MX2007004660A - Uso de 4-(4-metilpiperazin-1-ilmetil)-n-[4-metil-3-(4-(piridin-3- il)pirimidin-2-ilamino)fenil]-benzamida para inhibir el receptor de tirosina cinasa c-fms. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere al uso de 4-(4-metilpiperazin-1-ilmetil) -N-[4-metil-3-(4-(piridin-3-il)pirimidin-2-ilamino)fenil]- benzamida, (tambien conocido como imatinib, gleevec, glivec, cgp57148b u8TI1571), o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con c-fms incluyendo: coriocarcinoma, histiocitosis maligna, carcinoma embrional, carcinoma endometrico, tumores microgliales de cerebro, sarcoidosis, envolvimiento de celulas microgliales en enfermedad de Creutzfeld-Jacob normal y variante y esclerosis lateral amiotrofica.

Description

USO DE 4-(4-METI LPIPERAZIN-1 -IL ETIL)-N-r4-METIL-3-(4-(PIRIDIN- 3-IL.PIRIMI DIN-2-ILAMI NO)FENIL1-BENZAMIDA PARA IN HI BIR EL RECEPTOR DE TIROSINA CINASA C-FMS La presente invención se refiere al uso de 4-(4-metilpiperazin- 1 -ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-(p¡ridin-3-¡l)p¡rimidin-2-ilamino)fenil]-benza ¡da (Compuesto I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con c-fms. El factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF o CSF-1 ) , descrito ¡nicialmente como un factor de crecimiento del linaje fagocítico mononuclear, también participa en las reacciones inmunológicas e inflamatorias, metabolismo óseo y embarazo. Las actividades biológicas de M-CSF son mediadas por un receptor de tirosina cinasa c-fms. C-fms es una tirosina cinasa de proteína inducible de ligando y pertenece a la subfamilia de receptor l ll . El proto-oncogene de c-fms codifica el único receptor conocido para el factor estimulante de colonias de macrófagos-1 (CSF-1 ) . Consiste de un dominio de transmembrana simple, el cual separa la parte extracelular, es decir, el dominio de unión de ligando que contiene cinco repeticiones de inmunoglobulina del dominio de tirosina cinasa intracelular compuesto por dos partes que flanquean una secuencia de inserción no catalítica, la inserción de cinasa. El par de M-CSF o CSF-1 /c-fms de receptor de tirosina cinasa tiene funciones fisiológicas esenciales en diferenciación de monocitos y macrófagos, implantación embriogénica, desarrollo de placenta y diferenciación lactogénica del pecho humano. El mRNA humano para proto-oncogene de c-fms es X03663 como es accesible en ENTREZ www. ncbi. nlm. nih .gov. y ver Coussens L et al . , Nature 1 986, 320(6059) 277-280. La sobre-expresión anormal de M-CSF y c-fms, mRNA y proteínas, es detectada en tumores primarios de origen epitelial. La expresión anormalmente alta del c-fms de receptor de tirosina cinasa ha sido asociada con comportamiento agresivo en una variedad de malignidades, incluyendo cáncer de pecho, próstata , ovario y endometrio. 4-(4-metilpiperazin-1 -ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-(piridin-3-il)pirimidin-2-ilamino)fenil]-benzamida, referida en la presente a continuación como, Compuesto I , es un inhibidor de proteína cinasa que muestra alta eficacia en el tratamiento de leucemia mieloide crónica , abreviada como CML y tumores estromales gastrointestinales, abreviados como GIST. El Compuesto I enfoca la tirosina cinasa CML-específica bcr-abl pero también es un potente inhibidor del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-R) , el factor de cél ula tronco (c-kit), c-abl y gene relacionado con abl (ARG). En contraste con receptores de tirosina cinasa c-kit y PDGFRbeta, la fosforilación del receptor M-CSF, c-fms, fue reportada como no afectada por el Compuesto I . El Compuesto I nunca ha sido descrito como útil para la inhibición de c-fms o para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con c-fms. El Compuesto I es 4-(4-metilpiperazin-1 -ilmet¡l)-N-[4-metil-3-(4- (piridin-3-il)pirimidin-2-ilamino)fenil]-benzamida teniendo la siguiente fórmula La preparación de la 4-(4-metilpiperazin-1 -ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-(piridin-3-il)pirimidin-2-ilamino)fenil]-benzam¡da es descrita en EP-A-0 564 409. Las sales farmacéuticamente aceptables del Compuesto I son sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, con ácidos inorgánicos, tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, o con ácidos sulfónicos o carboxílicos orgánicos adecuados, por ejemplo, ácidos mono- o di-carboxílicos alifáticos, tales como, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido hidroximaleico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico o ácido oxálico o aminoácidos, tales como arginina o lisina, ácidos carboxílicos aromáticos, tales como ácido benzoico, ácido 2-fenoxi-benzoico, ácido 2-acetoxi-benzoico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácidos carboxílicos aromáticos-alifáticos, tales como, ácido mandélico o ácido cinámico, ácidos carboxílicos heteroaromáticos, tales como, ácido nicotínico o ácido isonicotínico, ácidos sulfónicos alifáticos, tales como, ácido metano-, etano- o 2-hidroxietano-sulfónico, o ácidos sulfónicos aromáticos, por ejemplo, ácido benceno, p-tolueno o naftaleno-2-sulfónico. La sal de adición de ácido monometanosulfónico de Compuesto I , de aquí en adelante referida como "Sal I", y formas cristalinas de la misma, por ejemplo, la forma de cristal alfa y la forma de cristal beta, se describen por ejemplo, en la solicitud de patente PCT WO99/03854 publicada el 28 de enero de 1 999 y en la patente europea no. 998 473. Todas las referencias WO (número) hacen referencia a las publicaciones WI PO de las aplicaciones de patente PCT de las referencias correspondientes. De manera sorprendente se ha encontrado ahora que el Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo, Sal I , es capaz de inhibir el receptor de tirosina cinasa c-fms que pertenece a la subfamilia de receptores I I y que está involucrado en la proliferación de una línea de células dependientes de M-CSF. La presente invención se refiere al uso del Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo, Sal I , para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con c-fms, por ejemplo, enfermedades neoplásticas asociadas con c-fms y enfermedades no neoplásticas asociadas con c-fms. La presente invención se refiere al uso de Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo, Sal I , para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cánceres asociados con c-fms, por ejemplo, cáncer ovárico asociado con c-fms, por ejemplo, carcinomas serosos ováricos asociados con c-fms o carcinomas ováricos epiteliales avanzados asociados con c-fms. La presente invención se refiere al uso de Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo, Sal I , para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de pecho asociado con c-fms. La presente invención se refiere al uso de Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo, Sal I , para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades de metabolismo óseo asociado con c-fms. La presente invención se refiere al uso de Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo Sal I , para la preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de metástasis asociada con c-fms, por ejemplo, metástasis asociada con c-fms a los huesos, por ejemplo, metástasis ósea asociada con c-fms en cáncer de pecho. La presente invención se refiere al uso de Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo, Sal I , para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias asociadas con c-fms, por ejemplo, artritis reumatoide asociada con c-fms. Por enfermedad asociada con c-fms se quiere decir una enfermedad en la cual c-fms está involucrada, especialmente en la cual la proteína o mRNA de c-fms o ambos se sobre-expresan en comparación con el paciente que no tiene una enfermedad relacionada con c-fms. La presente definición también abarca los casos donde el nivel de ligando del receptor de c-fms es sobre-expresado y el caso donde el receptor de c-fms es activado constitutivamente. Por enfermedades neoplásticas asociadas con c-fms se quiere decir las siguientes enfermedades en las cuales c-fms está involucrada: coriocarcioma, carcinoma hepatocelular, cáncer de pecho, histiocitosis maligna, leucemia míeloide aguda, carcinoma embrional , carcinoma de vejiga, carcinoma renal, carcinoma de próstata, cáncer gástrico, carcinoma endométrico, tumores microgliales de cerebro, melanoma y metástasis. Por enfermedades no neopláticas asociadas con c-fms se quiere decir artritis reumatoide, sarcoidosis, envolvimiento de células microgliales en enfermedad de Creutzfeld-Jacob normal y variante, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica y aterosclerosis. Una modalidad de la invención se refiere al uso de Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad asociada con c-fms seleccionada del grupo que consiste de coriocarcinoma, histiocitosis maligna, carcinoma enbriónico, carcinoma endométrico, tumores microgliales de cerebro, sarcoidosis, envolvimiento de células microgliales en enfermedad de Creutzfeld-Jacob normal y variante o esclerosis lateral amiotrófica. De acuerdo con una modalidad de la invención , el Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo, Sal I , es administrado al paciente. Las dosificaciones son expresadas como la dosis de base libre de Compuesto I administrada, por ejemplo, para una dosis de 1 00 mg , 1 1 9.5 mg de Sal I son administrados correspondientes a 100 mg de base libre de Compuesto I . Por ejemplo, una dosis de 400 mg de Compuesto I tiene que ser entendida como 478 mg de Sal I siendo administrada correspondiente a 400 mg de base libre de Compuesto I . Dependiendo de la especie, edad, condición individual, modo de administración, el panorama clínico en cuestión , las dosis efectivas de Compuesto I , por ejemplo, dosis diarias de aproximadamente 1 00-1000 mg, por ejemplo 200 hasta 800 mg, por ejemplo, 200-600 mg, por ejemplo, 400 mg de Compuesto I , son administrados a animales de sangre caliente de aproximadamente 70 kg de peso corporal . Para pacientes adultos que albergan una enfermedad mediada por c-fms o asociada con c-fms, una dosis inicial de 200-400 mg de Compuesto I diariamiente puede ser recomendada. Para pacientes con una respuesta inadecuada después de una valoración de respuesta a terapia con 400 mg de Compuesto I diarios, la escalación de dosis puede ser considerada segura y pacientes pueden ser tratados siempre y cuando se beneficien del tratamiento y en la ausencia de toxicidades limitantes. En esta forma, por ejemplo, alguien de habilidad en la técnica puede determinar una dosis efectiva de Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo a ser administrada al paciente.

De acuerdo con la presente invención, el mesilato de Compuesto I (Sal I) , por ejemplo, en la forma de cristal alfa, en la forma de cristal beta, o mezcla de las mismas, es administrado al paciente en necesidad de un tratamiento de una enfermedad asociada con c-fms.

Ejemplo 1 : Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo inhibe la actividad de tirosina cinasa del receptor de factor estimulante de colonias de macrófagos c-fms a concentraciones clínicamente relevantes. Materiales y métodos Aislamiento de células mononucleares de médula ósea (BMMNC). Médula ósea (BM) normal es aspirada de la cresta iliaca posterior de voluntarios saludables siguiendo un consentimiento informado. Las células mononucleares de médula ósea de baja densidad son recolectadas por centrifugación sobre Ficoll-Hypaque (Lymphoprep, 1 .077 g/dl ; Nycomed Pharma) a 400 g durante 30 min. Aislamiento de células CD34*. Las células progenitoras CD34+ (>90% puras) son aisladas de BMMNC usando un kit de aislamiento de selección de células progenitoras CD34+ MCS® (Miltenyi Biotech) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ensayos de colonias hemopoyéticas. Las células CD34+ o BMMNC son ensayadas para formación de colonias en agar semi-sólido, usando una modificación de Johnson G. R. 1980. J Cell Physiol 1 03: 371 -383. Brevemente, 5.0x1 04 BMMNC 0 7.5x103 de células CD34+ son platinadas por placa de cultivo celular de 35 mm (Falcon), en 1 .0 ml de IMDM (JRH Biosciences) complementado con 0.33% de agar (Bacto R Agar, Difco), 25% de FCS y 2mM de L-glutamina. El crecimiento de colonias es estimulado por la adición de 4 factores de crecimiento ((4HGF) IL-3, IL- 6, G-CSF, GM-CSF, cada uno a una concentración final de 10 ng/ml (Peprotech), 5 factores de crecimiento ((5HGF) IL-3, IL-6, G-CSF, GMCSF, factor de células tronco (SCF) , cada uno a una concentración final de 1 0 ng/ml) (Peprotech) , M-CSF (25 ng/ml) o GM-CSF (1 0 ng/ml) (Peprotech). El Compuesto I (0.3 µM a 30 µM), anticuerpos anti-c-fms (2-4A5, Santa Cruz Biotechnology Inc) (1 µg/ml), o anticuerpos anti-c-kit (Sigma) (1 µg/ml) también son adicionados a cultivos de colonias. Los cultivos son incubados en una cámara humidificada a 37°C + 5% CO2 durante un periodo de 2 semanas, después de lo cual se fijan en 3% de glutaraldehído. Los cultivos fijados son manchados secuencialmente por naftol acetato esterasa , por ejemplo, como se describe en Lojda, Z. et al. , 1979, Enzyme histochemistry: a laboratory manual (Histoquímica de enzimas: un manual de laboratorio), Springer-Verlag, Berlín, y cloroacetato esterasa, ver por ejemplo, Kubota K. et al. , 1980, Exp. Hematol . 8:339-44, entonces se mancharon con tinte azul rápido luxol (BDH), para identificar colonias de monocitos/macrófagos, neutrófilos y eosinófilos, respectivamente. Las colonias son calificadas de acuerdo con criterios estándares (>50 células) . ELISA DE M-CSF. Los monocitos son aislados de cubiertas amarillentas de donadores normales, como se describe previamente, por ejemplo, en Dewar A et al . , 2003, Leukemia 1 7: 171 3-21 . Los cultivos de monocitos (1 x105/ml) son establecidos en placas de 24 cavidades en medio privado de suero (SDM; IMDM/1 % BSA complementado con 2mM L-glutamina, 200 µg/ml transferrina, 1 0 µg/ml insulina (Actrapid®, Novo Nordisk) , 10" M ß-mercaptoetanol, 50 µg/ml de lipoproteínas de baja densidad (Sigma)) y estimulados con 20 ng/ml GM-CSF. Los sobrenadantes son recolectados a intervalos de 24 h durante 5 días y analizados por M-CSF usando un sistema de desarrollo de ELISA R&D Systems DuoSet® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Transducción de c-Fms en células FDC-P1. Líneas de células productoras de virus Psi-2 estables transfectadas con MSW/IRES/GFP/cfms (amablemente provistas por M. Roussel, St Jude Children's Research Hospital) son producidas mediante transfección de Fugene (Roche) y clasificadas en un citómetro de flujo FACStarPL U S (Becton Dickinson) , recolectando células que expresaron proteína de fluorescencia verde (GFP). Estas células son usadas para infectar células FDC-P1 mediante co-cultivo, y células FDC-P1 que expresan proteína c-fms (FDC-cfsm) son seleccionadas en DMEM complementado con 10% FCS , 200 mM L-glutamina y 60 ng/ml rhM-CSF. Ensayos de proliferación. Las células FDC-cfms son resuspendidas a 5.0x1 04/ml en DMEM conteniendo 10% FCS y estimuladas con I L-3 de murino (1 :2000) (amablemente provista por Dr S. Read, IMVS) o rhM-CSF (60 ng/ml) (Peprotech). El Compuesto I es adicionado a una concentración final de 0.5 µM-5.0 µM, por triplicado, y las células son recolectadas a 12, 24 y 48 h. Las células se fijan en un volumen conocido y un volumen fijo de Flow-CheckM R Fluorospheres de densidad conocida (Beckman Coulter) adicionado) . El número de células es determinado usando un citómetro de flujo analítico Coulter XL-MCS, usando análisis basado en compuertas en gráficas de FS v SS que correspondieron a perlas/células.

Lisados celulares. Se incubaron FDC-c-fms durante 1 h en medio libre de suero (DMEM, JRH Biosciences) a 37°C, +/- Compuesto I . Siguiendo el ayuno, las células se resuspendieron a 1 .5x107/ml en DMEM +/- Compuesto I, se estimularon con 60 ng/ml rhM-CSF durante 2 min a 37°C y entonces se usaron a 1 % NP40 en TSE (50 mM tris, 100 M NaCI, 1 mM EDTA, pH 8.0) complementado con 0.5 M Naf, 0J M NaPPi, 0.5 M NaVO4, e inhibidores de proteasa completos (Roche). Inmunoprecipitación. C-Fms es inmunoprecipitado a partir de los extractos celulares de FDC-c-fms usando 2.5 µg/ml de anticuerpo anti-c-fms (2-4A5, Santa Cruz Biotechnology I nc) y Protein G Sepharose (Amersham). Las inmunoprecipitaciones son realizadas durante 2 h a 4°C y las muestras son lavadas extensamente y resuspendidas en 30 µl de amortiguador de carga reductor (manchas de anti-fosfotirosina) y no reductor (manchas anti-c-fms) . Las cantidades equivalentes de proteína son determinadas usando un reactivo de ensayo de proteína Micro BCAM R (Pierce) son usados en cada I P. Análisis de western blot. Los inmunoprecipitados son corridos en un 8% SDS-PAGE y electroblotted a membrana de PVDF (Amersham). Las membranas son sondeadas con anticuerpos anti-fosfotirosina (mezcla de 1 /1 000 PY20 (Santa Cruz Biotechnology Inc) y 1 /2000 4G1 0 (Cell Signalling Technology®)) o un anticuerpo anti-c-fms (R&D Systems). La detección es realizada usando anticuerpo de Ig anti-ratón conjugado y desarrollado usando substrato de ECF (Amersham). La membrana es imaginada usando un Typhoon 941 0 (Amersham) a excitación de 488 nm y cuantificación realizada usando programa de cómputo l mageQuantM R. Análisis citométrico de flujo de expresión de c-Fms. Las células FDC-c-fms (5x105) son cultivadas durante 1 h en IMDM libre de suero en la presencia de Compuesto I , entonces se mancharon con 0.5 µg de anticuerpo anti-c-fms. El anticuerpo unido es detectado al manchar con un anticuerpo anti-ratón conjugado con R-phycoeritrina (SouthernBiotech) y células analizadas usando un citómetro de flujo analítico Coulter XL-MCS. Análisis estadístico y farmacocinético de datos. Los datos son analizados usando ANOVA y las diferencias son consideradas estadísticamente significativas cuando el valor de probabilidad es <0.05. El cálculo de valores de IC50 es realizado usando la ecuación de Hill, y=1 00/(1 +1 0(lo9 lC50"> x?nc"naclóndeH"l)) , donde y es el nivel de inhibición y x es la concentración de medicamento logarítmica .

Resultados Anti-c-Fms inhibe el crecimiento de colonias de monocitos/macr?fagos estimulado con M-CSF o GM-CSF El Compuesto I suprime el crecimiento estimulado de M-CSF o GM-CSF de células del linaje de monocitos/macrófagos aislados de donadores normales, ver por ejemplo, Dewar, A. L. et al. , 2003 Leukemia 17: 171 3-21 . En contraste con las tirosina cinasas de receptor de clase II relacionadas c-kit y PDGFR, la fosforilación de c-fms se ha reportado como no afectada por el Compuesto I hasta una concentración de 10 µM, ver por ejemplo, Buchdunger, E. et al. , 2000 J. Pharmacol Exp Ther 295: 1 39-145. Los cultivos de colonias establecidos usando células mononucleares de médula ósea de donadores normales fueron estimuladas con 4HGF o 5HGF y el efecto de los anticuerpos anti-c-kit en combinación con Compuesto I es examinado sobre el crecimiento de monocitos/macrófagos, ver Tabla 1 A a continuación . En la ausencia del Compuesto I , la adición de anti-c-kit a cultivos estimulados con 4HGF no tuvo efecto sobre el número de colonias. La dosis de anti-c-kit (1 µg/ml) usada en estos experimentos es mostrada como suficiente para bloquear completamente el receptor de SCF, ya que su adición a cultivos estimuló con 4HGF más SCF (5HGF) redujo el crecimiento de colonias al mismo nivel que los cultivos estimulados con 4HGF solo, ver Tabla 1 A a continuación. La falta de un efecto de anticuerpo anti-c-kit sobre el crecimiento de monocitos/macrófagos en la ausencia de SCF adicionado y Compuesto I sugiere que enfocar la ruta de señalización de c-kit siguiendo la producción de SCF autócrina no puede responder por la inhibición. En las siguientes tablas, la abreviatura "SEM" significa error estándar del promedio y "ce" concentración.

Tabla 1 A: El Compuesto I inhibe la formación de colonias de monocitos/macrófagos a través de la inhibición de c-fms. MNC de BM normal son estimuladas con 4HGGF (IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF) , 4HGF + anticuerpos anti-c-kit ( + KIT), 5HGF (IL-3, I L-6, G-CSF, GM-CSF, CSF) , 5HGF + anticuerpos anti-c-kit (+KIT), y el efecto de formación de colonias de monocitos/macrófagos examinado. Para examinar el papel de c-fms en el crecimiento de colonias, los anticuerpos anti-c-fms son adicionados a cultivos siguiendo la estimulación con M-CSF o GM-CSF. En cultivos estimulados con M- CSF, solo se observan colonias de monocitos/macrófagos, las cuales se inhibieron por hasta 80% en la presencia de 1 .0 µM Compuesto I , ver Tabla 1 B a continuación.

Tabla 1 B: El crecimiento de monocitos/macrófagos a partir de progenitores CD34+ estimulados con M-CSF es inhibido por la adición de anticuerpos anti-c-fms.

El anticuerpo anti-c-fms es suficiente para inhibir completamente las colonias de moncitos/macrófagos, demostrando la dependencia de crecimiento en M-CSF, ver Tabla 1 B anterior. La adición de 1 .0 µM Compuesto I a cultivos estimulados con GMCSF redujo el crecimiento de colonias de monocitos/macrófagos por aproximadamente 80% . En contraste, el crecimiento de eosinófilos no es afectado por el Compuesto I a concentraciones menores que 10.0 µM, ver Tabla 1 C a continuación.

Macrófago SEM Eosinófib SEM Macrófago SEM Eosinófilo SEM anti-c- fms GMCSF Comp. I ccenµM 100 7.14 100 7.36 95.8 10.20 28.89 5.79 94.15 6.50 93.96 11.67 83.47 8.35 66.89 12.45 10 0.53 0.53 59.62 9.52 24.35 6.84 Tabla 1 C: Crecimiento de colonias de monocitos/macrófagos a partir de progenitores CD34+ estimulados con GM-CSF. Ni el Compuesto I ni los anticuerpos anti-c-fms afectan el crecimiento de colonias de eosinófilos siguiendo la estimulación con GM-CSF.

La adición de un anticuerpo anti-c-fms a cultivos estimulados con GM-CSF anula completamente el crecimiento de colonias de monocitos/macrófagos mientras que el crecimiento de eosinófilos no es afectado, sugiriendo que aunque GM-CSF estimula directamente el crecimiento de eosinófilos, estimula indirectamente el crecimiento de colonias de monocitos/macrófagos. La estimulación con GM-CSF de monocitos induce a la secreción de proteína M-CSF y de aquí que GM-CSF estimula indirectamente el crecimiento de colonias de monocitos/macrófagos inhibible con anti-c- fms, se examina si GM-CSF induce la producción autócrina de M-CSF en el sistema de cultivo. Los bajos niveles (20 pg/ml) de M-CSF son detectados 24 h después de que los cultivos son establecidos (datos no mostrados) , aumentando estos niveles de manera estable durante los 5 días a aproximadamente 70 pg/ml de M-CSF. La adición de 1 .0 µM Compuesto I no tuvo efecto sobre la producción de M-CSF por los monocitos cultivados, mientras que una disminución de 30% en la producción de M-CSF en el día 5 es visto a 5.0 µM Compuesto I . El nivel máximo de M-CSF producido es estimado como 70 pg/ml , el cual es 300-500 veces menor que la concentración de M-CSF adicionada usada en este estudio. Es posible que una concentración subóptima de M-CSF sea suficiente para inducir el crecimiento y diferenciación de monocitos, con GM-CSF incapaz de soportar el crecimiento de monocitos/macrófagos solo, pero actuando sinérgicamente para potenciar el efecto de M-CSF. El Compuesto I inhibe la proliferación de una línea de células dependientes de M-CSF. Debido a que el Compuesto I parece estar mediando su efecto inhibitorio sobre el desarrollo de monocitos/macrófagos a través de c-fms, el efecto de Compuesto I en una línea celular que es dependiente de ya sea I L-3 de murino o M-CSF humano es investigado. Los cultivos de control estimulados con I L-3 de murino no mostraron efectos específicos de Compuesto I sobre el crecimiento celular a 12 o 24 h a lo largo del rango de dosis de Compuesto I examinadas, por ejemplo, ver Tabla 2A. A 48 h, la proliferación de FDC-c-fms en la presencia de I L-3 es reducida por 1 5% a 2.5 µM de Compuesto I y 40% a 5.0 µM de Compuesto I , sugiriendo que el Compuesto I tiene un efecto suavemente tóxico sobre estas células.

IL-3 Compuesto 1 ce en µM 12H SEM 24 H SEM 48 H SEM 0 125433 2899 257726 6837 1123171 25940 0.5 131724 1659 281975 5626 1107666 29249 1 126472 3478 264007 11736 1068150 69927 2.5 131857 3210 247613 8415 940233 34057 5 106917 3304 197345 6599 682771 28252 Tabla 2A M-CSF Compuesto I ce en µM 12H SEM 24 H SEM 48 H SEM 0 132174 5401 310859 10028 1453642 50607 0.5 133296 3123 339185 5220 1577777 108291 1 130010 3034 311035 9293 1362802 63713 2.5 117025 3559 174818 15975 295134 7763 5 68324 2040 20830 1708 20149 4695 Tabla 2B Tablas 2A y 2B: El Compuesto I inhibe el crecimiento estimulado con M- CSF pero no con I L-3 de una línea de células que expresan c-fms a concentraciones terapéuticas. Las cuentas celulares (células/ml) son realizadas a 1 2, 24 y 48 h. Los cultivos de control estimulados con IL-3 de murino mostraron inhibición de crecimiento menor a 48 h a concentración de Compuesto I de 2.5 µM o más (2A) . Ningún efecto es visto a 12 y 24 h. Un valor de IC50 de 5.9 µM es predicho usando el modelo sigmoidal que indica toxicidad de medicamento menor a mayores concentraciones de Compuesto I (no mostrado) . La estimulación de células con M-CSF demuestra inhibición de crecimiento a 5.0 µM de Compuesto I a 12 h y 2.5 µM a 24 y 48 h (2B) con un valor de IC50 de 1 .1 µM de Compuesto I. Donde M-CSF es la única fuente de estimulación , un 50% de inhibición de crecimiento celular es visto a 5.0 µM de Compuesto I 1 2 h después de la iniciación del cultivo. A 24 h, las cuentas celulares son hasta 45% menores a 2.5 µM de Compuesto I que los cultivos no estimulados con Compuesto I, y a 5.0 µM de Compuesto I , las cuentas celulares son menores que los valores sembrados. El efecto de Compuesto I sobre cultivos de FDC-c-fms estimulados con M-CSF es más profundo a 48 h, donde 2.5 µM de Compuesto I redujo las cuentas celulares por 80% en relación a los controles y a 5.0 µM de Compuesto I , la concentración de células es menor que el nivel sembrado . El Compuesto I inhibe la fosforilación de c-Fms. Para determinar si el Compuesto I medió un efecto inhibitorio en el receptor de M-CSF directamente, el efecto de Compuesto I sobre la fosforilación de c-fms es examinado en líneas de células de FDC-c-fms. Las células de FDC-c-fms en ayuno que no fueron estimuladas con M-CSF no mostraron fosforilación de c-fms. Las células de DFC-c-fms en ayuno que son estimuladas con M-CSF exhibieron fosforilación de receptor, y 1 .0 µM de Compuesto I redujo esta fosforilación por aproximadamente 30%. A 2.5 µM de Compuesto I , la fosforilación de c-fms es reducida por 75% y a 5.0 µM de Compuesto I, no se observa fosforilación significativa . El análisis de los datos produjo un valor de IC50 para inhibición de Compuesto I de fosforilación de c-fms de 1 .42 µM, similar al valor obtenido en los experimentos de proliferación. El Compuesto I no afecta la expresión de proteína de c-Fms. Se sobre-expresa c-Fms a bajos niveles en monocitos, y su expresión aumenta notablemente durante la diferenciación a macrófagos. En la ausencia de M-CSF, la forma de superficie de célula madura de c-fms es relativamente estable, sin embargo, la unión de ligando sub-regula la expresión de receptor mediante internalización y degradación dentro de lisosomas. Debido a que la fosforilación del receptor de M-CSF es inhibida por el tratamiento con el Compuesto I , Western blots son sondeadas para proteína de c-fms para confirmar que esto no se debe a una disminución en la expresión de c-fms. Dos bandas de c-fms son detectadas en estas manchas, con la banda de 1 70 kDa representando la proteína de c-fms completamente glicosilada , y la banda de 1 30 kDa representando la forma no glicosilada, inmadura. La intensidad de ambas bandas de 1 70 kDa y 1 30 kDa es cuantificada , y mientras que niveles mucho más altos de la proteína de 1 70 kDa son detectados de manera consistente, la expresión de ambas formas de c-fms no es afectada por el tratamiento de Compueto I , ver Tabla 4A a continuación. La falta de efecto de Compuesto I sobre la expresión de c-fms es confirmada usando citometría de flujo, sin diferencia en la expresión de superficie de c-fms en células de FDC-c-fms cultivadas en 0.5 µM-2.5 µM de Compuesto I, y expresión marginalmente menor a 5.0 µM de Compuesto I , ver Tabla 4B.

Especie c-fms 1 30kd 1 70kd Sin M-CSF 1 52478 5301 76 / M-CSF + Com puesto 1 ce en µM 0 1 88656 537484 0.5 146299 455754 1 147714 460596 2.5 1 17604 438912 5 97043 454761 IC de control 1 9097 1 53239 Tabla 4A: Cuantificación de Western blot de especie c-fms. IC = control de isotipo Compuesto 1 ce en µM I nte nsid ad de fl uorescencia promedio 0 63 0.5 69 1 52 2.5 54 5 37 Tabla 4B: c-fms de superficie detectado por citometría de flujo.

Se demuestra que el perfil in vitro del inhibidor de tirosina cinasa de proteína Compuesto I puede extenderse para incluir c-fms. La potencia de inhibición es menor que la observada para tirosinas cinasas de receptor Abl (IC50 = 0.025 µM), c-kit (ICS0 = OJ µM) o PDGF (IC50 = 0.25 µM) . Western blotting demuestra que una concentración de Compuesto I de 1 .4 µM es requerida para inhibir la fosforilación de tirosina de c-fms por 50% . En el presente estudio, el efecto de Compuesto I sobre la fosforilación de c-fms es examinado en inmunoprecipitados de c-fms siguiendo la estimulación de receptor específico con dosis de saturación de M-CSF. El Compuesto I puede ser usado en el tratamiento de enfermedades que involucran activación de c-fms anormal, incluyendo cáncer común, tal como cáncer de pecho y cáncer ovárico epitelial, y condiciones inflamatorias, tal como artritis reumatoide. La expresión anormal de c-fms ha sido demostrada en un rango de cáncer humano incluyendo carcinomas de pecho y ovario, y se ha demostrado que la activación de c-fms estimula la invasión de tumor por un mecanismo dependiente de urocinasa, ver Kacinski B. M. 1997, Mol Reprod Dev 46:71 -4, Sapi e y B.M. Kacinski, 1999, Proc Soc Exp Biol Med 220: 1 -8. La expresión anormal de c-fms en tumores de pecho y carcinomas ováricos epiteliales avanzados se correlaciona con invasión de células de tumor y prognosis clínica adversa, y M-CSF producida por tumores de pecho ha sido implicada en la promoción de metástasis de hueso en cáncer de pecho, ver Toy E . P. et al . , 2001 , Gynecol. Oncol . 80: 194-200, Sapi E. 2004 Exp Biol Med 229: 1 -1 1 . El efecto inhibitorio potente de Compuesto I sobre la fosforilación de c-fms también tiene implicaciones importantes con respecto a la toxicidad de medicamento potencial. Fuera del sistema hemopoyético, la señalización de c-fms juega un papel importante en el embarazo, afectando el desarrollo de embrión de pre-implantación y desarrollo de glándulas mamarias, ver Pollar J .W. 1997, Mol Reprod Dev 46:54-60. A través de la estimulación de M-CSF, c-fms también juega un papel importante en el metabolismo óseo y procesos inflamatorios, Fixe P. y V. Praloran, 1998, Cytokine 10: 32-37. Aunque la evidencia a la fecha demuestra que el Compuesto I es bien tolerado por pacientes, los efectos potenciales del Compuesto I sobre estos procesos debe ser considerado como una consecuencia de tratamiento de Compuesto I de largo plazo.

Ejemplo 2: Cápsulas con monometanosulfonato de 4-[(4-metil-1 -piperazin-1 -ilmetil)-N-[4-metil-3-[[4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]amino]fenil]benzamida, forma de cristal ß Las cápsulas conteniendo 1 19.5 mg del compuesto nombrado en el título (=SAL I) correspondiente a 1 00 mg de COMPUESTO I (base libre) como substancia activa son preparados en la siguiente composición: Composición SAL Í 1 19.5 mg Avicel 200 mg PVPPXL 15 mg Aerosil 2 mg Estearato de magnesio 1 .5 mg 338.0 mg Las cápsulas son preparadas al mezclar los componentes y llenar la mezcla en cápsulas de gelatina dura, tamaño 1 .

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1 . El uso de 4-(4-metilpiperazin-1 -ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-(piridin-3-il)pirimidin-2-ilamino)fenil]-benzamida (Compuesto I) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con c-fms, en donde la enfermedad asociada con c-fms es seleccionada del grupo que consiste de coriocarcinoma, histiocitosis maligna, carcinoma embrional , carcinoma endométrico, tumores microgliales de cerebro, sarcoidosis, envolvimiento de células microgliales en enfermedad de Creutzfeld-Jacob normal y variante, o esclerosis lateral amiotrófica.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el Compuesto I está en la forma de sal de monometano sulfonato.

3. Un empaque comercial que comprende Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo junto con instrucciones para usarse de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.

4. Un método para tratar un animal de sangre caliente, de preferencia un paciente humano, que sufre o probablemente sufrirá de una enfermedad asociada con c-fms seleccionada del grupo que consiste de coriocarcinoma, histiocitosis maligna, carcinoma embrional, carcinoma endométrico, tumores microgliales de cerebro, sarcoidosis, envolvimiento de células microgliales en enfermedad de Creutzfeld-Jacob normal y variante o esclerosis lateral amiotrófica, comprendiendo administrar a dicho animal una cantidad útil de Compuesto I .