MX2007005351A

MX2007005351A - Anticuerpos anti-properdina, y metodos para elaborarlos y utilizarlos.

Info

Publication number: MX2007005351A
Application number: MX2007005351A
Authority: MX
Inventors: Gadi Gazit-Bornstein; Giorgio Senaldi; Xiao-Dong Yang; Bruce Keyt; Gerardo Zapata
Original assignee: Amgen Fremont Inc
Priority date: 2004-11-03
Filing date: 2005-11-02
Publication date: 2007-08-17
Also published as: AU2005305019A1; JP2008518636A; WO2006052591A2; CA2586356A1; EP1814586A2; WO2006052591A3; US20060093599A1; EP1814586A4; US7423128B2

Abstract

La presente invencion se refiere a anticuerpos dirigidos contra el antigeno properdina y los usos de dichos anticuerpos. En particular, de conformidad con la presente invencion, se proveen anticuerpos monoclonales completamente humanos dirigidos al antigeno properdina. Se proveen secuencias de nucleotido que codifican para, y los polipeptidos que comprenden, moleculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, particularmente secuencias correspondientes a las secuencias de cadena pesada y ligera contiguas que abarcan las regiones de marco y/o las regiones determinantes de complementariedad (CDR), especificamente desde FR1 hasta FR4 o CDR1 hasta CDR3. Tambien se proveen hibridomas u otras lineas celulares que expresan dichas moleculas de inmunoglobulina y anticuerpos monoclonales.

Description

ANTICUERPOS ANTI-PROPERDINA, Y MÉTODOS PARA ELABORARLOS Y UTILIZARLOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está en el campo de anticuerpos, y en particular, anticuerpos específicos para properdina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El sistema del complemento provee un mecanismo de acción temprano para iniciar y amplificar la respuesta inflamatoria hacia infección microbiana y otras aqresiones aqudas. Aunque la activación del complemento provee una primera línea de defensa valiosa contra patóqenos, la activación inadecuada del complemento presenta un riesqo potencial para el hospedero. Por ejemplo, se ha implicado que el sistema del complemento contribuye a la patoqénesis de varias condiciones aqudas y crónicas, incluyendo inflamación posterior a derivación cardiopulmonar, infarto al miocardio, apoplejía, síndrome de dificultad respiratoria aquda (ARDS por sus siglas en inglés), choque séptico, rechazo de transplante, daño por quemadura, esclerosis múltiple, miastenia grave, y artritis reumatoide. Es importante mencionar que aunque el complemento podría no ser la única causa de patogénesis en estas condiciones, la activación del complemento parece ser un factor contribuyente importante y representa un sitio de intervención terapéutica. Este reconocimiento cada vez mayor de la importancia de daño tisular mediado por complemento en una variedad de estados patológicos enfatiza la necesidad respecto a fármacos inhibidores del complemento efectivos. El sistema del complemento se puede activar a través de cualquiera de dos cascadas enzimáticas, conocidas como la ruta clásica y la ruta alternativa. Estas rutas se muestran esquemáticamente en la figura 11. La evidencia científica en aumento argumenta que la ruta alternativa del complemento juega un papel predominante para inducir patología en muchos trastornos agudos y crónicos. La ruta clásica es disparada por la unión del anticuerpo a un patógeno exógeno, y por lo tanto requiere la exposición previa al patógeno para la generación de anticuerpo específico. Existen tres proteínas plasmáticas específicamente implicadas en la ruta clásica: Cl, C2, y C4. En contraste, la ruta alternativa es disparada en forma espontánea por superficies exógenas u otras superficies anormales (bacterias, levaduras, células infectadas con virus, o tejido dañado), y por lo tanto es capaz de una respuesta inmediata. Existen también tres proteínas plasmáticas específicas para la ruta alternativa: los factores B y D, y properdina. Es importante mencionar que tanto la ruta clásica como la ruta alternativa del complemento comparten proteínas comunes (C3, C5-9) que están implicadas en las etapas posteriores de las cascadas de activación. Las moléculas bioactivas que se producen después de la activación de cualquier ruta del complemento incluyen las anafilatoxinas C3a y C5a, así como el complejo terminal del complemento conocido como C5b-9, también referido como el complejo de ataque a membrana (MAC por sus siglas en inglés). Estas anafilatoxinas inician una respuesta inflamatoria celular que es benéfica en el caso de una infección por patógenos, pero es potencialmente perjudicial cuando se genera de manera inadecuada. Por ejemplo, MAC ocasiona daño celular a través de su inserción en las membranas celulares. Al igual que C3a y C5a, MAC puede jugar un papel positivo en la destrucción de patógenos, pero puede ser nocivo cuando éste ataca las células del hospedero. Hasta hace poco, el papel de la activación del complemento en la patogénesis de la enfermedad era poco entendido. Esto debido en parte, a la ausencia de inhibidores específicos que pudieran ser utilizados para evaluar directamente el papel del complemento en modelos animales de enfermedad. El desarrollo de una forma soluble del receptor 1 del complemento (sCRl) , un inhibidor de ambas rutas del complemento, ha arrojado luz sobre el papel que la activación del complemento juega en la patogénesis de la enfermedad. La molécula de sCRl suprime la activación del complemento uniéndose en forma reversible a las subunidades C3b y C4b presentes en la C3-convertasa (C4b2a y C3bBb) y en la C5-convertasa (C4b2a3b y (C3b)2Bb) de las dos rutas del complemento. sCRl ha demostrado ser benéfico en modelos animales de inflamación, isquemia-reperfusión, rechazo de transplante, trauma y enfermedad autoinmune. Aunque sCRl es efectivo para inhibir al complemento in vivo, éste podría tener limitaciones como un agente terapéutico. Tomando como base los resultados provenientes de estudios en animales, la concentración terapéutica efectiva de sCRl sería bastante alta. Además, la depuración de sCRl desde el torrente sanguíneo es sorpresivamente rápida. Además, debido a que sCRl bloquea tanto a la cascada clásica como a la cascada alternativa del complemento, las defensas del hospedero quedan comprometidas. La evidencia adicional de la importancia de activación inapropiada del complemento en la patología de la enfermedad ha sido suministrada por el uso de anticuerpos monoclonales anti-C5. Los anticuerpos anti-C5 han demostrado ser benéficos en modelos de artritis y nefritis del complejo inmune en múridos. En un modelo ex vivo de inflamación inducida por derivación cardiopulmonar (CPB por sus siglas en inglés), la administración de anticuerpo monoclonal anti-C5 de humano inhibe la activación de leucocito y plaquetas que normalmente ocurre durante dichos procesos. Aunque los anticuerpos anti-C5 han demostrado eficacia in vivo, existen ciertos defectos de C5 como un agente terapéutico. En primer lugar, C5 es una proteína plasmática abundante (~85 µg/ml); por lo tanto, se requieren concentraciones elevadas de anticuerpo monoclonal anti-C5 para bloquear la actividad de C5. Además, es importante mencionar que esta estrategia podría no bloquear la formación de C3a, otro potente mediador inflamatorio. Existe evidencia acumulativa respecto a que C3a puede iniciar eventos potencialmente perjudiciales, incluyendo la liberación de citocinas y prostaglandinas pro-inflamatorias desde los monocitos, liberación de histamina a partir de los mastocitos, y desgranulación de eosinófilos. Los datos clínicos disponibles sugieren que en muchos escenarios de lesión aguda y crónica, la activación del complemento es mediada en forma predominante por la ruta alternativa. Estos hallazgos indican que podría ser conveniente inhibir específicamente el daño tisular mediado por la ruta alternativa en una variedad de escenarios de lesión, tales como inflamación de derivación post-cardiopulmonar, infarto al miocardio, daño por reperfusión, apoplejía, artritis reumatoide, y quemaduras térmicas. Esto podría dejar aspectos de la ruta clásica intactos para manejar el procesamiento del complejo inmune y ayudar a la defensa del hospedero contra la infección. El paso enzimático clave de la ruta alternativa es mediado por la C3-convertasa (C3bBb) , la cual corta a C3 para producir C3a y C3b. Se ha especulado que la proteína específica de la ruta alternativa, properdina, desempeña un papel en la regulación de la ruta alternativa debido a su capacidad para incrementar el tiempo de vida media de los complejos de C3 y C5 convertasa (C3bBb y C3bBbC3b, respectivamente) . Existe en la técnica una necesidad respecto a agentes que reduzcan la inflamación y otros trastornos que son mediados, por lo menos en parte, por la ruta alternativa del complemento. La presente invención atiende esta necesidad.

Literatura Gupta-Bansal et al. (2000) Mol . Immunol . 37:191-201; Solicitud publicada de patente E.U.A No. 20020015701; patente E.U.A. No. 5,770,429; patente E.U.A. No. 6,162,963; patente E.U.A. No. 6,150,584; patente E.U.A. No. 6,114,598; patente E.U.A. No. 6,075,181; Green (1999) J. Immunol . Methods 231:11-23; Wells (2000) Chem Biol 7:R185-6; y Davis et al. (1999) Cáncer Metástasis Rev 18(4):421-5; Vuaqnat et al. (2000) Mol . Immunol . 37:467-478; Perdikoulis et al. (2001) Biochim . Biophys . Acta 1548:265-277.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra el antígeno properdina y a los usos de dichos anticuerpos. En particular, de conformidad con la presente invención, se proveen anticuerpos monoclonales completamente humanos dirigidos contra el antígeno properdina. Se proveen secuencias de nucleótido que codifican para, y los polipéptidos que comprenden, moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, en particular secuencias correspondientes a las secuencias de cadena pesada y ligera contiguas que abarcan las regiones de marco (FR) y/o las regiones determinantes de complementariedad (CDR) , específicamente desde FRl hasta FR4 o CDRl hasta CDR3. También se proveen hibridomas u otras líneas celulares que expresan dichas moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos monoclonales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra el análisis de anticuerpos IgG2 en una prueba de C5b-9 de activación con LPS.

La figura 2 muestra el análisis de anticuerpos IgG2 en una prueba de unión de C3b-properdina . La figura 3 muestra el análisis de anticuerpos IgG2 en una prueba de C3c de activación con LPS. La figura 4 muestra la inhibición de producción de complejo de ataque a membrana mediante anticuerpos anti-properdina . La figura 5 muestra la inhibición de producción de C3a mediante anticuerpos anti-properdina . La figura 6 muestra la producción del complejo de ataque a membrana en el modelo de bucle de tubo. La figura 7 muestra la producción de C3a en el modelo de bucle de tubo. La figura 8 muestra la inhibición de producción de C3a mediante anticuerpos anti-properdina (anticuerpo intacto, fragmento F(ab')2. Y fragmento Fab) en el modelo de bucle de tubo. La figura 9 muestra la inhibición del complejo de ataque a membrana mediante anticuerpos anti-properdina (anticuerpo intacto, fragmento F(ab')2, y fragmento Fab) en un modelo de derivación cardiopulmonar ex vivo . La figura 10 muestra la inhibición de producción de MAC mediante anticuerpos anti-properdina (anticuerpo intacto, fragmento F(ab')2/ Y fragmento Fab) en un modelo de derivación cardiopulmonar ex vivo .

La figura 11 muestra esquemáticamente dos rutas para activación del complemento. La figura 12 muestra las regiones FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y J de regiones variables de ejemplo de cadena ligera de anticuerpo de la presente invención, en comparación con secuencias de aminoácido de línea germinal ("GL") . Un guión indica la identidad de aminoácido a una secuencia de GL dada; un # simboliza un espacio introducido dentro de una secuencia GL. La figura 13 compara las secuencias de nucleótido en las uniones V-J ("secuencia V"; "secuencia J"), el número de secuencias N agregadas; así como la posición y longitud de las CDRs, y las secuencias de aminoácido de CDRl, CDR2, y CDR3 de varias regiones variables de ejemplo de cadena ligera de anticuerpo de la presente invención. La figura 14 muestra las regiones FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y J de regiones variables de ejemplo de cadena pesada de anticuerpo de la presente invención, en comparación con las secuencias de aminoácido de línea germinal ("GL"). Un guión indica la identidad de aminoácido a una secuencia de GL dada; un # simboliza un espacio introducido dentro de una secuencia GL. La figura 15 compara las secuencias de nucleótido en las uniones V-D-J ("secuencia V"; "secuencia DI"; y "secuencia J"), el número de secuencias N agregadas; así como la posición y longitud de las CDR, y las secuencias de aminoácido de CDRl, CDR2, y CDR3 de varios ejemplos de regiones variables de cadena pesada de anticuerpo de la presente invención. Las figuras 16A-F muestran secuencias de nucleótido de las cadenas ligera y pesada de ejemplos de anticuerpo de la presente invención. Las figuras 17A-C muestran secuencias de aminoácido de las cadenas ligera y pesada de anticuerpos de ejemplo de la presente invención.

Definiciones El término "polinucleótido aislado" tal como se utiliza en la presente invención debe significar un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, o sintético o alguna combinación de los mismos, el cual debido a su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con toda o con una porción de un polinucleótido en el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está ligado en forma operable a un polinucleótido al que no está ligado en la naturaleza, o (3) no se presenta en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. El término "proteína aislada" al que se hace referencia en la presente invención significa una proteína de ADNc, de ARN recombinante, o de origen sintético o alguna combinación de los mismos, la cual debido a su origen, o fuente de obtención, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas provenientes de la misma fuente, por ejemplo libre de proteínas de múrido, (3) es expresada por una célula proveniente de una especie diferente, o (4) no se presenta en la naturaleza. El término "polipéptido" se utiliza en la presente invención como un término genérico para hacer referencia a proteína original, fragmentos, o análogos de una secuencia de polipéptido. Por lo tanto, proteína original, fragmentos, y análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos preferidos de conformidad con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada de humano incluyendo las secuencias de aminoácido de la región variable representadas por las figuras 17A-C (por ejemplo, SEQ ID NOS: 04, 08, 12, 16, y 20) y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa de humano incluyendo las secuencias de aminoácido de región variable representadas por las figuras 17A-C (por ejemplo, SEQ ID NOS: 02, 06, 10, 14 y 18), así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas. El término "presente en la naturaleza" tal como se utiliza en la presente invención en la forma aplicada a un objeto se refiere al hecho que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un polinucleótido o secuencia de polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar a partir de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionadamente por el humano en el laboratorio o de alguna otra manera está presente en la naturaleza. El término "ligado en forma operable" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a posiciones de componentes descritos de está manera están en una relación que permite que estos funcionen en su manera pretendida. Una secuencia de control "ligada en forma operable" a una secuencia codificadora está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. El término "secuencia de control" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de las secuencias codificadoras a las cuales éstas están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere en función del organismo hospedero; en los procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen la secuencia de promotor, la secuencia de sitio de unión a ribosoma, y la secuencia de terminación de transcripción; en los eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y la secuencia de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es conveniente, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión. El término "polinucleótido" al que se hace referencia en la presente invención significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de cadena sencilla y doble de ADN. El término "oligonucleótido" al que se hace referencia en la presente invención incluye nucleótidos de origen natural, y nucleótidos modificados enlazados entre sí mediante enlazamientos de oligonucleótido de origen natural, y de origen no natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que generalmente comprenden una longitud de 200 bases o menos. De preferencia, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud y de manera más preferida 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos por lo general son de cadena sencilla, por ejemplo para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser de cadena doble, por ejemplo para uso en la construcción de un mutante de gen. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos de sentido o antisentido. El término "nucleótidos presentes en la naturaleza" al que se hace referencia en la presente invención incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" al que se hace referencia en la presente invención incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlazamientos de oligonucleótido" al que se hace referencia en la presente invención incluye enlazamientos de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato, y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche et al . , Nucí . Acids Res . 14:9081 (1986); Stec et al . J. Am . Chem . Soc . 106:6077 (1984); Stein et al . Nucí . Acids Res . 16:3209 (1988); Zon et al . An ti -Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al . Ol igonucleotides and Analogues : A Practi ca l Approach , pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec et al . patente E.U.A. No. 5,151,510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), cuyas descripciones se incporan en la presente invención para referencia. Un oligonucleótido puede incluir una marca para detección, si se desea. El término "hibridar en forma selectiva" al que se hace referencia en la presente invención significa unir en forma detectable y específicamente. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de conformidad con la invención se hibridan en forma selectiva a cadenas de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y lavado que reduzcan al mínimo cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden utilizar condiciones de alta astringencia para lograr las condiciones de hibridación selectiva como es sabido en la técnica y se discute en la presente invención. En términos generales, la homología de secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, y fragmentos de la invención y una secuencia de ácido nucleico de interés será de por lo menos 80%, y de manera más típica con homologías de preferencia cada vez mayores de por lo menos 85%, 90%, 95%, 99%, y 100%. Dos secuencias de aminoácido son homologas si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para coincidencia máxima. Los espacios (en cualquiera de las dos secuencias que se están comparando) se permiten para llevar al máximo la comparación; las longitudes de espacio de 5 o menos son preferidas siendo más preferidas 2 o menos. De manera alternativa y de preferencia, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido obtenidas a partir de éstas de por lo menos 30 aminoácidos de longitud) son homologas, tal como se utiliza este término en la presente invención, si éstas tienen una puntuación de alineación mayor de 5 (en unidades de desviación estándar) utilizando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y un castigo por espacio de 6 o mayor. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, pp . 101-110 (volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972) y el Suplemento 2 para dicho volumen, páginas 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas de manera más preferida son homologas si sus aminoácidos tienen identidad mayor o iguala 50% cuando se alinean óptimamente utilizando el programa ALIGN. El término "corresponde a" se utiliza en la presente invención para indicar que una secuencia de polinucleótido es homologa (es decir, es idéntica, no relacionada desde el punto de vista estrictamente evolutivo) a toda o una porción de una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia. En oposición, el término "complementario a" se utiliza en la presente invención para significar que la secuencia complementaria es homóloqa a toda o a una porción de una secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótido "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA" . Los siquientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótido o aminoácido: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de ADNc de longitud completa o secuencia de gen dada en un listado de secuencia o puede comprender un ADNc completo o secuencia de gen completa. En términos generales, una secuencia de referencia es de por lo menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, con frecuencia por lo menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud, y con mayor frecuencia por lo menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos de longitud. Debido a que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos pueden cada una (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia completa de polinucleótido o aminoácido) que sea similar entre las dos moléculas, y (2) también puede comprende una secuencia que sea divergente entre las dos secuencias de polinucleótidos o aminoácido, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) moléculas típicamente se efectúan comparando las secuencias de las dos moléculas a través de "una ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 18 posiciones de nucleótido contiguas o 6 aminoácidos en las cuales se puede comparar una secuencia de polinucleótido o secuencia de aminoácido con una secuencia de referencia de por lo menos 18 nucleótidos contiguos o secuencias de 6 aminoácidos y en las cuales la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones, deleciones, sustituciones, y similares (es decir, espacios) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o deleciones) para alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede efectuar mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl . Ma th . 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch J. Mol . Biol . 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman Proc. Na tl . Acad. Sci . (U.S.A.) 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de software Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis), paquetes de software de Geneworks, o Mac Vector), o mediante inspección, y se selecciona la mejor alineación (es decir, la que da como resultado el porcentaje más alto de homología a través de la ventana de comparación) generada por los diversos métodos. Tal como se utiliza en la presente invención, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology -A Syn thesi s (2da edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), la cual se incorpora en la presente invención para referencia. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a-, a-disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también puede ser componentes apropiados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-N, N, N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la notación de polipéptido utilizada en la presente invención, la dirección hacia la izquierda es la dirección amino terminal y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxi terminal, de conformidad con el uso y convención normales. En forma similar, a menos que se especifique de otra manera, el extremo a la izquierda de secuencias de polinucleótidos de cadena sencilla es el extremo 5' ; la dirección hacia la izquierda de secuencias de polinucleótido de doble cadena es referida como la dirección 5' . La dirección de adición 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se conoce como la dirección de trascripción; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que son 5' hacia el extremo 5' del transcrito de ARN son conocidas como "secuencias hacia el extremo 5'"; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que son 3' hacia el extremo 3' del transcrito de ARN son conocidas como "secuencias hacia el extremo 3' " . Tal como se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptido, cuando están alineadas óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando las ponderaciones de peso predeterminadas, comparten por lo menos 80 por ciento de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferido por lo menos 95 por ciento de identidad de secuencia, y de manera más preferida por lo menos 99 por ciento de identidad de secuencia. De preferencia, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácido conservadoras. Sustituciones de aminoácido conservadoras se refiere a la capacidad de intercambio de los residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas hidroxiladas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales con carácter básico es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales azufradas es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadora preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido glutámico-ácido aspártico, y asparagina-glutamina . Tal como se discute en la presente invención, se contempla que variaciones menores en las secuencias de aminoácido de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina quedan abarcadas por la presente invención, con la condición que las variaciones en la secuencia de aminoácido se mantengan en por lo menos 75%, más preferido por lo menos 80%, 90%, 95%, y más preferido aún 99%. En particular, se contemplan reemplazos de aminoácido conservadores. Los reemplazos conservadores son aquellos que toman lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados se dividen generalmente en familias: (1) con carácter ácido = aspartato, glutamato; (2) con carácter básico = lisina, arginina, histidina; (3) no polar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polar no cargado = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Las familias más preferidas son: serina y treonina son familia alifática-hidroxilada; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptófano, y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tenga un efecto mayor sobre la unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio de marco . Se puede determinar fácilmente si un cambio de aminoácido da o no como resultado un péptido funcional analizando la actividad específica del derivado polipeptídico. En la presente invención se describen con detalle las pruebas. Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina. Los extremos amino terminal y carboxi terminal preferidos de los fragmentos o análogos se presentan cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar comparando los datos de secuencia de nucleótido y/o aminoácido con bases de datos de secuencias públicas o registradas. De preferencia, se utilizan métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteína pronosticados que se presentan en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al . Science 253:164 (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer los motivos de secuencia y conformaciones estructurales que se pueden utilizar para definir los dominios estructurales y funcionales de conformidad con la invención. Las sustituciones de aminoácido preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteínicos, (4) alteran las afinidades de unión, y (5) confieren o modifican otras propiedades físico-químicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia diferente a la secuencia de péptido normalmente presente en la naturaleza. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de aminoácido individuales o múltiples (de preferencia sustituciones de aminoácido conservadoras) en la secuencia normalmente presente en la naturaleza (de preferencia en la porción del polipéptido fuera del dominio o dominios que forman los contactos intermoleculares) . Una sustitución de aminoácido conservadora no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia precursora (por ejemplo, un reemplazo de aminoácido no debe tender a disociar una hélice que se presenta en la secuencia precursora, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza a la secuencia precursora). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido reconocidas en la técnica se describen en Proteins , Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed. , W. H. Freeman and Company, New York (1984)); In troduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); y Thornton et a t . Na ture 354:105 (1991), cada una de las cuales se incorpora en la presente invención para referencia. El término "fragmento de polipéptido" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxilo-terminal, pero en la cual la secuencia de aminoácido remanente es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia normalmente presente en la naturaleza deducida, por ejemplo, a partir de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos típicamente son de por lo menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud, de preferencia por lo menos 14 aminoácidos de longitud, más preferido por lo menos 20 aminoácidos de longitud, normalmente por lo menos 50 aminoácidos de longitud, e incluso más preferido por lo menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a polipéptidos los cuales están constituidos por un segmento de por lo menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácido deducida y que tiene por lo menos una actividad biológica de un polipéptido original correspondiente. Típicamente, los análogos de polipéptido comprenden una sustitución de aminoácido conservadora (o adición o deleción) con respecto a la secuencia normalmente presente en la naturaleza. Los análogos típicamente son de por lo menos 20 aminoácidos de longitud, de preferencia por lo menos 50 aminoácidos de longitud o más largos, y con frecuencia pueden ser tan largos como un polipéptido de longitud completa normalmente presente en la naturaleza. Los análogos de péptidos se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquellas del péptido que sirve como plantilla. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "imitadores de péptido" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res . 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et al . J. Med . Chem . 30: 1229 (1987), las cuales se incorporan en la presente invención para referencia. Dichos compuestos con frecuencia se desarrollan con ayuda de modelado molecular computarizado. Los imitadores de péptido que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles se pueden utilizar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En términos generales, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) , tal como anticuerpo humano, pero que tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlazamiento que se selecciona a partir del grupo que consiste de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-( cis y trans) , -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Se puede utilizar la sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) para generar péptidos más estables. Además, se pueden generar péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica utilizando métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch. Ann . Rev. Biochem . 61:387 (1992), incorporado en la presente invención para referencia) ; por ejemplo, agregando residuos cisteína internos que puedan formar puentes de disulfuro intramoleculares los cuales ciclizan al péptido. "Anticuerpo" o "péptido (s) de anticuerpo" se refieren a un anticuerpo intacto, o a un fragmento de unión del mismo que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica. Los fragmentos de unión se producen utilizando técnicas de ADN recombinante, o mediante corte enzimático o químico de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')2r Fv, y anticuerpos de cadena sencilla. Se entiende que un anticuerpo aparte de un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo inhibe sustancialmente la adhesión de un polipéptido a un compañero de unión específico cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad del polipéptido unido al compañero de unión específico en por lo menos 20%, 40%, 60% u 80% aproximadamente, y más comúnmente más de 85% aproximadamente (según se mide en una prueba de unión competitiva in vi tro) . El término "epítope" incluye cualquier determinante proteínico con capacidad de unión específica a una inmunoglobulina o receptor de célula T. Los determinantes epitópicos normalmente consisten de agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activas tales como cadenas laterales de aminoácidos o azúcares y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carqa específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es = 1 µM, de preferencia = 100 nM y más preferido = 10 nM. El término "agente" se utiliza en la presente invención para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "marca" o "marcado" se refiere a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión de porciones de biotinilo a un polipéptido que pueden ser detectadas por avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contenga un marcador fluorescente o actividad enzimática que se pueda detectar mediante métodos ópticos o colorimétricos) . En algunas situaciones, la marca o marcador también puede ser terapéutico. Se conocen en la técnica y se pueden utilizar varios métodos de marcado de polipéptidos y glucoproteínas . Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Te, luIn, 125I, 131I), marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, luminóforos de lantánido) , marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopes polipeptídicos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcas de epítope) . En algunas modalidades, las marcas están unidas por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial . El término "agente o fármaco farmacéutico" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un compuesto químico o composición que pueda inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra de manera apropiada a un paciente. Otros términos de química en la presente invención se utilizan de conformidad con el uso convencional en la técnica como se ejemplifica por The McGraw-Hil l Di ctionary of Chemi ca l Terms (Parker, S., Ed., McGrawHill, San Francisco (1985)), incorporado en la presente invención para referencia) . Tal como se utiliza en la presente invención, "sustancialmente puro" significa que una especie objetivo es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) , y de preferencia una fracción sustancialmente purificada es una composición en la cual la especie objetivo comprende por lo menos 50 por ciento aproximadamente (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En términos generales, una composición sustancialmente pura comprende más de 80 por ciento aproximadamente de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferido más de 85%, 90%, 95% y 99% aproximadamente. De manera más preferida, la especie objetivo se purifica hasta homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición mediante métodos de detección convencionales) en la cual la composición consiste esencialmente de una sola especie macromolecular. Los términos "paciente", "hospedero mamífero", y similares se utilizan de manera intercambiable en la presente invención, y se refieren a mamíferos, incluyendo humanos e individuos veterinarios. El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polipéptido o aminoácido son idénticas (es decir, en una base nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) a través de la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas a través de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U, o I) o residuo se presenta en ambas secuencias para producir el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana) , y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. El término "identidad sustancial" tal como se utiliza en la presente invención indica una característica de una secuencia de polinucleótido o aminoácido, en la cual el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene por lo menos 85 por ciento de identidad de secuencia, de preferencia, por lo menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, de manera más común por lo menos 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia a través de una ventana de comparación de por lo menos "18 posiciones de nucleótido (6 aminoácidos), con frecuencia a través de una ventana de por lo menos 24-48 posiciones de nucleótido (8-16 aminoácidos), en la cual el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que totalicen 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a través de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más larga. Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "tratamiento", "tratar", y similares, se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de evitar completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se utiliza en la presente invención, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un humano, e incluye: (a) evitar que la enfermedad ocurra en un individuo que puede estar predispuesto a la enfermedad o en riesqo de adquirir la enfermedad pero que aún no ha sido diagnosticado con la misma; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, ocasionar la regresión de la enfermedad. El término "una enfermedad o trastorno asociado con la ruta alternativa del complemento", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una enfermedad o trastorno ocasionado, directa o indirectamente, por activación de la ruta alternativa del complemento, una enfermedad o trastorno que es mediada, directa o indirectamente, por uno o más componentes de la ruta alternativa del complemento, o un producto generado por la ruta alternativa del complemento. El término también se refiere a una enfermedad o trastorno que es exacerbado por uno o más componentes de la ruta alternativa del complemento, o un producto qenerado por la ruta alternativa del complemento. Antes que la presente invención se describa de manera adicional, se debe entender que esta invención no queda limitada a las modalidades particulares descritas, ya que desde luego, éstas pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en la presente invención es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente, y no pretende ser limitativa, debido a que el campo de la presente invención queda limitado únicamente por las reivindicaciones anexas. En casos en los que se provea un intervalo de valores, se entiende que cada valor intercalado, hasta la décima de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto claramente dicte lo contrario, entre el límite superior o inferior de dicho intervalo o cualquier otro valor declarado o intercalado en dicho intervalo establecido, queda abarcado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden ser incluidos de manera independiente en intervalos más pequeños, y también quedan abarcados dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. En casos en los que el intervalo mencionado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de estos límites incluidos también quedan incluidos en la invención. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que aquel comúnmente entendido por el experto en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente invención también se pueden utilizar en la práctica o análisis de la misma, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación. Todas las publicaciones mencionadas en la presente invención quedan incorporadas en la misma para referencia para describir y divulgar los métodos y/o materiales en conexión con el cual se citan las publicaciones . A menos que se defina de otra manera, los términos científicos y técnicas utilizados en conexión con la presente invención deben tener los significados que comúnmente son entendidos por los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, los términos en singular deben incluir los plurales y los términos en plural deben incluir los singulares. En términos generales, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, y química de proteína y oligonucleótido o polinucleótido e hibridación descritos en la presente invención son aquellos bien conocidos y utilizados comúnmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, y cultivo y transformación de tejido (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se efectúan de conformidad con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describen en la presente invención. Las técnicas y procedimientos anteriores qeneralmente se efectúan de conformidad con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten a través de toda la presente descripción. Véase, por ejemplo, Sambrook et al . Molecular Cloning: A Labora tory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), la cual se incorpora en la presente invención para referencia. Las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química de síntesis orgánica, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente invención son aquellas bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para síntesis química, análisis químico, preparación, formulación, y suministro farmacéutico, y tratamiento de pacientes . Se debe mencionar que tal como se utiliza en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", "y", y "el (la)" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo anti-properdina" incluye una pluralidad de dicho anticuerpo y la referencia a "la enfermedad" incluye referencia a una o más enfermedades y equivalentes de la misma conocidas por los expertos en la técnica, etc. Las publicaciones discutidas en la presente invención se proveen únicamente por su descripción previa a la fecha de presentación de la presente solicitud. Ninguna parte de las mismas debe ser considerada como una admisión que la presente invención no tiene el derecho a anteceder dicha publicación en virtud de la invención previa. Además, las fechas de publicación provistas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales lo cual necesita ser confirmado en forma independiente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee anticuerpos anti-properdina completamente humanos, y composiciones que comprenden los anticuerpos. Un anticuerpo de la presente invención se produce mediante una célula productora de anticuerpo de un XenoMouse®, un ratón genéticamente modificado que produce anticuerpos que tienen secuencias de aminoácidos de anticuerpos humanos, por ejemplo, secuencias de aminoácido de la región de marco (FR) y la región constante de humano. Las cepas de ratón modificado genéticamente XenoMouse® son ratones genéticamente manipulados en los cuales los loci de IgH e Igk de múrido han sido reemplazados funcionalmente con sus contrapartes de Ig en transgenes YAC artificiales de levadura. Estos transgenes Ig de humano pueden portar la mayoría del repertorio variable de humano y pueden experimentar intercambio de clase de isotipos de IgM a IgG. El sistema inmune del xenomouse reconoce los antígenos de humano administrados como exógenos y produce una respuesta humoral fuerte. El uso de XenoMouse® en conjunto con técnicas de hibridomas bien establecidas, da como resultado anticuerpos monoclonales de IgG completamente humanos con afinidades sub-nanomolares para antígenos de humano (véase patente E.U.A. No. 5,770,429, titulada "Transgenic non-human animáis capable of producing heterologous antibodies"; patente E.U.A. No. 6,162,963, titulada "Generation of Xenogenetic antibodies"; patente E.U.A. No. 6,150,584, titulada "Human antibodies derived from immunized xenomice"; patente E.U.A. No. 6,114,598, titulada Generation of xenogeneic antibodies; y patente E.U.A. No. 6,075,181, titulada "Human antibodies derived from immunized xenomice"; para revisiones, véase Green, Antibody engineering via genetic engineering of the mouse: XenoMouse® strains are a vehicle for the facile generation of therapeutic human monoclonal antibodies, J. Immunol . Methods 231:11-23, 1999; Wells, Eek, a XenoMouse®: Abgenix, Inc., Chem Biol Agosto de 2000 7(8):R185-ß; y Davis et al . , Transgenic mice as a source of fully human antibodies for the treatment of cáncer Cáncer Metástasis Rev 1999;18 (4) :421-5) . Un anticuerpo de la presente invención es útil en una variedad de métodos terapéuticos. Un anticuerpo anti-properdina de la invención es útil en métodos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades mediadas, directa o indirectamente, por un componente de la ruta alternativa del complemento, y/o por un factor generado después de la activación de la ruta alternativa del complemento. Un anticuerpo anti-properdina de la presente invención evita problemas asociados con otros anticuerpos de roedor, es decir, reacciones adversas en humanos, tales como reacciones de hipersensibilidad, incluyendo urticaria, disnea, hipotensión, anafilaxis, y similares.

Anticuerpos anti-properdina La presente invención provee anticuerpos anti-properdina completamente humanos, y composiciones que comprenden los anticuerpos. Un anticuerpo de la presente invención se produce mediante una célula productora de anticuerpo de un XenoMouse®, un ratón modificado genéticamente que produce anticuerpos que tienen secuencias de aminoácido de anticuerpos de humano, por ejemplo, secuencias de marco de humano (FR) y secuencias de aminoácido de región constante de humano.

Properdina Los polipéptidos de properdina son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de aminoácido de properdina de humano y de múrido se encuentran en la base de datos GenBank bajo los siguientes números de acceso: para properdina de humano, véase, por ejemplo, los números de acceso GenBank AAA36489, NP_002612, AAH15756, AAP43692, S29126, CAA40914; para properdina de ratón, véase, por ejemplo, los números de acceso GenBank P11680, y S05478. Properdina de humano es una proteína de 469 aminoácidos que incluye un péptido de señal (aminoácidos 1-28), y 6 repeticiones, de tromboespondina tipo 1 no idénticas (TSR) de aproximadamente 60 aminoácidos cada una, como sigue: aminoácidos 80-134 (TSR1), aminoácidos 139-191 (TSR2), aminoácidos 196-255 (TSR3), aminoácidos 260-313 (TSR4), aminoácidos 318-377 (TSR5), y aminoácidos 382-462 (TSR6) . Properdina se forma mediante oligomerización de un monómero tipo bastoncillo en dímeros, trímeros y tetrámeros cíclicos.

Actividades de anticuerpo Un anticuerpo anti-properdina de la presente invención presenta una o más de las siguientes actividades: (1) inhibe la unión de properdina a C3b; (2) inhibe la oligomerización de monómeros de properdina; (3) reduce el nivel y/o producción de un componente de la ruta alternativa del complemento, o un factor producido por acción de un componente de la ruta alternativa del complemento; (4) reduce la formación del complejo de ataque a membrana (MAC); (5) reduce la formación de anafilatoxinas, por ejemplo, C3a y/o C5a; y (6) reduce la formación de C3c. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención se une a un epítope dentro de una TSR de properdina, por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención se une a un epítope dentro de TSR1, TSR2, TSR3, TSR4, TSR5, o TSR6. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención se une a dos o más TSR de un polipéptido de properdina, por ejemplo, en casos en los que un epítope sea compartido entre o dentro de las TSR, y en las cuales los epítopes compartidos pueden, pero no necesariamente, ser idénticos en la secuencia de aminoácido. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención inhibe la unión de properdina a C3b. En estas modalidades, un anticuerpo de la presente invención efectúa una inhibición de unión de properdina a C3b de por lo menos 20% aproximadamente, por lo menos 30% aproximadamente, por lo menos 40% aproximadamente, por lo menos 50% aproximadamente, por lo menos 60% aproximadamente, por lo menos 70% aproximadamente, por lo menos 80% aproximadamente, por lo menos 90% aproximadamente, o más. Se puede determinar si un anticuerpo de la presente invención inhibe o no la unión properdina/C3b utilizando cualquiera de un número de pruebas bien conocidas para detectar la unión proteína-proteína, incluyendo, pero sin limitarse a, prueba de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), una prueba de transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), una prueba de extinción de fluorescencia; una prueba de anisotropía de fluorescencia; una prueba inmunológica; y una prueba que implica la unión de una proteína marcada en forma detectable a una proteína inmovilizada. Las pruebas inmunológicas, y las pruebas que implican la unión de una proteína marcada en forma detectable a una proteína inmovilizada se pueden arreglar en una variedad de maneras. Por ejemplo, C3b se inmoviliza en un soporte sólido, y se detecta la unión de properdina a C3b en presencia de un anticuerpo de prueba. La properdina se puede marcar en forma detectable, ya sea directa o indirectamente, como se describe en el ejemplo 1. Un anticuerpo de la presente invención inhibe el nivel y/o producción en un hospedero mamífero de uno o más componentes de la ruta alternativa del complemento y/o uno o más factores producidos por acción de uno o más componentes de la ruta alternativa del complemento. Los ejemplos no limitativos, ejemplares, de componentes y factores que se reducen incluyen MAC (C5b-9) , C3c, y anafilatoxinas, tales como C3a y C5a, y similares. Un anticuerpo de la presente invención reduce los niveles de uno o más componentes de la ruta alternativa del complemento y/o uno o más factores producidos por acción de uno o más componentes de la ruta alternativa del complemento en por lo menos 20% aproximadamente, por lo menos 30% aproximadamente, por lo menos 40% aproximadamente, por lo menos 50% aproximadamente, por lo menos 60% aproximadamente, por lo menos 70% aproximadamente, por lo menos 80% aproximadamente, por lo menos 90% aproximadamente, o más, en comparación con el nivel del componente o factor en ausencia del anticuerpo de la presente invención. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención reduce el nivel y/o producción de MAC en un hospedero mamífero. En estas modalidades, un anticuerpo de la presente invención reduce la formación de MAC en por lo menos 20% aproximadamente, por lo menos 30% aproximadamente, por lo menos 40% aproximadamente, por lo menos 50% aproximadamente, por lo menos 60% aproximadamente, por lo menos 70% aproximadamente, por lo menos 80% aproximadamente, por lo menos 90% aproximadamente, o más, en comparación con el nivel de MAC en un hospedero mamífero no tratado con el anticuerpo. Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo de la presente invención reduce o no la formación de MAC utilizando cualquier prueba conocida, por ejemplo, una prueba in vi tro tal como la descrita en el ejemplo 1. Por ejemplo, se pone en contacto suero de humano, en presencia o ausencia de un anticuerpo de prueba, con lipopolisacárido (LPS) inmovilizado para activar el complemento, lo cual da como resultado la unión covalente de C5b-9 al LPS inmovilizado. Se detecta LPS unido a C5b-9 utilizando un anticuerpo específico para C5b-9. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención reduce el nivel y/o producción de una anafilatoxina, tal como C3a y C5a, en un hospedero mamífero. En estas modalidades, un anticuerpo de la presente invención reduce la formación de una anafilatoxina en por lo menos 20% aproximadamente, por lo menos 30% aproximadamente, por lo menos 40% aproximadamente, por lo menos 50% aproximadamente, por lo menos 60% aproximadamente, por lo menos 70% aproximadamente, por lo menos 80% aproximadamente, por lo menos 90% aproximadamente, o más, en comparación con el nivel de una anafilatoxina en un hospedero mamífero no tratado con el anticuerpo. Se puede determinar fácilmente si el nivel de una anafilatoxina se reduce o no utilizando cualquier método conocido, incluyendo los métodos descritos en los ejemplos.

Marcas detectables En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención se marca en forma detectable. Las marcas detectables incluyen, pero no se limitan, proteínas fluorescentes; enzimas (por ejemplo, ß-galactosidasa, luciferasa, peroxidasa de rábano, etc.); radioisótopos, por ejemplo, 2P, 35S 3H; etc; agentes fluorescentes, por ejemplo, isotiocianato-fluoresceína (FITC), rodamina, rojo Texas, ficoeritrina, aloficocianina, y proteínas fluorescentes; quimio-luminiscentes; moléculas de unión específica; partículas, por ejemplo partículas magnéticas, y similares. Las moléculas de unión específica incluyen pares tales como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Las proteínas fluorescentes apropiadas incluyen aquellas descritas en Matz et al . ((1999) Na ture Biotechnology 17:969-973), una proteína fluorescente verde proveniente de cualquier especie o un derivado de la misma; por ejemplo, una GFP proveniente de otras especies tales como Renil la reniformis, Renilla mulleri , o Ptilosarcus guernyi , como se describe, por ejemplo, en el documento WO 99/49019 y Peelle et al . (2001) J. Protein Chem . 20:507-519; "humanized" recombinant GFP (hrGFP) (Stratagene) ; un GFP a partir de Aequoria victoria o mutante fluorescente de las mismas, por ejemplo, como las descritas en las patentes E.U.A Nos. 6,066,476; 6,020,192; 5,985,577; 5,976,796; 5,968,750; 5,968,738; 5,958,713; 5,919,445; 5,874,304.

Estructura de anticuerpo Se sabe que la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está constituido por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, en el que cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de antígeno. La porción carboxilo-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de las funciones efectoras. Las cadenas ligeras de humano se clasifican como cadenas ligera kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o epsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variables y constantes son unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, en el que la cadena pesada también incluye una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase en términos generales, Fundamen tal Immunology capítulo 7 (Paul, W., ed. , 2a ed. Raven Press, N. Y. (1989)) (incorporada para referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Por lo tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son los mismos. Todas las cadenas presentan la misma estructura general de regiones de marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hiper-variables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR provenientes de las dos cadenas de cada par están alineadas por las regiones de marco, lo que permite la unión a un epítope específico. Desde el extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal, ambas cadenas la ligera y la pesada comprenden los dominios FRl, CDRl, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio se efectúa de conformidad con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological In terest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987); Chothia et al . Na ture 342:878-883 (1989) . En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% aproximadamente, por lo menos 85% aproximadamente, por lo menos 90% aproximadamente, por lo menos 95% aproximadamente, por lo menos 98% aproximadamente, o por lo menos 99% aproximadamente de identidad de secuencia de aminoácido con cualquiera de SEQ ID NOS: 02, 06, 10, 14, y 18, como se muestra en las figuras 17A-C. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de cualquiera de SEQ ID NOS: 02, 06, 10, 14, y 18 en solamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente cuáles aminoácidos en una región variable de cadena ligera se pueden alterar. Por ejemplo, comparando las secuencias de aminoácido de las regiones variables de cadena ligera de anticuerpos con la misma especificidad, los expertos en la técnica pueden determinar cuáles aminoácidos se pueden alterar sin alterar la especificidad. Véase, por ejemplo, la figura 12 para una comparación de las secuencias de aminoácido de CDR de cadenas ligera de anticuerpo anti-properdina de ejemplo. Asimismo, se puede determinar fácilmente si la especificidad está o no alterada utilizando una prueba de unión a antígeno. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido como se indica en cualquiera de SEQ ID NOS:02, 06, 10, 14, y 18. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% aproximadamente, por lo menos 85% aproximadamente, por lo menos 90% aproximadamente, por lo menos 95% aproximadamente, por lo menos 98% aproximadamente, o por lo menos 99% aproximadamente de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de SEQ ID NOS: 04, 08, 12, 16, o 20, como se muestra en las figuras 17A-C. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido que difiere de cualquiera de SEQ ID NOS: 04, 08, 12, 16, o 20 en solamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente cuáles aminoácidos se pueden alterar en una región variable de cadena pesada. Por ejemplo, comparando las secuencias de aminoácido de las regiones variables de cadena pesada de anticuerpos con la misma especificidad, los expertos en la técnica pueden determinar cuáles aminoácidos se pueden alterar sin alterar la especificidad. Véase, por ejemplo, la figura 14 para una comparación de las secuencias de aminoácido de CDR de las cadenas pesadas de anticuerpo anti-properdina de ejemplo. Asimismo, se puede determinar fácilmente si la especificidad se altera o no utilizando una prueba de unión a antígeno. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido como la indicada en cualquiera de SEQ ID NOS: 04, 08, 12, 16, o 20. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como la indicada en cualquiera de SEQ ID NOS: 02, 06, 10, 14, y 18; y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido como la indicada en cualquiera de SEQ ID NOS: 04, 08, 12, 16, ó 20. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 02 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como la indicada en SEQ ID NO: 04. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 06 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 08. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como la indicada en SEQ ID NO: 10 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 16. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como la indicada en SEQ ID NO: 18 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 20. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos bi-específieos se pueden producir mediante una variedad de métodos que incluyen fusión de hibridomas o enlazamiento de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann Clin . Exp . Immunol . 79: 315-321 (1990), Kostelny et al . J. Immunol . 148:1547-1553 (1992). La producción de anticuerpos biespecíficos puede ser un proceso relativamente laborioso en comparación con la producción de anticuerpos convencionales y los rendimientos y grado de pureza generalmente son bajos para anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos no existen en forma de fragmentos que tengan un sitio de unión individual (por ejemplo, Fab, Fab', y Fv) .

Anticuerpos de humano y humanización de anticuerpos Los anticuerpos de humano evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes de múrido o rata. La presencia de tales proteínas derivadas de múrido o rata puede conducir a la rápida eliminación de los anticuerpos o puede llevar a la generación de una repuesta inmune contra el anticuerpo por parte de un paciente. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos derivados de múrido o de rata, se ha postulado que se pueden desarrollar anticuerpos humanizados o generar anticuerpos completamente humanos a través de la introducción de la función de anticuerpo de humano en un roedor de modo tal que el roedor pueda producir anticuerpos completamente humanos.

Anticuerpos de humano La capacidad para clonar y reconstruir loci de humano de tamaño megabase en YAC y de introducirlos en la línea germinal de ratón provee una estrategia poderosa para esclarecer los componentes funcionales de loci muy grandes o mapeados muy burdamente así como para generar modelos útiles de enfermedad en humanos. Asimismo, la utilización de dicha tecnología para sustitución de loci de ratón con sus equivalentes humanos puede proveer conocimientos únicos en cuanto a la expresión y regulación de productos génicos de humano durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas, y su implicación en la inducción y avance de la enfermedad. Una aplicación práctica importante de dicha estrategia es la "humanización" del sistema inmune humoral de ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina de humano (Ig) en ratones en los cuales los genes Ig endógenos han sido inactivados ofrece la oportunidad de estudiar el mecanismo subyacente a la expresión programada y ensamblado de anticuerpos así como su papel en el desarrollo de célula B. Asimismo, dicha estrategia puede proveer una fuente ideal para la producción de anticuerpos monoclonales (Mabs) completamente humanos - un avance importante para satisfacer la promesa de terapia de anticuerpo en enfermedad humana. Se espera que los anticuerpos completamente humanos reduzcan al mínimo las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los anticuerpos monoclonales de ratón o derivados de ratón y por lo tanto que incrementen la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. Se puede esperar que el uso de anticuerpos completamente humanos provea una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación, auto-inmunidad, y cáncer, las cuales requieren administraciones repetidas de anticuerpo. Una estrategia hacia este objetivo es la de diseñar cepas de ratón deficientes en producción de anticuerpo de ratón con fragmentos grandes del loci de Ig de humano en antelación a que dichos ratones puedan producir un gran repertorio de anticuerpos de humano en ausencia de anticuerpos de ratón. Los fragmentos de Ig de humano grandes pueden conservar la gran diversidad génica variable así como la regulación apropiada de la producción y expresión de anticuerpo. Al explotar la maquinaria de ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la carencia de tolerancia inmunológica hacia proteínas de humano, el repertorio de anticuerpos de humano reproducido en estas cepas de ratón debe producir anticuerpos con alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos de humano. Utilizando la tecnología de hibridoma, se pueden producir y seleccionar fácilmente anticuerpos monoclonales de humano específicos de antígeno con la especificidad deseada. Esta estrategia general se demuestra en conexión con la generación de las primeras cepas de XenoMouse™ como se publicó en 1994. véase Green et al . Na ture Geneti cs 7:13-21 (1994). Las cepas de XenoMouse™ se diseñan genéticamente con cromosomas artificiales de levadura (YAC) que contienen 245 kb y fragmentos de configuración de línea germinal de 190 kb de tamaño del locus de la cadena pesada de humano y del locus de cadena ligera kappa, respectivamente, los cuales contienen secuencias centrales de región variable y región constante. Id. Los YAC que contienen Ig de humano demuestran ser compatible con el sistema de ratón tanto para el reacomodo y expresión de anticuerpos y pueden sustituir los genes de Ig de ratón inactivados. Esto se demuestra por su capacidad para inducir el desarrollo de célula B, para producir un repertorio de humano tipo adulto de anticuerpos completamente humanos y para generar anticuerpos monoclonales de humano específicos de antígeno. Estos resultados también sugieren que la introducción de porciones más grandes del loci de Ig de humano que contienen números más grandes de genes V, elementos reguladores adicionales, y regiones constantes de Ig de humano podría recapitular sustancialmente el repertorio completo que es característico de la respuesta humoral de humano hacia la infección e inmunización. El trabajo de Green et al . , se extendió recientemente a la introducción de más de aproximadamente el 80% del repertorio de anticuerpo de humano a través de la introducción de fragmentos YAC de configuración de línea germinal, de tamaño megabase del loci de cadena pesada y el loci de cadena ligera kappa de humano, respectivamente, para producir ratones XenoMouse™. Véase Méndez et al . Na ture Geneti cs 15:146-156 (1997) y solicitud de patente E.U.A. No. de serie 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996, cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia. Dicha estrategia también se discute y delinea en las patentes E.U.A. Nos. 6,162,963; 6,150,584; 6,114,598, 6,075,181, y 5,939,598 y las patentes Japonesas Nos. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, y 3 068 507 B2. Véase también Méndez et al . Na ture Geneti cs 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp . Med . 188:483-495 (1998). Véase también patente Europea No., EP 0 463 151 Bl, concesión publicada el 12 de junio de 1996, Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, Solicitud Internacional de Patente No. WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. Las descripciones de cada una de las patentes, solicitudes y referencias citadas anteriormente quedan incorporadas en la presente invención para referencia en su totalidad. En una estrategia alternativa, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado una estrategia de "minilocus". En la estrategia de minilocus, se imita un locus de Ig exógeno a través de la inclusión de piezas (genes individuales) provenientes del locus de Ig. Por 1o tanto, se forman uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y una segunda región constante (de preferencia una región constante gamma) como una construcción para inserción dentro de un animal. Esta estrategia se describe en la patente E.U.A. No. 5,545,807 para Surani et al . y en las patentes E.U.A. Nos. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, y 6,255,458 cada una para Lonberg y Kay, patentes E.U.A. Nos. 5,591,669 y 6,023,010 para Krimpenfort y Berns, patentes E.U.A. Nos. 5,612,205, 5,721,367, y 5,789,215 para Berns et al . , y patente E.U.A. No. 5,643,763 para Choi y Dunn, y las solicitudes de patente E.U.A. de GenPharm International Nos. de serie 07/574,748, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575,962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810,279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853,408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904,068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990,860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053,131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096,762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155,301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161,739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/165,699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209,741, presentada el 9 de marzo de 1994, cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia. Véase también patente Europea No. 0 546 073 Bl, Solicitudes de Patente Internacional Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y la patente E.U.A. No. 5,981,175, cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad. Véase también Taylor et al . , 1992, Chen et al . , 1993, Tuaillon et al . , 1993, Choi et al . , 1993, Lonberg et al . , (1994), Taylor et al . , (1994), y Tuaillon et al . , (1995), Fishwild et al . , (1996), cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad. Los inventores de Surani et al., citados anteriormente y asignados al Consejo de Investigación Médica (el "MRC"), produjeron un ratón transgénico que posee un locus de Ig a través del uso de la estrategia de minilocus. Los inventores en el trabajo de GenPharm International, citado anteriormente, Lonberg y Kay, siguiendo la guía de los inventores de la presente, proponen la inactivación del locus de Ig de ratón endógeno acoplado con duplicación sustancial del trabajo de Surani et al . Una ventaja de la estrategia de minilocus es la rapidez con la cual se pueden generar construcciones que incluyan porciones de locus de Ig e introducir en animales. En forma conmensurada, sin embargo, una desventaja significativa de la estrategia de minilocus es que, en teoría, se introduce diversidad insuficiente a través de la inclusión de números pequeños de genes V, D, y J. En efecto, el trabajo publicado parece apoyar esta inquietud. El desarrollo de célula B y la producción de anticuerpo de animales producidos a través del uso de la estrategia de minilocus parece detenido. Por lo tanto, la investigación que rodea la presente invención ha sido dirigida consistentemente hacia la introducción de porciones grandes del locus de Ig con el fin de lograr una mayor diversidad en un esfuerzo para reconstituir el repertorio inmune de los animales . Kirin también demostró la generación de anticuerpos de humano a partir de ratones en los cuales, a través de microfusión de célula, se introducen piezas grandes de cromosomas, o cromosomas completos. Véase solicitudes de Patente Europea Nos. 773 288 y 843 961, cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia. Las respuestas de anticuerpo anti-ratón (HAMA) han llevado a la industria a preparar anticuerpos humanizados quiméricos o de alguna otra manera humanizados. Aunque los anticuerpos quiméricos tienen una región constante de humano y una región variable de múrido, se espera que se observen algunas respuestas anti-anticuerpo quimérico de humano (HACA) , particularmente en utilizaciones crónicas o de dosis múltiples del anticuerpo. Por lo tanto, sería deseable proveer anticuerpos completamente humanos contra properdina con el fin de menoscabar las preocupaciones y/o efectos de la respuesta HAMA o HACA.

Tecnologías de humanización y despliegue Como se discutió anteriormente en conexión con la generación de anticuerpo de humano, existen ventajas para producir anticuerpos con carácter inmunogénico reducido. Hasta cierto grado, esto se puede lograr en conexión con técnicas de humanización y técnicas de despliegue utilizando las genotecas apropiadas. Se apreciará que los anticuerpos de múrido o anticuerpos provenientes de otras especies se pueden humanizar o primatizar utilizando técnicas bien conocidas en el campo. Véase por ejemplo, Winter y Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) y Wright et a l . Cp t , Reviews m Immunol . 12125-168 (1992) . El anticuerpo de interés puede ser manipulado genéticamente utilizando técnicas de ADN recombinante para sustituir los dominios CH1, CH2, CH3, de gozne, y/o el dominio de marco con la secuencia de humano correspondiente (véase WO 92/02190 y patentes E.U.A Nos. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, y 5,777,085) . Además, el uso de ADNc de Ig para la construcción de genes de inmunoglobulina quiméricos es conocido en la técnica (Liu et al . P. N. A . S . 84:3439 (1987) y J. Immunol . 139:3521 (1987)). Se aisla ARNm a partir de un hibridoma u otra célula que produzca el anticuerpo y se utiliza para producir el ADNc. El ADNc de interés se puede amplificar utilizando la reacción en cadena de polimerasa empleando iniciadores específicos (patentes E.U.A Nos. 4,683,195 y 4,683,202). De manera alternativa, se elabora una genoteca y se tamiza para aislar la secuencia de interés. La secuencia de ADN que codifica para la región variable del anticuerpo se fusiona después a las secuencias de región constante de humano. Las secuencias de los genes de las regiones constantes de humano se pueden encontrar en Kabat et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, publicación del N.I.H. no. 91-3242. Los genes de la región C de humano se pueden conseguir fácilmente a partir de clones conocidos. La elección del isotipo será guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como fijación del complemento, o actividad en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Los isotipos preferidos son IgGl, IgG3 e IgG4. Se puede utilizar cualquiera de las regiones constantes de la cadena ligera de humano, kappa o lambda. El anticuerpo quimérico, humanizado se expresa después utilizando métodos convencionales. Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo, tales como Fv, F(ab')2 y Fab mediante corte de la proteína intacta, por ejemplo mediante corte con proteasa o corte químico. De manera alternativa, se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifique para una porción del fragmento F(ab')2 puede incluir secuencias de ADN que codifican para el dominio CH1 y la región de gozne de la cadena H, seguido por un codón de terminación de traducción para producir la molécula truncada.

Se pueden utilizar secuencias de consenso de las regiones H y L J para diseñar oligonucleótidos para ser utilizados como iniciadores para introducir sitios de restricción útiles en la región J para enlazamiento subsiguiente de los segmentos de la región V a segmentos de la región C de humano. El ADNc de la región C se puede modificar mediante mutagénesis dirigida a sitio para colocar un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia de humano. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retro-virus, YACs, episomas derivados de EBV, y similares. Un vector conveniente es aquel que codifica para una secuencia de inmunoglobulina CH o CL de humano funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados manipulados genéticamente de modo tal que se pueda insertar y expresar fácilmente cualquier secuencia de VH o VL . En dichos vectores, el empalme normalmente ocurre entre el sitio donador de empalme y la región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede a la región C de humano, y también en las regiones de empalme que se presentan dentro de los exones CH de humano. La poliadenilación y la terminación de transcripción ocurren en los sitios cromosómicos originales hacia el extremo 3' de las regiones de codificación. El anticuerpo quimérico resultante se puede unir a cualquier promotor fuerte, incluyendo LTR retrovirales, por ejemplo promotor temprano de SV-40 (Okayama et al . Mol . Cell . Bio . 3:280 (1983)), LTR de virus de sarcoma de Rous (Gorman et al . P. N. A . S . 79:6777 (1982)), y el LTR de virus de leucemia de múrido de Moloney (Grosschedl et al . Cel l 41:885 (1985)). Como se apreciará, también se pueden utilizar promotores de Ig originales y similares . Además, se pueden generar anticuerpos de humano o anticuerpos provenientes de otras especies a través de tecnologías tipo despliegue, incluyendo, sin limitación, despliegue de fago, despliegue retroviral, despliegue ribosómico, y otras técnicas, utilizando técnicas bien conocidas en el campo y las moléculas resultantes se pueden someter a maduración adicional, tal como maduración por afinidad, debido a que dichas técnicas son bien conocidas en el campo. Wright y Harris, supra . , Hanes y Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (despliegue ribosómico), Parmley y Smith Gene 73:305-318 (1988) (despliegue de fago), Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al . PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al . Nucí . Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al . Immunol . Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell y McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992), y patente E.U.A. No. 5,733,743. Si se utilizan tecnologías de despliegue para producir anticuerpos que no sean humanos, dichos anticuerpos se pueden humanizar como se describió anteriormente . Utilizando estas técnicas, se pueden generar anticuerpos para células que expresen properdina, para properdina misma, para formas de epítopes de properdina o péptidos de la misma, y genotecas de expresión para la misma (véase, por ejemplo, patente E.U.A. No. 5,703,057) los cuales después de esto se pueden tamizar como se describió anteriormente para las actividades antes descritas.

Criterios adicionales para agentes terapéuticos de anticuerpo Como se discute en la presente invención, la función de un anticuerpo anti-properdina de la presente invención parece importante para por lo menos una porción de su modo de operación. Con el término función, se quiere decir, a manera de ejemplo, la actividad del anticuerpo anti-properdina para inhibir la ruta alternativa del complemento, por ejemplo, un anticuerpo anti-properdina de la presente invención exhibe una o más de las siguientes propiedades: (1) inhibe la unión de properdina a C3b; (2) inhibe la oligomerización de monómeros de properdina; (3) reduce la formación de un componente de la ruta alternativa del complemento, o un factor producido por acción de un componente de la ruta alternativa del complemento; (4) reduce la formación del complejo de ataque a membrana (MAC); (5) reduce la formación de anafilatoxinas, por ejemplo, C3a y/o C5a; y (6) reduce la formación de C3c. Un anticuerpo de la presente invención en algunas modalidades puede comprender una región constante de cadena pesada de humano IgGi; en otras modalidades una región constante de cadena pesada de humano IgG2; y en otras modalidades una región constante de cadena pesada de humano IgG3. Se apreciará que los anticuerpos que se generan no necesitan poseer inicialmente dicho isotipo sino, más bien, el anticuerpo tal como se genera puede poseer cualquier isotipo y el anticuerpo puede cambiar de isotipo después de esto utilizando técnicas convencionales que son bien conocidas en el campo. Dichas técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (véase, por ejemplo, patente E.U.A. No. 4,816,397), técnicas de fusión célula-célula (véase por ejemplo, patentes E.U.A Nos. 5,916,771 y 6,207,418), entre otros. En la técnica de fusión célula-célula, se prepara una línea celular de mieloma u otra línea celular que posea una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otro línea celular de mieloma u otra línea celular que posea la cadena ligera. Después de esto, dichas células se pueden fusionar y se puede aislar una línea celular que exprese un anticuerpo intacto.

A manera de ejemplo, el anticuerpo anti-properdma discutido en la presente invención es un anticuerpo anti IgG2 de properdina de humano. Si dicho anticuerpo posee la unión deseada a un polipéptido o epítope de properdina o fragmento de la misma, este puede cambiarse fácilmente de isotipo para generar un isotipo IgM de humano, IgGl de humano, o IgG3 de humano, al tiempo que sigue poseyendo la misma región variable (la cual define la especificidad del anticuerpo y cierta cantidad de su afinidad) . Por consiguiente, debido a que se generan candidatos de anticuerpo que cumplen los atributos "estructurales" deseados como se describió anteriormente, estos se pueden proveer generalmente con por lo menos algunos de los atributos "funcionales" deseados a través de conmutación de isotipo.

Diseño y generación de otros agentes terapéuticos De conformidad con la presente invención y tomando como base la actividad de los anticuerpos que se producen y caracterizan en la presente invención con respecto a la inhibición de la ruta alternativa del complemento, se facilita el diseño de otras modalidades terapéuticas más allá de las porciones de anticuerpo. Dichas modalidades incluyen, sin limitación, terapéuticos de anticuerpo avanzados, tales como anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas, y terapéuticos radiomarcados, generación de terapéuticos peptídicos, terapias de gen, en particular intra-cuerpos, terapéuticos anti-sentido, y moléculas pequeñas . En conexión con la generación de agentes terapéuticos de anticuerpo avanzados, en los cuales la fijación del complemento es un atributo deseable, puede ser posible dejar a un lado la dependencia en el complemento para aniquilación celular a través del uso de anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas, o radiomarcas, por ejemplo. Por ejemplo, en conexión con anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos biespecíficos se pueden generar de manera tal que comprendan (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad hacia properdina y el otro hacia una segunda molécula que se conjugan entre sí, (ii) un anticuerpo individual que tiene una cadena específica para properdina y una segunda cadena específica para una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de cadena individual que tiene especificidad hacia properdina y la otra molécula. Dichos anticuerpos biespecíficos se pueden generar utilizando técnicas que son conocidas por ejemplo, en conexión con (i) e (ii), véase por ejemplo Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright y Harris, supra , y en conexión con (iii) véase por ejemplo, Traunecker et al . In t . J. Cáncer (Suppl . ) 7:51-52 (1992). En cada caso, la segunda especificidad se puede elaborar para los receptores de activación de cadena pesada, incluyendo, sin limitación, CD16 o CD64 (véase por ejemplo, Deo et al . 18:127 (1997)) o CD89 (véase por ejemplo, Valerius et al . Blood 90:4485-4492 (1997)). Los anticuerpos biespecíficos preparados de conformidad con lo anterior probablemente aniquilen células que expresan properdina y particularmente aquellas células en las cuales son efectivos los anticuerpos anti-properdina de la invención. En conexión con inmunotoxinas, los anticuerpos se pueden modificar para que actúen como inmunotoxinas utilizando técnicas que son bien conocidas en el campo. Véase por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Véase también patente E.U.A. No. 5,194,594. En conexión con la preparación de anticuerpos radiomarcados, dichos anticuerpos modificados también se pueden preparar fácilmente utilizando técnicas que sean conocidas en el campo. Véase por ejemplo, Junghans et al . en Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edición, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Véase también patentes E.U.A Nos. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471, y 5,697,902. Cada una de las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas probablemente aniquilen células que expresan properdina, y en particular aquellas células en las cuales los anticuerpos de la invención son efectivos. En conexión con la generación de péptidos terapéuticos, a través de la utilización de información estructural relacionada con properdina y anticuerpos para la misma, tales como los anticuerpos de la invención (como se discute más adelante en conexión con moléculas pequeñas) o el tamizaje de genotecas de péptido, se pueden generar péptidos terapéuticos que estén dirigidos contra properdina. El diseño y tamizaje de agentes terapéuticos peptídicos se discute en conexión con Houghten et al . Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al . Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake y Litzi-Davis BioConj uga te Chem . 3:510-513 (1992). También se pueden preparar inmuno-toxinas y moléculas radiomarcadas, y en una manera similar, en conexión con porciones peptídicas como se describió anteriormente con relación a anticuerpos. Suponiendo que la molécula de properdina (o una forma, tal como una variante de empalme o forma alternativa) esté funcionalmente activa en un proceso patológico, sería posible diseñar agentes terapéuticos de gen y antisentido para la misma a través de técnicas convencionales. Dichas modalidades se pueden utilizar para modular la función de properdina. En conexión con lo mismo, los anticuerpos de la presente invención facilitan el diseño y uso de pruebas funcionales relacionadas con la misma. Un diseño y estrategia para agentes terapéuticos anti-sentido se discute con mayor detalle en la Publicación Internacional de Patente No. WO 94/29444. El diseño y estrategias para terapia de genes son bien conocidos. Sin embargo, en particular, el uso de técnicas terapéuticas de gen que implican intra-cuerpos podría demostrar ser particularmente conveniente. Véase por ejemplo, Chen et al . Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) y Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997). El diseño general de, y las consideraciones relacionadas a los agentes terapéuticos de gen, también se discuten en la Solicitud Internacional de Patente No. WO 97/38137. También se pueden contemplar agentes terapéuticos de molécula pequeña de conformidad con la presente invención. Se pueden diseñar fármacos para modular la actividad de properdina tomando como base la presente invención. El conocimiento obtenido a través de la estructura de la molécula de properdina y sus interacciones con otras moléculas de conformidad con la presente invención, tal como los anticuerpos de la invención, properdina, y otros, se puede utilizar para diseñar racionalmente modalidades terapéuticas adicionales. En este sentido, se pueden utilizar técnicas de diseño racional de fármaco tales como cristalografía de rayos X, modelado molecular auxiliado por computadora (o asistido) (CAMM) , relación estructura-actividad cuantitativa o cualitativa (QSAR) , y tecnologías similares para enfocar los esfuerzos de descubrimiento de fármaco. El diseño racional permite la predicción de estructuras proteínicas o sintéticas que pueden interactuar con la molécula o formas específicas de la misma, las cuales se pueden utilizar para modificar o modular la actividad de properdina. Dichas estructuras se pueden sintetizar químicamente o expresar en sistemas biológicos. Esta estrategia ha sido revisada en Capsey et al . Genetically Engineered Human Therapeuti c Drugs (Stockton Press, NY (1988)). Además, se pueden diseñar y sintetizar y utilizar genotecas de combinación en programas de tamizaje, tales como esfuerzos de tamizaje de alto rendimiento.

Administración y formulaciones de agentes terapéuticos Se apreciará que las entidades terapéuticas de conformidad con la invención se pueden administrar con vehículos, excipientes, y otros agentes apropiados que se incorporan en las formulaciones para proveer transferencia, suministro, tolerancia y similares mejorados. Una multitud de formulaciones apropiadas se pueden encontrar en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington Pharmaceutical Sciences (15a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975) ) , en particular el capítulo 87 por Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípido (catiónico o amónico (tal como Lipofectin™) , conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de varios pesos moleculares), geles semi-sólidos, y mezclas semi-sólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de conformidad con la presente invención, con la condición que el ingrediente activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul Toxi col . Pharma col . 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". In t . J. Pharm . 203 (1-2) : 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts" J Pharm Sci 89(8): 967-78 (2000), Powell et al . "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol . 52:238-311 (1998) y las citas en las mismas para información adicional relacionadas con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos por el químico farmacéutico.

Preparación de anticuerpos Los anticuerpos de conformidad con la invención de preferencia se preparan a través de la utilización de un ratón transgénico que tenga una porción sustancial del genoma productor de anticuerpo de humano insertado, pero que sea deficiente en la producción de anticuerpos endógenos, de múrido. Entonces, dichos ratones pueden producir moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina de humano y son deficientes en la producción de moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina de múrido. Las tecnologías utilizadas para lograr este objetivo se describen en las patentes, solicitudes, y referencias descritas en la sección de antecedentes en la presente invención. En particular, sin embargo, una modalidad preferida de producción transgénica de ratones y anticuerpos a partir de los mismos se describe en la Solicitud de Patente E.U.A. No. de serie 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996 y las Solicitudes Internacionales de patentes Nos. WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000, cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia. Véase también Méndez et al . Na ture Geneti cs 15:146-156 (1997), cuya descripción se incorpora en la presente invención para referencia. A través del uso de dicha tecnología, se producen anticuerpos monoclonales completamente humanos para una variedad de antígenos. Esencialmente, se inmunizan líneas de XenoMouse® de ratones con un antígeno de interés, se recuperan las células linfáticas, (tales como células B) a partir de los ratones que expresan los anticuerpos, se fusionan dichas células recuperadas con la línea celular tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y dichas líneas celulares de hibridoma se tamizan y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que produzcan anticuerpos específicos para el antíqeno de interés. Se utilizan estas técnicas de conformidad con la presente invención para la preparación de anticuerpos específicos para properdina. En la presente invención, se describe la producción de líneas celulares de hibridoma múltiples que producen anticuerpos específicos para properdina. Además, se provee una caracterización de los anticuerpos producidos por dichas líneas celulares, incluyendo análisis de secuencia de nucleótido y aminoácido de las cadenas pesada y ligera de dichos anticuerpos. Las líneas de célula de hibridoma discutidas en la presente invención pueden ser generadas fácilmente por los expertos en la técnica dados los lineamientos provistos en la presente. Cada uno de los anticuerpos producidos por las líneas celulares de la presente invención pueden ser cadenas pesadas completas IgG2 o IgG4 de humano con cadenas ligeras kappa de humano. En general, los anticuerpos de conformidad con la invención poseen afinidades muy altas, típicamente poseen constantes de disociación (Kd) de 10"9 aproximadamente hasta 10"11 M aproximadamente, cuando se miden ya sea en fase sólida o en fase en solución. Como será apreciado, los anticuerpos de conformidad con la presente invención se pueden expresar en líneas celulares aparte de las líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican para anticuerpos particulares se pueden utilizar para transformación de una célula hospedera de mamífero apropiada. La transformación se puede efectuar utilizando cualquier método conocido para introducir polinucleótidos al interior de una célula hospedera, incluyendo, por ejemplo empacamiento del polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducción de una célula hospedera con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica mediante las patentes E.U.A Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, y 4,959,455 (cuyas patentes quedan incorporadas en la presente invención para referencia) . El procedimiento de transformación utilizado depende del hospedero a ser transformado. Los métodos para introducción de polinucleótidos heterólogos al interior de células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del o los polinucleótidos en liposomas, y micro-inyección directa del ADN al interior del núcleo. Las líneas de células de mamífero disponibles como hospederos para expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles a partir del Depósito Americano de Cultivos Tipo (ATCC) , incluyendo pero sin limitarse a células de ovario de hámster chino (CHO) células HeLa, células de riñon de Hámster bebé (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular de humano (por ejemplo, Hep G2), y muchas otras líneas celulares. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan determinando cuáles líneas celulares tienen niveles de expresión altos y producen anticuerpos con propiedades de unión a properdina constitutivas . Los resultados demostrados de conformidad con la presente invención indican que los anticuerpos de conformidad con la presente invención poseen ciertas cualidades que pueden hacer que los anticuerpos de la presente invención sean más eficaces que los anticuerpos actualmente disponibles contra properdina. Los anticuerpos de conformidad con la invención tienen afinidades altas y parecen eficaces para inhibir la ruta alternativa del complemento, y por lo tanto para tratar trastornos asociados con y/o mediados por la ruta alternativa del complemento.

Polinucleótidos, vectores, y células hospederas La presente invención también provee polinucleótidos, incluyendo polinucleótidos aislados, que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica para un anticuerpo de la presente invención. La presente invención también provee vectores, incluyendo vectores de expresión, que comprenden un polinucleótido de la presente invención. La presente invención también provee células hospederas, incluyendo células hospederas aisladas, que comprenden un polinucleótido de la presente invención o un vector de la presente invención. En muchas modalidades, una célula hospedera de la presente invención produce un anticuerpo de la presente invención. La presente invención provee polinucleótidos ("ácidos nucleicos"), incluyendo polinucleótidos aislados, que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica para un anticuerpo de la presente, así como composiciones que comprenden dichos ácidos nucleicos. Con la frase composición de ácido nucleico se quiere decir una composición que comprende una secuencia de ADN que tiene un marco de lectura abierto que codifica para un anticuerpo de la presente y que puede, bajo condiciones apropiadas, ser expresado como un anticuerpo de la presente.

Los ácidos nucleicos que codifican para un anticuerpo de la presente pueden ser ADNc o ADN genómico o un fragmento de los mismos. Se debe entender que el término gen significa el marco de lectura abierto que codifica para anticuerpos específicos de la presente invención, e intrones, así como secuencias de nucleótido no codificadoras 5' y 3' implicadas en la regulación de expresión, hasta 20 kb después de la región codificadora, pero posiblemente más en cualquier dirección. El gen se puede introducir en un vector apropiado para mantenimiento extra-cromosómico o para integración en un genoma hospedero. El término "ADNc" tal como se utiliza en la presente invención pretende incluir todos los ácidos nucleicos que comparten el arreglo de elementos de secuencia encontrado en las especies de ARNm maduras originales, en las cuales los elementos de las secuencias son exones y regiones no codificadoras 3' y 5' . Normalmente, las especies de ARNm tienen exones contiguos, en los que los intrones intercalados, cuando están presentes, son eliminados mediante empalme de ARN nuclear, para crear un marco de lectura abierto continuo que codifica para una proteína de conformidad con la presente invención. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la presente invención que codifica para una cadena ligera de anticuerpo de la presente invención comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 80% aproximadamente, por lo menos 85% aproximadamente, por lo menos 90% aproximadamente, por lo menos 95% aproximadamente, por lo menos 98% aproximadamente, o por lo menos 99% aproximadamente de identidad de secuencia de nucleótido con cualquiera de SEQ ID NOS: 01, 05, 09, 13, y 17, como se muestra en las figuras 16A-F. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la presente invención que codifica para una cadena ligera de anticuerpo de la presente difiere en únicamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ó 25 nucleótidos provenientes de cualquiera de SEQ ID NOS: 01, 05, 09, 13, y 17. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la presente invención que codifica para una cadena ligera de anticuerpo de la presente invención comprende una secuencia de nucleótido como la indicada en cualquiera de SEQ ID NOS: 01, 05, 09, 13, y 17. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la presente que codifica para una cadena pesada de anticuerpo de la presente invención comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 80% aproximadamente, por lo menos 85% aproximadamente, por lo menos 90% aproximadamente, por lo menos 95% aproximadamente, por lo menos 98% aproximadamente, o por lo menos 99% de identidad de secuencia de nucleótido con cualquiera de SEQ ID NOS: 03, 07, 11, 15, y 19, como se muestra en las figuras 16A-F. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la presente invención que codifica para una cadena pesada de anticuerpo de la presente invención difiere en únicamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 nucleótidos provenientes de cualquiera de SEQ ID NOS: 03, 07, 11, 15, y 19. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la presente que codifica para una cadena pesada de anticuerpo de la presente invención comprende una secuencia de nucleótido como la indicada en cualquiera de SEQ ID NOS: 03, 07, 11, 15, y 19. Los anticuerpos no limitativos de ejemplo son los siguientes: (1) un anticuerpo designado GL001H8_7 que comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 02 y codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como la indicada en SEQ ID NO: 01, una región variable de cadena pesada de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido como se indica en SEQ ID NO: 04 y codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como la indicada en SEQ ID NO: 03; (2) un anticuerpo designado GL001H8_14 que comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 06 y codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como la indicada en SEQ ID NO: 05, una región variable de cadena pesada de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 08 y codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como la indicada en SEQ ID NO: 07; (3) un anticuerpo designado GL001H8_11 que comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 10 y codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como la indicada en SEQ ID NO: 09, una región variable de cadena pesada de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 12 y codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como la indicada en SEQ ID NO: 11; (4) un anticuerpo designado GLOOl Hl_6_2 que comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 14 y codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como la indicada en SEQ ID NO: 13, una región variable de cadena pesada de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 16 y codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como la indicada en SEQ ID NO: 15; y (5) un anticuerpo designado GLOOl Hl 12 1 que comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 18 y codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como la indicada en SEQ ID NO: 17, una región variable de cadena pesada de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácido como la indicada en SEQ ID NO: 20 y codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como la indicada en SEQ ID NO: 19. Una secuencia genómica de interés comprende el ácido nucleico presente entre el codón de inicio y el codón de terminación, como se define en las secuencias listadas, incluyendo todos los intrones que normalmente están presentes en un cromosoma original. Esta también puede incluir las regiones no traducidas 3' y 5' encontradas en el ARNm maduro. Esta también puede incluir secuencias reguladoras específicas de transcripción y traducción, tales como promotores, incrementadores, etc, incluyendo aproximadamente 1 kb, pero posiblemente más, de ADN genómico de flanqueo en cualquiera del extremo 5' o 3' de la región transcrita. El ADN genómico se puede aislar como un fragmento de 100 kpb o más pequeño; y sustancialmente libre de la secuencia cromosómica de flanqueo. El ADN genómico que flanquea la región de codificación, ya sea 3' ó 5' , o las secuencias reguladoras internas como algunas veces se encuentra en los intrones, contiene las secuencias requeridas para la expresión en tejido y específica de etapa apropiada . Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también se pueden proveer como parte de un vector (por ejemplo, una "construcción"), de los cuales se conoce una amplia variedad en la técnica y no es necesario que sean discutan en la presente invención. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos; cósmidos; vectores virales; cromosomas artificiales (YAC, BAC, etc); mini-cromosomas; y similares. Los vectores se describen ampliamente en numerosas publicaciones bien conocidas por aquellos en el campo incluyendo, por ejemplo Short Protocols in Molecular Biology, (1999) F. Ausubel, et al . , eds., Wiley & Sons. Los vectores pueden proveer la expresión de los ácidos nucleicos de la presente, pueden asegurar la propagación de los ácidos nucleicos de la presente invención, o ambos. Los genes de la presente invención se aislan y obtienen en pureza sustancial, generalmente diferentes de un cromosoma intacto. Normalmente, el ADN se puede obtener sustancialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico que no incluyen una secuencia o fragmento del mismo de los genes de la presente invención, siendo por lo general de por lo menos 50% aproximadamente, normalmente por lo menos 90% aproximadamente puros y típicamente son "recombinantes", es decir flanqueados por uno o más nucleótidos con los cuales éste normalmente no está asociado en un cromosoma normalmente presente en la naturaleza. Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención encuentran uso en la preparación de todo o una porción de un anticuerpo de la presente invención. Para la expresión, se puede utilizar un cassette de expresión. El vector de expresión puede proveer una región de inicio de transcripción y traducción, la cual puede ser inducible o constitutiva, en la cual la región de codificación está ligada en forma operable bajo el control de transcripción de la región de inicio de transcripción, y una región de terminación de transcripción y traducción. Estas regiones de control pueden ser originarias a un gen que codifica para los péptidos de la presente, o se pueden obtener a partir de fuentes exógenas. Los vectores de expresión generalmente tienen sitios de restricción convenientes ubicados cerca de la secuencia de promotor para asegurar la inserción de las secuencias de ácido nucleico que codifican para proteínas heterólogas. Puede estar presente un marcador seleccionable que pueda funcionar en el hospedero de expresión. Los vectores de expresión se pueden utilizar para la producción de proteínas de fusión, en las cuales los péptidos de fusión exógenos proveen funcionalidad adicional, es decir síntesis incrementada de proteína, estabilidad, reactividad con anti- sueros definidos, un marcador enzimático, por ejemplo ß-galactosidasa, etc. Un anticuerpo de la presente invención se puede expresar en procariotas o eucariotas de conformidad con las formas convencionales, dependiendo del propósito para la expresión. Para producción a gran escala de la proteína, se puede utilizar como las células hospederas de expresión un organismo unicelular, tal como E . coli , B . subtili s , S . cerevisiae, células de insecto en combinación con vectores de baculovirus, o células de un organismo superior tales como vertebrados, particularmente mamíferos, por ejemplo células COS 7. En algunas situaciones, es deseable expresar el ácido nucleico en células eucariotas, en las cuales la proteína codificada se beneficia de las modificaciones de pliegue originarias y de post-traducción . La presente invención provee células hospederas, incluyendo células hospederas aisladas, que comprenden un polmucleótido de la presente o un vector de la presente. En muchas modalidades, una célula hospedera de la presente invención es una célula hospedera eucariota que puede producir anticuerpo después que se modifica genéticamente con un vector de expresión de la presente. En muchas modalidades, una célula hospedera de la presente invención es una célula de hibridoma que se produce fusionando una célula productora de anticuerpo proveniente de un XenoMouse® que ha sido inmunizado con properdina con una célula que sirve como un compañero de fusión, por ejemplo, un compañero de fusión de mieloma que no produce el anticuerpo.

Métodos de tratamiento La presente invención provee métodos terapéuticos que implican el uso de un anticuerpo anti-properdina de la presente invención en métodos terapéuticos efectuados en hospederos mamíferos, incluyendo métodos para inhibir la ruta alternativa del complemento, incluyendo métodos para reducir el nivel de un polipéptido que se genera después de la activación de la ruta alternativa del complemente-métodos para reducir el nivel de complejo de ataque a membrana (MAC) ; métodos para reducir el nivel de una anafilatoxina; métodos para reducir el nivel de C3c; y métodos para tratar una enfermedad o trastorno mediado por la ruta alternativa del complemento. Los métodos generalmente implican administrar a un individuo o mamífero en necesidad de lo mismo una cantidad efectiva de un anticuerpo de la presente invención. Una "cantidad efectiva" de un anticuerpo de la presente es una cantidad que es efectiva para reducir la producción y/o nivel de un polipéptido que se genera después de la activación de la ruta alternativa del complemento en por lo menos 20% aproximadamente, por lo menos 30% aproximadamente, por lo menos 40% aproximadamente, por lo menos 50% aproximadamente, por lo menos 60% aproximadamente, por lo menos 70% aproximadamente, por lo menos 80% aproximadamente, por lo menos 90% aproximadamente, o más. Un anticuerpo de la presente invención se administra a un individuo en una formulación con un excipiente o excipientes farmacéuticamente aceptables. Se conocen en la técnica una amplia variedad de excipientes farmacéuticamente aceptables y no necesitan ser discutidos con mayor detalle en la presente invención. Los excipientes farmacéuticamente aceptables han sido descritos ampliamente en una variedad de publicaciones, incluyendo, por ejemplo, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" 20a edición, Lippincott, Williams, & Wiikins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et a l . , eds., 7a ed., Lippincott, Williams, & Wiikins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al . , eds., 3ra ed. Amer. Pharmaceutical Assoc. Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, coadyuvantes, portadores o diluyentes, están fácilmente disponibles al público. Asimismo, también están fácilmente disponibles al público sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes amortiguadores y para ajuste de pH, agentes para ajuste de tonicidad, estabilizadores, agentes humectantes y similares.

En los métodos de la presente invención, un anticuerpo de la presente se puede administrar al hospedero utilizando cualesquiera medios convenientes que puedan dar como resultado el efecto terapéutico deseado. Por lo tanto, el anticuerpo se puede incorporar en una variedad de formulaciones para administración terapéutica. De manera más particular, se puede formular un anticuerpo de la presente invención como composiciones farmacéuticas mediante combinación con vehículos o diluyentes apropiados, farmacéuticamente aceptables, y se pueden formular como preparaciones en formas sólidas, semi-sólidas, líquidas o gaseosas, tales como tabletas, cápsulas, polvos, granulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles. Como tal, la administración de un anticuerpo de la presente invención se puede lograr de diversas maneras, incluyendo administración por vía oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intramuscular, transdérmica, intranasal, pulmonar, intra-tráquea, etc. La administración por vía subcutánea de un anticuerpo de la presente invención se logra utilizando métodos y dispositivos estándar, por ejemplo, aguja y jeringa, un sistema de suministro de orificio de inyección subcutánea, y similares. La administración intramuscular se logra utilizando medios estándar, por ejemplo, aguja y jeringa, un sistema de suministro continuo, etc. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente invención se suministra mediante un sistema de suministro continuo. El término "sistema de suministro continuo" se utiliza de manera intercambiable en la presente invención con "sistema de suministro controlado" y abarca dispositivos de suministro continuo (por ejemplo, controlado) (por ejemplo, bombas) en combinación con catéteres, dispositivos de inyección, y similares, de los cuales una amplia variedad son conocidos en la técnica. También pueden ser apropiadas para uso con la presente invención bombas de infusión mecánicas o electromecánicas. Los ejemplos de dichos dispositivos incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, las patentes E.U.A Nos. 4,692,147; 4,360,019; 4,487,603; 4,360,019; 4,725,852; 5,820,589; 5,643,207; 6,198,966; y similares. En general, los métodos de suministro de fármaco de la presente invención se pueden lograr utilizando cualquiera de una variedad de sistemas de bomba, recargables. Las bombas proveen liberación consistente, controlada con respecto al tiempo . En las formas de dosificación farmacéuticas, los agentes se pueden administrar en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, o estos también se pueden utilizar solos o en asociación apropiada, así como en combinación, con otros compuestos farmacéuticamente activos. Los siguientes métodos y excipientes son solamente ejemplares y de ninguna manera son limitativos. Se puede formular un anticuerpo de la presente invención como preparados para inyección disolviendo, suspendiendo o emulsificando el anticuerpo en un solvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros aceites similares, glicéridos de ácido alifático sintéticos, esteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol, y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizadores, agentes de isotonicidad, agentes para suspensión, agentes emulsificantes, estabilizadores y conservadores . Las formas de dosificación unitaria para inyección o administración por vía intravenosa pueden comprender al inhibidor o inhibidores en una composición como una solución en agua estéril, solución salina normal u otro vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "forma de dosificación unitaria", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosificaciones unitarias para individuos, humanos y animales, en las que cada unidad contiene una cantidad predeterminada de un anticuerpo de la presente invención calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, vehículo o portador farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para las formas de dosificación unitarias de la presente invención dependen del compuesto particular empleado y del efecto que se va a lograr, y de la farmacodinámica asociada con cada compuesto en el hospedero. Un anticuerpo de la presente invención se administra a un individuo a una frecuencia y durante un período de tiempo para lograr el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, se administra un anticuerpo de la presente invención una vez por mes, dos veces por mes, tres veces por mes, cada tercer semana (qow) , una vez por semana (qw) , dos veces por semana (biw) , tres veces por semana (tiw) , cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana, cada tercer día (qod) , diariamente (qd) , dos veces por día (qid) , o tres veces al día (tid) , o en forma sustancialmente continua o continuamente, a través de un intervalo de tiempo que varía desde aproximadamente un día hasta aproximadamente una semana, desde dos semanas aproximadamente hasta cuatro semanas aproximadamente, desde un mes aproximadamente hasta dos meses aproximadamente, desde dos meses aproximadamente hasta cuatro meses aproximadamente, desde cuatro meses aproximadamente hasta seis meses aproximadamente, o un intervalo más largo.

Terapia de combinación En algunas modalidades un anticuerpo de la presente invención se administra en una cantidad efectiva en terapia de combinación con un segundo agente terapéutico. Los segundos agentes terapéuticos apropiados incluyen, pero no se limitan a, agentes anti-inflamatorios; agentes utilizados para el tratamiento de trastornos cardiovasculares; agentes anti-inflamatorios esteroidales; y similares. Los agentes anti-inflamatorios apropiados incluyen, pero no se limitan a, fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (NSAID) , acetaminofen, salicilato, ácido acetil-salicílico (aspirina, diflunisal), ibuprofen, Motrin, Naprosin, Nalfon, y Trilisato, indometacina, glucametacina, acemetacina, sulindaco, naproxen, piroxicam, diclofenac, benoxaprofen, ketoprofen, oxaprozina, etodolac, ketorolac trometamina, ketorolac, nabumetona, y similares, y mezcla de dos o más de los anteriores. Otros agentes antiinflamatorios apropiados incluyen metotrexato. Los agentes anti-inflamatorios esteroidales incluyen, pero no se limitan a, hidrocortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona, betametasona, y triamcinolona. Los agentes apropiados para indicaciones cardiovasculares incluyen inhibidores de GP Ilb-IIIa tales como Integrilin® (eptifibatide) ; aprotinin; ReoPro® (abciximab); y similares. Los segundos agentes terapéuticos apropiados incluyen beta-adrenérgicos los cuales incluyen broncodilatadores incluyendo albuterol, sulfato de isoproterenol, sulfato de metaproterenol, sulfato de terbutalina, acetato de pirbuterol y formotorol-salmeterol ; esteroides incluyendo dipropionato de beclometasona, flunisolida, fluticasona, budesonida y acetonida de triamcinolona. Los fármacos anti-inflamatorios utilizados en conexión con el tratamiento de enfermedades respiratorias incluyen esteroides tales como dipropionato de beclometasona, acetonida de triamcinolona, flunisolida y fluticasona. Otros fármacos anti-inflamatorios apropiados incluyen cromoglicatos tales como cromolin sódico. Otros fármacos respiratorios que podrían calificar como broncodilatadores incluyen anti-colinérgicos incluyendo bromuro de ipratropio. Los anti-histamínicos incluyen, pero no se limitan a, difenhidramina, carbinoxamina, clemastina, dimenhidrinato, pri-ilamina, tripelenamina, clorfeniramina, bromofeniramina, hidroxizina, ciclizina, meclizina, clorociclizina, prometazina, doxilamina, loratadina, y terfenadina. Los anti-histamínicos particulares incluyen rinolast (Astelin) , claratina (Claritin) , claratina D (Claritin D) , telfast (Allegra) , zirtec, y beconasa.

En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente se administra en forma concurrente con un segundo agente terapéutico. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "en forma concurrente" indica que el anticuerpo de la presente y el segundo agente terapéutico se administran por separado y se administran dentro de aproximadamente 5 segundos hasta aproximadamente 15 segundos, dentro de aproximadamente 15 segundos hasta aproximadamente 30 segundos, dentro de aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 60 segundos, dentro de aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 5 minutos, dentro de aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 15 minutos, dentro de aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 30 minutos, dentro de aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 60 minutos, dentro de aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 2 horas, dentro de aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 6 horas, dentro de aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 12 horas, dentro de aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 24 horas, o dentro de 24 horas aproximadamente hasta aproximadamente 48 horas aproximadamente uno del otro. En algunas modalidades, un anticuerpo de la presente se administra durante el curso completo de tratamiento con el segundo agente terapéutico. En otras modalidades, un anticuerpo de la presente se administra durante un intervalo de tiempo que traslape con aquel del tratamiento con el segundo agente terapéutico, por ejemplo, el tratamiento con anticuerpo puede comenzar antes que comience el tratamiento con el segundo agente terapéutico y termina antes que termine el tratamiento con el segundo agente terapéutico; el tratamiento con anticuerpo puede comenzar después que empiece el tratamiento con el segundo agente terapéutico y terminar después que termina el tratamiento con anticuerpo; el tratamiento con tratamiento puede comenzar después que comienza el tratamiento con el segundo agente terapéutico y terminar antes que concluya el tratamiento con el segundo agente terapéutico; o el tratamiento con anticuerpo puede comenzar antes que comience el tratamiento con el segundo agente terapéutico y termina después que termina el tratamiento con el segundo agente terapéutico .

Individuos apropiados para tratamiento Los individuos apropiados para tratamiento con un método de la presente incluyen individuos que padecen de uno o más de los siguientes trastornos: inflamación por derivación post-cardiopulmonar, infarto al miocardio, apoplejía, síndrome de dificultad respiratoria aquda (ARDS), choque séptico, rechazo de trasplante, lesión por quemadura, esclerosis múltiple, miastenia grave, trastornos cardiovasculares, y artritis reumatoide. Los individuos apropiados para tratamiento con un método de la presente invención también incluyen individuos que padecen de cualquier trastorno inflamatorio, incluyendo, pero sin limitarse a, lupus eritematoso sistémico, nefritis membranosa, pénfigo, dermatomiositis, y síndrome anti-fosfolípido. Los individuos apropiados para tratamiento también incluyen individuos sometidos a diálisis renal.

Incorporación para referencia Todas las referencias citadas en la presente invención, incluyendo patentes, solicitudes de patente, artículos, libros de textos, y similares, y las referencias citadas en los mismos, hasta el grado en que estos no lo estén, se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad. Además, las siguientes referencias también quedan incorporadas para referencia en la presente invención en su totalidad, incluyendo las referencias citadas en dichas referencias: Equivalentes La descripción anterior y los ejemplos muestran con mayor detalle algunas modalidades preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Se apreciará, sin embargo, que no importa que tan detallado pueda parecer lo anterior en el texto, la invención se puede practicar en muchas maneras y la invención se debe considerar de conformidad con las reivindicaciones anexas y cualesquiera equivalentes de las mismas.

EJEMPLOS Se brindan los siguientes ejemplos para proveer a los expertos en la técnica una descripción y divulgación completa de como hacer y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el campo de lo que los inventores consideran como su invención ni tampoco pretenden representar que los siguientes experimentos son todos o los únicos experimentos efectuados. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc) pero se deben considerar ciertos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados Celsius, y la presión es o está cerca de la presión atmosférica. Se pueden utilizar abreviaturas estándar, por ejemplo, pb, par o pares de bases; kb, kilobase o kilobases; pl, picolitro o picolitros; s, segundo o segundos; min, minuto o minutos; hr, hora u horas; y similares.

EJEMPLO 1 Preparación y caracterización de anticuerpos monoclonales anti-properdina Generalidades El objetivo de este estudio es identificar anticuerpos monoclonales (MoAbs) completamente humanos que se unan a properdina de humano con alta afinidad y bloqueen la ruta del complemento alternativa. Debido a que es importante que estos MoAbs por sí mismos no disparen la inflamación a través de activación del complemento o los receptores Fc?, se eligen como blancos cepas IgG2 e IgG4 de XenoMouse para inmunización. Se utiliza properdina de humano como el inmunógeno y varios animales XenoMouse IgG2 e IgG4 reciben inmunizaciones ya sea en la almohadilla de la pata o en la vena de la cola. Se efectúan fusiones con esplenocitos provenientes de animales tanto IgG2 como IgG4, y se determina que las muestras de sobrenadante de hibridoma IgG2 se unen a properdina de humano. Estas muestras se evalúan respecto a su capacidad para neutralizar la función de properdina. Los resultados revelan que varios de los MoAbs anti-properdina completamente humanos bloquean la función de properdina.

Materiales y métodos Generación de hibridomas Se inmunizan animales Xenomouse a través de las almohadillas de las patas para todas las inyecciones. El volumen total de cada inyección es de 50 µl por ratón, o 25 µl por almohadilla de la pata. Las inyecciones iniciales se efectúan con 10 µg de properdina de humano en DPBS libre de pirógenos, mezclada 1:1 v/v con TiterMax Gold, por ratón. Se efectúan refuerzos subsiguientes con 10 ug de properdina de humano en DPBS libre de pirógenos mezclada con 25 µg de Adju-Phos (gel de fosfato de aluminio) por ratón durante seis veces, después un refuerzo final de 10 µg de properdina de humano en DPBS libre de pirógenos sin coadyuvante por ratón. Los animales se inmunizan en los días 0, 3, 6, 10, 13, 17, 20, y 24 para este protocolo; y las fusiones se efectúan el día 29. Después del régimen de inmunización descrito anteriormente, los ratones se sacrifican, después se recuperan los nodulos linfáticos inguinal y lumbar. Los linfocitos se liberan mediante ruptura mecánica de los nodulos linfáticos utilizando una trituradora para tejido, seguido por depleción de células T mediante selección de CD90-negativo . La fusión se efectúa mezclando células B enriquecidas lavadas y células P3X63Ag8.653 de mieloma no secretoras, adquiridas de ATCC, cat. # CRL 1580 (Kearney et a l , J. Immunol . 123, 1979, 1548-1550) a una relación de 1:1. La mezcla celular se convierte suavemente en comprimidos mediante centrifugación a 800 g. Después de la remoción completa del sobrenadante, las células se tratan con 2-4 ml de solución de pronasa (CalBiochem, cat. # 53702; 0.5 mg/ml en solución salina regulada con fosfato (PBS)) durante no más de 2 minutos. Después se agregan 3-5 ml de suero fetal de bovino (FBS) para detener la actividad de la enzima y la suspensión se ajusta a 40 ml de volumen total utilizando solución para electro-fusión de célula, ECFS (0.3 M de sacarosa, Sigma, Cat# S7903, 0.1 mM de acetato de magnesio, Sigma, Cat# M2545, 0.1 mM de acetato de calcio, Sigma, Cat# C4705) . El sobrenadante se elimina después de centrifugar y las células se vuelven a suspender en 40 ml de ECFS. Este paso de lavado se repite y las células de nuevo se vuelven a suspender en ECFS hasta una concentración de 2 x 106 células/ml. La electro-fusión de célula se efectúa utilizando un generador de fusión (modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. ) . El tamaño de la cámara de fusión utilizada es de 2.0 ml utilizando los siguientes parámetros de instrumentos. Condición de alineación: voltaje: 50 v, tiempo: 50 s . Ruptura de membrana a: voltaje: 3000 v, tiempo: 30 µs .

Tiempo de retención post-fusión: 3 segundos Después de la fusión, las células se vuelven a suspender en medio para fusión de hibridoma: DMEM (JRH Biosciences), 15% de FBS (Hyclone), que contiene 0.5 x de hipoxantina azaserina (HA) (Sigma, cat. # A9666), y complementado con L-glutamina, pen/strep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina de bovino) (todos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim) para cultivo a 37°C, y 10% de C02 en aire. Las células se siembran en placas para cultivo de tejidos de 96 cavidades de fondo plano a 4 x 104 células por cavidad. Los cultivos se mantienen en medio para fusión de hibridoma durante 2 semanas antes de transferir a medio para hibridoma: DMEM (JRH Biosciences), 15% de FBS (Hyclone), y complementado con L-glutamina, pen/strep (penicilina/estreptomicina), OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina de bovino) (todos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim) . Los hibridomas se seleccionan respecto a supervivencia en medio de fusión de hibridoma 0.5x HA y los sobrenadantes provenientes de las cavidades que contienen hibridomas se tamizan respecto a reactividad a antígeno mediante prueba con inmuno-sorbente ligado a enzima (ELISA) . La clonación se efectúa en las cavidades antígeno-positivas seleccionadas utilizando siembra por dilución limitada. Las placas se inspeccionan visualmente respecto a la presencia de crecimiento de colonia individual y los sobrenadantes provenientes de cavidades de colonia individual se tamizan después utilizando pruebas ELISA específicas de antígeno como se describió anteriormente. Los clones altamente reactivos se analizan para verificar la pureza de la cadena gamma y kappa de humano mediante pruebas ELISA multiplex utilizando un instrumento Luminex.

Prueba con inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) El formato ELISA implica incubar los sobrenadantes en placas revestidas con antígenos (placas revestidas con properdina de humano) y detectar los anticuerpos de unión anti-properdina de humano, de humano, utilizando anti-lgG de humano, de ratón, marcado con peroxidasa de rábano. Todas las muestras positivas se confirman mediante dos pruebas de ELISA en paralelo, lo cual implica incubar los sobrenadantes en placas revestidas con antígeno (placas sembradas con properdina de humano) y detectar los anticuerpos de unión anti-properdina de humano, de humano utilizando anticuerpo anti-cadena gamma y kappa de humano, de ratón, marcado con peroxidasa de rábano (HRP) .

Activación del complemento con LPS-prueba C5b-9 El complemento dentro del suero de humano es activado mediante lipo-polisacárido (LPS) que ha sido inmovilizado sobre cavidades de micro-titulación. Esto da como resultado la unión covalente de C5b-9 al LPS. Brevemente, se revisten cavidades de micro-titulación (placas de unión a medio Corning Costar) con 1 µg/50 µl/cavidad de LPS proveniente de Salmonella typhosa (Sigma Chemical) en solución reguladora de bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9.5, durante la noche a 4°C. Después de aspirar la solución de LPS, las cavidades se bloquean con 1% de BSA en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Al final de esta incubación, las cavidades se lavan con PBS y se incuban con suero normal de humano al 8% en cualquiera de a) HSA al 0.4% (seroalbúmina de humano) en solución reguladora Mg++-EGTA-VBS (barbiturato de dietilo 5 mM, 120 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 5 mM de EGTA, pH 7.2) o b) HSA al 0.4% en solución reguladora de EDTA-VBS (barbiturato de dietilo 5 mM, 120 mM de NaCl, 20 mM de EDTA) . Las muestras en EDTA-VBS sirven como los controles de fondo. Las placas de micro-titulación se incuban a 37°C durante 1 hora en un baño de agua para permitir que ocurra la activación del complemento mediada por LPS. Las placas se lavan con PBS y el C5b-9 depositado se detecta agregando un anticuerpo monoclonal anti-C5b-9 de humano, de ratón, (Quidel Corp, San Diego, CA) a una dilución 1:1000 en solución bloqueadora al 1%. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavan de nuevo con PBS y se agrega un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa (Sigma, dilución 1:2000 en solución bloqueadora). Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las placas se enjuagan exhaustivamente con PBS, y se agregan 100 µl del substrato 3, 3' , 5, 5' tetrametil-bencidina (TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories) . La reacción de TMB se extingue mediante la adición de 100 µl de ácido fosfórico 1 M, y las placas se leen a 450 nm en una lectora de placas de ELISA. Se evalúa el efecto de las muestras de IgG2 sobre la formación de C5b-9 agregando 3 µg/ml de IgG a una concentración fija de suero de humano. El grado de inhibición de formación de C5b-9 se determina utilizando el sistema de detección de anticuerpo antes descrito.

Prueba de unión a C3b-properdina Se revisten placas de micro-titulación de poliestireno (placas de unión a medio de 96 cavidades, Corning Costar) con C3b de humano (0.5 µg/50 µl/cavidad; Calbiochem, San Diego, CA) en PBS durante la noche a 4°C. Después de aspirar la solución de C3b, las cavidades se bloquean con PBS que contiene 1% de BSA durante 2 horas a temperatura ambiente. Las cavidades sin recubrimiento de C3b sirven como controles de fondo. La capacidad de las muestras de IgG2 para inhibir la unión C3b-properdina se evalúa agregando diversas muestras de IgG2 (concentración final 3 µg/ml) a una concentración constante de properdina (1 nM) . Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, las cavidades se enjuagan exhaustivamente con PBS. La properdina unida a C3b se detecta mediante la adición de anticuerpo monoclonal anti-properdina de humano, de ratón, P#2 (Quidel, San Diego, CA) a una dilución de 1:1000 en solución bloqueadora, la cual se deja incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar las placas con PBS, se agrega anticuerpo anti-ratón, de cabra, conjugado con peroxidasa (dilución 1:1000 en solución bloqueadora) y se deja incubar durante 1 hora. Las placas de nuevo se enjuagan minuciosamente con PBS y se agregan 100 µl del substrato TMB. La reacción de TMB se extingue mediante la adición de 100 µl de ácido fosfórico ÍM y las placas se leen a 450 nm en una lectora de micro-placas.

Activación del complemento mediante LPS-prueba de C3c El complemento dentro del suero de humano es activado mediante lipo-polisacárido (LPS) que ha sido inmovilizado sobre cavidades de micro-titulación. Esto da como resultado la unión covalente de C3c al LPS. Brevemente, se revisten placas de micro-titulación de poliestireno (placas de unión a medio Corning Costar) con LPS de Salmonella typhosa (1 µg/50 µl/cavidad, Sigma Co . ) en solución reguladora de bicarbonato 50 mM, pH 9.5, durante la noche a 4°C. Después de aspirar la solución de LPS, las cavidades se bloquean con PBS que contiene 1% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lava con PBS y se coloca sobre hielo. Se preparan las muestras que contienen IgG (1 µg/ml) y suero normal de humano al 8% en cualquiera de solución reguladora Mg++-EGTA-GVB (13 mM de MgCl2, 13 mM de EGTA en solución reguladora de gelatina veronal, pH 7.3) o solución reguladora de EDTA-GVB (20 mM de EDTA en solución reguladora de gelatina veronal, pH 7.3) a 4°C y las muestras (50 µl/cavidad), se transfieren a las placas de micro-titulación . El complemento se activa calentando las placas de micro-titulación a 37°C durante 30 minutos. Las placas se enfrían después hasta 0°C en un baño de agua para detener la activación adicional del complemento y se lavan exhaustivamente con PBS fría-Tween (detergente no iónico Tween 20™ al 0.05% en PBS). Se agrega anti-C3c humano de conejo (DAKO #A0062, dilución 1:10,000) en PBS-seroalbúmina de bovino (BSA) (PBS que contiene 2 mg/ml de BSA) y se deja incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la placa con PBS, se agrega anti-anticuerpo de conejo, de cabra, conjugado con peroxidasa (American Qualex, dilución 1:10,000) en PBS-BSA y se deja incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se enjuaga de nuevo minuciosamente con PBS, y se agregan 100 µl de substrato TMB. La reacción de TMB se extingue mediante la adición de 100 µl de ácido fosfórico ÍM, y la placa se lee a 450 nm en una lectora de microplaca.

Resultados Se analizan once muestras respecto a su capacidad para 1) inhibir la activación de la ruta alternativa del complemento inducida por lipopolisacárido (LPS) y 2) bloquear la unión de properdina a la proteína del complemento, C3b. Las muestras están designadas como 1.1, 1.2, 1.6, 1.7, 1.11, 1.14, 1.16, 1.20, 1.21, 1.22, y 1.25 en las figuras 1, 2, y 3. Se incluye el anticuerpo monoclonal #23 (MoAb #23) como un control positivo. Varias de las muestras de sobrenadante de IgG2 ocasionan una reducción en la formación del producto de activación del complemento, C5b-9, cuando se evalúan a 3 µg/ml en la prueba de ruta alternativa activada por LPS (Fig. 1). En particular, las muestras 1.1, 1.6, 1.11, 1.16, y 1.22 causan >50% de inhibición de formación de C5b-9. Las actividades de las muestras 1.11 y 1.16 se aproximan al nivel de inhibición observado con MoAb #23, un bloqueador potente anti-IgGl de properdina de humano, de múrido, que se incluye como un control positivo en la prueba. El análisis de las muestras de sobrenadante en la prueba de unión de C3b-properdina revela una concordancia general con los resultados de la prueba de activación por LPS. En particular, las muestras 1.6, 1.11 y 1.22 causan 50% o más de inhibición de unión de properdina a C3b (Fig. 2) . Como un aspecto interesante, las muestras 1.1 y 1.16, las cuales son activas en la prueba de activación por LPS, muestran poca actividad en la prueba de unión de C3b-properdina . Esto sugiere que éstas muestras pueden bloquear la función de ruta alternativa del complemento sin alterar la unión de properdina a C3b. También se analizan en esta prueba las muestras que contienen concentraciones bajas de IgG2 a las concentraciones más altas practicables. Los resultados de este análisis, los cuales se presentan en forma resumida en la tabla 1, indican que la muestra 1.12 es un inhibidor efectivo de la unión de C3b-properdina , debido a que 0.25 µg/ml ocasionan un efecto significativo. Dada la concentración relativamente baja que se analiza, también parece ser que la muestra 1.13 tiene actividad bloqueadora apreciable.

TABLA 1 Análisis de muestras de IgG2 diluidas en una prueba de unión de C3b-Properdina Se utiliza una segunda prueba de ruta alternativa del complemento para confirmar que las muestras 1.1 y 1.16 pueden inhibir la activación del complemento, aún cuando éstas no bloquean la unión de C3b-properdina . Esta prueba también se basa en la activación del complemento por LPS, pero mide la formación del producto de activación, C3c, en lugar de C5b-9. Se debe mencionar que esta prueba se efectúa con 1 µg/ml de las muestras en lugar de los 3 µg/ml utilizados en los ejemplos previos. En concordancia con los resultados presentados en la figura 1, las muestras más activas en la prueba de C3c son 1.11 y 1.16 (Figura 3) . Además, la muestra 1.6 parece inhibir parcialmente la activación de la ruta alternativa. Ninguna de las muestras es tan activa como MoAb #23 anti-properdina de referencia.

Sin embargo, debido a que éstas muestras probablemente sean mezclas de clones, puede haber copias múltiples de IgG2 en cada sobrenadante de muestra. La observación que la muestra 1.16 es activa en dos pruebas funcionales separadas, pero inactiva en la prueba de unión de C3b-properdina, parece confirmar que este MoAb está actuando mediante un mecanismo exclusivo. Las líneas antes mencionadas que presentan actividad en las pruebas anteriores se clonan y se evalúan adicionalmente para confirmar su potencia para inhibir la activación del complemento. De manera más específica, se clonan las líneas 1.16, 1.11, 1.22, y 1.6 y se vuelven a evaluar. Se determina que los clones de las líneas 1.16, 1.22, y 1.11 son inhibidores sólo parciales de la generación de C3c. Con base a dichos resultados, no se efectúan estudios adicionales sobre los clones derivados de las líneas 1.16, 1.22, y 1.11. Sin embargo, se determina que los clones de la línea 1.6 son inhibidores potentes de la generación de C3c. El clon candidato principal proveniente de la línea 1.6 se designa como 1.6.2.1.3 y se analiza adicionalmente para determinar su eficacia para inhibir la activación del complemento.

EJEMPLO 2 Anticuerpos monoclonales anti-properdina inhiben la generación de C3c y sC5b-9 en suero de humano al 8% Materiales y métodos Prueba ELISA para C3c y sMAC de humano Se utiliza LPS L6386 de S. typhosa de Sigma (25 mg/muestra) . Se disuelve LPS (3 mg) en 1 ml de solución reguladora de carbonato, y se diluye hasta 20 µg/ml en solución reguladora de carbonato (dilución 1:150). La solución de reserva de LPS se prepara antes de utilizar. Las cavidades se revisten durante la noche a 4°C con 50 µl/cavidad de LPS a 20 µg/ml en solución reguladora de carbonato 50 mM, pH 9.5 (1 µg LPS/cavidad) . La solución reguladora de carbonato se prepara disolviendo 0.265 g de Na2C03 en 50 ml de H20 estéril para la solución de reserva 50 mM. Se prepara solución reguladora AP (13 mM de EGTA, 13 mM de MgCl2 en solución reguladora de gelatina Veronal (Sigma-Aldrich, Número de Catalog: G6514) pH 7.3). Como un control negativo, se utiliza 13 mM de EDTA en solución reguladora de Gelatina Veronal. El suero de humano (QED BioScience, Inc.) se prepara diluyendo suero de humano hasta 16% con solución reguladora AP, o con solución reguladora de EDTA-Gelatina Veronal. Las muestras de anticuerpo se diluyen hasta una concentración de 180 µg/ml en BSA-PBS 2 mg/ml y se etiqueta como RESERVA A. Las soluciones de reserva B, C, y D se elaboran preparando diluciones 1:10 en serie de la solución de reserva A en BSA-PBS 2 mg/ml. Las pruebas ELISA se efectúan de la siguiente manera. Se revisten las cavidades de una placa de microtitulación de 96 cavidades con 1 µg de LPS recién preparado en un volumen de 50 µl por cavidad. Las placas se incuban durante la noche a 4°C. Las cavidades se lavan 3 veces con 200 µl de PBS. Se agregan 100 µl de solución reguladora para bloqueo (30 ml de PBS, 300 mg de BSA, es decir BSA al 1%); y las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavan 3 veces utilizando 200 µl de PBS. Las placas se mantienen posteriormente en hielo, y se agregan 50 µl de muestra por cavidad (por cuadruplicado) . Las placas se incuban durante 30 minutos a 37 °C en un baño de agua. La reacción se detiene transfiriendo la placa del baño de agua hacia una cubeta de hielo con una mezcla de hielo-agua. La muestra de sobrenadante se recolecta en un tubo de 0.7 ml sobre hielo para las pruebas ELISA subsiguientes para C3a y sC5b-9. La muestra se almacena a -70°C. Las cavidades se lavan 3 veces utilizando 200 µl de PBS-Tween 20 helada (Tween 20 al 0.5% en PBS- 250 µl de Tween 20 en 500 ml de PBS) . Los lavados se efectúan sobre hielo. Las cavidades se lavan dos veces con 200 µl de PBS a temperatura ambiente. Se agregan 100 µl/cavidad de una dilución 1:10,000 de anti-C3c de humano, de conejo, DAKO A0062 (Ab primario) en PBS-BSA (2 mg/ml) . Las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las cavidades se lavan 5 veces con 200 µl de PBS. Se agegan 100 µl de una dilución 1:10,000 de anti-lgG de conejo, de cabra conjugado con peroxidasa de American Qualex (A102PU) (anticuerpo secondario) en PBS- 2mg/ml de BSA. Se prepara una solución que contiene 2.2 µl de anticuerpo. Las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las placas se lavan 5 veces con 200 µl de PBS. Se agrega substrato pre-calentado a temperatura ambiente (100 µl/cavidad), y las placas se incuban durante 5 minutos aproximadamente (a temperatura ambiente) . La reacción se detiene con 100 µl de H3P04 ÍN y se mide la D045o.

Resultados Los resultados se muestran en las figuras 4 y 5. La figura 4 demuestra una inhibición dependiente de la dosis de la producción de sMAC en una prueba de LPS in vi tro utilizando anticuerpos anti-properdina. Como se demostró anteriormente, utilizando un anticuerpo de control de PK de isotipo, no se observa inhibición de producción de sMAC. Un anticuerpo completamente intacto anti-properdina (clon 1.6.2.1.3) o anticuerpo F(ab)'2 presenta inhibición casi completa de producción de sMAC a una concentración de 10 µg/ml. La figura 5 demuestra una inhibición dependiente de la dosis de la producción de C3a en una prueba de LPS in vi tro utilizando anticuerpos anti-properdina. Como se mostró anteriormente, utilizando un anticuerpo de control de PK de isotipo, no se observa inhibición de producción de sMAC. Un anticuerpo completamente intacto anti-properdina (clon 1.6.2.1.3) o anticuerpo F(ab)'2 presenta inhibición significativa de producción de C3a a una concentración de 10 µg/ml.

EJEMPLO 3 Efectos de anticuerpos monoclonales anti-properdina sobre la inhibición de activación del complemento en un modelo de bucles de tubo de derivación cardiopulmonar Diseño experimental En este experimento, se llenan bucles de tubo con 1.5 ml de sangre diluida proveniente de un voluntario sano. Los bucles de tubo se hacen girar verticalmente en un baño de agua a 37 °C durante 2 horas para permitir que ocurra la activación del complemento. Las muestras de sangre provenientes de los bucles de tubo se transfieren a tubos de polipropileno previamente cargados con EDTA para determinar la activación del complemento. La adición de EDTA evita la activación adicional del complemento que de otra manera ocurriría durante el procesamiento de la muestra. Las muestras de sangre se centrifugan para separar el plasma y se toman alícuotas para análisis.

Materiales/Reactivos Se recolecta sangre (25 ml) en un tubo de polipropileno de 50 ml que contiene 125 µl de heparina porcina. La sangre se diluye 1:1 con plasmalyte-148 (Baxter Healthcare Corporation) para una concentración final de heparina de 2.5 unidades por ml de sangre diluida. A cada tubo se agregan 700 µl de PBS (sin tratar), anticuerpo intacto, o anticuerpo F(ab)'2 (concentración final de 200 µg/ml o 133 µg/ml respectivamente) . Como un control negativo, se agregan 1.5 ml de sangre diluida a un tubo de polipropileno que contiene 48 µl de EDTA (concentración final 20 mM) . La muestra de control negativo no se agrega al bucle de tubo y representa un control de fondo. El tubo de polietileno (41.9 cm) se llena con 1.5 ml de muestra de sangre y se cierra como un bucle con una pieza de tubo de silicón. El tubo se incuba en un baño de agua a 37°C, y se hace girar verticalmente. Después de las 2 horas de incubación a 37°C, se toman alícuotas de las muestras de sangre y se colocan en tubos de polipropileno (4.0 ml de capacidad) previamente cargados con EDTA 0.5 M (concentración final de EDTA de 20 mM) . Las muestras de sangre se centrifugan a 4°C (2,500 G durante 20 minutos) para recolectar el plasma. Se evalúan los niveles de C3a, sMAC, y C5a mediante ELISA.

Resultados Los resultados se muestran en las figuras 6, 7, y 8. La figura 6 ilustra la producción de los niveles de sMAC en el modelo de bucle de tubo utilizando sangre diluida 1:1 en plasmalyte-148. Este estudio demuestra que los niveles de sMAC se incrementan rápidamente y llegan a un máximo a las 2 horas. La figura 7 ilustra la producción de los niveles de C3a en el modelo de bucle de tubo utilizando sangre diluida 1:1 en plasmalyte-148. Este estudio demuestra que los niveles de C3a se incrementan rápidamente y llegan a un máximo a las 3 horas. La figura 8 demuestra que los anticuerpos anti-properdina inhiben de manera efectiva la producción de C3a en el modelo de bucle de tubo en una manera dependiente de la dosis. En el estudio anterior, se evalúan un anticuerpo completamente intacto (clon 1.6.2.1.3), un anticuerpo F(ab)'2, y un anticuerpo Fab anti-properdina. Todos los anticuerpos antes mencionados proveen inhibición casi completa de la producción de C3a a una concentración de 10 µg/ml de sangre.

EJEMPLO 4 Efectos de anticuerpos monoclonales anti-properdina sobre el complemento en sangre expuesta a circulación extracorpórea Diseño experimental Se genera un fragmento de anticuerpo F(ab')2 monoclonal anti-properdina completamente humano para evaluar su capacidad para inhibir la activación del complemento en un modelo de CPB. De manera más específica, el estudio mostrado más adelante está diseñado para evaluar los efectos del anticuerpo F(ab')2 anti-properdina sobre la activación del complemento en sangre expuesta a circulación extracorpórea mediante el uso de unidades de derivación cardiopulmonar pediátricas (CPB). Brevemente, los circuitos de derivación pediátricos se ensamblan en una manera que sea consistente con su uso durante la práctica clínica. Se corren simultáneamente dos circuitos con sangre humana tratada con heparina recién recolectada, utilizando una bomba de rodillos común, oxigenador y regulador de temperatura. La sangre en uno de los circuitos paralelos se trata con el anticuerpo F(ab')2 anti-properdina, mientras que la sangre en el otro circuito se trata con un anticuerpo igualado con isotipo. A intervalos regulares durante el procedimiento de CPB simulado, se recolectan muestras de sangre para permitir la medición de los productos de activación del complemento.

Método de prueba (1) Los circuitos extracorpóreos se ensamblan utilizando un oxigenador de membrana pediátrico de fibra hueca con un módulo de intercambiador de calor integrado (D 901 Lilliput 1; Dideco, Mirándola, Italia), un depósito venoso pediátrico con un filtro integrado para cardiotomia (D754 Venomidicard; Dideco), un conjunto de tubería para perfusión (Sorin Biomedical, Inc., Irvine, CA) y una bomba de rodillos de flujo múltiple. Para permitir la comparación precisa del efecto de la adición de anticuerpo de prueba y de control a la sangre, cada experimento consiste en correr simultáneamente ambas muestras de sangre en circuitos extracorpóreos paralelos utilizando la misma bomba de rodillos de flujo múltiple. (2) El día del experimento, se extrae sangre de humano entera fresca (2 volúmenes de ~225 mL cada uno) en bolsas de transferencia que contiene heparina porcina (1125 unidades) . Antes de la participación, se requiere que los voluntarios satisfagan los siguientes criterios de ingreso: Criterios de inclusión 1. Individuos de género masculino 2. Clase nominal 1 (normal, sano) conforme a los lineamientos de la Sociedad Norteamericana de Anestesiólogos (ASA) 3. Con edad entre 18 y 65 años de edad 4. Peso de por lo menos 50 kg Criterios de exclusión 1. Que haya donado sangre en las últimas 8 semanas 2. Que actualmente esté tomando fármacos que puedan inhibir la agregación de plaquetas 3. Presión sanguínea, frecuencia del pulso, temperatura, o hematocrito anormales antes de la extracción (3). El anticuerpo F(ab')2 anti-properdina o el agente de control de anticuerpo igualado a isotipo se agregan a las bolsas de transferencia después de la recolección. Las bolsas de transferencia se pesan con el fin de determinar la cantidad exacta de sangre utilizada en cada circuito. La cantidad total de heparina utilizada debe ser de 5 unidades por ml de sangre. (4) . Antes de la adición de sangre al circuito extracorpóreo, se retiran dos muestras de sangre de 1.5 ml de la bolsa de transferencia y se mezclan con un volumen igual de plasmalyte-148. Esta muestra de sangre diluida se trata como se describe en el paso 7 más adelante. Esta muestra representa t = 0 minutos. (5) . Los circuitos de CPB se ceban con 450 mL de plasmalyte-148 a 32°C y se hacen circular a 500 mL/min mientras el barrido de flujo de gas se mantiene a 0.25 litros por minuto utilizando oxígeno al 100%. El gas de barrido se cambia a una mezcla de oxígeno (95%) y dióxido de carbono (5%) después que se agrega la sangre al circuito. Una vez que se ceba el sistema, se agregan 200 ml de sangre al depósito a través del orificio para cebar. Después de agregar la sangre, se extraen simultáneamente 250-mL de fluido para cebar (plasmalyte-148 ) alejado de la salida del oxigenador para obtener un volumen final del circuito de 400 mL . Se registran continuamente el pH, pC02, p02 y temperatura del material perfundido a lo largo de de todo el periodo de recirculación. La sangre se hace circular con el fluido para cebar para permitir el mezclado completo durante 3 minutos. Al concluir los 3 minutos, se recolecta una alícuota de 3 ml de la mezcla sangre : plasmalyte-148 (1:1) circulada a partir del circuito (t = 3 min) . (Nota, que la concentración final de heparina, después de diluir con el fluido para cebar es 2.5 unidades de heparina/mL de sangre diluida). (6) . Para imitar los procedimientos de operación quirúrgica bajo hipotermia, se sigue el siguiente protocolo para enfriar y volver a calentar la sangre. Después de mezclar la sangre y plasmalyte-148 , la sangre: a) se enfría a 27°C en un lapso de 5 minutos; b) se hace circular a través del circuito CPB durante 60 minutos; c) se vuelve a calentar a 37°C en un lapso de 30 minutos. (7) . Se recolectan dos muestras de sangre de 1.5 ml a diversos intervalos de tiempo a partir de cada circuito de CPB (3, 8, 15, 30, 40, 50, 60, 68, 80, 90, y 98 minutos, así como una muestra terminal). Se observa el horario mostrado en la tabla 2 : TABLA 2 (8). Inmediatamente después de recolectar las muestras de sangre, las dos muestras se centrifugan en forma individual a 2000 x g a 4°C para separar el plasma. (9) . Las muestras de plasma resultante se congelan en hielo seco y se almacenan a -80°C para análisis posterior en las pruebas de activación del complemento.

Resultados Los resultados se muestran en las figures 9 y 10. La figura 9 ilustra los efectos de anticuerpos anti-properdina en un modelo de CPB ex vivo . De manera más específica, se evalúan un anticuerpo completamente intacto (clon 1.6.2.1.3), un anticuerpo F(ab)'2 y un anticuerpo Fab anti-properdina a diversas concentraciones para determinar la eficacia en la inhibición de activación del complemento. Estos resultados representan los valores promedio de C3a provenientes de varios individuos para cada cohorte respectivo como se indica en la figura. Las desviaciones estándar se representan como barras verticales. Es evidente una activación pronunciada del complemento en el estudio anterior según se mide mediante los niveles de C3a en las muestras de control. Se observa una inhibición significativa de los niveles de C3a cuando se utiliza un anticuerpo anti-properdina completamente intacto (dosis de 200 µg/ml de sangre), así como cuando se evalúan dosis equivalentes molares de F(ab) '2 a 133 µg/ml de sangre. También es importante mencionar que se observa un nivel equivalente de inhibición con el anticuerpo F(ab) '2 a una dosis de 25 µg/ml. Por último, este estudio también demuestra que un anticuerpo Fab anti-properdina inhibe en forma efectiva la producción de C3a en el modelo anterior. En forma sorpresiva, el anticuerpo Fab demuestra eficacia a una dosis tan baja como 3 µg/ml de sangre. La figura 10 ilustra los efectos de anticuerpos anti-properdina en un modelo de CPB ex-vivo . De manera más específica, se evalúan un anticuerpo completamente intacto (clon 1.6.2.1.3), un anticuerpo F(ab) '2, y un anticuerpo Fab anti-properdina a diversas concentraciones para determinar la eficacia para inhibir la activación del complemento. Estos resultados representan los valores promedio de C3a provenientes de varios individuos para cada cohorte respectivo como se indica en la figura. Las desviaciones estándar se representan como barras verticales. Es evidente una activación pronunciada del complemento en el estudio anterior según se mide con los niveles de sMAC en las muestras de control. Se observa una inhibición significativa de los niveles de sMAC cuando se utiliza un anticuerpo anti-properdina completamente intacto (dosis de 200 µg/ml de sangre) , así como cuando se evalúa una dosis equivalente molar de F(ab) '2 a 133 µq/ml de sangre.

Estos resultados son consistentes con los hallazgos observados al medir los niveles de C3a. También es importante mencionar que se observa un nivel equivalente de inhibición con el anticuerpo F(ab)'2 a una dosis de 25 µg/ml. Por último, este estudio también demuestra que un anticuerpo Fab anti-properdma inhibe en forma efectiva la producción de sMAC en el modelo anterior. En forma sorpresiva, el anticuerpo Fab demuestra una eficacia a una dosis tan baja como 3 µg/ml de sangre. El análisis de alta resolución Biacore se efectúa en anticuerpos anti-properdma utilizando properdma de humano. Se registran las mediciones de afinidad para los anticuerpos intacto, Fab, y F(ab)'2 anti-properdina . Los datos se presentan en la siguiente tabla 3.

TABLA 3 Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a las modalidades específicas de la misma, los expertos en la técnica deben entender que se pueden hacer diversos cambios y se pueden sustituir equivalentes sin alejarse del alcance y campo verdadero de la invención. Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptar una situación, material, composición de materia, procedimiento, paso o pasos de procedimiento particulares al objetivo, alcance y campo de la presente invención. Se pretende que todas de dichas modificaciones queden dentro del campo de las reivindicaciones anexas a la presente invención .

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo humano aislado que se une específicamente a properdina.

2.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

3.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) que comprende una secuencia de aminoácido que se elige a partir de SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, y SEQ ID NO:41.

4. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) que comprende una secuencia de aminoácido que se elige a partir de SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO:64, y SEQ ID NO:69.

5.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1 que comprende SEQ ID NO: 31, una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 36, y una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 41; y porque dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende una CDRl que comprende SEQ ID NO: 59, una CDR2 que comprende SEQ ID NO: 64, y una CDR3 que comprende SEQ ID NO: 69.

6.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia de aminoácido con SEQ ID NO: 14; y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia de aminoácido con SEQ ID NO: 16.

7. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo se selecciona a partir de un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento Fab, y un fragmento F(ab')2.

8.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se une específicamente a un epítope dentro de una repetición tipo 1 de tromboespondina de properdina.

9.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha properdina es properdina de humano.

10.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo inhibe la unión de properdina al componente C3b del complemento .

11.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo se produce mediante una célula productora de anticuerpo proveniente de un xenomouse.

12.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una región constante que comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 85% aproximadamente idéntica a una secuencia de aminoácido de región constante de un anticuerpo humano presente en la naturaleza.

13.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una región de marco que comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 85% aproximadamente idéntica a una secuencia de aminoácido de región de marco de un anticuerpo humano presente en la naturaleza.

14.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una marca detectable.

15.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la marca detectable se selecciona a partir de una enzima, una marca fluorescente, y una marca bioluminiscente.

16.- Una composición que comprende un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.

17.- La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque dicha composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

18.- Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica para un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.

19.- Un vector de expresión que comprende al polinucleótido de conformidad con la reivindicación 18.

20.- Una célula hospedera aislada que comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 18.

21.- Una célula hospedera aislada que comprende un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 19.

22.- El uso de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para inhibir la activación de la ruta alternativa del complemento en un hospedero mamífero.

23.- El uso de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque se reduce el nivel de uno o más de C3C, complejo de ataque a membrana, y anafilatoxina .

24.- El uso de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la anafilatoxina se selecciona a partir de C3a y C5a.

25.- El uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno mediado por la ruta alternativa del complemento en un hospedero mamífero.

26.- El uso de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque dicho anticuerpo se administra con un segundo agente anti-inflamatorio.

27.- El uso de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el trastorno mediado por la ruta alternativa del complemento se selecciona a partir de inflamación, síndrome de dificultad respiratoria aguda, inflamación por derivación post-cardiopulmonar, choque séptico, rechazo de transplante, daño por quemadura, lupus eritematoso sistémico, nefritis membranosa, pénfigo, dermatomiositis, y síndrome anti-fosfolípido .