción para iniciación de transcripción. Son necesarias las secuencias promotoras, pero no siempre suficientes, para impulsar la expresión de un gen descendente. En general, los promotores eucarióticos incluyen una secuencia de ADN característica homologa a la caja de consenso 5 -TATAAT-3' (TATA) aproximadamente 10-30 bp 5' al sitio de inicio de transcripción, que, por convención, está numerado +1. Las bases 3' al sitio de inicio son dadas números positivos, mientras que las bases 5' en el sitio de inicio reciben números negativos, reflejando su distancia desde el sitio de inicio. Otro componente promotor, la caja CAAT, a menudo se encuentra aproximadamente 30 a 70 bp 5' a la caja TATA y tiene homología a la forma canónica de 5'-CCAAT-3' (Breathnach 1981). En plantas, la caja CAAT a veces es reemplazada por una secuencia conocida como la caja AGGA, una región teniendo residuos de adenina simétricamente flanqueando el triplete G(orT)NG (Messing 1983). Otras secuencias confiriendo influencias reguladoras en la transcripción se pueden encontrar dentro de la región promotora y extendiéndose tanto como 1000 bp o más 5' desde el sitio de inicio. El término "constitutivo" cuando se hace referencia a un promotor, significa que el promotor es capaz de dirigir transcripción de una secuencia de ácido nucleico ligada operativamente en ausencia de un estímulo (por ejemplo, choque térmico, químicos, luz, etc.). Típicamente, los promotores constitutivos son capaces de dirigir expresión de un transgen en sustancialmente cualquier célula o cualquier tejido.

Control Regulador se refiere a la modulación de expresión genética inducida por elementos de secuencia de ADN ubicados primariamente, pero no exclusivamente, hacia arriba de (5' a) el sitio de inicio de transcripción. La regulación puede resultar en una respuesta de todo o nada a los estímulos ambientales, o puede resultar en variaciones en el nivel de expresión genética. En esta invención, los elementos reguladores de choque térmico funcionan para mejorar de manera transitoria el nivel de expresión genética descendente en respuesta a elevación de temperatura repentina. La señal de poliadenilación se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico capaz de realizar procesamiento de mARN, us?almente caracterizado por la adición de rasgos de ácido poliadenílico en los extremos 3' de los precursores de mA¡RN. El segmento de ADN de señal de poliadenilación puede por sí mismo ser un compuesto de segmentos derivado de varias fuentes, que ocurren de manera natural o sintéticas, y puede ser de un ADN genómico o un cADN derivado de ARN. Las señales de poliadenilación se reconocen comúnmente por la presencia de homología a la forma canónica 5'-AATAA-3', aunque variación de distancia, "lectura" parcial, y secuencias canónicas tándem múltiples son comunes (Messing 1983). Se debe reconocer que una "señal de poliadenilación" canónica puede de hecho causar terminación transcripcional y no poliadenilación por sí misma (Montell 1983). Los elementos de choqµe térmico se refieren a secuencias de ADN que regulan la expresión genética en respuesta a la tensión de elevaciones de temperatura repentinas. La respuesta se observa como una mejora inmediata aunque transitoria en el nivel de expresión de un gen descendente. El trabajo original en genes de choque térmico se hizo con Drosophila, pero muchas otras especies incluyendo plantas (Barnett 1980) exhibieron respuestas análogas a tensión. El componente primario esencial del elemento de choque térmico se describió en Drosophila por tener la secuencia de consenso 5'-CTGGAATNTTCTAGA-3' (en donde N=A, T, C o G) y a ubicarse en la región entre los residuos -66 a -47 bp ascendente al sitio de inicio transcripcional (Pelma 1982). Una copia de oligonucleótido químicamente sintetizada de esta secuencia de consenso puede reemplazar la secuencia natural en conferir inducción de choque térmico. La secuencia líder se refiere a una secuencia de ADN que comprende aproximadamente 100 nucleótidos ubicados entre el sitio de inicio de transcripción y el sitio de inicio de traducción. Dentro de la secuencia líder hay una región que específica el sitio de unión a ribosoma. Los intrones o secuencias de intervención se refieren en este trabajo a aquellas regiones de secuencia de ADN que se transcriben junto con las secuencias codificadoras (exones) pero después son eliminadas en la formación del mARN maduro. Los intrones pueden ocurrir dentro de una secuencia transcrita entre las secuencias codificadoras de los mismos o diferentes genes, dentro de la secuencia codificadora de un gen, interrumpiendo y dividiendo sus secuencias de aminoácidos, y dentro de la región promotora (5' al sitio de inicio de traducción) . Los intrones en la transcripción primaria son cortados y las secuencias codificadoras se ligan sim ultánea y precisamente para formar el mARN maduro. Las uniones de intrones y exones forman los sitios de corte. La secuencia base de un intrón com ienza con GU y termina con AG. La misma señal de corte se encuentra en muchos eucariotes superiores . El térm ino "ligadura operativa" o "ligado operativamente" se debe entender como, por ejemplo, el arreglo en secuencia de un elemento regulador (por ejemplo, un promotor) con una secuencia de ácido nucleico a expresarse y, de ser apropiado, más elementos reguladores (tales como, por ejemplo, un terrriinador) en tal manera que cada uno de los elementos reguladores pueden cumplir su función destinada para permitir, modificar, facilitar o de lo contrario influir en la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico. La expresión puede resultar dependiendo del arreglo de las secuencias de ácido nucleico en relación a ARN de sentido o anti-sentido. A este extremo, la ligadura directa en el sentido qu ímico no se requiere necesariamente. Las secuencias de control genético tales como, por ejemplo, secuencias de mejora, también pueden ejercer su función en la secuencia blanco de posiciones que están más lejos, o de hecho de otras moléculas de ADN. Los arreglos preferidos son aquellos en donde la secuencia de ácido nucleico a expresarse recom binantemente se coloca detrás de la secuencia actuando como promotor, de modo que las dos secuencias se ligan covalentemente entre sí. La distancia entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico a expresarse recombinantementé es de preferencia menos de 200 pares base, en especial de preferencia menos de 100 pares base, muy especialmente de preferencia menos de 50 pares base. La ligadura operativa, y un cassette de expresión, se pueden generar por medio de recombinación de costumbre y técnicas de clonación como se describe (por ejemplo, en Maniatis 1989; Silhavy 1984; Ausubel 1987; Gelvin 1990). Sin embargo, otras secuencias que, por ejemplo, actúan como un enlazador con sitios de corte eápecífico para enzimas de restricción, o como un péptido de señal, también se pueden colocar entre las dos secuencias. La inserción de secuencias también puede conducir a la expresión de proteínas de fusión. Preferiblemente, el cassette de expresión, que consiste de una ligadura de secuencia promotora y de ácido nucleico a expresarse, puede existir en una forma de vector integrado e insertarse en un genoma vegetal, por ejemplo, por transformación. El término "transformación" como se µsa en la presente se refiere a la introducción de material genético (por ejemplo, un transgen) en una célula. La transformación de una célula puede ser estable o transitoria. El término "transformación transitoria" o "transformado de forma transitoria" se refiere a la introducción de uno o más transgenes en una célula en ausencia de la integración del transgen en el genoma de la célula huésped. La transformación transitoria se puede detectar, por ejemplo, por prueba inmunosorbente enlazada a enzima (ELISA) que detecta la presencia de un polipéptido codificado por uno o más de los transgenes. Alternativamente, la transformación transitoria se puede detectar al detectar la actividad de la proteína (por ejemplo, o-glucoronidasa) codificada por el transgen (por ejemplo, el gen uid A) como se demuestra en la presente [por ejemplo, prueba histoquímica de actividad de enzima GU al manchar con X-gluc lo que da un precipitado azul en presencia de la enzima GUS; y un ensayo quemiluminiscente de actividad de enzima GUS usando el juego de luz GUS-light (Tropix)]. El término "transformador transitorio/' se refiere a una célula que ha incorporado de forma transitoria uno o más transgenes. En contraste, el término "transformación estable" o "transformado establemente" se refiere a la introducción e integración de uno o más transgenes en el genoma de una célula, de preferencia resultando en la integración cromosómica y herencia estable a través de meiosis. La transformación estable de una célula se puede detectar por hibridación de Southern blot de ADN genómico de la célula con secuencias de ácido nucleico que son capaces de unir a uno o más de los transgenes. Alternativamente, la transformación estable de una célula también se puede detectar por la reacción en cadena de polimerasa de ADN genómico de la célula para amplificar secuencias de transgen. El término "transformador estable" se refiere a una célula que ha integrado establemente uno o más transgenes en el ADN genómico (incluyendo el ADN de los plástidos y el núcleo), de preferencia integración en el ADN cromosómico del núcleo. De esta manera, un transformador estable se distingue de un transformador transitorio en cuanto a que, mientras que el ADN genómico del transformador estable contiene uno o más transgenes, el ADN genómico del transformador transitorio no contiene un transgen. La transformación también incluye introducción de material genético en células vegetales en la forma de vectores virales vegetales involucrando replicación epicromosómica y expresión genética que puede exhibir propiedades variables con respecto a estabilidad meiótica. Las transformación también incluye introducción de material genético en células vegetales en la forma de vectores virales vegetales involucrando replicación epicromosómica y expresión genética que pueda exhibir propiedades variables con respecto a estabilidad meiótica. Preferiblemente, el término "transformación" incluye introducción de r?aterial genético en células vegetales resultando en integración cromosómica y herencia estable a través de meiosis. Los términos "infectando" e "infección" con una bacteria se refieren a co-incubación de una muestra biológica blanco (por ejemplo, célula, tejido, etc.) con la bacteria bajo condiciones de modo que las secuencias de ácido nucleico contenidas dentro de la bacteria se introducen en una o más células de la muestra biológica blanco. El término ''Agrobacterium" se refiere a bacteria fitopatogénica en forma de barra, Gram negativa, de tierra, que causa agalla del cuello de la remolacha en plantas infectadas), y Agrobacterium rhizogenes (que causa enfermedad de raíz peluda en plantas huésped infectadas). La infección de una célula vegetal con Agrobacterium por lo general resulta en la producción de opinas (por ejemplo, nopalina, agropina, octopina,. etc.) por la célula infectada. De esta manera, las cepas de Agrobacterium que causan producción de nopalina (por ejemplo, cepa LBA4301, C58, A208) son referidas como Agrobacteria del "tipo n?palina"; las cepas de Agrobacterium que causan producción de octopina (por ejemplo, cepa LBA4404, Ach5, B6) son referidas como Agrobacteria del "tipo octopina"; y cepas de Agrobacterium que causan producción de agropina (por ejemplo, cepa EHA105, EHA101, A281) son referidas como Agrobacteria del "tipo agropina". Los términos "bombardeando", "bombardeo" y "bombardeo biolístico" se refieren al proceso de acelerar partículas hacia una muestra biológica blanco (por ejemplo, célula, tejido, etc.) para realizar herida de la membrana celular en la muestra biológica blanco y/o entrada de las partículas en la muestra biológica blanco. Los métodos para bombardeo biolístico con conocidos en la técnica (por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,584,807, los contenidos de la cual se incorporan a la presente por referencia), y están comercialmente disponibles (por ejemplo, el acelerador de microproyectil impulsado por gas de helio (PDS-1000/He) (BioRad). El término "hibridación" como se usa en la presente incluye "cualquier proceso por el que una cepa de ácido nucleico se une con una cepa complementaria a través de emparejamiento de base". (Coombs 1994). La hibridación y la tensión de hibridación (es decir, la tensión de la asociación entre los ácidos nucleicos) se impacta por dichos factores como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, severidad de las condiciones involucradas, el Tm del h íbrido formado, y la relación de G :C dentro de los ácidos nucleicos. Como se usa en la presente, el término "Tm" se usa en referencia a la "temperatura de fusión" . La temperatura de fusión es la temperatura a la que una población de moléculas de ácido nucleico de doble cadena se convierte medio desasociada en cadenas individuales. La ecuación para calcular la Tm de ácidos nucleicos es bien conocida en la técnica. Como se indica por referencias estándar, un sim ple estimado del valor de Tm se puede calcular por la ecuación: Tm = 81 .5 + 0.41 (% G + C) , cuando un ácido nucleico está en solución acuosa a 1 M de NaCI [ver, por ejemplo, Anderson y Young , Quantitative Filter Hybridization , in Nucleic Acid Hybridization ( 1985)]. Otras referencias incluyen computaciones más sofisticadas que toman características estructurales así como de secuencia en consideración por el cálculo de Tm . Las cond iciones de severidad baja cuando se usan en referencia a hibridación de ácido nucleico a menos que se defina de lo contrario, comprenden condiciones equivalentes para unir o hibridación a 68°C en una solución que consiste de 5x SS PE (43.8 g/L NaCI , 6.9 g/L NaH2PO4, H2O y 1 .85 g/L EDTA, pH ajustado a 7.4 con NaOH) , 1 % SDS , 5x reactivo de Denhardt [50x Denhardt contiene lo siguiente por 500 mL; 5 g Ficoll (Tipo 400, Pharmacia) , 5 g BSA (fracción V; Sigma)] y 100 µg/mL ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguido por lavado en una solución que comprende 0.2x SSPE, y 0.1% SDS a temperatura ambiente cuando se emplea una sonda de ADN de alrededor de 100 a aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud. Las condiciones de alta severidad cuando se usan en referencia a hibridación de ácido nucleico comprenden, a menos que se defina lo contrario, condiciones equivalentes para unir o hibridar a 68°C. En una solución que consiste de 5x SSPE, 1% SDS, 5x reactivo de Denhardt y 100 µg/mL ADN de esperma de salmón desnaturalizado al lavar en una solución que comprende 0.1x SSPE, y 0.1% SDS a 68°C, cuando se emplea una sonda de alrededor de 100 a aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud. El término "equivalente" cuando se hace referencia a una condición de hibridación como se refiere a una condición de hibridación de interés significa que la condición de hibridación y la condición de hibridación de interés resultan en hibridación de secuencias de ácido nucleico que tienen el mismo rango de por ciento (%) de homología. Por ejemplo, si una condición de hibridación de interés resulta en hibridación de una primera secuencia de ácido nucleico con otras secuencias de ácido nucleico que tiene de 80% a 90% de homología a la primera secuencia de ácido nucleico, entonces otra condición de hibridación se dice ser equivalente a la condición de hibridación de interés si esta otra condición de hibridación también resulta en hibridación de la primera secuencia de ácido nucleico con las otras secuencias de ácido nucleico q ue tienen de 80% a 90% de homolog ía a la primera secuencia de ácido nucleico. Cuando se usa en referencia a hibridación de ácido nucleico, la técnica sabe bien que se pueden emplear numerosas Condiciones equivalentes para comprender condiciones de baja o alta severidad ; factores tales como la longitud y naturaleza (ADN, ARN , composición base) de la sonda y naturaleza del blanco (ADN , ARN , composición base, presente en solución o inmobilizar, etc. ) y la concentración de las sales y otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, dextran sulfato, polietilen glicol) se consideran y la solución de hibridación se puede variar para generar condiciones de hibridación de severidad baja o alta diferente de, pero equivalente a , las condiciones listadas antes. Aquellos expertos en la técnica saben que mientras se pueden preferir severidades mayores para reducir o elim inar la unión no específica , se pueden preferir severidades menores para detectar u n número más grande de secuencias de ácido n ucleico teniendo homolog ías diferentes.

DESCRI PCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se puede entender mejor por referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y los ejemplos incluidos en la presente.

Antes de los presentes compuestos, composiciones, y métodos sean descritos, se debe entender que esta invención no sé limita a ácidos nucleicos específicos, polipéptidos específicos, tipos celulares específicos, células huésped específicas, condiciones específicas, o métodos específicos, etc. , desde luego, como tales pueden variar y las numerosas modificaciones y variaciones ahí serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. También se debe entender que la term inolog ía µsada aqu í es para el propósito de describir modalidades particulares sólo y no debe ser limitante. Como se usa en la especificación y en las reivindicaciones, "un", o "uno(a)" pueden significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se use. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que se puede utilizar al menos una célula. La presente invención se basa , en parte, en el aislamiento y caracterización de moléculas de ácido nucleico que codifican LMPs del tipo FAD2 de plantas incluyendo Arabidopsis thaliana, soya {Glycine max) , arroz (Oryza sativa) , maíz {Zea mays), linaza {Linum usitatissimum) , cebada (Hordeum vulgare) y trigo { Triticum aestivum) y otras especies de cosecha relacionadas como maíz, cebada, linaza , azúcar de remolacha o girasol. De acuerdo con lo(s) propósito(s) de esta invención , como se describe ampliamente en la presente, en un aspecto, se provee un ácido nucleico aislado de una planta (Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum) que codifica una proteína de metabolismo de lípido (LMP), o una porción de la misma. Un aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácido nucleico aislada que codifican polipéptidos de LMP o porciones biológicamente activas de los mismos, así como fragmentos de ácido nucleico suficientes para usarse como sondas o cebadores de hibridación para la identificación o amplificación de ácidp nucleico codificando LMP (por ejemplo, ADN de LMP). Como se usa en la presente, el término "molécula de ácido nucleico" debe incluir moléculas de ADN (por ejemplo, cADN o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, mARN) y análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótido. Este término también abarca secuencia no traducida ubicada en los extremos 3' y 5' de la región codificadora de un gen: por lo menos aproximadamente 1000 nucleótidos de secuencia ascendente desde el extremo 5' de la región codificadora y al menos 200 nucleótidos de secuencia descendente desde el extremo 3' de la región codificadora del gen. La molécula de ácido nucleico puede ser de una cadena o doble cadena, pero de preferencia es ADN de doble cadena. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que se separa sustancialmente de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está sustanciaimente libre de secuencias que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo, del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias modalidades, la molécula de ácido nucleico de LMP aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de secuencias de nucleótido que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico (por ejemplo, una célula de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissim?m, Hordeum vulgare o Triticum aestivum). Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de cADN, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico teniendo una secuencia de nucleótido del apéndice A, en una modalidad preferida como se describe en SÉC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, o una porción de la misma, se puede aislar usando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencia provista aquí. Por ejemplo, una biblioteca de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum usando toda o una porción de una de las secuencias del apéndice A, en una modalidad preferida como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, como una sonda de hibridación y técnicas de hibridación estándar (por ejemplo, como se describe en Sambrook y otros 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Además, una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una porción de una de las secuencias del apéndice A, en una modalidad preferida como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC IP NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, se puede aislar por la reacción en cadena de polimerasa usando cebadores de oligonucleótido diseñados con base en esta secuencia (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una porción de una de las secuencias del apéndice A, en una modalidad preferida como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, se puede aislar por la reacción en cadena de polimeras usando cebadores de oligonucleótido diseñados con base en esta misma secuencia del apéndice A, en una modalidad preferida como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35). Por ejemplo, mARN se puede aislar de células vegetales (por ejemplo, por el procedimiento de extracción de guanidinio-tiocianato de Chirgwin y otros 1979, Biochemistry 18:5294-5299) y cADN se puede preparar usando transcriptasa de reversa (por ejemplo, Molones MLV transcriptasa de reversa, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o una AMV transcriptasa de reversa, disponible de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Los cebadores de oligonucleótido sintéticos para amplificación de reacción en cadena de polimerasa se pueden diseñar con base en una de las secuencias de nucleótido mostradas en el apéndice A, en una modalidad preferida como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35. Un ácido nucleico de la invención se puede amplificar usando cADN o, alternativamente, ADN genómico, como un ADN molde y cebadores de oligonucleótido apropiados de conformidad con técnicas de amplificación de PCR estándar. El ácido nucleico así amplificado se puede clonar en un vector apropiado y caracterizado por análisis de secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótido de LMP se pueden preparar por técnicas sintéticas estándar, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado. En una modalidad preferida, un ácido nucleico aislado de la invención comprende una de las secuencias de nucleótido mostradas en el apéndice A, en una modalidad preferida como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 13, SÉC ID NO: 17, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 29, o SEC ID NO: 33 corresponden a los cADNs de LMP de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum de la invención. Estos cADNs comprenden secuencias que codifican LMPs (es decir, la "región codificadora", indicada en el apéndice A), así como secuencias no traducidas de 5' y secuencias no traducidas de 3'. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico pueden comprender sólo la región codificadora de cualquiera de las secuencias en el apéndice A, en una modalidad preferida cómo se describe en SEC ID N.O: 7, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 31 o SEC ID NO: 35 o pueden contener fragmentos genómicos enteros de ADN genómico. Para los propósitos de esta solicitud, se entenderá que cada una de las secuencias establecidas en el apéndice A tiene un número de entrada de identificación (por ejemplo, TaFAD-01). Cada una de estas secuencias por lo general puede comprender tres partes: una región ascendente 5', una región codificadora, y µna región descendente. Una región codificadora de estas secuencias es indicada como "posición ORF" (tabla 3). En otra modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico, que es un complemento de una de las secuencias de nucleótido mostradas en el apéndice A, en una modalidad preferida como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, o una porción de las mismas. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una de las secuencias de nucleótido mostradas en el apéndice A, en una modalidad preferida como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, es una que es suficientemente complementaria a una de las secuencias de nucleótido mostradas en el apéndice A de modo que puede hibridar una de las secuencias de nucleótido en el apéndice A, así formando un dúplex estable. Todavía en otra modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótido que es al menos 50-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, más preferible al menos aproximadamente 70-80%, 80-90%, o 90-95%, también preferible al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% o 94% y todavía más preferible al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homologas a una secuencia de nucleótido mostrada en el apéndice A, en una modalidad preferida como se describe en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, o una porción de las mismas. La homología de secuencia de nucleótido se determina de preferencia usando Align X (22 de agosto de 2003) del Vector NTI Suite 9.0 con los siguientes parámetros: penalidad por abertura de Gap: 15; penalidad por extensión de Gap: 6.66; rango de penalidad por separación de Gap: 8; % de identidad por retraso de alineación: 40. En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótido que hibrida, por ejemplo, bajo condiciones severas, a una de las secuencias de nucleótido mostradas en el apéndice A, o una porción de las mismas. Estas condiciones de hibridación incluyen lavar con una solµción teniendo una concentración de sal de aproximadamente 0.02 molar a pH 7 a aproximadamente 60°C. Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender sólo una porción de la región codificadora de una de las secuencias en el apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, por ejemplo un fragmento que se puede usar como una sonda o cebador o un fragmento codificando una porción biológicamente activa de una LMP. Las secuencias de nucleótido determinadas a partir de la clonación de los genes de LMP de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum permite la generación de sondas, o cebadores diseñados para usarse en identificar y/o clonar homólogos de LMP en otros tipos celulares y organismos, así como homólogos de LMP de otras plantas o especies relacionadas. Por lo tanto, esta invención también provee compuestos que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente, o fragmentos de los mismos. Estos compuestos incluyen los ácidos nucleicos fijados a una porción. Estas porciones incluyen, pero no se limitan a, porciones de detección, porciones de hibridación, porciones de purificación, porciones de surtido, porciones de reacción, porciones de unión, y similares. La sonda/cebador típicamente comprende oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido típicamente comprende una región de secuencia de nucleótido que hibrida bajo condiciones severas a por lo menos aproximadamente 12, de preferencia aproximadamente 25, más preferible aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena de sentido de una de las secuencias establecidas en el apéndice A, en µna modalidad p referida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, una secuencia anti-sentido de una de las secuencias establecidas en el apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, o mutantes que ocurren de manera natural de las mismas. Los cebadores basados en una secuencia de nucleótido del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, se puede usar en reacciones de PCR para clonar homólogos de LMP. Las sondas con base en las secuencias de nucleótido de LMP se pueden usar para detectar transcripciones o secuencias genómicas codificando las mismas proteínas u homologas. En modalidades preferidas, la sonda comprende además un grupo de marca fijado a la misma, por ejemplo, el grupo de marca puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor de enzima. Dichas sondas se pueden usar como una parte de un equipo de prueba marcador genómico para identificar células que expresan una LMP, tal como al medir un nivel de un ácido nucleico codificando LMP en una muestra de células, por ejemplo, detectando niveles de mARN de LMP o determinando si un gen de LMP genómico ha sido mutado u omitido.

En una modalidad, la molécula de ácido nucleico de la invención codifica una proteína o porción de la misma que incluye una secuencia de aminoácido que es suficientemente homologa a un aminoácido codificado por una secuencia del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, de modo que la proteína o porción de la misma mantiene la misma o similar función como la proteína de tipo silvestre. Como se usa en la presente, el lenguaje "suficientemente homologa" se refiere a proteínas o porciones de las mismas que tienen secuencias de aminoácidos que incluyen un número mínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un residuo de aminoácidos, que tiene una cadena lateral similar como un residuo de aminoácidos en uno de los ORFs de una secuencia del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35), a una secuencia de aminoácidos de modo que la proteína o porción de la misma es capaz de participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la producción de compuestos de almacenamiento de semilla en plantas, construcción de membranas celulares en microorganismos o plantas, o en el transporte de moléculas sobre estas membranas. Las proteínas reguladoras, tales como proteínas de unión de ADN, factores de transcripción, kinasas, fosfatasas, o miembros de proteína de vías metabólicas tales como las vías biosintéticas de lípido, almidón y proteína, o sistemas de transporte de membrana, pueden jugar un papel en la biosíntesis de compuestos de almacenamiento de semilla. Ejemplos de dichas actividades se describen en la presente (ver anotaciones putativas en la tabla 3). Ejemplos de secuencias de ácido nucleico codificando LMP se establecen en el apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35. Ya que el azúcar alterada o aumentada y/o producción de ácido graso es un rasgo general que se desea heredar en una amplia variedad de plantas como maíz, trigo, centeno, avena, tritical, arroz, cebada, soya, cacahuate, algodón, cañóla, linaza, manihot, pimiento, girasol, remolacha y tapetes, plantas solanas como papa, tabaco, berenjena, y jitomate, especies de Vicia , chícharo, alfalfa , plantas tupidas (café , cacao , té) , especies de Salix, árboles (palma de aceite, coco) y pastos pereniales y cosechas de campaña, estas plantas de cosecha también son plantas blanco preferidas para manipulación genética como otra modalidad de la presente invención . Porciones de proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de LMP de la invención son porciones de preferencia biológicamente activas de una de las LMPs. Como se usa en la presente, el término "porción biológicamente activa de una LMP" debe incluir una porción, por ejemplo, un dominio/motivo, de una LMP que participa en el metabolismo de compuestos necesarios para la biosíntesis de l ípidos de almacenamiento de semilla , o la constrµcción de membranas celulares en m icroorganismos o plantas , p en el transporte de moléculas sobre estas membranas, o tiene una actividad como se establece en la tabla 3. Para determinar si una LMP o una porción biológicamente activa de la misma puede participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la prod ucción de compuestos de almacenam iento de semilla y membranas celulares, se puede realizar un ensayo de actividad enzimática. Dichos métodos de ensayo son bien conocidos a aquellos expertos en la técnica, y como se describe en el ejemplo 14 de la ejemplificación. Las porciones biológicamente activas de una LMP incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una LMP (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, o la secuencia de aminoácidos de una proteína homologa a una LMP, que incluyen menos aminoácidos que una LMP de longitud completa o la proteína de longitud completa que es homologa a una LMP) y exhiben al menos una actividad de una LMP. Típicamente, las porciones biológicamente activas (péptidos, por ejemplo, péptidos que son, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos en longitud) comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de una LMP. Además, otras porciones biológicamente activas, en donde se omiten otras regiones de la proteína, se pueden preparar por técnicas recombinantes y evaluar para una o más de las actividades descritas en la presente. Preferiblemente, las porciones biológicamente activas de una LMP incluyen uno o más dominios/motivos o porciones de los mismos teniendo actividad biológica. Se pueden preparar fragmentos de ácido nucleico adicionales codificando porciones biológicamente activas de una LMP al aislar una porción de una de las secuencias, expresando la porción codificada de la LMP o péptido (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y probando la actividad de la porción codificada de la LMP o péptido.

La invención abarca además moléculas de ácido nucleico que difieren de una de las secuencias de nucleótido mostradas en el apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, (y porciones de las mismas) debido a la degeneración del código genético y así codificar la misma LMP como aquella codificada por las secuencias de nucleótido mostradas en el apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico de la invención codifica una proteína de longitud completa que es sustancialmente homologa a una secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un marco de lectura abierta mostrado en el apéndice A. En una modalidad, el ácido nucleico de longitud completa o proteína o fragmento del ácido nucleico o proteína es de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum. Además de las secuencias de nucleótido de LMP de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum mostradas en el apéndice A, se apreciará por aquellos expertos en la técn ica que polimorfismos de secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de LMPs pueden existir dentro de una población (por ejemplo, la población de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum). Dicho polimorfismo genético en el gen de LMP puede existir entre individuos dentro de una población debido a variación natural. Como se usa en la presente, los térm inos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierta que codifica una LMP, de preferencia una LMP de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum. Dichas variaciones natuales pueden resultar típicamente en variación de 1 -40% en la secuencia de nucleótido del gen de LMP. Cualquiera y toda variación de nucleótido y polimorfismos de aminoácidos resultantes en LMP que son el resultado de variación natural y no alteran la actividad funcional de LMP deben estar dentro del alcance de la invención . Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes naturales y ortólogos de no Arabid?psis thaliaha, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum del cADN de LMP de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum de la invención se pueden aislar con base en su homolog ía a ácido nucleico de LMP de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum descrito en la presente usando el cADN de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum, o una porción del mismo, como una sonda de hibridación de conformidad con técnicas de hibridación estándar bajo condiciones de hibridación severas. Como se usa en la presente, el término "ortólogos" se refiere a dos ácidos nucleicos de diferentes especies, pero que han evolucionado de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican proteínas teniendo las mismas o similares funciones. Por consiguiente, en otra modalidad, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención es al menos 15 nucleótidos en long itud e hibrida bajo condiciones severas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC I D NO: 7, S EC I D NO: 9, SEC I D NO: 1 1 , SEC I D NO: 1 3, SEC I D NO: 15, SEC I D NO: 17 , SEC I D NO: 19, SEC I D NO: 21 , SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC I D NO: 27, SEC I D NO: 29, SEC I D NO: 31 , SEC I D NO: 33 o SEC ID NO: 35. En otras modalidades, el ácido nucleico es al menos 30, 50, 100, 250 o más nucleótidos en longitud . Como se usa en la presente, el término "hibrida bajo condiciones severas" debe describir condiciones par hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótido al menos 60% homologas entre sí típicamente permanecen hibridizadas entre sí. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias al menos aproximadamente 65%, más preferible al menos aproximadamente 70% y todavía más preferible al menos aproximadamente 75% o más homologas entre sí típicamente permanecen hibridizadas entre sí. Dichas condiciones severas son conocidas a aquellos expertos en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N . Y. , 1 989: 6.3.1 -6.3.6. Un ejemplo preferido no limitante de condiciones de hibridación severas son hibridación en 6X cloruró sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2 X SSC, 0.1 % SDS a 50-65°C. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que hibrida bajo condiciones severas a una secuencia del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC I D NO: 5, SEC I D NO: 7 , SEC I D NO: 9, SEC I D NO: 1 1 , SEC I D NO: 1 3, SEC I D NO: 15, SEC I D NO: 1 7 , SEC I D NO: 19, SEC I D NO: 21 , SEC I D NO: 23, SEC I D NO: 25, SEC I D NO: 27, SEC I D NO: 29, SEC ID NO: 31 , SEC I D NO: 33 o SEC ID NO: 35, corresponde a una molécula de ácido nucleico que ocurre de manera natural. Como se usa en la presente, una molécula de ácido nucleico "que ocurre de manera natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN teniendo una secuencia de nucleótido que ocurre en naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural). En una modalidad, el ácido nucleico codifica una LMP natural de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum v?lgare o Triticum aestivum.

Además de variantes que ocurren de manera natural de la secuencia de LMP que pueden existir en la población, el experto en la técnica apreciará que se pueden introducir cambios por mutación en una secuencia de nucleótido del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SÉC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NÓ: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, así conduciendo a cambios en la secuencia de aminoácido de la LMP codificada, sin alterar la habilidad funcional de lá LMP. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótido conduciendo a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en una secuencia del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia de tipo silvestre de una de las LMPs (apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35) sin alterar la actividad de dicha LMP, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para actividad de LMP. Otros residuos de aminoácido, sin embargo, (por ejemplo, aquellos que no están conservados o sólo semi-conservados en el dominio teniendo actividad de LMP) no pueden ser esenciales para actividad y así son propensos a ser susceptibles a alteración sin alterar la actividad de LMP. Por consiguiente, otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácido nucleico codificando LMPs que contienen cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para actividad de LMP. Dichas LMPs difieren en secuencias de aminoácidos de una secuencia aunque retienen al menos una de las actividades de LMP descritas en la presente. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótido que codifica una proteína, en donde la proteína comprende una secuencia de aminoácido al menos aproximadamente 50% homologa a una secuencia de aminoácido codificada por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, y es capaz de participar en el metabolismo de compµestos necesarios para la producción de compuestos de almacenamiento de semilla en Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestiv?m, o membranas celulares, o tiene una o más actividades establecidas en la tabla 3. preferiblemente, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico es al menos aproximadamente 50-60% homologa a una de las secuencias codificadas por un ácido nucleico en el apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, más preferible al menos 60-70% homologa a una de las secuencias codificadas por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, incluso más preferible al menos aproximadamente 70-80%, 80-90%, 90-95%, también preferible al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% o 95% homologa a una de las secuencias codificadas por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, y muy preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% homologa a una de las secuencias codificadas por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SÉC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID ÑO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35. La homología de la secuencia de polipéptido se determina de preferencia usando Align X (22 de agosto de 2003) del Vector NTI Suite 9.0 con los siguientes parámetros: penalidad púr abertura de Gap: 15; penalidad por extensión de Gap: 6.66; rango de penalidad por separación de Gap: 8; % de identidad por retraso de alineación: 40. Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, una de las secuencias codificadas por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, y una forma mutante de las mismas) o de dos ácidos nucleicos, las secuencias es alinean para propósitos de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para alineación óptima con la otra proteína o ácido nucleico). Entonces, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos correspondientes o posiciones de nucleótido. Cuando una posición en una secuencia (por ejemplo, una de las secuencias codificadas por un ácido nucleico del apéndice A, en un modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35) está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como la posición correspondiente en la otra secuencia (por ejemplo, una forma mutante de la secuencia seleccionada a partir del polipéptido codificado por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35), entonces las moléculas son homologas en esa posición (es decir, como se usa en la presente "homología" de aminoácido o nucleótido es equivalente a "identidad" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = números de posiciones idénticas/números totales de posiciones x 100). Una molécula de ácido nucleico aislada codificando una LMP homologa a una secuencia de proteína codificada por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, se puede crear al introducir una o más sustituciones de nucleótido, adiciones u omisiones en una secuencia de nucleótido del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, de modo que una o más sustituciones de aminoácido, adiciones u omisiones se introducen en la proteína codificada. Se pueden introducir mutaciones en una de las secuencias del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NÓ: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, por técnicas estándar, tales como mutagénesis de sitio dirigido y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se hacen sustituciones de aminoácidos conservadoras en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en donde el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido teniendo una cadena lateral similar. Las familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofan), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina). De esta manera, un residuo de aminoácido no esencial predicho en una LMP se reemplaza de preferencia con otro residuo de aminoácido desde la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra modalidad, se pueden introducir mutaciones de forma aleatoria sobre toda o parte de u na secuencia codificadora de LMP, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden seleccionar para una actividad de LMP descrita en la presente para identificar mutantes que retienen actividad de LMP. Después de la mutagénesis de una de las secuencias del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, la proteína codificada se puede expresar de forma recombinante y la actividad de la proteína se puede determinar usando, por ejemplo, ensayos descritos en la presente (ver Ejemplos 11-13 de la ejemplificación).

Las LMPs se producen de preferencia por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico codificando la proteína se clona en un vector de expresión (como se describió antes), el vector de expresión se introduce en una célula huésped (como se describe en la presente) y la LMP se expresa en la célula huésped. La LMP entonces se puede aislar de las células por un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteína estándar. Alternativo a la expresión recombinante, una LMP o péptido de la misma se puede sintetizar químicamente usando técnicas de síntesis de péptido estándar. Además, la LMP nativa se puede aislar de células, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-LMP, que se puede producir por técnicas estándar utilizando una LMP o fragmento de la misma de esta invención. La invención también provee proteínas quiméricas o de fusión de LMP. Como se usa en la presente, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" de LMP comprende un polipéptido de LMP ligado operativamente a una polipéptido de no LMP. Un "polipéptido de LMP" se refiere a un polipéptido teniendo una secuencia de aminoácidos correspondiente a una LMP, mientras que un "polipéptido de no LMP" se refiere a un polipéptido teniendo una secuencia de aminoácido correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homologa a la LMP, por ejemplo, una proteína que es diferente de la LMP y que se deriva del mismo o diferente organismo. Dentro de la proteína de fusión, el término "ligado operativamente" debe indicar que el polipéptido de LMP y el polipéptido de no LMP se fusionan enre sí de modo que ambas secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia usada. El polipéptido de no LMP se puede fusionar a la terminal N o terminal C del polipéptido de LMP. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión de GST-LMP (glutationa S-transferasa) en donde las secuencias de LMP se fusionan a la terminal C de las secuencias de GST. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de LMPs recombinantes. En otra modalidad, la proteína de fusión es una LMP que contiene una secuencia de señal heteróloga en su terminal N. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), expresión y/o secreción de una LMP se puede aumentar a través del uso de una secuencia de señal heteróloga. Preferiblemente, una proteína quimérica o de fusión de LMP de la invención se produce por técnicas de ADN recombinante estándar. Por ejemplo, los fragmentos de ADN codificando para las diferentes secuencias de polipéptido se ligan juntos en marco de conformidad con técnicas convencionales, por ejemplo al emplear terminaciones en extremo romo o extremo de decalaje para ligación, digestión de enzima de restricción para proveer terminales apropiadas, llenando los extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión no deseada, y ligación enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación de PCR de fragmentos genéticos se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje que puede dar lugar a lanzamientos complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivos, lo que se puede templar posteriormente y reamplificar para generar una secuencia genética quimérica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y otros, John Wiley & Sons; 1992). Además, muchos vectores de expresión están comercialmente disponibles que ya codifican una porción de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Un ácido nucleico que codifica LMP se puede clonar en dicho vector de expresión de modo que la porción de fusión se liga en marco a la LMP. Además de las moléculas de ácido nucleico codificando LMPs descritas antes, otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido a las mismas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a un ácido nucleico de "sentido" codificando una proteína, por ejemplo, complementaria a la cadena codificadora de una molécula de cADN de doble cadena o complementaria a una secuencia de mARN. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede ser unión de hidrógeno a un ácido nucleico de sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificadora de LMP entera, o sólo a una porción de la misma. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótido codificando una LMP. El término "región codificadora" se refiere a la región de la secuencia de nucleótido que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos (por ejemplo, toda la región codificadora de TaFAD-01 comprende nucleótidos 165-1325). En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región no codificadora" de la cadena codificadora de una secuencia de nucleótido codificando LMP. El término "región no codificadora" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificadora que no se traducen en aminoácidos (es decir, también referidos cómo regiones no traducidas 5' y 3'). Dadas las secuencias de cadena codificadora codificando LMP descritas en la presente (por ejemplo, las secuencias establecidas en el apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35), los ácidos nucleicos antisentido de la invención pueden diseñarse de acuerdo con las reglas de emparejamiento de base de Watson y Crack. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a toda la región codificadora de mARN de LMP, pero más preferible es un oligonucleótido que es antisentido a sólo una porción de la región codificadora o no codificadora de mARN de LMP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de traducción de mARN de LMP. Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos en longitud. Un ácido nucleico antisentido o de sentido de la invención se puede construir usando síntesis química y reacciones de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) se puede sintetizar químicamente usando nucleótidos que ocurren de manera natural o nucleótido modificados de forma variada diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido o de sentido, por ejemplo, se pueden usar derivados de fosforotioato y nucleótidos acridina sustituidos. Ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-yodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracil, 5-carboximetilamino-metil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracil, dihidro-uracil, beta-D-galactosilqueosina, inopina, N-6-isopenteniladenipa, 1-metil-guanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metil-citosina, N-6-adenina, 7-metilguanina, 5-metil-aminometiluracil, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracil, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetil-uracil, 5-metoxiuracil, 2-metiltio-N-6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, seudouracil, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracil, (acp3)w, y 2,6-diamino-purina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido se puede producir usando biológicamente un vector de expresión en donde un ácido nucleico se ha subclonado en una orientación antisentido (es decir, ARN trasncrito del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido a un ácido nucleido blanco de interés, descrito más en la siguiente subsección). En otra variación de la tecnología antisentido, una construcción de ARN interfiriente de doble cadena se puede usar para causar una regulación descendente del nivel de mARN de LMP y actividad de LMP en plantas transgénicas. Esto requiere transformar las plantas con una construcción quimérica conteniendo una porción de la secuencia de LMP en lá orientación de sentido fusionada a la secuencia antisentido de la misma porción de la secuencia de LMP. Una región enlazadora de ADN de longitud variable se puede usar para separar los fragmentos de sentido y antisentido de secuencias de LMP en la construcción. Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención se administran típicamente a una célula o se generan in situ de modo que hibridan con o se unen a mARN celular y/o ADN genómico codificando una LMP para así inhibir la expresión de la proteína, por ejemplo, al inhibir la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por nucleótido convencional complementario para formar un dúplex estable, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que une a duplexes de ADN, a través de interacciones específicas en la ranura principal de la hélice doble. La molécula antisentido se puede modificar de modo que se une específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una superficie celular seleccionada, por ejemplo, al enlazar la molécula de ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo que une a un receptor o antígeno de superficie celular. La molécula de ácido nucleico también se puede surtir a células usando los vectores descritos en la presente. Para lograr suficientes concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vector en donde la molécula de ácido nucleico antisentid se coloca bajo el control de un procariótico fuerte, viral o eucariótico incluyendo promotores de planta. Todavía en otra modalidad, la molécula de ácido nucleico antisentido dé la invención es una molécula de ácido nucleico anomérica. Una molécula de ácido nucleico anomérica forma híbridos de doble cadena específicos con ARN complementario en donde, contrario a las unidades usuales, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier y otros, 1987, Nucleic Acid Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metil-ribonucleótido (Inoue y otros, 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y otros, 1987, FEBS Lett. 215:327-330).

Todavía en otra modalidad, un ácido nucleico antisentido de la invención es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa, que son capaces de cortar un ácido nucleico de una sola cadena, tal como un mARN, a la que tienen una región complementaria. De esta manera, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas martillo (descritas en Haselhoff & Gerlach 1988, Nature 334:585-591)) se pueden usar para cortar catalíticamente transcripciones de mARN de LMP para así inhibir la traducción de mARN de LMP. Una ribozima teniendo especificidad para un ácido nucleico codificando LMP se puede diseñar con base en la secuencia de nucleótido de un cADN de LMP descrito en la presente (es decir, Bn01, en apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35) o en la base de una secuencia heteróloga a aislarse de conformidad con los métodos enseñados en esta invención. Por ejemplo, un derivado de un ARN Tetrahymena L-19 IVS se puede construir en donde la secuencia de nucleótido del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótido a cortarse en un mARN codificando LMP (ver, por ejemplo, Cech y otros, patente de E.U.A. No. 4,987,071 y Cech y otros, patente de E.U.A. No. 5,116,742). Alternativamente, se puede usar mARN de LMP para seleccionar un ARN catalítico teniendo una actividad de ribonucleasa específica de un acervo de moléculas de ARN (ver, por ejemplo, Bartel, D. & Szostak J.W. 1993, Science 281:1411-1418). Alternativamente, la expresión genética de LMP se puede inhibir al encontrar secuencias de nucleótido complementarias a la región reguladora de una secuencia de nucleótido de LMP (por ejemplo, un promotor y/o realzador de LMP) para formar estructuras helicoidales triples que previenen la transcripción de un gen de LMP en células blanco (ver, por lo general, Helene C. 1991, Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene C. y otros, 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L.J. 1992, Bioassays 14:807-15). Todavía en otra modalidad, se puede usar tecnología de microARN (Bartel D., Cell, 116:281-297, 2004). Un precursor de microARN se puede manipular para encontrar y regular la expresión de un gen de interés. El precursor se puede expresar predominantemente en semillas o en otros tejidos también. Los miARNs (-21 a 25 nt) surgen de precursores más grandes con una estructura de tallo con lazo que se transcriben de genes codificadores de no proteína. El miARN busca un mARN específico para suprimir expresión genética a nivel post-transcripcional (es decir, degrada mARN) o a nivel de traducción (es decir, inhibe síntesis de proteína). Otro aspecto de la invención pertenece a vectores, de preferencia vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica una LMP (o una porción de la misma). Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un lazo de ADN de doble cadena circular en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden Igiar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en donde se introducen (por ejemplo, vectores bacteriales teniendo un origen bacterial de replicación y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped al introducir en la célula huésped, y así se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se ligan operativamente. Dichos vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión dé utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se pueden usar de forma intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector usada más comúnmente. Sin embargo, la invención debe incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), que sirven funciones equivalentes. Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en la base dé las células huésped a usarse para expresión, que se liga operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresarse. Dentro de un vector de expresión recombinante, "ligado operativamente" debe significar que la secuencia de nucleótido de interés está ligada a la(s) secuencia(s) reguladora(s) en una manera que permite expresión de la secuencia de nucleótido y ambas secuencias se fusionan entre sí de modo que cada una cumple su función propuesta (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando se introduce el vector en la célula huésped). El término "secuencia reguladora" debe incluir promotores, realzadotes y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) o ver: Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Ratón, Florida, eds.: Glick & Thompson, Capitulo 7, 89-108, incluyendo las referencias ahí. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen expresión constitutiva de una secuencia de nucleótido en muchos tipos de célula huésped y aquellas que dirigen expresión de la secuencia de nucleótido sólo en ciertas células huésped o bajo ciertas condiciones. Se preciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de dichos factores como la elección de la célula huésped a transformarse, el nivel de expresión de próteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células huésped para así producir proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente (por ejemplo, LMPs, formas mutantes de LMPs, proteínas de fusión, etc.). Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para expresión de LMPs en células procarióticas y eucarióticas. Por ejemplo, se pueden expresar genes de LMP en células bacteriales, células de insectos (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura y otras células fúngicas (ver Romanos M.A. y otros, 1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. y otros, 1991, Heterologous gene expression in flamentous fungí, en: More Gene Manipulations in Fungi, Bennet & Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: an Diego; y van den Hondel & Punt 1991, Gene transfer systems and vector development for flamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungí, Peberdy y otros, eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore y otros, 1999, Marine Biotechnology 1:239-251), ciliatos de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophyra, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, y Stylonychia, en especial del genero Stylonychia lemnae con vectores siguiendo un método de transformación como se describe en WO 98/01572 y células vegetales multicelulares (ver Schmidt & Wilmitzer 1988, High efficency Agrobacterium fi/merac/ens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon plants, Plant Cell Rep.:583-586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Ratón, Florida, capitulo 6/7, S. 71-119 (1993); White, Jenes y otros, Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung y Wu, Academic Press 1993, 128-43; Potrykus 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:205-225 (y referencias citadas ahí) o células de mamífero. Se discuten células huésped adecuadas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras promotras T7 y polimerasa T7. La expresión de proteínas en procariotes se lleva a cabo más a menudo con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles dirigiendo la expresión de proteínas de fusión o no fusión. Los vectores de fusión agregan un número de aminoácidos a una proteína codificada ahí, usualmente a la terminal amino de la proteína recombinante, pero también a la terminal C o fusionada dentro de regiones adecuadas en las proteínas. Dichos vectores de fusión típicamente sirven uno o más de los siguientes propósitos: 1) aumentar la expresión de proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en purificación de afinidad. A menudo, en vectores dé expresión de fusión, un sitio de corte proteolítico se introduce en la unión de la porción de fusión y la proteína recombinante para permitir separación de la proteína recombinante desde la porción de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento afin, incluyen Factor Xa, trombina y enterokinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc: Smith & Jonson 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRiT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutationa S-transferasa (GST), proteína de unión de maltosa E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante blanco. En una modalidad, la secuencia codificadora de la LMP se clona en un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica una proteína de fusión que comprende, desde la terminal N a la terminal C, proteína de sitio X de corte de GST-trombina. La proteína de fusión se puede purificar por cromatografía de afinidad usando resina de glutationa-agarosá. La LMP recombinante no fusionada a GST se puede recuperar mediante corte de la proteína de fusión con trombina. Ejemplos de vectores de expresión de E. coli de no fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann y otros, 1988, Gene 69:301-315) y pET 11 d (Studier y otros, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 60-89). La expresión genética blanco del vector pTrc recae en ia transcripción de polimerasa de ARN huésped desde un promotor de fusión trp-lac híbrido. La expresión genética blanco desde el vector pET 11 d recae en la transcripción desde un promotor de fusión T7 gn10-lac mediada por una polimerasa de ARN viral coexpresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral se suministra por cepas huésped BL21 (DE3) o HMS174 (DE3) desde un profago residente protegiendo un gen T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5. Una estrategia para maximizar expresión de proteina recombinante es expresar la proteína en una bacteria huésped con una capacidad impedida para cortar proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman S. 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185:119-128, Academic Press, San Diego, California). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico a insertarse en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos utilizados de preferencia en la bacteria elegida para expresión (Wada y otros 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Dicha alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención se puede llevar a cabo por técnicas de síntesis de ADN estándar. En otra modalidad, el vector de expresión de LMP es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec 1(Baldari y otros 1987, Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan & Herskowitz 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz y otros 1987, Gene 54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores y métodos para la construcción de vectores apropiados para usarse en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen aquellos detallados en: van den Hondel & Punt 1991, "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Pebardy y otros, eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge. Alternativamente, las LMPs de la invención se pueden expresar en células de insectos usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insectos cultivadas (por ejemplo, células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith y otros, 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow & Summers 1989, Virology 170:31-39).

Todavía en otra modalidad, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed 1987, Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman y otros 1987, EMBO J. 6:187-195). Cuando se usan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión a menudo se proveen por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Simlan Virus 40. Para otros sistemas de expresión adecuados para células procarióticas y eucarióticas ver capítulos 16 y 17 de Sambrook, Fritsh y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. En otra modalidad, las LMPs de la invención se pueden expresar en células vegetales unicelulares (tales como alga, ver Falciatore y otros (1999, Marine Biotechhology 1:239-251 y referencias ahí) y células vegetales de plantas superiores (por ejemplo, los espermatofitos, tales como plantas de cosecha). Ejemplos de vectores de expresión de planta incluyen aquellos detallados en: Becker, Kemper, Schell y Masterson (1992, "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197) y Bevan (1984, "Binary Abrobacterium vectors for plant transformation, Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Hígher Plants; en: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38). Un cassette de expresión de planta contiene de preferencia secuencias reguladoras capaces de impulsar expresión genética en células vegetales y que se ligan operativamente de modo que cada secuencia puede cumplir su función tal como terminación de transcripción, incluyendo señales de poliadeniláción. Las señales de poliadenilación son aquellas que se originan de t-ADN de Agrobacterium tumefaciens tal como el gen 3 conocido como octopina sintasa del Ti-plásmido pTiACHd (Gielen y otros 1994, EMBO J. 3:835) o equivalentes funcionales del mismo pero también son adecuados todos los demás term inadores funcionalmente activos en plantas. Ya que la expresión genética de planta muy a menudo no está limitada en niveles transcripcionales, un cassette de expresión de planta contiene de preferencia otras secuencias operativamente ligadas comp realzadotes de traducción tal como la secuencia de sobremultiplicación conteniendo la secuencia líder no traducida 5' de virus de mosaico de tabajo realzando la proteína por relación de ARN (Gaille y otros 1 987 , N ucleic Acids Res. 1 5:8693-871 1 ). La expresión genética de planta tiene que ligarse operativamente a un promotor apropiado confiriendo expresión genética en una manera precisa, específica de célula o tejido. Se prefieren los promotores que impulsan expresión constitutiva (Benfey y otros 1989, EM BO J . 8: 2195-2202) como aquellos derivados de virus de planta como el 35S CAMV (Franck y otros 1 980, Cell 21 :285-294) , el 1 9S CaMV (ver tam bién patente de E . U .A. No. 5, 352,605 y WO 84/0291 3) o promotores de planta como aquellos de subunidad pequeña Rubisco descritos en la patente de E. U .A. No. 4, 962, 028. Incluso se prefieren más los promotores específicos de sem illa que impulsan la expresión de proteínas de LMP durante todas las etapas o etapas seleccionadas del desarrollo de semillas. Los promotores de planta específicos de sem illa son conocidos a aquellos expertos en la técnica y se identifican y caracterizan usando bibliotecas de mARN específicas de semilla y técnicas de perfil de expresión . Los promotores específicos de semillas incluyen el promotor napln-gen de colza (patente de E.U.A. No. 5,608,152), el promotor de USP de Vicia faba (Baeumlein y otros, 1991, Mol. Gen. Genetics 225:459-67), el promotor de olefina de Arabidopsis (WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (patente de E.U.A. No. 5,504,200), el promotor Bce4 de Brassica (WO9113980) o el promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein y otros 1992, Plant J. 2:233-239) así como promotores confiriendo expresión específica de semillas en plantas de monocot como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Los promotores adecuados a señalar son los promotores genéticos Ipt2 o Ipt1 de cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230) o aquellos descritos en WO 99/16890 (promotores del gen de hordeina de cebada, el gen de glutelina de arroz, el gen de origina de arroz, el gen de prolamina de arroz, el gen de gliadina de trigo, gen de glutelina de trigo, el gen de zeina de maíz, el gen de glutelina de avena, el gen de kasirina de Sorghum, y el gen de secalina de centeno). La expresión genética de planta también se puede facilitar vía un promotor inducible (para una revisión ver Gatz 1997, Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Bio. 48:89-108). Los promotores químicamente inducibles son especialmente adecuados si se desea expresión genética en una manera de tiempo específico. Ejemplos para dichos promotores son un promotor inducible con ácido salicílico (WO 95/19443), un promotor inducible con tetraciclína (Gatz y otros 1992, Plant J. 2:397-404) y un promotor inducible con etanol (WO 93/21334).

Los promotores que responden a condiciones d etension biótica o abiótica también son promotores adecuados tales como el promotor de gen PRP1 inducible con patógeno (Ward y otros, 1993, Plant. Mol. Biol. 22:361-366), el promotor hspdO inducible con calor de jitomate (patente de E.U.A. No. 5,187,267), promotor de alfa-amilasa inducible con frío de papa (WO 96/12814) o el promotor pinll inducible con mordedura (EP 375091). Otras secuencias preferidas para usarse en cassettes de expresión genética de planta son secuencias blanco necesarias para dirigir el producto genético en su compartimiento celular apropiado (para revisión ver Kermode 1996, Crit. Rev. Plant Sci. 15:285-423 y referencias citadas ahí) tales como la vacuola, el núcleo, todos los tipos de plástidos como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, mitocondria, el retículo endoplásmico, cuerpos oleosos, peroxisomas y otros compartimientos de células vegetales. También son especialmente adecuados los promotores que confieren expresión genética específica de plástido, ya que los plástidos son el compartimiento mientras que se sintetizan precursores y algunos productos finales de biosíntesis de lípido. Se describen promotores adecuados tal como el promotor de ARN-polimerasa viral en WO 95/16783 y WO 97/06250 y el promotor cipo de Arabidopsis descrito en WO 99/46394. La invención provee además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN se liga operativamente a una secuencia reguladora en una manera q ue permite expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido a mARN de LMP . Se pueden elegir secuencias reguladoras ligadas operativamente a un ácido n ucleico clonado en la orientación antisentido que dirigen la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos celulares, por ejemplo, promotores virales y/o realzadotes, o se pueden elegir secuencias reguladoras que dirigen expresión específica de tipo celular o específica de tejido, constitutiva de ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido recombinante, fagem ido o virus atenuado en donde se producen ácidos n ucleicos antisentido bajo el control de una región reg uladora de alta eficiencia , la actividad que se puede determinar por el tipo celular en donde se introduce el vector. Para una discusión de la regulación de expresión genética usando genes antisentido ver Weíntraub y otros ( 1 986, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends i n Genetics , vol . 1 ) y Mol y otros ( 1990, FEBS Lett. 268:427-430) . Otro aspecto de la invención pertenece a células huésped en donde se ha introducido un vector de expresión recombinante de la i nvención . Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan de forma intercambiable en la presente. Se debe entender que dichos términos no sólo se refieren a la célula sujeto particular, sino también a la descendencia o descendencia potencial de dicha célula. Ya que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones posteriores debido a mutación o influencias ambientales, tal descendencia, de hecho, quizá no sea idéntica a la célula original, sino todavía esté incluida dentro del alcance del término como se usa en la presente. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, una LMP se puede expresar en células bacteriales, células de insecto, células fúngicas, células de mamífero (tales como células de ovario de hámster Chino (CHO) o células COS), alga, ciliatoS o células vegetales. Otras células huésped adecuadas son conocidas a aquellos expertos en la técnica. Se puede introducir ADN de vector en células procarióticas o eucarióticas vía técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usa en la presente, los términos "transformación" y "transfección", "conjugación" y "transducción" se deben referir a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo co-precipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextran, lipofección, competencia natural, transferencia mediada por químico, o electroporación. Se pueden encontrar métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped incluyendo células vegetales en Sambrook y otros (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd., ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology 1 995, vol . 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland y Davey, Humana Press , Totowa , N ueva Jersey. Para transfección estable de células vegetales y de mam ífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usados , sólo una fracción pequeña de células puede integrar el ADN extraño en su genoma . A fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) se introduce por lo general en las células huésped junto con el gen de interés . Los m arcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higrom icina, kanamicina y metotrexato o en plantas que confieren resistencia hacia un herbicida tal como glifosato o glufosinato. Un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable se puede introducir en una célula huésped en el m ismo vector como aquel que codifica una LMP o se puede introducir en un vector separado. Se pueden identificar células establemente transfectadas con el ácido nucleico introducido por ejemplo, mediante selección de fármaco (por ejemplo , células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que otras células mueren) . Para crear un microorganismo recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen de LMP en donde se ha introducido una omisión, adición o sustitución para así alterar, por ejemplo, funcionalmente interrumpir, el gen de LMP. Preferiblemente , este gen de LMP es un gen de LMP de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum, pero puede ser un homólogo de una planta relacionada o incluso de una fuente de mam ífero, levadura o insecto. En una modalidad preferida , el vector está diseñado de modo que, al momento de recombinación homologa, el gen de LMP endógeno se interrumpe funcionalmente (es decir, ya no codifica una proteína funcional; también referida como un vector de desmoldeo) . Alternativamente, el vector se puede diseñar de modo q ue, al momento de recom binación homologa, el gen de LMP endógeno se muta o de lo contrario se altera pero todavía codifica proteína funcional (por ejemplo, la región reguladora ascendente se puede alterar para as í alterar la expresión de la LMP endógena) . Para crear una m utación de pu nto vía recombinación homologa, se pueden usar h íbridos de ADN-ARN en una técnica conocida como quimeraplastia (Cole-Strauss y otros, 1999, Nucleic Acids Res. 27: 1 323-1 330 y Kmlec 1999, American Scientist 87 : 240-247) . Los procedimientos de recombinación homologa en Arabidopsis thaliana u otras cosechas también son bien conocidos en la técnica y se contemplan para usarse en la presente. En un vector de recombinación homologa, la porción alterada del gen de LMP se flanquea en sus extremos 5' y 3' por ácido nucleico adicional del gen de LMP para permitir que ocurra recombinación homologa entre el gen de LMP exógeno llevado por el vector y u n gen de LMP endógeno en u n m icroorganismo o planta. El flanqueo adicional del ácido nucleico de LMP es de suficiente longitud para recombinación homologa exitosa con el gen endógeno. Típicamente, varios cientos de pares base hasta kilobases de flanqueo de ADN (ambos en los extremos 5' y 3') se incluyen en el vector (ver, por ejemplo, Thomas & Capecchi 1987, Cell 51: 503, para una descripción de vectores de recombinación homologa). El vector se introduce en un microorganismo o célula vegetal (por ejemplo, vía ADN mediado por polietilenglicol). Las células en donde el gen de LMP introducido se ha recombinado homólogamente con el gen de LMP endógeno, se seleccionan usando técnicas conocidas en la técnica. En otra modalidad, se pueden producir microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados, que permiten expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen de LMP en un vector colocándolo bajo control del operón lac permite expresión del gen de LMP sólo en presencia de IPTG. Dichos sistemas reguladores son bien conocidos en la técnica. Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariótica o eucariótica en cultivo se puede usar para producir (es decir, expresar) una LMP. Por consiguiente, la invención provee además métodos para producir LMPs usando las células huésped de la invención. En una modalidad, el método comprende Cultivar una célula huésped de la invención (en donde se ha introducido un vector de expresión recombinante codificando una LMP, o que contiene un gen de LMP de tipo silvestre o alterado en su genoma) en un medio adecuado hasta que se produce una LMP. En otra modalidad, el método comprende además aislar LMPs a partir del medio o la célula huésped. Otro aspecto de la invención pertenece a LMPs aisladas, y porciones biológicamente activas de las mismas. Una proteína "aislada" o "purificada" o porción biológicamente activa de la misma está sustancialmente libre de material Celular cuando se produce por técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de LMP en donde la proteína se separa de componentes celulares de las células en donde se produce de manera natural o recombinante. En una modalidad, el lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de LMP teniendo menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de no LMP (también referida en la presente como una "proteína contaminante"), más preferible menos de aproximadamente 20% de no LMP, todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de no LMP, y muy preferible menos de aproximadamente 5% de no LMP. Cuando la LMP o porción biológicamente activa de la misma se produce de manera recombinante, también está de preferencia sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferible menos de aproximadamente 10%, y muy preferible menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína. El lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de LMP en donde la proteína se separa de precursores químicos u otros químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. En µna modalidad, el lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de LMP teniendo menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores qu ímicos o químicos de no LMP, más preferible menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o quím icos de no LMP, todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de precursores qumicos o qu ím icos de no LMP, y muy preferible menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o químicos de no LMP. En modalidades preferidas, las proteínas aisladas o porciones biológicamente activas de las mismas carecen de proteínas contaminantes del m ismo organismo del que se deriva la LMP. Típicamente, dichas proteínas se producen por expresión recom binante de, por ejemplo, una LMP de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum en otras plantas que Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum o m icroorganismos, algas u hongos . Una LMP aislada o una porción de ia misma de la invención puede participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la producción de compuestos de almacenamiento de semilla en Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum o de membranas celulares, o tiene una o más de las actividades establecidas en la tabla 3. En modalidades preferidas, la proteína o porción de la misma comprende una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homologa a una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35 de modo que la proteína o porción de la misma mantiene la habilidad de participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la construcción de membranas celulares en Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aßstiv?m, o en el transporte de moléculas sobre estas membranas. La porción de la proteína es de preferencia una porción biológicamente activa como se describe en la presente. En otra modalidad preferida, una LMP de la invención tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35. Todavía en otra modalidad preferida, la LMP tiene una secuencia de aminoácidos que es codificada por una secuencia de nucleótido que hibrida, por ejemplo, hibrida bajo condiciones severas, a una secuencia de nucleótido del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35. Todavía en otra modalidad preferida, la LMP tiene una secuencia de aminoácidos que es codificada por una secuencia de nucleótido que es al menos aproximadamente 50-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, más preferible al menos aproximadamente 70-80%, 80-90%, 90-95%, también preferible al menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% homologa a una de las secuencias codificadas por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, y muy preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% ó 99% homologa a una de las secuencias codificadas por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35. La homología de la secuencia de polipéptido se determina de preferencia usando Align X (22 de agosto de 2003) del Vector NTI Suite 9.0 con los siguientes parámetros: penalidad por abertura de Gap: 15; penalidad por extensión de Gap: 6.66; rango de penalidad por separación de Gap: 8; % de identidad por retraso de alineación: 40. Las LMPs preferidas de la presente invención también poseen de preferencia al menos una de las actividades de LMP descritas en la presente. Por ejemplo, una LMP preferida de la presente invención incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótido que hibrida, por ejemplo, hibrida bajo condiciones severas, a una secuencia de nucleótido del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID ÑO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, y que puede participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la construcción de membranas celulares en Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum, o en el transporte de moléculas sobre estas membranas, o que tiene una o más de las actividades establecidas en la tabla 3. En otras modalidades, la LMP es sustancialmente homologa a una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, y retiene la actividad funcional de la proteína de una de las secuencias codificadas por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SÉC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SÉC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, pero difiere en secuencia de aminoácidos debido a variación natural o mutagénesis, como se describió en detalle antes. Por consiguiente, en otra modalidad, la LMP es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 50-60%, de preferencia al menos aproximadamente 60-70%, y más preferible al menos aproximadamente 70-80, 80-90, 90-95, también preferible al menos aproximadamente 85%, 86%, ß7%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ó 95% homologa a una de las secuencias codificadas por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35, y muy preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% ó 99% homologa a una de las secuencias codificadas por un ácido nucleico a una secuencia de aminoácidos entera que tiene al menos una de las actividades de LMP descritas en la presente. La homología de secuencia de polipéptido se determina de preferencia usando Align X (22 de agosto de 2003) del Vector NTI Suite 9.0 con los siguientes parámetros: penalidad por abertura de Gap: 15; penalidad por extensión de Gap: 6.66; rango de penalidad por separación de Gap: 8; % de identidad por retraso de alineación: 40. En otra modalidad, la invención pertenece a una proteína de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, o Triticum aestivum que es sustancialmente homologa a una secuencia de aminoácidos entera codificada por un ácido nucleico del apéndice A, en una modalidad preferida como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, $EC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35. Las mutaciones negativas dominantes o supresión transdominante se pueden usar para reducir la actividad de una LMP en semillas transgénicas a fin de cambiar los niveles de compuestos de almacenamiento de semilla. Para lograr esto, se crea una mutación que suprime la actividad de la LMP y el gen de LMP no funcional inactivo se sobreexpresa en la planta transgénica. La proteína de LMP trans-dominante inactiva compite con la próteína de LMP endógena activa para sustrato o interacciones con otras proteínas y se diluye fuera de fa actividad de la LMP activa. En esta manera, la actividad biológica de la LMP se reduce sin modificar en realidad la expresión del gen de LMP endógeno. Esta estrategia se usó por Portier y otros para modular la actividad de factores de transcripción de planta (Portier D, Miao ZH, Lam E, Plant J 2001 Sep. 27(6):529-38, Trans-dominant suppréssion of plant TGA factors reveáis their negative and positive roles in plant defense responses). Se pueden generar homólogos de la LMP por mutagénesis, por ejemplo, mutación de punta discreta o truncación de la LMP. Como se usa en la presente, el término "homólogo" se refiere a una forma variante de la LMP que actúa como un agonista o antagonista de la actividad de la LMP. Un antagonista de la LMP puede inhibir una o más de las actividades de la forma que ocurre de manera natural de la LMP, por ejemplo, al unir competitivamente a un miembro descendente o ascendente de la cascada metabólica de componente de membrana celular que incluye la LMP, o al unir a una LMP que media transporte de compuestos sobre dichas membranas, así previniendo que ocurra translocación. En una modalidad alternativa, homólogos de la LMP se pueden identificar al seleccionar bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncación, de la LMP para actividad agonista o antagonista de LMP. En una modalidad, una biblioteca variada de variantes de LMP se genera por mutagénesis combinatoria al nivel de ácido nucleico y se codifica por una biblioteca genética variada. Una biblioteca variada de variantes de LMP se puede producir, por ejemplo, al ligar enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias genéticas de modo que un juego degenerado de secuencias de LM P potenciales se puede expresar como polipéptidos individuales, o alternativamente, como una serie de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para exhibición de fago) conteniendo la serie de secuencias de LM P ah í . Hay una variedad de métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de homólogos de LMP potenciales de una secuencia de oligonucleótido degenerada. La s íntesis quím ica de una secuencia genética degenerada se puede realizar en un sintetizador de ADN automático, y el gen sintético después ligado en un vector de expresión apropiado. Uso de una serie degenerada de genes permite la provisión , en una mezcla , de todas las secuencias que codifican la serie deseada de secuencias de LM P potenciales. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Narang 1983, Tetrahedron 39: 3; Itakura y otros 1984, Annu . Rev. Biochem . 53: 323; Itakura y otros, 1984, Science 198: 1056; similares y otros 1983, Nucleic Acids Res. 1 :477) . Además, se pueden usar bibliotecas de fragmentos de las secuencias codificadoras de LMP para generar una población variada de fragmentos de LMP para seleccionar y selección posterior de homólogos de una LMP. En una modalidad, una biblioteca de fragmentos de secuencia codificadora se puede generar al tratar un fragmento de PCR de doble cadena de una secuencia codificadora de LMP con una nucleasa bajo condiciones en donde ocurre festoneado sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizar el ADN de cadena doble, renaturalizar el ADN para formar ADN de cadena doble que puede incluir pares de sentido/antisentido de diferentes productos festoneados, quitar porciones de una sola cadena de dúplex reformados mediante tratamiento con S1 nucleasa, y ligar la biblioteca de fragmento resultante en un vector dé expresión. Por este método, una biblioteca de expresión se puede derivar que codifica terminal N, terminal C y fragmentos internos de varios tamaños de la LMP. Varias técnicas son conocidas en la técnica para seleccionar productos genéticos de bibliotecas combinatorias hechas por mutaciones de punta o truncación, y para seleccionar bibliotecas de cADN para productos genéticos teniendo una propiedad seleccionada. Dichas técnicas se pueden adaptar para selección rápida de las bibliotecas genéticas generadas por la mutagénesis combinatoria de homólogos de LMP. Las técnicas más ampliamente usadas, que son susceptibles a análisis de alto rendimiento, para seleccionar bibliotecas genéticas grandes típicamente incluyen clonar la biblioteca genética en vectores de expresión replicables, transformando células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores, y expresando los genes combinatorios bajo condiciones en donde la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector codificando el gen cuyo producto fue detectado. La mutagénesis de ensamble recursivo (REM), una técnica nueva que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación con los ensayos de selección para identificar homólogos de LMP (Arkin & Yourvan 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:7811-7815; Delgrave y otros 1993, Protein Engineering 6:327-331). En otra modalidad, se pueden explotar ensayos a base de célula para analizar una biblioteca de LMP variada, usando métodos bien conocidos en la técnica. Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteína, proteínas de fusión, cebadores, vectores, y células huésped descritos en la presente se pueden usar en uno o más de los siguientes métodos: identificación de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum y organismos relacionados; mapeo de genomas de organismos relacionados con Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum; identificación y localización de secuencias de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum de interés; estudios evolucionarios; determinación de regiones de LMP requeridas para función; modulación de una actividad de LMP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares; modulación del transporte de transmembrana de uno o más compuestos; y modulación de acumulación de compuesto de almacenamiento de semilla. La planta Arabidopsis thaliana representa ün miembro de plantas superiores (o semilla). Se relaciona a otras plantas tales como Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum qsitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum que requieren luz para impulsar fotosíntesis y crecimiento. Las plantas como Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum comparten un alto grado de homología en la secuencia de ADN y nivel de polipéptido, permitiendo el uso de selección homologa de moléculas de ADN con sondas evolucionando de otras plantas u organismos , así perm itiendo la derivación de una secuencia de consenso adecuada para selección heteróloga o anotación funcional y predicción de funciones genéticas en terceras especies. Por lo tanto, la habilidad de identificar dichas funciones puede tener relevancia significativa, por ejemplo, predicción de especificidad de sustrato de enzimas. Además, estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como puntos de referencia para el mapeo de genomas de Arabidopsis, o de genomas de organismos relacionados. Las moléculas de ácido nucleico de LMP de la invención tienen una variedad de usos. Primero, el ácido nucleico y las moléculas de proteína de la invención pueden servir como marcadores para regiones especificas del genoma. Esto tiene utilidad no sólo en el mapeo del genoma, sino también para estudios funcionales de proteínas de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum. Por ejemplo, para identificar la región del genoma al que se une una proteína de unión a ADN particular de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum, se puede digerir el genoma de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Horde?m vulgare o Triticum aestivum, y los fragmentos incubados con la proteína de unión a ADN. Aquellos que unen la proteína se pueden sondear adicionalmente con las moléculas de ácido nucleico de la invención, de preferencia con marcas prontamente detectables; la unión de dicha molécula de ácido nucleico al fragmento de genoma permite la localización del fragmento al mapa de genoma de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum, y, cuando se realizan múltiples veces con diferentes enzimas, facilita una rápida determinación de la secuencia de ácido nucleico al que se une la proteína. Además, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser suficientemente homologas a las secuencias de especies relacionadas de modo que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en plantas relacionadas. Las moléculas de ácido nucleico de LMP de la invención también son útiles para estudios estructurales evolucionarios y de proteína. Los procesos metabólicos y de transporte en donde las moléculas de la invención participan, se utilizan por una amplia variedad de células procarióticas y eucarióticas; al comparar las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención a aquellas que codifican enzimas similares de otros organismos, se puede valorar la relación evolucionaría de los organismos. De manera similar, dicha comparación permite una valoración sobre cuales regiones de la secuencia se conservan y cuales no, lo que puede ayudar a determinar aquellas regiones de la proteína que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es de valor para estudios de ingeniería de proteína y puede dar una indicación de lo que la proteína puede tolerar en términos de mutagénesis sin perder función. La manipulación de las moléculas de ácido nucleico de LMP de la invención puede resultar en la producción de LMPs teniendo diferencias funcionales de las LMPs de tipo silvestre. Estas proteínas se pueden mejorar en eficiencia o actividad, pueden estar presentes en números mayores en la célula de lo que es usual, o se puede disminuir en eficiencia o actividad. Hay un número de mecanismos por los que la alteración de una LMP de la invención puede afectar directamente la acumulación y/o composición de compuestos de almacenamiento de semilla. En ei caso de plantas que expresan LMPs, el transporte aumentado puede conducir a acumulación alterada de compuestos y/o división de soluto dentro del tejido vegetal y órganos que finalmente se podrían usar para afectar la acumµlación de uno o más compuestos de almacenamiento de semilla durante el desarrollo de semillas. Un ejemplo es provisto por Mitsukawa y otros (1997, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94:7098-7102), en donde la sobreexpresión de un gen transportador de fosfato con alta afinidad de Arabidopsis en células cultivadas con tabaco mejoró ei crecimiento celular bajo condiciones limitadas a fosfato. La disponibilidad de fosfato también afecta de manera significativa la producción de azúcares e intermediarios metabólicos (Hurry y otros 2000, Plant J. 24:383-396) y la composición de lípidos en hojas y raíces (Hártel y otros 2000, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97:10649-10654). Asimismo, la actividad de la planta ACCase se ha demostrado ser regulada por fosforilación (Savage & Ohlrogge 1999, Plant J. 18:521-527) y alteraciones en la actividad de las kinasas y fosfatasas (LMPs) que actúan en la ACCase podrían conducir a niveles aumentados o disminuidos de acumulación de lípido de semilla. Además, la presencia de actividades de kinasa de lípido en membranas de sobre de cloroplasto sugiere que las vías de transducción de señal y/o regulación de proteína de membrana ocurren en sobres (ver, por ejemplo, Müller y otros 2000, J. Biol. Chem. 275:19475-19481 y literatura citada ahí). Los genes AB1 y AB2 codifican dos fosfatasas de serina/treonina 2C, que son reguladores en vía de señalamiento de ácido abscísico, y así en el desarrollo de semillas temprano y tardío (por ejemplo, Merlot y otros 2001, Plant J. 25:295-303). Para más ejemplos, ver también la sección transversal "antecedentes de la invención". La presente invención también provee anticuerpos que unen específicamente a una LMP-polipéptido, o una porción de los mismos, como se codifica por un ácido nucleico descrito en la presente o como se describe en la presente. Se pueden hacer anticuerpos mediante métodos bien conocidos (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988). En breve, el antígeno purificado se puede inyectar en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para elicitar una respuesta inmune. Los anticuerpos pueden purificarse directamente, o se pueden obtener células de bazo del animal. Las células entonces se pueden fusionar con una línea célula inmortal y seleccionar para secreción de anticuerpos. Los anticuerpos se pueden usar para seleccionar bibliotecas de clon de ácido nucleico para células que secret n el antígeno. Aquellos clones positivos entonces se pueden secuenciar (ver, por ejemplo, Nelly y otros 1992, Bio/Technology 10:163-167; Bebbington y otros 1992. Bio/Technology 10:169-175). La frase "une selectivamente" con el polipéptido se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heteróloga de proteínas y otros biológicos. De esta manera, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados unidos a una proteína particular no unen en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión selectiva a un anticuerpo bajo dichas condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una proteína particular. Una variedad de formatos de ¡nmunoensayo se puede usar para seleccionar anticuerpos que unen selectivamente con una proteína particular. Por ejemplo, se usan de forma rutinaria inmuno-ensayos de ELISA de fase sólida para seleccionar anticuerpos selectivamente inmunoreactivos con una proteína. Ver Harlow y Lañe "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que se podrían usar para determinar unión selectiva. En algunos casos, se desea preparar anticuerpos monoclonales de varios huéspedes. Una descripción de técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales se puede encontrar en Suites y otros, editores, "Basic and Clinical Immunology", (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., Cuarta Edición) y referencias citadas ahí, y en Harlow y Lañe ("Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, 1988). A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones. Las descripciones de todas estas publicaciones y aquellas referencias citadas en aquellas publicaciones en sus totalidades se incorporan a la presente por referencia en esta solicitud a fin de describir más completamente el estado de la técnica a la que pertenece esta invención. Será evidente a aquellos expertos en la técnica que se pueden hacer varias modificaciones y variaciones en la presente invención sin alejarse del espíritu o alcance de la invención. Otras modalidades de la invención serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de la consideración de la especificación y práctiva de la invención descrita en la presente. Se pretende que la especificación y los ejemplos sean considerados sólo ejemplos, con un verdadero alcance y espíritu de la invención siendo indicada por las reivindicaciones incluidas en la presente.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Procesos Generales a) Procesos Generales de Clonación: Los procesos de clonación tales como, por ejemplo, cortes de restricción, electroforesis de gel de agarosa, purificación de fragmentos de ADN, transformación de células de Escherichia qoli y levadura, crecimiento de bacteria y análisis de secuencia de ADN recombinante se llevaron a cabo como se describe en Sambrook y otros (1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-451-3). b) Químicos: Los químicos usados fueron obtenidos, a menos que se indique lo contrario en el texto, en cantidad p.a. de las compañías Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karisruhe), Serva (Heidel-berg) y Sigma (Deisenhofen). Se prepararon soluciones usando agua purificada, libre de pirógeno, diseñada como H2O en el siguiente texto, de una planta de purificación de agua con sistema de agua Milli-Q (Millipore, Eschborn). Se obtuvieron endonucleasas de restricción, enzimas modificadoras de ADN y juegos de biología molecular de las compañ ías AGS (Heidelberg) , Amersham (Braunschweig) , Biometra (Gdttingen) , Boehringer (Man?heim) , Genomed (Bad Oeynnhausen) , New England Biolabs (Schwaibach/Taunus) , Novagen (Madison , Wisconsín , EUA), Perkin-Elmer (Weiterstadt) , Pharmacia (Freilburg) , Qiagen (H ilden) y Stratagene (Ámsterdam , Países Bajos) . Se usaron, a menos que se indique lo contrario, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. c) Material y Crecimiento de la Planta: Pla ntas Arabidopsis Para este estudio, se usó material de raíz, hojas, siliques y sem illas de tipo silvestre y plantas mutantes de fad2 (como se describe en Miquel & Browse, 1 992, J Biol Chem 267: 1502- 1509) de Arabidopsis thaliana. Se preincubaron semillas de tipo silvestre y de Arabidopsis mutantes de fad2 durante tres días en la oscuridad a 4°C antes de colocarlas en una incubadora (AR-75, Percival Scientific, Boone, IA) a densidad de reflujo fotón de 60-80 µrhol m"2s" 1 y un periodo de luz de 16 horas (22°C) , y un periodo de oscuridad de 8 horas ( 18°C) . Todas las plantas fueron iniciadas en medio de MS de resistencia media (Murashige & Skoog, 1962, Physiol. Plant. 15, 473-497), ph 6.2, 2% de sacarosa y 1 .2% de agar. Se esterilizaron sem illas durante 20 minutos en 20% dé blanqueador 0.5% tritón X 100 y se enjuagaron 6 veces con agua estéril en exceso. Las plantas se hicieron crecer como se describió antes o en suelo bajo condiciones estándar como se describe en Klaus y otros (2002, Plant Physiol 128:885-895). Glycine max Se usó Glycine max cv. Resnick para este estudio para crear bibliotecas de cADN. Se recolectaron tejidos de semilla, vaina de semilla, flor, hoja, tallo y raíz de plantas que en algunos casos fueron tratadas en oscuridad, sal, calor y sequía. En algunos casos, las plantas también habían sido infectadas con nematodo. Sin embargo, este estudio se enfocó en el uso de tejidos de semilla y vaina de semilla para bibliotecas de cADN. Se etiquetaron plantas para cultivar semillas en los días establecitos después de antesis: 5-15, 15-25, 25-35 & 33-50. Oryza sativa Se usó Oryza sativa ssp. Japónica cv. Nippon-barre para este estudio para crear bibliotecas de cADN. Se recolectaron tejidos de semilla, vaina de semilla, flor, hoja, tallo y raíz de plantas que fueron en algunos casos tratadas en oscuridad, sal, calor y sequía. Este estudio se enfocó en el uso de tejidos de embrión de semilla para bibliotecas de cADN. Se recolectaron por separado embrión y endoesperma en caso de que el tejido de endoesperma pudiera interferir con la extracción de ARN. Habían crecido plantas en el invernadero en suelo de Wisconsin (tiene materia orgánica alta) a 85°F bajo un fotoperiodo de 14 horas. Se disectaron embriones de arroz fuera de las semillas en desarrollo.

Zea mays Se usaron híbridos de Zea mays B73 x Mo17 y B73 consanguíneo (el pariente hembra consanguíneo del híbrido B73 x Mo17) para generar bibliotecas de cADN. Se recolectaron de plantas frutas o semillas (óvulos fertilizados/granos jóvenes en etapa 1 y 9 días posteriores a fecundación; granos en etapa de leche [R3, producción de almidón temprana], 23 días posteriores a fecundación; granos en etapa de pasta temprana (R4), granos de almidón en desarrollo y embrión bien formado presente, 30 días posteriores a fecundación de plantas crecidas; granos muy jóvenes en etapa de ampolla [R2, endoesperma aguado]; granos en etapa de dentado temprana (R5), endoesperma haciéndose firme, 36 días posteriores a fecundación; consanguíneos B73, granos a 9 y 19 días posteriores a fecundación), flores (desarrollo de borla: borla de 6 cm (V10) hasta e incluyendo antesis, 44 a 70 dap; desarrollo de oreja: brotes de oreja de 2 cm (V13) hasta e incluyendo aguas (no fecundadas), 51 a 70 dap), hojas/raíz/rosetas (edades mixtas, todas antes de llenado de semilla; incluye hojas de a) plantas de 3 hojas (V3), b) plantas de 5 hojas (V6), y c) una hoja de fuente más vieja (3a desde el piso), justo antes de aparición de borla en el campo), tallo (ubicado subterráneo de plantas de 2 a 5 hojas; raíces y la mayor parte de tejido de hoja eliminado, 13 a 29 dap de plantas crecidas en campo; tejido de tallo cerca de la oreja en aparición de borla y durante ll nado de semilla (etapa de leche), 56 a 84 dap, plantas crecidas en campo) y tejidos de raíz (de plantas jóvenes a edad media; de semillas, plantas de 5 hojas, y plantas de 9 hojas; 12 a 35 dap). Linum usitatissimum Linum usitatissimum cv 00-44427 y cv 00-44338 (de la colección Svalóf Welbull) se usó para este estudio para crear bibliotecas de cADN. Plantas habían crecido en ollas de 2 litros con tierra para maceta conteniendo 5 ml de tierra Osmocote/litro en una cámara de invernadero enfriada a 19°C. Se ha recolectado material de semillas en desarrollo a 15daa (embrión está en una etapa de alargamiento intensivo, llenando aproximadamente 2/3 de la semilla; embrión es verde en etapa de torpedo tardía), 25 daa (embrión completamente alargado y aumentado en ancho, semilla entera se llena; embrión todavía es completamente verde) y 33 daa (semilla está empezando a madurar; color de embrión está cambiando a verde más claro y la punta es amarilla). Hordeum vulgare Hordeum vulgare cv. Morex se usó para este estudio para crear bibliotecas de cADN. Se han hecho crecer plantas en el invernadero en metromix bajo un fotoperiodo de 15 horas a 23°C durante el periodo de día y 18°C durante el período de noche. El grano estaba en la etapa de maduro aguado a leche tardía. La cabeza de semilla media a superior se cultivó primariamente. Se recolectó material de semilla 75 días después de plantar.

Triticum aestivum Triticum aestivum cv. Galeón se usó para este estudio para crear bibliotecas de cADN. Se recolectaron tejidos de semilla, flor, fruto, hoja, tallo y raíz de plantas que en algunos casos fueron tratadas en oscuridad, sal, calor y sequía. Se han hecho crecer plantas en el invernadero en metromix bajo un fotoperiodo de 12 horas a 72°F durante el periodo de día y 65°F durante el periodo de noche.

Ejemplo 2: Total aislamiento de ADN de plantas Los detalles para el aislamiento de ADN total se refieren al trabajo de peso de un gramo fresco de material de planta. Regulador de CTAB: 2% (p/v) bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (CTAB); 100 mM Tris HCl pH 8.0; 1.4 M NaCI; 20 mM EDTA. Regulador de N-laurilsarcosina; 10% (p/v) N-laurilsarcosina; 100 mM Tris HCl pH 8.0; 20 mM EDTA. Se trituró el material de planta bajo nitrógeno líquido en un mortero para dar un polvo fino y transferido a recipientes de 2 ml de Eppendorf. Después se curbrió el material de planta congelado con una capa de 1 ml de regulador de descomposición (1 ml de regulador de CTAB, 100 µl de regulador de N-laurilsarcosina, 20 µl de ß-mercaptoetanol y 10 µl de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60°C durante una hora con agitación continua. El homogeneizado obtenido se distribuyó en dos recipientes de Eppendorf (2 ml) y se extrajo dos veces al agitar con el mismo volumen de cloroformo/alcohol de isoamilo (24:1). Para separación de fase, se llevó a cabo centrifugación a 8000g y temperatura ambiente durante 15 minutos en cada caso. El ADN entonces se precipitó a -70°C durnate 30 minutos usando isopropanól helado. El ADN precipitado se sedimentó a 4°C y 10,000 g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 µl de regulador de TE (Sambrook y otros 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para purificación adicional, el ADN fue tratado con NaCI (1.2 M de concentración final) y se precipitó una vez más a -706C durante 30 minutos usando dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de un paso de lavado con 70% de etanol, el ADN se secó y posteriormente fue absorbido en 50 µl de H2O + ARNse (50 mg/ml de concentración final). El ADN se disolvió durante la noche a 4°C y la digestión de ARNse se llevó a cabo posteriormente a 37°C durante 1 hora. El almacenamiento del ADN ocurrió a 4°C.

Ejemplo 3: Aislamiento de ARN total y poli-(A) + ARN de plantas Arabidopsis thaliana Para la investigación de transcripciones, se aislaron ARN total y poli-(A)+ARN. Se aisló ARN de siliques de plantas de Arabidopsis de acuerdo con el siguiente procedimiento: Preparación de ARN de semillas de Arabidopsis - extracción "caliente": Reguladores, enzimas y solución 2M KCl Proteinasa K Fenol (para ARN) Cloroformo:alcohol de isoamilo (Fenol.cloroformo 1:1; pH ajustado para ARN) 4 M LICI, tratado con DEPC Agua tratada con DEPC 3M NaOAc, pH 5, tratado con DEPC Isopropanol 70% de etanol (formado con agua tratada con DEPC) Regulador de resuspensión: 0.5% SDS, 10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA formado con agua tratada con DEPC ya que esta solución no se puede tratar con DEPC Regulador de extracción: 0.2M Na Borato 30 mM EDTA 30 mM EGTA 1% SDS (250µl de 10% SDS-solución para 2.5 ml regulador) 1% Desoxicolato (25mg para 2.5 ml regulador) 0.2M Na Borato 30 mM EDTA 30 mM EGTA 1% SDS (250µl de 10% SDS-solución para 2.5 ml regulador) 1% Desoxicolato (25mg para 2.5 ml regulador) 2% PVPP (insoluble - 50 mg para 2.5 ml regulador) 2% PVP 40K (50 mg para 2.5 ml regulador) 10 mM DTT 100 mM ß-mercaptoetanol (fresco, manejar bajo cofre de humo uso 35 µl de 14.3M solución para 5 ml regulador) Extracción Calentar regulador de extracción hasta 80°C. Moler tejido en mortero enfriado con nitrógeno líquido, transferir polvo de tejido a 1.5ml tubo. El tejido se debe mantener congelado hasta que se agrega regulador para así transferir la muestra con espátula previamente enfriada y mantener el tubo en nitrógeno líquido en todo momento. Agregar 350µl de regulador de extracción precalentado (aquí para 100mg tejido, el volumen de regulador puede ser tanto como 500µl para muestras más grandes) a tubo, vórtice y calentar tubo a 80°C durante -1 minuto. Mantener entonces en hielo. Vórtice de muestra, moler adicionalmente con mortero eléctrico. Digestión Agregar proteinasa K (0.15mg/100mg tejido), vórtice y mantener a 37°C durante una hora. Primera purificación Agregar 27µl 2M KCl. Enfriar en hielo durante 10 minutos. Centrifugar a 12.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transferir sobrenadante a tubo libre de ARNasa fresco y hacer una extracción de fenol, seguido por una extracción de cloroformo:alcohol de isoamilo. Agregar 1 vol. Isopropanol a sobrenadante y enfriar en hielo durante 10 minutos. Granular ARN mediante centrifugación (7000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente). Resolver pildora en 1ml 4M LICI por 10 a 15 minutos en vórtice. Granular ARN por 5 minutos de centrifugación. Segunda purificación Resuspender pildora en 500µl regulador de resuspensión. Agregar 500µl fenol y vórtice. Agregar 250µl cloroformo:alcohol de isoamilo y vórtice. Girar durante 5 minutos y transferir sobrenadante a tubo fresco. Repetir extracción de cloroformo:alcohol de isoamilo hasta que interfaz está clara. Transferir sobrenadante a tubo fresco y agregar 1/10 vol 3M NaOAc, pH 5 y 600µl isopropanol. Mantener a -20 durante 20 minutos o más. Granular ARN por 10 minutos de centrifugación. Lavar pildora una vez con 70% etanol. Quitar todo el alcohol restante antes de resolver pildora con 15 a 20µl agua de DEPC. Determinar cantidad y calidad al medir la absorbancia de una dilución de 1:200 a 260 y 280nm. 40µg ARN/ml = 10D260. Se aisla ARN de tipo silvestre de Arabidopsis como se describe (Hosein, 2001, Plant Mol. Biol. Rep., 19, 65a-65e; Ruuska, S.A., Girke, T., Benning, C, & Ohlrogge, J.B., 2002, Plant Cell, 14, 1191-1206).

El mARN se prepara de ARN total , usando el equipó de purificación de mARN Amersham Pharmacia Biotech , que utiliza columnas de oligo(dT)-celulosa. Se aisló el aislam iento de poli-(A)+ARN usando Dyna BeadsR (Dynal , Oslo, Noruega) siguiendo las instrucciones del protocolo del fabricante. Después de la determinación de la concentración del ARN o del poli(A)+ARN , el ARN se precipitó por adición de 1 /10 volúmenes de 3M acetato sódico pH 4.6 y 2 volúmenes de etanol y se almacenó a -70°C . Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare y Triticum aestivum Se separaron semillas de Glycine max y Linum ?sitatissimum de vainas para crear materiales homogéneos para bibliotecas de cADN de sem illa y vaina de semilla . Se molieron tej idos en polvo fino bajo N2 líq uido usando un mortero y punzón y se transfieren a un tubo de 50ml . Se almacenaron las muestras de tejido a -80°C hasta que se pud ieron realizar las extracciones. En el caso de Oryza sativa, se aislaron 5K - 1 0K embriones y endoesperma a través de disección. Se colocaron tejidos en tubos pequeños o platos de Petri en hielo durante disección. Se colocaron contenedores en hielo seco, después se almacenaron a -80°C . En el caso de Zea mays, se molieron tejidos en polvo fino bajo N2 l íquido usando un mortero y punzón y se transfirieron a un tubo de 50m l . Se almacenaron m uestras de tej ido a -80°C hasta que se puedo realizar la extracción .

En el caso de Hordeum vulgare, se cortaron cabezas de semilla (secciones de aproximadamente 2 pulgadas) para tener florecillas en la etapa indicada. Todas las barbas fueron podadas. La etapa elegida fue lleno de semilla temprano/medio. Los granos de bibliotecas de cADN de tejido de semilla estaban en etapa de madurez aguada o en leche. En el caso de Triticum aestivum, se plantaron muestras de germinación de semilla de semillas de trigo Galeón a una profundidad de 2" en metromix en un plano 20" x 12". El suelo fue enjuagado liberalmente con agua y después se desaguó dos veces al día. 3-4 días después cuando las coleopilas fueron -1 cm, las plántulas fueron lavadas con agua y bloteadas. Para crear bibliotecas de cADN de flor, se recolecta un número igual de cabezas a 30%, 60% y 100% de aparición de cabeza desde el revestimiento en cada uno de los dos días. Todavía no había anteras. A fin de generar bibliotecas de cADN de tejido de semilla, los granos estaban en etapa de madurez aguada o leche dependiendo de la posición de granos en la cabeza; para etapas de desarrollo de semilla tardías sólo se cultivaron las cabezas de semilla. Para las bibliotecas de raíz, sólo se cosecharon raíces. Las plantas no tµvieron tallo principal ni tres brotes fuertes. Las plantas crecieron en macetas, el medio se lavó y las raíces se salvaron para esta muestra. Las plansas no fueron tratadas. El ARN total fue extraí de tejidos usando el equipo Rneasy Maxi (Queen) de acuerdo con el protocolo del fabricante y mARN se procesó de ARN total usando el equipo Oligotex mRNA Purification System (Qiagen), también de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se envió mARN a Hyseq Pharmaceuticals Incorporated (Sunnyville, CA) para procesamiento adicional de mARN de cada tipo de tejido en bibliotecas de cADN y para usarse en sus procesos propietarios en donde se agrupan insertos similares en plásmidos con base en patrones de hibridación.

Ejemplo 4: Construcción de biblioteca de cADN Para construcción de biblioteca de cADN, se logró primera síntesis de cadena usando transcriptasa de reversa de Virus de Leucemia Murino (Roche, Mannheim, Alemania) y oligo-d(T)-cebadores, segunda síntesis de cadena por incubación con polimerasa I de ADN, enzima Klenow y digestión de ARNseH a 12°C (2 horas), 16°C (1 hora) y 22°C (1 hora). La reacción fue detenida por incubación a 65°C (10 minutos) y se transfirió posteriormente a hielo. Se redondearon las moléculas de ADN de doble cadena por T4-ADN-polimerasa (Roche, Mannheim) a 37°C (30 minutos). Se eliminaron nucleótidos por extracción de fenol/cloroformo y columnas Sephadex G50. Se ligaron adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) a los extremos de cADN por T4-ADN-ligása (Roche, 12°C) durante la noche) y posforilaron por incubación con polinucleótido kinasa (Roche, 37°C, 30 minutos). Esta mezcla se sometió a separación en un gel de agarosa de fusión baja. Las moléculas de ADN más grandes que 300 pares base fueron eluidas a partir del gel, extraídas con fenol, concentradas en columnas Elutip-D (Schleicher and Schuell, Dassel, Alemania) y se ligaron a brazos de vector y empacaron en fagos lambda ZAPII o fagos lambda ZAP-Express usando el equipo Gigapack (Stratagene, Amsterdam, Países Bajos) usando material y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se generaron bibliotecas de cADN de Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum en Hyseq Pharmaceuticals Incorporated (Sunnyville, CA). Se usaron pasos de no amplificación en la producción de biblioteca para retener información de expresión. La propuesta genómica de Hyseq involucra agrupar los genes en racimos y después secuenciar miembros representativos de cada racimo. Se generaron bibliotecas de cADN de mARN purificado de columna oligo dT. Las colonias a partir de la transformación de la biblioteca de cADN en E. coli fueron elegidas de forma aleatoria y se amplificó el inseto de cADN por PCR y manchado en membranas de nylon. Una serie de oligonucleótidos radiomarcados 33"P se hibridaron a los clones y el patrón de hibridación resultante determinado al que perteneció un racimo de clon particular. Los clones de cADN y sus secuencias de ADN se obtuvieron para usarse en sobreexpresión en plantas transgénicas y en otros procesos de biología molecular descritos en la presente.

Ejemplo 5: Inentificación de genes de LMP de interés que son de tipo FAD2 Arabidopsis thaliana Se usaron Arabidopsis de tipo silvestre y mutante fad2 de Arabidopsis para identificar genes codificadores de LMP. El gen FAD2 se ha clonado y descrito (J Okuley, J Lightner, K Feldmann, N Yadav, E Lark & J Browse, Plant Cell 6:147-158, 1994). FAD2 codifica la enzima aß-desaturasa de ácido graso microsomal que inserta una unión doble en la posición D12 de ácido oleico (C18:1Dß) unido a fosfatidilcolina para producir ácido linoleico (C18:2°9,12) y, por esta razón, también es referido como una 12-desaturasa. FAD2 está presente como un solo gen en el genoma de Arabidopsis. Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare y Triticum aestivum Este ejemplo ilustra la forma en que se identificaron y aislaron clones de cADN codificando polipéptidos de tipo FAD1 de Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum. A fin de identificar genes de tipo FAD2 en bases de datos proprietarias, llevó a cabo un análisis de similitud usando software BLAST (Basic Local Alígnment Search Tool, versión 2.2.6, Altschul y otros, 1997, Nucleic Acid Res. 25:3389-3402). Los ajustes por defecto se usaron excepto para corte de valor e (1e-10) y todas las búsquedas de proteína se hicieron usando la matriz BLOSUM62. La secuencia de aminoácido del polipéptido de FAD2 Arabidopsis se usó como una consulta para buscar y alinear bases de datos de ADN de Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum que se tradujeron en todos los seis marcos de lectura, usando el algoritmo TBLASTN . Dicho aná lisis de sim ilitud de las bases de datos internas de BPS resultó en la identificación de numerosos ESTs y secuencias contiguas de cADN . Los datos de perfil de expresión de ARN obtenidos del proceso de agrupam iento Hyseq se usaron para determinar la especificidad de órgano. Los clones mostrando una expresión mayor en bibliotecas de sem i lla en comparación con las otras bibliotecas de tej ido se seleccionaron como genes candidatos de LMP . Se seleccionaron los clones de Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum para sobreexpresión en Arabidopsis y plantas de cosecha específica con base en su perfil de expresión .

Ejem plo 6: Clonación de cADNs de longitud completa y ortólogos de genes de LM P identificados Se han identificado clones correspondientes a secuencias de longitud completa y cADNs parciales de Arabidopsis thaliana, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum en las bases de datos Hyseq proprietarias internas. Los clones de Hyseq de genes de Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vulgare o Triticum aestivum se secuenciaron en marcas de ADN usando un secuenciador de gel de losa ABI 377 y equipos BigDye Terminator Ready Reaction (PE Biosystems, Foster City, CA). Se hicieron alineaciones de secuencia para determinar si los clones de Hyseq eran clones de longitud completa o parcial. En casos donde los clones de Hyseq se determinaro como cADNs parciales, se usó el siguiente procedimiento para aislar las secuencias de longitud completa. Se aislaron cADNs de longitud completa por RACE PCR usando el equipo de amplificación de cADN SMART RACE de Clontech permitiendo amplificación rápida de 5' y 3' de los extremos de cADN (RACE). Los cebadores de RACE PCR fueron diseñados con base en las secuencias de clon de Hyseq. El aislamiento de cADNs de longitud completa y el protocolo de RACE PCR usados se basaron en las condiciones del fabricante. Los fragmentos de producto RACE fueron extraídos de geles de agarosa con un equipo QIAquick Gel Extraction (Qiagen) y ligados en el vector TOPO pCR 2.1 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se transformaron vectores recombinantes en células TOP10 (Invitrogen) usando condiciones estándar (Sambrook y otros 1989). Se hicieron crecer células transformadas durante la noche a 37°C én LB agar conteniendo 50 µg/ml kanamicina y propagadas con 40µl de una solución de reserva 40 mg/ml de X-gal en dimetilformamida para selección azul-blanco. Se seleccionaron colonias blancas individuales y se usaron para inocular 3 ml de LB líquido conteniendo 50 µg/ml de kanamicina y se hicieron crecer durante la noche a 37°C. Se extrajo ADN plásmido usando el equipo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizaron análisis posteriores de clones y mapeo de restricción de acuerdo con técnicas de biología molécula estándar (Sambrook y otros 1989). Se aislaron cADNs de longitud completa y se clonaron en vectores binarios al usar el siguiente procedimiento: Se diseñaron cebadores específicos de genes usando las secuencias de longitud completa obtenidas de clones de Hyseq o productos de amplificación de RACE posteriores. Se mp'^icaron secuencias y genes de longitud completa utilizando clones de Hyseq o bibliotecas de cADN como plantilla de ADN usando PCR de toma de contacto. En algunos casos, se diseñaron cebadores para agregar una secuencia tipo "AACA" Kozak justo ascendente del codon de inicio de genes y dos bases descendentes, en algunos casos, cambiaron a GC para facilitar niveles de expresión genética aumentada (Chandrashekhar y otros 1997, Plant Molecular Biology 35:993-1001). Los ciclos de reacción de PCR fueron: 94°C, 5 minutos; 9 ciclos de 94°C, 1 minuto, 65°C, 1 minuto, 72°C, 4 minutos y en donde la temperatura de templado fue reducida por 1°C cada ciclo; 20 ciclos de 94ßC, 1 minuto, 55°C, 1 minuto, 72°C, 4 minutos; y el ciclo de PCR terminó con 72°C, 10 minutos. Los productos de PCR amplificados se purificaron con gel de 1% de geles de agarosa usando columnas de rotación GenElute-EtBr (Sigma) y después dé digestión enzimática estándar, se ligaron en el vector binario de planta pBPS-GB1 para transformación de Arabidopsis. El vector binario se amplificó durante la noche crecido en E. coli DH5 en medio LB y antibiótico apropiado y se preparó plásmido para pasos descendentes usando el equipo de preparación Qiagen MiniPrep DNA. El inserto fue verificado a lo largo de los varios pasos de clonación al determinar su tamaño a través de la digestión de restricción y se secuenciaron insertos para asegurar que se usó el gen esperado en la transformación de Arabidopsis. Se pueden usar secuencias de genes para identificar genes homólogos o heterólogos (ortólogos, el mismo gen de LMP de otra planta) de cADN o bibliotecas genómicas. Esto se puede hacer al diseñar cebadores de PCR a secuencias conservadas identificadas por alineaciones de secuencia múltiple. A menudo se identifican ortólogos al diseñar cebadores degenerados a secuencias de longitud completa o parcial de genes de interés. Se pueden usar secuencias de genes para identificar homólogos u ortólogos de cADN o bibliotecas genómicas. Se pueden aislar genes homólogos (por ejemplo, clones de cADN de longitud completa) vía hibridación usando, por ejemplo, bibliotecas de cADN: dependiendo de la abundancia del gen de interés, 100,000 hasta 1,000,000 bacteriófagos recombinantes se blindan y transfieren a membranas de nylon. Después de la desnaturalización con álcali, se inmovilizó ADN en la membrana, por ejemplo, por entrelazamiento UV. Se lleva a cabo hibridación a condiciones severas. Se realiza hibridación de solución acuosa y lavado a una resistencia iónica de 1 M NaCI y una temperatura de 68°C. Se generan sondas de hibridación por ejemplo, por marca de transcripción nick radioactiva (32P) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania). Se detectan señales mediante autoradiografía. Los genes parcialmente homólogos o heterólogos que se relacionan pero no son idénticos, se pueden identificar en un procedimiento análogo al procedimiento antes descrito usando condiciones de hibridación y lavado de baja severidad. Para hibridación acuosa, la resistencia iónica normalmente se mantiene a 1M NaCI mientras que la temperatura se reduce progresivamente de 68 a 42°C. El aislamiento de secuencias genéticas con homologías (o identidad/similitud de secuencia) sólo en un dominio distinto de (por ejemplo 10-20 aminoácidos) se puede llevar a cabo al usar sondas de oligonucleótido radio marcadas sintéticas. Se preparan oligonucleótidos radio marcados por fosforilación del extremo 5-prima de dos oligonucleótidos complementarios con T4 polinucleótido kinasa. Se templan los oligonucleótidos complementarios y se ligan para formar concatémeros. Los concatémeros de doble cadena entonces se radiomarcan por ejemplo mediante transcripción nick. La hibridación normalmente se realiza a condiciones de baja severidad usando altas concentraciones de oligonucleótido. Solución de hibridación de oligonucleótido: 6 x SSC M fosfato sódico mM EDTA (pH 8) 0.5% SDS 100 µg/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado % de leche seca sin grasa Durante la hibridación, se baja la temperatura en forma de pasos a 5-10°C debajo del Tm de oligonucleótido estimado o a temperatura ambiente seguido por pasos de lavado y autoradiografía. Se realiza el lavado con baja severidad tal como 3 pasos de lavado usando 4x SSC. Se describen más detalles por Sambrook y otros (1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press) o Ausubel y otros (1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).

Ejemplo 7: Identificación de genes de interés al seOeccionar bibliotecas de expresión con anticuerpos Se pueden usar clones de c-ADN para producir proteina recombinante por ejemplo en £. coli (por ejemplo, sistema Qiagen QIAexpress pQE). Las proteínas recombinantes encones se purifican normalmente en afinidad vía cromatografía de afinidad NINTA (Qiagen). Se pueden usar proteínas recombinantes para producir nticuerpos específicos por ejemplo usando técnicas estándar para inmunización de conejos. Se purifican en afinidad los anticuerpos usando una coluna de Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante como se describe por Gu y otros (1994, BioTechniques 17:257-262).

El anticuerpo entonces se puede usar para seleccionar expresión de bibliotecas de cADN para identificar genes homólogos o heterólogos vía una selección inmunológica (Sambrook y otros 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel y otros, 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).

Ejemplo 8: Hibridación Northern Para hibridación de ARN, se separa 20 µg de ARN total o 1 µg de ppli-(A)+ARN por electroforesis de gel en 1.25% de geles de agarosa usando formaldehído como se describe en Amasino (1986, Anal. Biochem. 152:304), transferido por atracción capilar usando 10 x SSC a membranas de nylon positivamente cargadas (Hybond N + , Amersham, Braunschweig), inmovilizado por luz UV y pre-hibridizado durante 3 horas a 68°C usando regulador de hibridación (10% dextran sulfato p/v, 1 M NaCI, 1% SDS, 100 µg/ml de ADN de esperma de arenque). El marcado de la sonda de ADN con el equipo de marca de ADN Highprime (Roche, Mannheim, Alemania) se lleva a cabo durante la pre-hibridación usando alfa-32P dCTP (Amersham, Braunschweig, Alemania). Se lleva a cabo hibridación después de la adición de la sonda de ADN marcada en el mismo regulador a 68°C durante la noche. Los pasos de lavado se llevan a cabo dos veces durante 15 minutos usando 2 x SSC y dos veces durante 30 minutos usando 1 x SSC, 1% SDS a 68°C. La exposición de los filtros sellados se lleva a cabo a 70°C durante un período 1 día a 14 días.

Ejemplo 9: Secuenciación de ADN y análisis funcional computacional Se pueden usar bibliotecas de cADN para secuenciación de ADN de acuerdo con métodos estándar, en particular por el método de terminación de cadena usando el equipo ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer, Wéiterstadt, Alemania). Se puede llevar a cabo secuenciación aleatoria posterior a recuperación de plásmido preparativo de bibliotecas de cADN vía escisión de masa in vivo, retransformación, y blindado posterior de DH109 en placas de agar (detalles de material y protocolo de Stratagene, Amsterdam, Países Bajos). Se puede preparar ADN plásmido de cultivos de E. coli crecidos durante la noche crecidos en medio Luria-Broth conteniendo ampicilina (ver Sambrook y otros (1989, Cold Spring Harbor Laborátory Press: ISBN 0-87969-309-6) en un robot de preparación de ADN de Qiagene (Qiagen, Hilden) de acuerdo con los protocolos del fabricante). Se pueden procesar secuencias y anotar usando el paquete de software EST-MAX comercialmente disponible por Bio-Max (Munich, Alemania). El programa incorpora métodos de bioinformática importantes para caracterización funcional y estructural de secuencias de proteína. Para referencia ver http://pendant.mips.biochem.mpg.de. Los algoritmos más importantes incorporados en EST-MAX son: FASTA: búsquedas de base de datos de secuencia de proteína muy sensibles con estimados de importancia estadística (Pearson W.R. 1990, Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FAST. Methods Enzymol. 183:63-98). BLAST: búsquedas de base de datos de secuencia de proteína muy sensible con estimados de importancia estadística (Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., y Lipman D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410). PREDATOR: predicción de estructura secundaria de alta precisión de secuencias individuales y múltiples. (Frishman & Argos 1997, 75% accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins 27:329-335). CLUSTALW: Alineación de secuencia múltiple (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. 1994). CLUSTAL W: mejorar la sensibilidad de alineación de secuencia múltiple progresiva a través de peso de secuencia, penalidades por hueco de posiciones específicas y elección de matriz de peso, Nucleic Acids Res. 22.4673-4680). TMAP: Predicción de región de transmembrana de secuencias múltiples alineadas (Persson B. & Argos P. 1994, Predictión of transmembrane segmente in proteins utilizing múltiple sequence alignments, J. Mol. Biol. 237:182-192). ALOM2: Predicción de región de transmembrana de secuencias individuales (Klein P., Kanehisa M., y DeLisi C. 1984, Prediction of protein fu?ction from sequence properties: A discriminant analysis of a datábase. Biochim. Biophys. Acta 787:221-226, versión 2 por Dr. K. Nakai). PROSEARCH: Detección de patrones de secuencia de proteína PROSITE. (Kolakowski L.F. Jr., Leunissen J.A.M. y Smith J.E. 1992, ProSearch: fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function.

Biotechniques 13:919-921). BLIMPS: Búsquedas de similitud contra una base de datos de bloques sin huecos (Wallace & Henikoff 1992, PATMAT: A searching and extraction program for sequence, pattern and block queries and databases, CABIOS 8:249-254. Escrito por Bill Alford).

Ejemplo 10: Plásmidos para transformación de planta Para transformación de planta, se pueden usar vectores binarios tal como pBinAR (Hófgen & Willmitzer 1990, Plant Sci. 66:221-230). Construcción de los vectores binarios se puede realizar por ligación del cADN en orientación de sentido o antisentido en el T-ADN. 5-prima al cADN, un promotor de planta activa la transcripción del cADN. Una secuencia de poliadenilación se ubica en 3'-pri a a la expresión específica de semilla se puede lograr al clonar el napín o LeB4 o promotor USP 5-prima al cADN. También se puede usar cualquier otro elemento promotor específico de semilla. Para expresión constitutiva dentro de toda la planta, se puede usar el promotor CaMV 35S. La proteína expresada se puede buscar a un compartimiento celular usando un péptido individual, por ejemplo para plástidos, mitocondria o retículo endoplástico (Kermode 1996, Crit. Rev. Plant Sci. 15:285-423). El péptido individual se clona 5-prima en marco al cADN para lograr localización subcelular de la proteína de fusión. Los vectores binarios de planta usados por ejemplo son los vectores pBPS-GB007, pSUN2-GW o pBPS-GB047 en donde se clonan candidatos de gen de LMP. Estos vectores binarios cohtienen un gen de resistencai a antibiótico impulsado bajo el control del promotor AtAcl2-1 y un USP u otro promotor específico de semilla o un promotor constitutivo enfrente del gen candidato con el terminador NOSpA o el terminador OCS. Se clona cADN de LMP de longitud parcial o completa en el sitio de clonación múltiple del vector binario de planta en orientación de sentido o antisentido detrás de los promotores de USP o específico de semilla u otro específico de semilla o constitutivo. Otros promotores que se pueden usar para diferentes especies de cosecha también se mencionan en el ejemplo 11. El vector recombinante que contiene el gen de interés se transforma en células Top10 (Invitrogen) usando condiciones estándar. Se seleccionan células transformados para un LG agar conteniendo 50 µg/ml de kanamicina crecida durante la noche a 37°C. Se extrae ADN plásmido usando el equipo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realiza análisis de clones posteriores y mapeo de restricción de acuerdo con técnicas de biología molécula estándar (Sambrook y otros 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY).

Ejemplo 11: Transformación de planta mediada por Agrobacterium La transformación de planta mediada por Agrobacterium con los ácidos nucleicos de LMP descritos en la presente se puede realizar usando técnicas de transformación y regeneración estándar (Gelvin, Stanton B. & Schilperoort R.A., Plant Molecular Biology Manual, 2a ed. Kluwer Academic Publ., Dordrecht 1995 en Sect., Ringbuc Zentrale Signatur:BT11-P: Glick, Bernard R. y Thompson, John E. Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, S. 360, CRC Press, Boca Ratón 1993). Por ejemplo, se puede realizar transformación mediadad por Agrobacterium usando la cepa GV3 de Agrobacterium tumefaciens (pMP90) (Koncz & Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o LBA4404 (Clontech). Se puede hacer crecer Arabidopsis thaliana y transformar de conformidad con condiciones estándar (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris. 316:1194-1199; Bent y otros 1994, Science 265:1856-1860). Adicionalmente, se puede transformar colza con los ácidos nucleicos de LMR de la presente invención vía transformación de cotiladpn o hipocotilo (Moloney y otros 1989, Plant Cell Report 8:238-242; De Block y otros 1989, Plant Physiol. 91:694-701). El uso de antibiótico para Agrobacterium y selección de planta depende del vector binario y la cepa de Agrobacterium usada para la transformación. Normalmente la selección de colza se realiza usando un marcador de planta que se puede seleccionar. Adicionalmente, se puede realizar transferencia de gene mediada por Agrobacterium a linaza usando, por ejemplo, una técnica descrita por Mynarova y otros (1994, Plant Cell Report 13:282-285). Se puede clonar el gen de tipo FAD2 de Arabidopsis o FAD2 en un vector binario, transformado y expresado con un promotor constitutivo como el superpromotor (Stanton B. Gelvin, USP#5,428,147 y USP#5, 217,903) o promotores específicos de semilla como USP (proteína de semilla desconocida) de Vicia faba (Baeumlein y otros 1991, Mol. Gen. Genetics 225:459-67), o el promotor B4 de legumina (LeB4; Baeµmlein y otros 1992, Plant J. 2:233-239) así como promotores confiriendo expresión específica de semilla en plantas de monocot como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. El gen de Arabidopsis AHAS (AtAHAS) se podría usar como un marcador seleccionable en estas construcciones. La transformación de soya se puede realizar usando por ejemplo una técnica descrita en EP 0424 047, patente de E.U.A. No. 5,322,783 (Pioneer Hi-Bred International) o en EP 0397 687, patente de E.U.A. No. 5,376,543 o patente de E.U.A. No. 5,169,770 (University Toledo), o por cualquiera de un número dé otros procedimientos de transformación conocidos en la técnica. Se esterilizan en superficie las semillas de soya con 70% de etanol durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido por 20% (v/v) Clorox suplementado con 0.05% (v/v) tween durante 20 minutos con agitación continua. Después, las semillas sé enjuagan 4 veces con agua destilada y se colocan en papel de filtro estéril húmedo en un plato de Petri a temperatura ambiente durante 6 a 39 horas. Se pelan los revestimientos de semilla y se desprenden los cotiledones del eje de embrión. El eje de embrión se examina para asegurar que la región meristemática no esté dañada. Los ejes de embrión cortados se recolectan en un plato de Petri estéril medio abierto y se secan al aire a un contenido de humedad de menos de 20% (peso fresco) en un plato de Petri sellado hasta uso adicional. El método de transformación de planta también se puede aplicar a Brassica napus, Linum usitatissimum y otras cosechas. En particular, se esterilizan en superficie las semillas de cañóla con 70% de etanol durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido por 20% (v/v) Clorox suplementado con 0.05% (v/v) Tween durante 20 minutos, a temperatura ambiente con agitación continua. Después, las semillas se enjuagan 4 veces con agua destilada y se colocan en papel de filtro estéril húmedo en un plato de Petri a temperatura ambiente durante 18 horas. Los revestimientos de semilla se quitan y las semillas se secan al aire durante la noche en un plato de Petri estéril medio abierto. Durante este periodo, las semillas pierden aproximadamente 85% de su contenido de agua. Las semillas entonces se almacenan a temperatura ambiente en un plato de Petri sellado hasta uso adicional. Se prepara cultivo de Agrobacterium tumefaciens de una colonia individual en medio sólido LB más antibióticos apropiados (por ejemplo, 100 mg/l estreptomicina, 50 mg/l kanamicina) seguido por crecimiento de la colonia individual en medio LB líquido a una densidad óptica a 600 nm de 0.8. Después, el cultivo de bacteria se granula a 7000 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiente, y se vuelve a suspender en medio MS (Murashige & Skoog 1962, Physiol. Plant. 15:473-497) suplementado con 100 mM acetosiringona. Se incuban cultivos de bacteria en este medio de pre-inducción durante 2 horas a temperatura ambiente antes de usarse. El eje de embriones de semilla zigótica de soya a aproximadamente 44% de contenido de humedad se imbiben durante 2 horas a temperatura ambiente con el cultivo de suspensión de Agrobacterium pre-inducido. (La imbibición de embriones secos con un cultivo de Agrobacterium también es aplicable a ejes de embriones de maíz). Se eliminan los embriones del cultivo de imbibición y se transfieren a platos de Petri conteniendo medio MS sólido suplementado con 2% sacarosa y se incuban durante 2 días, en la oscuridad a temperatura ambiente. Alternativamente, los embriones se colocan en la parte superior de papel filtro estéril humedecido (medio MS líquido) en un plato de Petri y se incuban bajo las mismas condiciones descritas antes. Después de este periodo, los embriones se transfieren a medio MS sólido o líquido suplementado con 500 mg/l carbenicilina o 300 mg/l cefotaxima para matar la agrobacteria. El medio líquido se usa para humedecer el papel de filtro estéril. Los embriones se incuban durante 4 semanas a 25°C, bajo 440 µmol m'2s'1 y 12 horas de fotoperiodo. Una vez que las plántulas hayan producido raíces, se transfieren a suelo metromix estéril. El medio de las plantas in vitro se lava antes de transferir las plantas a suelo. Las plantas se mantienen bajo una cubierta de plástico durante 1 sema na para favorecer el proceso de aclimatización. Después, las plantas se transfieren a un lugar de crecimiento en donde son incubadas a 25°C, bajo 440 µ mol m"2s" 1 de intensidad ligera y 12 horas de fotoperiodo durante aproximadamente 80 d ías. Se analizan muestras de las plantas transgénicas primarias (T0) por PCR para confirmar la presencia de T-ADN . Estos resultados son confirmados por hibridación Southern en donde ADN es electroforesado en un gel de 1 % de agarosa y transferido a una membrana de nylon positivamente cargada (Roche Diagnostics) . El equipo PCR DIG Probé Synthesis (Roche Diagnostics) se usa para preparar una sonda marcada con digoxigenina por PC R como lo recom ienda el fabricante. Como un ejemplo para transformación de monocot, un promotor constitutivo o específico de semilla en combinación con maíz U biquitin intrón y se pueden usar moléculas de ácido nucleico de FAD2 o de tipo FAD2. Por ejem plo, la construcción de gen ortólogo PtxA-FAD2 en pUC se digiere con Pací y Xmal. Se digiere pBPSMM348 con Pací y Xmal para aislar maíz Ubiquitin intrón (ZmU bi intrón) seguido por electroforesis y el equipo QIAEX I I Gel Extráction (cat# 20021 ) . El i ntrón Zm Ubi se liga en la construcción de molécula de ácido nucleico de PtxA-FAD2 o de tipo FAD2 seguido por digestión de enzima de restricción con Afel y Pmei. Se cortará el cassette genético de PtxA-Zm Ubi intro FAD2 o del tipo FAD2 de un gel de agarosa a tem peratura de fusión baja Seaplaque (SeaPlaque® GTC® Agarose No. de catálogo 501 10) después de electroforesis. Se digiere un vector base monocotiledono que contiene un cassette marcador seleccionable (vector basé monocot) con Pmel . El cassette de expresión de molécula de ácido nucleico de FAD2 o del tipo de FAD2 conteniendo un promotor específico de semilla-Zm Ubi intrón se liga en el vector base Monocot. Posteriormente, la construcción se transforma en una cepa recombinante LBA4404 conteniendo pSB1 (super plásm ido vir) usando electroporacíón siguiendo un protocolo general en la técnica . Se realiza tra nsformación mediada con Agrobacterium en maíz usando embrión inmaduro siguiendo un protocolo descrito en US 5, 591 , 616. Se aplica una selección herbicida de im idazolinona para obtener líneas de maíz transgénico.

Ejemplos de promotores usados en maíz también son las ceínas, que son un grupo de proteínas de almacenamiento encontradas en endoesperma de ma íz. Se han aislado clones genómicos para genes de ceína (Pedersen y otros, Cell 29: 101 5-1026, 1982) y los promotores de estos clones, incluyendo los genes 1 5 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD, también se podrían usar. Otros promotores conocidos por funcionar en maíz son sintasas de almidón , enzimas de ramificación, enzimas de desramificacíón , oleosinas , g lutelinas y sintasas de sacarosa. Un promotor particularmente preferido para expresión de endoesperma de maíz es el promotor para el gen de glutelina de arroz, más en particular el promotor Osgt-1 (Zheng y otros, Mole. Cell Biol. 13:5829-5842, 1993). Ejemplos de promotores adecuados para expresión en trigo incluyen aquellos promotores para las subunidades de pirosintasa de ADP glucosa, la unión de granulo y otra sintasa de almidón, las enzimas de ramificación y desramificación, las proteínas abundantes en embriogénesis, las gliadinas y las gluteninas. Ejemplos de promotores adecuados para la expresión en cebada incluyen aquellos promotores para las subunidades de ADP glucosa pirosintasa, la unión de granulo y otra sintasa de almidón, las enzimas de ramificación y desramificación, sintasas de sacarosa, las hordeinas, las globulinas de embrión y las proteínas específicas de aleurona. Ejemplos de promotores adecuados para la expresión en soya incluyen promotores ya mencionados aquí. Todavía, otros promotores que se pueden usar son un promotor de soya 7S y el promotor de soya 7Sa' beta conglicinina. En general, un gen de FAD2 de arroz (u otro monocot) o gen del tipo de FAD2 bajo un promotor de planta como USP se podría transformar en maíz, u otra planta de cosecha, para generar efectos de genes de FAD2 de monocot en otros monocotes, o genes de FAD2 de dicot en otros dicotes, o genes de monocot en dicotes, o viceversa. Los plásmidos conteniendo estas secuencias codificadoras de FAD2 o del tipo de FAD2, 5' de un promotor y 3' de un terminador se construirían en una manera similar a aquellos descritos para construcción de otros plásmidos en la presente. Ejemplos de promotores adecuados para expresión en arroz incluyen aquellos promotores para las subunidades de ADP glucosa pirosintasa , el granulo unido y otra sintasa de almidón , las enzimas de ramificación, las enzimas de desramificación , sintasas de sacarosa y las glutelinas. Un promotor particularmente preferido es el promotor para glutelirta de arroz, Osgt- 1 .

Ejemplo 12: Mutagénesis in vivo Se puede realizar mutagénesis in vivo de microorganismos mediante la incorporación y paso del ADN plásmido (u otro vector) a través de E. coli u otros m icroorganismos (por ejemplo, Bacillus spp. o levaduras tal como Saccharomyces cerevisiae) que son impedidos en sus capacidades para mantener la integridad de su información genética . Las cepas mutantes típicas tienen m utaciones en los genes para el sistema de reparación de ADN (por ejemplo, mutH LS, mutD, mutT, etc. , para referencia, ver Rupp W. D. 1996, DNA repair mechanisms , en : Escherichia coli y Salmonella, p. 2277-2294, ASM : Washington) . Dichas cepas son bien conocidas a aquellos expertos en la técnica . El uso de dichas cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener y Calla han 1994, Strategies 7 : 32-34. La transferencia de moléculas de ADN m utadas in plantas se hace de preferencia después de la selección y prueba en microorganismos. Se generan plantas transgénicas de conformidad con varios ejemplos dentro de la ejem plificación de este documento.

Ejem plo 13: Valoración de la expresión de mARN y actividad de u n producto de gen recombinante en el organismo transformado La actividad de un producto de gen recombinante en el organismo huésped transformado se puede medir en el nivel de transcripción y/o traducción . Un método útil para asegurar el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de mARN disponible para la traducción al producto genético) es realizar un Northern blot (para referencia, ver, por ejemplo, Ausubel y otros 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: N ueva York), en donde un cebador diseñado para unir al gen de interés se marca con una etiqueta detectable (usualmente radioactiva o quemilumin iscente) , de modo que cuando se extrae el ARN total de un cultivo del organismo, corre sobre gel, se transfeire a una matriz estable y se incuba en esta sonda , la unión y cantidad de unión de la sonda indica la presencia y también la cantidad de mARN para este gen . Esta información al menos demuestra parcialmente el grado de transcripción del gen transformado. Se puede preparar ARN celular total de células vegeta les, tejidos u órganos por varios métodos, todos bien conocidos en la técnica , tal como aquel descrito en Bormann y otros ( 1992 , Mol . Microbiol. 6: 317-326). Para valorar la presencia o cantidad relativa de proteína traducida de este mARN, se pueden emplear técnicas estándar, tal como un Western blot (ver, por ejemplo, Ausubel y otros 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley; Nueva York). En este proceso, se extraen prote ínas celulares totales, se separan por electroforesis de gel, transfieren a una matriz tal como nitrocel ulosa, y se incuban con una sonda, tal como un anticuerpo, que se une específicamente a la proteína deseada. Esta sonda se etiqueta por lo general con una etiqueta quemiluminiscente o colorimétriCa , lo que se puede detectar prontamente. La presencia y cantidad de etiq ueta observada indica la presencia y cantidad de la proteína m utante deseada presente en la célula . La actividad de LMPs que unen a ADN se puede medir por varios métodos bien establecidos, tales como ensayos de cambio de banda de ADN (también denominados ensayos de retardo de gel) . El efecto de dicha LMP en la expresión de otras moléculas se puede medir usando ensayos de gen reportero (tal como aquel descrito én Kolmar H . y otros, 1 995, EMBO J . 14: 3895-3904 y referencias citadas en la presente) . Los sistemas de prueba de gen reportero son bien conocidos y establecidos para aplicaciones en células procarióticas y eucarióticas, usando enzimas tales como beta-galactosidasa, prote ína fl uorescente verde, y varias otras. La determinación de actividad de metabolismo de lípido-proteínas de transporte se puede realizar de acuerdo con técnicas tales como aquellas descritas en Gennis R. B. ( 1 989 Pores, Channels and Transporte.rs, in Biomembranes, Molecular Structure and Function , Springer: Heidelberg, pp. 85- 137, 1 99-234 y 270-322) .

Ejemplo 14: Análisis in vitro de la función de genes de FAD2 o del tipo de FAD2 de Arabidopsis thalianá, Glycine max, Oryza sativa, Zea mays, Linum usitatissimum, Hordeum vtslgare o Triticum aestivum en plantas transgénicas La determinación de actividades y parámetros cinéticos de enzimas está bien establecida en la técnica. Se deben confeccionar experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima alterada dada a la actividad específica de la enzima dé tipo silvestre, que está bien dentro de la habilidad de un experto en la técnica. Se pueden encontrar estudios generales sobre enzimas, así como detalles específicos concernientes a la estructura, cinética, principios, métodos, aplicaciones y ejemplos para la determinación de muchas actividades de enzima, por ejemplo, en las siguientes referencias: Dixon, M, & Webb, E.C. 1979, Enzymes. Longmans: Londres; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: Nueva York; Walsh (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentáis of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzymes, 3a. ed. Academic Press: Nueva York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2a. ed. VHC: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Graßl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3a. ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; y Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, Enzymes, VCH: Weinheim, p. 352-363.

Ejemplo 15: Análisis del impacto de proteínas recombinamites n la producción de un compuesto de almacenamiento de semilla deseado Como un ejemplo para cambios de aceite de semilla, se analizaron semillas de plantas de Arabidopsis thaliana transformadas por cromatografía de gas (GC) para perfiles de ácido graso. Cada barra en las figuras 10 y 11 representa el valor obtenido con 5 mg de semillas a granel de una planta de tipo silvestre o mutante de fad2 o de un hecho transgénico independiente en un antecedente mutante de fad2. Como se ilustra en la figura 10, el mutante fad2 de Arabidopsis thaliana mostró un aumento en el contenido de ácido oleico (C18:1) de 16% en el tipo silvestre a aproximadamente 60% en el mutante fad2. Asimismo, hay una fuerte reducción en la proporción de ácido linoleico (C18:2) de alrededor de 31% eh el tipo silvestre a 2% en el mutante fad2. Las semillas mutantes de Arabidopsis fad2 con el gen de Oryza sativa OsFAD-01 (Sec ID No. 17) mostraron una restauración del patrón de ácido graso en varias líneas transgénícas independientes en el antecedente mutante fad2 (ver hechos FAD1172, FAD1214, FAD1246 y FAD1294 en la figura 10) hacia la composición de tipo silvestre incluso en una población de semilla T2 segregante. Se obtuvo una respuesta similar con e) gen de Hordeum vulgare HvFAD-01 (Sec ID No. 23) como se muestra en la figura 11 para los hechos FAD0503, FAD0483, FAD0475 y FAD0485. Este resultado indica que los genes de Oryza sativa (OsFAD-01) y Hordeum vulgare (HvFAD-01) son capaces de complementar el mutante fad2 Arabidopsis con respecto al perfil de ácido graso de semilla, indicando su función como desaturasas de ácido graso. Todos los demás genes de desaturasa de ácido graso diferentes de plantas de cosecha indicados en esta solicitud exhibieron una respuesta similar en un antecedente mutante fad2 Arabidopsis también (datos no mostrados). El efecto de la modificación genética en plantas en un compuesto de almacenamiento de semilla deseado (tales como azúcar, lípido o ácido graso) se puede valorar al hacer crecer la planta modificada bajo condiciones adecuadas y analizando las semillas o cualquier otro órgano de planta para producción aumentada del producto deseado (es decir, un lípido o un ácido graso). Dichas técnicas de análisis son bien conocidas a un experto en la técnica e incluyen espectroscopia, cromatografía de capa delgada, métodos de manchado de varias clases, métodos enzimáticos y microbiológicos, y cromatografía analítica tal como cromatografía líquida de alto rendimiento (ver, por ejemplo, Ullman 1985, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, pp. 89-90 y 443-613, VCH: Weinheim; Fallón, A. y otros 1987, Applications of HPLC-in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm y otros, 1993 Product recovery and purification, Biotechnology, vol. 3, capitulo lll, pp. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. y otros, 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley & Sons; Kennedy J.F. & Cabral J.M.S. 1992, Recovery processes for biological materials, John Wiley & Sons; Shaelwitz J.A. & Henry J.D. 1988, Biochemical separations en: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Separation and purification techniques in biotechnology, vol. B3, capitulo 11, p. 1-27, VCR: Weinheim; y Dechow F.J. 1989). Aparte de los métodos antes mencioandos, se extraen lípidos de plantas a partir de material de planta como se describe por Cahoon y otros (1999, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 96, 22:12935-12940) y Browse y otros (1986, Anal. Biochemistry 442:141-145). Se describe análisis de lípido o ácido graso cualitativo o cuantitativo en Christie, William W., Advances in Lipid Methodology. Ayr/Scotland:Oily Press. - (Oily Press Lipid Library; Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland:Oily Press, 1989 Repr. 1992. - I, 307 S. - (Oily Press Lipid Library; and "Progrese in Lipid Research, Oxford:Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN. Se puede obtener prueba inequívoa de la rpesencia de ácido graso mediante el análisis de plantas transgénicas siguiendo procedimientos analíticos estándar: GC, GC-MS o TLC como se describió previamente por Christie y referencias ahí (1997 en: Advances on Lipid Methodology 4a ed.: Christie, Oily Press, Dundee, pp. 119-169; 1998). Se describen métodos detallados para hojas por Lemieux y otros (1990, Theor. Appl. Genet. 80:234-240) y para semillas por Focks & Benning (1998, Plant Physiol. 118:91-101).

Se determina análisis posicional de la composición de ácido graso en las posiciones sn-1 , sn-2 o sn-3 de la estructura de glicerol por digestión de lipasa (ver, por ejemplo, Siebertz & Heinz 1 977 , Z.

Naturforsch . 32c: 193-206, y Christie 1 957, Lipid Analysis 2a edición , Pergamon Press, Exeter, ISBN 0-08-023791 -6) . Se puede medir los niveles de aceite de semilla totales por cualquier método apropiado . A menudo se realiza cuantificacióde contenido de aceite de semilla con métodos convencionales, tal como análisis infrarrojo cercano (N I R) o imagen de resonancia magnética nuclear (NMR) . La espectroscopia de N I R se ha convertido en un método estándar para seleccionar muestras de semilla cuando las muestras de interés hayan sido susceptibles a esta técnica . Las muestras estudiadas incluyen cañóla, soya, maíz, trigo, arroz y otras. Se puede usar análisis de NI R de sem illas individuales (ver, por ejem plo, Velasco y otros "Estimation of seed weight, oí l content and fatty acid compositíon in intact single seeds of rapeseed (Brassica napus L.) por espectroscopia de reflexión infrarroja cercana, "Euphytica" , vol . 106, 1999, pp. 79-85). También se ha usado NMR para analizar el contenido de aciete e? semillas (ver por ejemplo, Robertson & Morrison , "Analysis of oil content of sunflower seed by wide-line NMR" , Journal of the American Oil Chemists Society, 1979, vol . 56, 1979, pp. 961 -964, que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad). Una manera típica de recaudar información con respecto a la influencia de actividades de proteína aumentadas o disminuidas en vías biosintéticas de lípido y azúcar es por ejemplo analizando los flujos de carbono por studios de etiquetado con hojas o semillas usando 14C-acetato o 14C-piruvato (ver, por ejemplo, Focks & Benning 1998, Plant Physiol. 118:91-101; Eccleston & Ohlrogge 1998, Plant Cell 10:613-621). La distribución de carbón-14 en lípidos y componentes solubles acuosos se puede determinar por centelleo líquido contando después de la separación respectiva (por ejemplo, en placas de TLC) incluyendo estándares como 4C-sacarosa y 4C-malato (Eccleston & Ohlrogge 1998, Plant Cell 10:613-621). Se puede desintegrar material a analizarse vía sonificación, molienda de vidrio, nitrógeno líquido y molienda o vía otros métodos aplicables. El material se tiene que centrifugar después de la desintegración. El sedimento se vuelve a suspender en agua destilada, calentado durante 10 minutos a 100°C, enfriado en hielo y centrifugado una vez más seguido por extracción en 0.5 M ácido sulfúrico en metanol conteniendo 2% de dimetoxipropano durante 1 hora a 90°C conduciendo a compuestos de aceite y lípido hidrolizados resultando en lípidos transmetilados. Estos esteres metílicos de ácido graso se extraen en petroléter y finalmente se someten a análisis GC usando una columna capilar (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0.32 mm) a un gradiente de temperatura entre 170°C y 240ßC durante 20 minutos y 5 minutos a 240°C. La identidad de esteres metílicos de ácido graso resultantes se define por el uso de estándares disponibles de fuentes comerciales (es decir, Sigma).

En caso de ácidos grasos en donde no hay estándares, se muestra identidad de molécula vía derivación y análisis GC-MS posterior. Por ejemplo, la localización de ácidos grasos de triple unión se muestra vía GC-MS después de derivación vía 4,4-dimetoxi-oxazolin-derivaten (Christie, Oily Press, Dundee, 1998). Un método estándar común para analizar azúcares, en especial almidón, se publica por Stitt M., Li I ley R.Mc.C, Gerhardt R. y Heldt M.W. (1989, "Determination of metabolite levéis in specific cells and subcellular compartments of plant leaves" Methods Enzymol. 174:518-552; para otros métodos ver también Hártel y otros 1998, Plant Physiol. Biochem. 36:407-417 y Focks & Benning 1998, Plant Physiol. 118:91-101). Para la extracción de azúcares solubles y almidón, se homogenizan 50 semillas en 50 µl de 80% (v/v) etanol en un tubo de prueba de 1.5 ml polipropileno y se incuban a 70°C durante 90 minutos. Después de la centrifugación a 16,000 g durante 5 minutos, el sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo de prueba. La pildora se extrae dos veces con 500 µl de 80% etanol. El solvente de los sobrenadantes combinados s evaporado a temperatura ambiente al vacío. El residuo se disuelve en 50 µl de agua, representando la fracción de carbohidrato soluble. La pildora dejada de la extracción de etanol, que contiene los carbohidratos insolubles incluyendo almidón, se homogeniza en 200 µl de 0.2 N KOH, y la suspensión se incuba a 95°C durante 1 hora para disolver el almidón. Después de la adición de 35 µl de 1N ácido acético y centrifugación durante 5 minutos a 16,000 g, el sobrenadante se usa para cuantificación de alimidon. Para cuantificar azúcares solubles, 10 µl del extracto de azúcar se agrega a 990 µl de regulador de reacción conteniendo 100 mM imidazol, pH 6.9, 5 mM MgCI2, 2 mM NADP, 1 mM ATP, y 2 unidades de 2 mi"1 de glucosa-6-P-deshidrogenasa. Para determinación enzimática de glucosa, fructosa y sacarosa, 4.5 unidades de hexokinasa, 1 unidad de fosfoglucoisomerasa, y 2 µl de solución de fructosidasa saturada se agregan en sucesión. La producción de NADPH Se monitorea fotométricamente a una longitud de onda de 340 nm. De manera similar, se ensaya almidón en 30 µl de la fracción de carbohidrato insoluble con un equipo de Boehringer Mannheim. Un ejemplo para analizar el contenido de proteína en hojas y semillas se puede encontrar por Bradford M.M. (1976, "A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein using the principie of protein dye bihding" Anal. Biochem. 72:248-254). Para cuantificación de proteína de semilla total, se homogenizan 15-20 semillas en 250 µl de acetona en un tubo de prueba de 1.5 ml polipropileno. Después de la centrifugación a 16,000 g, el sobrenadante es descartado y la pildora seca al vacío se resuspende en 250 µl de regulador de extracción conteniendo 50 mM Tris-HCI, pH 8.0, 250 mM NaCI, 1 mM EDTA, y 1% (p/v) SDS. Después de incubación durante 2 horas a 25°C, el homogenato se centrifuga a 16,000 g durante 5 minutos y 200 ml del sobrenadante se usará para medidas de proteína. En el ensayo, se usa ?-globulina para calibración. Para medidas de proteína, se usa ensayo de proteína Lowry DC (Bio-Rad) o ensayo Bradford (Bio-Rad). Se realizan ensayos enzimáticos de hexokinasa y fructokinasa espectrométricamente de acuerdo con Renz y otros (1993, Planta 190:156-165) de fosfogluco-isomerasa, ATP-dependiente-6-f osf ofruct o kinasa, pi rof osf ato-dependiente-6-f osf o-fructoki nasa, fructosa-1 ,6-bifosfato aldolasa, triosa fosfato isomerasa, gliceral-3-P deshidrogenasa, fosfoglicerato kinasa, fosfoglicérato mutasa, enolasa y piruvato kinasa de acuerdo con Burell y otros (1994, Planta 194:95-101) y de UDP-glucosa-pirofosforilasa de acuerdo con Zrenner y otros, (1995, Plant J. 7:97-107). Se miden intermediarios del metabolismo de carbohidratos, como glucosa-1-fosfato, glucosa-6-fosfato, fructosa-6-fosfato, fosfoenolpiruvato, piruvato y ATP como se describe en Hártel y otros (1998, Plant Physiol. Biochem. 36:407-417) y metabolitos se miden como se describe en Jelitto y otros (1992, Planta 188:238-244). Además de la medición del compuesto de almacenamiento de semilla final (es decir, lípido, almidón o proteína de almacenamiento) también es posible analizar otros componentes de las vías metabólicas utilizadas para la producción de un compuesto de almacenamiento de semilla deseado, tales como intermediarios y productos laterales, para determinar la eficiencia global de producción del compuesto (Fíehn y otros 2000, Nature Biotech. 18:1447-1461).

Por ejemplo, vectores de expresión de levadura que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente, o frag mentos de los mismos, se pueden construir o transformar en Saccharomyces cerevisiae usando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes entonces se pueden ensayar para alteraciones en contenido de azúcar, aceite, lípido o ácido graso. De manera simi lar, los vectores de expresión de planta que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente, o fragmentos de los mismos, se pueden construir y transformar en una célula vegetal apropiada tal como Arabidopsis, soay, colza , arroz, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc. , usando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes y/o plantas derivadas de las mismas entonces se pueden ensayar para alteraciones en contenido de azúcar, aceite, lípido o ácido graso. Adicionalmente, las secuencias descritas en la presente, o fragmentos de las m ismas, se pueden usar para generar mutaciones de golpe en los genomas de varios organismos, tales como bacteria, células de mam ífero, células de levadura , y células vegetales (G irke y otros , 1998, Plant J . 1 5: 39-48) . Las células de golpe resultantes entonces se pueden evaluar por su composición y contenido en compuestos de almacenamiento de semilla , y el efecto del fenotipo y/o genotipo de la mutación . Para otros métodos de inactivación de gen incluyen US 6004804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" y Puttaraj u y otros ( 1 999, "Splícesome-mediated RNA frans-splicing as a tool for gene therapy" Nature Biotech . 17: 246-252).

Ejemplo 16: Purificación del producto deseado a partir de organismos transformados Se puede recuperar una LMP de material de planta por varios métodos bien conocidos en la técnica. Se pueden separar órganos de plantas mecánicamente de otro tejido u órganos antes del aislamiento del compuesto de almacenamiento de semilla del órgano de planta. Después de la homogenizacion del tejido, se elimina el desecho celular mediante centrifugación y la fracción de sobrenadante conteniendo las proteínas solubles se retiene para purificación adicional del compuesto deseado. Si el producto es secretado de célµlas crecidas en cultivo, entonces las células son eliminadas del cultivo por centrifugación de velocidad baja y la fracción supernata es retenida para purificación adicional. La fracción de sobrenadante a partir del método de purificación se somete a cromatografía con una resina adecuada, en donde la molécula deseada es retenida en una resina de cromatografía mientras que muchas de las impurezas en la muestra no lo son, o en donde las impurezas son retenidas por la resina, mientras que la muestra no lo es. Dichos pasos de cromatografía se pueden repetir tanto como sea necesario, usando las mismas o diferentes resinas de cromatografía. Un experto en la técnica estaría bien versado en la selección de resinas de cromatografía apropiadas y en su aplicación más eficaz para una molécula particular a purificarse. El producto purificado se puede concentrar mediante filtración o ultrafiltración, y almacenar a una temperatura a la que se maximiza la estabilidad del producto. Hay una amplia variedad de métodos de purificación conocidos en la técnica y el método precedente de purificación no debe ser limitante. Dichas técnicas de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey J.E. & Ollas D.F. 1986, Biochemical Engineering Fundamentáis, McGraw-Hill: Nueva York). La identidad y pureza de los compuestos aislados se puede valorar por técnicas estándar en la técnica. Estas incluyen cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de manchado, cromatografía de capa delgada, cromatografía analítica tal como cromatografía líquida de alto rendimiento, NIRS, ensayo enzimático, o microbiológicamente.

Dichos métodos de análisis se revisan en: Patek y otros (1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140), Malakhova y otros (1996, Biotekhnologiya 11:27-32) y Schmidt y otros (199é, Bioprocess Engineer 19:67-70), Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1995, vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, 575-581 y p. 581-587) y Michal G. (1999, Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallón, A. y otros 1987, Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecualr Biology, vol. 17).

Ejemplo 17: Regulación descendente de expresión genética al manipular precursor de microARN Los microARNs (miARNs) han surgido como reguladores a base de ARN evolucionariamente conservados de expresión genética en plantas y animales. Los miARNs (-21 a 25 nt) surgen de precursores más grandes con una estructura de tallo con lazo que se transcriben de genes codificadores de no proteína. El miARN busca un mARN específico para suprimir expresión genética a niveles post-transcripcionales (es decir, degrada mARN) o de traducción (es decir, inhibe síntesis de proteína) (Bartel D 2004, Cell 116:281-297). Se puede manipular miARN (pre-miARN) en tal manera que el miARN endógeno codificado por pre-miARN es reemplazado por miARN para buscar un gen de interés, por ejemplo, gen reportero dsRed. Se seleccionó precursor de maíz miR166 para manipulación. La secuencia de nucleótido codificando el precursor miRl66 se ilustra en SEC ID NO: 47. Se generaron dos construcciones de expresión binaria a través de propuesta de clonación Gateway de multi-sitio (Invitrogen, Carlsbad, CA). RLM323 como se describe en SEC ID NO: 41 fue un control, es decir, expresión de miR166 de maíz nativo bajo el control de promotor ScBV (badnavirus baciloforme de caña de azúcar) y terminador NOS (nopalina sintasa). RLM325 como se describe por SEC ID NO: 42 fue idéntico a RLM323 excepto que el miR166 nativo (5'tcggac-caggcttcattcccc 3') como se describe en SEC ID NO: 37 y en SEC ID NO: 38 dentro del precursor fue reemplazado por un dsRed buscando miARN (5' ttgtagatgaagcagccgtcc 3') como se describe en SEC ID NO: 39. MiR dsRed es complementario a región 3' de dsRed mARN. Se transformaron RLM323 y RLM325 vía Agrobacteria en SDM10828 de maíz homozigote qué ya lleva un vector binario, RLM185 expresa dsRed bajo control de promotor ScBV y terminador NOS. Se recolectaron muestras de hojas de 3 hechos TO independientes llevando RLM323 y 29 hechos TO independientes llevando RLM325. Las muestras después fueron analizadas usando Ty-phoon 9400 (General Engineering), un sistema de imagen bajo ajustes para detectar fluorescencia dsRed. La intensidad de fluorescencia de hechos RLM325 se redujo sobre 90% en comparación con la intensidad del control, hechos RLM323. La producción de miR dsRed en hechos RLM325 fue confirmada en análisis Northern blotting. Una banda específica de -21 nt fue detectada en RLM325, pero ningún hecho RLM323 (control) usando una sonda marcada radioactiva complementaria a miR dsRed. La reducción (casi 90%) de dsRed mARN en hechos RLM325 fue confirmada por comparación qRT-PCR al Control RLM323. Tomados juntos, estos datos demostraron que se puede manipular el precursor miARN para buscar un gen de interés. Los genes de maíz codificando desaturasas de ácido graso se expresan en muchos tejidos incluyendo semillas. Se usa una región de 19 a 21 nt (por ejemplo, ACCAGACCCCGAACGCCGC como se describe en SEC ID NO: 40) complementaria a una región codificadora de desaturasa de maíz o 5' UTR y 3' UTR en mARN para reemplazar Zm miARN (5' tcggaccaggcttcattcccc 3') como se describe en SEC I D NO: 37 y en SEC I D NO: 38 en precursor Zm miR166. El transgen entonces será transformado en ma íz. La expresión del gen Zm miR 166 manipulado será controlada por un promotor específico de semilla de maíz (por ejemplo, promotor 10 KD Zein específico de endoesperma o promotor específico de embrión Glob 1 ) . Un m icroARN (por ejemplo, ACCAGACCCCGAACGCCGC como se describe en SEC ID NO: 40) se genera en Semillas cuando se procesa el precursor Zm miR166 manipulado. Este miARN se une específicamente a la región en un mARN de desaturasa de ácido graso de ma íz complementario al m iARN , lo que resulta en una reducción de esta expresión de desaturasa de maíz buscada a niveles de transcripción o traducción en semillas por maquinaria silenciadora de genes. Como un resultado, el maiz transgénico pudo tener nivel de ácido graso deseable y composición como por ejemplo ácido linolénico bajo y/o niveles de ácido oleico medio o alto en semillas.

Ejemplo 18: Selección para tamaño de semilla aumentado La expresión condicional de FAD2 y de los genes del tipo de FAD2 de cosecha puede resultar en un tamaño de semilla aumentado. Se producirán plantas de Arabidopsis o cosecha transgénicas expresando genes de FAD2 o del tipo de FAD2. Se identificarán plantas transgénicas con sem illas más grandes que el tipo silvestre al usar un m icroscopio. Además, se medirá el peso de las semillas en líneas transgénicas. Por ejemplo, las semillas mutantes fad2 mostraron una reducción de 20% en peso de las semillas en comparación con el tipo silvestre. En la generación de semilla T2 segregante de las l íneas transgénicas de Arabidopsis independientes pFAD2RT-7 y pFAD2RT-5, el peso de 10Ó semillas aumentó por 30 y 40% , respectivamente. En semillas T3 homocigóticas, el peso de las semillas aumentó hasta 60% en comparación con el control de vector vacío (datos no mostrados). Se reflejó peso de semillas aumentado en un tamaño de semilla aumentado de sobreexpresores de gen FAD2 en Arabidopsis. El tamaño de semilla aumentado conduce a mayor producción en muchas plantas de cosecha económ icamente importantes. Por lo tanto, el tamaño de sem illa aumentado es una meta de manipular y seleccionar genéticamente usando moléculas de ácido nucleico de FAD2 o del tipo de FAD2 como se describió en esta solicitud .

TABLA 1 Clases de lípidos de plantas TABLA 2 Ácidos grasos de plantas comunes Estos ácidos grasos normalmente no ocurren en aceites de semilla de planta, pero su producción en aceite de semilla de planta transgénica es de importancia en biotecnología de plantas.

TABLA 3 Una tabla de las funciones putativas de las LMPs del tipo FAD2 (las secuencias de ácido nucleico de longitud completa se pueden encontrar en el apéndice A usando los códigos de secuencia) Aquel los expertos en la técnica reconocerán, o podrán acertar usando no más de u n experimento de rutina, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención descrita en la presente.

Dichos equivalentes deben ser abarcados por las reivindicaciones a la invención descrita en la presente y reclamada en la presente.

Apéndice A Figura 1A: SEC ID NO: 1 - Secuencia de ácido nucleico de AtFAD-01 Figura 1B: SEC ID NO: 3 - Secuencia de ácido nucleico del marco de lectura abierta de AtFAD-01 Figura 1C: SEC ID NO: 4 - Secuencia de aminoácido del marco de lectura abierta de AtFAD-01 Figura 2A: SEC ID NO: 5 - Secuencia de ácido nucleico de GmFAD-01 Figura 2B: SEC ID NO: 7 - Secuencia de ácido nucleico del marco de lectura abierta de GmFAD-01 Figura 2C: SEC ID NO: 8 - Secuencia de aminoácido del marco de lectura abierta de GmFAD-01 Figura 3A: SEC ID NO: 9 - Secuencia de ácido nucleico de GmFAD-02 Figura 3B: SEC ID NO: 11 - Secuencia de ácido nucleico del marco de lectura abierta de GmFAD-02 Figura 3C: SEC ID NO: 12 - Secuencia de aminoácido del marco de lectura abierta GmFAD-02 Figura 4A: SEC ID NO: 12 - Secuencia de ácido nucleico de GmFAD-03 Figura 4B: SEC ID NO: 15 - Secuencia de ácido nucleico del marco de lectura abierta de GmFAD-03 Figura 4C: SEC ID NO: 16- Secuencia de aminoácido del marco de lectura abierta de GmFAD-03 Figura 5A: SEC ID NO: 17 - Secuencia de ácido nucleico de ZmFAD-01 Figura 5B: SEC ID NO: 19 - Secuencia de ácido nucleico del marco de lectura abierta de ZmFAD-01 Figura 5C: SEC ID NO: 20 - Secuencia de aminoácido del marco de lectura abierta de ZmFAD-01 Figura 6A: SEC ID NO: 21 - Secuencia de ácido nucleico de OsFAD-01 Figura 6B: SEC ID NO: 23 - Secuencia de ácido nucleico del marco de lectura abierta de OsFAD-01 Figura 6C: SEC ID NO: 24 - Secuencia de aminoácido del marco de lectura abierta de OsFAD-01 Figura 7A: SEC ID NO: 25 - Secuencia de ácido nucleico de LuFAD-01 Figura 7B: SEC ID NO: 27 - Secuencia de ácido nucleico del marco de lectura abierta de LuFAD-01 Figura 7C: SEC ID NO: 28 - Secuencia de aminoácido del marco de lectura abierta de LuFAD-01 Figura 8A: SEC ID NO: 29 - Secuencia de ácido nucleico de HvFAD-01 Figura 8B: SEC ID NO: 31 - Secuencia de ácido nucleico del marco de lectura abierta de HvFAD-01 Figura 8C: SEC ID NO: 32 - Secuencia de aminoácido del marco de lectura abierta de HvFAD-01 Figura 9A: SEC ID NO: 33 - Secuencia de ácido nucleico de TaFAD-01 Figura 9B: SEC ID NO: 35: Secuencia de ácido nucleico del marco de lectura abierta de TaFAD-01 Figura 9C: SEC ID NO: 36 - Secuencia de aminoácido del marco de lectura abierta de TaFAD-01

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de X1X2X3LX4X5X6X7LX8X9PX10YL, en donde X1 no es M y X3 no es T y X6 no es F y X7 no es V (SEC ID NO: 48), G?11?12?13?14?15?16?17?18H?19?20p?21?22?23?24?25?26?27?28ER en donde X15 no es G y en donde X20 no es F y en donde X21 no es N y X22 no es A (SEC ID NO: 49), HX29X30PX31X32X33X34X35X36X37X38ER, en donde X30 no es F y en donde X31 no es N y X32 no es A (SEC ID NO: 50), L?39?4O?41?42?43?44?45G?46?47?48?49?50?51?52??53?54p en donde X41 no es Y y X45 no es Q y X48 no es S y X49 no es M y X50 no es I (SEC ID NO: 51), TX55X56X57X58HX59X60X61X62X63X64Xß5X66X67Xß8Xß9X70X71T, en donde X67 no es N (SEC ID NO: 52), y p?72?73?74?75?76?77?78?79?80?81?82?83?84?85?86 en rf Q fí d Q ?84 no es W y X85 no es Y y X8ß no es V (SEC ID NO: 53), y en donde X tiene el significado de cualquier aminoácido si no se ha definido antes.

2.- Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de AWYT PYX87YNNPX88GRLVHIX89VQLTLGWPLYLAX90NX91SGRPYPRFA CHFDPYGPIYNDRER (SEC ID NO: 54), FISDVGV (SEC ID NO: 55), ALX92KLX93SX94FGFWWVVRVYGVP (SEC ID NO: 56), ILGEYYQFDX95TPVAKAT (SEC ID NO: 57), y en donde X tiene el significado de cualquier aminoácido.

3.- Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2.

4.- Un polipéptido aislado codificado por una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3.

5.- Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada a partir del grupo que consiste de: una secuencia de polinucleótido como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35; una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido como se ilustra en SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 35 o SEC ID NO: 36; una secuencia de polinucleótido teniendo al menos 70% de identidad de secuencia con el ácido nucleico de a) o b) anterior; una secuencia de polinucleótido que es complementaria al ácido nucleico de a) o b) anterior; y una secuencia de polinucleótido que hibrida bajo condiciones severas al ácido nucleico de a) o b) anterior.

6.- Un polipéptido aislado codificado por secuencia de polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5.

7.- El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 5, en donde el ácido nucleico aislado codifica un polipéptido que funciona como un modulador de un compuesto de almacenamiento de semilla en microorganismos o plantas. 8 - El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 6, en donde la secuencia de polipéptido de LMP aislada funciona como un modulador de un compuesto de almacenamiento de semilla en microorganismos o plantas. 9.- Un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3 ó 5, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a un promotor seleccionado a partir del grupo que consiste de un promotor específico de semilla, un promotor específico de raíz, y un promotor específico de no tejido. 10.- Un método de producir una planta transgénica teniendo un nivel modificado de un porcentaje en peso de compuesto de almacenamiento de semilla en comparación con el tipo silvestre que comprende, a. un primer paso de introducción en una célula vegetal de un vector de expresión que contiene un ácido nucleico y b. un segundo paso de generar a partir de la célula vegetal la planta transgénica, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que funciona como un modulador de un compuesto de almacenamiento de semilla en la planta, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada a partir del grupo que consiste de: a. una secuencia de polinucleótido como se ilustra en SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33 o SEC ID NO: 35; b. una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido como se ilustra en SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 35 o SEC ID NO: 36; c. una secuencia de polinucleótido teniendo al menos 70% de identidad de secuencia con el ácido nucleico de a) o b) anterior; d. una secuencia de polinucleótido que es complementaria al ácido nucleico de a) o b) anterior; y e. una secuencia de polinucleótido que hibrida bajo condiciones severas al ácido nucleico de a) o b) anterior. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótido de a) o b) de la reivindicación 5. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el nivel de un ácido oleico es aumentado en la planta transgénica en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. 13.- Un método de producir una planta transgénica teniendo un nivel aumentado de porcentaje en peso de ácido oleico en comparación con el tipo silvestre que comprende, un primer paso de transformar una célula vegetal con una construcción de precursor de ARN, y un segundo paso de generar a partir de la célula vegetal la planta transgénica, en donde dicha construcción comprende un promotor que impulsa ia expresión en una célula vegetal ligada operativamente a una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de microARN precursora, en donde la secuencia de nucleótido que codifica dicha secuencia precursora de microARN se selecciona a partir del grupo que consiste de: a. una secuencia de nucleótido como se ilustra en SEC ID NO: 47 b. una secuencia de polinucleótido teniendo al menos 70% de identidad de secuencia con el ácido nucleico de a) anterior; c. una secuencia de polinucleótido que es complementaria al ácido nucleico de a) anterior; y d. una secuencia de polinucleótido que hibrida bajo condiciones severas ai ácido nucleico de a) anterior. 14.- Un método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la secuencia de nucleótido que codifica una secuencia precursora de micro ARN ha sido manipulada en una manera que la secuencia de nucleótido que codifica un microARN como se ilustra en SEC I D NO: 37 es reemplazada por una secuencia de nucleótido que codifica un micro ARN como se ilustra en SEC ID NO: 40. 15.- Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada a partir del grupo que consista de; = : una secuencia de nucleótido como se ilustra en SEC ID HO: 47 una secuencia de polinucleótido teniendo al menos 70% de identidad de secuencia con el ácido nucleico de a) anterior; una secuencia de polinucleótido que es complementuna al ácido nucleico de a) anterior; y una secuencia de polinucleótido que hibrida bajo condiciones severas al ácido nucleico de a) anterior. 16.- Un método de modular el nivel de un porcentaje en peso de compuesto de almacenamiento de semilla en una planta, que comprende a. un primer paso de introducción en una célula vegetal de un vector de expresión que contiene un ácido nucleico, y b. un segundo paso de generar a partir de la célula vegetal la planta transgénica, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que funciona como un modulador de un compuesto de almacenamiento do semilla en la planta en donde el ácido nucleico comprende la secuencia de polinucleótido de la reivindicación 5. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde se modifica el nivel de porcentaje en peso de ácido ©laieo. 1

8.- Una planta transgénica hecha por el método de conformidad con la reivindicación 10, 13 ó 16. 1

9.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 18, en donde el nivel de porcentaje en peso de ácido oloico es aumentado en la planta transgénica en comparación con la variedad de tipo silvestre de la planta. 20.- La plante transgénica de conformidad con la reivindicación 18, en donde la planta se selecciona a partir del grupo que consiste de colza, cañota, lino, soya, girasol, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, pimiento, tapetes, algodón, palma de aceite, palma d© coco, linaza, castor, remolacha, arroz y cacahuate. 21 .- Una semilla producida por la planta transgénica de conformidad con la reivindicación 18, en donde la planta expresa el polipéptido que funciona como un modulador de un compuesto de almacenamiento de semilla y en donde la planta es de reproducción verdadera para un nivel modificado de porcentaje en poso de compuesto de almacenamiento de semilla en comparación cßn una variedad de tipo silvestre de la planta.