MX2007002557A

MX2007002557A - Uso de polipeptidos obtenidos a traves de mutaciones sistematicas de aminoacidos unicos de bloque-a humano y no humano de hmgb1 para prevenir y/o antagonizar las patologias inducidas por hmgb1.

Info

Publication number: MX2007002557A
Application number: MX2007002557A
Authority: MX
Inventors: Silvano Fumero; Luisa Bertarione Rava Rossa; Domenico G Barone; Lila Drittanti; Thierry Guyon; Gilles Borrelly; Barbara Canepa; Chiara Lorenzetto
Original assignee: Creabilis Therapeutics Spa
Priority date: 2004-09-03
Filing date: 2005-09-05
Publication date: 2007-10-10
Also published as: CA2579094A1; US20080038309A1; KR101249287B1; WO2006024547A2; AU2005279308B2; BRPI0514835A; WO2006024547A3; CA2579094C; AU2005279308A1; US20110052493A1; NZ553809A; KR20070059128A; US8058232B2; US7635679B2; JP2008511300A; EP1797118A2; JP5622351B2

Abstract

La presente invencion se refiere a variantes de polipeptido de Bloque-A del dominio de union de alta afinidad HMGB1 (Bloque-A HMGB1) o a un fragmento biologicamente activo de Bloque-A HMGB1, los cuales se obtienen a traves de mutaciones sistematicas de aminoacidos unicos de la proteina de Bloque-A HMGB1 tipo silvestre y que muestran una resistencia aumentada a proteasas y que por lo tanto se caracterizan por configuraciones farmacodinamicas y farmacocineticas mas favorables. Ademas, la presente invencion se refiere al uso de dichas moleculas de polipeptido de Bloque-A HMGB1 para diagnosticar, prevenir, aminorar y/o tratar patologias asociadas con HMGB1 extracelular.

Description

USO DE POLIPEPTIDOS OBTENIDOS A TRAVÉS DE MUTACIONES SISTEMÁTICAS DE AMINOÁCIDOS ÚNICOS DE BLOQUE-A HUMANO Y NO HUMANO DE HMGBl PARA PREVENIR Y/O ANTAGONIZAR LAS PATOLOGÍAS INDUCIDAS POR HMGBl DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere a variantes de polipéptido del dominio de unión de alta afinidad Bloque-A HMGB-1 (Bloque-A HMGBl) o a un fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGB-1, que se obtiene a través de mutaciones sistemáticas de amino ácidos individuales de la proteína Bloque-A HMGBl de tipo silvestre y que muestran una resistencia incrementada a proteasas y que por consiguiente se caracterizan por perfiles farmacocinéticos y farmacodiná icos más favorables. Además, la presente invención se refiere al uso de dichas moléculas polipéptidas de Bloque-A HMGBl para diagnosticar, prevenir, aliviar y/o tratar patologías asociadas con HMGBl extracelular. La investigación reciente en el campo de sepsis e inflamación ha conducido a un entendimiento mejorado de los mecanismos patógenos y eventos que anteceden a su inicio y desarrollo clínico. En las etapas tempranas de sepsis, por ejemplo, las endotoxinas bacterianas estimulan las células del sistema inmune innato que liberan citoquinas pro-inflamatorias (TNF, IL-la e IL-6) . Estas citoquinas tempranas inducen, a su vez, la liberación de un mediador corriente debajo de acción tardía (identificado como la proteína conocida HMGBl) que activa la secuela patológica mediada por la liberación posterior de citoquinas tales como TNF, IL-la, IL-lß, IL-IRa, IL-6, IL-8, IL-18, IFN-?, PAF, etc., conduciendo a una patogénesis de multisistema o a una inflamación sistémica letal. (Andersson . et al . , 2002). La proteína HMGBl pertenece a la familia de proteínas del grupo de alta movilidad (HMG) . Las proteínas HMG, así llamadas debido a su elevada movilidad electroforética en geles de poliacrilamida, son las proteínas sin histona más ubicua asociada con cromatina aislada en células eucarióticas. Estas proteínas juegan un papel "arquitectónico" , generalizado en la mezcla, formación de bucles, doblez y envoltura de ADN, ya que distorsionan, mezclan o modifican estructuras de ADN y se acomplejan con factores de transcripción o histonas (Andersson et al . , 2002; Agreste et al . , 2003; Degryse et al . , 2003). La proteína del grupo 1 de alta movilidad (HMGBl) es normalmente un factor nuclear, en particular una molécula reguladora transcripcional que origina la mezcla de ADN y facilita la unión de varios complejos transcripcionales. Estructuralmente, la proteína HMGBl es una proteína de aproximadamente 25 kDa con una secuencia altamente conservada entre mamíferos, mediante lo cual 2 de 214 aminoácidos tienen sustituciones conservadoras .en todas las especies mamíferas. HMGBl se presenta de manera ubicua en todos los núcleos vertebrados y en particular puede encontrarse en fibroblastos, neuronas, hepatocitos, glia y en células derivadas de células germinales hematopoyéticas, incluyendo monocitos/ macrófagos, neutrófilos y plaquetas. La molécula de HMGBl tiene una estructura tripartita compuesta de tres distintos dominios: dos dominios de unión a ADN llamados Bloque-A HMG y Bloque-B, y un término carbóxilo ácido, que la carga de manera bipolar. Los dos bloques HMGBl se involucran en la función de la proteína como elementos de unión a ADN, arquitectónicos, no específicos de secuencia, que otorgan la habilidad de unirse a ADN en estructuras de ADN distorsionadas, reconocidas, y estabilizando el ensamble de nucleoso a, remodelando y deslizando. Ambos bloques A- y B-HMG se conforman de 84 residuos aminoácidos altamente conservados, se cargan fuertemente de manera positiva y se instalan en tres a-hélices que tienen un doblez- en forma de L similar. La extremidad larga de la "L" contiene el filamento extendido de terminal N y hélice III (Andersson et al . , 2002; Agreste et al . , 2003; Thomas, J.O., 2001), mientras que la extremidad corta comprende las hélices I y II. El análisis de estructura-función revela que el dominio de citoquina pro-inflamatoria de HMGBl es el Bloque-B y en particular la secuencia de sus primeros 20 aminoácidos. El Bloque-A es un agonista extremadamente débil de la liberación de citoquina inflamatoria activada por HMGBl e inhibe de manera competitiva las actividades pro-inflamatorias del Bloque-B y de la proteína entera. Por consiguiente, desde un punto de vista farmacológico, el Bloque-A actúa como un antagonista de las condiciones patológicas inducidas y/o prolongadas por el Bloque-B y HMGBl.

El tercer dominio, el término carbóxilo o cola acídica, se carga extremadamente de manera negativa ya que contiene 30 residuos aspárticos y de ácido glutámico repetitivos y se enlaza a los bloques por una región básica de aproximadamente 20 residuos. El HMGBl de ratón y de rata difiere de la forma humana solo en dos sustituciones que se localizan en esta tensión de terminal C continua . HMGBl se une más bien de manera débil a la variedad de forma B del ADN de doble filamento lineal sin especificidad de secuencia, mientras que se enlaza en el interior del núcleo con afinidad elevada a ADN súper bobinado, a estructuras de ADN inusuales como uniones de 4 vías (ADN cruciforme), ADN voluminoso y ADN curvo (Ferrari et al . , 1992; Pontiggia et ai., 1993 y PCT/EP2005/007198 en el nombre de Creabi li s Therapeuti cs ) . Aparte de su ubicación nuclear y función como un regulador de transcripción, HMGBl también se ha encontrado en el medio extracelular, liberado activamente por células activadas de los sistemas inmunes (monocitos y macrófagos) o liberado pasivamente por células necróticas o dañadas (Andersson et al . , 2002; Scaffidi et ai., 2002; Bonaldi et al . , 2002; Taniguchi et ai., 2003; Friedman et al . , 2003; Palumbo et al . , 2004) . El HMGBl liberado de manera extracelular actúa como una* potente citoquina y como un factor estimulador de macrófago extremadamente potente. HMGBl actúa directamente mediante unión a la membrana celular, induciendo señalización y quimiotaxis, teniendo una función similar a quimioquina (Yang et ai., 2001) y actuando además de manera indirecta mediante sobre-regulación de la expresión y secreción de citoquinas pro-inflamatorias. Esto hace a la proteína HMGBl extracelular una potente proteína quimiotáctica e inmuno-reguladora que promueve una eficaz respuesta inmune inflamatoria. Además, otras proteínas que pertenecen a la familia de proteínas HMG y que son capaces de curvar ADN, se liberan junto con HMGBl en el medio extracelular. Estas proteínas son, entre otras, HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y SP100-HMG. Comparten con HMGBl secuencias aminoácidos altamente homologas. Como HMGBl, activan/prolongan patologías inflamatorias que interactúan con los mismos receptores, conduciendo a las mismas trayectorias de interacción corriente abajo. En células saludables, HMGBl migra al citoplasma tanto mediante transporte pasivo como activo. Sin embargo, todas las células cultivadas y monocitos en reposo contienen la vasta mayoría de HMGBl en el núcleo, indicando que la importación de condiciones de línea de referencia es mucho más eficaz que la exportación. Las células podrían transportar HMGBl desde los núcleos mediante acetilación de residuos de lisina que son abundantes en HMGBl, neutralizando así su carga básica y volviéndola incapaz de funcionar como señales de localización nuclear. La hiperacetilación de HMGBl nuclear determina la reubicación de esta proteína desde el núcleo hacia el citoplasma (en los fibroblastos, por ejemplo) o su acumulación hacia endolisoso as segregadores (en monocitos y macrófagos activados, por ejemplo) y la posterior redirección hacia la liberación a través de una trayectoria segregadora mediada por vesícula, no clásica. La secreción de HMGBl por monocitos ya activados se acciona entonces mediante lisofosfatidilcolina bioactiva (LPC) , la cual se genera posteriormente en el sitio de inflamación a partir de fosfatidilcolina a través de la acción de sPLA2 fosfolipasa segregadora, producida por monocitos, varias horas después de la activación. Por consiguiente, la secreción de HMGBl parece inducirse por dos señales (Bonaldi et al . , 2003) y tomar lugar en tres etapas: 1) en primer lugar, una señal inflamatoria" promueve la acetilación de HMGBl y su reubicación a partir del núcleo hacia el citoplasma (etapa 1) y almacenamiento en vesículas segregadoras citoplásmicas (etapa 2); después, una señal de secreción (ATP extracelular o lisofosfatidilcolina) promueve la exocitosis (tercera etapa) (Andersson et al . , 2002; Scaffidi et al . , 2002; Gardella et al . , 2002; Bonaldi et al . , 2003; Friedman et al . , 2003). HMGBl liberado se ha identificado como uno de los ligandos que se unen al receptor RAGE. Este receptor se expresa en la mayoría de los tipos celulares y a un nivel elevado principalmente en células endoteliales, en células de músculo suave vascular, - en monocitos y macrófagos y en fagocitos mononucleares. El reconocimiento involucra la terminal C de HMGBl. La interacción de HMGBl y RAGE activa un periodo prolongado de activación celular mediada por sobre-regulación de RAGE y señalización dependiente de receptor. En particular, la interacción de HMGBl y RAGE activa varias trayectorias de transducción de señal intracelular, incluyendo quinasas de proteína activadas por mitogen (MAPKs), Cdc-42, p21ras, Rae y el factor de translocación nuclear rB (NF-?B) , el factor de transcripción clásicamente enlazado a procesos inflamatorios (Schmidt et al . , 2001) . De acuerdo con varias evidencias experimentales, el HMGBl liberado' también puede interactuar con receptores que pertenecen a una o más sub-clase(s) de la familia de los receptores similares a Toll. Además, HMGBl también puede interactuar con el dominio similar a lectina de terminal N funcional (DI) , de * trombomodulina . Debido a la habilidad del dominio DI funcional de trombomodulina para interceptar y unirse a HMGBl en circulación, se evita la interacción con los. receptores RAGE y los receptores similares a Toll. En el contexto de la presente invención, "HMGBl" incluye la forma no acetilada o/y la forma acetilada de HMGBl. De igual modo, "proteínas homologas de HMGBl" incluyen la forma no acetilada o/y la forma acetilada de las proteínas homologas de HMGBl. Las proteínas homologas de HMGBl preferidas son HMGBl, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L o/y SP100-HMG. Cuando se libera in vi vo, HMGBl es una citosina extremadamente potente y un factor estimulador de macrófago potente. De hecho, como otros mediadores de citosina de endoxotemia, HNGB1 activa in vi tro una cascada de múltiples citoquinas inflamatorias (TNF, IL-la, IL-lß, IL-lRa, IL-6, IL-8, MlP-la y MlP-lß) de macrófagos humanos. Por consiguiente, HMGBl actúa como un mediador tardío durante la inflamación aguda y participa en una manera importante en la patogénesis de la inflamación sistémica después de que se ha resuelto la respuesta del mediador anterior . Los efectos pro-inflamatorios observados de HMGBl in vi tro y la correlación entre los niveles de HMGBl en circulación y el desarrollo de la secuencia patógena de la inflamación sistémica in vi vo indican que el direccionamiento terapéutico de esta molécula similar a citoquina debe ser el valor clínico relevante, sugiriendo novedosos enfoques terapéuticos mediante una administración "tardía" de antagonistas/inhibidores de las actividades extracelulares (selectivos) de HMGBl. Por consiguiente, se llevaron a cabo varios intentos con objeto de bloquear esta proteína de quimo-citoquina HMGBl extracelular. Varios enfoques importantes se dirigieron a la administración de anticuerpos contra HMGBl, de fragmentos de HMGBl (por ejemplo, Bloque-A HMGBl), de anticuerpos hacia RAGE, de RAGE soluble (sRAGE) y de piruvato de etilo (Czura et al . , 2003; Lotze et al . , 2003) . La inmunización pasiva de ratones con anticuerpos neutralizantes de HMGBl otorgó una protección duradera y dependiente de la dosis altamente significativa contra dosis letales de endotoxina, incluso cuando las primeras dosis de anticuerpos se realizaran después de que había pasado el pico de TNF, sugiriendo que la actividad antagonista de HMGBl tardía en el curso clínico puede ser un enfoque de tratamiento eficaz para la sepsis potencialmente letal (Yang et al . , 2004). Otra posibilidad es administrar anticuerpos mono- u oligoclonales contra el Bloque-B HMGBl, o su núcleo relevante de 20 amino ácidos que señala a través de RAGE. Además, el Bloque-A HMGBl, uno de los dos dominios de unión a ADN en HMGBl, se ha identificado como un antagonista específico de HMGBl: el Bloque-A recombinante, altamente purificado, ha protegido a los ratones de la sepsis experimental letal incluso • cuando el tratamiento inicial se ha retrasado durante 24 horas después de inducción de la patología, sugiriendo además que los antagonistas de HMGBl pueden administrarse exitosamente en una ventana clínicamente relevante, más amplia que una utilizada para otras citoquinas conocidas (Yang e t ai . , 2004) . El análisis de función estructural de mutantes truncos de HMGBl ha revelado que el dominio de Bloque-A de HMGBl desplaza de manera competitiva la unión saturable de HMGBl a macrófagos, antagonizando específicamente actividades de HMGBl. Como ya se ha observado con la actividad protectora de anticuerpos anti-HMGBl, la administración del Bloque-A rescata a los ratones de la sepsis incluso cuando el tratamiento se ha iniciado posteriormente tanto como 24 horas después de la inducción quirúrgica de la sepsis (Yang H et al . , 2004). Los antagonistas o inhibidores de HMGBl seleccionados a partir del grupo de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen a una proteína HMGBl, secuencias de antidetección de gen HMGBl y antagonistas receptores de HMGBl, se conocen a partir de la EU 6,468,533, WO 02/074337 y EU 2003/0144201. Además, la saturación de HMGBl en circulación mediante la administración de sRAGE conduce al bloqueo de sus actividades mediadas por RAGE celular, un resultado que puede obtenerse mediante inhibición de RAGE en sí con la administración de anticuerpos anti-RAGE. Además, se ha observado una respuesta protectora similar, tardía en el curso de la sepsis, mediante la administración de etil-piruvato, un derivado lipofílico estable y aditivo alimenticio relativamente no tóxico, también utilizado como un agente anti-inflamatorio experimental, el cual atenúa la inflamación sistémica de daño a tejido por isquemia/reperfusión y choque hemorrágico letal. El etil-piruvato inhibió HMGBl y la liberación de TNF in vi tro a partir de macrófagos murinos estimulados por endotoxina, aunque i n vi vo protegió a los ratones de la sepsis letal inducida por peritonitis, nuevamente se indujo experimentalmente cuando la dosificación se inició 24 horas después de esta patología. Finalmente, se ha demostrado que el dominio similar a lectina de terminal N (DI) de trombomodulina es un inhibidor de HMGBl, ya que se une a y secuestra esta quimoquina, evitando la unión de HMGBl a RAGE y receptores similares a Toll, de tal manera que se inhiba la cascada de eventos corriente abajo que conduce a patologías inflamatorias. Como se describe arriba, se llevaron a cabo varios intentos con el propósito de inhibir y/o antagonizar la proteína de quimo-citoquina de HMGBl extracelular. La presente invención se basa en la evidencia experimental de que los dos dominios de unión de alta afinidad para ADN, es decir, Bloque-A HMGBl y Bloque-B HMGBl, que se presentan en la molécula de HMGBl, tienen dos funciones opuestas en la proteína liberada en el espacio extracelular. La principal actividad de Bloque-A HMGBl es mediar las actividades pro-inflamatorias atribuidas a la proteína HMGBl. Por otro lado, el Bloque-A HMGBl actúa como un antagonista que compite con la actividad pro- inflamatoria del dominio de Bloque-B. El problema subyacente a la presente invención fue, por consiguiente, la proporción de agentes novedosos para la prevención, alivio y/o tratamiento de patologías asociadas a HMGBl. En particular, el problema de la presente invención fue desarrollar agentes novedosos como antagonistas y/o inhibidores de HMGBl extracelular selectivo, con objeto de prevenir, aliviar y/o tratar el amplio espectro de efectos patológicos inducidos por la quimoquina HMGBl en sí y/o por la cascada de múltiples citoquinas inflamatorias originadas por ia liberación extracelular de la proteína HMGBl. Por consiguiente, la solución al problema anterior es la proporción de una variante polipéptida del Bloque-A de dominio de unión de alta afinidad de HMGBl humano y/o no humano (Bloque-A HMGBl) o de un fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl humano y/o no humano, caracterizada por que la secuencia amino acida de dicha variante polipéptida difiere de la secuencia amino acida de la proteína de Bloque-A HMGBl de tipo silvestre, mediante la mutación de uno o más amino ácidos individuales. Sorprendentemente, se encontró por los inventores de la presente invención que dicha variante de polipéptido exhibe una resistencia incrementada a proteólisis en comparación con Bloque-A HMGBl de tipo silvestre o con el fragmento" biológico activo del Bloque-A HMGBl de tipo silvestre. Al incrementar la resistencia a la actividad proteolítica de las proteasas, puede lograrse un perfil farmacocinética y farmacodinámico más favorable, ya que se obtiene una estabilidad incrementada en fluidos corporales para las variantes inventivas de polipéptido. Como resultado de io mismo, se observa también un incremento en la vida promedio en los fluidos corporales de las variantes de proteína de la presente invención. Se sabe que la vida promedio estimada de proteínas i n vi vo puede ser tan corta como de unos cuantos minutos. Las variantes de la presente invención preferentemente tienen una vida promedio incrementada, por ejemplo, debido a que son más resistentes a proteasas. En una modalidad más preferida de la presente invención, las variantes de polipéptido se obtienen mediante el uso de un proceso de evolución dirigido, cuya tecnología se describe de manera extensa en la WO 2004/7022593 y en varias solicitudes de patente adicionales (PCT/FROO/03503, PCT/FR01/ 01366, EU 10/022,249, EU 10/022,390, EU 10/375,192, EU 60/409,898, EU 60/457,135, EU 60/410,258 y EU 60/410,263), todas a nombre de Nautilus Biotech S.A. (París, Francia) , las cuales se incorporan en la presente para referencia. En general, el término "evolución dirigida" se refiere a procesos biotecnológicos dedicados a la mejora de configuraciones proteínicas objetivo por medio de cambios específicos introducidos en sus secuencias amino acidas. El proceso de evolución dirigida incluye la generación de una biblioteca de versiones mutantes del gen de interés, seguida por la selección de aquellas variantes que exhiben las características deseadas. Estos procesos pueden ser iterativos cuando los productos genéticos que tienen una mejora en una propiedad deseada se sujetan a ciclos adicionales de mutación y selección por observación. Con objeto de optimizar el Bloque-A de proteína HMGBl y obtener las variantes de polipéptido de la presente invención con mayor estabilidad contra proteasas, se ha aplicado una tecnología propiedad de Nautilus en particular, para la evolución dirigida. En particular, se ha aplicado un, así llamado, enfoque de exploración de mutagénesis racional de dos dimensiones ("exploración 2-D") , el cual se describe en la solicitud de patente de Nautilus WO 2004/022593, incorporándose dicha solicitud en la presente para referencia . El enfoque de exploración Nautilus 2-D para la evolución racional de la proteína se basa en un proceso, en el cual dos dimensiones de la proteína objetivo se exploran por mutagénesis en serie, con objeto de encontrar el cambio amino ácido correcto que se necesita en la posición amino acida correcta. La primer dimensión que se explora es la posición amino acida a lo largo de la secuencia proteínica objetivo, con objeto de identificar aquellos residuos amino ácidos específicos a reemplazarse con diferentes amino ácidos . Estas posiciones amino acidas son referidas como posiciones objetivo is-HIT. La segunda dimensión es el tipo amino ácido específico seleccionado para reemplazar una posición objetivo is-HIT en particular. De acuerdo con un enfoque particular del método de exploración en 2-D, se selecciona, i n si li co , un número de posiciones objetivo a lo largo de la secuencia proteínica. Según se utiliza en la presente, í n sili co se refiere a investigaciones y experimentos llevados a cabo mediante el uso de una computadora. En este contexto, los métodos i n si li co incluyen, pero sin limitarse, estudios de modelado molecular y experimentos de ensamblaje biomolecular . Por consiguiente, las posiciones amino acidas objetivo en la secuencia proteínica se identifican sin el uso de métodos biológicos experimentales. Una vez que se selecciona una característica de proteína por optimizar, se explotan diversas fuentes de información o conocimiento previo con objeto de determinar aquellas posiciones amino acidas que pueden ser factibles de mejorar la adaptabilidad de la proteína mediante reemplazo con un diferente amino ácido. En particular, las "posiciones objetivo is-HIT" se identifican en base a tres factores, siendo (i) la característica de la proteína por desarrollarse y optimizarse, (ii) la secuencia amino acida de la proteína y/o (iii) las propiedades conocidas de los amino ácidos individuales. En el contexto específico de la presente invención, los "HITs i n sil i co" ("is-HITs") son todos posibles posiciones amino acidas candidato a lo largo de la secuencia primaria de la proteína objetivo, que podrían desarrollarse como objetivo para la actividad proteolítica de proteasas. En base a la lista específica de proteasas consideradas en el contexto de la presente invención (Fig. 1), se determina la lista completa de todas las secuencias amino acidas que podrían dirigirse potencialmente dentro de la secuencia amino acida de Bloque-A HMGBl de tipo silvestre. Una vez que se han seleccionado las posiciones objetivo is-HIT, se lleva a cabo entonces la mutagénesis mediante el reemplazo de residuos amino ácidos individuales en las posiciones acidas objetivo específicas en la estructura de proteína. La mutagénesis se lleva a cabo mediante reemplazo de residuo "uno por uno" en adaptaciones direccionabíes y se producen moléculas que contienen los cambios amino ácidos preseleccionados en cada una de las posiciones amino acidas objetivo. La selección del amino ácido de reemplazo toma en cuenta la necesidad de preservar las propiedades físico-químicas tales como hidrofobicídad, carga y/o polaridad de residuos esenciales (tal como residuos catalíticos y de unión) . Se conocen en la materia numerosos métodos de selección de amino ácidos de reemplazo en la materia, en particular, se utilizan matrices de sustitución amino acida para este propósito. Una tecnología muy preferida de acuerdo con la presente invención hace uso de la así llamada "Mutación Aceptada Porcentual" (PAM) (Dayhoff et al . , Atlas de secuencia y estructura proteínicas, 5 (3) : 345-352, 1978), como se muestra en la Fig. 2, los valores PAM se utilizan con objeto de seleccionar un grupo adecuado de amino ácidos de reemplazo. Los valores PAM, originalmente desarrollados para producir alineaciones entre secuencias de proteína, se encuentran disponibles en la forma de matrices de probabilidad, que reflejan una distancia evolutiva. Las "sustituciones conservadoras" de un residuo en una secuencia de referencia con aquellas sustituciones que son física y funcionalmente similares a los residuos de referencia correspondientes, por ejemplo, aquellos que tienen un tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas, similares, incluyendo la habilidad de formar uniones covalentes o de hidrógeno, o lo similar. Las sustituciones conservadoras preferidas muestran la mayor adaptación de puntuaciones con los criterios de matriz PAM en la forma de "mutaciones de punto aceptadas". La matriz PAM250 se utiliza en la exploración en 2-D para identificar los amino ácidos de reemplazo para las is-HITs con objeto de generar mutaciones conservadoras sin afectar la función de la proteína. Por lo menos, se seleccionan los dos amino ácidos con los valores más elevados en la matriz PAM250, correspondientes a "sustituciones conservadoras" o "mutaciones de punto aceptadas". El reemplazo de amino ácidos por residuos de cisterna se evita explícitamente, ya que este cambio conduciría potencialmente a la formación de uniones de disulfuro intermoleculares . Mediante el uso de la tecnología de evolución dirigida Nautilus Biotech arriba resumida, los inventores de la presente invención fueron capaces de obtener variantes de polipéptido del Bloque-A HMGBl que difieren de la secuencia amino acida del polipéptido objetivo nativo en una o más mutaciones. En el contexto de la presente invención, cuando se hace referencia al término "Bloque-A HMGBl o secuencia amino acida de Bloque-A HMGBl", se refiere a Bloque-A HMGBl tanto humano como no humano. En una modalidad preferida de la presente invención, la mutación sistemática de amino ácido individual en las posiciones críticas is-HIT para proteasas, se ha obtenido en el tipo silvestre de la proteína de Bloque-A HMGBl humana y en la proteína de tipo silvestre de Bloque-A HMGBl Anophel es gambi a . La selección de las especies Anoph el es Gambi a se realizó por los inventores de la presente solicitud después de un adecuado análisis estructural y filogenético que muestra un 68% de identidad y un 88% de homología del Bloque-A HMGB humano y Anoph el es . "Los fragmentos biológicamente activos de Bloque-A HMGBl", según se utiliza en la presente, se entiende que abarcan parte de la proteína de Bloque-A HMGBl de tipo silvestre conocida, para la cual es aún observable al menos una de las actividades biológicas de la proteína madura correspondiente cuando se utilizan pruebas conocidas. Preferentemente, un fragmento de la proteína madura se considera como biológicamente activo si puede determinarse una actividad antagonista con respecto a la actividad pro-inflamatoria del Bloque-B HMGBl y la proteína HMGBl como un todo. Los fragmentos biológicamente activos de Bloque-A HMGBl nativo son fragmentos de al menos 20, 25, 30, 35, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 amino ácidos. Los fragmentos biológicamente activos preferidos de Bloque-A HMGBl nativo, utilizados en el contexto de la presente invención, comprenden fragmentos de al menos 77 o de al menos 54 amino ácidos, respectivamente . El término "mutación", según se utiliza en el contexto de la presente invención, puede entenderse como sustitución, omisión y/o adición de amino ácido individual en la secuencia objetivo. Preferentemente, la mutación de la secuencia objetivo en la presente invención es una sustitución. La sustitución puede ocurrir con diferentes amino ácidos genéticamente codificados o mediante amino ácidos no genéticamente codificados. Los ejemplos de amino ácidos no genéticamente codificados son homocisteína, hidroxiprolina, ornitina, hidroxilisina, citrulina, carnitina, etc. Las variantes de polipéptido de la presente invención, obtenidas mediante uso de tecnología de evolución dirigida, son proteínas mutantes que difieren de la secuencia amino acida del Bloque-A HMGBl de tipo silvestre por la mutación de uno o más amino ácidos individuales . En una modalidad muy preferida de la presente invención, solo un reemplazo amino ácido ocurre en la secuencia de la proteína nativa. En este caso, la variante de polipéptido de la invención se obtiene por la modificación de la proteína nativa, de tal manera que la secuencia amino acida de la variante difiere de la de la proteína nativa por un solo cambio amino ácido en solo una de las posiciones objetivo is-HIT. Sin embargo, se abarca por el sujeto de la presente invención que la proteína nativa puede optimizarse aún más mediante reemplazo de una pluralidad, por ejemplo, dos o más, de las posiciones objetivo is-HIT en la misma molécula de proteína. De acuerdo con esta variante de la invención, las variantes de polipéptido se obtienen mediante combinación de la mutación individual en una sola molécula de proteína. Las variantes de polipéptido modificadas que tienen más reemplazo de amino ácidos individuales, pueden diferir de la secuencia proteínica de tipo silvestre por reemplazos amino ácidos en 1-10, preferentemente 2, 3, 4, 5 y 6 diferentes posiciones objetivo de amino ácidos . La selección del candidato de las series de variantes de polipéptido, producidas con la tecnología utilizada en la presente invención, se basa tanto en el perfil farmacocinética más favorable, obtenido gracias a la mayor resistencia a proteasas como también un mejor perfil farmacodinámico gracias a una actividad intrínseca incrementada y afinidad de unión que da una mayor actividad antagonista que la proteína de Bloque-A HMGBl nativa. En una modalidad particular de la invención, comenzando a partir de Bloque-A HMGBl Humano como proteína nativa de inicio, se obtienen tres grupos de variantes de polipéptido. En particular, un grupo de variantes de polipéptido se deriva de mutaciones individuales introducidas en la secuencia amino acida de longitud completa (84 amino ácidos) de Bloque-A HMGBl Humano. Los otros dos grupos de variantes de polipéptido inventivas se generan comenzando a partir de fragmentos biológicamente activos de Bloque-A HMGBl Humano de 77 amino ácidos y 54 amino ácidos, respectivamente . En una modalidad particular adicional de la invención, comenzando a partir de Bloque-A HMGBl de Anoph el es gambi a como proteína nativa de inicio, se obtienen tres grupos de variantes de polipéptido. En particular, un grupo de variantes de polipéptido se deriva de mutaciones individuales introducidas en la secuencia amino acida de longitud completa (84 amino ácidos) proveniente de Bloque-A HMGBl de Anophel es gambi a . Los otros dos grupos de variantes de polipéptido inventivas se generan comenzando a partir de fragmentos biológicamente activos de Bloque-A HMGBl de Anoph el es gambi a de 77 amino ácidos y 54 amino ácidos, respectivamente. No obstante, las variantes de polipéptido muy preferidas, arriba mencionadas, de esta invención, se definen como abajo. 1) En el fragmento de longitud completa de Bloque-A HMGBl humano de 84 amino ácidos definidos por la secuencia SEQ ID NO: 1 (Fig. 3a), se identifican 53 posiciones amino acidas, reconocidas como sustrato para diferentes proteasas (cf . Fig. 1) . La numeración corresponde a la de la pro-teína de tipo silvestre: K2, D4, P5, K6, K7, P8, R9, ll, M12, Y15, F17, F18, R23, E24, E25, K27, K28 , K29, P31, D32, F37, E39, F40, K42, K43, E46, R47, W48, 49, M51, K54, E55, K56, K58, F59, E60, D61, M62, K64, D66, K67, R69, Y70, E71, R72, E73, M74, K75, Y77, P79, P80, K81, E83. El amino ácido nativo en cada una de estas posiciones se reemplaza por residuos definidos mediante la matriz de sustitución PAM250 (cf . Fig. 2) . En particular, las sustituciones de residuo llevadas a cabo se mencionan a continuación. R por H, Q E por H, Q, N K por Q, T D por N, Q M por I, V P por A, S Y por I, H F por I, V W por Y, S Se genera un total de 115 variantes de polipéptido de Bloque-A de HMGBl humano (Fig. 3a) . Estas variantes de polipéptido se definen en secuencias SEQ ID NOs: 2 a 116. 2) En el fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl Humano de 77 amino ácidos, definido en la secuencia SEQ ID NO: 117 (Fig. 4a), se identifican 48 posiciones amino acidas, reconocidas como sustrato para diferentes proteasas (cf . Fig. 1) . La numeración es de acuerdo a su posición en la SEQ ID NO: 117: Pl, R2, K4, M5, Y8, FIO, Fl 1 , R16, E17, E18, K20, K21, K22, P24, D25, F30, E32, F33, K35, 36, E39, R40, W41, K42, M44, K47, E48, K49, K51, F52, E53, D54, M55, K56, D59, K60, R62, Y63, E64, R65, E66, M67, K68, Y70, P72, P73, K74, E76. El amino ácido nativo en cada una de estas posiciones se reemplaza por residuos definidos mediante la matriz de sustitución PAM250 (cf . Fig. 2) . En particular, las sustituciones de residuo llevadas a cabo son como se mencionan a continuación . R por H, Q E por H, Q, N K por Q, T D por N, Q M por I, V P por A, S Y por I, H F por I, V W por Y, S Se genera un total de 105 variantes de polipéptido de Bloque-A de fragmento HMGBl Humano de 77 amino ácidos (Fig. 4b) y se definen como en las secuencias SEQ ID NOs: 118 a 222. 3) En el fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl Humano de 54 amino ácidos definidos en la secuencia SEQ ID NO: 223 (Fig. 5a) , se identifican 35 posiciones amino acidas, reconocidas como sustrato para diferentes proteasas (Fig. 1) . La numeración se encuentra de acuerdo con su posición en la SEQ ID NO: 223: Pl, D2, F7, E9, F10,K12, K13, E16, R17, W18, K19, M21, K24, E25, K26, K28, F29, E30, D31, M32, 34, D36, 37, R39, Y40, E41, R42, E43, M44, K45, Y47, P49, P50, K51, E53. El amino ácido nativo en cada una de estas posiciones se reemplaza por residuos definidos mediante la matriz de sustitución PAM250 (cf . Fig. 2) . En particular, las sustituciones de residuo llevadas a cabo son como se mencionan a continuación . R por H, Q E por H, Q, N K por Q, T D por N, Q M por I, V P por A, S Y por I, H F por I, V W por Y, S Se genera un total de 77 variantes de polipéptido de Bloque-A de fragmento HMGBl Humano de 54 amino ácidos (Fig. 5b) y se definen como en las secuencias SEQ ID NOs: 224 a 300. 4) En el fragmento de longitud completa de Bloque-A HMGBl de Anoph el es gambi a (XP_311154) de 84 amino ácidos, definidos por la secuencia SEQ ID NO: 301 (Fig. 6a), se identifican 53 posiciones amino acidas, reconocidas como sustrato para diferentes proteasas (Fíg. 1) . La numeración se encuentra de acuerdo con la posición en la proteína nativa. K2, K4, D5, K7, P8, R9, Rll, M12, Y15, F17, F18, R23, E24, E25, K27, K28 , K29, P31, E32, E33, F37, E39, F40, R42, K43, E46, R47, W48, K49, M51, L52, D53, K54, E55, K56, R58, F59, E61, M62, E64, K65, D66, K67, R69, Y70, E71, L72, E73, M74, Y77, P79, P80, K81. El amino ácido nativo en cada una de estas posiciones se reemplaza por residuos definidos mediante la matriz de sustitución PAM250 (cf . Fig. 2) . Las sustituciones de residuo real llevadas a cabo son como se mencionan a continuación . R por H, Q E por H, Q, N K por Q, T D por N, Q M por I, V P por A, S Y por I, H F por I, V W por Y, S Se generó un total de 117 variantes de Bloque-A de Anoph el es gambia HMGBl (XP_311154) (Fig. 6b) y se identifican en las secuencias según se definen en las SEQ ID NOs: 302 a 418. 5) En el fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl de Anophel es gambi a (XP_311154) de 77 amino ácidos, definidos en la secuencia SEQ ID NO: 419 (Fig. 7a) , se identificaron 49 posiciones amino acidas, reconocidas como sustrato para diferentes proteasas (cf . Fig. 1) . La numeración se encuentra de acuerdo con la posición en la secuencia según se define en la SEQ ID NO: 419. Pl, R2, R4, M5, Y8, FIO, Fll, R16, E17, E18, K20, K21, K22, P24, E25, E26, F30, E32, F33, R35, K36, E39, R40, W41, K42, M44, L45, D46, K47, E48, 49, R51, F52, E54, M55, E57, K58, D59, K60, R62, Y63, E64, L65, E66, M67, Y70, P72, P73, K74. El amino ácido nativo en cada una de estas posiciones se reemplazó por residuos definidos mediante la matriz de sustitución PAM250 (cf . Fig. 2) . Las sustituciones de residuo real llevadas a cabo son como se mencionan a continuación . R por H, Q E por H, Q, N K por Q, T D por N, Q M por I, V P por A, S Y por I, H F por I, V W por Y, S Se generó un total de 109 variantes de polipéptido de Bloque-A de HMGBl de 77 amino ácidos (Fig. 7b) y se identificaron en las secuencias SEQ ID NOs: 420 a 528. 6) En el fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl de Anophel es gambi a (XP_311154) de 54 amino ácidos, definidos en la secuencia SEQ ID NO: 529 (Fig. 8a), se identificaron 36 posiciones amino acidas, reconocidas como sustrato para diferentes proteasas (cf . Fig. 1) . La numeración se encuentra de acuerdo con la posición en la secuencia según se define en la SEQ ID NO: 529. Pl, E2, E3, F7, E9, FIO, R12, K13, E16, R17, W18, K19, M21, L22, D23, K24 , E25, K26, R28, F29, E31, M32, E34, K35, D36, K37, R39, Y40, E41, L42, E43, M44, Y47, P49, P50, K51. El amino ácido nativo en cada una de estas posiciones se reemplazó por residuos definidos mediante la matriz de sustitución PAM250 (cf . Fig. 2) . Las sustituciones de residuo real llevadas a cabo son como se mencionan a continuación . R por H, Q E por H, Q, N K por Q, T D por N, Q M por I, V P por A, S Y por I, H F por I, V W por Y, S Se generó un total de 81 variantes de polipéptido de Bloque-A de HMGBl Anoph el es gambi a (XP_311154) de 54 amino ácidos (Fig. 8b) y se identificaron en las secuencias según se define en las SEQ ID NOs: 530 a 610. Se observa que los amino ácidos que ocurren en las diversas secuencias amino acidas que aparecen en la presente, se identifican de acuerdo con sus abreviaturas conocidas de código de una letra. Debe observarse además que todas las secuencias de residuo amino ácido representadas en la presente por su código de abreviatura de una letra tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de términos amino a términos carbóxilo. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona variantes de polipéptido modificadas que exhiben resistencia incrementada a la actividad proteolitica de proteasas y/o peptidasas en comparación con la proteína de Bloque-A HMGBl de tipo silvestre. Las variantes de polipéptido de la invención exhibe, en particular, un incremento en la resistencia a la actividad proteolítica de las proteasas y/o peptidasas humanas, en particular de las proteasas de suero humanas y/o proteasas o peptidasas gastro-intestinales humanas. Las proteasas preferidas se mencionan en la Fig. 1. En una modalidad más preferida de la invención, las variantes de poíipéptido exhiben un incremento en la resistencia a la actividad proteolítica de al menos una proteasa seleccionada a partir del grupo que comprende quimotripsina, tripsina, endoproteasa, endopeptidasas o una combinación de los mismos. En particular, la resistencia a proteólisis es de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% o mayor en comparación con el Bloque-A HMGBl de tipo silvestre, no modificado. La resistencia a la proteasa se midió en diferentes puntos de tiempo (entre 5 minutos y 8 horas) a 25°C después de la incubación de 20 µg de variantes o tipo silvestre de Bloque-A con una mezcla de proteasas a 1% p/p de proteínas en total. La mezcla de las proteasas se preparó recientemente en cada ensayo a partir de soluciones de depósito de endoproteinasa Glu-C (SIGMA) 200 µg/ml; tripsina (SIGMA) 400 µg/ml y -quimotripsina (SIGMA) 400 µg/ml. Después de la incubación de la proteasa, la reacción se detuvo agregando 10 µl de solución de anti-proteasas (Roche) y las muestras se almacenaron a -20°C durante el ensayo de actividad biológica. Como consecuencia de la estabilidad incrementada debido a la resistencia incrementada a la actividad de proteasas, las variantes de polipéptido de la presente invención también exhiben una mayor vida promedio en los fluidos corporales en comparación con el Bloque-A HMGBl de tipo silvestre. En particular, la vida promedio en suero y/o en sangre se incrementa en al menos 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos o incluso más, en comparación con el Bloque A HMGBl de tipo silvestre. Un aspecto adicional de la presente invención es una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de polipéptido de la presente invención. En particular, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de polipéptido según se define en la SEQ ID NO: 2 a 116, 118 a 222, 224 a 300, 302 a 418, 420 a 528 y 530 a 610. Un aspecto aún adicional de la presente invención es un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según se define arriba. Además, la presente invención se refiere a un método para la producción de una variante de polipéptido según se describe arriba, que comprende (i) introducir una molécula de ácido nucleico según se define arriba en una célula huésped y(ii) cultivar la célula, bajo condiciones en las cuales se expresa la variante de polipéptido codificada. Preferentemente, la célula huésped es un mamífero, insecto o célula bacteriana, en particular E . coli , preferentemente la cepa M15. Un método adicional para la producción de una variante de poiipéptido según se describe arriba es el uso de síntesis péptida química, por ejemplo, una síntesis péptida de fase sólida de acuerdo con métodos estándares. Las variantes de polipéptido de la presente invención exhiben una resistencia incrementada a proteólisis y por lo tanto una mayor estabilidad en comparación con la proteína de tipo silvestre no modificada. En consecuencia, los péptidos de la invención también exhiben propiedades y actividad terapéuticas y biológicas mejoradas. De hecho, muestran un perfil farmacocinética y farmacodinámico más favorable que el Bloque-A HMGBl nativo. Por consiguiente, la invención se dirige al uso de las variantes de polipéptido arriba mencionadas del Bloque-A HMGBl, obtenidas a través de mutaciones sistémicas de amino ácidos individuales en la secuencia del Bloque-A HMGBl o de sus fragmentos biológicamente activos como agente activo en un medicamento. Un aspecto aún adicional de la invención es, por lo tanto, el uso de las variantes de polipéptido inventivas para la elaboración de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de patologías asociadas a HMGBl extracelular o patologías asociadas con las proteínas homologas de HMGBl . En particular, las patologías asociadas a HMGBl son patologías que se median por una cascada de citoquina inflamatoria múltiple. espectro de condiciones patológicas inducidas por la HMGBl-quimoquina y por la cascada inducida por HMGBl de citoquinas inflamatorias se agrupan en las siguientes categorías: enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, daño de reperfusión después de transplante de órgano, afecciones cardiovasculares, enfermedad obstétrica y ginecológica, enfermedad infecciosa (viral y bacteriana), enfermedad alérgica y atópica, patologías de tumor sólido y líquido, enfermedades de rechazo de transplante, enfermedades congénitas, enfermedades dermatológicas, enfermedades" neurológicas, caquexia, enfermedades renales, condiciones de intoxicación iatrogénica, enfermedades metabólicas e idiopáticas. Las patologías asociadas a HMGBl de acuerdo con la presente invención son preferentemente condiciones patológicas mediadas por activación de la cascada de citoquina inflamatoria. Los ejemplos no limitantes de condiciones que pueden tratarse útilmente mediante el uso de la presente invención incluyen el amplio espectro de condiciones patológicas inducidas por la quimoquina HMGBl y por la cascada inducida por HMGBl de citoquinas inflamatorias agrupadas en las siguientes categorías: restenosis y otras enfermedades cardiovasculares, daño por reperfusión, enfermedades inflamatorias tales como enfermedad inflamatoria del hígado, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica/ por ejemplo, sepsis, síndrome de disfunción respiratoria en adultos, etc., enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide y osteoartritis, enfermedades obstétricas y ginecológicas, enfermedades infecciosas, enfermedades atópicas, tales como asma, eczema, etc., patologías de tumor, por ejemplo, enfermedades de tumor sólido o no sólido asociadas con transplantes de órgano o tejido, tales como daños por reperfusión después del transplante de órganos, rechazo de órgano y enfermedad de injerto-contra-huésped, enfermedades congénitas, enfermedades dermatológicas tales como psoriasis o alopecia, enfermedades neurológicas, enfermedades oftalmológicas, enfermedades renales, metabólicas o idiomáticas y condiciones de intoxicación, por ejemplo, toxicidad iatrogénicas , en donde las enfermedades anteriores se originan por, se asocian con y/o se acompañan por liberación de proteína HMGBl. En particular, las patologías que pertenecen a enfermedades inflamatorias y autoinmunes incluyen artritis reumatoide/artropatías seronegativas , osteoartritis, enfermedad inflamatoria del hígado, enfermedad de Crohn, infarto intestinal, lupus eritematoso sistémico, iridooculitis/uveitis, neuritis óptica, fibrosis pulmonar idiomática, vasculitis sistémica/granulomatosis de Wegener, sarcoidosis, orquitis/procedimiento de reversión de vasectomía. La respuesta inflamatoria sistémica incluye síndrome de sepsis (incluyendo sepsis gram positiva, sepsis gram negativa, sepsis de cultivo negativo, sepsis fungal, fiebre neutropénica, urosepsis, conjuntivitis séptica) , meningococcemia, hemorragia por trauma, zumbidos, exposición a radiación ionizante, prostatitis aguda y crónica, pancreatitis aguda y crónica, apendicitis, úlceras pépticas, gástricas y duodenal, peritonitis, colitis ulcerativa, pseudomembranosa, aguda e isquémica, diverticulitis, acalasia, colangitis, colecistitis, enteritis, síndrome de disfunción respiratoria en adultos (ARDS) . Daño por reperfusión incluye síndrome post-bombeo y daño por reperfusión-isquemia. La enfermedad cardiovascular incluye síndrome de espasmo cardiaco, infarto al miocardio e isquemia, ateroesclerosis, tromboflebitis, endocarditis, pericarditis, falla cardiaca congestiva y restenosis. Las enfermedades ginecológicas y obstétricas incluyen parto prematuro, endometriosis, aborto, vaginitis e infertilidad. Las enfermedades infecciosas incluyen infección de VIH/neuropatía de VIH, meningitis, hepatitis B y C, infección simple de herpes, artritis séptica, peritonitis, E.coii 0157:H7, neumonía epiglotitis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica tro bolítica, candidiasis, filariasis, amibiasis, malaria, fiebre de dengue hemorrágico, leishmaniasis, lepra, síndrome de choque tóxico, miositis por estreptococos, gangrena, tuberculosis por micobacterias, mycobacteri um avi um intracell ulare, neumonía de carinas por neumocistos, enfermedad pélvica inflamatoria, orquitis/epididimitis , legionela, enfermedad de Lyme, influenza A, Virus Epstein-Barr, Citomegalovirus, síndrome hemiafagocítico asociado viral, encefalitis viral/meningitis aséptica. La enfermedad alérgica y atópica incluye asma, alergia, choque anafiláctico, enfermedad compleja inmune, fiebre de heno, rinitis alérgica, eczema, dermatitis de contacto alérgico, conjuntivitis alérgica, neumonitis de hipersensibilidad. Las malignidades (patologías de tumor líquido y sólido) incluyen ALL, AML, CML, CLL, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, carcinoma coiorectal, carcinoma nasofaringeal, his tiocitosis maligno y síndrome paraneoplástico/hipercalcemia de malignidad. Las enfermedades de transplantes incluyen rechazo de transplante de órgano y enfermedad de injerto-contra-huésped. La enfermedad congénita incluye fibrosis cística, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar y anemia celular falciforme. La enfermedad dermatológica incluye psoriasis, artritis psoriática y alopecia. La enfermedad neurológica incluye enfermedades neurodegenerativas (esclerosis múltiple, migraña, dolor de cabeza, patologías asociadas amiloides, enfermedades de prión/enfermedad de Creutzfeld-Jacob, enfermedades de Alzheimer y Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis e ilateral amiotrófica) y neuropatías periféricas, migraña, dolor de cabeza. La enfermedad renal incluye síndrome nefrótico, hemodiálisis y uremia. La condición de intoxicación iatrogénica incluye terapia 0KT3, terapia Anti-CD3, terapia de Citoquina, Quimioterapia, Terapia de Radiación e intoxicación crónica de salicilato. La enfermedad metabólica e idiopática incluye enfermedad de Wilson, hemocromatosis, deficiencia de antitripsina alfa-1, diabetes, pérdida de peso, anorexia, caquexia, obesidad, tiroiditis de Hashimoto, osteoporosis, evaluación de eje hipotalámico-pituitario-adrenal y cirrosis biliar primaria. La enfermedad oftalmológica incluye glaucoma, retinopatías y ojos secos. Una miscelánea de otras patologías comprende: síndrome de disfunción de órgano múltiple, distrofia muscular, meningitis séptica, ateroesclerosis, epiglotitis, enfermedad de Whipple, asma, alergia, rinitis alérgica, . necrosis de órgano, fiebre, septicemia, choque endotóxico, hiperpirexia, granuloma eosinofílico, granuiomatosis , sarcoidosis, aborto séptico, uretritis, enfisema, rinitis, alveolitos, bronquiolitis, faringitis, disfunciones de barrera epitelial, neumoultramicropícsiicovolcanoconiosis , pleurisia, sinusitis, influenza, infección de virus sincitial respiratorio, bacteremia diseminada, cisto hidátide, dermatomiositis, quemaduras, quemaduras solares, urticaria, verruga, ronchas, vasulitis, angitis, miocarditis, arteritis, periarteritis nodosa, fiebre reumática, enfermedad celiaca, encefalitis, embolia cerebral, síndrome de Gillame-Barre, neuritis, neuralgia, complicaciones iatrogénicas/lesiones de nervio periférico, daño a la médula espinal, parálisis, uveitis, artriditis, artralgias, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal, sinovitis, miastenia grave, síndrome del Buenpastor, síndrome de Babcets, espondilitis anquilosante, enfermedad de Barger, síndrome de Retier, bull ous derma ti ti s (bullous pemfigoide) , pemphi gous y pemphi gou s vul gari s y alopecia. En un aspecto adicional de la invención, el uso de las variantes de polipéptido obtenidas a través de mutaciones sistemáticas de secuencias amino acidas de Bioque-A de HMGBl humano y no humano, o de sus fragmentos biológicamente relevantes arriba descritos, se encuentra en combinación con un' agente adicional. El agente adicional es preferentemente un agente capaz de inhibir un mediador temprano de la cascada de citoquina inflamatoria. Preferentemente, este agente adicional es un antagonista o inhibidor de una citoquina seleccionada a partir del grupo que consiste en TNF, IL-lot, IL-lß, IL-Ra, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-18, IFN-?, MlP-la, MIF-lß, MIP-2, MIF y PAF. El agente adicional utilizado en combinación con las variantes de polipéptido de Bloque-A HMGBl, o de sus fragmentos biológicamente relevantes, también puede ser un inhibidor de RAGE, por ejemplo, un anticuerpo dirigido a RAGE, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de RAGE, por ejemplo, una molécula de antidetección, una ribozima o una molécula de interferencia de ARN, o un antagonista de molécula sintética pequeña de la interacción de HMGBl con RAGE, preferentemente de la interacción de la forma no acetilada y/o acetilada de HMGBl con RAGE, o RAGE soluble (sRAGE) . El anticuerpo para RAGE es preferentemente un anticuerpo monoclonal, más preferentemente un anticuerpo quimérico o humanizado o un anticuerpo recombinante, tal como un anticuerpo de cadena individual o un fragmento de unión a antígeno de tal anticuerpo. El análogo de RAGE soluble puede presentarse opcionalmente como una proteína de fusión, por ejemplo, con el dominio Fe de un anticuerpo humano. El antagonista molecular sintético pequeño de la interacción de HMGBl con RAGE preferentemente tiene un peso molecular de menos de 1000 Dalton. El antagonista molecular sintético pequeño preferentemente inhibe la interacción de RAGE con la forma no acetilada y/o con la forma acetilada de HMGBl y con la forma no acetilada y/o con la forma acetiíada de proteínas homologas de HMGBl, particularmente HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG. El agente adicional utilizado en combinación con ías variantes de polipéptido de Bloque-A HMGBl, o de sus fragmentos biológicamente relevantes, también puede ser un inhibidor de la interacción de un receptor similar a Toll (TLR) , por ejemplo, de TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 y/o TLR9, con HMGBl, cuyo inhibidor es preferentemente un anticuerpo monoclonal o polic.lonal, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de TLR, por ejemplo, una molécula de antidetección, una ribozima o una molécula de interferencia de ARN, o una molécula sintética que preferentemente tiene un tamaño de menos de 1000 Dalton. El inhibidor puede ser un inhibidor conocido de un receptor similar a Toll, en particular de TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 y/o TLR9. El inhibidor preferentemente inhibe la interacción del receptor similar a Toll con la forma no acetilada y/o la forma acetilada de HMGBl y con forma no acetilada y/o con la forma acetilada de proteínas homologas de HMGBl, en particular HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-41 y/o SP100-HMG. En todavía otra modalidad, el agente adicional utilizado en combinación con las variantes de polipéptido de Bloque-A HMGBl, o de sus fragmentos biológicamente relevantes, es el dominio similar a iectina de terminal N funcional (DI) de trombomodulina. El dominio DI de trombomodulina es capaz de interceptar la forma no acetilada y/o la forma acetilada de HMGBl liberado y de proteínas homologas de HMGB1 liberadas, en particular HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG-4L y/o SP100-HMG, evitando así su interacción con RAGE y receptores similares a Toll. El dominio DI de trombomodulina puede ser nativo o mutarse con objeto de hacerse resistente a proteasas. El agente adicional también puede ser un ácido nucleico de doble filamento sintético o molécula análoga de ácido nucleico con una estructura de forma curva, particularmente un ADN curvo de doble filamento, APN o quimera o híbrido de ADN/APN o un ADN cruciforme de doble filamento, APN o quimera o estructura híbrida de ADN/APN, capaz de unirse a la proteína HMGBl. Los ácidos nucleicos preferidos y las moléculas análogas nucleicas se exponen en una solicitud de patente internacional de co-propiedad y co-pendiente No. PCT/EP2005/007198, presentada el 4 de Julio de 2005 (que reclama la prioridad de la solicitud provisional de E.U. No. 60/584,678 presentada el 2 de Julio de 2004), las cuales se incorporan en la presente para referencia. El ácido nucleico o molécula análoga de ácido nucleico, de doble filamento, sintético, con una estructura de forma curva, es preferentemente capaz de unirse a la forma no acetilada y/o a la forma acetilada de HMGBl y la forma no acetilada y/o la forma acetilada de proteínas homologas de HMGBl, en particular HMGB2, HMGB3, HMG-1L10, HMG4L y/o SP100-HMG.

En todavía una modalidad adicional, el agente adicional utilizando en combinación con las variantes de polipéptido inventivas es K252a y/o una sal o derivado de la misma o un conjugado polímero de K-252a y/o de un derivado del mismo. El uso de K-252a o conjugado polímero de K-252a y derivados de los mismos se expone en una solicitud de patente internacional de co-propiedad y copendiente No. PCT/EP2005/008258 y solicitud provisional de E.U. presentada el 25 de Agosto de 2005. Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de por lo menos una de las variantes de polipéptido de Bloque-A HMGBl o un fragmento biológicamente activo de las mismas como un ingrediente activo para el tratamiento de patologías asociadas a HMGBl y vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica de ia presente invención es preferentemente adecuada para el tratamiento de patologías asociadas con la forma acetilada y/o la forma no acetilada de HMGBl y/o de proteínas homologas de HMGBl. En una modalidad preferida adicional, la composición farmacéutica de la presente invención que comprende la al menos una variante de polipéptido, comprende un agente adicional según se define arriba. La composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas . La formulación exacta, ruta de administración y dosis pueden seleccionarse por el médico individual en vista de las condiciones del paciente. La administración puede lograrse en una sola dosis o dosis repetidas en intervalos. La cantidad de dosis e intervalo pueden ajustarse de manera individual con objeto de proporcionar el efecto terapéutico que da como resultado la disminución de ios síntomas o una prolongación de la supervivencia en un paciente. La cantidad real de composición administrada dependerá, por supuesto, del sujeto a tratarse, del peso del sujeto, la severidad de la aflicción, la manera de administración y el juicio del médico que prescribe. Una dosis diaria adecuada se encontrará entre 0,001 a 10 mg/kg, particularmente 0,1 a 5 mg/kg . La administración puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos, por ejemplo, por inyección, en particular mediante inyección intravenosa, intramuscular, transmucosal, subcutánea o intraperitoneal y/o mediante aplicación oral, tópica, nasal, inhalación, aerosol y/o rectal, etc. La administración puede ser local o sistémica. Además, las variantes de Bloque-A de HMGBl, o de sus fragmentos farmacológicamente activos, objeto de esta invención, pueden inmovilizarse de manera reversible y/o adsorberse en la superficie y/o dentro de dispositivos médicos o sistemas de liberación/vehiculización de fármaco (microesferas) . Los dispositivos médicos y microesferas pueden cargarse de manera reversible con las variantes de polipéptido del Bloque-A objeto de esta invención, a través de su unión, impregnación y/o adsorción en la superficie del dispositivo médico o de la microesfera o en un estrato que cubre su superficie. .Cuando el dispositivo médico o la microesfera entran en contacto con fluidos biológicos, la variante reversiblemente inmovilizada de Bloque-A se libera. Por consiguiente, el dispositivo médico y la microesfera actúan como herramientas de liberación de fármaco que eluyen la molécula objeto de esta invención de tal manera que puede controlarse su cinética de liberación, asegurando la liberación controlada o prolongada, según se requiera por el tratamiento. Los métodos para cubrir/impregnar los dispositivos médicos y cargar las microesferas son muy conocidos por expertos en estas tecnologías. Por lo tanto, un aspecto adicional de esta invención es la manera de utilizar las variantes de Bloque-A de HMGBl o sus fragmentos biológicamente relevantes, en donde las moléculas de poiipéptido mutadas se inmovilizan de manera reversible en la superficie de dispositivos médicos o de microesferas o se adsorben dentro de ellos. Estos instrumentos médicos son preferentemente herramientas quirúrgicas, implantes, catéteres o microandamios, por ejemplo, microandamios para angioplastía y, en particular, microandamios eluyentes de fármaco medicado. Otro aspecto de ia invención se refiere a un dispositivo médico reversiblemente cubierto con al menos una variante de polipéptido de la invención. Tal dispositivo puede seleccionarse a partir de instrumentos quirúrgicos, implantes, catéteres o microandamios. Tal dispositivo puede ser útil para angioplastía. La invención se ilustra además por las siguientes Figuras y Ejemplos. Los ejemplos se proponen ejemplificar procesos genéricos y se incluyen solo con propósitos ilustrativos, sin intención de limitar el alcance de la presente invención . La Fig. 1 muestra las proteasas utilizadas para la identificación in sili c o de las posiciones amino acidas (is-HITs) en la secuencia amino acida de Bloque-A HMGBl que son objetivo de la actividad proteolítica. La Fig. 2 ilustra la matriz de "Mutación Porcentual Aceptada" (PAM 250) . Los valores dados a residuos idénticos se muestran en el cuadro gris. Los valores máximos en la matriz se muestran en el cuadrado negro y corresponden a la máxima ocurrencia de sustitución entre dos residuos. La Fig. 3a exhibe la secuencia amino acida del Bloque-A HMGBl Humano nativo, elaborado de 84 residuos amino ácidos. Se identifican en negritas, los amino ácidos sensibles a proteólisis de proteasas, mostrando las posiciones de residuo is-HIT. La Fig. 3b muestra el tipo de amino ácidos de reemplazo en las posiciones objetivo is-HITs respectivas, seleccionadas para generar la variante de polipéptido del Bloque-A HMGBl humano, de longitud completa. Además, las secuencias amino acidas específicas de la variante de polipéptido generada se muestran en las SEQ ID NOs: 2 a 116. La Fig. 4a muestra la secuencia amino acida del fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl Humano, elaborado de 77 residuos amino ácidos. Se identifican en negritas los amino ácidos sensibles a proteólisis de proteasas, mostrando las posiciones de residuo is-HIT. La Fig. 4b muestra el tipo de amino ácidos de reemplazo en las posiciones objetivo is-HIT seleccionadas para generar la variante de polipéptido del fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl Humano, elaborado de 77 residuos amino ácidos. Además, las secuencias amino acidas específicas de la variante de polipéptido generada se muestran en las SEQ ID NOs: 118 a 222. La Fig. 5a muestra la secuencia amino acida del fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl Humano, elaborado de 54 residuos amino ácidos. Se identifican en negritas, los amino ácidos sensibles a proteólisis de proteasas, mostrando las posiciones de residuo is-HIT . La Fig. 5b muestra el tipo de amino ácidos de reemplazo en las posiciones objetivo is-HITs respectivas, seleccionadas para generar la variante de polipéptido del fragmento biológicamente activo de Bioque-A HMGBÍ Humano, elaborado de 54 residuos amino ácidos. Además, las secuencias amino acidas específicas de la variante de polipéptido generada se muestran en las SEQ ID NOs: 224 a 300. La Fig. 6a muestra la secuencia amino acida del Bloque-A HMGBl de Anophel es gambia nativo, elaborado de 84 residuos amino ácidos. Se identifican en negritas, los amino ácidos sensibles a proteólisis de proteasas, mostrando las posiciones de residuo is-HIT. La Fig. 6b muestra el tipo de amino ácidos de reemplazo en las posiciones objetivo is-HITs respectivas, seleccionadas para generar la variante de polipéptido del Bloque-A HMGBl de Anoph el es gambi a de longitud completa. Además, las secuencias amino acidas específicas de la variante de polipéptido generada se exhiben en las SEQ ID NOs: 302 a 418. La Fig. 7a muestra la secuencia amino acida del fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl de Anoph el es gambi a , elaborado de 77 residuos amino ácidos. Se identifican en negritas los amino ácidos sensibles a proteólisis de proteasas, mostrando las posiciones de residuo is-HIT. La Fig. 7b muestra el tipo de amino ácidos de reemplazo en las posiciones objetivo is-HITs respectivas, seleccionadas para generar la variante de polipéptido del fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl de Anoph el es gambi a , elaborado de 77 residuos amino ácidos. Además, las secuencias amino acidas específicas de ia variante de polipéptido generada se muestran en las SEQ ID NOs: 420 a 528. La Fig. 8a muestra la secuencia amino acida del fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl de Anoph el es gambi a , elaborado de 54 residuos amino ácidos. Se identifican en negritas los amino ácidos sensibles a proteólisis de proteasas, mostrando las posiciones de residuo is-HIT.

La Fig. 8b muestra el tipo de amino ácidos de reemplazo en las posiciones objetivo is-HITs respectivas, seleccionadas para generar la variante de polipéptido del fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl de Anoph el es gambi a , elaborado de 54 residuos amino ácidos. Además, las secuencias amino acidas específicas de la variante polipéptida generada se muestran en las SEQ ID NOs: 530 a 610. La Fig. 9 muestra el vector plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante de polipéptido de la presente invención. La piásmida contiene el gen que codifica la variante de polipéptido de la presente invención, la cual se encuentra bajo control del promotor T5 inducible por IPT-G. La piásmida contiene además un gen resistente a ampicilina, un identificador His 6x y varios sitios de restricción . La Fig. 10 muestra una gráfica que muestra ia correlación entre la liberación TNF-alfa inducida por la estimulación de HMGBl en células RAW 264.7. La Fig. 11 - muestra una inhibición dependiente de dosis de la liberación T?F-alfa inducida por HMGBl por una proteína identificada His de Bloque-A. EJEMPLOS 1. PRODUCCIÓN DE BLOQUE-A HMGBl NATIVO Y VARIANTES EN BACTERIAS Las variantes generadas in sili co de Bloque-A HMGBl se clonaron a partir de proteína HMGBl en un vector plásmido inducible (Fig. 9) utilizado para transformar células competentes de cepa M15 de E.coli. Las células M15 se desarrollaron durante la noche en 1 mL de medio LB que contiene Kanamicina y Ampicilina en placas de 96 cavidades profundas bajo agitación (750 rpm) . En OD6oo nm de 0.2-0.3, los cultivos se diluyeron en 5 mL de medio LB en placas de 24 cavidades para alcanzar un OD6oo nm de 0.07. Las células M15 se incubaron a 37°C bajo agitación constante (200 rpm). La producción de Bloque-A (nativo o variantes) se indujo por la adición de IPTG (l M de concentración final) a ODboo nm de 0.6. El cultivo se continuó durante tres horas a 37°C bajo agitación (200 rpm) . Las células M15 se cosecharon entonces mediante centrifugación a 1000 g durante 15 minutos, el sobrenadante se descartó y el granulo se almacenó a -80°C al menos por 1 hora antes de lisis de células y purificación de Bloque-A. 2. PURIFICACIÓN DE BLOQUE A HMGBl NATIVO Y VARIANTES El granulo de células M15 se descongeló en hielo durante 15 min. Las células se re-suspendieron en 1 mL de regulador NPI-10 que contiene 1 mg/mL de Lisozima y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente bajo agitación a 750 rpm en un agitador de placa. Después del equilibrio de Ni-NTA QIAfiltro con 200 µL de resina Superflow (QIAGEN catálogo #969261) y 600 µL de regulador NPI-10, el lisado bacteriano se cargó y se agregaron 200 µL de EtOH absoluto. Se llevaron a cabo cuatro etapas de enjuague con 1 mL de NPI-20. Ei segundo y tercer enjuagues se realizaron con 1 L de NPI-20 adicionado con 100 µg/mL Polymyxin (Fluka catálogo #81271) con objeto de agotar contaminantes de LPS. Después de las etapas de enjuague, el Bloque-A nativo y las variantes se levigaron con 450 µL NPI-250. Las muestras se almacenaron a 4°C. El Bloque-A nativo y las variantes se re-purificaron . con una columna de polimixina DetoxiGel (PIERCE) a 4°C de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Finalmente, las proteínas levigadas se filtraron (0.22 µm) en PBS y se almacenaron a 4°C por examinarse. 3. ENSAYO DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE BLOQUE-A HMGBl estimula la secreción de TNF-alfa y de otras citoquinas así como también la proliferación de macrófagos y monolitos. El Bloque-A actúa como un antagonista mediante inhibición de la actividad de HMGBl. La actividad de Bloque-A nativo y variantes producidas se midió por el nivel de inhibición de la estimulación producida por HMGBl en células RAW 264.7 (macrófagos murinos, ATCC). El Bloque-A HMGBl nativo y las variantes producidas según se describe arriba se examinaron en un proceso de dos etapas de selección, dirigido a examinar i) su inhibición de liberación TNF-alfa inducida por HMGBl y ii) sus resistencia a proteólisis . Con objeto de determinar la adecuada concentración de HMGBl a utilizarse en el ensayo de inhibición, las células RAW 264.7 se sembraron en placas de 96 cavidades (4 x 105 células/cavidad) y se desarrollaron durante la noche en medio RPMI 1640 complementado con 0.1% BSA. Después de cultivo durante la noche, las células se estimularon con HMGBl (dos veces las concentraciones de dilución serial entre 100 µg/mL y 0.05 µg/mL) durante 24 horas. El nivel de TNF-alfa producido se midió a partir de medio celular mediante el uso de ELISA (R&D Systems), de acuerdo con instrucciones del fabricante. Como se presentó en la Fig. 10, HMGBl estimuló significativamente liberación de TNF-alfa en cultivos macrófagos. 4. INHIBICIÓN DE BLOQUE-A DE HMGBl LIBERACIÓN DE TNF-ALFA COMO PRUEBA DE SELECCIÓN Las células RAW 264.7 similares a macrófago murino se sembraron en placas de 96 cavidades (4xl05 células/cavidad) y se desarrollaron durante ia noche, las células se estimularon con una concentración adecuada de HMGBl y Bloque-A nativo o variantes o His-identificado (dos veces la dilución serial entre 20 µg/mL y 0.5 µg/mL) durante 24 horas. El nivel de TNF-alfa se midió a partir de medio celular utilizando ELISA (R&D systems) , de acuerdo con instrucciones del fabricante. La Fig. 11 muestra un ejemplo de inhibición dependiente de la dosis de liberación de TNF inducida por HMGBl por Bloque-A, con un EC50 de 7.5 µg/ml (línea sólida)'. Se obtiene 100% de inhibición de liberación TNF-alfa con una concentración de 20 µg/ml de Bloque-A. En paralelo, los niveles de TNF-alfa se midieron en células estimuladas con Bloque-A sin HMGBl con objeto de determinar la presencia o ausencia de endotoxina contaminante en preparación de Bloque-A y cuantificar cualquier liberación no dependiente de HMGBl de TNF-alfa. No se observa liberación alguna de TNF-alfa en todas las concentraciones de Bloque-A utilizadas en el ensayo (línea punteada) . 5. RESISTENCIA A PROTEÓLISIS DE VARIANTES DE BLOQUE-A La resistencia de variantes de Bloque-A a proteólisis se determina como la actividad biológica residual (en el sistema de HMGBl/células RAW) después de exposición a una mezcla de proteasas seleccionadas en momentos de incubación crecientes. 20 µg de Bloque-A nativo o variantes se trataron con una mezcla de proteasas a 1% w/w de proteínas totales. La mezcla de proteasas se preparó recientemente para cada ensayo a partir de soluciones de depósito de endoproteinasa Glu-C (SIGMA; 200 µg/ml), tripsina (SIGMA; 400 µg/ml) y a-quimotripsina (SIGMA; 400 µg/ml) . Las muestras se recolectaron en diferentes puntos de tiempo entre 5 minutos y 8 horas de incubación con proteasas después de detener la reacción con la adición de 10 µl de solución anti-proteasas (Roche) . La actividad biológica de cada muestra se evaluó entonces mediante la prueba de selección arriba descrita con objeto de determinar la actividad residual en cada punto de tiempo.

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Variante de polipéptido del Bloque-A de dominio de unión de alta afinidad de HMGBl humano y/o no humano (Bloque-A HMGBl) o de un fragmento biológicamente activo de Bloque-A HMGBl, caracterizada en que la secuencia amino acida de' dicha variante de polipéptido difiere de la secuencia amino acida del Bloque-A HMGBl de tipo silvestre por la mutación de uno o más amino ácidos individuales. 2. Variante de polipéptido de la reivindicación 1, en donde lá variante de polipéptido difiere de la secuencia de Bloque-A HMGBl de tipo silvestre por la mutación de 1 a 10 amino ácidos individuales, preferentemente por solo un amino ácido individual. 3. Variante de polipéptido - de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde la mutación es una sustitución, una omisión o una adición de amino ácidos individuales. 4. Variante de polipéptido de la reivindicación 3, en donde la sustitución se obtiene por diferentes amino ácidos genéticamente codificados o por amino ácidos no genéticamente codificados. 5. Variante de polipéptido de la reivindicación 3 o 4, en donde la sustitución es una sustitución conservadora o no conservadora. 6. Variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el Bloque-A HMGBl no humano es Bloque-A HMGBl Anoph el es gambi a . 1 . Variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la variante de polipéptido del Bloque-A HMGBl humano se selecciona a partir del grupo que consiste en las secuencias amino acidas según se define en cualquiera de las SEQ ID NO: 2 a 116. 8. Variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los fragmentos biológicamente activos del Bloque-A HMGBl de tipo silvestre humano son un fragmento de al menos 77 o al menos 54 amino ácidos, respectivamente y comprenden las secuencias amino acidas según se define en la SEQ ID NO: 177 o 223, respectivamente . 9. Variante de polipéptido de la reivindicación 7 u 8, en donde la variante de polipéptido de los fragmentos biológicamente activos del Bloque-A HMGBl humano se selecciona a partir del grupo que consiste en las secuencias amino acidas según se define en cualquiera de las SEQ ID NO: 118 a 222 o 224 a 300. 10. Variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la variante de polipéptido del Bloque-A HMGBl Anophel es gambi a se selecciona a partir del grupo que consiste en las secuencias amino acidas según se define en cualquiera de las SEQ ID NO: 302 a 418. 11. Variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde los fragmentos biológicamente activos . del Bloque-A HMGBl de tipo silvestre Anoph el es gambi a es un fragmentos de al menos 77 o al menos 54 amino ácidos, respectivamente y comprende las secuencias amino acidas según se define en la SEQ ID NO: 419 o 529, respectivamente. 12. Variante de polipéptido de la reivindicación 11, en donde la variante de polipéptido de los fragmentos biológicamente activos del Bloque-A HMGBl Anophel es gambi a se selecciona a partir del grupo que consiste en las secuencias amino acidas según se define en cualquiera de las SEQ ID NO: 420 a 528 o 530 a 610. 13. Variante de polipépti -- -e. cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha variante de polipéptido exhibe una resistencia incrementa^" "--^ la actividad proteolítica de ^ea5" . comparación con ei Bloque-A HMGBl de ._..«. silvestre o el fragmento biológicamente nc^-^nto er. resistencia a proteólisis se con ±. ^.._|_. __ _ „ _. _. „r ?,_ ^a proteasa seleccionada ~ ^ que rende quimotripsina, tripsina, e. endopeptidasa o una combinación de los mismos. 15. Variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el incremento en resistencia a prqteólisis es de por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70%^ -80%, 90%, 95% o más en comparación con el Bloque-A HMGBl de tipo silvestre. 16. Variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la variante de polipéptido exhibe una mayor vida promedio en los fluidos corporales en comparación con el Bloque-A HMGBl de tipo silvestre o con el fragmento biológicamente activo del Bloque-A HMGBl de tipo silvestre. 17. Variante de polipéptido de la reivindicación 16, en donde la vida promedio es de al menos 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos o incluso mayor en comparación con el Bloque-A HMGBl de tipo silvestre. 18. Molécula de ácido nucleico que codifica una variante de polipéptido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17. 19. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 18. 20. Método para producir una variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende: (i) introducir una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 18 en un huésped; y (ii) cultivar la célula, bajo condiciones en las cuales se expresa la variante de polipéptido codificada. 21. Método para la producción de una variante de polipéptido de las reivindicaciones 1 a 17, utilizando síntesis péptida química. 22. Variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para el uso como agente activo en un medicamento. 23. Uso de una variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la elaboración de un medicamento para la prevención o tratamiento de patologías asociadas a HMGBl o patologías asociadas con proteínas homologas de HMGBl .' 24. Uso de la reivindicación 23, en donde las patologías asociadas a HMGBl y las patologías asociadas con proteínas homologas a HMGBl son condiciones patológicas mediadas por activación de la cascada de citoquina inflamatoria. 25. Uso de la reivindicación 23 o 24, en donde las condiciones patológicas se seleccionan a partir del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, daño por reperfusión después del transplante de órganos, afecciones cardiovasculares, enfermedad obstétrica y ginecológica, enfermedad infecciosa (viral . y bacteriana) , enfermedad alérgica y atópica, patologías de tumor sólido y líquido, enfermedad de rechazo de transplante, enfermedades congénitas, enfermedades dermatológicas, enfermedades neurológicas, caquexia, enfermedades renales, condiciones de intoxicación iatrogénica, enfermedades metabólicas e idiopáticas, y enfermedades oftalmológicas. 26. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 en combinación con un agente adicional capaz de inhibir un mediador temprano de la cascada de citoquina inflamatoria. 27. Uso de ia reivindicación 26, en donde el agente adicional es un antagonista o inhibidor de una citoquina seleccionada a partir del grupo que consiste en TNF, IL-la, IL-lß, IL-Ra, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-18, IFN-?, MIP-la, MIF-lß, MIP-2, MIF y PAF . 28. Uso de la reivindicación 26, en donde el agente adicional es un anticuerpo a RAGE, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de RAGE, por ejemplo, una molécula de anti-detección, una ribozima o una molécula de interferencia de ARN o un antagonista de molécula sintética pequeña de la interacción de HMGBl con RAGE O RAGE soluble (sRAGE) . 29. Uso de la reivindicación 26, en donde el agente adicional que es un inhibidor de la interacción de un receptor similar a Toll (TLR), en particular de TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 y/o TLR9, con HMGBl, preferentemente un anticuerpo monoclonal o policlonal, un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de TLR, por ejemplo, una molécula de antidetección, una ribozima o una molécula de interferencia de ARN, o una molécula sintética que tiene un tamaño de menos de 1000 Dalton. 30. Uso de la reivindicación 26, en donde el agente adicional es el dominio similar a lectina de terminal N (DI) de trombomodulina nativa o mutada. 31. Uso de la reivindicación 26, en donde el agente adicional es un ácido nucleico de doble filamento sintético o molécula análoga de ácido nucleico con una estructura en forma curva, seleccionado a partir de ADN curvo o cruciforme, APN o quimera o híbrido de ADN/APN. 32. Uso de la reivindicación 26, en donde el agente adicional es K-252a y/o una sal o un derivado de la misma o un conjugado polímero de K-252a y/o un derivado del mismo. 33. Composición . farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de al menos una variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 como un agente activo y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable . 34. Composición de la reivindicación 33 en donde la por lo menos una variante de polipéptido se encuentra en combinación con al menos un agente adicional, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32. 35. Composición de las reivindicaciones 33 o 34 para aplicaciones de diagnóstico. 36. Composición de las reivindicaciones 33 a 34 para aplicaciones terapéuticas. 37. Método para el tratamiento de una condición en un paciente, caracterizado por la activación de HMGBl de una cascada de citoquina inflamatoria, que comprende la administración al paciente de una cantidad eficaz de al menos una de las variantes de polipéptido de cualquiera de las-reivindicaciones 1 a 17, capaz de antagonizar y/o inhibir la actividad patológica inducida por HMGBl . 38. Uso de al menos una variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dichas moléculas se inmovilizan de manera reversible en la superficie de dispositivos médicos. 39. Uso de la reivindicación 38, en donde dichos dispositivos médicos son instrumentos quirúrgicos, implantes, catéteres o microandamios. 40. Dispositivo médico reversiblemente cubierto con al menos una variante de polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17. 41. Dispositivo médico de la reivindicación 40, en donde ei dispositivo médico se selecciona a partir de instrumentos quirúrgicos, implantes, catéteres o microandamios.